KR20060070491A - 항종양 요법에 대한 종양 세포의 감수성 회복 및 세포 사멸유도를 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

Abstract

항에스트로겐 요법의 항종양형성 효과 및/또는 세포 독성 요법 및 세포 사멸 유도에 대한 감수성을 회복시키는 방법 및 조성물을 제공한다. 종양 세포와 GP88 안타고니스트(예, 항-GP88 항체, 항-GP88 안티센스 핵산, 항-GP88 siRNA 및 소분자)의 접촉은 세포 사멸을 유발하고, 항에스트로겐 요법 및 세포 독성 요법의 항종양형성 효과에 대한 감수성을 회복시킨다.

Description

항종양 요법에 대한 종양 세포의 감수성 회복 및 세포 사멸 유도를 위한 조성물 및 방법{COMPOSITIONS AND METHODS FOR RESTORING SENSITIVITY OF TUMOR CELLS TO ANTITUMOR THERAPY AND INDUCING APOPTOSIS}

출원에 관한 상호 참조

본 출원은 2003년 6월 23일자 미국 가특허출원 제 60/480/439호의 우선권을 주장한다. 다음의 미국특허 및 미국특허공보는 본 명세서에서 참고자료로서 전체적으로 포함되어 있다: 미국특허 제6720159호; 미국특허 제6309826호; 미국특허공보 제2003/0099646호; 미국특허공보 제2003/0215445호; 미국특허공보 제2002/0025543호.

본 발명은 세포생물학, 생리학 및 의학에 관한 것이며, 88kDa 글리코프로테인 성장 인자("GP88") 및 GP88의 발현 및 생물학적 활성에 영향을 미치는 조성물 및 방법에 관한 것이다. 본 발명은 암을 포함한 질병의 진단 및 치료용으로 유용한 키트 제품, 조성물 및 방법에 관한 것이다.

다세포 생명체에 있어서 세포의 증식과 분화는 고도로 조절적인 프로세스이다. 암세포의 현저한 특징은 이 프로세스에 대한 제어가 이루어지지 않아서; 증식 과 분화가 조절되지 않아 무절제한 성장이 초래된다는 것이다. 정상 세포와 종양 세포간의 이러한 차이점을 보다 잘 이해하기 위해 많은 연구노력이 행해져왔다. 이러한 연구 분야중 한가지는 성장인자, 보다 구체적으로는 자분비성 (autocrine)성장 촉진에 대한 것이다.

성장인자는 성장, 분화, 이동 및 유전자 발현과 관련한 메세지들을 세포에 전달하는 폴리펩타이드이다. 일반적으로, 성장인자는 한 세포에서 생산되어 다른 세포에 작용함으로써 증식을 촉진시킨다. 그러나, 어떠한 악성 세포들은 배양중에 자분비성 성장 메카니즘에 보다 많이 또는 절대적으로 의존하는 것으로 입증되었다. 이와 같은 자분비성 거동을 나타내는 악성 세포들은 다른 세포들에 의한 성장인자 생산 조절을 회피하므로 그의 성장이 조절되지 않게된다.

자분비성 성장 조절에 대한 연구는 세포성장 메카니즘에 대한 이해를 촉진시켜 암의 진단과 치료에 중대한 진전을 가능케해준다. 이러한 목적을 위해, 인슐린-유사 성장인자 ("IGF1" 및 "IGF2"), 가스트린-방출 펩타이드 ("GRP"), 형질전환 성장인자 알파 및 베타 ("TGF-a" 및 "TGF-b"), 및 상피세포 성장인자 ("EGF")를 비롯한 몇가지 성장인자들이 연구되어왔다.

본 발명은 최근 발견된 성장인자에 대한 것이다. 이 성장인자는 고도로 종양형성성인 (tumorigenic) "PC 세포", 즉 기형종 (teratoma) 유래의 지방생성 세포주 1246으로부터 분리된 인슐린-비의존성 변이체의 배양배지에서 최초로 발견되었다. 이하에서는 이 성장인자를 "GP88"이라 칭한다. GP88이 정제 및 구조적으로 특징화되었다. GP88의 아미노산 서열분석결과 GP88은 마우스 그래뉼린/에피쎌린 전구체와 유사한 아미노산 서열을 갖는 것으로 나타났다.

그래뉼린/에피쎌린 ("grn/epi")은 6kDa의 폴리펩타이드로서 이중 시스테인이 풍부한 폴리펩타이드의 신규한 패밀리에 속한다. 미국특허 제 5,416,192호 (Shoyab 등)는 6kDa 에피쎌린, 특히 에피쎌린 1과 에피쎌린 2에 관한 것이다. Shoyab에 따르면, 두가지 에피쎌린 모두 공통적인 63.5 kDa의 전구체에 의해 코딩되는데, 이 전구체는 합성되자마자 더 작은 형태로 프로세싱됨으로 해서, 생물학적 시료중에서 발견되는 자연적인 산물은 오직 6 kDa 형태라는 것이다. Shoyab 등은 에피쎌린 전구체가 생물학적을 불활성이라고 개시하고 있다.

Shoyab 등의 설명과 반대로, 본 발명자는 이 전구체가 합성되자마자 늘 프로세싱되는 것은 아니라는 것을 입증하였다. 본 발명자에 의해 부분적으로 수행된 연구에 따르면 이 전구체 (즉, GP88)은 실제로 N-링크된 탄수화물 부분이 20 kDa인 88 kDa 당단백질로서 분비되는 것으로 입증되었다. GP88의 N-말단 서열 분석 결과 GP88은 grn/epi 전구체의 아미노산 17에서 시작하는 것으로 나타났는데, 이는, 이 전구체 cDNA로부터 연역된 단백질 서열로부터의 최초의 17 아미노산이 막 국소화 또는 분비를 표적화하는데 적합한 시그널 펩타이드에 대응함을 입증하는 것이다. Shoyab 등의 교시와는 달리, GP88은 생물학적으로 활성적이며 성장 촉진 활성, 특히, 프로듀서 세포의 자분비성 성장인자로서 활성을 갖는다.

다세포 생물은 전신의 조직 내에서 세포의 증식과 파괴 간의 조심스러운 균형이 필요하다. 세포사멸, 또는 세포예정사, 는 손상된 세포 또는 정상 세포 조절 이외의 복제 세포가 급성 손상 및 괴사에 수반되는 조직파괴 및 염증 반응없이 제 거되는 조절된 절차이다.

최근 연구에서 세포사멸은 다양한 신호 (예를 들어, 호르몬, 혈청 성장인자 박탈, 화학요법제, 이온 방사 및 바이러스 감염)에 의하여 유도될 수 있는 대사 경로를 통하여 조절된다는 사실을 밝혔다. 예를 들어, 미국특허 제6586395 및 6570002호 참조. Bcl-2 유전자군은 많은 세포형의 세포사멸을 조절한다. Bcl-2의 일반적인 기능은 다양한 신호 (예를 들어, 조사, 고열, 성장인자제거, 클루코코르티코이드 및 다중 화학요법제) 에 반응하여 세포사멸을 억제하는 것이다. 그러므로, Bcl-2의 활성을 억제하면 세포사멸이 유도된다. Zhang 등, Clinical Cancer Research, 5: 2971-2977 (Oct. 1999). 예를 들어, 항에스트로겐 화합물 타목시펜은 유방암 세포 내에서 Bcl-2을 억제하여 세포사멸을 유도한다. 에스트로겐의 성장 촉진 억제와 더불어, 타목시펜은 유방암 세포주 및 임상 시료에서 세포예정사를 유도한다고 알려졌다. 타목시펜에 대한 반응으로 세포사멸을 하지 못하는 것을 타목시펜 저항성이라고 한다.

항에스트로겐 치료는 유방암 치료로 널리 사용된다. 타목시펜은 이러함 목적으로 사용되는 주된 치료제이다. 타목시펜의 활성은 전형적으로 에스트로겐 수용체 양성인 유방종양에서 관찰된다. 이는 에스트로겐은 이러한 형태의 종양의 주된 성장 자극제이다. 그러나, 장기간의 항호르몬 치료 후에, 유방암은 에스트로겐 민감성에서 비민감성으로 진행한다. 타목시펜 및 그 밖의 항에스트로겐 화합물에 의하여 사전에 성장이 억제된 유방암은 항에스트로겐 치료에 저항성을 갖게된다.

타목시펜에 의해 유도된 형태적 변화는 세포사멸에 의해 유도된 변화의 특징 이다. HER2에 의한 Bcl-2의 항진은 유방암 세포에서 타목시펜 유도 세포사멸을 억제한다. Kumar et al., Clin. Cancer Res. 1996 Jul. 2(7) : 1215-9. 그러므로, Bcl-2 농도의 변화는 세포사멸 유도를 위한 기작을 제공한다. 세포사멸 유도는 종양 세포의 제거, 축소, 파괴에 의하여 종양을 퇴화시킨다. Trauth etal., Science. 1989 Jul. 21; 245 (4915): 301-5. 항 세포사멸성 Bcl-2 유전자에 대한 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 투여하여 마우스 생체 내에서 종양 퇴화를 유도한다. Elez et al., Oncogene (2003) 22:69-80.

따라서, 새로운 세포사멸 유도 및 항에스트로겐 치료 및 세포독성 치료의 항암효과에 대한 민감성 회복 방법 및 조성물이 필요하게 되었다.

발명의 요약

본 발명자는 정상 세포에서는 정밀하게 조절되는 형식으로 발현되는 어떤 당단백질 (GP88)이, 정상 세포로부터 유래된 고도의 종양형성 세포에서는 과발현되어 조절되지 못한다는 것과, GP88이 종양형성 세포에 꼭 필요한 성장 자극제로서 작용한다는 것, 그리고 종양형성 세포에서의 GP88의 발현 또는 작용의 억제가 과형성 세포의 종양형성 특성의 억제로 이어진다는 것을 예기치 못하게 발견하였다.

본 발명의 구체적 실시상태에서, 항에스트로겐 및/또는 세포독성 화합물의 항암효과의 민감성은 GP88 대항제를 종양 세포에 투여함으로써 회복되었다. 그 밖의 실시상태에서, 상기 GP88 대항제는 항에스트로겐 또는 세포독성 (예컨대, 화학요법) 화합물과 함께 또는 순차적으로 투여될 수 있다. 종양 세포가 과다발현된 GP88은 성장이 자극되었으며, 타목시펜 및 그 밖의 항에스트로겐에 의한 치료에 대 한 저항성이 있다.

GP88 대항제를 종양 세포에 투여하면 (1) 타목시펜 및 그 밖의 항에스트로겐 (예컨대, 랄록시펜, 아로마타이즈 억제제) 및/또는 (2) 세포독성 또는 화학요법제 (예컨대, 알트레타민, 블레오마이신, 부술판, 칼슘 폴리네이트, 카페시타빈, 카보플라틴, 카무스틴, 클로람부실, 시스프라틴, 클라드리빈, 크리산타스페이즈, 시클로포스파미드, 시타라빈, 다카바진, 닥티노마이신, 다우노루비신, 도세탁셀, 독소로비신, 이피루비신, 이토포사이드, 플루다라빈, 플루오로우라실, 겜시타빈, 하이드록시우레아, 이다루비신, 이포스파미드, 이리노테칸, 리포소말 독소루비신, 루무스틴, 멜파란, 머캅토퓨린, 메토트렉사에이트, 미토마이신, 미토산트론, 옥살리플라틴, 파크리탁셀, 펜토스타틴, 프로카바진, 랄티트렉스드, 스트렙토조신, 테가퍼우라실, 테모졸로미드, 티오테파, 티오구아닌/티오구아닌, 토포테칸, 트레오설판, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 빈데신 및 비노랠빈) 및 이들의 조합에 대한 민감성을 회복시킨다. GP88 대항제는 항에스트로겐 및/또는 세포독성 화합물의 투여 전 또는 후에 투여되어 항에스트로겐 및/또는 세포독성 화합물의 민감성을 회복시킬 수도 있다.

본 발명은 GP88 대항제를 종양 세포에 투여하여 세포사멸을 유도하는 방법 및 조성물을 제공한다. 세포사멸 유도는 예를 들어, Bcl-2 단백질 또는 mRNA의 농도, 세포의 PARP (폴리(ADP 리보오스)폴리머라아제)분해 능력을 측정, 또는 외관 또는 종양 세포 또는 세포의 부피를 평가하여 결정될 수 있다.

본 발명은 또한 GP88의 발현 또는 활성을 억제할 수 있는 GP88 대항 조성물 , 포유류 혈액암, 척수, 혈청, 플라스마, 전립선, 방광, 비강인두, 머리 및 목, 자궁경부, 신경 조직, 갑상선, 췌장, 뇨, 유두함몰, 간, 신장, 유방, 골, 골수, 고환, 뇌, 신경, 난소, 피부 및 폐의 암과 같은, 그러나 이에 한정되지 않는, GP88 양 또는 활성 결함에 관련된 질병의 치료 방법, GP88의 활성 및 발현 결함에 관한 질병에 대한 대상자의 감수성을 측정하는 방법, GP88 대항 치료에 대한 감수성을 측정하는 방법, GP88 및 세포의 발암 활성의 생체 내/외 검출용 방법, 시약 및 키트를 제공한다 .

본 발명의 추가의 목적 및 이점은 이하의 상세한 설명에서 부분적으로 설명될 것이며, 일부는 설명에 의하여 명백할 것이며 본 발명의 실시예 의하여 알게될 것이다.

본 발명은 세포가 GP88 발현 또는 GP88에 대한 반응이 변화되는 유방암과 같은 질명의 진단 및 치료용 조성물 및 방법을 제공한다. 본 명세서에서 "변화된 발현"이라는 용어는 주변세포 또는 정상세포에 비하여 mRNA 또는 단백질의 농도를 기준으로 적어도 2배, 때로는 10 배 이상 GP88의 증가된 발현 또는 과다 발현을 의미한다. 상기 용어 "변화된 발현"은 미조절된 또는 필요한 항진없는 발현을 의미한다. GP88에 대한 증가된 또는 변화된 "반응"은 GP88의 변화된 발현과 같은 동일 또는 동등한 상태의 결과로서 어떠한 생물학적 기능이 증가된 상태를 의미한다 (예컨대, 성장, 분화, 바이러스 감염).

본 명세서에서 "GP88" 또는 "PCDGF"라는 용어는 세포추출물 및 세포외 유체 내의 에피셀린/그라뉼린 전구체 (프로그라뉼린)를 의미하며, 도 1 내지 3에 포함되 는 마우스 및 인간 기원 아미노산 서열에 의한 GP88 및 다른 종의 GP88을 포함하도록 의도되었다. 추가로, 이 용어는 또한 글리토단백질 또는 그 밖의 개질 구조를 지닌 카르복실레이트 부분과 같은 추가 성분을 지닌 이들의 기능성 유도체를 포함하기도 한다.

GP88 또는 PCDGF라는 용어는 상기 서열 내의 적어도 10개의 아미노산을 지니는 폴리펩타이드 단편을 포함한다. 이 길이의 서열은 항원으로 유용하며 전체 단백질의 다양한 에피토프에 대한 특이적 항체의 담체를 지닌 면역 접합체의 제조용으로 유용하다. 이러한 폴리펩타이드는 이러한 항체의 선별에 유용하며, 생물학적 유체 내에서 GP88 검출에관한 방법에 유용하다. 펩티드는 거대 단백질에 대한 항체의 생성에 유용하다는 사실이 업계에 잘 알려져 있다. 본 발명의 실시 상태에서, 12 내지 19개의 아미노산 길이의 펩티드는 GP88 전장을 인식하기 위한 항체 발달에 사용되어 왔다.

본 발명의 상기 폴리펩타이드는 다른 분자와 공유 또는 비공유 결합하여 존재할 수 있다. 예를 들어, 이는 하나 이상의 다른 폴리펩타이드가 하나 이상의 펩티드 결합, 예컨대 글루타티온트랜스퍼라아제, 폴리히스티딘, 또는 myc 태그 등에 의하여 결합될 수 있다.

상기 폴리펩타이드는 항원 구별 결정소 또는 GP88 또는 이들의 기능성 유도체에 대한 항원 생산 또는 시험을 위한 면역원으로 사용되는 에피토프를 포함할 정도로 충분히 크다.

실시상태에는 실질적으로 여타의 포유류 펩티드가 없는 폴리펩티드를 포함한 다. 본 발명의 GP88은 세포, 조직 또는 생물학적 유체로 부터 생화학적 또는 면역화학적으로 정제되었다. 대안적으로, 상기 폴리펩타이드는 원핵 또는 진핵 발현 시스템 및 숙주 세포 내에서 재조합 수단에 의해서 생산할 수 있다.

