JP5892794B2 - 癌患者に対する免疫療法の治療効果および／または免疫療法後の予後の予測方法、ならびに該方法に用いる遺伝子セットおよびキット - Google Patents

Description

本発明は、癌患者に対する免疫療法の治療効果および／または免疫療法後の予後の予測方法、ならびに前記方法に用いる遺伝子セットおよびキットに関する。なお、本願は、日本国特許出願第２００９−２３０２７９号に対して優先権を主張するものであり、参照により該日本国特許出願の内容を本願に一体化させる。

各種がんに対する免疫療法は、一部奏効する症例があるものの、すべての患者にとって最適な治療法とはなりえていない。その原因の一つとして、免疫療法が、がん細胞の増殖を抑えるために個人差の大きい免疫能を介していることが上げられる。がんの免疫療法には、現在その効果を予測する方法がなく、治療を行ってみなければ有効性を判断することができない。これまでに、乳癌患者において遺伝子発現レベルを測定し化学療法の効果を予測する方法が知られているが、この方法は遺伝子発現と他の因子とを組み合わせる複雑な系であり、また、乳癌に対する化学療法の効果のみを対象としている（特許文献１）。がんの免疫療法の治療効果や、免疫療法後の患者の予後を予測する方法はこれまで知られていない。
特表２００８−５３６０９４号公報

本発明は、癌患者に対する免疫療法の治療効果を精度よく予測する方法を提供することを目的とする。

本発明者らは、長年におよぶ前立腺癌患者に対するペプチドワクチン療法で得られた結果に基づき、がん免疫療法の治療効果を予測することを試みた。まず、ペプチドワクチン療法前の前立腺癌患者における遺伝子発現プロファイルをＤＮＡマイクロアレイで解析した。次いで、治療後の生存日数を基準として患者を予後良好群と予後不良群に分類し、治療前の各遺伝子の発現レベルと治療後の生存日数との相関を調べたところ、両者の間に相関のある遺伝子が存在することが明らかとなった。そして、これら遺伝子の発現レベルから免疫療法後の患者の生存日数を予測できることを確認し、本発明を完成するにいたった。

すなわち、本発明は、癌患者に対する免疫療法の効果および／または免疫療法後の予後を予測する方法であって、
（１）免疫療法前の癌患者から採取された試料において、表１〜５のいずれかに示す遺伝子の群から選択される少なくとも１の遺伝子からなる遺伝子セットの各遺伝子の発現レベルを測定する工程、および
（２）前記発現レベルを統計処理し、予測生存日数を算出する工程、
を含む方法を提供する。

また、本発明は、癌患者に対する免疫療法の効果および／または免疫療法後の予後を予測するための遺伝子セットであって、表１〜５のいずれかに示す遺伝子の群から選択される少なくとも１の遺伝子からなる遺伝子セットを提供する。

さらに、本発明は、癌患者に対する免疫療法の効果および／または免疫療法後の予後を予測するためのキットであって、前記遺伝子セットの各遺伝子に対するプローブまたはプライマーを含むキットを提供する。

本発明により、癌患者の遺伝子発現プロファイルを免疫療法開始前に測定することで、その患者に対する免疫療法の治療効果および治療後の予後を予測することが可能となった。本発明は、癌患者に対する治療法の選択に有用な情報を提供する。

４０名の前立腺癌患者の生存日数の分布。 マイクロアレイデータの前処理。 Pearsonの積率相関係数による上位３００遺伝子の分布。 各遺伝子選択方法における生存日数予測率。 Pearsonの積率相関係数により選択された上位３００遺伝子（表１）の１番目の遺伝子から順に選択した遺伝子からなる３０の遺伝子セットによる生存日数予測精度。縦軸は予測が正解であった患者数を示す。 各患者の予測生存日数（Pearsonの積率相関係数、潜在変数３、上位５０遺伝子の遺伝子セットによる）と、実際の生存日数との比較。 生存日数予測結果を用いたKaplan-Meier生存曲線。 Pearsonの積率相関係数により選択された上位３００遺伝子（表１）の３００番目の遺伝子から順に選択した遺伝子からなる３０の遺伝子セットによる生存日数予測精度。縦軸は予測が正解であった患者数を示す。 Pearsonの積率相関係数により選択された上位３００遺伝子（表１）からランダムに選択した遺伝子からなる３０の遺伝子セットによる生存日数予測精度。縦軸は予測が正解であった患者数を示す。 生存日数３００日で予後良好群と予後不良群を分類した場合の生存日数予測結果。 Pearsonの積率相関係数により選択された上位３００遺伝子（表１）からランダムに選択した１の遺伝子による生存日数予測結果（１）（表１の順位をグラフ横に示す）。 Pearsonの積率相関係数により選択された上位３００遺伝子（表１）からランダムに選択した１の遺伝子による生存日数予測結果（２）（表１の順位をグラフ横に示す）。 Pearsonの積率相関係数により選択された上位３００遺伝子（表１）からランダムに選択した１の遺伝子による生存日数予測結果（３）（表１の順位をグラフ横に示す）。

