CN111333699A - 一种多肽或其衍生物及其在制备防治肿瘤的药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种靶向促进C‑Myc蛋白降解的多肽或所述多肽的衍生物及其在制备防治肿瘤的药物中的应用。所述多肽的氨基酸序列如将序列表中SEQ ID No.1所示的氨基酸序列中的两个或两个以上的氨基酸替换为侧链可相连的非天然氨基酸所示;所述的衍生物包括所述多肽与细胞穿膜肽接连所形成的嵌合肽、所述多肽与病毒形成的融合肽、甲基化的所述多肽、糖基化的所述多肽和聚乙二醇化的所述多肽。所述多肽或其衍生物能够特异性地与TRB3结合,从而阻断TRB3和C‑Myc蛋白的相互作用,促进C‑Myc蛋白降解,因此将其应用于防治肿瘤的药物的制备中。所制备的药物在治疗肿瘤疾病中,具有疗效显著,毒副作用少,使用安全的优点。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,具体涉及一种多肽或其衍生物及其在制备防治肿瘤的药物中的应用。
背景技术
C-Myc是Myc家族重要成员之一。作为转录因子,C-Myc广泛表达于各种细胞,尤其具有高增殖活性的细胞,例如皮肤和肠道。C-Myc具有转化细胞的能力,并具有与染色质DNA结合的特性,在调节细胞生长、分化及恶性转移中发挥重要作用。越来越多的研究证实,C-Myc在多种肿瘤中高表达,并与一系列肿瘤的高恶性程度、低分化能力密切相关。C-Myc能诱导肿瘤细胞的快速增殖,抑制细胞的分化和凋亡,从而促进肿瘤发生发展。
C-Myc作为致癌蛋白在许多肿瘤的发生发展中起着重要的作用,因此靶向C-Myc蛋白、抑制C-Myc蛋白的表达及致癌活性在许多肿瘤的治疗中发挥着关键作用。目前在靶向C-Myc进行肿瘤治疗有两种新的策略:靶向C-Myc蛋白表达或靶向C-Myc/Max的相互作用。反义寡核苷酸和RNA干扰技术(RNAi)技术被用来抑制C-Myc蛋白的表达,但是由于在正常细胞中C-Myc也发挥着重要功能,因此这两种靶向药物在治疗方面缺乏敏感性、特异性和有效性。靶向C-Myc/Max相互作用的小分子化合物能够抑制C-Myc下游靶基因的活性,目前处于临床及临床前开发之中。因此,开发靶向C-Myc相互作用的蛋白质,降解C-Myc蛋白的表达对于许多肿瘤的治疗起着重要作用。而一些打断C-Myc及其相互作用蛋白的化合物或多肽药物直接作用于该信号通路的下游分子,靶向性强、副作用小,具有良好的抑制肿瘤发生和发展的成药前景。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对C-Myc分子靶向药物高耐药率以及缺乏直接靶向C-Myc蛋白稳定性药物的现状,提供一种多肽或其衍生物及其在制备防治肿瘤的药物中的应用。
本发明的发明人经过深入的研究和反复的试验发现,获得了能够靶向促进C-Myc降解的多肽CM4(氨基酸序列参见序列表SEQ ID No.1),然而多肽CM4的生物稳定性比较低。该生物稳定性低的缺陷与多肽CM4在溶液中不能稳定形成活性所需的α螺旋构象直接相关。由此,发明人进行了针对性的研究和试验,意外发现如果将多肽CM4中特定位置的氨基酸残基替换为侧链可以相连的非天然氨基酸,如S-戊烯丙氨酸(S5),则改造后的多肽具有稳定的α螺旋的二级结构,使改造后的多肽具有极高的亲和力、抗酶解稳定性以及细胞穿膜性,从而具有极高的α螺旋稳定性、代谢稳定性,能够抑制多种肿瘤细胞增殖和转移,从而应用于制备治疗肿瘤的药物中。基于发明人的研究工作,本发明提供下述的技术方案。
本发明提供的技术方案之一是:一种靶向促进C-Myc蛋白降解的多肽或所述多肽的衍生物,所述多肽的氨基酸序列为将如序列表中SEQ ID No.1所示的氨基酸序列中的两个或两个以上的氨基酸替换为侧链可相连的非天然氨基酸;所述的衍生物包括所述多肽与细胞穿膜肽接连所形成的嵌合肽、所述多肽与病毒形成的融合肽、甲基化的所述多肽、糖基化的所述多肽和聚乙二醇化的所述多肽。其中,所述的细胞穿膜肽为本领域常规的细胞穿膜肽,只要其能辅助将所述多肽送入细胞以发挥作用即可。通常地,所述的细胞穿膜肽为由10~30个氨基酸组成的短肽分子。
本发明中,所述的侧链相连的非天然氨基酸为本领域常规的非天然氨基酸,较佳地为S-戊烯丙氨酸(S5)。
本发明中,所述替换的氨基酸的数目为两个且所述替换的氨基酸的位置分别为第i位和第i+4位,其中1≤i≤10,i为正整数。
更佳地,所述的多肽的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.2~11中任一项所示;或者,所述的多肽为:如序列表中SEQ ID NO.2~11任一项所示的氨基酸序列经过替换、缺失或添加一个或几个氨基酸后形成的仍然具有改造前促进C-Myc蛋白降解的活性的多肽。
其中,上述SEQ ID No.2~SEQ ID No.11所示的氨基酸序列中可进行适当地氨基酸替换、缺失或添加,只要使改造后的氨基酸序列仍然能够与TRB3特异性结合并且保持改造前的活性即可。
本发明提供的技术方案之二是:一种上述靶向促进C-Myc蛋白降解的多肽或所述多肽的衍生物在制备防治与TRB3和C-Myc相互作用相关的疾病、特别是肿瘤的药物中的应用。
