CN114099681B - Akt/stat3作为免疫检查点抑制剂的靶点的用途 - Google Patents

Akt/stat3作为免疫检查点抑制剂的靶点的用途 Download PDF

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Abstract

本发明提供了AKT/STAT3作为免疫检查点抑制剂的靶点的用途，并提供了AKT/ATAT3抑制剂在制备治疗肿瘤和/或自身免疫性疾病的药物及制备PD‑1/PD‑L1抑制剂中的新用途；AKT/ATAT3抑制剂在抑制AKT/STAT3通路活性的同时，能显著抑制PD‑L1的表达水平，进而阻断PD‑1与PD‑L1的结合，使T细胞恢复活性，从而增强T细胞抗肿瘤免疫应答，能抑制肿瘤细胞体外增殖，诱导肿瘤细胞凋亡，具有很好的临床应用前景。

Description

AKT/STAT3作为免疫检查点抑制剂的靶点的用途
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及AKT/STAT3抑制剂的新用途。
背景技术
肺癌是目前世界各国发病率和死亡率增长最快，对人类健康和生命威胁最大的恶性肿瘤。最新数据显示：2018年全球新诊断癌症病例1810万人，其中11.6％为肺癌病例；2018年全球癌症死亡960万人，其中18.4％为肺癌病例。2018年，我国新诊断癌症病例406.4万人，其中肺癌病例为82.81万人，占全部癌症病人的20.38％；2018年我国癌症死亡病例241.35万人，其中肺癌病例为65.7万人，占全部癌症死亡病例的27.22％。根据病理类型、治疗方式及预后的不同，原发性肺癌被大体分为非小细胞肺癌(non-small cell lungcancer,NSCLC)和小细胞肺癌。前者较为常见，占比85％-90％，主要包括肺腺癌和肺鳞癌等病理类型。迄今，由于缺乏有效的早期诊断方法，肺癌病人就诊时35％-40％为局部晚期，40％-45％为伴有远处转移的晚期肺癌，失去了外科手术治疗的机会，只有15％-20％的属于早中期，适合于外科手术治疗。因此，肺癌是临床上预后最不好的恶性肿瘤。
近年来，随着分子靶向药物和免疫检查点抑制剂在肺癌临床的应用，治疗NSCLC的可选药物显著增多，且治疗的针对性较传统化疗更加明确：肿瘤组织或血液检测存在表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)基因敏感突变的NSCLC患者，优先选用第一代EGFR酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitor,TKI)口服治疗；耐药后，肿瘤组织或血液基因检测发现T790M突变者，还可换用第三代EGFR-TKI奥西替尼(osimertinib)；肿瘤组织存在间变性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase,ALK)基因重排的NSCLC患者，可选用ALK酪氨酸激酶抑制剂；而免疫组化染色结果程序性细胞死亡蛋白配体1(programmed death 1ligand,PD-L1)阳性率>50％，则可作为一线使用帕博利珠单抗(pembrolizumab)等免疫检查点抑制剂的指征。已有的研究证明：EGFR-TK等分子靶向药物的应用，NSCLC患者的5年生存率从10％作用提高到18％，同时也证明EGFR-TKI应用后平均8个月出现获得性耐药，部分病人还出现原发性耐药。免疫检查点抑制剂的临床应用，给肺癌的治疗带来了新的选择和新的希望，使晚期肺癌的5年生存率达到23.6％。
现有的免疫检查点抑制剂是通过抑制和阻断免疫通路中的PD-1/PD-L1分子靶点，逆转肿瘤导致的免疫逃逸，恢复机体的正常抗肿瘤免疫功能，调动人体自身的T淋巴细胞等免疫细胞杀死肿瘤，从而达到治疗肿瘤的作用。但是免疫检查点抑制剂同样存在获得性耐药和原发性耐药的问题，部分病人还会出现严重的、致死性的免疫性肺炎、免疫性心肌炎、免疫性肝炎等并发症。因此，研究和开发新的高效、低毒免疫检查点抑制剂是未来提高肺癌临床治愈率、生存率的希望所在。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新的免疫检查点抑制剂靶点AKT/STAT3，并提供AKT/STAT3抑制剂的新用途。
本发明提供了AKT/STAT3作为免疫检查点抑制剂的靶点的用途。
本发明还提供了AKT/STAT3抑制剂在制备治疗肿瘤和/或自身免疫性疾病的药物中的用途；优选地，所述治疗肿瘤的药物是治疗肺癌、肝癌、胃癌、宫颈癌、乳腺癌、前列腺癌、鼻咽癌、结直肠癌、口腔癌或胰腺癌的药物。
进一步地，上述治疗肿瘤和/或自身免疫性疾病的药物是恢复T细胞活性，增强T细胞免疫应答的药物。
进一步地，上述治疗肿瘤和/或自身免疫性疾病的药物是抑制肿瘤细胞增殖，和/或诱导肿瘤细胞凋亡的药物。
进一步地，上述治疗肿瘤和/或自身免疫性疾病的药物是抑制肿瘤细胞成瘤性的药物。
本发明还提供了一种N端乙酰基修饰的多肽，所述多肽的序列如SEQ ID NO.1所示。优选地，所述AKT/STAT3抑制剂是：(N端)Acetyl-Ser-Glu-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Asp-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn(C端)。
本发明还提供了上述N端乙酰基修饰的多肽在AKT/STAT3抑制剂中的用途。
本发明还提供了AKT/STAT3抑制剂在制备抑制PD-1/PD-L1的抑制剂中的用途。
进一步地，上述抑制PD-1/PD-L1的抑制剂是下调PD-L1表达的抑制剂。
进一步地，上述抑制PD-1/PD-L1的抑制剂是阻断PD-1与PD-L1结合的抑制剂。
进一步地，上述AKT/STAT3抑制剂包括：AKT通路抑制剂、PI3K/AKT通路抑制剂、STAT3通路抑制剂。
更进一步地，上述AKT/STAT3抑制剂是上述N端由乙酰基修饰的多肽。
