KR100855355B1

KR100855355B1 - Ｓｉｒｔ1 발현 억제제 함유 방사선 감수성 증진 조성물 및이를 이용하여 암세포의 방사선 감수성 증진 방법

Info

Publication number: KR100855355B1
Application number: KR1020070003950A
Authority: KR
Inventors: 이기호; 정재민; 박길홍; 이은주; 함용호
Original assignee: 재단법인 한국원자력의학원
Priority date: 2007-01-12
Filing date: 2007-01-12
Publication date: 2008-09-04
Also published as: KR20080066465A

Abstract

본 발명은 SIRT1 발현 억제제 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 암세포의 방사선 조사에 대한 감수성 증진용 조성물 및 SIRT1 siRNA를 암세포에 트랜스펙션시켜 SIRT1 단백질의 발현을 감소시키는 단계를 포함하는 방사선 조사에 대한 암세포의 감수성을 증진하는 방법을 제공한다. 본 발명에 따르면, 방사선 조사에 대한 암세포의 감수성을 증진시킬 수 있다.

Description

ＳＩＲＴ1 발현 억제제 함유 방사선 감수성 증진 조성물 및 이를 이용하여 암세포의 방사선 감수성 증진 방법{Composition for enhancing radiation sensitivity containing expression inhibitors of SIRT1 and method for enhancing radiation sensitivity of cancer cells using the same}

도 1은 방사선 조사에 의해 생성된 DNA 절단을 고치는 SIRT1(silent information regulator T1) 매개 증가를 보여준다. Q293A 세포를 SIRT1 (채운 막대기), SIRT1-HY(우성 음성 SIRT1) (사선 막대기), 또는 빈 벡터 대조군 (빈 막대기)으로 동시 트랜스펙션하고, 리포터 플라스미드를 다양한 투여량의 방사선 조사에 의해 절단하였다. 트랜스펙션 후 72시간에, 절단 자리의 재연결 능력을 루시퍼라아제 활성을 측정함으로써 측정하였다. 값은 3개의 별도의 실험으로부터의 평균으로서 나타내었다; 오차 막대기, ±SD. *, 빈 벡터에 대해 P < 0.05.

도 2는 SIRT1-siRNA에 의한 DNA 복구 활성의 감소를 보여준다. Q293A 세포를 SIRT1으로 동시 트랜스펙션시키고, pSilencer 키트에 의해 제조된 6개의 SIRT1 siRNA의 SIRT1 발현에 대한 감소 능력을 웨스턴 블롯 분석에 의해 측정하였다. SIRT1 발현을 감소시키는데 가장 활성인 SIRT1 siRNA를 갖는 SIRT1/pJJ77을 SIRT1 발현 플라스미드와 함께 Q293A 세포 내로 동시 트랜스펙션하고, 전술한 바와 같이 복구 활성을 시험하였다. β-액틴을 내부 로딩 대조군으로서 이용하였다. 값은 3 개의 별도의 실험으로부터의 평균으로서 나타내었다; 오차 막대기, ±SD. *, SIRT1에 대해 P < 0.05.

도 3은 SIRT1의 결합 및 이은 Ku70 단백질의 탈아세틸화를 나타낸다. Q293A 세포를 SIRT1으로 일시적으로 트랜스펙션하고, 36시간 후에 용해하였다. 세포 용해물을 항-SIRT1 (A), 항-Ku70 항체 (B), 또는 대조군 IgG 항체를 이용하여 면역침전한 후, 항-Ku70 (A) 또는 항-SIRT1 항체 (B)로 각각 역으로 프로빙하였다. (C) 아세틸화 상태의 분석을 위해, 세포 용해물을 아세틸화된-라이신에 대한 항체를 이용하여 면역침전한 후, 항-Ku70 항체를 이용하여 프로빙하였다. (D) Q293A 세포를 SIRT1, SIRT1-HY, 또는 빈 벡터 대조군 플라스미드로 일시적으로 트랜스펙션하였다. 세포 용해물을 각각 항-아세틸화된-라이신(상단 패널) 또는 항-Ku70 항체(하단 패널)을 이용하여 면역침전한 후, Ku70 단백질의 검출을 위해 웨스턴 블롯팅하였다.

도 4는 SIRT1에 의한 복구 단백질 Ku70의 기능적 조절에 대한 제안된 모델을 나타낸다. 복구 단백질 Ku70의 아세틸화 상태는 DNA 손상 유도 조건하의 세포의 운명을 조절할 수 있다: CBP 또는 PCAF에 의한 Ku70 아세틸화는 세포 사멸을 가속화시키는 반면, SIRT1에 의한 Ku70의 탈아세틸화는 DNA 복구 활성의 증가를 통해 세포 생존을 촉진한다.

본 발명은 SIRT1(silent information regulator T1) 발현 억제제를 함유하는 암세포의 방사선 조사에 대한 감수성 증진용 조성물 및 상기 SIRT1 발현 억제제를 이용하여 방사선 조사에 대한 암세포의 감수성을 증진하는 방법에 관한 것이다.