所述的肿瘤可为本领域常规的肿瘤。较佳地为淋巴瘤、白血病、肝癌、肺癌、乳腺癌、肠癌。其中,所述淋巴瘤可为本领域常规的淋巴瘤,优选T细胞淋巴瘤或者B细胞淋巴瘤;所述白血病可为本领域常规的白血病,优选淋巴细胞型白血病或非淋巴细胞型白血病;所述的肝癌可为本领域常规的肝癌,优选原发性肝癌或继发性肝癌;所述的肺癌可为本领域常规的肺癌,优选小细胞肺癌或非小细胞肺癌;所述乳腺癌可为本领域常规的乳腺癌,优选非浸润性乳腺癌、早期浸润性乳腺癌、浸润性特殊类型乳腺癌或浸润性非特殊类型乳腺癌;所述的肠癌可为本领域常规的肠癌,优选结肠癌或直肠癌。
所述的防治可为本领域常规概念,即包括预防和/或治疗。所述预防可为本领域常规的预防,较佳地指存在可能的肿瘤因素时,使用后防止或降低肿瘤的产生。所述治疗可为本领域常规的治疗,较佳地指减轻肿瘤的程度,或者治愈肿瘤使之正常化,或者减缓肿瘤的进程。
本发明提供的技术方案之三是:一种抗肿瘤的药物组合物,其含有上述靶向促进C-Myc蛋白降解的多肽或所述多肽的衍生物。
所述的活性成分是指具有预防或治疗肿瘤功能的化合物。在所述药物组合物中,所述的靶向促进C-Myc蛋白降解的多肽或所述多肽可以单独作为活性成分或和其他具有抗肿瘤活性的化合物一起作为活性成分。
本发明所述的药物组合物的给药途径较佳的为注射给药或口服给药。所述注射给药较佳的包括静脉注射、肌肉注射、腹腔注射、皮内注射或皮下注射等途径。所述的药物组合物为本领域常规的各种剂型,较佳的为固体、半固体或液体的形式,可以为水溶液、非水溶液或混悬液,更佳的为片剂、胶囊、颗粒剂、注射剂或输注剂等。
较佳地,本发明所述的药物组合物还包括一种或多种药用载体。所述的药用载体为本领域常规药用载体,所述的药用载体可以为任意合适的生理学或药学上可接受的药物辅料。所述的药物辅料为本领域常规的药物辅料,较佳的包括药学上可接受的赋形剂、填充剂或稀释剂等。更佳地,所述的药物组合物包括0.01~99.99%的上述蛋白质和0.01~99.99%的药用载体,所述百分比为占所述药物组合物的质量百分比。
较佳地,所述的药物组合物的施用量为有效量,所述有效量为能够缓解或延迟疾病、退化性或损伤性病症进展的量。所述有效量可以以个体基础来测定,并将部分基于待治疗症状和所寻求结果的考虑。
在符合本领域常识的基础上,上述各优选条件,可任意组合,即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于:本发明的多肽或多肽衍生物能够靶向促进C-Myc蛋白降解,抑制C-Myc下游信号通路的激活,从而应用于抗肿瘤的药物的制备中。所述的多肽及其衍生物在治疗肿瘤疾病中,尤其是在针对肝癌、肺癌、肠癌以及乳腺癌的体内和体外实验、以及针对淋巴瘤、白血病的体外实验中,均表现出了能够显著抑制肿瘤生长的能力,疗效显著,且所述的多肽及其衍生物具有毒副作用少,使用安全的优点。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明,但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,按照常规方法和条件,或按照商品说明书选择。
若无特别说明,实施例中所述的PBDS溶液,指浓度为0.1M、pH值为7.2的磷酸盐缓冲液。
实施例中所述的室温为本领域常规的室温,较佳的为15~30℃。
实验结果用均值±标准误表示,经参数或者非参数方差检验,经比较p<0.05认为有显著性差异,p<0.01认为有极其显著性差异。
实施例1多肽的合成
多肽CM4的氨基酸序列参见序列表中SEQ ID No.1。多肽CM4由中肽生化有限公司合成并纯化。
引入两个非天然氨基酸S-戊烯丙氨酸(S5)进行固相多肽链合成。固相多肽链合成完成后采用钌作为催化剂进行烯烃复分解反应(RCM)环化即得目标多肽。最后将目标多肽从树脂上切割下来进行纯化。上述固相多肽链合成及纯化的步骤由中肽生化有限公司完成。其中,两个S-戊烯丙氨酸(S5)插入在多肽CM4氨基酸序列中的第i、i+4位,由此得到不同序列的改造后的多肽(氨基酸序列参见序列表SEQ ID No.2~SEQ ID No.11),其具体插入位点如下所示:
CM4:Lys-Arg-Arg-Glu-Gln-Leu-Lys-His-Lys-Leu-Glu-Gln-Leu-Arg;
CM4-S01:S5-Arg-Arg-Glu-S5-Leu-Lys-His-Lys-Leu-Glu-Gln-Leu-Arg;
CM4-S02:Lys-S5-Arg-Glu-Gln-S5-Lys-His-Lys-Leu-Glu-Gln-Leu-Arg;
CM4-S03:Lys-Arg-S5-Glu-Gln-Leu-S5-His-Lys-Leu-Glu-Gln-Leu-Arg;
CM4-S04:Lys-Arg-Arg-S5-Gln-Leu-Lys-S5-Lys-Leu-Glu-Gln-Leu-Arg;
CM4-S05:Lys-Arg-Arg-Glu-S5-Leu-Lys-His-S5-Leu-Glu-Gln-Leu-Arg;
CM4-S06:Lys-Arg-Arg-Glu-Gln-S5-Lys-His-Lys-S5-Glu-Gln-Leu-Arg;
CM4-S07:Lys-Arg-Arg-Glu-Gln-Leu-S5-His-Lys-Leu-S5-Gln-Leu-Arg;
