KR20190040585A - Human Stm1 (hStm1) 유전자의 발현 또는 hSTM1 단백질의 활성을 억제하는 물질을 포함하는, 위암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 hStm1 유전자의 발현 또는 hSTM1 단백질의 활성을 억제하는 제제; 및 위암 치료제를 포함하는, 위암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

Description

Human Stm1 (hStm1) 유전자의 발현 또는 hSTM1 단백질의 활성을 억제하는 물질을 포함하는, 위암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 {Pharmaceutical Composition for Preventing or Treating Stomach Cancer comprising inhibitor for expressing of human Stm1 polynucleotide and hSTM1 protein}

본 발명은 (i) hStm1 유전자의 발현 또는 hSTM1 단백질의 활성을 억제하는 제제; 및 (ii) 위암 치료제를 유효성분으로 포함하는, 위암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 대한 것이다.

인간 세포에는 다수의 수용체 종류가 존재하며, 그 중 G-단백질 결합 수용체 (G-protein coupled receptor, 이하 "GPCRs"라 함)가 막에 결합된 수용체 중 가장 큰 부류이다. 사람 게놈 내에는 대략 30,000개의 유전자가 있는 것으로 추산되고, 이들 중에서도 약 1,000개의 유전자가 GPCRs를 암호화하는 것으로 알려져 있다. GPCRs는 다양한 범위의 조직 및 세포 유형에서 발견되고 많은 상이한 생리학적 기전과 연관이 있다. 그것들은 넓은 범위의 리간드, 예를 들어, 갑상선자극호르몬 (PTH), 부신피질자극호르몬, 글루카곤 및 바소프레신과 같은 호르몬 5-HT, 아세틸콜린(무스카린성 AchR), 히스타민 같은 아민류 LPA, S1P 같은 지질류 아미노산 및 Ca²⁺, 핵산, 펩티드, 빛 등과 같은 다양한 신호전달물질에 의해 활성화된다. 잠재적으로 좋은 표적은 정상 세포에서 결핍되거나 과소 발현되지만 세포 증식 또는 생존과 관련된 암세포에서 풍부하게 발현되는 단백질이다. GPCRs과 관계된 단백질 중 하나인 hSTM1 단백질이 위에서 그 발현양이 비정상적으로 높을 경우 암을 유발하는 것으로 밝혔으므로, 이의 발현을 억제하는 경우 위암 치료에 효과가 있을 것을 기대하였다. 또한 hSTM1은 기능적으로 아미노산 트랜스 포터이다. 종양 세포는 빠른 세포 성장을 유지하기 위해 아미노산에 대한 증가된 요구를 충족시키기 위해 정상 세포보다 높은 수준에서 선택적 아미노산 수송체를 발현한다. 종양에서 선택적 아미노산 전달체의 발현이 현저한 차이를 보인다면, 이들은 표적화된 암 치료를 위한 약물 표적으로서의 가능성을 갖는다. 아미노산 수송체 SLC1A5, SLC7A5, SLC7A11 및 SLC6A14 중 4 종은 암에서 과발현되는 것으로 알려져 있다. 상기 아미노산 수송체의 유도는 종양 유전자 c-Myc의 직접 또는 간접적인 참여로 암 유형별로 발생한다. SLC7A5는 c-Myc의 표적 인 SLC1A5에 기능적으로 결합되어 있으며, mTOR 경로를 활성화시킨다.

또한, 일반적으로 항암 치료제로 사용되는 물질들은 상당한 독성을 지니고 있어, 암세포만을 선택적으로 제거하지 못하므로, 암의 발생 후 이의 치료뿐 아니라, 암의 발생을 예방하기 위한 독성이 적고 효과적인 항암제의 개발이 요구되고 있다.

항암제는 악성 종양을 치료하기 위해 사용하는 방법들 중 수술이나 방사선 요법을 제외한 화학요법제를 총칭하는 것으로, 주로 핵산의 합성을 저해하여 항암 활성을 나타내는 물질을 의미한다. 그러나, 화학요법제의 가장 큰 문제는 약제 내성으로, 항암제에 의한 초기의 성공적인 반응에도 불구하고 결국에는 치료가 실패하게 되는 주요 요인이다. 이에 따라 약제 내성을 감소시킬 수 있는 새로운 작용점의 항암제 개발이 절실히 요구되고 있다.

또한, 암세포의 발생과 증식에는 여러 유전자 및 단백질이 관여하는데, 많은 티로신 키나아제 저해제가 이러한 유전자 및 단백질을 표적으로 하여 티로신 키나아제를 억제한다. 표적항암치료를 위해 사용되는 티로신 키나아제 저해제는 약물 투여 후 돌연변이가 일어나 획득 내성이 생기는 문제가 있다.

이러한 배경하에, 본 발명자들은 약물내성을 극복하고 위암을 효과적으로 치료할 수 있는 위암 치료제를 개발하기 위하여 예의 연구 노력한 결과, hStm1 유전자의 발현 또는 hSTM1 단백질의 활성을 억제하는 제제와 위암 치료제를 병용투여 하였을 때 서로의 활성을 증폭시켜 항암활성을 높인다는 것을 발견하였고, 이를 포함하는 조성물이 기존 약물에 대한 내성을 감소시키고, 위암의 예방 또는 치료용 조성물로 활용될 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 주된 목적은 (i) hStm1 유전자의 발현 또는 hSTM1 단백질의 활성을 억제하는 제제; 및 (ii) 위암 치료제를 유효성분으로 포함하는, 위암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는, 위암의 예방 또는 치료용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물 또는 키트를 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 위암의 예방 또는 치료방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 위암의 예방 또는 치료를 위한 의약품의 제조에 있어, 상기 조성물 또는 키트의 용도를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한, 본 발명의 하나의 양태는 (i) hStm1 유전자의 발현 또는 hSTM1 단백질의 활성을 억제하는 제제; 및 (ii) 위암 치료제를 유효성분으로 포함하는, 위암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 hStm1 유전자 (이하 "본 발명의 hStm1 폴리뉴클레오티드", "본 발명의 hSTM1 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드"라 한다)는 인간 게놈에 존재하는 유전자로서, 본 발명자들에 의해 그 기능이 최초로 동정된 유전자이다. 상기 폴리뉴클레오티드는 cDNA 서열로서 해독되지 않는 영역을 포함하고, 가장 긴 전사체는 약 2279개의 뉴클레오티드 길이를 가지며, isoform 1은 약 30 kDa, isoform 2는 약 23 kDa 분자량의 단백질 (해독 후 변형물은 제외)을 코딩한다. isofrom 2는 isoform 1의 N-말단 65개의 아미노산이 결손되어 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 hSTM1 단백질을 생산할 수 있고, 상기 폴리뉴클레오티드에 의해 생산된 단백질의 구체적인 기능은 인간에 존재하는 수용체를 코딩하는 신규 유전자로, 상기 유전자가 코딩하는 hSTM1은 PQ 모티프 (motif) (시스티노신 (cystinosin)을 라이소좀으로 이동시키는데 중요하다고 알려진 모티프)를 가지는 단백질로서 PQLC2로도 명명되고 두 개의 이소폼 (isoform)을 코딩한다.

본 발명의 hStm1 유전자는, 본 발명의 신규한 hSTM1 단백질을 코딩할 수 있는 모든 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고, 이러한 서열은 코돈의 축퇴성 (degeneracy), 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 코딩 영역으로부터 발현되는 단백질을 구성하는 아미노산을 변화시키지 않는 범위 내에서 다양한 변형이 이루어질 수 있음은 당업자에게 자명하다. 또한 코딩 영역을 제외한 부분에서도 상기 폴리뉴클레오티드의 발현에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 다양한 변형 또는 수식이 일어날 수 있으며, 이렇게 변형된 유전자 또한 본 발명의 범위에 포함된다. 즉, 본 발명의 폴리뉴클레오티드와 동일한, 또는 실질적으로 동일한 생물학적 활성을 가지는 범위 내에서 다양한 변형 또는 수식이 일어난 서열을 모두 포함하며, 따라서 구체적으로는 서열번호 1과 적어도 70% 이상, 구체적으로는 적어도 80% 이상, 더욱 구체적으로는 90% 이상, 가장 구체적으로는 95% 이상의 상동성을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 유전자를 포함한다.