本发明还提供了AKT/STAT3表达水平的检测试剂在制备肿瘤/或自身免疫性疾病筛查试剂中的用途；优选地，所述肿瘤/或自身免疫性疾病筛查试剂是肺癌、肝癌、胃癌、宫颈癌、乳腺癌、前列腺癌、鼻咽癌、结直肠癌、口腔癌或胰腺癌的筛查试剂。
本发明专利在研究发明人筛选鉴定的一个新型AKT/STAT3通路小分子抑制化合物ZQH2019818551220(结构为(N端)Acetyl-Ser-Glu-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Asp-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn(C端)，分子量3149)时，意外发现该化合物除了能抑制AKT/STAT3通路活性外，还能显著抑制PD-L1的表达水平，进而阻断PD-1与PD-L1的结合，使T细胞恢复活性，从而增强T细胞抗肿瘤免疫应答，在体外实验发现该小分子抑制化合物能抑制肿瘤细胞体外增殖，诱导肿瘤细胞凋亡；在小鼠肺癌移植瘤模型实验发现该小分子抑制化合物能显著抑制肺癌移植瘤成瘤性。因此，AKT/STAT3通路是一个新型的免疫检查点通路，该通路可以用于开发新型、高效、低毒的免疫检查点抑制剂用于肿瘤免疫治疗。此外，本发明AKT/STAT3通路免疫检查点还可以与现有的免疫检查点抑制剂联合应用，双通路阻断肿瘤的免疫逃逸，进而可以增强免疫治疗疗效和避免或/和减缓单一PD-1免疫检查点抑制剂产生的耐药。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1为(A)以正常人支气管上皮细胞株Beas-2B作为对照，Western Blot检测肺癌细胞株NL9980、L9981、95C、95D、A549、H1299、SPC-A-1、H460和YTMLC-90的PD-L1蛋白表达水平，图示具有代表性的Western Blot条带及灰度测算结果柱形图；(B)以Beas-2B细胞作为对照，qRT-PCR检测肺癌细胞株NL9980、L9981、95C、95D、A549、H1299、SPC-A-1、H460和YTMLC-90的PD-L1 mRNA水平。*：P<0.05；***：P<0.001。
图2为(A)Western Blot检测0、90、180、360μM/ml的ZQH2019818551220分别处理细胞72小时后，H1299、NL9980和L9981肺癌细胞PD-L1蛋白表达水平的变化情况；(B)WesternBlot检测360μM/ml的ZQH2019818551220处理0、24、48、72小时后，H1299、NL9980和L9981肺癌细胞PD-L1蛋白表达水平的变化情况；(C)流式细胞学技术检测0、180、360μM/ml的ZQH2019818551220分别处理细胞72小时后，H1299、NL9980和L9981肺癌细胞PD-L1平均荧光强度的改变。
图3为qRT-PCR检测0、90、180、360μM/ml的ZQH2019818551220分别处理72小时后，H1299(A)、NL9980(B)和L9981(C)肺癌细胞PD-L1mRNA水平的改变。
图4为(A)Western Blot检测0、90、180、360μM的ZQH2019818551220分别处理72小时后，H1299、NL9980和L9981肺癌细胞AKT蛋白的变化情况；(B)10μM的AKT激动剂SC79或相同浓度的溶剂(DMSO)预处理1小时后，再以360μM的ZQH2019818551220或相同浓度的溶剂(原装注射用水)处理72小时，组成图中所示的四种处理模式，Western Blot检测H1299细胞在四种不同的处理模式下p-AKT和PD-L1蛋白表达水平的变化。
图5为(A)360μM/ml的ZQH2019818551220处理72小时后，H1299、NL9980和L9981肺癌细胞HIF1α、STAT3、p65和c-jun蛋白表达水平的变化；(B)360μM/ml的ZQH2019818551220处理72小时后，H1299、NL9980和L9981细胞的细胞核STAT3和细胞浆STAT3蛋白表达情况；(C)0.5μM/ml的STAT3激动剂Colivelin或相同浓度的溶剂(DMSO)预处理1小时后，再以360μM/ml的ZQH2019818551220或相同浓度的溶剂(原装注射用水)处理72小时，组成图中所示的四种处理模式，Western Blot检测H1299细胞在四种不同的处理模式下p-STAT3和PD-L1蛋白表达水平的变化。
图6为(A)运用限制性内切酶Kpn I和Sac I酶切含有CD274启动子区域片段的pGL3-Basic重组质粒，结果DNA琼脂糖凝胶中呈现约1.5kb的目的片段条带和约5kb的载体片段条带；(B)运用双向测序技术，读取正向测序峰图和反向测序峰图所得的目的片段拼接序列结果；(C)重组质粒中，CD274启动子区目的片段的正向测序峰图；(D)重组质粒中，CD274启动子区目的片段的反向测序峰图。
图7为(A)双荧光素酶报告实验检测0、90、180、360μM/ml的ZQH2019818551220分别处理72小时后，转染有双荧光素酶报告质粒的H1299、NL9980和L9981肺癌细胞相对荧光活性的变化情况；(B)在转染有双荧光素酶报告质粒的H1299和L9981细胞中，用10μM/ml的AKT激动剂SC79或相同浓度的溶剂(DMSO)预处理细胞1小时后，再以360μM的ZQH2019818551220或相同浓度的溶剂(原装注射用水)处理72小时，组成图B中所示的四种处理模式，双荧光素酶报告实验检测细胞在四种不同的处理模式下相对荧光活性的变化；(C)在转染有双荧光素酶报告质粒的H1299和L9981细胞中，用0.5μM/ml的STAT3激动剂Colivelin或相同浓度的溶剂(DMSO)预处理细胞1小时后，再以360μM/ml ZQH2019818551220或相同浓度的溶剂(原装注射用水)处理72小时，组成图C中所示的四种处理模式，双荧光素酶报告实验检测细胞在四种不同的处理模式下相对荧光活性的变化。***：P<0.001。