"실질적으로 포유류 폴리펩타이드가 없는"이라는 것은 필요하다면, 폴리펩타이드가 원핵 또는 비포유류 또는 포유류 진핵 생물 내에서 합성될 수 있다는 사실을 반영한다. 대안적으로, 고체상 지지체에서 화학 합성하고, 이 지지체로부터 분리하여 소망하는 폴리펩타이드를 합성하는 방법이 업계에 잘 알려져 있다. 대안적으로, 상기 단백질은 천연이기 때문에 다른 포유류 폴리펩티드에 대하여 적어도 90% 또는 심지어 99% 까지 순수하여 실질적으로 이들이 부재하는 포유류 유체 또는 조직으로부터 정제될 수 있다. 이는 조직 추출물 또는 유체를 단백질에 대한 항체 반응을 하는 면역흡착제와 같은 표준 단백질 정제함으로써 달성된다. 본 발명의 구체적 실시상태에서는 천연 GP88 및 바큘로바이러스에 감염된 곤충 세포 및 포유류 세포에서 발현되는 제조합 GP88의 정제 방법을 설명한다. 대안적으로, 이러한 조직 또는 유체의 정제는 알려진 방법의 조합에 의하여 달성된다.

천연 정제 또는 재조합 글리코단백질 또는 폴리펩타이드의 대안으로써, "GP88"는 기능성 유도체를 포함하는 것을 의미한다. 기능성 유도체는 아래에 정의된 단백질 또는 글리코단백질의 "단편," "변이체," "유사체," 또는 "화학적 유도체"를 의미한다. A 기능성 유도체에는 적어도 본 발명의 기능을 하는 GP88 전장 기능의 부분을 포함한다.

GP88의 "단편"이라 함은 보다 이 분자의 서브세트로서 GP88의 발암 특성을 보유하는 보다 짧은 펩타이드를 지칭하는 것이다. 이것은 예컨대 마우스 GP88의 경우 K19T와 S14R, 사람의 GP88의 경우 E19V와 A14R (각각 K19T와 S14R에 해당)과 같은 대역에 대응하나 이에 한정되는 것은 아니다.

GP88의 "변이체 (variant)"라 함은 그의 전체 펩타이드나 또는 단편과 실질적으로 유사한 분자를 가리킨다. 변이 펩타이드는 이 기술분야의 공지방법을 이용하여 변이 펩타이드의 직접 화학합성법으로 만들 수 있다.

또는, 합성된 단백질 또는 펩타이드를 코딩하는 DNA를 변형시킴으로써 이 펩타이드의 아미노산 서열 변이체들을 만들수도 있다. 이러한 변이체로는 예컨대, GP88의 아미노산 서열 중에서 잔기를 결실, 삽입, 또는 치환하는 것을 포함한다. 최종 구조물이 소망하는 활성을 갖기만 한다면, 최종 구조물을 얻기 위해 결실, 삽입 및 치환을 어떠한 조합으로든 행할 수 있다. 변이 펩타이드를 코딩하는 DNA에서 행해질 돌연변이는 리딩 프레임을 변경해서는 아니되며 바람직하게는 2차 mRNA 구조를 생성할 수 있는 상보적인 대역을 만들지 않는 것이 좋다. 유전자 수준에서 이들 변이체들은 이 펩타이드를 코딩하는 DNA중의 뉴클레오타이드의 위치 지향적인 (site directed) 돌연변이 (8)에 의해 만들어지기 때문에, 변이체를 코딩하는 DNA를 생산한 후, 재조합 세포 배양체 중에서 그 DNA를 발현시킨다. 이러한 변이체는 대체로 비변이 펩타이드와 동일한 품질의 생물학적 활성을 나타낸다.

GP88 단백질의 "유사체 (analog)"라 함은 GP88 분자 전체 또는 그 단편과 실질적으로 유사한 비-자연적인 분자를 가리킨다.

"화학적 유도체"에는 일반적으로 펩티드 또는 단백질의 부분이 아닌 추가의 화학적 부분을 포함한다. 펩티드의 공유성 개질이 본 발명의 범위에 포함된다. 이러한 개질은 펩티드의 표적 아미노산 잔기와 선택된 측쇄 또는 종결 아미노산 잔기와 결합할 수 있는 유기 유도제를 반응시켜 분자에 도입될 수 있다. 가장 일반적인 유도된 잔기는 시스테이닐, 히스티딜, 라이시닐, 아르기닐, 티로시닐, 글루타미닐, 아스파라기닐 및 아미노 종결 잔기이다. 프롤린 및 라이신의 하이드록실화, 세릴 및 트레오닐 잔기의 하이드록실기의 인산화, 라이신, 히스티딘 및 히스티딘 측쇄의 알파-아미노기의 메틸화, N-말단의 아민의 아세틸화 및 C-말단 카르복실기의 아미드화. 이러한 유도된 부분은 용해도, 흡광도, 생물학적 반감기 등을 향상시켰다. 상기 부분은 또한 단백질의 바람직스럽지 않은 부작용을 제거 또는 감경시킨다. 추가로, 2 작용기제의 유도화는 수용성 지지체 매트릭스 또는 거대분자 담체에 펩티드를 가교결합시키는데 유용하다. 일반적으로 사용되는 가교결합제에는 글루타르알데히드, N-하이드록시석신이미드 에스테르, 동종2작용기 이미도에스테르, 1,1-비스 (-디아졸로아세틸)-2-페닐에탄 및 2작용기 말레이미드를 포함한다. 유도제, 예컨대, 메틸-3-[9p-아지도페닐)] 디티오프로피오이미데이트는 빛이 존재하는 경우 가교결합을 형성할 수 있는 광활성 중간체를 생서한다. 대안적으로, 반응성 수용성 매트릭스, 예컨대, 시아노겐 브로마이드 활성화 카보하이드레이트 및 미국 특허 3,969,287 및 3,691,016에 설명된 반응 기질은 단백질 고정에 사용되었다.

본 명세서의 GP88 대항제 또는 GP88 "대항제"라는 용어는 GP88의 발현, 생산, 분비를 억제 또는 방해하는 조성물을 의미한다. 또는 GP88의 생물학적 활성을 억제 또는 방해하는 조성물을 의미한다. 이는 다음의 반응에 의하여 달성되나 이에 한정되지 않는다:

(A) GP88 대항제에는 GP88 발현 또는 생산을 억제하는 다음의 모든 시약 또는 분자를 포함하나 이에 한정되지 않는다: (1) GP88 번역을 억제하여 GP88 발현을 억제하는 안티센스 GP88 DNA 또는 RNA 분자; (2) GP88 발현을 억제하는 작은 억제 또는 "siRNA" (3) GP88 mRNA 및/또는 단백질 발현을 전사, 번역 또는 전사후 수준에서 억제하는 시약(호르몬, 성장 인자, 작은 분자); (4) GP88 분비를 억제하는 인자 시약 또는 호르몬.

(B) GP88 대항제에는 GP88 작용 또는 생물학적 활성을 억제하는 모든 시약 또는 분자를 포함하나 이에 한정되지 않는다: (1) 단백질에 결합시켜 생물학적 활성을 발휘하지 못하게 하는 중성화 GP88 항체; (2) GP88가 이들의 수용체에 결합하지 못하게 하여 생물학적 활성을 발휘하지 못하게 하는 GP88 수용체의 항체; (3) 이들의 수용체에 결합하는 GP88의 경쟁적 억제제; (4) 작은 분자 대항제; 및 (5) GP88 신호 경로의 억제제.

본 발명의 구체적 실시상태에서, GP88 대항제는 GP88에 대한 안티센스 올리고뉴클레오타이드이다. 상기 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 GP88 단백질의 번역을 억제함으로써 GP88의 발현을 억제하는 것이 좋다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 DNA 또는 RNA로부터 형성되는 것이 좋다. 또 다른 실시상태에서는, 상기 GP88 대항제는 작은 억제 RNA 분자 (siRNA 또는 RNAi)이다. siRNA는 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있는 이중가닥 RNA 분자이다.

GP88 대항제는 GP88 발현을 억제하는 작은 분자(예컨대, 시약, 인자 또는 호 르몬)를 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 실시상태에서는 작은 분자 that (1) inhibit GP88 전사 후 개질 및 이들의 분비를 억제, (2) GP88 세포 표면 수용체와 결합하여 경쟁하여 GP88 활성을 억제, (3) GP88 신호전달 경로 (예컨대, GP88와 세표 표면 상의 수용체의 결합에 의하여 유도되는 생화학적 상호작용)를 억제, 또는 (4) GP88 수용체의 방해 또는 억제. 작은 분자는 GP88, GP88 세포 표면 수용체, 또는 다른 분자 상의 특정 활성 부위에 결합하기 위하여 합성되었다. 작은 분자는 천연원에서 유도될 수 있으며, 결합 및/또는 GP88, GP88 세포 표면 수용체, 또는 그 밖의 분자를 억제하도록 변형되었다.

본 발명의 항체는 (중성화 및 여타의 것) 유방암, 그 밖의 암 또는 GP88 발현이 증가되는 세포 질환 (예컨대, 신경모세포종, 아교모세포종, 별아교세포종, 육종 및 전립선, 혈액, 척수, 간, 신장, 유방, 머리 및 목, 인후, 갑상선, 췌장, 위, 결장, 직장결장, 자궁, 자궁경부, 뼈, 골수, 고환, 뇌, 신경조직, 난소, 피부 및 폐의 암)의 치료에 유용하다. "중화"라는 용어는 GP88의 정상적인 생물학적 활성을 억제 또는 차단하는 능력이 있는 항체를 의미하며, 실험 동물 또는 인간에서 GP88의 세포 증식 자극 또는 종양 성장 유고 능력을 포함한다. An effective amount of 항-GP88 항체의 유효량은 다양한 경로를 통하여 인간을 포함하는 동물에 투여된다. 대안적인 실시상태에서는, 상기 항-GP88 항체는 암(예컨대, 유방암) 등의 질병에서 일어나는 GP88 발현의 변화(증가)를 나타내는 세포의 검출 및 GP88 대항 치료에 반응하여 성장이 GP88에 의존적인 질환 세포를 확인하기위한 진단에 사용된다. 또 다른 실시상태에서는, 항-GP88 항체가 세포독성 인자 또는 안티센스 올리고뉴클레오 타이드 등의 화합물을 GP88를 발현 또는 반응하는 세포에 전달하는데 사용된다. 상기 세포독성인자는 항-GP88 항체에 결합, 연결 또는 연합될 수 있다.

본 발명의 안티센스 올리고뉴글레오티드는 또한 GP88의 발현 증가를 나타내는 세포의 암 치료제로서 사용된다. 유효량의 안티센스 올리고뉴클레오티드가 여러가지 경로를 통하여 사람을 비롯한 동물에 투여된다.

본 발명의 하나의 실시 상태에 있어서, GP88 대항제는 종양 세포의 개시 및/또는 진행을 억제 또는 방지하는데 사용된다. 예컨대 GP88 대항제는 흉부 암, 기타 암 또는 GP88의 발현 증가를 나타내는 세포에서의 기타 질환(예, 신경모세포종, 아교모세포종, 별아교세포종, 육종 및 전립샘, 혈액, 뇌척수액, 간, 신장, 흉부, 머리 및 목, 인두, 갑상샘, 이자, 위, 결장, 직장결장, 자궁, 자궁경부, 뼈, 골수, 고환, 뇌, 신경조직, 난소, 피부 및 폐의 암)의 발생 및 재발을 방지하는데 사용될 수 있다. GP88 대항제는 또한 GP88을 과다발현하는 종양 세포에 정상 표현형을 회복시키는데 사용될 수 있다. 본 발명은 또한 세포에 GP88 대항제를 투여하는 것을 포함하는 종양 세포에서 아포프토시스(apoptosis)를 유도하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 아포프토시스를 유도하는데 어떤 GP88 대항제라도 사용될 수 있다(예컨대, GP88 항체 또는 항체 조각, GP88 안티센스 핵산, 항-GP88 siRNA, 항-GP88 소분자 또는 항-GP88 수용자 항체). 하나의 실시 상태에 있어서, GP88 대항제를 투여한 후, 아포프토시스를 진행하는 종양 세포는 종양 세포 중 아포프토틱 메이커(apoptotic maker)의 농도(level)를 측정함으로써 정량화된다. 예컨대, Bcl-2의 농도 증가는 아포프토시스의 억제를 지시한다. 종양 세포의 아포프토틱 상태는 또한 종양 세포 중에서 PARP가 그것의 85kDa 조각으로 분해하는 것을 측정하여 결정될 수 있다. 아포프토시스는 제한되지는 않지만 신경모세포종, 아교모세포종, 별아교세포종, 육종 및 전립샘, 혈액, 뇌척수액, 간, 신장, 흉부, 머리 및 목, 인두, 갑상샘, 이자, 위, 결장, 직장결장, 자궁, 자궁경부, 뼈, 골수, 고환, 뇌, 신경조직, 난소, 피부 및 폐의 암을 비롯한 모든 형태의 종양 세포에서 유도될 수 있다.

GP88 대항제와 항에스트로겐약을 함께 투여하는 것을 포함하는 종양에서 아포프토시스를 유도하는 방법이 또한 제공된다. 하나의 실시 상태에 있어서, 상기 항에스트로겐약은 타목시펜, 아로마타제 억제제(예, Arimidex®, Femera®) 및 에스트로겐-수용자 하향조절제(예, Faslodex®)로 이루어진 군으로부터 선택된다.

본 발명은 제1 생물 시료에서 GP88 단백질 농도를 측정하고, 제2 생물 시료에서 GP88 단백질 농도를 측정하고, 제2 생물 시료에서의 GP88 단백질의 측정 농도가 제1 생물 시료에서의 GP88 단백질의 측정 농도보다 낮은지를 세포가 아포프토시스를 진행한다는 것을 지시하기에 충분한 양에 의하여 결정하는 것을 포함하는 세포가 아포프토시스를 진행하는지를 결정하는 방법을 제공한다. 그러한 생물 시료들은 제한되지는 않지만, 전립샘, 혈액, 방광, 뇌척수액, 혈정, 혈장, 오줌, 유두 흡인물, 갑상샘, 머리 및 목, 자궁경부, 간, 신장, 흉부, 이자, 위, 결장, 코인두, 직장결장, 자궁, 뼈, 골수, 고환, 뇌, 신경조직, 난소, 피부 및 폐 조직을 비롯한 유체 및/또는 조직으로부터 유래할 수 있다.

본 발명은 또한 GP88 대항제를 항-GP88 항체 또는 항-GP88 수용자 항체에 접합시킴(conjugating)으로써 질환 위치에 GP88 대항제를 표적화하는 방법을 제공한 다.

이 명세서에 포함되어 일부를 구성하는 다음의 도면들은 본 발명의 실시 상태를 예시하고, 발명의 상세한 설명과 함께 본 발명의 원리를 설명하는데 이용된다.

다음에 제시되는 바람직한 구체예를 참고로 더욱 상세히 설명하며, 이들은 다음의 실시예와 함께 본 발명의 기본개념을 이해하는데 도움이 될 것이다.

GP88 의 생물학적 활성

본 발명은 GP88의 변형된 (증가된) 발현과 연관된 질병을 치료 및 진단하는데 유용한 항종양 및 항바이러스성 조성물과 GP88에 관한 것이다. 그 밖에, 본 발명은 GP88에 대한 응답성 증가와 연관이 있는 질병들을 치료 및 진단하는데 이용될 수 있다. 본 발명의 바람직한 구체예에 있어서, GP88 길항제 (예컨대, 항체, 안티센스, siRNA, 소분자)를 항에스트로겐 요법의 항종양형성 효과에 대한 감수성을 회복시키는 데에 및 세포 사멸을 유도하는 데에 사용할 수 있다.

항- GP88 항체

본 발명은 GP88에 대한 증가된 응답과 연관된 질병의 치료 및 진단을 포함하는 GP88의 증가된 발현과 연관된 질병을 치료 및 진단하기 위한 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물들은 GP88의 생물학적 활성을 무력화시키는 항-GP88 항체를 포함한다.

본 발명은 또한 GP88 에피토프에 특이적인 항체 및 세포, 세포나 조직 추출물, 배양배지 또는 생물학적 체액 중에서 GP88 분자, 그의 기능적 유도체 또는 상이한 동물종으로부터의 동족체의 존재여부를 검색하거나 또는 존재할 경우 그 양이나 농도를 측정하는데 있어서 이러한 항체의 용도에 관한 것이다. 뿐만 아니라, 항체를 이용하여 특정 부위에 대한 세포독성 분자를 표적화할 수 있다.

