KR101323669B1 - 암세포 특이적 세포괴사 유도 및 암 소멸 효과를 나타내는 세포사 유도 융합 펩타이드 - Google Patents
암세포 특이적 세포괴사 유도 및 암 소멸 효과를 나타내는 세포사 유도 융합 펩타이드 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 세포사 유도 펩타이드에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 세포사를 일으키는 Noxa 단백질의 MTD 부위 10 개의 아미노산인 세포사 유도 펩타이드(cell killing peptide: CKP)와 암세포를 표적화시키는 7 개의 아미노산을 융합한 세포사 유도 CKP 융합 펩타이드(CTD7:CKP)에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 세포사 유도 CKP 융합 펩타이드가 여러 암 세포주(HeLa, HCT116, MCF-7, A549, BJAB, CT26, PC3 등)에서 강력한 세포괴사를 유도하는 반면, 정상세포에 대하여는 세포사멸 효과가 나타나지 않으며 실험동물을 이용한 mouse tumor model에서 강력한 암 소멸(tumor regression)효과를 나타내므로 세포사를 요하는 각종 질환의 치료, 특히 항암제로 인체에 널리 이용될 수 있다.
Description
본 발명은 세포사 유도 CKP 융합 펩타이드(CTD7:CKP)의 암세포 괴사(necrosis) 및 실험동물을 이용한 mouse tumor model에서 강력한 암 소멸(tumor regression)효과를 나타낸 것으로, 과도한 세포증식으로 인하여 세포사를 요하는 각종 질환의 치료, 특히 항암제 등에 널리 이용될 수 있는 합성 펩타이드에 관한 것이다.
세포괴사(necrosis)는 과도한 세포독성이나 지속적인 환경 스트레스로 인해 유발되는 비가역적 세포사로서 apoptosis와 달리 세포 에너지를 사용하지 않는다. 본 발명자는 human Noxa에서 아팝토시스 유도에 중요한 역할을 하는 BH3 도메인외에 C-말단부위에서 미토콘드리아 표적화 도메인(MTD:mitochondria targeting domain)을 처음 발견하였다(Seo et. al., 2003, JBC, 278, 48292-48299).
MTD는 apoptosis를 일으키는 것으로 잘 알려진 Noxa 단백질의 일부분이며, 미토콘드리아로 Noxa가 이동하는 것을 돕고 apoptosis는 Noxa의 BH3 domain에 의한 것이라고 알려져 있다. 본 발명에서는 이를 세포사 유도 펩타이드(Cell Killing Peptide: CKP)로 명명하였다. Noxa의 MTD는 세포질 내의 칼슘을 증가시켜, 80% 이상의 세포를 10 분 이내에 사멸시킬 수 있을 정도로 강력한 세포 괴사능을 가지고 있으며, 세포질 내 칼슘 증가의 원인은 일반적인 세포괴사의 원인으로 알려진 endoplasmic reticulum(ER)에서의 칼슘 방출이나 외부로 부터의 칼슘 유입이 아니라 세포 내 미토콘드리아에서의 칼슘 방출에 의한 것이다. 이는 ER에 비해서 칼슘의 양이 적은 미토콘드리아에서 한꺼번에 과량의 칼슘이 능동적으로 방출이 될 수 있다는 것과 그것이 세포괴사를 일으키는 충분한 원인이 될 수 있음을 보여준다(Seo et. al., 2009, Cancer Res, 69(21):8356-8365).
세포괴사를 일으키는 생리학적인 예로는 ischemia: reperfusion, 허혈성 뇌졸증에서 신경세포의 excitotoxicity, 항암제에 의한 세포사(e.g., photodynamic cancer-therapy drugs) 등이 있다. 최근 세포사 연구의 결과에 의하면 세포사의 분별 기준이 뚜렷하게 정리되지 않는 모호한 경우가 종종 나타나는데, Ischemia: reperfusion의 경우 ischemia 상태에 있는 세포가 필요한 ATP를 glycolysis를 통하여 생산하다가 갑자기 산소가 공급되면 미토콘드리아에서 oxidative phosphorylation을 통하여 ATP를 생산하게 된다. 이 과정에서 미토콘드리아는 많은 양의 ROS를 생산하게 되고 그로 인해 세포괴사가 일어나는 것으로 알려져 있다. 허혈성 뇌졸중의 in vitro 모델로 사용되는 N-methyl-D-aspartic acid(NMDA) 유발성 뇌피질신경세포의 excitotoxicity 경우 신경세포에 과도한 신경전달이 지속되면 세포내의 calcium 양이 증가하여 calcium에 의한 necrosis가 일어나는 것으로 알려져 있다. 또한, necrosis에서 볼 수 있는 pyknotic nuclei와 함께 세포막 밖으로 phosphatidylserine(PS)이 노출이 되는 PS flip-flopping 현상이 동시에 관찰이 된다(Wang et. al, 2004).
최근 세포괴사 유도물질이 과도한 세포증식으로 인한 질병의 치료제로 개발되고 있다. 합성 펩타이드가 세포괴사를 유도하여 항암효과를 나타내는 것으로 현재 펩타이드 부포린 유도체인 Kaisin, KaisinI, KaisinII가 암세포에만 선별적으로 작용하여 효과적인 항암제의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다는 보고가 있다(특허:10-2007-000159. 리틱 펩타이드로 명명되는 LTX-315는 노르웨이 바이오 제약업체 리틱스 바이오 파마 사가 현재 임상 1상/2상을 진행 중으로 종양 세포의 초고속 용해 및 세포괴사를 유도하는 특징을 지닌다고 보고 되어 있다. 또한, 국내에서는 녹십자가 미국 제네렉스(Jennerex)사와 공동으로 개발 중인 JX-594의 임상시험은 간암환자를 대상으로 국내에서 진행됐으며, 임상결과에 따르면 JX-594와 간암치료제 소라페닙(sorafenib)을 병용 투여한 결과 뚜렷한 암세포 괴사 유도 효과가 관찰됐다.
본 발명자들은 이미 종래 Noxa 단백질의 C-말단부위에 존재하며 BH3 도메인을 보조하여 단지 미토콘드리아 표적화 역할을 하는 것으로 알려진 MTD 도메인이 단백질 운반 도메인(PTD)인 R8과 조합되었을 때 강력하게 암세포주(예, HeLa, HCT116)의 세포사를 일으킬 수 있다는 것을 발견하고, 새로운 세포사 유도 펩타이드(CKP: cell-killing peptide)인 본 발명을 완성하였다(등록번호:10-685345).
