JP6403260B2 - 前立腺癌の判定、治療選択方法、予防又は治療剤 - Google Patents
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本発明は、前立腺癌の判定、治療選択方法、予防又は治療剤に関する。さらに詳しくはＧ３ＢＰ２（Ｒａｓ ＧＴＰａｓｅ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ （ＳＨ３ ｄｏｍａｉｎ） ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ２ （以下、Ｇ３ＢＰ２と示す））遺伝子の発現に基づく、前立腺癌の判定、治療選択方法や、この発現の抑制による前立腺癌の予防又は治療剤に関する。
近年、食生活の欧米化及び人口の高齢化に伴い、日本においても前立腺癌の患者数が飛躍的に増加している。前立腺癌の治療には、臨床的には前立腺全摘除術などの外科的治療、抗癌剤による化学療法、放射線治療及びホルモン療法等、様々な技術が確立されている。
前立腺癌の発生や増殖、治療抵抗性の獲得機序等については、アンドロゲンシグナルが活性化され、アンドロゲンレセプター（Ａｎｄｒｏｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＡＲ（以下、単にＡＲと示す場合がある））を介して標的遺伝子が過剰発現することにより癌が発生、進行し去勢抵抗性前立腺癌（Ｃａｓｔｒａｔｉｏｎ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ；ＣＲＰＣ）の増殖に働いている可能性が強く示唆されている。
前立腺癌の発生や増殖、治療抵抗性の獲得機序等については、アンドロゲンシグナルが活性化され、アンドロゲンレセプター（Ａｎｄｒｏｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＡＲ（以下、単にＡＲと示す場合がある））を介して標的遺伝子が過剰発現することにより癌が発生、進行し去勢抵抗性前立腺癌（Ｃａｓｔｒａｔｉｏｎ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ；ＣＲＰＣ）の増殖に働いている可能性が強く示唆されている。
そして、一般に前立腺癌細胞はアンドロゲンによって刺激され、増殖することが知られている。そのためアンドロゲンの産生や機能を阻害するホルモン療法が、しばしば行われている。これは、精巣を両側とも摘除する手術や、ＬＨＲＨアナログ剤を用いて精巣から分泌される血液中の男性ホルモン値を低下させ、さらに、微量に分泌されている副腎由来アンドロゲンを内服薬で除去するものである。
このホルモン療法は、効果が極めてよいものの、数年以内に去勢抵抗性前立腺癌として再燃することが問題となっており、前立腺癌の治療において、この去勢抵抗性前立腺癌の制御が最も重要な課題となっている。
このホルモン療法は、効果が極めてよいものの、数年以内に去勢抵抗性前立腺癌として再燃することが問題となっており、前立腺癌の治療において、この去勢抵抗性前立腺癌の制御が最も重要な課題となっている。
去勢抵抗性前立腺癌は、ＡＲの変異あるいは増幅により、超低濃度のアンドロゲン、抗アンドロゲン剤、その他のステロイドホルモンなどに感受性を示すことが示唆されている。しかし、このメカニズム等はいまだ不明であり、現状ではドセタキセル（Ｄｏｃｅｔａｘｅｌ：ＤＴＸ（以下、単にＤＴＸと示す場合がある））を用いた抗がん剤療法が唯一の治療法とされている。しかし、この治療法によって、効果を示す症例は限定的であり、事前にその効果を予測することもできないことから、効果の予測に有用なマーカーの提供が望まれている。
また、去勢抵抗性前立腺癌への進行を妨げるべく、前立腺癌に対してホルモン療法以外の有効な治療法の提供も望まれている。
ＡＲを発現している前立腺癌細胞が、アンドロゲン応答遺伝子の発現を亢進していることから、近年では、アンドロゲン応答遺伝子に対してアンチセンス核酸等を投与して、これらの遺伝子の発現を不安定化することにより、前立腺癌を治療する方法等が開発されている。しかし、アンチセンス核酸等は生体内で分解され易く、不安定であるため、前立腺癌の治療において十分な方法とはいえなかった。
ＡＲを発現している前立腺癌細胞が、アンドロゲン応答遺伝子の発現を亢進していることから、近年では、アンドロゲン応答遺伝子に対してアンチセンス核酸等を投与して、これらの遺伝子の発現を不安定化することにより、前立腺癌を治療する方法等が開発されている。しかし、アンチセンス核酸等は生体内で分解され易く、不安定であるため、前立腺癌の治療において十分な方法とはいえなかった。
そこで、本発明者らは、より効率的な前立腺癌の予防、治療等を目的として検討を行った結果、新たなＡＲの標的遺伝子の一つとして、Ｇ３ＢＰ２遺伝子を見出した。Ｇ３ＢＰ２遺伝子はヒト乳癌細胞において過剰発現しており予後不良因子であることが報告されている。
Ｇ３ＢＰ２遺伝子は、特許文献１において、前立腺癌を含む、がん患者に対する免疫療法の治療効果を予測するために有用な遺伝子セットに含まれる遺伝子の一つとして挙げられている。また、特許文献２において、前立腺癌の指標または前立腺癌の指標ではないことを分類する方法において、発現レベルを測定する遺伝子の一つとして挙げられている。
しかし、これらの文献献では、Ｇ３ＢＰ２遺伝子はあくまでも網羅的に解析された遺伝子のうちの一つとして挙げているだけであり、Ｇ３ＢＰ２遺伝子と前立腺癌との関連についての十分な検討はなされていない。
Ｇ３ＢＰ２遺伝子は、特許文献１において、前立腺癌を含む、がん患者に対する免疫療法の治療効果を予測するために有用な遺伝子セットに含まれる遺伝子の一つとして挙げられている。また、特許文献２において、前立腺癌の指標または前立腺癌の指標ではないことを分類する方法において、発現レベルを測定する遺伝子の一つとして挙げられている。
しかし、これらの文献献では、Ｇ３ＢＰ２遺伝子はあくまでも網羅的に解析された遺伝子のうちの一つとして挙げているだけであり、Ｇ３ＢＰ２遺伝子と前立腺癌との関連についての十分な検討はなされていない。
本発明は、前記従来における諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。
即ち、本発明は、前立腺癌に対して有効な新たな治療法の提供を課題とする。また、去勢抵抗性前立腺癌の治療による効果を予測するために有用なマーカーを提供することも課題とする。
即ち、本発明は、前立腺癌に対して有効な新たな治療法の提供を課題とする。また、去勢抵抗性前立腺癌の治療による効果を予測するために有用なマーカーを提供することも課題とする。
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、新たなＡＲの標的遺伝子の一つとして見出されたＧ３ＢＰ２遺伝子に着目するに至った。
本発明者らは本発明において、前立腺癌の診断を目的として生検した検体にＧ３ＢＰ２遺伝子が高発現している場合、その後の治療経過において有意にドセタキセル治療に反応せず、前立腺癌の再燃（ＰＳＡ再発）を起こすことを見出した。そこで、このＧ３ＢＰ２遺伝子の発現をマーカーとすることで、前立腺癌の治療による効果が事前に予測できることを見出し、本発明を完成するに至った。
また、本発明者らは、このＧ３ＢＰ２遺伝子が、前立腺癌の進行を促進させ、現在進行性前立腺癌（去勢抵抗性前立腺癌）の唯一の治療薬であるドセタキセルに抵抗性を持つ遺伝子である事を見出したことから、このＧ３ＢＰ２遺伝子の発現を抑制し得るｓｉＲＮＡ等の二本鎖核酸分子を作製し、これによって前立腺癌の進行が抑制できることを見出し、本発明を完成するに至った。
本発明者らは本発明において、前立腺癌の診断を目的として生検した検体にＧ３ＢＰ２遺伝子が高発現している場合、その後の治療経過において有意にドセタキセル治療に反応せず、前立腺癌の再燃（ＰＳＡ再発）を起こすことを見出した。そこで、このＧ３ＢＰ２遺伝子の発現をマーカーとすることで、前立腺癌の治療による効果が事前に予測できることを見出し、本発明を完成するに至った。
また、本発明者らは、このＧ３ＢＰ２遺伝子が、前立腺癌の進行を促進させ、現在進行性前立腺癌（去勢抵抗性前立腺癌）の唯一の治療薬であるドセタキセルに抵抗性を持つ遺伝子である事を見出したことから、このＧ３ＢＰ２遺伝子の発現を抑制し得るｓｉＲＮＡ等の二本鎖核酸分子を作製し、これによって前立腺癌の進行が抑制できることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は次の（１）〜（９）に記載の前立腺癌の予防又は治療剤や、前立腺癌の治療効果を判定するためのマーカー等に関する。
（１）Ｇ３ＢＰ２遺伝子の発現を抑制するための二本鎖核酸分子を有効成分として含む前立腺癌の予防又は治療剤。
（２）二本鎖核酸分子が次の（ａ）及び（ｂ）を含む二本鎖核酸分子である上記（１）に記載の前立腺癌の予防又は治療剤。
（ａ）配列番号２〜７のいずれかに示される標的配列に対応するヌクレオチド配列を含むセンス鎖
（ｂ）前記（ａ）のセンス鎖に相補的なヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖
（３）二本鎖核酸分子の各鎖の３´末端が、２塩基〜６塩基突出した突出末端である上記（２）に記載の前立腺癌の予防又は治療剤。
（４）二本鎖核酸分子の長さが、２３塩基から２９塩基の少なくともいずれかである上記（１）〜（３）のいずれかに記載の前立腺癌の予防又は治療剤。
（５）二本鎖核酸分子が二本鎖ＲＮＡである上記（１）〜（４）のいずれかに記載の前立腺癌の予防又は治療剤。
（６）二本鎖核酸分子がｓｉＲＮＡである上記（５）に記載の前立腺癌の予防又は治療剤。
（７）前立腺癌細胞の増殖を抑制するための上記（１）〜（６）のいずれかに記載の前立腺癌の予防又は治療剤。
（８）被験動物由来の生物学的試料におけるＧ３ＢＰ２蛋白質もしくはその断片、又はこれらをコードする核酸を前立腺癌の判定マーカーとする、被験動物における前立腺癌のリスクを判定する方法。
（９）Ｇ３ＢＰ２蛋白質もしくはその断片、又はこれらをコードする核酸からなる前立腺癌の判定マーカー。
（１）Ｇ３ＢＰ２遺伝子の発現を抑制するための二本鎖核酸分子を有効成分として含む前立腺癌の予防又は治療剤。
（２）二本鎖核酸分子が次の（ａ）及び（ｂ）を含む二本鎖核酸分子である上記（１）に記載の前立腺癌の予防又は治療剤。
（ａ）配列番号２〜７のいずれかに示される標的配列に対応するヌクレオチド配列を含むセンス鎖
（ｂ）前記（ａ）のセンス鎖に相補的なヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖
（３）二本鎖核酸分子の各鎖の３´末端が、２塩基〜６塩基突出した突出末端である上記（２）に記載の前立腺癌の予防又は治療剤。
（４）二本鎖核酸分子の長さが、２３塩基から２９塩基の少なくともいずれかである上記（１）〜（３）のいずれかに記載の前立腺癌の予防又は治療剤。
（５）二本鎖核酸分子が二本鎖ＲＮＡである上記（１）〜（４）のいずれかに記載の前立腺癌の予防又は治療剤。
（６）二本鎖核酸分子がｓｉＲＮＡである上記（５）に記載の前立腺癌の予防又は治療剤。
（７）前立腺癌細胞の増殖を抑制するための上記（１）〜（６）のいずれかに記載の前立腺癌の予防又は治療剤。
（８）被験動物由来の生物学的試料におけるＧ３ＢＰ２蛋白質もしくはその断片、又はこれらをコードする核酸を前立腺癌の判定マーカーとする、被験動物における前立腺癌のリスクを判定する方法。
（９）Ｇ３ＢＰ２蛋白質もしくはその断片、又はこれらをコードする核酸からなる前立腺癌の判定マーカー。