항체 개발을 위한 항원으로서의 용도를 위해, 재조합 형태 또는 그의 기능적 유도체 형태로 생산 또는 발현된, 바람직하게는 9개 이상의 아미노산을 갖는 GP88 단백질을 얻어서 폴리클로날 또는 모노클로날 항체 생산을 위해 동물을 면역하는데 이용하였다. 항체와 분자는 만약 그 항체가 그 분자와 반응하여서 그 분자가 항체에 결합할 수 있다면 그 분자에 결합할 수 있다고 말할 수 있다. 그 특이 반응은 항원이 그의 대응하는 항체와는 고도로 선택적인 방식으로 반응하나, 다른 항원에 의해 야기될 수 있는 다른 여러가지 항체와는 반응하지 않으리라는 것을 의미한다.

본 명세서에서 항체라는 용어는 인간 및 비-인간 폴리클로날 항체, 인간 및 비-인간 모노클로날 항체 (mAbs), 키메라 항체, 항-이디오타잎 항체 (항-IdAb), 및 인간화 항체를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 폴리클로날 항체들은 계란으로부터 또는 항원으로 면역화된 동물들의 혈청으로부터 유도된 항체 분자의 이종 집단이다. 모노클로날 항체 ("mAbs")는 특정 항원에 대한 실질적으로 동종 (homogeneous) 항체들의 집단이다. mAbs는 이 기술분야의 당업자에게 잘 알려진 방법 (예컨대 미국특허 제 4,376,110호)에 의해 얻어질 수 있다. 이러한 항체들은 IgG, IgM, IgE, IgA, IgD 및 그의 여하한 서브클래스를 비롯한 면역학적 클래스에 속하는 것일 수 있다. GP88에 대한 인간 및 비-인간 항체를 생산하는 하이브리도마는 in vitro 또는 in vivo에서 배양될 수 있다. mAbs를 대량생산하기 위해서는, in vivo에서 생산하는 것이 현재로서 바람직한 방법이다. 간단히 설명하면, 각각의 하이브리도마로부터의 세포들을 프리스탄 프라임시킨 Balb/c 마우스 또는 누드 마우스에게 복강주사하여 상술한 mAbs를 고농도로 함유하는 복수액을 얻는다. mAbs는 당업자들에게 잘 알려진 표준 크로마토그래피법을 이용하여 배양상등액이나 상기한 복수액으로부터 정제시킬 수 있다.

인간의 GP88에 대한 인간 모노클로날 항체는 인간 면역글로불린 유전자를 발현하는 트랜스제닉 마우스를 면역화시킴으로써 제조할 수 있다. 이러한 트랜스제닉 동물들로부터의 임파구를 이용하여 생산된 하이브리도마는 마우스 면역글로불린 대신 인간의 면역글로불린을 생산할 것이다.

대부분의 모노클로날 항체들이 쥐와 다른 비-인간 생물로부터 유래하기 때문에, 인간에 투여된 설치류 mAbs의 면역원성, 이펙터 기능의 저조한 소집력 및 혈청으로부터의 급속한 소실로 인해, 이들의 임상적 효과가 제한될 수 있다. 이러한 문제점을 피하기 위해, 쥐의 항체의 항원-결합 특성을 인간화 (humanization)이라는 프로세스를 통해 인간 항체에 부여할 수 있다. 인간화 항체는 인간 항체 구조내로 이식된 부모쥐의 mAb의 6개의 상보성-결정 대역 (CDRs: complementarity-determining regions)에 대한 아미노산 서열을 함유한다. 인간화 항체 중의 낮은 비-인간 서열 함량 (약 5%)은 인간에 있어서 혈청 반감기를 연장시키고 면역원성을 감소시키는데 있어 모두 효과적인 것으로 입증되었다. 모노클로날 항체의 인간화를 위해 일가 (monovalent) 파지 디스플레이와 복합적 라이브러리 전략을 이용하는 방법들은 이제 여러가지 항체를 인간화하는데 광범하게 적용되며 당업자들에게 잘 알려져 있다. 상술한 바와 같이 트랜스제닉 동물들을 이용하여 개발된 이들 인간화 항체들과 인간 항체들은 암을 비롯한 (그러나 암에 국한되지 않음) 여러가지 질병의 치료제로서 매우 유용하다.

당업자에게 잘 알려진 도트 블롯과 표준 면역분석법 (EIA 또는 ELISA)을 비롯한 몇가지 면역분석법에 의해, GP88에 특이적인 항체 존재 하에 하이브리도마 상등액과 혈청을 스크리닝한다. 일단 상등액이 목적하는 항체를 갖는 것으로 확인되면, 항체가 결합하는 항원의 크기를 동정하기 위해 웨스턴 블롯법으로 더욱 스크리닝한다. 당업자라면 목적하는 폴리클로날 항체 또는 mAb를 얻기 위해 과도한 실험을 하지 않고도 이러한 하이브리도마를 제조 및 스크리닝하는 방법을 알 것이다.

키메라 항체들은 여러가지 동물종으로부터 유래된 다양한 부분을 갖는다. 예컨대, 키메라 항체는 쥐의 mAb로부터 다양한 영역과 면역글로불린 불변부를 가질 수 있다. 키메라 항체와 그의 제조방법 역시 당업자에게 잘 알려져 있다.

따라서, GP88에 대해 생산된 mAbs는 적절한 동물에서 인간 및 비-인간 항-IdAbs를 유도하는데 이용될 수 있다. 이러한 면역화 마우스로부터의 비장 세포들을 이용하여 인간 또는 비-인간 항-Id mAbs를 분비하는 하이브리도마를 생산할 수 있다. 또한, 항-Id mAbs는 키홀 림펫 헤모시아닌 (KLH: Keyhole Limpet Hemocyanin)이나 소의 혈청 알부민 (BSA: bovine serum albumin)과 같은 캐리어에 커플링되어 부가적인 마우스를 면역하는데 이용될 수 있다. 이러한 마우스들로부터 얻어진 혈청은 GP88 폴리펩타이드 에피토프에 특이적인 본래의 mAb의 결합 특성을 갖는 인간 또는 비-인간 항-항-IdAb를 함유할 것이다. 따라서, 항-Id mAbs는 그 자신의 고유한 이디오타잎 에피토프나, 평가되는 에피토프와 구조적으로 유사한 이디오타잎을 갖는다.

항체라는 용어는 완전한 항체 전체 뿐만 아니라 항원에 결합할 수 있는 그의 단편, 예컨대, Fab 및 F(ab')2도 포함한다. Fab와 F(ab')2 단편은 본래 항체의 Fc 단편이 결여되어 있으며, 순환시 보다 빨리 소실되고 완전한 항체에 비해 덜 비-특이적인 조직 결합성을 가질 수 있다. 이러한 단편들은 일반적으로 파파인 (Fab 단편 제조를 위해)과 펩신 (F(ab')2 단편 제조를 위해)과 같은 효소들을 이용하여 단백질분해 절단법에 의해 생산된다. 본 발명에서 유용한 Fab 와 F(ab')2 및 항체의 기타 단편들도, 완전한 항체 분자에 대해 설명된 방법에 따라, GP88의 검출이나 정량, 및 GP88 발현과 관련된 질병 상태의 치료에 이용될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.

본 발명에 따라, in vitro에서 GP88 활성을 무력화시키는 항체들을 이용하여 in vivo 에서 GP88 활성을 무력화시킴으로써, 증가된 GP88 발현 또는 GP88에 대한 증가된 응답성과 연관된 질병을 치료할 수 있다. 증가된 GP88 발현과 연관이 있는 질병을 앓고 있는 대상자, 바람직하게는 인간 대상자를 GP88에 대한 항체로 치료한다. 이러한 치료는 다른 항=암 또는 항-바이러스 요법과 연합적으로 수행될 수 있다. 전형적인 치료법은 GP88에 특이적인 항체의 유효량을 1주 또는 수주일간 한달 내지 6개월간 투여하는 것이다. 본 발명의 항체는 그의 의도된 목적을 달성케하는 어떠한 수단으로는 투여될 수 있다. 예컨대, 피하, 정맥내, 피내, 근육내, 복강내 및 경구투여와 같은 다양한 경로로 투여될 수 있으며 상기 투여경로로 한정되는 것은 아니다. 비경구 투여는 볼러스 주입 또는 점진적인 관류에 의해 수행될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제로는 멸균수용액 또는 비수성용액, 현탁액 및 유제가 포함되며 이들은 기술분야에 알려진 보조제 또는 부형제를 함유할 수 있다. 타블렛 및 캡슐과 같은 약학적 조성물 역시 상법에 따라 제조될 수 있다. GP88 안타고니스트는 제약학적으로 허용 가능한 적당한 담체 (예컨대, 정제, 알약, 주사, 주입, 흡입, 경피 패치 및 좌약) 내에 제제화될 수 있다. 투여량은 대상자의 연령, 성별 및 체중, 병용 요법 (있다면)의 종류, 치료빈도 및 소망하는 효과의 특성에 따라 달라질 것이다. 아래에 제공되는 유효량 범위는 본 발명을 한정하려는 의도가 아니라 단지 바람직한 투여범위를 제시하려는 의도일 뿐이다. 그러나, 가장 바람직한 투여량 범위는 당업자가 잘 이해하고 결정할 수 있듯이 각 대상자마다 적당히 맞추는 것이 좋다. 각각의 치료시 요구되는 총 투여량은 복수 투여 또는 단일 투여에 의해 투여될 수 있다. 항체 유효량은 약 0.01 μg 내지 약 100 mg/kg 체중이며 바람직하게는 약 10 μg 내지 약 50 mg/kg인 것이 좋다. 항체는 단독으로 투여되거나 또는 동일 질병 치료를 위핸 다른 요법과 병용하여 투여될 수도 있다.

본 발명에 따라 그리고 무력화 항체와 관련하여, GP88의 생물학적 활성을 억제할 필요가 있는 모든 치료분야, 심지어는 GP88 세포 표면 수용체의 과발현이 있고 그로 인해 그의 생물학적 활성이 증가된 경우, 또는 GP88 시그널링 경로나 수용체의 변경으로 인해 시그널링 경로가 항상 "턴온(turned on)" 상태인 경우를 비롯하여, GP88 발현에 반드시 변화가 있는 것이 아닌 경우에조차 GP88 무력화 항체를 사용할 수 있다. 성장인자 및 성장인자 수용체에 대한 무력화 항체들이, 그의 증식이 이들 성장인자에 의존성인 세포들의 성장을 억제하는데 성공적으로 이용되어왔다. 이것은 인간 유방암종 세포에서의 IFG-I 수용체와 폐암에서의 봄베신의 경우가 그렇다. GP88에 대한 항체는 또한 톡신, 온코톡신, 미토톡신, 및 면역독신과 같은 세포독성 시약, 또는 안티센스 올리고뉴클레오타이드와 같은 화합물 (그러나 이에 국한되지 않음)을 전달하여, GP88를 발현하거나 이에 응답하는 세포들로 이들을 특이적으로 표적화시키는데도 이용될 수 있다.

항원으로 하여금 GP88에 대한 무력화 항체를 발달시킬 수 있는 항 대역은 마우스 GP88에서는 K19T, 인간 GP88에서는 E19V라 정의된 19개짜리 아미노산 대역으로서, 이것은 에피쎌린/그래뉼린 6 kDa 반복체사이에 위치하는 것이 아니라, 이들 반복체 사이, 구체적으로는 가변부로 여겨지는 그래뉼린 A (에피쎌린 1)과 그래뉼린 C 사이에 위치한다 (도 3 참조). 어떠한 특정 이론에 구애됨이 없이, GP88의 생물학적 활성에 중요한 역할을 하는 대역은 에피쎌린 반복체 외부에 있는 것으로 믿어진다.

본 발명에서 유용한 항체 또는 항체 단편은 GP88 단백질을 발현하는 세포의 존재여부를 정량적으로 또는 정성적으로 검출하는데 이용될 수도 있다. 이것은 형광 현미경, 형광 사이토메터, 또는 형광 검출을 이용하여 형광적으로 항체를 표지시키는 면역형광기술 (후술됨)에 의해 달성될 수 있다. 본 발명의 항체들과 폴리펩타이드의 반응은 기술분야에 잘 알려진 면역분석법으로 검출될 수 있을 것이다.

본 발명의 항체들은 광현미경, 면역형광 또는 면역전자 현미경과 함께, 조직 시료, 생검재료 및 생물학적 유체 중 GP88을 in situ 검출하는데 조직학적으로 이용될 수 있다. in situ 검출은 환자로부터 조직학적 표본을 떼어내서 적절히 표지시킨 본 발명의 항체를 적용함으로써 달성될 수 있다. 항체 (또는 단편)은 생물학적 시료에 대해 표지된 항체 (또는 단편)을 적용 또는 오버레이시킴으로써 제공되는 것이 바람직하다. 이러한 절차를 이용함으로써, GP88 단백질의 존재여부를 검출할 수 있을 뿐만 아니라, 시험 조직 중에서의 그의 분포상황 또는 생물학적 유체 내의 농도 역시 파악할 수 있다. 본 발명을 이용함으로써, 당업자들은 in situ 에서의 상기한 성과를 위해 다양한 조직학적 방법 (예컨대 염색법)을 변형사용할 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.

GP88에 대한 분석은 일반적으로 갓 수확된 생물학적 체액, 조직 추출물과 같은 생물학적 시료가나, 배양된 세포 또는 그들의 배양배지를 GP88 단백질을 검색하고 항체를 검출할 수 있는, 검출가능하게 표지된 항체 존재 하에 당업자에게 잘 알려진 기술에 의해 인큐베이팅시키는 것을 포함하여 이루어진다.

생물학적 시료는 니트로셀룰로스나 세포 똔느 세포 입자나 가용성 단백질을 고정시킬 수 있는 다른 고체 지지체와 같은 고상 지지체 또는 담체를 이용하여 처리될 수 있다. 이이서 지지체를 세정한 후 검출가능하게 표지된 항-GP88 항체를 이용하여 처리한다. 그 후 미결합 항체를 제거하기 위해 지지체를 씻어낸다. 상기 지지체 상에 결합된 라벨의 양을 상법에 따라 측정할 수 있다. 고상 지지체의 경우 유리, 폴리스티렌 폴리프로필렌, 나일론, 개질 셀룰로스, 또는 폴리아크릴아미드와 같은 항원이나 항체 결합가능한 여하한 지지체일 수 있다.

공지 방법에 따라, GP88 단백질에 대한 주어진 로트 항체의 결합 활성을 측정할 수 있다. 당업자라면 통상적인 실험을 이용함으로써 매 측정시마다 작동가능한 최적의 분석 조건을 결정할 수 있을 것이다.

GP88 단백질 또는 그의 기능적 유도체 및 그 단백질에 대한 특이적인 항체의 검출은 효소결합 면역분석법 (EIA: enzyme linked immunoassays) 또는 방사능면역분석법 (RIA: radioimmunoassays)와 같은 기술분야에 잘 알려진 다양한 면역분석법에 의해 달성될 수 있다. 이러한 분석법은 기술분야에 잘 알려져 있으며 당업자라면 본 발명의 항-GP88 항체와 GP88 단백질을 이용하여 이러한 분석법을 어떻게 수행할지를 쉽게 알 수 있을 것이다.

이러한 면역분석법은 혈청이나 다른 생물학적 시료, 예컨대 조직, 세포, 세포 추출물 또는 생검재료 중에서 GP88 단백질을 검출 및 정량하는데 유용하다. 바람직한 구체예에서는, 암이나, GP88의 증가된 발현과 관련된 다른 질환을 진단하기 위한 수단으로서 GP88의 농도를 조직 표본 중에서 측정한다. 다른 한 가지 구체예에서는, 생물학적 유체 시료 내의 GP88의 농도를, 환자가 응답성일 것 같은지 항종양형성 요법에 대하여 응답성인지 여부를 결정하는 데에 이용한다.

특정 유형의 암 (예컨대, 유방암)의 존재여부와 악성 정도는 GP88 단백질의 수준 증가와 "비례적"이다. 본 명세서에서 "비례적이라는 용어는 상기 단백질과 암의 악성특성 사이에 직선관계나 일정한 관계로 한정되는 것은 아니다. 본 명세서에 따른 "비례적"이라는 용어는, 당업자가 쉽게 측정할 수 있는 단백질 농도 범위에서, GP88 단백질의 증가된 수준이 암이나, GP88의 증가된 발현과 연관된 다른 질병의 악성 특성의 외관, 재발성 또는 디스플레이와 관계가 있다는 것을 가리키도록 의도된 것이다.

