CN108570096B - 一种多肽或其衍生物及其在制备治疗肿瘤的药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种靶向促进EGFR蛋白降解的多肽或所述多肽的衍生物及其在制备治疗肿瘤的药物中的应用。所述多肽的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.1所示，或者，如将序列表SEQ ID No.1所示的氨基酸序列中的两个或两个以上的氨基酸替换为侧链可相连的非天然氨基酸所示；所述的衍生物包括所述多肽与细胞穿膜肽接连所形成的嵌合肽。所述多肽或多肽衍生物能够促进EGFR蛋白降解，抑制EGFR信号通路活性，因此应用于治疗肿瘤的药物的制备中。所制备的药物可用于治疗肿瘤，例如肺癌、肠癌、胰腺癌、乳腺癌、肝癌以及神经胶质瘤等。

Description

一种多肽或其衍生物及其在制备治疗肿瘤的药物中的应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体地涉及一种多肽或其衍生物及其在制备治疗肿瘤的药物中的应用。
背景技术
表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)是ErbB跨膜受体酪氨酸激酶家族成员，也被命名为ErbBl或HER-1。EGFR在多种人类肿瘤中高表达或信号过度活化。活化的EGFR激活MAPK/ERK、PI3K/Akt等信号途径，在肿瘤增殖、血管新生、肿瘤转移，肿瘤免疫逃逸、肿瘤耐药以及肿瘤代谢重编程等方面发挥促进作用。EGFR除了作为膜受体激活信号途径参与肿瘤调节外，还可转位至细胞核作为一种新型转录因子在核内独立或与其他转录因子协同作用于与细胞周期行进或细胞增殖密切相关的靶基因，促进肿瘤发生发展。
目前，针对EGFR的肿瘤分子靶向药物，按其性质主要分为两大类：一类是单克隆抗体，主要通过阻碍配体与EGFR结合，阻断EGFR信号活化。另一类是小分子抑制剂，主要通过竞争性结合EGFR胞内区酪氨酸激酶的磷酸化位点，阻断其与ATP的相互作用，继而抑制EGFR的酪氨酸磷酸化及下游一系列的信号传导。虽然靶向EGFR在非小细胞肺癌、恶性胶质瘤、结直肠癌、胰腺癌以及头颈部肿瘤的治疗中已成功进入临床应用阶段，但其长期疗效并没有取得令人满意的效果。主要原因在于有的肿瘤患者对EGFR靶向治疗不敏感，而那些最初对EGFR靶向治疗敏感的患者往往在一年内出现耐药现象。有多种因素导致EGFR靶向治疗耐受，EGFR突变(T790M)导致激酶与ATP的亲和力提高，或阻碍药物与靶点结合是导致耐受的最常见原因。近年来，有研究表明靶向EGFR治疗导致的继发性耐药即使在没有EGFR突变的情况下也会发生。事实上，在肿瘤中EGFR过表达与EGFR突变相比是更为常见的现象。在很多情况下，EGFR表达量与efgr的基因拷贝数并不直接相关，表明EGFR过表达可能是由于EGFR降解调节异常所致。EGFR过表达不仅导致对靶向EGFR药物的耐受，也导致肿瘤对多种化疗药物耐受。正是由于EGFR在肿瘤中的重要调节作用并不完全依赖其激酶活性，以及现有靶向EGFR药物高耐药率的现状，直接调节EGFR表达水平或蛋白稳定性的物质具有良好的抑制肿瘤发生和发展的成药前景。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对EGFR分子靶向药物高耐药率以及缺乏直接靶向EGFR蛋白稳定性药物的现状，提供一种促进EGFR蛋白降解的多肽或其衍生物及其在制备治疗肿瘤的药物中的应用。
本发明的发明人经过深入的研究和反复的试验发现，获得了能够靶向促进EGFR降解的多肽EJ4(其氨基酸序列如序列表SEQ ID No.1所示)，然而多肽EJ4的生物稳定性比较低。该生物稳定性低的缺陷与多肽EJ4在溶液中不能稳定形成活性所需的α螺旋构象直接相关。由此，发明人进行了针对性的研究和试验，发现如果将多肽EJ4中特定位置的氨基酸残基替换为侧链可以相连的非天然氨基酸，如S-戊烯丙氨酸(S5)，则改造后的多肽具有稳定的α螺旋的二级结构，使改造后的多肽具有极高的亲和力、抗酶解稳定性以及细胞穿膜性，从而具有极高的α螺旋稳定性、代谢稳定性，能够抑制多种肿瘤细胞增殖和转移，从而应用于制备治疗肿瘤的药物中。基于发明人的研究工作，本发明提供下述的技术方案。
本发明提供的技术方案之一是：一种靶向促进EGFR蛋白降解的多肽或所述多肽的衍生物，所述多肽的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.1所示，或者，如将序列表SEQ ID No.1所示的氨基酸序列中的两个或两个以上的氨基酸替换为侧链可相连的非天然氨基酸所示。
本发明中，所述的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.1所示的多肽称为多肽EJ4。
本发明中，所述的靶向促进EGFR蛋白降解的多肽的氨基酸序列也可以是将序列表SEQ ID No.1所示的氨基酸序列中的两个或两个以上的氨基酸替换为侧链可相连的非天然氨基酸所示。
