BR112013033072B1

BR112013033072B1 - Uso de um agente

Info

Publication number: BR112013033072B1
Application number: BR112013033072-4A
Authority: BR
Inventors: Yoshiro Niitsu; Hiroki Nishita
Original assignee: Nitto Denko Corporation
Priority date: 2011-06-21
Filing date: 2011-06-21
Publication date: 2021-04-13
Also published as: ES2708932T3; WO2012176282A1; US20140315975A1; RU2014101547A; CA2841203A1; AU2011371755A1; JP6023709B2; CN103619355A; EP2724729A4; KR101786905B1; AU2011371755B2; CA2841203C; KR20140041770A; JPWO2012176282A1; RU2639459C2; EP2724729A1; BR112013033072A2; EP2724729B1

Abstract

agentes, composição farmacêutica, usos de um agent e, usos de uma droga e usos de gst-tt [001] esta invenção refere-se a: um novo uso de gst-tt e agentes de supressão de gst-tt; um agente de indução de apoptose que contém como componentes ativos uma droga que suprime gst-tt e uma droga que suprime autofagia; uma composição médica que contém dito agente; e um método com o uso da dita composição médica para tratar doenças associadas à apoptose anormal.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção refere-se a novos usos de GST-π e um agente de supressão do mesmo, um novo agente de indução de apoptose, uma composição farmacêutica que contém o agente de indução de apoptose e um novo método terapêutico para uma doença associada à apoptose anormal.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] O câncer é uma das doenças mais importantes e preocupantes que a humanidade enfrenta e está sendo realizada uma quantidade enorme de esforço em pesquisa no tratamento do mesmo. O câncer é uma doença em que células crescem de maneira incontrolável devido à mutação gênica, anormalidade epigenética, etc. Em relação a anormalidades genéticas em câncer, já foi relatado um grande número (por exemplo, Futreal et al., Nat Rev Cancer 2004; 4 (3): 177-83, etc.), e acredita-se que muitas das mesmas são de certo modo associadas à transdução de sinal relacionada à proliferação, diferenciação e sobrevivência celular. Além disso, devido a essas anormalidades genéticas, ocorrem anormalidades na transdução de sinal em células que consistem em moléculas normais, e isso causa ativação ou inativação de uma cascata de sinal específica e finalmente pode se tornar um fator acionador de proliferação celular anormal. O tratamento inicial de câncer tem se focado na própria supressão de proliferação celular, mas visto que esse tratamento também suprime proliferação de células com proliferação fisiologicamente normal, foi acompanhado por efeitos colaterais como perda de cabelo, disfunção gastrointestinal ou supressão da medula óssea. A fim de reduzir esses efeitos colaterais, o desenvolvimento de drogas para o tratamento de câncer com base em um novo conceito como drogas molecularmente direcionadas que atingem anormalidades genéticas específicas do câncer ou anormalidades na transdução de sinal está sendo realizado.

[003] Como uma anormalidade genética específica do câncer, a anormalidade de KRAS (homólogo do oncogene viral de sarcoma de rato Kirsten V-Ki-ras2) é bem conhecida. KRAS é uma proteína de ligação à GTP de baixo peso molecular (também chamada de proteína G de baixo peso molecular) posicionada a jusante de um receptor tirosina quinase como EGFR ou PDGFR, e é encarregada de transferir um sinal relacionado à proliferação ou diferenciação desses receptores para uma cascata de MAPK a jusante. A KRAS normal é ativada através de Grb2 e SOS por meio de ativação de tirosina quinase de um receptor ativado por ligação de ligante, e fosforila MAPK como Raf a fim de dirigir a cascata de MAPK, mas KRAS mutada é constantemente ativada sem estímulo de um receptor e continua a transmitir um sinal de proliferação. Acredita-se que devido a isso, a proliferação celular anormal ocorre.

[004] Por uma lado, a expressão de glutationa-S-transferase (GST), que é uma das enzimas que catalisa a conjugação de glutationa, em particular GST-π (glutationa S-transferase pi, também chamada GSTP1), aumenta em várias células de câncer, e foi apontado que há uma possibilidade que este seja um fator para resistência a alguns agentes anticâncer. De fato é sabido que quando o DNA antisense de GST-π ou um inibidor de GST-π é produzido para agir em uma linhagem de célula cancerosa que está superexpressando GST-π e exibindo resistência à droga, a resistência à droga é suprimida (Takahashi e Niitsu, Gan To Kagaku Ryoho. 1994; 21 (7): 945-51, Ban et al., Cancer Res. 1996; 56 (15): 3577-82, Nakajima et al., J Pharmacol Exp Ther. 2003; 306 (3): 861-9). Além disso, em um relato recente, quando siRNA de GST-π é produzido para agir em uma linhagem de célula de câncer de próstata independente de androgênio que está superexpressando GST-π, a proliferação da mesma e a apoptose é aumentada (Hokaiwado et al., Carcinogenesis. 2008; 29 (6): 1134-8). Além disso, foi sugerido que em câncer colorretal humano, a mutação de KRAS parece induzir a superexpressão de GST-π através da ativação de AP-1 (Miyanishi et al., Gastroenterology. 2001; 121 (4): 865-74).

[005] No entanto, até agora houve quase nenhum esclarecimento sobre a relação entre GST-π e a proliferação celular ou apoptose, o mecanismo molecular de GST-π e o papel, etc., de GST-π em vários tipos de transdução de sinal intracelular. A transdução de sinal intracelular é muito complicada; uma molécula pode influenciar o efeito de uma pluralidade de moléculas, ou inversamente, uma molécula pode ser influenciada por uma pluralidade de moléculas, quando o efeito de certa molécula é inibido, outra cascata de sinal pode ser ativada, e um efeito frequentemente esperado não pode ser obtido. Portanto, é necessário elucidar o mecanismo complicado de transdução de sinal celular para desenvolver melhor drogas direcionadas molecularmente, mas apenas uma parte muito pequena do mecanismo foi elucidada em muitos anos de pesquisa, e mais esforço de pesquisa é necessário.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO PROBLEMAS A SEREM SOLUCIONADOS PELA INVENÇÃO

[006] É um objetivo da presente invenção fornecer novos usos de GST-π e um agente de supressão do mesmo, uma composição para induzir apoptose efetivamente em células, e um método de uso do mesmo.

MEIOS PARA SOLUCIONAR OS PROBLEMAS

[007] Enquanto realizando pesquisa intensiva para elucidar o mecanismo molecular de GST-π, os presentes inventores descobriram que, quando a expressão de GST-π é inibida, a ativação de Raf-1, MEK e ERK é muito inibida, e de maneira similar na cascata de sinal de PI3K (Fosfoinositida 3-quinase), que é ativada por ativação de um receptor acoplado à proteína G ou um receptor de tirosina quinase, ocorre supressão de transdução de sinal, e esclareceram que, embora a apoptose seja causada por inibição de expressão de GST-π, a autofagia é induzida mais rapidamente que a apoptose. Como resultado de mais pesquisa, foi ainda descoberto que por supressão da autofagia, ao mesmo que a inibição de GST-π, as células podem ser induzidas a sofrer apoptose com alta eficiência, e a presente invenção foi assim realizada.

[008] Isto é, a presente invenção refere-se ao seguinte: (1) Agente para indução de apoptose, cujo agente contém como ingredientes ativos uma droga que suprime GST-π e uma droga que suprime autofagia. (2) Agente para indução de apoptose em uma célula na qual GST-π é suprimido, cujo agente contém como um ingrediente ativo uma droga que suprime autofagia. (3) Agente, de acordo com (1) ou (2), cujo agente é para indução de apoptose em uma célula que tem KRAS mutada. (4) Agente, de acordo com qualquer um de (1) a (3) acima, em que o ingrediente ativo é selecionado a partir do grupo que consiste em uma molécula de RNAi, uma ribozima, um ácido nucleico antisense, um polinucleotídeo quimera de DNA/RNA, e um vetor que expressa o mesmo. (5) Composição farmacêutica que contém o agente de acordo com qualquer um de (1) a (4) acima. (6) Composição farmacêutica, de acordo com (5) acima, cuja composição é para uso no tratamento de uma doença causada por proliferação celular anormal. (7) Composição farmacêutica, de acordo com (5) acima, cuja composição é para uso no tratamento de uma doença causada por mutação de KRAS. (8) Composição farmacêutica, de acordo com (5) acima, cuja composição é para uso no tratamento de um câncer. (9) Agente, para promover cascata de sinal de PI3K/Akt/mTOR e/ou cascata de sinal de RAS/Raf/MAPK, cujo agente contém como um ingrediente ativo GST-π e/ou uma variante funcional do mesmo. (10)Agente, para suprimir cascata de sinal de PI3K/Akt/mTOR e/ou cascata de sinal de RAS/Raf/MAPK, cujo agente contém como um ingrediente ativo uma droga que suprime GST-π. (11)Agente, para suprimir ubiquitinação, cujo agente contém como um ingrediente ativo GST-π e/ou uma variante funcional do mesmo. (12) Agente, para promover ubiquitinação, cujo agente contém como um ingrediente ativo uma droga que suprime GST-π. (13)Agente, para suprimir autofagia, cujo agente contém como um ingrediente ativo GST-π e/ou uma variante funcional do mesmo. (14) Agente, para promover autofagia, cujo agente contém como um ingrediente ativo uma droga que suprime GST-π.

EFEITOS DA INVENÇÃO

[009] Visto que o agente que induz apoptose da presente invenção pode induzir apoptose efetivamente em comparação com um convencional, sua eficácia como uma composição farmacêutica também é alta. No tratamento de câncer em particular, visto que células cancerosas podem ser destruídas por apoptose, não apenas é possível inibir o câncer de progredir, mas um efeito em fazer o câncer regredir também pode ser esperado. Além disso, visto que o mesmo nível de efeito que o de uma formulação convencional pode ser exibido com uma dose mais baixa que o da convencional, torna-se possível reduzir efeitos colaterais.

[010] Além disso, de acordo com a presente invenção, o mecanismo molecular de GST-π tornou-se claro e um novo uso de GST-π ou de um agente de supressão do mesmo foi descoberto. Isto fornece novas opções para o tratamento de doença, técnicas experimentais, etc., e uma contribuição enorme pode ser esperada não apenas para medicina e medicina veterinária, mas também para os campos da biologia, bioquímica, biologia molecular, etc.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[011] A Figura 1 a) é o resultado de western blotting mostrando um estado no qual a expressão de GST-π é especificamente suprimida por siRNA de GST-π. A Figura 1 b) é um diagrama mostrando alteração no número de células e nível de expressão de GST-π no 1o até o 4o dia após transfecção de siRNA de GST-π.

[012] A Figura 2 é o resultado de western blotting mostrando o estado de expressão de proteína envolvida na cascata de sinal de RAS/Raf/MAPK no segundo dia após transfecção de siRNA de GST-π. Pode ser visto que, acompanhando a supressão de expressão de GST-π, o nível de expressão de proteína Raf diminui e, além disso, a fosforilação de um MAPK como MEK ou ERK é suprimida.

[013] A Figura 3 mostra o resultado de um experimento na imunoprecipitação da proteína Raf. Pode ser visto que em um grupo tratado com siRNA de GST-π, a expressão de proteína Raf e proteína Raf fosforilada em Ser621 (p-Raf-1 (S621)) diminuiu levemente, enquanto que ao contrário, a proteína Raf ubiquitinada aumentou.

[014] A Figura 4 é um diagrama comparando a abundância de proteína Raf quando o siRNA transfectante de GST-π e mistura de siRNA transfectante foram tratados com inibidor de proteassoma MG132 e DMSO, que era um controle negativo. Observou-se que para o siRNA transfectante de GST-π, o tratamento com inibidor de proteassoma aumentou a abundância de proteína Raf fosforilada (p-Raf-1 (S338)), mas nenhuma alteração foi observada para mistura de siRNA. Isso é, isto sugere que devido à supressão de expressão de GST-π, a proteína Raf fosforilada sofre degradação por proteassoma, e isto é consistente com o aumento na proteína Raf ubiquitinada na Figura 3.

[015] FIG. A Figura 5 mostra os resultados de um experimento sobre a co-imunoprecipitação de proteína Raf e GST-π. Devido a uma reação em direção ao anticorpo anti-GST-π sendo mostrada para proteína precipitada por anticorpo anti-p-Raf-1, sugere-se que p-Raf-1 e GST-π formam um complexo.

[016] A Figura 6 mostra imagens de coloração por imunofluorescência de células knockdown em GST-π. As linhas superiores são imagens coradas com anticorpo anti-LC3 e as linhas inferiores são imagens coradas com DAPI. A partir da esquerda na parte superior são imagens coradas do 1o dia, 2o dia e 3o dia após a transfecção, e a partir da esquerda na parte inferior do 4o dia e 5o dia após a transfecção, respectivamente. Nas células marcadas por flechas na figura, foi observado um sinal de mancha que pode ser considerado como sendo um autofagossomo, inferindo que a autofagia é induzida.

[017] A Figura 7 mostra imagens de microscopia eletrônica de células knockdown em GST-π no ponto do tempo quando 2 dias tinham transcorrido após a transfecção de siRNA de GST-π. Na figura da esquerda, N denota o núcleo, e a figura da direita é uma imagem ampliada da parte A cercada pelo quadrado. Na figura da direita, M denota mitocôndria e L denota lisossomo. Foi observado que autofagossomos foram formados para cercar a mitocôndria nas áreas mostradas por flechas.

[018] A Figura 8 mostra os resultados de western blotting de um extrato de célula knockdown em GST-π com o uso de anticorpo anti-LC3. Foi observado que em células de KD em GST-π (siRNA de GST-π), a expressão de LC3 notadamente aumentou em comparação com o controle (mistura de siRNA). Visto que LC3 tipo II (LC3-II), em particular aumentou muito, isto infere a indução de autofagossomo.

[019] A Figura 9 mostra os resultados de coloração TUNEL. A linha superior mostra imagens de um grupo de controle e a linha inferior mostra imagens de um grupo de células KD em GST-π. Mostra a partir da esquerda, imagens coradas do 3o dia, 4o dia e 5o dia após transfecção. No grupo de células KD em GST-π, foram observadas células positivas para TUNEL.

