CN113121668A

CN113121668A - PEG修饰的可抑制gp96的多肽、其制备方法及用途

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Publication number: CN113121668A
Application number: CN202010024127.2A
Authority: CN
Inventors: 胡俊; 孟颂东; 杨哲; 吴飙; 杨博
Original assignee: Beijing Kangming Haihui Biological Technology Co ltd
Current assignee: Beijing Kangming Haihui Biological Technology Co ltd
Priority date: 2020-01-10
Filing date: 2020-01-10
Publication date: 2021-07-16
Also published as: WO2021139315A1; US20230067805A1

Abstract

本发明涉及生物医药领域，特别涉及PEG修饰的可抑制gp96的多肽、其制备方法及用途。具体地，本发明涉及PEG化多肽，包含通过共价键连接的PIBC以及平均分子量为20000～40000的PEG。本发明还涉及制备所述PEG化多肽的方法，包含所述PEG化多肽的药物或制剂，以及所述PEG化多肽的用途。

Description

PEG修饰的可抑制gp96的多肽、其制备方法及用途

技术领域

本发明涉及生物医药领域，特别涉及PEG修饰的可抑制gp96的多肽、其制备方法及用途。

背景技术

乳腺癌是中国女性发病率最高的癌症类型，其发病率正以每年3％的速度递增，成为城市中死亡率增长最快的癌症。尽管目前的乳腺癌药物非常多，但也存在一定的局限性，其中最为显著的就是三阴性乳腺癌治疗药物的缺乏。三阴性乳腺癌(triple negativebreast cancer,TNBC)是指雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)和人表皮生长因子受体2(Her-2)均为阴性的乳腺癌，约占乳腺癌病理类型的15％-20％，是一种恶性程度很高的肿瘤，目前治疗手段和药物极其有限，缺乏治疗靶点和靶向药物，亟需发现新的潜在靶标。

通过对80名乳腺癌患者肿瘤组织的免疫组化检测发现，大约有70％的患者乳腺癌细胞膜上高表达热休克蛋白gp96，其中包括大部分的三阴性乳腺癌患者，而正常细胞膜表面均不表达gp96，因此胞膜gp96可作为三阴性乳腺癌分子标志物以及潜在的治疗靶点。在此基础上，基于gp96氨基酸序列及空间构象，设计了含有α-螺旋序列的多肽，代号为PIBC。该多肽能与gp96特异结合，阻断gp96分子内部基序重排和构象变化，进而干扰胞膜gp96与HER-2、uPAR、ER-a36的相互作用并引起这些肿瘤蛋白的内吞和降解(中国专利ZL201110159487.4)。体外细胞实验和体内荷瘤小鼠试验均发现，该多肽药物有效抑制三阴性乳腺癌生长、促进细胞凋亡，同时抑制肿瘤侵袭和转移，显示该多肽可作为靶向三阴性乳腺癌的候选药物。

虽然该多肽作用位点专一，但刺激性强、溶解度低、免疫原性高、易被蛋白酶降解和被肾脏清除，这些缺陷严重地制约了其临床应用。

发明内容

本发明所要解决的技术问题之一至少在于，如何降低PIBC的毒性和刺激性，改善其溶血性，延长PIBC的半衰期，以使PIBC更加安全、有效。发明人发现，使用聚乙二醇(PEG)修饰PIBC可以实现上述效果，由此提供了下述发明。

PEG化多肽

在一个方面，本申请提供了一种PEG化多肽，包含PIBC以及平均分子量(数均分子量(Mn))为大约20000～40000的PEG，并且PIBC与所述PEG共价连接，其中，PIBC选自：

A1)：具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的多肽；和

A2)：由A1)衍生的且具有与A1)相同功能的多肽，其氨基酸序列与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列相比，具有一个或多个(例如1-10个或1-5个或1-3个)氨基酸残基的置换(例如保守置换)和/或缺失和/或添加，或者具有至少60％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％的同一性。

在某些实施方案中，所述PEG连接在PIBC的N端或C端。

在某些实施方案中，所述PEG为直链PEG或枝化PEG。

在某些实施方案中，所述PEG的平均分子量为大约20000～25000、25000～30000、30000～35000或35000～40000，例如大约20000、21000、22000、23000、24000、25000、26000、27000、28000、29000、30000、31000、32000、33000、34000、35000、36000、37000、38000、39000或40000。

本发明的PEG化多肽中，PIBC与PEG可以通过连接基团共价连接，也可以直接通过共价键连接。

在某些实施方案中，所述PEG化多肽具有如下结构：

R-(CH₂CH₂O)_n-linker-PIBC；

其中，n为PEG的聚合度，且n满足使PEG的分子量为大约20000～40000的条件，R为PEG的端基，例如为甲氧基；linker为连接基团，例如

所述氨基酸残基为带有巯基的氨基酸(例如半胱氨酸(Cys))残基。

在某些实施方案中，所述PEG化多肽具有如式I所示的结构：

式I中，n为PEG的聚合度，且n满足使PEG的分子量为大约20000～40000的条件。

在某些实施方案中，式I中，Cys与PIBC通过Cys的羧基与PIBC的N末端氨基形成的肽键相连，或通过Cys的氨基与PIBC的C末端羧基形成的肽键相连。

在某些实施方案中，所述共价连接通过利用反应物1与反应物2进行Michael加成反应实现，其中，所述反应物1为一端连接有马来酰亚胺的PEG，所述反应物2为N端或C端引入含有巯基的氨基酸残基的PIBC。Michael加成反应发生在马来酰亚胺与巯基之间。

在某些实施方案中，所述反应物1具有如式II所示的结构：

式II中，n为PEG的聚合度，且n满足使PEG的分子量为20000～40000的条件。所述反应物1可被称为甲氧基聚乙二醇马来酰亚胺(mPEGxMal，其中，x为PEG的平均分子量；Mal表示马来酰亚胺，马来酰亚胺修饰在PEG的一端；m表示甲氧基)。

在某些实施方案中，反应物2中，所述含有巯基的氨基酸残基为半胱氨酸残基。在某些实施方案中，所述反应物2为具有SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示氨基酸序列的多肽。

制备PEG化多肽的方法

在一个方面，本申请提供了制备本发明的PEG化多肽的方法，包括使PIBC与平均分子量为大约20000～40000的PEG发生共价连接的步骤。

在某些实施方案中，所述方法包括：利用反应物1与反应物2进行Michael加成反应的步骤；所述反应物1为一端连接有马来酰亚胺的PEG；所述反应物2为N端或C端引入含有巯基的氨基酸残基的PIBC。所述Michael加成反应发生在马来酰亚胺与巯基之间。

在某些实施方案中，所述反应物1或反应物2如上文所定义。

在某些实施方案中，所述Michael加成反应在pH值为大约7.2-7.6的条件下进行。在某些实施方案中，所述Michael加成反应在NaH₂PO₄缓冲溶液中进行。

在某些实施方案中，所述Michael加成反应在室温(例如20～30℃)下进行。

在某些实施方案中，反应物1相对于反应物2是过量的。在某些实施方案中，反应物1与反应物2的起始摩尔比为大约2-10:1。

在某些实施方案中，所述方法还包括对反应产物进行纯化的步骤。在某些实施方案中，所述纯化通过色谱(例如离子交换色谱或高效液相色谱)实现。

药物组合物、制剂、用途

在一个方面，本申请提供了含有本发明的PEG化多肽的药物组合物。在某些实施方案中，所述药物组合物用于治疗和/或预防受试者的与gp96蛋白过度表达相关的疾病。

本发明的药物组合物可以进一步包含一种或多种药用载体。可用于本发明的药用载体包括但不限于填充剂、稀释剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、润滑剂、表面活性剂、防腐剂、着色剂、矫味剂、芳香剂、泡腾剂、乳化剂、絮凝剂、反絮凝剂、抑菌剂、增溶剂。在某些实施方案中，所述药用载体选自：离子交换剂、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂、血清蛋白(例如人血清蛋白)、甘油、山梨酸、山梨酸钾、水、硫酸鱼精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐、胶态氧化硅、三硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素物质、聚乙二醇、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸酯、蜂蜡、聚乙烯-聚氧丙烯嵌段聚合物、羊毛脂及其任意组合。

本发明的药物组合物可被制成各种合适的剂型，包括但不限于：口服剂型、注射剂型(例如适于皮下注射、肌肉注射或静脉注射的剂型)、吸入剂型、粘膜给药剂型或者局部给药剂型。在某些实施方案中，所述药物组合物被制成口服剂型，例如片剂、胶囊剂、颗粒剂、口服溶液、口服混悬液、微丸剂或微片剂。