其中，所述的侧链可相连的非天然氨基酸是本领域常规的，较佳的为S-戊烯丙氨酸(S5)、R-戊烯丙氨酸(R5)或者R-辛烯丙氨酸(R8)。
较佳的，所述的侧链可相连的非天然氨基酸的侧链进行反应，环化形成侧链相连的结构。更佳的，相邻非天然氨基酸的侧链在钌的催化作用下进行烯烃复分解反应(RCM)环化即得。
Figure BDA0001578627160000031
其中，所述的多肽中，所述替换的氨基酸的数目为两个。所述替换的氨基酸分别为序列表SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的第i位和第i+3位的氨基酸、第i位和第i+4位的氨基酸，或者，第i位和第i+7位的氨基酸，其中i为整数，且1≤i≤11。较佳地，所述第i位替换成的非天然氨基酸为R-戊烯丙氨酸、S-戊烯丙氨酸或者R-辛烯丙氨酸，所述第i+3、i+4或i+7位替换成的非天然氨基酸为S-戊烯丙氨酸。
本发明中，更佳地，替换有侧链可相连的非天然氨基酸的所述的多肽的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ IDNo.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、或SEQ ID No.12、SEQ IDNo.13、SEQ ID No.14和SEQ ID No.15所示。
本发明中，所述的衍生物为所述多肽与细胞穿膜肽接连所形成的嵌合肽。
其中，本发明所述的细胞穿膜肽为本领域常规的细胞穿膜肽，只要其能辅助将所述多肽送入细胞以发挥作用即可。一般，所述的细胞穿膜肽为由10～30个氨基酸组成的短肽分子。较佳地，所述细胞穿膜肽连接在所述多肽的N端或者C端，更佳地连接在所述多肽的N端；进一步更佳地所述细胞穿膜肽和本发明多肽EJ4之间以两个甘氨酸(Gly-Gly)连接。
进一步更佳地，所述细胞穿膜肽为如序列表SEQ ID No.19所示的TAT肽(peptide)，所形成的嵌合多肽即本发明的多肽衍生物的氨基酸序列如SEQ ID No.18所示。本发明中，上述SEQ ID No.1～SEQ ID No.15所示的氨基酸序列中可进行适当地氨基酸替换、缺失或添加，只要使改造后的氨基酸序列仍然能够促进EGFR蛋白降解并且保持改造前的活性即可。例如，第8和/或第9位的氨基酸可突变为精氨酸(Arg)；较佳地，其氨基酸序列如序列表SEQ ID No.16或SEQ ID No.17所示。
本发明提供的技术方案之二是：一种靶向促进EGFR蛋白降解的多肽或所述多肽的衍生物在制备治疗肿瘤的药物中的应用。
本发明中，所述的肿瘤为本领域常规的，较佳地为肺癌、肠癌、胰腺癌、乳腺癌、肝癌或者神经胶质瘤。其中，所述肺癌为本领域常规，较佳的为非小细胞肺癌或小细胞肺癌。所述肠癌为本领域常规，较佳的为结肠癌或直肠癌。所述胰腺癌为本领域常规，较佳的为胰腺导管腺癌或胰腺腺泡细胞癌。所述乳腺癌为本领域常规，较佳的为非浸润性乳腺癌、早期浸润性乳腺癌、浸润性特殊类型乳腺癌或浸润性非特殊类型乳腺癌。所述肝癌为本领域常规，较佳的为原发性肝癌或继发性肝癌；所述神经胶质瘤可为本领域常规，较佳的为星形细胞瘤、胶质母细胞瘤、髓母细胞瘤、室管膜瘤、少枝胶质瘤、松果体瘤、混合性胶质瘤、脉络丛乳头状瘤、未分类胶质瘤或神经元性肿瘤。
本发明中，所述抗肿瘤是本领域常规的，较佳地指在存在可能的肿瘤因素时，使用后防止或降低肿瘤的产生，也指存在肿瘤病灶时，减轻肿瘤的程度，或者治愈肿瘤使之正常化，或者减缓或延迟肿瘤的进程，或者减轻肿瘤引起的症状。
本发明提供的技术方案之三是：一种抗肿瘤的药物组合物，其含有上述靶向促进EGFR蛋白降解的多肽或所述多肽的衍生物。
本发明中，所述的活性成分是指具有抗肿瘤功能的成分。在所述药物组合物中，上述靶向促进EGFR蛋白降解的多肽或所述多肽的衍生物可以单独作为活性成分或和其他具有抗肿瘤活性的成分一起作为活性成分。
本发明中，较佳地，所述的药物组合物还包括一种或多种药用载体。所述的药用载体为本领域常规药用载体，所述的药用载体可以为任意合适的生理学或药学上可接受的药物辅料。所述的药物辅料为本领域常规的药物辅料，较佳地包括药学上可接受的赋形剂、填充剂或稀释剂等。更佳地，所述的药物组合物包括0.01～99.99％的上述靶向促进EGFR蛋白降解的多肽或所述多肽的衍生物，和0.01～99.99％的药用载体，所述百分比为占所述药物组合物的质量百分比。
本发明所述的药物组合物的给药途径是常规的多肽药物给药途径，较佳地为注射给药或口服给药。所述注射给药较佳地包括静脉注射、肌肉注射、腹腔注射、皮内注射或皮下注射等途径。所述的药物组合物为本领域常规的各种剂型，较佳地为固体、半固体或液体的形式，可以为水溶液、非水溶液或混悬液，更佳地为片剂、胶囊、颗粒剂、注射剂或输注剂等。