本発明の判定マーカーの提供により、新たな前立腺癌の診断、治療選択法を提供することが可能となる。さらに、本発明のＧ３ＢＰ２遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ等の二本鎖核酸分子の提供により、前立腺癌の治療において有用な新たな治療剤、治療方法方等の提供が可能となる。さらに、本発明の二本鎖核酸分子と、前立腺癌の治療に有効とされるＰＩポリアミドや、本発明者らが先願で開示している二本鎖核酸分子等とを組み合わせることによって、前立腺癌の網羅的な治療等も可能となる。
本発明の「前立腺癌の予防又は治療剤」とは、Ｇ３ＢＰ２遺伝子の発現を抑制するための二本鎖核酸分子を有効成分として含む剤であり、この二本鎖核酸分子により、Ｇ３ＢＰ２遺伝子の発現を抑制することにより前立腺癌を予防又は治療できる剤のことをいう。
前立腺癌の予防又は治療が可能な剤であれば、有効成分の他にその他の成分や医薬として許容される担体等を含んでいても良い。
前立腺癌の予防又は治療が可能な剤であれば、有効成分の他にその他の成分や医薬として許容される担体等を含んでいても良い。
「Ｇ３ＢＰ２遺伝子」は、ヒト乳癌細胞において過剰発現しており予後不良因子であることが報告されている。本発明において「Ｇ３ＢＰ２遺伝子」は、そのｍＲＮＡ配列が前記二本鎖核酸分子の標的となり、前記二本鎖核酸分子によってその発現が抑制されることから、前記二本鎖核酸分子の「標的遺伝子」と示されることがある。
なお、参考として、ヒトの前記「Ｇ３ＢＰ２遺伝子」の塩基配列を配列表配列番号１に示す。
なお、参考として、ヒトの前記「Ｇ３ＢＰ２遺伝子」の塩基配列を配列表配列番号１に示す。
本発明の「二本鎖核酸分子」とは、所望のセンス鎖とアンチセンス鎖とがハイブリダイズしてなる二本鎖の核酸分子のことをいう。
本発明の「二本鎖核酸分子」は、Ｇ３ＢＰ２遺伝子の発現を抑制することができる二本鎖核酸分子であれば、いずれのヌクレオチド配列を含むセンス鎖及びアンチセンス鎖からなる「二本鎖核酸分子」であっても良い。
本発明のこのような「二本鎖核酸分子」は、次の（ａ）及び（ｂ）を含む二本鎖核酸分子であることが特に好ましい。
（ａ）配列番号２〜７のいずれかに示される標的配列に対応するヌクレオチド配列を含むセンス鎖
（ｂ）前記（ａ）のセンス鎖に相補的なヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖
これらのセンス鎖及びアンチセンス鎖は、ＲＮＡ鎖であってもよく、ＲＮＡ−ＤＮＡキメラ鎖等であってもよい。これらのセンス鎖とアンチセンス鎖が互いにハイブリダイズすることで本発明の「二本鎖核酸分子」を形成することができる。
本発明の「二本鎖核酸分子」は、Ｇ３ＢＰ２遺伝子の発現を抑制することができる二本鎖核酸分子であれば、いずれのヌクレオチド配列を含むセンス鎖及びアンチセンス鎖からなる「二本鎖核酸分子」であっても良い。
本発明のこのような「二本鎖核酸分子」は、次の（ａ）及び（ｂ）を含む二本鎖核酸分子であることが特に好ましい。
（ａ）配列番号２〜７のいずれかに示される標的配列に対応するヌクレオチド配列を含むセンス鎖
（ｂ）前記（ａ）のセンス鎖に相補的なヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖
これらのセンス鎖及びアンチセンス鎖は、ＲＮＡ鎖であってもよく、ＲＮＡ−ＤＮＡキメラ鎖等であってもよい。これらのセンス鎖とアンチセンス鎖が互いにハイブリダイズすることで本発明の「二本鎖核酸分子」を形成することができる。
本発明の「二本鎖核酸分子」は、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、二本鎖ＲＮＡ（ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ ＲＮＡ：ｄｓＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ−ＤＮＡキメラ等であってもよい。
「二本鎖ＲＮＡ」とは、センス鎖及びアンチセンス鎖のいずれもがＲＮＡ配列からなる二本鎖核酸分子のことをいう。また、「二本鎖ＲＮＡ−ＤＮＡキメラ」とは、センス鎖及びアンチセンス鎖のいずれもがＲＮＡとＤＮＡとのキメラ配列で構成されてなる二本鎖核酸分子をいう。
「二本鎖ＲＮＡ」とは、センス鎖及びアンチセンス鎖のいずれもがＲＮＡ配列からなる二本鎖核酸分子のことをいう。また、「二本鎖ＲＮＡ−ＤＮＡキメラ」とは、センス鎖及びアンチセンス鎖のいずれもがＲＮＡとＤＮＡとのキメラ配列で構成されてなる二本鎖核酸分子をいう。
本発明の「二本鎖核酸分子」が二本鎖ＲＮＡである場合、ｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）であることが特に好ましい。
「ｓｉＲＮＡ」とは、１８〜２９塩基長の小分子二本鎖ＲＮＡであり、標的遺伝子のｍＲＮＡに対して相補的な配列を有するアンチセンス鎖（ガイド鎖）が、標的遺伝子のｍＲＮＡを切断し、標的遺伝子の発現を抑制する機能を有する。
本発明における「ｓｉＲＮＡ」は、Ｇ３ＢＰ２遺伝子を標的遺伝子とし、この標的遺伝子の発現を抑制し得るものであれば、その末端構造に特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。例えば、本発明の「ｓｉＲＮＡ」は、平滑末端を有するものであってもよく、突出末端（オーバーハング）を有するものであってもよい。
本発明の「ｓｉＲＮＡ」は、特に、センス鎖及びアンチセンス鎖の３’末端が２〜６塩基突出した構造を有することが好ましく、各鎖の３’末端が２塩基突出した構造を有することがより好ましい。
「ｓｉＲＮＡ」とは、１８〜２９塩基長の小分子二本鎖ＲＮＡであり、標的遺伝子のｍＲＮＡに対して相補的な配列を有するアンチセンス鎖（ガイド鎖）が、標的遺伝子のｍＲＮＡを切断し、標的遺伝子の発現を抑制する機能を有する。
本発明における「ｓｉＲＮＡ」は、Ｇ３ＢＰ２遺伝子を標的遺伝子とし、この標的遺伝子の発現を抑制し得るものであれば、その末端構造に特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。例えば、本発明の「ｓｉＲＮＡ」は、平滑末端を有するものであってもよく、突出末端（オーバーハング）を有するものであってもよい。
本発明の「ｓｉＲＮＡ」は、特に、センス鎖及びアンチセンス鎖の３’末端が２〜６塩基突出した構造を有することが好ましく、各鎖の３’末端が２塩基突出した構造を有することがより好ましい。
また、本発明の「二本鎖核酸分子」が二本鎖ＲＮＡである場合、ｓｈＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ）であってもよい。
「ｓｈＲＮＡ」とは、１８〜２９塩基程度のｄｓＲＮＡ領域と３〜９塩基程度のｌｏｏｐ領域を含む一本鎖ＲＮＡであり、生体内で発現されることにより、塩基対を形成してヘアピン状の二本鎖ＲＮＡとなる。その後、ｓｈＲＮＡはＤｉｃｅｒ（ＲＮａｓｅ ＩＩＩ酵素）により切断されてｓｉＲＮＡとなり、標的遺伝子の発現抑制に機能することができる。
本発明における「ｓｈＲＮＡ」の末端構造も、本発明の「ｓｉＲＮＡ」と同様に目的に応じて適宜選択することができ、平滑末端を有するものであってもよく、突出末端（オーバーハング）を有するものであってもよい。
「ｓｈＲＮＡ」とは、１８〜２９塩基程度のｄｓＲＮＡ領域と３〜９塩基程度のｌｏｏｐ領域を含む一本鎖ＲＮＡであり、生体内で発現されることにより、塩基対を形成してヘアピン状の二本鎖ＲＮＡとなる。その後、ｓｈＲＮＡはＤｉｃｅｒ（ＲＮａｓｅ ＩＩＩ酵素）により切断されてｓｉＲＮＡとなり、標的遺伝子の発現抑制に機能することができる。
本発明における「ｓｈＲＮＡ」の末端構造も、本発明の「ｓｉＲＮＡ」と同様に目的に応じて適宜選択することができ、平滑末端を有するものであってもよく、突出末端（オーバーハング）を有するものであってもよい。
さらに、本発明の「二本鎖核酸分子」が「二本鎖ＲＮＡ−ＤＮＡキメラ」である場合、これはキメラｓｉＲＮＡであることが特に好ましい。
「キメラｓｉＲＮＡ」とは、ｓｉＲＮＡのＲＮＡ配列の一部がＤＮＡに変換された、１８〜２９塩基長の小分子二本鎖ＲＮＡ−ＤＮＡキメラをいう。特に、ｓｉＲＮＡのセンス鎖の３’側の８塩基、及び、アンチセンス鎖の５’側の６塩基がＤＮＡに変換された、２１〜２３塩基長の小分子二本鎖ＲＮＡ−ＤＮＡキメラであることが好ましい。
本発明における「キメラｓｉＲＮＡ」の末端構造も、本発明の「ｓｉＲＮＡ」と同様に目的に応じて適宜選択することができ、平滑末端を有するものであってもよく、突出末端（オーバーハング）を有するものであってもよい。
「キメラｓｉＲＮＡ」とは、ｓｉＲＮＡのＲＮＡ配列の一部がＤＮＡに変換された、１８〜２９塩基長の小分子二本鎖ＲＮＡ−ＤＮＡキメラをいう。特に、ｓｉＲＮＡのセンス鎖の３’側の８塩基、及び、アンチセンス鎖の５’側の６塩基がＤＮＡに変換された、２１〜２３塩基長の小分子二本鎖ＲＮＡ−ＤＮＡキメラであることが好ましい。
本発明における「キメラｓｉＲＮＡ」の末端構造も、本発明の「ｓｉＲＮＡ」と同様に目的に応じて適宜選択することができ、平滑末端を有するものであってもよく、突出末端（オーバーハング）を有するものであってもよい。
本発明の「二本鎖核酸分子」は、目的に応じて、適宜修飾を有するものであってもよい。例えば、「二本鎖核酸分子」に、２’Ｏ−ｍｅｔｈｙｌ化修飾や、ホスホロチオエート化（Ｓ化）修飾、ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）修飾等を施し、核酸分解酵素（ヌクレアーゼ）に対する耐性の付与や、培養液や生体中における安定性を向上させることができる。
また、前記二本鎖核酸分子のセンス鎖の５’端、又は３’端に、ナノ粒子、コレステロール、細胞膜通過ペプチド等の修飾を施し、細胞への導入効率を高めることもできる。
このような修飾は、従来知られているいずれかの方法によって、適宜行うことができる。
また、前記二本鎖核酸分子のセンス鎖の５’端、又は３’端に、ナノ粒子、コレステロール、細胞膜通過ペプチド等の修飾を施し、細胞への導入効率を高めることもできる。
このような修飾は、従来知られているいずれかの方法によって、適宜行うことができる。
このような、本発明の「二本鎖核酸分子」は、従来知られているいずれかの方法によって、適宜作成することができる。例えば、「二本鎖核酸分子」が「ｓｉＲＮＡ」である場合、センス鎖及びアンチセンス鎖に相当する１８〜２９塩基長の一本鎖ＲＮＡを、既存のＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成装置を利用する等して化学的に合成し、これらをアニーリングすることによって作製することができる。
また、本発明における「ｓｉＲＮＡ」は、合成受託会社に合成を依頼して作製されたものであっても良く、市販品の二本鎖ｓｉＲＮＡであっても良い。さらに、ｓｉＲＮＡ発現ベクターを構築し、この発現ベクターを細胞内に導入することにより、細胞内の反応を利用して作製した「ｓｉＲＮＡ」であっても良い。
本発明の「二本鎖核酸分子」が「キメラｓｉＲＮＡ」である場合は、例えば、キメラ核酸分子であるセンス鎖とアンチセンス鎖とをそれぞれ化学的に合成し、これらをアニーリングすることによって作製することができる。
また、本発明における「ｓｉＲＮＡ」は、合成受託会社に合成を依頼して作製されたものであっても良く、市販品の二本鎖ｓｉＲＮＡであっても良い。さらに、ｓｉＲＮＡ発現ベクターを構築し、この発現ベクターを細胞内に導入することにより、細胞内の反応を利用して作製した「ｓｉＲＮＡ」であっても良い。
