CN114617878A - Ck2抑制剂在制备抗衰药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本申请属于生物医药技术领域，尤其涉及一种CK2抑制剂在制备抗衰药物中的应用，CK2可磷酸化多种蛋白质底物，从而调节DDR（DNA损伤应答）、昼夜节律、细胞存活、衰老和凋亡，采用CK2抑制剂用于制备抗衰药物，能够导致DDR障碍并诱导早衰细胞凋亡，突破了现有技术中只有表达高水平p16Ink4a的“晚期衰老”细胞才能被杀死的限制，为制备抗衰药物提供了新的途径和方式。

Description

CK2抑制剂在制备抗衰药物中的应用

技术领域

本申请属于生物医药技术领域，尤其涉及一种CK2抑制剂在制备抗衰药物中的应用。

背景技术

衰老是许多慢性疾病的主要危险因素，如心血管疾病、退行性疾病和癌症。这些慢性病大多不单独存在于老年人中，从而使针对特定疾病的临床治疗策略变得困难。因此，干预衰老过程的方法和药物提供了一种延缓慢性疾病发作的替代疗法，从而延长健康寿命。细胞衰老是一个有利于防止受损细胞增殖的过程，从而保护细胞免于癌变并维持组织稳态(Krizhanovsky et al., 2008)。衰老也是胚胎发育过程中组织重塑和响应组织损伤的重要触发因素，它可以招募免疫细胞以促进组织再生。然而，衰老细胞的积累随着年龄的增长而增加，这导致普遍的组织损伤和衰老细胞清除不足，从而扰乱了组织的稳态。机体各组织中衰老细胞的增加是导致衰老和与年龄相关的疾病的主要因素 (Franckhauser et al.,2008; Starr et al., 2009)。在 INK-ATTAC 和 p16-3MR 转基因小鼠模型中，清除衰老细胞作为一种治疗衰老的策略首先在杀死 p16Ink4a 高表达的细胞中得到了验证，在早衰和自然衰老小鼠中具有改善组织器官功能障碍和延长寿命 (Baker et al., 2011; Bakeret al., 2016)，这开辟了一条抗衰老的新途径，但只有表达高水平 p16Ink4a 的“晚期衰老”细胞才能被杀死，从而限制了在人类中的应用和可行性。

发明内容

本申请的目的在于提供CK2抑制剂的新用途，同时也提供了新的抗衰类药物。

为实现上述申请目的，本申请采用的技术方案如下：

本申请第一方面提供CK2抑制剂在制备抗衰药物中的应用。

进一步地，CK2抑制剂包括TBB和/或CX4945。

进一步地，TBB靶向 DDR 通路。

进一步地，TBB抑制 CK2 对 HP1α 的磷酸化活性的通路。

进一步地，抗衰药物包括用于延缓衰老过程的药物。

进一步地，抗衰药物包括用于治疗早衰症的药物。

进一步地，抗衰药物中TBB的含量为10-100μmol/L。

进一步地，抗衰药物为片剂、胶囊剂和注射剂中的一种。

进一步地，抗衰药物还包括药学上可接受的辅料和/或药用载体。

本申请第二方面提供TBB作为靶向CK2抑制剂的应用。

本申请第一方面提供CK2抑制剂在制备抗衰药物中的应用，CK2可磷酸化多种蛋白质底物，从而调节 DDR（DNA损伤应答）、昼夜节律、细胞存活、衰老和凋亡，采用CK2抑制剂用于制备抗衰药物，能够导致DDR障碍并诱导早衰细胞凋亡，突破了现有技术中只有表达高水平 p16Ink4a 的“晚期衰老”细胞才能被杀死的限制，为制备抗衰药物提供了新的途径和方式。

本申请实施例第二方面提供TBB作为靶向CK2抑制剂的应用，TBB对其他已知蛋白质的亲和力非常低，能特异性抑制CK2磷酸化 HP1α，可诱导多种癌细胞凋亡，是一种有效的肿瘤化疗药物。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1~图4是本申请实施例提供的在 Zmpste24 缺陷型 MEF 中筛选DDR激酶抑制剂的示意图，其中，