在一个方面，本申请提供了本发明的PEG化多肽在制备药物中的用途，所述药物用于治疗和/或预防受试者的与gp96蛋白过度表达相关的疾病(例如肿瘤)。

在一个方面，本申请提供了含有本发明的PEG化多肽的制剂。在某些实施方案中，所述制剂用于与gp96蛋白结合，抑制肿瘤细胞增殖和/或生长和/或侵袭，促进肿瘤细胞凋亡，和/或，抑制肿瘤生长。

在一个方面，本申请提供了本发明的PEG化多肽在制备制剂中的用途，所述制剂用于与gp96蛋白结合，抑制肿瘤细胞增殖和/或生长和/或侵袭，促进肿瘤细胞凋亡，和/或，抑制肿瘤生长。

本发明的制剂可于体内或者体外施用；例如，所述制剂被施用至受试者体内，以与受试者体内的gp96蛋白结合，抑制受试者体内的肿瘤细胞增殖和/或生长和/或侵袭，促进受试者体内的肿瘤细胞凋亡，和/或，抑制受试者体内的肿瘤生长；或者，所述制剂被施用至体外的gp96蛋白，以与体外的gp96蛋白结合；或者，所述制剂施用至体外的细胞(例如细胞系或者来自受试者的细胞例如肿瘤细胞)，以抑制体外的肿瘤细胞增殖和/或生长和/或侵袭，和/或促进体外的肿瘤细胞凋亡。

在一个方面，本申请提供了治疗和/或预防受试者的与gp96蛋白过度表达相关的疾病(例如肿瘤)的方法，包括给有此需要的受试者施予治疗和/或预防有效量的本发明的PEG化多肽或药物组合物。

在一个方面，本申请提供了一种抑制肿瘤细胞增殖和/或生长和/或侵袭，促进肿瘤细胞凋亡，和/或，抑制肿瘤生长的方法，包括给肿瘤细胞或肿瘤施予本发明的PEG化多肽或制剂。在某些实施方案中，所述肿瘤细胞存在于受试者体内，所述方法在受试者体内进行。在某些实施方案中，所述肿瘤细胞存在于体外，所述方法在体外进行。所述方法可以用于预防或治疗目的，也可以用于非预防或治疗目的(例如科学研究)。

本发明的上述方案中，所述gp96蛋白可以存在于体外或受试者体内。

本发明的上述方案中，所述肿瘤包括但不限于：脑瘤、肺癌、鳞状上皮细胞癌、膀胱癌、胃癌、卵巢癌、腹膜癌、胰腺癌、乳腺癌、头颈癌、子宫颈癌、子宫内膜癌、直肠癌、肝癌、肾癌、食管腺癌、食管鳞状细胞癌、前列腺癌、雌性生殖道癌、原位癌、淋巴瘤、神经纤维瘤、甲状腺癌、骨癌、皮肤癌、脑癌、结肠癌、睾丸癌、胃肠道间质瘤、前列腺肿瘤、肥大细胞肿瘤、多发性骨髓瘤、黑色素瘤、胶质瘤或肉瘤。在某些实施方案中，所述肿瘤为乳腺癌，例如三阴性乳腺癌。

本发明的上述方案中，所述肿瘤细胞包括但不限于：脑瘤细胞、肺癌细胞、鳞状上皮细胞癌细胞、膀胱癌细胞、胃癌细胞、卵巢癌细胞、腹膜癌细胞、胰腺癌细胞、乳腺癌细胞、头颈癌细胞、子宫颈癌细胞、子宫内膜癌细胞、直肠癌细胞、肝癌细胞、肾癌细胞、食管腺癌细胞、食管鳞状细胞癌细胞、前列腺癌细胞、雌性生殖道癌细胞、原位癌细胞、淋巴瘤细胞、神经纤维瘤细胞、甲状腺癌细胞、骨癌细胞、皮肤癌细胞、脑癌细胞、结肠癌细胞、睾丸癌细胞、胃肠道间质瘤细胞、前列腺肿瘤细胞、肥大细胞肿瘤细胞、多发性骨髓瘤细胞、黑色素瘤细胞、胶质瘤细胞或肉瘤细胞。

在某些实施方案中，所述乳腺癌细胞为SKBr3或MDA-MB-231。

本发明的上述方案中，所述受试者可以为哺乳动物，例如牛科动物、马科动物、猪科动物、犬科动物、猫科动物、啮齿类动物、灵长类动物；其中，特别优选的受试者为人。

术语定义

在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所涉及的实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。

本发明中，gp96蛋白是指存在于真核生物细胞内质网中的分子量约为96KD的热休克蛋白(又称GRP94)。gp96蛋白的氨基酸序列是本领域技术人员已知的，并且见于各种公共数据库(例如GenBank数据库，Genbank Accession NO.AY040226)。野生型gp96蛋白的示例性氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。因此，在本发明中，当涉及gp96蛋白的序列时，其使用SEQ ID NO.4所示的序列来进行描述。然而，本领域技术人员理解，可在SEQ ID NO.4中天然产生或人工引入突变或变异(包括但不限于，置换、缺失和/或添加)，而不影响gp96蛋白的生物学特性。因此，在本发明中，术语“gp96蛋白”意欲包括所有此类多肽和变体，包括SEQID NO.4所示的多肽以及其天然或人工的变体，所述变体保留了gp96蛋白的生物学特性。

本发明中，PIBC(Peptide Inhibitor for Breast Cancer)是一种可与gp96蛋白结合的多肽。该多肽含有α-螺旋序列，能够与gp96特异结合，阻断gp96分子内部基序重排和构象变化，进而干扰胞膜gp96与HER-2、uPAR或ER-a36的相互作用。PIBC的示例性氨基酸序列可如SEQ ID NO.1所示。本发明中，术语“PIBC”意欲包含PIBC的变体，所述“变体”是指这样的多肽，其氨基酸序列与PIBC的氨基酸序列相比，具有一个或多个(例如1-10个或1-5个或1-3个)氨基酸不同(例如保守氨基酸置换)或者具有至少60％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％的同一性，并且其与PIBC具有相同的功能，所述“功能”可以是如下功能中的一个或者多个：(i)能够与gp96特异结合，(ii)能够阻断gp96分子内部基序重排和构象变化，(iii)能够干扰胞膜gp96与HER-2、uPAR或ER-a36的相互作用。

如本文中使用的，术语“同一性”用于指两个多肽之间或两个核酸之间序列的匹配情况。当两个进行比较的序列中的某个位置都被相同的碱基或氨基酸单体亚单元占据时(例如，两个DNA分子的每一个中的某个位置都被腺嘌呤占据，或两个多肽的每一个中的某个位置都被赖氨酸占据)，那么各分子在该位置上是同一的。两个序列之间的“百分数同一性”是由这两个序列共有的匹配位置数目除以进行比较的位置数目×100的函数。例如，如果两个序列的10个位置中有6个匹配，那么这两个序列具有60％的同一性。例如，DNA序列CTGACT和CAGGTT共有50％的同一性(总共6个位置中有3个位置匹配)。通常，在将两个序列比对以产生最大同一性时进行比较。这样的比对可通过使用，例如，可通过计算机程序例如Align程序(DNAstar,Inc.)方便地进行的Needleman等人(1970)J.Mol.Biol.48：443-453的方法来实现。还可使用已整合入ALIGN程序(版本2.0)的E.Meyers和W.Miller(Comput.ApplBiosci.，4:11-17(1988))的算法，使用PAM120权重残基表(weight residue table)、12的缺口长度罚分和4的缺口罚分来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。此外，可使用已整合入GCG软件包(可在www.gcg.com上获得)的GAP程序中的Needleman和Wunsch(J MoIBiol.48:444-453(1970))算法，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵以及16、14、12、10、8、6或4的缺口权重(gap weight)和1、2、3、4、5或6的长度权重来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。