本発明の「二本鎖核酸分子」が「キメラｓｉＲＮＡ」である場合は、例えば、キメラ核酸分子であるセンス鎖とアンチセンス鎖とをそれぞれ化学的に合成し、これらをアニーリングすることによって作製することができる。
このような本発明の「二本鎖核酸分子」のうち、前記「（ａ）配列番号２〜７のいずれかに示される標的配列に対応するヌクレオチド配列を含むセンス鎖」として、例えば、配列番号８、１０、１２、１４、１６又は１８に示されるセンス鎖を挙げることができる。
また、「（ｂ）前記（ａ）のセンス鎖に相補的なヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖」としては、配列番号９，１１、１３、１５、１７又は１９に示されるアンチセンス鎖を挙げることができる。
また、本発明の「二本鎖核酸分子」には、Ｇ３ＢＰ２遺伝子の発現を抑制することができる二本鎖核酸分子である、配列番号２０又は２２に示されるヌクレオチド配列を含むセンス鎖と、その相補的なヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖として、配列番号２１又は２３に示されるアンチセンス鎖を挙げることもできる。
また、「（ｂ）前記（ａ）のセンス鎖に相補的なヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖」としては、配列番号９，１１、１３、１５、１７又は１９に示されるアンチセンス鎖を挙げることができる。
また、本発明の「二本鎖核酸分子」には、Ｇ３ＢＰ２遺伝子の発現を抑制することができる二本鎖核酸分子である、配列番号２０又は２２に示されるヌクレオチド配列を含むセンス鎖と、その相補的なヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖として、配列番号２１又は２３に示されるアンチセンス鎖を挙げることもできる。
このような本発明の「二本鎖核酸分子」を有効成分として含むことで本発明の「前立腺癌の予防又は治療剤」を得ることができる。
本発明の「前立腺癌の予防又は治療剤」はこの有効成分のみからなる剤であってもよく、この有効成分以外にその他の成分を含むものであっても良い。
「その他の成分」としては、本発明の有効成分の効果を維持又は向上できる成分であれば、目的に応じて適宜選択することができる。例えば、本発明の「二本鎖核酸分子」を所望の濃度に希釈するための生理食塩水、培養液等の希釈用剤や、対象とする細胞内に導入（トランスフェクト）するためのトランスフェクション試薬などが挙げられる。
これらのその他の成分の含有量も、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
本発明の「前立腺癌の予防又は治療剤」はこの有効成分のみからなる剤であってもよく、この有効成分以外にその他の成分を含むものであっても良い。
「その他の成分」としては、本発明の有効成分の効果を維持又は向上できる成分であれば、目的に応じて適宜選択することができる。例えば、本発明の「二本鎖核酸分子」を所望の濃度に希釈するための生理食塩水、培養液等の希釈用剤や、対象とする細胞内に導入（トランスフェクト）するためのトランスフェクション試薬などが挙げられる。
これらのその他の成分の含有量も、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
また、「その他の成分」として、例えば、医薬として許容され得る担体を含むことができ、このような担体としても、特に制限はなく、剤型等に応じて適宜選択することができ、その含有量も、目的に応じて適宜選択することができる。
本発明の「前立腺癌の予防又は治療剤」の医薬としての剤型は、特に制限はなく、所望の投与方法に応じて適宜選択することができる。このような剤型として、例えば、経口固形剤（錠剤、被覆錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤等）、経口液剤（内服液剤、シロップ剤、エリキシル剤等）、注射剤（溶液、懸濁液、用事溶解用固形剤等）、軟膏剤、貼付剤、ゲル剤、クリーム剤、外用散剤、スプレー剤、又は吸入散剤などが挙げられる。
これらの剤には、目的に応じて、従来知られている賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味・矯臭剤、緩衝剤、安定化剤、ｐＨ調節剤、等張化剤、基剤、湿潤剤、保存剤、クリーム剤、ゲル剤、ペースト剤等の添加剤を加えることができ、各剤型も従来知られている方法によって製造することができる。
本発明の「前立腺癌の予防又は治療剤」の医薬としての剤型は、特に制限はなく、所望の投与方法に応じて適宜選択することができる。このような剤型として、例えば、経口固形剤（錠剤、被覆錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤等）、経口液剤（内服液剤、シロップ剤、エリキシル剤等）、注射剤（溶液、懸濁液、用事溶解用固形剤等）、軟膏剤、貼付剤、ゲル剤、クリーム剤、外用散剤、スプレー剤、又は吸入散剤などが挙げられる。
これらの剤には、目的に応じて、従来知られている賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味・矯臭剤、緩衝剤、安定化剤、ｐＨ調節剤、等張化剤、基剤、湿潤剤、保存剤、クリーム剤、ゲル剤、ペースト剤等の添加剤を加えることができ、各剤型も従来知られている方法によって製造することができる。
本発明の「前立腺癌の予防又は治療剤」は、投与対象動物に特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。例えば、ヒト、マウス、ラット、ウシ、ブタ、サル、イヌ、ネコなどが挙げられるが、これらの中でも、ヒトを対象とすることが特に好ましい。
また、この投与方法も、特に制限はなく、剤型、前立腺癌患者の状態等に応じて、本発明の剤を腫瘍部位等に直接投与する局所投与や、経口投与等により、全身投与することもできる。
この剤の投与量は、特に制限はなく、投与対象である患者の年齢、体重、所望の効果の程度等に応じて適宜選択することができる。例えば、成人を投与対象とする場合は、１日の投与あたり、有効成分（二本鎖核酸分子）の量が１０〜１５ｍｇとなることが好ましい。
また、この剤の投与回数も、特に制限はなく、投与対象である患者の年齢、体重、所望の効果等に応じて、適宜選択することができる。
本発明の「前立腺癌の予防又は治療剤」は、前立腺癌の予防又は治療を対象として投与時期を適宜選択することができる。
また、この投与方法も、特に制限はなく、剤型、前立腺癌患者の状態等に応じて、本発明の剤を腫瘍部位等に直接投与する局所投与や、経口投与等により、全身投与することもできる。
この剤の投与量は、特に制限はなく、投与対象である患者の年齢、体重、所望の効果の程度等に応じて適宜選択することができる。例えば、成人を投与対象とする場合は、１日の投与あたり、有効成分（二本鎖核酸分子）の量が１０〜１５ｍｇとなることが好ましい。
また、この剤の投与回数も、特に制限はなく、投与対象である患者の年齢、体重、所望の効果等に応じて、適宜選択することができる。
本発明の「前立腺癌の予防又は治療剤」は、前立腺癌の予防又は治療を対象として投与時期を適宜選択することができる。
また、本発明の「被験動物における前立腺癌のリスクを判定する方法」とは、例えば、ヒトを被験動物とした際に、そのヒト由来の前立腺組織や該組織から抽出した蛋白質、核酸等を生物学的試料とし、該試料に含まれるＧ３ＢＰ２蛋白質もしくはその断片、又はこれらをコードする核酸を定性的又は定量的に測定することにより、前立腺癌のリスクを判定する方法のことをいう。
上記のような生物学的試料に含まれるＧ３ＢＰ２蛋白質もしくはその断片、又はこれらをコードする核酸の量が多いほど、前立腺癌に罹患するリスクや、既に罹患しているリスクが高く、罹患している場合は将来、治療抵抗性前立腺癌になるリスクが高いと判定することができる。
この判定にあたり、「Ｇ３ＢＰ２蛋白質もしくはその断片、又はこれらをコードする核酸」を前立腺癌の「判定マーカー」として用いることができる。
この「判定マーカー」が「Ｇ３ＢＰ２蛋白質もしくはその断片」である場合は、Ｇ３ＢＰ２抗体等を用いて、定性的又は定量的に測定することができる。また、「判定マーカー」が「これらをコードする核酸」である場合は、この核酸に相補的な核酸を含むプローブや、この核酸をＲＴ−ＰＣＲ等で増幅可能なプライマーを用いて増幅することにより、定性的又は定量的に測定することができる。
この「被験動物における前立腺癌のリスクを判定する方法」によって得られた結果から、前立腺癌の治療方法を選択することも可能となる。
上記のような生物学的試料に含まれるＧ３ＢＰ２蛋白質もしくはその断片、又はこれらをコードする核酸の量が多いほど、前立腺癌に罹患するリスクや、既に罹患しているリスクが高く、罹患している場合は将来、治療抵抗性前立腺癌になるリスクが高いと判定することができる。
この判定にあたり、「Ｇ３ＢＰ２蛋白質もしくはその断片、又はこれらをコードする核酸」を前立腺癌の「判定マーカー」として用いることができる。
この「判定マーカー」が「Ｇ３ＢＰ２蛋白質もしくはその断片」である場合は、Ｇ３ＢＰ２抗体等を用いて、定性的又は定量的に測定することができる。また、「判定マーカー」が「これらをコードする核酸」である場合は、この核酸に相補的な核酸を含むプローブや、この核酸をＲＴ−ＰＣＲ等で増幅可能なプライマーを用いて増幅することにより、定性的又は定量的に測定することができる。
この「被験動物における前立腺癌のリスクを判定する方法」によって得られた結果から、前立腺癌の治療方法を選択することも可能となる。
本発明において、手術不能な進行性前立腺癌患者から得られた検体のうち、去勢抵抗性前立腺癌に対するドセタキセル導入後のＰＳＡ再発率が高い検体において、特にＧ３ＢＰ２の染色強度が強いことが確認されており、該検体を生物学的試料とし、該試料に含まれる判定マーカーであるＧ３ＢＰ２の存在を定性的、定量的に調べることにより、将来の治療抵抗性前立腺癌になるリスクを予測できることが確認されている。
また、Ｇ３ＢＰ２遺伝子の発現によって得られたＧ３ＢＰ２遺伝子のｍＲＮＡを判定マーカーとして、定性的、定量的に調べることにより、将来の治療抵抗性前立腺癌になるリスクを予測することも可能である。
本発明の「被験動物における前立腺癌のリスクを判定する方法」において、被験動物となる動物は前立腺癌になり得る動物であればその種類は問わず、いずれの動物も対象とすることができる。また、判定マーカーを定性的、定量的に調べるために、従来知られているいずれの機器、方法等も用いることができる。
また、Ｇ３ＢＰ２遺伝子の発現によって得られたＧ３ＢＰ２遺伝子のｍＲＮＡを判定マーカーとして、定性的、定量的に調べることにより、将来の治療抵抗性前立腺癌になるリスクを予測することも可能である。
本発明の「被験動物における前立腺癌のリスクを判定する方法」において、被験動物となる動物は前立腺癌になり得る動物であればその種類は問わず、いずれの動物も対象とすることができる。また、判定マーカーを定性的、定量的に調べるために、従来知られているいずれの機器、方法等も用いることができる。
以下に本発明の実施例、比較例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は、これらに何ら限定されるものではない。
［実施例１］
１−１．臨床検体を用いた免疫染色及び前立腺癌患者におけるＧ３ＢＰ２の発現と癌特異的生存率との関連性の評価
Ｇ３ＢＰ２の前立腺癌組織における発現を検証するため、１０１例の根治的前立腺全摘除術により得られた前立腺癌検体および、手術不能な進行性前立腺癌である３７例の経直腸的前立腺生検術で得られた前立腺癌検体を用いて免疫染色を行った。また、これらの検体について、ｐ５３の発現も検証した。