In vivo phage display를 이용하여 단기간 내에 특정 세포 및 조직을 targeting하는 small peptide ligands를 탐색하는데 최적화된 방법이며, 조직 특이적 peptide의 탐색은 drug delivery system과 접목하여 체내 전달이 어려운 단백질 약물의 운송 시스템 이용에 효과적으로 이용이 가능하다. Rouslahti등은 암의 증식 뿐만 아니라 암의 성장에 필요한 혈관의 증식을 억제하고자 T7 phage display를 이용하여 특정 암 조직을 targetting 하는 암세포 표적 펩타이드를 선별하였다.
이와 같은 배경에서 본 발명자들은 세포사를 일으키는 Noxa 단백질의 MTD 부위 10 amino acid인 세포사 유도 펩타이드(CKP)와 문헌 조사를 통해 암세포를 표적화시키는 7 아미노산을 융합한 세포사 유도 CKP 융합 펩타이드의 암세포주(예, HeLa, HCT116, MCF-7 등)의 강력한 세포사 유도능 및 실험동물을 이용한 mouse tumor model에서 강력한 암 소멸(tumor regression)효과와 이들의 세포 독성 등을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 주된 목적은 Noxa 단백질의 MTD 부위 10 개의 아미노산인 세포사 유도 펩타이드 CKP와 암세포를 표적화 시키는 7 개의 아미노산을 융합한 세포사 유도 CKP 융합 펩타이드(CTD7:CKP)를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 융합 단백질을 포함하는 세포사 유도 및 암 소멸 효과를 나타내는 약학적 조성물을 제공하는데 있다.
본 명세서에서 용어 “펩타이드”는 펩타이드 결합에 의해 아미노산 잔기들이 서로 결합되어 형성된 선형의 분자를 의미한다.
본 발명의 펩타이드는 당업계에 공지된 화학적 합성 방법, 특히 고상 합성 기술(solid-phase synthesis techniques)에 따라 제조될 수 있다(Merrifield, J. Amer. Chem. Soc. 85:2149-54(1963); Stewart, et al., Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd. ed., Pierce Chem. Co.: Rockford, 111(1984)).
본 발명의 세포사 유도 펩타이드(CKP)는 종래 아팝토시스 (apoptosis)를 유발하는 Noxa에서 미토콘드리아 표적 도메인으로 알려진 펩타이드가 암세포를 효과적으로 죽이는 활성을 갖는다는 것을 본 발명자가 처음으로 발견하고 세포사 유도 펩타이드(CKP: cell killing peptide)으로 명명한 것이다. 상기 세포사 유도 펩타이드(CKP)는 서열번호 21 (KLLNLISKLF)의 아미노산 서열을 가진다.
본 발명의 일 태양에 따르면, 본 발명은 다음 암세포 표적 도메인(CTD; R1~R7)과 세포사 유도 펩타이드(CKP)와 그사이의 링커(Liner) 서열를 포함하고, CTD(R1~R7)-Linker-CKP 혹은 CKP-Liner-CTD(R1~R7) 형태로 배열된 것을 특징으로 하는 암 표적 세포사 유도 융합 펩타이드:
(a) Arg-Xaa-Xaa-Arg-Xaa-Xaa-Arg로 표시되는 아미노산 서열로 구성된 암세포 표적 도메인(CTD; R1~R7);
(b) 서열번호 21 (KLLNLISKLF)에 나타낸 아미노산 서열 또는 이와 70% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 구성된 세포사 유도 펩타이드(CKP); 및,
(c) n=0 ~ 5의 아미노산 서열을 갖는 링커(Liner).
본 발명에 있어서, 상기 암세포 표적 도메인(CTD; R1~R7)은 Arg-Xaa-Xaa-Arg-Xaa-Xaa-Arg로 표시되는 어떤 아미노산 서열도 가질 수 있다. 본 발명자는 상기 1번째, 4번째, 7번째 아미노산이 아르기닌(Arg)인 공통규칙을 가진 서열이 암 세포 표적에 효과적이라는 것을 처음으로 밝혀냈다. 바람직하게는 상기 암세포 표적 도메인(CTD; R1~R7)은 서열번호 20 (RPARPAR)의 아미노산 서열로 구성된 것을 특징으로 하는 암표적 세포사 유도 융합 펩타이드를 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 세포사 유도 펩타이드(CKP)는 서열번호 21의 아미노산 서열과 적어도 70% 이상의 상동성을 가지면 본 발명의 세포사 유도 활성을 나타낼 수 있다. 본 발명의 실시예에서는 CKP의 10개의 아미노산 서열중 1개, 2개, 또는 3개의 아미노산 서열을 치환한 변이체도 세포사 유도 활성이 있다는 것을 증명하였다. 상기 서열번호 21과 70% 이상의 상동성을 갖는 세포사 유도 펩타이드(CKP)는 구체적으로 서열번호 22 (KALNLISKLF), 서열번호 23 (KLAALISKLF), 서열번호 24 (KLLNLIAALF), 또는 서열번호 25 (KALNLIAALF)의 아미노산 서열로 구성된 것을 특징으로 하며, 바람직하게는 상기 서열번호 21과 70% 이상의 상동성을 갖는 세포사 유도 펩타이드(CKP)는 서열번호 21의 2, 3, 5 및 9번째 아미노산 서열이 루이신(Leucine)인 것을 특징으로 하는 암표적 세포사 유도 융합 펩타이드를 제공한다. 상기 서열번호의 21의 세포사 유도 펩타이드는 2, 3, 5 및 9번째 서열에 루이신이 반복적으로 나타나고 있으며, 이들 서열이 세포사 능력에 중요한 역할을 한다는 것을 실시예에서 실험으로 증명하였다.
본 발명에 있어서, 상기 암세포 표적 도메인(CTD; R1~R7)과 세포사 유도 펩타이드(CKP)는 링커 서열없이 결합될 수도 있지만, 바람직하게는 CKP의 세포사 유도 활성에 방해가 되지 않을 정도 길이(n=0~5)의 아미노산 서열을 갖는 링커에 의해 서로 연결될 수도 있다. 상기 링커로는 당업계에 공지된 다양한 링커를 이용할 수 있다 (Huston, et al., Methods in Enzymology, 203:46-88(1991), 및 Whitlow, et al., Protein Eng., 6:989(1993) 참조). 본 발명에 적합한 링커는 주로 글리신 또는 세린 아미노산과 기타 아미노산들로 구성 되며, 그 길이는 2-5 아미노산이 바람직하다. 본 발명의 실시예에서는 2개의 Gly 잔기로 이루어진 링커를 사용하였다.