암의 치료법은 수술, 방사선치료법, 항암화학요법으로 크게 나눌 수 있는데, 현재 암 환자 중 국내의 경우 약 35%, 미국의 경우 약 50% 정도가 방사선 치료를 받고 있으며, 국내에서 방사선 치료를 받는 암 환자의 수가 매년 증가하고 있는 추세에 있으므로 암 치료에 있어 방사선 치료의 중요성 또한 증가하고 있다. 그러나 암세포의 방사선 내성 획득, 고선량 방사선 치료시 정상 조직의 손상 등이 방사선 치료의 효율을 저하시키는 문제점으로 지적되어 왔다.

따라서，방사선 치료의 효율을　증진시키기　위한　방사선 치료 민감제에 대한　연구가　시도되고 있으나, 현재까지 보고된　방사선 치료 민감제는 주로 항암제들로서, 예를 들어 탁솔(Taxol)과 시스플라틴(cisplatin)이 유방암, 자궁암, 폐암, 위암, 대장암 등의 고형암에서 방사선 치료 민감제로 사용될 수 있다고 개시된 바 있다 (Amorino et al, Radiat Oncol Investig 1999;7(6):343-52; Choy H., Oncology 1999 Oct;13:22-38; Safran H et al., Cancer Invest 2001;19(1):1-7). 그러나, 이들 방사선 치료 민감제들은 그 자체가 항암제로서 사용되는 물질로서, 높은 부작용을 가지므로 그 사용이 제한적이라는 문제점이 있다.

암세포에 대한 방사선 치료의 감수성의 차이가 존재하지만 방사선 치료에 대한 암세포의 감수성을 증진시킬 수 있다면, 환자에게 더 적은 양의 방사선을 조사하여 동일한 치료 효과를 얻을 수 있으므로 바람직하다.

휴지 정보 조절기 2(silent information regulator 2: SIR2) 유전자 패밀리 멤버는 원시세균에서 진핵세포까지 매우 보존되어 있다. Sir2 단백질은 NAD-의존성 단백질 탈아세틸화효소로서 기능하며, 히스톤 아세틸화를 조절함으로써 사일런싱을 매개하는 것으로 생각된다. 효소 반응에서, Sir2는 기질 단백질의 라이신 잔기로부터 아세틸기의 제거를 촉매한다. Sir2 단백질의 효소 활성은 주로 Sir2 패밀리 유전자 사이에 보존되는 약 260 아미노산을 포함하는 코아 도메인이 담당하고, 상기 구형 코아 도메인 내의 보존 잔기의 돌연변이는 탈아세틸화효소 활성의 상실을 초래한다. 효모에서 적어도 3가지 SIR 단백질인 Sir2, 3 및 4는 유전자 사일런싱뿐만 아니라, 적당한 세포 주기 진전, 방사선 내성 및 게놈 안정화에 참여한다.

인간은 시르투인(sirtuin)이라 불리는 Sir2에 유사성을 갖는 7개의 단백질을 가지나, 이의 역할은 거의 이해되지 않는다. 최근에, Sir2의 인간 동족체인 SIRT1이 p53 종양 억제제에 결합하여 이를 조절한다는 것이 밝혀졌다 (Luo J 등, Cell 107: 137-148, 2001; Vaziri H 등, Cell 107: 149-159, 2001; Cohen HY 등, Science 305: 390-392, 2004; 및 Brunet A 등, Science 303: 2011-2015, 2004). DNA 손상에 따라, SIRT1은 p53 단백질을 탈아세틸화하며, p53 단백질의 전사인자로서의 능력을 약화시킨다. 따라서, SIRT1 과발현은 DNA 손상 유도 조건하에 세포 생존을 증가시킨다. 상기 초기 관찰은 DNA 복구 과정 동안 생성된 신호가 SIRT1을 통해 아세틸화된 p53으로 전달되는 가능성을 제시한다.

따라서, 본 발명자들은 SIRT1이 DNA 복구능을 증진시키고, Ku70 단백질의 탈 아세틸화를 증진시킨다는 것에 기초하여, SIRT1 발현을 억제하면 DNA 복구능이 저하되어, 암세포의 방사선 조사에 대한 감수성이 증진될 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 SIRT1 발현 억제제를 포함하는 암세포의 방사선 조사에 대한 감수성 증진용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 SIRT1 siRNA를 암세포에 트랜스펙션시켜 SIRT1 단백질의 발현을 감소시키는 단계를 포함하는 방사선 조사에 대한 암세포의 감수성을 증진하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 SIRT1 발현 억제제 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 암세포의 방사선 조사에 대한 감수성 증진용 조성물을 제공한다.

본 발명에서 사용하는 SIRT1 발현 억제제는 SIRT1의 발현을 억제할 수 있는 임의의 물질을 말한다. 바람직하게는 상기 SIRT1 발현 억제제는 SIRT1 siRNA일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 서열번호 1 내지 6의 염기서열로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 SIRT1 siRNA일 수 있다. SIRT1은 Sir2의 인간 동족체를 말한다.