進行性前立腺癌の３７例の患者に関しては、全例で初期治療としてホルモン療法が施行されており、後に去勢抵抗性前立腺癌に進行し、ドセタキセル化学療法が施行されている。
１−１．臨床検体を用いた免疫染色及び前立腺癌患者におけるＧ３ＢＰ２の発現と癌特異的生存率との関連性の評価
Ｇ３ＢＰ２の前立腺癌組織における発現を検証するため、１０１例の根治的前立腺全摘除術により得られた前立腺癌検体および、手術不能な進行性前立腺癌である３７例の経直腸的前立腺生検術で得られた前立腺癌検体を用いて免疫染色を行った。また、これらの検体について、ｐ５３の発現も検証した。
進行性前立腺癌の３７例の患者に関しては、全例で初期治療としてホルモン療法が施行されており、後に去勢抵抗性前立腺癌に進行し、ドセタキセル化学療法が施行されている。
各検体から得られた５ｍｍスライスのパラフィン切片についてそれぞれ脱パラフィン処理を行った後、電子レンジで加熱処理し、抗原を賦活化した。
０．３％Ｈ２Ｏ２で内因性ペルオキシダーゼ除去を行い、ウエスタンブロットで用いたＧ３ＢＰ２抗体（Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ，ＵＳＡ；１：１００希釈）をオーバーナイトで反応させ、２次抗体（ビオチン化抗体）を１時間反応させ、３，３０−ジアミノベンジジン２０９（ＤＡＢ）溶液（１ｍＭ ＤＡＢ、５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ緩衝液ｐＨ７．６２１０、および０．００６％Ｈ２Ｏ２）を用いて可視化した。
Ｇ３ＢＰ２の定量的評価として、染色強度を３段階に、１視野における発現の割合を４段階に分類し、それぞれ加算したものを用いた。ｐ５３の発現の検証には、ｐ５３抗体（ＳＡＮＴＡ ＣＲＵＺ；１：１００希釈）を反応させた。
０．３％Ｈ２Ｏ２で内因性ペルオキシダーゼ除去を行い、ウエスタンブロットで用いたＧ３ＢＰ２抗体（Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ，ＵＳＡ；１：１００希釈）をオーバーナイトで反応させ、２次抗体（ビオチン化抗体）を１時間反応させ、３，３０−ジアミノベンジジン２０９（ＤＡＢ）溶液（１ｍＭ ＤＡＢ、５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ緩衝液ｐＨ７．６２１０、および０．００６％Ｈ２Ｏ２）を用いて可視化した。
Ｇ３ＢＰ２の定量的評価として、染色強度を３段階に、１視野における発現の割合を４段階に分類し、それぞれ加算したものを用いた。ｐ５３の発現の検証には、ｐ５３抗体（ＳＡＮＴＡ ＣＲＵＺ；１：１００希釈）を反応させた。
上記の定量的評価の結果から、前立腺全摘除術症例１０１例において、Ｇ３ＢＰ２の発現と癌特異的生存率との関連性を評価した。
また、経直腸的前立腺生検術で得られた進行性前立腺癌３７例をおいて、Ｇ３ＢＰ２の発現とドセタキセル導入後のＰＳＡ再発率との関連を評価した。この評価はそれぞれ、カプランマイヤー法ならびにＬｏｇ−Ｒａｎｋ検定により行った。さらに、主な患者背景因子との関連性を評価した。
また、経直腸的前立腺生検術で得られた進行性前立腺癌３７例をおいて、Ｇ３ＢＰ２の発現とドセタキセル導入後のＰＳＡ再発率との関連を評価した。この評価はそれぞれ、カプランマイヤー法ならびにＬｏｇ−Ｒａｎｋ検定により行った。さらに、主な患者背景因子との関連性を評価した。
１−２．結果
図１に前立腺全摘除術症例１０１例における、前立腺癌組織内におけるＧ３ＢＰ２の発現と癌特異的生存率との関連性を評価した結果を示した。Ｇ３ＢＰ２の発現の定量は発現強度と発現の割合をスコアリングしたものを用いた。図１に示されるように、１０１例のうち、Ｇ３ＢＰ２の強発現群（１８例）（図１、Ｈｉｇｈ ｉｍｍｕｎｏｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｇ３ＢＰ２）では、Ｇ３ＢＰ２の弱発現群（８３例）（図１、Ｌｏｗ ｉｍｍｕｎｏｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｇ３ＢＰ２）と比べて前立腺全摘術後の癌特異的生存率が有意に低かった。
また、図３（Ａ）にＧ３ＢＰ２の強発現群（図３（Ａ）、Ｈｉｇｈ）および弱発現群（図３（Ａ）、Ｌｏｗ）における免疫染色の結果を示した。図１、３（Ａ）に示されるように、Ｇ３ＢＰ２は前立腺癌組織においてＧｌｅａｓｏｎ ｓｃｏｒｅの高い症例に高発現している傾向が認められた。
さらに、表１および表２に示されるように、前立腺全摘患者において、Ｇ３ＢＰ２の発現が、有意にＧｌｅａｓｏｎ Ｓｃｏｒｅと相関し、多変量解析において、有意な予後因子となることが認められた。
図１に前立腺全摘除術症例１０１例における、前立腺癌組織内におけるＧ３ＢＰ２の発現と癌特異的生存率との関連性を評価した結果を示した。Ｇ３ＢＰ２の発現の定量は発現強度と発現の割合をスコアリングしたものを用いた。図１に示されるように、１０１例のうち、Ｇ３ＢＰ２の強発現群（１８例）（図１、Ｈｉｇｈ ｉｍｍｕｎｏｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｇ３ＢＰ２）では、Ｇ３ＢＰ２の弱発現群（８３例）（図１、Ｌｏｗ ｉｍｍｕｎｏｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｇ３ＢＰ２）と比べて前立腺全摘術後の癌特異的生存率が有意に低かった。
また、図３（Ａ）にＧ３ＢＰ２の強発現群（図３（Ａ）、Ｈｉｇｈ）および弱発現群（図３（Ａ）、Ｌｏｗ）における免疫染色の結果を示した。図１、３（Ａ）に示されるように、Ｇ３ＢＰ２は前立腺癌組織においてＧｌｅａｓｏｎ ｓｃｏｒｅの高い症例に高発現している傾向が認められた。
さらに、表１および表２に示されるように、前立腺全摘患者において、Ｇ３ＢＰ２の発現が、有意にＧｌｅａｓｏｎ Ｓｃｏｒｅと相関し、多変量解析において、有意な予後因子となることが認められた。
図２に前立腺全摘除術症例１０１例における、ｐ５３の細胞質優位な発現と癌特異的生存率との関連性を評価した結果を示した。図２に示されるように、１０１例のうち、ｐ５３が細胞質優位に発現している（図２、ｐ５３ ｃｙｔｏｓｏｌ ｓｔａｉｎｉｎｇ（＋））のは２９例であり、ｐ５３が細胞質優位に発現していない（図２、ｐ５３ ｃｙｔｏｓｏｌ ｓｔａｉｎｉｎｇ（−））のは７２例であった。また、図３（Ｂ）にＧ３ＢＰ２の強発現群（Ｈｉｇｈ）および弱発現群（Ｌｏｗ）におけるｐ５３の免疫染色の結果の一例を示した。その結果、ｐ５３は、Ｇ３ＢＰ２の強発現群において有意に細胞質優位に染色される傾向が認められた（図３（Ｂ）、Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ（＋））。また、ｐ５３の細胞質優位な染色症例群では、癌特異的生存率も有意に低かった。さらに、表３に示されるように、Ｇ３ＢＰ２染色及びｐ５３細胞質染色の発現はカイ２乗検定にて有意に相関していることが確認された。
図４に経直腸的前立腺生検術で得られた進行性前立腺癌３７例をおける、前立腺癌組織内におけるＧ３ＢＰ２の発現とドセタキセル導入後のＰＳＡ再発率との関連性を評価した結果を示した。図４に示されるように、去勢抵抗性前立腺癌に対するドセタキセル導入後のＰＳＡ再発率もＧ３ＢＰ２の強発現群（２７例）（図４、Ｈｉｇｈ ｉｍｍｕｎｏｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｇ３ＢＰ２）において有意に高かった。
従って、これらの結果から、前立腺癌の診断を目的として採取した前立腺癌組織におけるＧ３ＢＰ２を免疫染色やウエスタンブロット等によって定性的、定量的に調べることにより、将来の治療抵抗性前立腺癌になるリスクを予測できることが示唆された。
従って、これらの結果から、前立腺癌の診断を目的として採取した前立腺癌組織におけるＧ３ＢＰ２を免疫染色やウエスタンブロット等によって定性的、定量的に調べることにより、将来の治療抵抗性前立腺癌になるリスクを予測できることが示唆された。
［実施例２］
二本鎖核酸分子（ｓｉＲＮＡ）の作製
Ｇ３ＢＰ２遺伝子の発現を抑制するための二本鎖核酸分子（ｓｉＲＮＡ）を、次のようにして準備した。
Ｇ３ＢＰ２遺伝子に対するｓｉＲＮＡ（ｓｉＧ３ＢＰ２）＃１〜＃６は、それぞれのｓｉＲＮＡの標的配列（表４、配列表配列番号２〜７）に対応するヌクレオチド配列（表５、センス鎖、配列番号８、１０、１２、１４、１６、１８）と、その相補的なヌクレオチド配列（表５、アンチセンス鎖、配列番号９、１１、１３、１５、１７、１９）を、３´末端が２塩基オーバーハングするような二本鎖ＲＮＡとして合成した（Ｓｉｇｍａ）。
二本鎖核酸分子（ｓｉＲＮＡ）の作製
Ｇ３ＢＰ２遺伝子の発現を抑制するための二本鎖核酸分子（ｓｉＲＮＡ）を、次のようにして準備した。
Ｇ３ＢＰ２遺伝子に対するｓｉＲＮＡ（ｓｉＧ３ＢＰ２）＃１〜＃６は、それぞれのｓｉＲＮＡの標的配列（表４、配列表配列番号２〜７）に対応するヌクレオチド配列（表５、センス鎖、配列番号８、１０、１２、１４、１６、１８）と、その相補的なヌクレオチド配列（表５、アンチセンス鎖、配列番号９、１１、１３、１５、１７、１９）を、３´末端が２塩基オーバーハングするような二本鎖ＲＮＡとして合成した（Ｓｉｇｍａ）。
［実施例３］
二本鎖核酸分子によるＧ３ＢＰ２遺伝子発現に対する効果の検討
３−１．細胞培養
ＡＲ陽性のヒト前立腺癌細胞株ＬＮＣａＰ細胞（以下、単にＬＮＣａＰ細胞と示す）を用いた。
ＬＮＣａＰ細胞は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ，Ｓｉｇｍａ社）、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を含むＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｓｉｇｍａ社）を細胞培養液として、空気中に５％の炭酸ガスを含む培養器内にて３７℃で培養した。
二本鎖核酸分子によるＧ３ＢＰ２遺伝子発現に対する効果の検討
３−１．細胞培養
ＡＲ陽性のヒト前立腺癌細胞株ＬＮＣａＰ細胞（以下、単にＬＮＣａＰ細胞と示す）を用いた。
ＬＮＣａＰ細胞は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ，Ｓｉｇｍａ社）、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を含むＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｓｉｇｍａ社）を細胞培養液として、空気中に５％の炭酸ガスを含む培養器内にて３７℃で培養した。
３−２．トランスフェクション
上記３−１．にて培養したＬＮＣａＰ細胞を６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに３×１０５個／ｗｅｌｌになるように播いた。その後２４時間以内に、実施例２にて作製した５０μＭ ｓｉＧ３ＢＰ２ ＃１〜＃６（６種類）又はネガティブコントロール（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の２０μＭ ｓｉＲＮＡを、それぞれ１０ｎＭになるように調製して各ウェルに加え、トランスフェクションを行った。
トランスフェクション後７２時間以内に、細胞からＩＳＯＧＥＮ（日本ジーン）によって全ＲＮＡを回収し、そのうちの５００ｎｇのＲＮＡから、Ｐｒｉｍｅｓｃｒｉｐｔ（登録商標） ＲＴ ｒｅａｇｅｎｔ ｋｉｔ（ＴａＫａＲａ Ｂｉｏ）によってｃＤＮＡを合成した。
