JP6340162B2

JP6340162B2 - アポトーシス誘導剤

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Publication number: JP6340162B2
Application number: JP2012278706A
Authority: JP
Inventors: 洋司郎新津; 裕樹西夛; 洋行田中
Original assignee: Nitto Denko Corp
Current assignee: Nitto Denko Corp
Priority date: 2012-12-20
Filing date: 2012-12-20
Publication date: 2018-06-06
Anticipated expiration: 2032-12-20
Also published as: JP2014122175A; RU2015129287A; EP2937099A4; AU2013364893A1; KR20150095780A; CA2895690C; CN104884090A; CA2895690A1; EP2937099A1; US9914983B2; US20150328248A1; TW201440788A; WO2014098210A1; BR112015014842A2

Description

本発明は、新規なアポトーシス誘導剤、細胞増殖抑制剤、オートファジー抑制剤、該アポトーシス誘導剤、細胞増殖抑制剤またはオートファジー抑制剤を含む医薬組成物、およびアポトーシス、細胞増殖またはオートファジーの異常に伴う疾患の新規な治療方法等に関する。

がんは人類が直面している最も重要かつ厄介な疾患の１つであり、その治療のために多大な研究努力がなされている。がんは、遺伝子の突然変異やエピジェネティックな異常などにより、細胞が無制御に増殖する疾患である。がんにおける遺伝子異常としてはすでに数多くのものが報告されており（例えば、非特許文献１など）、その多くが、細胞の増殖、分化、生存に関するシグナル伝達に何らかの関連を有していると考えられている。また、かかる遺伝子異常により、正常な分子で構成される細胞内のシグナル伝達が異常を来し、これが特定のシグナルカスケードの活性化や不活性化をもたらし、最終的に細胞の異常増殖を引き起す一因となることもある。初期のがん治療は、細胞増殖自体の抑制に主眼がおかれていたが、かかる治療は生理的に正常に増殖する細胞の増殖をも抑制してしまうため、脱毛、消化器障害、骨髄抑制などの副作用を伴っていた。そこで、かかる副作用を抑えるため、がん特有の遺伝子異常や、シグナル伝達の異常を標的とした分子標的薬などの新たな発想に基づくがん治療薬の開発が進められている。

グルタチオン包含を触媒する酵素の１つであるグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、特にＧＳＴ−π（glutathione S-transferase pi、ＧＳＴＰ１ともいう）の発現が、種々のがん細胞において増大しており、これが一部の抗がん剤に対する耐性の一因となっている可能性が指摘されている。実際、ＧＳＴ−πを過剰発現しており、薬物耐性を示すがん細胞系に、ＧＳＴ−πに対するアンチセンスＤＮＡやＧＳＴ−π阻害剤を作用させると、薬剤耐性が抑制されることが知られている（非特許文献２〜４）。さらに、最近の報告では、ＧＳＴ−πを過剰発現するアンドロゲン非依存性前立腺がん細胞系にＧＳＴ−πに対するｓｉＲＮＡを作用させるとその増殖が抑制され、アポトーシスが増大することが報告されている（非特許文献５）。また、ＫＲＡＳに変異を有するがん細胞系にＧＳＴ−πに対するｓｉＲＮＡを作用させると、Ａｋｔの活性化が抑制され、オートファジーが増大するが、アポトーシスの誘導は中程度となることが報告されている（非特許文献６）。

しかしながら、ＧＳＴ−πと細胞増殖やアポトーシスとの関係、ＧＳＴ−πの分子機構、種々の細胞内シグナル伝達におけるＧＳＴ−πの役割などについては未だ殆ど明らかにされていない。細胞内のシグナル伝達は極めて複雑であり、１つの分子が複数の分子の作用に影響を与えたり、逆に１つの分子が複数の分子から影響を受けたりすることがあるうえ、ある分子の作用を抑えても、他のシグナルカスケードが活性化され、期待どおりの効果が得られないことがままある。したがって、より優れた分子標的薬の開発には、複雑に絡み合った細胞のシグナル伝達機構の解明が必要だが、長年の研究によってもそのごく一部が解明されているに過ぎず、さらなる研究努力が求められている。

Futreal et al., Nat Rev Cancer. 2004;4(3):177-83 Takahashi and Niitsu, Gan To Kagaku Ryoho. 1994;21(7):945-51 Ban et al., Cancer Res. 1996;56(15):3577-82 Nakajima et al., J Pharmacol Exp Ther. 2003;306(3):861-9 Hokaiwado et al., Carcinogenesis. 2008;29(6):1134-8 Nishita et al., AACR 102nd Annual Meeting, Abstact No. 1065

本発明は、細胞において効果的にアポトーシスおよび／または増殖阻害を誘導するための組成物およびそれを用いる方法を提供することを目的とする。

本発明者らは、ＧＳＴ−πの分子機構を解明すべく鋭意研究を続ける中で、ＧＳＴ−πとＡｋｔの発現を同時に阻害すると、両者のいずれか一方のみの発現を阻害したときに比べ、細胞増殖がより強力に抑制され、細胞死もより強く誘導されることを見出すとともに、ＧＳＴ−πの発現阻害により誘導されたオートファジーが、Ａｋｔの発現を同時に阻害することにより顕著に抑制されることをさらに見出し、本発明を完成させるに至った。

すなわち本発明は、以下に関する。
（１）ＧＳＴ−πを抑制する薬物と、Ａｋｔを抑制する薬物とを活性成分として含む、アポトーシスを誘導するための剤。
（２）ＧＳＴ−πを抑制する薬物と、Ａｋｔを抑制する薬物とを活性成分として含む、細胞増殖を抑制するための剤。
（３）Ａｋｔを抑制する薬物とを活性成分として含む、ＧＳＴ−πが抑制された細胞においてオートファジーを抑制するための剤。
（４）Ａｋｔを抑制する薬物とを活性成分として含む、ＧＳＴ−πを抑制する薬物によるアポトーシスの誘導および／または細胞増殖の抑制を増強するための剤。
（５）活性成分が、ＲＮＡｉ分子、リボザイム、アンチセンス核酸、ＤＮＡ／ＲＮＡキメラポリヌクレオチドおよびこれらを発現するベクターからなる群から選択される、（１）〜（４）のいずれかに記載の剤。
（６）（１）〜（５）のいずれかに記載の剤を含む、医薬組成物。
（７）細胞の異常増殖に起因する疾患の治療用である、（６）に記載の医薬組成物。
（８）がんの治療用である、（６）に記載の医薬組成物。

本発明のアポトーシス誘導剤は、従来のものと比較してより効果的にアポトーシスを誘導し、細胞増殖を抑制することができるため、医薬組成物として極めて有用である。特にがんの治療においては、がん細胞をアポトーシスにより死滅させることができるため、がんの進行を阻止するばかりでなく、がんを退縮させる効果も期待できる。

図１は、ＰＡＮＣ−１細胞におけるＧＳＴ−πまたはＡｋｔのノックダウンによる細胞増殖抑制効果を示したグラフである。図２は、Ａ５４９細胞におけるＧＳＴ−πまたはＡｋｔのノックダウンによる細胞増殖抑制効果を示したグラフである。図３は、ＰＡＮＣ−１細胞におけるＧＳＴ−πおよびＡｋｔのダブルノックダウンによる細胞増殖抑制効果を示したグラフである。図４は、Ａ５４９細胞におけるＧＳＴ−πおよびＡｋｔのダブルノックダウンによる細胞増殖抑制効果を示したグラフである。図５は、ＧＳＴ−π ｓｉＲＮＡとＡｋｔ阻害剤との併用による細胞増殖抑制効果を示したグラフである。*Ｐ＜０．０５、**Ｐ＜０．０１。図６は、ＧＳＴ−πおよびＡｋｔのダブルノックダウンによるオートファジーの抑制効果を示したグラフである。

