JP6701593B2 - 癌細胞のカベオラの形成を特異的に抑制する化合物のスクリーニング方法、スクリーニングキット、該キットに用いるベクター及び形質転換体、並びに分子標的薬の適応患者の選択方法 - Google Patents
癌細胞のカベオラの形成を特異的に抑制する化合物のスクリーニング方法、スクリーニングキット、該キットに用いるベクター及び形質転換体、並びに分子標的薬の適応患者の選択方法 Download PDFInfo
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Description
前記スクリーニング方法が、
Cavin−1及びCAV1の結合の抑制を検出できる系に試験化合物を接触させる工程、
Cavin−1及びCAV1の結合を抑制する活性を有する化合物を選択する工程、
を含むことを特徴とするスクリーニング方法。
(2)前記Cavin−1及びCAV1の結合の抑制を検出できる系が、
Cavin−1の機能の抑制を検出できる系であることを特徴とする上記(1)に記載のスクリーニング方法。
(3)前記Cavin−1の機能の抑制を検出できる系が、ROR1とCavin−1との結合の抑制を検出できる系、又はIGF−IRとCavin−1との結合の抑制を検出できる系であることを特徴とする上記(2)に記載のスクリーニング方法。
(4)前記Cavin−1及びCAV1の結合の抑制を検出できる系が、
CAV1の機能の抑制を検出できる系であることを特徴とする上記(1)に記載のスクリーニング方法。
(5)前記CAV1の機能の抑制を検出できる系が、ROR1とCAV1との結合の抑制を検出できる系、又はIGF−IRとCAV1との結合の抑制を検出できる系であることを特徴とする上記(4)に記載のスクリーニング方法。
(6)ヒトROR1の細胞内領域のアミノ酸配列428〜937番の内、少なくとも564〜746番のアミノ酸領域を含むアミノ酸配列をコードする核酸を挿入した組み換えベクター、及び、
ヒトCavin−1のアミノ酸配列をコードする核酸を挿入した組み換えベクター、
を導入した形質転換体。
(7)上記(6)に記載の形質転換体を含む、ROR1とCavin−1の結合を抑制する化合物のスクリーニングキット。
(8)ヒトROR1の細胞内領域のアミノ酸配列428〜937番の内、少なくとも853〜876番のアミノ酸領域を含むアミノ酸配列をコードする核酸を挿入した組み換えベクター、及び、
ヒトCAV1のアミノ酸配列をコードする核酸を挿入した組み換えベクター、
を導入した形質転換体。
(9)上記(8)に記載の形質転換体を含む、ROR1とCAV1の結合を抑制する化合物のスクリーニングキット。
(10)ヒトROR1の細胞内領域のアミノ酸配列428〜937番の内、564〜746番のアミノ酸領域を含むアミノ酸配列をコードする核酸及び853〜876番のアミノ酸領域を含むアミノ酸配列をコードする核酸、を少なくとも挿入した組み換えベクター、
ヒトCavin−1のアミノ酸配列をコードする核酸を挿入した組み換えベクター、及び、
ヒトCAV1のアミノ酸配列をコードする核酸を挿入した組み換えベクター、
を導入した形質転換体。
(11)上記(10)に記載の形質転換体を含む、ROR1とCavin−1の結合を抑制する化合物及び/又はROR1とCAV1の結合を抑制する化合物のスクリーニングキット。
(12)ヒトROR1の細胞内領域のアミノ酸配列428〜937番の内、564〜746番のアミノ酸領域を含むアミノ酸配列をコードする核酸及び/又は853〜876番のアミノ酸領域を含むアミノ酸配列をコードする核酸、を少なくとも挿入した組み換えベクター。
(13)被検体から癌細胞を取得する工程、
前記癌細胞中の、ROR1とCavin−1、ROR1とCAV1、IGF−IRとCavin−1、IGF−IRとCAV1、Cavin−1とCAV1、Cavin−1、又はCAV1から選択される少なくとも1種以上の発現を測定する工程、
を含むことを特徴とする分子標的薬の適応患者の選択方法。
また、Cavin−1及び/又はCAV1に結合するROR1の結合部位のDNAを含むベクター、並びにCavin−1及び/又はCAV1のDNAを含むベクターを用い、結合部位並びにCavin−1及び/又はCAV1が発現している形質転換体を作製し、当該形質転換体を用いたスクリーニングキットを作製することで、癌細胞のカベオラ形成を特異的に抑制する化合物のスクリーニングを簡単に行うことができる。
更に、カベオラの安定化にはROR1の発現が重要な役割を果たしていることから、ROR1、IGF−IR、Cavin−1、CAV1の発現の組み合わせを調べることで上記スクリーニングにより得られた分子標的薬の適応患者を事前に選択することができるので、コンパニオン診断薬を処方することができる。
(1)ROR1の細胞内領域のアミノ酸配列428〜937番の内、少なくとも564〜746番のアミノ酸領域を含むアミノ酸配列をコードする核酸を挿入した組み換えベクターを作製する。
(2)ヒトCavin−1のアミノ酸配列をコードする核酸を挿入した組み換えベクターを作製する。
(3)細胞に、(1)及び(2)のベクターを導入して形質転換体を作製する。
組み換えベクターの作製及び細胞への組み換えベクターの導入は、公知の方法で行えばよい。また、細胞としては、HeLa細胞、HEK293細胞、COS−7細胞、CHO細胞等を用いることができる。