图1为DDR激酶抑制剂化合物库的分类图；

图2为DDR激酶抑制剂的初级筛选图；

图3为SA-β-Gal活性检测图；

图4为定量分析 SA-β-Gal 阳性染色细胞比例图；

图5~图10是本申请实施例提供的TBB 通过加速 Zmpste24 缺陷型 MEF 中衰老细胞的凋亡来改善衰老表型的说明示意图，其中，

图5为MTS 测定法检测细胞活力示意图；

图6为Zmpste24^-/- MEF 和 WT 对照细胞检测细胞增殖示意图；

图7为SA-β-Gal 检测 Zmpste24^-/- MEFs 和 WT 对照中衰老细胞比例示意图；

图8为WB检测procaspase-3 (Procasp-3)、切割的 caspase-3 (cCasp-3)、P16 的蛋白表达量示意图；

图9为通过C₁₂FDG、 AnnexinV/7-AAD 染色检测TBB 处理的Zmpste24^-/- MEF 细胞的衰老和凋亡细胞比例示意图；

图10为Zmpste24^-/- MEF 细胞的衰老和凋亡细胞的流式细胞仪数据的统计学分析图；

图11~图15是本申请实施例提供的 TBB 通过加剧DNA 损伤的积累诱导 Zmpste24缺陷细胞凋亡的说明示意图，其中，

图11为TBB处理对 Zmpste24^-/- MEFs和WT 对照细胞凋亡的影响示意图；

图12为统计分析细胞凋亡百分比示意图；

图13为γH2AX 蛋白质表达水平示意图；

图14为彗星实验检测DNA损伤的程度示意图；

图15为DNA损伤的量的统计学分析图；

图16~图20是本申请实施例提供的TBB 通过抑制 CK2 诱导 Zmpste24 缺陷细胞凋亡的说明示意图，其中，

图16为衰老细胞检测示意图；

图17为不同蛋白表达水平示意图；

图18为细胞凋亡变化示意图；

图19为统计学分析活细胞和凋亡细胞的百分比示意图；

图20为免疫印迹检测 γH2AX 蛋白水平示意图；

图21~图26是本申请实施例提供的CK2 磷酸化 HP1α 促进 DNA 损伤情况下的染色质重塑的说明示意图，其中，

图21为免疫印迹检测 p-S/T Q的磷酸化水平示意图；

图22为免疫印迹检测 γH2AX 蛋白水平示意图；

图23为免疫沉淀检测在表达 FLAG-HP1α 的 HEK293 细胞中H3K9me3 蛋白的表达示意图；

图24为免疫沉淀检测H3K9me3 和各种 FLAG-HP1α 突变体之间的结合能力示意图；

图25为免疫印迹检测在 HEK293 细胞中转染的 FLAG-HP1α 和 T50A 或 T50D 突变体中 ATM-Ser1981、KAP1-Ser824 和 γH2AX 的蛋白质水平示意图；

图26为TBB 处理的 Zmpste24^–/– MEF在CPT处理后 0、1、2、4 小时处理示意图；

图27~图32是本申请实施例提供的TBB 治疗可改善 Zmpste24 缺陷小鼠的早衰特征并延长寿命的说明示意图，其中，

图27为Zmpste24^+/+、Zmpste24^−/−和 TBB 喂养的 Zmpste24^−/−小鼠在 4 个月大时的图像；

图28为使用 Kaplan-Meier 分析TBB 喂养的 Zmpste24^-/-小鼠 (n = 28) 与对照喂养组 (n = 25) 的小鼠存活率示意图；

图29为将 TBB 喂养的 Zmpste24^-/- 小鼠 (n= 28) 与载体对照或 WT 小鼠 (n=25, n=22 ) 的体重曲线示意图；

图30为Micro-CT 分析 TBB 喂养的 Zmpste24^-/-小鼠及对照小鼠的骨小梁体积/组织体积 (BV/TV)、骨小梁数量和骨小梁孔隙率示意图；

图31为 TBB 喂养的 Zmpste24^-/- 小鼠及其对照小鼠的肾脏和脾脏组织中的衰老细胞的SA-β-gal 检测示意图；

图32为免疫印迹检测 TBB 喂养的 Zmpste24^-/-及其对照小鼠的不同组织中的p16、p21 和 Bcl2 蛋白水平示意图。

具体实施方式

为了使本申请要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本申请进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本申请，并不用于限定本申请。

本申请中，术语“和/或”，描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，A和/或B，可以表示：单独存在A，同时存在A和B，单独存在B的情况。其中A，B可以是单数或者复数。字符“/”一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。

本申请中，“至少一个”是指一个或者多个，“多个”是指两个或两个以上。“以下至少一项(个)”或其类似表达，是指的这些项中的任意组合，包括单项（个）或复数项（个）的任意组合。例如，“a，b或c中的至少一项（个）”，或，“a，b和c中的至少一项（个）”，均可以表示：a，b，c，a-b（即a和b），a-c，b-c，或a-b-c，其中a，b，c分别可以是单个，也可以是多个。

应理解，在本申请的各种实施例中，上述各过程的序号的大小并不意味着执行顺序的先后，部分或全部步骤可以并行执行或先后执行，各过程的执行顺序应以其功能和内在逻辑确定，而不应对本申请实施例的实施过程构成任何限定。

在本申请实施例中使用的术语是仅仅出于描述特定实施例的目的，而非旨在限制本申请。在本申请实施例和所附权利要求书中所使用的单数形式的“一种”和“该”也旨在包括多数形式，除非上下文清楚地表示其他含义。

本申请实施例说明书中所提到的相关成分的重量不仅仅可以指代各组分的具体含量，也可以表示各组分间重量的比例关系，因此，只要是按照本申请实施例说明书相关组分的含量按比例放大或缩小均在本申请实施例说明书公开的范围之内。具体地，本申请实施例说明书中所述的质量可以是µg、mg、g、kg等化工领域公知的质量单位。

术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，用来将目的如物质彼此区分开，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。例如，在不脱离本申请实施例范围的情况下，第一XX也可以被称为第二XX，类似地，第二XX也可以被称为第一XX。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。