본 발명의 또 다른 구체예는 GP88의 항암 또는 항바이러스 약물이나 제제가 GP88의 발현 또는 생산을 억제하는 능력을 측정함으로써 상기 약물 또는 제제의 효능을 평가하는데 관한 것이다. 본 발명의 항체들은 상기한 면역분석법 중 하나에서 상기한 면역분석법들 중 하나에서 GP88 단백질의 양을 측정하는데 사용될 수 있다는 점에서, 항암 또는 항바이러스 약물을 평가하기 위한 방법에 유용하다. 다른 한편, 생성된 GP88 단백질의 양을 본 명세서에 설명된 바이오분석법 (세포증식 분석법)에 의해서 측정한다. 더욱 정밀한 평가를 위해 바이오분석법과 면역분석법을 병용할 수도 있다.

또 다른 구체예는, 바람직하게는 RNS-DNA 혼성화 분석법을 이용함으로써, 조직이나 생물학적 체액 중에서 GP88이나 또는 그의 기능적 유도체를 코딩하는, 존재하는 mRNA 서열의 양을 측정하는데 기초해서 암 또는 GP88 발현의 증가와 관련된 기타 질병을 진단하기 위한 분석법에 관한 것이다. 특정 암의 존재 및 그의 악성 정도는 존재하는 그러한 mRNA의 양에 비례한다. 그러한 분석을 위해, mRNA의 소스는 생검재료와 그 주변조직으로 한다. mRNA의 양을 측정하는 바람직한 기술은 상보적인 염기 서열의 DNA를 이용하는 혼성화 분석법이다.

또 다른 관련된 구체예는 어떠한 조직 생검재료에 대해, 항-GP88 무력화 항체를 이용한 치료가 그 조직의 성장이나 다른 생물학적 활성을 저해하는지 여부를 측정하는데 기초해서, 암이나 GP88 응답성의 증가와 관련된 다른 질병을 진단하기 위한 분석법에 관한 것이다.

또 다른 관련 구체예는 GP88에 대한 mRNA의 발현 억제 효능을 측정하는 단계를 포함하는 것으로 이루어지는, 항암 또는 항바이러스 약물 또는 제제의 효능을 측정하는 방법이다. 마찬가지로 이러한 방법은 GP88 mRNA의 생산을 저해하는 상기 제제의 능력을 측정함으로써, GP88 길항제제의 효능을 동정 또는 평가하는데 이용될 수 있다.

핵산 분석법, 특히 혼성화 분석법은 핵산분자의 크기, 서열 또는 제한 엔도뉴클레아제에 의한 절단에 대한 민감성과 같은 여하한 특성에 기초하는 것일 수 있다. 이러한 분석법의 민감성은 관찰자에게 검출이 보고되거나 시그널링되는 방식을 변경시킴으로써 증가될 수 있다. 효소, 방사능동위원소, 형광, 화학적 표지 및 개질 염기를 비롯한 매우 광범한 표지들이 집중적으로 개발되어 당업자에게 이용되어왔다.

검출을 위한 핵산의 민감성 제한성을 극복하기 위한 한가지 방법은 분석을 행하기에 앞서 그 핵산을 선택적으로 증폭시키는 것이다. 이 방법은 "폴리머라제 연쇄반응" 또는 PCR (미국특허 제 4,683,202호 및 4,582,788호)이라 칭해진다. PCR 반응은 특정 핵산 서열의 농도를 선택적으로 증가시키는 방법을 제공하며, 그 서열이 미리 정제되지 않아서 특정 시료 중에 한개의 카피만 존재하는 경우에도 가능하다.

항에스트로겐 요법 및 세포 독성 요법에 대한 민감도의 복원

종양은 성장 및 성숙의 다양한 단계를 통하여 진행되고, 신체를 통하여 종양의 이동이 증가한다. 그러므로, 종양 세포는 종양 성장 및 성숙의 진행 동안 여러 단계에서 표적화할 수 있다. 예를 들면, GP88 안타고니스트는 종양 세포 성장 및 증식을 억제한다. 예를 들면, GP88은 종양 세포의 성장 및 증식 중에서 세포 주기 조절 단백질인 사이클린 D1의 발현을 유도한다. 도 11에서 보이는 바와 같이, 항GP88 항체는 사이클린 D1 발현을 억제한다. 도 11의 레인 1과 2는 항GP88 항체 5B4가 사이클린 D1의 발현을 억제하는 것을 나타낸다. 레인 3과 4는 GP88이 사이클린 D1의 발현을 자극하는 것을 나타낸다. 레인 5와 6은 항GP88 항체 5B4가 GP88에 의하여 사이클린 D1의 유도를 막는 것을 입증한다.

종양 세포가 항에스트로겐 요법의 항발암 작용에 대한 민감도를 회복하기에 충분한 양의 GP88 안타고니스트를 가지고 항에스트로겐 요법의 항발암 작용에 민감하지 않게 접촉하는 것을 포함하여, 본 발명의 바람직한 구체예는 항에스트로겐 요법에 대한 종양 세포의 민감도를 회복하기 위한 방법을 제공한다. 일 구체예에서, "민감도 회복"이라는 용어는 항에스트로겐 요법의 항발암 작용를 위하여 처리된 종양 세포의 반응성을 증가시키는 것을 말한다. 예를 들면, 항에스트로겐 요법에 반응하지 않는 종양 세포(즉 , 조절되지 않은 방식으로 계속 자라는 것), GP88 안타고니스트와 접촉한 후에 항에스트로겐 요법에 반응하는 종양 세포(즉, 성장이 억제되고 세포 사멸 되는 것 등)가 있다.

GP88 안타고니스트 또는 GP88 길항제제는 항GP88 항체 또는 항체 조각, 항GP88 수용체 항체, 항GP88 저분자, 항GP88 안티센스 핵산 및 siRNA을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. GP88 안타고니스트는 전립샘암, 혈액암, 뇌척수액암, 간암, 신장암, 유방암, 머리 및 목에 관련된 암, 인두암, 갑상샘암, 췌장암, 위암, 결장암, 결장직장암, 자궁암, 자궁경부암, 골암, 골수암, 고환암, 뇌암, 신경 조직암, 난소암, 피부암 및 폐암을 포함하는 모든 종양 또는 암 유형의 성장을 예방할 수 있다.

일 구체예에서, 항에스트로겐 요법의 작용에 대한 종양 세포의 민감도는 세포 사멸를 유도함으로써 증가할 수 있다. 세포 사멸은 종양 세포에 항에스트로겐 및 GP88 안타고니스트를 접촉시킴으로써 유도될 수 있다. 항에스트로겐 요법은 종양 성장을 처리하고 예방할 목적으로 항에스트로겐을 투여하는 것과 관련 있다. 전술한 바와 같이, 타목시펜과 같은 항에스트로겐은 부분적으로 세포 사멸를 유도함으로써 종양 성장을 억제한다. 그러나, 도 9에 도시한 바와 같이, 타목시펜 단독은 GP88를 과발현하는 세포 중에서 in vivo에서 종양 성장을 실질적으로 자극할 수 있다. 따라서, 높은 수준의 GP88를 가지는 환자에게 항에스트로겐 단독을 처리하는 것은 비생산적일 수 있다.

항에스트로겐과 항GP88 항체 모두를 GP88를 과발현하는 종양에 처리하는 것은 세포 사멸를 야기할 수 있고, GP88를 과발현하는 세포 상에서 항에스트로겐을 처리하여 잠재적인 성장 자극 특성을 제거할 수 있다. 항에스트로겐의 예에는 구연산 타목시펜 ("tamoxffen"), 유효한 항에스트로겐 및 항종양제 성질이 입증된 유방암으로 고생하는 환자에게 흔히 처방하는 비스테로이드 항에스트로겐이 있다 (미국 특허 제 4,536, 516호), (랄록시펜(raloxifene), 아라마타제(aromatase) 억제제 (예컨대, Arimidex^® (아나스트로졸), Femera^®, 레트로졸) 및 에스트로겐 수용체 하양 조절제 (예컨대, Faslodex^®).

타목시펜 유도 세포 사멸은 GP88를 과발현하는 종양 세포 중에서 차단된다. 도 5는 타목시펜, 타목시펜 + GP88, 타목시펜 + 에스트라디올, GP88 및 대조군으로 처리된 MCF-7 유방 암종 세포 중에서 PARP 분할 생성물(85 kDa 밴드)의 수준을 웨스턴 블랏으로 측정한 것이다. 도 5에 도시한 바와 같이, 타목시펜의 처리는 MCF-7 세포의 세포 사멸를 유도한다. 85 kDa PARP 분할 생성물은 "타목시펜"이 표지된 레인에서 현저하게 증가하였고, 이는 세포 사멸를 나타내는 것이다. "타목시펜 +에스트라디올"이라고 표지된 레인에서 85 kDa 밴드 중에서 감소된 것으로 도시한 바와 같이, 타목시펜 유도 세포 사멸은 타목시펜 유도 세포 사멸를 차단하는 것으로 알려진 화합물인 에스트라디올로 처리하여 차단하였다. 에스트라디올의 처리한 것과 같은 수준으로 GP88을 처리하여 타목시펜 유도 세포 사멸를 차단하였다. "타목시펜 + GP88"으로 표지된 레인은 "타목시펜" 레인에 비하여 PARP 분할 생성물이 현저하게 감소된 것을 보여준다. 도 5는 GP88이 종양 세포 중에서 타목시펜 유도 세포 사멸를 차단하는 것을 보여준다.

본 발명의 또 다른 구체예는 세포 사멸를 유도하는 조성물과 방법을 제시한다. 세포 소멸 프로그램으로 알려진 세포 사멸은 또한 세포의 성장 조절 기전의 필수 성분이다. 예를 들면, 세포 사멸은 손상된 세포 (예컨대 , 바이러스 감염된 세포, DNA 손상된 세포)의 소체를 제거하기 위한 기전이다. 세포 사멸를 겪는 세포는 통상적으로 정상 세포보다 작고, 고농축된 핵을 가진다. 사멸 세포는 면역계에서 제거하기 위하여 표시된다.

세포 사멸의 조절 결핍은 억제되지 않은 세포 성장과 종양 형성력을 야기할 수 있다. 종양 유전자는 DNA 손상에 의하여 활성화될 수 있다. 정상 소멸 환경 하에서, 소체(body)는 손상된 세포를 제거할 것이다. 비정상 환경 하에서는, 세포 사멸가 일어나지 않고 손상된 세포는 성장 및 증식하여 종양을 형성한다. 예를 들면, p53은 정상적으로는 세포 사멸를 유도하는 기능을 한다. 그러나 p53의 종양 발생 형성은 세포 사멸의 유도를 차단하고 억제되지 않은 세포 성장을 이끈다. 조절되지 않은 세포의 생존은 암, 자가면역병 및 염증성 질환과 같은 질환을 일으킨다. 전술한 바와 같이, Bcl-2 유전자는 세포 사멸를 차단할 수 있는 단백질을 코딩한다. Bcl-2의 과발현은 세포 사멸가 차단되었고 세포는 세포예정사를 하지 않을 것이라는 것을 의미한다.

본 발명은 세포독성제 또는 화학요법제의 종양억제 작용에 대한 민감성을 회복하기 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 예를 들면, GP88 안타고니스트 (예컨대,항GP88 항체, GP88 안티센스 핵산, siRNA 및 저분자 등)는 세포독성제 (예컨대, 알트레타민, 블레오마이신, 부술판, 칼슘 폴리네이트, 카페시타빈, 카보플라틴, 카무스틴, 클로람부실, 시스프라틴, 클라드리빈, 크리산타스페이즈, 시클로포스파미드, 시타라빈, 다카바진, 닥티노마이신, 다우노루비신, 도세탁셀, 독소로비신, 이피루비신, 이토포사이드, 플루다라빈, 플루오로우라실, 겜시타빈, 하이드록시우레아, 이다루비신, 이포스파미드, 이리노테칸, 리포소말 독소루비신, 루무스틴, 멜파란, 머캅토퓨린, 메토트렉사에이트, 미토마이신, 미토산트론, 옥살리플라틴, 파크리탁셀, 펜토스타틴, 프로카바진, 랄티트렉스드, 스트렙토조신, 테가퍼우라실, 테모졸로미드, 티오테파, 티오구아닌/티오구아닌, 토포테칸, 트레오설판, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 빈데신 및 비노랠빈)의 항종양형성 작용에 내성이 발달한 환자에게 투여될 수 있다. 세포독성제 및/또는 화학요법제와 이들의 조합에 대한 민감도와 반응도는 복구할 수 있다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, GP88 안타고니스트는 종양 세포에 항에스트로겐 및/또는 세포독성 화합물과 함께 투여될 수 있다. 예를 들면, 타목시펜 내성의 발달을 억제하거나 타목시펜의 항발암 작용에 대한 민감도를 복구하기 위하여, 항GP88 항체는 타목시펜과 함께 종양 세포에 투여할 수 있다. 또 다른 구체예에서, GP88 안타고니스트는 항에스트로겐 및/또는 세포독성 화합물을 순차적으로 투여할 수 있다. 따라서, GP88 안타고니스트는 항에스트로겐 또는 세포독성 화합물의 투여 전 또는 후에 투여할 수 있다.

또한 본 발명은 종양 세포에 GP88 안타고니스트를 투여하는 것을 포함하여 세포 사멸를 유도하는 방법을 제공한다. 세포 사멸은 신경모세포종, 아교모세포종, 별아교세포종, 육종 및 전립샘암, 혈액암, 뇌척수액암, 간암, 신장암, 유방암, 머리 및 목에 관련된 암, 인두암, 갑상샘암, 췌장암, 위암, 결장암, 결장직장암, 자궁암, 자궁경부암, 골암, 골수암, 고환암, 뇌암, 신경 조직암, 난소암, 피부암 및 폐암을 포함하는 모든 종양 세포 유형을 유도할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 세포 사멸은 Bcl-2 수준의 검출 또는 PARP 분할 생성물, DNA 사다리 및 사멸 세포 생산의 발견을 포함하는 다양한 기술에 의하여 종양 세포 중에서 발견할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. PARP 또는 폴리 (ADP-리보오스) 중합효소는 DNA 가닥의 분열을 검출하고 DNA 치유에 참여하는 핵결합 단백질이다. PARP의 분할은 케스파세스(caspases) 의존 세포 사멸의 특징이다. 세포 사멸이 일어날 때, 116 kDa 무손상 PARP는 85 kDa과 25 kDa의 두 조각으로 분열된다. 항PARP 항체로 웨스턴 블랏 분석함으로써 PARP의 무손상 형태와 분열된 형태를 검출하는 것은 세포 사멸 분석으로 확립되었다. Duriez et al. , Biochem Cell Biol. 75: 337-49,1997.

세포 사멸은 항사멸 인자, 특히 Bcl-2, bcl-xl 및 박스(bax)에 대한 사멸 비율에 의하여 조절된다. 종래 보고에서는 Bcl-2 발현은 타목시펜 처리에 의하여 하향 조절되어 MCF-7 세포 및 타목시펜으로 처리한 환자의 조직 중에서 세포 사멸의 활성을 유도하는 것을 제안하였다. Zhang et al. , Clin. Cancer Res. 5: 2971-7,1999 ; Cameron et al. , Eur. J. Cancer 36: 845-51,2000. Bcl-2 발현 수준의 변화는 박스:Bcl- 2 비율을 변화시키고 세포 사멸에 대한 감수성을 변화시킨다. 04 세포는 GP88를 과발현하기 위하여 GP88 발현 구조물로 변형시킨 MCF-7 세포이다. Serrero et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97: 3993-8, 2000. 도 6에 도시한 바와 같이, 타목시펜은 시험된 모든 농도에서 타목시펜이 세포 사멸을 유도하는 것으로 나타내면서 MCF-7 세포 중에서 Bcl-2 전사의 하향 조절을 유도한다. 반대로, 04 세포 중에서는 더 높은 양에 불구하고 타목시펜이 Bcl-2를 하양 조절하는데 실패하였다.

타목시펜-내성 MCF-7 세포는 도 6에 도시한 바와 같이 Bcl-2를 하향 조절할 수 없다. 그러나, 타목시펜-내성 MCF-7 세포에 항GP88 항체를 첨가하여 Bcl-2의 하향조절(下向調節)에 의하여 나타나는 세포 사멸이 복구하였다(도 6). 따라서, GP88 안타고니스트는 타목시펜 내성 세포 중에서 세포 사멸을 유도하는 타목시펜의 능력을 회복시킨다.