(4)これらの細胞を用いて(1)および(2)の組み換えベクターを導入した形質転換体として恒常的に発現することができる細胞株を作製する。
(1)細胞株と試薬
ヒト肺腺癌細胞株であるNCI−H1975(ATCC寄託番号:CRL−5908)、NCI−H358(ATCC寄託番号:CRL−5087)、NCI−H441(ATCC寄託番号:HTB−174)、COS−7(ATCC寄託番号:CRL−1651);ヒト外陰部扁平上皮癌細胞であるA431(ATCC寄託番号:CRL−1555);HeLa(ATCC寄託番号:CCL−2)は、アメリカ培養細胞系統保存機関(American Type Culture Collection)から購入した。ヒト肺腺癌細胞株であるPC−9細胞株(RCB4455)は、RIKENのCell Bankより入手した。また、ヒト肺腺癌細胞株であるSK−LU−1細胞株は、Lloyd J.Old(メモリアル・スローン・ケタリング癌センター)から提供を受けた。そして、これらの細胞株は、10%ウシ胎児血清(FBS)添加RPMI 1640(Invitrogen社製)により維持した。
・anti−ROR1、anti−IGF−IR、anti−phospho−InsulinR(Y1150/Y1151)、anti−phospho−IGF−IR(Y1135/Y1136)、anti−phospho−PDGF(Y754)、anti−phospho−c−Met(Y1234/Y1235)、anti−pAKT(S473)、anti−AKT、anti−phosphoERK(T202/Y204)、anti−ERK、anti−METは、CellSignaling Technology社から購入した。
・anti−Cavin−1、anti−Cavin−2はabcam社から購入した。
・anti−α−tubulinはSigma社から購入した。
・anti−ROR1(免疫沈降用)はR&D system社から購入した。
・anti−CAV1、anti−CAV2はBD Bioscience社から購入した。
・anti−mouse IgG、及びanti−rabbit IgGはCell Signaling Technology社から購入した。
ヒトROR1全長cDNA(OriGene Technologies社製)はpCMV−puroベクターに挿入した。そして得られたコンストラクト(pCMVpuro−ROR1)のオープン・リーディング・フレーム(ORF)の配列を正確に確認した。ヒトCavin−1全長cDNA(OriGene Technologies社製)はpCMV−puroベクターに挿入した。そして得られたコンストラクト(pCMVpuro−Cavin−1)のオープン・リーディング・フレーム(ORF)の配列を正確に確認した。ヒトCAV1全長cDNA(OriGene Technologies社製)はpCMV−puroベクターに挿入した。そして得られたコンストラクト(pCMVpuro−CAV1)のオープン・リーディング・フレーム(ORF)の配列を正確に確認した。また、pCMVpuro−ROR1−ICD(428アミノ酸から937アミノ酸)、pCMVpuro−ROR1−TK2+TK3(564アミノ酸から746アミノ酸の領域)は制限酵素を用いた分子生物学的手法により作製した。
Δ746フォワードプライマー:5’−CGCTCCTGGGAGGGACTCTCAAGTC−3’(配列番号:1)、
Δ564フォワードプライマー:5’−ATCATGAGATCCCCACACTCTGATG−3’(配列番号:2)、
Δ655フォワードプライマー:5’−ATTCGCTGGATGCCCCCTGAAGCCA−3’(配列番号:3)、
Δ748フォワードプライマー:5‘−AACCCCAGATATCCTAATTACATGT−3’(配列番号:4)
Δ851フォワードプライマー:5‘−AAGAGTCGGTCCCCAAGCAGTGCCA−3’(配列番号:5)
Δ853フォワードプライマー:5‘−AATCAGGAAGCAAATATTCCTTTAC−3’(配列番号:6)
Δ473リバースプライマー:5’−AGCAGAAAGAGGTAGCTCTTTAGCC−3’(配列番号:7)、
Δ564リバースプライマー:5’−GAGGAACTCATGGAGATCCCCCTGA−3’(配列番号:8)、
Δ655リバースプライマー:5’−GGGCAGCAAGGACTTACTCTGGACC−3’(配列番号:9)。
Δ782リバースプライマー:5‘−CCGAAGCCGGACGTGAATATCTTTA−3’(配列番号:10)
Δ782リバースプライマー:5‘−GTTACTGAGATTACTCACTGGGCTG−3’(配列番号:11)
Δ876リバースプライマー:5‘−CTTGGGAGGTGGGCAGTGCTGAATC−3’(配列番号:12)