如本文中使用的，术语“保守置换”意指不会不利地影响或改变包含氨基酸序列的蛋白/多肽的生物学活性的氨基酸置换。例如，可通过本领域内已知的标准技术例如定点诱变和PCR介导的诱变引入保守置换。保守氨基酸置换包括用具有相似侧链的氨基酸残基替代氨基酸残基的置换，例如用在物理学上或功能上与相应的氨基酸残基相似(例如具有相似大小、形状、电荷、化学性质，包括形成共价键或氢键的能力等)的残基进行的置换。已在本领域内定义了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸和组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，优选用来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基替代相应的氨基酸残基。鉴定氨基酸保守置换的方法在本领域内是熟知的(参见，例如，Brummell等人，Biochem.32:1180-1187(1993)；Kobayashi等人Protein Eng.12(10):879-884(1999)；和Burks等人Proc.NatlAcad.Set USA 94:412-417(1997)，其通过引用并入本文)。

如本文中使用的，“大约”应该被本领域技术人员理解，并将随其所用之处的上下文而有一定程度的变化。如果根据术语应用的上下文，对于本领域技术人员而言，其含义不是清楚的，那么“大约”的意思是偏差不超过所述特定数值或范围的正负10％。

如本文中使用的，“有效量”是指，足以获得或至少部分获得期望的效果的量。例如，治疗有效量是指，足以治愈或至少部分阻止已患有疾病的患者的疾病和其并发症的量。测定这样的有效量完全在本领域技术人员的能力范围之内。例如，对于治疗用途有效的量将取决于待治疗的疾病的严重度，患者自己的免疫系统的总体状态，患者的一般情况例如年龄、体重和性别，药物的施用方式，以及同时施用的其他治疗等等。

对受试者给予的药物的量取决于所述疾病或病况的类型和严重程度以及受试者的特征，如一般健康状况、年龄、性别、体重和对药物的耐受度，还取决于制剂的类型和药物的给药方式，以及给药周期或时间间隔等因素。本领域技术人员能够根据这些因素和其它因素来确定适当的剂量。

有益效果

实验证明，本发明的PEG修饰的PIBC与gp96蛋白具有亲和力，不仅能显著抑制肿瘤细胞增殖(生长)、侵袭，明显促进肿瘤细胞凋亡，有效抑制肿瘤细胞引起的肿瘤生长，更加重要的是能够显著减轻PIBC的刺激性，延长多肽在体内的半衰期，最终明显改善了PIBC的成药性。以上结果表明，本发明的PEG修饰的PIBC可用作治疗肿瘤的药物。

附图说明

图1为实施例1中PEG化多肽mPEG₂₀₀₀₀CY的质谱鉴定结果图。

图2为实施例2中PEG化多肽mPEG₄₀₀₀₀CY的质谱鉴定结果图。

图3为实施例3中PEG化多肽mPEG₂₀₀₀₀LC的质谱鉴定结果图。

图4为实施例4中PEG化多肽mPEG₄₀₀₀₀LC的质谱鉴定结果图。

图5为实施例5中，昆虫细胞表达系统表达的分泌型人热休克蛋白gp96的鉴定图谱；1：分子量标准；2:纯化后的gp96蛋白；3:gp96蛋白的western blot结果。

图6显示了实施例9中PIBC及mPEG₂₀₀₀₀CY处理组的肿瘤抑制率。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

PBS缓冲液：8g NaCl、0.2g KCl、3.625g Na₂HPO₄·12H₂O、0.24g KH₂PO₄,加水至1L，调pH7.3。

5mM Na₂HPO₄：1.7907g Na₂HPO₄·12H₂O，用去离子水定容至1L。

5mM NaH₂PO₄：0.78g NaH₂PO₄·2H₂O，用去离子水定容至1L。

质谱采用VG PLATFORM质谱仪，用MALDI-TOF技术进样。

下述实施例中如无特殊说明，所述液体与液体的比值为体积与体积比；所述固体与液体的比值为物质的量与体积比，所述物质的量以mmol计，所述体积以ml计；所述固体与固体的比值为质量与质量比。

下述实施例中如无特殊说明，所述室温反应具体为将反应温度控制在20-30℃范围内，包括20℃和30℃。

实施例1、PEG化多肽mPEG₂₀₀₀₀CY的制备

(一)多肽的获得

将在序列表中SEQ ID NO.1所示PIBC的N端添加半胱氨酸得到的多肽命名为CY，CY的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所示，由吉尔生化(上海)有限公司合成SEQ ID NO.2所示的多肽CY。

(二)多肽的PEG化修饰

原料：mPEGxMal(甲氧基聚乙二醇马来酰亚胺，x为PEG的平均分子量；Mal表示马来酰亚胺，马来酰亚胺修饰在PEG的一端；m表示甲氧基)，其化学结构式如式II所示：

将mPEGxMal(x＝20000，即PEG的平均分子量为20000，mPEG₂₀₀₀₀Mal，北京键凯科技有限公司产品)通过Michael加成反应与多肽CY的N端氨基酸半胱氨酸的巯基进行加成反应，得到mPEG₂₀₀₀₀CY。

1、mPEG₂₀₀₀₀CY的合成：

80毫克(0.004mmol)mPEG₂₀₀₀₀Mal与10毫克(0.002mmol)多肽CY的混合物溶于10毫升5mM的NaH₂PO₄缓冲溶液中，用5mM的Na₂HPO₄溶液调节反应溶液pH值至7.2，HPLC监测反应，直至多肽反应完全。

2、PEG化多肽mPEG₂₀₀₀₀CY的纯化及表征

采用HiTrap SP FF(1ml)大量纯化mPEG₂₀₀₀₀CY，洗脱液为流动相A1液和流动相B1液，A1液由溶质和溶剂组成，溶剂为20mM Tris-HCl(pH7.4)，溶质及其浓度为1mM EDTA·2Na和0.01％(质量百分比浓度)NaN₃；B1液由溶质和溶剂组成，溶剂为20mM Tris-HCl(pH7.4)，溶质及其浓度为1000mM NaCl、1mM EDTA·2Na和0.01％(质量百分比浓度)NaN₃。洗脱条件为：先用A1液和B1液的体积比分别为80％和20％的混合液冲平，再用A1液和B1液的体积比分别为70％和30％的混合液洗脱收集样品。将收集到的样品用Millipore超滤离心管(10KD)4℃，3500r/min离心浓缩至500微升。浓缩后的样本用HiTrap Desalting(5ml)进行脱盐处理。冻干溶剂后得到的蓬松状态的PEG化多肽mPEG₂₀₀₀₀CY纯品。

mPEG₂₀₀₀₀CY的化学结构由MALDI-TOF质谱进行表征，mPEG₂₀₀₀₀CY的质谱表征结果见图1。mPEG₂₀₀₀₀CY的结构式如式I所示。此时，式I中Cys与PIBC通过Cys的羧基与PIBC的N端氨基酸残基的氨基形成的肽键相连。

mPEG₂₀₀₀₀CY纯度由分析型高效液相色谱仪(流速：1ml/min)给出。分析性高效液相色谱仪的型号：安捷伦1200，所采用色谱柱的型号：Angilent Eclipse XDB-C18Analytical,5μm,4.6×150006Dm。色谱操作条件：线性梯度洗脱，洗脱液由流动相A2液和流动相B2液组成。流动相A2液为三氟乙酸体积百分浓度为0.1％的三氟乙酸水溶液，流动相B2液为三氟乙酸体积百分浓度为0.1％的三氟乙酸乙腈溶液。线性梯度洗脱B2液的体积百分比由40％匀速升至65％，A2液的体积百分比由60％匀速降至35％，洗脱时间11分钟，洗脱流速为每分钟1毫升，紫外检测波长220纳米。分析型高效液相色谱仪检测结果显示，所得mPEG₂₀₀₀₀CY的纯度为94.5％。

实施例2、PEG化多肽mPEG₄₀₀₀₀CY的制备

将mPEGxMal(x＝40000，即PEG的平均分子量为40000，MPEG₄₀₀₀₀Mal，北京键凯科技有限公司产品)通过Michael加成反应与多肽CY的N端氨基酸半胱氨酸的巯基进行加成反应，得到mPEG₄₀₀₀₀CY。

mPEG₄₀₀₀₀CY按照实施例1中步骤(二)中1的方法制备，将mPEG₂₀₀₀₀Mal替换为mPEG₄₀₀₀₀Mal，进行反应，直至多肽反应完全。

采用安捷伦1200反相高效液相色谱仪对按照上述步骤所得的反应产物进行纯化。色谱柱型号：Angilent Eclipse XDB-C18 Semi-Prep,5μm,9.4×250mm。色谱操作条件：线性梯度洗脱，洗脱液由实施例1的A2液和B2液组成。线性梯度洗脱B2液的体积百分比由30％匀速升至52％B，A2液的体积百分比由70％匀速降至48％，洗脱时间11分钟，洗脱流速为每分钟2.5毫升，紫外检测波长220纳米。冻干溶剂后得到的蓬松状态的PEG化多肽mPEG₄₀₀₀₀CY纯品。

mPEG₄₀₀₀₀CY的MALDI-TOF质谱表征结果见图2。mPEG₄₀₀₀₀CY的结构式如式I所示。此时，式I中Cys与PIBC通过Cys的羧基与PIBC的N端氨基酸残基的氨基形成的肽键相连。

mPEG₄₀₀₀₀CY纯度分析同实施例1所述，不同的是线性梯度洗脱B2液的体积百分比由20％匀速升至100％，A2液的体积百分比由80％匀速降至0，洗脱时间25分钟。分析型高效液相色谱仪检测结果显示，所得mPEG₄₀₀₀₀CY的纯度为95.3％。

