KR102120927B1

KR102120927B1 - Cbr 1의 유전자 발현 억제를 통한 두경부암의 방사선 민감도 증진용 조성물

Info

Publication number: KR102120927B1
Application number: KR1020180166305A
Authority: KR
Inventors: 은영규; 윤미용; 이영찬
Original assignee: 경희대학교 산학협력단
Priority date: 2018-04-20
Filing date: 2018-12-20
Publication date: 2020-06-11
Also published as: KR20190122532A

Abstract

본 발명은 CBR1(Carbonyl reductase 1) 억제제를 포함하는, 방사선 민감성 증진용 조성물; 및 방사선 또는 항암 화학요법과 병용되는 CBR1 억제제를 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 방사선 민감성 증진용 조성물은 CBR1 억제를 통해 암의 방사선 민감도를 증진시킬 수 있으므로, 본 발명의 조성물을 이용하여 방사선 저항성을 극복하고, 방사선 치료에 의한 합병증 발병을 감소시킬 수 있다.

Description

CBR 1의 유전자 발현 억제를 통한 두경부암의 방사선 민감도 증진용 조성물{Composition comprising Carbonyl reductase 1 inhibitor for treating head and neck cancer and enhancing radiation sensitivity}

본 발명은 CBR1(Carbonyl reductase 1) 억제제를 포함하는, 방사선 민감성 증진용 조성물; 및 방사선 또는 항암 화학요법과 병용되는 CBR1 억제제를 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

암을 치료하는데 있어 주요 장애물은 암세포가 처음에는 감수성(sensitivity)이 있으나, 점차 항암 화학요법과 방사선 치료에 저항성이 생기는 것이다. 또한, 이온화 방사선(Ionizing radiation)은 방사 에너지 및 세포 내 물로부터 유래된 ROS에 의한 DNA, 지질 및 단백질 손상에 영향을 미친다. 이러한 영향들 중에서도, 이온화 방사선에 의해 유도된 ROS는 세포 사멸을 유도하므로 치명적이다. 또한, 이온화 방사선에 의해 생성된 ROS에 의해 막 지질이 쉽게 과산화되므로, 구조적 및 기능적 손상을 일으키게 된다. 그러나, 세포의 산화방지제 방어 효소(antioxidant defense enzyme)는 전리 방사선에 의해 방사선 손상을 유발하는 자유 라디칼의 발생을 억제할 수 있으며, 이 현상은 암세포의 방사선 저항성의 하나의 기전일 것으로 연구된 바 있으나, 암세포의 방사선 저항성에 대한 정확한 기전은 아직까지 알려진 바 없다.

이처럼, 방사선 치료 방법은 물리적, 공학적 발전으로 인해 크게 개선되었음에도 불구하고, 여전히 종양의 방사선 내성 유발, 종양 주위의 저산소증 상태의 극복이 해결되어야 할 문제로 남아있다. 또한, 현재 방사선 병용 치료제로 항암제들이 상용되고 있으나, 항암제의 독성으로 인하여 병용치료에 한계가 있으므로 부작용이 적고 효과적인 병용 치료 모델이 필요한 실정이다.

특히, 두경부암 환자에서 방사선 치료는 방사선이 도달하는 두경부 부위의 모든 정상 부위에서 발생하며, 급성 이하선염, 구강 건조증, 구강 점막염, 피부염, 치아 부식, 갑상선 기능 저하 등의 부작용이 발생한다. 따라서, 방사선의 부작용을 감소시킨다면 두경부암 환자의 삶의 질을 증진시킬 수 있을 것이다.

방사선 치료의 감수성을 증가시킬 수 있는 표적 분자의 발견을 통한 신규한 방사선 감작제의 개발은 두경부암에 대한 방사선 치료의 감수성을 증가시켜 방사선 치료의 효과를 증대하고, 기존의 방사선 치료 중단에 가장 많은 원인이었던 방사선 치료에 의한 합병증 발병을 감소시킬 수 있을 것이다.

항암 화학요법뿐만 아니라, 방사선 치료에 대한 두경부암 환자 개개인의 민감도는 상이하여, 현재 치료 전 이를 정확히 예측할 수 있는 방법은 수립되지 않았다. 이에, 본 발명에서 발굴한 방사섬 감수성과 관련된 표적 분자는 두경부암 진단시 조직검사를 이용하여, 개개인의 방사선 치료에 대한 감수성을 예측할 수 있으므로, 환자 개개인에 적합한 치료 계획을 수립할 수 있을 것이다.

이러한 배경 하에, 본 발명자는 방사선 치료 용량을 감소시키고 부작용을최소화할 수 있는 방사선 감작제 개발을 위해 예의 노력한 결과, 최근 세포 내 활성산소 생산을 억제하는 것으로 알려진 카보닐 리덕타아제 1(CBR1: Carbonyl reductase 1)을 두경부암에 대한 방사선 치료에 적용할 경우, 방사선 치료의 감수성을 증진시킬 수 있는 표적 분자로서의 역할을 수행함을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 CBR1(Carbonyl reductase 1) 억제제를 포함하는, 방사선 민감성 증진용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 하나의 목적은 방사선 또는 항암 화학요법과 병용되는 CBR1 억제제를 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 하나의 양태는 CBR1(Carbonyl reductase 1) 억제제를 포함하는, 방사선 민감성 증진용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명의 다른 하나의 양태는 CBR1 억제제를 포함하는, 암 예방 또는 치료용 보조제를 제공한다.

본 발명의 조성물은 CBR1 발현을 억제함으로써 방사선 민감도를 증진시킬 수 있으므로, 방사선 치료 내성을 극복하고, 방사선 치료에 의한 합병증을 감소시킬 수 있다. 이는 지금까지 알려진 바 없으며, 본 발명에 의해 최초로 밝혀진 것으로, 방사선 치료의 감수성을 증진시키고, 방사선 치료 내성을 극복할 수 있는 표적 분자를 발견하였다는 점에서 그 의의가 크다.

본 발명의 용어, "CBR1(Carbonyl reductase 1)"은 하기 반응식의 가역반응을 촉매하는 효소를 의미한다. 또한, 알데하이드 리덕타아제 1(aldehyde reductase 1), 프로스타글란딘 9-케토리덕타아제(prostaglandin 9-ketoreductase), 지노바이오틱 케톤 리덕타아제(xenobiotic ketone reductase), NADP-의존적 카보닐 리덕타아제(NADP-dependent carbonyl reductase), ALR3, 비특이적 NADPH-의존적 카보닐 리덕타아제(nonspecific NADPH-dependent carbonyl reductase)와 혼용될 수 있다.

[반응식]

R-CO-R' + NADPH + H⁺ ↔ :R-CHOH-R' + NADP⁺

본 발명의 용어, "CBR1 억제제"는 세포 내에서 CBR1의 발현 또는 활성을 감소시키는 제제를 의미하는 것으로서, CBR1을 표적으로 하여 CBR1의 발현 또는 활성을 억제할 수 있는 화합물, 핵산, 펩타이드, 바이러스 또는 상기 핵산을 포함하는 벡터 등 그 형태에 제한 없이 사용 가능하다. 구체적으로, 상기 CBR1 억제제는 CBR1 mRNA의 발현을 억제하는 올리고뉴클레오티드, 또는 CBR1 단백질의 활성을 억제하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편일 수 있으나, 세포 내 CBR1의 발현 또는 활성을 감소시켜 암의 방사선 민감성을 증진시킬 수 있는 제제라면 제한 없이 포함될 수 있다.

구체적으로, 이에 제한되는 것은 아니나, 상기 CBR1 mRNA의 발현을 억제하는 올리고뉴클레오티드는 CBR1 mRNA에 특이적인 안티센스 올리고뉴클레오티드, 앱타머(aptamer), shRNA 또는 siRNA일 수 있다.

