KR20120013992A - 항-ｃｄ４０ 항체를 사용한 치료에 대한 ｂ-세포 림프종의 반응성 평가를 위한 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 항-CD40 항체를 사용하는 치료에 대한 B-세포 림프종을 갖는 환자의 반응성을 예측 또는 평가하는데 유용한 방법 및 키트를 제공한다.
Description
<관련 출원에 대한 상호 참조>
본 출원은 2009년 4월 18일에 출원된 미국 가출원 제61/170,615호를 우선권 주장하며, 이는 그의 전문이 본원에 참고로 도입된다.
<기술 분야>
본 발명은 일반적으로 항-CD40 항체를 사용한 치료에 대한 B-세포 림프종 환자의 반응성을 예측하거나, 평가하거나 또는 그의 평가를 돕는 분야, 및 항-CD40 항체 치료에 대한 후보로 확인된 개체의 치료 방법에 관한 것이다.
CD40은 종양 괴사 수용체 거대부류의 타입 I 막횡단 단백질이다. CD40은 B-세포 증식 및 분화, 이뮤노글로불린 이소형 스위칭, 및 세포 생존률에 관여하는 중요한 분자이다. 수용체 신호 전달은 주로 활성화된 CD4+ T 세포 상에서 발현되는 CD40 리간드 (CD40L 또는 CD154)에 대한 CD40의 결합에 의해 개시된다.
정상 세포 상에서, CD40은 증식 가능성이 큰 세포, 예를 들어 조혈 전구세포, 상피 및 내피 세포, 및 모든 항원-제시 세포 (수지상 세포, 활성화된 B 림프구, 및 활성화된 단핵구) 상에서 발현된다. CD40은 몇몇 유형의 B-세포 혈액 악성종양, 예를 들어 다발성 골수종, 비-호지킨 (Hodgkin) 림프종 (NHL), 및 만성 림프구성 백혈병 (CLL) 상에서 고도로 발현된다. B-세포 악성종양 상에서 CD40 발현의 큰 우세성으로 인해 항체-기반 암 요법을 위한 매력적인 잠재적 종양 표적이 된다. CD40은 또한 대부분의 방광암 및 유의한 비율의 다른 고형 종양, 예를 들어 두경부암, 신세포 암종, 난소암 및 폐암에서 발현된다.
항-CD40 항체, 및 B-세포 혈액 악성종양을 치료하기 위한 그의 용도는 설명되었다. 예를 들어, 미국 특허 제6,946,129호; 제6,843,989호; 제6,838,261호; WO 2000/075348; US-2002-0197256; WO 2006/128103; 및 WO 2007/075326을 참조한다. 인간화 항-CD40 항체는 직접적 신호 전달을 통해 하위세트의 혈액 종양 세포주에서 CD40-양성 세포의 성장 억제 및 아폽토시스를 유도하는 것으로 나타났다. WO 2006/128103; WO 2007/075326. 또한, 인간화 항-CD40 항체는 면역 이펙터 기능, 예를 들어 항체 의존성 세포성 세포독성 (ADCC) 및 항체 의존성 세포성 포식작용 (ADCP)을 통해 종양 세포를 사멸시킨다. 생체 내에서, 다발성 골수종 (MM) 및 비-호지킨 림프종 (NHL)의 이종이식편 모델을 사용하여, 항-CD40 항체는 중증 복합 면역결핍 (SCID) 마우스에서 종양 성장을 억제하고 생존을 개선한다. 몇몇 모델에서 항-CD40 항체를 리툭시맙 (제넨테크, 인크. (Genentech, Inc.))에 비교하면 항-CD40 항체의 항-종양 활성이 적어도 리툭시맙만큼 효과적임이 밝혀졌다. 임상 시험은 재발성 및 불응성 다발성 골수종 (MM), 재발성 비-호지킨 림프종 (NHL), 만성 림프구성 림프종 (CLL) 또는 재발성 미만성 거대 B-세포 림프종 (DLBCL)을 갖는 환자에서 인간화 항-CD40 항체를 시험하기 위해 시작되었다.
항-CD40 항체가 CD40-양성 세포의 성장 억제 및 아폽토시스를 유도할 수 있고, 다양한 유형의 B-세포 림프종 환자에서 항-종양 활성을 가질 수 있는 것으로 나타났지만, 모든 B 림프종 세포가 항-CD40 항체 매개된 세포 사멸에 감수성인 것은 아니다. 항-CD40 항체 요법에 대한 B-세포 림프종 환자의 반응성에 대한 하나 이상의 예측 마커를 확인하는 것이 여전히 필요하다.
특허 출원 및 공개공보를 포함하여 본원에서 인용된 모든 참고문헌은 그 전문이 참고로 포함된다.
<발명의 개요>
본 발명은 항-CD40 항체를 사용한 치료에 대한 일종의 B-세포 림프종을 갖는 대상체의 반응성을 예측하거나, 평가하거나 또는 그의 평가를 돕기 위한 방법 및 조성물을 제공한다.
한 측면에서, 본 발명은 B-세포 림프종을 갖는 대상체로부터의 B-세포 림프종 샘플에서 UAP1, BTG2, CD40, VNN2, RGS13, CD22, LMO2, IFITM1, CTSC, CD44, PUS7, BCL6, EPDR1, IGF1R 및 CD79B로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 마커 유전자의 측정된 발현 수준을 참조 수준에 대해 비교하는 것을 포함하는, 항-CD40 항체를 사용한 치료에 대한 B-세포 림프종을 갖는 대상체의 반응성을 평가하거나 또는 그의 평가를 돕기 위한 방법을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 B-세포 림프종을 갖는 대상체로부터의 B-세포 림프종 샘플에서 UAP1, BTG2, CD40, VNN2, RGS13, CD22, LMO2, IFITM1, CTSC, CD44, PUS7, BCL6, EPDR1, IGF1R 및 CD79B로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 마커 유전자의 측정된 발현 수준을 참조 수준에 대해 비교하는 것을 포함하는, B-세포 림프종을 갖는 대상체에서 항-CD40 항체 치료에 대한 반응성을 예측하거나 또는 치료/반응성을 모니터링하기 위한 방법을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 (a) B-세포 림프종을 갖는 대상체로부터 수득한 B 림프종 세포를 포함하는 샘플에서 IFITM1, CD40, RGS13, VNN2, LMO2, CD79B, CD22, BTG2, IGF1R, CD44, CTSC, EPDR1, UAP1, PUS7 및 BCL6으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 마커 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 (b) 단계 (a)로부터의 상기 하나 이상의 마커 유전자의 측정된 발현 수준을 기반으로 대상체가 항-CD40 항체 치료에 대해 반응할 수 있는지 여부를 예측하는 단계를 포함하는, 항-CD40 항체 치료에 대한 B-세포 림프종을 갖는 대상체의 반응성을 예측하거나, 평가하거나 또는 그의 평가를 돕기 위한 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 군으로부터의 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 적어도 12개, 적어도 13개, 적어도 14개, 또는 15개의 마커 유전자의 발현 수준을 측정하고, 예측, 평가 또는 평가의 도움에 사용한다. 일부 실시양태에서, 예측, 평가 또는 평가의 도움은 하나 이상의 마커 유전자의 측정된 발현 수준을 참조 수준에 대해 비교하여 결정된다. 일부 실시양태에서, 참조 수준은 항-CD40 항체 치료 후에 증가 또는 감소된 종양 부피를 갖는 대상체로부터의 B 림프종 세포를 포함하는 샘플에서 상응하는 마커 유전자의 측정된 발현 수준을 기반으로 결정된 값 또는 범위이다. 일부 실시양태에서, 참조 수준 결정을 위한 대상체로부터의 샘플은 항-CD40 항체 치료에 대한 반응성이 예측되는 대상체로부터의 샘플과 동일한 유형의 B 림프종 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 반응성은 하나 이상의 마커 유전자의 측정된 발현 수준을 기반으로 결정된 감수성 지수 값을 사용하여 예측 또는 평가된다. 일부 실시양태에서, 반응성은 본원에 기재된 K-최근접 이웃 분석을 이용하여 대상체를 분류함으로써 예측 또는 평가된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 (a) B-세포 림프종을 갖는 대상체로부터 수득한 B 림프종 세포를 포함하는 샘플에서 IFITM1, CD40, RGS13, VNN2, LMO2, CD79B, CD22, BTG2, IGF1R, CD44, CTSC, EPDR1, UAP1, PUS7 및 BCL6으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 마커 유전자의 발현 수준을 결정하는 단계; 및 (b) 단계 (a)에서 수득한 하나 이상의 마커 유전자의 발현 수준을 요약하는 보고서를 작성하는 단계를 포함하는, 상기 대상체에 대한 개인별 맞춤 유전체학 (personalized genomics) 프로파일의 작성을 위한 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 군으로부터의 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 적어도 12개, 적어도 13개, 적어도 14개, 또는 15개의 마커 유전자의 발현 수준을 측정하고, 개인별 맞춤 유전체학 프로파일에 대한 보고서를 작성하기 위해 사용한다. 일부 실시양태에서, 보고서는 대상체를 위한 항-CD40 항체 치료에 대한 권장사항을 포함한다. 일부 실시양태에서, 권장사항은 마커 유전자의 측정된 발현 수준을 참조 수준에 대해 비교함으로써 결정된다. 일부 실시양태에서, 참조 수준은 항-CD40 항체 치료 후에 종양 부피가 증가하거나 감소된 대상체로부터의 B 림프종 세포를 포함하는 샘플에서 대응하는 마커 유전자의 측정된 발현 수준을 기반으로 결정된 값 또는 범위이다. 일부 실시양태에서, 권장사항은 마커 유전자의 측정된 발현 수준을 기반으로 결정된 감수성 지수 값에 의해 결정된다. 일부 실시양태에서, 권장사항은 본원에 기재된 K-최근접 이웃 분석을 이용하여 대상체를 분류함으로써 결정된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 (a) B-세포 림프종을 갖는 대상체로부터의 B 림프종 세포를 포함하는 샘플에서 IFITM1, CD40, RGS13, VNN2, LMO2, CD79B, CD22, BTG2, IGF1R, CD44, CTSC, EPDR1, UAP1, PUS7 및 BCL6으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 2개의 마커 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 (b) 단계 (a)에서 마커 유전자의 측정된 발현 수준을 기반으로 하기 식에 의해 감수성 지수 값 (SI)을 계산하는 단계를 포함하는, 항-CD40 항체 치료에 대한 B-세포 림프종을 갖는 대상체의 반응성을 예측하거나, 평가하거나 또는 그의 평가를 돕기 위한 방법을 제공한다:
여기서, 표 4에 나타낸 양의 상관관계 값을 갖는 적어도 하나의 마커 유전자 및 음의 상관관계 값을 갖는 적어도 하나의 마커 유전자의 발현 수준을 측정하고;
상기 식에서 (i) βj는 측정된 각각의 마커 유전자에 대한 계수 값이고; (ii) p는 측정된 마커 유전자의 수이고; (iii) χi는 측정된 각각의 마커의 발현 수준에 대해 변환된, 표준화된, 대상체로부터의 샘플에 대한 발현 수준이고; (iv) μj 및 σj는 측정된 각각의 마커 유전자에 대한 평균 및 표준 편차이고; 여기서 βj, μj 및 σj는 B 림프종 세포를 포함하는 환자 샘플로부터 결정된다. 일부 실시양태에서, 감수성 지수에 대한 0 이상의 값은 대상체가 항-CD40 항체 치료에 대해 반응할 수 있다는 것을 나타내거나, 또는 감수성 지수에 대한 0 미만의 값은 대상체가 항-CD40 항체 치료에 대해 덜 반응할 수 있다는 것을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 적어도 12개, 적어도 13개, 적어도 14개, 또는 15개의 마커 유전자의 발현 수준을 측정하고, 감수성 지수 계산을 위해 사용한다. 일부 실시양태에서, IFITM1, RGS13, CD79B, CD22, BTG2, CD44, EPDR1 및 UAP1의 발현 수준을 측정하고, 감수성 지수 계산을 위해 사용한다. 일부 실시양태에서, βj, μj 및 σj는 항-CD40 치료에 대한 반응성이 예측되는 대상체로부터의 샘플과 동일한 유형의 B 림프종 세포를 갖는 환자 샘플로부터 결정된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 (a) B-세포 림프종을 갖는 대상체로부터 수득한 B 림프종 세포를 포함하는 샘플에서 BCL6, IFITM1, CD40, RGS13, VNN2, LMO2, CD79B, CD22, BTG2, IGF1R, CD44, CTSC, EPDR1, UAP1 및 PUS7로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 마커 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 (b) 상기 대상체로부터의 샘플 및 공지된 클래스를 갖는 참조 샘플에서 상기 하나 이상의 마커 유전자의 발현 수준을 기반으로 K-최근접 이웃 분석을 이용하여 대상체를 반응성 대상체 또는 비-반응성 대상체로 분류하는 단계를 포함하는, 항-CD40 항체 치료에 대한 B-세포 림프종을 갖는 대상체의 반응성을 예측하기 위한 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 분류는 가중 K-최근접 이웃 분석을 이용하여 결정된다. 일부 실시양태에서, 상기 분류는 비가중 K-최근접 이웃 분석을 이용하여 결정된다. 일부 실시양태에서, 단계 (b)에서 대상체의 분류는 (1) 파라미터 K (즉, 최근접 이웃의 수)를 결정하고; (2) 대상체로부터의 샘플에서 마커 유전자의 측정된 발현 수준과 각각의 참조 샘플에서 각각의 마커 유전자의 발현 수준 사이의 차이를 계산하고; (3) 대상체로부터의 샘플과 참조 샘플 사이의 절대차의 가중 평균 (WAAD)이 가장 작은 샘플을 선택함으로써 최근접 참조 샘플을 결정하고; (4) K-최근접 참조 샘플의 공지된 클래스를 기반으로 대상체의 클래스를 결정함으로써 수행된다. 일부 실시양태에서, K는 임상 시험 샘플을 사용한 교차-검증을 사용하여 결정된다. 일부 실시양태에서, K는 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 13이다. 일부 실시양태에서, 참조 샘플은 항-CD40 항체 치료에 대한 반응성이 시험되었거나 또는 공지되어 있는 대상체로부터 수득한 B 림프종 세포를 포함하는 샘플이다. 일부 실시양태에서, 참조 샘플은 항-CD40 항체 치료에 대한 반응성이 예측되거나 또는 평가된 대상체로부터의 샘플과 동일한 유형의 B 림프종 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, BCL6, IFITM1, CD40, RGS13, VNN2, LMO2, CD79B, CD22, BTG2, IGF1R, CD44, CTSC, EPDR1, UAP1 및 PUS7의 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 적어도 12개, 적어도 13개, 적어도 14개, 또는 모든 15개의 마커 유전자의 발현 수준을 측정하고, 대상체를 분류하기 위해 사용한다. 일부 실시양태에서, BCL6, IFITM1, CD22, IGF1R, CD44, EPDR1 및 UAP1의 발현 수준을 측정하고, 대상체를 분류하기 위해 사용한다. 일부 실시양태에서, 측정된 발현 수준은 표준화된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 유효량의 항-CD40 항체를 B-세포 림프종을 갖는 대상체에게 투여하는 것을 포함하며, 여기서 상기 대상체에서 B-세포 림프종의 반응성이 본원에 기재된 방법에 의해 평가된 것인, B-세포 림프종을 갖는 대상체를 치료하기 위한 방법을 제공한다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 a) B-세포 림프종을 갖는 대상체로부터의 B-세포 림프종 샘플에서 UAP1, BTG2, CD40, VNN2, RGS13, CD22, LMO2, IFITM1, CTSC, CD44, PUS7, BCL6, EPDR1, IGF1R 및 CD79B로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 마커 유전자의 측정된 발현 수준을 참조 수준에 대해 비교함으로써 상기 대상체에서 B-세포 림프종이 항-CD40 항체 치료에 적합한지 여부를 평가하여 항-CD40 항체 치료를 위한 대상체를 선택하는 것, 및 유효량의 항-CD40 항체를 상기 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, B-세포 림프종을 갖는 대상체를 치료하기 위한 방법을 제공한다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 a) B-세포 림프종을 갖는 대상체로부터의 B-세포 림프종 샘플 및 공지된 클래스를 갖는 참조 샘플에서 UAP1, BTG2, CD40, VNN2, RGS13, CD22, LMO2, IFITM1, CTSC, CD44, PUS7, BCL6, EPDR1, IGF1R 및 CD79B로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 마커 유전자의 측정된 발현 수준을 기반으로 K-최근접 이웃 분석을 이용하여 대상체가 반응성 대상체로 분류된다면 항-CD40 항체 치료를 위한 대상체를 선택하는 것; 및 유효량의 항-CD40 항체를 상기 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, B-세포 림프종을 갖는 대상체를 치료하기 위한 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 참조 수준은 상이한 B-세포 림프종 샘플에서 마커 유전자의 측정된 발현 수준이다. 일부 실시양태에서, 상기 상이한 B-세포 림프종 샘플은 항-CD40 항체 유도된 세포 사멸에 내성인 B 림프종 세포를 포함한다.
일부 실시양태에서, 마커 유전자의 측정된 발현 수준 및/또는 참조 수준은 표준화된다.
일부 실시양태에서, 대상체로부터의 B-세포 림프종 샘플에서 UAP1, BTG2, CD40, VNN2, RGS13, CD22, LMO2, IFITM1, CTSC, CD44, PUS7, BCL6, EPDR1, IGF1R 및 CD79B로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 적어도 12개, 적어도 13개, 적어도 14개, 또는 15개의 유전자의 측정된 발현 수준을 하나 이상의 참조 수준에 대해 비교한다.
일부 실시양태에서, 발현 수준은 mRNA 발현을 검출함으로써 (예를 들어, 실시간 정량적 역전사 PCR (qRT-PCR)) 및/또는 단백질 발현을 검출함으로써 (예를 들어, 면역조직화학 (IHC)) 측정된다. 표 1에 나타낸 프로브 및 프라이머는 qRT-PCR에 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, B-세포 림프종은 비-호지킨 림프종 (NHL), 예를 들어 비제한적으로 여포성 림프종, 재발성 여포성 림프종, 소림프구성 림프종, 외투 세포 림프종, 변연부 림프종, 림프형질세포성 림프종, 균상 식육종/세자리(Sezary) 증후군, 비장 변연부 림프종 및 미만성 거대 B-세포 림프종 (DLBCL)이다. 일부 실시양태에서, B-세포 림프종은 무통성 림프종, 공격성 림프종 및 고도 공격성 림프종으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, B-세포 림프종은 재발성 및/또는 불응성 림프종이다. 일부 실시양태에서, B-세포 림프종은 재발성/불응성 DLBCL이다.
일부 실시양태에서, 항-CD40 항체 치료는 효능제 항-CD40 항체를 사용한 치료이다. 일부 실시양태에서, 효능제 항-CD40 항체는 CD40을 자극하고, CD40과 CD40 리간드 사이의 상호작용을 향상시킨다. 일부 실시양태에서, 효능제 항-CD40 항체는 CD40을 자극하지만, CD40과 CD40 리간드 사이의 상호작용을 향상시키지 않거나 또는 억제한다. 일부 실시양태에서, 효능제 항-CD40 항체는 서열 1에 제시된 중쇄 아미노산 서열 및 서열 2에 제시된 경쇄 아미노산 서열을 포함한다.
추가의 측면에서, 본 발명은 UAP1, BTG2, CD40, VNN2, RGS13, CD22, LMO2, IFITM1, CTSC, CD44, PUS7, BCL6, EPDR1, IGF1R 및 CD79B로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 마커 유전자의 발현 수준을 측정하기 위한 시약을 포함하는 키트를 제공한다. 일부 실시양태에서, 키트는 적어도 하나의 마커 유전자를 PCR에 의해 증폭시키기 위한 적어도 한 쌍의 프라이머를 포함한다. 예를 들어, 표 1에 나타낸 정방향 및 역방향 프라이머를 사용할 수 있다. 키트는 증폭된 유전자 생성물을 검출하기 위한 프로브가 그에 부착된 표면, 예를 들어 마이크로어레이 (microarray)를 추가로 포함할 수 있고, 본 발명에서는 이러한 표면을 고려하고 포함한다. 일부 실시양태에서, 키트는 qRT-PCR에 의해 하나의 마커 유전자 (예컨대 UAP1, BTG2, CD40, VNN2, RGS13, CD22, LMO2, IFITM1, CTSC, CD44, PUS7, BCL6, EPDR1, IGF1R 및 CD79B)의 발현 수준을 검출하기 위한 적어도 한 쌍의 프라이머 및 프로브를 포함한다. 키트는 qRT-PCR에 의해 참조 유전자의 발현 수준을 검출하기 위한 한 쌍의 프라이머 및 프로브를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 키트는 마커 유전자에 의해 코딩되는 하나 이상의 단백질을 특이적으로 인식하는 하나 이상의 항체를 포함한다. 키트는 다른 시약 및/또는 본원에 기재된 임의의 방법을 실시하기 위한 설명서를 추가로 포함할 수 있다.
본원에 기재된 다양한 실시양태의 특성 중 하나, 일부 또는 전부가 조합되어 본 발명의 다른 실시양태를 형성할 수 있다는 것이 이해된다. 본 발명의 이들 측면 및 다른 측면은 당업자에게 명백하게 될 것이다.
도 1a 내지 1z. 유전자의 일부에 대한 진뱅크(GenBank) 서열이 표 1에 수록된다. VNN2 (도 1a: 서열 258), RGS13 (도 1b: 서열 259), CD22 (도 1c 및 1d: 서열 260), CD40 (도 1e: 서열 261), IFITM1 (도 1f: 서열 262), BCL6 (도 1g 및 1h: 서열 263), EPDR1 (도 1i: 서열 264), IGF1R (도 1j 내지 1m: 서열 265), BTG2 (도 1n 및 1o: 서열 266), LMO2 (도 1p: 서열 267), CD79B (도 1q: 서열 268), CD44 (도 1r 및 1s: 서열 269), CTSC (도 1t: 서열 270), UAP1 (도 1u: 서열 271), PUS7 (도 1v 및 1w: 서열 272), CD22 (도 1x 및 1y: 서열 273) 및 RGS13 (도 1z: 서열 274)의 mRNA를 코딩하는 핵산 서열.
도 2. 임상 시험 001에서 21명의 환자에 대한 다변량 감수성 지수 및 종양의 직경의 곱의 합 (SPD) 측정치의 변화％의 연관성. SPD 변화％는 최소의 기준선-후 SPD를 기준선 SPD에 대해 비교함으로써 결정된다. 양의 변화는 종양 부피 증가를 나타내고, 음의 변화는 종양 부피 감소를 나타낸다. 감수성 지수 계산을 위해 사용된 가중치 (계수)를 표 5에 나타낸다. 보다 큰 다변량 감수성 지수 값은 기준선-후 SPD 감소와 연관된다 (스피어만 (Spearman) Rho = -0.58; P=0.006).