본 발명에서의 "hSTM1 (human seven transmembrane protein 1) 단백질"은 위에서 그 발현양이 비정상적으로 높을 경우 암을 유발하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 본 발명에서는 hSTM1 단백질의 발현을 억제하는 물질을 이용하여 위암의 예방 또는 치료를 하고자 노력하였다.

본 발명의 목적상 hSTM1 단백질은, 위암의 예방, 치료 또는 전이 억제용 타겟으로 사용될 수 있으며, 상기 단백질 전체 또는 일부에 대한 단편을 포함한다. 또한 본 발명에서의 hSTM1 단백질은 서열번호 2 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 단편은 적어도 10개, 20개, 30개 또는 40개의 아미노산, 구체적으로는 50개 이상의 아미노산, 더욱 구체적으로는 75개 이상, 100개 이상의 아미노산, 보다 구체적으로는 150개 이상의 아미노산을 포함하는 단편일 수 있으며, 상기 단편 서열은 단백질 서열과 적어도 50% 이상, 구체적으로는 적어도 60%, 70%, 80% 이상, 더욱 구체적으로는 90% 이상, 보다 더욱 구체적으로는 95% 이상, 가장 구체적으로는 98% 이상의 상동성을 갖는 단백질 서열일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서는 위암 세포주에서 hStm1 유전자의 발현 또는 hSTM1 단백질의 활성을 억제시키는 경우 위암 세포의 증식을 억제할 수 있음을 확인하였다. 따라서 본 발명의 hStm1 유전자의 발현 또는 hSTM1 단백질의 활성을 억제하는 제제는 위암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로 사용될 수 있다.

본 발명의 구체적인 일 양태로서 hStm1 유전자의 발현을 억제하는 제제는, hStm1 유전자에 특이적인 안티센스 올리고 뉴클레오티드, shRNA, siRNA 또는 앱타머인 것 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 상기 hSTM1 단백질의 활성을 억제하는 제제는 hSTM1 단백질에 특이적인 항체인 것 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 용어 "발현 또는 활성을 억제하는 물질"이란 상기 hStm1 유전자의 발현을 감소시키는 물질 또는 hSTM1 단백질의 발현을 감소시키는 물질 또는 이들의 활성을 억제시키는 물질을 통칭하는 의미로 사용되며, 보다 구체적으로는 hStm1 유전자의 발현을 전사 수준 또는 단백질 수준에서 감소시키는 모든 물질을 포함할 수 있다. 상기 hSTM1 단백질의 발현 또는 활성을 억제하는 물질은 hSTM1 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 표적으로 하여 hSTM1 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 발현을 억제할 수 있는 화합물, 핵산, 펩타이드, 바이러스 또는 상기 핵산을 포함하는 벡터 등 그 형태에 제한 없이 사용 가능하다. 구체적으로, hSTM1 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 mRNA의 발현을 억제하는 올리고 뉴클레오티드 또는 siRNA일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 hSTM1 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 발현 억제제는 위암의 예방 및 치료에 효과적으로 사용될 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어 "올리고 뉴클레오티드"는 수 개 내지 수십 개의 뉴클레오티드가 인산디에스테르 결합(phosphodiester bond)으로 중합되어 형성된 중합체를 의미한다. 상기 hStm1 유전자 mRNA의 발현을 저해하는 올리고 뉴클레오티드로의 예로, 구체적으로는 hStm1 유전자에 특이적인 안티센스 올리고 뉴클레오티드(antisense oligonucleotides), 또는 siRNA(small interfering RNA) 등을 들 수 있으나 이들에 한정되지 아니한다. 본 발명에서 사용되는 올리고 뉴클레오티드로 보다 구체적으로는 siRNA를 사용할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어 "안티센스 올리고 뉴클레오티드"는 특정 mRNA의 서열에 상보적인 핵산 서열을 함유하고 있는 DNA 또는 RNA, 또는 이들의 유도체를 의미하는 것으로서 mRNA 내의 상보적인 서열에 결합하여 mRNA의 단백질로의 번역을 저해하는 작용을 한다. 본 발명에서 상기 hStm1 유전자 mRNA의 발현을 저해하는 올리고 뉴클레오티드는 hStm1 유전자 mRNA에 상보적인 서열을 갖는 DNA 또는 RNA, 또는 이들의 유도체로서, 상기 hStm1 유전자 mRNA에 결합하여 상기 hStm1 유전자 mRNA의 번역, 세포질 내로의 전위(translocation), 성숙(maturation) 등을 방해하거나 또는 hStm1 유전자 mRNA의 그 밖의 다른 모든 생물학적 기능 또는 활성을 저해할 수 있다. 본 발명의 안티센스 올리고 뉴클레오티드는 본 발명의 hStm1 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하여 사용될 수 있다.

상기 안티센스 올리고 뉴클레오티드의 길이는 특별히 제한되지 아니하나, 구체적으로는 6 내지 80뉴클레오티드를 가질 수 있고, 보다 구체적으로는 8 내지 60 뉴클레오티드를 가질 수 있으며, 더욱 구체적으로는 10 내지 40 뉴클레오티드를 가질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 안티센스 올리고 뉴클레오티드는 당해 기술 분야에서 사용되는 통상의 방법에 따라 생체 내(in vivo) 에서 합성되거나, 시험관 내(in vitro) 에서 합성되어 생체 내로 투여될 수 있다. 생체 내에서 안티센스 RNA를 합성하는 방법의 비제한적인 예로 다중 클로닝 부위(Multi-cloning site; MCS)의 기원(origin)이 반대 방향에 있는 벡터를 사용하여 안티센스 RNA가 전사되도록 하는 방법을 들 수 있다. 시험관 내에서 안티센스 RNA를 합성하는 방법의 비제한적인 예로 RNA 중합효소 I을 이용하는 방법을 들 수 있다.

본 발명의 hStm1 유전자 mRNA의 발현을 억제하는 안티센스 올리고 뉴클레오티드는 hStm1 유전자의 염기 서열을 참조하여 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 공지의 방법에 따라 쉽게 제작할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어 "siRNA"는 RNA 간섭(interference) 또는 유전자 사일런싱(silencing)을 매개할 수 있는 핵산 분자이다. 보통 21 내지 25 뉴클레오티드 크기의 작은 RNA 조각을 의미하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 siRNA는 표적 유전자의 발현을 저해할 수 있기 때문에 효율적인 유전자 녹다운(knockdown) 방법 또는 유전자 치료 방법으로 사용될 수 있다. 이중 가닥의 RNA가 다이서(dicer)에 의해 절단되어 생성될 수 있는 상기 siRNA는 상보적인 서열을 갖는 mRNA에 특이적으로 결합하여 해당 mRNA의 발현을 억제할 수 있다. 본 발명의 목적상, hStm1 유전자의 발현을 억제하는데 사용될 수 있다. 구체적으로 본 발명에서 사용된 siRNA는 서열번호 5 또는 6일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 사용되는 용어 "shRNA (short hairpin RNA)"는 siRNA 타겟 서열의 센스 및 안티센스 서열이 5-9개의 염기로 구성된 루프 (loop)를 사이에 두고 위치한 짧은 헤어핀 RNA (short hairpin RNA)를 의미한다. 본 발명의 목적상, hStm1 유전자의 발현을 억제하는데 사용될 수 있다. 구체적으로 본 발명에서 사용된 shRNA는 서열번호 3 또는 4일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 사용될 수 있는 siRNA 및 shRNA는 hStm1 유전자의 염기 서열을 참조하여 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 공지의 방법에 따라 쉽게 제작할 수 있다. 상기 siRNA를 제작하는 방법의 비제한적인 예로는 siRNA를 직접 화학적으로 합성하는 방법, 시험관 내 전사를 이용하여 siRNA를 합성하는 방법, 시험관 내 전사에 의해 합성된 긴 이중 가닥 RNA를 다이서를 이용해 절단하여 제작하는 방법, siRNA 발현 플라스미드 또는 바이러스성 벡터의 세포 내 전달을 통하여 발현시키는 방법 또는 PCR(polymerase chain reaction) 유도 siRNA 발현 카세트(cassette)의 세포 내 전달을 통하여 발현시키는 방법 등을 들 수 있다.