[020] A Figura 10 é um gráfico (parte superior) mostrando alteração ao longo do tempo das proporções de células positivas para autofagia e células positivas para apoptose em um grupo de células KD em GST-π, e um grupo de células de controle no ponto no tempo quando 1 a 4 dias tinham transcorrido após transfecção de siRNA, e um diagrama (parte inferior) mostrando o nível de expressão de GST-π em células KD em GST-π. Mostra que no grupo de controle dificilmente qualquer autofagia ou apoptose foi observada, enquanto que no grupo KD de GST-π células positivas para autofagia primeiro aumentaram rapidamente com um pico no 2o dia, e então a apoptose foi induzida.

[021] A Figura 11 mostra os resultados de western blotting de proteína envolvida na sinalização de EGFR/PI3K/Akt/mTOR em células KD em GST-π. Pode ser visto que em um grupo de células KD de GST-π, a fosforilação de EGFR, PI3K e Akt foi notadamente suprimida.

[022] A Figura 12 mostra os resultados de western blotting mostrando alterações na expressão de EGFR fosforilado (p-EGFR) quando células KD em GST-π foram tratadas com inibidor de proteassoma MG132. Visto que uma redução no nível de expressão de p-EGFR em células KD em GST-π foi recuperada por tratamento com inibidor de proteassoma, foi inferido que a redução na expressão de p-EGFR foi devido à degradação por proteassoma.

[023] A Figura 13 mostra o resultado de western blotting de co-imunoprecipitado com o uso de anti-p-EGFR. Visto que um sinal foi observado para anticorpo anti-GST-π, foi inferido que p-EGFR e GST-π interagiram um com o outro.

[024] A Figura 14 mostra os resultados ao examinar a alteração do nível de expressão de proteína Raf e EGFR dependendo da concentração de inibidor quando o inibidor C16C2 de GST-π foi usado. Observou-se que, como no caso com knockdown em GST-π, a fosforilação de EGFR ou proteína Raf também foi suprimida quando o inibidor de GST-π foi usado.

[025] A Figura 15 é um gráfico mostrando alteração no número de células quando o inibidor C16C2 de GST-π foi adicionado. Pode ser visto que quando o inibidor de GST-π foi adicionado, dificilmente houve qualquer aumento no número de células.

[026] A Figura 16 é um gráfico mostrando a proporção de células positivas para autofagia em um grupo tratado com mistura de siRNA, um grupo KD em GST-π, e um KD em GST-π + grupo 3MA. Pode ser visto que a autofagia que foi aumentada por knockdown de GST-π foi suprimida por 3-MA.

[027] A Figura 17 mostra imagens coradas com TUNEL quando 3-MA foi adicionado em células KD em GST-π. A linha superior é um caso onde 3-MA foi adicionado em 1 mM, e a linha inferior é um caso onde 3-MA foi adicionado a 5 mM. Mostra a partir da esquerda, imagens coradas do 2o dia, 3o dia e 4o dia após transfecção. Quanto maior a quantidade de 3-MA adicionada, mais células apoptóticas foram observadas.

[028] A Figura 18 é um gráfico mostrando os resultados quando a porcentagem de apoptose foi examinada ao longo do tempo em um grupo de células de controle (mistura de siRNA), um grupo de células KD em GST-π (siRNA de GST-π), uma célula KD em GST-π + grupo 1 mM de 3-MA (siRNA de GST-π + 1 mM de 3-MA), e uma célula KD em GST-π + grupo de 5 mM de 3-MA (siRNA de GST-π + 5 mM de 3-MA). Descobriu-se que houve uma indução adicional de apoptose dependente de dose de 3-MA.

MODOS PARA REALIZAR A INVENÇÃO

[029] A presente invenção refere-se a um agente ou composição para induzir apoptose (a seguir, também chamado de um “agente de indução de apoptose” ou uma “composição de indução de apoptose”) que contém como ingredientes ativos uma droga que suprime GST-π e uma droga que suprime autofagia.

[030] Quando usado no presente pedido, GST-π denota uma enzima, codificada pelo gene GSTP1, que catalisa a conjugação de glutationa. GST-π está presente em vários animais, incluindo humanos, e sua informação de sequência é conhecida (por exemplo, humano: NP_000843 (NM_000852), rato: NP_036709 (NM_012577), camundongo: NP_038569 (NM_013541), etc. Os números denotam os números de acesso no banco de dados do NCBI; os parênteses externos são números de sequência de aminoácidos, e os parênteses internos são números de sequência de bases).

[031] Visto que há uma possibilidade de ocorrência de uma mutação de uma sequência gênica ou de uma sequência de aminoácidos entre indivíduos biológicos, que não comprometam a função fisiológica de uma proteína, os genes GST-π e GSTP1 na presente invenção não são limitados a uma proteína ou ácido nucleico que têm a mesma sequência que as sequências conhecidas acima, e podem incluir esses que têm uma sequência que é diferente da sequência acima por um ou mais aminoácidos ou bases, tipicamente um ou alguns, por exemplo, um, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, ou dez aminoácidos ou bases, mas têm uma função equivalente àquela do GST-π conhecido. A função específica de GST-π é conforme descrito posteriormente.

[032] No presente relatório descritivo, frases como “quando usado no presente pedido”, “usado no presente pedido”, “no presente relatório descritivo” e “descrito no presente pedido” significa, a menos que especificado de outra forma, que a descrição a seguir aplica-se a todas as invenções descritas no presente relatório descritivo. Além disso, a menos que definido de outra forma, todos os termos técnicos e termos científicos usados no presente pedido têm o mesmo significado que aquele usualmente entendido por um técnico no assunto. A totalidade de todas as patentes, publicações de patentes e outras publicações referidas no presente pedido são incorporadas ao presente pedido como referência.

[033] Exemplos da “droga que suprime GST-π” usada no presente pedido inclui, mas não se limita a, uma droga que suprime a produção e/ou atividade de GST-π e uma droga que promove a degradação e/ou inativação de GST-π. Exemplos da droga que suprime a produção de GST-π incluem, mas não se limitam a, uma molécula de RNAi, ribozima, ácido nucleico antisense, ou polinucleotídeo quimera de DNA/RNA para DNA que codifica GST-π, ou um vetor de expressão do mesmo.

[034] Exemplos da droga que suprime atividade de GST-π incluem, mas não se limitam a, uma substância que liga a GST-π como, por exemplo, glutationa, um análogo de glutationa (por exemplo, esses descritos nos documentos WO 95/08563, WO 96/40205, WO 99/54346, Nakajima et al., 2003, acima, etc.), cetoprofeno (Takahashi e Niitsu, 1994 acima), indometacina (Hall et al., Cancer Res. 1989; 49 (22): 6265-8), ácido etacrínico, Piloprost (Tew et al., Cancer Res. 1988; 48 (13): 3622-5), um anticorpo anti-GST-π, e um mutante negativo dominante de GST-π. Estas drogas são tanto comercialmente disponíveis como podem ser produzidas adequadamente com base em técnicas conhecidas.

[035] A droga que suprime a produção ou atividade de GST-π é preferencialmente uma molécula de RNAi, ribozima, ácido nucleico antisense, ou polinucleotídeo quimera de DNA/RNA para DNA que codifica GST-π, ou um vetor de expressão do mesmo, em termos de alta especificidade e uma possibilidade baixa de efeitos colaterais.

[036] A supressão de GST-π pode ser determinada pela expressão ou atividade de GST-π em células sendo suprimidas, em comparação com um caso em que um agente de supressão de GST-π não é utilizado. A expressão de GST-π pode ser avaliada por qualquer técnica conhecida; exemplos da mesma incluem, mas não se limitam a, um método de imunoprecipitação que utiliza um anticorpo anti-GST-π, EIA, ELISA, IRA, IRMA, um método de western blot, um método de imuno-histoquímica, um método de citometria de fluxo, vários métodos de hibridização que utilizam um ácido nucleico que especificamente hibridiza com um ácido nucleico que codifica GST-π ou um único fragmento do mesmo, ou um produto de transcrição (por exemplo, mRNA) um produto de splicing do dito ácido nucleico, um método northern blot, um método Southern blot, e vários métodos de PCR.

[037] Além disso, a atividade de GST-π pode ser avaliada por análise de uma atividade conhecida de GST-π incluindo, mas não se limitando a, ligação a uma proteína como, por exemplo, Raf-1 (em particular Raf-1 fosforilado) ou EGFR (em particular, EGFR fosforilado) por meio de qualquer método conhecido como, por exemplo, um método de imunoprecipitação, um método western blot, um método de análise de massa, um método pull-down, ou um método de ressonância plasmônica de superfície (SPR).

[038] Quando usado no presente pedido, a molécula de RNAi denota qualquer molécula que causa interferência de RNA, incluindo, mas não se limitando a, um RNA dúplex como siRNA (RNA pequeno de interferência), miRNA (micro RNA), shRNA (RNA curto de grampo), ddRNA (RNA dirigido a DNA), piRNA (RNA que interage com Piwi), ou rasiRNA (siRNA associado á repetição) e formas modificadas do mesmo. Estas moléculas de RNAi podem estar comercialmente disponíveis ou podem ser projetadas e preparadas com base em informações de sequência conhecida, etc.

[039] Além disso, quando usado no presente pedido, o ácido nucleico antisense inclui RNA, DNA, PNA, ou um complexo do mesmo.

[040] Quando usado no presente pedido, o polinucleotídeo quimera de DNA/RNA inclui, mas não se limita a, um polinucleotídeo dupla fita composto de DNA e RNA que inibe a expressão de um gene alvo descrito, por exemplo, em JP, A, 2003-219893.

[041] Quando usado no presente pedido, autofagia pode incluir macroautofagia, autofagia mediada por chaperona, etc., mas tipicamente significa macroautofagia. Portanto, o termo “autofagia” na presente invenção refere-se a “macroautofagia” a menos que especificado de outra forma.

[042] Autofagia, que significa “autodestruição”, é um dos mecanismos intracelulares de degradação de proteína, e é encarregada pela degradação e reciclagem de proteína dentro de uma célula. A autofagia é observada em uma variedade ampla de espécies biológicas incluindo leveduras e mamíferos, e é geralmente acompanhada por uma série de processos incluindo formação de um PAS (local de montagem de fagóforo), (b) alongamento e extensão do fagóforo que circunda uma proteína a ser degradada (membrana de isolamento) e formação de um autofagossomo que encapsula a proteína a ser degradada, (c) formação de um autolisossomo por fusão de um autofagossomo e um lisossolo, e (d) degradação da proteína dentro do autolisossomo.

[043] O processos (a) a (c) acima envolvem fatores específicos relacionados à autofagia. Com referência aos fatores relacionados à autofagia, a primeira pesquisa foi realizada com levedura, e um número amplo, incluindo ATG1 a ATG27, foi identificado até agora (Klionsky et al., Dev Cell. 2003; 5 (4): 539-45); a pesquisa com mamíferos também avançou, uma pluralidade de homólogos foi identificada, e o principal mecanismo molecular de autofagia está se tornando claro (Yang e Klionsky, Curr Opin Cell Biol. 2010; 22 (2): 124-31).

[044] Exemplos de fatores relacionados à autofagia envolvidos no principal mecanismo molecular de autofagia em mamíferos inclui aqueles envolvidos na formação de PAS, como VMP1, TP53INP2, mAtg9, o complexo ULK (compostos de ULK1, ULK2, mAtg13 e FIP200), o complexo PI3K (o complexo Atg14L composto de Beclin1, hVps34, p150, Ambra1 e Atg14L, e o complexo UVRAG composto de Beclin1, hVps34, p150, Bif-1 e UVRAG) e aqueles envolvidos no alongamento de fagóforo como LC3-II e o complexo Atg12-Atg5-Atg16L.

[045] Portanto, exemplos da droga que suprime autofagia incluem, mas não se limitam a, uma droga que suprime a produção e/ou atividade de um fator relacionado à autofagia como aqueles descritos acima e uma droga para promover a degradação e/ou inativação de um fator relacionado à autofagia. Exemplos da droga que suprime a produção de um fator relacionado à autofagia incluem uma molécula de RNAi, ribozima, ácido nucleico antisense, ou polinucleotídeo quimera de DNA/RNA para DNA que codifica um fator relacionado à autofagia, ou um vetor de expressão do mesmo.

[046] Exemplos da droga que suprime a atividade de um fator relacionado à autofagia inclui, mas não se limitam a, um inibidor de PI3K (por exemplo, wortmannin, etc.), em particular um inibidor de PI3K classe III (por exemplo, 3-MA (3-metiladenina), etc.), uma substância que inibe a fusão de um autofagossomo e um lisossomo (por exemplo, bafilomicina A1, etc.), uma substância que inibe a degradação de proteína em um autolisossomo (por exemplo, cloroquina, leupeptina, etc.), uma substância que liga a um fator relacionados à autofagia (por exemplo, um anticorpo para um fator relacionado à autofagia, etc.), e um mutante negativo dominante de um fator relacionado à autofagia. Estas drogas são comercialmente disponíveis ou podem ser produzidas adequadamente com base em técnicas conhecidas. Em uma realização da presente invenção, a droga que suprime autofagia não contém GST-π e/ou uma variante funcional do mesmo.

[047] Do ponto de vista de alta especificidade e baixos efeitos colaterais, a droga que suprime autofagia é preferencialmente uma molécula de RNAi, ribozima, ácido nucleico antisense, ou um polinucleotídeo quimera de DNA/RNA para DNA que codifica um fator relacionados à autofagia, ou um vetor que expressa o mesmo.