化学疗法、电离辐射、代谢物和复制压力不断导致细胞出现DNA 损伤，如果修复不当，可能导致体细胞突变，从而导致细胞癌变；如果损失累积，可导致 DNA 损伤反应 (DDR)不断激活并导致细胞衰老。本申请实施例第一方面提供一种CK2抑制剂在制备抗衰药物中的应用。本申请发明人研究发现CK2可磷酸化多种蛋白质底物，从而调节 DDR（DNA损伤应答）、昼夜节律、细胞存活、衰老和凋亡，抑制CK2可使DNA损伤应答（DDR）通路中早期事件-异染色质重塑障碍，导致损伤应答因子γH2AX不能很好的聚集在损伤位点，从而导致衰老细胞走向凋亡，采用CK2抑制剂用于制备抗衰药物，能够导致DDR障碍并诱导早衰细胞凋亡，突破了现有技术中只有表达高水平 p16Ink4a 的“晚期衰老”细胞才能被杀死，为制备抗衰药物提供了新的路径。

在本申请的实施例中，CK2抑制剂包括TBB(4,5,6,7-四溴-1H-苯并三唑)和/或CX4945，TBB和CX4945是 CK2 的特异性抑制剂。如TBB可导致早衰细胞中DDR 初始阶段H3K9me3-HP1α 介导的异染色质重塑障碍，并进一步抑制了 γ-H2AX 的形成，从而导致Bcl-2的抑制和细胞凋亡的激活。TBB 喂养的早衰小鼠减轻了早衰表型并显著延长小鼠寿命。综上，我们的研究表明 TBB 可清除缺乏 DDR 的衰老细胞来缓解细胞早衰表型，是一种新型的有效的抗衰老药物。

在本申请进一步地实施例中，TBB为抗衰效果更好的CK2抑制剂。如图3所示，采用SA-β-Gal 染色测定确认药物处理对细胞活力的影响，结果如图4所示，其中4种药物中发现衰老细胞与非衰老细胞的比例显著降低，即槲皮素、Ku60019、CX-4945 和 TBB，其中，TBB使 SA-β-Gal 染色的衰老细胞比例减少了 50% 以上，比槲皮素更有效。

在本申请进一步地实施例中，TBB特异性诱导早衰细胞凋亡，从而改善细胞衰老表型。CK2的轻度缺陷或抑制会导致衰老，而CK2的进一步恶化或严重抑制会导致细胞走向凋亡。如图8所示，随着TBB剂量的增加，细胞凋亡蛋白caspase 3的增加和衰老标志物 p16 水平的降低，表明 TBB可诱导早衰细胞的凋亡，从而改善细胞衰老表型，进一步地，如图9所示，TBB处理后，C₁₂FDG阳性细胞比例从29.5%下降到10.8%，而Annexin V和7-AAD阳性细胞比例从11.83%上升到28.1%，双阴性细胞略有下降Zmpste24^-/- MEFs 中从 71.7% 到 60.3%。相比之下，75 μmol TBB 处理的 WT 细胞中 C₁₂FDG 和 Annexin V 阳性染色的差异很小。经过统计分析，图10表明在Zmpste24^-/- MEFs 中衰老细胞比例降低和凋亡细胞比例升高的比例是相反的，说明TBB 可以选择性地触发衰老细胞的凋亡。

在本申请的实施例中，TBB靶向 DDR 通路。如图14 和图15所示，TBB 处理后增加了衰老细胞的 DNA损伤程度，而在野生型细胞中没有明显差异，表明 TBB 导致 DDR 和DNA 修复障碍，从而杀死衰老细胞。

在本申请的实施例中，TBB 通过抑制 CK2 对 HP1α 的磷酸化活性以响应 DNA 损伤，进而诱导衰老细胞凋亡。CK2 磷酸化 HP1α的 T50 位点，通过形成 HP1α-H3K9me3 复合物将 HP1α 动态募集到 DSB位点。DNA 损伤诱导的 HP1α 的磷酸化是协调大多数下游染色质相关事件的一个重要条件，例如 γH2AX 病灶的形成。CK2 对异染色质 HP1α-H3K9me3直接调节，HP1α T50位点的突变抑制了 ATM-KAP1 磷酸化和 γH2AX 形成，表明 CK2 调节pT50-HP1α，协调 ATM 以促进 DDR 期间异染色质 γH2AX 的形成，而TBB 不仅减少了pT50-HP1α/γH2AX 病灶的形成，而且在 DDR 失活后导致 pT50-HP1α 和 γH2AX 的错误定位。

在本申请的实施例中，抗衰药物包括用于延缓衰老过程的药物，进一步地，抗衰药物可用于治疗早衰症。抗衰药物还包括药学上可接受的辅料和/或药用载体，在本申请进一步的实施例中，抗衰药物中TBB的含量为10-100 μmol/L，此含量范围的TBB能促进衰老细胞凋亡，且不影响正常细胞的生命进程，从而有效延长早老小鼠寿命。需要说明的是，TBB含量过低，促进衰老细胞凋亡的数量少，抗衰效果较差，TBB含量过高，会加速一部分正常细胞的凋亡，影响抗衰效果。在本申请进一步的实施例中，抗衰药物为片剂、胶囊剂和注射剂中的一种如图31和图32所示，TBB治疗组Zmpste24-/- 小鼠的肾脏和脾脏中SA-β-gal阳性细胞数量显著减少，以及p16和p21水平显著降低，而抗凋亡蛋白Bcl-2的表达降低，说明TBB 可以通过促进细胞凋亡减轻 Zmpste24 缺陷小鼠的早衰特征并延长寿命。