최근에 유전자 수준에서 단백질의 발현을 조절하기 위한 방법으로 RNA 간섭(RNA interference, RNAi) 현상을 이용한 방법이 연구되고 있다. 일반적으로 siRNA(small interfering RNA)로 명명되는 작은 RNA 조각은 약 20 뉴클레오티드 크기의 작은 RNA 조각으로 상보적인 서열을 갖는 mRNA에 특이적으로 결합하여 단백질 발현을 억제하는 것으로 밝혀졌다. 이중-가닥 RNA를 선충에게 주입했을 때 상보적인 세포 내부의 mRNA와 서열 특이적으로 결합해 유전자 사일런싱(silencing)을 유도하는 기능을 확인했고, 이를 계기로 이런 현상을 RNA 간섭이라고 부른다. siRNA에 의해 그에 상보적인 염기서열을 갖는 mRNA 분해가 유발되는지 혹은 번역억제가 유도되는지 여부는 해당하는 21-25 뉴클레오티드 RNA와 mRNA간의 상보성 정도에 따라 결정되는 것으로 알려졌는데, 100% 상보적인 경우는 mRNA 분해를, 약 80-90% 상보적인 경우는 번역 억제를 일으키는 것으로 파악되고 있다. 본 발명에서는 서열번호 1 내지 6의 염기서열을 갖는 siRNA들 중의 하나를 이용할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따른 조성물에서, 상기 SIRT1 발현 억제제는 우성-음성(dominant-negative) SIRT1일 수 있으며, 상기 우성-음성 SIRT1은 SIRT1 단백질의 잔기 위치 363의 히스티딘이 타이로신으로 치환된 불활성화된 형태의 돌연변이체일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 명세서에서 사용하는 "방사선 감수성 증진용 조성물"이라는 용어는, 방사선 치료시 병행처리되어 방사선에 대한 세포의 감수성을 증진시켜 방사선 치료 효율을 상승시키는 물질로서, 예를 들어 암치료시 병행처리되어 방사선에 대한 암세포의 감수성을 증진시켜 암세포 살상 효과 및 증식 억제 효과를 나타내는 물질을 말한다.

본 발명의 방사선 감수성 증진용 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다. 즉, 본 발명에서 사용될 수 있는 약제학적으로 허용되는 담체로는 통상적인 부형제, 붕해제, 결합제, 활택제, 기타 첨가제, 예컨대 안정제, 완화제, 유화제 등을 선택하여 사용할 수 있다. 예를 들어, 부형제로서 미결정 셀룰로오스, 유당, 저치환도 히드록시셀룰로오스 등이 사용될 수 있고, 붕해제로서 전분글리콜산 나트륨, 무수인산일수소 칼슘 등이 사용될 수 있다. 결합제로는 폴리비닐피롤리돈, 저치환도 히드록시프로필셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스 등이 사용될 수 있고, 활택제로서는 스테아린산 마그네슘, 이산화규소, 탈크 등으로부터 선택하여 사용할 수 있다.

본 발명의 조성물의 투여경로로는 경구, 국소, 피하, 경피, 진피하, 근육내, 복막내, 방광내, 관절내, 동맥내, 정맥내, 피내, 두개내, 병소내, 안내, 폐내, 척수강내 및 전립선내 투여가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한 본 발명의 조성물은 비 흡입, 폐 흡입, 피부에의 압인 및 일렉트로코포레이션을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

투여 경로에 따라 투여량 당 용적은 바람직하게는 투여량 당 약 0.001 내지 100 ㎖, 더욱 바람직하게는 투여량당 약 0.01 내지 50 ㎖, 가장 바람직하게는 투여량당 약 0.1 내지 30 ㎖이다. 투여량 당 투여되는 siRNA의 양은 바람직하게는 약 1 ng 내지 100 ㎎/체중㎏, 더욱 바람직하게는 약 10 ng 내지 1 ㎎/체중㎏이고, 가장 바람직하게는 약 100 ng 내지 100 ㎍/체중㎏이다.

본 발명의 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 변할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따른 조성물에서, 상기 SIRT1 발현 억제제는 방사선 조사에 대한 암세포의 DNA 복구능을 저하시키고, 복구 단백질 Ku70의 탈아세틸화를 저하시킬 수 있다. SIRT1 단백질은 암세포의 DNA 복구능을 증진시키고, 복구 단백질 Ku70의 탈아세틸화를 증진시킨다. 따라서, SIRT1 단백질의 발현 억제제를 이용하여 방사선 조사에 대한 암세포의 DNA 복구능을 저하시키고, 복구 단백질 Ku70의 탈아세틸화를 저하시킴으로써 방사선을 조사하였을 때, 암세포가 방사선에 대해 더욱 민감하게 반응할 수 있는 것이다.

본 발명에서, 상기 암은 백혈병, 유방암, 피부암, 골암(bone cancer), 전립선암, 간암, 폐암, 뇌암, 후두암, 담낭암, 췌장암, 섬세포암, 직장암, 부갑상선암, 갑상선암, 부신암, 신경조직암, 두경부암, 결장암, 위암, 기관지암, 신장암, 기저세포 암종, 궤양형 및 유두형 둘 모두의 편평세포 암종, 전이성 피부 암종, 골육종, 유잉 육종(Ewing's sarcoma), 베티컬럼(veticulum) 세포 육종, 골수종, 거대세포 종양, 소세포 폐종양, 섬세포 암종, 원발성 뇌종양, 급성 및 만성 림프구 및 과립구 종양, 털세포 종양, 선종, 과형성, 수질 암종, 갈색세포종, 점막 신경종, 장 신경절신경종, 과형성 각막 신경 종양, 마르파노이드(marfanoid) 체질 종양, 윌름 종양(Wilm's tumor), 생식세포종, 난소 종양, 레이오미오마터(leiomyomater) 종양, 경부 이형성 및 상피내암종, 신경모세포종, 망막모세포종, 연질조직 육종, 악성 카르시노이드, 국소적 피부 병변, 균상식육종, 횡문근육종, 카포시 육종, 골원성 및 그 밖의 육종, 악성 고칼슘혈증, 신장 세포 종양, 진성 적혈구증가증, 선암종, 다 형성 아교모세포종, 백혈병, 림프종, 악성 흑색종, 및 표피유사 암종으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 SIRT1 siRNA를 암세포에 트랜스펙션시켜 SIRT1 단백질의 발현을 감소시키는 단계를 포함하는 방사선 조사에 대한 암세포의 감수성을 증진하는 방법을 제공한다.