본 발명의 다른 태양에 따르면, 본 발명은 상기 본 발명에 따른 암표적 세포사 유도 융합 펩타이드를 암호화하는 DNA 또는 RNA 올리고뉴클레오티드를 제공한다. 상기 DNA 또는 RNA 올리고뉴클레오티드는 암표적 세포사 유도 융합 펩타이드를 암호화하는 코돈을 기초로 DNA 또는 RNA 올리고뉴클레오티드를 자동합성기에서 화학합성하여 제조될 수 있다. 합성된 유전자의 PCR 증폭 또는 전사를 통해 제조할 수 있다.
본 발명의 다른 태양에 따르면, 상기 본 발명에 따른 DNA 올리고뉴클레오티드를 포함하는 재조합벡터, 및 상기 재조합벡터로 형질전환된 세포를 제공한다. 상기 재조합 벡터는 당업계에 알려진 방법에 따라 플라스미드 또는 바이러스 벡터에 DNA 올리고뉴클레오티드를 삽입하여 제조될 수 있다. 벡터를 제작하기 위해 이용되는 방법은 당업자에게 널리 공지되고 다양한 공개문에 기술되어 있다. 특히, 기능 및 조절 성분, 예를 들어 프로모터, 인핸서, 종결 및 폴리아데닐화 시그널, 선별 마커, 복제 오리진 및 스플라이싱 시그널을 포함한 적합한 벡터를 제작하기 위한 기술이 당업자에게 공지되어 있다. 진핵세포 발현 벡터는 통상적으로 세균에서의 벡터의 증식을 촉진하는 원색세포 서열, 예를 들어 복제 오리진 및 세균에서의 선별을 위한 항생제 내성 유전자도 포함할 것이다. 폴리뉴클레오타이드가 작동가능하게 연결될 수 있는 클로닝 부위를 포함하는 다양한 진핵세포 발현 벡터가 당업자에게 널리 공지되어 있으며, 일부는 회사 (예: Stratagene, La Jolla, CA; Invitrogen, Carlsbad, CA; Promega, Madison, WI; 또는 BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA)로부터 시판된다.
본 발명의 다른 태양에 따르면, 본 발명은 상기 본 발명에 따른 형질전환된 세포를 배양하고, 상기 배양된 세포로부터 암표적 세포사 유도 융합 펩타이드를 분리하는 것을 포함하는 암표적 세포사 유도 융합 펩타이드의 제조방법를 제공한다.
본 발명의 다른 태양에 따르면, 본 발명은 고분자 지지체에 본 발명에 따른 CTD(R1~R7)-Linker-CKP 혹은 CKP-Linker-CTD(R1~R7) 형태로 배열된 아미노산을 순차적으로 결합시킨 후 최종적으로 고분자 지지체에서 유리시키는 것을 포함하는 고체상합성법(Solid Phase Peptide Synthesis)에 따라 화학적으로 합성하는 암표적 세포사 유도 융합 펩타이드의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 다른 태양에 따르면, 본 발명은 상기 본 발명에 따른 암표적 세포사 유도 융합 펩타이드를 항원으로 생산된 항체를 제공한다.
폴리클로날 항체는 당업자에 알려진 종래방법에 따라 면역원인 암표적 세포사 유도 융합 펩타이드을 외부 숙주에 주사함으로써 제조될 수 있다. 외부 숙주는 마우스, 래트, 양, 토끼와 같은 포유동물을 포함한다. 면역원은 근내, 복강내 또는 피하 주사방법으로 주사되며, 일반적으로 항원성을 증가시키기 위한 보조제(adjuvant)와 함께 투여된다. 외부숙주로부터 정기적으로 혈액을 채취하여 향상된 역가 및 항원에 대한 특이성을 보이는 혈청을 수거하거나 이로부터 항체를 분리정제한다. 모노클로날 항체는 당업자에 알려진 융합에 의한 불멸화된 세포주 생성기술(Koeher and Milstein (1975) Nature, 256:495))에 의해 제조될 수 있다. 그 제조방법을 간단히 설명하면, 먼저 암표적 세포사 유도 융합 펩타이드를 합성하여 소혈청 알부민과 결합시켜 쥐에 면역화 시킨다. 그 후에 쥐에서 분리된 항원-생산 임파구를 인간 또는 마우스의 미엘로마와 융합하여 불멸화된 하이브리도마를 생성하며, 엘라이져(ELISA)방법을 사용하여 원하는 모노클노날 항체를 생성하는 하이브리도마 세포만을 선택하여 증식한 후 배양물로부터 모노클로날 항체를 분리 정제한다.
본 발명의 다른 태양에 따르면, 본 발명은 상기 본 발명에 따른 암표적 세포사 유도 융합 펩타이드에 PEG가 결합된 것을 특징으로 하는 암표적 세포사 유도 융합 펩타이드의 PEG 변이체를 제공한다. 상기 PEF 변이체는 종래 알려진 Pegylation방법에 따라 암표적 세포사 유도 융합 펩타이드에 PEG(polyethylene glycol)을 결합시킴으로써 제조될 수 있다. 예를 들어, 혈액 내 순환시 안정성 향상과 면역원성의 감소를 위해, 암표적 세포사 유도 융합 펩타이드의 N-terminus의 α-아민기에 mPEG aldehyde를 solid-phase PEGylation 시킬 수 있다.
가장 바람직한 구체예로서, 본 발명은 암세포 표적 펩타이드 아미노산 서열 RPARPAR(Arg-Pro-Ala-Arg-Pro-Ala-Arg) 과 세포사 유도 펩타이드 아미노산 서열 KLLNLISKLF(Lys-Leu-Leu-Asn-Leu-Ile-Ser-Lys-Leu-Phe)을 가진다(도 1). 본 발명의 세포사 유도 펩타이드와 암세포 표적 펩타이드를 융합한 세포사 유도 CKP 융합 펩타이드(CTD7:CKP)는 고분자 지지체에 아미노산을 순차적으로 결합시킨 후 최종적으로 고분자 지지체에 유리시켜 고순도로 펩타이드를 제조할 수 있는 고체상합성법(Solid Phase Peptide Synthesis)에 따라 화학적으로 합성할 수 있다. 또한, 상기 펩타이드를 코딩하는 올리고뉴클레오티드를 자동 합성기에서 합성하거나 Noxa 유전자의 염기서열(NCBI GenBank number: NM_021127)로부터 MTD 도메인(41-50)을 코딩하는 염기서열을 선택적으로 PCR(polymerase chain reaction) 증폭하여 적당한 벡터에 삽입한 후 in vivo에서 전사(transcription) 및 번역(translation)을 거쳐 발현, 정제하여 제조할 수도 있다.