CM4-S08:Lys-Arg-Arg-Glu-Gln-Leu-Lys-S5-Lys-Leu-Glu-S5-Leu-Arg;
CM4-S09:Lys-Arg-Arg-Glu-Gln-Leu-Lys-His-S5-Leu-Glu-Gln-S5-Arg;
CM4-S10:Lys-Arg-Arg-Glu-Gln-Leu-Lys-His-Lys-S5-Glu-Gln-Leu-S5;
实施例2用表面等离子共振的方法检测多肽与TRB3蛋白的结合能力
表面等离子共振实验在表面等离子共振仪Biacore T200中进行,操作步骤按照等离子共振仪Biacore T200的说明书进行。具体步骤如下:
1.将纯化的TRB3蛋白(购自RD公司)通过氨基偶联到CM5芯片上(购自GE公司),按10μL/min的流速洗脱除去未结合的蛋白,并且平衡芯片表面2小时。其中,氨基偶联、洗脱和平衡的具体步骤参见GE公司CM5芯片的相关说明书。
2.自动进样250μL不同浓度(800、400、200、50、12.5、6.25和3.125nM)的实施例1所制备的CM4-S01~CM4-S10和CM4多肽片段,整个表面等离子共振实验在25℃进行。所使用的缓冲液为HBS-EP缓冲液[0.01M HEPES、0.15M NaCl、3mM EDTA和0.005%(w/w)表面活性剂]。用Biacore T200自带分析软件模拟不同浓度多肽与TRIB3的结合曲线,计算出多肽与TRIB3蛋白的亲和力。表1说明,肽段CM4-S01、CM4-S02、CM4-S03、CM4-S04、CM4-S05、CM4-S06、CM4-S07、CM4-S08、CM4-S09、CM4-S10与TRB3蛋白的亲和力明显高于多肽CM4与TRB3蛋白的亲和力。
表1多肽CM4-S01~CM4-S10和CM4与TRB3蛋白的亲和力测试
多肽名称 | 与TRB3蛋白的亲和力常数(KD) |
CM4(对照) | 7.635×10<sup>-8</sup>M |
CM4-S01 | 2.12×10<sup>-10</sup>M |
CM4-S02 | 1.25×10<sup>-10</sup>M |
CM4-S03 | 3.25×10<sup>-10</sup>M |
CM4-S04 | 4.2×10<sup>-10</sup>M |
CM4-S05 | 1.09×10<sup>-10</sup>M |
CM4-S06 | 3.76×10<sup>-10</sup>M |
CM4-S07 | 1.25×10<sup>-10</sup>M |
CM4-S08 | 3.45×10<sup>-10</sup>M |
CM4-S09 | 1.76×10<sup>-10</sup>M |
CM4-S10 | 3.21×10<sup>-10</sup>M |
实施例3圆二色谱法检测多肽的α螺旋率
用圆二色谱仪(购自日本Jasco公司)检测多肽的α螺旋率。将实施例1所制备的多肽CM4、CM4-S01、CM4-S02、CM4-S03、CM4-S04、CM4-S05、CM4-S06、CM4-S07、CM4-S08、CM4-S09、CM4-S10溶解到PBS溶液中,将圆二色谱仪的上机浓度调整为1mg/mL,结果如表2所示。表2说明,多肽CM4-S01、CM4-S02、CM4-S03、CM4-S04、CM4-S05、CM4-S06、CM4-S07、CM4-S08、CM4-S09、CM4-S10的α螺旋率明显高于多肽CM4。多肽的α螺旋率的维持是增加多肽稳定性的重要指标,因此,多肽CM4-S01~CM4-S10的α螺旋率的提高会增强其稳定性。因此,多肽CM4-S01~CM4-S10的α螺旋率的提高与其和TRIB3蛋白结合能力的增加,以及多种肿瘤细胞的增殖和转移有关。其中,α螺旋率指保持二级结构α螺旋的多肽的肽段数量占总多肽的肽段数量的百分比。
表2圆二色谱法测定多肽α螺旋率
多肽名称 | α螺旋率(%) |
CM4 | 12 |
CM4-S01 | 45 |
CM4-S02 | 63 |
CM4-S03 | 58 |
CM4-S04 | 72 |
CM4-S05 | 38 |
CM4-S06 | 41 |
CM4-S07 | 56 |
CM4-S08 | 73 |
CM4-S09 | 46 |
CM4-S10 | 55 |
实施例4流式细胞术检测多肽穿膜能力
流式细胞术检测多肽穿过细胞膜的能力。具体操作步骤如下:
1.收集对数生长期的淋巴瘤细胞Jurkat(购自中国医学科学院基础医学研究所),用1640培养基(购自美国Invitrogen公司)调整细胞浓度,制成20万个/mL的细胞悬液。
2.将1mL步骤1所制得的细胞悬液加入6孔板进行培养,12小时后换成新的培养基,并且分别加入1μg/mL用FAM荧光基团标记的多肽CM4、CM4-S01、CM4-S02、CM4-S03、CM4-S04、CM4-S05、CM4-S06、CM4-S07、CM4-S08、CM4-S09或CM4-S10(FAM荧光基团标记的多肽由中肽生化有限公司合成)。
3.6小时后,收集细胞,制备成单细胞悬液,冷PBS重悬细胞。
4.运用流式细胞计数仪,激发波长为465nm,发射波长为520nm,测定细胞内荧光的强弱,计算含荧光细胞占总细胞的百分比。结果如表3所示,含荧光细胞占总细胞百分比越高,说明多肽能穿过的细胞数越多,即多肽的穿膜能力越好。