本发明中，较佳地，所述的药物组合物的施用量为有效量，所述有效量为能够缓解或延迟疾病病症进展的量。所述有效量可以以个体基础来测定，并将部分基于待治疗症状和所寻求结果的考虑。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：本发明的多肽或多肽衍生物能够靶向促进EGFR蛋白降解，抑制EGFR信号通路活性，从而应用于抗肿瘤的药物的制备中。所制备的药物在抗肿瘤中，具有疗效显著，毒副作用少，使用安全的优点。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
实施例中所述的PBS，指浓度为0.1M，pH值为7.2的磷酸盐缓冲液。
实施例中所述的室温为本领域常规的室温，较佳地为15～30℃。
实验结果用均值±标准误表示，经参数或者非参数方差检验，经比较p<0.05被认为有显著性差异，p<0.01被认为有极其显著性差异。
实施例1多肽的合成
多肽EJ4的氨基酸序列参见序列表SEQ ID No.1。多肽EJ4由北京赛百盛基因技术有限公司合成并纯化。
引入两个非天然氨基酸进行固相多肽链合成。固相多肽链合成完成后采用钌作为催化剂进行烯烃复分解反应(RCM)环化即得目标多肽。最后将目标多肽从树脂上切割下来进行纯化。上述固相多肽链合成及纯化的步骤由中肽生化有限公司公司完成。其中，两个S-戊烯丙氨酸(S5)插入在多肽EJ4氨基酸序列中的第i、i+4位，R-戊烯丙氨酸(R5)和S5分别插入在多肽EJ4的第i、i+3位；R-辛烯丙氨酸(R8)和S5分别插入在多肽EJ4的第i、i+7位。由此得到不同的序列改造后的多肽(氨基酸序列参见序列表SEQ ID No.2～SEQ ID No.15)，其具体插入位点如下所示：
EJ4：Asn-Gln-Ala-Leu-Leu-Arg-Ile-Leu-Lys-Glu-Thr-Glu-Phe-Lys-Lys；
EJ4-S1：S5-Gln-Ala-Leu-S5-Arg-Ile-Leu-Lys-Glu-Thr-Glu-Phe-Lys-Lys；
EJ4-S2：Asn-S5-Ala-Leu-Leu-S5-Ile-Leu-Lys-Glu-Thr-Glu-Phe-Lys-Lys；
EJ4-S3：Asn-Gln-S5-Leu-Leu-Arg-S5-Leu-Lys-Glu-Thr-Glu-Phe-Lys-Lys；
EJ4-S4：Asn-Gln-Ala-S5-Leu-Arg-Ile-S5-Lys-Glu-Thr-Glu-Phe-Lys-Lys；
EJ4-S5：Asn-Gln-Ala-Leu-S5-Arg-Ile-Leu-S5-Glu-Thr-Glu-Phe-Lys-Lys；
EJ4-S6：Asn-Gln-Ala-Leu-Leu-S5-Ile-Leu-Lys-S5-Thr-Glu-Phe-Lys-Lys；
EJ4-S7：Asn-Gln-Ala-Leu-Leu-Arg-S5-Leu-Lys-Glu-S5-Glu-Phe-Lys-Lys；
EJ4-S8：Asn-Gln-Ala-Leu-Leu-Arg-Ile-S5-Lys-Glu-Thr-S5-Phe-Lys-Lys；
EJ4-S9：Asn-Gln-Ala-Leu-Leu-Arg-Ile-Leu-S5-Glu-Thr-Glu-S5-Lys-Lys；
EJ4-S10：Asn-Gln-Ala-Leu-Leu-Arg-Ile-Leu-Lys-S5-Thr-Glu-Phe-S5-Lys；
EJ4-S11：Asn-Gln-Ala-Leu-Leu-Arg-Ile-Leu-Lys-Glu-S5-Glu-Phe-Lys-S5；
EJ4-S12：Asn-Gln-Ala-Leu-Leu-R5-Ile-Leu-S5-Glu-Thr-Glu-Phe-Lys-Lys；
EJ4-S13：Asn-Gln-Ala-Leu-Leu-R8-Ile-Leu-Lys-Glu-Thr-Glu-S5-Lys-Lys；
EJ4-S14：Asn-Gln-R8-Leu-Leu-Arg-Ile-Leu-Lys-S5-Thr-Glu-Phe-Lys-Lys；
EJ4-S15：Asn-Gln-Ala-Leu-Leu-S5-Ile-Arg-Arg-S5-Thr-Glu-Phe-Lys-Lys；
EJ4-S16：Asn-Gln-Ala-Leu-Leu-S5-Ile-Leu-Arg-S5-Thr-Glu-Phe-Lys-Lys；
TAT-EJ4：TAT peptide-Gly-Gly-Asn-Gln-Ala-Leu-Leu-Arg-Ile-Leu-Lys-Glu-Thr-Glu-Phe-Lys-L ys。
多肽EJ4进行氨基酸替换后的多肽如EJ4-S15、EJ4-S16所示(氨基酸序列参见序列表SEQ ID No.16、SEQ ID No.17)。与细胞穿膜肽TAT-肽(peptide)(氨基酸序列参见序列表SEQ ID No.19)接连所形成的嵌合肽如TAT-EJ4所示(氨基酸序列参见序列表SEQ IDNo.18)。
上述多肽均由北京赛百盛基因技术有限公司合成并纯化。
实施例2圆二色谱法检测多肽的α螺旋率
用圆二色谱仪(购自日本Jasco公司)检测多肽的α螺旋率。将实施例1所制备的多肽EJ4、EJ4-S1、EJ4-S2、EJ4-S3、EJ4-S4、EJ4-S5、EJ4-S6、EJ4-S7、EJ4-S8、EJ4-S9、EJ4-S10、EJ4-S11和EJ4-S12、EJ4-S13、EJ4-S14、EJ4-S15、EJ4-S16和TAT-EJ4溶解到水溶液中，将圆二色谱仪的上机浓度调整为1mg/mL，结果如表1所示。其中，α螺旋率指保持二级结构α螺旋的多肽的肽段数量占总多肽的肽段数量的百分比。