上記３−１．にて培養したＬＮＣａＰ細胞を６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに３×１０５個／ｗｅｌｌになるように播いた。その後２４時間以内に、実施例２にて作製した５０μＭ ｓｉＧ３ＢＰ２ ＃１〜＃６（６種類）又はネガティブコントロール（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の２０μＭ ｓｉＲＮＡを、それぞれ１０ｎＭになるように調製して各ウェルに加え、トランスフェクションを行った。
トランスフェクション後７２時間以内に、細胞からＩＳＯＧＥＮ（日本ジーン）によって全ＲＮＡを回収し、そのうちの５００ｎｇのＲＮＡから、Ｐｒｉｍｅｓｃｒｉｐｔ（登録商標） ＲＴ ｒｅａｇｅｎｔ ｋｉｔ（ＴａＫａＲａ Ｂｉｏ）によってｃＤＮＡを合成した。
３−３−１．定量的Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ法
上記３−２．にて合成したｃＤＮＡを１０倍希釈し、そのうちの２μｌを定量的ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲに使用した。内部コントロールにはＧＡＰＤＨ遺伝子を用いて補正を行い、発現レベルの解析を行った。
Ｓｔｅｐ ｏｎｅ（登録商標） ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ（Ａｐｐｌｉｅｄ ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）ならびにＫＡＰＡ ＳＹＢＲ（登録商標） Ｆａｓｔ ＰＣＲ ｋｉｔ（ＮＩＰＰＯＮ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）を用いて、各ＳｉＲＮＡをトランスフェクションしたＬＮＣａＰ細胞のＧ３ＢＰ２遺伝子及び内部コントロールであるＧＡＰＤＨ遺伝子の発現レベルを測定した。ＧＡＰＤＨ遺伝子の測定にあたり用いたプライマーはＧＡＰＤＨ ｆｏｒｗａｒｄ（５’−ＧＧＴＧＧＴＣＴＣＣＴＣＴＧＡＣＴＴＣＡＡＣＡ−３’（配列番号２５））およびＧＡＰＤＨ ｒｅｖｅｒｓｅ（５’−ＧＴＧＧＴＣＧＴＴＧＡＧＧＧＣＡＡＴＧ−３’（配列番号２６））であり、Ｇ３ＢＰ２遺伝子の測定にあたり用いたプライマーはＧ３ＢＰ２ ｆｏｒｗａｒｄ（５’−ＴＧＴＧＧＡＡＣＴＴＣＧＣＡＴＣＡＡＴＡＣＣ−３’（配列番号２７））およびＧ３ＢＰ２ ｒｅｖｅｒｓｅ（５’−ＡＡＡＣＧＴＡＣＴＴＣＣＣＣＴＣＧＡＡＡＣＡ−３’（配列番号２８））であった。
ＧＡＰＤＨ遺伝子に対する発現レベルをＣｙｃｌｅ数からΔΔＣｔ法を用いて計算して補正を行い、Ｇ３ＢＰ２遺伝子の発現レベルを調べた。
上記３−２．にて合成したｃＤＮＡを１０倍希釈し、そのうちの２μｌを定量的ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲに使用した。内部コントロールにはＧＡＰＤＨ遺伝子を用いて補正を行い、発現レベルの解析を行った。
Ｓｔｅｐ ｏｎｅ（登録商標） ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ（Ａｐｐｌｉｅｄ ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）ならびにＫＡＰＡ ＳＹＢＲ（登録商標） Ｆａｓｔ ＰＣＲ ｋｉｔ（ＮＩＰＰＯＮ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）を用いて、各ＳｉＲＮＡをトランスフェクションしたＬＮＣａＰ細胞のＧ３ＢＰ２遺伝子及び内部コントロールであるＧＡＰＤＨ遺伝子の発現レベルを測定した。ＧＡＰＤＨ遺伝子の測定にあたり用いたプライマーはＧＡＰＤＨ ｆｏｒｗａｒｄ（５’−ＧＧＴＧＧＴＣＴＣＣＴＣＴＧＡＣＴＴＣＡＡＣＡ−３’（配列番号２５））およびＧＡＰＤＨ ｒｅｖｅｒｓｅ（５’−ＧＴＧＧＴＣＧＴＴＧＡＧＧＧＣＡＡＴＧ−３’（配列番号２６））であり、Ｇ３ＢＰ２遺伝子の測定にあたり用いたプライマーはＧ３ＢＰ２ ｆｏｒｗａｒｄ（５’−ＴＧＴＧＧＡＡＣＴＴＣＧＣＡＴＣＡＡＴＡＣＣ−３’（配列番号２７））およびＧ３ＢＰ２ ｒｅｖｅｒｓｅ（５’−ＡＡＡＣＧＴＡＣＴＴＣＣＣＣＴＣＧＡＡＡＣＡ−３’（配列番号２８））であった。
ＧＡＰＤＨ遺伝子に対する発現レベルをＣｙｃｌｅ数からΔΔＣｔ法を用いて計算して補正を行い、Ｇ３ＢＰ２遺伝子の発現レベルを調べた。
３−３−２．結果
図５に示したように、ｓｉＧ３ＢＰ２ ＃１〜＃６をそれぞれトランスフェクションした細胞（図５、＃１、＃２、＃３、＃４、＃５または＃６）では、いずれもブランク（図５、Ｒｅａｇｅｎｔ）やネガティブコントロール（図５、ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ）と比べてｍＲＮＡレベルでＧ３ＢＰ２遺伝子の発現が抑制されており、ｓｉＧ３ＢＰ２ ＃１〜＃６のいずれをトランスフェクションした場合でも高い効果が得られることが確認された。特に、ｓｉＧ３ＢＰ２ ＃１、＃２、＃３、＃５、＃６をトランスフェクションした場合において、高い抑制効果が得られた。
図５に示したように、ｓｉＧ３ＢＰ２ ＃１〜＃６をそれぞれトランスフェクションした細胞（図５、＃１、＃２、＃３、＃４、＃５または＃６）では、いずれもブランク（図５、Ｒｅａｇｅｎｔ）やネガティブコントロール（図５、ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ）と比べてｍＲＮＡレベルでＧ３ＢＰ２遺伝子の発現が抑制されており、ｓｉＧ３ＢＰ２ ＃１〜＃６のいずれをトランスフェクションした場合でも高い効果が得られることが確認された。特に、ｓｉＧ３ＢＰ２ ＃１、＃２、＃３、＃５、＃６をトランスフェクションした場合において、高い抑制効果が得られた。
３−４−１．Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ法
上記３−２．にて各ＳｉＲＮＡをトランスフェクションしたＬＮＣａＰ細胞のＧ３ＢＰ２の発現レベルを測定した。トランスフェクション後７２時間以内の各細胞からＮＰ４０ ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ［５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），１５０ｍＭ ＮａＣｌ，１％ ＮＰ−４０，ａｎｄ Ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｋｔａｉｌ（Ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ， Ｋｙｏｔｏ， Ｊａｐａｎ）］を用いて全細胞抽出液を採取した。
該抽出液に含まれるタンパク質をＢＣＡ ａｓｓａｙにて濃度調整し、各サンプル１０μｇを８％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ ｇｅｌで泳動しＩｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ， Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ， ＭＡ）にブロットした。
一次抗体としてａｎｔｉ−Ｇ３ＢＰ２（Ａｂｃａｍ，１：１０００）を用いて一晩反応させ、ペルオキシダーゼの結合した抗ラビットＩｇＧ抗体を１時間反応させた。また、内部コントロールとして、ａｎｔｉ−β−ａｃｔｉｎ（Ｓｉｇｍａ，１：１０００）を用いて一晩反応させ、ペルオキシダーゼの結合した抗マウスＩｇＧ抗体を１時間反応させた。
抗原抗体複合体をＩｍｍｕｎｏＣｒｕｚ Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ ｄｅｔｅｃｔｏｒ ｓｙｓｔｅｍ （Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｉｎｃ）を用いて反応させＸ線フィルムへ撮影した。
上記３−２．にて各ＳｉＲＮＡをトランスフェクションしたＬＮＣａＰ細胞のＧ３ＢＰ２の発現レベルを測定した。トランスフェクション後７２時間以内の各細胞からＮＰ４０ ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ［５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），１５０ｍＭ ＮａＣｌ，１％ ＮＰ−４０，ａｎｄ Ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｋｔａｉｌ（Ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ， Ｋｙｏｔｏ， Ｊａｐａｎ）］を用いて全細胞抽出液を採取した。
該抽出液に含まれるタンパク質をＢＣＡ ａｓｓａｙにて濃度調整し、各サンプル１０μｇを８％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ ｇｅｌで泳動しＩｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ， Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ， ＭＡ）にブロットした。
一次抗体としてａｎｔｉ−Ｇ３ＢＰ２（Ａｂｃａｍ，１：１０００）を用いて一晩反応させ、ペルオキシダーゼの結合した抗ラビットＩｇＧ抗体を１時間反応させた。また、内部コントロールとして、ａｎｔｉ−β−ａｃｔｉｎ（Ｓｉｇｍａ，１：１０００）を用いて一晩反応させ、ペルオキシダーゼの結合した抗マウスＩｇＧ抗体を１時間反応させた。
抗原抗体複合体をＩｍｍｕｎｏＣｒｕｚ Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ ｄｅｔｅｃｔｏｒ ｓｙｓｔｅｍ （Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｉｎｃ）を用いて反応させＸ線フィルムへ撮影した。
３−４−２．結果
図６に示したように、ｓｉＧ３ＢＰ２ ＃１〜＃６をそれぞれトランスフェクションした細胞（図６、＃１、＃２、＃３、＃４、＃５または＃６）では、いずれもネガティブコントロール（図６、ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ）と比べて蛋白レベルでＧ３ＢＰ２の発現が抑制されており、ｓｉＧ３ＢＰ２ ＃１〜＃６のいずれをトランスフェクションした場合でも高い効果が得られることが確認された。
図６に示したように、ｓｉＧ３ＢＰ２ ＃１〜＃６をそれぞれトランスフェクションした細胞（図６、＃１、＃２、＃３、＃４、＃５または＃６）では、いずれもネガティブコントロール（図６、ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ）と比べて蛋白レベルでＧ３ＢＰ２の発現が抑制されており、ｓｉＧ３ＢＰ２ ＃１〜＃６のいずれをトランスフェクションした場合でも高い効果が得られることが確認された。
［実施例４］
二本鎖核酸分子によるＬＮＣａＰ細胞の増殖に対する効果の検討
４−１．ＭＴＳ ａｓｓａｙ
実施例３の３−１．と同様に培養したＬＮＣａＰ細胞を９６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに３×１０３個／ｗｅｌｌとなるよう播いた。その後２４時間以内に、実施例２で作製した各ｓｉＲＮＡ又はネガティブコントロールのｓｉＲＮＡを実施例３の２−２．と同様の濃度となるように調製してそれぞれ各ウェルに加え、トランスフェクションを行った。