本発明の予測方法は、その発現レベルが癌患者の免疫療法後の生存日数と高い相関を示した遺伝子を利用する。本発明の遺伝子セットは、表１〜５のいずれかに示す遺伝子の群から選択される少なくとも１の遺伝子から構成される。遺伝子は、表１〜５の１番目から順に選択しても、３００番目から順に選択しても、あるいはランダムに選択してもよい。予測率を考慮すると、１番目から順に選択することが好ましい。

遺伝子セット中の遺伝子数は、１以上であれば特に制限はない。例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００の遺伝子を選択することができる。

本発明の対象となる癌患者は特に限定されず、例えば前立腺癌、膵臓癌、乳癌、肝臓癌などの患者が挙げられる。本発明は、なかでも前立腺癌患者に対して好適に用いられる。

本発明において、免疫療法とは、癌患者における腫瘍抗原タンパク質に対する免疫応答を賦活化することにより癌を治療する方法を意味する。本発明の免疫療法としては、腫瘍抗原ペプチドを用いるペプチドワクチン療法、細胞傷害性Ｔ細胞やナチュラルキラー細胞などのリンパ球を用いる養子免疫療法、腫瘍抗原タンパク質や腫瘍抗原ペプチドを発現するウイルスベクターを生体に導入するＤＮＡワクチン、腫瘍抗原ペプチドを提示する樹状細胞を投与する樹状細胞ワクチンなどが挙げられる。本発明は、ペプチドワクチン療法に特に好適である。

本発明の方法において、遺伝子の発現レベルは、常套的方法により測定すればよい。発現レベルの測定方法としては、ＤＮＡマイクロアレイ法、ＤＮＡチップ法、ＰＣＲ法、ノーザンブロット法などが挙げられるが、なかでもＤＮＡマイクロアレイ法が好適である。

ＤＮＡマイクロアレイ法では、測定対象とする遺伝子に対するプローブを含むマイクロアレイを使用する。かかるマイクロアレイとしては、llumina社製 HumanWG-6 v3.0 Expression BeadChipが挙げられる。あるいは、測定対象の遺伝子に対するプローブを合成し、スライドガラスなどの適当な基盤上に固定して、所望のマイクロアレイを作製してもよい。マイクロアレイの作製方法は、当業界にて周知である。マイクロアレイデータの解析も周知であり、例えば「統合ゲノミクスのためのマイクロアレイデータアナリシス」星田有人訳 シュプリンガー・フェアラーク東京社出版を参考に行うことができる。

遺伝子発現レベルの測定に用いる患者試料は、限定はされないが、例えば患者から採取した末梢血を使用することができる。

ＤＮＡマイクロアレイ法による発現レベルの測定は、例えば以下のとおりである。はじめに、患者の末梢血から全ＲＮＡを抽出し、精製する。次いで、Illumina TotalPrep RNA Amplification Kit（アンビオン社製）などを使用し、ビオチン化ｃＲＮＡを合成する。このビオチン化ｃＲＮＡをマイクロアレイにハイブリダイズさせ、次いでＣｙ３標識ストレプトアビジンと反応させる。反応後のマイクロアレイを専用のスキャナーでスキャンし、BeadStudioなどの専用ソフトウエアを用いて各スポットのＣｙ３の蛍光を数値化することで、各遺伝子の発現レベルを得ることができる。