본 발명에서 CBR1 억제제로 이용할 수 있는 siRNA는 CBR1에 특이적으로 작용하여 CBR1을 발현하는 mRNA를 절단(cleavage)하여 RNA 간섭(RNAi: RNA interference) 현상을 유도할 수 있는 이중사슬 RNA를 말한다. 본 발명에서 siRNA는 G3BP1 핵산 서열의 일부 또는 전부와 상동인 서열을 포함하는 센스 RNA 가닥과 이와 상보적인 서열을 포함하는 안티센스 RNA 가닥으로 구성되어 세포 내에서 CBR1 mRNA에 혼성화될 수 있는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것이 바람직하다. 본 발명의 CBR1에 특이적인 siRNA는 세포에 도입되었을 때, CBR1의 발현을 저해시킬 수 있으며, 내인성 뉴클레아제, 예를 들어 엑소뉴클레아제 및 엔도뉴클레아제에 내성인 것일 수 있다. 본 발명에서 CBR1에 특이적인 siRNA는 CBR1 유전자로부터 전사된 mRNA에 상보적인 서열을 가지고 있으며, 해당 mRNA에 특이적으로 결합하여 발현을 억제하고, 기능을 저해시킬 수 있게 된다.

본 발명의 CBR1에 특이적인 siRNA는 표준 분자 생물학 기술, 예를 들어 화학적 합성 방법 또는 재조합 방법을 이용하여 증폭, 분리 또는 제조하거나, 시판되는 것을 사용할 수 있다.

본 발명에서 CBR1 억제제로 이용할 수 있는 RNA 앱타머는 특정의 3차원 입체형태를 채택하는 능력에 의해 CBR1 mRNA와 결합하여 이에 대해 길항 효과를 갖는 핵산 리간드 분자를 의미한다. 전형적으로 앱타머는 규정된 이차 및 삼차 구조, 예컨대 스템-루프구조로 접혀지는 15-50 염기 길이의 작은 핵산일 수 있다. 앱타머는 10^-6, 10^-8, 10^-10, 또는 10^-12 보다 적은 kd로 표적 분자와 결합하는 것이 바람직하다. 앱타머는 매우 고도의 특이성을 가지는 표적 분자와 결합할 수 있다. 또한, 앱타머는 다수의 리보뉴클레오티드 단위, 데옥시리보뉴클레오티드 단위, 또는 두가지 유형의 뉴클레오티드 잔기의 혼합물로 구성될 수 있다. 앱타머는 하나 이상의 변형된 염기, 당 또는 포스페이트 주쇄 단위를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에서 CBR1 염기서열에 상보적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드는 세포 내의 CBR1 mRNA 분자의 단일 가닥 단편에 상보적으로 결합하여 CBR1 mRNA의 프로세스 효율을 감소시킴으로써, 이들의 발현을 억제하고, 기능을 저해시킬 수 있게 된다.

본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드는 RNA-RNA, RNA-DNA, RNA-PNA(단백질 핵산) 상호작용에 의해 CBR1 mRNA 분자에 결합하여 이들의 활성을 변이시키는 비효소적 핵산 화합물이며, 이들은 하나의 연속서열이 CBR1 염기서열에 상보적일 수 있다.

또한, 본 발명의 CBR1 염기서열에 상보적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드는 세포에 도입되었을 때, CBR1의 발현을 저해시킬 수 있으며, 내인성 뉴클레아제, 예를 들어 엑소뉴클레아제 및 엔도뉴클레아제에 내성이며, 생체 내에서 안정적인 선택적으로 변형된 올리고 뉴클레오티드이다.

본 발명에서 용어 "올리고뉴클레오티드"는 자연 발생적인 염기, 당 및 당간(intersugar) 연결로 이루어진 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드 단량체의 올리고머 또는 중합체를 지칭한다. 또한, 이 용어는 유사하게 기능하는 비-자연 발생적인 단량체 또는 그의 부분을 포함하는 변형된 또는 치환된 올리고머를 포함한다. 치환된 올리고머의 혼입은 세포 흡수 증대 또는 뉴클레아제 내성 증가를 비롯한 인자에 기초하며, 당업계에 공지된 바와 같이 선택된다. 전체 올리고뉴클레오티드 또는 그의 일부분이 치환된 올리고머를 함유할 수 있다. 또한, 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드는 이들의 표적에 대한 친화성을 증가시키고 표적 서열의 미스매치(mismatch)에 대한 내성을 제공하도록 당업계에 공지된 방법으로 변형된 올리고머 모방체, 예를 들어 펩티드 핵산 (PNA) 및 고정 (locked) 핵산(LNA)을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드는 천연형 올리고뉴클레오티드, 포스포로티오에이트형 올리고데옥시리보뉴클레오티드, 포스포로디티오에이트형 올리고데옥시리보뉴클레오티드, 메틸포스포네이트형 올리고데옥시리보뉴클레오티드, 포스포르아미데이트형 올리고데옥시리보뉴클레오티드, H-포스포네이트형 올리고데옥시리보뉴클레오티드, 트리에스테르형 올리고데옥시리보뉴클레오티드, 알파-아노머형 올리고데옥시리보뉴클레오티드, 펩티드 핵산, 그외 인조 핵산 및 핵산-변형된 화합물을 포함한, 변형된 올리고뉴클레오티드 형태일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드는 CBR1 단일 가닥 염기서열에 상보적인 이중나선 또는 단일나선 DNA, 이중나선 또는 단일나선 RNA, DNA/RNA 하이브리드, DNA 및 RNA 아날로그 및 염기, 당 또는 백본 변형을 지닌 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 올리고뉴클레오티드는 안정성을 증가시키고, 뉴클레아제 분해에 대한 저항성을 증가시키기 위해 당분야에 알려진 방법에 의해 변형될 수 있으며, 이들 변형은 당업계에 알려져 있고, 올리고뉴클레오티드 백본의 변형, 당 모이어티의 변형 또는 염기의 변형을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 당 변형의 예로는, 1-6 포화 또는 불포화 탄소 원자를 포함하는 -O-저급 알킬기, 또는 2-6 탄소 원자를 포함하는 -O-아릴, 또는 알릴기로 2'-O-치환된 것을 포함하는, 리보스 모이어티의 2' 위치에 변형이 있으며, 상기 -O-알킬, 아릴 또는 알릴기는 아미노 또는 할로기(예, 할로, 하이드록시, 트리플루오로메틸 시아노, 니트로 아실 아실옥시, 알콕시, 카르복시, 카르브알콕실 또는 아미노기)로 비치환 또는 치환될 수 있다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드의 비제한적인 예로는, 3', 5' 또는 3' 및 5' 말단에 2'-O-알킬화된 리보뉴클레오티드를 가지며, 적어도 4 개 또는 5 개의 연속 뉴클레오티드가 그렇게 변형된다. 2'-O-알킬화된 기의 예로는, 2'-O-메틸, 2'-O-에틸, 2'-O-프로필 및 2'-0-부틸이 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다.

한편, 본 발명의 핵산으로 이루어지는 CBR1 억제제는 세포 내 전달을 위해 발현벡터에 포함되어 제공될 수 있다. 이러한 경우, G3BP1에 특이적인 shRNA 등을 발현하는 벡터일 수 있다.

본 발명의 각종 핵산들은 당업계에 알려진 다양한 형질전환 기술을 이용하여 세포 내로 도입시킬 수 있는데, 이를 위해 상기 siRNA는 세포 내로의 효율적인 도입을 가능하게 하는 전달체 내에 포함된 형태일 수 있다. 상기 전달체는 바람직하게는 벡터이며, 바이러스 벡터 및 비바이러스 벡터 모두 사용 가능하다. 바이러스 벡터(viral vector)로서 예를 들면, 렌티바이러스(lentivirus), 레트로바이러스(retrovirus), 아데노바이러스 (adenovirus), 허피스바이러스(herpes virus) 및 아비폭스바이러스(avipox virus) 벡터 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 CBR1 억제제는 세포 내로 도입시켜 암 세포의 방사선 민감성을 증진시킬 수 있는데, 여기서 "도입"은 형질감염 (transfection) 또는 형질도입 (transduction)에 의해 외래 DNA를 세포로 유입시키는 것을 의미한다. 형질감염은 칼슘 포스페이트-DNA 공침전법, DEAE-덱스트란-매개 형질감염법, 폴리브렌-매개 형질감염법, 전기충격법, 미세주사법, 리포좀 융합법, 리포펙타민 및 원형질체 융합법 등의 당업계에 공지된 여러 방법에 의해 수행될 수 있다. 형질도입은 감염 (infection)을 수단으로 하여 바이러스 또는 바이러스 벡터 입자를 사용하여 세포 내로 유전자를 전달시키는 것을 의미한다.