또한 항GP88 항체는 04 세포(GP88를 과발현하는, 타목시펜-내성 MCF-7 세포) 중에서 세포 사멸을 야기한다. 도 7에 도시한 바와 같이, 5B4 항체 (5B4) 또는 세포 사멸을 유도하는 항GP88 항체로 세포를 처리한 것을 나타내는 5B4 플러스 타목시펜 (5B4 + T)으로 처리한 04 세포 중에서 PARP 분할 생성물이 증가하였다.

타목시펜 내성 MCF-7 세포에 항GP88 항체를 처리하는 것 또한 세포 사멸을 유도한다. 도 8에 도시한 바와 같이, 타목시펜 단독으로 처리하면 PARP을 분할하지 못하는 반면에, 항GP88 항체 5B4을 단독으로 또는 타목시펜과 조합하여 첨가하면 PARP이 분할된다.

도 9는 난소가 절제(切除)된 누드 마우스 중에서 MCF-7 세포 및 04 세포의 성장에 대한 타목시펜의 효과를 보여준다. 무흉선(無胸腺) 난소가 절제된 암컷 누드 마우스에 MCF-7 세포 또는 04 세포를 주입(S. C)하기 하루 전에 에스트라디올 침전물을 이식하였다. 10일 후에 종양이 보일 때, 마우스에 플라세보 침전물 또는 타목시펜 침전물을 주입하였다. 종양 성장을 45일 동안 관찰하였다. 실험의 마지막에, 마우스를 안락사시키고 종양을 잘라내어 평가하였다. 도 9에 도시한 바와 같이, 04 세포 (GP88 과발현 세포)에 의하여 유도되고, 타목펜으로 처리한 종양을 가지는 마우스에서의 종양의 부피는 45일 후에 50mm³ 에서 약 225 mm³로 증가하였다. 반대로 04 세포에 의하여 유도되고, 타목펜으로 처리하지 않은 종양을 가지는 마우스에서의 종양의 부피는 45일 후에 75 mm³ 에서 150 mm³ 로 증가하였다. 종양을 과발현하는 GP88로 처리하지 않은 종양의 부피가 2배인 것에 비하여, GP88를 과발현하는 종양에 타목시펜을 처리하는 것은 종양 부피를 4배 더 증가하였다.

따라서, GP88 길항제제 (예컨대, 항GP88 항체, GP88 안티센스 핵산, siRNA, 항GP88 저분자 등)는 종양 세포에 투여할 수 있고, 예를 들면 세포 사멸을 유도함으로써 항에스트로겐 요법의 종양억제 효과를 회복시킨다.

GP88 항체는 항에스트로겐 요법 및 세포 독성 요법에 대한 민감도를 복구시키는데 적합하며, 미국 유형 배양 수집(American Type Culture Collection; ATCC), 10801 University Blvd. , Manassas, VA 20110-2209에 기탁된 다른 바람직한 조성물에서 본 발명의 방법은(예컨대, 세포 사멸의 유도 등) 항에스트로겐 요법 및 세포 독성 요법의 종양억제 효과에 대한 민감도를 회복하고 종양 세포에서 세포 사멸을 유도하기 위하여, 6B3 하이브리도마 세포주 (ATCC 기탁 번호 PTA-5262), 6B2 하이브리도마 세포주 (ATCC 기탁 번호 PTA-5261), 6C12 하이브리도마 세포주 (ATCC 기탁 번호 PTA-5597), 5B4 하이브리도마 세포주 (ATCC 기탁 번호 PTA-5260), 5G6 하이브리도마 세포주 (ATCC 기탁 번호 PTA-5595), 4D1 하이브리도마 세포주 (ATCC 기탁 번호 PTA-5593), 3F8 하이브리도마 세포주 (ATCC 기탁 번호 PTA-5591), 3F5 하이브리도마 세포주 (ATCC 기탁 번호 PTA-5259), 3F4 하이브리도마 세포주 (ATCC 기탁 번호 PTA-5590), 3G2 하이브리도마 세포주 (ATCC 기탁 번호 PTA-5592) 및 2A5 하이브리도마 세포주 (ATCC 기탁 번호 PTA-5589)를 포함하여, 그러나 이에 제한되지 않은 하이브리도마 세포주로부터 생산할 수 있다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 6G8 하이브리도마 세포주 (ATCC 기탁 번호 PTA-5263), 5A8 하이브리도마 세포주 (ATCC 기탁 번호 PTA-5594)를 포함하여, 그러나 이에 제한되지 않은 하이브리도마 세포주로부터 생산된 항체를 포함하는, 항GP88 수용체 항체를 항에스트로겐 요법 및 세포 독성 요법의 종양억제 효과에 대한 민감도를 회복하고 종양 세포에서 세포 사멸을 유도하기 위하여 사용할 수 있다.

항GP88 항체 및 항GP88 수용체 항체(올바르게는 "GP88 안타고니스트 항체")는 in vitro 및 in vivo 모두에서 세포에 부여될 수 있다. in vitro 적용을 위하여, GP88 안타고니스트 항체는 통상적으로 세포 배양 매질의 0.01 ng 내지 약 100 mg/ml, 바람직하게 약 10 ng 내지 약 50 mg/ml의 범위의 농도에서 세포 배양 매질에 첨가될 수 있다. 항체는 단독으로 투여되거나, 동일한 질병을 조절하는 다른 치료제와 함께 투여될 수 있다. 또한, 세포는 GP88 안타고니스트 항체 또는 항체 조각을 코딩하는 DNA 또는 RNA, 또는 이러한 DNA 또는 RNA 서열을 함유하는 벡터로 트랜스펙션될 수 있다. 트랜스펙션된 세포는 P88 안타고니스트 항체 또는 항체 조각을 만들기 위하여, 적절한 기술(예컨대, 유도 프로모터, 및 다발성 플라스미드 복사체)을 이용하여 유도될 수 있다.

또한, GP88 안타고니스트 항체 조성물은 ex vivo 기술을 이용하여 세포로 투여될 수 있다. 종양형성 또는 정상 세포는 숙주(예컨대 , 인간 또는 다른 포유동물)로부터 제거된 후, 배양물 내에서 성장될 수 있다. 그 후, 세포는 GP88 안타고니스트 항체를 코딩하는 DNA 또는 RNA로 트랙스펙션시키고, GP88 안타고니스트 항체를 생산하기 위해 유도될 수 있다. 그 후, 세포는 개체 내로 재도입되어, GP88 안타고니스트 항체 또는 항체 조각을 생성하고, GP88의 활성을 억제하고, 종양 세포 증식과 종양 부피를 감소시킬 수 있다.

in vivo 적용을 위하여, GP88 안타고니스트 항체 조성물은 다양한 투여 경로 및 복용 형태로 개체에게 투여될 수 있다. 증가된 GP88 발현과 관련된 질환으로 고통받는 개체는 GP88 안타고니스트 항체 또는 조각로 치료될 수 있다. 다르게는, 개체의 세포를 GP88 안타고니스트 항체 또는 조각을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드로 트랜스팩션한다. 일반적인 요법은 1주 내지 약 6 개월의 기간에 걸쳐 유효한 양의 GP88 안타고니스트 항체를 투여하는 것을 포함한다.

본 발명의 GP88 안타고니스트는 다양한 경로로 투여될 수 있다. 이러한 경로는 이에 제한되는 것은 아니지만, 피하 투여, 정맥내 투여, 진피내 투여, 근육내 투여, 복막내 투여 및 경구 투여를 포함한다. 비경구 투여는 일시주사 또는 시간에 걸친 순차 관류가 될 수 있다. 비경구 투여용 제제는 무균의 수성 또는 비수성 용액, 현탁액 및 에멀젼을 포함하고, 이들은 본 기술 분야에 잘 알려진 보조제 또는 부형제를 함유할 수 있다. 정제 및 캡슐과 같은 약학적 조성물도 제조될 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체(예컨대 , 정제(錠劑), 알약, 주사, 즙, 흡입, 피부통과 부착포 및 좌약)가 환자에게 GP88 안타고니스트를 투여하기 위하여 사용될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 GP88 안타고니스트를 함유하며, 항에스트로겐 및/또는 세포독성 화합물을 함유할 수 있다.

용량은 환자의 나이, 성별, 체중, 현재 치료 종류, 치료 횟수, 원하는 효과정도에 따라 달라질 수 있을 것이다. 아래에 기재된 유효한 용량의 범위는 본 발명을 제한하려는 의도는 아니며, 단지 용량 범위의 예를 나타내는 것이다. 그러나, 각 개체에 적절한 가장 바람직한 용량은 본 기술 분야의 당업자에 의해서 이해되고 확인된다. 각 치료에 요구되는 총 용량은 수회 용량 또는 일회량으로 투여될 수 있다. 항체의 유효양은 통상적으로 체중 당 약 0.01 ㎍ 내지 약 100 mg이고, 바람직하게는 체중 당 10 ㎍ 내지 약 50 mg이다. 항체는 단독으로 또는 동일한 질병을 조절하는 다른 제제와 같이 투여될 수 있다.

또한 본 발명은 제1의 생물 시료 내의 GP 88 단백질의 수준을 측정하는 것, 제2의 생물 시료 내의 GP 88 단백질의 수준을 측정하는 것 및 세포가 GP88 안타고니스트 치료에 대하여 응답한다는 것을 지시하는 데에 충분한 양만큼 제2의 생물 시료 내의 GP 88 단백질의 수준이 제1의 생물 시료 내의 GP 88 단백질의 수준에 비하여 낮은가를 결정하는 것을 포함하는, GP88 안타고니스트 치료에 대한 응답을 결정하는 방법을 제공한다. "GP88 안타고니스트 치료에 대하여 응답한다는 것"이라는 용어는 세포 성장 또는 종양 세포 성장의 방지 억제, 및/또는 감소를 지칭하는 것이다.

제1의 또는 초기 생물 시료에서의 GP88 수준을 측정하고, 다른 시간에 채취된 제2의 종양 생물 시료 내의 GP88의 수준과 비교할 수 있다. 예컨대, 생물 시료 또는 생검(biopsies)를 일정 시간 간격으로 취하고, 연속적인 시료에서 측정된 GP88의 농도를 초기 시료 내의 GP88 수준과 비교할 수 있다. 시간 경과에 따른 종양 시료 내의 GP88의 수준의 감소는 GP88 안타고니스트 치료에 대하여 세포가 응답한다는 것을 나타내는 것이다.

GP88 발현 억제제

또한, 본 발명은 GP88 발현 억제제 (예컨대, 안티센스 성분 및 siRNA)를 제공한다. 상기 용어 안티센스 성분은 RNA 서열과, 특정한 mRNA 분자에 대하여 충분히 상보적인, 이들을 암호화하는 DNA 서열에 해당하는 것으로서, 상기 안티센스 RNA는 특이적이어서 안티센스 RNA와 mRNA 사이의 분자 혼성화를 일으키고, 이로써 mRNA의 해독을 억제한다. 이와 같은 혼성화는 생체내 조건에서 일어날 수 있다. 안티센스 RNA의 작용은 세포 내 유전자 발현의 특이적 억제를 초래한다. 예를 들면, 안티센스 성분은 mRNA의 해독을 차단하거나, 및/또는 mRNA의 접합(splicing)을 차단하거나 또는 방지한다. 또한, 안티센스 분자는 종들 사이에 덜 보존된 인트론에 결합하도록 유도될 수 있고, 이는 특이성이 더 높아지는 결과를 가져온다(예컨대, 한 가지 종의 유전자 생성물의 발현을 억제하지만, 다른 종의 동종물에 대해서는 그렇지 않다).

siRNA는 표적 핵산과 복합체를 형성함으로써 유전자 발현을 억제하는 두가닥 (ds) RNA 분자이다. 센스 가닥이라고 지칭되는 한 가닥은 표적 핵산 (예컨대, 전령 RNA ("mRNA"))에 대하여 상보적인 반면에, 두번째 가닥은 센스 가닥에 대하여 상보적이다. Fire 외, Nature, 391 (6669): 806-811 (1998). siRNA 또는 RNAi는 다양한 종에 있어서 유전자 발현을 억제하는 데에 사용될 수 있다 (예컨대 , C. elegans Id. and Drosophila (Kennerdell 및 Carthew, Cell (1998) 95:1017-1026 ; Misquitta 및 Patterson, PNAS (1999) 96: 1451-1456)). 일 구체예에서, siRNA로서 사용되는 dsRNA는 생체내 전사에 의하여 생성될 수도 있다. 대안으로서, dsRNA는 표준 및 기타의 프로토콜에 따라 폴리머라제 연쇄 반응(polymerase chain reaction, PCR) 또는 다른 기술 (예컨대, Promega Large Scale RNA Production System (Madison, Wis.))을 이용하여 생체 외에서 생성될 수도 있다. 또 다른 구체예에서, 상보 센스 및 안티센스 RNA 가닥은 표적 유전자 (예컨대, GP88)의 서열로부터 유도될 수 있고, 합성될 수 있다. 얻어지는 센스 및 안티센스 RNA들을 완충액 내에서 어닐링하여 동물에 투여하거나 또는 세포 배양 실험에 사용할 수 있다. 예컨대, R., Timmons 및 Fire, Nature (1998) 395: 854; Montgomery 외, PNAS (1998) 95: 15502-15507; Tabara 외, Science (1998) 282: 430-431 참조.

두가닥 siRNA는 표적mRNA와 복합체를 형성하거나 또는 분해하여 표적 RNA의 파괴를 초래한다. Id. 두가닥 siRNA는 RNA 유도 침묵 복합체 또는 RISC로 지칭되는 복합체 내에 병합된다. Kim 외, J. Korean Med Sci 18: 309-18 (2003). RNA 헬리카제(helicase)는 RISC 복합체를 활성화하는 siRNA의 가닥 중의 하나의 파괴를 촉진하고, 이는 표적 RNA 분자의 표적화 및 파괴를 초래한다. Id. siRNA는 이들의 표적 유전자에 대한 높은 특이성을 가지며, 대부분의 유전자에 있어서 유전자 발현을 90%까지 억제할 수 있다. Id.

바람직하게는, GP88 쪽으로 유도되는(directed) siRNA는 GP88 mRNA의 기능을 간섭한다. 이들은 GP88의 어떤 부분, 바람직하게는 길이로 약 20개 이상의 뉴클레오타이드로 이루어진 것에 대항하여 유도될 수 있다. 본 발명에 따라, GP88에 대항하여 유도되는 siRNA는 종양 세포 성장을 억제하고, 종양 세포 성장을 방지하며, 종양 퇴행을 유도하고, 세포 사멸를 유도할 수 있다.

GP88에 대항하여 유도되는 siRNA는 적당한 서열 중의 어떤 것에 대하여 표적화될 수 있다. siRNA는 GP88 뉴클레오타이드 서열 중의 어떤 부분을 표적으로 하도록 만들어질 수 있다. GP88 뉴클레오타이드 서열의 부분에 결합한 후에, GP88 핵산은 파괴되도록 표시된다. 일 구체예에서, siRNA는 서열: 5' AGGTTGATGCCCACTGCTCTG 3' (siRNA 서열 1)을 갖는 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드로부터 생성된다. siRNA 서열 1은 뉴클레오타이드 위치 203 (도 2A)에서 시작하는 인간 GP88 뉴클레오타이드 부위를 표적으로 한다. GP88의 위치 223에서 시작하는 인간 GP88 서열을 표적으로 하는 siRNA는 서열: GAGCAGUGGGCAUCAACCUGG (siRNA 서열 2)를 갖는다. siRNA 서열 3 (5' AGATCAGGTAACAACTCCGTG 3')은 뉴클레오타이드 342에서 시작하는 인간 GP88 서열을 표적으로 한다. siRNA 서열 4 (5' GGACACTTCTGCCATGATAAC 3')는 뉴클레오타이드 1569에서 시작하는 인간 GP88 서열을 표적으로 한다.