实施例3、PEG化多肽mPEG₂₀₀₀₀LC的制备

将在序列表中SEQ ID NO.1所示PIBC的C端添加半胱氨酸得到的多肽命名为LC，LC的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.3所示，由吉尔生化(上海)有限公司合成SEQ ID NO.3所示的多肽LC。

将mPEGxMal(x＝20000，即PEG的平均分子量为20000，mPEG₂₀₀₀₀Mal，北京键凯科技有限公司产品)通过Michael加成反应与多肽LC的C端氨基酸半胱氨酸的巯基进行加成反应，即得到mPEG₂₀₀₀₀LC，mPEG₂₀₀₀₀LC的制备、纯化和表征的具体过程同实施例1中步骤(二)所述，不同的是将实施例1中的多肽CY换成多肽LC，得到蓬松状态的PEG化多肽mPEG₂₀₀₀₀LC。mPEG₂₀₀₀₀LC的MALDI-TOF质谱表征结果见图3。分析型高效液相色谱仪检测结果显示，所得mPEG₂₀₀₀₀LC的纯度为93.6％。mPEG₂₀₀₀₀LC的结构式如式I所示。此时，式I中Cys与PIBC通过Cys的氨基与PIBC的C端氨基酸残基的羧基形成的肽键相连。

实施例4、PEG化多肽mPEG₄₀₀₀₀LC的制备

将mPEGxMal(x＝40000，即PEG的平均分子量为40000，mPEG₄₀₀₀₀Mal，北京键凯科技有限公司产品)通过Michael加成反应与多肽LC的C端氨基酸半胱氨酸的巯基进行加成反应，即得PEG化多肽mPEG₄₀₀₀₀LC，mPEG₄₀₀₀₀LC的制备、纯化和表征的具体过程同实施例1中步骤(二)所述，不同的是将实施例1中的mPEGxMal(x＝20000)换成mPEGxMal(x＝40000)，多肽CY换成多肽LC，得到蓬松状态的PEG化多肽mPEG₄₀₀₀₀LC。mPEG₄₀₀₀₀LC的MALDI-TOF质谱表征结果见图4。分析型高效液相色谱仪检测结果显示，所得mPEG₄₀₀₀₀LC的纯度为95.1％。mPEG₄₀₀₀₀LC的结构式如式I所示。此时，式I中Cys与PIBC通过Cys的氨基与PIBC的C端氨基酸残基的羧基形成的肽键相连。

实施例5、gp96蛋白与PEG化多肽的相互作用

gp96蛋白(人热休克蛋白；Genbank Accession NO.AY040226)的氨基酸序列如序列表的SEQ ID NO.4所示，其编码序列如SEQ ID NO.5所示。

一、pFastBac^TM1-gp96质粒的构建

1、gp96引物的设计与合成：以GenBank中人gp96基因的序列为模板，设计正向引物和反向引物，其中，正向引物序列为：5’-CGggattcATGGACGATGAAGTTGATGTGGAT-3’(SEQ IDNO.6)，反向引物序列为：5’-GCTCTAGATTAGAATTCATCTTTTTCAGCTG-3’(SEQ ID NO.7)，所述正向引物在5’端含有BamHI酶切位点，所述反向引物在5’端含有XbaI酶切位点。

2、提取人肝癌细胞HepG2的mRNA，反转录合成cDNA。

3、以步骤2中获取的cDNA为模板，采用步骤1设计的引物通过聚合酶链式反应(PCR)扩增目的基因，得到PCR产物，即为gp96基因。

4、用EcoRI和XbaI双酶切步骤3获得的PCR产物，回收大小约为2400bp的酶切产物。

5、用EcoRI和XbaI双酶切pFastBac^TM1空载质粒(Invitrogen，产品目录号为10359-016)，回收得到大小约为4700bp的骨架载体。

6、将步骤4获得的大小约为2400bp的酶切产物和步骤5获得的大小约为4700bp的载体骨架连接，得到重组质粒，测序验证后，将序列正确的重组质粒命名为pFastBac^TM1-gp96。重组质粒pFastBac^TM1-gp96编码并能够表达gp96蛋白，gp96蛋白的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.4所示。

二、昆虫细胞表达gp96重组蛋白及gp96蛋白的纯化

利用Cellfectin II reagent(Life technologies，货号：10362-100)将步骤一的pFastBac^TM1-gp96转染到Sf9细胞(Invitrogen，产品目录号为11496-015)中。将转染所述质粒的Sf9细胞培养72h。观察到的细胞病变情况表明，重组的一代杆状病毒(P1)已经释放到培养基中，收取细胞上清获得P1病毒。加适量P1到Sf9单层(1×10⁶细胞/mL)细胞中，27℃，培养72h，4000rpm离心5min，收取上清获得二代病毒(P2)。将适量P2毒加到100ml Sf9(1.6×10⁶细胞/mL)的悬浮细胞中27℃，100-120rpm/min培养72h，扩增获得三代病毒(P3)。利用大鼠抗gp96抗体(santa cruz，产品号sc-56399)作为一抗，进行western blotting检测，结果表明gp96蛋白在Sf9细胞中表达。

随后，在新鲜的Sf9细胞(1.5×10⁶细胞/mL，300ml)中加入适量P3毒，27℃,100-120rpm/min在Insect-XPRESS^TM Protein-free Insect Cells medium with L-Glutamine(Catalog No:12-730Q)培养基中进行悬浮培养。72小时后，将悬浮培养的培养液7000rpm离心20分钟得到清澈的上清液，将上清液经过0.22mm滤膜滤过后，经过HiTrap Q HP柱，Superdex 200 10/300GL离子柱纯化后得到纯化产物。将纯化产物经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western blot免疫印迹试验(所用一抗为大鼠抗gp96抗体(santa cruz，产品号sc-56399))进行鉴定，鉴定结果如图5所示，确定纯化产物中含有高纯度的gp96蛋白。利用超滤管将上述纯化产物中溶剂替换为PBS缓冲液，并浓缩，采用BCA法测定蛋白浓度，最后将蛋白分装，贮存于-80℃。

三、gp96蛋白与PEG化多肽片段的相互作用

通过Biacore方法分别检测实施例1-4制备的PEG化多肽片段与gp96蛋白之间的相互作用。检测所用仪器为Biacore3000系统，使用CM5传感芯片，按说明书将步骤二的gp96蛋白通过氨基偶联固化在CM5传感芯片上，具体方法如下：采用过滤并除气的HBS缓冲盐溶液(10mmol/L HEPES，0.15mol/L NaCl，3.4mol/L EDTA，0.05％P-20；pH7.4)作为流动相溶液，将CM5传感器芯片模块嵌入BIAcore系统；设定流过流动池的流速为5μL/min；用0.2mol/L的N-乙基-N-二甲基-氨丙基碳二亚胺和0.05mol/L的N-羟基琥珀酰亚胺等体积混合溶液活化CM5传感芯片表面7min；注射35μL 1mg/mL的gp96蛋白到活化表面，使之与CM5传感芯片表面结合；注射35μL乙醇胺使过量的反应基团失活；快速注射10μL 20mmol/L的HCl，然后用Extraclean除去非共价结合型材料；通过在开始注射gp96蛋白前放置第1个基线报道点，并在注射20mmol/L HCl结束后2min放置第2个报道点,来测定结合gp96蛋白的水平；设定结合gp96的流通池为检测通道，未结合gp96蛋白的流通池为参比通道，HBS缓冲溶液为流动相，流通池的流速为10μL/min；同时将待测物注入gp96蛋白流通池和参比流通池，使结合反应在22-24℃，pH7.4的条件下进行；注射10μl实施例1-4中的一种PEG化多肽片段或PIBC(使用含1mg/mL羧甲基葡聚糖的HBS缓冲液稀释)检测；快速注射10μL 20mmol/L的HCl，用Extraclean再生gp96蛋白表面；再次注射10μL PEG化多肽片段，重复此循环，以测定其结合到gp96蛋白表面的重现性。按上述步骤，分别检测不同浓度级别(156，312，625，1250，2500nmol/L)的多肽片段，每一浓度级别重复测定1次。