本申请实施例第二方面提供TBB作为靶向CK2抑制剂的应用，TBB对其他已知蛋白质的亲和力非常低，能特异性抑制CK2磷酸化 HP1α，可诱导多种癌细胞凋亡，是一种有效的肿瘤化疗药物。

为使本申请上述实施细节和操作能清楚地被本领域技术人员理解，以及本申请实施例CK2抑制剂在制备抗衰药物中的应用的进步性能显著的体现，以下通过多个实施例来举例说明上述技术方案。

实施例1：筛选靶向 DDR 相关激酶的抗衰老药物

如图1~图4所示，为了识别 DDR 相关细胞命运决定通路中的抗衰老化合物，利用Zmpste24^-/- MEFs ——一种经典的早衰细胞模型，筛选了 DDR 相关激酶抑制剂的小分子化合物库，其中包含 80 种药物，涵盖了25 种细胞信号通路。化合物种类如图1所示，采用10 μM 浓度下进行初步筛选，通过分析荧光衰老相关的β-半乳糖苷酶活性（SA-β-Gal）。药物处理早老细胞两天后，将衰老细胞数与总细胞数作比较，发现大多数药物增加了衰老细胞数量，具有潜在的促细胞衰老功能，但其中 11 种药物可显著降低衰老细胞比例至 70%以下，表明具有潜在的抗衰老作用，在这 11 种药物中，其中6种药物未显著改变细胞总数，另 5 种药物可显著减少衰老细胞数和总细胞数，因此被认为具有Senolytics抗衰老潜力。为了验证初步筛选的结果，11种药物在10 μM 浓度下再次测试，结果表明这些药物都减少了细胞衰老表型，但只有 5 种具有Senolytics的潜力（图2）。进一步进行 SA-β-Gal 染色测定以确认药物处理对细胞活力的影响（图3）。其中4种药物中发现衰老细胞与非衰老细胞的比例显著降低，即槲皮素、Ku60019、CX-4945 和 TBB（图4），TBB 使 SA-β-Gal 染色的衰老细胞比例减少了50% 以上，比槲皮素更有效。

其中，（图1）DDR相关激酶抑制剂化合物库的分类图；

(图2) 从80 种 DDR相关激酶抑制剂中筛选出的11种抗衰药物的抗衰效果图，统计衰老细胞数量/细胞总数量的比例，所有药物均以 10 μM 进行统计分析，*p < 0.05；

(图3) SA-β-Gal活性检测，比例尺，50 μm；

(图4) 从每组随机选择的 10 个视野中定量分析 SA-β-Gal 阳性染色细胞比例，means ± SEM. *P < 0.05。

实施例2：TBB可诱导 Zmpste24 缺陷型 MEF细胞中衰老细胞的凋亡

如图5~图10所示，在野生型 (WT) 和 Zmpste24 缺陷型 MEF（第5代）细胞中，利用0-1000 μM TBB 处理24 小时，MTT测定的药物毒性和细胞存活率，结果表明，在WT MEF 细胞中的 IC50 约为1000 μmol/L，而 Zmpste24 缺陷型 MEF细胞中的 IC50 显著降低至100 μmol/L（图5），这意味着 TBB 在诱导衰老细胞中的细胞死亡方面更有效。尽管在 75 μmol/L TBB 处理的 Zmpste24^-/- MEFs 中发现细胞生长迟缓（图6），但细胞表现比对照细胞更加年轻（图7，TBB 组 SA-β-Gal 阳性细胞比例为20.4%，对照组为 45.4%）。同时，在WT细胞中SA-β-Gal阳性细胞的百分比没有观察到明显变化。我们推断 TBB 可优先触发衰老细胞的凋亡。为了验证这一假设，我们使用不同浓度的 TBB 来处理 Zmpste24 缺陷型 MEF，并检测这些细胞的凋亡水平。观察到随着TBB剂量的增加，细胞凋亡蛋白caspase 3的增加和衰老标志物 p16 水平的降低（图8），表明 TBB可诱导早衰细胞的凋亡，从而改善细胞衰老表型。为了确定 TBB是否优先触发衰老细胞的凋亡，利用 TBB 处理的 Zmpste24^-/- MEF，C12FDG 标记衰老细胞， Annexin V标记早期凋亡细胞，7-氨基放线菌素 D (7-AAD) 标记晚期凋亡细胞，最后用流式细胞仪进行分析。结果显示，TBB处理后，C12FDG阳性细胞比例从29.5%下降到10.8%，而Annexin V和7-AAD阳性细胞比例从11.83%上升到28.1%，双阴性细胞略有下降Zmpste24^-/- MEFs 中从71.7% 到60.3%（图9）。相比之下，75 μmol TBB 处理的 WT细胞中 C12FDG 和 Annexin V 阳性染色的差异很小。经过统计分析表明在Zmpste24^-/-MEFs 中衰老细胞比例降低和凋亡细胞比例升高的比例是相反的（图10）。以上研究结果表明，TBB 可以选择性地触发衰老细胞的凋亡。