본 발명에서 용어, "항체"는 생체의 면역계에서 혈액이나 림프를 순환하면서 외부 물질인 항원이 침입한 경우 이에 반응하는 물질을 말하며, 림프조직에서 형성되는 글로불린계 단백질로 면역글로불린이라고도 불린다. 항체는 B 세포가 생산해서 체액으로 흘려보내는 단백질로 항원과 특이적으로 결합하며, 하나의 항체 분자에는 두 개의 중사슬 (heavy chain)과 두 개의 경사슬 (light chain)이 있으며, 각각의 중사슬과 경사슬은 그의 N-터미널 말단에 가변영역을 갖고 있다. 각각의 가변 영역은 3 개의 상보성 결정부위 (Complementarity determining region: CDR)와 4개의 구조 형성부위 (framework regions: FRs)로 구성되는데, 상보성 결정 부위들은 항체의 항원 결합 특이성을 결정하고, 가변영역의 구조형성 부위들로 유지되는 비교적 짧은 펩티드 서열로 존재한다. 본 발명의 목적상 상기 항체는 CBR1과 결합하여 CBR1의 활성을 억제할 수 있는 항체일 수 있다.

본 발명에서 용어 "암"은 세포의 사멸 조절과 관련된 질병으로서, 정상적인 세포 사멸 균형이 깨지는 경우 세포가 과다 증식하게 됨으로써 생기는 질병을 일컫는다. 이러한 비정상적 과다 증식 세포들은, 경우에 따라 주위 조직 및 장기에 침입하여 종괴를 형성하고, 체내의 정상적인 구조를 파괴하거나 변형시키게 되는데, 이러한 상태를 암이라고 한다. 일반적으로 종양 (tumor)이라 하면 신체 조직의 자율적인 과잉 성장에 의해 비정상적으로 자란 덩어리를 의미하며, 양성 종양 (benign tumor)과 악성 종양 (malignant tumor)으로 구분할 수 있다. 악성 종양은 양성 종양에 비해 성장속도가 매우 빠르고, 주변 조직에 침윤하면서 전이 (metastasis)가 일어나 생명을 위협하게 된다. 이러한 악성 종양을 통상적으로 '암(cancer)'이라 하며, 암의 종류로는 뇌척수종양, 두경부암, 폐암, 유방암, 흉선종, 중프종, 식도암, 취암, 대장암, 간암, 위암, 췌장암, 담도암, 신장암, 방광암, 전립선암, 고환암, 생식세포종, 난소암, 자궁 경부암, 자궁 내막암, 대장암, 림프종, 급성 백혈병, 만성 백혈병, 다발성 골수종, 육종, 악성 흑색종 및 피부암을 포함하나, 상기 예들에 의해 본 발명의 암의 종류가 한정되는 것은 아니다. 상기 암은 이에 제한되지는 않으나, 구체적으로는 두경부암이 적합할 수 있으며, 보다 구체적으로는 두경부 편평상피세포 암일 수 있다. 또한, 본 발명의 목적상 방사선에 저항성을 가지는 암일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 용어 "방사선 민감성 증진"이란 방사선을 이용한 질병 치료에 있어서, 방사선에 대한 세포의 민감성을 증진시키는 것을 의미한다. 이를 통해 방사선 치료효율을 상승시킬 수 있는데, 특히, 암 치료시 병행처리 되면 암 세포의 방사선 민감성이 증진되어 암 세포의 살상 효과 및 증식 억제효과를 낼 수 있게 된다.

본 발명의 CBR1 억제제는 세포 내에서 CBR1 mRNA 등에 작용하여 이들의 발현율을 감소시키거나 CBR1 단백질의 활성을 억제하는 등, CBR1 기능을 저해함으로써 세포의 방사선 저항성을 낮추어 방사선에 대한 민감성을 증진시킨다. 본 발명의 CBR1 억제제를 포함하는 방사선 민감성 증진용 조성물은 방사선 치료를 적용할 수 있는 모든 세포에 적용이 가능하며, 특히 암 세포의 방사선 민감성을 증진시키는 데 이용하는 것이 바람직하다.

본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, 방사선 조사가 암세포에서의 CBR1 활성을 증가시키고, CBR1이 과발현되는 암세포에서 방사선 조사에 대한 보호 효과를 나타냄을 확인하였다(도 1 및 도 2D).

다른 구체적인 일 실시예에서는, CBR1-siRNA를 이용하여 CBR1 유전자 발현을 억제하거나, CBR1 선택적 억제제(hydroxyl-PP-Me)를 처리하는 경우, 암세포의 방사선 조사에 대한 생존율을 유의적으로 감소시킴을 확인하였다(도 2A 내지 2C).

또 다른 구체적인 일 실시예에서는 CBR1 억제는 방사선 조사 후의 비정상적인 DNA 손상의 회복을 지연함으로써 유사분열을 증가시키며, 방사선 조사 후의 ROS 생성의 증가를 유도함을 확인하였다(도 3 및 도 4).

또 다른 구체적인 일 실시예에서는 CBR1 발현을 억제시킨 마우스에 방사선을 조사할 경우, 방사선 조사만을 처리한 대조군에 비해 종량의 부피 및 중량이 유의적으로 감소함을 확인하였으며(도 6), 실제로 CBR1 유전자 발현이 낮은 환자에서 방사선 치료를 적용할 경우 좋은 예후를 보임을 확인하였다(도 7).

상기 결과를 통해, 암 세포주에서 CBR1을 억제함으로써 방사선 민감성을 현저히 증가시킬 수 있음을 알 수 있었다. 이는, 본 발명의 CBR1 억제제를 포함하는 조성물은 방사선 민감성 증진 용도로 우수한 효과가 있음을 시사하는 것이다.

상기 본 발명의 조성물은 암의 치료시 방사선 조사와 병용하여 투여될 수 있다. 본 발명에서 용어, "방사선 조사"는 악성 세포의 DNA를 손상시키는 국소 치료 방법을 의미한다. 정상 세포는 종양 세포에 비해 이런 손상을 수선하는 능력이 더 크다. 방사선 조사는 이런 차이를 이용하는 치료를 의미하여, 통상적으로 의미하는 방사선을 이용하여 치료하는 방법을 포함한다. 방사선 조사는 방사선치료는 치료 목적에 따라 근치(적)방사선치료, 보조적 방사선치료, 고식적 방사선치료로 나눌 수 있다. 근치(적)방사선치료는 종양이 비교적 국소부위에 제한되어 있으며 원격전이가 없을 때, 완치를 목적으로 하는 방사선치료를 말한다. 보조적 방사선치료는 외과적 수술 후 국소 재발 방지를 목적으로 시행하는 방사선치료를 말한다. 방사선치료를 병용함으로써 단순히 재발을 줄일 뿐만 아니라 수술의 범위를 줄여 기능을 유지할 수도 있다. 고식적 방사선치료는 암으로 인한 증상 완화를 목적으로 시행하는 방사선치료이다. 방사선은 고에너지 방사선을 이용하여 암세포를 죽이는 치료법이나, 암세포뿐만 아니라 주위에 있는 정상 조직에도 영향을 미치므로, 치료에 따른 부작용이 발생하기도 한다. 그 예로 피부변화, 탈모, 오심 및 구토, 설사, 점막염/식도염, 구강건조증, 생식기능의 변화 등이 있다.

본 발명에 따른 방사선 민감성 증진용 조성물은 방사선의 필요량을 감소시킴으로써 이러한 부작용을 줄일 수 있다. 또한, 방사선에 민감한 암세포뿐만 아니라, 방사선에 저항성이 있는 암세포에서도 방사선 민감도를 증가시킬 수 있다.

