CN103619355A - 细胞凋亡诱导剂 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及GST-π及其抑制剂的新用途、以及含有抑制GST-π的药物和抑制自噬的药物作为活性成分的用于诱导细胞凋亡的药剂、含有该药剂的医药组合物、使用了该组合物的伴随着细胞凋亡异常的疾病的处置方法等。
Description
技术领域
本发明涉及GST-π及其抑制剂的新用途、新型的细胞凋亡诱导剂、含有该细胞凋亡诱导剂的医药组合物及伴随着细胞凋亡异常的疾病的新治疗方法。
背景技术
癌是人类所面对的最重要且最难对付的疾病之一，为了对其进行治疗进行了大量的研究努力。癌是由于基因的突变或表基因的异常等而使细胞失去控制地进行增殖的疾病。关于癌的基因异常已有很多报告（例如Futrealet al.，Nat Rev Cancer.2004；4（3）：177-83等），其中很多被认为与细胞的增殖、分化、生存相关的信号传递有某些关联。另外，由于相关的基因异常，由正常分子构成的细胞内的信号传递发生异常，由此导致特定的信号级联的活化或灭活，最终有时会成为引起细胞异常增殖的一个因素。初期的癌治疗主要着眼于对细胞增殖本身的抑制，但由于该治疗也生理性地抑制正常增殖的细胞的增殖，因此会伴随着脱发、消化系统疾病、骨髄抑制等副作用。因此，为了抑制所述副作用，基于以癌特有的基因异常或信号传递异常为靶的分子靶向药等的新想法的癌治疗药的开发不断进展。
作为癌特有的基因异常，熟知的有KRAS（V-Ki-ras2Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因同源物，V-Ki-ras2Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog）的异常。KRAS为位于EGFR、PDGFR等酪氨酸激酶型受体的下游的低分子量GTP结合蛋白（也称为低分子量G蛋白），其担负着将来自这些受体的增殖或分化相关的信号向下游的MAPK级联传递的任务。正常的KRAS在通过配体结合而活化的受体的酪氨酸激酶活性的作用下介由Grb2及SOS而被活化，将Raf等MAPK磷酸化，从而驱动MAPK级联，但变异型KRAS即使没有受到来自受体的刺激也稳定地活化而持续地传递增殖信号。认为因此而发生异常的细胞增殖。
另一方面，作为催化谷胱甘肽结合的酶之一的谷胱甘肽-S-转移酶（GST）、特别是GST-π（glutathione S-transferase pi，也称为GSTP1）的表达在各种癌细胞中增加，表明其可能是对部分抗癌剂产生抗性的一个原因。实际上已知，当使针对GST-π的反义DNA或GST-π抑制剂作用于过量表达GST-π并显示药物抗性的癌细胞系时，药剂抗性得到抑制（Takahashi andNiitsu，Gan To Kagaku Ryoho.1994；21（7）：945-51；Ban et al.，Cancer Res.1996；56（15）：3577-82；Nakajima et al.，J Pharmacol Exp Ther.2003；306（3）：861-9）。此外，最近的报告中报告了，当使针对GST-π的siRNA作用于过量表达GST-π的雄激素非依赖性前列腺癌细胞系时，其增殖得到抑制，细胞凋亡增加（Hokaiwado et al.，Carcinogenesis.2008；29（6）：1134-8）。另外还启示，人结肠癌中，KRAS的变异通过AP-1的活化来诱导GST-π的过量表达（Miyanishi et al.，Gastroenterology.2001；121（4）：865-74）。
但是，关于GST-π与细胞增殖或细胞凋亡之间的关系、GST-π的分子机理、GST-π在各种细胞内信号传递中的作用等还几乎未弄清楚。细胞内的信号传递极其复杂，不仅常有1种分子影响多种分子的作用、或相反1种分子受到多种分子的影响的情况，而且常有即使抑制了某种分子的作用，其它的信号级联也活化，从而无法获得期望效果的情况。因此，为了开发更为优异的分子靶向药，需要弄清楚复杂地交织在一起的细胞的信号传递机理，尽管经过了多年研究也不过弄清楚了其中的极小一部分，因此还需要进一步的研究努力。
发明内容
发明要解决的课题
本发明的目的在于提供GST-π或其抑制剂的新用途、以及用于在细胞内有效诱导细胞凋亡的组合物及使用该组合物的方法。
用于解决课题的手段
本发明者们为了弄清楚GST-π的分子机理不断地进行刻苦研究，结果不仅发现了当抑制GST-π的表达时，Raf-1、MEK及ERK的活化得到显著抑制、和同样地在通过G蛋白共轭型受体或酪氨酸激酶型受体的活化而活化的PI3K（Phosphoinositide3-kinase）信号级联中也引起信号传递抑制，而且弄清楚了由于GST-π的表达抑制而发生细胞凋亡，由此也快速诱导自噬。并且，进一步继续研究的结果还发现，通过在抑制GST-π的同时抑制自噬，能够高效率地诱导细胞发生细胞凋亡，从而完成了本发明。
即本发明涉及以下内容。
（1）一种用于诱导细胞凋亡的药剂，其含有抑制GST-π的药物和抑制自噬的药物作为活性成分。
（2）一种用于诱导GST-π得到抑制的细胞发生细胞凋亡的药剂，其含有抑制自噬的药物作为活性成分。
（3）根据上述（1）或（2）所述的药剂，其用于诱导具有变异型KRAS的细胞发生细胞凋亡。
（4）根据上述（1）～（3）中任一项所述的药剂，其中，活性成分选自由RNAi分子、核酶、反义核酸、DNA/RNA嵌合多核苷酸及表达它们的载体组成的组。
（5）一种医药组合物，其含有上述（1）～（4）中任一项所述的药剂。
（6）根据上述（5）所述的医药组合物，其用于治疗细胞的异常增殖所引起的疾病。
（7）根据上述（5）所述的医药组合物，其用于治疗KRAS的变异所引起的疾病。
（8）根据上述（5）所述的医药组合物，其用于治疗癌。
（9）一种用于促进PI3K/Akt/mTOR信号级联和/或RAS/Raf/MAPK信号级联的药剂，其含有GST-π和/或其功能性突变体作为活性成分。
（10）一种用于抑制PI3K/Akt/mTOR信号级联和/或RAS/Raf/MAPK信号级联的药剂，其含有抑制GST-π的药物作为活性成分。
（11）一种用于抑制泛素化的药剂，其含有GST-π和/或其功能性突变体作为活性成分。
（12）一种用于促进泛素化的药剂，其含有抑制GST-π的药物作为活性成分。
（13）一种用于抑制自噬的药剂，其含有GST-π和/或其功能性突变体作为活性成分。
（14）一种用于促进自噬的药剂，其含有抑制GST-π的药物作为活性成分。
发明效果
由于本发明的细胞凋亡诱导剂与以往的药剂相比能够更有效地诱导细胞凋亡，因此制成医药组合物后的效果也高。特别是在癌的治疗中，由于能够利用细胞凋亡杀死癌细胞，因此不仅阻止癌的进展，而且还能够期待使癌退缩的效果。另外，由于能够以比以往的制剂低的用量发挥与以往同等的效果，因此还能够减轻副作用。
另外，通过本发明还弄清楚了GST-π的分子机理，发现了GST-π或其抑制剂的新用途。其为疾病的处置、实验方法等提供了新的选择，不仅在医疗、兽医疗方面，而且在生物学、生化学、分子生物学等方面也可期待有较大贡献。
附图说明
图1的a）为表示在GST-πsiRNA作用下GST-π的表达被特异性抑制的情况的蛋白免疫印迹（Western blotting）的结果。图1的b）为表示在GST-πsiRNA转染后第1～4天时的细胞数及GST-π的表达量的变化的图。
图2为表示GST-πsiRNA转染后第2天时的RAS/Raf/MAPK信号级联相关蛋白的表达的情况的蛋白免疫印迹的结果。可知伴随着GST-π的表达抑制，Raf蛋白的表达量减少，进而MEK、ERK等MAPK的磷酸化得到抑制。
图3表示Raf蛋白的免疫沈降实验的结果。可知在GST-πsiRNA处理组中，Raf蛋白及Ser621磷酸化Raf蛋白（p-Raf-1（S621））的表达有些许减少，相反经泛素化的Raf蛋白增加。
图4为对将GST-πsiRNA转染子及Scramble siRNA转染子用蛋白酶体抑制剂MG132及作为阴性对照的DMSO处理时的Raf蛋白的存在量进行比较的图。GST-πsiRNA转染子通过用蛋白酶体抑制剂进行处理，观察到磷酸化Raf蛋白（p-Raf-1（S338））的存在量增加，但在Scramble siRNA中未见变化。即，该情况启示通过抑制GST-π的表达，磷酸化Raf蛋白在蛋白酶体作用下发生分解，其也与图3中的泛素化Raf蛋白的增加相吻合。
图5表示Raf蛋白与GST-π的共免疫沈降实验的结果。在用抗p-Raf-1抗体沈降了的蛋白中显示与抗GST-π抗体反应，因此启示p-Raf-1与GST-π形成了复合物。
图6表示GST-π敲除细胞的免疫荧光染色图像。上一行为利用抗LC3抗体时的染色图像，下一行为DAPI染色图像。上一行从左起分别为转染后第1天、第2天、第3天的染色图像，下一行从左起分别为转染后第4天、第5天的染色图像。在图中用箭头表示的细胞中观察到考虑是自噬体的点状信号，推测自噬得到诱导。
图7表示GST-πsiRNA转染后经过2天时的GST-π敲除细胞的电子显微镜图像。左图中，N表示核、用四边形围住的A部分的放大图像在右图。右图中，M表示线粒体、L表示溶酶体。在用箭头表示的部分中观察到以包围线粒体的方式形成了自噬体。
图8表示使用了抗LC3抗体的GST-π敲除（KD）细胞提取液的蛋白免疫印迹（Western blot）的结果。GST-πKD细胞（GST-πsiRNA）中观察到与对照（Scramble siRNA）相比，LC3的表达显著增加。特别是II型的LC3（LC3-II）大量增加，由此推测诱导产生了自噬体。
图9表示TUNEL染色的结果。上一行为对照组的图像，下一行为GST-πKD细胞组的图像。从左起分别表示转染后第3天、第4天、第5天的染色图像。GST-πKD细胞组中观察到TUNEL阳性细胞。
图10为表示GST-πKD细胞组和对照细胞组在siRNA转染后经过1～4天时、自噬阳性细胞及细胞凋亡阳性细胞的比例的经时变化的图（上）、和表示GST-πKD细胞的GST-π的表达量的图（下）。显示对照组中几乎未观察到自噬或细胞凋亡，而GST-πKD组中首先自噬阳性细胞在第2天达到峰值地急增、然后诱导了细胞凋亡。