본 발명의 의약적 합성 펩타이드는 암세포 치료에 사용되는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 의약적 합성 펩타이드는 약제학적 분야에서 공지의 방법에 의해 제조될 수 있으며, 융합 단백질 그 자체 또는 약학적으로 허용되는 담체, 부형제, 희석제 등과 혼합하여 분말, 과립, 정제, 캡슐제, 또는 주사제 등의 제형으로 제조되어 사용될 수 있다. 또한 이들은 비경구로 투여될 수 있다. 본 발명의 의약적 조성물을 투여하는 투여량은 환자의 연령, 성별, 상태, 질병의 증상에 따라 적절히 선택될 수 있으며, 바람직하게는 성인 암환자를 기준으로 1일 1-100mg(유효성분)의 양으로 투여될 수 있다.
본 발명에서는 세포사 유도 CKP 펩타이드가 암세포 표적 펩타이드와 융합되었을 때 강력하게 암세포주의 세포사를 일으킬 수 있으며 mouse tumor model에서 강력한 암 소멸(tumor regression)효과를 나타내는 것을 증명하였다. 이러한 세포사가 어떠한 경로를 통해서 이루어지는지에 대해서는 아직까지 알려져 있지 않으나, 통상적인 아팝토시스 보다 훨씬 강력한 세포사멸효과를 나타낸다.
도 1은 암세포 표적 펩타이드(CTD: cancer targeting domain)도메인과 세포사 유도 펩타이드(CKP: cell killing peptide)를 융합한 본 발명의 세포사 유도 CKP 융합 단백질(CTD7:CKP)의 개략도이다. A는 N-terminal에 CTD 도메인과 C-terminal에 CKP 도메인을 융합한 것이다. B는 N-terminal에 CKP 도메인과 C-terminal에 CTD 도메인을 융합한 것이다.
도 2는 생쥐 결장암 세포주인 CT-26에서 다양한 세포사 유도 CKP 융합 단백질(CTD1:CKP 내지 CTD12:CKP) 의 세포괴사 유도 활성을 나타낸 그림이다.
도 3은 생쥐 결장암 세포주인 CT-26에서 다양한 세포사 유도 CKP 융합 단백질(CTD13:CKP 내지 CTD19:CKP) 의 세포괴사 유도 활성을 나타낸 그림이다.
도 4은 실험동물을 이용한 mouse tumor model에서 다양한 세포사 유도 CKP 융합 단백질들의 암 소멸(tumor regression) 효과를 나타낸 그림이다.
도 5는 인간 자궁경부암 세포주인 HeLa 및 인간 결장암 세포주인 HCT116에서 세포사 유도 CKP 융합 단백질(CTD7:CKP)의 세포괴사 유도 증가 효과를 나타낸 그림이다.
도 6는 인간 유방암 세포주인 MCF-7 및 인간 폐암 세포주인 A549 에서 세포사 유도 CKP 융합 단백질(CTD7:CKP)의 세포괴사 유도 증가 효과를 나타낸 그림이다.
도 7은 인간 B-림프종 세포주인 BJAB 및 생쥐 전립선암 세포주인 PC3 에서 세포사 유도 CKP 융합 단백질(CTD7:CKP)의 세포괴사 유도 증가 효과를 나타낸 그림이다.
도 8은 정상세포인 일차 복강 거식세포 및 비장세포에서 세포사 유도 CKP 융합 단백질(CTD7:CKP)의 세포괴사 유도 증가 효과를 나타낸 그림이다.
도 9은 실험동물을 이용한 mouse tumor model에서 세포사 유도 CKP 융합 단백질(CTD7:CKP)의 암소멸 전략의 개략도이다.
도 10는 mouse tumor model에서 세포사 유도 CKP 융합 단백질(CTD7:CKP)의 암 소멸(tumor regression) 효과를 나타낸 그림이다.
도 11은 세포사 유도 CKP 융합 단백질(CTD7:CKP)의 간 손상시 혈액으로 유리되는 ALT 및 AST의 양을 측정한 그림이다.
도 12은 세포사 유도 CKP 융합 단백질의 암 소멸 효과를 시간별로 조직학적으로 관찰한 그림이다.
도 13은 세포사 유도 CKP 융합 단백질에 의한 정상세포의 세포 독성을 평가하기 위해 간(liver)을 시간별로 조직학적으로 관찰한 그림이다.
도 14는 CKP 펩타이드의 변이체에 의한 세포사 유도 실험 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 생쥐 결장암 세포주인 CT-26에서 다양한 세포사 유도 CKP 융합 단백질(CTD1:CKP 내지 CTD12:CKP) 의 세포괴사 유도 활성을 나타낸 그림이다.
도 3은 생쥐 결장암 세포주인 CT-26에서 다양한 세포사 유도 CKP 융합 단백질(CTD13:CKP 내지 CTD19:CKP) 의 세포괴사 유도 활성을 나타낸 그림이다.
도 4은 실험동물을 이용한 mouse tumor model에서 다양한 세포사 유도 CKP 융합 단백질들의 암 소멸(tumor regression) 효과를 나타낸 그림이다.
도 5는 인간 자궁경부암 세포주인 HeLa 및 인간 결장암 세포주인 HCT116에서 세포사 유도 CKP 융합 단백질(CTD7:CKP)의 세포괴사 유도 증가 효과를 나타낸 그림이다.
도 6는 인간 유방암 세포주인 MCF-7 및 인간 폐암 세포주인 A549 에서 세포사 유도 CKP 융합 단백질(CTD7:CKP)의 세포괴사 유도 증가 효과를 나타낸 그림이다.
도 7은 인간 B-림프종 세포주인 BJAB 및 생쥐 전립선암 세포주인 PC3 에서 세포사 유도 CKP 융합 단백질(CTD7:CKP)의 세포괴사 유도 증가 효과를 나타낸 그림이다.
도 8은 정상세포인 일차 복강 거식세포 및 비장세포에서 세포사 유도 CKP 융합 단백질(CTD7:CKP)의 세포괴사 유도 증가 효과를 나타낸 그림이다.