본 발명의 방법은 SIRT1 siRNA를 암세포에 트랜스펙션시켜 SIRT1 단백질의 발현을 감소시킴으로써 방사선 조사에 대한 암세포의 DNA 복구능을 저하시켜 방사선 조사에 대한 암세포의 감수성을 증진시킨다. 따라서, 소량의 방사선 조사로도 암세포를 사멸시킬 수 있는 것이다.

본 발명의 일 구현예에 따른 방법에서, 상기 SIRT1 siRNA는 서열번호 1 내지 6의 염기서열로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다. 상기 염기서열을 가진 siRNA를 제조하는 방법에는 siRNA를 직접 화학적으로 합성하는 방법(Sui G 등, (2002) Proc Natl Acad Sci USA 99: 5515-5520), 시험관 내 전사를 이용한 siRNA의 합성법(Brummelkamp TR 등, (2002) Science 296: 550-553), 시험관 내 전사에 의해 합성된 긴 이중 가닥 RNA를 RNaseⅢ 패밀리 효소와 같은 효소를 이용하여 절단하는 방법(Paul CP 등, (2002) Nature Biotechnology 20: 505-508), siRNA 발현 플라스미드나 바이러스성 벡터의 세포내 전달을 통한 발현법 (Lee NS 등, (2002) Nature Biotechnology 20: 500-505) 및 PCR(polymerase chain reaction) 유도 siRNA 발현 카세트의 세포 내 전달을 통한 발현법(Castanotto D 등, (2002) RNA 8: 1454-1460) 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 하나 이상의 siRNA를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다. 예를 들어 염색체, 에피솜 및 유도된 바이러스와 같은 수많은 발현 시스템이 사용될 수 있다. 보다 구체적으로 사용할 수 있는 재조합 벡터로는 세균성 플라스미드, 트랜스포존, 효모 에피솜, 삽입 인자, 효모 염색체 인자, 배큘로바이러스와 같은 바이러스, SV40과 같은 유두종 바이러스, 백신 바이러스, 아데노 바이러스, 계두 바이러스, 가성광견병 바이러스, 레트로바이러스로부터 유래한 것이 사용될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 이들 재조합 벡터는 또한 코스미드 또는 파지미드 유도체일 수 있다.

siRNA 서열은 예를 들어 문헌(Molecular cloning: A laboratory manual, Sambrook 등, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2001)에 기재된 바와 같이 본 발명이 속한 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 익히 공지되어 있는 방법들에 의해 재조합 발현 벡터에 삽입될 수 있다.

재조합 벡터는 본 발명의 siRNA 발현의 조절을 제어하는 염기서열을 포함할 수 있고, 이들 서열은 사용된 숙주 세포에 따라서 선택된다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 재조합 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 숙주 세포에 재조합 벡터의 도입은 인산칼슘를 이용한 형질감염(Graham, F.L. 등, Virology, 52:456(1973)), DEAE 덱스트란에 의한 형질감염, 미세주사에 의한 형질감염(Capecchi, M.R., Cell, 22:479(1980)), 양이온성 지질에 의한 형질감염(Wong, T.K. 등, Gene, 10:87(1980)), 전기천공법(Neumann E. 등, EMBO J., 1:841(1982)), 형질도입 또는 트랜스펙션과 같이 문헌(Basic methods in molecular biology, Davis 등, 1986 및 Molecular cloning: A laboratory manual, Davis 등, 1986)에 기재된 바와 같이 본 발명이 속한 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 익히 공지되어 있는 방법들에 따라 제조될 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따른 방법에서, 상기 암은 백혈병, 유방암, 피부암, 골암(bone cancer), 전립선암, 간암, 폐암, 뇌암, 후두암, 담낭암, 췌장암, 섬세포암, 직장암, 부갑상선암, 갑상선암, 부신암, 신경조직암, 두경부암, 결장암, 위암, 기관지암, 신장암, 기저세포 암종, 궤양형 및 유두형 둘 모두의 편평세포 암종, 전이성 피부 암종, 골육종, 유잉 육종(Ewing's sarcoma), 베티컬럼(veticulum) 세포 육종, 골수종, 거대세포 종양, 소세포 폐종양, 섬세포 암종, 원발성 뇌종양, 급성 및 만성 림프구 및 과립구 종양, 털세포 종양, 선종, 과형성, 수질 암종, 갈색세포종, 점막 신경종, 장 신경절신경종, 과형성 각막 신경 종양, 마르파노이드(marfanoid) 체질 종양, 윌름 종양(Wilm's tumor), 생식세포종, 난소 종양, 레이오미오마터(leiomyomater) 종양, 경부 이형성 및 상피내암종, 신경모세포종, 망막모세포종, 연질조직 육종, 악성 카르시노이드, 국소적 피부 병변, 균상식육종, 횡문근육종, 카포시 육종, 골원성 및 그 밖의 육종, 악성 고칼슘혈증, 신장 세포 종양, 진성 적혈구증가증, 선암종, 다형성 아교모세포종, 백혈병, 림프종, 악성 흑색종, 및 표피유사 암종으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구현예에 따른 방법에서, 상기 암세포를 감마선으로 방사선 조 사할 수 있다. 본원에 이용된, 용어 "암세포"는 다세포 생물체의 조직 또는 기관에서 조절되지 않은 성장을 나타내는 임의의 세포를 말한다. "방사선 조사(irradiation)"는 예를 들면, X-선, 자외선, 알파 입자 및 감마선을 포함하는 전자기 방사선 또는 알파 또는 베타 입자의 작용에 대한 노출을 포함한다. "방사선 감수성"은 방사선 조사에 의해 쉽게 영향을 받는 세포, 예를 들면, 방사선에 노출 후에 저해된 세포 복구 또는 세포 성장의 유사분열기에서 세포의 감소된 비율을 말하기 위해 이용된다. 마찬가지로, 용어 "방사선 내성"은 방사선 조사에 의해 쉽게 영향을 받지 않으며, 방사선에 노출시 세포 복구 또는 증식에 거의 변화가 없는 세포를 말한다.