本発明は、ＧＳＴ−πを抑制する薬物と、Ａｋｔを抑制する薬物とを活性成分として含む、細胞増殖を抑制するための剤または組成物（以下、「細胞増殖抑制剤」または「細胞増殖抑制用組成物」ともいう）および、アポトーシスを誘導するための剤または組成物（以下、「アポトーシス誘導剤」または「アポトーシス誘導組成物」ともいう）に関する。
本明細書で用いる場合、ＧＳＴ−πは、ＧＳＴＰ１遺伝子によりコードされる、グルタチオン抱合を触媒する酵素を指す。ＧＳＴ−πはヒトを含む種々の動物に存在し、その配列情報も公知である（例えば、ヒト：NP_000843（NM_000852）、ラット：NP_036709（NM_012577）、マウス：NP_038569（NM_013541）など。番号はＮＣＢＩデータベースのアクセッション番号を示し、括弧外はアミノ酸配列、括弧内は塩基配列の番号である）。

本明細書で用いる場合、Ａｋｔは、Ａｋｔ遺伝子によりコードされる、ＰＨドメインを有するセリン／スレオニンキナーゼを指す。ＡｋｔにはＡｋｔ１〜３の３種類のアイソタプが知られているが、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路に関連しているのはＡｋｔ１であるため、本明細書では、特に別記しない限りＡｋｔはＡｋｔ１を指すものとする。Ａｋｔはヒトを含む種々の動物に存在し、その配列情報も公知である（例えば、ヒト：NP_005154（NM_005163）など。番号はＮＣＢＩデータベースのアクセッション番号を示し、括弧外はアミノ酸配列、括弧内は塩基配列の番号である）。

生物個体間には、タンパク質の生理学的機能を損なわない遺伝子配列やアミノ酸配列の変異が生じる可能性があるため、本発明におけるＧＳＴ−πもしくはＧＳＴＰ１遺伝子、または、ＡｋｔもしくはＡｋｔ遺伝子は、既知配列と同一の配列を有するタンパク質や核酸に限定されず、同配列に対し１個または２個以上、典型的には１個または数個、例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個または１０個のアミノ酸または塩基が相違する配列を有するが、なお上記の公知のＧＳＴ−πまたはＡｋｔと同等の機能を有するものを含み得る。ＧＳＴ−πおよびＡｋｔの具体的機能については、後述のとおりである。

なお、本明細書において、「本明細書で用いる場合」、「本明細書で用いる」、「本明細書において」、「本明細書に記載される」等の句は、特に別記しない限り、これに引続く記載が本明細書に記載された全ての発明に適用されることを意味するものとする。また、他に定義されない限り、本明細書で用いる全ての技術用語および科学用語は、当業者が通常理解しているものと同じ意味を有する。本明細書中で参照する全ての特許、公報および他の出版物は、その全体を本明細書に援用する。

本明細書で用いる「ＧＳＴ−πを抑制する薬物」には、限定されずに、例えば、ＧＳＴ−πの産生および／または活性を抑制する薬物や、ＧＳＴ−πの分解および／または不活性化を促進する薬物などが含まれる。ＧＳＴ−πの産生を抑制する薬物としては、これに限定するものではないが、例えばＧＳＴ−πをコードするＤＮＡに対するＲＮＡｉ分子、リボザイム、アンチセンス核酸、ＤＮＡ／ＲＮＡキメラポリヌクレオチドおよびこれらを発現するベクター等が挙げられる。

ＧＳＴ−πの活性を抑制する薬物としては、これに限定するものではないが、例えば、ＧＳＴ−πに結合する物質、例えば、グルタチオン、グルタチオンアナログ（例えば、WO 95/08563、WO 96/40205、WO 99/54346、非特許文献４等に記載のもの）、ケトプロフェン（非特許文献２）、インドメタシン（Hall et al., Cancer Res. 1989;49(22):6265-8）、エタクリン酸、ピロプロスト（Tew et al., Cancer Res. 1988;48(13):3622-5）、抗ＧＳＴ−π抗体、ＧＳＴ−πのドミナントネガティブ変異体等が挙げられる。これらの薬物は市販されているか、公知の技術に基づいて適宜製造することができる。

ＧＳＴ−πの産生または活性を抑制する薬物としては、特異性の高さや、副作用の可能性の低さから、ＧＳＴ−πをコードするＤＮＡに対するＲＮＡｉ分子、リボザイム、アンチセンス核酸、ＤＮＡ／ＲＮＡキメラポリヌクレオチドおよびこれらを発現するベクターが好ましい。

ＧＳＴ−πの抑制は、ＧＳＴ−π抑制剤を作用させなかった場合に比べ、細胞においてＧＳＴ−πの発現や活性が抑制されていることにより決定することができる。ＧＳＴ−πの発現は、既知の任意の手法、限定されずに、例えば、抗ＧＳＴ−π抗体を利用した免疫沈降法、ＥＩＡ、ＥＬＩＳＡ、ＩＲＡ、ＩＲＭＡ、ウェスタンブロッティング法、免疫組織化学法、免疫細胞化学法、フローサイトメトリー法、ＧＳＴ−πをコードする核酸もしくはそのユニークな断片または該核酸の転写産物（例えば、ｍＲＮＡ）もしくはスプライシング産物に特異的にハイブリダイズする核酸を利用した、種々のハイブリダイゼーション法、ノーザンブロット法、サザンブロット法、種々のＰＣＲ法などにより評価することができる。

また、ＧＳＴ−πの活性は、ＧＳＴ−πの既知の活性、限定されずに、例えば、Ｒａｆ−１（特にリン酸化Ｒａｆ−１）や、ＥＧＦＲ（特にリン酸化ＥＧＦＲ）などのタンパク質との結合性などを、既知の任意の方法、例えば、免疫沈降法、ウェスタンブロッティング法、質量分析法、プルダウン法、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法などにより解析することによって評価することができる。

本明細書で用いる「Ａｋｔを抑制する薬物」には、限定されずに、例えば、Ａｋｔの産生および／または活性を抑制する薬物や、Ａｋｔの分解および／または不活性化を促進する薬物などが含まれる。Ａｋｔの産生を抑制する薬物としては、これに限定するものではないが、例えばＡｋｔをコードするＤＮＡに対するＲＮＡｉ分子、リボザイム、アンチセンス核酸、ＤＮＡ／ＲＮＡキメラポリヌクレオチドおよびこれらを発現するベクター等が挙げられる。

Ａｋｔの活性を抑制する薬物としては、これに限定するものではないが、例えば、Ａｋｔに結合する物質、例えば、Merck Millipore社のAkt Inhibitor（Akt Inhibitor、Akt Inhibitor II〜XIII）、MK-2206、Perifosine、GSK690693、AT7867、CCT128930、PHT-427、Palomid 529、PF-04691502、トリシリビン、リン酸トリシリビン（NSC-280594）、A-674563、sc-221226、抗Ａｋｔ抗体、Ａｋｔのドミナントネガティブ変異体等が挙げられる。これらの薬物は市販されているか、公知の技術に基づいて適宜製造することができる。

Ａｋｔの産生または活性を抑制する薬物としては、特異性の高さや、副作用の可能性の低さから、ＡｋｔをコードするＤＮＡに対するＲＮＡｉ分子、リボザイム、アンチセンス核酸、ＤＮＡ／ＲＮＡキメラポリヌクレオチドおよびこれらを発現するベクターが好ましい。