其中，(图5) MEF 细胞用TBB 处理 72 小时，MTS 测定法检测细胞活力；

(图6) 用 75 μM TBB 或对照 (DMSO; Ctr) 处理Zmpste24^-/- MEF 和 WT 对照细胞检测细胞增殖，n=3；

(图7) SA-β-Gal 检测 Zmpste24^-/- MEFs 和 WT 对照中衰老细胞比例，在第 6代用 75 μM TBB 或 DMSO（对照）处理，比例尺，100 μm；

(图8)TBB 处理Zmpste24 缺陷细胞，WB检测procaspase-3 (Procasp-3)、切割的caspase-3 (cCasp-3)、P16 的蛋白表达量；

(图9) 流式细胞术分析，通过 AnnexinV/7-AAD 染色检测TBB 处理的Zmpste24^-/- MEF 细胞的衰老和凋亡细胞比例，其中衰老的细胞（C12FDG+；顶部），非衰老的细胞（C12FDG-，底部），活细胞对 7-AAD 和 AnnexinV（左下象限）呈双阴性，早期凋亡细胞对 Annexin V（右下象限）呈阳性，晚期凋亡细胞对 AnnexinV 和 7-AAD（左上象限）呈阳性，死细胞仅对 7-AAD 呈阳性（右下象限）；

(图10) 流式细胞仪数据的统计学分析。通过汇总所有 AnnexinV 阳性细胞计算衰老和非衰老细胞的凋亡。n = 3 ，* p <0.05 。

实施例3：TBB 加剧了 Zmpste24 缺陷细胞中 DNA 损伤的积累

如图11~图15所示，将第6代衰老 Zmpste24^-/- MEF细胞用 TBB 预处理24 h，然后用一种典型的诱导 DNA 断裂的化学试剂喜树碱 (CPT) 处理 1 小时，然后用Annexin V染色，用流式细胞仪分析。如图所示，单独的 CPT 处理导致 Zmpste24-/- MEFs 中 AnnexinV 阳性细胞的百分比增加（23.4%），当用 TBB 预处理时，Annexin V 阳性细胞的百分比进一步增加到 50.6%（图11 和图12 中，p = 0.0008)。这些结果表明，在 Zmpste24 缺陷型MEF 中存在 DNA 损伤时，TBB 会加速细胞凋亡。蛋白印迹显示TBB仅影响Zmpste24^-/- MEF中的 γ-H2AX 水平显著降低，相比之下，WT细胞中无明显差异（图13）。为了探讨 γ-H2AX的减少是由于凋亡细胞的去除还是在 TBB 存在的情况下增强了DNA损伤，利用彗星试验检测DNA 损伤的严重程度。结果表明，TBB 处理后增加了衰老细胞的 DNA损伤程度（图14和图15），而在野生型细胞中没有明显差异。这些研究结果表明 TBB 导致 DDR 和 DNA 修复障碍，从而杀死衰老细胞。

（图11）流式细胞技术分析在DNA损伤情况下，TBB处理对 Zmpste24^-/- MEFs和WT对照细胞凋亡的影响，活细胞（门 II：PI-annexin V-）和凋亡（门 III 和 IV：PI-annexinV+ 和 PI+annexin V+）（右），用 4 μM 喜树碱 (CPT) 处理 1 小时诱导 DNA 损伤，DMSO(Ve) 对照和75 μM TBB 处理 24 小时；

(图12) 统计分析细胞凋亡百分比；

(图13) 免疫印迹检测4 μM 喜树碱 (CPT) 处理 1 小时后 γH2AX 蛋白质表达水平， DMSO (Ve) 对照或75 μM TBB 处理24 小时；

(图14) 用 75 μM TBB 预处理6小时的 Zmpste24^–/– MEF 中，4 μM 喜树碱 (CPT)处理 1 小时后诱导 DNA 损伤，彗星实验检测DNA损伤的程度；

(图15) 统计学分析DNA损伤的量，由软件 Open Comet 计算。数据代表平均值 ±s.e.m.，**p<0.01，n = 40。

实施例4：CK2被抑制导致DDR障碍并诱导细胞凋亡

如图16~图20所示，制备 CK2α siRNA，转染 WT 和 Zmpste24 ^-/- MEF细胞。SA-β-gal 染色显示，在Zmpste24 ^-/- MEF细胞中，CK2α 降低使衰老细胞百分比从 50.4% 降低到20.4%（图16），并且CK2α 的降低增加了 Zmpste24 缺陷细胞中凋亡蛋白caspase 3表达水平并降低了 p16 的水平（图17）。流式细胞术分析表明，敲除CK2α显著诱导Zmpste24^-/- MEFs中的细胞凋亡，凋亡细胞的百分比从20.32%增加到52.8%（图18和图19）。这与 TBB 处理类似，转染si-CK2α的细胞在 DNA 损伤时表现出 γ-H2AX 表达降低（图20）。并且，与对照相比，TBB 可以显著降低 Zmpste24^-/- MEFs 中的 SASP 基因的表达。这些研究结果表明在Zmpste24缺陷型细胞中CK2被抑制导致DDR障碍并诱导衰老细胞凋亡。

