KR101525122B1 - Ｕｂｂ 넉­다운에 의한 암의 예방 또는 치료 - Google Patents

Abstract

본 발명은 Ubb(Ubiquitin B) 유전자의 발현 억제제를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, Ubb 유전자의 발현 억제는 암세포의 성장 억제, 아폽토시스 유발, 유비퀴틴화-의존적 프로테아좀 분해 및 NF-κB의 활성화 저해 효과를 나타낸다. 따라서, 본 발명의 조성물은 암을 예방 또는 치료하는 데 이용될 수 있다.

Description

Ｕｂｂ 넉­다운에 의한 암의 예방 또는 치료{the prevention or treatment of cancers by Ubb knockdown}

본 발명은 Ubb(Ubiquitin B) 유전자의 발현 억제제를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

유비퀴틴(Ubiquitin, Ub)은 3종류의 효소들의 연이은 작용에 의하여 단백질과 공유 결합된 작은 진핵세포성 단백질이다(1, 2). Ub는 먼저 Ub-활성화 효소(Ub-activating enzyme, E1)에 의하여 활성화된 후, Ub-결합 효소(Ub-conjugating enzyme, E2)로 옮겨진 다음 Ub 라이게이즈(Ub ligase, E3)의 조절 하에 타겟 단백질과 결합한다. 인간의 경우 적은 수의 E1 효소, ~30종의 E2 효소 및 600종 이상의 E3 효소가 존재하며, 이들 효소들은 함께, 다양한 길이와 토폴로지의 폴리유비퀴틴화(polyubiquitination) 뿐만 아니라, 단일 또는 복수 부위의 모노유비퀴틴화(monoubiquitination)를 통하여 수천 종의 단백질들의 다양한 유비퀴틴화 유형을 발생시킨다(3, 4). 이후, 다양한 유비퀴틴 생성물은 다운스트림(downstream) 효과를 유발하는 Ub-결합 도메인(UBD)을 포함하는 Ub 수용체 또는 반대의 반응을 촉매하는 탈유비퀴틴화 효소(deubiquitinating enzymes)에 의하여 특이적으로 인지된다(5). 따라서, Ub 시스템은 많은 용도를 갖고 있으며, 단백질 안정성의 조절뿐만 아니라, 단백질 상호작용, 수송(trafficking) 및 활성화의 조절을 통하여 다양한 세포 과정(cellular processes)에서 중요한 역할을 할 수 있다.

한편, 암은 현대인의 사망원인에서 가장 큰 비중을 차지하고 있는 질환 중 하나로 여러 가지 원인에 의해 정상세포 유전자의 돌연변이로 인하여 발생하며, 정상적인 세포의 분화, 성장 형태를 따르지 않는 종양 중 악성인 것을 말한다. 현재 악성종양인 암을 치료하기 위하여 주로 3가지의 치료법 즉, 외과적 수술법, 방사선 치료법 및/또는 화학요법이 이용되어 왔다. 또한, 최근에는 암의 발생, 진행, 악화 및 예후 등과 관련된 세포분자(예컨대, 단백질, 핵산 등)를 표적으로 하여, 이의 발현 또는 활성의 억제 또는 증가를 통하여 암을 치료하고자 하는 기술 개발이 활발히 이루어지고 있다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

(선행논문 1) Hershko, A. & Ciechanover, A. Annu. Rev. Biochem. 67, 425-479 (1998) (선행논문 2) Pickart, C. M. Annu. Rev. Biochem. 70, 503-533 (2001)) (선행논문 3) Weissman, A. M. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2, 169-178 (2001) (선행논문 4) Kulathu, Y. & Komander, D. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 13, 508-523 (2012) (선행논문 5) Reyes-Turcu, F. E., et al., Annu. Rev. Biochem. 78, 363-397 (2009)

본 발명자들은 암의 예방 및 치료제를 개발하기 위하여 유비퀴틴과 암과의 관련성에 대한 연구를 수행하였다. 그 결과, 유비퀴틴을 코딩하는 유전자 중 하나인 Ubb(Ubiquitin B)의 넉-다운에 의하여 암세포의 성장이 억제되고, 아폽토시스가 유발됨으로써 항암효과를 얻을 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 Ubb(Ubiquitin B) 유전자의 발현 억제제를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명자들은 암의 예방 및 치료제를 개발하기 위하여 유비퀴틴과 암과의 관련성에 대한 연구를 수행하였다. 그 결과, 유비퀴틴을 코딩하는 유전자 중 하나인 Ubb(Ubiquitin B)의 넉-다운에 의하여 암세포의 성장이 억제되고, 아폽토시스가 유발됨으로써 항암효과를 얻을 수 있음을 확인하였다.

본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 Ubb 유전자의 발현 억제제는 siRNA, shRNA, miRNA, 안티센스 올리고뉴클레오타이드 및 핵산 앱타머로 구성된 군으로부터 선택된다. 상기 Ubb 유전자의 발현 억제제는 암세포 내의 단독의 모노-Ub(free mono-Ub)와, 효소와 결합된 Ub를 포함하는 모노-Ub, 및 세포 내 단백질과 컨쥬게이트 된 Ub(conjugated Ub)의 수준을 감소시킴으로써, 암세포에 대한 Ub의 공급을 저해하여 항암효과를 나타낼 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어, "siRNA"는 RNA 방해 또는 유전자 사일런싱을 매개할 수 있는 핵산 분자를 의미한다(참조: WO 00/44895, WO 01/36646, WO 99/32619, WO 01/29058, WO 99/07409 및 WO 00/44914). siRNA는 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있기 때문에 효율적인 유전자 넉-다운 방법으로서 또는 유전자 치료 방법으로 제공된다.

하나의 특정예에서, 본 발명의 siRNA 분자는 센스 가닥(Ubb mRNA 서열에 상응하는 서열)과 안티센스 가닥(Ubb mRNA 서열에 상보적인 서열)이 서로 반대쪽에 위치하여 이중쇄를 이루는 구조를 가질 수 있다. 다른 특정예에 따르면, 본 발명의 siRNA 분자는 자기-상보성(self-complementary) 센스 및 안티센스 가닥을 가지는 단일쇄 구조를 가질 수 있다.

siRNA는 RNA끼리 짝을 이루는 이중사슬 RNA 부분이 완전히 쌍을 이루는 것에 한정되지 않고 미스매치(대응하는 염기가 상보적이지 않음), 벌지(일방의 사슬에 대응하는 염기가 없음) 등에 의하여 쌍을 이루지 않는 부분이 포함될 수 있다. 전체 길이는 10 내지 100 염기, 바람직하게는 15 내지 80 염기, 더욱 바람직하게는 20 내지 70 염기이다.

siRNA 말단 구조는 Ubb 유전자의 발현을 RNAi 효과에 의하여 억제할 수 있는 것이면 평활(blunt) 말단 혹은 점착(cohesive) 말단 모두 가능하다. 점착 말단 구조는 3'-말단 돌출 구조와 5'-말단 돌출 구조 모두 가능하다.

본 발명의 siRNA 분자는, 자기-상보성 센스 및 안티센스 가닥 사이에 짧은 뉴클레오타이드 서열(예컨대, 약 5-15 nt)이 삽입된 형태를 가질 수 있으며, 이 경우 뉴클레오타이드 서열의 발현에 의해 형성된 siRNA 분자는 분자 내 혼성화에 의하여 헤어핀 구조를 형성하게 되며, 전체적으로는 스템-앤드-루프 구조를 형성하게 된다. 이 스템-앤드-루프 구조는 인 비트로 또는 인 비보에서 프로세싱되어 RNAi를 매개할 수 있는 활성의 siRNA 분자를 생성한다.