图11表示GST-πKD细胞的EGFR/PI3K/Akt/mTOR信号相关的蛋白的蛋白免疫印迹的结果。可知在GST-πKD细胞组中EGFR、PI3K及Akt的磷酸化被显著抑制。
图12为表示用蛋白酶体抑制剂MG132处理GST-πKD细胞时的磷酸化EGFR（p-EGFR）的表达量的变化的蛋白免疫印迹的结果。GST-πKD细胞中的p-EGFR的表达量降低通过蛋白酶体抑制剂处理而恢复，由此推测p-EGFR的表达量降低是由于蛋白酶体作用下的分解所引起的。
图13为使用抗p-EGFR对共免疫沈降了的蛋白进行蛋白免疫印迹的结果。在抗GST-π抗体中观察到了信号，由此推测p-EGFR与GST-π发生相互作用。
图14为对使用了GST-π抑制剂C16C2时的Raf蛋白及EGFR的表达水平的变化抑制剂浓度依赖性地进行观察的结果。使用了GST-π抑制剂时，与GST-π敲除的情况相同地观察到EGFR、Raf蛋白的磷酸化得到抑制。
图15为表示添加了GST-π抑制剂C16C2时的细胞数的变化的曲线图。可知添加了GST-π抑制剂时，细胞数几乎没有增加。
图16为表示Scramble siRNA处理组、GST-πKD组及GST-πKD+3MA组的自噬阳性细胞的比例的曲线图。可知通过GST-π敲除而增加的自噬被3-MA抑制。
图17表示向GST-πKD细胞添加3-MA时的TUNEL染色图像。上一行为添加了1mM的3-MA的情况，下一行为添加了5mM的3-MA的情况。从左起分别表示转染后第2天、第3天、第4天的染色图像。3-MA的添加量多者，更多地观察到细胞凋亡细胞。
图18为表示经时观察对照细胞组（Scramble siRNA）、GST-πKD细胞组（GST-πsiRNA）、GST-πKD细胞+1mM3-MA组（GST-πsiRNA+1mM3-MA）及GST-πKD细胞+5mM3-MA组（GST-πsiRNA+5mM3-MA）的细胞凋亡的比例的结果的曲线图。可知，3-MA的用量依赖性地进一步诱导了细胞凋亡。
具体实施方式
本发明涉及一种用于诱导细胞凋亡的药剂或组合物（以下也称为“细胞凋亡诱导剂”或“细胞凋亡诱导组合物”），其含有抑制GST-π的药物和抑制自噬的药物作为活性成分。
在本说明书中使用的情况下，GST-π是指由GSTP1基因编码的对谷胱甘肽结合（glutathione conjugation）进行催化的酶。GST-π存在于包括人在内的各种动物，其序列信息也是公知的（例如人：NP_000843（NM_000852）、大鼠：NP_036709（NM_012577）、小鼠：NP_038569（NM_013541）等。编号表示NCBI数据库的登录号，括号外为氨基酸序列的编号、括号内为碱基序列的编号）。
由于生物个体间有可能发生不影响蛋白的生理学功能的基因序列或氨基酸序列的变异，因此本发明中的GST-π或GSTP1基因不限于与上述的公知序列具有相同序列的蛋白或核酸，可具有相对于该序列有1个或2个以上、典型地有1个或多个、例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个不同氨基酸或碱基的序列，另外可以包含与上述公知的GST-π具有同等功能的序列。关于GST-π的具体功能，如后所述。
需要说明的是，本说明书中，“在本说明书中使用的情况下”、“本说明书中使用的”、“本说明书中”、“本说明书中记载的”等表述只要没有特别说明，表示其后的记载适用于本说明书中记载的全部发明。另外，只要没有另外地定义，本说明书中使用的全部技术用语及科学用语具有与本领域技术人员通常理解的相同的含义。本说明书中参照的全部专利、公报及其它出版物它们全部引用到本说明书中。
对本说明书中使用的“抑制GST-π的药物”没有限定，例如包括抑制GST-π的产生和/或活性的药物、促进GST-π的分解和/或灭活的药物等。作为抑制GST-π的产生的药物，对其没有限定，可列举出例如针对编码GST-π的DNA的RNAi分子、核酶、反义核酸、DNA/RNA嵌合多核苷酸及表达它们的载体等。
作为抑制GST-π的活性的药物，对其没有限定，可列举出例如与GST-π结合的物质、例如谷胱甘肽、谷胱甘肽类似物（例如WO95/08563、WO96/40205、WO99/54346、上述Nakajima et al.，2003等中记载的物质）、酮洛芬（上述Takahashi and Niitsu，1994）、吲哚美辛（Hall et al.，Cancer Res.1989；49（22）：6265-8）、依他尼酸、伊洛前列素（iloprost）（Tew et al.，Cancer Res.1988；48（13）：3622-5）、抗GST-π抗体、GST-π的显性失活突变体等。这些药物可从市售获得，也可基于公知的技术适当制造。
作为抑制GST-π的产生或活性的药物，从特异性高、副作用的可能性低出发，优选针对编码GST-π的DNA的RNAi分子、核酶、反义核酸、DNA/RNA嵌合多核苷酸及表达它们的载体。
GST-π的抑制与不使GST-π抑制剂发挥作用的情况相比，可通过细胞中GST-π的表达、活性受到抑制来确定。GST-π的表达可通过已知的任意方法来进行评价，没有限定，例如利用了抗GST-π抗体的免疫沈降法、EIA、ELISA、IRA、IRMA、蛋白免疫印迹法、免疫组化法、免疫细胞化学法、流式细胞法、利用了与编码GST-π的核酸或其独特的片段或该核酸的转录产物（例如mRNA）或剪接（splicing）产物特异性地杂交的核酸的、各种杂交反应法、Northern blot法、Southern blot法、各种PCR法等。
另外，GST-π的活性可以通过采用已知的任意方法、例如免疫沈降法、蛋白免疫印迹法、质量分析法、拉下法（pull-down method）、表面等离体激元共振（SPR）法等对GST-π的已知活性、没有限定、例如与Raf-1（特别是磷酸化Raf-1）、EGFR（特别是磷酸化EGFR）等蛋白的结合性等进行分析来评价。
在本说明书中使用的情况下，RNAi分子是指引起RNA干扰的任意分子，没有限定，包括siRNA（small interfering RNA）、miRNA（micro RNA）、shRNA（short hairpin RNA）、ddRNA（DNA-directed RNA）、piRNA（Piwi-interacting RNA）、rasiRNA（repeat associated siRNA）等双链RNA及它们的改性体等。这些RNAi分子可从市售获得，或基于公知的序列信息等进行设计、制作。
另外，在本说明书中使用的情况下，反义核酸包括RNA、DNA、PNA或它们的复合物。
在本说明书中使用的情况下，DNA/RNA嵌合多核苷酸，没有限定，包括例如日本特开2003-219893中记载的由抑制靶基因的表达的DNA和RNA构成的双链多核苷酸。
在本说明书中使用的情况下，自噬可包括巨自噬、微自噬、分子伴侣介导的自噬等，典型地是指巨自噬。因此，本发明中的“自噬”这一用语只要没有特别说明，是指“巨自噬”。
自噬是也被称为“自食”的细胞内蛋白分解机理之一，负责细胞内的蛋白分解、循环。自噬在包括酵母、哺乳动物在内的广泛的生物种中可见，大致伴随有包括（a）PAS（吞噬泡组装位置，phagophore assembly site）的形成、（b）将要分解的蛋白包围的吞噬泡（隔离膜）的伸长及增大、和由此的将要分解的蛋白内包的自噬体的形成、（c）通过自噬体与溶酶体的融合的自溶酶体的形成、（d）自溶酶体内的蛋白的分解的一连串过程。
上述（a）～（c）的过程特别与自噬相关因子相关。自噬相关因子最初在酵母中进行研究，到目前为止被鉴定为以Atg1～27为代表的多种物质（Klionsky et al.，Dev Cell.2003；5（4）：539-45），但在哺乳动物中的研究也在进展，也鉴定了多种同源物，自噬的核分子机理也在逐渐变得清楚（Yang and Klionsky，CurrOpin Cell Biol.2010；22（2）：124-31）。
作为哺乳动物中的与自噬的核分子机理相关的自噬相关因子，可列举出例如与PAS的形成相关的VMP1、TP53INP2、mAtg9、ULK复合物（由ULK1、ULK2、mAtg13、FIP200构成）、PI3K复合物（由Beclin1、hVps34、p150、Ambra1、Atg14L构成的Atg14L复合物、及由Beclin1、hVps34、p150、Bif-1、UVRAG构成的UVRAG复合物）、与吞噬泡的伸长相关的LC3-II、Atg12-Atg5-Atg16L复合物等。
因此，作为抑制自噬的药物，没有限定，可列举出例如抑制包括上述因子在内的自噬相关因子的产生和/或活性的药物、促进自噬相关因子的分解和/或灭活的药物等。作为抑制自噬相关因子的产生的药物，可列举出针对编码自噬相关因子的DNA的RNAi分子、核酶、反义核酸、DNA/RNA嵌合多核苷酸及表达它们的载体等。
作为抑制自噬相关因子的活性的药物，对其没有限定，可列举出例如PI3K的抑制剂（例如渥曼青霉素等）、特别是Class III PI3K的抑制剂（例如3-MA（3-甲基腺嘌呤）等）、抑制自噬体与溶酶体的融合的物质（例如巴佛洛霉素A1等）、抑制自溶酶体中的蛋白分解的物质（例如氯喹、亮肽素等）、与自噬相关因子结合的物质（例如抗自噬相关因子的抗体等）、自噬相关因子的显性失活突变体等。这些药物可以从市售获得，也可以基于公知的技术适当制造。本发明的一个方式中，抑制自噬的药物不包括GST-π和/或其功能性突变体。
作为抑制自噬的药物，从特异性高、副作用低的角度出发，优选针对编码自噬相关因子的DNA的RNAi分子、核酶、反义核酸、DNA/RNA嵌合多核苷酸及表达它们的载体。