도 3. 26명의 DLBCL 환자에 대한 BCL6 발현 및 SPD 측정치의 변화％의 연관성. SPD 변화％는 최소의 기준선-후 SPD를 기준선 SPD에 대해 비교함으로써 결정된다. 양의 변화는 종양 부피 증가를 나타내고, 음의 변화는 종양 부피 감소를 나타낸다.
도 4. 항-CD40 Ab.1 치료에 대한 감수성을 예측하기 위한 마커 유전자의 mRNA 발현 수준의 사용. SPD 변화％는 최소의 기준선-후 SPD를 기준선 SPD에 대해 비교함으로써 결정된다. 양의 변화는 종양 부피 증가를 나타내고, 음의 변화는 종양 부피 감소를 나타낸다.
도 5. 마커 유전자의 mRNA 발현 수준을 기반으로 항-CD40 Ab.1 치료에 대해 반응성 (Dx 양성) 또는 비-반응성 (Dx 음성)으로 분류된 환자에 대한 무진행 생존.
도 2. 임상 시험 001에서 21명의 환자에 대한 다변량 감수성 지수 및 종양의 직경의 곱의 합 (SPD) 측정치의 변화％의 연관성. SPD 변화％는 최소의 기준선-후 SPD를 기준선 SPD에 대해 비교함으로써 결정된다. 양의 변화는 종양 부피 증가를 나타내고, 음의 변화는 종양 부피 감소를 나타낸다. 감수성 지수 계산을 위해 사용된 가중치 (계수)를 표 5에 나타낸다. 보다 큰 다변량 감수성 지수 값은 기준선-후 SPD 감소와 연관된다 (스피어만 (Spearman) Rho = -0.58; P=0.006).
도 3. 26명의 DLBCL 환자에 대한 BCL6 발현 및 SPD 측정치의 변화％의 연관성. SPD 변화％는 최소의 기준선-후 SPD를 기준선 SPD에 대해 비교함으로써 결정된다. 양의 변화는 종양 부피 증가를 나타내고, 음의 변화는 종양 부피 감소를 나타낸다.
도 4. 항-CD40 Ab.1 치료에 대한 감수성을 예측하기 위한 마커 유전자의 mRNA 발현 수준의 사용. SPD 변화％는 최소의 기준선-후 SPD를 기준선 SPD에 대해 비교함으로써 결정된다. 양의 변화는 종양 부피 증가를 나타내고, 음의 변화는 종양 부피 감소를 나타낸다.
도 5. 마커 유전자의 mRNA 발현 수준을 기반으로 항-CD40 Ab.1 치료에 대해 반응성 (Dx 양성) 또는 비-반응성 (Dx 음성)으로 분류된 환자에 대한 무진행 생존.
<상세한 설명>
본 발명은 특정 유전자가 항-CD40 항체 유도된 세포 사멸에 감수성인 B 림프종 세포와 항-CD40 항체 유도된 세포 사멸에 내성인 B 림프종 세포 사이에서 차별적으로 발현된다는 발견에 기초한 것이다. 실시예 1 및 2에 기재된 임상 시험으로부터의 데이터는 15개의 유전자 UAP1, BTG2, CD40, VNN2, RGS13, CD22, LMO2, IFITM1, CTSC, CD44, PUS7, BCL6, EPDR1, IGF1R 및 CD79B 중 하나 이상의 발현 수준이 항-CD40 항체 치료 (예컨대, 항-CD40 Ab.1 치료)에 대한 반응성의 예측, 평가 또는 평가의 도움을 위해 사용될 수 있다는 것을 나타낸다. 감수성 B 림프종 세포와 내성 B 림프종 세포 사이에서 차별적으로 발현된 유전자의 일부는 CD40 리간드 하향조정된 경로 유전자이고; 일부는 B-세포 수용체 신호전달 경로 내에 있다. 따라서, 하나 이상의 이들 차별적으로 발현된 유전자의 발현 수준은 항-CD40 항체를 사용한 치료에 대한 B-세포 림프종을 갖는 대상체의 반응성을 평가하거나 그의 평가를 돕기 위해, 항-CD40 항체를 사용한 치료에 대한 대상체의 반응성을 예측하기 위해, 대상체에서 치료/반응성을 모니터링하기 위해 사용될 수 있다.
A. 일반적 기술
달리 나타내지 않는 한, 본 발명의 실시는 분자 생물학 (재조합 기술 포함), 미생물학, 세포 생물학, 생화학 및 면역학의 통상적인 기술을 이용할 것이고, 이들은 당업계의 기술 범위 내에 속한다. 이러한 기술은 문헌, 예를 들어 ["Molecular Cloning: A Laboratory Manual", second edition (Sambrook et al., 1989)]; ["Oligonucleotide Synthesis" (M.J. Gait, ed., 1984)]; ["Animal Cell Culture" (R.I. Freshney, ed., 1987)]; ["Methods in Enzymology" (Academic Press, Inc.)]; ["Current Protocols in Molecular Biology" (F.M. Ausubel et al., eds., 1987)] 및 주기적인 증보판; ["PCR: The Polymerase Chain Reaction", (Mullis et al., eds., 1994)]에 충분히 설명되어 있다.
본 발명에서 사용되는 프라이머, 올리고뉴클레오티드 및 폴리뉴클레오티드는 당업계에 공지된 표준 기술을 사용하여 생성될 수 있다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 전문 학술 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자가 통상적으로 이해하는 바와 동일한 의미를 갖는다. 문헌 [Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2nd ed., J. Wiley ＆ Sons (New York, N.Y. 1994)], 및 [March, Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure 4th ed., John Wiley ＆ Sons (New York, N.Y. 1992)]은 당업자에게 본 출원에서 사용된 많은 용어에 관한 일반적인 지침을 제공한다.
B. 정의
본원에 사용된 용어 "B-세포 림프종을 갖는 대상체" 및 "B-세포 림프종 환자"는 일종의 B-세포 림프종으로 진단되었거나 또는 일종의 B-세포 림프종으로 진단이 가능한 대상체를 나타낸다.
본원에 사용된 용어 "바이오마커" 또는 "마커"는 포유동물 조직 또는 세포 내에서 또는 그 상에서의 그의 발현 또는 분비가 공지의 방법 (또는 본원에 개시된 방법)에 의해 검출될 수 있고 항-CD40 항체에 기반한 치료 요법에 대한 포유동물 세포 또는 조직의 감수성을 예측하거나 또는 이를 예측하기 위해 (또는 예측을 돕기 위해) 사용될 수 있고, 일부 실시양태에서 항-CD40 항체에 기반한 치료 요법에 대한 개체의 반응성을 예측하기 위해 (또는 예측을 돕기 위해) 사용될 수 있는, 유전자, 단백질, 탄수화물 구조, 또는 당지질을 포함하는 분자를 일반적으로 나타낸다.
본원에 사용된 용어 "샘플"은 예를 들어 물리적, 생화학적, 화학적 및/또는 생리학적 특징을 기초로 하여 특성화 및/또는 확인되는 세포성 및/또는 다른 분자 엔티티를 함유하는 관심있는 있는 대상체로부터 얻거나 상기 대상체로부터 유도된 조성물을 나타낸다. 예를 들어, 어구 "질환 샘플" 및 그의 변형 표현은 특성화되는 세포성 및/또는 분자 엔티티를 함유하는 것으로 예상되거나 공지된 관심있는 있는 대상체로부터 수득한 임의의 샘플을 나타낸다.
"조직 또는 세포 샘플"은 대상체 또는 환자의 조직으로부터 유도된 유사한 세포의 집합을 의미한다. 조직 또는 세포 샘플의 공급원은 신선한, 동결 및/또는 보존된 장기 또는 조직 샘플 또는 생검 또는 흡인물로부터의 고형 조직; 혈액 또는 임의의 혈액 구성분; 체액, 예를 들어 뇌척수액, 양수, 복수, 또는 간질액; 대상체의 임신 또는 발생 중의 임의의 시간으로부터의 세포일 수 있다. 또한, 조직 샘플은 1차 또는 배양된 세포 또는 세포주일 수 있다. 임의로, 조직 또는 세포 샘플은 질환 조직/장기로부터 수득한다. 조직 샘플은 자연에서 조직과 자연히 서로 혼합되지 않는 화합물, 예를 들어 보존제, 항응고제, 완충제, 고정제, 영양분, 항생제 등을 함유할 수 있다.
본원의 목적상, 조직 샘플의 "절편"은 조직 샘플의 단일 부분 또는 조각, 예를 들어 조직 샘플로부터 절단된 조직 또는 세포의 박편을 나타낸다. 조직 샘플의 동일한 절편이 형태 및 분자 수준 모두에서 분석되거나, 또는 단백질과 핵산 모두에 대해 분석되는 방법을 본 발명이 포함함을 이해한다면, 조직 샘플의 다수의 절편을 채취하여 본 발명에 따른 분석에 적용할 수 있음이 이해된다.
본원에 사용된 "B-세포 림프종 샘플" 또는 "B 림프종 세포를 포함하는 샘플"은 일종의 B-세포 림프종으로 진단된 대상체 또는 환자로부터의 B 림프종 세포를 함유하는 조직 또는 세포 샘플이다.
본원에 사용된 "평가를 돕기" 위한 방법은 임상 결정 (예를 들어, 항-CD40 항체를 사용한 치료에 대한 B-세포 림프종의 반응성)을 돕는 방법을 나타내고, 최종 평가에 대해 결정적일 수 있거나 그렇지 않을 수 있다.
"대상체" 또는 "개체"는 포유동물, 보다 바람직하게는 인간이다. 포유동물은 인간, 영장류, 가축, 스포츠 동물, 설치류 및 애완동물 (예를 들어, 개 및 고양이)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본원에 사용된 "참조 값"은 절대값; 상대 값; 상한 및/또는 하한을 갖는 값; 값의 범위; 평균(average) 값; 중간 값; 평균(mean) 값; 또는 특정 대조 또는 기준선 값에 대해 비교된 값일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "어레이" 또는 "마이크로어레이"는 혼성화가능한 어레이 요소, 예를 들어 폴리뉴클레오티드 프로브 (예를 들어, 올리고뉴클레오티드) 및 항체의 기판 상의 규칙적인 정렬을 나타낸다. 상기 기판은 고체 기판, 예를 들어 유리 슬라이드, 또는 반-고체 기판, 예를 들어 니트로셀룰로스 막일 수 있다. 뉴클레오티드 서열은 DNA, RNA, 또는 이들의 임의의 치환일 수 있다.
본원에 사용된 "증폭"은 일반적으로 원하는 서열의 다중 카피를 생산하는 과정을 나타낸다. "다중 카피"는 적어도 2개의 카피를 의미한다. "카피"가 반드시 주형 서열에 대한 완전한 서열 상보성 또는 동일성을 의미하는 것이 아니다. 예를 들어, 카피는 뉴클레오티드 유사체, 예를 들어 데옥시이노신, 의도적인 서열 변경 (예를 들어, 주형에 혼성화가능하지만 상보성이지는 않은 서열을 포함하는 프라이머를 통해 도입되는 서열 변경), 및/또는 증폭 동안 발생하는 서열 오류를 포함할 수 있다.
제1 샘플에서 유전자 또는 바이오마커의 발현/양은 제1 샘플에서 유전자 또는 바이오마커의 발현 수준/양이 제2 샘플에서 유전자 또는 바이오마커의 발현 수준/양의 적어도 약 1.5X, 1.75X, 2X, 3X, 4X, 5X, 6X, 7X, 8X, 9X 또는 10X이면 제2 샘플에서 수준"보다 더 큰" 수준이다. 발현 수준/양은 mRNA, cDNA, 단백질, 단백질 단편 및/또는 유전자 카피를 포함하고 이에 제한되지 않는, 당업계에 공지된 임의의 적합한 기준을 기초로 하여 결정될 수 있다. 발현 수준/양은 정성적으로 및/또는 정량적으로 결정될 수 있다.
본원에서 상호교환적으로 사용된 "폴리뉴클레오티드" 또는 "핵산"은 임의의 길이의 뉴클레오티드의 중합체를 나타내고, DNA 및 RNA를 포함한다. 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드, 변형된 뉴클레오티드 또는 염기 및/또는 이들의 유사체, 또는 DNA 또는 RNA 폴리머라제에 의해 중합체로 혼입될 수 있는 임의의 기질일 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드, 예를 들어 메틸화 뉴클레오티드 및 그의 유사체를 포함할 수 있다. 뉴클레오티드 구조에 대한 변형이 존재하는 경우, 이러한 변형은 중합체의 조립 이전 또는 이후에 부여될 수 있다. 뉴클레오티드의 서열에 비뉴클레오티드 성분이 개재될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 표지 성분과의 접합에 의해서와 같이 중합 후에 추가로 변형될 수 있다. 다른 유형의 변형은, 예를 들어 "캡(cap)", 1개 이상의 자연 발생 뉴클레오티드의 유사체로의 치환, 뉴클레오티드간 변형, 예컨대 비하전된 연결을 갖는 것 (예를 들어, 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포아미데이트, 카르바메이트 등) 및 하전된 연결을 갖는 것 (예를 들어, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등), 펜던트 잔기, 예를 들어 단백질 (예를 들어, 뉴클레아제, 독소, 항체, 신호 펩티드, 폴리-L-리신 등)을 함유하는 것, 인터칼레이터(intercalator) (예를 들어, 아크리딘, 프소랄렌 등)가 있는 것, 킬레이터 (예를 들어, 금속, 방사성 금속, 붕소, 산화성 금속 등)를 함유하는 것, 알킬레이터를 함유하는 것, 변형된 결합이 있는 것 (예를 들어, 알파 아노머 핵산 등), 뿐만 아니라 변형되지 않은 형태의 폴리뉴클레오티드(들)을 포함한다. 또한 당에 본래 존재하는 임의의 히드록실기는 예를 들어 포스포네이트기, 포스페이트기에 의해 치환되거나, 표준 보호기에 의해 보호되거나, 또는 추가의 뉴클레오티드에 대한 추가의 연결을 형성하기 위해 활성화되거나, 또는 고체 지지체에 접합될 수 있다. 5' 및 3' 말단 OH는 인산화되거나 또는 아민 또는 1 내지 20개의 탄소 원자를 갖는 유기 캡핑 기 잔기로 치환될 수 있다. 다른 히드록실이 표준 보호기로 유도체화될 수도 있다. 폴리뉴클레오티드는 또한 예를 들어 2'-O-메틸-2'-O-알릴, 2'-플루오로- 또는 2'-아지도-리보스, 카르보시클릭 당 유사체, α-아노머 당, 에피머 당, 예를 들어 아라비노스, 자일로스 또는 릭소스, 피라노스 당, 푸라노스 당, 세도헵툴로스, 비환식 유사체 및 무염기성 뉴클레오시드 유사체, 예를 들어 메틸 리보시드를 포함하여, 일반적으로 당업계에 공지되어 있는 유사한 형태의 리보스 또는 데옥시리보스 당을 함유할 수 있다. 하나 이상의 포스포디에스테르 연결부가 대안적 연결기로 대체될 수 있다. 이들 대안적 연결기는 포스페이트가 P(O)S ("티오에이트"), P(S)S ("디티오에이트"), "(O)NR2 ("아미데이트"), P(O)R, P(O)OR', CO 또는 CH2 ("포름아세탈")로 대체된 실시양태를 포함하나, 이에 제한되지 않으며, 여기서 각각의 R 또는 R'는 독립적으로 H 또는 임의로 에테르 (-O-) 연결을 함유하는 치환 또는 비치환된 알킬 (1-20 C), 아릴, 알케닐, 시클로알킬, 시클로알케닐 또는 아르알킬이다. 폴리뉴클레오티드 내의 모든 연결부가 동일할 필요는 없다. 전술한 설명은 RNA 및 DNA를 비롯하여 본원에서 언급되는 모든 폴리뉴클레오티드에 적용된다.
일반적으로, 본원에 사용된 "올리고뉴클레오티드"는 일반적으로 길이가 약 200개 미만 뉴클레오티드이긴 하지만 반드시 그럴 필요가 없는 짧은, 일반적으로 단일 가닥, 일반적으로 합성 폴리뉴클레오티드를 나타낸다. 용어 "올리고뉴클레오티드" 및 "폴리뉴클레오티드"는 서로 배타적이지 않다. 폴리뉴클레오티드에 대한 상기 기재는 올리고뉴클레오티드에 동일하고 완전하게 적용가능하다.
"프라이머"는 일반적으로 표적 서열에 혼성화함으로써 관심있는 샘플에 잠재적으로 존재하는 표적에 결합한 후, 표적에 상보성인 폴리뉴클레오티드의 중합을 촉진하는, 일반적으로 유리 3'-OH 기를 갖는 짧은 단일 가닥의 폴리뉴클레오티드이다. "프라이머의 쌍"은 특이적 표적 유전자의 일부를 증폭하기 위해 사용될 수 있는 5' 프라이머 및 3' 프라이머를 나타낸다.
용어 "3'"은 일반적으로 동일한 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 내의 또 다른 영역 또는 위치로부터의 3' (하류)에 위치하는 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 내의 영역 또는 위치를 나타낸다. 용어 "5'"은 일반적으로 동일한 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 내의 또 다른 영역 또는 위치로부터의 5' (상류)에 위치하는 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 내의 영역 또는 위치를 나타낸다.
어구 "유전자 증폭"은 특정 세포 또는 세포주에서 다중 카피의 유전자 또는 유전자 단편이 형성되는 과정을 나타낸다. 중첩된 영역 (증폭된 DNA의 스트레치)이 종종 "앰플리콘"으로 지칭된다. 대체로, 생성된 메신저 RNA (mRNA)의 양, 즉, 유전자 발현의 수준도 발현되는 특정 유전자로 이루어진 카피의 수에 비례하여 증가한다.
"검출"은 직접 및 간접 검출을 비롯하여 임의의 검출 수단을 포함한다.
용어 "예측"은 본원에서 환자가 약물 또는 약물 세트에 대해 유리하게 또는 불리하게 반응할 가능성을 지칭하기 위해 사용된다. 한 실시양태에서, 예측은 이러한 반응의 정도에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 예측은 환자가 치료, 예를 들어 특정 치료제를 사용한 치료 이후에 질환의 재발 없이 특정 기간 동안 생존하거나 개선되는지의 여부 및/또는 그러할 확률과 관련이 있다. 본 발명의 예측 방법은 임의의 특정 환자에 대한 가장 적절한 치료 방식을 선택하여 치료를 결정하는데 임상적으로 사용될 수 있다. 본 발명의 예측 방법은 환자가 치료 방식, 예를 들어 주어진 치료 방식, 예를 들어 주어진 치료제 또는 조합물의 투여, 수술적 개입, 스테로이드 치료 등에 유리하게 반응할 것인지의 여부 또는 치료 방식 수행 후에 환자의 장기간 생존이 가능한지의 여부를 예측할 때 유용한 도구이다.
용어 "장기간 생존"은 치료학적 치료 이후 적어도 1년, 5년, 8년, 또는 10년 동안 생존해 있는 것을 나타내는 것으로 본원에 사용된다.
"환자 반응"은 (1) 질환 진행의 어느 정도까지의 억제, 예를 들어 지연 및 완전한 정지, (2) 질환 에피소드 및/또는 증상의 수의 감소, (3) 병변 크기의 감소, (4) 인접한 말초 기관 및/또는 조직으로의 질환 세포 침윤의 억제 (즉, 감소, 지연 또는 완전한 정지), (5) 질환 확산의 억제 (즉, 감소, 지연 또는 완전한 정지), (6) 장애와 관련된 하나 이상의 증상의 어느 정도까지의 완화, (7) 치료 후 무병 상태를 보이는 기간의 증가, 및/또는 (8) 치료 후 주어진 시점에서의 사망률 감소를 포함하지만 이에 제한되지 않는, 환자에 대한 이로움을 나타내는 임의의 종점을 이용하여 평가할 수 있다.
용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되고, 구체적으로는 모노클로날 항체 (예를 들어, 전장 모노클로날 항체), 다중특이적 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체), 및 원하는 생물학적 활성 또는 기능을 나타내는 한은 항체 단편을 포함한다.
"항체 단편"은 전장 항체의 일부, 일반적으로는 그의 항원 결합 또는 가변 영역을 포함한다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편, 디아바디, 선형 항체, 단일-쇄 항체 분자, 및 항체 단편들로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함한다.
"Fv"는 완전한 항원-인식 및 항원 결합 부위를 함유하는 최소 항체 단편이다. 이 단편은 1개의 중쇄 가변 영역 도메인 및 1개의 경쇄 가변 영역 도메인이 단단하게 비-공유적으로 결합된 이량체로 이루어진다. 이들 2개 도메인이 폴딩되어 6개의 초가변 루프 (H 쇄 및 L 쇄로부터 각각 3개의 루프)가 형성되는데, 상기 루프는 항원 결합을 위한 아미노산 잔기를 제공하고 항체에 항원 결합 특이성을 부여한다. 그러나, 단일 가변 도메인 (또는 항원에 특이적인 3개의 CDR만을 포함하는 Fv의 절반)일지라도 전체 결합 부위보다 친화도가 낮긴 하지만 항원을 인식하고 결합하는 능력을 갖는다.