Ａｋｔの抑制は、Ａｋｔ抑制剤を作用させなかった場合に比べ、細胞においてＡｋｔの発現や活性が抑制されていることにより決定することができる。Ａｋｔの発現は、既知の任意の手法、限定されずに、例えば、抗Ａｋｔ抗体を利用した免疫沈降法、ＥＩＡ、ＥＬＩＳＡ、ＩＲＡ、ＩＲＭＡ、ウェスタンブロッティング法、免疫組織化学法、免疫細胞化学法、フローサイトメトリー法、Ａｋｔをコードする核酸もしくはそのユニークな断片または該核酸の転写産物（例えば、ｍＲＮＡ）もしくはスプライシング産物に特異的にハイブリダイズする核酸を利用した、種々のハイブリダイゼーション法、ノーザンブロット法、サザンブロット法、種々のＰＣＲ法などにより評価することができる。

また、Ａｋｔの活性は、Ａｋｔの既知の活性、限定されずに、例えば、ｍＴＯＲなどのタンパク質との結合性などを、既知の任意の方法、例えば、免疫沈降法、ウェスタンブロッティング法、質量分析法、プルダウン法、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法などにより解析することによって評価することができる。

本明細書で用いる場合、ＲＮＡｉ分子は、ＲＮＡ干渉をもたらす任意の分子を指し、限定されずに、ｓｉＲＮＡ（small interfering RNA）、ｍｉＲＮＡ（micro RNA)、ｓｈＲＮＡ（short hairpin RNA）、ｄｄＲＮＡ（DNA-directed RNA）、ｐｉＲＮＡ（Piwi-interacting RNA）、ｒａｓｉＲＮＡ（repeat associated siRNA）などの二重鎖ＲＮＡおよびこれらの改変体などを含む。これらのＲＮＡｉ分子は市販されているか、公知の配列情報などに基づいて設計、作製することが可能である。

また、本明細書で用いる場合、アンチセンス核酸は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ＰＮＡ、またはこれらの複合物を含む。
本明細書で用いる場合、ＤＮＡ／ＲＮＡキメラポリヌクレオチドは、限定されずに、例えば、特開2003-219893に記載の、標的遺伝子の発現を阻害するＤＮＡとＲＮＡとからなる２本鎖ポリヌクレオチドを含む。

ＧＳＴ−πを抑制する薬物とＡｋｔを抑制する薬物とは、単一の製剤に含まれていてもよいし、２個以上の製剤に別々に含まれていてもよい。後者の場合、各製剤は同時に投与されてもよいし、時間間隔をあけて投与されてもよい。時間間隔をあけて投与される場合、ＧＳＴ−πを抑制する薬物を含む製剤を、Ａｋｔを抑制する薬物を含む製剤の前に投与してもよいし、後に投与してもよい。

本発明はまた、Ａｋｔを抑制する薬物を活性成分として含む、ＧＳＴ−πを抑制する薬物によるアポトーシスの誘導および／または細胞増殖の抑制を増強するための剤または組成物（以下、「アポトーシス誘導増強剤」、「細胞増殖抑制増強」、「アポトーシス誘導増強用組成物」または「細胞増殖抑制増強用組成物」ともいう）に関する。

本発明の剤または組成物における活性成分の配合量は、剤または組成物が投与された場合に、アポトーシスが誘導および／または細胞増殖が抑制される量であってもよい。また、投与による利益を超える悪影響が生じない量が好ましい。かかる量は公知であるか、培養細胞などを用いたin vitro試験や、マウス、ラット、イヌまたはブタなどのモデル動物における試験により適宜決定することができ、このような試験法は当業者によく知られている。アポトーシスの誘導は、種々の既知の手法、例えば、ＤＮＡ断片化、アネキシンＶの細胞膜への結合、ミトコンドリア膜電位の変化、カスパーゼの活性化などのアポトーシス特有の現象の検出や、ＴＵＮＥＬ染色などにより評価することができる。また、細胞増殖の抑制は、種々の既知の手法、例えば、経時的な生細胞数の計数、腫瘍のサイズ、体積または重量の測定、ＤＮＡ合成量の測定、ＷＳＴ−１法、ＢｒｄＵ（ブロモデオキシウリジン）法、^３Ｈチミジン取込み法、などにより評価することができる。活性成分の配合量は、剤や組成物の投薬態様によって変化し得る。例えば、１回の投与に複数の単位の組成物を用いる場合、組成物１単位に配合する有効成分の量は、１回の投与に必要な有効成分の量の複数分の１とすることができる。かかる配合量の調整は当業者が適宜行うことができる。

本発明はまた、ＧＳＴ−πを抑制する薬物と、Ａｋｔを抑制する薬物とを活性成分として配合することを含む、アポトーシスを誘導するもしくは細胞増殖を抑制するための剤または組成物を製造する方法、ＧＳＴ−πを抑制する薬物およびＡｋｔを抑制する薬物の、アポトーシスを誘導するもしくは細胞増殖を抑制するための剤または組成物の製造への使用、アポトーシスの誘導もしくは細胞増殖の抑制に用いる、ＧＳＴ−πを抑制する薬物およびＡｋｔを抑制する薬物の組合わせ、ならびに、有効量のＧＳＴ−πを抑制する薬物およびＡｋｔを抑制する薬物を投与することを含む、アポトーシスを誘導するもしくは細胞増殖を抑制する方法に関する。

本発明はまた、Ａｋｔを抑制する薬物を活性成分として配合することを含む、ＧＳＴ−πを抑制する薬物によるアポトーシスの誘導および／または細胞増殖の抑制を増強するための剤または組成物を製造する方法、Ａｋｔを抑制する薬物の、ＧＳＴ−πを抑制する薬物によるアポトーシスの誘導および／または細胞増殖の抑制を増強するための剤または組成物の製造への使用、ＧＳＴ−πを抑制する薬物によるアポトーシスの誘導および／または細胞増殖の抑制を増強するために用いるＡｋｔを抑制する薬物、ならびに、有効量のＡｋｔを抑制する薬物を投与することを含む、ＧＳＴ−πを抑制する薬物によるアポトーシスの誘導および／または細胞増殖の抑制を増強する方法に関する。

上記製造方法または使用における薬物やその配合量については、既に上述したとおりである。各薬物の配合は、既知の任意の手法に従って行うことができる。
上記アポトーシス誘導または細胞増殖抑制方法はいずれも、in vitroの方法であっても、in vivoの方法であってもよい。また、当該方法における薬物については既に上述したとおりであり、薬物の有効量は、投与した細胞においてアポトーシスが誘導される、または細胞増殖が抑制される量であってもよい。また、投与による利益を超える悪影響が生じない量が好ましい。かかる量は公知であるか、培養細胞などを用いたin vitro試験などにより適宜決定することができ、このような試験法は当業者によく知られている。アポトーシスの誘導または細胞増殖の抑制は、上述のものを含む種々の既知の手法により評価することができる。上記有効量は、薬物をある細胞集団に投与した場合に、必ずしも同細胞集団の全ての細胞にアポトーシスまたは増殖抑制をもたらすものでなくともよい。例えば、上記有効量は、細胞集団における細胞の１％以上、２％以上、３％以上、４％以上、５％以上、６％以上、８％以上、１０％以上、１２％以上、１５％以上、２０％以上、さらには２５％以上などにアポトーシスまたは増殖抑制をもたらす量であってよい。

本発明のアポトーシス誘導および細胞増殖抑制剤は、細胞増殖に異常がある細胞などにおいても効果的にアポトーシスまたは増殖抑制を誘導できるものであり、医薬組成物の成分として有効である。したがって本発明の一側面には、本発明のアポトーシス誘導剤または細胞増殖抑制剤を含む医薬組成物が含まれる。