表2说明,给予多肽CM4、CM4-S01、CM4-S02、CM4-S03、CM4-S04、M4-S05、CM4-S06、CM4-S07、CM4-S08、CM4-S09或CM4-S10处理后,含荧光的细胞比例明显多于CM4,因此多肽CM4-S01~CM4-S10的穿膜能力明显优于CM4。
表3流式细胞术检测多肽穿膜能力
实施例5免疫印迹实验验证多肽对C-Myc蛋白的半衰期的影响
1.收集对数生长期的淋巴瘤细胞Jurkat,用1640培养基调整细胞浓度,制成20万个/mL的细胞悬液。
2.将2mL步骤1所制得的细胞悬液加入6孔板进行培养,12小时后换成新的培养基,并且分别加入1μg/mL实施例1所制得的多肽CM4、CM4-S01、CM4-S02、CM4-S03、CM4-S04、CM4-S05、CM4-S06、CM4-S07、CM4-S08、CM4-S09和CM4-S10,对照组加入等体积的溶剂PBS。
3.12小时后,按时间点加入蛋白合成抑制剂放线菌酮(Cycloheximide,CHX),使其作用时间分别为24h,12h,8h,4h,2h,0h。每过12h分别补加1μg/mL实施例1所制得的多肽CM4、CM4-S01、CM4-S02、CM4-S03、CM4-S04、CM4-S05、CM4-S06、CM4-S07、CM4-S08、CM4-S09和CM4-S10,对照组加入等体积的溶剂。
4.收集细胞,加入RIPA裂解液(购自上海碧云天生物技术有限公司)(按照使用说明书,用前加入蛋白酶抑制剂PMSF和leupeptin,aprotinin等其它抑制剂),冰上裂解30min;12000rpm,4℃离心30min;吸取上清,用BCA法对蛋白进行定量,按照定量结果将蛋白调整成统一浓度,加入5×上样缓冲液,98℃变性10min。
5.取部分样品按照《分子克隆》所述的方法进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳结束后,进行免疫印迹检测。
6.免疫印迹结果利用Gel-Pro Analyzer32Analyzer4.0进行定量分析,并绘制时间相关C-Myc含量变化曲线,确定C-Myc蛋白含量下降至CHX作用0h时的50%所需时间,即为C-Myc蛋白半衰期。结果如表4所示。
表4说明,与多肽CM4相比,多肽CM4-S01、CM4-S02、CM4-S03、M4-S04、CM4-S05、CM4-S06、CM4-S07、CM4-S08、CM4-S09和CM4-S10能明显降低C-Myc蛋白半衰期。
表4多肽对细胞C-Myc蛋白半衰期的影响
多肽名称 | C-Myc蛋白半衰期(min) |
对照 | 120 |
CM4 | 60 |
CM4-S01 | 30 |
CM4-S02 | 15 |
CM4-S03 | 15 |
CM4-S04 | 20 |
CM4-S05 | 10 |
CM4-S06 | 10 |
CM4-S07 | 15 |
CM4-S08 | 15 |
CM4-S09 | 18 |
CM4-S10 | 20 |
实施例6细胞计数实验验证多肽抑制肿瘤细胞的生长
1.收集对数生长期的淋巴瘤细胞Jurkat(购自中国医学科学院基础医学研究所)、白血病细胞K562(购自中国医学科学院基础医学研究所)、肝癌细胞HepG2(购自中国医学科学院基础医学研究所)、肺癌细胞A549(购自中国医学科学院基础医学研究所)、结肠癌细胞HCT-8(购自中国医学科学院基础医学研究所)和乳腺癌细胞MDA-MB-231(购自中国医学科学院基础医学研究所),调整细胞浓度,制成15万个/mL的细胞悬液。
2.取步骤1所制得的细胞悬液1ml,将其加入12孔板进行培养(其中HepG2、HCT-8和MDA-MB-231细胞所用培养基为DMEM培养基,Jurkat、K562细胞所用培养基为RPMI1640培养基,均购自Invitrogen公司(培养温度为37℃,培养基体积为1mL),12小时后换成新的培养基,并且分别加入1μg/mL实施例1所制得的多肽CM4、CM4-S01、CM4-S02、CM4-S03、CM4-S04、CM4-S05、CM4-S06、CM4-S07、CM4-S08、CM4-S09和CM4-S10。对照组加入等体积溶剂。每隔一天传代一次,并进行计数。随着细胞数量增多,更换至相应底面积培养皿中进行培养。培养12天后,收集所有细胞至1ml培养基中进行细胞计数,并计算总的细胞数量。实验结果以mean±SD表示,并采用t test检验各组与CM4组间的差异。实验结果见表5~10。表5~10说明多肽CM4-S01、CM4-S02、CM4-S03、CM4-S04、CM4-S05、CM4-S06、CM4-S07、CM4-S08、CM4-S09和CM4-S10相比于CM4更能够抑制肿瘤细胞的生长。
表5多肽抑制淋巴瘤细胞Jurkat的生长
多肽名称 | 细胞数量(10<sup>4</sup>) | P值 |
对照 | 748.468±34.567 | |
CM4 | 651.235±45.349 | |
CM4-S01 | 341.435±28.431 | 0.0003 |
CM4-S02 | 218.346±34.421 | 0.0004 |
CM4-S03 | 345.325±46.245 | 0.0061 |