ウェスタンブロッティング分析、及びIP−WB分析は、Immobilon−P フィルター(Millipore社製)及び化学発光増強システム(enhanced chemiluminescence system、GE Healthcare社製)を用いて、標準的な方法により施行した。ROR1とCavin−1の結合部位を特定するために、pCMVpuro−Cavin−1−WTを、wild type(WT)、TKΔ473−564(TKΔ1)、TKΔ564−655(TKΔ2)、TKΔ655−746(TKΔ3)、TKΔ473−655(TKΔ1+Δ2)、TKΔ564−746(TKΔ2+Δ3)、TKΔ473−746(TKΔ1+Δ2+Δ3)、といった様々なROR1発現コンストラクトとともに共発現を行った。また、ROR1とCAV1の結合部位を特定するために、pCMVpuro−CAV1−WTを、wild type(WT)、TKΔ473−564(TKΔ1)、TKΔ564−655(TKΔ2)、TKΔ655−746(TKΔ3)、ST1Δ748−782(ΔST1)、PΔ784−851(ΔP)、ST2Δ853−876(ΔST2)といった様々なROR1発現コンストラクトとともに共発現を行った。これらはCOS−7細胞を用いて、FuGene6(Promega社)によるトランスフェクション後24時間で細胞を回収し、IP−WB分析を行った。
FluoppiによりHeLa細胞にトランスフェクションした細胞は、24時間後に培養液を取り除き、PBSで洗浄後、3.7%のホルマリン溶液で固定し、プレパラートを作製した後、蛍光顕微鏡(Leica社製)を用いて観察した。
NCI−H1975およびPC−9肺腺癌細胞株は、siControl、siROR1のトランスフェクション後72時間で培養液を取り除き、PBSで洗浄後、細胞を回収し、NP−40 lysis buffer(1% NP−40、20mM Tris−HCl(pH8.0)、137mM NaCl、10% glycerol、2mM EDTA、1mM sodium orthovanadate、protein inhibitor tablet(Roche社))に懸濁後、R&D社のプロトコールに従い解析を行った。
RNAiを行うため、下記RNAオリゴマーをQIAGEN社及びSigma−Aldrich社から入手した。
・5’−CAGCAAUGGAUGGAAUUUCAA−3’:siROR1#1(配列番号:13)、
・5’−CCCAGUGAGUAAUCUCAGU−3’:siROR1#2(配列番号:14)、
・5’−CCCAGAAGCUGCGAACUGU−3’:siROR1#3(配列番号:15)、
・5’−GGAAUUGCAUGGUAGCCGAUU−3’:siIGF−IR#1(配列番号:16)、
・5’−CUGACUACAGGGAUCUCAUUU−3’:siIGF−IR#2(配列番号:17)、
・5’−CUCCAAGACCGCGGUCUACAA−3’:siCavin−1#1(配列番号:18)、
・5’−CCCGCCGAGCGGCGCGAGAAA−3’:siCavin−1#2(配列番号:19)、
・5’−AGACGAGCUGAGCGAGAAGCA−3’:siCAV1#1(配列番号:20)。
siROR1に対するsilent mutationを含んだpCMVpuro−ROR1−WTm(siROR1)やpCMVpuro−ROR1−KDm(siROR1)については、KOD−plus−DNAポリメラーゼ(TOYOBO社)を用いて、in vitro mutagenesisを行い、作製した。作製にはアミノ酸の置換を伴わない、
・5’−CAACAGTGGACAGAGTTCCAG−3’:(配列番号:21)
のプライマーを用いた。野生型のROR1(ROR1−WT)、あるいはsiROR1に対するsilent mutationを加えた野生型のROR1(ROR1−WTm)、またはsiROR1に対するsilent mutationを加えたキナーゼ活性を欠失したROR1(ROR1−KDm)をNCI−H1975細胞にトランスフェクションを行い、24時間後、puromycinでセレクション(1.5μg/ml)を行った上で、シングルクローンを採取し、それぞれのROR1を発現したstable clone(恒常的ROR1発現細胞株)を作製した。これらのstable cloneは、その後、siControlあるいはsiROR1で処理した後、3日後に細胞を回収し、ウェスタンブロッティング分析を行った。
siROR1に対するsilent mutationを含んだpCMVpuro−ROR1−WTm(siROR1)やpCMVpuro−ROR1−TKΔ2+TKΔ3m(siROR1)については、KOD−plus−DNAポリメラーゼ(TOYOBO社)を用いて、in vitro mutagenesisを行い、作製した。作製にはアミノ酸の置換を伴わない、
・5’−CAACAGTGGACAGAGTTCCAG−3’:(配列番号:21)
のプライマーを用いた。野生型のROR1(ROR1−WT)、あるいはsiROR1に対するsilent mutationを加えた野生型のROR1(ROR1−WTm)、またはsiROR1に対するsilent mutationを加えたcavin−1の結合領域を欠損したROR1(ROR1−TKΔ2+TKΔ3m)をPC−9細胞にトランスフェクションを行い、24時間後、puromycinでセレクション(1.0μg/ml)を行った上で(3日後)、バルククローンとして細胞を回収し、再度6ウェルプレートに撒き直した。その後、siControlあるいはsiROR1で処理した後、3日後に細胞を回収し、ウェスタンブロッティング分析を行った。