본원에 사용된 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 동질적 항체 집단, 즉 집단을 차지하고 있는 개개의 항체가 모노클로날 항체의 생성 동안 유발될 수 있는 가능한 변이체 (이러한 변이체는 일반적으로 미량으로 존재한다)를 제외하고는 동일하고/하거나 동일한 에피토프(들)와 결합하는 집단으로부터 수득한 항체를 나타낸다. 전형적으로, 이러한 모노클로날 항체는 표적에 결합하는 폴리펩티드 서열을 포함하는 항체를 포함하고, 여기서의 표적-결합 폴리펩티드 서열은 복수 개의 폴리펩티드 서열로부터 단일 표적 결합 폴리펩티드 서열의 선택을 포함하는 방법에 의해 수득된 것이다. 예를 들어, 선택 방법은 복수 개의 클론, 예컨대 하이브리도마 클론, 파지 클론 또는 재조합 DNA 클론의 풀로부터 특유한 클론을 선택하는 것일 수 있다. 선택된 표적 결합 서열을 추가로 변경시켜서 예를 들어 표적에 대한 친화도를 개선시키고 표적 결합 서열을 인간화하고 세포 배양물 중에서의 그의 생성을 개선시키며 생체내 그의 면역원성을 저하시키고 다중특이적 항체를 생성할 수 있으며, 변경된 표적 결합 서열을 포함하는 항체 또한 본 발명의 모노클로날 항체라는 것을 이해해야 한다. 상이한 결정자 (에피토프)에 대해 유도된 상이한 항체를 전형적으로 포함하는 폴리클로날 항체 제제와는 달리, 모노클로날 항체 제제의 각 모노클로날 항체는 항원상의 단결정자에 대한 것이다. 모노클로날 항체 제제는 그의 특이성 이외에도 다른 이뮤노글로불린에 의해 전형적으로 오염되지 않는다는 점에서 유리하다. 수식어 "모노클로날"은 항체의 특징을 실질적으로 동종인 항체들의 집단으로부터 수득하였다는 것으로 표시하고, 임의의 특정한 방법을 통한 항체 생성이 필요하다는 것으로 해석되어서는 안된다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용될 모노클로날 항체는 다양한 기술, 예를 들어 하이브리도마 방법 (예를 들어, 문헌 [Kohler et al., Nature, 256:495 (1975)]; [Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988)]; [Hammerling et al., in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681, (Elsevier, N.Y., 1981)]), 재조합 DNA 방법 (예를 들어, 미국 특허 제4,816,567호 참조), 파지 디스플레이 기술 (예를 들어, 문헌 [Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991)]; [Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)]; [Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2):299-310 (2004)]; [Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5):1073-1093 (2004)]; [Fellouse, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 101(34):12467-12472 (2004)]; 및 [Lee et al. J. Immunol. Methods 284(1-2):119-132 (2004)] 참조), 및 인간 이뮤노글로불린 서열을 코딩하는 인간 이뮤노글로불린 유전자좌 또는 유전자의 일부 또는 전부를 갖는 동물에서 인간 또는 인간-유사 항체를 생성하기 위한 기술 (예를 들어, WO 1998/24893; WO 1996/34096; WO 1996/33735; WO 1991/10741; 문헌 [Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993)]; [Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993)]; [Bruggemann et al., Year in Immuno., 7:33 (1993)]; 미국 특허 제5,545,806호; 제5,569,825호; 제5,591,669호 (모두 젠팜(GenPharm)의 특허임); 제5,545,807호; WO 1997/17852; 미국 특허 제5,545,807호; 제5,545,806호; 제5,569,825호; 제5,625,126호; 제5,633,425호; 및 제5,661,016호; [Marks et al., Bio/Technology, 10: 779-783 (1992)]; [Lonberg et al., Nature, 368: 856-859 (1994)]; [Morrison, Nature, 368: 812-813 (1994)]; [Fishwild et al., Nature Biotechnology, 14: 845-851 (1996)]; [Neuberger, Nature Biotechnology, 14: 826 (1996)]; 및 [Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol., 13: 65-93 (1995) 참조)로 제조될 수 있다.
모노클로날 항체는 본원에서 특이적으로 "키메라" 항체를 포함한다. "키메라" 항체 (이뮤노글로불린)는 특정 종으로부터 유래되었거나 특정 항체 클래스 또는 하위클래스에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 이와 상동성이 있는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부를 가지며, 상기 쇄(들)의 나머지 부분은 또 다른 종으로부터 유래되었거나 또 다른 항체 클래스 또는 하위클래스에 속하는 항체, 뿐만 아니라 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한은 이러한 항체의 단편의 상응하는 서열과 동일하거나 이와 상동성이 있다 (미국 특허 제4,816,567호, 및 문헌 [Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)]). 본원에 사용된 인간화 항체는 키메라 항체의 하위세트이다.
"인간화" 형태의 비-인간 (예를 들어, 뮤린) 항체는 비-인간 이뮤노글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 대부분의 경우, 인간화 항체는 수용자의 초가변 영역의 잔기가 원하는 특이성, 친화도 및 능력을 보유하는 마우스, 래트, 토끼 또는 비-인간 영장류와 같은 비-인간 종 (공여자 항체)의 초가변 영역의 잔기로 대체된 인간 이뮤노글로불린 (수용자(recipient) 또는 수용자(acceptor) 항체)이다. 일부 경우에, 인간 이뮤노글로불린의 Fv 프레임워크 영역 (FR) 잔기를 상응하는 비-인간 잔기로 치환한다. 추가로, 인간화 항체는 수용자 항체 또는 공여자 항체에서는 발견되지 않는 잔기를 포함할 수도 있다. 이러한 변형은 항체 성능, 예컨대 결합 친화도가 추가로 증진되도록 이루어진다. 일반적으로, 인간화 항체는 적어도 1개, 전형적으로는 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이고, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 루프는 비-인간 이뮤노글로불린의 것에 상응하고, FR 영역이 결합 친화도를 개선시키는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함할 수 있지만 모든 또는 실질적으로 모든 FR은 인간 이뮤노글로불린 서열의 것이다. FR 중 이들 아미노산 치환의 수는 전형적으로 H 쇄에서 6 이하, L 쇄에서는 3 이하이다. 또한, 인간화 항체는 임의로 이뮤노글로불린 불변 영역 (Fc)의 적어도 일부, 전형적으로 인간 이뮤노글로불린의 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 것이다. 추가의 세부사항에 대해서는, 문헌 [Jones et al., Nature 321:522-525 (1986)]; [Reichmann et al., Nature 332:323-329 (1988)]; 및 [Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)]을 참조한다.
"인간 항체"는 인간에 의해 생성된 항체의 그것에 상응하는 아미노산 서열을 갖고/갖거나 공지된 인간 항체 제조 기술 중 임의의 것을 이용하여 제조된 것이다. 인간 항체의 이러한 정의에서 비-인간 항원 결합 잔기를 포함하는 인간화 항체는 명확하게 제외된다.
"친화도 성숙" 항체는 변경(들)을 갖지 않는 모 항체에 비해 항원에 대한 항체의 친화도를 개선시키는, 그의 하나 이상의 CDR/HVR에 하나 이상의 변경을 갖는 것이다. 바람직한 친화도 성숙 항체는 표적 항원에 대해 나노몰 또는 심지어는 피코몰의 친화도를 가질 것이다. 친화도 성숙 항체는 당업계에 공지된 절차에 의해 제조된다. 문헌 [Marks et al. Bio/Technology 10:779-783 (1992)]에서는 VH 및 VL 도메인 셔플링 (shuffling)에 의한 친화도 성숙을 설명하고 있다. CDR/HVR 및/또는 프레임워크 잔기의 무작위 돌연변이유발은 문헌 [Barbas et al. Proc Nat. Acad. Sci, USA 91:3809-3813 (1994)]; [Schier et al. Gene 169:147-155 (1995)]; [Yelton et al. J. Immunol. 155:1994-2004 (1995)]; [Jackson et al., J. Immunol. 154(7):3310-9 (1995)]; 및 [Hawkins et al., J. Mol. Biol. 226:889-896 (1992)]에 기재되어 있다.
용어 "Fc 영역"은 무손상 항체의 파파인 소화에 의해 생성될 수 있는 이뮤노글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 정의하는데 사용된다. Fc 영역은 천연 서열 Fc 영역 또는 변이체 Fc 영역일 수 있다. 이뮤노글로불린 중쇄의 Fc 영역의 경계는 다양할 수 있지만, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 일반적으로 약 위치 Cys226, 또는 약 위치 Pro230의 아미노산 잔기로부터 Fc 영역의 카르복실-말단까지의 스트레치로 정의된다. 이뮤노글로불린의 Fc 영역은 일반적으로 2개의 불변 도메인인 CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하고, 임의로 CH4 도메인을 포함한다. 본원에서의 "Fc 영역 쇄"는 Fc 영역의 2개의 폴리펩티드 쇄 중 하나를 의미한다.
항체 "이펙터 기능"은 항체의 Fc 영역 (천연 서열 Fc 영역 또는 아미노산 서열 변이체 Fc 영역)에 기인하는 생물학적 활성을 지칭하고, 항체 이소형에 따라 달라진다. 항체 이펙터 기능의 예에는 C1q 결합성 및 보체 의존성 세포독성; Fc 수용체 결합성; 항체-의존성 세포-매개된 세포독성 (ADCC); 포식작용; 세포 표면 수용체 (예를 들어, B-세포 수용체)의 하향 조절; 및 B-세포 활성화가 포함된다.
"항체-의존성 세포-매개 세포독성" 또는 "ADCC"는 특정 세포독성 세포 (예를 들어, 천연 킬러 (NK) 세포, 호중구 및 대식세포)에 존재하는 Fc 수용체 (FcR)에 결합된 분비된 Ig가 이러한 세포독성 이펙터 세포가 항원-보유 표적 세포에 특이적으로 결합하여 이후에 표적 세포를 세포독소로 사멸시킬 수 있게 하는 세포독성 형태를 나타낸다. 항체는 세포독성 세포의 "암(arm)"이고 이러한 사멸에 반드시 필요하다. ADCC를 매개하는 주요 세포인 NK 세포는 FcγRIII 만을 발현하는 반면에, 단핵구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII을 발현한다. 조혈 세포 상에서의 FcR 발현은 문헌 [Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991)]의 페이지 464, 표 3에 요약되어 있다. 관심있는 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위해, 시험관내 ADCC 검정, 예컨대 미국 특허 제5,500,362호 또는 제5,821,337호 또는 미국 특허 제6,737,056호 (Presta)에 기재된 것을 수행할 수 있다. 이러한 검정에 유용한 이펙터 세포는 말초혈 단핵 세포 (PBMC) 및 천연 킬러 (NK) 세포를 포함한다. 다르게는 또는 추가로, 관심있는 분자의 ADCC 활성은 예를 들어 문헌 [Clynes et al. PNAS (USA) 95:652-656 (1998)]에 개시된 바와 같은 동물 모델에서 생체내 평가할 수 있다.
"치료하는" 또는 "치료" 또는 "경감"은 표적화된 병리적 상태 또는 장애를 치유하지 않거나 상기 상태의 재발을 예방하지 않으면 대상체가 무기력해지는 (약해지는) 치료학적 치료를 나타낸다. 대상체는 치료량의 CD40 결합 항체를 투여한 후, 대상체가 특정 질환의 하나 이상의 징후 및 증상의 관찰가능한 및/또는 측정가능한 감소 또는 부재를 보일 경우에 B-세포 악성종양에 대해 성공적으로 "치료된다". 예를 들어, 암 세포 수의 유의한 감소 또는 암 세포의 부재; 종양 크기의 감소; 종양 전이의 억제 (즉, 어느 정도의 지연, 바람직하게는 정지); 종양 성장의 어느 정도의 억제; 특이적인 암과 연관된 하나 이상의 증상의 완화 기간의 증가, 및/또는 어느 정도의 경감; 이환률 및 사망률 감소, 및 삶의 질 개선이 그 대상체다. 질환의 징후 또는 증상의 감소는 환자도 느낄 수 있다. 치료는 암의 모든 징후의 소멸로서 정의되는 완전 반응 또는 종양의 크기가 바람직하게는 50％ 초과, 보다 바람직하게는 75％로 감소되는 부분적 반응을 달성할 수 있다. 환자는 또한 환자가 안정적인 질환을 경험한다면 치료된 것으로 간주된다. 한 기준에서, 본 발명의 항체는 95％ 초과의 말초혈 B-세포 고갈 및 기준선의 25％까지의 B-세포 회복을 달성한다. 일부 실시양태에서, 항-CD40 항체를 사용한 치료는 치료 3개월 후, 바람직하게는 6개월 후, 보다 바람직하게는 1년 후, 훨씬 더 바람직하게는 2년 이상 후에 암 환자에서 암이 진행되지 않을 정도로 효과적이다. 질환에 있어서의 성공적인 치료 및 개선을 평가하는 이러한 파라미터는 당업계의 숙련된 의사에게 일반적인 통상의 절차로 쉽게 측정가능하다.
본원에 사용된 용어 "비-호지킨 림프종" 또는 "NHL"은 호지킨 림프종 이외의 림프계 암을 나타낸다. 호지킨 림프종은 일반적으로 호지킨 림프종에는 리드-스테른베르그(Reed-Sternberg) 세포가 존재하고 비-호지킨 림프종에는 상기 세포가 없는 것으로서 비-호지킨 림프종과 구별될 수 있다.
"유효량"은 원하는 치료 또는 예방 결과 달성에 필요한 용량에서 이러한 기간 동안 효과적인 양을 나타낸다. 치료제의 "치료 유효량"은 개체병 상태, 연령, 성별 및 체중, 개체에서 원하는 반응을 유도하기 위한 항체의 능력과 같은 요인에 따라 달라질 수 있다. 치료 유효량은 또한 치료제의 임의의 독성 또는 유해 효과보다 치료상 유익한 효과가 더 큰 양이다. "예방 유효량"은 원하는 예방 결과 달성에 필요한 용량 및 이러한 기간 동안 효과적인 양을 나타낸다. 반드시는 아니지만, 일반적으로 예방 용량은 질환 발생 전에 또는 질환의 초기 단계에 대상체에 사용되기 때문에, 예방 유효량은 치료 유효량 미만일 것이다.
용어 "하우스키핑 유전자"는 그의 활성이 세포 기능의 유지에 필수적인 단백질을 코딩하는 일군의 유전자를 의미한다. 상기 유전자는 전형적으로 모든 세포 유형에서 유사하게 발현된다.
"상관관계가 있다" 또는 "상관관계가 있는"은, 제1 분석 또는 프로토콜의 성능 및/또는 결과를 제2 분석 또는 프로토콜의 성능 및/또는 결과와 임의의 방식으로 비교하는 것을 의미한다. 예를 들어, 제2 프로토콜의 수행시에 제1 분석 또는 프로토콜의 결과를 이용할 수 있고/있거나 제1 분석 또는 프로토콜의 결과를 이용하여 제2 분석 또는 프로토콜을 수행해야 하는지의 여부를 결정할 수 있다. 유전자 발현 분석 또는 프로토콜의 실시양태와 관련하여, 유전자 발현 분석 또는 프로토콜의 결과를 이용하여 특정 치료 방식을 수행해야 하는지의 여부를 결정할 수 있다.
본원에 사용될 때 단어 "표지"는 시약, 예를 들어 핵산 프로브 또는 항체에 직접 또는 간접적으로 접합되거나 융합되어, 접합되거나 또는 융합된 시약의 검출을 용이하게 하는 화합물 또는 조성물을 나타낸다. 표지는 그 자체가 검출가능할 수도 있고 (예를 들어, 방사성 동위원소 표지 또는 형광 표지), 또는 효소 표지의 경우에는 기질 화합물 또는 조성물의 검출가능한 화학적 변경을 촉매할 수도 있다.
본원에 사용된 관사 ("a", "an", 및 "the")는 달리 나타내지 않는 한 단수 또는 복수를 의미할 수 있다 (즉, 하나 이상을 의미할 수 있다).
본원에 기재된 본 발명의 측면 및 실시양태는 측면 및 실시양태를 "포함하는", "이로 이루어지는", 및 "본질적으로 이로 이루어지는" 것을 포함하는 것으로 이해된다.
C. 본 발명의 방법
본 발명은 항-CD40 항체를 사용한 치료에 대한 B-세포 림프종을 갖는 대상체의 반응성을 평가하거나 또는 그의 평가를 돕기 위한 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 B-세포 림프종을 갖는 대상체에서 항-CD40 항체 치료에 대한 반응성을 예측하거나 치료/반응성을 모니터링하기 위한 방법을 제공한다. 본 발명은 항-CD40 항체를 사용하는 치료를 위한 B-세포 림프종을 갖는 대상체를 선택하고, 이 대상체를 항-CD40 항체 치료로 치료하기 위한 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 방법은 대상체로부터 수득한 B 림프종 세포를 포함하는 샘플에서 UAP1, BTG2, CD40, VNN2, RGS13, CD22, LMO2, IFITM1, CTSC, CD44, PUS7, BCL6, EPDR1, IGF1R 및 CD79B로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 마커 유전자의 발현 수준을 측정하고, 상기 하나 이상의 마커 유전자의 발현 수준 측정을 기반으로 항-CD40 항체 치료에 대한 대상체의 반응성을 예측하거나, 평가하거나 또는 그의 평가를 돕는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 대상체로부터의 B-세포 림프종 샘플에서 UAP1, BTG2, CD40, VNN2, RGS13, CD22, LMO2, IFITM1, CTSC, CD44, PUS7, BCL6, EPDR1, IGF1R 및 CD79B로부터 선택된 적어도 하나의 마커 유전자의 측정된 발현 수준을 각각의 마커 유전자에 대한 참조 수준에 대해 비교하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 반응성은 하나 이상의 마커 유전자의 측정된 발현 수준을 기반으로 결정된 감수성 지수 값을 사용하여 예측되거나 또는 평가된다. 일부 실시양태에서, 반응성은 본원에 기재된 K-최근접 이웃 분석을 이용하여 대상체를 분류함으로써 예측되거나 또는 평가된다.
본 발명의 방법은 임상의가 항-CD40 항체를 사용한 치료를 위한 B-세포 림프종을 갖는 환자를 확인하는데, 항-CD40 항체 요법의 개발 과정 동안 환자 선택을 돕는데, 개별 환자를 특정 치료 요법으로 치료할 때 성공 가능성을 예측하는데, 질환 진행을 평가하고 모니터링하는데, 치료 효능을 모니터링하는데, 및 개별 환자의 예후를 결정하는데 유용하다. 임의의 이들 실시양태가 본 발명에 포함된다.
일부 실시양태에서, B-세포 림프종은 여포성 림프종, 재발성 여포성 림프종, 소림프구성 림프종, 외투 세포 림프종, 변연부 림프종, 림프형질세포성 림프종, 균상 식육종/세자리 증후군, 비장 변연부 림프종, 및 미만성 거대 B-세포 림프종 (이에 제한되지 않음)을 포함하는 비-호지킨 림프종 (NHL)이다.
일부 실시양태에서, B-세포 림프종은 무통성이다. 일부 실시양태에서, B-세포 림프종은 공격성이다. 일부 실시양태에서, B-세포 림프종은 고도 공격성이다. 일부 실시양태에서, 무통성 B-세포 림프종은 여포성 림프종, 변연부 림프종 또는 소림프구성 림프종이다. 일부 실시양태에서, 무통성 B-세포 림프종은 여포성 림프종이다.
마커 유전자
B-세포 림프종 샘플에서 하나 이상의 마커 유전자의 발현 수준은 예컨대 항-CD40 항체를 사용한 치료에 대한 B-세포 림프종의 반응성을 예측하거나, 평가하거나 또는 그의 평가를 돕기 위한 본 발명의 방법에서 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 참조 수준과 관련하여 하나 이상의 마커 유전자의 발현 수준이 본 발명의 방법에 사용된다.
항-CD40 항체 치료에 대한 반응성을 예측하거나, 평가하거나 또는 그의 평가의 돕기 위해 UAP1, BTG2, CD40, VNN2, RGS13, CD22, LMO2, IFITM1, CTSC, CD44, PUS7, BCL6, EPDR1, IGF1R 및 CD79B의 발현 수준을 사용하는 것이 실시예 1 및 2에 제시된다. 하나 이상의 이들 유전자의 발현 수준은 본 발명의 방법에서 사용된다. 일부 실시양태에서, UAP1, BTG2, CD40, VNN2, RGS13, CD22, LMO2, IFITM1, CTSC, CD44, PUS7, BCL6, EPDR1, IGF1R 및 CD79B로부터 선택된 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 적어도 12개, 적어도 13개, 적어도 14개, 또는 15개의 유전자의 발현 수준을 측정하고, 본 발명의 방법에 사용한다.
본원에서 마커로 사용되는 유전자 (서열 포함)는 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 인간 유전자에 대한 진뱅크 등록 번호의 예는 다음과 같다:
유전자의 일부의 핵산 서열은 도 1 (1a 내지 1z)에 나타낸다.
참조 수준
B-세포 림프종 샘플에서 하나 이상의 마커 유전자의 측정된 발현 수준은 참조 수준에 대해 비교된다. 일부 실시양태에서, 참조 수준은 그의 발현 수준이 상이한 유형의 B-세포 림프종 사이에서, 예를 들어, 항-CD40 항체에 감수성인 B-세포 림프종과 항-CD40 항체에 내성인 B-세포 림프종 사이에서 변하지 않는 (유의하게 변하지 않는) 유전자의 발현 수준이다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 하우스키핑 유전자 (예컨대, WO 2009/062125의 표 8 및 9에 나타낸 유전자)의 발현 수준을 참조 수준으로 사용한다.
일부 실시양태에서, 마커 유전자의 측정된 발현 수준은 참조 수준을 이용하여 표준화된다. 일부 실시양태에서, 마커 유전자의 표준화된 발현 수준은 각각 원래 규모 또는 로그 규모의 마커 유전자와 참조 발현 수준 사이의 비 또는 차이로서 계산된다.
참조 유전자는 마커 유전자에 특이적인 표준화 대응부로 선택될 수 있다. 참조 유전자는 B-세포 림프종 샘플에서 높은 평균 발현 및 낮은 변동을 위해 선택되었다. 또한, 참조 유전자는 생물학상 구분되는 세포주의 발현 측정치 사이의 변동에 비해 개별 세포주의 복제된 발현 측정치 사이의 유사한 변동을 갖도록 선택되었다. 또한, 참조 유전자는 하나 이상의 마커와 낮은 통계적 연관성을 갖도록 선택되었다.
일부 실시양태에서, 참조 수준은 상이한 B-세포 림프종 샘플에서 마커 유전자의 측정된 발현 수준이다. 일부 실시양태에서, 상이한 B-세포 림프종 샘플은 항-CD40 항체 유도된 세포 사멸에 내성인 B 림프종 세포를 포함한다.
일부 실시양태에서, 참조 수준은 항-CD40 항체 치료 후에 종양 부피가 증가한 및/또는 항-CD40 항체 치료 후에 종양 부피가 감소한 대상체로부터의 B 림프종 세포를 포함하는 샘플에서 대응하는 마커 유전자의 발현 수준을 기반으로 결정된다. 일부 실시양태에서, 참조 수준 결정을 위한 대상체로부터의 샘플은 항-CD40 항체 치료에 대한 그의 반응성이 예측 또는 평가되는 대상체로부터의 샘플과 동일한 유형의 B 림프종 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 샘플에서 마커 유전자의 발현 수준을 측정하고 참조 샘플에서 대응하는 마커 유전자의 발현 수준을 측정하기 위해 동일한 방법 (예를 들어, qRT-PCR) 및/또는 시약 (예를 들어, 프라이머 및 프로브)이 사용된다.