その後、１日、４日、５日又は６日経過後にＣｅｌｌ ｔｉｔｅｒ ９６（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）を加えて２時間反応させた。その後、マイクロプレートリーダーにて吸光度４９０ｎｍで生細胞数を測定し、細胞増殖能を調べた。
二本鎖核酸分子によるＬＮＣａＰ細胞の増殖に対する効果の検討
４−１．ＭＴＳ ａｓｓａｙ
実施例３の３−１．と同様に培養したＬＮＣａＰ細胞を９６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに３×１０３個／ｗｅｌｌとなるよう播いた。その後２４時間以内に、実施例２で作製した各ｓｉＲＮＡ又はネガティブコントロールのｓｉＲＮＡを実施例３の２−２．と同様の濃度となるように調製してそれぞれ各ウェルに加え、トランスフェクションを行った。
その後、１日、４日、５日又は６日経過後にＣｅｌｌ ｔｉｔｅｒ ９６（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）を加えて２時間反応させた。その後、マイクロプレートリーダーにて吸光度４９０ｎｍで生細胞数を測定し、細胞増殖能を調べた。
４−２．結果
図７に示したように、ブランク（図７、Ｒｅａｇｅｎｔ）やネガティブコントロール（図７、ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ）と比べてｓｉＧ３ＢＰ２ ＃１〜＃６をそれぞれトランスフェクションした細胞（図７、＃１、＃２、＃３、＃４、＃５または＃６）ではいずれも有意に細胞増殖が抑制されたが、ｓｉＧ３ＢＰ２＃１、同＃２をトランスフェクションした細胞において特に有意に細胞増殖が抑えられていた。
図７に示したように、ブランク（図７、Ｒｅａｇｅｎｔ）やネガティブコントロール（図７、ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ）と比べてｓｉＧ３ＢＰ２ ＃１〜＃６をそれぞれトランスフェクションした細胞（図７、＃１、＃２、＃３、＃４、＃５または＃６）ではいずれも有意に細胞増殖が抑制されたが、ｓｉＧ３ＢＰ２＃１、同＃２をトランスフェクションした細胞において特に有意に細胞増殖が抑えられていた。
［実施例５］
二本鎖核酸分子によるＬＮＣａＰ細胞の遊走能に対する効果の検討
５−１．細胞遊走能の評価
実施例２で作製した各ｓｉＲＮＡのうちｓｉＧ３ＢＰ２＃１、同＃２又はネガティブコントロールのｓｉＲＮＡ（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を導入した細胞を培養し、Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｅｒ Ｉｎｓｅｒｔと、８．０μｍ ｐｏｒｅ ｓｉｚｅ ＰＥＴ ｆｉｌｔｅｒ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ製）を用いてＣｅｌｌ ｍｉｇｒａｔｉｏｎアッセイによって各細胞の遊走能を検討した。
即ち、培養皿にＰＢＳで１０μｇ／ｍｌに希釈したフィブロネクチン（Ｓｉｇｍａ製）を３０分間作用させ、下層フィルターを作成した後、下層チャンバーにフェノールレッド含有培地ＲＰＭＩ １６４０培地を７００μｌ加えた。
各ｓｉＲＮＡを５μＭとなるように添加したフェノールレッド含有培地で３日間培養したＬＮＣａＰ細胞を５×１０４細胞ごとに分け、各細胞を３００μｌのフェノールレッド含有培地に懸濁したものをそれぞれ上層チャンバーに加えた。これを、３７℃、５％ＣＯ２条件下で２４時間培養した後、フィルターを剥がした。
下層フィルター上の細胞を３０分間メタノールで固定した後、ＰＢＳで洗浄し、Ｇｉｍｓａ‘ｓ ｓｔａｉｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｍｕｔｏ Ｐｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ製）で３０秒間インキュベートした。その後、細胞を２００倍率の蛍光顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ ｅｃｌｉｐｓｅ ＴＥ ２０００−Ｕ； Ｎｉｋｏｎ， Ｔｏｋｙｏ， Ｊａｐａｎ）×４００視野にてランダム５視野で撮影し、細胞数を数えることで、細胞遊走能を評価した。
二本鎖核酸分子によるＬＮＣａＰ細胞の遊走能に対する効果の検討
５−１．細胞遊走能の評価
実施例２で作製した各ｓｉＲＮＡのうちｓｉＧ３ＢＰ２＃１、同＃２又はネガティブコントロールのｓｉＲＮＡ（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を導入した細胞を培養し、Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｅｒ Ｉｎｓｅｒｔと、８．０μｍ ｐｏｒｅ ｓｉｚｅ ＰＥＴ ｆｉｌｔｅｒ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ製）を用いてＣｅｌｌ ｍｉｇｒａｔｉｏｎアッセイによって各細胞の遊走能を検討した。
即ち、培養皿にＰＢＳで１０μｇ／ｍｌに希釈したフィブロネクチン（Ｓｉｇｍａ製）を３０分間作用させ、下層フィルターを作成した後、下層チャンバーにフェノールレッド含有培地ＲＰＭＩ １６４０培地を７００μｌ加えた。
各ｓｉＲＮＡを５μＭとなるように添加したフェノールレッド含有培地で３日間培養したＬＮＣａＰ細胞を５×１０４細胞ごとに分け、各細胞を３００μｌのフェノールレッド含有培地に懸濁したものをそれぞれ上層チャンバーに加えた。これを、３７℃、５％ＣＯ２条件下で２４時間培養した後、フィルターを剥がした。
下層フィルター上の細胞を３０分間メタノールで固定した後、ＰＢＳで洗浄し、Ｇｉｍｓａ‘ｓ ｓｔａｉｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｍｕｔｏ Ｐｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ製）で３０秒間インキュベートした。その後、細胞を２００倍率の蛍光顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ ｅｃｌｉｐｓｅ ＴＥ ２０００−Ｕ； Ｎｉｋｏｎ， Ｔｏｋｙｏ， Ｊａｐａｎ）×４００視野にてランダム５視野で撮影し、細胞数を数えることで、細胞遊走能を評価した。
５−２．結果
図８に細胞遊走能の評価結果を示した。その結果、図８に示されるように、ｓｉＧ３ＢＰ２＃１、同＃２等の本発明のｓｉＲＮＡを導入することにより、ネガティブコントロールのｓｉＲＮＡ（図８、ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ）を導入した場合と比べて顕著に細胞の遊走が抑制されることが認められた。
図８に細胞遊走能の評価結果を示した。その結果、図８に示されるように、ｓｉＧ３ＢＰ２＃１、同＃２等の本発明のｓｉＲＮＡを導入することにより、ネガティブコントロールのｓｉＲＮＡ（図８、ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ）を導入した場合と比べて顕著に細胞の遊走が抑制されることが認められた。
［実施例６］
二本鎖核酸分子が細胞周期や細胞死に与える効果の検討
二本鎖核酸分子がＬＮＣａＰ細胞の細胞周期や細胞死に与える効果を検討した。一方で、ＬＮＣａＰ細胞において、Ｇ３ＢＰ２安定過剰発現細胞株（Ｓｔａｂｌｅ細胞）を作製し、Ｇ３ＢＰ２遺伝子の過剰発現によるＬＮＣａＰ細胞の細胞周期や細胞死に与える効果を検討した。
二本鎖核酸分子が細胞周期や細胞死に与える効果の検討
二本鎖核酸分子がＬＮＣａＰ細胞の細胞周期や細胞死に与える効果を検討した。一方で、ＬＮＣａＰ細胞において、Ｇ３ＢＰ２安定過剰発現細胞株（Ｓｔａｂｌｅ細胞）を作製し、Ｇ３ＢＰ２遺伝子の過剰発現によるＬＮＣａＰ細胞の細胞周期や細胞死に与える効果を検討した。
６−１．Ｇ３ＢＰ２安定過剰発現細胞株（Ｓｔａｂｌｅ細胞）の作製
ｐｃＤＮＡ３．１−ＦＬＡＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて作製したＧ３ＢＰ２発現ｖｅｃｔｏｒをＬＮＣａＰ細胞にトランスフェクションした。Ｇ４１８ ５００μｇ／ｍｌで処理し、Ｎ末端にＦｌａｇ付きのＧ３ＢＰ２安定過剰発現細胞株（２株）（Ｆｌａｇ−Ｇ３ＢＰ２ ＃１，同＃２）を作製した。比較として、ｐｃＤＮＡ３．１−ＦＬＡＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のみをトランスフェクションした細胞株（２株）（ｖｅｃｔｏｒ ＃１，同＃２）も作製した。
ｐｃＤＮＡ３．１−ＦＬＡＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて作製したＧ３ＢＰ２発現ｖｅｃｔｏｒをＬＮＣａＰ細胞にトランスフェクションした。Ｇ４１８ ５００μｇ／ｍｌで処理し、Ｎ末端にＦｌａｇ付きのＧ３ＢＰ２安定過剰発現細胞株（２株）（Ｆｌａｇ−Ｇ３ＢＰ２ ＃１，同＃２）を作製した。比較として、ｐｃＤＮＡ３．１−ＦＬＡＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のみをトランスフェクションした細胞株（２株）（ｖｅｃｔｏｒ ＃１，同＃２）も作製した。
６−２−１．Ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ ａｎａｌｙｓｉｓ
１０ｃｍ ｄｉｓｈにＬＮＣａＰ細胞を培養し、ｓｉＲＮＡ １０ｎＭを４８時間作用させた。また、上記６−１．にて作製したＳｔａｂｌｅ細胞にドセタキセル（Ｄｏｃｅｔａｘｅｌ：ＤＴＸ）１ｎＭを４８時間作用させた。
次に、それぞれの細胞について、細胞周期を揃えるためにＰＢＳでよく洗った後、ｐｈｅｎｏｌ−ｒｅｄ ｆｒｅｅ ＲＰＭＩ １６４０ ｍｅｄｉｕｍで２４時間細胞培養を行った。その後、２０％ ＦＣＳになるように培養液を調整し２４時間培養したのちにＰＢＳ、７０％エタノールで洗い、０．５％ ＲＮａｓｅを３７℃で３０分作用させた。
測定はＣｅｌｌ Ｑｕｅｓｔ ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いたＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙにて３０，０００個の細胞にて行った。
１０ｃｍ ｄｉｓｈにＬＮＣａＰ細胞を培養し、ｓｉＲＮＡ １０ｎＭを４８時間作用させた。また、上記６−１．にて作製したＳｔａｂｌｅ細胞にドセタキセル（Ｄｏｃｅｔａｘｅｌ：ＤＴＸ）１ｎＭを４８時間作用させた。
次に、それぞれの細胞について、細胞周期を揃えるためにＰＢＳでよく洗った後、ｐｈｅｎｏｌ−ｒｅｄ ｆｒｅｅ ＲＰＭＩ １６４０ ｍｅｄｉｕｍで２４時間細胞培養を行った。その後、２０％ ＦＣＳになるように培養液を調整し２４時間培養したのちにＰＢＳ、７０％エタノールで洗い、０．５％ ＲＮａｓｅを３７℃で３０分作用させた。
測定はＣｅｌｌ Ｑｕｅｓｔ ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いたＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙにて３０，０００個の細胞にて行った。
６−２−２．結果