本発明の医薬組成物は、特にアポトーシスに異常を有する疾患を処置するのに有効である。したがって、本発明の一態様は、上記アポトーシス誘導剤を含む、アポトーシスに異常を有する疾患を処置するための医薬組成物に関する。本明細書で用いる場合、アポトーシスに異常を有する疾患は、これに限定するものではないが、例えば細胞の異常増殖に起因する疾患、ＫＲＡＳの変異に起因する疾患、ＧＳＴ−πの過剰発現に起因する疾患などが含まれる。細胞の異常増殖に起因する疾患としては、限定されずに、例えば、良性または悪性腫瘍、過形成症、ケロイド、クッシング症候群、原発性アルドステロン症、紅板症、真性多血症、白板症、過形成瘢痕、扁平苔癬および黒子症などを含む。ＫＲＡＳの変異に起因する疾患としては、限定されずに、例えば、良性または悪性腫瘍（がん、悪性新生物ともいう）などを含む。ＧＳＴ−πの過剰発現に起因する疾患としては、限定されずに、例えば、良性または悪性腫瘍、特に薬剤耐性（例えば、メルファラン、シクロホスファミドなどのアルキル化剤、アドリアマイシンなどのアントラサイクリン系抗腫瘍性抗生物質、シスプラチンなどの白金錯体、エトポシドなどに対して耐性）の悪性腫瘍などを含む。本発明の一態様において、アポトーシスに異常を有する疾患はがんである。

本発明におけるがんとしては、限定されずに、例えば、線維肉腫、悪性線維性組織球腫、脂肪肉腫、横紋筋肉腫、平滑筋肉腫、血管肉腫、カポジ肉腫、リンパ管肉腫、滑膜肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫などの肉腫、脳腫瘍、頭頚部癌、乳癌、肺癌、食道癌、胃癌、十二指腸癌、虫垂癌、大腸癌、直腸癌、肝癌、膵癌、胆嚢癌、胆管癌、肛門癌、腎癌、尿管癌、膀胱癌、前立腺癌、陰茎癌、精巣癌、子宮癌、卵巣癌、外陰癌、膣癌、皮膚癌などの癌腫、さらには白血病や悪性リンパ腫などが挙げられる。なお、本発明では、「がん」は、上皮性悪性腫瘍および非上皮性悪性腫瘍を含む。本発明におけるがんは、身体の任意の部位、例えば、脳、頭頚部、胸部、四肢、肺、心臓、胸腺、食道、胃、小腸（十二指腸、空腸、回腸）、大腸（結腸、盲腸、虫垂、直腸）、肝臓、膵臓、胆嚢、肛門、腎、尿管、膀胱、前立腺、陰茎、精巣、子宮、卵巣、外陰、膣、皮膚、横紋筋、平滑筋、滑膜、軟骨、骨、甲状腺、副腎、腹膜、腸間膜、骨髄、血液、血管系、リンパ節等のリンパ系、リンパ液などに存在し得る。

本発明の一態様において、がんは、上記で定義した変異型ＫＲＡＳを有するがん細胞を含む。本発明の一態様において、がんは、ホルモンまたは成長因子非依存性の増殖を示すがん細胞を含む。本発明の一態様において、がんは、ＧＳＴ−πの過剰発現を示すがん細胞を含む。本発明の一態様において、がんは、薬剤耐性である。本発明の一態様において、がんは、メルファラン、シクロホスファミドなどのアルキル化剤、アドリアマイシンなどのアントラサイクリン系抗腫瘍性抗生物質、シスプラチンなどの白金錯体、エトポシドからなる群から選択される薬剤に対して耐性を有する。本発明の一態様において、がんは、メルファラン、シクロホスファミド、アドリアマイシン、シスプラチン、エトポシドからなる群から選択される薬剤に対して耐性を有する。

本発明はまた、ＧＳＴ−πを抑制する薬物およびＡｋｔを抑制する薬物とを活性成分としてを含む、アポトーシスに異常を有する疾患を処置する医薬組成物、ＧＳＴ−πを抑制する薬物およびＡｋｔを抑制する薬物とを活性成分として配合することを含む、アポトーシスに異常を有する疾患を処置する医薬組成物の製造方法、ＧＳＴ−πを抑制する薬物およびＡｋｔを抑制する薬物の、アポトーシスに異常を有する疾患を処置する医薬組成物を製造するための使用、アポトーシスに異常を有する疾患の処置に用いる、ＧＳＴ−πを抑制する薬物とＡｋｔを抑制する薬物との組合せ、ならびに、前記医薬組成物の有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む、アポトーシスに異常を有する疾患を処置するための方法に関する。
上記製造方法または使用における薬物や配合量、アポトーシスに異常を有する疾患については、既に上述したとおりである。また、各薬物の配合は、既知の任意の手法に従って行うことができる。

本発明のアポトーシス誘導剤、細胞増殖阻害剤およびこれを含む組成物は、他の有効成分と併用してもよい。ここで、併用するとは、例えば、他の有効成分を別々の製剤として投与すること、および、他の有効成分を、少なくとも１種の他の薬剤との合剤として投与することなどを含む。別々の製剤として投与する場合には、他の有効成分を含む製剤を、他の製剤より前、他の製剤と同時、または、他の製剤より後に投与してもよい。

かかる他の有効成分としては、対象となる疾患の処置に有効なものが挙げられる。例えば、処置する疾患ががんである場合は、抗がん剤を併用することができる。抗がん剤の例としては、例えば、イホスファミド、塩酸ニムスチン、シクロホスファミド、ダカルバジン、メルファラン、ラニムスチン等のアルキル化剤、塩酸ゲムシタビン、エノシタビン、シタラビン・オクホスファート、シタラビン製剤、テガフール・ウラシル、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤（例えば、ＴＳ−１）、ドキシフルリジン、ヒドロキシカルバミド、フルオロウラシル、メトトレキサート、メルカプトプリン等の代謝拮抗剤、塩酸イダルビシン、塩酸エピルビシン、塩酸ダウノルビシン、クエン酸ダウノルビシン、塩酸ドキソルビシン、塩酸ピラルビシン、塩酸ブレオマイシン、硫酸ペプロマイシン、塩酸ミトキサントロン、マイトマイシンＣ等の抗腫瘍性抗生物質、エトポシド、塩酸イリノテカン、酒石酸ビノレルビン、ドセタキセル水和物、パクリタキセル、硫酸ビンクリスチン、硫酸ビンデシン、硫酸ビンブラスチン等のアルカロイド、アナストロゾール、クエン酸タモキシフェン、クエン酸トレミフェン、ビカルタミド、フルタミド、リン酸エストラムスチン等のホルモン療法剤、カルボプラチン、シスプラチン（ＣＤＤＰ）、ネダプラチン等の白金錯体、サリドマイド、ネオバスタット、ベバシズマブ等の血管新生阻害剤、Ｌ−アスパラギナーゼなどを挙げることができる。

他の有効成分の別の例としては、オートファジーを抑制する薬物が挙げられる。本明細書で用いる場合、オートファジーは、マクロオートファジー、ミクロオートファジー、シャペロン介在性オートファジー等を含み得るが、典型的にはマクロオートファジーを意味する。したがって、本発明における「オートファジー」なる用語は、特に別記しない限り「マクロオートファジー」を指すものとする。

オートファジーは「自食」とも呼ばれる細胞内タンパク質分解機構の一つであり、細胞内におけるタンパク質の分解、リサイクルを担っている。オートファジーは、酵母や哺乳動物を含む広範な生物種でみられ、概ね（ａ）ＰＡＳ（phagophore assembly site）の形成、（ｂ）分解すべきタンパク質を取り囲むファゴフォア（隔離膜）の伸長および拡大と、これによる、分解すべきタンパク質を内包するオートファゴソームの形成、（ｃ）オートファゴソームとリソソームとの融合によるオートリソソームの形成、（ｄ）オートリソソーム内でのタンパク質の分解を含む一連のプロセスを伴う。

上記（ａ）〜（ｃ）のプロセスには特有のオートファジー関連因子が関与している。オートファジー関連因子は、当初酵母において研究がなされ、これまでにＡｔｇ１〜２７を始め数多くのものが同定されているが（Klionsky et al., Dev Cell. 2003;5(4):539-45）、哺乳動物における研究も進み、ホモログが複数同定され、オートファジーのコア分子機構も明らかになりつつある（Yang and Klionsky, Curr Opin Cell Biol. 2010;22(2):124-31）。