[048] A supressão de autofagia pode ser determinada por observação de que a autofagia é suprimida em células, em comparação com um caso em que o agente de supressão de autofagia da presente invenção não é utilizado. A inibição de autofagia pode ser avaliada com base em qualquer técnica conhecida, exemplos destas incluem, mas não se limitam a, detecção de um autofagossomo por um método de microscopia eletrônica, e detecção de um marcador de autofagia (por exemplo, Atg5, Atg12, LC3, em particular LC3-II, etc). LC3-II pode ser detectado, por exemplo, mas não se limitado ao uso de um anticorpo específico para LC3-II, ou pode ser detectado submetendo uma amostra à separação com eletroforese, etc., e então detectando LC3-II, separado como uma banda que é diferente de LC3-I, por um método western blot, etc., com o uso de um anticorpo que reage com LC3-II ou ambos, LC3-I e LC3-II. Além disso, devido ao fato de LC3-I estar disperso dentro do citoplasma, embora LC3-II estaja localizado em uma estrutura específica de autofagia como uma membrana de isolamento, um autofagossomo ou um autolisossomo, a presença ou número de sinais similares a manchas mostrando estas estruturas, que são manifestadas por imunocoloração, etc., com um anticorpo que reage com LC3-II (incluindo um anticorpo que reage com ambos, LC3-I e LC3-II) podem ser usadas como um indicador para autofagia.

[049] A droga que suprime GST-π e a droga que suprime autofagia podem estar contidas em uma única formulação ou podem estar contidas separadamente em duas ou mais formulações. No caso da última, cada formulação pode ser administrada ao mesmo tempo ou elas podem ser administradas com um intervalo de tempo entre as mesmas. Quando administrada com um intervalo de tempo entre as mesmas, a formulação contendo uma droga que suprime GST-π pode ser administrada antes da formulação contendo uma droga que suprime autofagia ou pode ser administrada subsequente a isso.

[050] A presente invenção também se refere a um agente ou composição para induzir apoptose (a seguir, também chamado de um “agente de indução de apoptose” ou uma “composição de indução de apoptose”) em células em que GST-π é suprimido, cujo agente ou composição contém como um ingrediente ativo uma droga que suprime autofagia.

[051] Quando usado no presente pedido, “GST-π sendo suprimido” inclui, por exemplo, um estado em que GST-π está sendo suprimido em células que expressam GST-π. Exemplos desse estado inclui um estado em que uma droga que suprime GST-π (por exemplo, aquelas descritas acima, etc) foi administrada em células que expressam GST-π.

[052] Se GST-π está ou não sendo expresso em certas células é conhecido a partir da literatura ou pode ser determinado realmente por detecção de expressão de GST-π em células. A expressão de GST-π pode ser detectada por qualquer técnica conhecida, incluindo aquelas descritas acima.

[053] O agente ou composição da presente invenção pode ser aquele para induzir apoptose em células que têm KRAS mutada.

[054] Quando usado no presente pedido, exemplos de KRAS mutada incluem, mas não se limitam àquelas que têm uma mutação que causa ativação constante de KRAS, como uma mutação que inibe GTPase endógena ou uma mutação que aumenta a taxa de troca de nucleotídeo guanina. Exemplos específicos dessa mutação incluem, mas não se limitam a, por exemplo, mutação nos aminoácidos 12, 13 e/ou 61 em KRAS humana (inibição de GTPase endógena) e mutação em aminoácidos 116 e/ou 119 em KRAS humana (aumentando a taxa de troca de nucleotídeo guanina) (Bos, Cancer Res. 1989; 49 (17): 4682-9, Levi et al., Cancer Res. 1991; 51 (13): 3497-502). Portanto, em uma realização da presente invenção, KRAS mutada pode ser uma KRAS que tem uma mutação em pelo menos um dos aminoácidos 12, 13, 61, 116 e 119 de KRAS humana. Em uma realização da presente invenção, KRAS mutada tem uma mutação no aminoácido 12 de KRAS humana. Além disso, em uma realização da presente invenção, KRAS mutada pode ser aquela que induz a superexpressão de GST-π. Portanto, as células que têm KRAS mutada podem exibir a superexpressão de GST-π.

[055] A detecção de KRAS mutada pode ser realizada com o uso de qualquer técnica conhecida. Exemplos dessa técnica incluem, mas não se limitam a, hibridização seletiva por meio de uma sonda de ácido nucleico específica para uma sequência de mutação conhecida, um método de clivagem incompatível de enzima, sequenciamento (Bos, 1989 acima), e um método de PCR-RFLP (Miyanishi et al., 2001 acima).

[056] Além disso, a detecção de expressão de GST-π pode ser realizada com o uso de qualquer técnica conhecida, incluindo aquelas descritas acima. Se GST-π está ou não sendo superexpresso pode ser avaliado, por exemplo, por comparação do grau de expressão de GST-π em células que têm KRAS mutada com o grau de expressão de GST-πi no mesmo tipo de célula que têm KRAS normal. Neste caso, pode ser dito que GST-π está sendo superexpresso se o grau de expressão de GST-π em células que têm KRAS mutada excede o grau de expressão de GST-π no mesmo tipo de célula que tem KRAS normal.

[057] A quantidade de ingrediente ativo formulado no agente ou composição da presente invenção pode ser uma quantidade que induz apoptose quando o agente ou composição é administrada. Além disso, é preferencialmente uma quantidade que não causa um efeito adverso que excede o benefício de administração. Essa quantidade é conhecida ou pode ser determinada apropriadamente por um teste in vitro com o uso de células cultivadas, etc., ou um teste em um modelo animal como um camundongo, um rato, um cachorro ou um porco, e esses métodos de teste são bem conhecidos por um técnico no assunto. A indução de apoptose pode ser avaliada por várias técnicas conhecidas, por exemplo, por detecção de um fenômeno específico de apoptose como fragmentação de DNA, ligação de anexina V à membrana celular, alteração no potencial de membrana mitocondrial ou ativação de caspase, ou por coloração TUNEL. A quantidade de ingrediente ativo formulado pode variar de acordo com a maneira na qual o agente ou composição é administrada. Por exemplo, quando uma pluralidade de unidades da composição é usada para uma administração, a quantidade de ingrediente ativo a ser formulada em uma unidade da composição pode ser determinada dividindo-se a quantidade de ingrediente ativo necessária para uma administração pela dita pluralidade de unidades. O ajuste dessa quantidade de formulação pode ser realizado adequadamente por técnico no assunto.

[058] A presente invenção também se refere a um processo para produzir um agente ou composição para induzir apoptose, cujo processo compreende formular como ingredientes ativos uma droga que suprime GST-π e uma droga que suprime autofagia; uso de uma droga que suprime GST-π e uma droga que suprime autofagia na produção de um agente ou composição para induzir apoptose; uma combinação de uma droga que suprime GST-π e uma droga que suprime autofagia para uso na indução de apoptose; e um método de indução de apoptose que compreende administrar quantidades efetivas de droga que suprime GST-π e droga que suprime autofagia.

[059] A presente invenção também se refere a um processo para produzir um agente ou composição para induzir apoptose em células nas quais GST-π é suprimido, cujo processo compreende formular como um ingrediente ativo uma droga que suprime autofagia; uso de uma droga que suprime autofagia na produção de um agente ou composição para induzir apoptose em células em que GST-π é suprimido; uma droga que suprime autofagia para uso na indução de apoptose em células em que GST-π é suprimido; e um método de indução de apoptose em células em que GST-π é suprimido, cujo método compreende administrar uma quantidade efetiva de uma droga que suprime autofagia.

[060] A quantidade de droga ou da formulação do mesmo no processo de produção mencionado acima ou uso são conforme descrito acima. A formulação de cada droga pode ser realizada de acordo com qualquer técnica conhecida.

[061] Todos os métodos acima para induzir apoptose podem ser tanto um método in vitro como um método in vivo. Além disso, as drogas nos métodos conforme descrito acima, e a quantidade efetiva de droga pode ser uma quantidade que induz apoptose em células nas quais é administrada. É também preferencialmente uma quantidade que não causa um efeito adverso que excede o benefício de administração. Essa quantidade é conhecida ou pode ser determinada apropriadamente por um teste in vitro com o uso de células cultivadas, etc., e esse método de teste é bem conhecido por um técnico no assunto. A indução de apoptose pode ser avaliada por várias técnicas conhecidas, incluindo essas descritas acima. A quantidade efetiva acima não necessariamente necessita ser aquela que induz apoptose em todas as células de uma população de células em que a droga é administrada. Por exemplo, a quantidade efetiva acima pode ser uma quantidade que induz apoptose na população de células em pelo menos 1% das células, pelo menos 2%, pelo menos 3%, pelo menos 4%, pelo menos 5%, pelo menos 6%, pelo menos 8%, pelo menos 10%, pelo menos 12%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, etc.

[062] O agente de indução de apoptose da presente invenção pode induzir apoptose efetivamente mesmo em células que têm uma anormalidade na proliferação celular, etc., e é efetiva como um componente de uma composição farmacêutica. Portanto, um aspecto da presente invenção inclui uma composição farmacêutica que contém o agente de indução de apoptose da presente invenção.

[063] A composição farmacêutica da presente invenção é efetiva no tratamento de uma doença em que há apoptose anormal, em particular. Portanto, uma realização da presente invenção refere-se a uma composição farmacêutica para o tratamento de uma doença em que há apoptose anormal, cuja composição farmacêutica contém o agente de indução de apoptose. Quando usado no presente pedido, exemplos da doença em que há apoptose anormal incluem, mas não se limitam a, uma doença devido à proliferação celular anormal, uma doença devido à mutação de KRAS, e uma doença devido à superexpressão de GST-π. Exemplos da doença devido à proliferação celular anormal incluem, mas não se limitam a, um tumor benigno ou maligno, hiperplasia, queloide, síndrome de Cushing, aldosteronismo primário, eritroplaquia, policitemia vera, leucoplaquia, cicatriz hiperplásica, líquen plano e lentiginose. Exemplos da doença devido à mutação de KRAS incluem, mas não se limitam a, um tumor benigno ou maligno (também chamado de um câncer ou um neoplasma maligno). Exemplos da doença devido à superexpressão de GST-π incluem, mas não se limitam a, um tumor benigno ou maligno, em particular um tumor maligno resistente à droga (por exemplo, resistente a um agente alquilante como melfalano ou ciclofosfamida, um antibiótico antitumoral á base de antraciclina como adriamicina, um complexo de platina como cisplatina, etoposídeo, etc.). Em uma realização da presente invenção, a doença em que há apoptose anormal é um câncer.

[064] Exemplos do câncer na presente invenção incluem, mas não se limitam a, sarcomas como fibrosarcoma, histiocitoma fibroso maligno, lipossarcoma, rabdomiossarcoma, leiomiossarcoma, angiossarcoma, sarcoma de Kaposi, linfangiossarcoma, sarcoma sinovial, condrossarcoma e osteossarcoma, carcinomas, como tumor no cérebro, carcinoma da cabeça e pescoço, carcinoma de mama, carcinoma de pulmão, carcinoma esofágico, carcinoma gástrico, carcinoma de duodeno, carcinoma de apêndice, carcinoma de cólon, carcinoma retal, carcinoma de fígado, carcinoma pancreático, carcinoma de vesícula biliar, carcinoma de duto biliar, carcinoma anal, carcinoma renal, carcinoma de ureter, carcinoma de bexiga, carcinoma de próstata, carcinoma peniano, carcinoma testicular, carcinoma de útero, carcinoma de ovário, carcinoma de vulva, carcinoma vaginal e carcinoma da pele e, além disso, leucemia e linfoma maligno. Na presente invenção, “câncer” inclui malignidade epitelial e malignidade não epitelial. O câncer na presente invenção pode estar presente em qualquer local do corpo, por exemplo, cérebro, cabeça e pescoço, tórax, membros, pulmão, coração, timo, esôfago, estômago, intestino delgado (duodeno, jejuno, íleo), intestino grosso (cólon, ceco, apêndice, reto), fígado, pâncreas, vesícula biliar, ânus, rim, canal urinário, bexiga, próstata, pênis, testículo, útero, ovário, vulva, vagina, pele, músculo estriado, músculo liso, membrana sinovial, cartilagem, osso, tiroide, glândula adrenal, peritôneo, mesentério, medula óssea, sangue, sistema vascular, sistema linfático como nódulo linfático, fluido linfático, etc.

[065] Em uma realização da presente invenção, o câncer inclui células cancerosas que têm KRAS mutada definida acima. Em uma realização da presente invenção, o câncer inclui células cancerosas que exibem proliferação independente de hormônio ou fator de crescimento. Em uma realização da presente invenção, o câncer inclui células cancerosas que exibem superexpressão de GST-π. Em uma realização da presente invenção, o câncer é resistente à droga. Em uma realização da presente invenção, o câncer tem resistência a uma droga selecionada a partir do grupo que consiste em um agente alquilante como melfalano ou ciclofosfamida, um antibiótico antitumoral à base de antraciclina como adriamicina, um complexo de platina como cisplatina e etoposídeo. Em uma realização da presente invenção, o câncer tem resistência a um agente medicinal selecionado a partir do grupo que consiste em melfalano, ciclofosfamida, adriamicina, cisplatina e etoposídeo.

[066] A presente invenção também se refere a uma composição farmacêutica para o tratamento de uma doença em que há apoptose anormal, cuja composição contém como ingredientes ativos uma droga que suprime GST-π e uma droga que suprime autofagia, um processo para produção de uma composição farmacêutica para o tratamento de um doença em que há apoptose anormal, cujo processo compreende formular como ingredientes ativos uma droga que suprime GST-π e uma droga que suprime autofagia; uso de uma droga que suprime GST-π e uma droga que suprime autofagia para a produção de uma composição farmacêutica para o tratamento de uma doença em que há apoptose anormal, uma combinação de uma droga que suprime GST-π e uma droga que suprime autofagia para uso no tratamento de uma doença em que há apoptose anormal, e um método para o tratamento de uma doença em que há apoptose anormal, cujo método compreende administrar uma quantidade efetiva da composição farmacêutica a um sujeito que necessita da mesma.

[067] A droga, a quantidade de formulação, e a doença em que há apoptose anormal no processo de produção ou uso são conforme descrito acima. A formulação de cada droga pode ser realizada de acordo com qualquer técnica conhecida.