CM4-S04 | 436.756±40.456 | 0.0006 |
CM4-S05 | 450.384±43.421 | 0.0341 |
CM4-S06 | 273.493±23.498 | 0.0016 |
CM4-S07 | 248.482±16.352 | 0.0002 |
CM4-S08 | 336.478±28.321 | 0.0006 |
CM4-S09 | 245.834±23.685 | 0.0002 |
CM4-S10 | 245.682±32.134 | 0.0003 |
表6多肽抑制白血病细胞K562的生长
多肽名称 | 细胞数量(10<sup>4</sup>) | P值 |
对照 | 789.345±35.142 | |
CM4 | 610.378±43.124 | |
CM4-S01 | 240.367±24.462 | 0.0004 |
CM4-S02 | 264.846±30.146 | 0.0003 |
CM4-S03 | 450.462±34.678 | 0.0019 |
CM4-S04 | 354.675±18.746 | 0.0002 |
CM4-S05 | 450.345±23.456 | 0.0046 |
CM4-S06 | 189.347±19.325 | 0.0002 |
CM4-S07 | 198.287±21.347 | 0.0003 |
CM4-S08 | 243.579±20.346 | 0.0003 |
CM4-S09 | 298.428±31.465 | 0.0004 |
CM4-S10 | 188.436±23.584 | 0.0003 |
表7多肽抑制肝癌细胞HepG2的生长
表8多肽抑制肺癌细胞A549的生长
多肽名称 | 细胞数量(10<sup>4</sup>) | P值 |
对照 | 712.638±28.346 | |
CM4 | 584.684±27.348 | |
CM4-S01 | 312.389±23.491 | 0.0004 |
CM4-S02 | 278.467±19.478 | 0.0001 |
CM4-S03 | 298.489±23.986 | 0.0005 |
CM4-S04 | 232.389±28.478 | 0.0008 |
CM4-S05 | 302.385±26.345 | 0.0045 |
CM4-S06 | 198.378±20.345 | 0.0005 |
CM4-S07 | 182.356±22.456 | 0.0004 |
CM4-S08 | 234.568±29.346 | 0.0008 |
CM4-S09 | 184.382±26.346 | 0.0005 |
CM4-S10 | 206.478±15.347 | 0.0002 |
表9多肽抑制结肠癌细胞HCT-8的生长
表10多肽抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231的生长
实施例7细胞划痕实验验证多肽CM4、CM4-S01、CM4-S02、CM4-S03、CM4-S04、CM4-S05、CM4-S06、CM4-S07、CM4-S08、CM4-S09和CM4-S10抑制肿瘤细胞划痕后的愈合
具体操作步骤如下:
1.先用记号笔在6孔板背后,用直尺比着划横线,横穿过孔。
2.在每个孔中分别加入5×105个肿瘤细胞,在DMEM培养基中37℃孵育箱培养过夜后细胞贴壁。该肿瘤细胞为对数生长期的肝癌细胞HepG2、肺癌细胞A549、结肠癌细胞HCT-8和乳腺癌细胞MDA-MB-231。
3.第二天用枪头比着直尺,尽量垂直于背后的横线进行划痕,枪头要垂直。
4.用PBS洗细胞3次,去除划下的细胞,加入新的培养基,同时加入1μg/mL实施例1所制备的多肽CM4、CM4-S01、CM4-S02、CM4-S03、CM4-S04、CM4-S05、CM4-S06、CM4-S07、CM4-S08、CM4-S09和CM4-S10。对照组给予等体积的溶剂。取样拍照,计算划痕面积,即为0h划痕面积。
5.然后放入37℃5%(v/v)CO2培养箱培养,24小时后取样拍照。24小时后取样拍照,并计算此时未修复的剩余面积,即24h剩余面积。按损伤修复比=(0h划痕面积-24h剩余面积)/0h划痕面积*100%计算损伤修复比。
实验结果以mean±SD表示,并采用t test检验各组与CM4组间的差异。实验结果见表11~14。
表11~14的结果表明,损伤修复面积比越大,肿瘤细胞的迁移能力越强,细胞划痕后愈合能力越强。因此多肽CM4-S01、CM4-S02、CM4-S03、CM4-S04、CM4-S05、CM4-S06、CM4-S07、CM4-S08、CM4-S09和CM4-S10可以降低肿瘤细胞划痕后的愈合能力。
表11多肽CM4-S01~CM4-S10和CM4抑制肝癌细胞HepG2迁移
表12多肽CM4-S01~CM4-S10和CM4抑制肺癌细胞A549迁移
多肽名称 | 损伤修复面积比 | P值 |
对照 | 88.2±3.56 | |
CM4 | 82.4±3.45 | |
CM4-S01 | 42.3±1.46 | 0.0001 |
CM4-S02 | 26.4±3.56 | 0.0005 |
CM4-S03 | 56.4±3.48 | 0.0234 |