본 발명의 siRNA 또는 shRNA를 포함하는 조성물은, 이들 RNAs를 이용한 유전자 치료에서 이용되는 통상적인 방법에 따라 개체에 투여되어 발암 또는 전이 유전자의 발현을 저해할 수 있다. 예를 들면 Filleur 등, Cancer Res., 63(14): 3919-22, 2003 등의 문헌에 따라, 적은 양의 정맥 주사 방법 (low-volume intravenous injection)에 의해 siRNA로 유전자 발현 조절이 가능할 수 있다. 또한 siRNA 생체 내 흡수량과 안정성을 증가시키기 위하여 Chien 등, Cancer Gene Ther., 12(3) 321-8, 2005 등의 문헌에 따라 siRNA 주입에 있어서, 복합체를 제조하여 사용할 수도 있다.

본 발명에서 사용되는 용어 "앱타머"는 단일 가닥 올리고 뉴클레오티드로를 의미하는 것으로, 소정의 표적 분자에 대한 결합 활성을 갖는 핵산 분자를 말한다. 상기 앱타머는 그 염기 서열에 따라 다양한 3차원 구조를 가질 수 있으며, 항원-항체 반응과 같이 특정 물질에 대하여 높은 친화력을 가질 수 있다. 앱타머는 소정의 표적 분자에 결합함으로써 소정의 표적 분자의 활성을 저해할 수 있다.

본 발명의 앱타머는 RNA, DNA, 변형된(modified) 핵산 또는 이들의 혼합물일 수 있으며, 그 형태가 직쇄상 또는 환상(環狀)일 수 있으나 이들에 한정되지 아니한다. 본 발명의 hStm1 유전자의 활성을 억제하는 앱타머는 hStm1 유전자의 염기 서열을 참조하여 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 공지의 방법에 따라 쉽게 제작할 수 있다.

또한, hStm1 유전자 mRNA의 발현을 억제하는 물질은 hStm1 유전자로부터 발현되는 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 또는 화합물 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이러한 항체는 다클론 항체, 단일클론 항체 또는 hSTM1 단백질에 대한 항원 결합성을 가지며, 이의 활성을 저해하는 것이라면 상기 항체의 단편들도 본 발명의 항체에 포함된다. 또한 키메라성 항체 또는 이중 결합 항체 등과 같이 유전 공학적으로 제작된 항체들도 모두 포함할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어 "항체"는 면역학적으로 특정 항원과 반응성을 갖는 면역 글로불린 분자를 포함하는 단백질 분자로, 체내에 특정 항원이 침입한 경우 이를 특이적으로 인식하여 반응하는 항원 수용체 역할을 하는 단백질 분자를 말한다. 나아가, 본 발명의 항체에는 인간화 항체 등의 특수 항체 및 인간 항체 등도 포함하며, 신규한 항체 외에 이미 당해 기술분야에서 공지된 항체들도 포함될 수 있다. 상기 항체는 hStm1 유전자로부터 발현되는 단백질을 특이적으로 인식하는 결합의 특성을 갖는 한, 2개의 중쇄와 2개의 경쇄의 전체 길이를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체의 분자의 기능적인 단편이란, 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab')₂ 및 Fv 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 용어 "항암제"는 악성 종양을 치료하기 위해 사용하는 방법들 중 수술이나 방사선 요법을 제외한 화학요법제를 총칭하는 것으로, 주로 핵산의 합성을 저해하여 항암 활성을 나타내는 물질을 의미한다. 화학요법제는 크게 대사 길항제(antimetabolites), 알킬화제(alkylating agents), 유사분열 억제제(antimitotic drugs), 호르몬제(hormones) 등으로 분류된다. 암세포의 증식에 필요한 대사과정을 저해하는 대사길항제로는 엽산 유도체(methotrexate), 퓨린 유도체(6-mercaptopurine, 6-thioguanine), 피리미딘 유도체(5-fluorouracil, Cytarabine) 등이 있다. DNA의 구아닌 등에 알킬기를 도입하여 DNA의 구조를 변형시키고 사슬을 절단시켜 항암효과를 나타내는 알킬화제로는 니트로겐 머스타드계 화합물(chlorambucil, cyclophosphamide), 에틸렌이민계 화합물(thiotepa), 알킬설포네이트계 화합물(busulfan), 니트로소우레아계 화합물(carmustine), 트리아젠계 화합물(dacarbazine)이 있다. 분열시기 특이성 약물로서 유사분열을 차단하여 세포분열을 억제하는 유사분열 억제제에는 액티노마이신 D(actinomycin D), 독소루비신, 블레오마이신, 미토마이신과 같은 항암제, 빈크리스틴, 빈블라스틴과 같은 식물알칼로이드, 탁산환을 포함하는 유사분열 저해제인 탁소이드 등이 포함된다. 이외에 부신피질호르몬이나 프로게스테론과 같은 호르몬제와 시스플라틴 같은 백금함유 화합물을 항암제로 들 수 있다.

본 발명의 구체적인 일 양태로서 상기 위암 치료제는 수용체 티로신 키나아제(RTK) 저해제인 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서의 용어 "수용체 티로신 키나아제(Receptor Tyrosine Kinase; RTK) 저해제"는 표적항암치료를 위해 주로 사용된다. 암세포의 발생과 증식에는 여러 유전자 및 단백질이 관여하는데, 많은 티로신 키나아제 저해제가 이러한 유전자 및 단백질을 표적으로 하여 티로신 키나아제를 억제한다. 그러나, 약물 투여 후 돌연변이가 일어나 획득 내성이 생기는 문제가 있어, 본 발명자들은 약물내성을 극복하고 위암을 효과적으로 치료할 수 있는 위암 치료제를 개발하기 위하여 예의 연구 노력한 결과, hStm1 유전자의 발현 또는 hSTM1 단백질의 활성을 억제하는 제제와 위암 치료제를 병용투여 하였을 때 서로의 활성을 증폭시켜 항암활성을 높인다는 것을 발견하였고, 이를 포함하는 조성물이 기존 약물에 대한 내성을 감소시키고, 위암의 예방 또는 치료용 조성물로 활용될 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

구체적으로, 상기 RTK 저해제는 Her-1, Her-2, VEGFR(vascular endothelial growth factor receptor), EGFR(Epidermal growth factor receptor), Kras 또는 c-MET 중 어느 하나를 타겟으로 하는 것 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 목적상 상기 위암 치료제는 상피 성장 인자 수용체인 Her-1, Her-2, EGFR, 혈관 내피 성장 인자 수용체인 VEGFR 또는 c-MET의 억제를 타겟으로 하는 물질로서 RTK 저해제로 사용되는 물질이라면 이에 제한되지 않고 사용될 수 있다.

본 발명의 용어 "Her-1, Her-2, EGFR"는 상피 성장 인자 수용체(Epidermal growth factor receptor)로서 세포 외 단백질 리간드의 상피 성장 인자 패밀리 (EGF 패밀리)일부에 대한 막 관통 단백질이다. EGFR 발현이나 활동에 영향을 미치는 돌연변이는 암을 유발할 수 있는 것으로 알려져 있다.

본 발명의 용어 "VEGFR(vascular endothelial growth factor receptor)"는 혈관 내피 성장 인자 (VEGF)에 대한 수용체이다. 1, 2 및 3으로 번호가 매겨진 VEGFR의 세 가지 주요 아형이 있으며, 이들은 선택적 스플라이싱에 따라 막 결합 (mbVEGFR) 또는 가용성 (sVEGFR) 일 수 있다. 혈관 내피 성장 인자 (VEGF)는 혈관 신생 (순환계 형성)과 혈관 신생 (기존 혈관계에서 혈관 성장)에 관여하는 중요한 신호 단백질이다. VEGF 활성은 제한된 수의 다른 세포 유형 (예를 들어, 자극 단핵구/대식세포 이동)에 영향을 미치지만, VEGF 활성은 주로 혈관 내피 세포에만 제한된다. VEGF는 또한 미세 혈관 투과성을 향상시키기도 한다.