siROR1に対するsilent mutationを含んだpCMVpuro−ROR1−WTm(siROR1)やpCMVpuro−ROR1−ΔS/T2m(siROR1)については、KOD−plus−DNAポリメラーゼ(TOYOBO社)を用いて、in vitro mutagenesisを行い、作製した。作製にはアミノ酸の置換を伴わない、
・5’−CAACAGTGGACAGAGTTCCAG−3’:(配列番号:21)
のプライマーを用いた。野生型のROR1(ROR1−WT)、あるいはsiROR1に対するsilent mutationを加えた野生型のROR1(ROR1−WTm)、またはsiROR1に対するsilent mutationを加えたCAV1の結合領域を欠損したROR1(ROR1−ΔS/T2m)をPC−9細胞にトランスフェクションを行い、24時間後、puromycinでセレクション(1.0μg/ml)を行った上で(3日後)、バルククローンとして細胞を回収し、再度6ウェルプレートに撒き直した。その後、siControlあるいはsiROR1で処理した後、3日後に細胞を回収し、ウェスタンブロッティング分析を行った。
培養ディッシュ内に20μmの厚さの金箔を敷き、その上で肺腺癌細胞株であるNCI−H1975細胞を培養し、siControlあるいはsiROR1のトランスフェクションを行った。トランスフェクション後72時間でhigh−pressure freezing machine(Leica社)を用いて急速凍結を行った。BAF400 apparatus(Baltec社)を用いて凍結割断レプリカを作製し、SDSで処理後、mouse anti−CAV2 antibody(BD Transduction社)でラベルを行った。その後、10nmの金コロイド−conjugated goat anti−mouse IgG antibody(British Biocell International社)を用いて二次抗体反応を行い、JEM−1011電子顕微鏡により観察を行った。また、カベオラ分布密度計測については、電子顕微鏡下でランダムに選択した領域(17−50μmの18個のランダムな細胞膜領域)を測定し、それぞれの電子顕微鏡写真の細胞膜の領域は、ImageJを用いて測定した。
Image−based Protein−Protein Interaction analysisによる実験系の構築および解析方法は、入手先であるMBLのプロトコールに従って行った。pCMVpuro−ROR1−ICD(428アミノ酸から937アミノ酸)、pCMVpuro−ROR1−TK2+TK3(564アミノ酸から746アミノ酸の領域)およびpCMVpuro−Cavin−1―WT(全長)はMBLのプロトコールに従い、制限酵素を用いた分子生物学的手法により以下のコンストラクトの作製を行った。phAG−MNL−ROR1−ICD、phAG−MNL−ROR1−TK2+TK3、phAG−MNL−Cavin−1−WT、phAG−MCL−ROR1−ICD、phAG−MCL−ROR1−TK2+TK3、phAG−MCL−Cavin−1−WT、pAsh−MNL−ROR1−ICD、pAsh−MNL−ROR1−TK2+TK3、pAsh−MNL−Cavin−1−WT、pAsh−MCL−ROR1−ICD、pAsh−MCL−ROR1−TK2+TK3、pAsh−MCL−Cavin−1−WT。そしてそれぞれの得られたコンストラクトが適切に組み込まれていることをシークエンスにより配列を正確に確認した。その後、適切な8通りの組み合わせによるトランスフェクション(Fugene6(Promega社))を、HeLa細胞を用いて行った。同時にROR1−ICDあるいはROR1−TK2+TK3を組み込んだプラスミドとCavin−1−WTを組み込んでいないプラスミドのトランスフェクションも行った(4通りの組み合わせ、ネガティブコントロール)。トランスフェクション後24時間で細胞を3.7%のホルマリン溶液で固定し、観察を行った。
ROR1、Cavin−1、CAV1の発現抑制による細胞増殖への影響を調べるために、PC−9及びNCI−H1975細胞株に対してsiControlあるいはsiROR1、siCavin−1、siCAV1のトランスフェクションを行った。トランスフェクション後120時間で、Cell Counting Kit−8(DOJINDO社)を用いて反応させ、プレートリーダーにより吸光度を測定し、比色法を行った。なお、この実験は独立に3回行い、その平均値をグラフ化した。
臨床上問題となっている様々なリガンド存在下でのEGFR−TKI耐性を獲得した細胞株におけるROR1、Cavin−1、CAV1の発現抑制による細胞増殖への効果と生存シグナルへの影響を調べた。外陰部扁平上皮癌細胞であるA431、肺腺癌細胞であるPC−9、およびNCI−1975細胞株に対して、様々なリガンド(50ng/ml)とEGFR−TKI(Gefitinibは1uM、CL−387,785は0.5uM)存在下の状態(A431:Gefitinib+IGF−I、PC−9:Gefitinib+HGF、H1975:CL−387,785+HGF)を作り出した上で、siControlあるいはsiROR1、siCavin−1、siCAV1のトランスフェクション(20uM)を行った。ウェスタンブロッティングの場合は、細胞をプレートに撒いた次の日に各々のsiRNAの処理を行い、3日後にそれぞれのリガンドとEGFR−TKIを6時間作用させ、細胞を回収した。MTT assayの場合は、細胞をプレートに撒いた次の日に各々のsiRNAの処理を行い、さらに次の日にそれぞれのリガンドとEGFR−TKIを作用させ、4日後にCell Counting Kit−8(DOJINDO社)を用いて反応させ、プレートリーダーにより吸光度を測定し、比色法を行った。なお、この実験は独立に3回行い、その平均値をグラフ化した。