图8为ZQH2019818551220在H1299-luc和L9981-luc移植瘤体内抗肿瘤生长的作用。(A)肿瘤接种及给药模式：接种肿瘤并待瘤体肉眼可见(肿瘤体积约60mm3)时，ZQH2019818551220给药组的5只裸鼠，给予ZQH2019818551220 20mg/kg/d皮下注射共36天，相应的对照组给药同样剂量的ZQH2019818551220溶剂皮下注射36天。待H1299-luc对照组接种瘤体积达到约900mm3以及L9981-luc对照组接种瘤体积达到约500mm3时，对裸鼠实施安乐死剖取接种瘤做进一步处理；(B)给药36天中，ZQH20198185512201给药组和对照组肿瘤体积增长曲线；(C)用药处理结束，荷瘤裸鼠麻醉后拍照；(D)剖取移植的原位肿瘤，观察比较ZQH2019818551220给药组与对照组瘤体大小和形态；(E)ZQH2019818551220给药组与对照组肿瘤重量和裸鼠体重的比较。*：P<0.05；**：P<0.01；***：P<0.001。
图9为活体成像技术检测H1299-luc和L9981-luc移植瘤裸鼠体内荧光素酶活性。(A)在接种H1299-luc和L9981-luc的裸鼠中，分别比较其对照组和ZQH2019818551220给药组体内原位移植瘤情况和转移灶分布情况；(B)统计分析各组中原位移植瘤和转移灶荧光素酶活性。*：P<0.05；**：P<0.01。
图10为免疫组化染色检测L9981-luc原位移植瘤对照组和给药组的肿瘤组织PD-L1表达水平。图中标尺代表90μm(A)和30μm(B)。
具体实施方式
本发明所用原料与设备均为已知产品，通过购买市售产品所得。
实验例1、不同组织学来源和不同转移潜能肺癌细胞株PD-L1表达水平比较PD-L1在各种肺癌细胞株中表达水平差异较大，有的表达量微小，需要干扰素γ、表皮生长因子等诱导后才能在Western Blot检测中显示出条。所以，我们首先选取正常人支气管上皮细胞株Beas-2B作为对照，运用Western Blot检测肺癌细胞株NL9980、L9981、95C、95D、A549、H1299、SPC-A-1、H460和YTMLC-90的PD-L1表达水平。
Western Blot结果显示：与人正常支气管上皮细胞Beas-2B比较，肺癌细胞NL9980、L9981、95D、H1299的PD-L1表达水平显著增高；而A549、SPC-A-1和H460细胞系，PD-L1表达水平轻度增高(图1A)。qRT-PCR结果显示：各细胞间PD-L1 mRNA水平，经F检验有非常显著性差异(P<0.001)；两两比较：NL9980、L9981、95C、95D、H1299、H460、YTMLC-90、SPC-A-1细胞PD-L1 mRNA水平较Beas-2B细胞均显著增高，其中,Beas-2B细胞株与NL9980、L9981、95C、95D、H1299、H460、YTMLC-90细胞间PD-L1 mRNA水平比较,有非常显著性差异(P<0.001),与SPC-A-1细胞间亦存在显著差异(P<0.05)(表1，图1B)；95D细胞与YTMLC-90细胞间,以及H460与YTMLC-90细胞间，PD-L1 mRNA水平无显著差异(P>0.05)，其余各细胞两两比较PD-L1 mRNA水平均存在显著差异(P<0.05)(表1，图1)。
表1 qRT-PCR测定不同类型肺癌细胞PD-L1 mRNA水平
Figure GDA0003897079660000061
*YTM：YTMLC-90cell line；**P values are compared with Beas-2B cells.
由此，我们选取H1299、NL9980和L9981三株PD-L1表达相对较高的细胞系进行后续实验。
实验例2、ZQH2019818551220对不同转移潜能肺癌细胞株PD-L1蛋白表达的影响
2.1 H1299肺癌细胞株不同浓度的ZQH2019818551220处理组间PD-L1表达水平比较
不同浓度的ZQH2019818551220(0/ml、90/ml、180/ml、360μM/ml)处理H1299肺癌细胞株72小时后，各组间PD-L1表达水平经F检验有非常显著性差异(P<0.001)；两两比较：(1)0μM/ml的ZQH2019818551220处理组与180/ml、360μM/ml处理组间细胞PD-L1表达水平比较,有非常显著性差异(P<0.001),但0μM/ml的ZQH2019818551220处理组与90μM/ml处理组间比较无显著差异(P>0.05)(表2，图2)；(2)90μM/ml的ZQH2019818551220处理组与180/ml和360μM/ml处理组间细胞PD-L1表达水平比较有显著性差异(P<0.05)(表2)；(3)180μM的ZQH2019818551220处理组与360μM处理组间细胞PD-L1表达水平比较无显著性差异(P>0.05)(表2)。
2.2 NL9980肺癌细胞株不同浓度ZQH2019818551220处理组间PD-L1表达水平比较
不同浓度ZQH2019818551220(0/ml、90/ml、180/ml、360μM/ml)处理NL9980肺癌细胞株72小时后，各组间PD-L1表达水平经F检验有非常显著性差异(P<0.001)；两两比较：(1)0μM/ml ZQH2019818551220处理组与90μM/ml处理组间细胞PD-L1表达水平比较无显著性差异(P>0.05)(表2，图2)，0μM/ml ZQH2019818551220处理组与180μM/ml、360μM/ml处理组比较有非常显著的差异(P<0.001)；(2)90μM/ml的ZQH2019818551220处理组与180μM/ml处理组间细胞PD-L1表达水平比较无显著性差异(P>0.05)(表2)，与360μM/ml处理组间比较有非常显著的差异(P<0.001)；(3)180μM/ml的ZQH2019818551220处理组与360μM/ml处理组间比较有非常显著的差异(P<0.001)(表2，图2)。
2.3 L9981肺癌细胞株不同浓度ZQH2019818551220处理组间PD-L1表达水平比较