본 발명의 일 구현예에 따른 방법에서, 방사선 조사 전에 방사선 감수성제 또는 화학요법제에 상기 암세포를 노출하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. "방사선 감수성제"는 통상적으로 세포 복구를 저해하거나 또는 세포 성장의 유사분열기에서 세포의 비율을 증가시킴으로써 방사선 치료의 효과에 대한 세포의 감수성을 증가시키는 임의의 물질을 포함한다. "화학요법제"는 질병의 치료 또는 제어에 이용되는 임의의 화학물질을 포함한다. 암 화학요법제의 예는 시스플라틴, 카르무스틴(BCNU), 및 부티오닌 설폭시민(BSO)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

실시예

재료 및 방법

세포 배양

Q293A 세포 (Quantum Biotech., Montreal, Canada)를 5% 소태아혈청으로 보충된 둘베코 변형 이글 배지(DMEM)에서 유지하였다. 상기 세포를 5% CO₂를 갖는 37℃ 습한 대기 인큐베이터에서 유지하였다.

레트로바이러스 생산 및 감염

인간 SIRT1 및 SIRT1-HY cDNA (Luo J 등, Cell 107: 137-148, 2001; 및 Vaziri H 등, Cell 107: 149-159, 2001)를 레트로바이러스 벡터 pMFG-puro에 서브클로닝하였다. 상기 레트로바이러스를 H29D 패키징 세포 내로 pMFG-puro, MFG-SIRT1 및 MFG-SIRT1-HY (탈아세틸화효소 사멸 돌연변이체) 플라스미드의 일시적인 트랜스펙션에 의해 제조하였다. Q293A 세포를 8 ㎍/ml의 폴리브렌(polybrene)을 포함하는 레트로바이러스로 4시간 동안 감염시켰다. 감염 후 24시간에, 상기 세포를 2 ㎍/ml 퓨로마이신 (BD Biosciences, USA)에서 선발하였다.

면역침전 및 웨스턴 블롯 분석

상기 세포를 TNN 완충액 (120 mM NaCl, 40 mM Tris-HCl, pH 8.0, 0.5% NP-40, 1 mM 페닐메틸설포닐 플루오라이드, 1 mM 소듐 오르토바나데이트, 100 mM 소듐 플루오라이드 및 1 ㎍/ml 각각의 류펩틴, 아프로티닌 및 펩스타틴)에 용해하였다. 면역침전물을 SDS-시료 완충액에서 끓이고, 7.5 % SDS-폴리아크릴아미드 겔 상에 로딩하고, 전기영동에 의해 분리하였다. 단백질을 PROTRAN Nitrocellulose Transfer Membrane (Schleicher & Schuell, Germany)에 전기영동적으로 옮겼다. 1차 항체의 검출을 Luminal Reagent (Santa Cruz, USA)를 이용하여 호스래디쉬 퍼옥시다제 접합된 당나귀 항-토끼 IgG 또는 항-염소 IgG를 이용하여 수행하였다.

DNA 복구능의 측정

CMV 프로모터를 반딧불이 루시퍼라아제 유전자를 포함하는 pGL2 플라스미드(Promega, USA) 내로 서브클로닝하였다. pGL2-CMV라 명명한 상기 플라스미드는 DNA 복구능을 측정하기 위해 이용되었다. 그리하여, pGL2-CMV 플라스미드는 ¹³⁷Cs 소스로서 γ-선에 노출에 의해 시험관 내에서 손상을 받았다. pMFG-SIRT1은 인산칼슘 침전법(Invitrogen, USA)을 이용하여 손상되거나 또는 손상되지 않은 pGL2-CMV 및 pCH110 (Pharmacia, USA)와 함께 Q293A 세포 내로 일시적으로 동시 트랜스펙션시켰다. 상기 세포를 트랜스펙션 후 72시간에 모으고, 세포 추출액을 이용하여 루시퍼라아제 활성을 분석하였다. 상기 단백질 농도를 Bio-Rad 단백질 분석 키트를 이용하여 측정하였다. pCH110에 의해 유도된 lac 활성은 기질로서 오르토니트로페닐-β-D-갈락토피라노시드를 이용함으로써 72시간에 측정하였다. 상기 루시퍼라아제 활성을 Promega 루시퍼라아제 분석 시스템을 이용하여 측정하고, 각 트랜스펙션에서 동시 트랜스펙션된 lacZ 대조군 활성에 표준화함으로써 상대적인 루시퍼라아제 단위로서 나타내었다.