实施例1-3的PEG化多肽片段与gp96蛋白的结合系数K_D(mM/L)见表1。

表1PEG化多肽与gp96结合反应的系数

多肽	结合系数K<sub>D</sub>(mM/L)

mPEG<sub>20000</sub>CY	4.562
		mPEG<sub>40000</sub>CY	50.41
mPEG<sub>20000</sub>LC	10.31

结果表明，实施例1-3的PEG化多肽与gp96蛋白均有亲和力，在N端修饰PEG分子量为20000的mPEG₂₀₀₀₀CY结合能力最强。

实施例6、PEG化多肽注射给药部位刺激性试验

设置对照溶媒组、PIBC组、mPEG₂₀₀₀CY组(PEG分子量为2000，在N端添加半胱氨酸修饰的多肽，参考实施例1制备)、mPEG₅₀₀₀CY组(PEG分子量为5000，在N端添加半胱氨酸修饰的多肽，参考实施例1制备)、mPEG₂₀₀₀₀CY组、mPEG₂₀₀₀₀LC组、mPEG₄₀₀₀₀CY组和mPEG₄₀₀₀₀LC组，对照溶媒组注射溶媒(生理盐水)、其余组分三个浓度，分别以125、250、500mg/kg(以PIBC的量计)的剂量单次皮下注射SD大鼠，每组5只。每日观察大鼠的临床表现以及其注射部位的变化，7天后安乐死，大体解剖和显微观察注射部位的病理变化。

试验期间，相对于溶媒组，PIBC组、mPEG₂₀₀₀CY组和mPEG₅₀₀₀CY组中大鼠自主活动减少、体重和适量也有降低，且跟给药剂量呈相关性，给药局部有较强的皮肤刺激性，在以125、250、500mg/kg剂量单次皮下注射给予SD大鼠，给药局部皮肤异常(结痂或破溃)，且随着剂量的加大，刺激性越明显。大体解剖可见给药部位及其临近部位皮肤结痂；显微镜下可见相应的组织学改变,给药局部出现变性或坏死等局部反应。

mPEG₂₀₀₀₀CY组、mPEG₂₀₀₀₀LC组、mPEG₄₀₀₀₀CY组和mPEG₄₀₀₀₀LC组的临床表现未出现异常，且皮肤刺激性显著下降，在最高500mg/kg的剂量下，注射部位无红斑和水肿的出现，解剖和显微镜下观察也未发现明显的异常。

相比于PIBC、mPEG₂₀₀₀CY和mPEG₅₀₀₀CY显示出强烈的皮肤刺激性极大地影响了其临床应用，分子量在20000-40000的PEG修饰后的多肽皮肤刺激性得到明显改善。

实施例7、PEG化多肽溶血性试验

取兔血20毫升，用玻璃棒搅动血液，除去纤维蛋白原，使成脱纤血液。加入0.9％氯化钠溶液约10倍量，摇匀，1000-1500r/min离心15分钟，除去上清液，沉淀的红细胞再用0.9％氯化钠溶液按上述方法洗涤2-3次，至上清液不显红色为止。将所得红细胞用0.9％氯化钠溶液配成2％的混悬液，供试验用。

取洁净试管9只，进行编号，1-7号管为供试品管(PIBC、mPEG₂₀₀₀CY、mPEG₅₀₀₀CY、mPEG₂₀₀₀₀CY、mPEG₂₀₀₀₀LC、mPEG₄₀₀₀₀CY和mPEG₄₀₀₀₀LC，浓度为5mg/ml以PIBC计)，8号管为阴性对照管，9号管为阳性对照管。按下表所示依次加入2％红细胞悬液、0.9％氯化钠溶液或蒸馏水，混匀后，立即置37℃±0.5℃的恒温箱中进行温育，开始每隔15分钟观察1次，1小时后，每隔1小时观察1次，观察3小时。

试验中加入受试物PIBC、mPEG₂₀₀₀CY、mPEG₅₀₀₀CY，3小时后溶液呈澄明红色，管底有少量红细胞残留，有溶血发生，因此PIBC、mPEG₂₀₀₀CY、mPEG₅₀₀₀CY不宜注射使用；而加入受试物mPEG₂₀₀₀₀CY、mPEG₂₀₀₀₀LC、mPEG₄₀₀₀₀CY和mPEG₄₀₀₀₀LC，3小时的溶液中红细胞全部下沉，上清液体无色澄明，无溶血发生，表明分子量在20000-40000的PEG修饰后的PIBC可以注射使用。

实施例8重复静脉输注PIBC或mPEG₂₀₀₀₀CY给予SD大鼠14天的毒理试验

30只大鼠(15只/性别)分性别区段按照体重分为3组，分别静脉输注给予溶媒对照品(氯化钠注射液，第1组)、10mg/kg/天的PIBC(第2组)和10mg/kg/天的mPEG₂₀₀₀₀CY。给药容量10mL/kg，给药速度2mL/kg/min。重复给药14天后于D15安乐死。观察记录动物的死亡、临床症状、体重、食量，进行了临床病理(血细胞计数、凝血功能指标、血液生化指标)检测、脏器称重、大体解剖观察，对大体观察异常组织进行组织病理学检查。

溶媒对照组：动物未见异常。

PIBC组：自第三天至给药结束陆续可见给药局部的刺激性反应，包括尾部轻度/中度肿胀(M：5/5、F：5/5)，尾部远端变色(紫色)(M：5/5、F：4/5)，轻度/中度/重度注射局部破溃(M：5/5、F：2/5)。此外还有3/5雌性动物在D1～D3可见自发活动减少，1/5雌性动物在D1药后至D2药前可见异常运动(行走缓慢)。雄性动物体重和体重增量在D7降低。血细胞计数可见雌雄动物WBC、Neut、Baso、Retic、PLT和Mono升高，RBC、HGB和HCT降低，此外雄性动物Lymph(10^9/L)、Eos(10^9/L)以及雌性动物Mono升高。凝血功能指标可见雌雄动物PT延长和FIB升高。血液生化指标雌雄动物可见Alb、A/G、Na+降低，CK、LDH升高，另外雄性动物Cre和雌性动物AST、ALT升高。大体解剖可见(8/10)动物腹股沟淋巴结变大，(10/10)动物注射部位(尾巴)肿胀，(9/10)动物伴有变色，(5/10)注射部位(尾巴)皮肤破溃。镜下检查可见腹股沟淋巴结皮质淋巴组织细胞增生，髓质窦组织细胞增生、出血；注射部位(尾巴)痂皮形成和/或溃疡，表皮坏死、增生、角化过度，真皮坏死、水肿和炎细胞浸润，皮下组织坏死、水肿、纤维组织和/或成纤维细胞增生、中性粒细胞为主的炎细胞浸润、血栓形成，皮下组织深层肌纤维萎缩/坏死、成骨细胞反应性增生等改变。

mPEG₂₀₀₀₀CY组：各动物未见死亡或濒死，体重和食量的一过性降低或减少，凝血功能和血液生化指标未见明显异常，大体解剖可见各个脏器未见明显异常。

结果表明，静脉注射PIBC有强烈的刺激性和毒性，而PEG化修饰后的mPEG₂₀₀₀₀CY能够显著减轻其毒性。

实施例9、PEG化多肽对乳腺癌细胞SKBr3的作用效果

乳腺癌细胞SKBr3：ATCC(American type culture collection)产品，产品号为HTB-30。乳腺癌细胞MDA-MB-231ATCC(American type culture collection)产品，产品号为HTB-26。分别将实施例1-4制备的PEG化多肽片段进行如下实验：