<肺腺癌細胞株でのROR1発現抑制に伴うRTK活性化への影響に関する検証>
上記(5)に示す手順で、肺腺癌細胞株であるNCI−H1975、PC−9細胞株を用いたphospho−RTK array解析による検討を行った。図1(1)はNCI−H1975、図1(2)はPC−9の解析結果を示す写真である。図1(1)が示すように、NCI−H1975では、主にERBB2、ERBB3、PDGFR、c−KIT、ALK、InsulinR、IGF−IRのRTKのリン酸化反応の低下が認められた。また、図1(2)が示すように、PC−9細胞株では、主にERBB2、ERBB3、IGF−IR、c−MET、MSPR、EphR2のRTKのリン酸化反応の低下が認められた。以上の結果より、ROR1の発現抑制によって多くの様々なRTKのリン酸化反応(活性化)を低下できることが分かった。特に、2つの細胞株で共通して見られるRTKのリン酸化の低下として顕著なものとしては、ERBB2、ERBB3およびIGF−IRが挙げられる。以上の結果は、肺腺癌細胞株においてROR1の発現が、広範囲に多くのRTKのリン酸化反応、つまりはRTKの活性化の維持に関与していることを示しており、共通するROR1を介したRTKの活性化機序が存在する可能性を示している。更に、今回影響が見られたRTKは肺腺癌細胞において重要な生存シグナルなど生理的な機能を担っている。したがって、ROR1の発現抑制がこれらのRTKを網羅的に抑制させることから、ROR1が肺腺癌にとって重要な役割を担う各々のRTKの活性化を一網打尽にできる全く新しいこれまでにない革新的な分子標的となる可能性を秘めていることが明らかとなった。
<ROR1の発現抑制によるCAV1の発現低下とカベオラ形成への影響に関する検討>
上記(6)に示す手順で、各種肺腺癌細胞株によるROR1の発現抑制によるCAV1の発現低下とカベオラ形成への影響を、ウェスタンブロッティングにより分析した。図2(1)は肺腺癌細胞株としてNCI−H1975を用いた際の結果を示しており、配列の異なるsiROR1#1〜3を用いたROR1の発現抑制は、何れのケースでもカベオラの形成に不可欠なCAV1の発現低下が認められた。この結果は、siROR1の特定の配列に基づく特異的な現象ではなく、CAV1の発現低下はROR1の発現抑制によるものであることが明らかとなった。図2(2)は、肺腺癌細胞株として、NCI−H441、NCI−H358、PC−9を用いた際の結果を示しており、図2(1)と同様に、siControl及びsiROR1を用いてROR1の発現を抑制させたところ、各々の細胞株においてもCAV1の発現低下が認められた。これらの結果は、ROR1によるCAV1の発現制御は多くの肺腺癌細胞株において共通の制御機序が存在する可能性を示している。
<ROR1によるCAV1の発現制御におけるROR1のキナーゼ活性の必要性の検討>
肺腺癌細胞株においてRTKであるROR1は、癌細胞の生存シグナルに関わるPI3K−AKT軸をキナーゼ活性依存的に、あるいは非依存的に制御していることを本発明者は報告しているが(上記特許文献2参照)、ROR1によるCAV1の発現制御にROR1のキナーゼ活性が必要であるか否かを検討した。ROR1−WT(野生型のROR1)、ROR1−WTm(siROR1に対するsilent mutationを加えた野生型のROR1)、ROR1−KDm(siROR1に対するsilent mutationを加えたキナーゼ活性を欠失したROR1)を恒常的に発現させた肺腺癌細胞株NCI−H1975を用い、上記(7)の手順により、実験を行った。図3は、ウェスタンブロッティングによって分析した結果を示す写真である。図3に示すように、ROR1−WTを発現させた細胞株ではsiROR1処理によってこれまで確認してきたCAV1の発現低下が認められた。
これに対して、ROR1−WTmを発現させた細胞株では、siROR1処理によってCAV1の発現低下が見られなかった。このことは、siROR1が細胞内で正しく働き、細胞内でのROR1の機能としてCAV1の発現低下を引き起こしていることを示している。さらに、ROR1−KDmを発現させた細胞株においても、siROR1処理によって、CAV1の発現低下が見られなかった。この結果から、siROR1によるCAV1の発現低下にはROR1のキナーゼ活性が必要でないことが分かり、つまりはROR1を介したCAV1の発現制御にROR1のキナーゼ活性は重要でないことが判明した。このことは、ROR1のキナーゼ活性非依存的な機能に着目したROR1機能阻害剤の同定と、その阻害剤を同定するためのスクリーニング法が必要であることを示している。