[068] Os presentes inventores esclareceram agora que GST-π se liga a um receptor tirosina quinase, que está a montante da cascata de sinal PI3K/AKT/mTOR, em particular à sua forma fosforilada, e à Raf, que é uma molécula constituinte da cascata de sinal RAS/Raf/MAPK, em particular à sua forma fosforilada, para inibir assim a ubiquitinação destas moléculas, promovendo, dessa forma, estas cascatas de sinal. Portanto, a presente invenção também se refere a um agente ou composição para promover a cascata de sinal de PI3K/Akt/mTOR e/ou a cascata de sinal de RAS/Raf/MAPK (também chamado de um “promotor de cascata de sinal” ou uma “composição que promove cascata de sinal”), cujo agente ou composição contém como um ingrediente ativo GST-π e/ou uma variante funcional do mesmo. Em particular, o agente ou composição da presente invenção pode promover ambas, a cascata de sinal PI3K/Akt/mTOR e a cascata de sinal de RAS/Raf/MAPK ao mesmo tempo.

[069] Exemplos de “variante funcional de GST-π” usados no presente pedido incluem, mas não se limitam a, (i) uma variante que tem uma ou mais mutações, tipicamente uma ou poucas, na sequência de aminoácidos de GST-π, mas ainda tem uma função equivalente a GST-π, (ii) uma variante que é codificada por um ácido nucleico que tem uma sequência de bases de um gene que codifica GST-π ou um ácido nucleico que tem uma ou mais mutações, tipicamente uma ou poucas, na sequência de um ácido nucleico que codifica o mesmo polipeptídeo que aquele codificado pelo ácido nucleico acima, e tem uma função equivalente a GST-π, (iii) uma variante que é codificada por um ácido nucleico que hibridiza, mediante condições estringentes, a uma fita complementar de um ácido nucleico que tem uma sequência de bases de um gene que codifica GST-π, um ácido nucleico que codifica o mesmo polipeptídeo que aquele codificado pelo ácido nucleico acima, ou um ácido nucleico que codifica uma variante de (ii), ou um fragmento da fita complementar, e tem uma função equivalente a GST-π, (iv) uma variante que tem uma sequência de aminoácidos que tem homologia de pelo menos 60%, preferencialmente pelo menos 70%, mais preferencialmente pelo menos 80%, ainda mais preferencialmente pelo menos 90%, e particularmente preferencial pelo menos 95% com a sequência de aminoácidos de GST-π, e tem uma função equivalente a GST-π, e (v) uma variante que é codificada por um ácido nucleico que tem homologia de pelo menos 60%, preferencialmente pelo menos 70%, mais preferencialmente pelo menos 80%, ainda mais preferencialmente pelo menos 90%, e particularmente preferencialmente pelo menos 95% com a sequência de aminoácidos de GST-π, e tem uma função equivalente a GST-π.

[070] A sequência de aminoácidos de GST-π e a sequência de bases do gene que codifica GST-π são conhecidas para vários tipos de animais conforme descrito acima, e um técnico no assunto pode preparar adequadamente os variantes funcionais mencionados acima com base nestas informações de sequência por qualquer técnica conhecida, por exemplo, síntese química, clivagem ou inserção de um ácido nucleico por uma enzima de restrição, mutagênese sítio-dirigida, aplicação de radiação ou raios UV, etc.

[071] Se dada variante tem ou não uma função equivalente a GST-π pode ser avaliada por análise de uma função conhecida de GST-π incluindo, por exemplo, mas não se limitando a, ligação com uma proteína como Raf-1 (em particular, Raf-1 fosfotilado) ou EGFR (em particular, EGFR fosforilado) por qualquer método conhecido como, por exemplo, um método de imunoprecipitação, um método western blot, um método de análise de massa, um método pull-down, ou um método de ressonância plasmônica de superfície (SPR), e comparando o mesmo com um controle negativo apropriado ou GST-π como um controle positivo. Por exemplo, quando a função de dada variante é superior a um controle negativo, por exemplo, quando este é superior por pelo menos 10%, pelo menos 25%, pelo menos 50%, pelo menos 75%, ou pelo menos 100% e/ou quando a função é pelo menos 1/100 de GST-π, pelo menos 1/50, pelo menos 1/25, pelo menos 1/10, pelo menos 1/5 ou pelo menos 1/2, este variante é incluído nos variantes funcionais de GST-π.

[072] O termo “condições estringentes” usado no presente pedido é um parâmetro conhecido neste campo técnico e é descrito em um protocolo padrão como, por exemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a ed., Cold Spring Harbor Press (2001) ou Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992).

[073] As condições estringentes na presente de invenção significam, por exemplo, hibridização a 65 °C por meio de um tampão de hibridização contendo 3,5x SSC (cloreto de sódio 0,15 M/ citrato de sódio 0,15 M, pH 7), Ficoll 0,02%, polivinilpirrolidona 0,02%, albumina de soro bovino 0,02%, NaH2PO4 25 mM (pH 7), SDS 0,05%, e EDTA 2 mM. Após a hibridização, uma membrana para a qual o DNA foi transferido é lavada com 2x SSC em temperatura ambiente, e então com 0,1 a 0,5x SSC/0,1x SDS a uma temperatura até 68 °C. Alternativamente, a hibridização estringente pode ser realizada com o uso de um tampão de hibridização comercial, como Solução de Hibridização ExpressHyb® (Clontech) mediante hibridização e condições de lavagem descritas pelo fabricante.

[074] Há outras condições aplicáveis, reagentes, etc., que podem resultar no mesmo grau de estringência, mas visto que pode ser esperado que um técnico no assunto esteja familiarizado com essas condições, eles não são referidas especificamente no presente pedido. No entanto, é possível manipular condições para identificar claramente um ácido nucleico que codifica um GST-π variante.

[075] GST-π e/ou uma variante funcional do mesmo na presente invenção inclui, além de GST-π e uma variante funcional do mesmo como proteínas, um ácido nucleico que codifica GST-π e um ácido nucleico que codifica uma variante funcional de GST-π.

[076] Quando usado no presente pedido, a “cascata de sinal” significa transdução de sinal em que uma pluralidade de moléculas de sinalização transmitem um sinal na sequência. Por exemplo, no caso da “cascata de sinal PI3K/Akt/mTOR”, um sinal é transmitido de modo que PI3Ké primeiro ativado, isto então faz com que Akt seja ativado, e isto então faz com que mTOR seja ativado. Isto também se aplica na nota de outras cascatas de sinal. Com referência à relação entre montante e jusante de sinalização, a cadeia de ativação pode ser ocasionada tanto diretamente como indiretamente. Por exemplo, é conhecido que a ativação de Akt causada por PI3K é mediada por moléculas como PIP3 (fosfatidilinositol (3,4,5) trifosfato) e PDK1 (proteína quinase 1 dependente de fosfoinositida, também chamada de PDPK1).

[077] A cascata de sinal PI3K/Akt/mTOR é uma cascata de sinal que é dirigida por ativação de PI3K e é conhecida por ser sinalização envolvida na sobrevivência celular, etc. Exemplos da maneira em que a ativação de PI3K ocorre incluem, mas não se limitam a, um ligante que se liga a um receptor acoplado de proteína G ou um receptor tirosina quinase, e PI3K ativado fosforila fosfolipídeos inositol, produzindo assim um fosfatidilinositol como PIP3. Este se liga a PDK1 ou Akt em um domínio PH, promovendo assim localização destas proteínas na membrana. PDK1 se liga a PIP3 para assim ser ativado na membrana, e o PDK1 ativado fosforila T na posição 308a posição de Akt. A serina na 473a posição de Akt é fosforilada por mTORC2, que é um dos complexos de mTOR, e Akt é completamente ativado como um resultado da fosforilação dos aminoácidos nestas duas posições.

[078] Embora a rota para ativação de mTOR por Akt não tenha sido completamente elucidada, acredita-se que PRAS40 (Akt rico em prolina/substrato PKB de 40 kDa) está envolvido. PRAS40 é um substrato de Akt como o nome indica, e acredita-se que é uma molécula que se liga a um complexo de mTOR para então suprimir sua ativação, e acredita-se que quando Akt é ativado, PRAS40 é fosforilado, através disso fazendo com que PRAS40 seja liberado do complexo de mTOR para assim ativar mTOR. Quando mTOR é ativado, ULK1 e ULK2 (quinase similar a unc-51) e mAtg13 (relacionados 13 à autofagia em mamífero) são fosforilados, inibindo assim a iniciação de sinalização de autofagia para suprimir assim a autofagia.

[079] Por outro lado, a cascata de sinal de RAS/Raf/MAPK é uma cascata de sinal que está relacionada com a proliferação de celular, etc. Quando um ligante como, por exemplo, um fator de crescimento que se liga a um receptor acoplado à proteína G ou um receptor tirosina quinase, KRAS, que é uma proteína G de baixo peso molecular, é ativado, e o KRAS ativado fosforila Raf (um tipo de MAPKKK) para assim ativá-lo. O Raf ativado ativa MEK (MAPK/ERK quinase, um tipo de MAP2K), e o MEK ativado ativa ERK (quinase regulada por sinal extracelular, um tipo de MAPK). O ERK ativado transloca no núcleo e promove transcrição de vários mRNAs para assim desencadear proliferação celular.

[080] Na presente invenção, promover uma cascata de sinal significa não apenas aumentar a ativação da cascata de sinal, mas também supressão de inativação da cascata de sinal. Se uma cascata de sinal é ou não promovida pode ser determinado pela cascata de sinal sendo ativada, em comparação com um caso em que o agente ou composição da presente invenção não é utilizado. A ativação de uma cascata de sinal pode ser avaliada por detecção, por exemplo, mas não se limitando a, um fenômeno celular resultando da ativação de uma molécula constituinte da cascata de sinal (por exemplo, fosforilação, etc.) ou ativação de uma cascata de sinal como, por exemplo, supressão de autofagia, etc., no caso da cascata de sinal de PI3K/Akt/mTOR.

[081] A presente invenção também se refere a um processo para produzir um agente ou composição para promover a cascata de sinal de PI3K/Akt/mTOR e/ou cascata de sinal de RAS/Raf/MAPK, cujo processo compreende uma etapa de formulação de GST-π e/ou de uma variante funcional do mesmo; uso de GST-π e/ou de uma variante funcional do mesmo na produção de um agente ou composição para promover a cascata de sinal de PI3K/Akt/mTOR e/ou cascata de sinal de RAS/Raf/MAPK; GST-π e/ou uma variante funcional do mesmo para uso na promoção da cascata de sinal de PI3K/Akt/mTOR e/ou cascata de sinal de RAS/Raf/MAPK; cujo método compreende administrar uma quantidade efetiva de GST-π e/ou de uma variante funcional do mesmo.

[082] O agente ou composição para promover uma cascata de sinal da presente invenção é úril para o tratamento de uma doença associada com uma anormalidade da cascata de sinal de PI3K/Akt/mTOR e/ou da cascata de sinal de RAS/Raf/MAPK, em particular, com uma supressão dessas cascatas de sinal. Exemplos dessa doença incluem, mas não se limitam a, uma doença acompanhada por supressão de expressão ou atividade e/ou aumento na degradação ou inativação de uma molécula constituinte dessas cascatas de sinal (por exemplo, devido a uma anormalidade genética dessas moléculas, supressão de expressão ou atividade de GST-π, etc.).

[083] Portanto, a presente invenção também se refere a uma composição farmacêutica para tratar uma doença associada com a supressão da cascata de sinal de PI3K/Akt/mTOR e/ou cascata de sinal de RAS/Raf/MAPK, cuja composição farmacêutica contém como um ingrediente ativo GST-π e/ou uma variante funcional do mesmo; um processo para produzir uma composição farmacêutica para tratar uma doença associada com a supressão da cascata de sinal de PI3K/Akt/mTOR e/ou da cascata de sinal de RAS/Raf/MAPK, cujo processo inclui uma etapa de formulação de GST-π e/ou de uma variante funcional do mesmo; uso de GST-π e/ou de uma variante funcional do mesmo na produção de uma composição farmacêutica para tratar uma doença associada com a supressão da cascata de sinal de PI3K/Akt/mTOR e/ou da cascata de sinal de RAS/Raf/MAPK; GST-π e/ou uma variante funcional do mesmo para uso no tratamento de uma doença associada com a supressão da cascata de sinal de PI3K/Akt/mTOR e/ou da cascata de sinal de RAS/Raf/MAPK; e um método para tratar uma doença associada com a supressão da cascata de sinal de PI3K/Akt/mTOR e/ou da cascata de sinal de RAS/Raf/MAPK, cujo método compreende administrar uma quantidade efetiva de GST-π e/ou de uma variante funcional do mesmo.

[084] Portanto, a presente invenção também se refere a um agente ou composição para suprimir a cascata de sinal de PI3K/Akt/mTOR e/ou a cascata de sinal de RAS/Raf/MAPK (também chamado de um “agente de supressão de cascata de sinal” ou uma “composição de supressão de cascata de sinal”), cujo agente ou composição contém como um ingrediente ativo uma droga que suprime GST-π.

[085] Na presente invenção, suprimir uma cascata de sinal significa não apenas induzir inativação da cascata de sinal, mas também suprimir ativação da cascata de sinal. Se uma cascata de sinal é ou não suprimida pode ser determinado pela cascata de sinal sendo suprimida, em comparação com um caso em que o agente ou composição da presente invenção não é utilizado. A supressão de uma cascata de sinal pode ser avaliada por detecção, por exemplo, mas não se limitando a, redução de ativação (por exemplo, fosforilação, etc.) de uma molécula constituinte de uma cascata de sinal ou um fenômeno celular resultante da supressão da cascata de sinal como, por exemplo, aumento ou supressão de proliferação celular, etc., no caso da cascata de sinal de RAS/Raf/MAPK.

[086] A presente invenção também se refere a um processo para produzir um agente ou composição para suprimir a cascata de sinal de PI3K/Akt/mTOR e/ou cascata de sinal de RAS/Raf/MAPK, cujo processo compreende uma etapa de formulação de uma droga que suprime GST-π; uso de uma droga que suprime GST-π na produção de um agente ou composição para suprimir a cascata de sinal de PI3K/Akt/mTOR e/ou cascata de sinal de RAS/Raf/MAPK; uma droga que suprime GST-π para uso na supressão da cascata de sinal de PI3K/Akt/mTOR e/ou cascata de sinal de RAS/Raf/MAPK; cujo método compreende administrar uma quantidade efetiva de uma droga que suprime GST-π.