SIRT1 siRNAs

SIRT1 유전자에 대한 센스 및 안티-센스 RNA의 서열은 하기와 같다: pJJ71 5'-AACTTGTACGACGAAGACGAC-3'(서열번호 1), pJJ72 5'-AAAGTGATGAGGAGGATAGAG-3'(서열번호 2), pJJ73 5'-AATTCCAGCCATCTCTCTGTC-3'(서열번호 3), pJJ75 5'-AACAGTTTCATAGAGCCATGA-3'(서열번호 4), pJJ76 5'-AACCTTTGCCTCATCTGCATT-3'(서열번호 5), pJJ77 5'-AACTTCACCACCAGATTCTTC-3'(서열번호 6). 상기 SIRT1-siRNA 올리고뉴클레오티드를 제조자(Ambion, USA)의 지시에 따라 siRNA 구축 벡터인 pSilencer-neo2 내로 서브클로닝하였다. Q293A 세포를 인산칼슘 침전법을 이용하여 상기 SIRT1 siRNA 플라스미드로 트랜스펙션시켰다. 상기 세포를 트랜스펙션 후 48시간에 모으고, 세포 추출액을 이용하여 웨스턴 블롯 분석에 의한 siRNA의 효과를 확인하였다.

실시예 1: SIRT1 에 의한 DNA 복구능의 증진

최근의 연구는 SIRT1이 과산화수소(Luo J 등, Cell 107: 137-148, 2001), 항암 약물(Luo J 등, Cell 107: 137-148, 2001), 및 이온 방사선(Vaziri H 등, Cell 107: 149-159, 2001)을 포함하는 스트레스 반응시 세포 생존을 증가시킨다는 증거를 제공하였다. DNA 손상 유도 조건하에 세포 생존을 증가시킬 때 SIRT1의 기작을 추가로 평가하기 위해, SIRT1이 방사선을 포함하는 항암제에 대한 감수성에 결정적으로 영향을 줄 수 있는 DNA 복구능을 조절할 수 있는지를 조사하였다. DNA 복구 활성을 모니터링하기 위해, 가닥 절단을 갖는 플라스미드 DNA를 복구하는 세포의 능력을 분석하였다. SIRT1 또는 빈 대조군 벡터를 트랜스펙션 전에 다양한 투여량 의 방사선 조사에 의해 절단된 루시퍼라아제 리포터 플라스미드와 함께 Q293A 세포에 동시 트랜스펙션하고, 루시퍼라아제 활성을 측정함으로써 절단된 플라스미드를 복구하는 능력을 측정하였다. SIRT1의 도입은 MFG 빈 대조군 벡터의 것과 비교하여 상대적인 루시퍼라아제 활성의 증가를 초래하였는데(도 1), 이는 전위적으로(ectopically) 과발현된 SIRT1에 의한 DNA 복구 활성의 증가를 나타낸다. 구체적으로, 루시퍼라아제 리포터 플라스미드의 절단이 트랜스펙션 전에 10, 20, 및 30 Gy 방사선 조사에 대한 노출에 의해 생성되었을 때, SIRT1은 빈 벡터 대조군의 것과 비교하여, 루시퍼라아제 활성에서 각각 2.6, 3.3, 및 2.4배 증가를 초래하였다.

실시예 2: SIRT1 siRNA 에 의한 DNA 복구능의 억제

상기 결과는 전위적으로 과발현된 SIRT1에 의해 수득되었다. 그러므로, SIRT1의 내재하는 수준이 낮아졌을 때, DNA 복구 활성을 모니터링할 필요가 있었다. 따라서, 내재하는 SIRT1을 감소시키기 위해 siRNA 기술을 적용하였다. SIRT1에 대한 가장 효율적인 siRNA를 수득하기 위해, SIRT1 유전자의 발현 좌위(loci) 내의 6개의 상이한 siRNA를 디자인한 후, SIRT1 발현 플라스미드와 함께 Q293A 세포 내로 이를 동시 트랜스펙션시켰다. 도 2의 A는 모든 상기 siRNA가 외부적으로 과발현된 SIRT1 단백질의 수준을 효율적으로 감소시킨다는 것을 보여준다. 그러므로, SIRT1 단백질 수준을 가장 효율적으로 낮추는 하나의 SIRT1 siRNA를 선발하였다 (도 2의 A). 상기 선발된 SIRT1 siRNA는 또한 내재하는 SIRT1 단백질뿐만 아니라 외래의 SIRT1 단백질의 감소를 초래하였다 (도 2의 B). SIRT1 siRNA로 트랜스펙션된 Q293A 세포는 야생형 SIRT1으로 트랜스펙션된 것과 비교하여, DNA 복구능의 현저한 감소를 나타내었다. 야생형 SIRT1과 대조적으로, 우성 음성(dominant-negative) SIRT1인 SIRT1 단백질의 잔기 위치 363의 히스티딘이 타이로신으로 치환됨으로써 돌연변이된 촉매적으로 불활성 형태를 발현하는 SIRT1-HY(Vaziri H 등, Cell 107: 149-159, 2001)는 DNA 복구능을 증진시키지 못하였다. 상기 발견은 SIRT1 단백질이 DNA 손상에 따른 생체 내 DNA 복구능을 증진시킬 수 있다는 것을 나타낸다.