一、PEG化多肽抑制乳腺癌细胞SKBr3增殖

通过CCK-8试剂盒(日本同仁化学研究所，货号CK04-05)分别检测各个PEG化多肽片段对乳腺癌细胞SKBr3增殖的抑制作用。具体操作步骤如下：

1、将SKBr3细胞铺到96孔板中，汇合度为50％左右。每组细胞设三个复孔。

2、待细胞贴壁后，加入PEG化多肽(终浓度6μM)做为实验组，设三个不加多肽的孔为对照组。

3、在不同的时间检测点(0，3，6，12小时)，每孔中加入CCK-8检测试剂10μl，37℃孵育2小时。

4、测定490nm的OD值。

细胞生长抑制率计算公式为：(对照组OD₄₉₀平均值-实验组OD₄₉₀平均值)/对照组OD₄₉₀×100％。各个PEG化多肽片段处理组的细胞生长抑制率(平均值)见表2。

表2 PEG化多肽处理的细胞生长抑制率

结果表明，实施例1-4的PEG化多肽均可以抑制乳腺癌细胞SKBr3增殖(生长)，其中mPEG₂₀₀₀₀CY抑制效果最明显。

二、PEG化多肽抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231的侵袭力

利用Tanswell plate(Corning公司，产品号#3422)和Matrigel(BD公司，产品号354234)分别检测实施例1-4的PEG化多肽对乳腺癌细胞MDA-MB-231侵袭能力的影响。细胞侵袭实验根据Transwell和Matrigel说明书进行操作。主要操作步骤如下：

1、实验前一天在冰上过夜冻融Matrigel，在Transwell上层小室中加入60μl的Matrigel，37℃包被1小时，PBS缓冲液洗涤2次。

2、将己消化计数好的乳腺癌细胞MDA-MB-231用含有PIBC及实施例1-4的PEG化多肽的无血清培养液(终浓缩为10μM)稀释到40万/ml，取100μl加入Transwell上层小室，Transwell下层小室加入600μl完全细胞培养液，作为实验组；用无血清培养液代替含多肽片段的无血清培养液，作为阴性对照组。

3、在CO₂孵箱中37℃5％CO₂继续培养24小时，用棉签刮去上层Transwell小室中的细胞，50％甲醇/50％丙酮固定15分钟后，再用PBS缓冲液洗3次，DAPI封片，荧光显微镜下计数侵袭的细胞数。

侵袭抑制率的计算公式为：(阴性对照组中侵袭的细胞数-实验组中侵袭的细胞数)/阴性对照组中侵袭的细胞数×100％。

各个PEG化多肽片段处理组相对阴性对照组对MDA-MB-231的侵袭抑制率(平均值)见表3。

表3 PEG化多肽处理组相对阴性对照组对MDA-MB-231侵袭的抑制率

结果表明，实施例1-4的PEG化多肽均可以抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231侵袭，其中mPEG₂₀₀₀₀CY抑制效果最明显。

三、PEG化多肽促进乳腺癌细胞SKBr3的凋亡

分别检测实施例1-4的PEG化多肽对乳腺癌细胞SKBr3凋亡的促进作用。具体步骤如下：

1、乳腺癌细胞SKBr3接种于6孔细胞培养板，20万细胞/孔；

2、待细胞贴壁后，加入PIBC及实施例1-4的PEG化多肽(终浓度6μM)继续培养24小时，作为实验组；将加入PBS溶液的作为阴性对照组。

3、运用Invitrogen公司生产的试剂盒

Apoptosis Assay kit对细胞染色后通过流式细胞仪分析结果，具体的操作步骤如下：

(1)用胰酶常规消化细胞，PBS缓冲液洗两遍(细胞数量一般为6孔板的四分之一或一个24孔板的数量为宜)。

(2)用20μl 1x Annexin V Buffer将细胞轻轻悬起来，加入1μl的FITC annexin V后轻轻混匀，室温避光染色15分钟。

(3)向反应管中加入1x Annexin V Buffer使终体积为200μl。

(4)加入浓度为100μg/ml的PI，使其终浓度为1μg/ml，室温避光染色3分钟左右即可上机检测。

实施例1-4的PEG化多肽处理组相比阴性对照组增加的细胞凋亡率(平均值)见表4。

表4 PEG化多肽处理组比阴性对照组增加的细胞凋亡率

多肽	凋亡率
		mPEG<sub>20000</sub>CY	32.1％
mPEG<sub>40000</sub>CY	11.1％
		mPEG<sub>20000</sub>LC	21.1％
mPEG<sub>40000</sub>LC	3.8％

结果表明，实施例1-4的PEG化多肽均可以促进乳腺癌细胞SKBr3细胞凋亡，其中mPEG₂₀₀₀₀CY促进效果最明显。

四、mPEG₂₀₀₀₀CY抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231的移植瘤生长

检测mPEG₂₀₀₀₀CY对乳腺癌细胞MDA-MB-231的移植瘤生长的抑制作用。具体步骤如下：

1、将培养至对数生长期的乳腺癌细胞MDA-MB-231皮下接种BALB/c裸鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司)，每只接种1000万细胞，建立移植瘤模型，之后在裸鼠体内经过3次传代用于接瘤实验。

2、等到肿瘤生长到100mm³时将BALB/c裸鼠随机分为3组，每组5只，分别进行如下治疗处理，第1次处理当天记为第1天：

PIBC组：用PIBC溶液(多肽溶于0.9％的生理盐水)进行静脉注射治疗，每次注射剂量为5mg/kg，每天给药一次，总共治疗二周；

mPEG₂₀₀₀₀CY组：用mPEG₂₀₀₀₀CY溶液(mPEG₂₀₀₀₀CY溶于0.9％的生理盐水)进行静脉注射治疗，每次注射剂量为5mg/kg(以PIBC的量计算)，注射体积同PIBC治疗组，每二天给药一次，总共治疗二周；

对照组：用PBS缓冲液进行静脉注射治疗，注射体积同PIBC治疗组，每天注射一次，总共二周。

3、每周检测二次肿瘤体积，治疗二周后处死裸鼠，称取肿瘤重量并计算肿瘤抑制率。

肿瘤抑制率的计算公式如下：(对照组小鼠的肿瘤体积-多肽组小鼠肿瘤的体积)/对照组小鼠的肿瘤体积×100％。

PIBC及mPEG₂₀₀₀₀CY治疗组的肿瘤抑制率结果如图6所示。结果表明，PIBC及mPEG₂₀₀₀₀CY均能有效抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231引起的乳腺癌肿瘤生长。

实施例10、PEG化多肽在SD大鼠中的体内血浆半衰期评价

供试多肽：PIBC、mPEG₂₀₀₀₀CY

1.标准曲线的制作：用硼砂缓冲液(pH 9.5)配制PIBC以及mPEG₂₀₀₀₀CY的浓度为1mg/mL的储备液。取该储备液适量用乙腈体积百分比为50％的乙腈水溶液配制成多肽浓度为25、37.5、50、75、100、150、250μg/mL的标准曲线工作液。取准备好的标准曲线工作液20μl，加入空白鼠血浆80μl，配制多肽浓度为5、7.5、10、15、20、30、50μg/mL的标准曲线样品，标准曲线样品中加入20μl 20％(质量百分比)磷酸溶液和300μl甲醇-乙腈(甲醇与乙腈的体积比为1:1)，涡旋混匀约2min；4000rmp/min离心10分钟，取上清液上样分析，得各供试药物的标准曲线，并依该方法配制质控样品检测其精密度。

2.实验过程

药物配制：给药前配制，将供试多肽用等体积的0.9％氯化钠注射液和5mM Na₂HPO₄溶解成均一透明溶液，PIBC、mPEG₂₀₀₀₀CY的终浓度分别为8mg/ml和12mg/ml，用于静脉给药。

试验动物：雌雄SD大鼠，体重160～180克，来源：北京华阜康生物科技股份有限公司。

动物实验：给药：每种多肽处理四只SD大鼠，雌雄各两只。给药前称定体重，给药剂量为8mg/kg。

样品采集：给药时记为零时刻，PIBC给药组在零时刻和给药后2min、10min、20min、40min、60min、90min和120min尾静脉取血。mPEG₂₀₀₀₀CY给药组在零时刻和给药后30min、1h、2h、4h、6h、10h、12h、24h、36h、48h、72h后尾静脉取血，每次取血0.3ml于装有6μl抑肽酶和5μl肝素钠的离心管中，4500rmp/min离心5min分离上层血浆置于-80℃冰箱保存。

样品处理：取100μl待测样本的血浆，加入20μl 20％磷酸溶液、20μl 50％乙腈水溶液和300μl甲醇-乙腈(1:1)溶液，涡旋混匀约2min，4000rmp/min离心10分钟，取上清液上样分析。