한편, 본 발명의 G3BP1 억제제를 포함하는 방사선 민감성 증진용 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함할 수 있으며, 담체와 함께 제제화될 수 있다.

본 발명에서 용어, "약학적으로 허용가능한 담체"란 생물체를 자극하지 않고 투여 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 말한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용되는 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.

본 발명의 CBR1 억제제 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물은 이를 유효성분으로 포함하는 어떠한 제형으로도 적용가능하며, 경구용 또는 비경구용 제형으로 제조할 수 있으며, 투여의 용이성과 투여량의 균일화를 위해 단위 투여 형태로 제형화할 수 있다. 본 발명의 약학적 제형은 구강 (oral), 직장 (rectal), 비강 (nasal), 국소 (topical; 볼 및 혀 밑을 포함), 피하, 질 (vaginal) 또는 비경구 (parenteral; 근육내, 피하 및 정맥 내를 포함) 투여에 적당한 것 또는 흡입 (inhalation) 또는 주입 (insufflation)에 의한 투여에 적당한 형태를 포함한다.

본 발명의 조성물을 유효성분으로 포함하는 경구 투여용 제형으로는, 예를 들어 정제, 트로키제, 로렌지, 수용 성 또는 유성현탁액, 조제분말 또는 과립, 에멀젼, 하드 또는 소프트 캡슐, 시럽 또는 엘릭시르제로 제제화할 수 있다. 정제 및 캡슐 등의 제형으로 제제화하기 위해, 락토오스, 사카로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아밀로펙틴, 셀룰로오스 또는 젤라틴과 같은 결합제, 디칼슘 포스페이트와 같은 부형제, 옥수수 전분 또는 고구마 전분과 같은 붕괴제, 스테아르산 마스네슘 스테아르산 칼슘, 스테아릴푸마르산 나트륨 또는 폴리에틸렌글리콜 왁스와 같은 윤활유를 포함할 수 있으며, 캡슐제형의 경우 상기 언급한 물질 외에도 지방유와 같은 액체 담체를 더 함유할 수 있다.

본 발명의 조성물을 유효성분으로 포함하는 비경구 투여용 제형으로는, 피하 주사, 정맥주사 또는 근육내 주사 등의 주사용 형태, 좌제 주입방식 또는 호흡기를 통하여 흡입이 가능하도록 하는 에어로졸제 등 스프레이용으로 제제화할 수 있다. 주사용 제형으로 제제화하기 위해서는 본 발명의 조성물을 안정제 또는 완충제와 함께 물에서 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고, 이를 앰플 또는 바이알의 단위 투여용으로 제제화할 수 있다. 좌제로 주입하기 위해서는, 코코아버터 또는 다른 글리세라이드 등 통상의 좌약 베이스를 포함하는 좌약 또는 체료 관장제와 같은 직장투여용 조성물로 제제화할 수 있다. 에어로졸제 등의 스프레이용으로 제형화하는 경우, 수분산된 농축물 또는 습윤 분말이 분산되도록 추진제 등이 첨가제와 함께 배합될 수 있다.

본 발명의 또 다른 하나의 양태는 방사선 또는 항암 화학요법과 병용되는 CBR1 억제제를 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다. 상기 용어 "방사선", "CBR1", "CBR1 억제제", "암" 등에 대한 설명은 전술한 바와 같다.

본 발명에서 용어, "병용"은 다양한 종류의 암세포를 치료하는 항암 과정에서 방사선 조사 또는 항암 화학요법과 함께 투여하는 것을 의미한다. 즉, 상기 조성물은 암이 발생된 개체에 단독으로 투여될 수도 있고, 또는 방사선 조사를 수행하면서 상기 조성물을 함께 투여하거나, 다른 항암 화학요법과 함께 병용하여 투여될 수 있다.

상기 항암 화학요법은 예컨대 독소루비신, 빈블라스틴, 탁솔, 에디포사이드, 시스플라틴, 5-FU, 이포스파마이드 등일 수 있으며, 이에 제한되지 않는다. 이들은 단독으로 또는 조합하여 사용될 수 있다.

본 발명에서 용어, "예방"은 본 발명에 따른 조성물의 투여로 상기 암의 발병을 억제 또는 지연시키는 행위를 말한다.

본 발명에서 용어, "치료"는 본 발명에 따른 조성물의 투여로 상기 암의 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 말한다.

본 발명의 또 다른 하나의 양태는 CBR1 억제제를 포함하는 방사선 민감성 증진용 조성물을 사용하여 암세포의 방사선 민감성을 증진시키는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명의 또 다른 하나의 양태는 상기 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암 치료를 위한 방사선 요법을 제공한다.

상기 용어 “방사선”, "CBR1", "CBR1 억제제", "암". "치료" 등에 대한 설명은 전술한 바와 같다.

본 발명에서 용어, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 개체에 본 발명의 조성물을 도입하는 것을 의미하며, CBR1 억제제, 예를 들어 안티센스 올리고뉴클레오티드의 바이러스성 또는 비바이러스성 기술에 의한 운반을 포함한다. 본 발명의 조성물이 암세포 내로 도입되면, CBR1의 발현 수준을 낮추거나 활성을 저해함으로써, 방사선 민감성을 증진시키게 된다.

본 발명의 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있으며, 구체적으로, 구강, 직장, 국소, 정맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 경피, 비측내, 흡입, 안구내 또는 피내경로를 통해 통상적인 방식으로 투여될 수 있다. 바람직하게는 해당 조직에 국소 투여한다.

본 발명의 암 치료를 위한 방사선 요법은 본 발명의 방사선 민감성 증진용 조성물을 치료적 유효량으로 투여하는 것을 포함한다. 상기 치료적 유효량은 방사선에 대해 암 세포 내의 종양의 민감성을 효과적으로 증진시키는 양을 의미한다. 적합한 총 1 일 사용량은 올바른 의학적 판단범위 내에서 처치의에 의해 결정될 수 있다는 것은 당업자에게 자명한 일이다. 특정 환자에 대한 구체적인 치료적 유효량은 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 경우에 따라 다른 제제가 사용되는지의 여부를 비롯한 구체적 조성물, 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 및 조사되는 방사선량을 비롯한 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용하는 것이 바람직하다. 따라서 본 발명의 목적에 적합한 방사선 민감성 증진용 조성물의 유효량은 전술한 사항을 고려하여 결정하는 것이 바람직하다. 또한, 경우에 따라, 본 발명의 방사선 민감성 증진용 조성물과 함께 공지의 항암제를 병용 투여하여 방사선 치료 효과를 포함한 항암 효과를 증대시킬 수 있다.

또한, 본 발명의 방사선 요법은 방사선 저항성이 증가될 수 있는 임의의 동물에 적용가능하며, 특히, CBR1의 발현에 기인하여 방사선 저항성이 증가될 수 있는 경우에 적용 가능하다. 동물은 인간 및 영장류뿐만 아니라, 소, 돼지, 양, 말, 개 및 고양이 등의 가축을 포함한다. 또한, 본 발명의 방사선 요법은 방사선 저항성이 증가된 모든 암 치료에 이용할 수 있으며, 특히 CBR1의 발현에 기인하여 방사선 저항성이 증가된 모든 암 치료에 이용할 수 있다. 바람직하게는 두경부암 등의 암 치료에 이용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 방사선 민감성 증진용 조성물은 CBR1 억제를 통해 암의 방사선 민감도를 증진시킬 수 있으므로, 본 발명의 조성물을 이용하여 방사선 저항성을 극복하고, 방사선 치료에 의한 합병증 발병을 감소시킬 수 있다.