도 9은 실험동물을 이용한 mouse tumor model에서 세포사 유도 CKP 융합 단백질(CTD7:CKP)의 암소멸 전략의 개략도이다.
도 10는 mouse tumor model에서 세포사 유도 CKP 융합 단백질(CTD7:CKP)의 암 소멸(tumor regression) 효과를 나타낸 그림이다.
도 11은 세포사 유도 CKP 융합 단백질(CTD7:CKP)의 간 손상시 혈액으로 유리되는 ALT 및 AST의 양을 측정한 그림이다.
도 12은 세포사 유도 CKP 융합 단백질의 암 소멸 효과를 시간별로 조직학적으로 관찰한 그림이다.
도 13은 세포사 유도 CKP 융합 단백질에 의한 정상세포의 세포 독성을 평가하기 위해 간(liver)을 시간별로 조직학적으로 관찰한 그림이다.
도 14는 CKP 펩타이드의 변이체에 의한 세포사 유도 실험 결과를 나타낸 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
1. 시약
시약은 다음의 것을 구입하여 사용하였다.
인체 암세포주인 HeLa, HCT116, A549, MCF-7, BJAB, PC3과 생쥐 암세포주인 CT-26 세포주는 한국세포주은행에서 구입하였고, Dulbecco's Modified Eagle Medium, RPMI-1640 배양액, Trypsin, Fetal bovine serum, Hematoxylin&Eosin 염색시약은 시그마사(Sigma chemical co)에서 구입하였으며, XTT assay kit는 프로메가(Promega)에서 구입 하였다.
2. 동물
실험동물은 생후 6주된 22∼25g의 마우스(BALB/c mouse)를 사용하였고, 사료(purina korea)와 물은 자유롭게 섭취하도록 하였으며, 사육장의 온도는 21∼24℃, 상대습도는 40∼80%로 유지하였다. 또한 12시간마다 낮과 밤이 반복 되도록 사육장내 빛을 조절하였다.
실시예 1 : 펩타이드 합성
본 발명의 세포사 유도 CKP 펩타이드(KLLNLISKLF)를 암 조직을 targetting할 것으로 예상되는 수많은 암세포 표적 펩타이드들과 융합하여 세포사 유도 CKP 융합 펩타이드를 합성하였다. 펩타이드 합성은 0.25 mmol를 단위로 하는 수동 Fmoc 합성방법을 기본적으로 이용하였다. 구체적으로 기술하면, 레진을 DMF(4x)로 깨끗이 씻은 후 10 ml의 20% piperidine/DMF 용액을 레진에 넣었다. 1분간 잘 저은 후 위의 용액을 제거하고 다시 10 ml의 20% piperidine/DMF 용액을 레진에 넣었다. 30분 동안 흔들어 준 후 다시 레진을 DMF(4x)으로 씻고 piperidine이 남아 있지 않았음을 ninhydrin test를 하여 확인하였다(레진이 파란색이 되어야 한다). Coupling 단계를 진행하기 위해 아래의 용액을 준비하였다: 1 mmol Fmoc-amino acid, 2.1 ml 0.45 M HBTU/HOBT(1 mmol), 348 μL DIEA(2 mmol). 위의 용액을 레진에 넣고 30분 동안 흔들어 주었다. 용액을 레진에서 따라낸 후 DMF(4x) 넣어 레진을 씻어 주었다. 다음 아미노산을 coupling 시키기 위해 위의 용액을 넣은 후 위의 coupling 단계를 반복하여 세포사 유도 펩타이드와 결합된 형태의 여러 종류의 본 발명의 암세포 표적화 펩타이드를 합성하였다. 이러한 방법으로 합성된 펩타이드는 HPLC(기기: Waters 2690 separations module, Flow rate: 1.0ml/min, Gradient: 0%-20% B 5분; 20%-50% B 20분; 50%-80% B 5분, A; 0.1% TFA water, B; 0.1% TFA acetonitrile, column: Waters C18, 5 micron, Detection: 220 nm, purity: 95%) 그리고 질량 분석(기기: HP 1100 series LC/MSD)을 하였다. 합성된 펩타이드는 물에 1 mM 농도로 녹여 -80℃에 보관하여 사용하였다.
| CTD:CKP 종류 |
서열 번호 |
서열의 형 | 쇄의 수 | 서열종류 | 아미노산 서열 |
| CTD1:CKP | 1 | 아미노산 | 1본쇄 | 펩타이드 | CNGRCGGKLLNLISKLF |
| CTD2:CKP | 2 | 아미노산 | 1본쇄 | 펩타이드 | CGKRKGGKLLNLISKLF |
| CTD3:CKP | 3 | 아미노산 | 1본쇄 | 펩타이드 | KLLNLISKLFGGCGKRK |
| CTD4:CKP | 4 | 아미노산 | 1본쇄 | 펩타이드 | WIFPWIQLKLLNLISKLF |
| CTD5:CKP | 5 | 아미노산 | 1본쇄 | 펩타이드 | RLLRLLRGGKLLNLISKLF |
| CTD6:CKP | 6 | 아미노산 | 1본쇄 | 펩타이드 | KLLNLISKLFGGRLLRLLR |
| CTD7:CKP | 7 | 아미노산 | 1본쇄 | 펩타이드 | RPARPARGGKLLNLISKLF |
| CTD8:CKP | 8 | 아미노산 | 1본쇄 | 펩타이드 | KLLNLISKLFGGRPARPAR |
| CTD9:CKP | 9 | 아미노산 | 1본쇄 | 펩타이드 | RGDRGDLGGKLLNLISKLF |
| CTD10:CKP | 10 | 아미노산 | 1본쇄 | 펩타이드 | KLLNLISKLFGGLGDRGDR |
| CTD11:CKP | 11 | 아미노산 | 1본쇄 | 펩타이드 | WDLAWMFRLPVGKLLNLISKLF |
| CTD12:CKP | 12 | 아미노산 | 1본쇄 | 펩타이드 | CGRDKGPDCKLLNLISKLF |
| CTD13:CKP | 13 | 아미노산 | 1본쇄 | 펩타이드 | KLLNLISKLFCGRDKGPDC |
| CTD14:CKP | 14 | 아미노산 | 1본쇄 | 펩타이드 | KLLNLISKLFCGRDKRLYDC |