CM4-S04 | 32.4±2.56 | 0.0005 |
CM4-S05 | 62.4±3.42 | 0.0187 |
CM4-S06 | 29.8±2.34 | 0.0002 |
CM4-S07 | 34.8±1.64 | 0.0001 |
CM4-S08 | 25.7±1.38 | 0.0002 |
CM4-S09 | 29.6±3.16 | 0.0004 |
CM4-S10 | 32.4±2.02 | 0.0002 |
表13多肽CM4-S01~CM4-S10和CM4抑制结肠癌细胞HCT-8迁移
表14多肽CM4-S01~CM4-S10和CM4抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231迁移
多肽名称 | 损伤修复面积比 | P值 |
对照 | 87.4±1.34 | |
CM4 | 68.4±1.57 | |
CM4-S01 | 40.4±1.57 | 0.0002 |
CM4-S02 | 35.6±2.78 | 0.0007 |
CM4-S03 | 42.9±2.78 | 0.0246 |
CM4-S04 | 31.7±1.34 | 0.0004 |
CM4-S05 | 46.3±1.67 | 0.0003 |
CM4-S06 | 28.7±3.12 | 0.0403 |
CM4-S07 | 38.4±2.12 | 0.0003 |
CM4-S08 | 29.4±1.49 | 0.0003 |
CM4-S09 | 31.4±2.34 | 0.0004 |
CM4-S10 | 36.5±2.02 | 0.0004 |
实施例8克隆形成实验验证多肽CM4、CM4-S01、CM4-S02、CM4-S03、CM4-S04、CM4-S05、CM4-S06、CM4-S07、CM4-S08、CM4-S09和CM4-S10抑制淋巴瘤细胞和白血病细胞克隆形成
其操作步骤如下:
1.铺下层琼脂:5%(w/w)琼脂沸水浴至完全融化,冷却至50℃,加9倍体积37℃预温的1640培养液(购自Invitrogen公司),混匀,加入24孔板,每孔0.8mL,室温凝固备用。
2.铺上层琼脂:9.4mL细胞悬液中加入0.6mL 50℃5%(w/w)琼脂,混匀,加入已铺好下层琼脂的24孔板,每孔0.8mL。室温凝固。每孔细胞数100个。其中,细胞悬液的制备方法为:将淋巴瘤细胞Jurkat和白血病细胞K562用1640培养液稀释,调整浓度为132个细胞/mL。
3.将步骤2所得的细胞用1640培养液在37℃孵育箱中孵育培养3周,计算克隆形成数量。
表15多肽CM4-S01~CM4-S10和CM4抑制白血病细胞的克隆形成
其结果表15所示。表15的结果说明,多肽CM4-S01~CM4-S10相对于多肽CM4对白血病细胞克隆形成的抑制水平显著提高。
实施例9肿瘤皮下生长实验验证多肽抑制肿瘤细胞在小鼠体内的生长
操作步骤如下:
1.实验耗材及试剂:灭菌1.5mL EP管、15mL离心管、枪头、滤网(100目)、脱脂棉球、镊子数把、酒精棉球、无菌1mL注射器、500mL烧杯(灭菌,用前照紫外)、PBS(过滤)、胰酶,以及血清。
2.实验动物及分组:4-6周龄雄性裸鼠120只(购自北京维通利华实验动物有限公司),随机分为1组:CM4、CM4-S01、CM4-S02、CM4-S03、CM4-S04、CM4-S05、CM4-S06、CM4-S07、CM4-S08、CM4-S09和CM4-S10组及溶剂对照组,每组10只。
3.细胞制备:将贴壁培养的肿瘤细胞用胰酶消化,到达胰酶消化时间后(此时细胞状态应为单细胞且刚好贴壁不掉),吸掉胰酶。用含有1%血清的PBS按2mL/皿终止,将细胞吹下,移至15mL离心管中,1200转离心5min。弃上清,PBS重悬,过100目滤网一次;细胞计数,调整细胞终浓度至2.5×107/mL。该肿瘤细胞为对数生长期的肝癌细胞HepG2、肺癌细胞A549、结肠癌细胞HCT-8和乳腺癌细胞MDA-MB-231直接收集至15mL离心管,1200转离心5min。弃上清,PBS重悬,过100目滤网一次;细胞计数,调整细胞终浓度至2.5×107/mL。
4.肿瘤细胞接种:接种5×106个肿瘤细胞(细胞悬液200μL)于裸鼠左上腹部近腋下皮下。
5.肿瘤生长观察:皮下注射肿瘤细胞后一周用多肽进行治疗(5mg/kg体重,每周两次),游标卡尺纪录肿瘤大小。肿瘤体积=(长×宽×宽)/2;
实验结果以mean±SEM表示,并采用t test检验各组与CM4组间的差异。
接种肿瘤后4周,各组小鼠皮下肿瘤体积如表14~18所示,肿瘤体积越大表明肿瘤生长越快,因此多肽CM4-S01、CM4-S02、CM4-S03、CM4-S04、CM4-S05、CM4-S06、CM4-S07、CM4-S08、CM4-S09和CM4-S10均能抑制肿瘤细胞在小鼠体内生长。
表16.多肽抑制肝癌细胞HepG2在小鼠体内生长
多肽名称 | 肿瘤体积(mm<sup>3</sup>) | P值 |
对照 | 2535.2±160.3 | |
CM4 | 2465.7±180.3 | |
CM4-S01 | 1683.5±170.2 | 0.0169 |
CM4-S02 | 870.3±46.7 | <0.0001 |