본 발명의 siRNA는 생체 내 핵산 분해효소에 의한 빠른 분해를 막기 위해 화학적으로 변형된 형태일 수 있다. siRNA가 쉽게 분해되지 않도록 안정하고 저항적이도록 하기위한 siRNA의 화학적 변형 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다. siRNA의 화학적 변형에 가장 많이 사용되는 방식은 보라노포스페이트(boranophosphate) 또는 포스포로티오에이트(phosphorothioate) 수식 방법(modification)이다.

본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 siRNA는 서열목록 제1서열의 뉴클레오타이드로 이루어진다.

본 명세서에서 사용된 용어, "shRNA(short hairpin RNA)" 는 45 내지 70 뉴클레오티드의 길이를 가지는 단일가닥의 RNA로서 타겟 유전자 siRNA 염기서열의 센스와 상보적인 nonsense 사이에 3-10개의 염기 링커를 연결하는 올리고 DNA를 합성한 후 플라스미드 벡터에 클로닝하거나 또는 shRNA를 레트로바이러스인 렌티바이러스(lentivirus) 및 아데노 바이러스(adenovirus)에 삽입하여 발현시키면 loop가 있는 헤어핀 구조의 shRNA가 만들어지고 세포 내의 dicer에 의해 siRNA로 전환되어 RNAi 효과를 나타낸다.

본 명세서에서 사용된 용어, "miRNA(microRNA)"는 21-25 뉴클레오타이드의 단일 가닥 RNA 분자로서, 타겟 mRNA의 파쇄 또는 해독단계에서의 억제를 통하여 진핵생물의 유전자 발현을 제어하는 조절물질이다. 이러한 miRNA는 두 단계의 프로세싱으로 이루어진다. 최초의 miRNA 전사체(primary miRNA)가 핵 안에서 Drosha라는 RNaseⅢ type 효소에 의해 70-90 염기 정도의 스템-루프 구조, 즉 pre-miRNA로 만들어지고, 이후 세포질로 이동하여 다이서(Dicer)라는 효소에 의해 절단되어 21-25 염기의 성숙한 miRNA로 만들어진다. 이렇게 생성된 miRNA는 표적 mRNA에 상보적으로 결합하여 전사 후 유전자 억압자(post-transcriptional gene suppressor)로써 작용하며, 번역 억제와 mRNA 불안정화를 유도한다. miRNA는 다양한 생리학적 현상 및 질환에 관여한다.

본 명세서에서 사용된 용어, "안티센스 올리고뉴클레오타이드"란 특정 mRNA의 서열에 상보적인 핵산 서열을 함유하고 있는 DNA 또는 RNA, 또는 이들의 유도체를 의미하고, mRNA 내의 상보적인 서열에 결합하여 mRNA의 단백질로의 번역을 저해하는 작용을 한다. 본 발명의 안티센스 서열은 Ubb 유전자에 상보적이고 Ubb 유전자 mRNA에 결합할 수 있는 DNA 또는 RNA 서열을 의미하고, Ubb mRNA의 번역, 세포질 내로의 전위(translocation), 성숙(maturation) 또는 다른 모든 전체적인 생물학적 기능에 대한 필수적인 활성을 저해할 수 있다. 안티센스 핵산의 길이는 6내지 100 염기이고, 바람직하게는 8 내지 60 염기이고, 보다 바람직하게는 10 내 40 염기이다.

본 명세서에서 사용된 용어, "핵산 앱타머(aptamer)"는 소정의 표적 분자에 대한 결합 활성을 갖는 핵산 분자를 말한다. 앱타머는 소정의 표적 분자에 대하여 결합함으로써, 소정의 표적 분자의 활성을 저해할 수 있다. 본 발명의 앱타머는 RNA, DNA, 수식(modified) 핵산 또는 이들의 혼합물일 수 있다. 본 발명의 앱타머는 또한 직쇄상 또는 환상의 형태일 수 있다.

본 발명의 앱타머는, SELEX법 및 그 개량법[예컨대 Ellington et al., Nature, 1990 346, 818-822; Tuerk et al., Science, 1990 249, 505-510]을 이용함으로써 제작할 수 있다. 또한, 앱타머는 종래 SELEX 기법 이외에, 복합 타겟, 즉 살아있는 세포 및 조직에 대해 Cell-SELEX 기법을 이용하여 얻을 수 있는데(Guo et al. Int. J. Mol. Sci., 9(4): 668, 2008), Cell-SELEX 기법은 표면 마커 타겟이 알려져 있지 않을 때조차도, 질환 세포에 대한 앱타머를 개발할 수 있게 하는 장점이 있다.

본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 Ubb 유전자의 발현 억제제는 유비퀴틴화-의존적 프로테아좀 분해(ubiquitination-dependent proteasomal degradation)를 억제한다.

하나의 특정예에서, 상기 유비퀴틴화-의존적 프로테아좀 분해는 p53의 분해이다. 하기 실시예에서 확인한 바와 같이, Ubb 넉-다운은 암세포에서 암 억제제인 p53의 유비퀴틴화-의존적 프로테아좀 분해를 억제하며(도 11의 B 참조), Ubb 넉-다운에 의하여 안정화된 p53은 암세포의 아폽토시스를 유도할 수 있다.

본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 Ubb 유전자의 발현 억제제는 NF-κB의 활성화를 저해한다. NF-κB의 활성화는 항-아폽토시스 단백질의 발현을 유도하는데, Ubb 넉-다운은 이러한 NF-κB의 활성화를 억제하였으며(도 13의 A 참조), NF-κB 다이머 p50/p65의 핵으로의 이동(translocate) 역시 억제하였다(도 13의 B 및 C 참조).

본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 Ubb 유전자의 발현 억제제는 암세포의 증식 억제 또는 암세포의 아폽토시스(apoptosis)를 유도한다. Ubb 넉-다운은 암세포의 증식을 현저하게 억제하고, 암세포의 아폽토시스를 유도하였으며(도 4 내지 6 참조), 마우스 이종이식 모델에서도 종양의 성장을 억제하였다(도 9 및 10 참조).

본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 암은 간암, 유방암, 전립선암, 신경모세포종, 피부암, 자궁경부암, 난소암, 대장암, 폐암, 신장암 및 위암을 포함하나, 이에 의하여 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일구현예에 따르면, 본 발명의 약제학적 조성물은 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 비강내 주입, 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다.

본 발명의 일구현예에 따르면, 본 발명의 약제학적 조성물의 1일 혹은 1회 투여량은 0.000001-100 ㎎/㎏이다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 Ubb 유전자의 발현 억제제를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.

(b) 본 발명에 따르면, Ubb 유전자의 발현 억제는 암세포의 성장 억제, 아폽토시스 유발, 유비퀴틴화-의존적 프로테아좀 분해 및 NF-κB의 활성화 저해 효과를 나타낸다.

(c) 따라서, 본 발명의 조성물은 암을 예방 또는 치료하는 데 이용될 수 있다.