발현 수준 측정
본원에 개시된 방법은 림프종 샘플 (예를 들어, B-세포 림프종 샘플)에서 하나 이상의 이러한 마커 유전자의 발현 수준을 조사하기 위한 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 참조 수준에 대한 발현 수준을 하나 이상의 마커 유전자에 대해 조사한다. 방법 및 검정은 마커 유전자, 예컨대 하나 이상의 UAP1, BTG2, CD40, VNN2, RGS13, CD22, LMO2, IFITM1, CTSC, CD44, PUS7, BCL6, EPDR1, IGF1R 및 CD79B의 발현을 조사하는 것을 포함한다. 발현 수준은 mRNA 수준 및/또는 단백질 수준에서 측정될 수 있다.
본 발명은 포유동물 조직 또는 세포 샘플 (예를 들어, B-세포 림프종과 연관된 세포 및/또는 조직)로부터 발현 수준을 측정하기 위한 방법을 제공한다. 예를 들어, 환자 샘플을 얻기 위해, H＆E 염색을 수행하고, 종양 함량을 농축시키기 위해 조직 육안절제를 위한 유도로서 사용한다. 샘플은 수술적 절제, 흡인 또는 생검을 포함하고 이에 제한되지 않는 당업계에 공지된 다양한 절차에 얻을 수 있다. 샘플은 신선하거나 동결될 수 있다. 일부 실시양태에서, 샘플은 고정되어 파라핀 등에 포매된다. 방법에서, 포유동물 조직 또는 세포 샘플을 얻고, 하나 이상의 바이오마커의 발현에 대해 검사한다. 방법은 mRNA 발현을 검출하는 검정, 효소 활성의 존재를 검출하는 효소적 검정, 및 면역조직화학 검정을 비롯한 다양한 검정 포맷으로 수행할 수 있다. 상기 조직 또는 세포 내의 이러한 바이오마커의 발현의 결정은 예측적일 것이어서, 이러한 조직 또는 세포는 항-CD40 항체를 사용한 치료에 대해 감수성/반응성일 것이다.
아래에서 논의되는 바와 같이, 샘플에서 다양한 바이오마커의 발현은 많은 방법에 의해 분석할 수 있고, 마이크로어레이 (유전자 및/또는 조직 어레이 분석), 계내 혼성화, 노던 분석, mRNA의 PCR 분석, 면역조직화학적 및/또는 웨스턴 분석, FACS, 단백질 검정, 질량 분광측정, 정량적 혈액 기반 검정 (예를 들어, 혈청 ELISA) (예를 들어, 단백질 발현의 수준을 조사하기 위해), 및/또는 생화학적 효소적 활성 검정을 포함하나 이에 제한되지 않는 이러한 많은 방법은 당업계에 공지되어 있고 당업자에 의해 이해된다. 유전자 및 유전자 생성물의 상태를 평가하는 전형적인 프로토콜은 예를 들어 문헌 [Ausubel et al. eds., 1995, Current Protocols In Molecular Biology]의 유닛 2 (노던 블롯팅), 유닛 4 (서던 블롯팅), 유닛 15 (이뮤노블롯팅) 및 유닛 18 (PCR 분석)에 기재된다. 샘플에서 특정 바이오마커, 예컨대 하나 이상의 UAP1, BTG2, CD40, VNN2, RGS13, CD22, LMO2, IFITM1, CTSC, CD44, PUS7, BCL6, EPDR1, IGF1R 및 CD79B의 발현 수준의 검출과 관련된 하기 프로토콜이 설명 목적으로 제공된다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 방법은 또한 조직 또는 세포 샘플에서 mRNA, 예컨대 UAP1, BTG2, CD40, VNN2, RGS13, CD22, LMO2, IFITM1, CTSC, CD44, PUS7, BCL6, EPDR1, IGF1R 및 CD79B로부터의 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 적어도 12개, 적어도 13개, 적어도 14개, 또는 15개의 유전자의 mRNA의 존재 및/또는 발현을 조사하는 프로토콜을 포함한다. 일부 실시양태에서, 샘플에서 다양한 바이오마커의 발현은 조직 또는 세포 샘플에서 mRNA를 조사하거나 또는 검출하는 마이크로어레이 기술에 의해 분석될 수 있다. 핵산 마이크로어레이를 사용함으로써, 시험 및 대조군 조직 샘플로부터의 시험 및 대조군 mRNA 샘플을 역전사시키고 표지하여 cDNA 프로브를 생성한다. 이어서, 프로브를 고체 지지체에 고정된 핵산의 어레이에 혼성화시킨다. 상기 어레이를 이 어레이의 각 구성원의 서열 및 위치를 알 수 있게 배열한다. 예를 들어, 특정 질환 상태에서 발현될 잠재력을 갖는 유전자의 선택물을 고체 지지체 상에 배열할 수 있다. 특정 어레이 구성원을 갖는 표지된 프로브의 혼성화는, 프로브가 유래된 샘플이 상기 유전자를 발현함을 나타낸다. 질환 조직의 차등적 유전자 발현 분석은 가치있는 정보를 제공할 수 있다. 마이크로어레이 기술에서는 단일 실험 내에서 수천 개 유전자의 mRNA 발현 프로파일을 평가하기 위해 핵산 혼성화 기술 및 전산화 기술을 이용한다. (예를 들어, 2001년 10월 11일자로 공개된 WO 01/75166 참조; 어레이 제작의 논의에 대해서는 또한 예를 들어 미국 특허 제5,700,637호, 미국 특허 제5,445,934호, 및 미국 특허 제5,807,522호, 문헌 [Lockart, Nature Biotechnology, 14:1675-1680 (1996)]; [Cheung, V.G. et al., Nature Genetics 21(Suppl):15-19 (1999)] 참조). DNA 마이크로어레이는, 유리 또는 다른 기판에서 직접 합성되거나 이것으로 스팟팅되는 유전자 단편을 함유하는 미니어처 어레이이다. 수천개의 유전자는 통상적으로 단일 어레이로 나타낸다. 통상적인 마이크로어레이 실험은 1) 샘플로부터 단리된 RNA로부터 형광 표지된 표적의 제조 단계, 2) 표지된 표적의 마이크로어레이로의 혼성화 단계, 3) 어레이의 세척, 염색 및 스캐닝 단계, 4) 스캐닝된 영상의 분석 단계, 및 5) 유전자 발현 프로파일의 생성 단계를 포함한다. 현재, 2가지 주요 유형의 DNA 마이크로어레이가 사용된다: 올리고뉴클레오티드 (통상적으로, 25 내지 70머) 어레이 및 cDNA로부터 제조된 PCR 생성물을 함유하는 유전자 발현 어레이. 어레이를 형성하는 경우, 올리고뉴클레오티드는 미리 제작되어 표면에 스팟팅되거나, 또는 표면에서 직접 합성될 수 있다 (계내).
아피메트릭스 진칩(Affymetrix GeneChip)？ 시스템은, 유리 표면 상에서 올리고뉴클레오티드를 직접 합성하여 제작되는 어레이를 포함하는 시판되는 마이크로어레이 시스템이다. 프로브/유전자 어레이: 올리고뉴클레오티드 (일반적으로 25머)는 반도체-기재 포토리소그래피 및 고체상 화학적 합성 기술의 조합에 의해 유리 웨이퍼 상에서 직접 합성된다. 각각의 어레이는 최대 400,000개의 상이한 올리고를 함유하고, 각각의 올리고는 수백만개의 카피로 존재한다. 올리고뉴클레오티드 프로브는 어레이상의 공지된 위치에서 합성되기 때문에, 혼성화 패턴 및 신호 강도는 아피메트릭스 마이크로어레이 스위트(Affymetrix Microarray Suite) 소프트웨어에 의해 유전자 정체성 및 상대적인 발현 수준의 면으로 해석될 수 있다. 각각의 유전자는 어레이에서 일련의 상이한 올리고뉴클레오티드 프로브에 의해 나타난다. 각각의 프로브 쌍은 완전 매치 올리고뉴클레오티드 및 미스매치 올리고뉴클레오티드로 이루어진다. 완전 매치 프로브는 특정 유전자에 대해 정확하게 상보적인 서열을 갖기 때문에 유전자 발현을 결정한다. 미스매치 프로브는 중심 염기 위치에서의 단일 염기 치환에 의해 완전 매치 프로브과 상이하여 표적 유전자 전사체의 결합을 방해한다. 이것은 완전 매치 올리고에 대해 측정된 신호에 기여하는 백그라운드 및 비-특이적 혼성화를 결정하는 것을 돕는다. 마이크로어레이 스위트 소프트웨어는 완전 매치 프로브의 혼성화 강도로부터 미스매치 프로브의 혼성화 강도를 감하여 각 프로브 세트에 대한 절대 강도 값 또는 특이적 강도 값을 결정한다. 프로브는 진뱅크 및 다른 뉴클레오티드 정보보관소의 최근 정보를 기초로 선택한다. 상기 서열은 유전자의 3' 말단의 독특한 영역을 인식한다고 여겨진다. 진칩 혼성화 오븐 ("회전식(rotisserie)" 오븐)을 사용하여 한번에 최대 64개 어레이의 혼성화를 수행한다. 플루이딕스 스테이션(fluidics station)은 프로브 어레이의 세척 및 염색을 수행한다. 이는 완벽하게 자동화되어 있고, 4가지 모듈을 함유하며, 각 모듈에는 하나의 프로브 어레이가 들어간다. 각 모듈은 미리 프로그래밍된 플루이딕스 프로토콜을 이용하여 마이크로어레이 스위트 소프트웨어를 통해 독립적으로 제어된다. 스캐너는 공초점 레이저 형광 스캐너이며, 이는 프로브 어레이에 결합된 표지된 cRNA에 의해 방출되는 형광 강도를 측정한다. 마이크로어레이 스위트 소프트웨어에 의한 컴퓨터 워크스테이션은 플루이딕스 스테이션 및 스캐너를 제어한다. 마이크로어레이 스위트 소프트웨어는 프로브 어레이에 대해 미리 프로그래밍된 혼성화, 세척 및 염색 프로토콜을 이용하여 최대 8개의 플루이딕스 스테이션을 제어할 수 있다. 또한, 상기 소프트웨어는 혼성화 강도 데이터를 수득하고 이것을 적절한 알고리즘을 이용하여 각 유전자에 대한 존재/부재 신호로 전환한다. 마지막으로, 상기 소프트웨어는 실험들 사이의 비교 분석에 의해 유전자 발현의 변화를 검출하고, 결과를 텍스트 파일 형식으로 구성하며, 이를 사용하여 다른 소프트웨어 프로그램으로 추가의 데이터 분석을 수행할 수 있다.
일부 실시양태에서, 샘플 내에서 다양한 바이오마커의 발현은 또한 유전자 결실 또는 유전자 증폭을 검사하여 평가할 수 있다. 유전자 결실 또는 증폭은 당업계에 공지된 매우 다양한 프로토콜의 임의의 하나, 예를 들어 통상적인 서던 블롯팅, mRNA의 전사를 정량화하는 노던 블롯팅 (문헌 [Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:5201-5205 (1980)]), 도트 블롯팅 (DNA 분석), 또는 적절하게 표지된 프로브를 사용하는 계내 혼성화 (예를 들어, FISH), 적절하게 표지된 프로브를 사용하는 세포유전학 방법 또는 비교 게놈 혼성화 (CGH)에 의해 측정할 수 있다. 예로서, 이들 방법은 유전자의 결실 또는 증폭을 검출하기 위해 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 샘플에서 다양한 바이오마커의 발현은 상보적 DNA 프로브를 사용하는 혼성화 검정 (예컨대 표지된 리보프로브를 사용하는 계내 혼성화, 노던 블롯 및 관련 기술) 및 다양한 핵산 증폭 검정 (예컨대 상보적 프라이머, 예컨대 UAP1, BTG2, CD40, VNN2, RGS13, CD22, LMO2, IFITM1, CTSC, CD44, PUS7, BCL6, EPDR1, IGF1R 및 CD79B의 하나 이상의 유전자에 특이적인 프라이머를 사용하는 RT-PCR 및 다른 증폭 유형 검출 방법, 예컨대 분지형 DNA, SISBA, TMA 등)에 의해 평가될 수 있다.
포유동물로부터의 조직 또는 세포 샘플은 노던, 도트 블롯 또는 PCR 분석을 이용하여 예를 들어 임의의 하나 이상의 UAP1, BTG2, CD40, VNN2, RGS13, CD22, LMO2, IFITM1, CTSC, CD44, PUS7, BCL6, EPDR1, IGF1R 및 CD79B 유전자의 mRNA에 대해 편리하게 분석될 수 있다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 바이오마커의 발현은 RT-PCR에 의해 검정할 수 있다. 일부 실시양태에서, RT-PCR은 정량적 RT-PCR (qRT-PCR)이다. 일부 실시양태에서, RT-PCR은 실시간 RT-PCR이다. 일부 실시양태에서, RT-PCR은 정량적 실시간 RT-PCR이다. RT-PCR 검정, 예컨대 정량적 PCR 검정은 당업계에 잘 공지되어 있다. 본 발명의 예시적인 실시양태에서, 생물학적 샘플에서 mRNA를 검출하는 방법은 적어도 하나의 프라이머를 사용한 역전사에 의해 샘플로부터 cDNA를 생성하고; 그 내부에서 cDNA를 증폭시키기 위해 센스 및 안티센스 프라이머로서 폴리뉴클레오티드를 사용하여 이렇게 생산된 cDNA를 증폭시키고; 관심있는 증폭된 cDNA의 존재를 검출하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 실시간 RT-PCR은 정량적 RT-PCR이다. 일부 실시양태에서, 실시간 RT-PCR은 TaqMan？ 화학 (어플라이드 바이오시스템즈 (Applied Biosystems))을 이용하여 수행할 수 있다. 일부 실시양태에서, 실시간 RT-PCR은 TaqMan？ 화학 (어플라이드 바이오시스템즈) 및 ABI 프리즘(Prism)？ 7700 서열 검출 시스템 (어플라이드 바이오시스템즈)을 이용하여 수행할 수 있다. 실시간 RT-PCR은 Taq 중합효소가 5'-3' 엑소뉴클레아제 활성을 갖고, 형광 공명 에너지 전달의 원리를 기초로 하여 절단시에만 형광 신호를 방출하는 이중-표지된 형광 올리고뉴클레오티드 문제가 발생한다는 원리를 조합한 것이다. 예를 들어, 문헌 [Overbergh, L. et al., J. Biomolecular Techniques 14(1): 33-43 (2003)]을 참조한다. 또한, 이러한 방법은 생물학적 샘플 중 mRNA의 수준을 결정하도록 하는 (예를 들어, "하우스키핑" 유전자, 예컨대 액틴 부류 구성원 및/또는 WO 2009/062125의 표 8 및 9에 수록된 하나 이상의 유전자의 비교 대조군 mRNA 서열의 수준을 동시에 조사함) 하나 이상의 단계를 포함할 수 있다. qRT-PCR의 수행에 사용될 수 있는 프라이머 및 프로브의 예가 표 1에 제공된다.
일부 실시양태에서, 샘플에서 UAP1, BTG2, CD40, VNN2, RGS13, CD22, LMO2, IFITM1, CTSC, CD44, PUS7, BCL6, EPDR1, IGF1R 및 CD79B에 의해 코딩되는 단백질의 발현은 면역조직화학 및 염색 프로토콜을 사용하여 조사한다. 조직 절편의 면역조직화학 염색은 샘플 내 단백질의 존재를 평가 또는 검출하는 신뢰할 수 있는 방법으로 나타난 바 있다. 면역조직화학 ("IHC") 기술은 프로브에 대한 항체를 이용하고, 일반적으로 발색 또는 형광 방법에 의해 계내에서 세포 항원을 가시화시킨다.
샘플 제조를 위해, 포유동물 (전형적으로 인간 환자)로부터의 조직 또는 세포 샘플을 사용할 수 있다. 샘플의 예는 조직 생검, 혈액, 폐 흡인물, 객담, 림프액 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 샘플은 수술에 의한 절제, 흡인 또는 생검을 포함하나 이에 제한되지 않는 당업계에 공지된 다양한 절차에 의해 얻을 수 있다. 조직은 신선하거나 냉동될 수 있다. 일부 실시양태에서, 샘플은 고정되어 파라핀 등에 포매된다.
조직 샘플은 통상의 방법으로 고정 (즉, 보존)될 수 있다 (예를 들어, 문헌 ["Manual of Histological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology," 3rd edition (1960) Lee G. Luna, HT (ASCP) Editor, The Blakston Division McGraw-Hill Book Company, New York; The Armed Forces Institute of Pathology Advanced Laboratory Methods in Histology and Pathology (1994) Ulreka V. Mikel, Editor, Armed Forces Institute of Pathology, American Registry of Pathology, Washington, D.C.] 참조). 당업자는 샘플이 조직학적으로 염색되거나 달리 분석되는 목적에 따라 고정제를 선택할 수 있음을 알 것이다. 당업자는 또한 고정시키는 시간의 길이는 조직 샘플의 크기 및 사용된 고정제에 따라 달라질 것임을 알 것이다. 예를 들어, 중성 완충된 포르말린, 보우인(Bouin) 또는 파라포름알데히드를 사용하여 샘플을 고정시킬 수 있다.
일반적으로, 샘플을 먼저 고정시킨 후에 농도가 상승하는 일련의 알콜을 통해 탈수시켜서 조직 샘플이 절편화될 수 있도록 파라핀 또는 다른 절편화 매질로 침윤 및 포매시킨다. 다르게는, 조직을 절편화하여 수득된 절편을 고정시킬 수 있다. 예를 들어, 조직 샘플을 통상의 방법으로 파라핀에 포매시키고 처리할 수 있다 (예를 들어, 문헌 ["Manual of Histological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology", 상기 문헌] 참조). 사용될 수 있는 파라핀의 예는 파라플라스트(Paraplast), 브롤로이드(Broloid) 및 티슈메이(Tissuemay)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 조직 샘플이 포매되면, 샘플을 마이크로톰 등으로 절편화시킬 수 있다 (예를 들어, 문헌 ["Manual of Histological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology", 상기 문헌] 참조). 이러한 절차의 예를 들어, 절편의 두께는 약 3 ㎛ 내지 약 5 ㎛의 범위일 수 있다. 절편화되면, 절편을 여러가지 표준 방법을 통해 슬라이드에 부착시킬 수 있다. 슬라이드 접착제의 예는 실란, 젤라틴, 폴리-L-리신 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 파라핀 포매된 절편은 양으로 하전된 슬라이드 및/또는 폴리-L-리신으로 코팅된 슬라이드에 부착될 수 있다.
파라핀이 포매재로서 사용된 경우, 조직 절편을 일반적으로 탈파라핀화하고 물에 재수화시킨다. 조직 절편은 통상적인 여러가지 표준 방법을 통해 탈파라핀화될 수 있다. 예를 들어, 크실렌 및 점차적으로 농도가 감소하는 일련의 알콜을 사용할 수 있다 (예를 들어, 문헌 ["Manual of Histological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology", 상기 문헌] 참조). 다르게는, 시판되는 탈파라핀화 비-유기 작용제, 예를 들어 Hemo-De7 (CMS, 미국 텍사스주 휴스톤)을 사용할 수 있다.
일부 실시양태에서, 샘플 제조 이후에, IHC를 사용하여 조직 절편을 분석할 수 있다. IHC는 추가의 기술, 예컨대 형태적 염색 및/또는 형광 계내 혼성화와 함께 수행될 수 있다. 2가지 일반적인 IHC 방법인 직접 및 간접 검정을 이용할 수 있다. 제1 검정에 따라, 표적 항원 (예를 들어, UAP1, BTG2, CD40, VNN2, RGS13, CD22, LMO2, IFITM1, CTSC, CD44, PUS7, BCL6, EPDR1, IGF1R 및 CD79B 중 어느 하나에 의해 코딩된 단백질 또는 그의 단편)에 대한 항체의 결합을 직접 결정한다. 이러한 직접 검정은 추가의 항체 상호작용 없이도 가시화될 수 있는 표지된 시약, 예를 들어 형광 태그 또는 효소-표지된 1차 항체를 사용한다. 전형적인 간접 검정에서는, 미접합 1차 항체가 항원에 결합한 후, 표지된 2차 항체가 상기 1차 항체에 결합한다. 2차 항체가 효소 표지에 접합된 경우, 항원이 가시화되도록 발색 또는 형광 기질을 첨가한다. 여러 2차 항체가 1차 항체 상의 상이한 에피토프와 반응할 수 있기 때문에 신호 증폭이 발생한다.
면역조직화학에 사용되는 1차 및/또는 2차 항체는 전형적으로 검출가능한 잔기로 표지될 것이다. 수많은 표지가 이용가능하고, 이들은 일반적으로 하기 카테고리로 분류될 수 있다:
(a) 방사성 동위원소, 예를 들어 35S, 14C, 125I, 3H, 및 131I. 항체는 예를 들어 문헌 [Current Protocols in Immunology, Volumes 1 and 2, Coligen et al., Ed. Wiley-Interscience, New York, New York, Pubs. (1991)]에 기재된 기술을 이용하여 방사성 동위원소로 표지할 수 있고, 방사능은 섬광 계수를 이용하여 측정할 수 있다.
(b) 콜로이드성 금 입자.
(c) 형광 표지, 예를 들어 (이에 제한되지 않음) 희토류 킬레이트 (유로퓸 킬레이트), 텍사스 레드(Texas Red), 로다민, 플루오레세인, 댄실, 리사민(Lissamine), 움벨리페론, 피코크리테린, 피코시아닌 또는 시판되는 형광단, 예를 들어 스펙트럼 오렌지7(SPECTRUM ORANGE7) 및 스펙트럼 그린7(SPECTRUM GREEN7) 및/또는 상기 물질 중 임의의 하나 이상의 유도체. 형광 표지는 예를 들어 문헌 [Current Protocols in Immunology, 상기 문헌]에 개시된 기술을 이용하여 항체에 접합될 수 있다. 형광은 형광계를 사용하여 정량할 수 있다.