不同浓度ZQH2019818551220(0/ml、90/ml、180/ml,360μM/ml)处理L9981肺癌细胞株72小时后，各组间PD-L1表达水平经F检验有非常显著性差异(P<0.001)；两两比较：(1)0μM/ml ZQH2019818551220处理组与90/ml、180/ml、360μM/ml处理组间细胞PD-L1表达水平比较有非常显著性差异(P<0.001)(表2，图2)；(2)90μM/ml的ZQH2019818551220处理组与180μM/ml处理组间细胞PD-L1表达水平比较无显著性差异(P>0.05)(表2)，与360μM/ml处理组间有显著性差异(P<0.05)；(3)180μM/ml ZQH2019818551220处理组与360μM/ml处理组间细胞PD-L1表达水平比较存在显著性差异(P<0.05)(表2，图2)。
2.4相同浓度ZQH2019818551220处理后不同肺癌细胞株间PD-L1表达水平比较
2.4.1 H1299、NL9980和L9981肺癌细胞株间0μM/ml ZQH2019818551220处理72小时后PD-L1表达水平比较
H1299、NL9980和L9981肺癌细胞株间0μM/ml ZQH2019818551220处理72小时后，细胞PD-L1表达水平经F检验，没有显著性差异(P>0.05)(表2，图2)。
2.4.2 H1299、NL9980和L9981肺癌细胞株间90μM/ml ZQH2019818551220处理72小时后PD-L1表达水平比较
H1299、NL9980和L9981肺癌细胞株间90μ/ml ZQH2019818551220处理72小时后，细胞PD-L1表达水平经F检验，有显著差异(P<0.05)：两两比较：H1299肺癌细胞株与NL9980肺癌细胞株间PD-L1表达水平比较无显著性非常差异(P>0.05)，NL9980肺癌细胞株与L9981肺癌细胞株间，以及H1299肺癌细胞株与L9981肺癌细胞株间，PD-L1表达水平比较有非常显著性差异(P<0.001)(表2，图2)。
2.4.3.H1299、NL9980和L9981肺癌细胞株间180μM/ml ZQH2019818551220处理72小时后PD-L1表达水平比较
H1299、NL9980和L9981肺癌细胞株间180μM/ml ZQH2019818551220处理72小时后，细胞PD-L1表达水平经F检验，有显著性差异(P<0.05)：两两比较：H1299肺癌细胞株与NL9980肺癌细胞株间PD-L1表达水平比较有非常显著的差异(P<0.001)，NL9980肺癌细胞株与L9981肺癌细胞株间PD-L1表达水平比较有非常显著性差异(P<0.001)，H1299肺癌细胞株与L9981肺癌细胞株间PD-L1表达水平比较有显著性差异(P<0.05)(表2，图2)。
2.4.4.H1299、NL9980和L9981肺癌细胞株间360μM/ml ZQH2019818551220处理72小时后PD-L1表达水平比较
H1299、NL9980和L9981肺癌细胞株间360μM/ml ZQH2019818551220处理72小时后，细胞PD-L1表达水平经F检验，有显著性差异(P<0.05)：两两比较：H1299组与NL9980组、NL9980组与L9981组，以及H1299组与L9981组肺癌细胞株间PD-L1蛋白水平比较，均存在显著性差异(P<0.05)(表2、3,图2)。
表2 Western Blot测定肺癌细胞在不同浓度ZQH2019818551220处理后的PD-L1蛋白水平
Figure GDA0003897079660000091
表3流式细胞学技术测定肺癌细胞在不同浓度ZQH2019818551220处理后的PD-L1荧光强度
Figure GDA0003897079660000092
2.5 H1299肺癌细胞株360μM/ml ZQH2019818551220处理后不同时间点PD-L1表达水平比较
360μM/ml ZQH2019818551220分别处理H1299肺癌细胞株0、24、48、72小时后，各组间PD-L1表达水平经F检验有非常显著性差异(P<0.001)；两两比较：(1)起始对照组与24h处理组间细胞PD-L1表达水平比较,无显著性差异(P>0.05),但与48和72h处理组比较存在非常显著的差异(P<0.001)(表4，图2)；(2)24h处理组与48、72μM处理组间细胞PD-L1表达水平比较有非常显著的差异(P<0.001)(表4)；(3)48h处理组与72h处理组间细胞PD-L1表达水平比较无显著性差异(P>0.05)(表3)。
2.6 NL9980肺癌细胞株360μM/ml ZQH2019818551220处理后不同时间点PD-L1表达水平比较
360μM/ml ZQH2019818551220分别处理NL9980肺癌细胞株0、24、48、72小时后，各组间PD-L1表达水平经F检验有非常显著性差异(P<0.001)；两两比较：(1)起始对照组与24h处理组间细胞PD-L1表达水平比较,存在显著性差异(P<0.05),与48和72h处理组比较存在非常显著的差异(P<0.001)(表4，图2)；(2)24h处理组与48、72μM处理组间细胞PD-L1表达水平比较有非常显著的差异(P<0.001)(表4)；(3)48h处理组与72h处理组间细胞PD-L1表达水平比较有显著性差异(P<0.05)(表4)。
2.7 L9981肺癌细胞株360μM/ml ZQH2019818551220处理后不同时间点PD-L1表达水平比较
360μM/ml的ZQH2019818551220分别处理L9981肺癌细胞株0、24、48、72小时后，各组间PD-L1表达水平经F检验有非常显著性差异(P<0.001)；两两比较：(1)起始对照组与24h处理组间细胞PD-L1表达水平比较,无显著性差异(P>0.05),与48和72h处理组比较存在非常显著的差异(P<0.001)(表4，图2)；(2)24h处理组与48h、72h处理组间比较，有非常显著的差异(P<0.001)；(3)48h处理组与72h处理组间比较，PD-L1表达水平有非常显著的差异(P<0.001)(表4)。