(图16) 利用CK2 siRNA 干扰 P6代 Zmpste24^-/- MEFs ，检测衰老相关 β-半乳糖苷酶（比例尺，200 μm）；

(图17) 免疫印迹检测 CK2 siRNA干扰处理的 Zmpste24^-/- MEF 和野生型对照中procaspase-3 (Procasp-3)、切割的 caspase-3 (cCasp-3) 和 P16 的蛋白表达水平；

(图18) 流式细胞技术检测CK2 siRNA干扰处理的 Zmpste24-/- MEF 和野生型对照中细胞凋亡的变化；

(图19) 统计学分析 (图18) 中活细胞（门 II：PI-/膜联蛋白 V-）和凋亡（门 III和 IV：PI-/膜联蛋白 V+ 和 PI+/膜联蛋白 V+）细胞的百分比。显示的数据代表来自三个独立实验的平均值 ± SD 值；

(图20) 在 Zmpste24^–/– MEF 和野生型对照中转染的 siRNA-CK2 和对照，用 75μM TBB 处理，4 μM 喜树碱 (CPT) 处理 1 小时后，免疫印迹检测 γH2AX 蛋白水平。

实施例5：CK2 磷酸化 HP1α 促进 DNA 损伤情况下的染色质重塑

在 HEK293 细胞中过表达CK2α-HA 和HP1α-FLAG及其对照，利用抗FLAG的琼脂糖磁珠免疫沉淀，蛋白质印迹显示，HP1α的磷酸化S / T（p-S / T）水平以CK2α-HA剂量依赖性方式明显增加（图21）。序列比对分析揭示了HP1α T50符合 CK2的磷酸化基序，该基序在不同物种中具有高度保守性。将T50位点突变为丙氨酸（A）减少了CK2过表达对HP1α的磷酸化的影响。因此，我们制备了 pT50-HP1α 的特异性磷酸化抗体。通过蛋白质印迹检测抗体特异性。结果表明，降低CK2α导致pT50-HP1α明显下调，同时Zmpste24缺陷型MEF中γH2AX水平降低（图22）。免疫共沉淀 (Co-IP) 实验证实在过表达 HP1α-FLAG 的 HEK293 细胞中，HP1α 和 H3K9me3 的相互作用在 CPT 处理后减弱，并伴随着 pT50-HP1α 和 γH2AX 水平的增加（图23）。此外，HP1α 和 H3K9me3 的相互作用受到HP1α 突变体的持续失活（T50A）和组成型激活（T50D）减弱（图24），证实了T50位点对 HP1α与H3K9me3 相互作用至关重要。如图24所示，HP1α T50A 和 T50D 都会导致 HP1α 和 H3K9me3 之间的相互作用减弱，表明 HP1α T50 在 DDR 期间对 H3K9me3 的解离至关重要，同时，T50A 和 T50D 突变体均引起pS1981-ATM 和 pS824-KAP-1 的下调（图25），这两个蛋白是异染色质重塑的关键调节因子。这些研究结果表明 CK2 介导的 HP1α T50 磷酸化对于 DDR 的启动非常重要。此外，在Zmpste24^-/- MEFs 中检测了 TBB 处理后的 pT50-HP1α 和 γH2AX foci的共定位情况，免疫荧光染色结果显示 TBB 处理后，抑制了pT50-HP1α 和 γH2AX 的foci形成及其共定位（图26 ），TBB 处理导致 Zmpste24^-/- MEF 中 DNA 损伤部位 HP1α 和 γH2AX foci形成受损，但在 WT 细胞中他们的共定位几乎不受影响。综上，这些研究结果表明 CK2α 通过磷酸化HP1α的T50位点，促进其与H3K9me3 的结合和 DDR 信号转导，而 TBB 抑制了CK2，从而导致 Zmpste24^-/- MEF 中的 DNA 损伤积累，进一步导致衰老细胞凋亡。

（图21）在 CK2α 敲除 HKE293 细胞中转染 HA-CK2α 和 FLAG-HP1α 的 FLAG-HP1α ，使用抗 FLAG 抗体进行免疫沉淀反应，免疫印迹检测 p-S/T Q的磷酸化水平， CK2α 质粒的量为0.1、0.5、1μg；

(图22) 在 Zmpste24^–/–MEF 和野生型对照细胞中，用 75 μM TBB处理 siRNA-CK2及对照，4 μM 喜树碱 (CPT) 处理 1 小时后免疫印迹检测 γH2AX 蛋白水平，至少进行了三次独立的实验；

(图23) 免疫沉淀检测在表达 FLAG-HP1α 的 HEK293 细胞中H3K9me3 蛋白的表达，用 4 μM CPT 处理 1 小时；

(图24) 免疫沉淀检测H3K9me3 和各种 FLAG-HP1α 突变体之间的结合能力；

(图25) 免疫印迹检测在 HEK293 细胞中转染的 FLAG-HP1α 和 T50A 或 T50D突变体中 ATM-Ser1981、KAP1-Ser824 和 γH2AX 的蛋白质水平，用 4 μM 喜树碱 (CPT)或载体 (Ve) DMSO 处理细胞 1 小时，然后通过蛋白质印迹分析；