色谱条件：色谱柱：XSELECT CSH C18,4.6×150mm,5μm，流动相：A相：0.1％(体积百分比)TFA水溶液，B相：0.1％(体积百分比)TFA乙腈溶液，洗脱液由A相和B相组成，洗脱液中B相的体积百分比由20％匀速升至35％，A相的体积百分比80％匀速降至65％，洗脱时间10分钟，洗脱流速为每分钟1毫升，紫外检测波长：220nm，进样体积：20μL。

3.实验结果

1)由药物PIBC、mPEG₂₀₀₀₀CY的标准曲线所得的药物浓度与峰面积的关系式分别为y＝2.879x+4.12(R＝0.996)、y＝3.742x+0.98(R＝0.991)。其中y为峰面积，x为药物浓度。

2)各时间点各药物浓度依据标准曲线得到，结果见表5。

表5给药不同时间的血药浓度

表5的结果表明：mPEG₂₀₀₀₀CY在动物体内的半衰期(T_1/2)约为30.1h，相比PIBC22min的半衰期延长了80多倍。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 北京康明海慧生物科技有限公司

<120> PEG修饰的可抑制gp96的多肽、其制备方法及用途

<130> IDC190318

<160> 7

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 37

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的肽：PIBC的氨基酸序列

<400> 1

Leu Asn Val Ser Arg Glu Thr Leu Gln Gln His Lys Leu Leu Lys Val

1 5 10 15

Ile Arg Lys Lys Leu Val Arg Lys Thr Leu Asp Met Ile Lys Lys Ile

20 25 30

Ala Asp Asp Lys Tyr

35

<210> 2

<211> 38

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的肽：PIBC的N端添加半胱氨酸得到的多肽

<400> 2

Cys Leu Asn Val Ser Arg Glu Thr Leu Gln Gln His Lys Leu Leu Lys

1 5 10 15

Val Ile Arg Lys Lys Leu Val Arg Lys Thr Leu Asp Met Ile Lys Lys

20 25 30

Ile Ala Asp Asp Lys Tyr

35

<210> 3

<211> 38

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的肽：PIBC的C端添加半胱氨酸得到的多肽

<400> 3

Leu Asn Val Ser Arg Glu Thr Leu Gln Gln His Lys Leu Leu Lys Val

1 5 10 15

Ile Arg Lys Lys Leu Val Arg Lys Thr Leu Asp Met Ile Lys Lys Ile

20 25 30

Ala Asp Asp Lys Tyr Cys

35

<210> 4

<211> 782

<212> PRT

<213> 人属人

<400> 4

Asp Asp Glu Val Asp Val Asp Gly Thr Val Glu Glu Asp Leu Gly Lys

1 5 10 15

Ser Arg Glu Gly Ser Arg Thr Asp Asp Glu Val Val Gln Arg Glu Glu

20 25 30

Glu Ala Ile Gln Leu Asp Gly Leu Asn Ala Ser Gln Ile Arg Glu Leu

35 40 45

Arg Glu Lys Ser Glu Lys Phe Ala Phe Gln Ala Glu Val Asn Arg Met

50 55 60

Met Lys Leu Ile Ile Asn Ser Leu Tyr Lys Asn Lys Glu Ile Phe Leu

65 70 75 80

Arg Glu Leu Ile Ser Asn Ala Ser Asp Ala Leu Asp Lys Ile Arg Leu

85 90 95

Ile Ser Leu Thr Asp Glu Asn Ala Leu Ser Gly Asn Glu Glu Leu Thr

100 105 110

Val Lys Ile Lys Cys Asp Lys Glu Lys Asn Leu Leu His Val Thr Asp

115 120 125

Thr Gly Val Gly Met Thr Arg Glu Glu Leu Val Lys Asn Leu Gly Thr

130 135 140

Ile Ala Lys Ser Gly Thr Ser Glu Phe Leu Asn Lys Met Thr Glu Ala

145 150 155 160

Gln Glu Asp Gly Gln Ser Ser Ser Glu Leu Ile Gly Gln Phe Gly Val

165 170 175

Gly Phe Tyr Ser Ala Phe Leu Val Ala Asp Lys Val Ile Val Thr Ser

180 185 190

Lys His Asn Asn Asp Thr Gln His Ile Trp Glu Ser Asp Ser Asn Glu

195 200 205

Phe Ser Val Ile Ala Asp Pro Arg Gly Asn Thr Leu Gly Arg Gly Thr

210 215 220

Thr Ile Thr Leu Val Leu Lys Glu Glu Ala Ser Asp Tyr Leu Glu Leu

225 230 235 240

Asp Thr Ile Lys Asn Leu Val Lys Lys Tyr Ser Gln Phe Ile Asn Phe

245 250 255

Pro Ile Tyr Val Trp Ser Ser Lys Thr Glu Thr Val Glu Glu Pro Met

260 265 270

Glu Glu Glu Glu Ala Ala Lys Glu Glu Lys Glu Glu Ser Asp Asp Glu

275 280 285

Ala Ala Val Glu Glu Glu Glu Glu Glu Lys Lys Pro Lys Thr Lys Lys

290 295 300

Val Glu Lys Thr Val Trp Asp Trp Glu Leu Met Asn Asp Ile Lys Pro

305 310 315 320

Ile Trp Gln Arg Pro Ser Lys Glu Val Glu Glu Asp Glu Tyr Lys Ala

325 330 335

Phe Tyr Lys Ser Phe Ser Lys Glu Ser Asp Asp Pro Met Ala Tyr Ile

340 345 350

His Phe Thr Ala Glu Gly Glu Val Thr Phe Lys Ser Ile Leu Phe Val

355 360 365

Pro Thr Ser Ala Pro Arg Gly Leu Phe Asp Glu Tyr Gly Ser Lys Lys

370 375 380

Ser Asp Tyr Ile Lys Leu Tyr Val Arg Arg Val Phe Ile Pro Asp Asp

385 390 395 400

Phe His Asp Met Met Pro Lys Tyr Leu Asn Phe Val Lys Gly Val Val

405 410 415

Asp Ser Asp Asp Leu Pro Leu Asn Val Ser Arg Glu Thr Leu Gln Gln

420 425 430

His Lys Leu Leu Lys Val Ile Arg Lys Lys Leu Val Arg Lys Thr Leu

435 440 445

Asp Met Ile Lys Lys Ile Ala Asp Asp Lys Tyr Asn Asp Thr Phe Trp

450 455 460

Lys Glu Phe Gly Thr Asn Ile Lys Leu Gly Val Ile Glu Asp His Ser

465 470 475 480

Asn Arg Thr Arg Leu Ala Lys Leu Leu Arg Phe Gln Ser Ser His His

485 490 495

Pro Thr Asp Ile Thr Ser Leu Asp Gln Tyr Val Glu Arg Met Lys Glu

500 505 510

Lys Gln Asp Lys Ile Tyr Phe Met Ala Gly Ser Ser Arg Lys Glu Ala

515 520 525

Glu Ser Ser Pro Phe Val Glu Arg Leu Leu Lys Lys Gly Tyr Glu Val

530 535 540

Ile Tyr Leu Thr Glu Pro Val Asp Glu Tyr Cys Ile Gln Ala Leu Pro

545 550 555 560

Glu Phe Asp Gly Lys Arg Phe Gln Asn Val Ala Lys Glu Gly Val Lys

565 570 575

Phe Asp Glu Ser Glu Lys Thr Lys Glu Ser Arg Glu Ala Val Glu Lys

580 585 590

Glu Phe Glu Pro Leu Leu Asn Trp Met Lys Asp Lys Ala Leu Lys Asp

595 600 605

Lys Ile Glu Lys Ala Val Val Ser Gln Arg Leu Thr Glu Ser Pro Cys

610 615 620

Ala Leu Val Ala Ser Gln Tyr Gly Trp Ser Gly Asn Met Glu Arg Ile

625 630 635 640

Met Lys Ala Gln Ala Tyr Gln Thr Gly Lys Asp Ile Ser Thr Asn Tyr

645 650 655

Tyr Ala Ser Gln Lys Lys Thr Phe Glu Ile Asn Pro Arg His Pro Leu

660 665 670

Ile Arg Asp Met Leu Arg Arg Ile Lys Glu Asp Glu Asp Asp Lys Thr

675 680 685

Val Leu Asp Leu Ala Val Val Leu Phe Glu Thr Ala Thr Leu Arg Ser

690 695 700