일 구체예에서, siRNA 서열은 본 발명 분야에 잘 알려져 있는 방법에 따라 두 가닥 siRNA 서열로 만들어질 수 있다. siRNA는 다양한 종 (인간, 마우스, 돼지, 개 등 )으로부터 유래하는 GP88 뉴클레오타이드 서열의 적당한 어떤 부위를 표적으로 할 수 있는 것으로 이해된다. GP88 핵산 (예컨대, mRNA)을 파괴하는 siRNA의 기능을 변경시키지 않으면서 뉴클레오타이드 치환, 결손, 전환 및 돌연변이가 siRNA 서열에 도입될 수 있다.(115)

GP88 cDNA에 대한 DNA 안티센스 또는 siRNA로 종양형성 세포를 트랜스펙션시키면 내인성 (endogenous) GP88 발현이 억제되어, 안티센스 cDNA 트랜스펙션된 세포의 종양형성성이 억제된다. 이러한 안티센스 DNA는, 안티센스 RNA가 GP88 유전자 (또는 mRNA)에 하이브리다이즈하여 그 작용이 스플라이싱, 전사 또는 번역 중 어느 수준에서 이루어지던지와 관계없이 GP88 유전자 발현을 저해할 수 있도록, GP88 유전자에 대해 충분한 상보성을 갖는 약 18-30개의 뉴클레오타이드를 가져야 한다. 억제 정도는 본 명세서의 설명을 참조하면 당업자가 과도한 시험 없이 쉽게 인식할 수 있으며 바람직하게는 그의 증식이 GP88의 발현에 의존하는 세포들의 성장을 억제하는데 충분한 것이 좋다. 당업자라면 안티센스 RNA 접근이 특정 유전자 발현을 차단하는데 사용가능한 여러가지 공지 메카니즘 중 일례에 불과하다는 것을 잘 알 것이다.

본 발명의 안티센스 성분들은 코딩 서열, 3' 또는 5' 미번역 대역, 또는 다른 인트론 서열을 비롯한 표적 GP88 cDNA의 여하한 몇몇 부분들이나, 또는 GP88 mRNA에 하이브리다이즈될 수 있다. 당업자가 쉽게 결정할 수 있듯이, 본 발명에 의해 요구되는 상동성의 최소량은 바람직하게는 mRNA 분자의 기능과 다른 비관련 유전자들의 발현에 영향을 미침이 없이, GP88 DNA나 mRNA에 대한 혼성화과, DNA의 전사 억제, mRNA의 번역 또는 기능 억제를 일으키는데 충분한 양이다.

안티센스 RNA는 레트로바이러스 벡터와 플라스미드를 비롯한 벡터를 통해, 숙주 세포에서 안티센스 RNA의 발현을 야기시키는 프로모터를 비롯한 적절한 조절 서열과 함께 안티센스 RNA를 코딩하는 DNA가 주입된 세포내로 형질전환이나 트랜스펙션에 의해 전달된다. 안티센스 방향으로 GP88 cDNA 단편들을 함유하는 여러가지 안티센스 발현 벡터의 안정한 트랜스펙션이 수행되어왔다. 레트로바이러스 벡터를 이용해서도 안티센스 성분들을 세포내로 전달할 수 있다. 전달을 또한 예를 들어, 리포좀 또는 누클레오펙션에 의해서도 달성할 수 있다.

in vivo 요법을 위해, 현재 바람직한 방법은, 발현 벡터 내로 제작된 안티센스 cDNA 단편을 안정하게 트랜스펙션하는 대신, 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 사용하는 것이다. 길이가 15-30 염기이고 코딩 서열, 3' 또는 5' 미번역 대역 또는 기타 인트론 서열을 비롯한 표적 GP88 cDNA의 몇몇 부분이나 또는 GP88 mRNA에 대해 하이브리다이즈할 수 있는 서열을 갖는 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 바람직하다. GP88에 대한 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 대한 서열은 바람직하게는 가장 강력한 안티센스 효과를 갖는 것으로 선택하는 것이 좋다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드 서열에 대한 표적 부위를 좌우하는 인자는 올리고뉴클레오타이드의 길이, 결합 친화도, 및 표적 서열에 대한 접근성과 관련이 있다. 서열은 GP88 단백질 번역 및 GP88 관련 표현형의 억제, 예컨대, 배양중 세포에서의 세포분화의 억제를 측정함으로써, 그의 안티센스 활성의 강도에 대해 서열들을 in vitro 에서 스크리닝할 수 있다. 일반적으로, RNA (5' 및 3' 미번역 부분, AUG 개시, 코딩, 스플라이스 정션 및 인트론)의 대부분은 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 이용하여 표적화시킬 수 있는 것으로 알려져있다.

바람직한 GP88 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 안정하고, 뉴클레아제 (올리고뉴클레오타이드를 잠재적으로 분해할 수 있는 효소)에 대한 복원력이 높고, 비독성 투여량으로, 병에 걸린 조직과 교통할 수 있을 정도로 적절한 약동학은 가지며, 막을 통과할 수 있는 것들이다.

포스포로티오에이트 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 이용할 수 있다. 헤테로사이클 또는 슈가의 변형 뿐만 아니라 포스포디에스터 결합의 변형은 효율증가를 가져온다. 포스포디에스테르 결합의 변형의 경우, 포스포로티오에이트를 사용할 수 있다. N3'-N5' 포스포라미데이트 결합이 뉴클레아제에 대해 올리고뉴클레오타이드를 안정화시키고 RNA에 결합하는 것으로 설명되어 왔다. 펩타이드 핵산 (PNA: peptide nucleic acid) 결합은 리보스 및 포스포디에스테르 백본의 완벽한 대체물이며 뉴클레아제에 대해 안정하므로 RNA에 대한 결합 친화도를 증가시키고 RNAse H에 의해 절단되지 않게 한다. 그의 기본적인 구조는 그 구조를 안티센스 성분으로서 최적화시킬 수 있게 해주는 변형에 순응적이다. 헤테로사이클의 변형과 관련해서, 어떤 헤테로사이클 변형은 RNAse H 활성을 간섭하지 않은채 안티센스 효과를 개시하는 것으로 입증된 바 있다. 이러한 변형예는 C-5 티아졸 변형이다. 슈가의 변형 역시 고려해 볼 수 있다. 2'-O-프로필 및 2'-메톡시에톡시 리보스 변형은 세포배양기, 그리고 in vivo 에서 뉴클레아제에 대해 올리고뉴클레오타이드를 안정화시킨다. c-raf-1에 표적화된 이러한 유형의 올리고뉴클레오타이드를 이용하여 세포 배양 및 in vivo 종양 실험하지 강도가 증강되었다.

전달 경로는 상술한 기준에 따라 측정했을 때 최고의 안티센스 효과를 제공하는 것으로 한다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 이용한 in vitro 세포 배양 및 in vivo 종양 성장 분석결과 음이온성 리포좀, 테르로바이러스 벡터 및 직접 전달에 의해 매기된 전달방식이 효과적인 것으로 나타났다. 또 다른 가능한 전달형식은 종양세포에 대한 세포 표면 마커에 항체를 이용하여 표적화시키는 것이다. 이 목적을 위해 GP88 또는 그의 수용체에 대한 항체를 이용할 수 있다.

재조합 GP88

본 발명은 또한 실질적으로, 다른 포유류의 DNA 서열 없이, 재조합 GP88 폴리펩타이드 또는 그의 기능적 유도체를 발현하기 위한 DNA 발현계에 관한 것이기도 하다. 이러한 DNA는 이중 또는 단일사슬일 수 있다. 이 DNA 서열은 다른 폴리뉴클레오타이드에 대해 하이브리다이즈할 수 있도록 약 20개 이상의 뉴클레오타이드를 갖는 것이 바람직하다. 혼성화에 대한 특이성을 보다 증가시키기 위해, GP88 단백질 또는 그의 동족체나 기능적 유도체를 코딩하는 것 이외의 다른 서열에 혼성화하지 않는 것으로 특징지어지는, 적어도 50개의 뉴클레오타이드 길이인 것이 바람직하다.

본 발명은 또한 상기 DNA 분자, 발현가능한 비히클 또는 벡터 뿐만 아니라, 상기 비히클에 의해 트랜스펙션 또는 형질전환되어 상기 폴리펩타이드를 발현할 수 있는 숙주에 관한 것이기도 하다. 이러한 숙주는 원핵생물, 바람직하게는 세균, 또는 진핵생물, 바람직하게는 효모나 포유동물 세포일 수 있다. 바람직한 벡터계는 곤충 세포에서 발현된 배큘로바이러스를 함유하는 것이다. 이 DNA는 형질전환, 형질유도, 트랜스펙션, 감염 또는 기타 관련 공지기술에 의해 숙주 생명체내로 인코포레이션될수 있다. GP88 폴리펩타이드를 코딩하는 DNA와 mRNA에 더해, 본 발명은 또한 핵산 서열의 발현법을 제공한다. 뿐만 아니라, 유전자 서열과 올리고뉴클레오타이드는 상술한 폴리펩타이드 GP88에 대한 서열 상동성을 갖는 부가적인 폴리펩타이드를 동정 및 클로닝하는 것을 가능케 해준다.

발현 벡터는 벡터 내로 클로닝됨으로 해서 폴리펩타이드나 단백질을 생산하는 DNA (또는 cDNA)를 발현시킬 수 있는 것을 말한다 (적절한 전사 및/또는 번역 제어 서열 존재로 인해). 클로닝된 서열의 발현은 발현 벡터가 적절한 숙주 세포내로 도입되면 일어난다. 원핵 발현 벡터가 사용될 경우, 적절한 숙주 세포는 클로닝된 서열을 발현할 수 있는 것이면 어떠한 원핵 세포이든 무방하다. 마찬가지로, 진핵 발현계가 사용될 경우에는, 클로닝된 서열을 발현할 수 있는 것이면 어떠한 진핵 세포이든 무방하다. 예컨대, 배큘로바이러스 벡터를 이용하여 GP88 cDNA를 클로닝한 후 이어서 숙주 세포에서 cDNA를 발현할 수 있다.

적절한 말단을 제공하기 위해 접합, 제한효소 절단용 블런트-말단화 또는 스태거드 말단화, 적절하게 코히시브 말단 채우기, 바람직하지 못한 결합을 방지하기 위한 알칼라인 포스파타제 처리, 및 적절한 효소 리가제를 이용한 접합을 비롯한 통상적인 기술에 따라 GP88 폴리펩타이드 또는 그의 유도체를 코딩하는 DNA 서열을 재조합시킬 수 있다. 이러한 조작 기술은 문헌에 잘 나타나있다 (35).

어떤 핵산 분자는 그것이 전사 및 번역 조절 정보를 함유하는 뉴클레오타이드 서열을 함유하고 그러한 서열이 그 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열에 작동적으로 링크되면 그 포리펩타이드를 발현시킬 수 있다. 작동가능한 링크는 조절 DNA 서열과 발현시키고자 하는 DNA 서열이 유전자 발현을 가능케하는 방식으로 연결되어 있는 링크를 말한다. 유전자 발현에 필요한 조절 대역의 정밀한 특성은 생물체마다 달라질 수 있으나 일반적으로, 프로모터 대역을 포함하여, 이것은 원색생물에서는 프로모터 (RNA 전사 개시에 지향됨) 뿐만 아니라 RNA로 전사될 경우 단백질 합성을 시그널 및 개시시킬 DNA 서열도 포함한다. 이러한 대역은 보통은 TATA 박스, 캐핑 서열, CAAT 서열등과 같이, 전사개시와 관련된 5' 비-코딩 서열을 포함할 것이다.

소망될 경우, 단백질을 코딩하는 유전자 서열의 3' 비-코딩 대역을 설명된 방법에 의해 얻을 수 있다 (cDNA 라이브러리 또는 PCT 증폭에 적절한 스크리닝). 이 대역은 종결 및 폴리아데닐화와 같은 전사 종결 조절 서열의 존재 하에 유지될 수 있다. 따라서, 단백질을 코딩하는 DNA 서열에 본래 근접하게 3' 대역을 유지시킴으로써, 전사 종결 시그털이 제공될 수 있다. 전사 종결 시그널이 제공되지 않거나 발현 숙주세포내에서 만족스럽게 기능하지 않을 경우에는 다른 유전자로부터의 3' 대역으로 대체시킬 수 있다.

프로모터 대역 서열과 GP88 코딩 서열과 같은 두개의 DNA 서열들은 서열들간의 링크 특성이 프레임-쉬프트 돌연변이의 도입을 야기시키지 않거나 또는 폴리펩타이드 유전자 서열의 전사를 지향하는 프로모터 서열의 능력을 간섭할 경우 작동적으로 링크되어 있다고 칭해진다. 프로모터 서열은 원핵, 진핵 또는 바이러스성일 수 있다. 적절한 프로모터는 유도가능하고, 억제적이며 보존적인 것이다.

진핵 프로모터로는 마우스 메탈로시오네인 I 유전자, 헤르페스 바이러스의 TK 프로모터, 유전자 gal4 프로모터, SV40 조기 (early) 프로모터, 마우스 유선종양 바이러스 (MMTV) 프로모터 및 시토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터를 들 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 강력한 프로모터들이 바람직하다. 이러한 프로모터의 예로는 T3, SP6, 및 T7 폴리머라제를 인식하는 것들, 박테리오파지 람다의 PL 프로모터, recA 프로모터, 마우스 메탈로시오네인 I 유전자의 프로모터, SV40 프로모터 및 CMV 프로모터가 포함된다.

본 발명의 내용을 특정 문제나 조건에 적용하는 것은 본 명세서에 내용에 비추어 당업자의 재량에 따라 이루어질 것이다. 본 발명을 다음의 비제한적인 실시예를 들어 더욱 상세히 설명한다.

도 1A-1C는 마우스의 GP88의 뉴클레오타이드와 연역된 아미노산 서열을 도시한 것이다. 항-GP88 항체 K19T 및 S14R을 일으키기 위해 항원으로서 사용된 펩타이드 대역에 밑줄 표시하였다. pCMV4 포유루 발현 벡터 중 안티센스 방향으로 클로닝된 대역은 괄호안에 나타내었다.

도 2A는 인간의 GP88 cDNA의 뉴클레오타이드 서열을 나타낸다. 괄호 사이에 표시된 것들은 pcDNA3 포유류 발현계 내로 안티센스 방향으로 클로닝된 대역이다.

도 2B는 인간의 GP88의 연역된 아미노산 서열을 나타낸다. 항-인간 GP88 무력화 항체를 개발하기 위해 항원으로서 사용된 E19V 대역에 밑줄 표시했다. 이것은 마우스의 S14R 대역과 동등한 대역인 A14R도 가리킨다.

도 3은 그래뉼린 g, f, B, A, C, D 및 e (우측)으로 정의된 7과 1/2의 반복을 나타내도록 정렬된 마우스 GP88의 아미노산 서열을 도시한다. 이것은 항-GP88 무력화 항체를 발달시키기 위한 GP88 항체를 일으키는데 사용된 대역 K19T와 S14R 이 변이체 대역으로 여겨지는 두개의 에피쎌린/그래뉼린 반복체 사이에서 발견된 것임을 보여준다. 우측에 표시된 것은 Bateman 등 (6)에 따른 반복체의 그래뉼린 분류이다. 그래뉼린 B와 그래뉼린 A는 Plowman 등의 1992 (5)에서는 각각 에피쎌린 2와 에피쎌린 1로 정의되어 있기도 하다.

도 4은 GP88 안티센스 cDNA를 발현 벡터 내로 클로닝시키는데 사용된 제한효소 부위를 나타내는 GP88 cDNA 클론 및 pCMV4를 개략적으로 도시한 것이다.

도 5는 GP88이 타목시펜에 반응하는 MCF-7 세포의 세포사멸의 억제를 도시한다. PARP(폴리(ADP리보오스)폴리머레이즈), 자기사명 표지는 GP88 또는 타목시펜+GP88의 부재 및 타목시펜의 존재하에 분해되어 85kDa 단편을 생성한다.

도 6은 항-GP88 항체가 세포사멸을 유도하는 것을 도시한다. 타목시펜 저항성 MCF-7세포는 Bcl-2을 하향조절 할 수 없다. GP88 항체 또는 타목시펜+GP88 항체의 존재하에, Bcl-2는 하향조절되었다.

도 7은 또한 항-GP88 항체가 세포사멸을 유도하는 것을 도시한다. O4 세포( 과다발현 GP88)는 PARP를 분해할 수 없다. 항-GP88 항체 또는 항 GP88 항체+타목시펜의 존재하에, PARP는 분해되어 세포자멸을 유도하였다.

도 8 역시 항GP88 항체가 세포 사멸을 유도한다는 것을 보여준다. 타목시펜-내성 MCF-7 세포는 PARP를 절단하지 못한다. 항GP88 항체가 존재하거나 또는 항GP88 항체와 타목시펜이 함께 존재하는 경우 PARP는 절단되며, 이는 세포 사멸의 유도를 의미하는 것이다.