| CTD15:CKP | 15 | 아미노산 | 1본쇄 | 펩타이드 | CRGDKGPDCKLLNLISKLF |
| CTD16:CKP | 16 | 아미노산 | 1본쇄 | 펩타이드 | KLLNLISKLFCRGDKGPDC |
| CTD17:CKP | 17 | 아미노산 | 1본쇄 | 펩타이드 | KLLNLISKLFCRGDKRLYDC |
| CTD18:CKP | 18 | 아미노산 | 1본쇄 | 펩타이드 | CRGDKGGKLLNLISKLF |
| CTD19:CKP | 19 | 아미노산 | 1본쇄 | 펩타이드 | KLLNLISKLFGGCRGDK |
실시예
2 :
세포사
유도
CKP
융합
펩타이드의
암세포 괴사 활성 유무 선별 시험
실시예 1에서 제조된 여러 종류의 세포사 유도 CKP 융합 펩타이드들의 세포괴사 유도 활성을 시험하고 선별하기 위하여, 생쥐 결장암 세포주인 CT-26를 배양한 후, 96-well plates에서 배양액을 세포사 유도 CKP 융합 펩타이드(CTD1~CTD10:CKP) 5, 10, 20 μM을 가지고 있는 배양액으로 교체하고 15분 후 XTT방법을 이용하여 세포괴사 유도능을 확인하였다. 도 2 내지 3에서 보여 지듯이, CTD1:CKP 내지 CTD4:CKP에서는 유의성 있는 세포괴사 유도 활성 결과를 얻지 못하였으며, CTD5:CKP 내지 CTD8:CKP에서는 농도 의존적으로 세포괴사 유도 활성이 현저히 증가하였다. 또한, CTD9:CKP 내지 CTD19:CKP에서는 유의성 있는 세포괴사 유도 활성 결과를 얻지 못하였다. 그러나, 암 세포주를 이용한 세포괴사 유도능 실험에서 우수한 세포괴사 유도능을 보이더라도 실제 동물실험에서 독성을 나타내거나 암소멸 효과가 없을수도 있으므로 추가적으로 실험동물에서 암소멸 활성을 실험하였다.
실시예
3 :
세포사
유도
CKP
융합
펩타이드의
암 소멸 활성 실험
실시예1에서 제조된 세포사 유도 CKP 융합 펩타이드들의 암 소멸 활성을 시험하기 위하여, BALB/c mouse에서 대장암 세포주인 CT-26(1.5×105 cells)를 6 주령 BALB/C mouse의 등 쪽에 피하 주사(s.c injection)하고 tumor가 형성되게 하였다. 약 10일 후 tumor가 형성되면 tumor의 크기가 약 70 ± 10 mm3이 되었을 때 암세포 특이 CKP 융합 펩타이드 100 ul (1 mM)를 각각 3마리 생쥐에 연속 2 ~ 3회 (1회/1일) 정맥주사하고 10 ~ 13일 후 암 조직의 크기(length x wide2 x 0.5) 변화를 관찰하였다. 그 결과 대부분의 세포사 유도 CKP 융합 펩타이드에서 암 소멸(Tumor Regression)이 유의성있게 발견되지 않았고 CTD4:CKP, CTD5:CKP, CTD6:CKP, CTD17:CKP에서는 주사한 꼬리가 괴사되어 없어지는 독성(Toxic)이 발견되었고, CTD14:CKP는 주사한 쥐가 사멸(Dead)하였다. 이에 반해 CTD7:CKP를 정맥주사한 실험군에서 암조직의 크기가 완전히 제거되거나, 암조직의 크기 증가가 현저히 저해되는 결과가 관찰되었다.(도 4 참조). 따라서, 암 세포주를 이용한 세포괴사 유도능 실험에서 탁월할 뿐만 아니라 암소멸 활성도 뛰어나며 실험동물에 아무런 독성을 나타내지 않는 CTD7:CKP를 선별하여 본 발명을 완성하였다. 표 2는 In vivo screening summary를 나타낸 것이다.
Movement activity는 CTD:CKP 75 ul (1 mM)를 BalB/C mouse(약 20 gm)에 i.v. 주사한 후 10 ~ 30 분 동안 mouse의 움직임을 관찰함.
NR: no regression (튜머 크기 축소가 없다), ND: not determined
실시예
4 :
세포사
유도
CKP
융합
펩타이드(CTD7:CKP)의
인간
암세포사
활성 실험
실시예 3에서 선별된 세포사 유도 CKP 융합 펩타이드(CTD7:CKP)의 세포괴사 유도 활성 시험을 인간 암세포주(HeLa, HCT116, MCF7, A549, BJAB, PC3)를 이용하여 실시하였다.
자궁경부암 세포주인 HeLa 세포 및 인간 결장암 세포주인 HCT116 세포를 배양한 후, 96-well plates에서 배양액을 세포사 유도 CKP 융합 펩타이드(CTD7:CKP) 5, 10, 20 μM을 가지고 있는 배양액으로 교체하고 15분 후 XTT방법을 이용하여 세포괴사 유도능을 확인하였다. 도 5에서 보여 지듯이, HeLa 세포의 경우 처리 농도 20 μM에서 33%세포괴사 유도 활성을 보였으며 HCT116 세포의 경우 처리 농도 20 μM에서 44% 세포괴사 유도 활성을 보였다.
인간 유방암 세포주인 MCF-7 및 인간 폐암 세포주인 A549 세포를 배양한 후, 96-well plates에서 배양액을 세포사 유도 CKP 융합 펩타이드(CTD7:CKP) 5, 10, 20 μM을 가지고 있는 배양액으로 교체하고 15분 후 XTT방법을 이용하여 세포괴사 유도능을 확인하였다. 도 6에서 각각 보여 지듯이, MCF-7 세포의 경우 처리 농도 20 μM에서 43.2%세포괴사 유도 활성을 보였으며 A549 세포의 경우 처리 농도 20 μM에서 44% 세포괴사 유도 활성을 보였다.
인간 B-림프종 세포주인 BJAB 및 인간 전립선암 세포주인 PC3 세포를 배양한 후, 96-well plates에서 배양액을 세포사 유도 CKP 융합 펩타이드(CTD7:CKP) 5, 10, 20 μM을 가지고 있는 배양액으로 교체하고 15분 후 XTT 방법을 이용하여 세포괴사 유도능을 확인하였다. 도 7에서 보여 지듯이, BJAB 세포의 경우 처리 농도 20 μM에서 27% 세포괴사 유도 활성을 보였으며 PC3 세포의 경우 처리 농도 20 μM에서 31% 세포괴사 유도 활성을 보였다.