図９にｓｉＲＮＡ １０ｎＭを４８時間作用させたＬＮＣａＰ細胞（図９、ｓｉＧ３ＢＰ２ ＃１、ｓｉＧ３ＢＰ２ ＃２）におけるＣｅｌｌ ｃｙｃｌｅ ａｎａｌｙｓｉｓの結果を示した。その結果、本発明のｓｉＧ３ＢＰ２＃１又は同＃２等を導入し、Ｇ３ＢＰ２遺伝子の発現をノックダウンすることにより、前立腺癌細胞（ＬＮＣａＰ細胞）においてＳ期が有意に減少することが確認できた。図９のｓｉＣｏｎｔｒｏｌは、ネガティブコントロールのｓｉＲＮＡを作用させたＬＮＣａＰ細胞の結果を示したものである。
また、図１０にＳｔａｂｌｅ細胞（図１０、Ｆｌａｇ−Ｇ３ＢＰ２ ＃１、＃２）におけるＣｅｌｌ ｃｙｃｌｅ ａｎａｌｙｓｉｓの結果を示した。また、比較として、ｐｃＤＮＡ３．１−ＦＬＡＧのみをトランスフェクションした細胞株（図１０、Ｖｅｃｔｏｒ ＃１、＃２）の結果も示した。
その結果、図１０に示されるように、Ｇ３ＢＰ２遺伝子を過剰発現させることにより、前立腺癌細胞（ＬＮＣａＰ細胞）において細胞周期のＳ期が有意に亢進されることが確認できた。
図９にｓｉＲＮＡ １０ｎＭを４８時間作用させたＬＮＣａＰ細胞（図９、ｓｉＧ３ＢＰ２ ＃１、ｓｉＧ３ＢＰ２ ＃２）におけるＣｅｌｌ ｃｙｃｌｅ ａｎａｌｙｓｉｓの結果を示した。その結果、本発明のｓｉＧ３ＢＰ２＃１又は同＃２等を導入し、Ｇ３ＢＰ２遺伝子の発現をノックダウンすることにより、前立腺癌細胞（ＬＮＣａＰ細胞）においてＳ期が有意に減少することが確認できた。図９のｓｉＣｏｎｔｒｏｌは、ネガティブコントロールのｓｉＲＮＡを作用させたＬＮＣａＰ細胞の結果を示したものである。
また、図１０にＳｔａｂｌｅ細胞（図１０、Ｆｌａｇ−Ｇ３ＢＰ２ ＃１、＃２）におけるＣｅｌｌ ｃｙｃｌｅ ａｎａｌｙｓｉｓの結果を示した。また、比較として、ｐｃＤＮＡ３．１−ＦＬＡＧのみをトランスフェクションした細胞株（図１０、Ｖｅｃｔｏｒ ＃１、＃２）の結果も示した。
その結果、図１０に示されるように、Ｇ３ＢＰ２遺伝子を過剰発現させることにより、前立腺癌細胞（ＬＮＣａＰ細胞）において細胞周期のＳ期が有意に亢進されることが確認できた。
６−３−１．定量的Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ法
ｓｉＲＮＡ １０ｎＭを４８時間作用させたＬＮＣａＰ細胞およびＤＴＸ １ｎＭを４８時間作用させたＳｔａｂｌｅ細胞からＩＳＯＧＥＮ（日本ジーン）によってそれぞれの全ＲＮＡを回収し、そのうちの５００ｎｇのＲＮＡから、Ｐｒｉｍｅｓｃｒｉｐｔ（登録商標） ＲＴ ｒｅａｇｅｎｔ ｋｉｔ（ＴａＫａＲａ Ｂｉｏ）によってｃＤＮＡを合成した。
上記３−３−１．に示したＧＡＰＤＨ遺伝子およびＧ３ＢＰ２遺伝子を増幅するためのプライマーを用いて、ＡＢＩ ｓｔｅｐ ｏｎｅ（商標）（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ， ＵＳＡ）により、各遺伝子の発現量を定量化した。
ｓｉＲＮＡ １０ｎＭを４８時間作用させたＬＮＣａＰ細胞およびＤＴＸ １ｎＭを４８時間作用させたＳｔａｂｌｅ細胞からＩＳＯＧＥＮ（日本ジーン）によってそれぞれの全ＲＮＡを回収し、そのうちの５００ｎｇのＲＮＡから、Ｐｒｉｍｅｓｃｒｉｐｔ（登録商標） ＲＴ ｒｅａｇｅｎｔ ｋｉｔ（ＴａＫａＲａ Ｂｉｏ）によってｃＤＮＡを合成した。
上記３−３−１．に示したＧＡＰＤＨ遺伝子およびＧ３ＢＰ２遺伝子を増幅するためのプライマーを用いて、ＡＢＩ ｓｔｅｐ ｏｎｅ（商標）（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ， ＵＳＡ）により、各遺伝子の発現量を定量化した。
６−３−２．結果
図１１にｓｉＲＮＡ １０ｎＭを４８時間作用させたＬＮＣａＰ細胞における定量的Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ法の結果を示した。その結果、図１１に示されるように、本発明のｓｉＧ３ＢＰ２ ＃１又は同＃２等を導入し、Ｇ３ＢＰ２遺伝子の発現をノックダウンした前立腺癌細胞（ＬＮＣａＰ細胞）（図１１、ｓｉＧ３ＢＰ２ ＃１、ｓｉＧ３ＢＰ２ ＃２）において、ｐ５３により誘導されるａｐｏｐｔｏｓｉｓで転写活性化されるＢＡＸ及びＮＯＸＡの有意な転写活性化が確認できた。図１１のｓｉＣｏｎｔｒｏｌは、ネガティブコントロールのｓｉＲＮＡを作用させたＬＮＣａＰ細胞の結果を示したものである。
また、図１２にＤＴＸ １ｎＭを４８時間作用させたＳｔａｂｌｅ細胞（図１２、Ｆｌａｇ−Ｇ３ＢＰ２ ＃１、＃２）における定量的Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ法の結果を示した。また、比較として、ｐｃＤＮＡ３．１−ＦＬＡＧのみをトランスフェクションした細胞株（図１２、Ｖｅｃｔｏｒ ＃１、＃２）の結果も示した。
その結果、図１２に示されるように、Ｇ３ＢＰ２遺伝子を過剰発現させることにより、前立腺癌細胞（ＬＮＣａＰ細胞）において、ＢＡＸ及びＮＯＸＡの転写活性化が有意に抑制されていることが確認できた。
図１１にｓｉＲＮＡ １０ｎＭを４８時間作用させたＬＮＣａＰ細胞における定量的Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ法の結果を示した。その結果、図１１に示されるように、本発明のｓｉＧ３ＢＰ２ ＃１又は同＃２等を導入し、Ｇ３ＢＰ２遺伝子の発現をノックダウンした前立腺癌細胞（ＬＮＣａＰ細胞）（図１１、ｓｉＧ３ＢＰ２ ＃１、ｓｉＧ３ＢＰ２ ＃２）において、ｐ５３により誘導されるａｐｏｐｔｏｓｉｓで転写活性化されるＢＡＸ及びＮＯＸＡの有意な転写活性化が確認できた。図１１のｓｉＣｏｎｔｒｏｌは、ネガティブコントロールのｓｉＲＮＡを作用させたＬＮＣａＰ細胞の結果を示したものである。
また、図１２にＤＴＸ １ｎＭを４８時間作用させたＳｔａｂｌｅ細胞（図１２、Ｆｌａｇ−Ｇ３ＢＰ２ ＃１、＃２）における定量的Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ法の結果を示した。また、比較として、ｐｃＤＮＡ３．１−ＦＬＡＧのみをトランスフェクションした細胞株（図１２、Ｖｅｃｔｏｒ ＃１、＃２）の結果も示した。
その結果、図１２に示されるように、Ｇ３ＢＰ２遺伝子を過剰発現させることにより、前立腺癌細胞（ＬＮＣａＰ細胞）において、ＢＡＸ及びＮＯＸＡの転写活性化が有意に抑制されていることが確認できた。
６−４−１．ＴＵＮＥＬ ａｓｓａｙ
２４ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに３．０×１０４個になるようにＬＮＣａＰ細胞を播き、ｓｉＲＮＡ １０ｎＭを作用させた。また、同様にＳｔａｂｌｅ細胞を播き、ＤＴＸ １ｎＭを作用させた。
作用後４８時間経過後にＩｎ Ｓｉｔｕ Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ， ＡＰ（Ｒｏｃｈｅ）を用いてアポトーシスを起こしている細胞を標識した。光学顕微鏡を用いて、ランダムに５視野を撮影し、細胞死として標識されている細胞数を数え定量化した。
２４ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに３．０×１０４個になるようにＬＮＣａＰ細胞を播き、ｓｉＲＮＡ １０ｎＭを作用させた。また、同様にＳｔａｂｌｅ細胞を播き、ＤＴＸ １ｎＭを作用させた。
作用後４８時間経過後にＩｎ Ｓｉｔｕ Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ， ＡＰ（Ｒｏｃｈｅ）を用いてアポトーシスを起こしている細胞を標識した。光学顕微鏡を用いて、ランダムに５視野を撮影し、細胞死として標識されている細胞数を数え定量化した。
６−４−２．結果
図１３にｓｉＲＮＡ １０ｎＭを４８時間作用させたＬＮＣａＰ細胞におけるＴＵＮＥＬ ａｓｓａｙの結果を示した。その結果、本発明のｓｉＧ３ＢＰ２ ＃１又は同＃２等を導入し、Ｇ３ＢＰ２遺伝子の発現をノックダウンした前立腺癌細胞（ＬＮＣａＰ細胞）（図１３、ｓｉＧ３ＢＰ２ ＃１、ｓｉＧ３ＢＰ２ ＃２）のａｐｏｐｔｏｓｉｓが起こることが確認できた。図１３のｓｉＣｏｎｔｒｏｌは、ネガティブコントロールのｓｉＲＮＡを作用させたＬＮＣａＰ細胞の結果を示したものである。さらに、図１３において、この細胞（図１３、ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ Ｖｅｈｉｃｌｅ）およびＳｔａｂｌｅ細胞（図１３、Ｇ３ＢＰ２ ＃１Ｖｅｈｉｃｌｅ）の写真を示した。
また、図１４にＤＴＸ １ｎＭを４８時間作用させたＳｔａｂｌｅ細胞（図１４、Ｆｌａｇ−Ｇ３ＢＰ２ ＃１、＃２）におけるＴＵＮＥＬ ａｓｓａｙの結果を示した。また、比較として、ｐｃＤＮＡ３．１−ＦＬＡＧのみをトランスフェクションした細胞株（図１４、Ｖｅｃｔｏｒ ＃１、＃２）の結果も示した。さらに、図１４において、Ｓｔａｂｌｅ細胞（図１４、Ｆｌａｇ−Ｇ３ＢＰ２ ＃１）およびｐｃＤＮＡ３．１−ＦＬＡＧのみをトランスフェクションした細胞株（図１４、Ｖｅｃｔｏｒ ＃１）の写真を示した。
これらの結果から、図１４に示されるように、Ｇ３ＢＰ２遺伝子を過剰発現させることにより、前立腺癌細胞（ＬＮＣａＰ細胞）において、ａｐｏｐｔｏｓｉｓの誘導が有意に抑制されており、ａｎｔｉ−ａｐｏｐｔｏｓｉｓ作用を獲得していることが確認できた。
従って、これらの結果から、前立腺癌の発症、進行にＧ３ＢＰ２遺伝子の発現が深く関わっており、前立腺癌の予防、治療において、この遺伝子の発現を制御することが有用であることが示された。
図１３にｓｉＲＮＡ １０ｎＭを４８時間作用させたＬＮＣａＰ細胞におけるＴＵＮＥＬ ａｓｓａｙの結果を示した。その結果、本発明のｓｉＧ３ＢＰ２ ＃１又は同＃２等を導入し、Ｇ３ＢＰ２遺伝子の発現をノックダウンした前立腺癌細胞（ＬＮＣａＰ細胞）（図１３、ｓｉＧ３ＢＰ２ ＃１、ｓｉＧ３ＢＰ２ ＃２）のａｐｏｐｔｏｓｉｓが起こることが確認できた。図１３のｓｉＣｏｎｔｒｏｌは、ネガティブコントロールのｓｉＲＮＡを作用させたＬＮＣａＰ細胞の結果を示したものである。さらに、図１３において、この細胞（図１３、ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ Ｖｅｈｉｃｌｅ）およびＳｔａｂｌｅ細胞（図１３、Ｇ３ＢＰ２ ＃１Ｖｅｈｉｃｌｅ）の写真を示した。
また、図１４にＤＴＸ １ｎＭを４８時間作用させたＳｔａｂｌｅ細胞（図１４、Ｆｌａｇ−Ｇ３ＢＰ２ ＃１、＃２）におけるＴＵＮＥＬ ａｓｓａｙの結果を示した。また、比較として、ｐｃＤＮＡ３．１−ＦＬＡＧのみをトランスフェクションした細胞株（図１４、Ｖｅｃｔｏｒ ＃１、＃２）の結果も示した。さらに、図１４において、Ｓｔａｂｌｅ細胞（図１４、Ｆｌａｇ−Ｇ３ＢＰ２ ＃１）およびｐｃＤＮＡ３．１−ＦＬＡＧのみをトランスフェクションした細胞株（図１４、Ｖｅｃｔｏｒ ＃１）の写真を示した。
これらの結果から、図１４に示されるように、Ｇ３ＢＰ２遺伝子を過剰発現させることにより、前立腺癌細胞（ＬＮＣａＰ細胞）において、ａｐｏｐｔｏｓｉｓの誘導が有意に抑制されており、ａｎｔｉ−ａｐｏｐｔｏｓｉｓ作用を獲得していることが確認できた。
従って、これらの結果から、前立腺癌の発症、進行にＧ３ＢＰ２遺伝子の発現が深く関わっており、前立腺癌の予防、治療において、この遺伝子の発現を制御することが有用であることが示された。
［実施例７］
二本鎖核酸分子による腫瘍増殖に対する効果の検討
７−１．ヌードマウスへの癌細胞皮下移植
オスの８週齢のＢＡＬＢ／ｃヌードマウス（日本クレア社）（二十匹）を用いた。