본 발명의 용어 "c-MET"는 신장, 위암 및 소세포 폐암, 조절 장애, 중추 신경계 종양 및 여러 육종을 일으킬 수 있는 수용체 티로신 키나아제이다. c-Met는 세포의 산란, 침입, 세포 사멸 및 혈관 형성으로부터 보호하는 역할을 한다. 소분자 억제제에 의한 c-Met의 ATP 결합 부위를 표적으로하는 것은 티로신 키나아제 저해에 대한 하나의 전략이다. c-Met 억제제는 간세포 성장 인자/산란 인자 (HGF/SF)의 수용체인 c-Met 티로신 키나아제의 효소 활성을 억제하는 소분자 부류이다. 이러한 억제제는 다양한 종류의 암 치료에 응용될 수 있다.

본 발명의 용어 "KRAS(K-ras 또는 Ki-ras)"는 Kirsten 쥐 육종 바이러스에서 처음 발견된 암 유전자이며 정상적인 KRAS 단백질은 정상 조직 신호 전달에 필수 기능을 수행하나, KRAS 유전자의 변이는 많은 암의 발병을 일으킨다. 따라서, KRAS 억제제는 다양한 종류의 암 치료에 응용될 수 있다.

구체적으로 상기 위암 치료제는 소라페니브(Sorafenib), 에롤티니브(Erlotinib), 라피티니브(Lapatinib), 수니티니브 (Sunitinib) 및 AMG337을 포함하는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 위암 치료제 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 구체적으로 표피생성인자수용체의 티로신 키나아제 저해제로는 에롤티니브(Erlotinib)이 사용되고 있고, HER2 저해제인 라피티니브(Lapatinib)과 VEGFR 등 혈관생성 관련 인자의 저해제인 소라페니브(Sorafenib), 수니티니브 (Sunitinib) 및 c-MET저해제로 AMG337 등이 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서의 "소라페니브(Sorafenib)"은 원발성 신장암 (진행성 신 세포 암종), 진행성 원발성 간암 (간세포 암종) 방사성 요오드 내성 진행 갑상선암에 치료 효과를 나타내는 것으로 알려져 있는 약물이다. "에롤티니브(Erlotinib)"는 비소 세포성 폐암 (non-small cell lung cancer; NSCLC), 췌장암 및 여러 가지 암 종류를 치료하는 데 사용되는 약물이다. 이것은 상피 성장 인자 수용체 (EGFR)에 작용하는 수용체 티로신 키나아제 억제제이다. "라피티니브(Lapatinib)"는 유방암과 다른 고형 종양을 치료하는 데 사용되는 약물이다. 또한, HER2/neu와 상피 성장 인자 수용체 (EGFR) 경로를 방해하는 이중 티로신 키나아제 억제제이다. 대체로 HER2 양성 유방암이나 HER2 (ErbB2)를 과발현하는 진행성 또는 전이성 유방암 환자의 치료에 사용된다. "수니티니브(Sunitinib)"는 신장 세포 암종 (RCC) 및 저항성 위장관 간질 종양 (GIST)을 치료하는데 사용되는 약물이다. 또한, 다목적 수용체 티로신 키나아제 (RTK) 억제제이다. "AMG337"는 c-MET 억제제로 사용되는 물질이다.

상기와 같은 화합물들은 공지의 합성 방법을 통하여, 상업적으로 입수 가능한 것일 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어 "약학적으로 허용 가능한 염"이란 투여되는 부펙사멕, 트라카졸레이트의 생물학적 활성과 물성들을 손상시키지 않는 제형을 의미한다. 상기 약학적으로 허용 가능한 염은, 약학적으로 허용되는 음이온을 함유하는 무독성 산부가염을 형성하는 산, 예를 들어, 염산, 황산, 질산, 인산, 브롬화수소산, 요드화수소산 등과 같은 무기산, 타타르산, 포름산, 시트르산, 아세트산, 트리클로로아세트산, 트리플로로아세트산, 글루콘산, 벤조산, 락트산, 푸마르산, 말레인산, 살리신산 등과 같은 유기 카본산, 메탄설폰산, 에탄술폰산, 벤젠설폰산, p-톨루엔설폰산 등과 같은 설폰산 등에 의해 형성된 산부가염이 포함된다. 예를 들어, 약학적으로 허용되는 카르복실산 염에는, 리튬, 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘 등에 의해 형성된 금속염 또는 알칼리 토금속 염, 라이신, 아르지닌, 구아니딘 등의 아미노산 염, 디시클로헥실아민, N-메틸-D-글루카민, 트리스(히드록시메틸)메틸아민, 디에탄올아민, 콜린 및 트리에틸아민 등과 같은 유기염 등이 포함되나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서의 용어, "예방"이란 본 발명에 따른 약학 조성물의 투여에 의해 암을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미하고, "치료"란 상기 약학 조성물의 투여에 암의 증상이 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.

본 발명의 일 실시 예에 의하면, 상기 약학적 조성물이 위암 세포주에서 hStm1 Knock-down과 위암 치료제의 병용처리 시 대부분의 세포주에서 세포성장 저해 및 세포사멸에 우수한 효과가 있음을 확인하였다. 뿐만 아니라, hStm1의 knock-down 및 항체 처리에 따라 세포성장 억제 효과를 확인하지 못한 hStm1 저발현 세포주 SNU638에서도 위암 치료제의 병용처리 시 세포성장 저해 및 세포사멸에 시너지효과가 있음을 확인하였다(도 5).

상기 결과는 hStm1 Knock-down과 위암 치료제의 병용처리 시 서로의 활성을 증폭시켜 항암활성을 높인다는 것을 알 수 있을 뿐만 아니라, 위암 치료제에 의해 발생하는 약물 내성을 극복하는 좋은 방법이 될 수 있음을 시사하는 것이다.

또한, 대부분의 세포주에서 hStm1 Knock-down과 위암 치료제의 병용처리 시 세포성장 촉진과 종양형성 관련 MAP 카이네이즈 경로 유전자인 p-AKT, p-ERK의 발현이 감소함을 확인하였다(도 6). 뿐만 아니라, hStm1의 knock-down시 MAP 카이네이즈 경로 유전자인 p-AKT, p-ERK의 발현이 저해되지 않음을 확인한 hStm1 저발현 세포주 SNU638에서도 hStm1 Knock-down과 위암 치료제의 병용처리 시 MAP 카이네이즈 경로 유전자인 p-AKT, p-ERK의 발현이 저해됨을 확인하였다.

상기 결과를 통해 hStm1 Knock-down만을 시켰을 때, 세포 성장 억제의 효과를 확인하지 못한 세포주에서도 위암 치료제의 병용처리시 서로의 활성을 증폭시켜 항암활성을 높인다는 것을 시사하는 것이다.

아울러, 본 발명의 hStm1 Knock-down과 위암 치료제를 병용하여 처리할 경우 종양 성장 억제 효과가 있는지 관찰하기 위하여 마우스를 이용하여 동물 실험을 수행한 결과, vehicle과 용매만 사용한 대조군에 비하여 hStm1 shRNA 렌티바이러스와 위암 치료제 (Sorafenib/Erlotinib)를 사용한 그룹에서 대조군 (100%로 산정)에 비해 종양의 크기가 36% ~ 67%로 줄어들었으며, 병용으로 처리하였을 때 21% ~ 33%로 줄어들었음을 확인하였다(도 7).

상기 결과는 hStm1 Knock-down과 위암 치료제의 병용처리시 서로의 활성을 증폭시켜 항암활성을 높인다는 것을 알 수 있을 뿐만 아니라, 위암 치료제에 의해 발생하는 위암 치료제 내성을 극복하는 좋은 방법이 될 수 있음을 시사하는 것이다.

본 발명의 약학 조성물은, 약학 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 상기와 같은 담체, 부형제 또는 희석제는 비자연적으로 발생된 것일 수 있다.