患者の予測生存日数は、例えば、その患者における本発明の遺伝子セットの各遺伝子の発現レベルを以下の実施例に示すＰＬＳ回帰分析の回帰式にあてはめ、算出することができる。あるいは、実施例の癌患者群、または別の癌患者群における本発明の遺伝子セットの各遺伝子の発現レベルを測定し、ＳＶＭ（サポートベクターマシーン）、正則化最小二乗法、主成分分析法などにより算出することも可能である。

本発明の遺伝子セットは、癌患者に対する免疫療法の効果および／または免疫療法後の予後を予測するために使用されるものであり、本発明の予測方法に用いるＤＮＡマイクロアレイ用のプローブやＰＣＲ用プライマーなどを作製するために用いることができる。

本発明のキットは、本発明の遺伝子セットの各遺伝子の発現レベルを測定することができる、プローブまたはプライマーを含む。各遺伝子に対するプローブおよびプライマーは、その遺伝子の配列情報に基づき、常套的方法により合成することができる。キットは、測定方法に応じて、その他必要な試薬を含んでいてもよい。本発明のキットは、例えば、ＤＮＡマイクロアレイ法、ＤＮＡチップ法、ＰＣＲ法、ノーザンブロット法などに用いられるキットである。ＤＮＡマイクロアレイ法用のキットとしては、前記プローブが適当な基盤上に固定されたマイクロアレイを含むものが挙げられる。

実施例１
１：ＤＮＡマイクロアレイによるペプチドワクチン療法前の遺伝子発現プロファイルの検討
患者試料として、久留米大学倫理委員会により承認されたプロトコールに即してインフォームドコンセントを得た前立腺癌患者から過去の臨床試験において再燃前立腺癌と診断された時点に収集した末梢血を使用した。４０名の前立腺癌患者において、ＤＮＡマイクロアレイ（llumina社製 HumanWG-6 v3.0 Expression BeadChip）を用いて、ペプチドワクチン療法前の遺伝子発現プロファイルを調べた。前立腺癌患者は、予後良好群（ペプチドワクチン療法後の生存日数７００日以上）２０名、予後不良群（ペプチドワクチン療法後の生存日数７００日未満）２０名であった（図１）。

（Ｉ）患者末梢血からのＲＮＡ抽出・精製
１．患者末梢血サンプルにTRIzol LS（インビトロジェン社製）を１：３の比率になるように添加し、混濁した。
２．TRIzol LS溶液７５０μＬに対し、２００μＬのクロロホルムを加え、混濁後、遠心分離した。
３．上清を新しいチューブに移し、上清の０．５５倍量のエタノールを添加した。
４．SV Total RNA Isolation System（プロメガ社製）のカラムに上記３．の検体をのせ、フィルターを通した。
５．フィルターを５００μＬのWash Bufferで洗浄した。
６．全ＲＮＡを８０μＬのNuclease Free Waterで溶出した。
７．分光光度計を用いて、ＲＮＡの濃度を測定し、Experionシステム（バイオラッド社製）を用いて電気泳動によりＲＮＡのクオリティをチェックした。

（ＩＩ）Illumina TotalPrep RNA Amplification Kit（アンビオン社製）を用いたマイクロアレイ用ｃＲＮＡの合成
（１）逆転写による一本鎖ｃＤＮＡの合成
１．各５００μｇの全ＲＮＡにNuclease Free Waterを加え、１１μＬに調整した。
２．上記１．の溶液に９μＬのReverse Transcription Master Mixを加え、４２°Ｃで２時間インキュベートした。

（２）二本鎖ｃＤＮＡ合成
１．８０μＬの Second Strand Master Mixを、上記（１）２．の各々のチューブに添加した。
２．各チューブを１６°Ｃで２時間インキュベートした。

（３）ｃＤＮＡ精製
１．２５０μＬのcDNA Binding Bufferを各々のチューブに添加した。
２．上記１．の溶液を、cDNA Filter Cartridgeにのせ、遠心によりフィルターを通した。
３．フィルターを５００μＬのWash Bufferで洗浄した。
４．ｃＤＮＡを１９μＬの５０〜５５°Ｃに予熱しておいたNuclease Free Waterで溶出した。