도 1은 이온화 방사선에 의해 두경부 편평상피세포암의 CBR1 활성이 증가됨을 나타내는 그래프이다.
도 2는 CBR1과 두경부 편평상피세포암의 방사선 민감도와의 관련성을 나타내는 그래프이다.
도 3은 CBR1 억제는 DNA 손상의 회복을 지연시켜, 유사분열이 증가됨을 나타내는 그래프이다.
도 4는 CBR1 억제한 경우의 방사선 조사 후의 활성 산소(ROS) 생성이 증가됨을 나타내는 그래프이다.
도 5는 방사선 조사 하에, 두경부 편평상피세포암 환자의 암 조직에서 CBR1의 발현의 상관관계, 및 CBR1 발현을 조절하는 Nrf2를 나타내는 그래프이다.
도 6은 이종이식 모델 연구에서 방사선-유도 암세포 사멸을 증진시키는 CBR1 억제(silencing)를 나타내는 그래프이다.
도 7은 CBR1의 낮은 발현 조건 하에서, 방사선 조사로 두경부암 환자를 치료한 경우의 좋은 예후를 나타내는 그래프이다.

이하, 본 발명을 하기 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예만으로 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 실험 재료의 준비 및 분석 방법

실시예 1-1: 세포 배양

두경부 편평상피세포암(HNSCC) 세포주 YD8 및 SCC4는 경희대학교 안광석 교수가 제공하였고, SNU-1041은 아주대학교 김철호 교수가 제공하였다. FaDu 및 YD-10B는 한국 세포주 은행에서 구입하였다. YD8, SNU-1041 및 YD10B는 RPMI-1640(Corning, Mannasas, VA, USA) 배지에서 배양하였다. FaDu는 Eagle 최소 필수 배양 배지(Eagle's Minimum Essential Medium, MEM; Corning, Mannasas, VA, USA)에서 배양하였고, SCC4는 10% 소태아 혈청(FBS; Mannasas, VA, USA), 1% 페니실린-스트렙토마이신(Corning, Mannasas, VA, USA)이 보충된 둘베코 수정 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle's Medium, DMEM; Corning, Mannasas, VA, USA)에서 배양하였다. 모든 세포주는 5% CO₂ 존재 하에 37 ℃에서 배양하였다.

실시예 1-2: 플라스미드 및 siRNA 형질주입

HNSCC 세포는 형질주입(transfection) 전에 24시간 동안 60 mm 디시에서 60% 콘플루언시(confluency)로 플레이팅하였다. GFP-컨쥬게이트된 (pCMV6-AC-GFP) 빈 플라스미드 또는 CBR1 플라스미드를 오리젠(Origene, Rockville, MD, USA)으로부터 구매하였다. 세포는 제조사의 지침에 따라 TransIT-LT1 (Mirus Bio, Medison, WI, USA)를 사용하여 플라스미드로 형질주입시켰다. siRNA는 인간 CBR1 mRNA의 특이적 표적 서열에 대하여 디자인되었다. siRNA는 IDT(Cambridge, MA, USA)로부터 구매하였다. 스크램블드 듀플렉스 RNA(Scrambled duplex RNA)는 대조군으로 사용하였다. siRNA 형질주입은 제조사의 지침에 따라 TransIT-TKO 형질주입 시약을 이용하여 수행하였다.

실시예 1-3: 안정적인 shCBR1 녹다운 세포의 제조

비표적(nontargeting) shRNA 및 CBR1 유전자의 상이한 코딩 영역을 표적으로 하는 5개늬 shRNA의 세트를 Sigma Aldrich Biosciences (shNT; SH001V, shCBR1; TRCN0000046373, TRCN0000046375, TRCN0000046377, TRCN0000286407, TRCN0000289028)로부터 구매하였다. 안정적인 유도성 shRNA 라인을 생성하기 위해, FaDu 및 YD-10B 세포는 형질도입된 이후 2 내지 2.5 ㎍/ml 퓨로마이신(puromycin) 상에서 선별하였다.

실시예 1-4: 방사선 조사

분당 1.6 Gray의 선량률(dose rate)을 생성하는 95 kV/15 mA X 선으로 실온에서 XStrahl RS225 캐비닛(cabinet)을 사용한 조직 배양 베셀(vessels)에서 방사선 조사(IR) 전에, 세포는 3시간 동안, 억제제 또는 상대적인 DMSO 대조군을 함유하는 신선 배지(fresh media)에 노출시켰다.

실시예 1-5: 루시퍼라제(Luciferase) 활성 분석

CBR1 번역 개시 코돈의 1003-bp 업스트림의 CBR1 프로모터 서열, 빈 벡터, pGL3-Basic을 포함하는 리포터 유전자 구조물들을 TransITLT1(Mirus Bio.)을 사용하여 70% 콘플루언시 세포 배양액 내로 pRL-CMV 플라스미드(Renilla luciferase, Promega)로 공동-형질주입시켰다. 형질주입 24시간 후, 세포는 0 내지 6 Gy IR으로 처리하였다. 24-48시간 후, 배양액은 인산염-완충 식염수로 한번 세척하였고, passive 용해 완충액(Promega, 100 μl)으로 세포를 용해시켰다. 세포 용해물은 상온(15분)에서 배양하였고, vortex blender로 혼합시켰고, 4°C (1500 rpm, 30초)에서 원심분리하였다. 루시퍼라제 리포터 유전자 활성은 제조사 지침에 따라 Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega)으로 측정하였다. 빛의 세기는 데이터 분석을 위한 proprietary software를 구비한 Spectramax luminometer (Molecular Devices, Sunnyvale CA)로 측정하였다. pGL3-basic 벡터로 형질주입된 세포 배양액의 빛의 세기 값을 백그라운드에 대하여 보정하는데 사용하였다. 보정된 파이어플라이(firefly) 루시퍼라제 활성은 레닐라(Renilla) 루시퍼라제 활성에 대하여 정규화하였고, pGL3-basic 빈 벡터로부터 수득된 값에 대하여 배수 증가로 표현하였다. 재현성을 평가하기 위해, 3가지의 독립적인 실험을 삼중으로 수행하였다.

실시예 1-6: 루시퍼라제(Luciferase) 활성 분석

기하급수적으로 성장하는 세포는 24시간 동안 대조군 siRNA 올리고뉴클레오티드 또는 유전자-특이적 siRNA로 형질주입하였다. HNSCC 세포는 60-mm 디시에 플레이팅하였고, 방사선 조사 전에 70% 콘플루언시까지 24시간 동안 성장시켰다. HNSCC 세포는 방사선 조사 전에 3시간 동인 Hpp-Me를 처리하였다. 세포는 2 내지 6 Gy로 방사선 조사하였다. 세포는 방사선 조사 3시간 후에 트립신화하였고, 혈청 함유 배지에서 6-웰 세포 배약 플레이트 내로 3배 희석하여 복제물을 플레이팅하였다. 세포를 10 내지 14일 동안 성장시킨 후, 고정 및 Gentiana violet을 이용한 염색하였다. 50개 이상의 세포를 함유하는 콜로니를 계산하였다. 생존율(survival fraction)을 측정하기 위해, 콜로니-형성 효율을 측정하고, 평균하고, 방사선이 조사되지 않은 대조군의 값에 대하여 정규화하였다. 각각의 방사선 양에 대하여, 3 웰으로부터 수득된 콜로니의 평균 개수를 플레이팅 효율에 따라 보정하였고, 각 용량에서 세포 생존을 계산하기 위해 사용하였다. 이온화 방사선 의존적 세포 생존율 곡선은 linear-quadratic(LQ) 모델을 사용하여 피팅되었다. 3개의 독립적 실험의 평균 정규화 생존율을 기록하였다(±SE). 용량 반응 간의 유의적인 차이는 two-way ANOVA 테스트를 수행하여 계산하였다.

실시예 1-7: 웨스턴 블로팅

방사선 조사 후, 세포는 얼음-냉각된 PBS로 헹구고, cell scraper를 이용하여 수확하고, 이후 원심분리하였다. 세포 펠렛은 얼음 상에서 10분동안 용해시키고, 이후 최대 속도로 원심분리하였다. 단백질 정량화(Micro-BCA Protein Assay, Pierce, Meridian RD, USA) 후에, 단백질 및 로딩 염료의 동일한 양을 10% 또는 12% SDS-폴리아크릴아마이드 겔 상의 레인 마다 첨가하고, 전기영동시키고, 폴리비닐리덴 다이플루오라이드(polyvinylidene difluoride) 막(Milliphore, Billerica, MA, USA)으로 이동시켰다. 상기 막을 차단하고, 항-CBR1(Novurs) 또는 항-α-안튜불린(antubulin)(abcam, Cambridge, MA, USA)에 대한 1차 항체로 프로브되고, 홀스래디쉬 퍼옥시다제-컨쥬게이트된 2차 항체 (Cell signaling, Beverly, MA, USA)와 함께 배양하였다. 단백질-항체 결합체를 제조사의 프로토콜에 따라 증가된 화학 발광(chemiluminescence) (GEhealthcare. Burkinghamshire, UK)을 사용하여 검출하였다.