表1说明，多肽EJ4-S1、EJ4-S2、EJ4-S3、EJ4-S4、EJ4-S5、EJ4-S6、EJ4-S7、EJ4-S8、EJ4-S9、EJ4-S10、EJ4-S11、EJ4-S12、EJ4-S13、EJ4-S14、EJ4-S15、EJ4-S16和TAT-EJ4的α螺旋率明显高于多肽EJ4，多肽的α螺旋率的维持是增加多肽稳定性的重要指标，因此，多肽EJ4-S1～EJ4-S11的α螺旋率的提高会增强其稳定性。
表1.圆二色谱法测定多肽α螺旋率
Figure BDA0001578627160000081
Figure BDA0001578627160000091
实施例3流式细胞术检测多肽穿膜能力
流式细胞术检测多肽穿过细胞膜的能力。具体操作步骤如下：
1.收集对数生长期的肺癌细胞A549(购自中国医学科学院基础医学研究所)，用1640培养基(购自美国Invitrogen公司)调整细胞浓度，制成20万个/mL的细胞悬液。
2.将1mL步骤1所制得的细胞悬液加入6孔板进行培养，12小时后换成新的培养基，并且分别加入1μg/mL实施例1所制得的FAM荧光基团标记的多肽EJ4、EJ4-S1、EJ4-S2、EJ4-S3、EJ4-S4、EJ4-S5、EJ4-S6、EJ4-S7、EJ4-S8、EJ4-S9、EJ4-S10、EJ4-S11、EJ4-S12、EJ4-S13、EJ4-S14、EJ4-S15、EJ4-S16和TAT-EJ4。
3.6小时后，用胰酶消化制备成单细胞悬液，冷PBS重悬细胞。
4.运用流式细胞计数仪，激发波长为465nm，发射波长为520nm，测定细胞内荧光的强弱，计算含荧光细胞占总细胞的百分比。结果如表2所示，含荧光细胞占总细胞百分比越高，说明多肽能穿过的细胞数越多，即多肽的穿膜能力越好。
表2说明，给予多肽EJ4-S1、EJ4-S2、EJ4-S3、EJ4-S4、EJ4-S5、EJ4-S6、EJ4-S7、EJ4-S8、EJ4-S9、EJ4-S10、EJ4-S11、EJ4-S12、EJ4-S13、EJ4-S14、EJ4-S15、EJ4-S16和TAT-EJ4处理后，含荧光的细胞比例
明显多于EJ4，因此多肽EJ4-S1～TAT-EJ4的穿膜能力明显优于EJ4。
表2.流式细胞术检测多肽穿膜能力
Figure BDA0001578627160000092
Figure BDA0001578627160000101
实施例4免疫荧光染色验证多肽对EGFR蛋白的半衰期的影响
1.收集对数生长期的肺癌细胞A549，用1640培养基调整细胞浓度，制成20万个/mL的细胞悬液。
2.将2mL步骤1所制得的细胞悬液加入6孔板进行培养，12小时后换成新的培养基，并且分别加入1μg/mL实施例1所制得的多肽EJ4、EJ4-S1、EJ4-S2、EJ4-S3、EJ4-S4、EJ4-S5、EJ4-S6、EJ4-S7、EJ4-S8、EJ4-S9、EJ4-S10、EJ4-S11、EJ4-S12、EJ4-S13、EJ4-S14、EJ4-S15、EJ4-S16和TAT-EJ4。对照组加入等体积的溶剂PBS。
3. 12小时后，按时间点加入蛋白合成抑制剂放线菌酮(Cycloheximide，CHX)，使其作用时间分别为24h，12h，8h，4h，2h，0h。每过12h分别补加1μg/mL实施例1所制得的多肽EJ4、EJ4-S1、EJ4-S2、EJ4-S3、EJ4-S4、EJ4-S5、EJ4-S6、EJ4-S7、EJ4-S8、EJ4-S9、EJ4-S10、EJ4-S11、EJ4-S12、EJ4-S13、EJ4-S14、EJ4-S15、EJ4-S16和TAT-EJ4。对照组加入等体积的溶剂。
4.收集细胞，加入RIPA裂解液(购自上海碧云天生物技术有限公司)(按照使用说明书，用前加入蛋白酶抑制剂PMSF和leupeptin，aprotinin等其它抑制剂)，冰上裂解30min；12000rpm，4℃离心30min；吸取上清，用BCA法对蛋白进行定量，按照定量结果将蛋白调整成统一浓度，加入5×上样缓冲液，98℃变性10min。
5.取部分样品按照《分子克隆》所述的方法进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳结束后，进行免疫印迹检测。
6.免疫印迹结果利用Gel-Pro Analyzer32Analyzer4.0进行定量分析，并绘制时间相关EGFR含量变化曲线，确定EGFR蛋白含量下降至CHX作用0h时的50％所需时间，即为EGFR蛋白半衰期。结果如表3所示。
表3说明，与多肽EJ4相比，多肽EJ4-S1、EJ4-S2、EJ4-S4、EJ4-S6、EJ4-S7、EJ4-S8、EJ4-S9、EJ4-S10、EJ4-S11、EJ4-S12、EJ4-S13、EJ4-S14、EJ4-S15、EJ4-S16和TAT-EJ4能明显降低EGFR蛋白半衰期。