CM4-S03 | 904.6±170.1 | 0.0368 |
CM4-S04 | 542.1±43.7 | <0.0001 |
CM4-S05 | 562.4±42.5 | <0.0001 |
CM4-S06 | 784.3±56.4 | <0.0001 |
CM4-S07 | 624.3±84.3 | <0.0001 |
CM4-S08 | 389.4±42.3 | <0.0001 |
CM4-S09 | 434.5±43.2 | <0.0001 |
CM4-S10 | 562.7±62.4 | <0.0001 |
表17.多肽抑制肺癌细胞A549在小鼠体内生长
表18.多肽抑制结肠癌细胞HCT-8小鼠体内生长
多肽名称 | 肿瘤体积(mm<sup>3</sup>) | P值 |
对照 | 2267.4±139.3 | |
CM4 | 1987.4±80.3 | |
CM4-S01 | 1334.5±81.4 | 0.0041 |
CM4-S02 | 302.4±31.5 | <0.0001 |
CM4-S03 | 1150.4±106.4 | 0.0025 |
CM4-S04 | 413.4±52.1 | <0.0001 |
CM4-S05 | 462.3±41.3 | <0.0001 |
CM4-S06 | 487.4±56.7 | <0.0001 |
CM4-S07 | 482.6±32.5 | <0.0001 |
CM4-S08 | 413.4±43.8 | <0.0001 |
CM4-S09 | 509.3±48.8 | <0.0001 |
CM4-S10 | 489.7±42.4 | <0.0001 |
表19.多肽抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231在小鼠体内生长
上述实施例结果表明,本发明的多肽具有显著的抗肿瘤作用,可作为活性成份用于制备抗肿瘤的药物。
应理解,在阅读了本发明的上述内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 北京伟峰益民科技有限公司
<120> 一种多肽或其衍生物及其在制备防治肿瘤的药物中的应用
<130> P180115777C
<160> 11
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CM4
<400> 1
Lys Arg Arg Glu Gln Leu Lys His Lys Leu Glu Gln Leu Arg
1 5 10
<210> 2
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CM4-S1
<220>
<222> (1)..(1)
<223> S5代表S-戊烯丙氨酸
<220>
<222> (5)..(5)
<223> S5代表S-戊烯丙氨酸
<400> 2
S5 Arg Arg Glu S5 Leu Lys His Lys Leu Glu Gln Leu Arg
1 5 10
<210> 3
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CM4-S2
<220>
<222> (2)..(2)
<223> S5代表S-戊烯丙氨酸
<220>
<222> (6)..(6)
<223> S5代表S-戊烯丙氨酸
<400> 3
Lys S5 Arg Glu Gln S5 Lys His Lys Leu Glu Gln Leu Arg
1 5 10
<210> 4
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CM4-S3
<220>
<222> (3)..(3)
<223> S5代表S-戊烯丙氨酸
<220>
<222> (7)..(7)
<223> S5代表S-戊烯丙氨酸
<400> 4
Lys Arg S5 Glu Gln Leu S5 His Lys Leu Glu Gln Leu Arg
1 5 10
<210> 5
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CM4-S4
<220>
<222> (4)..(4)
<223> S5代表S-戊烯丙氨酸
<220>
<222> (8)..(8)
<223> S5代表S-戊烯丙氨酸
<400> 5
Lys Arg Arg S5 Gln Leu Lys S5 Lys Leu Glu Gln Leu Arg
1 5 10
<210> 6
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CM4-S5
<220>
<222> (5)..(5)
<223> S5代表S-戊烯丙氨酸
<220>
<222> (9)..(9)
<223> S5代表S-戊烯丙氨酸
<400> 6
Lys Arg Arg Glu S5 Leu Lys His S5 Leu Glu Gln Leu Arg
1 5 10
<210> 7
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CM4-S6
<220>