自噬的抑制可通过与不使本发明的自噬抑制剂发挥作用的情况相比，细胞中自噬得到抑制来确定。自噬的抑制可基于已知的任意方法，没有限定，例如利用电子显微镜法的自噬体的检测、自噬标记物（例如Atg5、Atg12、LC3、特别是LC3-II等）的检测等来进行评价。LC3-II，没有限定，可以例如用抗LC3-II特异性抗体检测，也可以在用电泳将试样分离后，使用与LC3-II或者与LC3-I和LC3-II这两者反应的抗体通过蛋白免疫印迹法等对分为与LC3-I不同的条带的LC3-II进行检测。另外，由于LC3-I散在于细胞质内，而LC3-II局部分布在隔离膜、自噬体、自溶酶体等自噬特有的结构中，因此也可以通过利用与LC3-II反应的抗体（包括与LC3-I和LC3-II这两者反应的抗体）的免疫染色等使其显现出来，将显示这些结构的点状信号的存在、数量作为自噬的指标。
抑制GST-π的药物与抑制自噬的药物可以包含在单一制剂中，也可以分别包含在2个以上的制剂中。后者的情况下，各制剂可同时给予，也可以隔开时间间隔地给予。在隔开时间间隔地给予的情况下，可以将含有抑制GST-π的药物的制剂在含有抑制自噬的药物的制剂之前给予，也可以在之后给予。
本发明还涉及一种用于诱导GST-π得到抑制的细胞发生细胞凋亡的药剂或组合物（以下也称为“细胞凋亡诱导剂”或“细胞凋亡诱导组合物”），其含有抑制自噬的药物作为活性成分。
在本说明书中使用的情况下，“GST-π得到抑制”包括例如在有GST-π表达的细胞中，GST-π得到抑制的状态。作为所述状态，可列举出例如将抑制GST-π的药物（例如上述的药物等）向有GST-π表达的细胞给予后的状态等。
某细胞中是否有GST-π表达可以是文献学上已知的，或可以通过实际地对细胞的GST-π的表达进行检测来确定。GST-π的表达可以使用包括已在上文描述过的方法在内的已知的任意方法来进行检测。
本发明的药剂或组合物可以是用于诱导具有变异型KRAS的细胞发生细胞凋亡的药剂或组合物。
在本说明书中使用的情况下，作为变异型KRAS，没有限定，可列举出例如具有导致KRAS稳定地活化的变异的变异型KRAS，例如抑制内因性GTPase的变异、具有使鸟嘌呤核苷酸交换速度增加的变异等的变异型KRAS。作为所述变异的具体例子，没有限定，可列举出例如人KRAS的第12、13和/或61位氨基酸处的变异（抑制内因性GTPase）、人KRAS的第116和/或119位氨基酸处的变异（增加鸟嘌呤核苷酸交换速度）等（Bos，Cancer Res.1989；49（17）：4682-9；Levi et al.，Cancer Res.1991；51（13）：3497-502）。因此，本发明的一个方式中，关于变异型KRAS，可列举出人KRAS的第12、13、61、116、119位氨基酸中的至少一处具有变异的KRAS。本发明的一个方式中，变异型KRAS在人KRAS的第12位氨基酸处具有变异。另外，本发明的一个方式中，变异型KRAS还可以是诱导GST-π的过量表达的变异型KRAS。因此，具有变异型KRAS的细胞可以显示GST-π的过量表达。
变异型KRAS的检测可以使用已知的任意方法来进行。作为所述方法，没有限定，可列举出例如利用针对已知的变异序列的特异性核酸探针的选择性杂交反应、酶错配切割法、测序（上述Bos，1989）、PCR-RFLP法（上述Miyanishi et al.，2001）等。
另外，GST-π表达的检测还可以使用包括上述方法在内的已知的任意方法来进行。GST-π是否过量表达可通过例如将具有变异型KRAS的细胞中的GST-π的表达程度与具有正常的KRAS的同种细胞中的GST-π的表达程度进行比较等来评价。此时，当具有变异型KRAS的细胞中的GST-π的表达程度超过具有正常的KRAS的同种细胞中的GST-π的表达程度时，可以判断GST-π过量表达。
关于本发明的药剂或组合物中的活性成分的配合量，可以是当给予药剂或组合物时细胞凋亡得到诱导的量。另外，优选为不产生超过给予所带来的好处的不良影响的量。所述量可以是公知的，或者可以通过使用了培养细胞等的体外试验、或通过在小鼠、大鼠、狗或猪等动物模型中进行的试验来适当确定，这样的试验方法是本领域技术人员熟知的。细胞凋亡的诱导可通过各种已知的方法、例如检测DNA片段化、膜联蛋白V在细胞膜上的结合、线粒体膜电位的变化、胱天蛋白酶的活化等细胞凋亡特有的现象、或TUNEL染色等来进行评价。活性成分的配合量可以根据药剂或组合物的给药方式的不同而变化。例如，当1次给予中使用几个单位的组合物时，组合物1单位中配合的有效成分的量可以为1次给予所需要的有效成分的量的几分之一。所述配合量的调整是本领域技术人员能够适当进行的。
本发明还涉及制造用于诱导细胞凋亡的药剂或组合物的方法，其包含将抑制GST-π的药物和抑制自噬的药物作为活性成分进行配合；本发明还涉及抑制GST-π的药物及抑制自噬的药物在制造用于诱导细胞凋亡的药剂或组合物中的用途；本发明还涉及细胞凋亡诱导中使用的抑制GST-π的药物和抑制自噬的药物的组合；以及，本发明还涉及诱导细胞凋亡的方法，其包含给予有效量的抑制GST-π的药物及抑制自噬的药物。
本发明还涉及制造用于诱导GST-π得到抑制的细胞发生细胞凋亡的药剂或组合物的方法，其包含将抑制自噬的药物作为活性成分进行配合；本发明还涉及抑制自噬的药物在制造用于诱导GST-π得到抑制的细胞发生细胞凋亡的药剂或组合物中的用途；本发明还涉及诱导GST-π得到抑制的细胞发生细胞凋亡时使用的抑制自噬的药物；以及，本发明还涉及诱导GST-π得到抑制的细胞发生细胞凋亡的方法，其包含给予有效量的抑制自噬的药物。
关于上述制造方法或用途中的药物和/或其配合量如已在上文所述的。各药物的配合可以按照已知的任意方法来进行。
上述细胞凋亡诱导方法均可以是体外的方法，也可以是体内的方法。另外，关于该方法中的药物如已在上文所述的，药物的有效量可以是能够诱导给予的细胞发生细胞凋亡的量。另外，优选不产生超过给予所带来的好处的不良影响的量。该量可以是公知的，或可以通过使用了培养细胞等的体外试验等来适当确定，这样的试验方法是本领域技术人员熟知的。细胞凋亡的诱导可以通过包含上述方法在内的各种已知方法来进行评价。关于上述有效量，当将药物给予某细胞集团时，可以不必是诱导该细胞集团的全部细胞发生细胞凋亡的量。例如，上述有效量可以是诱导细胞集团中的细胞的1%以上、2%以上、3%以上、4%以上、5%以上、6%以上、8%以上、10%以上、12%以上、15%以上、20%以上、进而25%以上等发生细胞凋亡的量。
本发明的细胞凋亡诱导剂能够诱导细胞增殖存在异常的细胞等有效地发生细胞凋亡，作为医药组合物的成分是有效的。因此，本发明的一个方面包括含有本发明的细胞凋亡诱导剂的医药组合物。
本发明的医药组合物在处置细胞凋亡存在异常的疾病方面特别有效。因此，本发明的一个方式涉及用于处置细胞凋亡存在异常的疾病的医药组合物，其含有上述细胞凋亡诱导剂。在本说明书中使用的情况下，细胞凋亡存在异常的疾病，对其没有限定，包括例如细胞的异常增殖所引起的疾病、KRAS的变异所引起的疾病、GST-π的过量表达所引起的疾病等。作为细胞的异常增殖所引起的疾病，没有限定，包括例如良性或恶性肿瘤、增生、瘢痕疙瘩、Cushing’s综合征、原发性醛固酮增多症、红斑症、真性红细胞增多症、白斑症、增生性瘢痕、扁平苔癣及着色斑病等。作为KRAS的变异所引起的疾病，没有限定，包括例如良性或恶性肿瘤（也称为癌、恶性新生物）等。作为GST-π的过量表达所引起的疾病，没有限定，包括例如良性或恶性肿瘤、特别是药物抗性（例如对美法仑、环磷酰胺等烷化剂、阿霉素等蒽环类抗肿瘤性抗生素、顺铂等铂络合物、依托泊甙等产生抗性）的恶性肿瘤等。本发明的一个方式中，细胞凋亡存在异常的疾病为癌。
作为本发明中的癌，没有限定，可列举出例如纤维肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、脂肪肉瘤、横纹肌肉瘤、平滑肌肉瘤、血管肉瘤、kaposi肉瘤、淋巴管肉瘤、滑膜肉瘤、软骨肉瘤、骨肉瘤等肉瘤、脑肿瘤、头颈部癌、乳腺癌、肺癌、食道癌、胃癌、十二指肠癌、阑尾癌、结肠癌、直肠癌、肝癌、胰腺癌、胆嚢癌、胆管癌、肛门癌、肾癌、输尿管癌、膀胱癌、前列腺癌、阴茎癌、睾丸癌、子宫癌、卵巢癌、外阴癌、阴道癌、皮肤癌等肿瘤、以及白血病、恶性淋巴瘤等。需要说明的是，本发明中，“癌”包括上皮性恶性肿瘤及非上皮性恶性肿瘤。本发明中的癌可存在于身体的任意部位，例如脑、头颈部、胸部、四肢、肺、心脏、胸腺、食道、胃、小肠（十二指肠、空肠、回肠）、大肠（结肠、盲肠、阑尾、直肠）、肝脏、胰脏、胆嚢、肛门、肾、输尿管、膀胱、前列腺、阴茎、睾丸、子宫、卵巢、外阴、阴道、皮肤、横纹肌、平滑肌、滑膜、软骨、骨、甲状腺、肾上腺、腹膜、肠系膜、骨髄、血液、血管系统、淋巴结等淋巴系统、淋巴液等。
本发明的一个方式中，癌包含具有上述定义的变异型KRAS的癌细胞。本发明的一个方式中，癌包含显示激素或生长因子非依赖性的增殖的癌细胞。本发明的一个方式中，癌包含显示GST-π的过量表达的癌细胞。本发明的一个方式中，癌为药物抗性的。本发明的一个方式中，癌具有对选自由美法仑、环磷酰胺等烷化剂、阿霉素等蒽环类抗肿瘤性抗生素、顺铂等铂络合物、依托泊甙组成的组中的药物具有抗性。本发明的一个方式中，癌对选自由美法仑、环磷酰胺、阿霉素、顺铂、依托泊甙组成的组中的药物具有抗性。
本发明还涉及用于处置细胞凋亡存在异常的疾病的医药组合物，其含有抑制GST-π的药物及抑制自噬的药物作为活性成分；本发明还涉及用于处置细胞凋亡存在异常的疾病的医药组合物的制造方法，其包含将抑制GST-π的药物及抑制自噬的药物作为活性成分进行配合；本发明还涉及抑制GST-π的药物及抑制自噬的药物在制造用于处置细胞凋亡存在异常的疾病的医药组合物中的用途；本发明还涉及在处置细胞凋亡存在异常的疾病中使用的抑制GST-π的药物与抑制自噬的药物的组合；以及，以及本发明还涉及用于处置细胞凋亡存在异常的疾病的方法，其包含将所述医药组合物的有效量给予需要的对象。
上述制造方法或用途中的药物和/或配合量、细胞凋亡存在异常的疾病如已在上文所述的。另外，各药物的配合可以按照已知的任意方法来进行。