도 1은 siRNA에 의한 Ubb mRNA의 넉-다운에 의하여 Ub 수준이 하향 조절되었음을 보여준다. (A) 4종류의 Ub 유전자를 보여준다. (B) SH-SY5Y 신경모세포종 세포를 20 nM의 대조군 siRNA 또는 Ubb siRNA로 48시간 동안 형질주입하고, 각 Ub 유전자의 mRNA 수준을 PCR로 분석하였다. Ubb siRNA는 효율적이고 특이적으로 Ubb mRNA를 감소시켰다. (C) SH-SY5Y 신경모세포종 세포를 Ubb siRNA(5, 10, 20 nM)로 48시간 동안 형질주입하고, Ub 수준을 전체 단백질 추출물의 SDS-PAGE 후의 웨스턴 블랏을 통하여 분석하였다. 모노-Ub(mUb)는 유비퀴틴화 된 히스톤(화살표)을 포함하는 얼룩(smear)과 다수의 구별되는 밴드로 나타난 컨쥬게이트 된 Ub로부터 분리될 수 있다. (D) 모노-Ub와 컨쥬게이트 된 Ub의 양을 농도계로 독립적으로 비교하였다(n=2). 둘 모두 용량 의존적으로 감소되었으나, 모노-Ub의 하향 조절이 특히 두드러졌다. 데이터는 평균 ± SD이고, #, p<0.1; *, p<0.05; **, p<0.01이다.
도 2는 Ubb siRNA에 의한 Ubb mRNA의 특이적 분해를 보여준다. 데이터는 평균 ± SE(n=3)이고, *, p<0.05이다.
도 3은 Ubb 넉-다운이 활성화된 Ub 수준을 하향 조절하였음을 보여준다. (A) HEK 세포 용해물을 NR/R 2DE 후의 Ub 면역블랏으로 분석하였으며, 6개의 모노-Ub 스팟이 확인되었다: 분자량을 기준으로 E1-Ub에서 1개, E2-Ub에서 4개 및 단독(free) Ub에서 1개. (B) 10 nM의 대조군 또는 Ubb siRNA로 48시간 동안 형질주입 된 HEK 세포로부터 얻은 단백질 추출물을 NR/R 2DE로 분리하였다. 겔의 저분자량 부분을 절단하고, 동일한 막으로 옮긴 후 Ub에 대하여 면역블랏 하였다. 로딩 대조군을 위하여, 동량의 단백질을 SDS-PAGE로 분리하고, β-액틴에 대한 면역블랏을 하였다. (C) (B)의 면역블랏 결과의 Ub 스팟의 광밀도를 보여주는 그래프이다. 값은 β-액틴으로 정규화 하였다. (D) 상기에서 설명한 형질주입 된 HEK 세포로부터 얻은 단백질 추출물을 비환원 또는 환원 조건 하에서 SDS-PAGE로 분리하고, UBE2K에 대한 면역블랏을 하였다. 값은 Ub charged UBE2K의 %를 보여준다.
도 4는 Ubb 넉-다운이 세포 증식을 억제하고, 세포의 아폽토시스를 유도함을 보여준다. (A) SH-SY5Y, PC3 및 HepG2 세포를 20 nM의 대조군 siRNA 또는 Ubb siRNA로 72시간 동안 형질주입하고, 광학 현미경으로 관찰하였다. siRNA-형질주입 세포의 Ub 수준을 웨스턴 블랏으로 비교하였다. (B) siRNA-형질주입 세포의 상대적인 세포 증식을 MTT 분석으로 측정하였다(n=9). 72시간에서의 사멸된 세포를 FACS 분석에 의한 서브-G1 군집을 측정하여 평가하였다(n=2). PARP 절단을 웨스턴 블랏을 통하여 아폽토시스 생성물로서 모니터링 하였다. (D) siRNA-형질주입 세포의 세포주기 분포를 FACS로 분석하였다. 각 패널의 두 개의 값은 서브-G1 및 G2/M기에서의 세포 비율을 나타낸다. 데이터는 평균 ± SD이고, **, p<0.01; ***, p<0.001이다.
도 5는 Ubb 넉-다운에 의한 감소된 콜로니 형성능력을 보여준다. (A) 콜로니 형성능력에 대한 Ubb 넉-다운의 효과를 SH-SY5Y, PC3 및 HepG2 세포에서 확인하였다. (B) 결과를 대조군 siRNA-형질주입 세포의 콜로니 수의 퍼센트로 표현하였다. 데이터는 평균 ± SD(n=4)이고, ***, p<0.001이다.
도 6은 Ubb 넉-다운에 의하여 유도된 세포 사멸이 카스페이즈 억제제의 의하여 억제될 수 있음을 보여준다. 데이터는 평균 ± SD이고, **, p<0.01; ***, p<0.001; N.S., 유의성 없음을 의미한다.
도 7은 Ubb 넉-다운이 MCF10A 세포 보다 MCF7 세포에 보다 더 세포독성을 나타냄을 보여준다. (A) MCF10A 및 MCF7 세포를 대조군 siRNA 또는 Ubb siRNA(20 nM)로 72시간 동안 형질주입하고, 광학 현미경으로 관찰하였다. 형질주입 세포의 Ub 수준을 항-Ub 항체를 사용한 웨스턴 블랏으로 비교하였다. (B) 상대적인 세포 증식을 MTT 분석으로 측정하였다(n=5). (C) 72시간 후 사멸된 세포의 비율을 FACS로 측정하였다(n=2). 절단된 PARP의 양을 웨스턴 블랏으로 분석하였다. (D) DNA 단편화를 분리된 genomic DNA로부터 평가하였다. 데이터는 평균 ± SD이고, ***, p<0.001이다.
도 8은 Ubb 넉-다운이 Detroit 511 정상세포의 세포 증식을 억제하지 않음을 보여준다. (A) 20 nM의 대조군 또는 Ubb siRNA로 형질주입 후, Detroit 511 정상 인간 배아 피부세포를 72시간 동안 배양하고, Ub의 수준을 항-Ub 항체를 사용한 웨스턴 블랏을 통하여 비교하였다. (B) 상대적인 세포 증식을 MTT 분석으로 측정하였다. 데이터는 평균 ± SD(n=5)이고, N.S., 유의성 없음을 의미한다.
도 9는 Ubb 넉-다운이 인 비보에서 종양 세포의 성장을 억제하였음을 보여준다. (A) 대조군 siRNA 또는 Ubb siRNA로 형질주입 된 PC3 세포를 누드마우스의 왼쪽과 오른쪽 옆구리에 피하 투여하였다(n=11). 종양의 크기를 매 5일마다 측정하였다. (B) 투여 후 40일째의 종양 크기를 비교하였다. (C) 절개 후 종양의 무게를 측정하였다. 데이터는 평균 ± SD이고, *, p<0.05; **, p<0.01이다.
도 10은 이종이식 된 종양에서의 Ub 수준을 보여준다. 숫자 1-5 및 6-8은 각 이종이식 마우스를 가리킨다. 데이터는 평균 ± SD이고, **, p<0.01; ***, p<0.001; N.S., 유의성 없음을 의미한다.
도 11은 Ubb 넉-다운이 유비퀴틴-의존적 기질을 안정화시키고, 스트레스 단백질의 발현을 유도하였음을 보여준다. (A) GFPu를 안정적으로 발현하는 SH-SY5Y 세포를 20 nM의 대조군 또는 Ubb siRNA로 48시간 동안 형질주입하고, 항-GFP 항체를 사용한 웨스턴 블랏을 통하여 GFPu의 수준을 평가하였다. (B) p53, ODC 및 β-액틴의 수준을 20 nM의 대조군 또는 Ubb siRNA로 48시간 동안 형질주입 된 HepG2 세포에서 비교하였다. (C) αTCR을 안정적으로 발현하는 HeLa 세포를 20 nM의 대조군 또는 Ubb siRNA로 72시간 동안 형질주입하고, αTCR의 수준을 항-HA 항체를 사용한 웨스턴 블랏을 통하여 비교하였다. (A), (B) 및 (C)에서 MG132(10 μM)를 양성 대조군으로서 24시간 동안 처리하였다. (D) HeLa 세포를 대조군 siRNA 또는 Ubb siRNA(20 nM)로 48시간 동안 형질주입하고, EGF(100 ng/㎖)를 처리하였다. 지시된 시간(0, 0.5, 1, 2 및 3시간)에서 세포를 모으고, EGFR의 수준을 웨스턴 블랏으로 비교하였다. (E) (D)의 면역블랏 결과의 EGFR 광밀도를 보여주는 그래프이다. 값은 β-액틴으로 정규화 하였다. (F) HeLa 세포를 대조군 siRNA 또는 Ubb siRNA(20 nM)로 72시간 동안 형질주입하고, HSP70, GRP78 및 β-액틴의 수준을 웨스턴 블랏으로 비교하였다. (G 및 H) 전체 RNA를 siRNA-형질주입 HeLa 세포로부터 분리하고, HSP70 및 GRP78 mRNA의 수준을 PCR(G) 및 실시간 PCR(H)로 비교하였다. 데이터는 평균 ± SD이고(n=2), *, p<0.05; ***, p<0.001; N.D., 미검출을 의미한다.
도 12는 Ubb 넉-다운이 EGFR의 하향 조절을 약화시켰음을 보여준다.
도 13은 Ubb 넉-다운이 TNFα-매개 NF-κB 활성화를 억제하였음을 보여준다. (A) HeLa 세포를 NF-κB(2x) 루시퍼라아제 플라스미드(30 ng), HSP70-β-갈락토시다아제 플라스미드(30 ng) 및 대조군 siRNA 또는 Ubb siRNA(20 nM)로 48시간 동안 공동 형질주입하고, 50 ng/㎖의 TNFα로 2시간 동안 자극하였다. 세포를 모으고, 루시퍼라아제 및 β-갈락토시다아제 활성을 측정하였다. 루시퍼라아제 활성은 β-갈락토시다아제 활성으로 정규화 하였다. 데이터는 평균 ± SD이고(n=6), ***, p<0.001이다. (B) HeLa 세포를 대조군 siRNA 또는 Ubb siRNA(20 nM)로 48시간 동안 형질주입하고, TNFα(50 ng/㎖)를 10분간 처리하였다. 대조군(TNFα(-)) 및 TNFα-처리(TNFα(+)) 세포의 p65를 위한 면역염색은 TNFα 처리 후의 p65의 핵으로의 이동이 Ubb 넉-다운에 의하여 상당히 억제되었음을 보여주었다. 핵을 DAPI로 염색하였다. (C) 핵 및 세포질 분획물(fraction)을 (B)에서 설명한 것과 같은 처리 후의 HeLa 세포로부터 제조하고, 웨스턴 블랏으로 p65의 발현을 분석하였다. 핵 분획물의 p65의 양은 Ubb 넉-다운에 의하여 상당히 감소되었다. 히스톤 H2A를 핵 마커로서 사용하였다. (D) HeLa 세포를 대조군 siRNA 또는 Ubb siRNA(20 nM)로 48시간 동안 형질주입하고, 50 ng/㎖의 TNFα를 지시된 시간(0, 2, 4, 6 및 8분)에서 처리하였다. RIP1, 인산화 IκBα(p-IκBα), IκBα 및 β-액틴을 웨스턴 블랏으로 분석하였다. 유비퀴틴화 된 RIP1은 RIP1 면역블랏의 RIP1 보다 높은 분자량으로 나타났다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실험재료 및 실험방법