[087] O agente ou composição para suprimir uma cascata de sinal da presente invenção é úril para o tratamento de uma doença associada com uma anormalidade da cascata de sinal de PI3K/Akt/mTOR e/ou da cascata de sinal de RAS/Raf/MAPK, em particular, com uma ativação dessas cascatas de sinal. Exemplos dessa doença incluem, mas não se limitam a, uma doença associada com um aumento na expressão ou atividade e/ou supressão de degradação ou inativação de uma molécula constituinte dessas cascatas de sinal (por exemplo, devido a uma anormalidade genética dessas moléculas, um aumento na expressão ou atividade de GST-π) e uma doença associada com ativação dessa cascata de sinal por meio de um fator exceto uma molécula constituinte dessas cascatas de sinal (por exemplo, ativação de receptor tirosina quinase, etc.)

[088] Portanto, a presente invenção se refere ainda a uma composição farmacêutica para tratar uma doença associada com a ativação da cascata de sinal de PI3K/Akt/mTOR e/ou cascata de sinal de RAS/Raf/MAPK, cuja composição farmacêutica contém como um ingrediente ativo uma droga que suprime GST-π; um processo para produzir uma composição farmacêutica para tratar uma doença associada com a ativação da cascata de sinal de PI3K/Akt/mTOR e/ou da cascata de sinal de RAS/Raf/MAPK, cujo processo compreende uma etapa de formulação de uma droga que suprime GST-π; uso de uma droga que suprime GST-π na produção de uma composição farmacêutica para tratar uma doença associada com a ativação da cascata de sinal de PI3K/Akt/mTOR e/ou da cascata de sinal de RAS/Raf/MAPK; uma droga que suprime GST-π para uso no tratamento de uma doença associada com a ativação da cascata de sinal de PI3K/Akt/mTOR e/ou da cascata de sinal de RAS/Raf/MAPK; e um método para tratar uma doença associada com a ativação da cascata de sinal de PI3K/Akt/mTOR e/ou da cascata de sinal de RAS/Raf/MAPK, cujo método compreende administrar uma quantidade efetiva de uma droga que suprime GST-π.

[089] A presente invenção também se refere a um agente ou composição para suprimir ubiquitinação (também chamado de um “agente que suprime ubiquitinação” ou uma “composição que suprime ubiquitinação”), cujo agente ou composição contém como um ingrediente ativo GST-π e/ou uma variante funcional do mesmo.

[090] Ubiquitinação quer dizer que a ubiquitina se liga a uma proteína e está envolvida no processo de disposição de uma proteína que torna-se desnecessária em uma célula. Uma proteína ubiquirinada é degradada em um proteassoma.

[091] Em uma realização da presente invenção, a proteína para a qual a ubiquitinação é suprimida é uma proteína à qual GST-π pode se ligar. Além disso, em uma realização da presente invenção, a proteína para a qual a ubiquitinação é suprimida é selecionada a partir do grupo que consiste em uma proteína que constitui a cascata de sinal de RAS/Raf/MAPK, uma proteína que constitui a cascata de sinal de PI3K/Akt/mTOR, e um receptor tirosina quinase. Em uma realização preferencial da presente invenção, a proteína para a qual a ubiquitinação é suprimida é selecionado a partir do grupo que consiste em EGFR e Raf-1, em particular uma forma fosforilada da mesma.

[092] Na presente invenção, supressão de ubiquitinação pode ser determinada por ubiquitinação sendo suprimida em comparação com um caso em que o agente ou composição da presente invenção não é utilizado. A supressão de ubiquitinação pode ser avaliada por qualquer técnica conhecida, por exemplo, mas não se limitando a, um método de imunoprecipitação, um método western blot, um método de análise de massa, um método pull-down, etc.

[093] A presente invenção também se refere a um processo para produzir um agente ou composição para suprimir ubiquitinação, cujo processo compreende uma etapa de formulação de GST-π e/ou de uma variante funcional do mesmo; uso de GST-π e/ou de uma variante funcional do mesmo na produção de um agente ou composição para suprimir ubiquitinação; e/ou GST-π e/ou uma variante funcional do mesmo para uso na supressão de ubiquitinação; e um método para suprimir ubiquitinação, cujo método compreende administrar uma quantidade efetiva de GST-π e/ou de uma variante funcional do mesmo.

[094] O agente ou composição para suprimir ubiquitinação da presente invenção é útil no tratamento de uma doença associada com hiperubiquitinação. Exemplos dessa doença incluem, mas não se limitam a, uma doença acompanhada por um aumento na expressão ou atividade e/ou uma supressão de degradação ou inativação de ubiquitina ligase (por exemplo, devido a uma anormalidade genética de ubiquitina ligase, supressão de expressão ou atividade de GST-π, etc.).

[095] Portanto, a presente invenção se refere ainda a uma composição farmacêutica para tratar uma doença associada com hiperubiquitinação, cuja composição farmacêutica contém como um ingrediente ativo GST-π e/ou uma variante funcional do mesmo; um processo para produzir uma composição farmacêutica para tratar uma doença associada com hiperubiquitinação, cujo processo compreende uma etapa de formulação de GST-π e/ou uma variante funcional do mesmo; uso de GST-π e/ou de uma variante funcional do mesmo na produção de uma composição farmacêutica para tratar uma doença associada com hiperubiquitinação; GST-π e/ou uma variante funcional do mesmo para uso no tratamento de uma doença associada com hiperubiquitinação; e um método para tratar uma doença associada com hiperubiquitinação, cujo método compreende administrar uma quantidade efetiva de GST-π e/ou de uma variante funcional do mesmo.

[096] A presente invenção também se refere a um agente ou composição para promover ubiquitinação (também chamado de um “agente que promove ubiquitinação” ou uma “composição que promove ubiquitinação”), cujo agente ou composição contém como um ingrediente ativo uma droga que suprime GST-π.

[097] Em uma realização da presente invenção, a proteína para a qual a ubiquitinação é promovida é uma proteína à qual GST-π pode se ligar. Além disso, em uma realização da presente invenção, a proteína para a qual a ubiquitinação é promovida é selecionada a partir do grupo que consiste em uma proteína que constitui a cascata de sinal de RAS/Raf/MAPK, uma proteína que constitui a cascata de sinal de PI3K/Akt/mTOR, e um receptor tirosina quinase. Em uma realização preferencial da presente invenção, a proteína para a qual a ubiquitinação é promovida é selecionada a partir do grupo que consiste em EGFR e Raf-1, em particular uma forma fosforilada da mesma.

[098] Na presente invenção, promoção de ubiquitinação pode ser determinada por ubiquitinação sendo promoção em comparação com um caso em que o agente ou composição da presente invenção não é utilizado. A promoção de ubiquitinação pode ser avaliada por qualquer técnica conhecida, por exemplo, mas não se limitando a, um método de imunoprecipitação, um método western blot, um método de análise de massa, um método pull-down, etc.

[099] A presente invenção também se refere a um processo para produzir um agente ou composição para promover ubiquitinação, cujo processo compreende uma etapa de formulação de uma droga que suprime GST-π; uso de uma droga que suprime GST-π na produção de um agente ou composição para promover ubiquitinação; uma droga que suprime GST-π para uso na promoção de ubiquitinação; e um método para promover ubiquitinação, cujo método compreende administrar uma quantidade efetiva de uma droga que suprime GST-π.

[0100] O agente ou composição para promover ubiquitinação da presente invenção é útil no tratamento de uma doença associada com a supressão de ubiquitinação. Exemplos dessa doença incluem, mas não se limitam a, uma doença associada com a supressão de expressão ou atividade e/ou um aumento na degradação ou inativação de ubiquitina ligase (por exemplo, devido a uma anormalidade genética de ubiquitina ligase, um aumento na expressão ou atividade de GST-π, etc.).

[0101] Portanto, a presente invenção se refere ainda a uma composição farmacêutica para tratar uma doença associada com a supressão de ubiquitinação, cuja composição farmacêutica contém como um ingrediente ativo uma droga que suprime GST-π; um processo para produzir uma composição farmacêutica para tratar uma doença associada com a supressão de ubiquitinação, cujo processo compreende uma etapa de formulação de uma droga que suprime GST-π; uso de uma droga que suprime GST-π na produção de uma composição farmacêutica para tratar uma doença associada com a supressão de ubiquitinação; uma droga que suprime GST-π para uso no tratamento de uma doença associada com a supressão de ubiquitinação; e um método para tratar uma doença associada com a supressão de ubiquitinação, cujo método compreende administrar uma quantidade efetiva de uma droga que suprime GST-π.

[0102] A presente invenção também se refere a um agente ou composição para suprimir autofagia (também chamado de um “agente que suprime autofagia” ou uma “composição que suprime autofagia”), cujo agente ou composição contém como um ingrediente ativo GST-π e/ou uma variante funcional do mesmo. Os presentes inventores esclareceram agora que GST-π se liga a um receptor tirosina quinase, em particular uma forma fosforilada do mesmo, que está a montante da cascata de sinal de PI3K/Akt/mTOR, para assim inibir a ubiquitinação do mesmo, através disso promovendo a cascata de sinal; sabe-se que a ativação da cascata de sinal de PI3K/Akt/mTOR suprime autofagia (por exemplo, Yang e Klionsky, 2010 acima).

[0103] Na presente invenção, supressão de autofagia pode ser determinada por autofagia sendo suprimida, em comparação com um caso em que o agente ou composição da presente invenção não é utilizado. A técnica para avaliar autofagia é conforme descrito acima.

[0104] A presente invenção refere-se ainda a um processo para produzir um agente ou composição para suprimir autofagia, cujo processo compreende uma etapa de formulação de GST-π e/ou de uma variante funcional do mesmo; uso de GST-π e/ou de uma variante funcional do mesmo na produção de um agente ou composição para suprimir autofagia; e/ou GST-π e/ou uma variante funcional do mesmo para uso na supressão de autofagia; e um método para suprimir autofagia, cujo método compreende administrar uma quantidade efetiva de GST-π e/ou de uma variante funcional do mesmo.

[0105] O agente ou composição para suprimir autofagia da presente invenção é útil para o tratamento de uma doença associada com autofagia aumentada. Exemplos dessa doença incluem, mas não se limitam a, uma doença associada com a supressão da cascata de sinal PI3K/Akt/mTOR (por exemplo, devido a uma anormalidade genética de uma cascata de sinal de PI3K/Akt/mTOR e/ou molécula constituinte e/ou molécula a montante, supressão de expressão ou atividade de GST-π, etc.), miopatia, lesão hepático, lesão de reperfusão, etc.

[0106] Portanto, a presente invenção também se refere a uma composição farmacêutica para tratar uma doença associada com autofagia aumentada, cuja composição farmacêutica contém como um ingrediente ativo GST-π e/ou uma variante funcional do mesmo; um processo para produzir uma composição farmacêutica para tratar uma doença associada com autofagia aumentada, cujo processo compreende uma etapa de formulação de GST-π e/ou uma variante funcional do mesmo; uso de GST-π e/ou de uma variante funcional do mesmo na produção de uma composição farmacêutica para tratar uma doença associada com autofagia aumentada; GST-π e/ou uma variante funcional do mesmo para uso no tratamento de uma doença associada com autofagia aumentada; e um método para tratar uma doença associada com autofagia aumentada, cujo método compreende administrar uma quantidade efetiva de GST-π e/ou de uma variante funcional do mesmo a um sujeito que necessita da mesma.

[0107] Além disso, os presentes inventores esclareceram agora que a autofagia é promovida por supressão de GST-π. Portanto, a presente invenção também se refere a um agente ou composição para promover autofagia (também chamado de um “agente que promove autofagia” ou uma “composição que promove autofagia”), cujo agente ou composição contém como um ingrediente ativo uma droga que suprime GST-π. A presente invenção refere-se ainda a um processo para produzir um agente ou composição para promover autofagia, cujo processo compreende uma etapa de formulação de uma droga que suprime GST-π; uso de uma droga que suprime GST-π na produção de um agente ou composição para promover autofagia; uma droga que suprime GST-π para uso na promoção de autofagia; e um método para promover autofagia, cujo método compreende administrar uma quantidade efetiva de uma droga que suprime GST-π.

[0108] O agente ou composição para promover autofagia da presente invenção é útil no tratamento de uma doença associada com a supressão de autofagia. Exemplos dessa doença incluem, mas não se limitam a, uma doença associada com a ativação da cascata de sinal de PI3K/Akt/mTOR (por exemplo, devido a uma anormalidade genética de uma molécula constituinte de uma cascata de sinal de PI3K/Akt/mTOR e/ou uma molécula a montante do mesmo, um aumento na expressão ou atividade de GST-π, etc.), envelhecimento e uma doença isquêmica.

[0109] Portanto, a presente invenção também se refere a uma composição farmacêutica para tratar uma doença associada com a supressão de autofagia, cuja composição farmacêutica contém como um ingrediente ativo uma droga que suprime GST-π; um processo para produzir uma composição farmacêutica para tratar uma doença associada com a supressão de autofagia, cujo processo compreende uma etapa de formulação de uma droga que suprime GST-π; uso de uma droga que suprime GST-π na produção de uma composição farmacêutica para tratar uma doença associada com a supressão de autofagia; uma droga que suprime GST-π para uso no tratamento de uma doença associada com a supressão de autofagia; e um método para tratar uma doença associada com a supressão de autofagia, cujo método compreende administrar uma quantidade efetiva de uma droga que suprime GST-π para um sujeito que necessita da mesma.

[0110] A quantidade de formulação do ingrediente ativo dos vários tipos de agente ou composição da presente invenção relacionada à supressão/promoção de uma cascata de sinal, ubiquitinação ou autofagia pode ser uma quantidade que atinge um efeito desejado (isto é, supressão/promoção da cascata de sinal, ubiquitinação ou autofagia) quando o agente ou composição é administrado. Além disso, é preferencialmente uma quantidade que não causa um efeito adverso que excede o benefício de administração. Essa quantidade é conhecida ou pode ser determinada apropriadamente por meio de um teste in vitro com o uso de células cultivadas, etc., ou um teste em um modelo animal como um camundongo, um rato, um cachorro ou um porco, e esse métodos de teste é bem conhecidos por um técnico no assunto. A inibição/promoção de uma cascata de sinal, ubiquitinação ou autofagia pode ser avaliada por técnicas conhecidas, incluindo aquelas descritas acima. A quantidade de formulação de ingrediente ativo pode variar de acordo com o modo de administração do agente ou composição. Por exemplo, quando uma pluralidade de unidades da composição é usada para uma administração, a quantidade de ingrediente ativo a ser formulada em uma unidade da composição pode ser aquela obtida dividindo-se a quantidade de ingrediente ativo necessária para uma administração pela dita pluralidade de unidades. O ajuste dessa quantidade de formulação pode ser realizado adequadamente por técnico no assunto.