表3.多肽对细胞EGFR蛋白半衰期的影响
Figure BDA0001578627160000111
Figure BDA0001578627160000121
实施例5细胞计数实验验证多肽抑制肿瘤细胞的生长
1.收集对数生长期的肺癌细胞A549(购自中国医学科学院基础医学研究所)、结肠癌细胞HCT-8(购自中国医学科学院基础医学研究所)、胰腺癌细胞SW1990(购自中国医学科学院基础医学研究所)、乳腺癌细胞MDA-MB-231(购自中国医学科学院基础医学研究所)、肝癌细胞HepG2(购自中国医学科学院基础医学研究所)和神经胶质瘤细胞U251(购自中国医学科学院基础医学研究所)，将其制备为1.5×105/ml的细胞悬液。
2.取步骤1所制得的细胞悬液1ml，将其加入12孔板进行培养(其中HepG2、HCT-8和MDA-MB-231细胞所用培养基为DMEM培养基，A549、SW1990细胞所用培养基为RPMI1640培养基，均购自Invitrogen公司；U251细胞所用培养基为MEM-EBSS培养基，购自Invitrogen公司；培养温度为37℃，培养基体积为1mL)，12小时后换成新的培养基，并且分别加入1μg/mL实施例1所制得的多肽EJ4、EJ4-S1、EJ4-S2、EJ4-S3、EJ4-S4、EJ4-S5、EJ4-S6、EJ4-S7、EJ4-S8、EJ4-S9、EJ4-S10、EJ4-S11、EJ4-S12、EJ4-S13、EJ4-S14、EJ4-S15、EJ4-S16和TAT-EJ4。对照组加入等体积溶剂。每隔一天传代一次，并进行计数。随着细胞数量增多，更换至相应底面积培养皿中进行培养。培养12天后，收集所有细胞至1ml培养基中进行细胞计数，并计算总的细胞数量。实验结果以mean±SD表示，并采用t test检验各组与EJ4组间的差异。实验结果见表4～9。表4～9说明多肽EJ4-S1、EJ4-S2、EJ4-S3、EJ4-S4、EJ4-S5、EJ4-S6、EJ4-S7、EJ4-S8、EJ4-S9、EJ4-S10、EJ4-S11、EJ4-S12、EJ4-S13、EJ4-S14、EJ4-S15、EJ4-S16和TAT-EJ4相比于EJ4更能够抑制肿瘤细胞的生长。
表4.多肽抑制肺癌细胞A549的生长
Figure BDA0001578627160000131
Figure BDA0001578627160000141
表5.多肽抑制肠癌细胞HCT-8的生长
多肽名称 细胞数量(10<sup>4</sup>) P值
对照 633.248±36.356
EJ4 602.402±43.298
EJ4-S1 212.124±39.271 0.0003
EJ4-S2 254.345±31.346 0.0004
EJ4-S3 492.294±40.201 0.0319
EJ4-S4 234.442±19.895 0.0002
EJ4-S5 504.730±39.485 0.0445
EJ4-S6 192.358±24.579 0.0001
EJ4-S7 178.314±33.137 0.0002
EJ4-S8 214.536±35.365 0.0003
EJ4-S9 222.585±35.258 0.0003
EJ4-S10 257.573±29.467 0.0003
EJ4-S11 249.468±32.146 0.0003
EJ4-S12 312.383±28.301 0.0003
EJ4-S13 284.482±30.193 0.0002
EJ4-S14 233.482±29.492 0.0001
EJ4-S15 312.490±29.443 0.0003
EJ4-S16 248.477±30.482 0.0001
TAT-EJ4 294.418±28.747 0.0002
表6.多肽抑制胰腺癌细胞SW1990的生长
多肽名称 细胞数量(10<sup>4</sup>) P值
对照 629.247±55.146
EJ4 628.591±48.249
EJ4-S1 278.357±36.148 0.0007
EJ4-S2 189.468±24.520 0.0002
EJ4-S3 523.436±38.579 0.0420
EJ4-S4 257.486±33.567 0.0004
EJ4-S5 527.498±40.482 0.0498
EJ4-S6 303.465±23.935 0.0005
EJ4-S7 213.460±31.351 0.0002
EJ4-S8 218.462±29.462 0.0002
EJ4-S9 222.456±35.456 0.0003
EJ4-S10 188.375±30.948 0.0002
EJ4-S11 283.462±29.462 0.0005
EJ4-S12 294.498±31.341 0.0005
EJ4-S13 248.592±29.493 0.0003
EJ4-S14 312.421±35.291 0.0008
EJ4-S15 193.442±22.236 0.0001
EJ4-S16 341.244±31.453 0.0010