（４）インビトロ転写反応によるｃＲＮＡ合成
１．７．５μＬのIVT Master Mixを、上記（３）４．で得られたｃＤＮＡサンプルに添加した。
２．上記１．のチューブを３７℃で１４時間インキュベートした。
３．上記２．のチューブに７５μＬのNuclease Free Waterを添加した。

（５）ｃＲＮＡ精製
１．３５０μＬのcRNA Binding Bufferを各チューブに添加した。
２．２５０μＬの１００％エタノールを各チューブに加え、混濁した。
３．上記２．のサンプルをcRNA Filter Cartridgeにのせ、遠心によりフィルターを通した。
４．６５０μＬのWash Bufferでフィルターを洗浄した。
５．ｃＲＮＡを１００μＬの５０〜５５°Ｃに予熱しておいたNuclease Free Waterで溶出した。
６．ｃＲＮＡ濃度をＯＤで測定後、ハイブリダイゼーションサンプルとした。

（ＩＩＩ）マイクロアレイハイブリダイゼーション
（１）ハイブリダイゼーション用ｃＲＮＡの調製
１．各５００μｇの全ＲＮＡにNuclease Free Waterを加え、１０μＬに調整した。
２．上記１．の溶液に２０μＬのGEX-HYBを加え、６５℃で５分インキュベートした。
（２）ハイブリダイゼーション
１．専用チャンバーにセットしたHumanWG-6 v3.0 Expression BeadChipに、調製済みのｃＲＮＡサンプルをアプライした。
２．専用チャンバーのふたを閉め、５５℃で１８時間インキュベートした。

（ＩＶ）マイクロアレイ洗浄・染色
（１）アレイの洗浄
１．Wash E1BC溶液中で、マイクロアレイのカバーを外した。
２．アレイを速やかにスライドラックにセットし、５５℃に予熱しておいた1×High-Temp Wash buffer内で１０分間洗浄した。
３．アレイをWash E1BC溶液中で５分間洗浄した。
４．アレイをエタノール中で５分間洗浄した。
５．アレイをWash E1BC溶液中で５分間洗浄した。
６．染色専用トレイに４ｍｌのブロックE1バッファーを準備し、アレイを一枚ずつセットし、室温で１０分間ブロッキングを行った。
７．染色専用トレイに２ｍｌのブロックE1バッファーに対して２μＬのストレプトアビジン−Ｃｙ３を加え、アレイを一枚ずつセットし、室温で１０分間染色を行った。
８．アレイをWash E1BC溶液中で５分間洗浄後、遠心により乾燥した。

（Ｖ）スキャニング、数値化
１．Illumina社専用スキャナーにアレイをセットし、標準モードでスキャンを行った。
２．スキャン終了後、専用ソフトウエアBeadStudioを用いて、マイクロアレイ上の各スポットの数値化を行った。

得られたマイクロアレイデータは、VST（Variance Stabilizing Transformation）、及びRSN（robust spline normalization）を用いて正規化を行なった。陰性対照（マイクロアレイ上に存在しない遺伝子に対するプローブにより測定される遺伝子発現量）に対するPresence Probability < 0.05の遺伝子発現量を有意と判断した（図２）。４０名中、７０％以上の患者でPresence Probability < 0.05の遺伝子を以下の実験に使用した。

２：ＰＬＳ回帰モデル構築に用いる遺伝子セットの選択
実施例１の前立腺癌患者を、ペプチドワクチン療法後の生存日数を基準として予後良好群（生存日数７００日以上）または予後不良群（生存日数７００日未満）に分類し、各遺伝子の遺伝子発現レベルと生存日数との間の相関、および予後良好群と予後不良群との間の発現変動を基準として遺伝子を選択した。発現変動は、予後良好群の平均発現レベルを対照とした、予後不良群の平均発現レベルの増加または減少として表した。