Gly Tyr Leu Leu Pro Asp Thr Lys Ala Tyr Gly Asp Arg Ile Glu Arg

705 710 715 720

Met Leu Arg Leu Ser Leu Asn Ile Asp Pro Asp Ala Lys Val Glu Glu

725 730 735

Glu Pro Glu Glu Glu Pro Glu Glu Thr Ala Glu Asp Thr Thr Glu Asp

740 745 750

Thr Glu Gln Asp Glu Asp Glu Glu Met Asp Val Gly Thr Asp Glu Glu

755 760 765

Glu Glu Thr Ala Lys Glu Ser Thr Ala Glu Lys Asp Glu Phe

770 775 780

<210> 5

<211> 2349

<212> DNA

<213> 人属人

<400> 5

gacgatgaag ttgatgtgga tggtacagta gaagaggatc tgggtaaaag tagagaagga 60

tcaaggacgg atgatgaagt agtacagaga gaggaagaag ctattcagtt ggatggatta 120

aatgcatcac aaataagaga acttagagag aagtcggaaa agtttgcctt ccaagccgaa 180

gttaacagaa tgatgaaact tatcatcaat tcattgtata aaaataaaga gattttcctg 240

agagaactga tttcaaatgc ttctgatgct ttagataaga taaggctaat atcactgact 300

gatgaaaatg ctctttctgg aaatgaggaa ctaacagtca aaattaagtg tgataaggag 360

aagaacctgc tgcatgtcac agacaccggt gtaggaatga ccagagaaga gttggttaaa 420

aaccttggta ccatagccaa atctgggaca agcgagtttt taaacaaaat gactgaagca 480

caggaagatg gccagtcgtc ttctgaattg attggccagt ttggtgtcgg tttctattcc 540

gccttccttg tagcagataa ggttattgtc acttcaaaac acaacaacga tacccagcac 600

atctgggagt ctgactccaa tgaattttct gtaattgctg acccaagagg aaacactcta 660

ggacggggaa cgacaattac ccttgtctta aaagaagaag catctgatta ccttgaattg 720

gatacaatta aaaatctcgt caaaaaatat tcacagttca taaactttcc tatttatgta 780

tggagcagca agactgaaac tgttgaggag cccatggagg aagaagaagc agccaaagaa 840

gagaaagaag aatctgatga tgaagctgca gtagaggaag aagaagaaga aaagaaacca 900

aagactaaaa aagttgaaaa aactgtctgg gactgggaac ttatgaatga tatcaaacca 960

atatggcaga gaccatcaaa agaagtagaa gaagatgaat acaaagcttt ctacaaatca 1020

ttttcaaagg aaagtgatga ccccatggct tatattcact ttactgctga aggggaagtt 1080

accttcaaat caattttatt tgtacccaca tctgctccac gtggtctgtt tgacgaatat 1140

ggatctaaaa agagcgatta cattaagctc tatgtgcgcc gtgtattcat cccagacgac 1200

ttccatgata tgatgcctaa atacctcaat tttgtcaagg gtgtggtgga ctcagatgat 1260

ctccccttga atgtttcccg cgagactctt cagcaacata aactgcttaa ggtgattagg 1320

aagaagcttg ttcgtaaaac gctggacatg atcaagaaga ttgctgatga taaatacaat 1380

gatacttttt ggaaagaatt tggtaccaac atcaagcttg gtgtgattga agaccactcg 1440

aatcgaacac gtcttgctaa acttcttagg ttccagtctt ctcatcatcc aactgacatt 1500

actagcctag accagtatgt ggaaagaatg aaggaaaaac aagacaaaat ctacttcatg 1560

gctgggtcca gcagaaaaga ggctgaatct tctccatttg ttgagcgact tctgaaaaag 1620

ggctatgaag ttatttacct cacagaacct gtggatgaat actgtattca ggcccttccc 1680

gaatttgatg ggaagaggtt ccagaatgtt gccaaggaag gagtgaagtt cgatgaaagt 1740

gagaaaacta aggagagtcg tgaagcagtt gagaaagaat ttgagcctct gctgaattgg 1800

atgaaagata aagcccttaa ggacaagatt gaaaaggctg tggtgtctca gcgcctgaca 1860

gaatctccgt gtgctttggt ggccagccag tacggatggt ctggcaacat ggagagaatc 1920

atgaaagcac aagcgtacca aacgggcaag gacatctcta caaattacta tgcgagtcag 1980

aagaaaacat ttgaaattaa tcccagacac ccgctgatca gagacatgct tcgacgaatt 2040

aaggaagatg aagatgataa aacagttttg gatcttgctg tggttttgtt tgaaacagca 2100

acgcttcggt cagggtatct tttaccagac actaaagcat atggagatag aatagaaaga 2160

atgcttcgcc tcagtttgaa cattgaccct gatgcaaagg tggaagaaga gcccgaagaa 2220

gaacctgagg agacagcaga agacacaaca gaagacacag agcaagacga agatgaagaa 2280

atggatgtgg gaacagatga agaagaagaa acagcaaagg aatctacagc tgaaaaagat 2340

gaattctaa 2349

<210> 6

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 6

cgggattcat ggacgatgaa gttgatgtgg at 32

<210> 7

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 7

gctctagatt agaattcatc tttttcagct g 31

Claims

1.PEG化多肽，包含PIBC以及平均分子量为20000～40000的PEG，并且PIBC与所述PEG共价连接，其中，PIBC选自：

A1)：具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的多肽；和

A2)：由A1)衍生的且具有与A1)相同功能的多肽，其氨基酸序列与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列相比，具有一个或多个氨基酸残基的置换和/或缺失和/或添加，或者具有至少60％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％的同一性；

优选地，所述PEG连接在PIBC的N端或C端；

优选地，所述PEG为直链PEG或枝化PEG。

2.权利要求1的PEG化多肽，其中，PIBC与PEG通过连接基团共价连接，或直接通过共价键连接；

优选地，所述PEG化多肽具有如下结构：

R-(CH₂CH₂O)_n-linker-PIBC；

其中，n为PEG的聚合度，且n满足使PEG的分子量为20000～40000的条件，R为PEG的端基，例如为甲氧基；linker为连接基团，例如

所述氨基酸残基为带有巯基的氨基酸(例如半胱氨酸(Cys))残基；

优选地，所述PEG化多肽具有如式I所示的结构：

式I中，n为PEG的聚合度。

3.权利要求1或2的PEG化多肽，所述共价键连接通过利用反应物1与反应物2进行Michael加成反应实现，其中，所述反应物1为一端连接有马来酰亚胺的PEG，所述反应物2为N端或C端引入含有巯基的氨基酸残基的PIBC。

4.权利要求3的PEG化多肽，所述反应物1具有如式II所示的结构：

式II中，n为PEG的聚合度。

5.权利要求3或4的PEG化多肽，所述含有巯基的氨基酸残基为半胱氨酸残基；

优选地，所述反应物2为具有SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示氨基酸序列的多肽。

6.制备权利要求1-5任一项的PEG化多肽的方法，包括使PIBC与平均分子量为20000～40000的PEG发生共价连接的步骤；

优选地，所述方法包括：利用反应物1与反应物2进行Michael加成反应的步骤；

所述反应物1为一端连接有马来酰亚胺的PEG；

所述反应物2为N端或C端引入含有巯基的氨基酸残基的PIBC。

7.含有权利要求1-5任一项的PEG化多肽的药物组合物；

优选地，所述药物组合物用于治疗和/或预防受试者的与gp96蛋白过度表达相关的疾病(例如肿瘤，例如乳腺癌，例如三阴乳腺癌)。

8.含有权利要求1-5任一项的PEG化多肽的制剂；

优选地，所述制剂用于与gp96蛋白结合，抑制肿瘤细胞增殖和/或生长和/或侵袭，促进肿瘤细胞凋亡，和/或抑制肿瘤生长；

优选地，所述肿瘤为乳腺癌，例如三阴乳腺癌。

9.权利要求1-5任一的PEG化多肽在制备药物中的用途，所述药物用于治疗和/或预防受试者的与gp96蛋白过度表达相关的疾病(例如肿瘤，例如乳腺癌，例如三阴乳腺癌)。

10.权利要求1-5任一的PEG化多肽在制备制剂中的用途，所述制剂用于与gp96蛋白结合，抑制肿瘤细胞增殖和/或生长和/或侵袭，促进肿瘤细胞凋亡，和/或，抑制肿瘤生长；

优选地，所述肿瘤为乳腺癌，例如三阴乳腺癌。