[0111] A droga e a quantidade de formulação do mesmo no processo de produção ou uso dos vários tipos de agentes ou composição relacionados à supressão/promoção de uma cascata de sinal, ubiquitinação ou autofagia são conforme descrito acima. A formulação de cada droga pode ser realizada de acordo com qualquer técnica conhecida.

[0112] Todos os vários tipos de métodos relacionados à supressão/promoção de uma cascata de sinal, ubiquitinação ou autofagia podem ser um método in vitro ou um método in vivo. Além disso, a quantidade efetiva de droga nos métodos acima podem ser uma quantidade que atinge um efeito desejado (isto é, supressão/promoção de uma cascata de sinal, ubiquitinação ou autofagia) as células ás quais é administrado. Além disso, é preferencialmente uma quantidade que não causa um efeito adverso que excede o benefício de administração. Essa quantidade é conhecida ou pode ser determinada apropriadamente por um teste in vitro etc., com o uso de células cultivadas, etc., e esse método de teste é bem conhecido por um técnico no assunto. O alcance de um efeito desejado pode ser avaliado por várias técnicas conhecidas, incluindo essas descritas acima. A quantidade efetiva acima não necessariamente necessita ser aquela que induz um efeito desejado em todas as células de uma população de células em que a droga é administrada. Por exemplo, a quantidade efetiva acima pode ser uma quantidade que induz um efeito desejado na população de células em pelo menos 1% das células, pelo menos 2%, pelo menos 3%, pelo menos 4%, pelo menos 5%, pelo menos 6%, pelo menos 8%, pelo menos 10%, pelo menos 12%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, etc.

[0113] Quando o ingrediente ativo nos vários agentes ou composições, métodos de tratamento, etc., da presente invenção descrita no presente pedido é um ácido nucleico, por exemplo, uma molécula de RNAi, uma ribozima, um ácido nucleico antisense , um polinucleotídeo quimera de DNA/RNA, etc., pode ser usado como um ácido nucleico nu como é, mas também pode ser realizado por vários vetores. Como vetor, podem ser usados quaisquer vetores conhecidos, como um vetor de plasmídeo, um vetor de fago, um vetor de fagomídeo, um vetor de cosmídeo, ou um vetor de vírus. O vetor preferencialmente contém pelo menos um promotor que melhora a expressão do ácido nucleico carregado, e neste caso o ácido nucleico é preferencialmente ligado de maneira funcional a esse promotor. O ácido nucleico sendo ligado de maneira funcional a esse promotor referido no presente pedido significa que o ácido nucleico e o promotor estão posicionados de modo que uma proteína codificada pelo ácido nucleico seja apropriadamente produzida pela ação do promotor. O vetor pode ou não pode ser replicável em uma célula hospedeira, e a transcrição de um gene pode ser realizada tanto fora do núcleo como dentro do núcleo de uma célula hospedeira. No último caso, o ácido nucleico pode ser incorporado no genoma de uma célula hospedeira.

[0114] Além disso, o ingrediente ativo pode ser carregado por vários lipídeos não virais carreadores de proteína. Exemplos desses carreadores incluem, mas não se limitam a, colesterol, um lipossomo, um protômero de anticorpo, nanopartículas de ciclodextrina, um peptídeo de fusão, um aptâmero, um copolímero de ácido poliláctico biodegradável, e polímero; a eficiência de incorporação em células pode ser melhorada (consulte, por exemplo, Pirollo e Chang, Cancer Res. 2008; 68 (5): 1247-50, etc.). Em particular, um lipossomo catiônico ou um polímero (por exemplo, polietileneimina, etc.) é útil. Exemplos adicionais de polímeros úteis como um carreador incluem aqueles descritos em nas patentes US 2008/0207553, US 2008/0312174, etc.

[0115] Com referência às várias composições farmacêuticas da presente invenção descritas no presente pedido, o ingrediente ativo pode ser combinado com outro componente opcional, contanto que o efeito do ingrediente ativo não seja comprometido. Exemplos desse componente opcional incluem outro agente terapêutico químico, um transportador farmacologicamente aceitável, um excipiente, um diluente, etc. Além disso, dependendo da rota de administração, o modo de liberação de droga, etc., a composição pode ser revestida com um material apropriado como, por exemplo, uma camada de entérico ou um material de desintegração determinada, ou pode ser incorporada em um sistema apropriado de liberação de droga.

[0116] Os vários agentes e composições (incluindo as várias composições farmacêuticas) da presente invenção descritos no presente pedido podem ser administrados através de várias rotas incluindo tanto rota oral como parenteral, por exemplo, sem limitação, oral, intravenosa, intramuscular, subcutânea, local, intratumoral, retal, intra-arterial, intraportal, intraventricular, transmucosal, transdérmica, intranasal, intraperitoneal, intrapulmonar, e rota intrauterina, e podem ser formuladas sob a forma de dosagem conveniente para cada rota de administração. Com referência a essas formas de dosagem e métodos de formulação, qualquer forma ou método conhecidos podem ser empregados apropriadamente (consulte, por exemplo, Hyojun yakuzaigaku (Standard Pharmaceutical Science), Ed. by Yoshiteru Watanabe et al., Nankodo, 2003, etc.).

[0117] Exemplos da forma de dosagem adequada para administração oral incluem, mas não se limitam a, um pó, grânulos, um comprimido, uma cápsula, um líquido, uma suspensão, uma emulsão, um gel, e um xarope, e exemplos da forma de dosagem adequada para a administração parenteral incluem uma injeção, como uma solução injetável, uma suspensão injetável, uma injeção de emulsão, ou uma injeção sob a forma que é preparada no momento do uso. Uma formulação para administração parenteral pode estar sob a forma de uma solução estéril isotônica ou suspensão aquosa ou não aquosa.

[0118] Os vários agentes ou composições (inclusive várias composições farmacêuticas) da presente invenção descritos no presente pedido podem ser direcionados para um tecido ou células específicas. O direcionamento pode ser realizado por qualquer técnica conhecida. Quando a distribuição a um câncer é tentada, por exemplo, sem limitação, uma técnica como o direcionamento passivo em que uma formulação é feita em um tamanho de 50 a 200 μm de diâmetro, em particular 75 a 150 μm, etc., que é adequada para exibição de um efeito EPR (permeabilidade aumentada e retenção), ou direcionamento ativo em que um ligante de CD19, HER2, um receptor de transferrina, um receptor de ácido fólico, um receptor de VIP, EGFR (Torchilin, AAPS J. 2007; 9 (2) : E128-47), RAAG10 (JP, A (PCT) 2005-532050), PIPA (JP, A (PCT) 2006-506071), ou KID3 (JP, A (PCT) 2007-529197), etc., um peptídeo que tem um motivo RGD ou um motivo NGR, F3, LyP-1 (Ruoslahti et al., J Cell Biol. 2010; 188 (6): 759-68), etc., é usado como um agente de direcionamento, pode ser usado. Além disso, visto que um retinoide é conhecido por ser útil como agente de direcionamento para células cancerosas (documento WO 2008/120815), um carreador contendo um retinoide como um agente de direcionamento também pode ser usado. Esses carreadores são descritos na literatura acima, bem como no documento WO 2009/036368, documento WO 2010/014117, etc.

[0119] Os vários agentes ou composições (inclusive várias composições farmacêuticas) da presente invenção descritas no presente pedido podem ser fornecidos sob qualquer forma, e do ponto de vista de estabilidade de armazenamento, pode ser fornecido sob a forma que pode ser preparada no momento do uso, por exemplo, sob a forma que permite que um médico e/ou farmacêutico, uma enfermeira, outro paramédico, etc., prepare os mesmos no local médico ou na sua vizinhança. Essa forma é particularmente útil quando o agente ou composição da presente invenção contém um componente que é difícil de armazenar de forma estável, como um lipídeo, uma proteína ou um ácido nucleico. Neste caso, o agente ou composição da presente invenção é fornecido em um ou mais recipientes contendo pelo menos um dos constituintes essenciais, e a preparação é realizada antes do uso, por exemplo, dentro de 24 horas, preferencialmente dentro de 3 horas, e mais preferencialmente imediatamente antes do uso. Ao realizar a preparação, um reagente, um solvente, um equipamento de preparação, que estão geralmente disponíveis em um local de preparação podem ser usados conforme apropriado.

[0120] Portanto, a presente invenção também se refere a um kit para preparar uma composição, cujo kit contém um ou mais recipientes, o recipiente isoladamente ou em combinação contendo ingredientes ativos para serem contidos nos vários agentes ou composições da presente invenção; e constituintes essenciais dos vários agentes ou composições fornecidos sob a forma desse kit. O kit da presente invenção pode incluir, além do acima, instruções como uma explicação por escrito ou uma mídia de gravação eletrônica como um CD ou DVD descrevendo um método de preparação, um método de administração, etc., para os vários agentes ou composições da presente invenção. Além disso, o kit da presente invenção pode conter todos os constituintes para completar os vários agentes ou composições da presente invenção, mas não necessariamente deve conter todos os constituintes. Portanto, o kit da presente invenção não deve conter um reagente ou um solvente que está geralmente disponível em um local médico, um laboratório experimental, etc., como água estéril, solução salina fisiológica, ou uma solução de glicose.

[0121] A quantidade efetiva dos vários métodos de tratamento da presente invenção descritos no presente pedido é, por exemplo, uma quantidade que reduz os sintomas de uma doença ou atrasos ou paradas na progressão de uma doença, e é preferencialmente uma quantidade que suprime ou cura uma doença. É também preferencialmente uma quantidade que não causa um efeito adverso que excede o benefício de administração. Essa quantidade pode ser determinada apropriadamente por um teste in vitro camundongo, um rato, um cachorro ou um porco, e esses métodos de teste são bem conhecidos por um técnico no assunto. Além disso, a dose de uma droga usada no método de tratamento da presente invenção é conhecida por um técnico no assunto ou pode ser determinada adequadamente pelos testes descritos acima, etc.

[0122] A dose específica do ingrediente ativo a ser administrada no método de tratamento da presente invenção descrita no presente pedido pode ser determinada levando-se em consideração várias condições relacionadas ao sujeito que necessita de tratamento como, por exemplo, a seriedade de sintomas, o estado geral de saúde do sujeito, idade, peso corporal, o gênero do sujeito, dieta, o momento e frequência de administração, produtos farmacêuticos concomitantes, a responsividade ao tratamento, a forma de dosagem, e a obediência ao tratamento.

[0123] Exemplos da rota de administração incluem várias rotas, incluindo ambas as rotas, oral e parenteral, como rotas oral, intravenosa, intramuscular, subcutânea, local, intratumoral, retal, intra-arterial, intraportal, intraventricular, transmucosal, transdérmica, intranasal, intraperitoneal, intrapulmonar, intrauterina.

[0124] A frequência de administração depende das propriedades do agente ou composição usada e a condição do sujeito, incluindo aquelas descritas acima, e pode ser uma pluralidade de vezes ao dia (isto é, dois, três, quatro, cinco ou mais vezes ao dia), uma vez ao dia, a cada poucos dias (isto é, a cada dois, três, quatro, cinco, seis, sete dias, etc.), toda semana, a cada poucas semanas (isto é, a cada duas, três, quatro semanas, etc.), etc.

[0125] Quando usado no presente pedido, o termo “sujeito” significa qualquer indivíduo biológico e é preferencialmente um animal, mais preferencialmente um mamífero, e ainda mas mais preferencialmente um indivíduo humano. Na presente invenção, o sujeito pode ser ou tanto saudável como afetado por alguma doença, mas quando uma tentativa é feita para tratar uma doença específica, geralmente significa um sujeito afetado por essa doença ou que tem um risco de ser afetado.

[0126] Além disso, quando usado no presente pedido, o termo “tratamento” inclui todos os tipos de intervenções preventivas e/ou terapêuticas clinicamente permitidas para os propósitos de cura, remissão temporária, prevenção, etc., de uma doença. Por exemplo, o termo “tratamento” inclui intervenções clinicamente permitidas para vários tipos de propósitos, incluindo atrasar ou estacionar o progresso de uma doença, fazendo com que uma lesão regrida ou desapareça, prevenindo o princípio ou impedindo recorrência.

EXEMPLOS

[0127] A presente invenção é ainda explicada abaixo com base nos Exemplos, mas esses Exemplos são somente ilustrações da presente invenção e não devem ser interpretados como limitação à presente invenção.

EXEMPLO 1 EFEITO KNOCKOUT DE GST-n NA CASCATA DE SINAL DE RAS/RAF/MAPK (1) CULTURA CELULAR

[0128] A linhagem celular de carcinoma de cólon com mutação positiva de K-RAS M7609 foi cultivada em soro bovino fetal (FBS) 10% contendo meio RPMI-1640 a 37 °C sob uma atmosfera contendo CO2 5%. Além disso, 100 U/mL de penicilina de 100 μg/mL de estreptomicina foram adicionados como antibióticos ao meio.