(d) 다양한 효소-기질 표지가 이용가능하고, 미국 특허 제4,275,149호는 이들 중 일부에 대한 개관을 제공한다. 효소는 일반적으로 발색 기질의 화학적 변경을 촉매하며, 이는 다양한 기술을 이용하여 측정할 수 있다. 예를 들어, 효소는 기질에서의 색상 변화를 촉매할 수 있고, 이는 분광학적으로 측정할 수 있다. 다르게는, 효소는 기질의 형광 또는 화학발광을 변경시킬 수 있다. 형광의 변화를 정량하는 기술은 상기 기재되어 있다. 화학발광 기질은 화학적 반응에 의해 전자적으로 여기된 후에 측정 (예를 들어, 화학발광계 사용)할 수 있는 광을 방출하거나 에너지를 형광 수용자에게 제공할 수 있다. 효소 표지의 예는 루시페라제 (예를 들어, 반딧불이 루시페라제 및 박테리아 루시페라제; 미국 특허 제4,737,456호), 루시페린, 2,3-디히드로프탈라진디온, 말레이트 데히드로게나제, 우레아제, 퍼옥시다제, 예를 들어 양고추냉이 퍼옥시다제 (HRPO), 알칼리성 포스파타제, β-갈락토시다제, 글루코아밀라제, 리소자임, 사카라이드 옥시다제 (예를 들어, 글루코스 옥시다제, 갈락토스 옥시다제, 및 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제), 헤테로시클릭 옥시다제 (예를 들어, 우리카제 및 크산틴 옥시다제), 락토퍼옥시다제, 마이크로퍼옥시다제 등을 포함한다. 효소를 항체에 접합시키는 기술이 문헌 [O'Sullivan et al., Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay, in Methods in Enzym. (ed. J. Langone ＆ H. Van Vunakis), Academic press, New York, 73:147-166 (1981)]에 기재되어 있다.
효소-기질 조합의 예는 예를 들어 다음을 포함한다:
(i) 양고추냉이 퍼옥시다제 (HRPO)와 기질로서의 수소 퍼옥시다제 (여기서, 수소 퍼옥시다제는 염료 전구체 (예를 들어, 오르토페닐렌 디아민 (OPD) 또는 3,3',5,5'-테트라메틸 벤지딘 히드로클로라이드 (TMB))를 산화시킴);
(ii) 알칼리성 포스파타제 (AP)와 발색 기질로서의 파라-니트로페닐 포스페이트; 및
(iii) β-D-갈락토시다제 (β-D-Gal)와 발색 기질 (예를 들어, p-니트로페닐-β-D-갈락토시다제) 또는 형광발생 기질 (예를 들어, 4-메틸움벨리페릴-β-D-갈락토시다제).
수많은 다른 효소-기질 조합이 당업자에게 이용가능하다. 이들의 일반적인 검토를 위해, 미국 특허 제4,275,149호 및 제4,318,980호를 참조한다. 때때로, 표지는 항체에 간접적으로 접합된다. 당업자는 이를 달성하기 위한 각종 기술을 알 것이다. 예를 들어, 항체는 비오틴과 접합될 수 있고, 상기 언급된 4가지 넓은 카테고리의 표지 중 임의의 것이 아비딘과 접합될 수도 있고, 또는 그 반대의 경우도 가능하다. 비오틴은 아비딘에 선택적으로 결합하기 때문에, 표지는 이러한 간접적인 방식으로 항체와 접합될 수 있다. 다르게는, 표지와 항체의 간접 접합을 달성하기 위해서, 항체는 작은 합텐과 접합되고, 상기 언급된 표지의 여러 유형 중 하나가 항-합텐 항체와 접합된다. 따라서, 표지와 항체의 간접적인 접합이 달성될 수 있다.
앞서 논의된 샘플 제조 절차 외에도, IHC 이전, IHC 동안 또는 IHC 이후에 조직 절편을 추가로 처리하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 조직 샘플을 시트레이트 완충제 중에서 가열하는 것과 같은 에피토프 복구 방법이 수행될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Leong et al. Appl. Immunohistochem. 4(3):201 (1996)] 참조).
임의의 차단 단계 후에, 조직 절편을 1차 항체가 조직 샘플 중의 표적 단백질 항원에 결합하기에 적합한 조건하에 충분한 기간 동안 1차 항체에 노출시킨다. 이를 달성하기에 적절한 조건은 통상적인 실험으로 결정할 수 있다. 항체가 샘플에 결합하는 정도는 상기 논의된 검출가능한 표지 중 어느 하나를 사용하여 결정한다. 바람직하게는, 표지는 발색 기질, 예를 들어 3,3'-디아미노벤지딘 발색체의 화학적 변형을 촉매하는 효소 표지 (예를 들어, HRPO)이다. 바람직하게는, 효소 표지는 1차 항체에 특이적으로 결합하는 항체에 접합된다 (예를 들어, 1차 항체는 토끼 폴리클로날 항체이고, 2차 항체는 염소 항-토끼 항체이다).
일부 실시양태에서, 하나 이상의 바이오마커의 발현을 검출하기 위해 IHC 분석에 사용되는 항체는 하나 이상의 관심있는 바이오마커, 예컨대 UAP1, BTG2, CD40, VNN2, RGS13, CD22, LMO2, IFITM1, CTSC, CD44, PUS7, BCL6, EPDR1, IGF1R 및 CD79B에 의해 코딩되는 하나 이상의 단백질에 주로 결합하도록 생성된 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 모노클로날 항체이다. 항체는 다양한 상업적 공급처로부터 입수하는 것을 포함하여 당업계에서 용이하게 이용가능하고, 당업계에 공지된 통상적인 기술을 사용하여 생성할 수도 있다.
이와 같이 제조한 시료를 장착하여 커버 글라스를 덮을 수 있다. 이어서, 예를 들어 현미경을 사용하여 슬라이드 평가를 수행하고, 당업계에서 통상 사용되는 염색 강도 기준을 사용할 수 있다. 일례로서, 염색 강도 기준은 다음과 같이 평가될 수 있다:
[표 A]
대안적 방법에서, 샘플을 항체-바이오마커 복합체 형성에 충분한 조건하에서 상기 바이오마커에 특이적인 항체와 접촉시킨 후에 상기 복합체를 검출할 수 있다. 바이오마커의 존재는 수많은 방법, 예를 들어 혈장 및 혈청을 포함하는 다양한 조직 및 샘플을 검정하기 위한 웨스턴 블롯팅 및 ELISA 절차로 검출할 수 있다. 이러한 검정 포맷을 이용한 광범위한 면역검정 기술이 이용가능하고, 예를 들어 미국 특허 제4,016,043호, 제4,424,279호 및 제4,018,653호를 참조한다. 이들은 비-경쟁 유형의 단일-부위 및 2-부위 또는 "샌드위치" 검정 뿐만 아니라, 통상적인 경쟁적 결합 검정을 둘 모두 포함한다. 또한, 이러한 검정은 표적 바이오마커에 대한 표지된 항체의 직접 결합을 포함한다.
샌드위치 검정은 가장 유용하고 일반적으로 이용되는 검정 중 하나이다. 샌드위치 검정 기술의 수많은 변형이 존재하고, 모두가 본 발명에 포함된다. 간략하게, 전형적인 정방향 검정에서, 표지되지 않은 항체를 고체 기판에 고정시키고, 시험할 샘플을 결합된 분자와 접촉시킨다. 항체-항원 복합체 형성에 충분한 기간 동안의 적합한 인큐베이션 기간 후, 검출가능한 신호를 생성할 수 있는 리포터 분자로 표지되고 항원에 특이적인 2차 항체를 첨가하고, 항체-항원-표지된 항체의 또 다른 복합체 형성에 충분한 시간 동안 인큐베이션한다. 임의의 미반응 물질을 세척해 내고, 항원의 존재를 리포터 분자에 의해 생성된 신호를 관찰하여 결정한다. 결과는 가시적인 신호의 단순 관찰에 의해 정성적일 수도 있고, 또는 공지된 양의 바이오마커를 함유하는 대조군 샘플과의 비교로 정량할 수도 있다.
정방향 검정의 변형은 결합된 항체에 샘플 및 표지된 항체 둘다를 동시에 첨가하는 동시 검정을 포함한다. 이들 기술은 쉽게 명백해질 임의의 근소한 변형을 포함하여 당업자에게 공지되어 있다. 전형적인 정방향 샌드위치 검정에서, 바이오마커에 특이성을 갖는 1차 항체는 고체 표면에 공유 또는 수동 결합된다. 고체 표면은 전형적으로 유리 또는 중합체이고, 가장 일반적으로 사용되는 중합체는 셀룰로스, 폴리아크릴아미드, 나일론, 폴리스티렌, 폴리비닐 클로라이드 또는 폴리프로파일렌이다. 고체 지지체는 튜브, 비드, 마이크로플레이트의 디스크의 형태, 또는 면역검정 수행에 적합한 임의의 다른 표면일 수 있다. 결합 과정은 당업계에 공지되어 있고, 일반적으로 가교 공유 결합 또는 물리적 흡착으로 이루어지고, 중합체-항체 복합체는 시험 샘플 제조시에 세척하였다. 시험되는 샘플의 분취액을 이어서 고상 복합체에 첨가하고, 항체에 존재하는 임의의 서브유닛의 결합에 적합한 조건 (예를 들어, 실온 내지 40℃, 예를 들어 25℃ 내지 32℃) 하에 충분한 시간 (예를 들어, 2-40분 또는 보다 편리할 경우 밤새) 동안 인큐베이션한다. 인큐베이션 기간 후, 항체 서브유닛 고체 상을 세척하여 건조시키고, 바이오마커의 일부에 특이적인 2차 항체와 함께 인큐베이션한다. 2차 항체는 분자 마커에 대한 2차 항체의 결합을 표시하는데 사용되는 리포터 분자에 연결된다.
일부 실시양태에서, 방법은 샘플에서 표적 바이오마커를 고정시킨 후, 고정된 표적을 리포터 분자로 표지되거나 표지되지 않을 수 있는 특이적 항체에 노출시키는 것을 수반하였다. 표적의 양 및 리포터 분자 신호의 강도에 따라, 항체를 사용한 직접 표지에 의해 결합된 표적을 검출할 수 있다. 다르게는, 1차 항체에 특이적인 제2 표지된 항체를 표적-1차 항체 복합체에 노출시켜 표적-1차 항체-2차 항체의 3원 복합체를 형성시킨다. 상기 복합체는 리포터 분자에 의해 방출되는 신호에 의해 검출된다. 본 명세서에서 사용된 "리포터 분자"는 그의 화학적 성질에 의해 항원 결합된 항체의 검출을 허용하는 분석적으로 확인가능한 신호를 제공하는 분자를 나타낸다. 이러한 유형의 검정에서 가장 일반적으로 사용되는 리포터 분자는 효소, 형광단 또는 방사선핵종 함유 분자 (즉, 방사성 동위원소) 및 화학발광 분자이다.
효소 면역검정의 경우에, 효소는 일반적으로 글루타르알데히드 또는 퍼요오데이트에 의해 2차 항체에 접합된다. 그러나, 쉽게 인지될 바와 같이, 당업자가 쉽게 이용가능한 다양한 여러가지 접합 기술이 존재한다. 통상적으로 사용되는 효소는 특히 양고추냉이 퍼옥시다제, 글루코스 옥시다제, -갈락토시다제 및 알칼리성 포스파타제를 포함한다. 특이적 효소와 함께 사용될 기질은 일반적으로 상응하는 효소에 의한 가수분해시에 검출가능한 색상 변화가 생성되는 것으로서 선택된다. 적합한 효소의 예는 알칼리성 포스파타제 및 퍼옥시다제를 포함한다. 상기한 발색 기질 보다는 형광 생성물을 생성하는 형광 기질을 사용하는 것이 또한 가능하다. 모든 경우에서, 효소 표지된 항체를 1차 항체-분자 마커 복합체에 첨가하여 결합시킨 후에 잉여 시약을 세척해 낸다. 이어서, 적절한 기질을 함유하는 용액을 상기 항체-항원-항체의 복합체에 첨가한다. 기질은 2차 항체에 연결된 효소와 반응하여 정성적인 가시적 신호를 생성할 것이고, 이는 샘플 내에 존재하는 바이오마커의 양을 표시하도록 일반적으로는 분광학적으로 추가로 정량될 수 있다. 다르게는, 플루오레세인 및 로다민과 같은 형광 화합물이 이들의 결합 능력을 변경시키지 않으면서 항체에 화학적으로 커플링될 수 있다. 특정 파장의 광을 사용한 조명으로 활성화될 때, 형광색소 표지 항체는 광 에너지를 흡수하여 분자를 여기가능 상태로 유도한 후, 광학 현미경으로 가시적으로 검출가능한 특징적인 색상의 광을 방출한다. EIA에서와 같이, 형광 표지된 항체는 1차 항체-분자 마커 복합체에 결합하게 된다. 결합되지 않은 시약을 세척해 낸 후, 남아있는 3원 복합체를 적절한 파장의 광에 노출시키고, 관찰된 형광은 관심있는 분자 마커의 존재를 나타낸다. 면역형광 및 EIA 기술 둘 다 당업계에 널리 확립되어 있다. 그러나, 다른 리포터 분자, 예를 들어 방사성 동위원소, 화학발광 또는 생체발광 분자를 사용할 수도 있다.
일부 실시양태에서, 조직 또는 세포 샘플로부터 선택된 바이오마커의 발현은 기능적 또는 활성-기반 검정에 의해 조사할 수 있다. 예를 들어, 바이오마커가 효소인 경우, 당업계에 공지된 검정을 수행함으로써 조직 또는 세포 샘플에서 주어진 효소 활성의 존재를 결정 또는 검출할 수 있다.
하나 이상의 바이오마커의 발현 수준을 평가하기 위한 임의의 상기 방법에서, 표적 분자를 포함하는 샘플은 당업계에 잘 공지된 방법에 의해 얻을 수 있고, 이는 관심있는 질환의 특정 유형 및 위치에 적합한 것이다. 조직 생검은 종종 질환 조직의 대표적인 조각을 수득하기 위해 사용된다. 다르게는, 세포는 관심있는 질환 세포를 함유하는 것으로 공지되거나 사료되는 조직/체액의 형태로 간접적으로 수득될 수 있다. 예를 들어, 질환 병변의 샘플은 절제, 기관지경술, 미세 바늘 흡인, 기관지 브러싱에 의해, 또는 객담, 흉수 또는 혈액으로부터 수득될 수 있다. 유전자 또는 유전자 생성물은 질환 조직으로부터 또는 다른 신체 샘플, 예를 들어 소변, 가래 또는 혈청으로부터 검출될 수 있다. 질환 샘플에서 표적 유전자 또는 유전자 생성물의 검출을 위한, 상기 논의된 바와 동일한 기술을 다른 신체 샘플에 적용할 수 있다. 이러한 신체 샘플을 스크리닝함으로써, 상기 질환에 대해 간단한 초기 진단이 달성될 수 있다. 또한, 요법의 진행은 이러한 신체 샘플을 표적 유전자 또는 유전자 생성물에 대해 시험함으로써 보다 쉽게 모니터링될 수 있다.
질환 세포에 대한 조직 제제를 농축하기 위한 수단은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 조직을 파라핀 또는 동결 절편으로부터 단리할 수 있다. 관심있는 세포는 또한 유동 세포측정법 또는 레이저 포획 미세절제에 의해 정상 세포로부터 분리될 수 있다. 정상 세포로부터 질환 세포를 분리하기 위한 이들 및 다른 기술은 당업계에 잘 공지되어 있다. 질환 조직이 정상 세포로 크게 오염된 경우, 시그너쳐 유전자 발현 프로파일의 검출이 보다 어려울 수 있지만, 오염 및/또는 위 양성/음성 결과를 최소화하기 위한 기술이 알려져 있고, 그 일부가 아래에서 설명된다. 예를 들어, 샘플은 또한 관심있는 질환 세포와 연관되지만 대응하는 정상 세포에는 연관되지 않은 것으로 공지된 바이오마커 (돌연변이 포함) 또는 그 반대의 경우의 바이오마커의 존재에 대해 평가될 수 있다.
조직 또는 세포 샘플이 항-CD40 항체를 사용한 치료에 대해 감수성일 것이라는 사실을 나타내는, 조직 또는 세포 샘플이 하나 이상의 바이오마커를 발현함을 결정한 후에, 포유동물을 괴롭히는 장애, 예를 들어 B-세포 림프종을 치료하기 위해 포유동물, 예를 들어 인간에게 유효량의 항-CD40 항체를 투여할 수 있음이 고려된다. 포유동물, 예를 들어 인간에서 본원에 기재된 다양한 병리학적 상태의 진단은 당업자에 의해 수행될 수 있다.
발현 수준을 비교하고, 항-CD40 항체 치료에 대한 B-세포 림프종의 반응성을 예측하거나, 평가하거나 또는 그의 평가를 도움
본원에 기재된 방법은 마커 유전자의 측정된 발현 수준 및 참조 수준을 비교하는 과정을 포함한다. 참조 수준은 상이한 샘플에서 마커 유전자와 상이한 참조 유전자의 측정된 발현 수준 또는 동일한 마커 유전자의 측정된 발현 수준이다.
일부 실시양태에서, 대상체로부터의 B-세포 림프종 샘플에서 마커 유전자의 측정된 발현 수준은 샘플에서 참조 유전자의 측정된 발현 수준에 대해 비교된다. 일부 실시양태에서, 참조 유전자의 발현 수준은 항-CD40 항체 감수성 세포 및 내성 세포를 포함한 다양한 유형의 B 림프종 세포들 사이에서 실질적으로 변화하지 않는다. 일부 실시양태에서, 마커 유전자의 측정된 발현 수준 대 참조물의 측정된 발현 수준의 비를 계산하고, 상기 비는 항-CD 항체 치료에 대한 B-세포 림프종의 반응성을 평가하거나 그의 평가를 돕기 위해 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 대상체로부터의 B-세포 림프종 샘플에서 마커 유전자의 측정된 발현 수준은 참조 샘플에서 마커 유전자의 측정된 발현 수준에 대해 비교된다. 일부 실시양태에서, 참조 샘플은 항-CD40 항체에 내성이거나 반응성이 아닌 B 림프종 세포를 포함한다. 예를 들어, 비교는 대상체로부터의 샘플과 참조 샘플에서 마커 유전자의 측정된 발현 수준 사이의 차이의 크기를 결정하기 위해 수행된다 (예를 들어, 대상체로부터의 샘플과 참조 샘플에서 마커 유전자의 발현 수준 사이의 차이의 배수 또는 백분율을 비교). 일부 실시양태에서, 항-CD40 항체에 내성이거나 반응성이 아닌 B 림프종 세포를 포함하는 참조 샘플에서 마커 유전자의 발현에 비해 대상체로부터의 샘플에서 마커 유전자의 발현 증가 또는 감소는 항-CD40 항체를 사용한 치료에 대한 B-세포 림프종의 반응성을 제시하거나 나타낸다. 일부 실시양태에서, 대상체로부터의 샘플의 발현 수준의 증가 배수는 참조 샘플의 발현 수준의 적어도 임의의 약 1.5X, 1.75X, 2X, 3X, 4X, 5X, 6X, 7X, 8X, 9X, 또는 10X 일 수 있다. 일부 실시양태에서, 대상체로부터의 샘플의 발현 수준의 감소 배수는 참조 샘플의 발현 수준의 임의의 약 0.01, 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8 미만일 수 있다.
일부 실시양태에서, IFITM1, CD40, RGS13, VNN2, LMO2, CD79B, CD22, BTG2, IGF1R, CD44, CTSC, EPDR1, UAP1 및 PUS7로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 마커 유전자의 발현 수준이 참조 수준에 대해 비교된다.
일부 실시양태에서, 참조 수준에 비해 하나 이상의 IFITM1, CD79B, IGF1R, CD44, CTSC, EPDR1 및 PUS7의 발현 수준의 증가는 상기 대상체가 효능제 항-CD40 항체 치료에 덜 반응할 수 있다는 것을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 참조 수준은 효능제 항-CD40 항체 치료 후에 종양 부피가 증가한 대상체로부터의 B 림프종 세포를 포함하는 샘플에서 대응하는 마커 유전자의 발현 수준을 기반으로 결정된 값 또는 범위이다.
일부 실시양태에서, 참조 수준에 비해 하나 이상의 CD40, RGS13, VNN2, LMO2, CD22, BTG2 및 UAP1의 발현 증가는 상기 대상체가 효능제 항-CD40 항체 치료에 반응할 수 있다는 것을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 참조 수준은 효능제 항-CD40 항체 치료 후에 종양 부피가 감소된 대상체로부터의 B 림프종 세포를 포함하는 샘플에서 대응하는 마커 유전자의 발현 수준을 기반으로 결정된 값 또는 범위이다.
일부 실시양태에서, BCL6의 발현 수준이 측정되고 참조 수준에 대해 비교된다. BCL6의 발현 수준은 항-CD40 항체 치료에 대한 대상체의 반응성을 예측하거나, 평가하거나 또는 그의 평가를 돕기 위해 사용된다. 실시예 1에 나타낸 바와 같이, BCL6 발현은 효능제 항-CD40 항체 치료 후에 종양이 증가한 대상체에서 낮아지는 경향이 있다. 일부 실시양태에서, 효능제 항-CD40 항체 치료 후에 종양 부피가 감소된 대상체로부터의 샘플에서 BCL6의 발현 수준에 의해 결정된 참조 수준에 비해 BCL6의 발현 증가는 대상체가 효능제 항-CD40 항체 치료에 반응할 것인지를 나타낼 수 있다.
일부 실시양태에서, 하나 이상의 IFITM1, CD40, RGS13, VNN2, LMO2, CD79B, CD22, BTG2, IGF1R, CD44, CTSC, EPDR1, UAP1, PUS7 및 BCL6의 발현 수준이 측정되고, 감수성 지수는 마커 유전자의 측정된 발현 수준을 기반으로 계산된다. 예를 들어, 감수성 지수 (SI)를 계산하기 위해 다음 식을 사용할 수 있다:
여기서, 표 4에 나타낸 양의 상관관계 값을 갖는 적어도 하나의 마커 유전자 및 음의 상관관계 값을 갖는 적어도 하나의 마커 유전자의 발현 수준이 측정되고; 상기 식에서 (i) βj는 측정된 각각의 마커 유전자에 대한 계수 값이고; (ii) p는 측정된 마커 유전자의 수이고; (iii) χi는 측정된 각각의 마커의 발현 수준에 대해 변환된, 표준화된, 대상체로부터의 샘플에 대한 발현 수준이고; (iv) μj 및 σj는 측정된 각각의 마커 유전자에 대한 평균 및 표준 편차이고; 여기서 βj, μj 및 σj는 임상 시험으로부터의 B 림프종 세포를 포함하는 환자 샘플로부터 결정된다. 일부 실시양태에서, 감수성 지수에 대해 0 이상의 값은 대상체가 항-CD40 항체 치료에 반응할 수 있다는 것을 나타내거나, 또는 감수성 지수에 대해 0 미만의 값은 대상체가 항-CD40 항체 치료에 덜 반응할 수 있다는 것을 나타낸다. 실시예 1은 참조 샘플 및 새로운 샘플에 대한 파라미터를 분석하고 결정하는 방법을 상세히 설명한다. 일부 실시양태에서, IFITM1, RGS13, CD79B, CD22, BTG2, CD44, EPDR1 및 UAP1의 발현 수준을 측정하고, 감수성 지수 계산을 위해 사용한다. 일부 실시양태에서, 동일한 수의 양의 상관관계의 마커 유전자 및 음의 상관관계의 마커 유전자를 측정하고, 감수성 지수 계산을 위해 사용한다.