本发明者们这次弄清楚了GST-π通过分别与位于PI3K/Akt/mTOR信号级联上游的酪氨酸激酶型受体、特别是其磷酸化形态、以及作为RAS/Raf/MAPK信号级联的构成分子的Raf、特别是其磷酸化形态结合，阻止这些分子的泛素化，从而促进这些信号级联。因此，本发明还涉及用于促进PI3K/Akt/mTOR信号级联和/或RAS/Raf/MAPK信号级联的药剂或组合物（也称为“信号级联促进剂”或“信号级联促进组合物”），其含有GST-π和/或其功能性突变体作为活性成分。本发明的药剂或组合物特别是能够同时促进PI3K/Akt/mTOR信号级联及RAS/Raf/MAPK信号级联这两者。
作为本说明书中使用的“GST-π的功能性突变体”，没有限定，可列举出例如（i）GST-π的氨基酸序列上虽然具有1个或2个以上、典型地1个或多个变异、但与GST-π具有同等功能的突变体、（ii）由具有编码GST-π的基因的碱基序列的核酸、或者与该核酸编码同一多肽的核酸在碱基序列上具有1个或2个以上、典型地1个或多个变异的核酸编码、且与GST-π具有同等功能的突变体、（iii）由具有编码GST-π的基因的碱基序列的核酸、与该核酸编码同一多肽的核酸或者与编码（ii）的突变体的核酸的互补链、或其片段在严格条件下杂交的核酸编码、且与GST-π具有同等功能的突变体、（iv）具有与GST-π的氨基酸序列具有60%以上、优选70%以上、更优选80%以上、进一步优选90%以上、特别优选95%以上的同源性的氨基酸序列、且与GST-π具有同等功能的突变体、（v）由具有与编码GST-π的基因的碱基序列具有60%以上、优选70%以上、更优选80%以上、进一步优选90%以上、特别优选95%以上的同源性的核酸编码、且与GST-π具有同等功能的突变体等。
GST-π的氨基酸序列及编码GST-π的基因的碱基序列如上所述在各种动物中已知，本领域技术人员可以以这些序列信息为基础，通过已知的任意方法、例如化学合成、利用限制酶的核酸的剪切或插入、部位特异性变异导入、放射线或紫外线照射等来适当制作上述功能性突变体。
关于某突变体是否与GST-π具有同等功能，可通过采用已知的任意方法，例如免疫沈降法、蛋白免疫印迹法、质量分析法、拉下法、表面等离体激元共振（SPR）法等来分析GST-π的已知功能，没有限定，例如与Raf-1（特别是磷酸化Raf-1）、EGFR（特别是磷酸化EGFR）等蛋白的结合性等，并与合适的阴性对照、作为阳性对照的GST-π比较来进行评价。例如，某突变体中，在上述功能比阴性对照优异的情况下，例如当优异10%以上、25%以上、50%以上、75%以上、进而100%以上时，和/或当在该功能为GST-π的1/100以上、1/50以上、1/25以上、1/10以上、1/5以上、进而1/2以上时，该突变体包括在GST-π的功能性突变体中。
本说明书中使用的“严格条件”的用语是本技术领域公知的参数，记载在标准的协议集，例如Sambrook et al.，Molecular Cloning：A LaboratoryManual，3d ed.，Cold Spring Harbor Press（2001）、Ausubel et al.，CurrentProtocols in Molecular Biology，Greene Publishing Associates（1992）等中。
本发明的严格条件是指，例如使用65℃的、由3.5×SSC（0.15M氯化钠/0.15M柠檬酸钠、pH为7）、Ficoll0.02%、聚乙烯吡咯烷酮0.02%、牛血清白蛋白0.02%、NaH2PO425mM（pH为7）、SDS0.05%、EDTA2mM组成的杂交反应缓冲液的杂交反应。杂交反应后，DNA移动了的膜用2×SSC在室温中，接着用0.1～0.5×SSC/0.1×SDS在直至68℃的温度下洗涤。或者，严格杂交反应也可以使用ExpressHyb（R）杂交液（Clontech公司）等市售的杂交反应缓冲液，按照制造者所记载的杂交反应及洗涤条件进行。
虽然也存在达到产生同程度的严格性的结果的能够使用的其它条件、试剂等，但是由于本领域技术人员了解该条件，因此对此本说明书中没有特别记载。但是，也可以操作条件从而能够明确地确定编码GST-π的突变体的核酸。
本发明中的GST-π和/或其功能性突变体除了作为蛋白的GST-π、其功能性突变体以外，还包括编码GST-π的核酸、编码GST-π的功能性突变体的核酸。
在本说明书中使用的情况下、“信号级联”是指多个信号传递分子依次传递信号的信号传递。例如在“PI3K/Akt/mTOR信号级联”的情况下，按照首先PI3K被活化、由此接着Akt被活化、进而由此mTOR被活化的情形，信号被传递。这在其它的信号级联的表述中也同样。信号的上游与下游的关系中，活化的联系可以直接发生，也可以间接发生。例如PI3K所引起的Akt的活化中，已知中间存在称为PIP3（磷脂酰肌醇（3,4,5）三磷酸酯）或PDK1（磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1，也称为PDPK1）的分子。
PI3K/Akt/mTOR信号级联是由PI3K的活化所驱动的信号级联，其作为与细胞的生存等相关的信号是已知的。关于PI3K的活化，对其没有限定，例如通过配体与G蛋白共轭型受体或酪氨酸激酶型受体结合而发生活化，经活化的PI3K通过将肌醇磷脂磷酸化，产生例如PIP3等磷脂酰肌醇。其通过在PH区域与PDK1或Akt结合，从而促进这些蛋白局部分布于膜。PDK1通过与PIP3结合而在膜活化，经活化的PDK1将Akt的第308位的T磷酸化。Akt的第473位的丝氨酸被mTOR的复合物之一mTORC2磷酸化，通过这2处的氨基酸的磷酸化，Akt完全活化。
关于Akt活化mTOR的路径虽然尚未完全弄清楚，但考虑与PRAS40（proline-rich Akt/PKB substrate40kDa）相关。PRAS40如其名称所示为Akt的底物，认为其是与mTOR复合物结合后抑制其活化的分子，认为当Akt被活化时，PRAS40被磷酸化，由此PRAS40与mTOR复合物脱离，mTOR活化。并且，当mTOR活化时，将ULK1、ULK2（unc-51样激酶）以及mAtg13（mammalian autophagy-related13）磷酸化，通过抑制自噬信号的启动从而抑制自噬。
另一方面，RAS/Raf/MAPK信号级联是与细胞增殖等相关的信号级联。当例如生长因子等配体与G蛋白共轭型受体、酪氨酸激酶型受体结合时，属于低分子G蛋白的KRAS被活化、经活化的KRAS将Raf（一种MAPKKK）磷酸化并活化。经活化的Raf将MEK（MAPK/ERK激酶，一种MAP2K）活化，经活化的MEK将ERK（细胞外信号调节激酶，一种MAPK）活化。经活化的ERK向核内移动，促进各种mRNA的转录，从而引起细胞增殖。
本发明中，促进信号级联不仅是指提高信号级联的活化，也指抑制信号级联的灭活。信号级联是否得到促进可以通过与未使本发明的药剂或组合物发挥作用时相比、信号级联得到活化来确定。对于信号级联的活化，没有限定，例如可通过检测信号级联构成分子的活化（例如磷酸化等）、或者由信号级联的活化所引起的细胞现象、例如在PI3K/Akt/mTOR信号级联的情况下为自噬的抑制等、在RAS/Raf/MAPK信号级联的情况下为细胞的增殖等来进行评价。
本发明还涉及用于促进PI3K/Akt/mTOR信号级联和/或RAS/Raf/MAPK信号级联的药剂或组合物的制造方法，其包含将GST-π和/或其功能性突变体进行配合的工序；本发明还涉及GST-π和/或其功能性突变体在制造用于促进PI3K/Akt/mTOR信号级联和/或RAS/Raf/MAPK信号级联的药剂或组合物中的用途；本发明还涉及PI3K/Akt/mTOR信号级联和/或RAS/Raf/MAPK信号级联的促进中使用的GST-π和/或其功能性突变体；以及，本发明还涉及促进PI3K/Akt/mTOR信号级联和/或RAS/Raf/MAPK信号级联的方法，其包含给予有效量的GST-π和/或其功能性突变体。
本发明的用于促进信号级联的药剂或组合物对于处置PI3K/Akt/mTOR信号级联和/或RAS/Raf/MAPK信号级联的异常、特别是伴随着这些信号级联的抑制的疾病是有用的。作为所述疾病，没有限定，可列举出例如伴随着这些信号级联的构成分子的表达、活性抑制和/或分解、灭活增加的疾病（例如由这些分子的基因异常、GST-π的表达/活性抑制等导致的疾病）等。
因此，本发明还涉及用于处置伴随着PI3K/Akt/mTOR信号级联和/或RAS/Raf/MAPK信号级联的抑制的疾病的医药组合物，其含有GST-π和/或其功能性突变体作为活性成分；本发明还涉及用于处置伴随着PI3K/Akt/mTOR信号级联和/或RAS/Raf/MAPK信号级联的抑制的疾病的医药组合物的制造方法，其包含将GST-π和/或其功能性突变体进行配合的工序；本发明还涉及GST-π和/或其功能性突变体在制造用于处置伴随着PI3K/Akt/mTOR信号级联和/或RAS/Raf/MAPK信号级联的抑制的疾病的医药组合物中的用途；本发明还涉及伴随着PI3K/Akt/mTOR信号级联和/或RAS/Raf/MAPK信号级联的抑制的疾病的处置中使用的GST-π和/或其功能性突变体；以及，本发明还涉及处置伴随着PI3K/Akt/mTOR信号级联和/或RAS/Raf/MAPK信号级联的抑制的疾病的方法，其包含给予有效量的GST-π和/或其功能性突变体。
本发明还涉及用于抑制PI3K/Akt/mTOR信号级联和/或RAS/Raf/MAPK信号级联的药剂或组合物（也称为“信号级联抑制剂”或“信号级联抑制组合物”），其含有抑制GST-π的药物作为活性成分。
本发明中，抑制信号级联不仅是指诱导信号级联的灭活，还指抑制信号级联的活化。信号级联是否得到抑制可通过与未使本发明的药剂或组合物发挥作用时相比、信号级联得到抑制来确定。关于信号级联的抑制，没有限定，例如可通过检测信号级联构成分子的活化（例如磷酸化等）的降低、或者由信号级联的抑制所引起的细胞现象，例如在PI3K/Akt/mTOR信号级联的情况下为自噬的增加等、在RAS/Raf/MAPK信号级联的情况下为细胞增殖的抑制等来进行评价。