(2) TRANSFECÇÃO DE SIRNA DE GST-n

[0129] No dia anterior a transfecção, células M7609 foram plaqueadas em uma placa de plástico de cultura de tecido de 100 mm com o uso de meio RPMI-1640 contendo FBS 10% sem antibiótico de modo a dar 1 x 106 células/10 mL. 600 pmol de siRNA de GST-π (SEQ ID No: 1: GGGAGGCAAGACCUUCAUUTT, siRNA ID n° 2385, Ambion) foi adicionado a 1 mL de Meio de Soro Reduzido Opti-MEM I (GIBCO) e misturado gentilmente. Subsequentemente, 35 μL de Lipofectamina RNAiMAX (Invitrogen) foi diluída em 1 mL de Meio de Soro Reduzido Opti-MEM I e misturada suavemente. O siRNA de GST-π diluído e a Lipofectamina RNAiMAX diluída foram combinados e misturados suavemente, e então incubados em temperatura ambiente por 10 min. Durante esse tempo, o meio foi substituído com 10 mL de Meio de Soro Reduzido Opti-MEM I. Depois de 10 min. de incubação, o complexo entre siRNA de GST-π e Lipofectamine RNAiMAX foi adicionado às células e incubado a 37 °C sob uma atmosfera contendo CO2 5%. Depois de 5 horas de incubação, foi substituído com 10 mL de meio RPMI-1640 contendo FBS 10% sem conter antibiótico. Como um experimento de controle, o mesmo procedimento foi repetido com o uso de siRNA Scramble (SEQ ID No: 2: CGAUUCGCUAGACCGGCUUCAUUGCAG, Hokkaido System Science Co., Ltda.). No 1°, 2°, 3° e 4° dia depois da transfecção com siRNA de GST-π, o número de células foi contado, e foi examinado knockdown de GST-π. O knockdown de GST-π foi analisado por um método Western Blot conforme descrito abaixo.

(3) ANÁLISE WESTERN BLOT DE KNOCKDOWN DE GST-n

[0130] A análise western blot de GST-π foi realizada com o uso de células coletadas em cada ponto no tempo mencionado acima após transfecção com siRNA de GST-π. As células coletadas foram cultivadas por 16 horas em um meio livre de soro. Após as células serem lavadas com PBS frio, tampão de lise frio (NP-40 1%, 50 mM de Tris-HCl, 150 mM de NaCl, 1 mM de EDTA, Mini livre de EDTA completo (Roche), PhosSTOP (Roche), pH 7,5) foi adicionado, e a solubilização foi realizada por incubação por 30 min enquanto esfriando em gelo. A centrifugação foi realizada a 4 °C e 15000 rpm por 15 min, fornecendo assim um extrato celular. O extrato celular assim obtido foi submetido à análise quantitativa de proteína com o uso de um Kit de Ensaio de Proteína Micro BCA (Thermo SCIENTIFIC) (siRNA de GST-π transfectante: 4,35 μg/μL, mistura de siRNA transfectante: Subsequentemente, 20 μg do extrato celular foi desnaturado mediante condições de redução, e a proteína foi separada realizando-se SDS-PAGE com o uso de multi gel II Mini 4/20 (13W) (Cosmo Bio Co., Ltda.). Depois que SDS-PAGE foi completado, a transferência para uma membrana de PVDF foi realizada eletricamente com o uso de um sistema de blotting tipo tanque. A membrana de transferência foi bloqueada por incubação com leite desnatado 5%/Tween20 0.05% em PBS (abreviado para PBS-T) a 4 °C por 16 horas. Subsequentemente, uma reação com anticorpo anti-GST diluído em PBS-T (MBL) foi realizada a 4 °C por 16 horas. Uma reação de anticorpo secundário foi realizada com o uso de anticorpo de coelho marcado com peroxidase de rábano silvestre (HRP) por 1 hora. Uma reação com um substrato quimioluminescente foi então realizada em temperatura ambiente por 1 min, e então esta quimioluminescência foi detectada com o uso de um filme de raio X. A lavagem entre as operações foi realizada três vezes por agitação por 5 min com o uso de PBS-T. Além disso, após transfecção com siRNA, o plaqueamento sobre um disco plástico de cultura de tecido foi realizado para fornecer 1,0 x 105 células/5 mL, e a contagem total de células no prato foi medida copm o uso de um hemocitômetro até o 4° dia.

(4) ANÁLISE WESTERN BLOT DE PROTEÍNA ENVOLVIDA NA CASCATA DE SINAL DE RAS/RAF/MAPK

[0131] Uma análise western blot para a proteína principal envolvida na cascata de sinal de RAS/Raf/MAPK foi realizada da mesma maneira que para (3) acima, com o uso de células colhidas no 2o dia após a transfecção com siRNA de GST-π. Como anticorpos, além do anticorpo anti-GST-π, anticorpo anti-p-Raf-1 (Ser338) (MILLIPORE), anticorpo anti-Raf-1 (Santa Cruz), anticorpo anti-p-MEK1/2 (Ser217/221) (Cell Signaling), anticorpo anti-MEK1/2 (Cell Signaling), anticorpo anti-p-ERK1/2 (Thr202/Tyr204) (Cell Signaling), anticorpo anti-ERK (Cell Signaling), e anticorpo anti-GAPDH (Abcam) foram usados.

[0132] Os resultados são mostrados nas Figuras 1 e 2. Na Figura 1 a), foi observado que a expressão de GST-π foi suprimida por siRNA de GST-π, mas não foi suprimida por mistura de siRNA. Na Figura 1 b), descobriu-se que mesmo no ponto de tempo quando 4 dias tinham transcorrido depois da transfecção, a expressão de GST-π foi ainda suprimida estavelmente por siRNA de GST-π e, além disso, no caso de expressão de GST-π sendo suprimida, o número de células após o cultivo por 4 dias foi notadamente menor que no caso de nenhuma supressão. Além disso, era também evidente a partir da Figura 2 que no grupo tratado com siRNA de GST-π, a fosforilação de todas as proteínas envolvidas na cascata de sinal de RAS/Raf/MAPK diminuiu em comparação com o grupo tratado com mistura de siRNA. Portanto, está claro que, devido à supressão de expressão de GST-π, a cascata de sinal de RAS/Raf/MAPK e a anormalidade de proliferação celular foram suprimidas.

EXEMPLO 2 EFEITO KNOCKOUT DE GST-Π NA UBIQUITINAÇÃO (1) EFEITO KNOCKDOWN DE GST-π NA UBIQUITINAÇÃO DE RAF-1

[0133] A cultura de células M7609 e transfecção com siRNA de GST-π foram realizadas de acordo com os procedimentos do Exemplo 1 (1) e (2).

[0134] Na mesma maneira que no Exemplo 1 (3), no 2o dia após transfecção com siRNA, a cultura foi realizada por 16 horas em um meio livre de soro, e um extrato celular foi coletado. O extrato celular assim obtido foi submetido à análise quantitativa de proteína com o uso de um Kit de Ensaio de Proteína Micro BCA (Mistura de siRNA: 8,88 μg/μL, siRNA de GST-π: 7,18 μg/ mL). 0,5 μg do extrato celular foi misturado com anticorpo anti-Raf-1 conjugado a Dynabeads Proteína G (Invitrogen), a incubação foi realizada a 4 °C por 2 horas com mistura suavemente em um misturador para assim isolar a proteína Raf-1, e então uma análise western blot foi realizada da mesma maneira que no Exemplo 1 (3) com o uso de um anticorpo anti-ubiquitina (Santa Cruz). A modificação de fosforilação de Ser621, que está envolvida na inibição de degradação de proteassoma de Raf-1, foi investigada da mesma maneira com o uso de um anticorpo anti-p-Raf-1 (Ser621) (MILLIPORE).

(2) EFEITO DE INIBIDOR DE PROTEASSOMA NA EXPRESSÃO DE RAF-1 MEDIANTE KNOCKDOWN DE GST-n

[0135] A cultura de células M7609 e transfecção com siRNA de GST-π foram realizadas de acordo com os procedimentos do Exemplo 1 (1) e (2). No 2o dia após transfecção de siRNA de GST-π a cultura foi realizada por 16 horas em um meio livre de soro. Após tratamento com 5 μM de MG132 por 4 horas, um extrato celular foi coletado. Como um controle para o tratamento com MG132, o tratamento com DMSO 0,05% foi realizado da mesma maneira. O extrato celular assim obtido foi submetido à análise quantitativa de proteína com o uso de um Kit de Ensaio de Proteína Micro BCA (grupo tratado com mistura de siRNA-DMSO: 3,36 μg/μL, grupo tratado com mistura de siRNA-MG132: 3,16 μg/μL, grupo tratado com mistura de siRNA de -DMSO: 3,12 μg/μL, grupo tratado com mistura de siRNA de GST-π-MG132: 3,16 μg/μL). 20 μg do extrato celular foi submetido a SDS-PAGE, e então a análise western blot foi realizada da mesma maneira que no Exemplo 1 (3) com o uso de um anticorpo anti-p-Raf-1(Ser338) e um anticorpo anti-Raf-1.

(3) COIMUNOPRECIPITAÇÃO DE P-RAF-1 E GST-n

[0136] A cultura de células M7609 foi realizada de acordo com o procedimento do Exemplo 1 (1). Subsequentemente, após as células knockdown de GST-π obtidas pelo procedimento do Exemplo 1 (2) serem lavadas com PBS frio, um tampão frio de coimunoprecipitação (NP-40 0,5%, 50 mM de HEPES, 150 mM de NaCl, 1 mM de EGTA, 1,5 mM de MgCl2, Mini EDTA-livre completo, PhosSTOP, pH 7,5) foi adicionado, e a solubilização foi realizada por incubação por 30 min enquanto esfriando em gelo. A centrifugação foi realizada a 4 °C e 15000 rpm por 15 min, fornecendo assim um extrato celular. O extrato celular assim obtido foi submetido à análise quantitativa de proteína com o uso de um Kit de Ensaio de Proteína Micro BCA (12,1 μg/μL). 1 mg do extrato celular foi misturado com anticorpo anti-p-Raf-1 (Ser338) (US Biological) conjugado a Proteína G Dynabeads, e a incubação foi realizada a 4 °C por 16 horas misturando-se suavemente em um misturador, realizando assim coimunoprecipitação. Subsequentemente, uma análise western blot foi realizada com o uso de um anticorpo GST-π.

[0137] Os resultados são mostrados nas Figuras 3 a 5. Ficou claro a partir da Figura 3 que no grupo tratado com siRNA de GST-π a quantidade de ubiquitina coprecipitada com Raf-1 foi grande em comparação com o grupo tratado com mistura de siRNA, e ubiquitinação de Raf-1 foi aumentada. Além disso, pode-se observar a partir da Figura 4 que o proteassoma foi envolvido na redução da expressão de p-Raf-1 por siRNA de GST-π, e pode pode-se observar a partir da Figura 5 que GST-π estava ligado a p-Raf-1. Os resultados acima sugerem que a GST-π se liga a p-Raf-1 para assim inibir a sua ubiquitinação e, devido à supressão da GST-π, a ubiquitinação de p-Raf-1 é promovida, e a abundância de p-Raf-1 é reduzida.

EXEMPLO 3 ANÁLISE DE INDUÇÃO DE AUTOFAGIA E APOPTOSE POR KNOCKDOWN DE GST-n (1) ANÁLISE DE INDUÇÃO DE AUTOFAGIA POR COLORAÇÃO DE IMUNOFLUORESCÊNCIA

[0138] A indução de autofagia por knockdown de GST-π foi analisada por coloração de imunofluorescência com LC3, que é uma proteína marcadora específica de autofagia. As células knockdown de GST-π obtidas pelo procedimento do Exemplo 1 (2) foram plaqueadas sobre uma lamínula colocada em um prato plástico de cultura de tecido de modo a fornecer 1 x 105 células/2 mL. Depois que o meio foi aspirado, paraformaldeído 4% em PBS foi adicionado, e a incubação foi realizada em temperatura ambiente por 10 min, fixando assim as células. A permeabilização das células foi realizada com o uso de Triton 0,5% X-100 em PBS em gelo por 5 min. Após lavagem com PBS frio por 10 min, uma reação com anticorpo anti-LC3B (Invitrogen) diluído com BSA 1 % contendo PBS foi realizada dentro de uma câmara úmida a 37 °C por 1 hora. Uma reação de anticorpo secundário foi realizada com o uso de anticorpo de coelho marcado com Alexa Fluor488 (Invitrogen) a 37 °C por 1 hora. A montagem em uma lâmina de vidro foi realizada com o uso de reagente Prolong Gold antifade com DAPI, e a incubação foi realizada a 4 °C por 16 horas. A lavagem após a reação com o anticorpo foi realizada três vezes com o uso de PBS a 37 °C por 5 min. As células positivas para autofagia no momento do exame com um microscópio de fluorescência foram definidas como células tendo um sinal LC3 similar a uma mancha presente no citoplasma.

(2) ANÁLISE DE INDUÇÃO DE AUTOFAGIA POR WESTERN BLOTTING

[0139] A indução de autofagia em células knockdown de GST-π foi ainda analisada por uma análise western blot de LC3. As células knockdown de GST-π obtidas pelo procedimento do Exemplo 1 (2) foram plaqueadas em uma lamínula colocada em um prato plástico de cultura de tecido de modo a fornecer 1 x 105 células/2 mL. Após incubação por um tempo pré-determinado, um extrato celular foi coletado e foi submetido a uma análise western blot. Uma reação com uma membrana de transferência foi realizada a 4 °C por 16 horas com o uso de anticorpo anti-LC3B (SIGMA) como um anticorpo primário. A detecção de moléculas LC3 foi realizada com o uso de um reagente quimioluminescente após uma reação com anticorpo secundário marcado com HRP. Se a autofagia foi ou não induzida foi avaliado por uma mudança de LC3 do tipo I (18 kDa) ao tipo II (16 kDa).

(3) ANÁLISE DE INDUÇÃO DE AUTOFAGIA POR EXAME COM MICROSCÓPIO ELETRÔNICO

[0140] No 1o dia após transfecção de siRNA no Exemplo 1 (2), as células foram plaqueadas sobre uma placa de cultura com 8 poços para cultura de tecido a fim de fornecer 0,4 x 105 células/0,5 mL. A fixação foi realizada com o uso de glutaraldeído 2,5% em tampão de ácido cacodílico 0,1 M (pH 7,4) por 1 hora, e após o enxágue com tampão de ácido cocadílico 0,1 M a pós fixação foi realizada com o uso de OsO4 e 1,5% ferrocianida de potássio 1,5% por 2 horas. Após desidratação ser realizada três vezes com etanol por 10 min, a incorporação em uma resina epóxi (TAAB Laboratories Equipment) foi realizada. Um corte ultrafino foi preparado com o uso de uma faca de diamante, a coloração eletrônica foi realizada com o uso de acetato de uracila e citrato de chumbo e o corte foi examinado com o uso de microscopia eletrônica (Hitachi Transmission Electron Microscope H-7500, Hitachi High-Technologies Corporation).