감수성 지수의 결정 방법은 당업계에 공지되어 있다. 문헌 [Zhou H. and Hastie T. (2005) Regularization and variable selection via the elastic net; J. R. Statist. Soc. B. 67(2). pp. 301-320]; [Friedman J., Hastie T. and Tibshirani R. 2008. Regularization Paths for Generalized Linear Models via Coordinate Descent. Technical Report, Department of Statistics, Stanford University (World Wide Web-stat.stanford.edu/~hastie/Papers/glmnet.pdf) R package glmnet; R Development Core Team (2008). R: A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria. ISBN 3-900051-07-0, URL World Wide Web at R-project.org]를 참조한다.
항-CD40 항체 치료에 대해 반응성인 것으로 환자 샘플을 분류하기 위해 가중 K-최근접 이웃 (WKNN)을 사용하는 대안적 방법이 실시예 2에 기재된다. qRT-PCR을 사용하여 15개 유전자, UAP1, BTG2, CD40, VNN2, RGS13, CD22, LMO2, IFITM1, CTSC, CD44, PUS7, BCL6, EPDR1, IGF1R 및 CD79B의 발현을 측정한다. 적어도 10％의 종양 크기 감소가 항-CD40 항체 치료에 대해 반응성인 것으로 정의된다. 15개 유전자에 대한 가중치는 벌칙 회귀(penalized regression) (GLMNET)를 사용하여 결정한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 방법은 대상체로부터의 샘플 및 공지된 클래스를 갖는 참조 샘플에서 상기 UAP1, BTG2, CD40, VNN2, RGS13, CD22, LMO2, IFITM1, CTSC, CD44, PUS7, BCL6, EPDR1, IGF1R 및 CD79B의 하나 이상의 마커 유전자의 발현 수준을 기반으로 K-최근접 이웃 분석을 이용하여 대상체를 반응성 대상체 또는 비-반응성 대상체로 분류하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, K-최근접 이웃 분석을 이용하여 대상체를 분류하는 것은 (1) 파라미커 K (즉, 최근접 이웃의 수)를 결정하고; (2) 분류될 새로운 샘플에서 마커 유전자의 측정된 발현 수준과 각각의 참조 샘플에서 각각의 마커 유전자의 발현 수준 사이의 차이를 계산하고; (3) 새로운 샘플과 참조 샘플 사이의 절대차의 가중 평균 (WAAD)이 가장 작은 샘플을 선택함으로써 최근접 참조 샘플을 결정하고; (4) K 최근접 참조 샘플의 공지된 클래스를 기반으로 새로운 샘플의 클래스를 결정함으로써 수행된다. 가중치 및/또는 파라미터 K는 공지된 클래스를 갖는 임상 시험 샘플을 사용하는 교차-검증을 사용하여 결정한다. 예를 들어, 5배 (예컨대 5배, 6배, 7배, 8배, 9배 또는 10배) 내지 N배 교차-검증을 사용하여 가중 K-최근접 이웃 분류 오류를 최소화할 수 있고, 여기서 N은 샘플의 크기이다. 일부 실시양태에서, K는 4 내지 13 (예를 들어, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 및 13)의 정수이다. 일부 실시양태에서, 최근접 참조 샘플 (최근접 이웃)은 각각의 15개 마커 유전자 UAP1, BTG2, CD40, VNN2, RGS13, CD22, LMO2, IFITM1, CTSC, CD44, PUS7, BCL6, EPDR1, IGF1R 및 CD79B에 대한 분류될 새로운 샘플의 발현 수준과 각각의 참조 샘플의 발현 수준 사이의 절대차의 가중 평균 (WAAD)이 가장 작은 것이다. 일부 실시양태에서, WAAD에 대한 가중치는 15개 마커 유전자의 발현 수준에 대한 참조 샘플 종양 수축의 탄성망 벌칙 회귀로부터의 계수의 절대값이다. 일부 실시양태에서, 페널티의 규모는 WKNN 분류 오류를 최소화하기 위해 10배 교차-검증에 의해 선택된다. 15개 유전자에 대한 가중치는 벌칙 회귀 (GLMNET)를 사용하여 결정할 수 있다. 일부 실시양태에서, qRT-PCR을 사용하여 15개 유전자, UAP1, BTG2, CD40, VNN2, RGS13, CD22, LMO2, IFITM1, CTSC, CD44, PUS7, BCL6, EPDR1, IGF1R 및 CD79B의 발현 수준을 측정한다. 일부 실시양태에서, K 최근접 참조 샘플은 이들의 공지된 클래스 표지에 대한 투표의 방식으로 이들의 WAAD의 역수 (즉, 1/WAAD)를 부여하고, 최대 총 역 WAAD 기여도를 갖는 클래스 표지를 새로운 샘플에 배정한다. 일부 실시양태에서, 환자가 항-CD40 항체 치료 후에 적어도 10％ 종양 크기 감소를 나타낸다면 환자는 항-CD40 항체 치료에 대해 반응성인 것을 분류된다. 종양 크기 감소는 생성물 직경의 합 (SPD)에 의해 결정될 수 있다. 실시예 2는 참조 샘플로서 39명의 DLBCL 환자 샘플을 사용하는 가중 K-최근접 이웃 방법의 상세한 설명을 제공한다.
예측, 평가 또는 평가의 도움을 위한 비교 및/또는 계산은 해당 유전자 마커에 대해 측정된 값 및/또는 참조 값의 유형에 적절한 임의의 편리한 방식으로 수행할 수 있다. 비교 또는 계산 방법은 수동적일 수 있거다 또는 자동적 (예컨대, 컴퓨터-기재 기기를 비롯한 기기에 의함)일 수 있다. 일부 실시양태에서, 측정된 발현 수준은 표준화된 값이다. 예를 들어, 발현 수준은 실시예 1에 설명된 변환된, 표준화된 검정 값 아래의 식에 기초하여 표준화될 수 있다. 당업자에게 명백할 바와 같이, 복제 측정치는 마커 유전자 및/또는 참조 유전자의 발현 수준에 대해 고려될 수 있다. 일부 실시양태에서, 복제 측정치는 측정된 값에 대해 고려된다. 복제 측정치는 측정된 값들의 평균 또는 중간을 "측정된 값"으로 사용함으로써 고려될 수 있다. 당업계에 공지된 통계적 분석은 비교된 2개의 값들 사이의 차이의 유의성을 입증하기 위해 사용될 수 있다.
항-CD40 항체 치료
본 발명에서 확인되는 마커 유전자는 하나 이상의 항-CD40 항체를 사용한 치료에 대한 B-세포 림프종의 반응성을 예측하거나, 평가하거나 또는 그의 평가를 돕기 위해 사용될 수 있다. 항-CD40 항체는 하나 이상의 효능제 항체 (즉, CD40에 결합하여 자극하는)일 수 있다. 자극 항체는 상이한 유형, 예컨대 (1) CD40을 통해 자극 신호를 전달하지만, CD40과 CD40L 사이의 상호작용을 증가시키지 않거나 (예를 들어, 미국 특허 제5,182,368호; 및 PCT WO 96/18413에 기재된 항체 G28-5 및 G28-5로부터 유래된 항체), CD40과 CD40L 사이의 상호작용을 감소시키지 않는 것 (예를 들어, 항체 HuCD40-M2 및 HuCD40-M3 및 미국 특허 제5,674,492호에 기재된 인간화 항체); 및 (2) CD40을 통해 자극 신호를 전달하고 CD40과 CD40L 사이의 상호작용을 증가시킬 수 있는 것, 예를 들어 S2C6 (문헌 [Francisco et al., 2000, Cancer Res. 60:3225-31]) 및 S2C6으로부터 유래된 항체일 수 있다. 효능제 항체는 또한 미국 특허 제7,288,251호에 기재되어 있다. 항-CD40 항체는 하나 이상의 길항제 항체 (즉, CD40에 결합하고 CD40L에 의해 유도된 활성을 억제하는)일 수 있다. 길항제 항-CD40 항체의 예는 미국 특허 출원 공개 제2007/0110754호에 기재된 인간 항체 CHIR-12.12, 및 WO 97/31025에 기재된 항-CD40 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-CD40 항체는 서열 1의 중쇄 아미노산 서열 및 서열 2의 경쇄 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 방법은 대상체가 본원에 기재된 검정/방법에 기반한 치료를 위한 후보로서 확인된 후 유효량의 항-CD40 항체를 B-세포 림프종을 갖는 대상체에게 투여하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 하나 이상의 항-CD40 항체가 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 항-CD40 항체는 하나 이상의 다른 치료제와 함께 투여된다. 예를 들어, 항-CD40 항체는 하나 이상의 다음 치료제와 함께 투여된다: 리툭시맙, 겜자르 및 ICE. 예를 들어, 항-CD40 항체는 리툭시맙 요법; 리툭시맙 + 겜자르; 리툭시맙 + ICE (이포스파미드, 카르보플라틴, 에토포시드) (R-ICE); 또는 리툭시맙 + 화학요법과 함께 환자에게 투여될 수 있다.
여기서 사용된, "조합" 투여는 동시 투여 및/또는 상이한 시간에서의 투여를 포함한다. 조합 투여는 또한 공동-제형 (즉, 상이한 약물이 동일한 조성물 내에 존재함)으로서 투여 또는 별개의 조성물로서 투여, 상이한 투약 빈도 또는 간격으로 투여, 및 동일한 경로 또는 상이한 경로를 이용한 투여를 포함한다.
항-CD40 항체 또는 기능적 단편이 임의의 하나의 다음 약물을 사용한 치료에 비-반응성이거나 부적당한 반응을 하거나, 이들 약물을 사용한 치료 후에 재발한 NHL 환자의 치료를 위해 사용될 수 있다: 리툭시맙 (제넨테크); 오크렐리주맙 (제넨테크, 인크.); 이브리투모맙 티욱세탄 (제발린 (Zevalin)TM, 비오겐 아이덱 (Biogen Idec)); 토시투모맙 (벡사르 (Bexxar)TM, 글락소스미쓰클라인 (GlaxoSmithKline)); HuMAX-CD20TM (젠맙 (GenMab)); IMMU-106 (인간화 항-CD20 a.k.a. hA20 또는 90Y-hLL2임, 이뮤노메딕스(Immunomedics)); AME-133 (어플라이드 몰레큘라 에볼루션(Applied Molecular Evolution)/일라이 릴리(Eli Lilly)); 겐투주맙 오조가미신 (밀로타르그(Mylotarg)TM, 인간화 항-CD33 항체, 와이어쓰(Wyeth)/PDL); 알렘투주맙 (캄패스(Campath)TM, 항-CD52 항체, 쉐링 플로(Schering Plough)/젠자임(Genzyme)); 에프라투주맙 (IMMU-103TM, 인간화 항-CD22 항체, 이뮤노메딕스).
하기 참고문헌은 림프종 및 CLL, 이들의 진단, 치료, 및 치료 효능을 측정하기 위한 표준 의약 절차를 기재한다. 문헌 [Canellos GP, Lister, TA, Sklar JL: The Lymphomas. W.B.Saunders Company, Philadelphia, 1998]; [van Besien K and Cabanillas, F: Clinical Manifestations, Staging and Treatment of Non-Hodgkin's Lymphoma, Chap. 70, pp 1293-1338, in: Hematology, Basic Principles and Practice, 3rd ed. Hoffman et al. (editors). Churchill Livingstone, Philadelphia, 2000]; 및 [Rai, K and Patel, D:Chronic Lymphocytic Leukemia, Chap. 72, pp 1350-1362, in: Hematology, Basic Principles and Practice, 3rd ed. Hoffman et al. (editors). Churchill Livingstone, Philadelphia, 2000].
치료에 사용하기 위한 항-CD40 항체는 키메라, 인간화 및 인간 항체를 포함한다. 본원에서 설명되거나 당업계에 공지된 임의의 효능제 또는 길항제 항체가 치료에서 사용될 수 있다. 예를 들어, WO 2006/128103에 기재된 인간화 항-CD40 항체가 항-CD40 항체 치료를 위해 사용될 수 있고, 이들 항체 및 그의 아미노산 서열은 본원에 참고로 도입된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 치료에 사용하기 위한 항-CD40 항체는 B 림프종 세포 상에 발현된 CD40 (예를 들어, 인간 CD40)에 결합하고, B 림프종 세포의 아폽토시스를 유도한다. 항-CD40 항체는 또한 면역 이펙터 기능, 예를 들어 ADCC, CDC 및/또는 ADCP를 통해 생체 내에서 B 림프종 세포를 사멸시키는 특징을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 항-CD40 항체는 약 1x10-8 이하 또는 1x10-9 이하의 Kd 값으로 CD40에 결합한다. 일부 실시양태에서, 항-CD40 항체는 CD40에 결합하고 CD40을 자극한다 (즉, 효능제 항체). 일부 실시양태에서, 항-CD40 항체는 CD40에 대한 CD40 리간드의 결합을, 예를 들어 적어도 45％, 적어도 50％, 적어도 60％, 또는 적어도 75％ 증가시킨다. CD40에 대한 CD40 리간드의 결합의 증가를 결정하는 방법은 미국 특허 제6,838,261호 (그 개시내용은 본원에 참고로 도입된다)에 개시되어 있다. 일부 실시양태에서, 항-CD40은 WO 00/75348에 기재된 뮤린 모노클로날 항체 S2C6으로부터 유래된 인간화 항체이다 (WO 00/75348의 표 3 및 4에 제공된 항체 포함). 일부 실시양태에서, 항-CD40 항체, 예를 들어 항-CD40 Ab.1은 서열 1에 제시된 중쇄 아미노산 서열 및 서열 2에 제시된 경쇄 아미노산 서열을 포함한다.
D. 키트
상기 기재되거나 제안된 용도에서 사용하기 위해, 본 발명에 의해 키트 또는 제조품이 또한 제공된다. 이러한 키트는 본원에 기재된 마커 유전자의 발현 수준을 검출하기 위해 특이적인 적어도 하나의 시약을 포함할 수 있고 본원에 기재된 방법을 실시하기 위한 설명서를 추가로 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 그의 임의의 특이적 부분의 특이적 증폭을 허용하는 프라이머 및 프라이머 쌍, 및 본 발명의 핵산 분자 또는 그의 임의의 일부에 선택적으로 또는 특이적으로 혼성화하는 프로브를 포함하는 조성물 및 키트를 제공한다. 프로브는 검출가능한 마커, 예를 들어 방사성 동위원소, 형광 화합물, 생물발광 화합물, 화학발광 화합물, 금속 킬레이터 또는 효소로 표지될 수 있다. 이러한 프로브 및 프라이머는 샘플에서 폴리뉴클레오티드, 예컨대 유전자 UAP1, BTG2, CD40, VNN2, RGS13, CD22, LMO2, IFITM1, CTSC, CD44, PUS7, BCL6, EPDR1, IGF1R 및 CD79B에 상응하는 폴리뉴클레오티드의 존재를 검출하기 위해 사용될 수 있고, 유전자 UAP1, BTG2, CD40, VNN2, RGS13, CD22, LMO2, IFITM1, CTSC, CD44, PUS7, BCL6, EPDR1, IGF1R 및 CD79B에 상응하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 단백질을 발현하는 세포를 검출하기 위한 수단으로 사용될 수 있다. 당업자에게 이해되는 바와 같이, 매우 많은 상이한 프라이머 및 프로브가 본원에서 제공되는 서열을 기반으로 제조되고, mRNA를 증폭 및/또는 클로닝하고/하거나 그의 존재 및/또는 수준을 결정하기 위해 효과적으로 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 키트는 UAP1, BTG2, CD40, VNN2, RGS13, CD22, LMO2, IFITM1, CTSC, CD44, PUS7, BCL6, EPDR1, IGF1R 및 CD79B로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 5개, 적어도 10개, 또는 15개의 마커 유전자의 발현 수준을 검출하기 위한 시약을 포함한다. 키트는 또한 참조 값을 생성하는 것으로서 유용한 참조 샘플을 포함할 수 있다. 마커 유전자는 UAP1, BTG2, CD40, VNN2, RGS13, CD22, LMO2, IFITM1, CTSC, CD44, PUS7, BCL6, EPDR1, IGF1R 및 CD79B를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 마커 유전자의 mRNA 발현 수준을 검출하기 위한 시약은 하나의 마커 유전자의 mRNA 생성물을 증폭하기 위해 특이적인 적어도 한 쌍의 프라이머를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 프라이머의 쌍은 mRNA 서열의 3' 말단을 표적화할 수 있다 (예를 들어, 대체로 모든 전사체 변이체와 공통으로 공유되는 3' UTR에서 mRNA를 표적화함). 일부 실시양태에서, 키트는 증폭된 핵산의 검출을 위한 프로브를 포획하기 위한 표면 또는 기재 (예를 들어, 마이크로어레이)를 추가로 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 키트는 qRT-PCR을 이용하여 하나의 마커 유전자의 발현 수준을 검출하기 위해 특이적인 적어도 한 쌍의 프라이머 및 프로브를 포함한다. qRT-PCR에서 사용할 수 있는 프라이머 및 프로브의 세트의 예는 표 1에 나타낸다. IFITM1을 검출하기 위해, 서열 27, 28 및 29, 서열 60, 61 및 62, 및 서열 93, 94 및 95에 제시된 프라이머 및 프로브 세트를 사용할 수 있다. CD40을 검출하기 위해, 서열 24, 25 및 26, 서열 57, 58 및 59, 서열 90, 91 및 92에 제시된 프라이머 및 프로브 세트를 사용할 수 있다. RGS13을 검출하기 위해, 서열 114, 115 및 116, 및 서열 126, 127 및 128에 제시된 프라이머 및 프로브 세트를 사용할 수 있다. VNN2를 검출하기 위해, 서열 30, 31 및 32, 서열 63, 64 및 65, 및 서열 96, 97 및 98에 제시된 프라이머 및 프로브 세트를 사용할 수 있다. LMO2를 검출하기 위해, 서열 12, 13 및 14, 서열 45, 46 및 47, 및 서열 78, 79 및 80에 제시된 프라이머 및 프로브 세트를 사용할 수 있다. CD79B를 검출하기 위해, 서열 141, 142 및 143, 서열 150, 151 및 152, 및 서열 159, 160 및 161에 제시된 프라이머 및 프로브 세트를 사용할 수 있다. CD22를 검출하기 위해, 서열 15, 16 및 17, 서열 48, 49 및 50, 및 서열 81, 82 및 83에 제시된 프라이머 및 프로브 세트를 사용할 수 있다. BTG2를 검출하기 위해, 서열 9, 10 및 11, 서열 42, 43 및 44, 및 서열 75, 76 및 77에 제시된 프라이머 및 프로브 세트를 사용할 수 있다. IGF1R을 검출하기 위해, 서열 6, 7 및 8, 서열 39, 40 및 41, 및 서열 72, 73 및 74에 제시된 프라이머 및 프로브 세트를 사용할 수 있다. CD44를 검출하기 위해, 서열 174, 175 및 176, 서열 180, 181 및 182, 및 서열 186, 187 및 188에 제시된 프라이머 및 프로브 세트를 사용할 수 있다. CTSC를 검출하기 위해, 서열 165, 166 및 167, 서열 168, 169 및 170, 및 서열 171, 172 및 173에 제시된 프라이머 및 프로브 세트를 사용할 수 있다. EPDR1을 검출하기 위해, 서열 21, 22 및 23, 서열 54, 55 및 56, 서열 87, 88 및 89, 서열 129, 130 및 131, 서열 132, 133 및 134, 서열 135, 136 및 137에 제시된 프라이머 및 프로브 세트를 사용할 수 있다. UAP1을 검출하기 위해, 서열 138, 139 및 140, 서열 147, 148 및 149, 및 서열 156, 157 및 158에 제시된 프라이머 및 프로브 세트를 사용할 수 있다. PUS7을 검출하기 위해, 서열 177, 178 및 179, 서열 183, 184 및 185, 및 서열 189, 190 및 191에 제시된 프라이머 및 프로브 세트를 사용할 수 있다. BCL6을 검출하기 위해, 서열 102, 103 및 104, 및 서열 108, 109 및 110에 제시된 프라이머 및 프로브 세트를 사용할 수 있다.
마커 유전자의 단백질 발현 수준을 검출하기 위한 시약은 마커 유전자에 의해 코딩되는 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함할 수 있다.
키트는 하나 이상의 용기 수단, 예를 들어 바이알, 튜브 등을 근접하여 수용하기 위해 구획되어 있는 운반 수단을 추가로 포함할 수 있고, 상기 각각의 용기 수단은 방법에서 사용될 별개의 요소들 중 하나를 포함한다. 예를 들어, 용기 수단 중 하나는 검출가능하게 표지된 것이거나 검출가능하게 표지될 수 있는 프로브를 포함할 수 있다. 이러한 프로브는 마커 유전자에 특이적인 항체 또는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 키트가 표적 핵산을 검출하기 위해 핵산 혼성화를 이용하는 경우에, 키트는 또한 표적 핵산 서열의 증폭을 위한 뉴클레오티드(들)을 함유하는 용기, 및/또는 리포터 분자, 예를 들어 효소, 형광, 또는 방사성 동위원소 표지에 결합된 리포터-수단, 예를 들어 비오틴-결합 단백질, 예를 들어 아비딘 또는 스트렙타비딘을 포함하는 용기를 가질 수 있다.
본 발명의 키트는 일반적으로 상기 기재된 용기, 및 상업적 및 사용자 관점에서 바람직한 물질, 예를 들어 버퍼, 희석제, 필터, 바늘, 시린지, 및 사용 설명서를 갖는 포장 삽입물을 포함하는 하나 이상의 다른 용기를 포함할 것이다. 조성물이 특정 요법을 위해 또는 비-치료 용도로 사용되는지 나타내도록 라벨이 용기 상에 존재할 수 있고, 또한 상기 기재된 것과 같은 생체내 또는 시험관내 사용을 위한 지시를 나타낼 것이다.