구체적으로, 상기 약학 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 액제, 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명에서, 상기 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화 할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물과 이의 분획물들에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트(calcium carbonate), 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는 데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물에 포함된 상기 소라페니브(Sorafenib), 에롤티니브(Erlotinib), 라피티니브(Lapatinib), 수니티니브 (Sunitinib) 및 AMG337, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염의 함량은 약학 조성물이 암에 대한 예방 또는 치료 효과를 가지는 한 제한되지 않으나, 최종 조성물 총 중량을 기준으로 0.0001 내지 99.9 중량%, 보다 구체적으로는 0.01 내지 80 중량%의 함량으로 포함될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있는데, 본 발명의 용어 "약학적으로 유효한 양"이란 의학적 치료 또는 예방에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료 또는 예방하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 질환의 중증도, 위암 치료제의 활성, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 위암 치료제에 대한 민감도, 사용된 본 발명 조성물의 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율 치료기간, 사용된 본 발명의 조성물과 배합 또는 동시 사용되는 위암 치료제를 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하다.

본 발명의 용어 "개체"란, 상기 질환이 발명하였거나 발병할 수 있는 인간과, 원숭이, 소, 말, 양, 돼지, 닭, 칠면조, 메추라기, 고양이, 개, 마우스, 쥐, 토끼 또는 기니아 피그를 포함한 모든 동물을 의미한다. 본 발명의 약학적 조성물을 개체에게 투여함으로써 상기 질환을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있다면 개체의 종류는 제한없이 포함된다.

본 발명의 용어 "투여"란, 임의의 적절한 방법으로 대상체에게 소정의 물질을 제공하는 것을 의미하며, 본 발명의 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여, 피 내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비 내 투여, 폐 내 투여, 직장 내 투여될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 도 있다. 구체적인 투여방식 및 제제는 정맥 주사제, 피하 주사제, 피 내 주사제, 근육 주사제, 점적 주사제 등이다.

또한, 본 발명에 따른 화합물의 인체에 대한 투여용량은 환자의 나이, 몸무게, 성별, 투여형태, 건강상태 및 질병 정도에 따라 달라질 수 있으며, 몸무게가 70kg인 성인환자를 기준으로 할 때 일반적으로 1일 0.01mg 내지 5000mg이며, 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정 시간 간격으로 1일 1회 내지 수회로 분할 투여할 수도 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 또 다른 하나의 양태는, 상기 조성물을 포함하는, 위암의 예방 또는 치료용 키트를 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태는 상기 (ⅰ) Human Stm1 유전자의 발현 또는 hSTM1 단백질의 활성을 억제하는 제제; 및 (ⅱ) 위암 치료제를 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 위암의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.

상기 투여의 경우, 앞서 기술한 바와 같으며, (ⅰ) hStm1 유전자의 발현 또는 hSTM1 단백질의 활성을 억제하는 제제; 및 (ⅱ) 위암 치료제는 각각 동시, 순차적, 또는 역순으로 투여될 수 있으며, 적절한 유효량의 조합으로 동시에 투여될 수 있다.

본 발명의 또 다른 하나의 양태는 위암의 예방 또는 치료를 위한 의약품의 제조에 있어, (ⅰ) hStm1 유전자의 발현 또는 hSTM1 단백질의 활성을 억제하는 제제; 및 (ⅱ) 위암 치료제를 포함하는 조성물 또는 키트의 용도를 제공한다.

본 발명에 따르면, hStm1 유전자의 발현 또는 hSTM1 단백질의 활성을 억제하는 제제; 및 위암 치료제를 병용투여 하는 경우 위암의 예방 또는 치료용 약물로 사용이 가능하다.

도 1은 정상과 위암환자 조직에서 hStm1 단백질 마커의 발현을 조사한 그림이다. 위암 임상조직을 hStm1 발현정도로 0 < 1 < 2 < 3 수준으로 나누어서 분석하였다.
도 2는 6개 위암 세포주에서의 shRNA를 활용한 hStm1을 knock-down 시키고 암성장 저해/사멸 효과를 검증한 그래프이다. 각 세포주에 hStm1을 knock-down 시킬 수 있는 렌티 바이러스를 접종하고 120시간 동안 조사하였다.
도 3은 본 발명의 hStm1 유전자를 siRNA를 이용하여 knock-down하고 세포성장 촉진과 종양형성 관련 MAP 카이네이즈 경로 유전자발현 (p-AKT, p-ERK)을 웨스턴 블럿을 이용하여 조사한 결과이다.
도 4은 hStm1 항체의 위암세포성장에서 영향을 조사한 그래프이다. hStm1 고발현 세포주인 SNU216과 저발현 세포주인 SNU638에서의 세포성장 저해 차이를 나타내었다.
도 5는 hStm1 knock-down과 위암 치료제 병용요법의 효과를 정량적으로 나타낸 그래프이다. hStm1 shRNA 렌티 바이러스를 처리하고 24시간 후 소라페니브 20μM, 에롤티니브 20μM, 라피티니브 1μM, 수니티니브 20μM, 도는 AMG337 1μM를 처리한 후 48시간 후 세포의 성장저해/사멸을 조사한 결과이다.
도 6은 본 발명의 hStm1 유전자를 sh (small hairpin) RNA 렌티 바이러스를 이용하여 knock-down하고 위암 치료제 소라페니브와 에롤티니브를 처리하고 세포성장 촉진과 종양형성 관련 MAP 카이네이즈 경로 유전자발현 (p-AKT, p-ERK)을 웨스턴 블럿을 이용하여 조사한 결과이다.
도 7은 위암 세포주 MKN1에 hStm1 유전자를 shRNA 렌티 바이러스를 이용하여 knock-down시키고 면역결핍마우스에 접종하여 종양을 형성시킨 후 위암 치료제를 투여하여 종양형성을 확인한 결과이며, 그 정량적인 결과를 나타낸 그래프이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 암 세포주 및 실험의 준비

실시예 1-1: 위암 세포주 준비

10% FBS (Fetal Bovine Serum, GIBCO사), 페니실린 (10000U/ml)과 스트렙토마이신 (10mg/ml)을 첨가한 RPMI-1640 배양액을 100mm 페트리디쉬에 10ml씩 분주한 후 위암 세포주 SNU216, SNU668, MKN1, SNU638, SNU484 및 AGS를 디쉬 당 세포수가 1X10⁶이 되도록 접종하고 이를 37, 5% CO₂가 존재하는 배양기에서 배양하였다. 실험에 사용된 위암 세포주 및 이의 RTK 유전자의 상황은 하기와 같다 (표 1).

실시예 1-2: 조직 샘플, Tissue microarray construction ( TMA ), 면역 조직 화학 실험

2000년부터 2003년까지 충남 대학교 병원에서 위암 선별 수술을 받은 180 명의 환자를 대상으로 위암 조직 샘플을 채취하여 D1 절제술 후 R0 절제술을 시행 하였다. 환자의 위에서 선암종이 분리되어 조직학적으로 확인되었다. 평가된 임상 병리학적 변수는 일본 위암 협회 (Japan Gastric Cancer Association)에 의해 확립되었다 (모든 환자는 치료와 후속 조직 검사에 대한 정보에 동의하였으며, 실험은 기관 검토위원회의 사전 승인을 받았다).

위암 조직 샘플을 10% 완충 포르말린에 고정시키고 일상적으로 가공하고 파라핀에 내장시켰다. 180개의 인간 위암 샘플 중 파라핀 블록이 해당 H&E 염색된 절편에서 확인되었다. 침습성 선암을 대표하는 관심 영역이 확인되어 기증자 블록에 표시하였다. 관심 영역의 2-mm 코어를 Tissue Microarrayer (Meditech Ind., Korea)를 사용하여 수령인 마스터 블록으로 옮겼다. 한 위암 표본당 두 개의 편이 배열되었다. 또한, 정상 위 조직의 4 코어도 샘플링되었다. 파라핀 TMA 블록으로부터 3-마이크로 미터 두께의 파라핀 절편을 EnVision-HRP 검출 시스템 (Dako, Carpinteria, CA)으로 면역 조직 화학 (IHC)에 사용하였다. IHC는 hStm1 (PQCL2, Atlas, USA)에 대한 항체를 사용하였다.