실시예 1-8: 실시간 정량적 역전사 효소 PCR 분석

제조사 지침에 따라 RNeasy mini kit (Qiagen, Hilden, Germany)를 사용하여 지시된 세포주로부터 총 RNA를 추출하였고, RNA 농도는 NanoDrop 분광광도계를 이용하여 정량화하였다. qPCRBIO cDNA Synthesis kit (PCRBIOSYSTEMS. London, UK)를 이용하여, 총 RNA의 500ng을 cDNA로 역전사하였다. 생성된 cDNA는 2X qPCRBIO SyberGreen Mix (PCRBIOSYSTEMS)실시간 정량적 RT-PCR을 사용하여 분석하였다. 실시간 RT-PCR은 96-웰 블록 모듈을 가진 Step One Plus 실시간 RT-PCR 시스템 (Applied Biosystems)을 이용하여 수행하였다. 내인성 CBR1, GAPDH에 대한 프라이머는 CBR1, 5'-CAGAGACCCCTGTGTACTTG-3' (sense); CBR1, 5'-CAACTCAGGACAAGGTACAAAATG-3' (antisense)이다. 사이클링 조건은 10분 동안 95℃이고, 이후 40회 사이클은 15초 동안 95℃이고, 60초 동안 60℃이다. mRNA의 상대적인 양은 내인성 대조군으로서 GAPDH의 발현을 이용하여 임계 사이클 수로부터 계산하였다. 모든 실험은 삼중으로 수행하였으며, 값을 평균내었다.

실시예 1-9: γ-H2AX 형광항체법

DNA 두 가닥 파손(DSB) 동력학을 γ-H2AX foci 형광항체법을 이용하여 연구하였다. 세포는 24-웰 플레이트에서 유리 커버슬립 상에 플레이팅하였고, CBR1를 억제하며 배양하였고, 0 내지 6 Gy IR로 처리하였고, PBS로 세척하였고, 상온에서 10분 동안 10% 포르말린으로 고정하였다. 상기 표본은 5% BSA/PBS의 상층액으로 블로킹하였고, 1시간 동안 섞고, 하룻밤 동안 4 ℃에서 γ-H2AX에 대한 토끼-다클론성 항체(phosphor S139, abcam) 와 함께 배양하였고, 이후 상온에서 1시간 동안 Alexa-488 라벨링된 항-토끼 2차 항체(abcam)와 함께 배양하였다. 표본들은 40,6-diamidino2-phenylindole (DAPI)으로 대비염색하였고, Vectashield 마운팅 배지(Vector Labs, Inc. Burlingame, CA, USA)에 마운팅하기 전에, inPBS-Tween20 0.1%로 세척하였다. 형광 이미지는 공초점 현미경으로 획득하였다(Zeiss LSM710, Germany).

실시예 1-10: ROS 생산의 측정

기하급수적으로 성장하는 세포는 대조군 siRNA 올리고뉴클레오티드 또는 유전자-특이적 siRNA로 24시간 동안 형질주입시켰다. 세포는 250-kVp X-선 (0.61 Gy/분)을 이용하여 방사선 조사하였다. IR 24시간 후, 세포 내 ROS의 수준을 제조사 지침에 따라 total ROS detection kit(Enzo life sciences, Farmingdale, NY, USA) 를 이용하여 모니터링 하였다. 세포를 수확하였고, 처리 후 5 ml 둥근 폴리스티렌 튜브 내에 두었고, 1X 세척 완충액으로 세척하였다. 그 후, 세포를 상온에서 400 g에서 5분 동안 원심분리하였고, 상층액은 폐기하였다. 세포는 500 ㎕ ROS 검출 용액에서 재부유시켰고, 어둠 속에서 30분 동안 37 ℃에서 염색하였고, 유세포 분석기 (BD phamigen. San Jose. CA, USA) 에 의해 분석하였다.

실시예 1-11: 세포-주기 분석

처리되지 않은 세포 및 방사선 조사 처리된 세포는 트린신화, 얼음 냉각 PBS로 세척 및 DNA 분석 전에 20 ℃에서 하룻밤 동안 70% 에탄올으로 고정화되어 수확하였다. 원심분리에 의해 에탄올을 제거한 후, FACS Calibur 유세포 분석기(BD phamigen. San Jose. CA, USA)에 의해 분석되기 전에, 세포는 PI Master Mix (40 mg/mL 프로피디움 요오드화물(Sigma-Aldrich) 및 100 mg/mL DNase-free-RNase (Bioneer, Korea))와 함께, PBS에서 37 ℃에서, 30분 동안 배양하였다. 기준선(방사선 조사되지 않은 세포)으로부터 백분율 변화를 방사선 조사 0, 4, 16, 24 및 48 시간 후에 수집된 샘플로부터 그래프를 도시하였다.

실시예 1-12: 이종이식 마우스 모델

체중 20±2 g, 수컷 BALB/c 누드 마우스를 Orient(Seongnam, Korea)로부터 구매하였다. 안정적 shCBR1 녹다운 세포 (0.1 ml 식염수에서 마우스당 2.5Υ10⁶세포)를 각 마우스의 오른쪽 허벅지에 피하 주사하였고, 종양을 성장시켰다. 종양의 크기가 70 - 100 mm³에 도달한 경우, 마우스를 각각 5마리의 상이한 그룹으로 임의로 나누었다. 마우스는 매주 체중을 측정하였다. 종양의 직경을 측정하기 위해 전자 캘리퍼스(electronic calipers)를 이용하여 오른쪽 각도에서 매주 2회씩 가장 길고 가장 짧은 길이(d_long 및 d_short)를 측정하였고, 식(volume=[(d_short)²Х(d_long)]/2)을 이용하여 부피로 전환하였다. 실험에서 사용된 방사선 조사 일정은 5일 동안 매일 2 Gy, 총 10 Gy이었다.

실시예 1-13: HNSCC 조직 샘플 및 면역조직화학

포르말린-고정화되고 파라핀-포매된 85 HNSCC 조직을 사용하였다. 모든 환자는 방사선 치료 또는 보조적 방사선 치료를 받았다. 면역조직화학(IHC)를 제조사 지침에 따라 Bond Polymer Refine Detection System (Leica Biosystems, Newcastle, United Kingdom)을 사용하여 4 um 조직 절편 상에서 수행하였다. 헤마톡실린-에오신 염색 슬라이드의 1차 평가에 의해 선별된 대표적인 파라핀 블록을 IHC를 위해 선택하였다. 포르말린-고정화된, 파라핀-포매된 조직의 4-um 절편을 Bond Dewax 용액(LeicaBiosystems)으로 탈파라핀화시키고, Bond Epitope Retrieval 용액 1(LeicaBiosystems)을 사용하여 20분 동안 100 ℃에서 항원 회복 과정을 수행하였다. 내인성 퍼옥시다제는 15분 동안 과산화수소와 함께 배양함으로써 억제하였다. 절편은 Bond-max automatic slide stainer (LeicaBiosystems)에서 비오틴-없는 중합 홀스래디쉬 퍼옥시다제(HRP)-링커 항체 컨쥬게이트 시스템을 사용하여 라벨링된 CBR1에 대한 1차 다클론성 항체(1:100; NBP1-86595, Novus Biologicals, Littleton, CO, USA)와 함께 주위 온도에서 15분 동안 배양하였다. 결합 퍼옥시다제(Bound peroxidase)는 다이아미노벤지딘 용액을 발색원으로 사용하여 시각화하였고, 핵은 Mayer's 헤마톡실린으로 대비염색하였다. 종양 부분의 스트로마 세포 및 침윤성 염증 세포는 내부 양성 대조군으로 사용하였다.