실시예 3: SIRT1 과 Ku70 의 상호작용

공지된 탈아세틸화효소인 SIRT1이 DNA 복구능을 조절할 수 있다는 결과는 DNA 복구 과정에 관련된 SIRT1의 가능한 기질을 탐색하게 하였다. 염색체 말단 텔로미어 반복에서 SIRT1과 함께 위치하는 몇 가지 후보 단백질 중에서, Ku70은 DNA 복구 단백질의 촉진제로서 기능하며(Ouyang H 등, J Exp Med 186: 921-929, 1997), 절단된 염색체의 자리에 SIRT1과 함께 동원된다는 것이 밝혀졌다(Hegde V and Klein H, Nucleic Acids Res 28: 2779-2783, 2000).

그러므로, SIRT1이 Ku70과 물리적으로 복합체를 형성할 수 있는지를 조사하였다. 내재하는 SIRT1의 낮은 수준은 세포 기질에 대한 이의 결합을 조사하는 것을 어렵게 하기 때문에, SIRT1 과발현 세포를 제조하였다. 그리하여, SIRT1을 갖는 레트로바이러스로 U2OS 세포를 감염시킨 후, 퓨로마이신에 내성인 혼합된 집단을 분리하였다. 상기 혼합된 집단은 높은 수준의 외래 SIRT1 및 내재하는 Ku70 발현을 나타내었으며(데이타 미제시), U2OS 세포의 용해물에서 SIRT1 및 Ku70 단백질 사이의 가능한 상호작용을 조사하였다. 상기 세포 용해물을 이어서 항-SIRT1 항체 로 면역침전시키고, 생성된 면역 복합체를 항-Ku70 항체를 이용한 면역블롯팅에 의해 분석하였다. 도 3의 A에 보여준 바와 같이, SIRT1을 전위적으로 과발현하는 U2OS 세포의 용해물로부터 SIRT1의 면역침전은 Ku70의 동시면역침전을 초래하였다. 상기 상호작용은 항-Ku70 항체를 이용하여 용해물로부터 면역블롯팅하고, 이어서 상기 블롯팅된 침전물을 SIRT1 항체로 프로빙함으로써 역으로 확인하였다 (도 3의 B). 반대로, 동일한 세포 용해물로부터 IgG 대조군 항체의 면역침전에서는 Ku70 또는 SIRT1 단백질을 검출할 수 없었다. 상기 결과는 SIRT1 및 Ku70이 상호작용할 수 있으며, 생체 내에서 서로 물리적으로 복합체를 형성할 수 있다는 것을 나타낸다.

실시예 4: SIRT1 에 의한 Ku70 의 탈아세틸화

공지된 탈아세틸화효소인 SIRT1이 Ku70과 물리적으로 복합체를 형성할 수 있다는 상기 결과는 SIRT1이 생체 내에서 Ku70을 탈아세틸화할 수 있는지를 조사하게 하였다. 최근에 293 세포 시스템에서 보고된 바와 같이(Cohen HY 등, Mol Cell 13: 627-638, 2004), U2OS 세포에서 Ku70 아세틸화는 항-아세틸-라이신 항체에 의해 면역침전된 아세틸화된 단백질 풀에서 이의 존재를 보여줌으로써 확인되었다 (도 3의 C). 항-아세틸 라이신 항체에 의해 동시 면역침전된 Ku70 단백질의 아세틸화된 형태는 전위적으로 과발현된 SIRT1에 의해 감소되었다 (도 3의 D).

그러나, 우성 음성 SIRT11인 SIRT1-HY의 도입은 아세틸화된 Ku70 단백질의 수준의 회복을 초래하였으며, Ku70 항체에 의한 웨스턴 블롯 분석은 총 Ku70 단백질의 검출가능한 변화를 찾을 수 없었다는 것을 나타내었다. 그러므로, 상기 관찰 은 SIRT1이 Ku70 단백질과 생체 내에서 물리적으로 서로 복합체를 형성함으로써 Ku70 단백질을 탈아세틸화할 수 있다는 것을 제공한다. 게다가, 복구 단백질 Ku70의 아세틸화가 유전자독성(genotoxic) 물질에 노출시 세포 사멸을 가속화시킨다는 최근의 보고(Cohen HY 등, Mol Cell 13: 627-638, 2004)와 함께 상기 발견은 SIRT1이 SIRT1 단백질의 탈아세틸화를 통해 DNA 복구능을 증가시킬 수 있다는 것을 제시한다 (도 4).

본 발명에 따르면, 방사선 조사에 대한 암세포의 감수성을 증진시킬 수 있다.