실시예
5 :
세포사
유도
CKP
융합
펩타이드(CTD7:CKP)의
정상세포 괴사 활성 실험
실시예 3에서 선별된 세포사 유도 CKP 융합 펩타이드(CTD7:CKP)의 정상 세포에서의 세포괴사 유도능을 시험하기 위하여, BALB/c mouse의 일차 복강 거식세포(peritoneal macrophages) 및 비장세포(splenocytes)를 분리하였다.
일차 복강 거식세포는 4%(w/v) fluid thioglycollate medium을 3일 동안 복강주사(i.p injection)하고 RPMI 1640 media에 세포를 수합한 다음 96-well에 2시간 동안 37℃ 5% CO2 incubator에서 안정화 시켰다. 세포사 유도 CKP 융합 펩타이드(CTD7:CKP) 5, 10, 20 μM을 가지고 있는 배양액으로 교체하고 15분 후 XTT 방법을 이용하여 세포괴사 유도능을 확인하였다. 그 결과, 도 8에서 보여 지듯이, 세포사 유도 CKP 융합 펩타이드(CTD7:CKP)는 정상세포인 일차 복강 거식세포에서는 유의성 있는 세포사 유도 활성을 보이지 않았다.
비장세포(splenocytes)는 cell culture dish에 compelete RPMI media를 넣고 male mouse 비장을 분리하여 조직을 으깬 후 원심분리 수행하였다. Pellet을 media로 한 번 washing 한 후 다시 원심분리하고 ACK lysis buffer(0.15 M NH4Cl, 1 M KHCO3, 0.01 M Na2EDTA, pH 7.2-7.4)를 처리하고 다시 원심분리하고 pellet을 5% FBS가 함유된 compelete RPMI media를 이용하여 비장세포를 일차배양 한 후 세포사 유도 CKP 융합 펩타이드(CTD7:CKP) 5, 10, 20 μM을 가지고 있는 배양액으로 교체하고 15분 후 XTT 방법을 이용하여 세포괴사 유도능을 확인하였다. 그 결과, 도 8에서 보여 지듯이, 세포사 유도 CKP 융합 펩타이드(CTD7:CKP)는 정상세포인 비장세포에서는 유의성 있는 세포사 유도 활성을 보이지 않았다.
실시예
6 :
세포사
유도
CKP
융합
펩타이드(CTD7:CKP)의
암 소멸 활성 실험
실시예1에서 제조된 세포사 유도 CKP 융합 펩타이드(CTD7:CKP)의 암 소멸 활성을 시험하기 위하여, 도 9에서 보여 지듯이, BALB/c mouse에서 대장암 세포주인 CT-26(1.5×105 cells)를 6 주령 BALB/C mouse의 등 쪽에 피하 주사(s.c injection)하고 tumor가 형성되게 하였다. 약 10일 후 tumor가 형성되면 tumor의 크기가 약 70 ± 10 mm3이 되었을 때 암세포 특이 CKP 융합 펩타이드(CTD7:CKP)를 2일 정맥주사하고 3일 간격으로 3회 정맥주사 하여 210μg/mouse가 되도록 하였으며, 15일 후 암 조직의 크기(length x wide2 x 0.5) 변화를 관찰하였다. 그 결과 세포사 유도 CKP 융합 펩타이드(CTD7:CKP)를 정맥주사한 실험군에서 암조직의 크기가 크게 줄어드는 반면 대조군에서는 암조직의 크기가 계속 증가하였다(도. 10).
실시예
7 :
세포사
유도
CKP
융합
펩타이드(CTD7:CKP)의
간세포 독성 실험
세포사 유도 CKP 융합 펩타이드(CTD7:CKP)의 독성을 확인하기 위하여 간 손상 시 간 세포에서 혈액으로 유리되는 alanine amino transferase(ALT) 및 asparate amino transferase(AST)의 양을 측정하여 간세포 손상 여부를 확인함으로써 세포사 유도 CKP 융합 펩타이드에 의한 독성여부를 판단하였다. 도 11에서 보여 지듯이 CTD7:CKP를 처리하지 않은 대조군에서 분리한 혈액과 CTD7:CKP를 처리한 후 시간별로 분리한 혈액에서 간 손상 지표인 AST 및 ALT의 차이를 확인할 수 없었다.
실시예
8 :
세포사
유도
CKP
융합
펩타이드의
시간에 따른 조직학적 변화 실험
세포사 유도 CKP 융합 펩타이드(CTD7:CKP)의 암 소멸 활성에 따른 암 조직의 시간에 따른 조직학적 변화를 확인하기 위하여, CTD7:CKP을 꼬리 정맥 주사 30분, 2시간, 2일, 8일, 15일 후 실험동물의 암 조직을 적출하여 4% formaldehyde에 넣고 4℃에서 고정시켰다. Gloss과정을 거친 후 조직의 탈수(dehydration)-투명(clearing)-침투(impregnation)-포매(embedding)과정을 tissue processor(SAKURA tissue tek, VIP-5Jr-J2)를 이용하여 진행하였으며, embedding center에서 block 제작 후 -20℃에서 보관하였다. Microtome(LEICA, RM2135)으로 조직을 serial section(3 μm)을 한 후 리본을 항온수조에 띄운 후 슬라이드에 붙였다. 슬라이드를 말리고 파라핀 제거과정과 함수과정을 진행하였다. 탈파라핀-탈수-Hematoxylin&eosin 염색-함수과정을 거친 후 비 수용성 봉입제(malinol)로 봉입하였다. 공기 중에서 말린 후 cover glass를 씌우고 현미경(Olympusoptical.Co.LTD, V-MD010B)과 Magna fire-SP 프로그램을 이용하여 병리학적으로 관찰하였다. 도 12에서 보여 지듯이, 세포사 유도 CKP 융합 펩타이드(CTD7:CKP)를 정맥 주사한 실험군의 암 조직에서 시간 변화에 따라 강력한 세포사가 유도됨을 확인하였으나 대조군에서는 암조직의 세포사 유도 활성을 확인할 수 없었다.
실시예
9 :
세포사
유도
CKP
융합
펩타이드의
정상조직(
liver
)의
독성여부
실험
간 조직의 독성정도를 평가하기 위해 실시예 8과 같은 방법으로 간 조직절편을 제작한 다음 병리학적으로 관찰하였다. 무 처치군인 normal mice군과 tumor가 생성된 군에 0.85% normal saline을 정맥 주사한 군 및 세포사 유도 CKP 융합 펩타이드를 시간별로 정맥주사 한 군으로 나누어 확인한 결과 도 13에서 보여 지듯이 유의성 있는 손상을 확인할 수 없었다.