<肺腺癌細胞株でのROR1とカベオラの構成因子であるCavin−1及びCAV1との結合と、CAV1とCavin−1の結合におけるROR1の重要性の検討>
カベオラの形成に必要であるCAV1の発現はCavin−1との結合によってその発現が安定化されていることが分かっている(非特許文献8〜10参照)。つまりCavin−1はカベオラの形成において非常に重要なタンパク質であることが理解されている。しかしながら、カベオラの形成においてCavin−1がどのような制御下においてCAV1の発現を安定化させているかについては不明のままであり、さらにCavin−1についての詳細な機能はよく分かっていない。そこでCavin−1に着目し、オクチルグルコシドによる細胞抽出液を用いてROR1とCavin−1との結合を検討した。
<肺腺癌細胞株におけるROR1発現抑制に伴う、様々なリガンド刺激を介した各々のRTK活性化への影響に関する検証>
[実施例1]のphospho−RTK arrayの解析結果により、肺腺癌細胞株におけるROR1の発現抑制は、定常状態での様々なRTKのリン酸化反応(活性化)の低下を引き起こすことが明らかとなった。実施例5では、さらにこれらのRTKについて、各々のリガンド刺激によるリン酸化反応にもROR1の発現抑制が影響を及ぼすかどうか、同様に肺腺癌細胞株NCI−H1975を用い、上記(3)の手順により分析を行った。図5(1)〜(4)は各リガンドを用いた時のウェスタンブロッティング写真である。図5(1)〜(4)が示すように、ROR1の発現抑制は各々のリガンド(IGF−I、IGF−II、Insulin、PDGF)によるRTK(IGF−IR、InsulinR、PDGFR)のリン酸化反応(活性化)を有意に低下させることが明らかとなった。IGF−IRは、IGF−I又はIGF−IIのどちらでも活性化されるが、ROR1の発現抑制はどちらのリガンド刺激においてもIGF−IRのリン酸化反応を低下させた。
<肺腺癌細胞株でのCavin−1の細胞増殖における重要性の検討>
上記(12)の手順により、Cavin−1の細胞増殖への影響を検討した。図6(1)及び(2)に示すように、異なる2つの肺腺癌細胞株であるPC−9、NCI−H1975において、ROR1、Cavin−1、CAV1の発現抑制を行ったところ、2つの細胞株でROR1、Cavin−1、CAV1の発現抑制は有意に細胞増殖を阻害することが分かった。また、Cavin−1の発現抑制は、配列の異なるsiCavin−1#1、#2を用いた場合においても同様に細胞増殖の阻害が認められたことから、siCavin−1の特定の配列に基づく特異的な現象ではないことが分かった。これらの結果から、ROR1の発現抑制は細胞増殖を阻害すること(特許文献1及び非特許文献5)やCAV1の発現抑制もまた細胞増殖を阻害すること(非特許文献7)に関しては報告があり、再現性を得ることができたが、新たに、Cavin−1の発現抑制によっても肺腺癌細胞株の細胞増殖を阻害することが分かった。
<肺腺癌細胞株でのIGF−IR発現抑制に伴うCAV1の発現低下に関する検証>
上記(3)に示す手順で、各種肺腺癌細胞株によるIGF−IRの発現抑制によるCAV1の発現への影響を、ウェスタンブロッティングにより分析した。図7(1)は肺腺癌細胞株としてNCI−H1975を用いた際の結果を示しており、配列の異なるsiIGF−IR#1、#2を用いたIGF−IRの発現抑制は、siROR1で処理した場合と同様に、何れのケースでもCAV1の発現低下が認められた。この結果は、siIGF−IRの特定の配列に基づく特異的な現象ではなく、CAV1の発現低下はIGF−IRの発現抑制によるものであることが明らかとなった。図7(2)は、肺腺癌細胞株として、NCI−H358を用いた際の結果を示しており、図7(1)と同様に、siIGF−IR#1、#2を用いてIGF−IRの発現を抑制させたところ、siROR1で処理した場合と同様に、NCI−H358細胞株においてもCAV1の発現低下が認められた。この結果は、IGF−IRによるCAV1の発現制御は異なる肺腺癌細胞株においても観察されることが分かり、ROR1以外の因子であるIGF−IRによってもCAV1の発現低下を誘導することが明らかとなった。
<肺腺癌細胞株でのCavin−1とIGF−IRの結合>
上記(3)の手順によりIP−WB分析を行ったところ、図8に示すように、肺腺癌細胞株であるNCI−H1975において、内因性のCavin−1とIGF−IRが共沈降したことから両者は結合することが明らかとなった。この結果から、Cavin−1はROR1以外にもIGF−IRとも結合することが分かり、またROR1の発現抑制と同様にIGF−IRの発現抑制によってもCAV1の発現低下が認められたことから、ROR1とCavin−1の結合の重要性と同様に、IGF−IRとCavin−1の重要性についても考察できる。
<Cavin−1によるROR1の結合領域の特定と、細胞内での両者の結合を阻害するための阻害剤スクリーニングのためのCavin−1およびROR1の結合の検出>