세포 배양 및 siRNA 형질주입

HEK293, HeLa, HepG2 및 SH-SY5Y 세포를 10% FBS(Hyclone, Logan, UT, USA) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신(Gibco-BRL)이 함유된 DMEM(Gibco-BRL, Grand Island, NY, USA)에서 배양하였다. PC3 및 MCF7 세포를 동일한 보충물을 함유하는 RPMI1640(Gibco-BRL)에서 배양하고, Detroit 551 세포를 동일한 보충물을 함유하는 MEM Alpha(Gibco-BRL)에서 배양하였다. MCF10A 세포를 5% 말 혈청(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), 0.5 μg/㎖ 하이드로코티손(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), 10 μg/㎖ 인슐린(Sigma-Aldrich), 20 ng/㎖ EGF(Peprotech, Rocky Hill, NJ, USA), 100 ng/㎖ 콜레라독소(Sigma-Aldrich) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신을 함유하는DMEM-F12(Gibco-BRL)에서 배양하였다. 안정적으로 HA-αTCR을 발현하는 HeLa 세포는 Dr. Cezary Wojcik(Indiana University)으로부터 제공받았으며, 불안정한 GFP (GFPu)를 안정적으로 발현하는 SH-SY5Y 세포는 10% FBS, 1% 페니실린/스트렙토마이신 및 0.5 μg/㎖ G418(Gibco-BRL)이 함유된 DMEM에서 배양하였다. 세포를 RNAiMax 시약(Invitrogen)을 사용하여 제조사의 지시에 따라 siRNA로 형질주입하였다. 폴리Ub 유전자 Ubb에 대한 siRNA(Ubb-siRNA; 5'-CCAGCAGAGGCUCAUCUUUUU-3', 서열목록 제1서열)를 Genolution(Seoul, Korea)에서 제작하였으며, Stealth RNAi Negative Control Med GC(Invitrogen, 12935-300)를 대조군으로 사용하였다. MG132(BIOMOL International, Allemagne, Germany)를 10 μM의 최종 농도로 처리하였다. 형질주입 후, zVAD-fmk(Sigma-Aldrich)를 20 μM의 최종 농도로 배양배지에 첨가하였다.

RT-PCR 분석

TRI 시약(Molecular Research Center, Cincinnati, OH, USA)을 사용하여 전체 RNA를 제조하였다. 간략히 설명하면, 세포를 모으고, 1 ㎖ Trizol 시약에 용해시킨 다음, 클로로폼 용액 200 μl를 첨가하였다. 볼텍싱 후, 샘플들을 12,000 x g로 4℃에서 15분 동안 원심분리하고, 상등액을 새로운 튜브로 옮겼다. 동량의 이소프로판올을 침전을 위하여 넣어주었다. 75% 에탄올로 펠렛을 세척한 다음, RNA를 공기 건조시키고, 뉴클레아제-프리 워터에 용해하였다. 올리고 (dT) 프라이머(Promega, Madison, WI, USA) 및 Accupower RT premix(Bioneer, Daejeon, Korea)를 사용하여 전체 RNA(1 μg of each sample)로부터 cDNA를 합성하였다. cDNA를 Taq 폴리머레이즈(Neurotics, Daejeon, Korea)를 사용하여 PCR 증폭하였다. 정량적 실시간 PCR을 위하여, IQ^™ SYBR^ㄾ Green Supermix(Bio-Rad)사용하여 IQ^™ 실시간 PCR 검출 시스템(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)으로 cDNA를 증폭하였다. PCR 증폭은 하기의 프라이머를 사용하여 수행하였다:

Rps27a: 5ㅄ-CAGGATAAGGAAGGAATTCCTC-3ㅄ(서열목록 제2서열) 및 5'-CACCACATTCATCAGAAGGG-3'(서열목록 제3서열);

Uba52: 5'-ACATCCAGAAAGAGTCCACC-3'(서열목록 제4서열) 및 5'-TGAAAGGGACACTTTATTGAGG-3'(서열목록 제5서열);

Ubb: 5'-GGTGAGCTTGTTTGTGTCCCTGT-3'(서열목록 제6서열) 및 5'-TCCACCTCAAGGGTGATGGTC-3'(서열목록 제7서열);

Ubc: 5'-CGCAGCGAGCGTCCTGATCC-3'(서열목록 제8서열) 및 5'-CTAGCTGTGCCACACCCGGC-3'(서열목록 제9서열);

HSP70: 5'-CAAGATCACCATCACCAACG-3'(서열목록 제10서열) 및 5'- GCTCAAACTCGTCCTTCTCG-3'(서열목록 제11서열);

GRP78: 5'-TAGCGTATGGTGCTGCTGTC-3'(서열목록 제12서열) 및 5'- TTTGTCAGGGGTCTTTCACC-3'(서열목록 제13서열);

β- actin: 5'-TGTGGCATCCACGAAACTAC-3'(서열목록 제14서열) 및 5'-GGAGCAATGATCTTGATCTTCA-3'(서열목록 제15서열).

전기영동 및 웨스턴 블랏

단백질을 4-12% precast 겔(KOMA, Seoul, Korea)에서 SDS-PAGE로 분리하고, 니트로셀룰로오스 막(Bio-Rad)으로 옮겼다. 막을 5% 무-지방 우유로 블록하고, 일차 항체와 함께 인큐베이션 하였다. 블롯팅 전에 막을 121℃에서 10분 동안 멸균(autoclaved)하였다. 면역반응성 단백질들을 ECL 시약(GE Healthcare/Amersham Bioscience, Piscataway, NJ, USA)으로 시각화하였다. 필름을 GS-800 덴시토미터(Bio-Rad)로 스캔하고, QuantityOne 소프트웨어(Bio-Rad)로 분석하였다. 사용한 일차 항체는 다음과 같았다: Ub, GFP, p53, HSP70, GRP78, EGFR, p65, histone H2A, phospho-IκBα, IκBα, 및 β-actin(Santa Cruz Biotechnology); E1 (Abcam, Cambridge, UK); UBE2K/E2-25K(Boston Biochem, Cambridge, USA); hemagglutinin(HA; Covance, Princeton, NJ, USA); RIP1(BD biosciences, San Jose, CA, USA); 절단된(cleaved) PARP(Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA); 및 α-tubulin(Lab Frontier, Seoul, Korea).

비환원/환원 이차원 전기영동(NR/R-2DE)

NR/R-2DE(Non-reduced/reduced two-dimensional electrophoresis)를 이전에 개시된 방법에 따라 실시하였다(Shin, D. Y., et al., FEBS Lett. 585, 3959-3963 (2006)). 간략히 설명하면, 환원제가 없는 SDS 샘플 버퍼의 전체 단백질 추출물을 비환원 조건에서 SDS-PAGE로 분리하였다. 각 겔 라인을 절단하고, 65 mM의 DTT와 함께 15분 동안 인큐베이션 한 다음, 4-12% precast 겔 상에 수평으로 로딩한 후 5% β-머캅토에탄올이 함유된 SDS 샘플 버퍼를 처리하였다. 두 번째 전기영동 동안 환원 조건에서 겔 안의 단백질을 수직적으로 분리하였다.

핵/세포질 분리(Nuclear/cytoplasmic fractionation)

세포를 버퍼 A(10 mM Tris-HCl(pH 7.8), 5 mM MgCl₂, 10 mM KCl, 0.3 mM EGTA, 0.3 M 수크로스, 10 mM β-글리세롤 인산염, 0.5 mM DTT, 0.5%(v/v) NP-40, 1 x 프로테아제 칵테일(Roche Biochemical, Indianapolis, IN, USA))에서 재현탁 시키고, 15분 동안 얼음에서 인큐베이션 한 다음 7200 x g로 4℃에서 10분 동안 원심분리 하였다. 상청액을 수용성 세포질 분획물로 사용하였다. 펠렛을 버퍼 A로 세척하고, 초음파 처리 하에서 SDS 버퍼에서 재현탁 하였다. 원심분리 후, 상청액을 핵 분획물로 사용하였다.

세포 증식, 아폽토시스, 세포주기 분포 및 콜로니 형성 분석

세포를 웰 당 4 X 10⁴ 세포 농도로 24-웰 플레이트에 분주하고, 24시간 성장시킨 다음 20 nM의 대조군 siRNA 또는 Ubb siRNA로 형질주입 하였다. 72시간 후, 세포 이미지를 CoolSNAP mono CCD 카메라(Optronics, Los Angeles, CA, USA)를 사용하여 얻은 후, 상대적인 세포 증식을 MTT 분석으로 확인하였다. 세포주기 분포뿐 아니라, 아폽토시스 세포의 퍼센트를 결정할 수 있는 PI(propidium iodide) 염색을 통하여 세포 DNA의 양을 평가하였다. 간략히 설명하면, 형질주입 세포들을 지시된 시간에서 모으고, 70% 에탄올로 하룻밤 동안 고정하였다. PBS로 세척 후, 상온에서 고정된 세포에 0.5 μg/㎖의 DNase-free RNase(Sigma-Aldrich)를 20분간 처리하고, 0.1 M 시트르산나트륨 버퍼(pH 7.4)에서 4℃의 온도에서 30분간 100 μg/㎖의 PI로 염색하였다. 세포를 유세포 분석기로 분석하고, Expo32 프로그램(Beckman Coulter)을 사용하여 세포주기 분포를 확인하였다. 서브-G1 군을 아폽토시스 세포로서 측정하였다. Genomic DNA를 a G-spin total DNA extraction kit(Intron Biotechnology, Seoul, Korea)를 사용하여 분리하고, 아가로스 겔 전기영동으로 분리한 다음 브롬화 에티듐 염색으로 시각화하였다. 10 nM의 대조군 또는 Ubb siRNA로 형질주입한 전체 1,000개의 세포들을 60 mm 디쉬에 분주하였다. 7일 후, 세포를 메탄올로 고정하고, 0.5% 크리스탈 바이올렛으로 염색하였다.

인 비보 종양 성장 실험

PC3 세포를 8 nM의 대조군 siRNA 또는 Ubb siRNA로 12시간 동안 형질주입 하였다. PBS로 세포를 세척한 후, 10⁷개의 세포들을 7주령 누드마우스(athymic BALB/c)의 왼쪽과 오른쪽 옆구리에 피하 투여하였다. 11마리의 수컷 마우스를 대상으로, 40일 동안 매 5일 간격으로 종양 크기를 측정하였다. 종양 부피는 (길이 X 폭²)/2의 식에 따라 계산하였다. 모든 동물실험은 GIST 동물 관리와 사용 위원회로부터 승인받았다.