哺乳動物におけるオートファジーのコア分子機構に関与するオートファジー関連因子としては、例えば、ＰＡＳの形成に関与するＶＭＰ１、ＴＰ５３ＩＮＰ２、ｍＡｔｇ９、ＵＬＫ複合体（ＵＬＫ１、ＵＬＫ２、ｍＡｔｇ１３、ＦＩＰ２００から構成）、ＰＩ３Ｋ複合体（Ｂｅｃｌｉｎ１、ｈＶｐｓ３４、ｐ１５０、Ａｍｂｒａ１、Ａｔｇ１４Ｌから構成されるＡｔｇ１４Ｌ複合体、および、Ｂｅｃｌｉｎ１、ｈＶｐｓ３４、ｐ１５０、Ｂｉｆ−１、ＵＶＲＡＧから構成されるＵＶＲＡＧ複合体）、ファゴフォアの伸長に関与するＬＣ３−ＩＩ、Ａｔｇ１２−Ａｔｇ５−Ａｔｇ１６Ｌ複合体などが挙げられる。

したがって、オートファジーを抑制する薬物としては、限定されずに、例えば、上記のものを含むオートファジー関連因子（関連因子が複合体の場合は、同複合体自体のみならず、これを構成する個々の成分を含む）の産生および／または活性を抑制する薬物や、オートファジー関連因子の分解および／または不活性化を促進する薬物等が挙げられる。オートファジー関連因子の産生を抑制する薬物としては、オートファジー関連因子をコードするＤＮＡに対するＲＮＡｉ分子、リボザイム、アンチセンス核酸、ＤＮＡ／ＲＮＡキメラポリヌクレオチドおよびこれらを発現するベクター等が挙げられる。

オートファジー関連因子の活性を抑制する薬物としては、これに限定するものではないが、例えば、ＰＩ３Ｋの阻害剤（例えば、ワートマニン等）、特にクラスＩＩＩＰＩ３Ｋの阻害剤（例えば、３−ＭＡ（３−メチルアデニン）等）、オートファゴソームとリソソームとの融合を阻害する物質（例えば、バフィロマイシンＡ１等）、オートリソソームにおけるタンパク質分解を阻害する物質（例えば、クロロキン、ロイペプチン等）、オートファジー関連因子に結合する物質（例えば、オートファジー関連因子に対する抗体など）、オートファジー関連因子のドミナントネガティブ変異体などが挙げられる。これらの薬物は市販されているか、公知の技術に基づいて適宜製造することができる。

オートファジーを抑制する薬物としては、特異性の高さや、副作用の低さから、オートファジー関連因子をコードするＤＮＡに対するＲＮＡｉ分子、リボザイム、アンチセンス核酸、ＤＮＡ／ＲＮＡキメラポリヌクレオチドおよびこれらを発現するベクターが好ましい。

オートファジーの抑制は、本発明のオートファジー抑制剤を作用させなかった場合に比べ、細胞においてオートファジーが抑制されていることにより決定することができる。オートファジーの抑制は、既知の任意の手法、限定されずに、例えば、電子顕微鏡法によるオートファゴソームの検出、オートファジーマーカー（例えば、Ａｔｇ５、Ａｔｇ１２、ＬＣ３、特にＬＣ３−ＩＩなど）の検出などに基づいて評価することができる。ＬＣ３−ＩＩは、限定されずに、例えば、ＬＣ３−ＩＩに対する特異的抗体で検出してもよいし、試料を電気泳動などで分離した後、ＬＣ３−Ｉとは異なるバンドに分れたＬＣ３−ＩＩを、ＬＣ３−ＩＩまたはＬＣ３−ＩとＬＣ３−ＩＩの両方に反応する抗体を用いてウェスタンブロット法などにより検出することもできる。また、ＬＣ３−Ｉは細胞質内に散在する一方、ＬＣ３−ＩＩは隔離膜、オートファゴソーム、オートリソソームなどのオートファジー特有の構造に局在するため、ＬＣ３−ＩＩに反応する抗体（ＬＣ３−ＩとＬＣ３−ＩＩの両方に反応する抗体を含む）による免疫染色等で顕在化する、これらの構造を示す点状シグナルの存在や数をオートファジーの指標としてもよい。

本発明はまた、Ａｋｔを抑制する薬物を活性成分として含む、ＧＳＴ−πが抑制された細胞においてオートファジーを抑制するための剤または組成物（「オートファジー抑制剤」または「オートファジー抑制組成物」ともいう）に関する。
本発明において、オートファジーの抑制は、本発明の剤または組成物を作用させなかった場合に比べ、細胞においてオートファジーが抑制されていることにより決定することができる。オートファジーの評価手法については、上述のとおりである。
本明細書で用いる場合、「ＧＳＴ−πが抑制された」とは、例えば、ＧＳＴ−πが発現している細胞において、ＧＳＴ−πが抑制されている状態を含む。かかる状態としては、例えば、ＧＳＴ−πが発現している細胞に、ＧＳＴ−πを抑制する薬物（例えば、上述のものなど）を投与した状態などが挙げられる。
ある細胞においてＧＳＴ−πが発現しているか否かは、文献学的に知られているか、または、細胞におけるＧＳＴ−πの発現を実際に検出することにより決定することができる。ＧＳＴ−πの発現は、既に上述したものを含む、既知の任意の手法を用いて検出することができる。

本発明はさらに、Ａｋｔを抑制する薬物を配合する工程を含む、ＧＳＴ−πが抑制された細胞においてオートファジーを抑制するための剤または組成物の製造方法、Ａｋｔを抑制する薬物の、ＧＳＴ−πが抑制された細胞においてオートファジーを抑制するための剤または組成物の製造への使用、ＧＳＴ−πが抑制された細胞におけるオートファジー抑制に用いるＡｋｔを抑制する薬物、ならびに、有効量のＡｋｔを抑制する薬物を投与することを含む、ＧＳＴ−πが抑制された細胞においてオートファジーを抑制する方法にも関する。

本発明のオートファジーを抑制するための剤または組成物は、ＧＳＴ−πが抑制された状況下におけるオートファジーの亢進に伴う状態などの処置に有用である。かかる状態としては、限定されずに、例えば、ＧＳＴ−πの発現や活性が低下した状態、ＧＳＴ−πの発現や活性を抑制する薬物が投与された状態等が挙げられる。

したがって、本発明はまた、Ａｋｔを抑制する薬物を活性成分として含む、ＧＳＴ−πが抑制された状況下におけるオートファジーの亢進に伴う状態を処置するための医薬組成物、Ａｋｔを抑制する薬物を配合する工程を含む、ＧＳＴ−πが抑制された状況下におけるオートファジーの亢進に伴う状態を処置するための医薬組成物の製造方法、Ａｋｔを抑制する薬物の、ＧＳＴ−πが抑制された状況下におけるオートファジーの亢進に伴う状態を処置するための医薬組成物の製造への使用、ＧＳＴ−πが抑制された状況下におけるオートファジーの亢進に伴う状態の処置に用いるＡｋｔを抑制する薬物、ならびに、有効量のＡｋｔを抑制する薬物を、それを必要とする対象に投与することを含む、ＧＳＴ−πが抑制された状況下におけるオートファジーの亢進に伴う状態を処置する方法にも関する。