[実施例4]の結果から、肺腺癌細胞株においてROR1とCavin−1の結合を確認した。次に、Cavin−1が結合するROR1の結合部位の同定を行うために、上記(3)の手順により、図9(1)に示す模式図のように、様々なROR1のキナーゼドメインの欠損変異体を作製し、各々のROR1のキナーゼドメインの欠損変異体およびCavin−1を発現させて、IP−WB分析により、Cavin−1との結合およびCavin−1によるROR1の結合部位の同定を行った。図9(2)は、IP−WB分析の写真である。図9(2)の写真より、ROR1のキナーゼドメイン内の564アミノ酸から746アミノ酸の領域でCavin−1と結合していることが判明した。これらの結果は、ROR1がCavin−1に特異的に結合していることを示しており、ROR1のキナーゼドメイン内の一部の領域(564アミノ酸から746アミノ酸の領域)とCavin−1との結合が、CAV1の発現の安定化、さらには正常なカベオラの形成、カベオラによる種々のRTKの活性化に重要な働きを担っている可能性が考えられる。
<CAV1によるROR1の結合領域の特定>
実施例9において、Cavin−1によるROR1の結合領域が特定できたことから、次に、CAV1によるROR1の結合部位の同定を行うために、上記(3)の手順により、図10(1)に示す模式図のように、様々なROR1の欠損変異体を作製し、各々のROR1の欠損変異体およびCAV1を発現させて、IP−WB分析により、CAV1との結合およびCAV1によるROR1の結合部位の同定を行った。図10(2)は、IP−WB分析の写真である。図10(2)の写真より、ROR1の細胞内領域の853アミノ酸から876アミノ酸の領域(セリン・スレオニンリッチドメイン)でCAV1と結合していることが判明した。これらの結果は、ROR1がCAV1に特異的に結合していることを示しており、ROR1の細胞内領域の一部(853アミノ酸から876アミノ酸の領域)とCAV1との結合が、ROR1とCavin−1との結合と同様に、CAV1の発現の安定化、さらには正常なカベオラの形成、カベオラによる種々のRTKの活性化に重要な働きを担っている可能性が考えられる。細胞内においてタンパク質とタンパク質の結合を簡便かつ容易に検出できる、阻害剤のスクリーニングのための結合検出系の構築は、実施例9と同様の手順で作製すればよい。
<CAV1発現制御におけるROR1のcavin−1結合領域の重要性の検討>
実施例9に示すとおり、cavin−1はROR1の細胞内領域のキナーゼドメイン内の564〜746アミノ酸領域(TK2+TK3)と結合する。このROR1とcavin−1の結合領域がCAV1の発現制御に関与しているかを確認するために、上記(8)の手順により、ROR1のcavin−1が結合する領域を欠損させた変異体に、siROR1の効果をキャンセルさせる変異を加えた変異体を作製し、細胞に発現させ、siROR1処理を行った。図11はウェスタンブロッティングによって分析した結果を示す写真である。図11に示すように、ROR1−TKΔ2+TKΔ3mをトランスフェクションした細胞では、ROR1は発現しているものの、CAV1の発現が低下したことを確認した。 以上の結果から、cavin−1が結合するROR1の領域(564〜746アミノ酸領域)がCAV1の発現安定化に必須であることが分かった。またこの結果は、ROR1とcavin−1のこの領域の結合を阻害するスクリーニング系の重要性を示唆するものであり、この結合を阻害する阻害剤の候補は、CAV1の発現の低下、すなわち癌特異的なカベオラ形成の阻害を引き起こすことが推測できる。
実施例10に示すとおり、CAV1はROR1の細胞内領域のセリン・スレオニンリッチドメインである853〜876アミノ酸領域(S/T2)と結合する。このROR1とCAV1の結合領域がCAV1の発現制御に関与しているかを確認するために、上記(9)の手順により、ROR1のCAV1が結合する領域を欠損させた変異体に、siROR1の効果をキャンセルさせる変異を加えた変異体を作製し、細胞に発現させ、siROR1処理を行った。図12はウェスタンブロッティングによって分析した結果を示す写真である。図12に示すように、ROR1−ΔS/T2mをトランスフェクションした細胞では、ROR1は発現しているものの、CAV1の発現が低下したことを確認した。
以上の結果から、CAV1が結合するROR1の領域(853〜876アミノ酸領域)がcavin−1の結合領域と同様に、CAV1の発現安定化に必須であることが分かった。またこの結果は、ROR1とCAV1のこの領域の結合を阻害するスクリーニング系の重要性を示唆するものであり、この結合を阻害する阻害剤の候補は、CAV1の発現の低下、すなわち癌特異的なカベオラ形成の阻害を引き起こすことが推測できる。
<リガンド刺激下でのEGFR−TKI耐性細胞株でのROR1の発現抑制による細胞増殖への効果と生存シグナルへの影響についての検討>
上記(13)に示す手順で、様々なリガンド存在下でのEGFR−TKI耐性を獲得した細胞株におけるROR1の発現抑制による細胞増殖への効果と生存シグナルへの影響を、ウェスタンブロッティングおよびMTT assayにより評価した。