실시예 1-14: 면역조직화학 해석 및 분석

모든 절편은 임상적 데이터에 무지한, 전문적인 병리학자에 의해 검사되었다. 세포질 및/또는 핵 염색은 CBR1에 대하여 양성인 것으로 나타났다. 염색 강도는 다음과 같이 정의되었다: 0, 염색 없음; 1, 약함; 2, 중간; 3, 강함. 양성(0%~10%)의 정량화는 각 강도(0-3)을 가진 종양 세포의 백분율의 추정 값에 기초하였다. 최종 면역반응도-점수는 0 내지 300 값의 범위로, 다음 식을 통해 계산하였다: 최종 면역반응도-점수= (염색이 없는 종양 세포의 비율 x 0) + (약한 강도를 가지는 종양 세포의 비율 x 1) + (중간 강도를 가지는 종양 세포의 비율 x 2) + (강한 강도를 가지는 종양 세포의 비율 x 3). 컷-오프 값은 시간-의존적 ROC 곡선 분석에 의해 계산하였다. 컷-오프 값보다 높은 면역반응도-점수는 높은 발현으로 간주하였다.

실시예 1-15: 환자 및 유전자 발현 데이터

158명의 HNSCC 환자로부터 이전에 개시된 임상적 데이터 및 유전자 발현 데이터를 사용하였다. 3개 집단의 유전자 발현 및 임상적 데이터는 생물정보센터(NCBI) 유전자 발현 옴니버스(GEO) 데이터 베이스로부터 획득하였다. 이들은 MD Anderson Cancer Center (GSE42743, n=74)(17), Vanderbilt University (GSE10300, n=44)(18) 및 Aristotle University of Thessaloniki (GSE25727, n=56)(19)로부터 획득한 데이터이다.

실시예 1-16: 통계 분석

모든 실험은 3회 이상 수행하였다. 데이터는 R 언어 환경(http://www.r-project.org)을 사용하여 처리 및 분석하였다. 독립적 t-검사는 2 그룹간의 값을 비교하는데 사용하였다. 카플란-마이어 분석 및 로그순위법을 사용하여 예후를 예측하였다. 0.05 이하의 P 값을 통계적으로 유의적인 것으로 나타내었다.

<실시예 2> 방사선 조사에 의한, 암 세포에서의 CBR1 활성 증진 확인

두경부암 세포주인 YD10B, FaDu, SNU-1041 및 YD8 세포주에 방사선을 0 내지 6 Gy로 조사한 결과, 도 1A에서 확인할 수 있는 바와 같이, CBR1 단백질의 합성이 방사선 조사량에 비례하여 증가됨을 확인하였다. 또한, 도 1B에서 확인할 수 있는 바와 같이, RT-PCR 결과를 통해 CBR1 mRNA 전사가 방사선 조사량에 비례하여 증가됨을 확인하였다. 또한, 도 1C 및 1D에서 확인할 수 있는 바와 같이, 리포터 유전자에 의한 CBR1의 프로모터 활성을 분석한 결과, 방사선을 조사할 경우에 CBR1 프로모터를 포함하는 플라스미드의 루시퍼라제 활성이 대조군에 비해 4배 이상으로 증가시킴을 확인하였으며, 이는 방사선 조사에 의해 CBR1 합성이 mRNA 전사에 의해 상향 조절됨을 의미한다.

<실시예 3> CBR1 과발현에 의한, 방사선 조사에 대한 암세포 보호 효과 확인

FaDu 및 YD8 세포주를 이용하여, CBR1이 안정적으로 형질주입된 세포주를 제작하고, 방사선을 조사하여 클론원성(clonogenic) 생존율 분석 결과, 도 2D에서 확인할 수 있는 바와 같이, CBR1이 안정적으로 형질주입된 세포주에서 방사선 조사에도 불구하고 세포 생존율이 증가하는 것을 확인하였습니다. 이를 통해, CBR1 과발현을 통해, 방사선 조사에 대하여 암 세포를 보호할 수 있음을 확인하였습니다.

<실시예 4> CBR1 억제를 통한 방사선 민감도 증진 효과 확인

실시예 4-1: CBR1 억제(siRNA 및 hydroxyl-PP-Me)를 통한 민감도 증진 효과 확인

방사선 민감도에 대한 CBR1의 역할을 확인하기 위해, FaDu 및 YD10B 세포에서 CBR1에 특이적인 siRNA를 이용하여 RNA 간섭 실험을 수행하였다. 웨스턴 블로팅 결과, 도 2A에서 확인할 수 있는 바와 같이, CBR1 특이적 siRNA에 의해 CBR1 발현은 완전히 억제되었음을 확인하였다.

CBR1 유전자 발현이 방사선 민감도 증진에 관여하는지 확인하기 위해, FaDu 및 YD10B 세포로부터 스크램블(scrambled) siRNA 및 CBR1-siRNA가 형질주입된 세포에서 클론원성 생존율 분석 결과, 도 2B에서 확인할 수 있는 바와 같이, 스크램블 siRNA가 형질주입된 세포와 비교하여, CBR1-siRNA가 형질주입된 세포는 2 Gy 내지 4 Gy에서 세포 생존이 현저히 감소됨을 확인하였다. 이를 통해, 암세포에서 CBR1을 녹다운하는 경우, 방사선 민감도가 향상되어 암 세포 생존율이 현저히 감소됨을 확인하였다.

또한, CBR1의 선택적 억제제로 알려져 있는 hydroxy-PP-Me(3-(7-isopro- pyl-4-(methylamino)-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5yl)phenol)를 FaDu 및 YD10B 세포에 방사선 조사 전/후에 투여하였고, 클론원성 생존율 분석 결과, 도 2C에서 확인할 수 있는 바와 같이, 25 mM hydroxy-PP-Me를 투여한 후 방사선 조사를 수행할 경우에, 방사선에 의한 세포 생존율을 유의적으로 감소시킴을 확인하였다. 이를 통해, CBR1 억제제를 처리할 경우, 방사선 민감도가 향상되어 암 세포 생존율이 현저히 감소됨을 확인하였다.

실시예 4-2: CBR1 억제를 통한 DNA 손상 회복의 지연 및 유사분열 증가 효과 확인

CBR1에 의해 방사선 조사에 의한 DNA 손상의 회복이 방해되는지를 확인하기 위해, 인산화된 히스톤 2AX foci(γH2AX)의 유동 혈구 계산 분석(flow cytometric analysis)을 이용하여, DNA 손상 프로파일을 측정하였다. 그 결과, 도 3A 및 3B에서 확인할 수 있는 바와 같이, 방사선 조사 후 γH2AX-양성 세포는 CBR1-siRNA 형질주입된 세포에서 스크램블 siRNA 형질주입된 세포에서 보다 현저히 증가됨을 확인하였다. 이를 통해, CBR1 억제는 방사선 조사에 의한 DNA 두 가닥 파손(DSB)의 회복을 막음을 확인할 수 있다.

CBR1 억제에 의한 방사선 민감도 증진이 방사선 유도 세포 사멸의 증가에 의한 것인지 여부를 확인하기 위해, CBR1-siRNA 및 스크램블 siRNA가 형질주입된 세포에서 방사선 조사 후의 세포 사멸 단백질을 분석하였다. 그 결과, 도 3C 및 3D에서 확인할 수 있는 바와 같이, 두 세포군 간의 유의적인 차이는 확인되지 않았다. 이에, 세포 사멸의 메커니즘이 방사선에 의해 유도된 유사 분열의 증가를 포함한다고 가정하였고, CBR1이 억제된 세포에 방사선 조사 후 관찰한 결과, 유사분열 상태의 세포가 유의적으로 관찰됨을 확인하였다.