탈 파라핀화 후, 최대 전력에서 4분 동안 pressure cooker를 통해 10 mM 시트르산 나트륨 완충액 (pH 6.0)으로 항원 회수를 수행하였다. 조직 절편을 3% 과산화수소로 10 분간 처리하였다. 일차 항체는 background reducing diluent (Dako, Carpinteria, CA)로 hStm1 항체를 1:100으로 희석하고 4의 챔버에서 하루 동안 결합시켰다. 이 후, 슬라이드를 EnVision 시약과 함께 30분 동안 인큐베이션 하였다. 다시 슬라이드를 5분 동안 DAB chromogen으로 순차적으로 반응시키고, Meyer's hematoxylin으로 대조 염색하여 장착하였다. 각 단계마다 TBS-0.3 % Tween 완충액을 여러 번 교체하여 조심스럽게 세척하였다. 일차 항체를 처리하지 않은 IgG 이소 타입 대조군을 음성 대조군으로 사용하였다. 그 결과를 도 1과 표 2에 정리하였다.

실시예 2: shRNA와 siRNA를 이용한 hStm1 유전자 knockdown에 의한 위암 세포주에서의 성장저해 및 사멸효과 확인

실시예 2-1: shRNA를 이용한 위암 세포주에서의 성장저해 및 사멸효과 확인

hStm1 유전자 knockdown시에 위암 세포주에서 성장저해 및 사멸효과가 있는지 확인하기 위하여 shRNA를 이용하여 실험을 수행하였다. 실험에 사용된 hStm1 SMART 벡터 렌티 바이러스 shRNA의 서열은 다음과 같다: sh-1, AATGACTTCCTGCCGGGTG(서열번호 3); sh-2, AGCATCACCAGCGCGAACA(서열번호 4) (VSC11714, V3SH11240-229519281, V3SH11240-230189578, GE Dharmacon).

구체적으로, hStm1의 역할을 확인하기 위해 위암 세포를 하루 전날에 96-웰 플레이트에 접종하고, 세포를 1 시간 동안 8μg/ml polybrene을 함유하는 RPMI 배양하고 적절한 다중 감염 (MOI)을 추가하는 방법으로 hStm1 shRNA 렌티 바이러스를 감염시켰다. 12 시간 후에 렌티 바이러스 용액을 완전 배양 배지로 대체하였다. IncuCyte ZOOM® 시스템 (EssenBioscience, Ann Arbor, Michigan, USA)을 사용하여 세포의 증식을 120시간 동안 분석하였다 (도 2).

그 결과, 실험에 사용된 위암 세포주 (SNU216, SNU668, MKN1, SNU638, SNU484 및 AGS) 대부분에서 성장이 저해됨을 확인하였다. 특히, hStm1 고발현 세포주인 SNU216의 세포성장은 shRNA 처리후 96시간에 약 90% 이상 저해되었고, SNU484 세포주는 세포성장이 완벽히 저해되고 (100%) 세포사멸이 확인되었다. 중간정도의 발현을 보이는 SNU668, MKN1, AGS 의 경우 각 약 57%, 64%. 55% 정도 저해되었고, 저발현되는 SNU638의 경우 10% 미만의 성장저해를 보였다.

상기 결과를 통해 hStm1 유전자가 과발현되어 중독된 위암 세포주에서 hStm1 유전자를 knockdown 시키는 경우에 위암 세포의 성장이 발현량과 비례하여 저해됨을 확인할 수 있었다.

실시예 2-2: siRNA를 이용한 위암 세포주에서의 성장저해 및 사멸효과 확인

위암 세포주에서의 hStm1 knock-down에 의한 세포성장 촉진과 종양형성 관련 MAP 카이네이즈 경로 유전자인 p-AKT, p-ERK의 발현 저해를 검증하기 위하여 hStm1 siRNA를 이용하였다.

siRNA의 경우 제조업체의 지시에 따라 Lipofectamine 3000 (Invitrogen, Carlsbad, CA)을 사용하여 표적 유전자의 siRNA를 도입함으로써 유전자 knock-down을 수행하였다. 6-웰 플레이트에 세포를 약 40-5 %로 깔고 하루 지난 후 siRNA 100pmol을 처리하고 72시간 동안 배양하였다. siRNA의 효능을 단백질 변화를 통해 확인하였다.

실험에 사용된 siRNA 서열은 다음과 같다: si-1: 5-CCGUGCUGUUGUUCCUCAUTT-3'(서열번호 5); si-2: 5'-GGGAUCUCCUACUCUCUGUTT-3'(서열번호 6); si-Control: 5'- AGCGCUGACAACAGUUUCA -3'(서열번호 7) (ST Pharm. Co., Ltd., Kyunggido, Korea).

이후 웨스턴 블럿(Western Blot)을 수행하였다. 구체적으로 배양된 세포를 차가운 PBS로 2회 세척한 후 단백질 용해 완충액 (RIPA cell lysis buffer: 50mM Tris-Cl (pH 7.5), 150mM NaCl, 1% Nonidet P-40, 10% Glycerol, 1mM PMSF, 1mM DTT, 20mM NaF, 1 mM Na₃VO_{4 ,} 1mM EDTA, Protease inhibitor)을 첨가하여 세포의 단백질을 준비하였다. 준비된 각 단백질 시료를 30㎍씩 사용하여 10% 혹은 12% SDS-PAGE gel에 걸어 크기별로 단백질을 분리해 낸 후 PVDF 막에 잘 옮겼다. 단백질이 옮겨진 막을 적당한 크기로 잘라내고 각 단백질에 해당하는 항체를 붙여주었다. 각각의 단백질의 양은 Immobilon^TM Western Blotting Detection reagents (Millipore)를 사용하여 band로 확인하였다.

항체에 대한 정보는 다음과 같다: anti-hStm1 (PQLC2, Atlas, USA), anti-phospho Erk1/2 (1:10000, Pharmingen, 554093), anti-p-AKT(S473)(1:2000, Cell signal, #9271), anti-GPADH (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, AbFrontier (Seoul, Korea), 1: 3000).

그 결과, 실험에 사용된 위암 세포주 (SNU216, SNU668, MKN1, 및 SNU638) 대부분에서 MAP 카이네이즈 경로 유전자인 p-AKT, p-ERK의 발현이 저해됨을 확인하였다. 그러나, hStm1 저발현 세포주인 SNU638에서는 유전자 konck-down 만으로는 MAP 카이네이즈 경로 유전자인 p-AKT, p-ERK의 발현이 저해되지 않음을 확인하였다.

상기 결과를 통해 위암 세포주에서 hStm1 유전자를 knockdown 시키는 경우에 세포성장 촉진과 종양형성 관련 MAP 카이네이즈 경로 유전자인 p-AKT, p-ERK의 발현 저해됨을 확인할 수 있었으며, 특히 hStm1 고발현 세포주에서 세포성장 촉진과 종양형성 관련 MAP 카이네이즈 경로 유전자들의 저해가 더 확실하게 일어남을 알 수 있었다.

실시예 3: h Stm1 발현 저해를 통한 위암 세포주의 성장여부 확인

hStm1 발현에 차이가 있는 위암 세포주에서 hStm1의 기능을 hStm1 항체를 통하여 저해한 후에 위암 세포주의 세포성장이 줄어드는지를 관찰하고자 실험을 수행하였다. hStm1 항체를 배양액에 40ug/ml로 처리하여 배지속의 세포에 발현된 hStm1이 작용하지 못하도록 하고, 세포성장 정도를 IncuCyte ZOOM® 시스템 (EssenBioscience, Ann Arbor, Michigan, USA)을 사용하여 세포의 증식을 120시간 동안 분석하였다.

그 결과 hStm1의 항체 처리에 따라 hStm1 고발현 세포주인 SNU216의 세포성장은 60% 이상 저해되었고 hStm1 저발현 세포주인 SNU638의 세포성장은 20~30% 정도 줄어드는 듯 하다가 장기 배양에 의해 그 차이가 줄어들고 최종적으로는 세포성장이 회복되었다 (도 4).

상기 결과를 통해 hStm1의 발현과 항체에 의한 기능 방해에 의한 세포성장 저해가 관련되어 있음을 알 수 있었고, hStm1 항체가 위암 세포의 성장저해에 사용될 수 있음을 확인하였다.