키트는 조직 또는 세포 샘플을 제조하고 샘플로부터 핵산 (예를 들어, mRNA)을 제조하기 위한 설명서 및 물질의 세트를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명은 본 발명의 방법을 수행하는데 사용하기 적합한 다양한 조성물을 제공하고, 이는 키트 내에 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명은 이러한 방법에서 사용될 수 있는 표면, 예를 들어 어레이를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 어레이는 본 발명의 돌연변이를 검출하기 위해 유용한 개별적인 핵산 분자 또는 핵산 분자의 집합체를 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 어레이는 표적 핵산을 포함하는 샘플에 혼성화가능한, 일련의 별개로 배치된 개별적인 핵산 올리고뉴클레오티드 또는 핵산 올리고뉴클레오티드의 세트를 포함할 수 있고, 상기 혼성화는 본 발명의 돌연변이의 존재 또는 부재를 나타낸다.
핵산을 고체 기재, 예를 들어 유리 슬라이드에 부착시키기 위한 몇몇 기술이 당업계에 잘 공지되어 있다. 하나의 방법은 고체 기재에 부착될 수 있는 잔기, 예를 들어 아민 기, 아민 기의 유도체 또는 양전하를 갖는 다른 기를 함유하는 변형된 염기 또는 유사체를 합성되는 핵산 분자 내로 통합시키는 것이다. 이어서, 합성된 생성물을, 증폭 생성물 상의 반응기와 공유 연결을 형성하여 유리 슬라이드에 공유 부착되는 알데히드 또는 다른 반응기로 코팅된 고체 기재, 예를 들어 유리 슬라이드와 접촉시킨다. 인터넷 웹 사이트 cmt.corning.com 및 cmgm.stanford.edu/pbrown1에 개시되어 있는 바와 같이, 아미노 프로파일 실리칸 표면 화학을 사용하는 것과 같은 다른 방법도 당업계에 공지되어 있다.
또한, 추후에 반응기로 전환될 수 있는 기의 올리고뉴클레오티드에 대한 부착도 당업계에 공지된 방법을 사용하여 실시할 수 있다. 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드에 대한 임의의 부착물은 올리고뉴클레오티드의 일부가 될 것이고, 이어서 마이크로어레이의 고체 표면에 부착될 수 있다. 증폭된 핵산은 사용된 기술에 필요하거나 및/또는 허용되는 바와 같이, 예를 들어 단편으로의 절단을 통해 또는 고체 기재에 대한 부착 전 또는 후에 검출가능한 표지의 부착에 의해 추가로 변형될 수 있다.
다음은 본 발명의 방법 및 조성물의 예이다. 상기 나타낸 일반적인 설명을 기초로 하여 다양한 다른 실시양태를 실시할 수 있음이 이해된다.
실시예
실시예 1. 임상 시험에서 항-CD40 Ab.1을 사용한 치료에 대한 반응성과 연관된 마커의 확인
임상 시험 001 (II상)
재발성 DLBCL의 환자에서 항-CD40 Ab.1의 총 반응 속도 및 독성학 프로파일을 결정하기 위한 다기관 II상 공개 (open-label) 연구. 종양 샘플은 병리학 확인 및 CD40 발현에 대해 중앙 실험실에서 평가하였다. 적격인 환자는 진단 시에 새로운 또는 변환된 DLBCL이 있고, 무통성 림프종의 기왕력이 존재하면 배제되었다. 요구되는 선행 요법은 리툭시맙, 및 적격일 경우, 자가 줄기 세포 이식과의 조합 화학요법으로 이루어졌다. 환자에게 항-CD40 Ab.1을 환자 내부 용량 로딩 (1 mg/kg 제1일; 2 mg/kg 제4일; 4 mg/kg 제8일) 및 그 후 8 mg/kg/wk으로 5주 (사이클 1)에 걸쳐 6회 IV 주입하였다. 반응하는 환자 및 SD (안정한 질환)이 있는 환자가 질환 진행까지 또는 최대 12 사이클까지 계속되는 요법에 적격이었다. 종양 조직은 항-CD40 Ab.1을 사용한 치료를 받기 전의 환자로부터 취하였다. 예를 들어, 샘플은 일상적인 림프종 진단의 일부로서 취하였다.
항-CD40 Ab.1은 CD40에 대한 인간화 IgG1 모노클로날 항체이다. 이는 유전공학에 의해 처리된 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포주에서 생산되고 분비된다. 항-CD40 Ab.1은 하기 아미노산 서열을 갖는다:
중쇄 (서열 1). 이탤릭체의 밑줄친 ASN 294 잔기는 탄수화물 잔기의 위치를 나타낸다.
임상 시험 002 (I상)
재발성 NHL의 환자에서 정맥내 항-CD40 Ab.1의 안전성, 약동학적 특성, 면역원성 및 항종양 활성을 시험하기 위해 다기관 다-용량 I상 연구를 수행하였다. 미만성 거대 B-세포 (DLBCL; 14), 여포성 (FCL; 9), 외투 세포 (MCL; 9), 변연부 (MZL; 2) 및 소림프구성 (SLL; 1)을 비롯한 다수의 조직학적 하위형의 NHL이 있는 환자를 본 연구에 참여시켰다. 환자를 용량-로딩 스케쥴로 처리하였다: 제1일 및 제4일에 1 mg/kg의 항-CD40 Ab.1, 및 4개의 코호트 (cohort)에 걸쳐 3, 4, 6 또는 8 mg/kg의 최대 용량으로 2-5주 동안 후속적인 환자 내부 용량-증가. 후속적으로, 신속한 용량-로딩 스케쥴을 하나의 코호트에서 시험하였다 (사이클 1 동안 투여된 총 항-CD40 Ab.1의 40％ 증가). 반응하는 환자 또는 안정한 질환이 있는 환자가 제2 사이클에 대해 적격이었고, 제2 사이클은 코호트-특이적 최대 용량의 항-CD40 Ab.1에서 4회의 연속적인 매주 주입으로 이루어진다. 8명의 DLBCL 환자는 사이클 1을 완료하였고, 37.5％의 객관적인 반응 속도 (즉, 1 CR 및 2 PR) 및 2 SD를 갖는 적어도 3 mg/kg 항-CD40 Ab.1의 최대 용량을 투여받았다. 추가의 객관적인 반응이 1명의 MCL 환자 (CR) 및 1명의 MZL 환자 (PR)에서 보였다. 이들 5명의 환자에 대한 중간 반응 지속시간은 아직 도달되지 않았다 (범위 8-37주). 종양 조직은 항-Cd40 Ab.1을 사용한 치료를 받기 전의 환자로부터 취하였다. 예를 들어, 샘플은 일상적인 림프종 진단의 일부로서 취하였다.
임상 샘플 제조 및 qRT-PCR
상기 기재된 I상 및 II상 임상 시험으로부터의 포르말린 고정된 파라핀 포매된 (FFPE) 기록 종양 조직을 임상 조사 현장으로부터 적절한 IRB 승인 및 환자 동의 하에 얻었다. 종양 조직으로부터 유래된 4-6 마이크로미터 절편을 유리 슬라이드 상에 마운팅하고, 각각의 경우에 대해 하나의 슬라이드를 표준 병리학 실험 프로토콜을 이용하여 H＆E 염색하였다. 자격 인증 (board certified) 병리학자가 H＆E 슬라이드를 종양 함량에 대해 표시하고, FFPE 조직에 대한 앰비온 리커버올(RecoverAll)TM 총 핵산 단리 키트 (Cat. No. AM1975; 어플라이드 바이오시스템즈/앰비온, 미국 텍사스주 오스틴)를 사용하는 RNA 추출을 위해 남아있는 종양-함유 영역을 육안절제하기 위한 가이드로서 사용하였다.
샘플당 450 ng의 총 RNA를 20 ㎕의 총 반응 부피에서 어플라이드 바이오시스템즈의 고용량 역전사 cDNA 합성 키트 (Cat. No. 4368814; 어플라이드 바이오시스템즈, 미국 캘리포니아주 포스터 시티)를 사용하여 역전사시켰다. 37도에서 단축된 60분 RT 반응을 수행하는 것을 제외하고 제조자의 권장사항에 따랐다. 5 ng의 총 RNA 동등 cDNA (100％ cDNA 합성 효율을 가정) 생성물을 어플라이드 바이오시스템즈의 2X 보편적 마스터 믹스 (UNG 없음)와 각각의 PCR 검정 웰에 대해 15 ㎕의 부피로 혼합하였다. 모든 증폭은 2-단계 (95도 15초, 60도 1분) PCR 증폭 절차를 이용하여 384-웰 플레이트에서 삼중으로 수행하였다. 반응을 검증된 ABI 7900 실시간 PCR 시스템에서 40 사이클로 수행하였다. 사용되는 프라이머 및 프로브의 서열은 표 1에 나타낸다.
데이터 처리
결과로서 미가공 qRT-PCR을 표준화, 변환 및 귀속 (imputation) 하의 설명에 따라 예비-처리하고, 감수성 지수는 감수성 지수 및 분류자 하에 설명된 바와 같이 연산하였다. 스피어만 순위 상관관계를 상관관계 추정치 및 상응하는 P-값을 위해 사용하였다. 다변량 감수성 지수를 위해, 프로브를 선택하고, 계수를 문헌 [Zhou et al., Statist. Soc. B. 67:301-320, 2005]에 설명되고 문헌 [Friedman, Hastie and Tibshirani, Regularization Paths for Generalized Linear Models via Coordinate Descent. Technical Report, Dept. of Statistics, Stanford University at www-stat.stanford.edu/~hastie/Papers/glmnet.pdf]에서 시행된 바와 같이 래소 (lasso) (L1) 및 능형 (ridge) (L2) 벌칙 회귀의 탄성망 블렌드 (elastic net blend)를 사용하여 추정하였다. X2 시험은 카테고리의 가변치 사이의 연관성에 대해 시험하기 위해 사용하였다.
표준화, 변환 및 귀속
다음은 검정 데이터 및 모델 파라미터에 대한 정의이다:
정의
검정 데이터
모델 파라미터
샘플의 참조 세트, 예를 들어 지수 계수 및 분류자 컷오프를 피팅하기 위해 사용되는 것에 대해, 평균 및 표준 편차 모델 파라미터는 참조 세트 데이터를 사용하여 연산된다 (아래 참조 세트 모델 파라미터에 대한 식을 참조한다). 새로운 샘플, 예를 들어 그에 대한 지수 및 클래스가 연산되어야 하는 단일의 새로운 샘플에 대해, 모델 파라미터는 참조 세트 
로부터 취해져야 하고, 상기 세트는 새로운 샘플이 추출되는 집단의 가장 대표적인 것이 되도록 선택된다. 예를 들어, 검정이 사용되는 요법의 선 및 각각의 지시에 대한 임상 참조 세트는 유지될 수 있다. 참조 세트 모델 파라미터를 계산하기 위한 식 및 변환된, 표준화된 검정 값을 아래에 나타낸다.
식
참조 세트 모델 파라미터
변환된, 표준화된 검정 값
값의 완성된 
x 
행렬 
을 감수성 지수 및 분류기 계산에 입력한다.
감수성 지수 및 분류기
다음은 검정 데이터 및 모델 파라미터에 대한 정의이다:
정의
검정 데이터
모델 파라미터
참조 세트 모델 파라미터 및 감수성 지수 및 분류기를 계산하기 위한 식은 아래 나타낸다.
식
참조 세트 모델 파라미터
지수 및 분류기
임상 시험 001 결과
아래 표 2는 임상 시험 001로부터의 검정된 시료 및 임상 샘플의 샘플 회계를 제공한다. 24명의 DLBCL 환자로부터의 29개의 기록 FFPE 종양 시료를 qRT-PCR 처리를 위해 제출하였다. 3명의 환자가 다수의 시료를 가졌고, 24명의 환자 모두는 적어도 하나의 시료에 대해 이용가능한 qRT-PCR 결과를 가졌다. 이들 24명 중에서, 21명은 기준선 및 적어도 하나의 기준선-후 방문 모두에서 보고된 종양 직경의 곱의 합 (SPD) 측정치를 가졌다.
표 3은 감수성 지수에 기여하는 주요 유전자 및 쌍 유전자 사이의 쌍별 (pairwise) 스피어만 순위 상관관계를 요약한다. 세포주 발달 샘플을 기반으로, 특정 군의 환자에서 발현이 낮은 유전자는 평균하여 대응하는 쌍의 비교적 높은 발현을 갖는 것으로 예상될 것이고, 이는 자가-표준화, 및 상향- 대 하향-조절된 발현 경로의 비로서 (즉, 밑이 2인 로그 규모로) 감수성 지수의 해석을 제공한다. 상기 제1 임상 샘플에서 쌍들 사이의 상관관계의 크기는 통계상 유의하고 현저하게 고효율이고, 여기서 하부 상관관계 추정치는 -0.67 (P=0.0004)이다. 이들 테스트는 단독으로 검정 표적 서열이 시험관 내에서 상기 임상 집단으로부터의 종양 샘플 내에서 발현되고, 검정은 기록된 FFPE 조직 샘플 내에서 발현을 검출한다는 독립적인 확인을 구성한다.
표 4는 개별적으로 각각의 프로브에 대한 측정치와 기준선-후 종양 SPD에서 최대 감소 (또는 최소 증가) 사이의 연관성을 요약한다. 순위 상관관계는 기준선-후 측정치 대 기준선 측정치 사이의 차이 (또는 비)에 기반하므로, 양의 상관관계는 프로브의 보다 높은 발현이 평균하여 종양 증가와 연관됨을 의미하고; 음의 상관관계는 프로브의 보다 높은 발현이 평균하여 종양 감소와 연관됨을 의미한다. 특히, 모든 주요-쌍 프로브 쌍은 SPD와 반대-방향 연관을 갖는다. P-값은 상기 샘플에서 유망한 경향과 일치한다. 모든 P-값은 .5 미만이다 (진정한 연관성이 없을 때 예상된 50％). 모든 범위는 DLBCL 환자 샘플 (N=21)로부터의 교체로 샘플링된 5,000개의 복제값을 기반으로 부트스트랩 (bootstrap) 제95 백분위 신뢰 구간으로서 계산된다. 샘플 크기가 증가함에 따라 더 좁은 범위가 이용가능해질 것이다. 이들 결과를 생성하기 위해 모델-구축 또는 검토가 요구되지 않으므로, 이들은 이들 qRT-PCR 프로브 측정치가 전체적으로 항-CD40 Ab.1로 치료한 환자에서 종양 SPD의 감소와 연관됨을 확인하는 강력한 경향을 갖는다.
다변량 감수성 지수는 표 3 및 4의 프로브의 가중 평균이다. 세포주 내의 가중치가 환자 종양 시료 내의 최적 가중치를 반영하는 것으로 예상되지 않으므로, 세포주 내의 가중치는 부호, 동일-가중 평균에 상응하는 1 및 -1로 제한되고, 여기서 부호는 각각의 프로브 및 세포주에서 IC25에 의한 항-CD40 Ab.1에 대한 내성 사이의 연관성을 매칭시키켰다. 임상 집단에 대해, 새로운 가중치가 요구된다. 21개의 샘플에만 기초한 예비 분석으로서, 14개의 프로브 중 최상의 8개에 대한 가중치를 선택하고 추정하기 위해 벌칙 다변량 회귀 절차를 사용하도록 결정한다. 이들 가중치 (계수)를 표 5에 나타내고, 생성되는 감수성 지수 및 기준선으로부터 SPD 변화 사이의 연관성을 도 2에 도시한다. 보다 큰 다변량 감수성 지수 값은 기준선-후 SPD 감소와 연관된다 (스피어만 Rho = -0.58, P=0.006). 표 4, 5, 및 6 내의 모든 범위는 DLBCL 환자 샘플 (N=21)로부터의 교체로 샘플링된 5,000개의 복제값을 기반으로 부트스트랩 제95 백분위 신뢰 구간으로서 계산되었다. 샘플 크기가 증가함에 따라 더 좁은 범위가 이용가능해질 것이다.
임상 시험 001로부터 26개의 샘플을 사용하여, 수득한 μj 및 σj 값에 대한 범위는 표 6에 나타낸 바와 같다.
임상 시험 002 결과
미가공 qRT-PCR 결과는 기록 시료를 사용하여 10명의 환자에 대해 성공적으로 생성되었다. 이들 10명의 환자에 대해, 진단, 처리군, 다변량 감수성 지수, 임상 반응 및 기준선으로부터 SPD 변화를 표 7에 나타낸다. 다변량 감수성 지수 가중치는 21명의 임상 시험 001 환자로부터 취하였고 (표 5), 따라서 이들 환자는 매우 작은 검증 세트를 구성한다. 감수성 지수 ≥ 0인 4명의 환자 중 2명이 항-CD40 Ab.1 노출 후 일부 종양 수축을 보였고, 감수성 지수 < 0인 6명의 환자 중 4명이 종양 증가 또는 PD의 최상의 반응을 보였다 (SPD는 2명의 환자에 대해 이용가능하지 않았지만, 상기 환자에 대해 최상의 임상 반응 결과가 이용가능하였다).
BCL6. qRT-PCR 검정은 BCL6 유전자에 대한 15번째 프로브를 함유한다. 다변량 감수성 지수에서 현재 사용되지 않지만, 항-CD40 Ab.1에 대한 반응의 잠재적인 예측자가 이전에 확인되었다. 도 3에 나타낸 바와 같이, 조합된 DLBCL 환자 샘플에서 SPD 변화와 유의하게 연관되지 않지만 (P=0.25, N=26), BCL6은 종양 증가가 있는 대상체에서 낮아지는 경향이 있다 (rho=-0.23).
실시예 2. 항-CD40 Ab.1로의 치료에 대한 DLBCL 환자의 반응성을 결정하기 위한 15개 유전자 마커의 사용
실시예 1에 기재된 I상 (11개 샘플) 및 II상 (28개 샘플) 임상 시험으로부터의 DLBCL 환자 샘플을 사용하여, 벌칙 회귀 (GLMNET)를 사용하여 결정되는 15개 마커 (UAP1, BTG2, CD40, VNN2, RGS13, CD22, LMO2, IFITM1, CTSC, CD44, PUS7, BCL6, EPDR1, IGF1R 및 CD79B)에 대해 가중된 가중 K-최근접 이웃 (KNN)을 사용하여 적어도 10％의 종양 크기 감소 (본원에서 항-CD Ab.1 감수성으로 정의됨)에 대한 qRT-PCT 기반의 분류기를 개발하였다. 모델 파라미터는 교차-검증에 의해 결정하고, 확실한 p-값은 순열 시험을 통해 계산하였다.
가중 K-최근접 이웃 (WKNN)을 사용하여, K 최근접 참조 샘플의 공지된 클래스를 사용하는 새로운 샘플에 대한 클래스를 배정하였으며, 여기서 K는 4 내지 13의 정수이다. 최근접 참조 샘플 (최근접 이웃)은 UAP1, BTG2, CD40, VNN2, RGS13, CD22, LMO2, IFITM1, CTSC, CD44, PUS7, BCL6, EPDR1, IGF1R 및 CD79B에 대한 각각의 15개 프로브 측정치 사이의 절대차의 가중 평균 (WAAD)이 가장 작은 것이고, 여기서 차이는 분류될 새로운 샘플의 프로브 측정치와 각각의 참조 샘플로부터의 상기 값 사이의 것이다. WAAD에 대한 가중치는 15개 프로브 측정치에 대한 참조 샘플 종양 수축의 탄성망 벌칙 회귀로부터의 계수의 절대값이다. 페널티 규모는 WKNN 분류 오류를 최소화하기 위해 10배 교차-검증에 의해 선택된다. 최적의 K는 트레이닝 데이터세트에 대한 10배 교차 검증에서 5로 결정하였다. 일부 프로브 측정치에 대한 가중치는 모든 프로브 측정치가 반드시 분류에 기여하지는 않도록 0일 수 있으며, 상대적 기여도는 참조 샘플 프로브 측정치 및 이들의 공지된 클래스에 의존한다는 것에 유의한다. 새로운 샘플의 예측되는 클래스를 결정하기 위해, K 최근접 참조 샘플은 이들의 공지된 클래스 표지에 대한 투표의 방식으로 이들의 WAAD의 역수 (즉, 1/WAAD)를 부여한다. 최대 총 역 WAAD 기여도를 갖는 클래스 표지를 새로운 샘플에 배정한다. 0 내지 1인 이전의 클래스의 가중치 (모든 클래스에 대한 가중치의 합은 1임)를 표준화된 역 WAAD 기여도의 승수로 사용하여 각각의 클래스로 분류된 새로운 샘플의 비율을 증가시키거나 감소시킬 수 있다. 유사한 결과를 비가중 KNN을 사용하여 수득하였다.
qRT-PCT는 환자 샘플에 대해 실시예 1에 기재된 프라이머 및 프로브를 사용하여 모든 15개 유전자에 대해 수행하였다. 39명의 DLBCL 환자의 특정 샘플에 대해, 중량을 각각의 15개 마커 유전자에 대해 결정하였다 (표 8).
상기 기재된 방법을 기반으로, 39명 환자로부터의 샘플을 Dx 음성 (항-CD40 Ab.1 치료에 대해 비-반응성) 또는 Dx 양성 (항-CD40 Ab.1 치료에 대한 반응에서 적어도 10％ 종양 감소)으로 결정하였다. 도 4에 나타낸 데이터는 항-CD40 Ab.1 치료에 대한 반응성의 예측에 대한 전체적인 정확도가 79.5％ (P=0.004)라는 것을 나타낸다. 24명의 시그니쳐 음성 환자 중 21명 (88％)은 항-CD40 Ab.1 치료에 대한 반응에서 측정가능하지 않은 종양 수축을 나타내었다. 15명의 시그니쳐 양성 환자 중 10명 (67％)은 항-CD40 Ab.1 치료에 대한 반응에서 유의한 종양 수축을 나타내었다. 또한, 도 5에 나타낸 바와 같이, Dx 양성 환자는 무진행 생존이 증가하였다. 이는 관찰된 종양 수축과 일치한다. 시그니쳐 양성 환자 (반응하는 것으로 예측됨)의 무진행 생존 (PFS)은 시그니쳐 음성 환자에 비해 유의하게 연장되었다 (각각 169일 대 40일의 중간 PFS를 가짐, (p=0.001)). 이들 데이터는 15-유전자 qRT-PCR DLBCL 종양 시그니쳐가 항-CD40 Ab.1로의 CD40 경로 자극에 따른 결과를 예측하는데 효과적이라는 것을 나타낸다.