TAT-EJ4 334.592±21.492 0.0006
表7.多肽抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231的生长
Figure BDA0001578627160000151
Figure BDA0001578627160000161
表8.多肽抑制肝癌细胞HepG2的生长
Figure BDA0001578627160000162
Figure BDA0001578627160000171
表9多肽抑制胶质瘤细胞U251的生长
Figure BDA0001578627160000172
Figure BDA0001578627160000181
实施例6细胞划痕实验验证多肽抑制肿瘤细胞划痕后的愈合
1.先用记号笔在6孔板背后，用直尺比着划横线，横穿过孔。
2.在每个孔中分别加入5×105个肿瘤细胞，在相应培养基中37℃孵育箱培养过夜后细胞贴壁。该肿瘤细胞为对数生长期的肺癌细胞A549、结肠癌细胞HCT-8、胰腺癌细胞SW1990、乳腺癌细胞MDA-MB-231、肝癌细胞HepG2和神经胶质瘤细胞U251。
3.第二天用枪头比着直尺，尽量垂直于背后的横线进行划痕，枪头要垂直。
4.用PBS洗细胞3次，去除划下的细胞，加入新的培养基，同时分别加入1μg/mL实施例1所制备的多肽EJ4、EJ4-S1、EJ4-S2、EJ4-S3、EJ4-S4、EJ4-S5、EJ4-S6、EJ4-S7、EJ4-S8、EJ4-S9、EJ4-S10、EJ4-S11、EJ4-S12、EJ4-S13、EJ4-S14、EJ4-S15、EJ4-S16和TAT-EJ4。对照组给予等体积的溶剂。取样拍照，计算划痕面积，即为0h划痕面积。
5.然后放入37℃、5％(v/v)CO2培养箱培养，24小时后取样拍照，并计算此时未修复的剩余面积，即24h剩余面积。按损伤修复比＝(0h划痕面积-24h剩余面积)/0h划痕面积*100％计算损伤修复比。
实验结果以mean±SD表示，并采用t test检验各组与EJ4组间的差异。实验结果见表10～15。
表10～15的结果表明，损伤修复面积比越大，肿瘤细胞的迁移能力越强，细胞划痕后愈合能力越强。因此多肽EJ4-S1、EJ4-S2、EJ4-S3、EJ4-S4、EJ4-S5、EJ4-S6、EJ4-S7、EJ4-S8、EJ4-S9、EJ4-S10、EJ4-S11、EJ4-S12、EJ4-S13、EJ4-S14、EJ4-S15、EJ4-S16和TAT-EJ4可以降低肿瘤细胞划痕后的愈合能力。
表10.多肽抑制肺癌细胞A549迁移
多肽名称 损伤修复面积比 P值
对照 91.7±4.26
EJ4 88.3±7.34
EJ4-S1 23.2±2.87 0.0001
EJ4-S2 33.7±1.65 0.0002
EJ4-S3 60.3±6.38 0.0076
EJ4-S4 35.2±2.79 0.0003
EJ4-S5 70.4±5.49 0.0277
EJ4-S6 27.0±1.30 0.0001
EJ4-S7 25.8±2.55 0.0002
EJ4-S8 27.7±3.94 0.0002
EJ4-S9 29.4±5.19 0.0003
EJ4-S10 22.0±1.80 0.0001
EJ4-S11 31.3±3.86 0.0003
EJ4-S12 30.4±4.02 0.0003
EJ4-S13 28.6±3.13 0.0002
EJ4-S14 33.4±3.78 0.0003
EJ4-S15 30.7±4.10 0.0003
EJ4-S16 38.5±4.04 0.0005
TAT-EJ4 41.5±5.14 0.0008
表11.多肽抑制肠癌细胞HCT-8迁移
多肽名称 损伤修复面积比 P值
对照 89.9±3.50
EJ4 87.8±2.57
EJ4-S1 32.4±1.54 <0.0001
EJ4-S2 25.3±3.06 <0.0001
EJ4-S3 72.3±6.50 0.0184
EJ4-S4 28.4±3.22 <0.0001
EJ4-S5 69.4±7.92 0.0187
EJ4-S6 28.0±3.24 <0.0001
EJ4-S7 33.9±2.64 <0.0001
EJ4-S8 20.33±2.38 <0.0001
EJ4-S9 28.5±4.16 <0.0001
EJ4-S10 30.0±1.99 <0.0001
EJ4-S11 30.4±5.01 <0.0001
EJ4-S12 29.4±3.21 <0.0001
EJ4-S13 31.5±4.13 <0.0001
EJ4-S14 27.7±1.98 <0.0001
EJ4-S15 26.1±2.77 <0.0001
EJ4-S16 22.8±3.10 <0.0001
TAT-EJ4 37.2±5.16 0.0001
表12.多肽抑制胰腺癌细胞SW1990迁移
Figure BDA0001578627160000201
Figure BDA0001578627160000211