실시예 4: 위암 세포주에서의 h Stm1 Knock-down과 위암 치료제의 병용처리 효과

실시예 4-1: 병용처리시 세포성장 저해 및 세포사멸 효과 확인

상기 결과를 바탕으로 hStm1 유전자 knockdown시에 위암 세포주(SNU216, SNU668, MKN1, 및 SNU638)에서 성장저해 및 사멸효과를 확인한 hStm1 shRNA와 기존 위암 치료제를 병용처리하여 위암 세포주에서 세포성장저해/세포사멸을 조사하였다.

구체적으로, 세포를 접종한 후 하루 정도 지나고 나서 hStm1 shRNA 렌티 바이러스를 감염시키고, 12 시간 후에 렌티 바이러스 용액을 완전 배양 배지로 대체하였다. 24시간 후 위암 치료제인 소라페니브(Sorafenib) 20μM, 에롤티니브(Erlotinib) 20μM, 라피티니브(Lapatinib) 1μM, 수니티니브 (Sunitinib) 20μM 또는 AMG337 1μM를 처리한 후 48시간 후 세포의 성장저해/사멸을 SRB 방법으로 조사하였다.

구체적으로 0.4% SRB 염색용액을 이용하여 세포의 성장/사멸 정도를 측정하였다. 배양이 종료된 후 10% formalin solution (Sigma)를 1/2 volume 첨가하고 4에서 1 시간동안 고정하였다. 고정이 끝나고 증류수로 5회 세척하여 말렸다. 0.4% SRB 용액 100ml를 첨가하고 상온에서 1시간 동안 염색하고 난 후 0.1% acetic acid로 5회 세척하고 잘 건조시켰다. 150ml의 10 mM Tris 용액으로 SRB를 잘 녹여내어 흡광도 540nm에서 측정하였다.

그 결과 도 5에 나타낸 바와 같이 대부분의 세포주에서 hStm1 shRNA와 위암 치료제의 병용처리시 세포성장 저해 및 세포사멸에 우수한 효과가 있음을 확인하였다. 뿐만 아니라, hStm1의 knock-down 혹은 항체 처리 시 세포성장 억제 효과를 확인하지 못한 hStm1 저발현 세포주 SNU638에서도 hStm1 shRNA와 위암 치료제의 병용처리시 세포성장 저해 및 세포사멸에 좀 더 강한 효과가 있음을 확인하였다.

상기 결과는 hStm1 Knock-down과 위암 치료제의 병용처리시 서로의 활성을 증폭시켜 항암활성을 높인다는 것을 알 수 있을 뿐만 아니라, 위암 치료제에 의해 발생하는 약물 내성을 극복하는 좋은 방법이 될 수 있음을 시사하는 것이다.

실시예 4-2: 병용처리시 세포성장 촉진과 종양형성 관련 MAP 카이네이즈 경로 유전자발현의 변화 확인

세포성장 촉진과 종양형성 관련 MAP 카이네이즈 경로 유전자발현 (p-AKT, p-ERK)의 변화를 확인하기 위하여, 위암 세포주 (SNU216, MKN1, 및 SNU638)에 hStm1 Knock-down과 위암 치료제를 병용하여 처리한 후 웨스턴 블럿을 이용하여 조사하였다.

그 결과 도 6에 나타낸 바와 같이 대부분의 세포주에서 hStm1 Knock-down과 위암 치료제의 병용처리시 세포성장 촉진과 종양형성 관련 MAP 카이네이즈 경로 유전자인 p-AKT, p-ERK의 발현이 감소함을 확인하였다.

또한, hStm1의 knock-down 혹은 항체 처리 시 MAP 카이네이즈 경로 유전자인 p-AKT, p-ERK의 발현이 저해되지 않음을 확인한 hStm1 저발현 세포주 SNU638에서도 hStm1 Knock-down과 위암 치료제의 병용처리시 MAP 카이네이즈 경로 유전자인 p-AKT, p-ERK의 발현이 저해됨을 확인하였다.

상기 결과를 통해, hStm1 Knock-down만을 시켰을 때, 세포 성장 억제의 효과를 확인하지 못한 세포주에서도 위암 치료제와 병용처리 시 서로의 활성을 증폭시켜 항암활성을 높인다는 것을 알 수 있다.

실시예 4-3. 동물실험을 통한 병용처리시 종양 성장 억제 확인

본 발명의 hStm1 Knock-down과 위암 치료제를 병용하여 처리할 경우 종양 성장 억제 효과가 있는지 관찰하기 위하여 마우스를 이용하여 동물 실험을 수행하였다.

동물 실험실 (Korean of Laboratory Animal Unit)은 지침에 따라 무균 상태로 수거된 동물 실험실 (Animal Inc., Seoul, Korea)에서 구입한 balb/c 무균 쥐 (6 주령)를 이용하였다. 구체적으로, 이종 이식 종양 퇴행 분석을 위해 위암 세포주 MKN1, 5X10⁶ 세포를 생쥐 (n=6/그룹)의 피하에 주입한 후(Subcutaneous injection), 2주간 종양을 형성시켰다. hStm1 shRNA 렌티바이러스를 종양 내에 1, 3, 5일에 주입한 후 약물을 일주일에 5회 복강 내, 2주간 주사하였다. 약물을 처리하지 않는 실험군은 control shRNA 바이러스를 사용하였으며, 위암 치료제는 10% DMA, 10% Tween 및 80 % 증류수에 용해하였고 5mg/kg로 사용하였다.

그 결과 vehicle과 용매만 사용한 대조군에 비하여 Stm1 shRNA 렌티 바이러스와 위암 치료제 (Sorafenib/Erlotinib)를 사용한 그룹에서 대조군 (100%로 산정)에 비해 종양의 크기가 36% ~ 67%로 줄어들었으며, 병용으로 처리하였을 때 21% ~ 33%로 줄어듬을 확인하였다. 즉, hStm1 shRNA 렌티 바이러스와 위암 치료제 (Sorafenib/Erlotinib) 각각의 처리도 종양성장 억제에 효과가 있었으나, 병용처리 하였을 때 더 강한 종양억제 효과가 있음을 확인하였다.

상기 결과는 hStm1 Knock-down과 위암 치료제의 병용 처리시 서로의 활성을 증폭시켜 항암활성을 높임으로써, 위암 치료제의 내성이 없는 위암의 예방 또는 치료에 사용될 수 있음을 시사하는 것이다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