ヌードマウス一匹あたり、実施例３の２−１．と同様に培養したＬＮＣａＰ細胞が１ｘ１０７個になるようにＰＢＳ １００μｌと混合し、さらに、これとマトリゲル（ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）１００μｌを混合し、２５Ｇ注射針を用いて各マウスへ皮下注射した。
二本鎖核酸分子による腫瘍増殖に対する効果の検討
７−１．ヌードマウスへの癌細胞皮下移植
オスの８週齢のＢＡＬＢ／ｃヌードマウス（日本クレア社）（二十匹）を用いた。
ヌードマウス一匹あたり、実施例３の２−１．と同様に培養したＬＮＣａＰ細胞が１ｘ１０７個になるようにＰＢＳ １００μｌと混合し、さらに、これとマトリゲル（ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）１００μｌを混合し、２５Ｇ注射針を用いて各マウスへ皮下注射した。
７−２．二本鎖核酸分子の投与
上記７−１．の皮下注射後５〜８週経過し、各マウスにおける腫瘍体積が１００ｍｍ３を超える大きさに達したところで二本鎖核酸分子の投与を行った。
二本鎖核酸分子は、実施例２で作製したうちのｓｉＧ３ＢＰ２ ＃１を用い、ＢａｎｎｏＮｅｇａＣｏｎ（株式会社ＲＮＡｉ）（５’−ＧＵＡＣＣＧＣＡＣＧＵＣＡＵＵＣＧＵＡＵＣ−３’（配列番号２４））をネガティブコントロールとした。
ｓｉＲＮＡ又はネガティブコントロール各５μｇをＲＮＡｉ ＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）１５μｌとｐｈｅｎｏｌ ｒｅｄ−ｆｒｅｅ ＯＰＴＩ−ＭＥＭを混合し、各ｓｉＲＮＡ溶液を得た。このｓｉＲＮＡ溶液１００μｌを各マウスの腫瘍内へ局所注入により投与した。この投与は２回／週を４週間繰り返し、マウスの腫瘍径を週１回測定した。
マウスの腫瘍径は、長径（ｒ１）、及び短径（ｒ２，ｒ３）を２か所計測し、ｒ１×ｒ２×ｒ３／２の公式にて腫瘍の大きさを計測した。また、投与開始５週間後、アバチンにて麻酔をかけ、腫瘍の大きさが分かるように写真撮影をした。
その結果、図１５に示すように、本発明のｓｉＧ３ＢＰ２ ＃１を投与した場合（図１５、ｓｉＧ３ＢＰ２ ＃１）、ネガティブコントロール（図１５、ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ）と比べて腫瘍が小さくなることが目視できた。実際、図１６に示すように、本発明のｓｉＧ３ＢＰ２＃１を投与する（図１６、ｓｉＧ３ＢＰ２ ＃１）ことにより、ネガティブコントロール（図１６、ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ）と比べてマウスにおける腫瘍の増殖が有意に抑制されることが確認できた。
上記７−１．の皮下注射後５〜８週経過し、各マウスにおける腫瘍体積が１００ｍｍ３を超える大きさに達したところで二本鎖核酸分子の投与を行った。
二本鎖核酸分子は、実施例２で作製したうちのｓｉＧ３ＢＰ２ ＃１を用い、ＢａｎｎｏＮｅｇａＣｏｎ（株式会社ＲＮＡｉ）（５’−ＧＵＡＣＣＧＣＡＣＧＵＣＡＵＵＣＧＵＡＵＣ−３’（配列番号２４））をネガティブコントロールとした。
ｓｉＲＮＡ又はネガティブコントロール各５μｇをＲＮＡｉ ＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）１５μｌとｐｈｅｎｏｌ ｒｅｄ−ｆｒｅｅ ＯＰＴＩ−ＭＥＭを混合し、各ｓｉＲＮＡ溶液を得た。このｓｉＲＮＡ溶液１００μｌを各マウスの腫瘍内へ局所注入により投与した。この投与は２回／週を４週間繰り返し、マウスの腫瘍径を週１回測定した。
マウスの腫瘍径は、長径（ｒ１）、及び短径（ｒ２，ｒ３）を２か所計測し、ｒ１×ｒ２×ｒ３／２の公式にて腫瘍の大きさを計測した。また、投与開始５週間後、アバチンにて麻酔をかけ、腫瘍の大きさが分かるように写真撮影をした。
その結果、図１５に示すように、本発明のｓｉＧ３ＢＰ２ ＃１を投与した場合（図１５、ｓｉＧ３ＢＰ２ ＃１）、ネガティブコントロール（図１５、ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ）と比べて腫瘍が小さくなることが目視できた。実際、図１６に示すように、本発明のｓｉＧ３ＢＰ２＃１を投与する（図１６、ｓｉＧ３ＢＰ２ ＃１）ことにより、ネガティブコントロール（図１６、ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ）と比べてマウスにおける腫瘍の増殖が有意に抑制されることが確認できた。
７−３−１．Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ法
さらに、ＬＮＣａＰ細胞の移植から８週間後、腫瘍は皮下より摘出した。腫瘍は重量を計測した後、一部はＩＳＯＧＥＮによりＲＮＡを摘出し、一部はＮＰ４０ ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒにより溶解しタンパク質を抽出した。タンパク質の抽出は、腫瘍を５〜１０ｍｍ３の大きさに分け、５００μｌ ＮＰ４０ ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒを加え、ホモジナイザーですりつぶした後、その溶液を１５，０００ｒｐｍ，４℃，３０分で遠心し、上清を回収することで行った。
抽出したタンパク質をＳＤＳ ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒにより可溶化した後、８％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ ｇｅｌで泳動しＩｍｍｏｂｉｌｏｎ（登録商標）−Ｐ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ．，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）にブロットした。
一次抗体としてＧ３ＢＰ２抗体（Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ，ＵＳＡ；１：１０００希釈）を用いて一晩反応させ、ペルオキシダーゼの結合した抗ラビットＩｇＧ抗体を１時間反応させた。また、ａｎｔｉ−β−ａｃｔｉｎ（Ｓｉｇｍａ，１：１０００）を用いて一晩反応させ、ペルオキシダーゼの結合した抗マウスＩｇＧ抗体を１時間反応させた。
抗原抗体複合体をＩｍｍｕｎｏＣｒｕｚ（登録商標） Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ ｄｅｔｅｃｔｏｒ ｓｙｓｔｅｍ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ）を用いて反応させＸ線フィルムへ撮影した。
さらに、ＬＮＣａＰ細胞の移植から８週間後、腫瘍は皮下より摘出した。腫瘍は重量を計測した後、一部はＩＳＯＧＥＮによりＲＮＡを摘出し、一部はＮＰ４０ ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒにより溶解しタンパク質を抽出した。タンパク質の抽出は、腫瘍を５〜１０ｍｍ３の大きさに分け、５００μｌ ＮＰ４０ ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒを加え、ホモジナイザーですりつぶした後、その溶液を１５，０００ｒｐｍ，４℃，３０分で遠心し、上清を回収することで行った。
抽出したタンパク質をＳＤＳ ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒにより可溶化した後、８％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ ｇｅｌで泳動しＩｍｍｏｂｉｌｏｎ（登録商標）−Ｐ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ．，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）にブロットした。
一次抗体としてＧ３ＢＰ２抗体（Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ，ＵＳＡ；１：１０００希釈）を用いて一晩反応させ、ペルオキシダーゼの結合した抗ラビットＩｇＧ抗体を１時間反応させた。また、ａｎｔｉ−β−ａｃｔｉｎ（Ｓｉｇｍａ，１：１０００）を用いて一晩反応させ、ペルオキシダーゼの結合した抗マウスＩｇＧ抗体を１時間反応させた。
抗原抗体複合体をＩｍｍｕｎｏＣｒｕｚ（登録商標） Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ ｄｅｔｅｃｔｏｒ ｓｙｓｔｅｍ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ）を用いて反応させＸ線フィルムへ撮影した。
７−３−２．結果
図１７にウエスタンブロット法によるＧ３ＢＰ２蛋白量の解析結果を示した。図１７のＮｏ．１，Ｎｏ．２は、腫瘍を摘出した個体の違いを示すものである。その結果、図１７に示されるように、ｓｉＲＮＡを腫瘍内に投与する（図１７、ｓｉＧ３ＢＰ２ ＃１）ことにより、ネガティブコントロール（図１７、ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ）と比べてＧ３ＢＰ２の発現レベルが抑制されることが確認できた。
図１７にウエスタンブロット法によるＧ３ＢＰ２蛋白量の解析結果を示した。図１７のＮｏ．１，Ｎｏ．２は、腫瘍を摘出した個体の違いを示すものである。その結果、図１７に示されるように、ｓｉＲＮＡを腫瘍内に投与する（図１７、ｓｉＧ３ＢＰ２ ＃１）ことにより、ネガティブコントロール（図１７、ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ）と比べてＧ３ＢＰ２の発現レベルが抑制されることが確認できた。
本発明の判定マーカーの提供により、新たな前立腺癌の診断、治療選択法を提供することが可能となる。また、本発明のＧ３ＢＰ２遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ等の二本鎖核酸分子の提供により、前立腺癌の治療において有用な新たな治療剤、治療方法方等の提供が可能となる。また、本発明の二本鎖核酸分子と、前立腺癌の治療に有効とされる他の二本鎖核酸分子等を組み合わせることにより、前立腺癌の網羅的な治療等も可能となる。
Claims (6)
- Ｇ３ＢＰ２遺伝子の発現を抑制するための次の（ａ）及び（ｂ）を含む二本鎖核酸分子を有効成分として含む前立腺癌の予防又は治療剤。
（ａ）配列番号８、１０、１２、１４、１６又は１８に示される、配列番号２〜７のいずれかに示される標的配列に対応するヌクレオチド配列を含むセンス鎖
（ｂ）前記（ａ）のセンス鎖に相補的なヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖 - 二本鎖核酸分子の各鎖の３´末端が、２塩基〜６塩基突出した突出末端である請求項１に記載の前立腺癌の予防又は治療剤。
- 二本鎖核酸分子の長さが、２３塩基から２９塩基の少なくともいずれかである請求項１又は２に記載の前立腺癌の予防又は治療剤。
- 二本鎖核酸分子が二本鎖ＲＮＡである請求項１〜３のいずれかに記載の前立腺癌の予防又は治療剤。
- 二本鎖核酸分子がｓｉＲＮＡである請求項４に記載の前立腺癌の予防又は治療剤。
- 前立腺癌細胞の増殖を抑制するための請求項１〜５のいずれかに記載の前立腺癌の予防又は治療剤。
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