2.8 360μM/ml的ZQH2019818551220在相同时间点，不同肺癌细胞株间PD-L1表达水平比较
2.8.1.H1299、NL9980和L9981肺癌细胞株间360μM ZQH2019818551220处理起始PD-L1表达水平比较
H1299、NL9980和L9981肺癌细胞株间360μM/ml ZQH2019818551220处理起始组，细胞PD-L1表达水平经F检验，没有显著性差异(P>0.05)(表4，图2)。
2.8.2.H1299、NL9980和L9981肺癌细胞株间360μM/ml ZQH2019818551220处理24小时后PD-L1表达水平比较
H1299、NL9980和L9981肺癌细胞株间360μM/ml ZQH2019818551220处理24小时后，细胞PD-L1表达水平经F检验，有显著差异(P<0.05)：两两比较：H1299肺癌细胞株与NL9980肺癌细胞株间，以及H1299肺癌细胞株与L9981肺癌细胞株间，PD-L1表达水平比较有显著性差异(P<0.05)，NL9980肺癌细胞株与L9981肺癌细胞株间，PD-L1表达水平比较无显著性差异(P>0.05)(表4，图2)。
2.8.3.H1299、NL9980和L9981肺癌细胞株间360μM/ml ZQH20198185512201处理48小时后PD-L1表达水平比较
H1299、NL9980和L9981肺癌细胞株间360μM/ml的ZQH20198185512201处理48小时后，细胞PD-L1表达水平经F检验，没有显著性差异(P>0.05)(表4，图2)。
2.8.4.H1299、NL9980和L9981肺癌细胞株间360μM/ml ZQH2019818551220处理72小时后PD-L1表达水平比较
H1299、NL9980和L9981肺癌细胞株间360μM/ml ZQH2019818551220处理72小时后，细胞PD-L1表达水平经F检验，有显著性差异(P<0.05)：三组间两两比较PD-L1表达水平均存在显著性差异(P<0.05)(表4，图2)。
表4 Western Blot测定肺癌细胞在360μM/ml ZQH2019818551220处理不同时间点的PD-L1蛋白水平
Figure GDA0003897079660000111
实验例3、ZQH2019818551220对不同转移潜能肺癌细胞株PD-L1 mRNA水平的影响
3.1 H1299肺癌细胞株不同浓度ZQH2019818551220处理组间PD-L1 mRNA水平比较
不同浓度ZQH2019818551220(0μM/ml、90μM/ml、180μM/ml、360μM/ml)处理H1299肺癌细胞株72小时后，各组间PD-L1 mRNA表达水平经F检验有非常显著性差异(P<0.001)；两两比较：(1)0μM/ml ZQH2019818551220处理组与90、180、360μM/ml处理组间细胞PD-L1mRNA水平比较,有非常显著性差异(P<0.001)(表5，图3)；(2)90μM/ml ZQH2019818551220处理组与180μM/ml和360μM/ml处理组间细胞PD-L1mRNA水平比较有显著性差异(P<0.05)(表5)；(3)180μM/ml ZQH2019818551220处理组与360μM/ml处理组间细胞PD-L1 mRNA表达水平比较无显著性差异(P>0.05)(表5)。
3.2 NL9980肺癌细胞株不同浓度ZQH2019818551220处理组间PD-L1mRNA表达水平比较
不同浓度ZQH2019818551220(0、90、180、360μM/ml)处理NL9980肺癌细胞株72小时后，各组间PD-L1mRNA表达水平经F检验有非常显著性差异(P<0.001)；两两比较：(1)0μM/mlZQH2019818551220处理组与90、180、360μM/ml处理组间比较有非常显著的差异(P<0.001)(表5，图3)；(2)90μM/ml ZQH2019818551220处理组与180μM/ml处理组间细胞PD-L1mRNA表达水平比较无显著性差异(P>0.05)(表5)，与360μM/ml处理组间比较有非常显著的差异(P<0.001)；(3)180μM/ml ZQH2019818551220处理组与360μM/ml处理组间比较有显著差异(P<0.05)(表5，图3)。
3.3 L9981肺癌细胞株不同浓度ZQH2019818551220处理组间PD-L1mRNA表达水平比较
不同浓度ZQH2019818551220(0、90、180、360μM/ml)处理L9981肺癌细胞株72小时后，各组间PD-L1 mRNA表达水平经F检验有非常显著性差异(P<0.001)；两两比较：(1)0μM/ml ZQH2019818551220处理组与90、180、360μM/ml处理组间细胞PD-L1mRNA表达水平比较有非常显著性差异(P<0.001)(表5，图3)；(2)90μM/ml ZQH2019818551220处理组与180μM/ml处理组间细胞PD-L1mRNA表达水平比较无显著性差异(P>0.05)(表5)，与360μM/mlZQH2019818551220处理组间有显著性差异(P<0.05)；(3)180μM/ml ZQH2019818551220处理组与360μM/ml处理组间细胞PD-L1mRNA表达水平比较存在显著性差异(P<0.05)(表5，图3)。
3.4相同浓度ZQH2019818551220不同肺癌细胞株间PD-L1 mRNA表达水平比较
3.4.1.H1299、NL9980和L9981肺癌细胞株间0μM/ml ZQH2019818551220处理72小时后PD-L1 mRNA表达水平比较