도 9는 타목시펜은 생체 내에서 GP88 과발현 세포 (O4 세포) 내에서의 종양 부피의 증가를 유도할 수 있다는 것을 보여준다. 따라서, 타목시펜으로 치료하는 경우, GP88 수준이 상승되는 종양에서의 종양 성장을 증진시킬 위험성을 내포할 수 있다.

실시예 1

GP88 안타고니스트는 타목시펜-처리된 세포에서 세포사멸을 유도한다

GP88 과발현은 타목시펜 처리에 반응하는 Bcl-2mRNA 전사의 하향 조절을 차단한다. GP88을 과발현하는 MCF-7 세포 및 MCF-7 세포(04 세포)를 0 내지 2 ㎛의 타목시펜으로 처리하였다. 도 6. 프라이머로 20ng의 랜덤 헥사머(random hexamer, Gibco))를 이용하여 Super Script II (BRL, Gaithersburg, MD)에 의하여 5㎍의 전체 RNA를 단일 가닥 cDNA 내로 역전사시켰다. 역전사 반응을 10nM Tris-HCl(pH8.3), 2.5mM MgCl₂, 50mM KCl, DTT 0.01M 및 dNTP (각 0.5mM) 내, 42℃에서, 1시간 동안 수행하였다. 증폭된 유전자에 따르는 총 3-~35 PCR 사이클을 수행한 후, 1% 아가로스 겔에 전기영동하였다. 아래와 같은 특이적인 프라이머 쌍을 사용하였다.

글리세랄데히드 3-포스페이트 디하이드로게나제(GAPDH):

forward primer 5'TGAAGGTCGGAGTCAACGGATTTGGT3',

reverse primer 5' CATGTGGGCCATGAGGTCCACCAC3';

Bcl-2:

forward primer 5' GGTGCCACCTGTGGTCCACCTG3',

reverse primer 5'CTTCACTTGTGGCCCAGATAGG3';

Bax:

forward primer 5' GAGCAGATCATGAAGACAGGGG 3',

reverse primer5' CTCCAGCAAGGCCCAGCGTC3';

Bcl-xl:

forward primer 5' CAGTGAGTGAGCAGGTGTTTTGG3',

reverse primer 5' GTTCCACAAAAGTATCCCAGCCG 3'.

도 6에서 보는 바와 같이, Bcl-2는 GP88를 과발현하지 않는 타목시펜 처리된 세포 내에서 하향 조절되었다(라인 1~4 없는 벡터). Bcl-2 하향 조절은, GP88를 과발현하고 타목시펜으로 처리한 세포 내에서 차단되었다(라인 5~8).

실시예 2

항- GP88 항체 5B4는 GP88 를 과발현하는 세포( O4 세포) 또는 타목시펜 내성 세포에서 세포사멸을 유도한다

상기 언급한 바와 같이, PARP의 절단은 세포사멸을 겪고 있는 세포를 표지하는 5kDa의 단편을 방출한다. 항-PARP 항체를 이용한 웨스턴 블로팅 분석은 타목시펜, 항-GP88 항체 및 에스트라디올의 조합을 처리한 세포에서 세포사멸의 존재 또는 부존재를 보여주었다.

MCF-7 세포 또는 04 세포를 5% FBS가 보충된 DMEM/F12 내 60mm 접시에 7x10⁵ 세포 밀도로 유입하였다. 24시간 후, 배지를 담체 또는 정제된 GP88이 보충된 무혈청 무 페놀레드 DMEM/F12로 교환하였다. 24시간 후, 세포를 단독 담체로 또는 타목시펜, 항-GP88 항체, 에스트라디올 또는 담체의 다양한 조합으로 처리하였다. 세포 용해물을 RIPA 완충액(50mM Tris HCl pH7.4, 1% NP-40, 0.25% 나트륨 디옥시콜레이트, 150mM NaCl, 1mM EDTA, 1mM 나트륨 오르쏘바나데이트, 1mM NaF, 프로테아제 억제제) 내, 6M 요소 내로 수집하였다. 각 샘플로부터 얻은 100㎍의 단백질을 항-PARP 항체를 이용한 면역블로팅에 사용하였다. Oncogene Research (San Diego,CA)의 마우스 단클론 항-PARP 항체를 이용하여, PARP의 손상되지 않은 형태와 절단된 형태를 검출하였다. α-액틴을 로딩을 정상화하기 위하여 사용하였다.

도 5에서 보는 바와 같이, GP88은 타목시펜에 의한 세포사멸 유도를 억제한다. 또한, 에스트로겐 수용체 경로의 활성제인 에스트라디올도 타목시펜에 의한 세포사멸 유도를 억제한다. 도 21 및 도 22는 항-GP88 항체 5B4가 GP88를 과발현하는 세포(04 세포) 또는 타목시펜 내성 세포에서 세포사멸을 유도하는 것을 나타낸다.

상기 설명과 실시예는 어디까지나 본 발명의 목적, 특성과 장점을 달성케해주는본 발명의 설명을 위한 구체예로서 제공되는 것이며, 본 발명을 이에 한정하려는 것은 아니다. 아래의 청구항의 정신과 범위에 부합하는 본 발명의 어떠한 변형도 본 발명의 일부로 판단된다.

<110> A & G PHARMACEUTICLA, INC. <120> COMPOSITIONS AND METHODS FOR RESTORING SENSITIVITY OF TUMOR CELLS TO ANTITUMOR THERAPY AND INDUCING APOPTOSIS <150> US60/480,439 <151> 2003-06-23 <160> 17 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 2137 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (23)..(1789) <400> 1 cggaccccga cgcagacaga cc atg tgg gtc ctg atg agc tgg ctg 46 Met Trp Val Leu Met Ser Trp Leu 1 5 gcc ttc gcg gca ggg ctg gta gcc gga aca cag tgt cca gat ggg cag 94 Ala Phe Ala Ala Gly Leu Val Ala Gly Thr Gln Cys Pro Asp Gly Gln 10 15 20 ttc tgc cct gtt gcc tgc tgc ctt gac cag gga gga gcc aac tac agc 142 Phe Cys Pro Val Ala Cys Cys Leu Asp Gln Gly Gly Ala Asn Tyr Ser 25 30 35 40 tgc tgt aac cct ctt ctg gac aca tgg cct aga ata acg agc cat cat 190 Cys Cys Asn Pro Leu Leu Asp Thr Trp Pro Arg Ile Thr Ser His His 45 50 55 cta gat ggc tcc tgc cag acc cat ggc cac tgt cct gct ggc tat tct 238 Leu Asp Gly Ser Cys Gln Thr His Gly His Cys Pro Ala Gly Tyr Ser 60 65 70 tgt ctt ctc act gtg tct ggg act tcc agc tgc tgc ccg ttc tct aag 286 Cys Leu Leu Thr Val Ser Gly Thr Ser Ser Cys Cys Pro Phe Ser Lys 75 80 85 ggt gtg tct tgt ggt gat ggc tac cac tgc tgc ccc cag ggc ttc cac 334 Gly Val Ser Cys Gly Asp Gly Tyr His Cys Cys Pro Gln Gly Phe His 90 95 100 tgt agt gca gat ggg aaa tcc tgc ttc cag atg tca gat aac ccc ttg 382 Cys Ser Ala Asp Gly Lys Ser Cys Phe Gln Met Ser Asp Asn Pro Leu 105 110 115 120 ggt gct gtc cag tgt cct ggg agc cag ttt gaa tgt cct gac tct gcc 430 Gly Ala Val Gln Cys Pro Gly Ser Gln Phe Glu Cys Pro Asp Ser Ala 125 130 135 acc tgc tgc att atg gtt gat ggt tcg tgg gga tgt tgt ccc atg ccc 478 Thr Cys Cys Ile Met Val Asp Gly Ser Trp Gly Cys Cys Pro Met Pro 140 145 150 cag gcc tct tgc tgt gaa gac aga gtg cat tgc tgt ccc cat ggg gcc 526 Gln Ala Ser Cys Cys Glu Asp Arg Val His Cys Cys Pro His Gly Ala 155 160 165 tcc tgt gac ctg gtt cac aca cga tgc gtt tca ccc acg ggc acc cac 574 Ser Cys Asp Leu Val His Thr Arg Cys Val Ser Pro Thr Gly Thr His 170 175 180 acc cta cta aag aag ttc cct gca caa aag acc aac agc gca gtg tct 622 Thr Leu Leu Lys Lys Phe Pro Ala Gln Lys Thr Asn Ser Ala Val Ser 185 190 195 200 ttg cct ttt tct gtc gtg tgc cct gat gct aag acc cag tgt ccc gat 670 Leu Pro Phe Ser Val Val Cys Pro Asp Ala Lys Thr Gln Cys Pro Asp 205 210 215 gat tct acc tgc tgt gag cta ccc act ggg aag tat ggc tgc tgt cca 718 Asp Ser Thr Cys Cys Glu Leu Pro Thr Gly Lys Tyr Gly Cys Cys Pro 220 225 230 atg ccc aat gcc atc tgc tgt tcc gac cac ctg cac tgc tgc ccc cag 766 Met Pro Asn Ala Ile Cys Cys Ser Asp His Leu His Cys Cys Pro Gln 235 240 245 gac act gta tgt gac ctg atc cag agt aag tgc cta tcc aag aac tac 814 Asp Thr Val Cys Asp Leu Ile Gln Ser Lys Cys Leu Ser Lys Asn Tyr 250 255 260 acc acg gat ctc ctg acc aag ctg cct gga tac cca gtg aag gag gtg 862 Thr Thr Asp Leu Leu Thr Lys Leu Pro Gly Tyr Pro Val Lys Glu Val 265 270 275 280 aag tgc gac atg gag gtg agc tgc cct gaa gga tat acc tgc tgc cgc 910 Lys Cys Asp Met Glu Val Ser Cys Pro Glu Gly Tyr Thr Cys Cys Arg 285 290 295 ctc aac act ggg gcc tgg ggc tgc tgt cca ttt gcc aag gcc gtg tgt 958 Leu Asn Thr Gly Ala Trp Gly Cys Cys Pro Phe Ala Lys Ala Val Cys 300 305 310 tgt gac gat cac att cat tgc tgc ccg gca ggg ttt cag tgt cac aca 1006 Cys Asp Asp His Ile His Cys Cys Pro Ala Gly Phe Gln Cys His Thr 315 320 325 gag aaa gga acc tgc gaa atg ggt atc ctc caa gta ggg tgg atg aag 1054 Glu Lys Gly Thr Cys Glu Met Gly Ile Leu Gln Val Gly Trp Met Lys 330 335 340 aag gtc ata gcc ccc ctc cgc ctg cca gac cca cag atc ttg aag agt 1102 Lys Val Ile Ala Pro Leu Arg Leu Pro Asp Pro Gln Ile Leu Lys Ser 345 350 355 360 gat aca cct tgt gat gac ttc act agg tgt cct aca aac aat acc tgc 1150 Asp Thr Pro Cys Asp Asp Phe Thr Arg Cys Pro Thr Asn Asn Thr Cys 365 370 375 tgc aaa ctc aat tct ggg gac tgg ggc tgc tgt ccc atc cca gag gct 1198 Cys Lys Leu Asn Ser Gly Asp Trp Gly Cys Cys Pro Ile Pro Glu Ala 380 385 390 gtc tgc tgc tca gac aac cag cat tgc tgc cct cag ggc ttc aca tgt 1246 Val Cys Cys Ser Asp Asn Gln His Cys Cys Pro Gln Gly Phe Thr Cys 395 400 405 ctg gct cag ggg tac tgt cag aag gga gac aca atg gtg gct ggc ctg 1294 Leu Ala Gln Gly Tyr Cys Gln Lys Gly Asp Thr Met Val Ala Gly Leu 410 415 420 gag aag ata cct gcc cgc cag aca acc ccg ctc caa att gga gat atc 1342 Glu Lys Ile Pro Ala Arg Gln Thr Thr Pro Leu Gln Ile Gly Asp Ile 425 430 435 440 ggt tgt gac cag cat acc agc tgc cca gta ggg caa acc tgc tgc cca 1390 Gly Cys Asp Gln His Thr Ser Cys Pro Val Gly Gln Thr Cys Cys Pro 445 450 455 agc ctc aag gga agt tgg gcc tgc tgc cag ctg ccc cat gct gtg tgc 1438 Ser Leu Lys Gly Ser Trp Ala Cys Cys Gln Leu Pro His Ala Val Cys 460 465 470 tgt gag gac cgg cag cac tgt tgc ccg gcc ggg tac acc tgc aac gtg 1486 Cys Glu Asp Arg Gln His Cys Cys Pro Ala Gly Tyr Thr Cys Asn Val 475 480 485 aag gcg agg acc tgt gag aag gat gtc gat ttt atc cag cct ccc gtg 1534 Lys Ala Arg Thr Cys Glu Lys Asp Val Asp Phe Ile Gln Pro Pro Val 490 495 500 ctc ctg acc ctc ggc cct aag gtt ggg aat gtg gag tgt gga gaa ggg 1582 Leu Leu Thr Leu Gly Pro Lys Val Gly Asn Val Glu Cys Gly Glu Gly 505 510 515 520 cat ttc tgc cat gat aac cag acc tgt tgt aaa gac agt gca gga gtc 1630 His Phe Cys His Asp Asn Gln Thr Cys Cys Lys Asp Ser Ala Gly Val 525 530 535 tgg gcc tgc tgt ccc tac cta aag ggt gtc tgc tgt aga gat gga cgt 1678 Trp Ala Cys Cys Pro Tyr Leu Lys Gly Val Cys Cys Arg Asp Gly Arg 540 545 550 cac tgt tgc ccc ggt ggc ttc cac tgt tca gcc agg gga acc aag tgt 1726 His Cys Cys Pro Gly Gly Phe His Cys Ser Ala Arg Gly Thr Lys Cys 555 560 565 ttg cga aag aag att cct cgc tgg gac atg ttt ttg agg gat ccg gtc 1774 Leu Arg Lys Lys Ile Pro Arg Trp Asp Met Phe Leu Arg Asp Pro Val 570 575 580 cca aga ccg cta ctg t aaggaagggc tacagactta aggaactcca cagtcctggg 1830 Pro Arg Pro Leu Leu 585 aaccctgttc cgagggtacc cactactcag gcctccctag cgcctcctcc cctaacgtct 1890 ccccggccta ctcatcctga gtcaccctat caccatggga ggtggagcct caaactaaaa 1950 ccttctttta tggaaagaag gctctggcca aaagccccgt atcaaactgc catttcttcc 2010 ggtttctgtg gaccttgtgg ccaggtgctc ttcccgagcc acaggtgttc tgtgagcttg 2070 cttgtgtgtg tgtgcgcgtg tgcgtgtgtt gctccaataa agtttgtacg ctttctgaaa 2130 aaaaaaa 2137 <210> 2 <211> 589 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 2 Met Trp Val Leu Met Ser Trp Leu Ala Phe Ala Ala Gly Leu Val Ala 1 5 10 15 Gly Thr Gln Cys Pro Asp Gly Gln Phe Cys Pro Val Ala Cys Cys Leu 20 25 30 Asp Gln Gly Gly Ala Asn Tyr Ser Cys Cys Asn Pro Leu Leu Asp Thr 35 40 45 Trp Pro Arg Ile Thr Ser His His Leu Asp Gly Ser Cys Gln Thr His 50 55 60 Gly His Cys Pro Ala Gly Tyr Ser Cys Leu Leu Thr Val Ser Gly Thr 65 70 75 80 Ser Ser Cys Cys Pro Phe Ser Lys Gly Val Ser Cys Gly Asp Gly Tyr 85 90 95 His Cys Cys Pro Gln Gly Phe His Cys Ser Ala Asp Gly Lys Ser Cys 100 105 110 Phe Gln Met Ser Asp Asn Pro Leu Gly Ala Val Gln Cys Pro Gly Ser 115 120 125 Gln Phe Glu Cys Pro Asp Ser Ala Thr Cys Cys Ile Met Val Asp Gly 130 135 140 Ser Trp Gly Cys Cys Pro Met Pro Gln Ala Ser Cys Cys Glu Asp Arg 145 150 155 160 Val His Cys Cys Pro His Gly Ala Ser Cys Asp Leu Val His Thr Arg 165 170 175 Cys Val Ser Pro Thr Gly Thr His Thr Leu Leu Lys Lys Phe Pro Ala 180 185 190 Gln Lys Thr Asn Ser Ala Val Ser Leu Pro Phe Ser Val Val Cys Pro 195 200 205 Asp Ala Lys Thr Gln Cys Pro Asp Asp Ser Thr Cys Cys Glu Leu Pro 210 215 220 Thr Gly Lys Tyr Gly Cys Cys Pro Met Pro Asn Ala Ile Cys Cys Ser 225 230 235 240 Asp His Leu His Cys Cys Pro Gln Asp Thr Val Cys Asp Leu Ile Gln 245 250 255 Ser Lys Cys Leu Ser Lys Asn Tyr Thr Thr Asp Leu Leu Thr Lys Leu 260 265 270 Pro Gly Tyr Pro Val Lys Glu Val Lys Cys Asp Met Glu Val Ser Cys 275 280 285 Pro Glu Gly Tyr Thr Cys Cys Arg Leu Asn Thr Gly Ala Trp Gly Cys 290 295 300 Cys Pro Phe Ala Lys Ala Val Cys Cys Asp Asp His Ile His Cys Cys 305 310 315 320 Pro Ala Gly Phe Gln Cys His Thr Glu Lys Gly Thr Cys Glu Met Gly 325 330 335 Ile Leu Gln Val Gly Trp Met Lys Lys Val Ile Ala Pro Leu Arg Leu 340 345 350 Pro Asp Pro Gln Ile Leu Lys Ser Asp Thr Pro Cys Asp Asp Phe Thr 355 360 365 Arg Cys Pro Thr Asn Asn Thr Cys Cys Lys Leu Asn Ser Gly Asp Trp 370 375 380 Gly Cys Cys Pro Ile Pro Glu Ala Val Cys 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atgtgacatg gaggtgagct gcccagatgg ctatacctgc 900 tgccgtctac agtcgggggc ctggggctgc tgccctttta cccaggctgt gtgctgtgag 960 gaccacatac actgctgtcc cgcggggttt acgtgtgaca cgcagaaggg tacctgtgaa 1020 caggggcccc accaggtgcc ctggatggag aaggccccag ctcacctcag cctgccagac 1080 ccacaagcct tgaagagaga tgtcccctgt gataatgtca gcagctgtcc ctcctccgat 1140 acctgctgcc aactcacgtc tggggagtgg ggctgctgtc caatcccaga ggctgtctgc 1200 tgctcggacc accagcactg ctgcccccag cgatacacgt gtgtagctga ggggcagtgt 1260 cagcgaggaa gcgagatcgt ggctggactg gagaagatgc ctgcccgccg cggttcctta 1320 tcccacccca gagacatcgg ctgtgaccag cacaccagct gcccggtggg cggaacctgc 1380 tgcccgagcc agggtgggag ctgggcctgc tgccagttgc cccatgctgt gtgctgcgag 1440 gatcgccagc actgctgccc ggctggctac acctgcaacg tgaaggctcg atcctgcgag 1500 aaggaagtgg tctctgccca gcctgccacc ttcctggccc gtagccctca cgtgggtgtg 1560 aaggacgtgg agtgtgggga aggacacttc tgccatgata accagacctg ctgccgagac 1620 aaccgacagg gctgggcctg ctgtccctac gcccagggcg tctgttgtgc tgatcggcgc 1680 cactgctgtc ctgctggctt ccgctgcgca cgcaggggta ccaagtgttt gcgcagggag 1740 gccccgcgct gggacgcccc tttgagggac ccagccttga gacagctgct gtgagggaca 1800 gtactgaaga ctctgcagcc ctcgggaccc cactcggagg gtgccctctg ctcaggcctc 1860 cctagcacct ccccctaacc aaattctccc tggaccccat tctgagctcc ccatcaccat 1920 gggaggtggg gcctcaatct aaggcccttc cctgtcagaa gggggttgag gcaaaagccc 1980 attacaagct gccatcccct ccccgtttca gtggaccctg tggccaggtg cttttcccta 2040 tccacagggg tgtttgtgtg ttgggtgtgc tttcaataaa gtttgtcact ttctt 2095 <210> 4 <211> 1676 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Met Glu Thr Thr Arg Pro Thr His Arg Leu Glu Val Ala Leu Ser Glu 1 5 10 15 Arg Thr Arg Pro Val Ala Leu Ala Leu Ala Leu Glu Thr His Arg Ala 20 25 30 Leu Ala Gly Leu Tyr Leu Glu Val Ala Leu Ala Leu Ala Gly Leu Tyr 35 40 45 Thr His Arg Ala Arg Gly Cys Tyr Ser Pro Arg Ala Ser Pro Gly Leu 50 55 60 Tyr Gly Leu Asn Pro His Glu Cys Tyr Ser Pro Arg Val Ala Leu Ala 65 70 75 80 Leu Ala Cys Tyr Ser Cys Tyr Ser Leu Glu Ala Ser Pro Pro Arg Gly 85 90 95 Leu Tyr Gly Leu Tyr Ala Leu Ala 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Tyr Ser Pro Arg Thr Tyr Arg Ala Leu Ala Gly Leu Asn Gly 1540 1545 1550 Leu Tyr Val Ala Leu Cys Tyr Ser Cys Tyr Ser Ala Leu Ala Ala Ser 1555 1560 1565 Pro Ala Arg Gly Ala Arg Gly His Ile Ser Cys Tyr Ser Cys Tyr Ser 1570 1575 1580 Pro Arg Ala Leu Ala Gly Leu Tyr Pro His Glu Ala Arg Gly Cys Tyr 1585 1590 1595 1600 Ser Ala Leu Ala Ala Arg Gly Ala Arg Gly Gly Leu Tyr Thr His Arg 1605 1610 1615 Leu Tyr Ser Cys Tyr Ser Leu Glu Ala Arg Gly Ala Arg Gly Gly Leu 1620 1625 1630 Ala Leu Ala Pro Arg Ala Arg Gly Thr Arg Pro Ala Ser Pro Ala Leu 1635 1640 1645 Ala Pro Arg Leu Glu Ala Arg Gly Ala Ser Pro Pro Arg Ala Leu Ala 1650 1655 1660 Leu Glu Ala Arg Gly Gly Leu Asn Leu Glu Leu Glu 1665 1670 1675 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polynucleotide sequence <400> 5 aggttgatgc ccactgctct g 21 <210> 6 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polynucleotide sequence <400> 6 gagcaguggg caucaaccug g 21 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> 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<212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic PCR primer <400> 15 cagtgagtga gcaggtgttt tgg 23 <210> 16 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic PCR primer <400> 16 gttccacaaa agtatcccag ccg 23 <210> 17 <211> 55 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> consensus sequence <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(7) <223> variable amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (9)..(13) <223> variable amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (16)..(20) <223> variable amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (22)..(25) <223> variable amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (28)..(33) <223> variable amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (36) <223> variable amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (38)..(39) <223> variable amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (44)..(47) <223> variable amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (49)..(54) <223> variable amino acid <400> 17 Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Cys Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Cys Cys Xaa Asp Xaa Xaa His Cys Cys Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Cys 35 40 45 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys 50 55