本发明还涉及用于抑制PI3K/Akt/mTOR信号级联和/或RAS/Raf/MAPK信号级联的药剂或组合物的制造方法，其包含将抑制GST-π的药物进行配合的工序；本发明还涉及抑制GST-π的药物在制造用于抑制PI3K/Akt/mTOR信号级联和/或RAS/Raf/MAPK信号级联的药剂或组合物中的用途；本发明还涉及PI3K/Akt/mTOR信号级联和/或RAS/Raf/MAPK信号级联的抑制中使用的抑制GST-π的药物；以及，本发明还涉及抑制PI3K/Akt/mTOR信号级联和/或RAS/Raf/MAPK信号级联的方法，其包含给予有效量的抑制GST-π的药物。
本发明的用于抑制信号级联的药剂或组合物对于处置伴随着PI3K/Akt/mTOR信号级联和/或RAS/Raf/MAPK信号级联的异常、特别是这些信号级联的活化的疾病是有用的。作为所述疾病，没有限定，可列举出例如伴随着这些信号级联的构成分子的表达、活性的增加和/或分解、灭活抑制的疾病（例如由这些分子的基因异常、GST-π的表达/活性的增加等导致的疾病）、伴随着由除这些信号级联的构成分子以外的因子（例如受体型酪氨酸激酶的活化等）引起的信号级联的活化的疾病等。
因此，本发明还涉及用于处置伴随着PI3K/Akt/mTOR信号级联和/或RAS/Raf/MAPK信号级联的活化的疾病的医药组合物，其含有抑制GST-π的药物作为活性成分；本发明还涉及用于处置伴随着PI3K/Akt/mTOR信号级联和/或RAS/Raf/MAPK信号级联的活化的疾病的医药组合物的制造方法，其包含将抑制GST-π的药物进行配合的工序；本发明还涉及抑制GST-π的药物在制备用于处置伴随着PI3K/Akt/mTOR信号级联和/或RAS/Raf/MAPK信号级联的活化的疾病的医药组合物中的用途；本发明还涉及伴随着PI3K/Akt/mTOR信号级联和/或RAS/Raf/MAPK信号级联的活化的疾病的处置中使用的抑制GST-π的药物；以及，本发明还涉及处置伴随着PI3K/Akt/mTOR信号级联和/或RAS/Raf/MAPK信号级联的活化的疾病的方法，其包含给予有效量的抑制GST-π的药物。
本发明还涉及用于抑制泛素化的药剂或组合物（也称为“泛素化抑制剂”或“泛素化抑制组合物”），其含有GST-π和/或其功能性突变体作为活性成分。
泛素化是指泛素与蛋白结合，与对细胞内不需要的蛋白进行处理的过程相关。经泛素化的蛋白被蛋白酶体分解。
本发明的一个方式中，泛素化得到抑制的蛋白为GST-π可结合的蛋白。另外，本发明的一个方式中，泛素化得到抑制的蛋白选自由构成RAS/Raf/MAPK信号级联的蛋白、构成PI3K/Akt/mTOR信号级联的蛋白、及酪氨酸激酶型受体组成的组。本发明的优选方式中，泛素化得到抑制的蛋白选自由EGFR及Raf-1、特别是它们的磷酸化形态组成的组。
本发明中，泛素化的抑制可通过与不使本发明的药剂或组合物发挥作用时相比、泛素化得到抑制来确定。泛素化的抑制可通过已知的任意方法，没有限定，例如免疫沈降法、蛋白免疫印迹法、质量分析法、拉下法等来进行评价。
本发明还涉及用于抑制泛素化的药剂或组合物的制造方法，其包含将GST-π和/或其功能性突变体进行配合的工序；本发明还涉及GST-π和/或其功能性突变体在制造用于抑制泛素化的药剂或组合物中的用途；本发明还涉及泛素化抑制中使用的GST-π和/或其功能性突变体；以及，本发明还涉及抑制泛素化的方法，其包含给予有效量的GST-π和/或其功能性突变体。
本发明的用于抑制泛素化的药剂或组合物对于处置伴随着泛素化亢进的疾病是有用的。作为所述疾病，没有限定，可列举出例如伴随着泛素连接酶的表达、活性增加和/或分解、灭活抑制的疾病（例如由泛素连接酶的基因异常、GST-π的表达/活性抑制等导致的疾病）等。
因此，本发明还涉及用于处置伴随着泛素化亢进的疾病的医药组合物，其含有GST-π和/或其功能性突变体作为活性成分；本发明还涉及用于处置伴随着泛素化亢进的疾病的医药组合物的制造方法，其包含将GST-π和/或其功能性突变体进行配合的工序；本发明还涉及GST-π和/或其功能性突变体在制备用于处置伴随着泛素化亢进的疾病的医药组合物中的用途；本发明还涉及伴随着泛素化亢进的疾病的处置中使用的GST-π和/或其功能性突变体；以及，本发明还涉及处置伴随着泛素化亢进的疾病的方法，其包含给予有效量的GST-π和/或其功能性突变体。
本发明还涉及用于促进泛素化的药剂或组合物（也称为“泛素化促进剂”或“泛素化促进组合物”），其含有抑制GST-π的药物作为活性成分。
本发明的一个方式中，泛素化得到促进的蛋白为GST-π可结合的蛋白。另外，本发明的一个方式中，泛素化得到促进的蛋白选自由构成RAS/Raf/MAPK信号级联的蛋白、构成PI3K/Akt/mTOR信号级联的蛋白、及酪氨酸激酶型受体组成的组。本发明的优选方式中，泛素化得到促进的蛋白选自由EGFR及Raf-1、特别是它们的磷酸化形态组成的组。
本发明中，泛素化的促进可通过与不使本发明的药剂或组合物发挥作用时相比、泛素化得到促进来确定。泛素化的促进可通过已知的任意方法，没有限定，例如免疫沈降法、蛋白免疫印迹法、质量分析法、拉下法等来进行评价。
本发明还涉及用于促进泛素化的药剂或组合物的制造方法，其包含将抑制GST-π的药物进行配合的工序；本发明还涉及抑制GST-π的药物在制造用于促进泛素化的药剂或组合物中的用途；本发明还涉及泛素化促进中使用的抑制GST-π的药物；以及，本发明还涉及促进泛素化的方法，其包含给予有效量的抑制GST-π的药物。
本发明的用于促进泛素化的药剂或组合物对于处置伴随着泛素化抑制的疾病是有用的。作为所述疾病，没有限定，可列举出例如伴随着泛素连接酶的表达、活性抑制和/或分解、灭活增加的疾病（例如由泛素连接酶的基因异常、GST-π的表达/活性增加等导致的疾病）等。
因此，本发明还涉及用于处置伴随着泛素化抑制的疾病的医药组合物，其含有抑制GST-π的药物作为活性成分；本发明还涉及用于处置伴随着泛素化抑制的疾病的医药组合物的制造方法，其包含将抑制GST-π的药物进行配合的工序；本发明还涉及抑制GST-π的药物在制备用于处置伴随着泛素化抑制的疾病的医药组合物中的用途；本发明还涉及伴随着泛素化抑制的疾病的处置中使用的抑制GST-π的药物；以及，本发明还涉及处置伴随着泛素化抑制的疾病的方法，其包含有效量的抑制GST-π的药物进行给予。
本发明还涉及用于抑制自噬的药剂或组合物（也称为“自噬抑制剂”或“自噬抑制组合物”），其含有GST-π和/或其功能性突变体作为活性成分。本发明者们这次弄清楚了GST-π与位于PI3K/Akt/mTOR信号级联上游的酪氨酸激酶型受体、特别是其磷酸化形态结合、阻止其泛素化，从而促进该信号级联，而已知PI3K/Akt/mTOR信号级联的活化会抑制自噬（例如上述Yang and Klionsky，2010）。
本发明中，自噬的抑制可通过与不使本发明的药剂或组合物发挥作用时相比、细胞中自噬得到抑制来确定。关于自噬的评价方法，如上所述。
本发明还涉及用于抑制自噬的药剂或组合物的制造方法，其包含将GST-π和/或其功能性突变体进行配合的工序；本发明还涉及GST-π和/或其功能性突变体在制备用于抑制自噬的药剂或组合物中的用途；本发明还涉及自噬抑制中使用的GST-π和/或其功能性突变体；以及，本发明还涉及抑制自噬的方法，其包含给予有效量的GST-π和/或其功能性突变体。
本发明的用于抑制自噬的药剂或组合物对于处置伴随着自噬亢进的疾病等是有用的。作为所述疾病，没有限定，可列举出例如伴随着PI3K/Akt/mTOR信号级联抑制的疾病（例如由PI3K/Akt/mTOR信号级联构成分子和/或位于其上游的分子的基因异常、GST-π的表达/活性抑制等导致的疾病）、肌病、肝脏疾病、再灌注损伤等。
因此，本发明还涉及用于处置伴随着自噬亢进的疾病的医药组合物，其含有GST-π和/或其功能性突变体作为活性成分；本发明还涉及用于处置伴随着自噬亢进的疾病的医药组合物的制造方法，其包含将GST-π和/或其功能性突变体进行配合的工序；本发明还涉及GST-π和/或其功能性突变体在制备用于处置伴随着自噬亢进的疾病的医药组合物中的用途；本发明还涉及伴随着自噬亢进的疾病的处置中使用的GST-π和/或其功能性突变体；以及，本发明还涉及处置伴随着自噬亢进的疾病的方法，其包含将有效量的GST-π和/或其功能性突变体给予需要的对象。
本发明者们这次还弄清楚了通过抑制GST-π使得自噬得到促进。因此，本发明还涉及用于促进自噬的药剂或组合物（也称为“自噬促进剂”或“自噬促进组合物”），其含有抑制GST-π的药物作为活性成分。本发明还涉及用于促进自噬的药剂或组合物的制造方法，其包含将抑制GST-π的药物进行配合的工序；本发明还涉及抑制GST-π的药物在制备用于促进自噬的药剂或组合物中的用途；本发明还涉及自噬促进中使用的抑制GST-π的药物；以及，本发明还涉及促进自噬的方法，其包含给予有效量的抑制GST-π的药物。
本发明的用于促进自噬的药剂或组合物对于处置伴随着自噬抑制的疾病等是有用的。作为所述疾病，没有限定，可列举出例如伴随着PI3K/Akt/mTOR信号级联活化的疾病（例如由PI3K/Akt/mTOR信号级联构成分子和/或位于其上游的分子的基因异常、GST-π的表达/活性增加等导致的疾病）、衰老（aging）、缺血性疾病等。
因此，本发明还涉及用于处置伴随着自噬抑制的疾病的医药组合物，其含有抑制GST-π的药物作为活性成分；本发明还涉及用于处置伴随着自噬抑制的疾病的医药组合物的制造方法，其包含将抑制GST-π的药物进行配合的工序；本发明还涉及抑制GST-π的药物在制备用于处置伴随着自噬抑制的疾病的医药组合物中的用途；本发明还涉及伴随着自噬抑制的疾病的处置中使用的抑制GST-π的药物；以及，本发明还涉及对伴随着自噬抑制的疾病进行处置的方法，其包含将有效量的抑制GST-π的药物给予需要的对象。
关于信号级联、泛素化或自噬的抑制/促进所涉及的本发明的上述各种药剂或组合物中的活性成分的配合量，当给予该药剂或组合物时，可以是实现所期望的效果（即信号级联、泛素化或自噬的抑制/促进）的量。另外，优选不产生超过给予所带来的好处的不良影响的量。所述量可以是公知的，或者可以通过使用了培养细胞等的体外试验、或通过在小鼠、大鼠、狗或猪等动物模型中的试验来适当确定，这样的试验方法是本领域技术人员熟知的。信号级联、泛素化或自噬的抑制/促进可通过包括上述方法在内的各种已知的方法来进行评价。活性成分的配合量可根据药剂、组合物的给药方式的不同而变化。例如，当1次给予中使用几个单位的组合物时，组合物1单位中配合的有效成分的量可以为1次给予所需的有效成分的量的几分之一。本领域技术人员可适当对所述配合量进行调整。