表13.多肽抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231迁移
Figure BDA0001578627160000212
Figure BDA0001578627160000221
表14.多肽抑制肝癌细胞HepG2迁移
Figure BDA0001578627160000222
Figure BDA0001578627160000231
表15.多肽抑制神经胶质瘤细胞U251迁移
Figure BDA0001578627160000232
Figure BDA0001578627160000241
实施例7肿瘤皮下生长实验验证多肽抑制肿瘤细胞在小鼠体内的生长
操作步骤如下：
1.实验耗材及试剂：灭菌EP管1.5mL，15mL离心管，枪头，滤网(100目)，脱脂棉球，镊子数把，酒精棉球，无菌1mL注射器，500mL烧杯(灭菌，用前照紫外)，PBS(过滤)，胰酶，血清。
2.实验动物及分组：4-6周龄雄性裸鼠110只(购自北京维通利华实验动物有限公司)，随机分为1组：EJ4、EJ4-S3、EJ4-S4、EJ4-S5、EJ4-S6、EJ4-S8、EJ4-S12、EJ4-S13、EJ4-S15、TAT-EJ4组及溶剂对照组，每组10只。
3.细胞制备：将贴壁培养的肿瘤细胞用胰酶消化，到达胰酶消化时间后(此时细胞状态应为单细胞且刚好贴壁不掉)，吸掉胰酶。用含有1％血清的PBS按2mL/皿终止，将细胞吹下，移至15mL离心管中，1200转离心5min。弃上清，PBS重悬，过100目滤网一次；细胞计数，调整细胞终浓度至2.5×107/mL。该肿瘤细胞为对数生长期的肺癌细胞A549、结肠癌细胞HCT-8、胰腺癌细胞SW1990、乳腺癌细胞MDA-MB-231、肝癌细胞HepG2和U251细胞直接收集至15mL离心管，1200转离心5min。弃上清，PBS重悬，过100目滤网一次；细胞计数，调整细胞终浓度至2.5×107/mL。
4.肿瘤细胞接种：接种5×106个肿瘤细胞(细胞悬液200μL)于裸鼠左上腹部近腋下皮下。
5.肿瘤生长观察：皮下注射肿瘤细胞后一周用多肽进行治疗(5mg/kg体重，每周两次)，游标卡尺纪录肿瘤大小。肿瘤体积＝(长×宽×宽)/2；
实验结果以mean±SEM表示，并采用t test检验各组与EJ4组间的差异。
接种肿瘤后4周，各组小鼠皮下肿瘤体积如表16～表21所示，肿瘤体积越大表明肿瘤生长越快，因此多肽EJ4-S3、EJ4-S4、EJ4-S5、EJ4-S6、EJ4-S8、EJ4-S12、EJ4-S13、EJ4-S15、TAT-EJ4均能抑制肿瘤细胞在小鼠体内生长。
表16.多肽抑制肺癌细胞A549在小鼠体内生长
多肽名称 肿瘤体积(mm<sup>3</sup>) P值
对照 2445.2±180.8
EJ4 2381.4±201.4
EJ4-S3 1789.3±100.3 0.0169
EJ4-S4 664.3±56.8 <0.0001
EJ4-S5 1738.4±201.8 0.0368
EJ4-S6 498.5±46.4 <0.0001
EJ4-S8 511.8±57.4 <0.0001
EJ4-S12 409.7±44.3 <0.0001
EJ4-S13 428.4±39.6 <0.0001
EJ4-S15 399.2±44.0 <0.0001
TAT-EJ4 441.4±53.9 <0.0001
表17.多肽抑制肠癌细胞HCT-8在小鼠体内生长
Figure BDA0001578627160000251
Figure BDA0001578627160000261
表18.多肽抑制胰腺癌细胞SW1990在小鼠体内生长
多肽名称 肿瘤体积(mm<sup>3</sup>) P值
对照 2089.4±189.3
EJ4 1893.4±135.6
EJ4-S3 1338.6±100.4 0.0041
EJ4-S4 403.5±44.6 <0.0001
EJ4-S5 1250.5±123.4 0.0025
EJ4-S6 422.8±44.7 <0.0001
EJ4-S8 403.8±44.2 <0.0001
EJ4-S12 513.8±60.3 <0.0001
EJ4-S13 502.5±41.9 <0.0001
EJ4-S15 403.8±51.2 <0.0001
TAT-EJ4 664.5±56.8 <0.0001
表19.多肽抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231在小鼠体内生长
Figure BDA0001578627160000262
Figure BDA0001578627160000271
表20.多肽抑制肝癌细胞HepG2在小鼠体内生长
多肽名称 肿瘤体积(mm<sup>3</sup>) P值
对照 2038.4±164.2
EJ4 1739.2±157.1
EJ4-S3 1231.4±114.5 0.0176
EJ4-S4 427.4±44.2 <0.0001
EJ4-S5 1279.5±104.6 0.0255
EJ4-S6 488.1±50.3 <0.0001