オートファジーの抑制に係る本発明の上記剤または組成物における活性成分の配合量は、当該剤または組成物が投与された場合に、オートファジーの抑制を達成する量であってもよい。また、投与による利益を超える悪影響が生じない量が好ましい。かかる量は公知であるか、培養細胞などを用いたin vitro試験や、マウス、ラット、イヌまたはブタなどのモデル動物における試験により適宜決定することができ、このような試験法は当業者によく知られている。オートファジーの抑制は、上述のものを含む、種々の既知の手法により評価することができる。活性成分の配合量は、剤や組成物の投薬態様によって変化し得る。例えば、１回の投与に複数の単位の組成物を用いる場合、組成物１単位に配合する有効成分の量は、１回の投与に必要な有効成分の量の複数分の１とすることができる。かかる配合量の調整は当業者が適宜行うことができる。

オートファジーの抑制に係る上記剤または組成物の製造方法または使用における薬物やその配合量については、既に上述したとおりである。各薬物の配合は、既知の任意の手法に従って行うことができる。

オートファジーの抑制に係る上記方法はいずれも、in vitroの方法であっても、in vivoの方法であってもよい。また、上記方法における薬物の有効量は、投与した細胞において所望の効果（すなわち、オートファジーの抑制）が達成される量であってもよい。また、投与による利益を超える悪影響が生じない量が好ましい。かかる量は公知であるか、培養細胞などを用いたin vitro試験などにより適宜決定することができ、このような試験法は当業者によく知られている。所望の効果の達成は、上述のものを含む種々の既知の手法により評価することができる。上記有効量は、薬物をある細胞集団に投与した場合に、必ずしも同細胞集団の全ての細胞に所望の効果を誘導するものでなくともよい。例えば、上記有効量は、細胞集団における細胞の１％以上、２％以上、３％以上、４％以上、５％以上、６％以上、８％以上、１０％以上、１２％以上、１５％以上、２０％以上、さらには２５％以上などに所望の効果を誘導する量であってよい。

本明細書に記載される本発明の各種の剤や組成物、処置方法等における活性成分が核酸、例えば、ＲＮＡｉ分子、リボザイム、アンチセンス核酸、ＤＮＡ／ＲＮＡキメラポリヌクレオチドなどである場合、これらは、裸の核酸としてそのまま利用することもできるが、種々のベクターに担持させることもできる。ベクターとしては、プラスミドベクター、ファージベクター、ファージミドベクター、コスミドベクター、ウイルスベクター等の公知の任意のものを利用することができる。ベクターは、担持する核酸の発現を増強するプロモーターを少なくとも含んでいることが好ましく、この場合、該核酸は、かかるプロモーターと作動可能に連結されていることが好ましい。核酸がプロモーターに作動可能に連結されているとは、プロモーターの作用により、該核酸のコードするタンパク質が適切に産生されるように、該核酸とプロモーターとが配置されていることを意味する。ベクターは、宿主細胞内で複製可能であってもなくてもよく、また、遺伝子の転写は宿主細胞の核外で行われても、核内で行われてもよい。後者の場合、核酸は宿主細胞のゲノムに組み込まれてもよい。

また、有効成分は、種々の非ウイルス性脂質またはタンパク質担体に担持させることもできる。かかる担体としては、限定されずに、例えば、コレステロール、リポソーム、抗体プロトマー、シクロデキストリンナノ粒子、融合ペプチド、アプタマー、生分解性ポリ乳酸コポリマー、ポリマーなどが挙げられ、細胞内への取込み効率を高めることができる（例えば、Pirollo and Chang, Cancer Res. 2008;68(5):1247-50などを参照）。特に、カチオン性リポソームやポリマー（例えば、ポリエチレンイミンなど）が有用である。かかる担体として有用なポリマーのさらなる例としては、例えば、US 2008/0207553、US 2008/0312174等に記載のものなどが挙げられる。

本明細書に記載される本発明の各種医薬組成物においては、活性成分の効果を妨げない限り、活性成分を他の任意成分と組み合わせてもよい。そのような任意成分としては、例えば、他の化学治療剤、薬理学的に許容される担体、賦形剤、希釈剤等が挙げられる。また、投与経路や薬物放出様式などに応じて、上記組成物を、適切な材料、例えば、腸溶性のコーティングや、時限崩壊性の材料で被覆してもよく、また、適切な薬物放出システムに組み込んでもよい。

本明細書に記載される本発明の各種剤および組成物（各種医薬組成物を含む）は、経口および非経口の両方を包含する種々の経路、例えば、限定することなく、経口、静脈内、筋肉内、皮下、局所、腫瘍内、直腸、動脈内、門脈内、心室内、経粘膜、経皮、鼻内、腹腔内、肺内および子宮内等の経路で投与してもよく、各投与経路に適した剤形に製剤してもよい。かかる剤形および製剤方法は任意の公知のものを適宜採用することができる（例えば、標準薬剤学、渡辺喜照ら編、南江堂、２００３年などを参照）。
例えば、経口投与に適した剤形としては、限定することなく、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、液剤、懸濁剤、乳剤、ゲル剤、シロップ剤などが挙げられ、また非経口投与に適した剤形としては、溶液性注射剤、懸濁性注射剤、乳濁性注射剤、用時調製型注射剤などの注射剤が挙げられる。非経口投与用製剤は、水性または非水性の等張性無菌溶液または懸濁液の形態であることができる。

本明細書に記載される本発明の各種剤または組成物（各種医薬組成物を含む）は、特定の組織や細胞に標的化されていてもよい。標的化は、既知の任意の手法により達成することができる。がんへの送達を企図する場合は、限定されずに、例えば、製剤をＥＰＲ（enhanced permeability and retention）効果の発現に好適な直径５０〜２００μｍ、特に７５〜１５０μｍなどのサイズにすることによるパッシブターゲティングや、ＣＤ１９、ＨＥＲ２、トランスフェリン受容体、葉酸受容体、ＶＩＰ受容体、ＥＧＦＲ（Torchilin, AAPS J. 2007;9(2):E128-47）、ＲＡＡＧ１０（特表２００５−５３２０５０）、ＰＩＰＡ（特表２００６−５０６０７１）、ＫＩＤ３（特表２００７−５２９１９７）などのリガンドや、ＲＧＤモチーフやＮＧＲモチーフを有するペプチド、Ｆ３、ＬｙＰ−１（Ruoslahti et al., J Cell Biol. 2010;188(6):759-68）などを標的化剤として利用するアクティブターゲティングなどの手法を用いることができる。また、レチノイドまたはその誘導体ががん細胞への標的化剤として有用であることも知られているため（WO 2008/120815）、レチノイドを標的化剤として含む担体を利用することもできる。かかる担体は、上記文献のほか、WO 2009/036368、WO 2010/014117、WO 2012/170952などに記載されている。

本明細書に記載される本発明の各種剤または組成物（各種医薬組成物を含む）はいずれの形態で供給されてもよいが、保存安定性の観点から、用時調製可能な形態、例えば、医療の現場あるいはその近傍において、医師および／または薬剤師、看護士、もしくはその他のパラメディカルなどによって調製され得る形態で提供してもよい。かかる形態は、本発明の剤または組成物が、脂質やタンパク質、核酸などの安定した保存が難しい成分を含むときに特に有用である。この場合、本発明の剤または組成物は、これらに必須の構成要素の少なくとも１つを含む１個または２個以上の容器として提供され、使用の前、例えば、２４時間前以内、好ましくは３時間前以内、そしてより好ましくは使用の直前に調製される。調製に際しては、調製する場所において通常入手可能な試薬、溶媒、調剤器具などを適宜使用することができる。

したがって、本発明は、本発明の各種剤または組成物に含まれ得る活性成分を、単独でもしくは組み合わせて含む１個または２個以上の容器を含む組成物の調製キット、ならびに、そのようなキットの形で提供される各種剤または組成物の必要構成要素にも関する。本発明のキットは、上記のほか、本発明の各種剤または組成物の調製方法や投与方法などが記載された指示、例えば説明書や、ＣＤ、ＤＶＤ等の電子記録媒体等を含んでいてもよい。また、本発明のキットは、本発明の各種剤または組成物を完成するための構成要素の全てを含んでいてもよいが、必ずしも全ての構成要素を含んでいなくてもよい。したがって、本発明のキットは、医療現場や、実験施設などで通常入手可能な試薬や溶媒、例えば、無菌水や、生理食塩水、ブドウ糖溶液などを含んでいなくてもよい。