解析には、以下の５種類の統計学的方法を用いた（Ａ：生存日数と遺伝子発現レベルとの相関を解析、Ｂ：予後良好群と予後不良群との間の発現変動を解析）。

Pearsonの積率相関係数 （Ａ）
Limma^ｂ （Ｂ）
SAM^ａ （Ｂ）
Rank Prod^ｃ （Ｂ）
Spearmanの順位和係数 （Ａ）

（参考文献）
^ａ Tusher et al. Significance analysis of microarrays applied to the ionizing radiation response. Proc Natl Acad Sci USA (2001) vol. 98 (9) pp. 5116-21.
^ｂ Smyth. Linear models and empirical bayes methods for assessing differential expression in microarray experiments. Statistical applications in genetics and molecular biology (2004) vol. 3 pp. Article.
^ｃ Breitling et al. Rank products: a simple, yet powerful, new method to detect differentially regulated genes in replicated microarray experiments. FEBS Letters (2004) vol. 573 (1-3) pp. 83-92.
これらの参考文献は、出典明示により本願明細書の一部とする。

３：ＰＬＳ回帰モデルの評価
各患者のペプチドワクチン療法後の生存日数を予測するため、ＰＬＳ（Partial Least Square）回帰モデルを構築した。具体的には、上記５種類の方法で選択された上位３００の遺伝子（表１〜５、図３）からなる５つの遺伝子セットから、上位から１０遺伝子ずつを含む（すなわち、それぞれ１０、２０、・・・または３００の遺伝子を含む）３０セットの遺伝子セットを抽出し、潜在変数１〜１０でＰＬＳ回帰モデルを構築した。

回帰モデルの評価は、Leave One Out Cross Validation（LOOCV）形式で行った。すなわち、全４０名の前立腺癌患者について、３９名の結果を用いて回帰モデルを構築し、構築された回帰モデルを用いて残りの１名の患者の生存日数を予測した。

例として、上位５０遺伝子からなる遺伝子セットによる生存日数の算出方法を説明する。予測生存日数は、以下の回帰式により算出した。

予測生存日数＝ａ１ｇ１＋ａ２ｇ２＋ａ３ｇ３＋・・・＋ａ５０ｇ５０＋Ｅ（式１）

（式中、ａ１、ａ２、ａ３、・・・、ａ５０は、回帰モデル構築された各遺伝子の発現量にかかる係数であり、ｇ１、ｇ２、ｇ３、ｇ４、・・・、ｇ５０は、対象とする患者における各遺伝子の発現レベルであり、Ｅは回帰式の定数項である。）
Pearsonの積率相関係数、潜在変数３、上位５０遺伝子の遺伝子セットによる各患者の生存日数予測に使用した係数を表６に示す。

（参考文献）
[1] Bjrn-Helge Mevik and Ron Wehrens Journal of Statistical Software: Vol 18, Issue 2 (2007), "The pls Package: Principal Componentand Partial Least Squares Regression in R"
[2] Geladi, P. and B. Kowalski (1986) Partial least-squares regression: Atutorial. Analytica Chimica Acta 185:1-17.
これらの参考文献は、出典明示により本願明細書の一部とする。

予測生存日数が、予後良好患者の場合は７００日以上、予後不良患者の場合は７００日未満であった場合に正解とし、各回帰モデルの正解率（予測率）を計算した。回帰モデルの評価の結果、上記５種類の統計学的方法により選択された３００遺伝子は、いずれも最高で８０％以上の予測率を示した（図４）。なかでも、Pearsonの積率相関係数、潜在変数３、上位５０遺伝子の遺伝子セットが最も予測率がよく、９５％であった。この遺伝子セットによる生存日数予測精度、および予測生存日数と実際の生存日数の比較を図５および６に示す。図６の右上枠内および左下枠内の患者は、予測生存日数と実際の生存日数が一致した患者に相当する。左上枠内は、免疫療法後の予後が良好と予測されたにもかかわらず、実際の生存日数が短かった患者を示す。一方、本方法により予後不良と予測されたにもかかわらず、実際の生存日数が長かった患者は存在しなかった（図６、右下枠内）。このことは、本方法により、免疫療法開始前に免疫療法の治療効果が低い患者を予測できることを示す。

また、Pearsonの積率相関係数、潜在変数３、上位５０遺伝子の遺伝子セットを用いて分類された予後良好群および不良群と、実際の生存日数を用いてKaplan-Meier曲線を描き、ログランク検定を行なったところ、本方法で分類された患者群は、p＝1.6e-10の確率で予後良好群と予後不良群に分類できることが示された。（図７）。