면역염색

20 nM의 대조군 siRNA 또는 Ubb siRNA로 형질주입한 HeLa 세포를 글라스 커버 슬립 상에서 48시간 동안 성장시켰다. 50 ng/㎖의 TNFα를 10 분간 또는 100 ng/㎖의 EGF를 0, 0.5 및 3시간 동안 처리한 후, 세포를 PBS에서 4% 파라포름알데하이드로 20분간 고정하고, 0.2% Triton X-100으로 투과성으로 만들었다. 고정 후, 세포를 PBS로 세 번 세척하고, 20분간 1% 소혈청알부민으로 블록하였다. 세포를 일차 항체(항-p65 또는 항-EGFR)와 함께 4℃에서 하룻밤 동안 인큐베이션 하였다. 이후, 세포를 PBS로 세 번 세척하고, FITC-결합 이차 항체의 1:100 희석물( Sigma-Aldrich)과 함께 인큐베이션 한 다음 PBS로 세 번 세척하였다. 핵을 PBS에서 5분간 DAPI(Invitrogen)로 표지하였다. PBS로 마지막 세척 후, 세포를 anti-fade mounting medium(Molecular Probes Inc., Eugene, OR, USA)을 사용하여 슬라이드 상에 놓고, FV1000 공초점 레이저 현미경(Olympus Corporation, Tokyo, Japan)을 사용하여 분석하였다. 이미지는 Fluoview 소프트웨어(Olympus Corporation)를 사용하여 얻었다.

NF-κB-중심 루시퍼라아제 활성 분석

NF-κB(2x)-루시퍼라아제 리포터 플라스미드(Frank Mercurio, Signal Pharmaceuticals, San Diego, CA, USA)를 리포펙타민 2000을 사용하여 대조군 siRNA 또는 Ubb siRNA와 함께 HeLa 세포를 공동-형질주입 하였다. 내부 대조군으로서 heat shock protein 70(HSP70)-β-갈락토시다아제 리포터 플라스미드(Robert Modlin, University of California, Los Angeles, CA, USA) 역시 공동-형질주입 하였다. 48시간의 형질주입 후, 루시퍼라아제 활성 분석 전 HeLa 세포에 TNFα(50 ng/㎖)를 처리하였다. 루시퍼라아제 및 β-갈락토시다아제 효소 활성을 루시퍼라아제 분석 시스템과 β-갈락토시다아제 효소 시스템(Promega)으로 측정하고, RLA(relative luciferase activity)를 얻기 위하여 루시퍼라아제 활성을 β-갈락토시다아제 활성에 대하여 정규화 하였다.

실험결과

폴리Ub 유전자 Ubb 넉-다운에 의한 Ub의 하향 조절

인간에서 Ub는 4개의 유전자가 코딩한다: Rps27a, Uba52, Ubb 및 Ubc(도 1의 A). 이 중에서, 폴리Ub 유전자인 Ubb와 Ubc(각각 3개 및 9개의 탠덤 Ub를 코딩)를 넉-다운의 타겟으로 하였다. Ubb mRNA를 타겟팅 하는 20 nM의 siRNA(Ubb siRNA)를 SH-SY5Y 인간 신경모세포종 세포에 형질주입(transfection)한 경우, Ubb mRNA는 48시간 안에 거의 완전하게 분해되었으나, 다른 Ub 유전자들의 발현에는 아무런 영향이 없었다(도 1의 B). Ubb siRNA 처리에 의한 Ubb mRNA의 특이적 분해를 정량적 실시간 PCR을 통하여 추가적으로 확인하였다(도 2). Ubc mRNA에 대한 siRNA를 이용한 형질주입은 Ubc mRNA의 불완전한 분해 및 Rps27a mRNA의 상당한 분해를 초래하였다. 세포에서 Ub는 프리 형태 또는 다양한 세포 내 단백질들과 결합(conjugate)되어 있다. SDS-PAGE 후 항-Ub 면역블랏으로 Ub 수준을 측정한 결과, 모노-Ub와 컨쥬게이트 Ub의 수준은 5 nM, 10 nM 및 20 nM의 Ubb siRNA 처리에 의하여 용량 의존적으로 감소되었다(도 1의 C). 또한, 농도계를 사용하여 각 양을 비교한 결과, 모노-Ub가 더 크게 감소되었다(도 1의 D). 구체적으로, 20 nM의 siRNA에 의한 Ubb 넉-다운은 모노-Ub 수준을 70% 이상 감소시켰으나, 컨쥬게이트 Ub의 수준은 30% 미만의 감소만을 초래하였다(도 1의 D).

환원 조건하의 모노-Ub는 단독(free) 모노-Ub 뿐만 아니라, NR/R-2DE로 분리할 수 있는 효소와 티오에스테르 결합한 Ub를 포함한다. NR/R-2DE 동안, 티오에스테르 결합은 비환원 조건에서 유지되었으나, 환원조건 하에서는 쉽게 절단되었으며, 이에 의하여 티오에스테르-결합 Ub는 효소로부터 분리되고 독립적으로 이동하였다. 단독(free) 모노-Ub 외에도 총 5개의 구별되는 모노-Ub 스팟들이 NR/R-2DE 후의 항-Ub 면역블롯팅에 의하여 검출되었다: E1-Ub로부터의 1 스팟 및 E2-Ub로부터의 4 스팟(도 3). 10 nM의 대조군 siRNA 또는 Ubb siRNA를 처리한 HEK293 세포 유래의 상기 모노-Ub 스팟의 농도 분석은, 프리 모노-Ub 및 티오에스테르-결합 Ub로부터 기원한 총 5개의 모노-Ub 스팟들이 50% 정도 감소하였음을 보여주었다(도 3의 B 및 C). 상기 결과와 마찬가지로, Ub-결합 효소(예컨대, Ube2K/E2-25K~Ub)의 양은 Ubb siRNA 처리에 의하여 유사하게 감소되었다(도 3의 D). 따라서, Ubb siRNA에 의한 데 노보 Ub 합성의 하향 조절은 단독 모노-Ub의 양, 나아가 Ub-charged 효소의 수준을 감소시켰으며, 이에 의하여 컨쥬게이션을 위한 Ub 공급의 감소를 초래하였다.

Ubb 넉-다운은 암세포의 증식을 억제하고, 암세포의 아폽토시스를 유도한다.

Ubb 넉-다운이 세포 증식을 억제할 수 있는지 확인하여 보았다. 20 nM의 Ubb siRNA를 SH-SY5Y 세포에 형질주입하고 72시간 동안 배양한 결과, 세포 증식의 억제를 광학 현미경으로 명확히 관찰할 수 있었다(상단 패널, 도 4의 A). MTT 분석은 Ubb siRNA-형질주입 세포에서의 세포 증식이 대조군 siRNA-형질주입 세포에 비하여 55 ± 20% 억제되었음을 보여주었다(상단 패널, 도 4의 B). 또한, 많은 Ubb siRNA-형질주입 세포는 쪼그라든 형상을 보였으며, 배양 플레이트로부터 분리되었는데, 이는 세포의 아폽토시스를 시사한다. FACS 분석은 서브-G1 군에서 Ubb siRNA-형질주입 세포의 70 ± 16%가 사멸된 세포(apoptotic cell)임을 보여주었다(상단 패널, 도 4의 C). 이러한 세포의 아폽토시스는 Ubb siRNA-처리 세포에서 PARP의 증가된 절단을 통하여 확인하였다(도 4의 C).