H1299、NL9980和L9981肺癌细胞株间0μM/ml ZQH2019818551220处理72小时后，细胞PD-L1 mRNA表达水平经F检验，有非常显著性差异(P<0.001)。两两比较：H1299组与NL9980组、NL9980组与L9981组，以及H1299组与L9981组肺癌细胞株间PD-L1 mRNA水平比较，均存在非常显著性差异(P<0.001)(表5，图3)。
3.4.2.H1299、NL9980和L9981肺癌细胞株间90μM/ml ZQH2019818551220处理72小时后PD-L1 mRNA水平比较
H1299、NL9980和L9981肺癌细胞株间90μM/ml ZQH2019818551220处理72小时后，细胞PD-L1 mRNA水平经F检验，有非常显著的差异(P<0.001)：两两比较：H1299肺癌细胞株与NL9980肺癌细胞株间PD-L1mRNA水平比较有显著性差异(P<0.05)，NL9980肺癌细胞株与L9981肺癌细胞株间，以及H1299肺癌细胞株与L9981肺癌细胞株间，PD-L1 mRNA表达水平比较有非常显著性差异(P<0.001)(表5，图3)。
3.4.3.H1299、NL9980和L9981肺癌细胞株间180μM/ml ZQH2019818551220处理72小时后PD-L1 mRNA表达水平比较
H1299、NL9980和L9981肺癌细胞株间180μM/ml ZQH2019818551220处理72小时后，细胞PD-L1 mRNA表达水平经F检验，有非常显著性差异(P<0.001)：两两比较：H1299组与NL9980组、NL9980组与L9981组，以及H1299组与L9981组肺癌细胞株间PD-L1 mRNA表达水平比较，均存在非常显著性差异(P<0.001)(表5，图3)。
3.4.4.H1299、NL9980和L9981肺癌细胞株间360μM/ml ZQH2019818551220处理72小时后PD-L1 mRNA表达水平比较
H1299、NL9980和L9981肺癌细胞株间360μM/ml ZQH2019818551220处理72小时后，细胞PD-L1mRNA表达水平经F检验，有显著性差异(P<0.05)；两两比较：H1299肺癌细胞株与NL9980肺癌细胞株间PD-L1mRNA表达水平比较有显著性差异(P<0.05)，NL9980肺癌细胞株与L9981肺癌细胞株间，以及H1299肺癌细胞株与L9981肺癌细胞株间，PD-L1mRNA表达水平比较有非常显著性差异(P<0.001)(表5，图3)。
表5 qRT-PCR检测肺癌细胞在不同浓度ZQH2019818551220处理后的PD-L1 mRNA表达水平
Figure GDA0003897079660000141
实验例4、ZQH2019818551220对不同转移潜能肺癌细胞株PI3K-AKT信号通路的影响
4.1 ZQH2019818551220抑制PI3K-AKT信号通路
我们应用Western Blot方法，检测在本研究ZQH2019818551220下调PD-L1体系中，PI3K-AKT通路是否受到抑制，并验证该通路的改变是否与PD-L1的下调有关。Western Blot结果显示：180和360μM/ml ZQH2019818551220处理72小时后，p-AKT表达量较对照组有明显降低(图4)。说明180和360μM ZQH2019818551220处理72小时，肺癌细胞PI3K-AKT通路受到明显抑制。
4.2运用AKT激活剂SC79证明ZQH2019818551220通过抑制AKT信号通路从而下调PD-L1表达
AKT激活剂SC79可以选择性地激活PI3K-AKT通路，促进AKT磷酸化。我们将SC79加入ZQH2019818551220下调PD-L1的体系中，探索PI3K-AKT通路是否在ZQH2019818551220对PD-L1的下调中发挥作用。实验设计四个处理组，第四组的处理方式为，用10μM/ml的AKT激活剂SC79预处理肺癌细胞1小时，然后，再以360μM/ml的ZQH2019818551220处理细胞72小时；其余三组依次为，DMSO预处理后用ZQH2019818551220溶剂(原装注射用水)继续处理，SC79预处理后用ZQH2019818551220溶剂继续处理，以及DMSO预处理后用ZQH2019818551220继续处理，各组溶质、溶剂浓度及处理时间，和第四组保持一致。提取总蛋白，做WesternBlot检测，结果显示：(1)SC79上调p-AKT蛋白表达，同时总AKT蛋白未见明显变化，促进了AKT的磷酸化激活；(2)ZQH2019818551220单药处理组，PD-L1蛋白条带信号弱，而在ZQH2019818551220联合SC79处理组，PD-L1蛋白条带信号较前者增强(图4)。说明ZQH2019818551220可能通过PI3K-AKT通路下调肺癌细胞PD-L1表达。
实验例5、ZQH2019818551220对不同转移潜能肺癌细胞株PD-L1相关转录因子的影响
5.1 Western Blot检测ZQH2019818551220处理后各相关转录因子的变化
鉴于ZQH2019818551220不仅下调PD-L1蛋白，也在转录水平上下调PD-L1的mRNA，我们应用Western Blot方法检测肺癌细胞中相关转录因子在ZQH2019818551220处理后发生的改变。结果显示：360μM/ml ZQH2019818551220处理72小时后，p-STAT3明显减少，但NF-κB的代表组分p65，AP-1的代表组分p-c-jun，以及HIF-1α均没有明显改变(图5)。说明STAT3可能是ZQH2019818551220调节PD-L1转录的重要分子。
为了验证ZQH2019818551220处理后STAT3入核过程是否受影响，分别以360μM/mlZQH2019818551220和相同剂量溶剂处理H1299、NL9980和L9981肺癌细胞，核浆分离法提取核蛋白和浆蛋白，Western Blot检测STAT3相关蛋白浓度，结果显示：ZQH2019818551220处理组较对照组，核内p-STAT3和总STAT3蛋白均显著降低，降低幅度较大；而细胞浆内总STAT3未明显降低，甚至有所上升(图5)。说明以360μM/ml ZQH2019818551220处理肺癌细胞，亦可明显抑制转录因子STAT3入核。