<222> (6)..(6)
<223> S5代表S-戊烯丙氨酸
<220>
<222> (10)..(10)
<223> S5代表S-戊烯丙氨酸
<400> 7
Lys Arg Arg Glu Gln S5 Lys His Lys S5 Glu Gln Leu Arg
1 5 10
<210> 8
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CM4-S7
<220>
<222> (7)..(7)
<223> S5代表S-戊烯丙氨酸
<220>
<222> (11)..(11)
<223> S5代表S-戊烯丙氨酸
<400> 8
Lys Arg Arg Glu Gln Leu S5 His Lys Leu S5 Gln Leu Arg
1 5 10
<210> 9
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CM4-S8
<220>
<222> (8)..(8)
<223> S5代表S-戊烯丙氨酸
<220>
<222> (12)..(12)
<223> S5代表S-戊烯丙氨酸
<400> 9
Lys Arg Arg Glu Gln Leu Lys S5 Lys Leu Glu S5 Leu Arg
1 5 10
<210> 10
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CM4-S9
<220>
<222> (9)..(9)
<223> S5代表S-戊烯丙氨酸
<220>
<222> (13)..(13)
<223> S5代表S-戊烯丙氨酸
<400> 10
Lys Arg Arg Glu Gln Leu Lys His S5 Leu Glu Gln S5 Arg
1 5 10
<210> 11
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CM4-S10
<220>
<222> (10)..(10)
<223> S5代表S-戊烯丙氨酸
<220>
<222> (14)..(14)
<223> S5代表S-戊烯丙氨酸
<400> 11
Lys Arg Arg Glu Gln Leu Lys His Lys S5 Glu Gln Leu S5
1 5 10
Claims (10)
1.一种靶向促进C-Myc蛋白降解的多肽或所述多肽的衍生物,其特征在于,所述多肽的氨基酸序列为将如序列表中SEQ ID No.1所示的氨基酸序列中的两个或两个以上的氨基酸替换为侧链可相连的非天然氨基酸;所述的衍生物包括所述多肽与细胞穿膜肽接连所形成的嵌合肽、所述多肽与病毒形成的融合肽、甲基化的所述多肽、糖基化的所述多肽和聚乙二醇化的所述多肽。
2.如权利要求1所述的靶向促进C-Myc蛋白降解的多肽或所述多肽的衍生物,其特征在于,所述的侧链可相连的非天然氨基酸为S-戊烯丙氨酸。
3.如权利要求1所述的靶向促进C-Myc蛋白降解的多肽或所述多肽的衍生物,其特征在于,所述替换的氨基酸的数目为两个且所述替换的氨基酸的位置分别为第i位和第i+4位,其中i为整数,且1≤i≤10。
4.如权利要求1所述的靶向促进C-Myc蛋白降解的多肽或所述多肽的衍生物,其特征在于,所述的多肽为:
a.)氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.2~11中任一项所示的多肽;或者,
b.)在a.)中的氨基酸序列经过替换、缺失或添加一个或几个氨基酸后形成的仍然具有改造前促进C-Myc蛋白降解的活性的多肽。
5.如权利要求1~4中任一项所述的靶向促进C-Myc蛋白降解的多肽或所述多肽的衍生物在制备防治与TRB3和C-Myc相互作用相关的疾病的药物中的应用。
6.如权利要求5所述的应用,其特征在于,所述的疾病为肿瘤,所述的肿瘤优选淋巴瘤、白血病、肝癌、肺癌、乳腺癌或者肠癌。
7.如权利要求6所述的应用,其特征在于,所述的淋巴瘤为T细胞淋巴瘤或者B细胞淋巴瘤;白血病为淋巴细胞型白血病或非淋巴细胞型白血病;肝癌为原发性肝癌或继发性肝癌;所述肺癌为小细胞肺癌或非小细胞肺癌;所述乳腺癌为非浸润性乳腺癌、早期浸润性乳腺癌、浸润性特殊类型乳腺癌或浸润性非特殊类型乳腺癌;所述肠癌为结肠癌或直肠癌。
8.一种抗肿瘤的药物组合物,其特征在于,其含有如权利要求1~4任一项所述的靶向促进C-Myc蛋白降解的多肽或所述多肽的衍生物。
9.如权利要求8所述的药物组合物,其特征在于,所述的药物组合物还包括一种或多种药用载体。
10.如权利要求8或9所述的药物组合物,其特征在于,其含有如权利要求1~4任一项所述的靶向促进C-Myc蛋白降解的多肽或所述多肽的衍生物作为单一活性成分;或者,其含有如权利要求1~4任一项所述的靶向促进C-Myc蛋白降解的多肽或所述多肽的衍生物和其他具有抗肿瘤活性的化合物一起作为活性成分。
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication | ||
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Application publication date: 20200626 |