Claims (29)

1. 항에스트로겐 요법의 항종양형성 효과에 대하여 둔감한 종양 세포를, 항에스트로겐 요법의 항종양형성 효과에 대한 감수성을 회복시키는 데에 유효한 양의 GP88 안타고니스트와 접촉시키는 것을 포함하는, 항에스트로겐 요법의 항종양형성 효과에 대한 감수성을 회복시키는 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 항에스트로겐 요법은 타목시펜, 랄록시펜, 아로마타제 억제제 및 에스트로겐 수용체 하향 조절제로 구성된 군에서 선택되는 것인 방법.
3. 제1항에 있어서, 상기 GP88 안타고니스트는 항GP88 항체 또는 항체 단편인 방법.
4. 제3항에 있어서, 상기 항GP88 항체 또는 항체 단편은 6B3 하이브리도마 세포주 (ATCC 기탁 번호 PTA-5262), 6B2 하이브리도마 세포주 (ATCC 기탁 번호 PTA-5261),6C12 하이브리도마 세포주 (ATCC 기탁 번호 PTA-5597), 5B4 하이브리도마 세포주 (ATCC 기탁 번호 PTA-5260), 5G6 하이브리도마 세포주 (ATCC 기탁 번호 PTA-5595), 4D1 하이브리도마 세포주 (ATCC 기탁 번호 PTA-5593), 3F8 하이브리도마 세포주 (ATCC 기탁 번호 PTA-5591), 3F5 하이브리도마 세포주 (ATCC 기탁 번호 PTA-5259), 3F4 하이브리도마 세포주 (ATCC 기탁 번호 PTA-5590), 3G2 (ATCC 기탁 번호 PTA-5592) 및 2A5 하이브리도마 세포주 (ATCC 기탁 번호 PTA-5589)로 구성되는 군에서 선택되는 하이브리도마 세포주로부터 생산되는 것인 방법.
5. 제1항에 있어서, 상기 GP88 안타고니스트는 항GP88 수용체 항체인 방법.
6. 제5항에 있어서, 상기 항체는 6G8 하이브리도마 세포주 (ATCC 기탁 번호 PTA-5263) 및 5A8 하이브리도마 세포주 (ATCC 기탁 번호 PTA-5594)로 구성되는 군에서 선택되는 하이브리도마 세포주로부터 생산되는 것인 방법.
7. 제1항에 있어서, 상기 GP88 안타고니스트는 GP88 안티센스 핵산인 방법.
8. 제7항에 있어서, 상기 GP88 안타고니스트는 siRNA인 방법.
9. 제7항에 있어서, 상기 GP88 안티센스 핵산은 GP88 mRNA에 대하여 상보성이어서 상기 안티센스 핵산과 상기 GP88 mRNA 사이의 혼성화를 야기하여 GP88의 발현을 억제하는 것인 방법.
10. 제1항에 있어서, 상기 종양은 전립선, 두부 및 목(head and neck), 코인두, 갑상선, 췌장, 방광, 목(cervix), 직장결장(colorectal), 혈액, 간, 신장, 유방, 골(bone), 골수, 고환, 난소, 뇌, 신경, 결장 및 폐 종양으로 구성되는 군에서 선 택되는 것인 방법.
11. 종양 세포의 세포사멸을 유도하는 데에 유효한 양의 GP88 안타고니스트를 종양 세포에 접촉시키는 것을 포함하는, 종양 세포 내에서 세포사멸을 유도하는 방법.
12. 제11항에 있어서, 상기 종양 세포는 전립선, 두부 및 목, 신경, 코인두, 갑상선, 방광, 목, 직장결장, 혈액, 간, 신장, 유방, 골, 췌장, 골수, 고환, 난소, 뇌, 신경, 결장 및 폐 종양으로 구성되는 군에서 선택되는 것인 방법.
13. 제11항에 있어서, 상기 GP88 안타고니스트는 항GP88 항체 또는 항체 단편인 방법.
14. 제13항에 있어서, 상기 항GP88 항체 또는 항체 단편은 6B3 하이브리도마 세포주 (ATCC 기탁 번호 PTA-5262), 6B2 하이브리도마 세포주 (ATCC 기탁 번호 PTA-5261),6C12 하이브리도마 세포주 (ATCC 기탁 번호 PTA-5597), 5B4 하이브리도마 세포주 (ATCC 기탁 번호 PTA-5260), 5G6 하이브리도마 세포주 (ATCC 기탁 번호 PTA-5595), 4D1 하이브리도마 세포주 (ATCC 기탁 번호 PTA-5593),3F8 하이브리도마 세포주 (ATCC 기탁 번호 PTA-5591), 3F5 하이브리도마 세포주 (ATCC 기탁 번호 PTA-5259), 3F4 하이브리도마 세포주 (ATCC 기탁 번호 PTA-5590), 3G2 (ATCC 기탁 번호 PTA-5592) 및 2A5 하이브리도마 세포주 (ATCC 기탁 번호 PTA-5589)로 구성되는 군에서 선택되는 하이브리도마 세포주로부터 생산되는 것인 방법.
15. 제11항에 있어서, 상기 GP88 안타고니스트는 항GP88 수용체 항체인 방법.
16. 제18항에 있어서, 상기 항체는 6G8 하이브리도마 세포주 (ATCC 기탁 번호 PTA-5263) 및 5A8 하이브리도마 세포주 (ATCC 기탁 번호 PTA-5594)로 구성되는 군에서 선택되는 하이브리도마 세포주로부터 생산되는 것인 방법.
17. 제11항에 있어서, 상기 GP88 안타고니스트는 GP88 안티센스 핵산인 방법.
18. 제11항에 있어서, 상기 GP88 안타고니스트는 siRNA인 방법.
19. GP88 안타고니스트 및 항에스트로겐을 종양 세포에 접촉시켜 상기 종양 세포 내에서 세포사멸을 유도하는 것을 포함하는, 종양 세포 내에서 세포사멸을 유도하는 방법.
20. 제19항에 있어서, 상기 항에스트로겐은 타목시펜, 랄록시펜, 아로마타제 억제제 및 에스트로겐 수용체 조절 억제제로 구성되는 군에서 선택되는 것인 방법.
21. 제19항에 있어서, 상기 종양 세포는 전립선, 두부 및 목, 코인두, 목, 직장결장, 방광, 갑상선, 췌장, 혈액, 간, 신장, 유방, 골, 골수, 고환, 난소, 뇌, 신경, 결장 및 폐 종양으로 구성되는 군에서 선택되는 종량으로부터 유래하는 것인 방법.
22. 세포를 세포 독성 요법에 대한 응답성을 회복시키는 데에 충분한 양의 GP88 안타고니스트와 접촉시키는 것을 포함하는, 세포 독성 요법에 대한 응답성을 회복시키는 방법.
23. 제22항에 있어서, 상기 세포 독성 요법은 알트레타민, 블레오마이신, 부술판, 칼슘 폴리네이트, 카페시타빈, 카보플라틴, 카무스틴, 클로람부실, 시스플라틴, 클라드리빈, 크리산타스파제, 사이클로포스파미드, 시타라빈, 다카바진, 닥티노마이신, 다우노루비신, 도세탁셀, 독소루비신, 에피루비신, 에토포시드, 플루다라빈, 플루오로우라실, 젬시타빈, 하이드록시우레아, 이다루비신, 이포스파미드, 이리노테칸, 리포솜성(liposomal) 독소루비신, 로무스틴, 멜팔란, 머캅토퓨린, 메토트렉세이트, 미토마이신, 미토크산트론, 옥살리플라틴, 파클리탁셀, 펜토스타틴, 프로카바진, 랄티트렉세드, 스트렙토조신, 테가퍼-우라실, 테모졸로미드, 티오테파, 티오구아닌(tioguanine)/티오구아닌(thioguanine), 토포테칸, 트레오술판, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 빈데신 및 비노렐빈으로 구성되는 군에서 선택되는 화학요법제를 종양 세포에 투여하는 것을 포함하는 것인 방법.
24. GP88 안타고니스트, 제2의 항종양형성제 및 제약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는, 항에스트로겐 요법의 항종양형성 효과에 대한 감수성 회복용 의약 조성물.
25. 제24항에 있어서, 상기 제약학적으로 허용 가능한 담체는 정제, 환약, 주사, 주입, 흡입, 경피 패치 및 좌약으로 구성되는 군에서 선택되는 것인 조성물.
26. 제24항에 있어서, 상기 항종양형성제는 항에스트로겐을 포함하는 것인 조성물.
27. 제26항에 있어서, 상기 항에스트로겐은 타목시펜, 랄록시펜, 아로마타제 억제제 및 에스트로겐 수용체 조절 억제제로 구성되는 군에서 선택되는 것인 조성물.
28. 제24항에 있어서, 상기 제2의 항종양형성 화합물은 세포 독성 화합물을 포함하는 것인 조성물.
29. 제26항에 있어서, 상기 세포 독성 화합물은 알트레타민, 블레오마이신, 부술판, 칼슘 폴리네이트, 카페시타빈, 카보플라틴, 카무스틴, 클로람부실, 시스플라틴, 클라드리빈, 크리산타스파제, 사이클로포스파미드, 시타라빈, 다카바진, 닥티 노마이신, 다우노루비신, 도세탁셀, 독소루비신, 에피루비신, 에토포시드, 플루다라빈, 플루오로우라실, 젬시타빈, 하이드록시우레아, 이다루비신, 이포스파미드, 이리노테칸, 리포솜성 독소루비신, 로무스틴, 멜팔란, 머캅토퓨린, 메쏘트렉세이트, 미토마이신, 미토크산트론, 옥살리플라틴, 파클리탁셀, 펜토스타틴, 프로카바진, 랄티트렉세드, 스트렙토조신, 테가퍼-우라실, 테모졸로미드, 티오테파, 티오구아닌/티오구아닌, 토포테칸, 트레오술판, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 빈데신 및 비노렐빈으로 구성되는 군에서 선택되는 것인 조성물.

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