本明細書に記載される本発明の各種処置方法における有効量とは、例えば、疾患の症状を低減し、または疾患の進行を遅延もしくは停止する量であり、好ましくは、疾患を抑制し、または治癒する量である。また、投与による利益を超える悪影響が生じない量が好ましい。かかる量は、培養細胞などを用いたin vitro試験や、マウス、ラット、イヌまたはブタなどのモデル動物における試験により適宜決定することができ、このような試験法は当業者によく知られている。また、本発明の処置方法に用いる薬物の用量は当業者に公知であるか、または、上記の試験等により適宜決定することができる。

本明細書に記載される本発明の処置方法において投与する活性成分の具体的な用量は、処置を要する対象に関する種々の条件、例えば、症状の重篤度、対象の一般健康状態、年齢、体重、対象の性別、食事、投与の時期および頻度、併用している医薬、治療への反応性、剤形、および治療に対するコンプライアンスなどを考慮して決定され得る。
投与経路としては、経口および非経口の両方を包含する種々の経路、例えば、経口、静脈内、筋肉内、皮下、局所、腫瘍内、直腸、動脈内、門脈内、心室内、経粘膜、経皮、鼻内、腹腔内、肺内および子宮内等の経路が含まれる。
投与頻度は、用いる剤や組成物の性状や、上記のものを含む対象の条件によって異なるが、例えば、１日多数回（すなわち１日２、３、４回または５回以上）、１日１回、数日毎（すなわち２、３、４、５、６、７日毎など）、１週間毎、数週間毎（すなわち２、３、４週間毎など）であってもよい。

本明細書で用いる場合、用語「対象」は、任意の生物個体を意味し、好ましくは動物、さらに好ましくは哺乳動物、さらに好ましくはヒトの個体である。本発明において、対象は健常であっても、何らかの疾患に罹患していてもよいものとするが、特定の疾患の処置が企図される場合には、典型的にはかかる疾患に罹患しているか、罹患するリスクを有する対象を意味する。
また、用語「処置」は、本明細書で用いる場合、疾患の治癒、一時的寛解または予防などを目的とする医学的に許容される全ての種類の予防的および／または治療的介入を包含するものとする。例えば、「処置」の用語は、疾患の進行の遅延または停止、病変の退縮または消失、発症の予防または再発の防止などを含む、種々の目的の医学的に許容される介入を包含する。

本発明を以下の例でさらに詳細に説明するが、これらは例示に過ぎず、本発明を決して限定するものではない。
例１：ｓｉＲＮＡによるＧＳＴ−πおよびＡｋｔのノックダウン
１×１０^６個のＰＡＮＣ−１細胞を１０ｃｍシャーレに播種し、１０％ウシ胎児血清（Fetal bovine serum、FBS）と５％Ｌ−グルタミンを添加したRoswell Park Memorial Institute 1640（RPMI 1640、Sigma社）で１８時間培養した。培養条件は、特に別記しない限り３７℃、５％ＣＯ_２で行った。また、１×１０^６個のＡ５４９細胞を１０ｃｍシャーレに播種し、１０％ＦＢＳと１０％Ｌ−グルタミンを添加したDulbecco’s modified Eagle’s medium（DMEM、Sigma社）で１８時間培養した。培地をそれぞれ交換し、２時間後、２０〜３０％コンフルエントになったＰＡＮＣ−１またはＡ５４９細胞にLipofectamine RNAiMAX（Life Technologies社）を用いて、ＧＳＴ−π ｓｉＲＮＡおよび／またはＡｋｔｓｉＲＮＡをトランスフェクションした。

トランスフェクション用のLipofectamine／ｓｉＲＮＡ混合溶液は以下のように作製した。まず、３５μＬのLipofectamine RNAiMAXと９６５μＬのOPTI-MEM（Sigma社）とを混合したLipofectamine溶液を調製した。次に、所定量の１０μＭｓｉＲＮＡをOPTI-MEMで１ｍＬにメスアップしたｓｉＲＮＡ溶液を調製し（例えば、終濃度３０ｎＭの使用するｓｉＲＮＡ溶液を作製する場合、３６μＬの１０μＭｓｉＲＮＡと９６４μＬのOPTI-MEMを混合した）、これを上記のlipofectamine溶液と混合し、１５分間室温で静置した。なお、ｓｉＲＮＡは以下のものを使用した。
ＧＳＴ−π ｓｉＲＮＡ：
センス鎖：GGGAGGCAAGACCUUCAUUtt（配列番号１）
アンチセンス鎖：AAUGAAGGUCUUGCCUCCCtg（配列番号２）
（なお大文字はＲＮＡ、小文字はＤＮＡをそれぞれ意味する）
ＡｋｔｓｉＲＮＡ：Akt siRNA I（Cell Signaling Technology社、#6211）
ＣｏｎｔｒｏｌｓｉＲＮＡ：AllStars Neg. Control siRNA 1027281（QIAGEN社）

ｓｉＲＮＡの濃度を最適化するため、ＧＳＴ−π ｓｉＲＮＡまたはＡｋｔｓｉＲＮＡを１０〜５０ｎＭの終濃度で、１０ｍＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭで置換したＰＡＮＣ−１細胞またはＡ５４９細胞を含むシャーレに添加し、室温で５時間培養後、培地を置換し（ＰＡＮＣ−１細胞は５％ＦＢＳ加ＲＰＭＩ１６４０、Ａ５４９細胞は１０％ＦＢＳ加ＤＭＥＭ）、２時間培養した。コントロールとして、ＣｏｎｔｒｏｌｓｉＲＮＡを３０ｎＭの終濃度で添加したものを使用した。これらの細胞をトリプシン処理で１０ｃｍシャーレから剥離、採取し、６ｃｍシャーレに１×１０^５個ずつ播種し直した。その後、２４時間毎に、細胞をトリプシン処理でシャーレから剥離、採取し、細胞数をカウントした。トランスフェクションから４日後の結果を図１および２に示す。これらの結果から、各ｓｉＲＮＡによる細胞増殖阻害効果が３０ｎＭの終濃度でほぼプラトーに達することが分かる。

ＧＳＴ−π ｓｉＲＮＡおよびＡｋｔｓｉＲＮＡを同時に作用させた場合の効果を検証するために、各細胞にＧＳＴ−π ｓｉＲＮＡとＡｋｔｓｉＲＮＡとを混合したLipofectamine／ｓｉＲＮＡ混合溶液を、上記と同様に添加し、細胞数をカウントした。コントロールとして、ＣｏｎｔｒｏｌｓｉＲＮＡを３０ｎＭの終濃度で添加したものを使用した。なお、上記Lipofectamine／ｓｉＲＮＡ混合溶液は、ｓｉＲＮＡ溶液として、３６μＬの１０μＭＧＳＴ−π ｓｉＲＮＡと、３６μＬの１０μＭＡｋｔｓｉＲＮＡと、９２８μＬのOPTI-MEMとを混合したものを使用して、上記と同様の手法で作製した。図３および４に示す結果から、ＧＳＴ−πとＡｋｔを両方ともノックダウンすると、いずれか一方のみをノックダウンしたときよりも細胞増殖抑制効果は大きくなることがわかる。