5.2运用STAT3激活剂Colivelin证明ZQH2019818551220通过抑制STAT3从而下调PD-L1
为了证明ZQH2019818551220通过抑制转录因子STAT3的活化从而下调PD-L1的表达，我们将STAT3激活剂Colivelin加入ZQH2019818551220下调PD-L1的体系中，探索STAT3在ZQH2019818551220下调PD-L1过程中所发挥的作用。与上述SC79联合ZQH2019818551220的实验设计相似，实验分为四个处理组，第四组的处理方式为，用0.5μM/ml的STAT3激活剂Colivelin预处理肺癌细胞1小时，然后，再以360μM/ml的ZQH2019818551220处理细胞72小时；其余三组依次为，DMSO预处理后用ZQH2019818551220溶剂(原装注射用水)继续处理，Colivelin预处理后用ZQH2019818551220溶剂继续处理，以及DMSO预处理后用ZQH2019818551220继续处理，各组溶质、溶剂浓度及处理时间，和第四组保持一致。提取总蛋白，做Western Blot检测，结果显示：ZQH2019818551220单药处理组，PD-L1蛋白水平明显低于对照组，而在ZQH2019818551220联合Colivelin处理组，PD-L1蛋白水平部分恢复，但仍然低于对照组(图6)。说明ZQH2019818551220可能通过抑制肺癌细胞中转录因子STAT3的活化，从而下调PD-L1表达。
实验例6、制作含有CD274(编码PD-L1的基因)启动子区域的双荧光素酶报告质粒，验证ZQH2019818551220通过AKT-STAT3通路调控CD274转录
6.1包含CD274启动子区域的双荧光素酶报告质粒插入序列的鉴定
实验方法部分，我们已经介绍了制作双荧光素酶报告质粒的步骤，最后的鉴定由两种方法完成：酶切鉴定法和测序鉴定法。酶切鉴定法结果如下：经过限制性内切酶Kpn I和Sac I酶切鉴定，DNA琼脂糖凝胶中，在1-2kb中间和5kb处分别呈现一条DNA条带(图7),提示重组子中包含1369kb的目的片段。进一步测序鉴定结果如下图所示(图6)，核对碱基后确认与CD274基因启动子区碱基序列完全一致。该质粒可以用于后续的双荧光素酶报告实验。
6.2运用双荧光素酶报告质粒，验证ZQH2019818551220抑制了PD-L1的转录
转染双荧光素酶报告质粒后，用0、90、180、360μM/ml ZQH2019818551220处理三种肺癌细胞72小时，回收各组细胞进行双荧光素酶报告上机检测，结果显示：在三种肺癌细胞系中，180和360μM/ml处理组的相对荧光素酶活性均显著低于各自对照组，且随剂量的增大，降低幅度也增大(图7)。该结果与ZQH2019818551220下调PD-L1蛋白及mRNA水平的结果一致，验证了以上实验。
6.3运用双荧光素酶报告质粒，验证ZQH2019818551220通过抑制AKT从而抑制了STAT3对PD-L1的转录
为证明PI3K/AKT信号的减弱是否从上游抑制了STAT3对PD-L1的转录，我们将AKT激活剂SC79加入ZQH2019818551220下调PD-L1的体系中，观察肺癌细胞相对荧光素酶活性的变化情况。将双荧光素酶报告质粒转染进入肺癌细胞，以同样的实验设计，将AKT激活剂SC79加入ZQH2019818551220下调PD-L1的体系中，设置对照组，ZQH2019818551220单药处理组，SC79单药处理组，以及ZQH2019818551220+SC79处理组。处理72小时后，回收细胞进行双荧光素酶报告上机检测，结果显示：SC79单药处理组的相对荧光素酶活性显著高于对照组，而ZQH2019818551220+SC79联合处理组的相对荧光素酶活性较ZQH2019818551220单药组有所恢复(图7)。该结果进一步验证了ZQH2019818551220通过抑制AKT通路从而抑制STAT3对PD-L1的转录。
6.4运用双荧光素酶报告质粒，证明ZQH2019818551220抑制转录因子STAT3，导致PD-L1的转录水平降低
前述实验证明，在PD-L1的主要转录因子当中，STAT3是唯一一个被ZQH2019818551220明显抑制的。因此，运用STAT3激活剂和ZQH2019818551220联合处理转染有双荧光素酶的肺癌细胞，观察细胞相对荧光素酶活性的变化，可以有力地证明转录因子STAT3的抑制与PD-L1转录下调有关。
将双荧光素酶报告质粒转染进入肺癌细胞，以同样的实验设计，将STAT3激活剂Colivelin加入ZQH2019818551220下调PD-L1的体系中，设置对照组，ZQH2019818551220单药处理组，Colivelin单药处理组，以及ZQH2019818551220+Colivelin处理组。处理72小时后，回收细胞进行双荧光素酶报告上机检测，结果显示：Colivelin单药处理组的相对荧光素酶活性显著高于对照组，而ZQH2019818551220+Colivelin联合处理组的相对荧光素酶活性较ZQH2019818551220单药组有所恢复(图7)。该结果提示：(1)转录因子STAT3能与PD-L1启动子区域结合，参与PD-L1的转录过程；(2)ZQH2019818551220通过抑制转录因子STAT3的活化从而抑制PD-L1转录。
实验例7、ZQH2019818551220对肺癌裸鼠移植瘤成瘤性的影响
7.1 ZQH2019818551220用药组和对照组裸鼠肿瘤体积的比较
统计ZQH2019818551220用药组和对照组裸鼠肿瘤生长过程中体积的变化，制作肿瘤体积生长曲线，结果显示：无论是H1299-luc移植瘤，还是L9981-luc移植瘤，在36天用药完毕后，T检验显示，ZQH2019818551220用药组肿瘤体积均非常显著性的低于对照组(P<0.001)，ZQH2019818551220用药组的平均肿瘤体积大约仅有对照组的1/3-1/4(表6，图8)。实验结束后剥离裸鼠移植瘤，肉眼及测量观察证实了以上测量结果(图8)。说明20mg/kg/d的ZQH2019818551220用药36天后，裸鼠移植瘤的生长被明显抑制。