(图26) 免疫荧光激光共聚焦显微镜分析 γ-H2AX 和 pT50-HP1α 免疫灶募集，TBB 处理的 Zmpste24^–/–MEF ， CPT (4 μM) 诱导的 DNA 损伤，CPT处理后 0、1、2、4 小时后取样，比例尺，10 µm。

实施例6：TBB 治疗可改善 Zmpste24 缺陷小鼠的早衰特征并延长寿命

在本申请的一个具体实施例中，取Zmpste24^-/-小鼠及其 WT 同窝对照小鼠，将100 μmol/L TBB 添加到的小鼠饮用水中。从 1 月龄开始给药，一直持续到整个生命周期；定期监测小鼠的体重和寿命。结果显示，与不给药的对照组相比，TBB 治疗组显著延长了大约 6 周的早老小鼠的寿命（图27 和图28），在小鼠体重上没有观察到明显差异（图29）。微型计算机断层扫描 (CT) 分析结果表明， TBB 处理的 Zmpste24^-/-小鼠的骨小梁体积/组织体积比增加、骨小梁数量增加和骨小梁的孔隙率降低（图30）。值得注意的是，与对照相比，TBB治疗组Zmpste24^-/-小鼠的肾脏和脾脏中SA-β-gal阳性细胞数量显著减少，以及p16和p21水平显著降低，而抗凋亡蛋白Bcl-2的表达降低（图31和图32)。上述结果表明，TBB 通过促进细胞凋亡减轻 Zmpste24 缺陷小鼠的早衰特征并延长寿命。

(图27) Zmpste24^+/+、Zmpste24^−/−和 TBB 喂养的 Zmpste24^−/−小鼠在 4 个月大时的图像，将 TBB (100 μM/L) 或对照 DMSO 溶解在饮用水中；

(图28) 使用 Kaplan-Meier 分析TBB 喂养的 Zmpste24^-/-小鼠 (n = 28) 与对照喂养组 (n = 25) 的小鼠存活率；

(图29) 将 TBB 喂养的 Zmpste24^-/- 小鼠 (n= 28) 与载体对照或 WT 小鼠 (n=25, n=22 ) 绘制体重曲线进行比较，数据代表平均值±SEM， *P < 0.05；

(图30) Micro-CT 分析 TBB 喂养的 Zmpste24^-/- 小鼠及对照小鼠的骨小梁体积/组织体积 (BV/TV)、骨小梁数量和骨小梁孔隙率， **P < 0.01；

(图31) SA-β-gal 检测 TBB 喂养的 Zmpste24^-/-小鼠及其对照小鼠，肾脏和脾脏组织中的衰老细胞，比例尺，200 μm；

(图32)免疫印迹检测 TBB 喂养的 Zmpste24^-/-及其对照小鼠的不同组织中的p16、p21 和 Bcl2 蛋白水平。

实施例7：材料和方法

细胞培养

采用已报道的Zmpste24^-/-小鼠模型(Pendas et al., 2002)，即从13.5天大的怀孕雌性 Zmpste24^+/-小鼠（C57BL 背景）的胎儿中提取胚胎成纤维细胞MEF。细胞在含有 10%(vol/vol) FBS (Gibco) 和 1% 青霉素/链霉素的 DMEM/HIGH 葡萄糖培养基中，在 5%CO₂及一定湿度 37°C恒温培养箱中培养。

药物制备

所有药物均以10 mM DMSO 储备溶液制备成母液，包括DNA 损伤和激酶抑制剂库中的化合物。然后将它们在培养基中稀释以获得合适的工作溶液。阴性对照使用含有相同浓度DMSO的培养基。为避免反复冻融，将储备溶液等分并储存在-20°C保存。

senotherapeutics检测方法

将第6代的 MEF (5 × 103) 每孔接种在 96 孔板中，贴壁至少 6 小时后，添加药物后，将 MEF 细胞继续孵育 24 至 48 小时。对于 SA-β-Gal 活性的荧光分析，用 PBS洗涤细胞1次，将 C12FDG (10 µM) 添加到培养基中，并将细胞继续孵育2小时。分析前 10分钟，将细胞核Hoechst 染料 (2 µg/ml) 添加到细胞中。为了定量分析细胞数量和C12FDG 阳性、衰老细胞的数量，使用了基于激光共聚焦扫描成像仪 IN Cell Analyzer6000检测技术。使用 Acquisition 软件 v4.5 建立了采集协议，包括成像的板和孔、波长和曝光时间等参数。使用多目标分析模块对获取的图像进行分析。所有样品均重复分析，每孔 3-5 个区域，并相应计算平均值和标准偏差。