암세포 증식 및 아폽토시스에 대한 Ubb 넉-다운의 영향을 PC3 전립선암 세포 및 HepG2 간세포암 세포를 사용하여 추가적으로 검증하였다. 20 nM의 Ubb siRNA의 형질주입 72시간 후, PC3 세포의 증식은 70 ± 8%억제되었으며, HepG2 세포의 증식은 45 ± 20% 억제되었다(도 4의 A 및 B). 또한, 이 처리는 세포의 아폽토시스를 유도하였다(PC3 세포: 43 ± 10%, HepG2 세포: 57 ± 10%; 도 4의 C). 증가된 PARP 절단 또한 Ubb siRNA-처리 세포주에서 관찰되었다(도 4의 C). 증식성 세포 분석(clonogenic assay)을 통하여 7일간 Ubb 넉-다운의 콜로니 형성 능력을 평가한 결과, 20 nM의 siRNA 처리에 의하여 콜로니 형성 능력이 SH-SY5Y, PC3 및 HepG2 세포에서 각각 66.7 ± 6%, 34.7 ± 3% 및 47 ± 20%까지 감소되었다(도 5).

Ubb 넉-다운이 세포의 아폽토시스를 유도하기 때문에, 세포주기 진행에 대한 Ubb 넉-다운의 영향을 조사하였다. SH-SY5Y, PC3 및 HepG2 세포를 대조군 siRNA 또는 Ubb siRNA로 형질주입하고, 세포주기 분포를 FACS로 분석하였다(도 4의 D). SH-SY5Y 세포에서는 뚜렷한 G2/M arrest 없이 48시간에서 세포의 아폽토시스가 확인되었다(도 4의 D). 그에 반해서, PC3 및 HepG2 세포에서는 사멸된 세포가 나타나기 전에 G2/M기에서 세포 군집(cell population)이 증가하기 시작하였다(도 4의 D).

Ubb 넉-다운에 의한 Ub의 하향 조절에 따라 PARP 절단이 증가하였음을 고려하여, 상기 세포에 대한 20 μM zVAD-fmk의 영향을 확인한 결과, 관찰된 세포 사멸이 SH-SY5Y 및 HepG2 세포에서는 거의 완전하게 카스페이즈 억제제에 의하여 억제되었으며, PC3 세포에서는 부분적으로 억제되었으며(도 6), 이러한 결과는 Ubb 넉-다운에 의한 세포 사멸이 카스페이즈 의존적임을 보여준다.

이상의 실험결과는, Ubb 넉-다운에 의한 Ub 수준의 하향 조절이 암세포의 증식을 효율적으로 억제하고, 암세포의 아폽토시스를 유도함을 명확히 보여준다.

Ubb 넉-다운은 MCF10A 정상 세포보다 MCF7 암세포에서 더 세포 독성을 나타낸다.

Ubb 넉-다운은 MCF7 유방암 세포의 증식을 MCF10A 정상 유방세포에 비하여 훨씬 더 억제하였다(MCF7 세포: 38 ± 7%, MCF10A 세포: 12 ± 2%, 도 7의 A 및 B). 또한, Ubb 넉-다운은 MCF10A에 비하여 MCF7 세포에서 증가된 세포의 아폽토시스를 유도하였다(MCF7 세포: 31 ± 3%, MCF10A 세포: 5.6 ± 4.9%). 세포 아폽토시스의 차이는 또한 Ubb siRNA-형질주입 MCF7 세포에서의 절단된 PARP 및 DNA 단편화(fragmentation)의 증가 수준을 통하여 확인할 수 있었다(도 7의 C 및 D). 이러한 실험결과는, Ubb 넉-다운에 의한 Ub의 하향 조절은 정상세포 보다 암세포 선호적으로 세포독성을 나타냄을 보여준다.

또한, 다른 정상세포의 증식에 미치는 Ubb 넉-다운의 영향을 확인하였다. Detroit 551 정상 인간 배아 피부세포를 20 M의 Ubb siRNA로 형질주입 한 경우, Ub 수준은 상당히 하향 조절되었으나, 세포 증식에는 거의 영향이 없었으며(도 8), 이러한 결과는 암세포가 정상세포 보다 Ub 수준에 보다 더 의존적임을 보여준다.

Ubb 넉-다운은 마우스 이종이식 모델에서 종양세포의 성장을 억제한다.

마우스 이종이식 모델을 대상으로 종양세포 성장에 대한 Ubb 넉-다운의 억제 효과를 조사하였다. 이를 위하여, PC3 세포를 대조군 siRNA 또는 Ubb siRNA로 형질주입하고, 누드마우스(n = 11)의 왼쪽과 오른쪽 옆구리에 피하 투여하였다. 투여 후 종양 크기를 매 5일마다 측정하고, 최종 종양의 무게를 40일째에 재었다(도 9). 그 결과, PC3 세포-유래 종양의 성장은 Ubb 넉-다운에 의하여 억제되었으며, 이는 종양 부피 및 무게의 약 40% 감소를 초래하였다(도 9). PC3 세포의 Ub 수준의 하향 조절을 위하여 siRNA를 사용하였음을 고려하면, 종양 성장의 초기 단계에서 Ub의 수준은 재수준으로 돌아갔을 것이며, 그 결과 종양 크기의 40% 감소는 Ub 고갈의 초기 효과에 기인한 것이다(도 10). Ub 수준의 감소는 Ubb 넉-다운된 PC3 세포 유래의 5일째 종양에서 관찰되었다(도 10의 C 및 D).

Ubb 넉-다운은 Ub-의존적 단백질 분해를 억제한다.

단백질 분해(degradation)에 대한 Ubb 넉-다운의 영향을 알아보기 위하여, 먼저 불안정한 GFP(GFPu; 유비퀴틴화-의존적 프로테아좀 분해에 관한 테스트 기질 단백질; Bence, N. F., et al., Science 292, 1552-1555 (2001))의 안정성을 GFPu를 안정적으로 발현하는 SH-SY5Y 세포를 이용하여 분석하였으며, 그 결과 Ubb 넉-다운은 세포에서 GFPu를 안정시켰다(도 11의 A). 또한, 내생의 세포 단백질(endogenous cellular protein)을 분석한 결과, 유비퀴틴화-의존적 프로테아좀 기질로서 알려진 p53 종양 억제제는 Ubb siRNA-형질주입 세포에서 안정화되었으나, 유비퀴틴화-비의존적 프로테아좀 기질로서 알려진 ODC(ornithine decarboxylase)는 같은 세포에서 안정화되지 않았다(도 11의 B). 또한, ERAD(endoplasmic reticulum associated degradation) 기질인 T 세포 수용체의 알파-체인(αTCR) 역시 Ubb siRNA 형질주입 후 αTCR을 발현하는 HeLa 세포에서 안정화되었다(도 11의 C). 이러한 결과는, Ubb 넉-다운에 의한 Ub 수준의 감소가 유비퀴틴화 과정의 약화를 통하여 유비퀴틴화-의존적 프로테아좀 분해를 효율적으로 억제함을 보여준다.