关于信号级联、泛素化或自噬的抑制/促进所涉及的上述各种药剂或组合物的制造方法或用途中的药物、其配合量，如已在上文所述的。各药物的配合也可以按照已知的任意方法来进行。
信号级联、泛素化或自噬的抑制/促进所涉及的上述各种方法均可以是体外方法，也可以是体内方法。另外，关于上述方法中的药物的有效量，可以是在给予的细胞中实现所期望的效果（即信号级联、泛素化或自噬的抑制/促进）的量。另外，优选是不产生超过给予所带来的好处的不良影响的量。所述量可以是公知的，或者可以通过使用了培养细胞等的体外试验等来适当确定，这样的试验方法是本领域技术人员熟知的。所期望的效果的实现可以通过包括上述方法在内的各种已知方法来进行评价。关于上述有效量，当将药物给予某细胞集团时，可以不必是诱导该细胞集团的全部细胞产生所期望的效果的量。例如，上述有效量可以是诱导细胞集团中的细胞的1%以上、2%以上、3%以上、4%以上、5%以上、6%以上、8%以上、10%以上、12%以上、15%以上、20%以上、进而25%以上等产生所期望的效果的量。
当本说明书中记载的本发明的各种药剂、组合物、处置方法等中的活性成分为核酸、例如RNAi分子、核酶、反义核酸、DNA/RNA嵌合多核苷酸等时，这些活性成分可以作为单独的核酸直接利用，也可以载持到各种载体上后利用。作为载体，可以利用质粒载体、噬菌体载体、噬菌粒载体、粘粒载体、病毒载体等公知的任意载体。载体优选至少包含增加所载持的核酸的表达的启动子，此时，所述核酸优选与所述启动子可发挥功能的方式连接。核酸与启动子以可发挥功能的方式连接是指，在启动子的作用下，该核酸与启动子按照合适地产生该核酸所编码的蛋白的方式配置。载体可以是在宿主细胞内能够复制的，基因的转录可以是在宿主细胞的细胞核外进行，也可以在细胞核内进行。在后者的情况下，核酸被整合到宿主细胞的基因组中。
另外，有效成分也可以载持在各种非病毒性脂质或蛋白载体上。作为所述载体，没有限定，可列举出例如胆固醇、脂质体、抗体原体（antibodyprotomer）、环糊精纳米粒子、融合肽、适体（aptamer）、生物降解性聚乳酸共聚物、聚合物等，能够提高向细胞内摄入的效率（例如参照Pirollo andChang，Cancer Res.2008；68（5）：1247-50等）。特别是阳离子脂质体、聚合物（例如聚乙烯亚胺等）是有用的。关于作为所述载体有用的聚合物的进一步的例子，可列举出例如US2008/0207553、US2008/0312174等中记载的载体等。
本说明书中记载的本发明的各种医药组合物中，只要不影响活性成分的效果，还可以将活性成分与其它任意成分组合。作为这样的任意成分，可列举出例如其它的化学治疗剂、药理学上容许的载体、赋形剂、稀释剂等。另外，根据给予途径、药物释放方式等，还可以将上述组合物用合适的材料、例如肠溶性包衣剂、限时崩解性材料包覆，另外，还可以纳入合适的药物释放体系。
本说明书中记载的本发明的各种药剂及组合物（包括各种医药组合物）可以通过包括经口及非经口这两者的各种路径给予，例如没有限定，经口、静脉内、肌肉内、皮下、局部、肿瘤内、直肠、动脉内、门静脉内、心室内、经粘膜、经皮、鼻内、腹腔内、肺内及子宫内等路径，也可以制成适合各给予途径的剂型。所述剂型及制剂方法可以适当采用任意的公知的剂型及制剂方法（例如参照標準薬剤学、渡辺喜照ら編、南江堂、2003年等）。
例如，作为适合经口给予的剂型，没有限定，可列举出散剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、液体制剂、悬浮剂、乳剂、凝胶剂、糖浆剂等，另外作为适合非经口给予的剂型，可列举出溶液性注射剂、悬浮性注射剂、乳浊性注射剂、用时制备型注射剂等注射剂。非经口给予用制剂可以为水性或非水性的等渗性无菌溶液或悬浮液的形态。
本说明书中记载的本发明的各种药剂或组合物（包括各种医药组合物）可以靶向化为以特定的组织、细胞为靶。靶向化可以通过已知的任意方法实现。当期望向癌递送时，没有限定，可以使用例如通过将制剂制成适合EPR（增强性透过与滞留，enhanced permeability and retention）效果的表达的直径为50～200μm、特别是75～150μm等大小的被动靶向、和/或使用CD19、HER2、转铁蛋白受体、叶酸受体、VIP受体、EGFR（Torchilin，AAPS J.2007；9（2）：E128-47）、RAAG10（日本特表2005-532050）、PIPA（日本特表2006-506071）、KID3（日本特表2007-529197）等配体、或具有RGD基序、NGR基序的肽、F3、LyP-1（Ruoslahti et al.，J Cell Biol.2010；188（6）：759-68）等作为靶向剂的主动靶向等方法。另外，类视黄醇由于已知作为针对癌细胞的靶向剂是有用的（WO2008/120815），因此还可以利用含有类视黄醇作为靶向剂的载体。所述载体除了上述文献外，在WO2009/036368、WO2010/014117等中有记载。
本说明书中记载的本发明的各种药剂或组合物（包括各种医药组合物）可以以任意形态供给，从保存稳定性的观点出发，也可以以可用时制备的形态提供，例如在医疗现场或其附近由医师和/或药剂师、护士、或其他辅助医务人员等制备得到的形态。该形态当本发明的药剂或组合物含有脂质和/或蛋白、核酸等难以稳定保存的成分时特别有用。此时，本发明的药剂或组合物可以以包含这些必须构成要素中的至少一个的1个或2个以上的容器形式提供，在使用之前，例如使用前24小时以内、优选使用前3小时以内、并且更优选即将使用前制备。制备时，可以适当使用进行制备的场所中通常能够获得的试剂、溶剂、调剂器具等。
因此，本发明还涉及组合物的制备试剂盒，其包含单独或组合地包含本发明的各种药剂或组合物中可含有的活性成分的1个或2个以上的容器；以及以这样的试剂盒形式提供的各种药剂或组合物的必要构成要素。本发明的试剂盒除了上述容器外，还可以包含记载有本发明的各种药剂或组合物的制备方法、给予方法等的说明，例如说明书、CD、DVD等电子记录介质等。另外，本发明的试剂盒可以包含用于完成本发明的各种药剂或组合物的全部构成要素，但也可以不一定要含有全部构成要素。因此，本发明的试剂盒可以不含有在医疗现场、实验室等中通常可获得的试剂、溶剂，例如无菌水、生理盐水、葡萄糖溶液等。
本说明书中记载的本发明的各种处置方法中的有效量是例如减轻疾病的症状，或使疾病的进展延缓或停止的量，优选为抑制或使疾病治愈的量。另外，优选为不产生超过给予所带来的好处的不良影响的量。所述量可以通过使用了培养细胞等的体外试验、或通过在小鼠、大鼠、狗或猪等动物模型中的试验来适当确定，这样的试验方法是本领域技术人员熟知的。另外，本发明的处置方法中使用的药物的用量可以是本领域技术人员公知的，也可以通过上述试验等来适当确定。
本说明书中记载的本发明的处置方法中给予的活性成分的具体用量可以考虑与需要处置的对象有关的各种条件，例如症状的严重程度、对象的一般健康状态、年龄、体重、对象的性别、饮食、给予的时期及频率、并用的药物、对治疗的反应性、剂型及对治疗的依从性等来确定。
作为给予途径包括包含经口及非经口这两者的各种路径，例如经口、静脉内、肌肉内、皮下、局部、肿瘤内、直肠、动脉内、门静脉内、心室内、经粘膜、经皮、鼻内、腹腔内、肺内及子宫内等路径。
关于给予频率，根据所用药剂、组合物的性状、包括上述条件在内的对象的条件的不同而不同，例如可以为1日多次（即1日2、3、4次或5次以上）、1日1次、数日（即2、3、4、5、6、7日等）1次、1周1次、数周1次（即2、3、4周1次等）。
在本说明书中使用的情况下，用语“对象”表示任意的生物个体，优选为动物，进一步优选为哺乳动物，进一步优选为人的个体。本发明中，对象可以是健康的，也可以患有某种疾病，当期望处置特定的疾病时，典型地是指患有所述疾病，或者具有患病风险的对象。
另外，用语“处置”在本说明书中使用的情况下，是包含以疾病的治愈、暂时的缓解或预防等为目的的医学上容许的全部种类的预防性和/或治疗性介入。例如，“处置”这一用语包括疾病进展的延缓或停止、病变的退缩或消失、发病的预防或再发的防止等，包含各种目的的医学上容许的介入。
实施例
以下基于实施例对本发明进一步进行说明，但所述实施例是本发明的示例，并不是对本发明进行限定。
实施例1：GST-π敲除对RAS/Raf/MAPK信号级联的影响
（1）细胞培养
将K-RAS变异阳性结肠癌细胞株M7609在含有10%胎牛血清（FBS）的RPMI-1640培养基中、在37℃、含有5%CO2的大气下进行培养。另外，在培养基中加入作为抗生素的100U/mL的青霉素、100μg/mL的链霉素。
（2）GST-πsiRNA的转染
在转染的前一日，将M7609细胞用不含抗生素的加有10%FBS的RPMI-1640培养基播种到100mm组织培养用塑料培养皿中，使细胞达到1×106个/10mL。在1mL的Opti-MEM I减少血清培养基（Opti-MEM IReduced Serum Medium，GIBCO公司）中加入600pmol的GST-πsiRNA（序列编号1：GGGAGGCAAGACC UUCAUUTT，siRNA ID#2385，Ambion公司），温和混合。接着，将35μL的Lipofectamine RNAiMAX（Invitrogen公司）稀释到1mL的Opti-MEM I减少血清培养基中，温和混合。将稀释后的GST-πsiRNA与稀释后的Lipofectamine RNAiMAX合并，温和混合后，在室温下孵育10分钟。其间，将培养基换成10mL的Opti-MEM I减少血清培养基。孵育10分钟后，向细胞中加入GST-πsiRNA与LipofectamineRNAiMAX的复合物，在37℃、含有5%CO2的大气下进行孵育。孵育5小时后，换成10mL的不含抗生素的加有10%FBS的RPMI-1640培养基。另外，作为对照实验，使用Scramble siRNA（序列编号2：CGAUUCGCUAGACCGGCUUCAUUGCAG，北海道System science公司）进行同样的操作。在GST-πsiRNA转染后的第1、2、3、4天时，测量细胞数，同时观察GST-π敲除。GST-π敲除如下所述地用蛋白免疫印迹法进行分析。