质粒构建和 siRNA

将 HP1α 全长基因亚克隆到 pcDNA3.1-3xFLAG 载体中。CK2α 从 HEK293 细胞的cDNA 文库中扩增并克隆到 pKH3-3xHA 载体中。使用定点突变试剂盒 (New EnglandBiolabs, USA) 构建产生 HP1α 点突变载体。根据制造商的说明，使用 Lipofectamine3000 (Invitrogen) 对这些质粒进行瞬时转染。针对 CK2 或模拟 siRNA 的小干扰 RNA(siRNA) 购自 Cell Signaling Technology (USA)，根据制造商的说明，使用Lipofectamine RNAiMAX 转染试剂（Invitrogen）进行转染。

蛋白质印迹分析

用改良的 RIPA 缓冲液（0.1 M Tris-HCl，pH 7.5）、0.25 M NaCl、1 mM EDTA、1mM DTT、苯甲磺酰氟和蛋白酶抑制剂混合物（Roche，Germany）分离总蛋白，用 BCA 蛋白测定试剂盒测量 (Invitrogen) 蛋白浓度，并通过 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，然后用各自的抗体进行蛋白质印迹。

免疫共沉淀试验

裂解缓冲液（250 mM NaCl、20 mM Tris-HCl [pH 8.0]、2 mM EDTA、10% 甘油和0.1% NP-40，加入不含 EDTA 的蛋白酶抑制剂 [Roche]）。然后将全细胞提取物与指定的抗体在 4°C 孵育过夜。次日用裂解缓冲液洗涤磁珠结合的免疫沉淀物，在loading buffer中煮沸，然后通过蛋白质印迹进行分析。

流式细胞仪检测

对于流式细胞分析，将来自第6代的衰老 MEF 细胞以 70-80% 的密度接种在6孔培养板中，并在 37°C 条件下培养 24 小时。对于 MEF，使用 5 × 105 个细胞/孔。添加药物后，在 37 °C 的新鲜细胞培养基中用 100 nM bafilomycin A1 预处理细胞 1 小时以诱导溶酶体碱化。然后将 C12FDG (10 μM) 溶液添加到细胞培养基中处理2 小时。通过胰蛋白酶消化收集细胞并重悬于每 1 × 105 个细胞/100 µl 含有 5 µl PE /Annexin 和5 µl 7-AAD 的 1× Annexin V 缓冲液中。在1小时内通过流式细胞术分析细胞。为了估计相对 SA-β-Gal 活性，建立了 FSC 与 SSC 的两参数显示，不包括亚细胞碎片。该区域内以绿色荧光直方图表示，其中 Y 轴表示细胞数，X 轴表示对数刻度的 C12FDG 荧光强度。

RNA分离和定量RT-PCR

根据制造商的说明，使用 Trizol 试剂（Invitrogen）分离总 RNA。即使用 5×PrimeScript RT Master Mix (Takara) 逆转录 2 μg mRNA。使用 2× SYBR Green Mix(Takara) 进行定量 RT-PCR 反应，该反应在 7500 Fast Real-Time PCR 系统 (AppliedBiosystems) 上运行。 β-肌动蛋白mRNA用作结果标准化的对照。

SA-β-Gal 染色和细胞凋亡测定

根据制造商的说明（目录号 9860，Cell Signaling Technology），用细胞衰老测定试剂盒进行 SA-β-Gal 染色，然后显微镜拍照。在 300 多个随机选择的细胞中计数蓝色染色的 MEF细胞比例。

动物研究

使用已报道的 Zmpste24^-/-小鼠模型（Pendas 等，2002）。 Zmpste24^+/+和Zmpste24^-/-小鼠被分配到对照或 TBB 治疗组。 TBB组小鼠喂食TBB，将其混合在饮用水中，最终浓度为100 uM/L。记录 TBB 处理或对照处理组的 Zmpste24^-/-小鼠和野生型对照小鼠的存活率，并每周监测它们的体重。对未处理和喂食 TBB 的小鼠的存活曲线进行 Kaplan-Meir 分析。对于骨密度分析，大腿骨在 4°C 下固定在 4% PFA 中过夜。相关数据由micro-CT (Scanco Medical, CT100) 采集。每个实验组至少包括三只小鼠。所有使用小鼠的实验均按照深圳大学活体动物教学与研究委员会批准的方案进行。

所有实验至少重复三次。所有数据均表示为 mean ± S.D或r mean ± S.E.M。使用Student’s t test进行统计分析。当相应的 P 值 <0.05 时，差异被认为具有统计学意义。

以上所述仅为本申请的较佳实施例而已，并不用以限制本申请，凡在本申请的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (10)

1.CK2抑制剂在制备抗衰药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述CK2抑制剂包括TBB和/或CX4945。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述TBB靶向 DDR 通路。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述 TBB抑制 CK2 对 HP1α 的磷酸化活性的通路。

5.根据权利要求2~4任一所述的应用，其特征在于，所述抗衰药物包括用于延缓衰老过程的药物。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述抗衰药物包括用于治疗早衰症的药物。

7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述抗衰药物中所述TBB的含量为10-100μmol/L。

8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述抗衰药物为片剂、胶囊剂和注射剂中的一种。

9.根据权利要求2~4、6~8任一所述的应用，其特征在于，所述抗衰药物还包括药学上可接受的辅料和/或药用载体。

10.TBB作为靶向CK2抑制剂的应用。

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