<110> Korea atomic energy research institute <120> Composition for enhancing radiation sensitivity containing expression inhibitors of SIRT1 and method for enhancing radiation sensitivity of cancer cells using the same <160> 6 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SIRT1 siRNA <400> 1 aacttgtacg acgaagacga c 21 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SIRT1 siRNA <400> 2 aaagtgatga ggaggataga g 21 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SIRT1 siRNA <400> 3 aattccagcc atctctctgt c 21 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SIRT1 siRNA <400> 4 aacagtttca tagagccatg a 21 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SIRT1 siRNA <400> 5 aacctttgcc tcatctgcat t 21 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SIRT1 siRNA <400> 6 aacttcacca ccagattctt c 21

Claims

서열번호 1 내지 6의 염기서열로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 SIRT1(silent information regulator T1) 발현 억제제 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 암세포의 방사선 조사에 대한 감수성 증진용 조성물.
삭제
삭제
SIRT1 발현 억제제로서 SIRT1 단백질의 잔기 위치 363의 히스티딘이 타이로신으로 치환된 돌연변이체 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 암세포의 방사선 조사에 대한 감수성 증진용 조성물.
삭제
제1항 또는 제4항에 있어서, 상기 SIRT1 발현 억제제는 방사선 조사에 대한 암세포의 DNA 복구능을 저하시키고, 복구 단백질 Ku70의 탈아세틸화를 저하시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항 또는 제4항에 있어서, 상기 암이 백혈병, 유방암, 피부암, 골암(bone cancer), 전립선암, 간암, 폐암, 뇌암, 후두암, 담낭암, 췌장암, 섬세포암, 직장암, 부갑상선암, 갑상선암, 부신암, 신경조직암, 두경부암, 결장암, 위암, 기관지암, 신장암, 기저세포 암종, 궤양형 및 유두형 둘 모두의 편평세포 암종, 전이성 피부 암종, 골육종, 유잉 육종(Ewing's sarcoma), 베티컬럼(veticulum) 세포 육종, 골수종, 거대세포 종양, 소세포 폐종양, 섬세포 암종, 원발성 뇌종양, 급성 및 만성 림프구 및 과립구 종양, 털세포 종양, 선종, 과형성, 수질 암종, 갈색세포종, 점막 신경종, 장 신경절신경종, 과형성 각막 신경 종양, 마르파노이드(marfanoid) 체질 종양, 윌름 종양(Wilm's tumor), 생식세포종, 난소 종양, 레이오미오마터(leiomyomater) 종양, 경부 이형성 및 상피내암종, 신경모세포종, 망막모세포종, 연질조직 육종, 악성 카르시노이드, 국소적 피부 병변, 균상식육종, 횡문근육종, 카포시 육종, 골원성 및 그 밖의 육종, 악성 고칼슘혈증, 신장 세포 종양, 진성 적혈구증가증, 선암종, 다형성 아교모세포종, 백혈병, 림프종, 악성 흑색종, 및 표피유사 암종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
서열번호 1 내지 6의 염기서열로 이루어진 군으로부터 선택된 SIRT1 siRNA를 암세포에 트랜스펙션시켜 SIRT1 단백질의 발현을 감소시키는 단계를 포함하는 방사선 조사에 대한 암세포의 감수성을 증진하는 방법.
삭제
제8항에 있어서, 상기 암이 백혈병, 유방암, 피부암, 골암(bone cancer), 전립선암, 간암, 폐암, 뇌암, 후두암, 담낭암, 췌장암, 섬세포암, 직장암, 부갑상선암, 갑상선암, 부신암, 신경조직암, 두경부암, 결장암, 위암, 기관지암, 신장암, 기저세포 암종, 궤양형 및 유두형 둘 모두의 편평세포 암종, 전이성 피부 암종, 골육종, 유잉 육종(Ewing's sarcoma), 베티컬럼(veticulum) 세포 육종, 골수종, 거대세포 종양, 소세포 폐종양, 섬세포 암종, 원발성 뇌종양, 급성 및 만성 림프구 및 과립구 종양, 털세포 종양, 선종, 과형성, 수질 암종, 갈색세포종, 점막 신경종, 장 신경절신경종, 과형성 각막 신경 종양, 마르파노이드(marfanoid) 체질 종양, 윌름 종양(Wilm's tumor), 생식세포종, 난소 종양, 레이오미오마터(leiomyomater) 종양, 경부 이형성 및 상피내암종, 신경모세포종, 망막모세포종, 연질조직 육종, 악성 카르시노이드, 국소적 피부 병변, 균상식육종, 횡문근육종, 카포시 육종, 골원성 및 그 밖의 육종, 악성 고칼슘혈증, 신장 세포 종양, 진성 적혈구증가증, 선암종, 다형성 아교모세포종, 백혈병, 림프종, 악성 흑색종, 및 표피유사 암종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제8항에 있어서, 상기 암세포를 감마선으로 방사선 조사하는 것을 특징으로 하는 방법.
제8항에 있어서, 방사선 조사 전에 방사선 감수성제 또는 화학요법제에 상기 암세포를 노출하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제12항에 있어서, 상기 방사선 감수성제 또는 화학요법제는 시스플라틴, 카르무스틴 또는 부티오닌 설폭시민인 것을 특징으로 하는 방법.