(4) ANÁLISE DE INDUÇÃO DE APOPTOSE POR COLORAÇÃO TUNEL

[0141] Um método de TUNEL foi realizado como segue com o uso de um Kit de Detecção de Morte Celular In Situ, POD (Roche). As células knockdown de GST-π obtidas pelo procedimento do Exemplo 1 (2) foram plaqueadas em uma lamínula colocada em um prato plástico de cultura de tecido de modo a fornecer 1 x 105 células/2 mL. Depois que o meio foi aspirado, paraformaldeído 4% em PBS foi adicionado, e a incubação foi realizada em temperatura ambiente por 60 min, fixando assim as células. Para realizar o bloqueio de peroxidase endógeno, a incubação foi realizada com H2O2 3% em metanol à temperatura ambiente por 10 min. Subsequentemente, a permeabilização de células foi realizada por tratamento com Triton X-100 0,1% em citrato de sódio 0,1% no gelo por 2 min. A reação de TUNEL foi realizada em uma câmara úmida a 37 °C por 60 min. A detecção de células positivas para TUNEL foi realizada por uma reação de coloração com o uso de um substrato DAB após reação com anticorpo anti-fluoresceína marcado com peroxidase a 37 °C por 30 min. A contracoloração foi realizada com o uso de hematoxilina, as células coradas foram examinadas com microscopia óptica, e as células positivas para TUNEL foram avaliadas como células apoptóticas. A lavagem entre as operações foi realizada por enxágue com PBS.

[0142] Os resultados são mostrados nas Figuras 6 a 10. A Figura 6 é uma imagem de imunofluorescência com anticorpo anti-LC3, e foi observado nas células mostradas por flechas um sinal similar a manchas mostrando LC3. Visto que este sinal similar a mancha de LC3 poderia ser autofagossomo, pode-se observar que as células knockdown de GST-π a autofagia foi induzida.

[0143] A Figura 7 mostra imagens de exame de microscopia eletrônica das células KD de GST-π 2 dias após transfecção de siRNA de GST-π. A imagem da direita é uma ampliação da parte A cercada por um quadrado na imagem da esquerda. Na imagem da direita, pode-se observar que nas partes mostradas por flechas, foi formado autofagossomo a fim de cercar a mitocôndria.

[0144] A Figura 8 mostra os resultados de western blotting de LC3. Há dois tipos de proteína LC3 que são reconhecidos por um anticorpo anti-LC3. Quando ocorre autofagia e LC3 é incorporada em uma membrana lipídica dupla, LC3 muda de tipo I para tipo II. Portanto, é possível confirmar se a autofagia foi ou não induzida a partir de uma alteração na quantidade de LC3 tipo II detectada. A partir do resultado da Figura 8, pode-se observar que no grupo tratado com siRNA de GST-π, a expressão de ambos, LC3 tipo I e II, foi induzido e tipo II notadamente foi aumentado, enquanto no grupo tratado com mistura de siRNA, a expressão foi baixa para ambos, tipo I e tipo II, e o nível de expressão de tipo I foi menor que do tipo II.

[0145] A partir desses resultados, pode-se observar que a autofagia é induzida pela supressão da expressão de GST-π.

[0146] A Figura 9 mostra os resultados de coloração de TUNEL. A linha superior mostra imagens do grupo tratado com mistura de siRNA, a linha inferior mostra imagens do grupo tratado com siRNA de GST-π; nas células knockdown de GST-π, as células positivas para TUNEL, isso é, a apoptose, foi observada.

[0147] A Figura 10 é um gráfico mostrando alteração ao longo do tempo das proporções de células positivas para autofagia e células positivas para apoptose no grupo tratado com siRNA GST-π e no grupo tratado com siRNA de GST-π. A proporção de células positivas para autofagia denota a proporção de células que têm um sinal de LC3 similar à mancha por 500 células no experimento de coloração de imunofluorescência com o uso do anticorpo anti-LC3 em (1) acima, e a proporção de células positivas para apoptose denota a proporção de células positivas para TUNEL por 1000 células no experimento de coloração TUNEL em (4) acima. Pode-se obsevar a partir disso que a proporção de células positivas para autofagia aumentou rapidamente após o tratamento, chegando ao máximo no 2° dia, e então diminuindo, enquanto que a proporção de células positivas para apoptose gradualmente, mas continuou aumentando até o 4o dia.

EXEMPLO 4 EFEITO KNOCKOUT DE GST-n NA CASCATA DE SINAL DE EGFR/PI3K/AKT/MTOR (1) ANÁLISE WESTERN BLOT DE SINAL DE EGFR/PI3K/AKT/MTOR

[0148] A expressão de cada proteína que constitui a cascata de sinal de EGFR/PI3K/Akt/mTOR foi analisada da mesma maneira que no Exemplo 1 (1), (2) e (4), exceto que como anticorpos primários, anticorpo anti-p-EGFR (Tyr1068) (Cell Signaling), anticorpo anti-EGFR (Santa Cruz), anticorpo anti-p-PI3K p85 (Tyr458)/p55 (Tyr199) (Cell Signaling), anticorpo anti-PI3K, p85 (MILLIPORE), anticorpo anti-p-Akt (Ser473) (Cell Signaling), anticorpo anti-Akt (Cell Signaling), anticorpo anti-p-p70S6K (Thr389) (Cell Signaling), anticorpo anti-p-p70S6K (Thr421/Ser424) (Cell Signaling), e anticorpo anti-p70S6K (Cell Signaling) foram usados.

(2) EFEITO DE INIBIDOR DE PROTEASSOMA NA EXPRESSÃO DE P-EGFR MEDIANTE KNOCKDOWN DE GST-n

[0149] A cultura de células M7609 e transfecção com siRNA de GST-π foram realizadas de acordo com os procedimentos do Exemplo 1 (1) e (2). No 2o dia após transfecção de siRNA de GST-π, as células foram cultivadas em meio livre de soro por 16 horas. Após tratamento com 5 μM de MG132 por 2 horas, um extrato celular foi coletado. Como um controle para o tratamento com MG132, o tratamento com DMSO 0,05% foi realizado da mesma maneira. O extrato celular assim obtido foi submetido à análise quantitativa de proteína com o uso de um Kit de Ensaio de Proteína Micro BCA (grupo tratado com mistura de siRNA-DMSO: 11,98 μg/μL, grupo tratado com mistura de siRNA-MG132: 12,29 μg/μL, grupo tratado com mistura de siRNA-DMSO: 8,91 μg/μL, grupo tratado com mistura de siRNA de GST-π-MG132: 9,24 μg/μL). Depois que 80 μg do extrato celular foi submetido a SDS-PAGE, uma análise western blot foi realizada com o uso de anticorpo anti-p-EGFR (Tyr1068) e anticorpo anti-EGFR.

(3) COIMUNOPRECIPITAÇÃO DE P-EGFR E GST-n

[0150] A cultura de células M7609 foi realizada de acordo com o procedimento do Exemplo 1 (1). Subsequentemente, após as células serem lavadas com PBS frio, um tampão frio de coimunoprecipitação (Triton X-100 1,0%, 50 mM de Tris-HCl, 150 mM de NaCl, Mini livre de EDTA completo, PhosSTOP, pH 7.5) foi adicionado, e a solubilização foi realizada por incubação por 30 min enquanto esfriando em gelo. A centrifugação foi realizada a 4 °C e 12000 rpm por 10 min, fornecendo assim um extrato celular. O extrato celular assim obtido foi submetido à análise quantitativa de proteína com o uso de um Kit de Ensaio de Proteína Micro BCA (9,08 μg/μL). 1 mg do extrato celular foi misturado com anticorpo anti-p-EGFR (Tyr1068) (Calbiochem) conjugado a Proteína G Dynabeads, e a coimunoprecipitação foi realizada por incubação em um misturador a 4 °C por 16 horas enquanto misturando suavemente. Subsequentemente, uma análise western blot foi realizada com o uso de um anticorpo GST-π.

[0151] Os resultados são mostrados nas Figuras 11 a 13. A Figura 11 mostra que no grupo tratado com siRNA de GST-π a fosforilação de cada proteína constituinte da cascata de sinal de EGFR/PI3K/Akt/mTOR foi reduzida, em comparação com o grupo tratado com mistura de siRNA, a Figura 12 mostra que o proteassoma está envolvido na redução da expressão de p-EGFR por siRNA de GST-π, e a Figura 3 mostra que GST-π está ligado a p-EGFR. Os resultados acima sugerem que GST-π se liga a p-EGFR para assim contribuir com a estabilização do mesmo, a ubiquitinação de p-EGFR é promovida pela supressão de GST-π, e a abundância de p-EGFR diminui.

EXEMPLO 5 EFEITO DE INIBIDOR DE GST-n NA PROLIFERAÇÃO CELULAR, ETC. (1) EFEITO DE INIBIDOR DE GST-n NA FOSFORILAÇÃO DE EGFR E RAF-1

[0152] A cultura de células M7609 foi realizada de acordo com o procedimento do Exemplo 1 (1). As células foram plaqueadas em um prato plástico de cultura de tecido de 60 mm a fim de fornecer 105 células/5 mL. C16C2 inibidor de GST-π (preparado por Teijin Pharma Limitou por solicitação) foi adicionado a fim de fornecer 10, 50 e 100 μM, e depois de 24 horas um extrato celular foi coletado. O extrato celular assim obtido foi submetido à análise quantitativa de proteína com o uso de um Kit de Ensaio de Proteína Micro BCA (não tratado: 8,5 μg/μL, 10 μL: 8,49 μg/μL, 50 μM: 7,68 μg/μL, 100 μM: 6,4 μg/μL). 50 μg do extrato celular foi submetido a SDS-PAGE, e expressão de cada proteína foi então analisada pelo método western blotting.

(2) EFEITO DE INIBIDOR DE GST-n NA PROLIFERAÇÃO CELULAR, ETC.

[0153] A cultura de células M7609 foi realizada de acordo com o procedimento do Exemplo 1 (1). As células foram plaqueadas em um prato plástico de cultura de tecido de 60 mm a fim de fornecer 1,0 x 105 células/5 mL. Após 16 horas, o inibidor de GST-π foi adicionado a fim de fornecer 50 μM. A conta total de células no prato foi medida com o uso de um hemocitômetro até o 2o dia. Como um controle para o inibidor de GST-π, o tratamento com DMSO 0,05% foi realizado.

[0154] Os resultados são mostrados nas Figuras 14 e 15. Tornou-se claro a partir destes resultados que o inibidor de GST-π também poderia suprimir a fosforilação de EGFR e Raf-1 (Figura 14) e a proliferação celular (Figura 15) da mesma maneira que com o knockdown de GST-π.

EXEMPLO 6 EFEITO DE INIBIDOR DE AUTOFAGIA NAS CÉLULAS KNOCKDOWN DE GST (1) CULTURA CELULAR

[0155] A transfecção de siRNA de GST-π foi realizada de acordo com os procedimentos do Exemplo 1 (2), o meio foi então substituído por um meio livre de antibiótico, e a incubação foi realizada por 3 horas. As células foram plaqueadas sobre uma lamínula colocada em um prato plástico de cultura de tecido, o inibidor de autofagia 3-metil adenina (3-MA, SIGMA) foi adicionado a fim de fornecer 1 ou 5 mM, e em seguida este cultivo foi realizado por um tempo pré-determinado.

(2) AVALIAÇÃO DE CÉLULAS POSITIVAS PARA AUTOFAGIA

[0156] As células cultivadas em (1) foram submetidas à coloração de imunofluorescência com o uso de anticorpo anti-LC3 da mesma maneira que no Exemplo 3 (1).

(3) COLORAÇÃO TUNEL

[0157] As células cultivadas em (1) foram submetidas à coloração TUNEL da mesma maneira que no Exemplo 3 (4).

[0158] Os resultados são mostrados nas Figuras 16 a 18. A Figura 16 mostra a proporção de células positivas para autofagia por 1000 células em cada grupo, e pode-se observar que a proporção de células positiva para autofagia notadamente diminuiu pelo inibidor de autofagia. Na Figura 17, a linha superior mostra o grupo tratado com siRNA de GST-π + 1 mM de 3-MA e a linha inferior mostra o grupo tratado com siRNA de GST-π + 5 mM de 3-MA. Pode-se observar a partir das Figuras 9 e Figura 17 que as células positivas para apoptose aumentaram acentuadamente devido ao uso de um inibidor de autofagia em combinação. A Figura 18 é um gráfico mostrando que a apoptose foi ainda induzida por inibidor de autofagia de uma maneira dependente de dose. A apoptose foi induzida pela adição de siRNA de GST-π, mas quando de 3-MA, que é um inibidor de autofagia, foi ainda adicionado, a apoptose foi ainda induzida dependente da dose adicional de 3-MA. Portanto, tornou-se claro que a apoptose pode ser induzida mais eficientemente pela combinação de uma droga que suprime GST-π e uma droga que suprime autofagia.

Claims

1. USO DE UM AGENTE que compreende como ingredientes ativos uma droga que suprime GST-π e uma droga que suprime autofagia, caracterizado por ser na fabricação de uma composição farmacêutica para o tratamento de câncer devido à superexpressão de GST-π e mutação de KRAS, em que a droga que suprime autofagia é um inibidor de PI3K, e em que o inibidor de PI3K é um inibidor de PI3K classe III.

2. USO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo inibidor de PI3K ser 3-metiladenina.

3. USO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo inibidor de PI3K ser selecionado a partir do grupo que consiste em uma molécula de RNAi, ribozima, ácido nucleico antisense, polinucleotídeo quimera de DNA/RNA e um vetor que expressa o mesmo.

4. USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pela droga que suprime GST-π ser selecionada a partir do grupo que consiste em uma molécula de RNAi, ribozima, ácido nucleico antisense, polinucleotídeo quimera de DNA/RNA e um vetor que expressa o mesmo.