실시예
10:
CKP
펩타이드의
변이체에
의한
세포사
유도 실험
본 발명의 CKP 펩타이드(서열번호 21: KLLNLISKLF) 중 일부의 아미노산을 치환한 변이체도 세포사 유도 활성을 나타내는지를 알아보기 위해, 종래 알려진 단백질 운반 도메인(PTD)인 RRRRRRRRG(RQ)서열에 연결된 1 내지 3 개의 아미노산 잔기가 치환된 CKP 펩타이드의 변이체 CKP2(1개 치환)(서열번호 22: KALNLISKLF), CKP3(2개 치환)(서열번호 23: KLAALISKLF), CKP4(2개 치환)(서열번호 24: KLLNLIAALF), CKP5(3개 치환)(서열번호 25: KALNLIAALF)를 실시예1의 방법에 따라 합성하였다. 또한, CKP에서 반복적으로 나타나는 서열인 루이신의 치환에 대한 영향을 알아보기 위하여, 단백질 운반 도메인(PTD)인 RRRRRRRRG(RQ)서열에 연결된 CKP 펩타이드의 변이체 CKP6(2,3번째 L을 A로 치환)(서열번호 26: KAANLISKLF), CKP7(5번째 L을 A로 치환)(서열번호 27: KLLNAISKLF), CKP8(9번째 L을 A로 치환)(서열번호 28: KLLNLISKAF)을 실시예1의 방법에 따라 합성하였다. 이들 변이체들의 세포사 유도 활성을 시험하기 위하여, 자궁경부암 세포주인 HeLa 세포를 배양한 후, 배양액을 CKP 펩타이드를 0, 1, 5, 10, 15, 20, 30, 40 μM을 가지고 있는 배양액으로 교체한 후 24시간 더 배양하였다. 바닥에 붙어 있는 살아있는 세포를 염색하기 위해 100 μl 0.5% crystal violet 용액으로 10분간 염색하였다. 배양액에 떠있는 죽은 세포를 제거하는 것과 동시에 crystal violet 용액의 탈 염색을 위해 증류수 또는 수돗물로 깨끗이 씻어 냈다. 배양 용기를 형광등박스에 놓고 카메라로 사진을 찍은 결과를 도 14에 도시하였다. cyrstal violet으로 염색된 파란색은 바닥에 붙어 있는 살아 있는 세포를 나타내는 것이다. 도 14에서 보여지듯이, CKP2, CKP3, CKP5 펩타이드는 CKP 펩타이드에 비해 세포사 유도 능력이 약간 감소하였으나, CKP4 펩타이드는 CKP 펩타이드보다 오히려 우수한 세포사 능력을 보여주었다. 또한, 루이신이 치환된 CKP6, CKP7, CKP8 펩타이드는 CKP 펩타이드에 비해 세포사 유도 능력이 많이 감소하여, 이들 루이신 서열이 CKP의 세포사 능력에 중요한 역할을 하는 영역임을 알 수 있었다.
상술한 바와 같이 세포사 유도 융합 펩타이드의 암세포의 괴사 및 tumor model에서 암 소멸을 유도 활성을 이용한 세포사를 요하는 각종 질환의 치료, 특히 항암제로서 유용하게 사용될 수 있다.
서열목록 전자파일 첨부
Claims (12)
- 다음 암세포 표적 도메인(CTD; R1~R7)과 세포사 유도 펩타이드(CKP)와 그사이의 링커(Liner) 서열을 포함하고, CTD(R1~R7)-Linker-CKP 혹은 CKP-Liner-CTD(R1~R7) 형태로 배열된 것을 특징으로 하는 암 표적 세포사 유도 융합 펩타이드:
(a) Arg-Xaa-Xaa-Arg-Xaa-Xaa-Arg로 표시되는 아미노산 서열로 구성된 암세포 표적 도메인(CTD; R1~R7);
(b) 서열번호 21 (KLLNLISKLF), 서열번호 22 (KALNLISKLF), 서열번호 23 (KLAALISKLF), 서열번호 24 (KLLNLIAALF), 및 서열번호 25 (KALNLIAALF)로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열로 구성된 세포사 유도 펩타이드(CKP); 및,
(c) n=0 ~ 5의 아미노산 서열을 갖는 링커(Liner).
- 제 1항에 있어서, 상기 암세포 표적 도메인(CTD; R1~R7)은 서열번호 20 (RPARPAR)의 아미노산 서열로 구성된 것을 특징으로 하는 암표적 세포사 유도 융합 펩타이드.
- 삭제
- 삭제
- 제1항에 있어서, 상기 링커(Liner)는 글리신 또는 세린 아미노산을 포함하는 n=2 ~ 5의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 암표적 세포사 유도 융합 펩타이드.
- 제1항, 제2항 또는 제5항중 어느 한항에 따른 암표적 세포사 유도 융합 펩타이드를 암호화하는 DNA 또는 RNA 올리고뉴클레오티드.
- 제6항에 따른 DNA 올리고뉴클레오티드를 포함하는 재조합벡터.
- 제7항에 따른 재조합벡터로 형질전환된 세포.
- 제8항에 따른 형질전환된 세포를 배양하고, 상기 배양된 세포로부터 암표적 세포사 유도 융합 펩타이드를 분리하는 것을 포함하는 암표적 세포사 유도 융합 펩타이드의 제조방법.
- 고분자 지지체에 제1항, 제2항, 또는 제5항중 어느 한항에 따른 CTD(R1~R7)-Linker-CKP 혹은 CKP-Linker-CTD(R1~R7) 형태로 배열된 아미노산을 순차적으로 결합시킨 후 최종적으로 고분자 지지체에서 유리시키는 것을 포함하는 고체상합성법(Solid Phase Peptide Synthesis)에 따라 화학적으로 합성하는 암표적 세포사 유도 융합 펩타이드의 제조방법.
- 제1항, 제2항, 또는 제5항중 어느 한항에 따른 암표적 세포사 유도 융합 펩타이드를 항원으로 생산된 항체.
- 제1항, 제2항, 또는 제5항중 어느 한항에 따른 암표적 세포사 유도 융합 펩타이드에 PEG가 결합된 것을 특징으로 하는 암표적 세포사 유도 융합 펩타이드의 PEG 변이체.
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