なお、今回用いた細胞株は、臨床上問題視されている細胞株であり、外陰部扁平上皮癌細胞と肺腺癌細胞である。これらの細胞株はEGFR−TKIと呼ばれるEGFR阻害剤に効果が認められる細胞株であるが、IGF−IやHGFなどのリガンド存在下ではEGFR−TKIの効果がキャンセルされてしまう。例えば、外陰部扁平上皮癌細胞であるA431細胞はGefitinibに感受性を示すが、IGF−I存在下では耐性を示す。また、肺腺癌細胞であるPC−9細胞はGefitinibに感受性を示すが、HGF存在下では耐性を示す。さらに、肺腺癌細胞であるNCI−H1975細胞はGefitinibに耐性を示す細胞株であるが(EGFRの二重変異T790Mを有しているため、効果が見られない)、しかしながら、近年、次世代型のEGFR−TKIが開発され、irreversibleなEGFR−TKIとしてCL−387,785が誕生し、感受性を示すようになり、臨床で使用されるようになった。しかし、さらに現在問題になっているのは、このCL−387,785とHGF存在下では耐性を示すことである。これらの細胞株での耐性の理由は、IGF−IやHGFによってIGF−IRやMETなどのEGFRとは異なる他のRTK(受容体型チロシンキナーゼ)が活性化してしまうためである(バイパス経路)。
図13(1)下図は、外陰部扁平上皮癌細胞株としてA431を用いた際のIGF−IおよびGefitinib存在下でのMTT assayの結果を表すグラフで、ROR1の発現抑制により細胞増殖の低下を確認した。また、図13(1)上図は、A431を用いた際のウェスタンブロッティング写真で、ROR1の発現抑制により、生存シグナルに関与するAKTとIGF−IRのリン酸化の低下を確認した。
図13(2)下図は、肺腺癌細胞株としてPC−9を用いた際のHGFおよびGefitinib存在下でのMTT assayの結果を表すグラフで、ROR1の発現抑制により細胞増殖の低下を確認した。また、図13(2)上図は、PC−9を用いた際のウェスタンブロッティング写真で、ROR1の発現抑制により、生存シグナルに関与するAKTとMETのリン酸化の低下を確認した。
図13(3)下図は、肺腺癌細胞株としてNCI−H1975を用いた際のHGFおよびCL−387,785存在下でのMTT assayの結果を表すグラフで、ROR1の発現抑制により細胞増殖の低下を確認した。また、図13(3)上図は、NCI−H1975を用いた際のウェスタンブロッティング写真で、生存シグナルに関与するAKTとMETのリン酸化の低下を確認した。
図13(1)〜(3)に示すように、様々なリガンド存在下でのEGFR−TKI耐性を獲得した細胞株においても、ROR1の発現抑制は生存シグナルの低下(AKTのリン酸化の低下)を引き起こし、増殖低下を引き起こすことが判明した(同様にcavin−1やCAV1の発現抑制においても増殖低下を確認した)。つまり、ROR1の発現抑制によって、IGF−IRやMETのリン酸化反応の低下がウェスタンブロッティングによって認められたことから、ROR1の発現抑制は癌特異的にカベオラの形成を阻害するので、カベオラに存在しているRTKの活性化が抑制されることを示している。この結果は、実際にこのような薬剤耐性を持つ患者に対しても臨床的に効果を示す可能性を示唆するものである。
Claims (7)
- 癌細胞のカベオラの形成を特異的に抑制する化合物のスクリーニング方法であって、
前記スクリーニング方法が、
ROR1とCavin−1との結合の抑制を検出できる系、IGF−IRとCavin−1との結合の抑制を検出できる系、ROR1とCAV1との結合の抑制を検出できる系、又は、IGF−IRの発現抑制によりCAV1の発現低下を検出できる系に試験化合物を接触させる工程、
ROR1とCavin−1との結合を抑制、IGF−IRとCavin−1との結合を抑制、ROR1とCAV1との結合を抑制、又は、IGF−IRの発現抑制によりCAV1の発現を低下する活性を有する化合物を選択する工程、
を含むことを特徴とするスクリーニング方法。 - ヒトROR1の細胞内領域のアミノ酸配列428〜937番の内、少なくとも564〜746番のアミノ酸領域を含むアミノ酸配列をコードする核酸を挿入した組み換えベクター、及び、
ヒトCavin−1のアミノ酸配列をコードする核酸を挿入した組み換えベクター、
を導入した形質転換体。 - 請求項2に記載の形質転換体を含む、ROR1とCavin−1の結合を抑制する化合物のスクリーニングキット。
- ヒトROR1の細胞内領域のアミノ酸配列428〜937番の内、少なくとも853〜876番のアミノ酸領域を含むアミノ酸配列をコードする核酸を挿入した組み換えベクター、及び、
ヒトCAV1のアミノ酸配列をコードする核酸を挿入した組み換えベクター、
を導入した形質転換体。 - 請求項4に記載の形質転換体を含む、ROR1とCAV1の結合を抑制する化合物のスクリーニングキット。
- ヒトROR1の細胞内領域のアミノ酸配列428〜937番の内、564〜746番のアミノ酸領域を含むアミノ酸配列をコードする核酸及び853〜876番のアミノ酸領域を含むアミノ酸配列をコードする核酸、を少なくとも挿入した組み換えベクター、
ヒトCavin−1のアミノ酸配列をコードする核酸を挿入した組み換えベクター、及び、
ヒトCAV1のアミノ酸配列をコードする核酸を挿入した組み換えベクター、
を導入した形質転換体。 - 請求項6に記載の形質転換体を含む、ROR1とCavin−1の結合を抑制する化合物及び/又はROR1とCAV1の結合を抑制する化合物のスクリーニングキット。
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