また、細胞の形態を観察すると、ＧＳＴ−πをノックダウンしたときには、肥大化して増殖しない細胞が２０〜３０％程度みられた。特に、ＰＡＮＣ−１では、肥大化に加え、浮いている細胞（死細胞）も多く認められた。Ａｋｔをノックダウンしたときには、死細胞が多く認められた。ＧＳＴ−πとＡｋｔの両方をノックダウンすると、ＰＡＮＣ−１、Ａ５４９共に、いずれか一方をノックダウンしたときに比べ、死細胞数が増加した。これらの所見から、ＧＳＴ−πまたはＡｋｔのノックダウンによりアポトーシスが誘導され、両者をノックダウンすると、アポトーシスがより強く誘導されることが示唆された。

例２：ＧＳＴ−π ｓｉＲＮＡとＡｋｔ阻害剤との併用
Ａｋｔ阻害剤としてｓｉＲＮＡ以外の物質を用いても同様の結果が得られることを、小分子であるAkt Inhibitor VIII（Merck #124018、1,3-Dihydro-1-(1-((4-(6-phenyl-1H-imidazo[4,5-g]quinoxalin-7-yl)phenyl)methyl)-4-piperidinyl)-2H-benzimidazol-2-one）を使用して検討した。なお、Akt Inhibitor VIIIは、ＡｋｔのPleckstrin homology（ＰＨ）領域に結合してアロステリック阻害をもらたし、Ａｋｔ３は阻害しないが、Ａｋｔ１およびＡｋｔ２のリン酸化と活性化を選択的にブロックすることが知られている（Barnett, S.F., et al. 2005. Biochem. J. 385: 399-408、Lindsley, C.W., et al. 2005. Bioorg. Med. Chem. Lett. 15: 761-764、Zhao, Z., et al. 2005. Bioorg. Med. Chem. Lett. 15: 905-909）。

１×１０^６個のＰＡＮＣ−１細胞を１０ｃｍシャーレに播種し、１０％ＦＢＳと５％Ｌ−グルタミンを添加したＲＰＭＩ１６４０で２４時間培養した。培地を１０ｍＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭに置換し、例１と同様に調製したＧＳＴ−π ｓｉＲＮＡを５０ｎＭの終濃度でシャーレに添加し、室温で５時間培養後、培地を５％ＦＢＳ加ＲＰＭＩ１６４０に置換し、２時間培養した。コントロールとして、ＳｃｒａｍｂｌｅｓｉＲＮＡを同濃度で添加したものを使用した。ＳｃｒａｍｂｌｅｓｉＲＮＡは、以下の配列のものを使用した（北海道システムサイエンス社）。
センス鎖：ＣＧＡＵＵＣＧＣＵＡＧＡＣＣＧＧＣＵＵＣＡＵＵＧＣＡＧ（配列番号３）
アンチセンス鎖：ＧＣＡＡＵＧＡＡＧＣＣＧＧＵＣＵＡＧＣＧＡＡＵＣＧＡＵ（配列番号４）
これらの細胞をトリプシン処理で１０ｃｍシャーレから剥離、採取し、６ｃｍシャーレに１×１０^５個ずつ播種し直し、Akt Inhibitor VIIIを１μＭの終濃度で添加した。その後、２４時間毎に、細胞をトリプシン処理でシャーレから剥離、採取し、細胞数をカウントした。検定にはBonferroni/Dunn法を用いた。結果を図５に示す。この結果から、Ａｋｔ阻害剤としてｓｉＲＮＡ以外の物質を用いても、ＧＳＴ−πとＡｋｔの両方の阻害により、ＧＳＴ−πおよびＡｋｔのいずれか一方を阻害した場合に比べ、細胞増殖抑制効果が増大することが分かる。

例３：ＧＳＴ−πおよびＡｋｔのダブルノックダウンによるオートファジーの抑制
ＧＳＴ−πおよびＡｋｔのダブルノックダウンによりオートファジーがどのような影響を受けるかを検討した。
１×１０^６個のＰＡＮＣ−１細胞を１０ｃｍシャーレに播種し、１０％ＦＢＳと５％Ｌ−グルタミンを添加したＲＰＭＩ１６４０で２４時間培養した。培地を１０ｍＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭに置換し、例１と同様に調製したＧＳＴ−π ｓｉＲＮＡ、ＡｋｔｓｉＲＮＡ、またはＧＳＴ−π ｓｉＲＮＡとＡｋｔｓｉＲＮＡとの混合溶液を、各ｓｉＲＮＡが１０ｎＭの終濃度となるようにシャーレに添加し、室温で５時間培養後、培地を５％ＦＢＳ加ＲＰＭＩ１６４０に置換し、３日間培養した。シャーレの細胞を氷冷ＰＢＳで洗った後、氷冷Lysis bufferを加え、細胞を破砕した。Lysis bufferはNP-40 Alternative, PROTEIN GRADE^(R) Detergent, 10% Solution, Sterile-Filtered（CALBIOCHEM社）１００μＬ、１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）５００μＬ、５ＭＮａＣｌ３００μＬ、０．５ＭＥＤＴＡ２０μＬ、滅菌水９．０８μＬを混和して調製した。細胞破砕液をセルスクレイパーで集め、３０分氷冷した。この間１０分おきに転倒混和した。得られた溶液を１５０００ｒｐｍ、４℃で１５分遠心し、上清を採取し、細胞抽出液とした。この細胞抽出液をウェスタンブロット解析に供した。一次抗体として、抗ＬＣ３Ｂ抗体（Sigma社）を用いて、転写膜と４℃、１６時間反応させた。ＬＣ３分子の検出は、ＨＲＰ標識二次抗体と反応させた後、化学発光試薬を用いて行った。オートファジーが誘導されているかどうかは、ＬＣ３のＩ型（１８ｋＤａ）とＩＩ型（１６ｋＤａ）への移行で評価した。
図６に示す結果から、ＧＳＴ−πのノックダウンにより誘導されたオートファジーが、Ａｋｔを同時にノックダウンすることによりほぼ完全に抑制されたことが分かる。

Claims

少なくとも１種のＧＳＴ−πをコードするＤＮＡに対するＲＮＡｉ分子、リボザイム、アンチセンス核酸、ＤＮＡ／ＲＮＡキメラポリヌクレオチドおよびこれらを発現するベクターからなる群から選択される薬物と、少なくとも１種のＡｋｔを選択的に抑制する薬物とを活性成分として含む、アポトーシスを誘導するための剤。
少なくとも１種のＧＳＴ−πをコードするＤＮＡに対するＲＮＡｉ分子、リボザイム、アンチセンス核酸、ＤＮＡ／ＲＮＡキメラポリヌクレオチドおよびこれらを発現するベクターからなる群から選択される薬物と、少なくとも１種のＡｋｔを選択的に抑制する薬物とを活性成分として含む、細胞増殖を抑制するための剤。
Ａｋｔを選択的に抑制する薬物を活性成分として含む、ＧＳＴ−πが抑制された細胞においてオートファジーを抑制するための剤。
Ａｋｔを選択的に抑制する薬物を活性成分として含む、ＧＳＴ−πをコードするＤＮＡに対するＲＮＡｉ分子、リボザイム、アンチセンス核酸、ＤＮＡ／ＲＮＡキメラポリヌクレオチドおよびこれらを発現するベクターからなる群から選択される薬物によるアポトーシスの誘導および／または細胞増殖の抑制を増強するための剤。
活性成分が、ＲＮＡｉ分子、リボザイム、アンチセンス核酸、ＤＮＡ／ＲＮＡキメラポリヌクレオチドおよびこれらを発現するベクターからなる群から選択される、請求項１または２に記載の剤。
活性成分が、ＲＮＡｉ分子、リボザイム、アンチセンス核酸、ＤＮＡ／ＲＮＡキメラポリヌクレオチドおよびこれらを発現するベクターからなる群から選択される、請求項３または４に記載の剤。
細胞の異常増殖に起因する疾患の治療用である、請求項１、２または５に記載の剤を含む医薬組成物。
がんの治療用である、請求項１、２または５に記載の剤を含む医薬組成物。