（3）GST-π敲除的蛋白免疫印迹分析
在GST-πsiRNA转染后的上述各时间点使用采集的细胞进行GST-π敲除的蛋白免疫印迹分析。将采集的细胞在不含血清的培养基中培养16小时。将细胞用冷PBS洗涤后，加入冷lysis buffer（1%NP-40、50mM Tris-HCl、150mM NaCl、1mM EDTA、complete Mini EDTA-free（Roche公司）、PhosSTOP（Roche公司）、pH为7.5），冰冷，孵育30分钟，使其溶解。在4℃、15000rpm下进行离心分离15分钟，得到细胞提取液。对得到的细胞提取液使用Micro BCA蛋白分析试剂盒（Micro BCA Protein Assay Kit，Thermo SCIENTFIC公司）进行蛋白定量。GST-πsiRNA转染子：4.35μg/μL，Scramble siRNA转染子：4.56μg/μL）。接着，使20μg的细胞提取液在还原条件下变性，使用MultiGel II mini4/20（13W）（CosmoBio公司）进行SDS-PAGE，将蛋白分离。SDS-PAGE结束后，使用箱式印迹装置电转录到PVDF膜上。将转录膜用添加有5%脱脂乳/0.05%Tween20的PBS（简写为PBS-T）在4℃下孵育16小时，进行印迹（blotting）。然后，使其与用PBS-T稀释的抗GST-π抗体（MBL公司）在4℃下反应16小时。二次抗体反应使用辣根过氧化物酶（HRP）标记的兔抗体在室温下进行1小时。然后，使其与化学发光底物在室温下反应1分钟，然后使用X射线膜检测化学发光。各操作之间的洗涤使用PBS-T振荡5分钟、3次。另外，siRNA转染后，按照达到1.0×105个/5mL的方式播种到60mm组织培养用塑料培养皿中，培养皿中的总细胞数用血细胞计测量直至第4天。
（4）RAS/Raf/MAPK信号级联相关蛋白的蛋白免疫印迹分析
使用在GST-πsiRNA转染后第2天采集的细胞，对RAS/Raf/MAPK信号级联相关的主要蛋白与上述（3）同样地进行蛋白免疫印迹分析。作为抗体加入抗GST-π抗体，使用了抗p-Raf-1（Ser338）抗体（MILLIPORE公司）、抗Raf-1抗体（Santa Cruz公司）、抗p-MEK1/2（Ser217/221）抗体（CellSignaling公司）、抗MEK1/2抗体（Cell Signaling公司）、抗p-ERK1/2（Thr202/Tyr204）抗体（Cell Signaling公司）、抗ERK抗体（Cell Signaling公司）、抗GAPDH抗体（Abcam公司）。
将结果示于图1及2。图1a）中观察到，GST-π的表达被GST-πsiRNA抑制，但Scramble siRNA中没有被抑制。图1b）中可知，转染后即使经过4天时，GST-π的表达仍然被GST-πsiRNA稳定地抑制，并且抑制GST-π的表达的情况下，与未抑制的情况相比，培养4天后的细胞数显著减少。另外，从图2可清楚，GST-πsiRNA处理组中，RAS/Raf/MAPK信号级联相关蛋白的磷酸化与Scramble siRNA处理组相比均降低。因此可知，由于GST-π的表达抑制，RAS/Raf/MAPK信号级联及细胞增殖异常得到抑制。
实施例2：GST-π敲除对泛素化的影响
（1）GST-π敲除对Raf-1的泛素化的影响
按照实施例1（1）～（2）的步骤进行M7609细胞的培养及GST-πsiRNA转染。
与实施例1（3）同样地，从siRNA转染后第2天开始在不含血清的培养基中培养16小时，回收细胞提取液。对得到的细胞提取液使用Micro BCA蛋白分析试剂盒进行蛋白定量（Scramble siRNA：8.88μg/μL、GST-πsiRNA：7.18μg/mL）。将0.5μg的细胞提取液与结合在Dynabeads Protein G（Invitrogen公司）上的抗Raf-1抗体混合，在用振荡机温和混合的同时，在4℃下孵育2小时，将Raf-1蛋白分离后，使用抗泛素抗体（Santa Cruz公司），与实施例1（3）同样地进行蛋白免疫印迹分析。关于Raf-1的蛋白酶体分解抑制相关的Ser621的磷酸化修饰，使用抗p-Raf-1（Ser621）抗体（MILLIPORE公司）同样地进行研究。
（2）GST-π敲除下蛋白酶体抑制剂对Raf-1表达的影响
按照实施例1（1）～（2）的步骤进行M7609细胞的培养及GST-πsiRNA的转染。从GST-πsiRNA转染后第2天开始，将细胞在不含血清的培养基中培养16小时。用5μM MG132处理4小时后，回收细胞提取液。作为MG132处理的对照，同样地进行0.05%DMSO处理。对得到的细胞提取液使用Micro BCA蛋白分析试剂盒进行蛋白定量（Scramble siRNA-DMSO处理组：3.36μg/μ、Scramble siRNA-MG132处理组：3.16μg/μL、GST-πsiRNA-DMSO处理组：3.12μg/μL、GST-πsiRNA-MG132处理组：3.16μg/μL）。在将20μg的细胞提取液供给到SDS-PAGE后，使用抗p-Raf-1（Ser338）抗体及抗Raf-1抗体，与实施例1（3）同样地进行蛋白免疫印迹分析。
（3）p-Raf-1与GST-π的共免疫沈降
按照实施例1（1）的步骤进行M7609细胞的培养。接着，将按照实施例1（2）的步骤得到的GST-π敲除细胞用冷PBS洗涤，然后加入冷共免疫沈降缓冲液（0.5%NP-40、50mM HEPES、150mM NaCl、1mM EGTA、1.5mMMgCl2、complete Mini EDTA-free、PhosSTOP、pH为7.5），冰冷、孵育30分钟，使其溶解。在4℃、15000rpm下进行离心分离15分钟，得到细胞提取液。对得到的细胞提取液使用Micro BCA蛋白分析试剂盒进行蛋白定量（12.1μg/μL）。将1mg的细胞提取液与结合在Dynabeads Protein G上的抗p-Raf-1（Ser338）抗体（US Biological公司）混合，在用振荡机温和混合的同时，在4℃下孵育16小时，进行共免疫沈降。接着，进行使用了抗GST-π抗体的蛋白免疫印迹分析。
将结果示于图3～5。从图3可清楚，GST-πsiRNA处理组中，与Raf-1共沈降的泛素量与Scramble siRNA处理组相比更多，Raf-1的泛素化增强。另外，图4显示，GST-πsiRNA作用下的p-Raf-1的表达降低与蛋白酶体相关；图5显示，GST-π与p-Raf-1结合。以上结果启示，GST-π与p-Raf-1结合，抑制其泛素化，由于GST-π抑制，p-Raf-1的泛素化得到促进，p-Raf-1的存在量减少。
实施例3：利用GST-π敲除的自噬及细胞凋亡诱导的分析
（1）利用免疫荧光染色的自噬诱导的分析
利用作为自噬特异性标记蛋白的LC3的免疫荧光染色对利用GST-π敲除的自噬诱导进行分析。将实施例1（2）的步骤中得到的GST-π敲除细胞按照达到1×105个/2mL的方式播种到放入到35mm组织培养用塑料培养皿的盖玻片上。将培养基吸出（aspirate）后，加入添加有4%多聚甲醛的PBS，在室温下孵育10分钟，使细胞固定。细胞的浸透化使用添加有0.5%TritonX-100的PBS在冰上进行5分钟。用冷PBS洗涤10分钟后，与用添加有1%BSA的PBS稀释了的抗LC3B抗体（Invitrogen公司）在湿式腔室内、37℃下使其反应1小时。二次抗体反应使用Alexa Fluor488标记的兔抗体（Invitrogen公司）在37℃进行1小时。使用Prolong Gold antifade reagentwith DAPI载持（mount）到载玻片上，在4℃下孵育16小时。抗体反应后的洗涤使用PBS、37℃下进行5分钟、3次。荧光显微镜观察时的自噬阳性细胞为具有存在于细胞质中的点状LC3信号的细胞。
（2）利用蛋白免疫印迹的自噬诱导的分析
进而利用LC3的蛋白免疫印迹分析对GST-π敲除细胞的自噬诱导进行分析。将实施例1（2）的步骤中得到的GST-π敲除细胞按照达到1×105个/2mL的方式播种到放入到35mm组织培养用塑料培养皿的盖玻片上。孵育规定的时间后，回收细胞提取液，供于蛋白免疫印迹分析。作为一次抗体，使用抗LC3B抗体（SIGMA公司），使其与转录膜在4℃反应16小时。LC3分子的检测在与HRP标记二次抗体反应后，使用化学发光试剂来进行。是否诱导了自噬采用向LC3的I型（18kDa）和II型（16kDa）的转移来评价。
（3）利用电子显微镜观察的自噬诱导的分析
在实施例1（2）中的siRNA转染后第1天，将细胞按照达到0.4×105个/0.5mL的方式播种到8孔组织培养用培养玻片上。用含有2.5%戊二醛的0.1M二甲酸缓冲液（pH为7.4）固定1小时，在用0.1M二甲酸缓冲液冲洗后，用1%OsO4和1.5%亚铁氰化钾进行2小时后固定。在采用乙醇、10分钟脱水3次后，用环氧树脂（TAAB Laboratories Equipment公司）包埋。用Diamond Knife制作超薄切片，用乙酸铀酰和柠檬酸铅进行电子染色，用电子显微镜（日立透射电子显微镜H-7500，日立High Technologies公司）观察切片。
（4）利用TUNEL染色的细胞凋亡诱导的分析