유비퀴틴화가 엔도사이토시스 및 많은 수용체들의 리소좀 분해와 관련되어 있음을 고려하여(Mukhopadhyay, D. & Riezman, H. Science 315, 201-205(2007)), EGF 처리 후 Ubb siRNA-형질주입 HeLa 세포에서 EGFR의 안정성을 조사하였다. EGFR의 분해는 Ubb 넉-다운에 의하여 그 반감기가 30분에서 60 분까지 상당히 지연되었다(도 11의 D 및 E). Ubb siRNA-형질주입 HeLa 세포에서 EGFR의 지연된 분해는 면역염색을 통하여 다시 확인할 수 있었다(도 12). EGFR 처리 3시간 후, EGFR의 상당한 양이 Ubb siRNA-형질주입 세포에서 검출되었으나, 대조군 세포에서는 검출되지 않았다(도 12).

흥미롭게도, Ubb 넉-다운은 HSP70 및 GRP78과 같은 스트레스-유도성 단백질의 증가를 초래하였다(도 11의 F). PCR 및 실시간 PCR은 상기 단백질들의 mRNA 발현 역시 상향 조절되었음을 보여주었으며(도 11의 G 및 H), 이러한 결과는 Ubb 넉-다운에 의하여 암세포가 과중한 스트레스(stress overload)에 노출되었음을 의미한다.

Ubb 넉-다운은 TNFα-유도 NF-κB 활성화를 억제한다.

NF-κB 경로는 종양-촉진성 염증과 관련된 주요한 신호전달 케스케이드(cascade)로서 암 치료의 유망한 타겟이다(Karin, M. Nature 441, 431-436 (2006); Nakanishi, C. & Toi, M. Nat. Rev. Cancer 5, 297-309 (2005)). 다양한 세포 자극이 NF-κB 활성화로 모이며, 이는 사이토카인, 성장인자 및 항-아폽토시스성 단백질을 포함하는 아주 다양한 단백질들의 발현을 유도한다. NF-κB 활성화에 대한 Ubb 넉-다운의 효과를 알아보기 위하여, 먼저 NF-κB-중심 루시퍼라제 리포터 분석(NF-κB-driven luciferase reporter assay)을 통하여 전사조절 활성의 TNFα-매개 활성화를 확인하였다. Ubb siRNA의 단독 형질주입 후에 RLA의 변화가 관찰되지 않았다. TNFα 50 ng/㎖을 2시간 동안 처리함에 따라, 대조군 세포에서는 RLA가 23 ± 3.7배 증가하였으나, Ubb siRNA-형질주입 세포에서는 단지 6.8 ± 5배(~70% 억제에 해당) 증가하였다(도 13의 A).

IκBα는 기초 조건(basal condition) 하에서 NF-κB 다이머 p50/p65에 결합하나, 자극 후에 신속하게 분해되며, 이는 p50/p65가 세포질에서 핵으로 이동하게 하고(translocate), 유전자의 발현을 활성화시킨다. p65에 대한 HeLa 세포의 면역염색은, 오직 세포질에만 위치하는 p65가 TNFα 10분 처리 후 대조군 세포에서 핵으로 빠르게 이동하였음을 보여주었다(도 13의 B). 그러나, Ubb 넉-다운은 TNFα의 동일 처리 후 p65의 핵으로의 이동을 현저하게 억제하였다(도 13의 B). 핵/세포질 분리(nuclear/cytoplasmic fractionation) 후의 p65 단백질의 웨스턴 블랏결과는 상기 면역염색 결과와 일치하였다(도 13의 C). TNFα 처리 없이, p65 단백질은 오직 세포질 분획물에서만 검출되었다. TNFα 처리 후, 50% 이상의 p65 단백질은 대조군 세포의 핵에서 검출되었으나, Ubb siRNA-형질주입 세포에서는 훨씬 더 적은 양만이 검출되었다(도 13의 C).

도 13의 D에 나타난 바와 같이, Ubb 넉-다운은 IκBα의 분해를 효율적으로 억제하였는데, 이는 아마도 IκBα의 유비퀴틴화 차단에 의한 것일 것이다. 또한, IκBα 인산화의 지연 및 감소가 관찰되었으며(도 13s의 D), 이는 NF-κB 신호전달경로의 업스트림(upstream) 분자의 유비퀴틴화의 억제를 시사한다. TNFα의 수용체와의 결합은 몇몇 신호전달 분자의 모집(recruitment)을 야기한다: 이러한 신호전달 분자 중 하나인 RIP1(receptor-interacting protein kinase)은 폴리유비퀴틴화의 중요한 타겟으로 부상하였다(21). TNFα 처리 후 RIP1의 유비퀴틴화 수준을 분석한 결과, 대조군 세포에 비하여 Ubb siRNA-형질주입 세포에서 RIP1의 지연 및 감소된 유비퀴틴화가 명확하게 관찰되었다(도 13의 D).

이상의 결과들은, Ubb 넉-다운이 IκBα 뿐만 아니라, 업스트림 신호전달 분자들의 유비퀴틴화를 억제하여 TNFα-유도성 NF-κB 활성화를 효율적으로 저해시킴을 보여준다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Gwangju Institute of Science and Technology <120> the prevention or treatment of cancers by Ubb knockdown <130> PN130420 <160> 15 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA against the polyUb gene Ubb <400> 1 ccagcagagg cucaucuuuu u 21 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for Rps27a <400> 2 caggataagg aaggaattcc tc 22 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for Rps27a <400> 3 caccacattc atcagaaggg 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for Uba52 <400> 4 acatccagaa agagtccacc 20 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for Uba52 <400> 5 tgaaagggac actttattga gg 22 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for Ubb <400> 6 ggtgagcttg tttgtgtccc tgt 23 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for Ubb <400> 7 tccacctcaa gggtgatggt c 21 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for Ubc <400> 8 cgcagcgagc gtcctgatcc 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for Ubc <400> 9 ctagctgtgc cacacccggc 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for HSP70 <400> 10 caagatcacc atcaccaacg 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for HSP70 <400> 11 gctcaaactc gtccttctcg 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for GRP78 <400> 12 tagcgtatgg tgctgctgtc 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for GRP78 <400> 13 tttgtcaggg gtctttcacc 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for beta-actin <400> 14 tgtggcatcc acgaaactac 20 <210> 15 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for beta-actin <400> 15 ggagcaatga tcttgatctt ca 22

Claims (8)

1. Ubb(Ubiquitin B) 유전자의 발현 억제제로서, Ubb 유전자의 발현을 억제하는 siRNA, shRNA, miRNA, 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 핵산 앱타머를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
   
2. 삭제
3. 제 1 항에 있어서, 상기 siRNA는 서열목록 제1서열의 뉴클레오타이드로 이루어진 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
   
4. 제 1 항에 있어서, 상기 Ubb 유전자의 발현 억제제는 유비퀴틴화-의존적 프로테아좀 분해(ubiquitination-dependent proteasomal degradation)를 억제하는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
   
5. 제 4 항에 있어서, 상기 유비퀴틴화-의존적 프로테아좀 분해는 p53의 분해인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
   
6. 제 1 항에 있어서, 상기 Ubb 유전자의 발현 억제제는 NF-κB의 활성화를 저해하는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
   
7. 제 1 항에 있어서, 상기 Ubb 유전자의 발현 억제제는 암세포의 증식을 억제하거나, 또는 암세포의 아폽토시스(apoptosis)를 유도하는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
   
8. 제 1 항에 있어서, 상기 암은 간암, 유방암, 전립선암, 신경모세포종, 피부암, 자궁경부암, 난소암, 대장암, 폐암, 신장암 및 위암으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.

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