또한, PI로 염색된 세포의 유동세포 분석법을 이용하여 세포주기를 분석한 결과, 도 3E에서 확인할 수 있는 바와 같이, 대조군 세포 또는 방사선만을 처리한 세포와 비교하여, CBR1 억제 세포에서 G2-M 단계에서 방사선에 의해 세포주기를 유의적으로 억제함을 확인하였다. 이를 통해, CBR1 억제는 비정상적 DNA 손상의 회복을 지연시켜, 유사분열을 증가시킴을 확인하였다.

실시예 4-3: CBR1 억제를 통한 방사선 조사 후 ROS 생성의 증가 효과

방사선 조사 수의 ROS 생성에 있어 CBR1 억제의 효과를 확인하기 위해, Cellular Reactive Oxygen Species Detection Assay Kit를 이용하여 세포 내 ROS 농도를 측정한 결과, 도 4A 및 4B에서 확인할 수 있는 바와 같이, 방사선 조사 후, 스크램블 siRNA가 형질주입된 세포에 비하여, CBR1-siRNA가 형질주입된 세포에서 ROS 생성이 크게 증가됨을 확인하였다. 이를 통해, CBR1 억제를 통해 방사선 민감도를 증진시키므로, ROS 생성 증가를 포함한 방사선 치료 효과를 향상시킴을 확인하였다.

<실시예 5> Nrf-2 전사인자와 CBR1과의 상관관계 확인

암 세포에서 Nrf-2가 CBR1의 전사를 조절하는지 확인하기 위해, CBR1 프로모터가 포함된 리포터 플라스미드를 이용한 프로모터 분석을 수행한 결과, 도 5A에서 확인할 수 있는 바와 같이, Nrf-2 고갈 세포에서 CBR1 프로모터를 포함한 루시퍼라제 활성은 스크램블 siRNA로 형질주입된 세포에서 보다 2배 이상 크게 감소됨을 확인하였다. 또한, 도 5B 및 5C에서 확인할 수 있는 바와 같이, CBR1 단백질은 방사선 조사 후 Nrf-2 녹다운 세포에서 유의적으로 하향-조절되는 반면에, Nrf-2 결핍은 방사선 조사가 없는 경우에는 CBR1 단백질의 발현에 영향을 미치지 않음을 확인하였다.

TCGA 데이터베이스의 두경부암 환자에서 두 유전자의 발현을 비교한 결과, 도 5D에서 확인할 수 있는 바와 같이, CBR1 발현과 Nrf-2의 mRNA 양은 유의적인 연관성을 나타냄을 확인하였다. 이를 통해, Nrf-2는 암 세포에서 방사선 조사 후 CBR1 mRNA 발현을 조절하는 주요 전사인자이며, 생체 내에서 CBR1과 유의적인 상관관계가 있음을 확인하였다.

<실시예 6> CBR1 억제를 통한 방사선 유도 암 세포 사멸의 증가 효과 확인

시험관 내(in vitro) 연구를 기반으로, YD10B 세포를 이용하여 BALB/c 누드 마우스에서 이종이식 종양을 만들기 위해, 부형제(vehicle), 방사선 조사, shCBR1, shCBR1 + 방사선 조사의 4개의 그룹으로 나누었다. 상기 마우스에 CBR1-shRNA 또는 스크램블 shRNA가 형질주입된 YD10B 세포를 접종한 후, 매일 2 Gy 용량으로 5일 동안, 총 10 Gy의 방사선을 조사하였다.

그 결과, 도 6A에서 확인할 수 있는 바와 같이, CBR1 억제 및 방사선 조사한 마우스 그룹의 종양 부피는 12일째부터 CBR1-shRNA 또는 방사선 단독 처리 그룹에 비해 유의적인 차이(약 2배 더 작음)를 나타냄을 확인하였다. 또한, 상기와 같은 차이는 21일 이후에는 더 커짐을 확인하였으며, 구체적으로 치료 종결 시점에는 평균 종양 부피가 대조군에 비해 60% 이상 감소하였고, 방사선 조사군에 비해서는 54.7% 감소하였음을 확인하였다.

또한, 도 6B에서 확인할 수 있는 바와 같이, CBR1 억제 및 방사선 조사한 마우스 그룹의 종양의 중량은 방사선 단독 처리 그룹에 비해 현저하게 감소됨을 확인하였다.

이를 통해, CBR1 유전자 억제는 방사선 조사에 의해 유도되는 암세포 사멸 효과를 향상시킴을 확인하였다.

<실시예 7> CBR1 발현이 낮은 두경부암 환자의 방사선 치료에 대한 좋은 예후 확인

CBR1 발현이 방사선 치료 결과에 실제로 어떠한 영향을 미치는지 확인하기 위해, 방사선 치료를 받은 두경부암 환자 85명에서 CBR1 발현 및 예후와의 상관관계를 확인하였다. 면역반응도 점수를 사용하여 염색 강도와 IHC 정성 검사를 수행한 결과, 도 7A 및 7B에서 확인할 수 있는 바와 같이, CBR1 발현이 높은 환자의 5년 전체 생존율(OS)은 40%였고, CBR1 발현이 낮은 환자의 5년 전체 생존율(OS)은 72.9%로, CBR1 발현이 낮은 환자의 경우 방사선 치료에 의해 유의적으로 좋은 예후를 나타냄을 확인하였다. 이처럼, 환자 조직에서의 CBR1의 면역반응도 점수는 방사선 치료의 예후에 대한 지표로 이용될 수 있음을 확인하였다.

또한, 공개적으로 이용 가능한 다른 두경부암 집단에서 CBR1의 효과를 조사한 결과, 도 7C에서 확인할 수 있는 바와 같이, GSE42743, GSE10300, GSE25727에서 158명의 두경부암 환자가 포함되어 있으며, 이들 중 CBR1 증간 값을 기준으로 높은 그룹과 낮은 그룹으로 나누는 경우, CBR1의 발현이 낮은 그룹이 CBR1 발현이 높은 그룹 보다 유의적으로 높은 생존율을 나타냄을 확인하였다.

이상의 내용을 종합하면, 본 발명에서는 방사선 조사가 암 세포주의 CBR1 활성을 증진시키고, CBR1의 과발현은 방사선 조사에 대한 암 세포 보호 효과를 나타냄을 확인하였다. CBR1 억제는 비정상적인 DNA 손상을 유도하여 유사분열을 증가시키고, 방사선 조사 후의 ROS 생성을 증가시키고, 궁극적으로 방사선 조사에 의해 유도되는 암세포 사멸을 증가시킴을 확인하였다. 실제로, CBR1 발현이 낮은 암 환자가 방사선 치료에서 좋은 예후를 나타냄을 확인하였다. 상기와 같은 결과를 통해, CBR1 억제에 의한 방사선 민감도 증진 효과, 및 CBR1 억제제와 방사선 조사를 병용하는 경우의 암 치료 효과를 확인하였다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims

CBR1(Carbonyl reductase 1) 억제제를 포함하는, 구강암 또는 인두암의 방사선 민감성 증진용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 CBR1 억제제는 CBR1 mRNA의 발현을 억제하는 올리고뉴클레오티드 또는 CBR1 단백질의 활성을 억제하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편인 것인, 구강암 또는 인두암의 방사선 민감성 증진용 조성물.
제2항에 있어서, 상기 CBR1 mRNA 발현을 억제하는 올리고뉴클레오티드는 CBR1 mRNA에 특이적인 안티센스 올리고뉴클레오티드, 앱타머(aptamer), shRNA 또는 siRNA인 것인, 구강암 또는 인두암의 방사선 민감성 증진용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 방사선에 저항성을 가지는 구강암 또는 인두암 세포의 방사선 민감성을 회복 또는 증진시키는 것인, 구강암 또는 인두암의 방사선 민감성 증진용 조성물.
삭제
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함하는 것인, 구강암 또는 인두암의 방사선 민감성 증진용 조성물.
CBR1 억제제를 포함하는 구강암 또는 인두암의 예방 또는 치료용 약학 조성물로서, 상기 CBR1 억제제는 방사선 치료와 병용되는 것인, 약학 조성물.
삭제
제7항에 있어서, 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함하는 것인, 약학 조성물.