TUNEL法使用In Situ Cell Death Detection Kit，POD（Roche）如下进行。将实施例1（2）的步骤中得到的GST-π敲除细胞按照达到1×105个/2mL的方式播种到放入到35mm组织培养用塑料培养皿的盖玻片中。将培养基吸出后，加入添加有4%多聚甲醛的PBS，在室温下孵育60分钟，将细胞固定。为了进行内因性过氧化物酶的印迹，用添加有3%H2O2的甲醇在室温下孵育10分钟。接着，用添加有0.1%Triton X-100的0.1%柠檬酸钠在冰上处理2分钟，进行细胞的浸透化。TUNEL反应在湿式腔室内、37℃下进行60分钟。使过氧化物酶标记抗荧光素抗体在37℃下反应30分钟后，利用使用了DAB底物的发色反应进行TUNEL阳性细胞的检测。用苏木精进行复染，在光学显微镜下观察染色细胞，将TUNEL阳性细胞评价为细胞凋亡细胞。各操作之间的洗涤采用利用PBS的冲洗来进行。
将结果示于图6～10。图6为抗LC3抗体时的免疫荧光染色图像，在用箭头示出的细胞中，观察到显示LC3的点状信号。推测该LC3的点状信号为自噬体，其结果可知在GST-π敲除细胞中诱导了自噬。
图7为GST-πsiRNA转染后经过2天时的GST-πKD细胞的电子显微镜观察图像。左图中用四边形围住的A的部分的放大图像在右图。右图中，箭头所示的部分中可确认到自噬体按照包围线粒体的方式形成。
图8表示LC3的蛋白免疫印迹的结果。被抗LC3抗体识别的LC3蛋白存在2种型。当发生自噬、LC3被摄入脂质双层膜时，LC3从I型变化为II型。因此，通过LC3-II型的检测量的变化，能够确认是否诱导了自噬。从图8的结果可知，GST-πsiRNA处理组中LC3的I型、II型均诱导了表达，特别是确认到II型显著增加；而Scramble siRNA处理组中，I型、II型的表达均低，且I型比II型的表达量更低。
从这些结果可知，通过抑制GST-π的表达，自噬得到诱导。
图9表示TUNEL染色的结果。上一行为Scramble siRNA处理组的图像，下一行为GST-πsiRNA处理组的图像，在敲除了GST-π的细胞中，观察到TUNEL阳性细胞、即细胞凋亡。
图10为表示GST-πsiRNA处理组和Scramble siRNA处理组的自噬阳性细胞及细胞凋亡阳性细胞的比例的经时变化的曲线图。需要说明的是，自噬阳性细胞的比例表示上述（1）的利用抗LC3抗体的免疫荧光染色实验中的具有点状LC3信号的细胞相对于500个细胞的比例；细胞凋亡阳性细胞的比例表示上述（4）的TUNEL染色实验中的TUNEL阳性细胞相对于1000个细胞的比例。由此可知，自噬阳性细胞的比例在处理后急剧增加，在第2天达到峰值，其后下降，而细胞凋亡阳性细胞的比例虽然缓慢但持续地增加至第4天。
实施例4：GST-π敲除对EGFR/PI3K/Akt/mTOR信号级联的影响
（1）EGFR/PI3K/Akt/mTOR信号的蛋白免疫印迹分析
除了使用抗p-EGFR（Tyr1068）抗体（Cell Signaling公司）、抗EGFR抗体（Santa Cruz公司）、抗p-PI3Kp85（Tyr458）/p55（Tyr199）抗体（CellSignaling公司）、抗PI3K、p85抗体（MILLIPORE公司）、抗p-Akt（Ser473）抗体（Cell Signaling公司）、抗Akt抗体（Cell Signaling公司）、抗p-p70S6K（Thr389）抗体（Cell Signaling公司）、抗p-p70S6K（Thr421/Ser424）抗体（Cell Signaling公司）、抗p70S6K抗体（Cell Signaling公司）作为一次抗体以外，与实施例1（1）、（2）、（4）同样地对构成EGFR/PI3K/Akt/mTOR信号级联的各蛋白的表达进行分析。
（2）GST-π敲除下蛋白酶体抑制剂对p-EGFR表达的影响
按照实施例1（1）～（2）的步骤进行M7609细胞的培养及GST-πsiRNA的转染。GST-πsiRNA转染后第2天，用不含血清的培养基培养细胞16小时。用5μM MG132处理2小时后，回收细胞提取液。作为MG132处理的对照，同样地进行0.05%DMSO处理。对得到的细胞提取液使用Micro BCA蛋白分析试剂盒进行蛋白定量（Scramble siRNA-DMSO处理组：11.98μg/μL、Scramble siRNA-MG132处理组：12.29μg/μL、GST-πsiRNA-DMSO处理组：8.91μg/μL、GST-πsiRNA-MG132处理组：9.24μg/μL）。将80μg的细胞提取液供于SDS-PAGE后，用抗p-EGFR（Tyr1068）抗体及抗EGFR抗体进行蛋白免疫印迹分析。
（3）p-EGFR与GST-π的共免疫沈降
按照实施例1（1）的步骤进行M7609细胞的培养。接着，将细胞用冷PBS洗涤后，加入冷共免疫沈降缓冲液（1.0%TritoN X-100、50mM Tris-HCl、150mM NaCl、complete Mini EDTA-free、PhosSTOP、pH为7.5），冰冷、孵育30分钟，使其溶解。在4℃、12000rpm下进行离心分离10分钟，得到细胞提取液。对得到的细胞提取液使用Micro BCA蛋白分析试剂盒进行蛋白定量（9.08μg/μL）。将1mg细胞提取液与结合在Dynabeads Protein G上的抗p-EGFR（Tyr1068）抗体（Calbiochem公司）混合，在用振荡机温和混合的同时，在4℃孵育16小时，进行共免疫沈降。接着，使用抗GST-π抗体进行蛋白免疫印迹分析。
将结果示于图11～13。图11显示GST-πsiRNA处理组中，构成EGFR/PI3K/Akt/mTOR信号级联的各蛋白的磷酸化与Scramble siRNA处理组相比减少；图12显示利用GST-πsiRNA的p-EGFR的表达降低与蛋白酶体相关；并且，图13显示GST-π与p-EGFR结合。以上结果启示，GST-π与p-EGFR结合，有助于其稳定化，通过抑制GST-π，p-EGFR的泛素化得到促进，p-EGFR的存在量减少。
实施例5：GST-π抑制剂对细胞增殖等的影响
（1）GST-π抑制剂对EGFR及Raf-1的磷酸化的影响
按照实施例1（1）的步骤进行M7609细胞的培养。将细胞按照达到4.0×105个/5mL的方式播种到60mm组织培养用塑料培养皿中。加入GST-π抑制剂C16C2（委托帝人Pharma公司制作）使其达到10、50、100μM，24小时后回收细胞提取液。对得到的细胞提取液使用Micro BCA蛋白分析试剂盒进行蛋白定量（非处理：8.5μg/μL、10μL：8.49μg/μL、50μM：7.68μg/μL、100μM：6.4μg/μL）。在将50μg细胞提取液供于SDS-PAGE后，通过蛋白免疫印迹法对各蛋白的表达进行分析。
（2）GST-π抑制剂对细胞增殖等的影响
按照实施例1（1）的步骤进行M7609细胞的培养。将细胞按照达到1.0×105个/5mL的方式播种到60mm组织培养用塑料培养皿中。16小时后，加入GST-π抑制剂，使其达到50μM。培养皿中的总细胞数用血细胞计测量，直至第2天。作为GST-π抑制剂的对照，进行0.05%DMSO处理。
将结果示于图14及15。从这些结果可知，利用GST-π抑制剂也与GST-π敲除同样地抑制EGFR及Raf-1的磷酸化（图14）以及细胞增殖（图15）。
实施例6：自噬抑制剂对GST-π敲除细胞的影响
（1）细胞培养
在按照实施例1（2）的步骤进行GST-πsiRNA转染后，替换成不含抗生素的培养基，孵育3小时。将细胞播种到放入到35mm组织培养用塑料培养皿的盖玻片上，在培养基中加入自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-MA，SIGMA公司），使其达到1及5mM，然后培养规定的时间。
（2）自噬阳性细胞的评价
与实施例3（1）同样用抗LC3抗体对（1）中培养的细胞进行免疫荧光染色。
（3）TUNEL染色
与实施例3（4）同样地对（1）中培养的细胞进行TUNEL染色。
将结果示于图16～18。图16表示各组中自噬阳性细胞相对于1000个细胞的比例，可知在自噬抑制剂的作用下自噬阳性细胞的比例显著减少。图17的上一行表示GST-πsiRNA＋1mM3-MA处理组、下一行表示GST-πsiRNA＋5mM3-MA处理组。从图9及图17可知，通过并用自噬抑制剂，细胞凋亡阳性细胞显著增加。图18为表示自噬抑制剂用量依赖性地进一步诱导细胞凋亡的曲线图。通过添加GST-πsiRNA，细胞凋亡得到诱导，当进一步追加自噬抑制剂即3-MA时，3-MA的追加用量依赖性地进一步诱导细胞凋亡。因此可知，通过将抑制GST-π的药物与抑制自噬的药物组合，能够更有效地诱导细胞凋亡。
Claims (14)
1.一种用于诱导细胞凋亡的药剂，其含有抑制GST-π的药物和抑制自噬的药物作为活性成分。
2.一种用于诱导GST-π得到抑制的细胞发生细胞凋亡的药剂，其含有抑制自噬的药物作为活性成分。
3.根据权利要求1或2所述的药剂，其用于诱导具有变异型KRAS的细胞发生细胞凋亡。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的药剂，其中，活性成分选自由RNAi分子、核酶、反义核酸、DNA/RNA嵌合多核苷酸及表达它们的载体组成的组。
5.一种医药组合物，其含有权利要1～4中任一项所述的药剂。
6.根据权利要求5所述的医药组合物，其用于治疗细胞的异常增殖所引起的疾病。
7.根据权利要求5所述的医药组合物，其用于治疗KRAS的变异所引起的疾病。
8.根据权利要求5所述的医药组合物，其用于治疗癌。
9.一种用于促进PI3K/Akt/mTOR信号级联和/或RAS/Raf/MAPK信号级联的药剂，其含有GST-π和/或其功能性突变体作为活性成分。
10.一种用于抑制PI3K/Akt/mTOR信号级联和/或RAS/Raf/MAPK信号级联的药剂，其含有抑制GST-π的药物作为活性成分。
11.一种用于抑制泛素化的药剂，其含有GST-π和/或其功能性突变体作为活性成分。
12.一种用于促进泛素化的药剂，其含有抑制GST-π的药物作为活性成分。
13.一种用于抑制自噬的药剂，其含有GST-π和/或其功能性突变体作为活性成分。
14.一种用于促进自噬的药剂，其含有抑制GST-π的药物作为活性成分。
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