EJ4-S8 503.3±48.2 <0.0001
EJ4-S12 482.4±40.5 <0.0001
EJ4-S13 601.2±49.8 <0.0001
EJ4-S15 438.4±44.5 <0.0001
TAT-EJ4 471.0±45.6 <0.0001
表21.多肽抑制神经胶质瘤细胞U251在小鼠体内生长
Figure BDA0001578627160000272
Figure BDA0001578627160000281
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
<110> 北京伟峰益民科技有限公司
<120> 一种多肽或其衍生物及其在制备治疗肿瘤的药物中的应用
<130> P1711837C
<150> 201710150282.7
<151> 2017-03-14
<160> 19
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> EJ4
<400> 1
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<210> 2
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> EJ4-S1
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<213> 人工序列
<220>
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<213> 人工序列
<220>
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<220>
<223> EJ4-S14
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<213> 人工序列
<220>
<223> EJ4-S15
<400> 16
Asn Gln Ala Leu Leu S5 Ile Arg Arg S5 Thr Glu Phe Lys Lys
1 5 10 15
<210> 17
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> EJ4-S16
<400> 17
Asn Gln Ala Leu Leu S5 Ile Leu Arg S5 Thr Glu Phe Lys Lys
1 5 10 15
<210> 18
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TAT-EJ4
<400> 18
Arg Arg Arg Arg Thr Leu Arg Arg Leu Leu Gln Glu Arg Gly Gly Asn
1 5 10 15
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20 25
<210> 19
<211> 13
<212> PRT
<213> Human immunodeficiency virus type 1
<220>
<223> TAT肽
<400> 19
Arg Arg Arg Arg Thr Leu Arg Arg Leu Leu Gln Glu Arg
1 5 10

Claims (7)

1.一种靶向促进EGFR蛋白降解的多肽，其特征在于，所述的多肽的氨基酸序列如SEQID No:7、SEQ ID No:16或SEQ ID No:17所示。
2.如权利要求1所述的靶向促进EGFR蛋白降解的多肽在制备治疗肿瘤的药物中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的肿瘤为肺癌、肠癌、胰腺癌、乳腺癌、肝癌或者神经胶质瘤。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述肺癌为非小细胞肺癌或小细胞肺癌；所述肠癌为结肠癌或直肠癌；所述胰腺癌为胰腺导管腺癌、胰腺腺泡细胞癌；所述乳腺癌为非浸润性乳腺癌、早期浸润性乳腺癌、浸润性特殊类型乳腺癌或浸润性非特殊类型乳腺癌；所述的肝癌为原发性肝癌或继发性肝癌；所述神经胶质瘤为星形细胞瘤、胶质母细胞瘤、髓母细胞瘤、室管膜瘤、少枝胶质瘤、松果体瘤、混合性胶质瘤、脉络丛乳头状瘤、未分类胶质瘤或神经元性肿瘤。
5.一种抗肿瘤的药物组合物，其特征在于，其含有如权利要求1所述的靶向促进EGFR蛋白降解的多肽。
6.如权利要求5所述的药物组合物，其特征在于，其还包括一种或多种药用载体。
7.如权利要求5或6所述的药物组合物，其特征在于，其含有如权利要求1所述的靶向促进EGFR蛋白降解的多肽作为单一活性成分；或者，其含有如权利要求1所述的靶向促进EGFR蛋白降解的多肽和其他具有抗肿瘤活性的化合物一起作为活性成分。
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