表6裸鼠H1299-luc和L9981-luc移植瘤在ZQH2019818551220给药36天后的肿瘤体积
Figure GDA0003897079660000181
7.2 ZQH2019818551220用药后，裸鼠肿瘤重量明显减小，但裸鼠体重无明显减轻
用药结束后称重裸鼠体重，并剥离移植瘤称重。结果显示：两组间经T检验分析，ZQH2019818551220用药组裸鼠肿瘤重量非常显著性地低于对照组(P<0.001)，但两组裸鼠平均体重无显著差异(P>0.05)(表7，表8，图8)：在H1299-luc移植瘤裸鼠中，ZQH2019818551220用药组的平均肿瘤重量大约是对照组的1/4；在L9981-luc移植瘤裸鼠中，ZQH2019818551220用药组的平均肿瘤重量仅有对照组的1/10左右(表7，图8)。另外，ZQH2019818551220用药36天后，ZQH2019818551220给药组裸鼠精神状态、运动能力较对照组改善，皮肤色泽、进食进水较对照组无明显差异(图8.)，该结果提示，20mg/kg/d的ZQH2019818551220用药36天，裸鼠可以耐受，未出现明显毒副反应，并且移植瘤的生长被明显抑制。
7.3运用活体成像技术，比较ZQH2019818551220用药组和对照组裸鼠原位移植瘤荧光素酶活性
为了实时监测原位移植瘤及转移灶的肿瘤细胞活性，我们运用IVIS-200活体成像仪检测移植瘤内荧光强度。结果显示：在给药36天后，肉眼观察活体图像即可发现，ZQH2019818551220给药组原位移植瘤的荧光素酶活性已明显小于对照组。测定各组荧光素酶活性，计算相对荧光素酶活性，并绘制柱状图进行统计分析，T检验结果显示：在接种H1299-luc裸鼠当中，ZQH2019818551220给药组的荧光素酶活性较对照组显著降低(P<0.05)，平均荧光素酶活性降低幅度大约在1/3以上；在接种L9981-luc裸鼠当中，ZQH2019818551220给药组的荧光素酶活性亦较对照组显著降低(P<0.05)，给药组的平均荧光素酶活性仅为对照组的1/2左右(表9，图9)。说明ZQH2019818551220显著抑制了原位移植瘤的细胞活性。
表7接种H1299-luc和L9981-luc移植瘤裸鼠在ZQH2019818551220给药36天后的体重
Figure GDA0003897079660000191
表8 H1299-luc和L9981-luc移植瘤在ZQH2019818551220给药36天后的肿瘤重量
Figure GDA0003897079660000192
表9 ZQH2019818551220给药36天后H1299-luc和L9981-luc原位移植肿瘤的荧光素酶活性
Figure GDA0003897079660000193
实验例8、ZQH2019818551220对肺癌裸鼠移植瘤癌组织中PD-L1蛋白表达的影响
为验证ZQH2019818551220在体内实验中是否也能够抑制肺癌细胞PD-L1蛋白表达，我们回收剖取的移植瘤新鲜标本，提取肿瘤蛋白，运用免疫组织化学染色方法，检测PD-L1蛋白表达水平。结果显示：在H1299-luc移植瘤及L9981-luc移植瘤中，ZQH2019818551220给药组的肿瘤PD-L1蛋白水平均较对照组明显降低(图10)。说明ZQH2019818551220对裸鼠成瘤后肿瘤PD-L1蛋白表达也有明显下调作用。
综上，本发明提供了AKT/STAT3作为免疫筛查点抑制剂的靶点的用途，并提供了AKT/ATAT3抑制剂的新用途，ZQH2019818551220作为一种新型AKT/ATAT3抑制剂能通过抑制AKT/STAT3通路(包括AKT通路、PI3K/AKT通路、STAT3通路)活性，显著抑制PD-L1的表达水平，进而阻断PD-1与PD-L1的结合，使T细胞恢复活性，从而增强T细胞抗肿瘤免疫应答；能抑制肿瘤细胞体外增殖，诱导肿瘤细胞凋亡；在小鼠肺癌移植瘤模型实验发现该小分子抑制化合物能显著抑制肺癌移植瘤成瘤性。
因此，AKT/STAT3通路是一个新型的免疫检查点通路，该通路可以用于开发新型、高效、低毒的免疫检查点抑制剂用于肿瘤免疫治疗。此外，本发明AKT/STAT3通路免疫检查点还可以与现有的免疫检查点抑制剂联合应用，双通路阻断肿瘤的免疫逃逸，进而可以增强免疫治疗疗效和避免或/和减缓单一PD-1免疫检查点抑制剂产生的耐药。
SEQUENCE LISTING
<110> 周清华
<120> AKT/STAT3作为免疫检查点抑制剂的靶点的用途
<130> GYKH1562-2021P0114211CCZ
<150> 2020114068236
<151> 2020-12-04
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 28
<212> PRT
<213> ZQH2019818551220
<400> 1
Ser Glu Ala Ala Val Asp Thr Ser Ser Glu Ile Thr Thr Lys Asp Leu
1 5 10 15
Lys Asp Lys Lys Glu Val Val Glu Glu Ala Glu Asn
20 25

Claims (4)

1.一种N端乙酰基修饰的多肽，其特征在于，所述多肽的序列如SEQ ID NO.1所示。
2.权利要求1所述的N端乙酰基修饰的多肽在制备治疗肺癌的药物中的用途。
3.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述药物是通过抑制PD-1/PD-L1通路治疗肺癌的药物。
4.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述通过抑制PD-1/PD-L1通路治疗肺癌的药物是通过抑制AKT/STAT3通路治疗肺癌的药物。
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