<110> KOREA RESEARCH INSTITUTE OF BIOSCIENCE AND BIOTECHNOLOGY <120> Pharmaceutical Composition for Preventing or Treating Stomach Cancer comprising inhibitor for expressing of human Stm1 polynucleotide and hSTM1 protein <130> KPA170918-KR <160> 7 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 2279 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> hStm1 <400> 1 agcgcgcggc gtgggggcgg ggcctgcggt tcccgcgggg gcggtggcgc gcggtcagct 60 gacccggcgg gccttgaccc agaagctggg ccctggcggc ggatctggac gtggtgagcc 120 ggaccggggg caggtggcaa acttcacggc tgggggtcgg ggctcctggg cttccctgcc 180 acatccttcc agccctctcc tccggccgct ggactgtccc ggctcctgcg ccctccttgt 240 ggcgcgatat cgtgggacga ggctccgggc cgggactggg tggccctcgg gaatccgcag 300 ccagtggccc cccacctcaa aggcgaccag cgcggcctct cgagctggcc tggccaggag 360 ttgccctgcc ccggccgacc ggccccttgg catctgatgg cttcgttttt cccgggccgg 420 ccgggcgagg ggccctcgcg gcgctggccc cagcagctgt cctatcatta tccctccaaa 480 caggcggccc gcgccgggct gagtcaccag gagggagctg tggccgagga cgccgaggcc 540 tggagtgggt ggtagccccg agctgggacg ctcctccctc cacaatctcc ccaggtctgc 600 agggaccgag ggcctacact gcctcctccc acgccgtgct taggaaccct tgctggcctc 660 agaacaccag cgccctccct ccggtgcagc cctgcctggc cgggggcccc tcctccacag 720 ccatggtctg gaagaaactg ggctcccgca acttctccag ctgccccagt ggctccatcc 780 agtggatatg ggatgtgttg ggtgaatgtg cccaggacgg ctgggacgag gccagcgtgg 840 gcctgggctt gatctccatt ctctgctttg ctgcatctac cttcccccag ttcatcaaag 900 cctacaagac gggcaacatg gaccaggcgc tgtccctgtg gttcctcctg ggctggattg 960 gcggagactc ctgcaacctc atcggctcct tccttgctga ccagctgccc ctgcagacct 1020 acacggctgt gtattatgtc ttggcagacc tggtgatgct gacgctgtac ttttactaca 1080 agttcaggac gcgcccctct ctgttgtctg cccccatcaa ctccgtgctg ttgttcctca 1140 tggggatggc gtgcgccaca ccgctgctga gtgctgctgg gcccgtggct gcccctaggg 1200 aagccttccg ggggcgggcg ctcctgtccg tggagtcggg cagcaagccc ttcacccggc 1260 aggaagtcat tggcttcgtc atcggctcca tctccagcgt gttgtacctg ctttcccggc 1320 tgcctcagat ccgcaccaac ttcctccgga agtccaccca ggggatctcc tactctctgt 1380 tcgcgctggt gatgctgggg aacacgctgt atgggctgag cgtgctgctc aaaaaccccg 1440 aggagggcca gagcgagggc agctacctgc tgcaccacct gccctggctt gtgggcagcc 1500 tgggcgtgct gctgctcgac accatcatct ccatccagtt cctggtgtac aggcgcagca 1560 ccgccgcctc ggagcttgag cccctcctcc ccagctgacc agaaccaggc tgagcgcagg 1620 aggacaggca ccaccggatg ccacaccagg caggaggagg tgtggacagt gatggtacgg 1680 cggccctgca tcagcctgcg ggtggcctct ggatcctccg tggaccgaac cgtcccccca 1740 ggaacacacc ttcaggtaga ccccgaagcc tcaaggccgg ggctggagcg gagaccccag 1800 ggcctctcag gagacagtga ggctgcccct cctaccacct acctcattct gcctactcac 1860 cccaggggcc acagccacag cctgctggac tcaggactgt cctgtcaact ccagacaact 1920 gaataaacag gccgggtaca gtggctcgca cctgtaatcc tagcactttg ggaggccgaa 1980 gcgggtggac cacttgacgt ccgtagttcg agaccagcct ggccaacatg gtgaaacccc 2040 atctctacta aaaatacaaa aattagccag gtgtggtggc acacatctgt agtcccagct 2100 acttgggagg ctgaggcagg agaactgttt gaacctggga gacagaggtt gcggtgaacc 2160 gagatcgtgc cactgtactc cagcctgggt gacagagtga gactccgtct caaaaaaata 2220 aaaaagataa ccgaggaaac ggtacctccc catgaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaa 2279 <210> 2 <211> 291 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> hStm1 <400> 2 Met Val Trp Lys Lys Leu Gly Ser Arg Asn Phe Ser Ser Cys Pro Ser 1 5 10 15 Gly Ser Ile Gln Trp Ile Trp Asp Val Leu Gly Glu Cys Ala Gln Asp 20 25 30 Gly Trp Asp Glu Ala Ser Val Gly Leu Gly Leu Ile Ser Ile Leu Cys 35 40 45 Phe Ala Ala Ser Thr Phe Pro Gln Phe Ile Lys Ala Tyr Lys Thr Gly 50 55 60 Asn Met Asp Gln Ala Leu Ser Leu Trp Phe Leu Leu Gly Trp Ile Gly 65 70 75 80 Gly Asp Ser Cys Asn Leu Ile Gly Ser Phe Leu Ala Asp Gln Leu Pro 85 90 95 Leu Gln Thr Tyr Thr Ala Val Tyr Tyr Val Leu Ala Asp Leu Val Met 100 105 110 Leu Thr Leu Tyr Phe Tyr Tyr Lys Phe Arg Thr Arg Pro Ser Leu Leu 115 120 125 Ser Ala Pro Ile Asn Ser Val Leu Leu Phe Leu Met Gly Met Ala Cys 130 135 140 Ala Thr Pro Leu Leu Ser Ala Ala Gly Pro Val Ala Ala Pro Arg Glu 145 150 155 160 Ala Phe Arg Gly Arg Ala Leu Leu Ser Val Glu Ser Gly Ser Lys Pro 165 170 175 Phe Thr Arg Gln Glu Val Ile Gly Phe Val Ile Gly Ser Ile Ser Ser 180 185 190 Val Leu Tyr Leu Leu Ser Arg Leu Pro Gln Ile Arg Thr Asn Phe Leu 195 200 205 Arg Lys Ser Thr Gln Gly Ile Ser Tyr Ser Leu Phe Ala Leu Val Met 210 215 220 Leu Gly Asn Thr Leu Tyr Gly Leu Ser Val Leu Leu Lys Asn Pro Glu 225 230 235 240 Glu Gly Gln Ser Glu Gly Ser Tyr Leu Leu His His Leu Pro Trp Leu 245 250 255 Val Gly Ser Leu Gly Val Leu Leu Leu Asp Thr Ile Ile Ser Ile Gln 260 265 270 Phe Leu Val Tyr Arg Arg Ser Thr Ala Ala Ser Glu Leu Glu Pro Leu 275 280 285 Leu Pro Ser 290 <210> 3 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sh-1 <400> 3 aatgacttcc tgccgggtg 19 <210> 4 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sh-2 <400> 4 agcatcacca gcgcgaaca 19 <210> 5 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> si-1 <400> 5 ccgugcuguu guuccucaut t 21 <210> 6 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> si-2 <400> 6 gggaucuccu acucucugut t 21 <210> 7 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> si-control <400> 7 agcgcugaca acaguuuca 19

Claims (13)

1. (i) hStm1 유전자의 발현 또는 hSTM1 단백질의 활성을 억제하는 제제; 및
   (ii) 위암 치료제를 유효성분으로 포함하는, 위암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
   
2. 제1항에 있어서,
   상기 hStm1 유전자는 서열번호 1로 구성되는 것인, 위암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
   
3. 제1항에 있어서,
   상기 hSTM1 단백질은 서열번호 2로 구성되는 것인, 위암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
   
4. 제1항에 있어서,
   상기 hStm1 유전자의 발현을 억제하는 제제는, hStm1 유전자에 특이적인 안티센스 올리고 뉴클레오티드, shRNA, siRNA 또는 앱타머인 것인, 위암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
   
5. 제1항에 있어서,
   상기 hSTM1 단백질의 활성을 억제하는 제제는 hSTM1 단백질에 특이적인 항체인 것인, 위암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
   
6. 제4항에 있어서,
   상기 shRNA는 서열번호 3 또는 4로 구성되는 것인, 위암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
   
7. 제4항에 있어서,
   상기 siRNA는 서열번호 5 또는 6으로 구성되는 것인, 위암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
   
8. 제1항에 있어서,
   상기 위암 치료제는 수용체 티로신 키나아제(RTK) 저해제인 것인, 위암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
   
9. 제8항에 있어서,
   상기 수용체 티로신 키나아제(RTK) 저해제는 Her-1, Her-2, EGFR(Epidermal growth factor receptor), VEGFR(vascular endothelial growth factor receptor), KRAS 또는 c-MET 중 어느 하나를 타겟으로 하는 것인, 위암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
   
10. 제8항에 있어서,
    상기 위암 치료제는 소라페니브(Sorafenib), 에롤티니브(Erlotinib), 라피티니브(Lapatinib), 수니티니브 (Sunitinib) 및 AMG337을 포함하는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 위암 치료제 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 것인, 위암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
    
11. 제1항에 있어서,
    상기 약학적 조성물은 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함하는, 위암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
    
12. 제1항에 있어서,
    상기 약학적 조성물은 액제, 산제, 에어로졸, 주사제, 수액제, 캡슐제, 환제, 정제 또는 좌제의 형태로 제형인 위암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
    
13. 제1항의 조성물을 포함하는, 위암의 예방 또는 치료용 키트.
    
    

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