次いで、表１の遺伝子セットにおいて、下位から順に１０遺伝子ずつを含む（すなわち、それぞれ１０、２０、・・・または３００の遺伝子を含む）３０セットの遺伝子セットを抽出し、潜在変数３でＰＬＳ回帰モデルを構築した（図８）。この場合の予測率は６５〜８５％であった。また、同じ３００遺伝子のセットから、ランダムに３０セットの遺伝子セットを抽出し（表７）、潜在変数３でＰＬＳ回帰モデルを構築した（図９）。この場合の予測率は６２．５〜８５％であった。以上の結果から、いずれの選択方法でも治療後の生存日数が予測可能であることが明らかとなった。

実施例２
実施例１の４０名の前立腺癌患者にさらに９名の前立腺癌患者の遺伝子発現データを加え、生存日数３００日以上を予後良好群、生存日数３００日未満を予後不良群と分類し、Pearsonの積率相関係数、潜在変数３、上位５０遺伝子の遺伝子セットを用いてＰＬＳ回帰モデルを構築し、新たな９名の前立腺癌患者の生存日数を予測した（図１０）。本方法においても、９名中８名で予測が正解であった。

実施例３
実施例１の４０名の前立腺癌患者について、Pearsonの積率相関係数で選択された上位３００遺伝子（表１）の各遺伝子の発現レベルと生存日数より、一次線形回帰式を作成した。次いで、得られた式と各患者における発現レベルから各患者の予測生存日数を算出し、実際の生存日数をｘ軸、算出された予測生存日数をｙ軸にとりグラフ化した（図１１）。グラフには、１から３００の間で乱数をとり、これを順位と仮定して表１から選択した１０の遺伝子の結果を示す。その結果、１の遺伝子の発現レベルに基づいた場合でも、生存日数が予測可能であることが明らかとなった。

表１ Pearsonの積率相関係数で選択された上位３００の遺伝子のリスト

表２ Limmaで選択された上位３００の遺伝子のリスト

表３ SAMで選択された上位３００の遺伝子のリスト

表４ Rank Prodで選択された上位３００の遺伝子のリスト

表５ Spearmanの順位和係数で選択された上位３００の遺伝子のリスト

表６ Pearsonの積率相関係数、潜在変数３、上位５０遺伝子の遺伝子セットによる各患者の生存日数予測に使用した係数

表７ ランダム選択による３０の遺伝子セット

＊数字は表１における順位を示す。

Claims (6)

1. 前立腺癌患者に対する免疫療法の効果および／または免疫療法後の予後を予測する方法であって、以下の工程を含む方法：
   （１）免疫療法前の前立腺癌患者から採取された試料において、以下の遺伝子：
   
   

   

   
   

   

   
   

   

   
   

   

   
   からなる遺伝子セットの各遺伝子の発現レベルを測定する工程、および
   （２）前立腺癌患者群における前記遺伝子セットの各遺伝子の発現レベルの測定結果から潜在変数３で構築されたPLS回帰モデルに、工程（１）の前立腺癌患者の各遺伝子の発現レベルをあてはめ、予測生存日数を算出する工程、
   ここで、予測生存日数は、以下の回帰式：
   予測生存日数＝ａ１ｇ１＋ａ２ｇ２＋ａ３ｇ３＋・・・＋ａ５０ｇ５０＋Ｅ（式１）
   （式中、ａ１、ａ２、ａ３、・・・、ａ５０は、回帰モデル構築された各遺伝子の発現量にかかる係数であり、ｇ１、ｇ２、ｇ３、ｇ４、・・・、ｇ５０は、対象とする患者における各遺伝子の発現レベルであり、Ｅは回帰式の定数項である。）
   により算出される。
2. 免疫療法がペプチドワクチン療法である、請求項１の方法。
3. 前立腺癌患者に対する免疫療法の効果および／または免疫療法後の予後を予測するための、以下の遺伝子：
   
   

   

   
   

   

   
   

   

   
   

   

   
   からなる遺伝子セット。
4. 免疫療法がペプチドワクチン療法である、請求項３の遺伝子セット。
5. 前立腺癌患者に対する免疫療法の効果および／または免疫療法後の予後を予測するためのキットであって、請求項３の遺伝子セットの各遺伝子に対するプローブまたはプライマーを含むキット。
6. ＤＮＡマイクロアレイ法に用いられる、請求項５のキット。

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