전술된 발명이 이해를 명확하게 하고자 하는 목적으로 설명 및 실시예로서 약간 상세하게 기재되었지만, 상기 기재 및 실시예가 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
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<223> Synthetic construct
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Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Val Ile Pro Asn Ala Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Asn Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Ile Tyr Trp Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser
115 120 125
Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys
130 135 140
Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu
145 150 155 160
Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr
180 185 190
Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val
195 200 205
Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro
210 215 220
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
225 230 235 240
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
245 250 255
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe
260 265 270
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
275 280 285
Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
290 295 300
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
305 310 315 320
Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
325 330 335
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
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Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
355 360 365
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
370 375 380
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
385 390 395 400
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
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Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
420 425 430
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
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Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
65 70 75 80
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<223> Synthetic construct
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<210> 46
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 46
ggttaaaagt tgtggtttcc attctc 26
<210> 47
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 47
tggagacgca tttcg 15
<210> 48
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 48
gacatcccca ctcacgaata ttatg 25
<210> 49
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 49
ctgtcctttt ctgggctttc c 21
<210> 50
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 50
ccagtttctg cctctga 17
<210> 51
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 51
ggcatagagc agcactaaat gaca 24
<210> 52
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 52
ttctataacg cttcacattc cagatc 26
<210> 53
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 53
cactaaagaa acgatcagac 20
<210> 54
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 54
cgcactttgg ccttcctaga 20
<210> 55
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 55
tggaaggaga tgcagaagtc aga 23
<210> 56
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 56
cactgcttca taacctc 17
<210> 57
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 57
cctgcccagt cggcttct 18
<210> 58
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 58
gtccaagggt gacatttttc g 21
<210> 59
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 59
ctccaatgtg tcatctg 17
<210> 60
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 60
gggttactag tagccgccca ta 22
<210> 61
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 61
gcagggccag cattgc 16
<210> 62
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 62
caacctttgc actccac 17
<210> 63
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 63
tgtccatttt tttggctact ctga 24
<210> 64
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 64
cccaaacacc caggctctt 19
<210> 65
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 65
cagtgtggaa caatg 15
<210> 66
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 66
gctccagtgc cccaagatt 19
<210> 67
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 67
cgacggatcg cctctgaa 18
<210> 68
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 68
aaactgtgga tatcagcatg a 21
<210> 69
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 69
tgggcaactc agaaatactt cga 23
<210> 70
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 70
acgtcaatag gcacgtttgc t 21
<210> 71
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 71
ctcccaagat ataagaggc 19
<210> 72
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 72
gtccaccctc tcccctttct 20
<210> 73
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 73
cacgcactct agtacaaagc ataaga 26
<210> 74
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 74
ctcactccaa gaaac 15
<210> 75
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 75
cccaaaccga atcaccttaa ga 22
<210> 76
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 76
caggagggtg gccatcct 18
<210> 77
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 77
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<210> 78
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 78
tctccatggc atcttcgtct t 21
<210> 79
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 79
atcccttacc ccaccctcaa 20
<210> 80
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 80
actcttaggc actttgg 17
<210> 81
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 81
cggcctcagg cacaagaa 18
<210> 82
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 82
gcagcccatc cagtgtcaat 20
<210> 83
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 83
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<210> 84
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 84
catggtacat gagtggctat catactg 27
<210> 85
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 85
gtgagcacct tccttctttt tga 23
<210> 86
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 86
ctattatatg ggtttcagac aaa 23
<210> 87
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 87
gactattgtc tcctaaaccc aggacta 27
<210> 88
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 88
cccagtgcat ttaatgacca aa 22
<210> 89
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 89
agttccctcg tactgtc 17
<210> 90
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 90
atcaattttc ccgacgatct tc 22
<210> 91
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 91
cggttggcat ccatgtaaag t 21
<210> 92
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 92
tggctccaac actg 14
<210> 93
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 93
aggtccaccg tgatcaacat c 21
<210> 94
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 94
cagggaccag acgacatggt 20
<210> 95
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 95
acagcgagac ctccgt 16
<210> 96
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 96
caacttgtgg acggccagta 20
<210> 97
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 97
gtgccactga gggagaacat tt 22
<210> 98
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 98
aaactgcttc tacaagatt 19
<210> 99
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 99
cagcagagac cctgaaggaa a 21
<210> 100
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 100
caagccatga gttgccatca 20
<210> 101
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 101
aggtgcatat aagatctt 18
<210> 102
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 102
cccattctgc gtcatgctt 19
<210> 103
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 103
aatgcagttt agacacagcc aaac 24
<210> 104
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 104
tgttataact actccggaga cag 23
<210> 105
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 105
agttcagccc agatggaagg t 21
<210> 106
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 106
gcggcatcgc taaataagga 20
<210> 107
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 107
ttcagggaaa ggtgggc 17
<210> 108
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 108
cacagggact tgaagttgtt actaactaa 29
<210> 109
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 109
tgacgcagaa tgggatgaga 20
<210> 110
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 110
ctctctttgg gaatgtt 17
<210> 111
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 111
caaagcagcc agacgttgaa c 21
<210> 112
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 112
cacaccagat ccggaagaca 20
<210> 113
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 113
tttccctggg cgcagg 16
<210> 114
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 114
gggattccta ccccagattt cta 23
<210> 115
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 115
cagaaactgt tgttggactg catag 25
<210> 116
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 116
agtcagaaat gtaccaaaaa 20
<210> 117
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 117
tgagctgtag ctgcgtaagt acct 24
<210> 118
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 118
ggccttgtgc ctttcagaag 20
<210> 119
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 119
cttgatgcct gtcggc 16
<210> 120
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 120
tggctgccct acacatgct 19
<210> 121
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 121
caggatcccc tctaccactt tg 22
<210> 122
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 122
cctgctctat ctgcattt 18
<210> 123
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 123
gaggctcagc tgtgattgac at 22
<210> 124
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 124
cacccatatc ctcgaagcta gag 23
<210> 125
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 125
agaacatgga tgatacctc 19
<210> 126
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 126
tccagccaca gtcccctaga 20
<210> 127
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 127
tcctgaatgt tcctgatgat agtctct 27
<210> 128
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 128
agattaacat tgacagttcg aca 23
<210> 129
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 129
cgagaggaag gcgctgatc 19
<210> 130
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 130
acatcactcc atccttatac agcaaa 26
<210> 131
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 131
cctgcaagag attattt 17
<210> 132
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 132
ggatcctctt gacattcctc aaa 23
<210> 133
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 133
ggccccccga tgga 14
<210> 134
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 134
ctccaccttt gaagacc 17
<210> 135
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 135
cgagggtgtg gccatatga 19
<210> 136
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 136
gaacaggcat tagaaatacc caaag 25
<210> 137
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 137
tgactagatg gctaatatg 19
<210> 138
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 138
ctactgcaag gcatgctttg at 22
<210> 139
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 139
tggccccctg cattga 16
<210> 140
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 140
tcccttcatc attgctg 17
<210> 141
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 141
gccggtgcag ttacacgtt 19
<210> 142
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 142
ccccaaaccc gtgacaac 18
<210> 143
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 143
cctccaagga gcctc 15
<210> 144
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 144
caaggccctc aacacattca 20
<210> 145
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 145
ggtacataac gggcatcttg atg 23
<210> 146
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 146
acctgttcgc ctttg 15
<210> 147
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 147
cctatgctgg agaaggatta gaaagt 26
<210> 148
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 148
cgatgattag aggtgcatgg aa 22
<210> 149
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 149
atgtggcaga taaag 15
<210> 150
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 150
tctcgccacc ctcaccat 18
<210> 151
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 151
gctgacagaa gtagatgcca ttgt 24
<210> 152
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 152
caaggcatcc ggtttg 16
<210> 153
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 153
aagtcgccct ggaacttcct 20
<210> 154
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 154
caccgagtcc tgctcctcat 20
<210> 155
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 155
atgagttgta cgagcagtc 19
<210> 156
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 156
catgagctgg tgaaaaatgg tattt 25
<210> 157
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 157
aaagctattc ctatcgtggc aaa 23
<210> 158
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 158
aaccagatac caagtttt 18
<210> 159
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 159
tccccagctc ttgccaaag 19
<210> 160
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 160
cagagaactc cctccaagtt gct 23
<210> 161
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 161
ctggagtaga aggacaacag 20
<210> 162
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 162
ggcaggccag ggtttgt 17
<210> 163
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 163
cgagatggct ggaaacacag a 21
<210> 164
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 164
aggcgctgtc tgtc 14
<210> 165
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 165
gactcagcct ctgggatgga 20
<210> 166
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 166
ggatccggaa gtagccattc t 21
<210> 167
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 167
tggattgtta aaaacagctg g 21
<210> 168
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 168
aggcggcttc ccatacct 18
<210> 169
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 169
cttcttccac cagcccaaaa 20
<210> 170
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 170
attgcaggaa agtacgcc 18
<210> 171
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 171
cccaaacctg caccactga 19
<210> 172
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 172
caagatgttg gcaaatgcaa a 21
<210> 173
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 173
ctgaaataca gcaaaaga 18
<210> 174
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 174
cctttgtggc atttattcat cagt 24
<210> 175
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 175
gcttctatga caagcagcct ttg 23
<210> 176
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 176
agggtgtccg attgg 15
<210> 177
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 177
ctctgtagca caggctggat tg 22
<210> 178
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 178
aggctgcagt gcaagattga 20
<210> 179
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 179
agtgcaatcc tgcaatt 17
<210> 180
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 180
ccacttggag gcctttcatc 20
<210> 181
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 181
aggttggcga tcaggaatac a 21
<210> 182
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 182
tcgggtgtgc tatgga 16
<210> 183
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 183
ccttgcctgg tttcgatgtt 20
<210> 184
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 184
gagcatttcc ctgtaggctt ctt 23
<210> 185
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 185
cccaaagcat aaaatt 16
<210> 186
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 186
caaccgttgg aaacataacc att 23
<210> 187
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 187
aacaatcagt agcacattgc atctg 25
<210> 188
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 188
agggagctgg gacact 16
<210> 189
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 189
tggactcact gaggctgacg ta 22
<210> 190
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 190
gattcccgag aacccttgat g 21
<210> 191
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 191
tcaccaagtt tgtgagttc 19
<210> 192
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 192
gctgccaatt ttgagcagtt t 21
<210> 193
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 193
gttcccagct tttccgttca 20
<210> 194
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 194
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<210> 195
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 195
tcttgcctgc cctgtgttg 19
<210> 196
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 196
tgccttcccc ttaataatgc a 21
<210> 197
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 197
aaaatgcggg tccctt 16
<210> 198
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 198
ctcccgctac acagaagtaa caaa 24
<210> 199
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 199
aaaacatccc tgctaccaat acatt 25
<210> 200
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 200
atggtagtca gttttgtatt tag 23
<210> 201
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 201
tccgttacaa gatgaggtct gtgt 24
<210> 202
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 202
cattctcctg gataacaacg ttga 24
<210> 203
<211> 13
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 203
tgctcacttc ccc 13
<210> 204
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 204
tccatccctt gacggttctg 20
<210> 205
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 205
agcccaagag gaatcaaaag atc 23
<210> 206
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 206
ccttcccaaa ctgcttt 17
<210> 207
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 207
gagtcatcac tgaggaagag aagaatt 27
<210> 208
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 208
tggcacgggc catacg 16
<210> 209
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 209
caaagccttc gctagtc 17
<210> 210
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 210
cctacacccc ttatccccat act 23
<210> 211
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 211
ccagggctat tggttgaatg a 21
<210> 212
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 212
ttattatcga aaccatcagc c 21
<210> 213
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 213
cgacctgcga gactcacaag 20
<210> 214
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 214
ggcacagcac tccgtctgt 19
<210> 215
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 215
aagctgacag agatacc 17
<210> 216
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 216
tctggctgtc ctttttataa tgca 24
<210> 217
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 217
cttggcaata gaacctggac aac 23
<210> 218
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 218
agtgagaact ttccc 15
<210> 219
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 219
gcaagaagaa gccactgaaa ca 22
<210> 220
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 220
gaaagcctta tcttcctcgt ccat 24
<210> 221
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 221
cccaagaagc aggcca 16
<210> 222
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 222
ggctgaaaat ggtggaaaag g 21
<210> 223
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 223
ctttgtccct gaggtgtcag ttt 23
<210> 224
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 224
ccaagatggc ggccg 15
<210> 225
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 225
tgtggatgag gcttccaaga a 21
<210> 226
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 226
cagcagggtc cggtcatact 20
<210> 227
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 227
agatcaaaga catcctcatc 20
<210> 228
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 228
ggcaggtgga ctacgagtca tac 23
<210> 229
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 229
gtctcctcgc tgccaggat 19
<210> 230
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 230
catggcggaa actg 14
<210> 231
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 231
ccggaacatt aagaccattg c 21
<210> 232
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 232
cccttggcag cattgatga 19
<210> 233
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 233
agtgcctggc agatg 15
<210> 234
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 234
ctgccacccc actcttaatc a 21
<210> 235
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 235
ggccaattga aacaaacagt tct 23
<210> 236
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 236
tggtggaaga acggtc 16
<210> 237
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 237
ggaagcctgc cacctcctat 20
<210> 238
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 238
tggcgcgagc attcttg 17
<210> 239
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 239
tgcggaccac catc 14
<210> 240
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 240
tgtccttgaa gcttgtatct gatatca 27
<210> 241
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 241
ttcaatacaa ggtcaaaatc agcaa 25
<210> 242
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 242
cactggattg tagaactt 18
<210> 243
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 243
agcctcagat gaaagaaaca atca 24
<210> 244
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 244
cacttgtgcc tgcagtttgg 20
<210> 245
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 245
aaccaggaaa aactc 15
<210> 246
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 246
aagcaggcga atcgtaatga g 21
<210> 247
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 247
tgcttgtgga atgtacagtg cat 23
<210> 248
<211> 13
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 248
cgtgcgccgc caa 13
<210> 249
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 249
cccttttctg ggtttgaagc t 21
<210> 250
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 250
ctgactgata caaagcacaa ttgaga 26
<210> 251
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 251
ctgtctctag aagtgcc 17
<210> 252
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 252
gctgtgaaag caacataaat ggat 24
<210> 253
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 253
ggcatgggaa cttaacagat gag 23
<210> 254
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 254
ttaaactgtc tacggttctt 20
<210> 255
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 255
cgctatccag aacctccact ct 22
<210> 256
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 256
caggtcatca cccttacttg ca 22
<210> 257
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 257
tcgacccctt tgctg 15
<210> 258
<211> 2034
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 258
aaaccttggc catggtcact tcctcttttc caatctctgt ggcagttttt gccctaataa 60
ccctgcaggt tggtactcag gacagtttta tagctgcagt gtatgaacat gctgtcattt 120
tgccaaataa aacagaaaca ccagtttctc aggaggatgc cttgaatctc atgaacgaga 180
atatagacat tctggagaca gcgatcaagc aggcagctga gcagggtgct cgaatcattg 240
tgactccaga agatgcactt tatggatgga aatttaccag ggaaactgtt ttcccttatc 300
tggaggatat cccagaccct caggtgaact ggattccgtg tcaagacccc cacagatttg 360
gtcacacacc agtacaagca agactcagct gcctggccaa ggacaactct atctatgtct 420
tggcaaattt gggggacaaa aagccatgta attcccgtga ctccacatgt cctcctaatg 480
gctactttca atacaatacc aatgtggtgt ataatacaga aggaaaactc gtggcacgtt 540
accataagta ccacctgtac tctgagcctc agtttaatgt ccctgaaaag ccggagttgg 600
tgactttcaa caccgcattt ggaaggtttg gcattttcac gtgctttgat atattcttct 660
atgatcctgg tgttaccctg gtgaaagatt tccatgtgga caccatactg tttcccacag 720
cttggatgaa cgttttgccc cttttgacag ctattgaatt ccattcagct tgggcaatgg 780
gaatgggagt taatcttctt gtggccaaca cacatcatgt cagcctaaat atgacaggaa 840
gtggtattta tgcaccaaat ggtcccaaag tgtatcatta tgacatgaag acagagttgg 900
gaaaacttct cctttcagag gtggattcac atcccctatc ctcgcttgcc tacccaacag 960
ctgttaattg gaatgcctac gccaccacca tcaaaccatt tccagtacag aaaaacactt 1020
tcaggggatt tatttccagg gatgggttca acttcacaga actttttgaa aatgcaggaa 1080
accttacagt ctgtcaaaag gagctttgct gtcatttaag ctacagaatg ttacaaaaag 1140
aagagaatga agtatacgtt ctaggagctt ttacaggatt acatggccga aggagaagag 1200
agtactggca ggtctgcaca atgctgaagt gcaaaactac taatttgaca acttgtggac 1260
ggccagtaga aactgcttct acaagatttg aaatgttctc cctcagtggc acatttggaa 1320
cagagtatgt ttttcctgaa gtgctactta ccgaaattca tctgtcacct ggaaaatttg 1380
aggtgctgaa agatgggcgt ttggtaaaca agaatggatc atctgggcct atactaacag 1440
tgtcactctt tgggaggtgg tacacaaagg actcacttta cagctcatgt gggaccagca 1500
attcagcaat aacttacctg ctaatattca tattattaat gatcatagct ttgcaaaata 1560
ttgtaatgtt atagggcgtc tctttatcac tcagcttctg catcatatgc ttggctgaat 1620
gtgtttatcg gcttcccaag tttactaaga aactttgaag ggctatttca gtagtataga 1680
ccagtgagtc ctaaatattt tttctcatca ataattattt tttaagtatt atgataatgt 1740
tgtccatttt tttggctact ctgaaatgtt gcagtgtgga acaatggaaa gagcctgggt 1800
gtttgggtca gataaatgaa gatcaaactc cagctccagc ctcatttgct tgagactttg 1860
tgtgtatggg ggacttgtat gtatgggagt gaggagtttc agggccattg caaacatagc 1920
tgtgcccttg aagagaatag taatgatggg aatttagagg tttatgactg aattcccttt 1980
gacattaaag actatttgaa ttcaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaa 2034
<210> 259
<211> 1498
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 259
gaggccagag tgccatcgaa ggtaattata gagacagtaa aatcctttta ctctgggaaa 60
aataaaatgc tgggtgtctc acaaaatttc agaacctgat ttcaaacgga tcataacaaa 120
gaggagatca aatttagcat ggtggactgc tcgacaggat atatttgtca atggaatgtt 180
tccacatatt ataccaccaa catgagaaaa aaatgatcat tgtttatttg aagcttgatg 240
atattctaac gctgcctttt ctcttctcat tttagagaaa aatgagcagg cggaattgtt 300
ggatttgtaa gatgtgcaga gatgaatcta agaggccccc ttcaaacctt actttggagg 360
aagtattaca gtgggcccag tcttttgaaa atttaatggc tacaaaatat ggtccagtag 420
tctatgcagc atatttaaaa atggagcaca gtgacgagaa tattcaattc tggatggcat 480
gtgaaaccta taagaaaatt gcctcacggt ggagcagaat ttctagggca aagaagcttt 540
ataagattta catccagcca cagtccccta gagagattaa cattgacagt tcgacaagag 600
agactatcat caggaacatt caggaaccca ctgaaacatg ttttgaagaa gctcagaaaa 660
tagtctatat gcatatggaa agggattcct accccagatt tctaaagtca gaaatgtacc 720
aaaaactttt gaaaactatg cagtccaaca acagtttctg actacaactc aaaagtttaa 780
atagaaaaca gtatattgaa agtggtgggt ttgatctttt tatttagaaa cccacaaaat 840
cagaaacaca gtacaaataa aacagaaatc aaactataag ttgactttta gttcctaaaa 900
agaaacatat ttcaaaagca atggaatcta gaattcttat aacatgaata acaaaatgta 960
cagcaagcct atgtagttca attaatatat aaggaaaagg aaggtctttc ttcatgatac 1020
aagcattata aagtttttac tgtagtagtc aattaatgga tatttccttg ttaataaaat 1080
tttgtgtcat aatttacaaa ttagttcttt aaaaattgtt gttatatgaa ttgtgtttct 1140
agcatgaatg ttctatagag tactctaaat aacttgaatt tatagacaaa tgctactcac 1200
agtacaatca attgtattat accatgagaa aatcaaaaag gtgttcttca gagacatttt 1260
atctataaaa ttttcctact attatgttca ttaacaaact tctttatcac atgtatcttc 1320
tacatgtaaa acatttctga tgatttttta acaaaaaata tatgaatttc ttcatttgct 1380
cttgcatcta cattgctata aggatataaa atgtggtttc tatattttga gatgtttttt 1440
ccttacaatg tgaactcatc gtgatcttgg aaatcaataa agtcaaatat caactaaa 1498
<210> 260
<211> 3260
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 260
ccatcccata gtgagggaag acacgcggaa acaggcttgc acccagacac gacaccatgc 60
atctcctcgg cccctggctc ctgctcctgg ttctagaata cttggctttc tctgactcaa 120
gtaaatgggt ttttgagcac cctgaaaccc tctacgcctg ggagggggcc tgcgtctgga 180
tcccctgcac ctacagagcc ctagatggtg acctggaaag cttcatcctg ttccacaatc 240
ctgagtataa caagaacacc tcgaagtttg atgggacaag actctatgaa agcacaaagg 300
atgggaaggt tccttctgag cagaaaaggg tgcaattcct gggagacaag aataagaact 360
gcacactgag tatccacccg gtgcacctca atgacagtgg tcagctgggg ctgaggatgg 420
agtccaagac tgagaaatgg atggaacgaa tacacctcaa tgtctctgaa aggccttttc 480
cacctcatat ccagctccct ccagaaattc aagagtccca ggaagtcact ctgacctgct 540
tgctgaattt ctcctgctat gggtatccga tccaattgca gtggctccta gagggggttc 600
caatgaggca ggctgctgtc acctcgacct ccttgaccat caagtctgtc ttcacccgga 660
gcgagctcaa gttctcccca cagtggagtc accatgggaa gattgtgacc tgccagcttc 720
aggatgcaga tgggaagttc ctctccaatg acacggtgca gctgaacgtg aagcacaccc 780
cgaagttgga gatcaaggtc actcccagtg atgccatagt gagggagggg gactctgtga 840
ccatgacctg cgaggtcagc agcagcaacc cggagtacac gacggtatcc tggctcaagg 900
atgggacctc gctgaagaag cagaatacat tcacgctaaa cctgcgcgaa gtgaccaagg 960
accagagtgg gaagtactgc tgtcaggtct ccaatgacgt gggcccggga aggtcggaag 1020
aagtgttcct gcaagtgcag tatgccccgg aaccttccac ggttcagatc ctccactcac 1080
cggctgtgga gggaagtcaa gtcgagtttc tttgcatgtc actggccaat cctcttccaa 1140
caaattacac gtggtaccac aatgggaaag aaatgcaggg aaggacagag gagaaagtcc 1200
acatcccaaa gatcctcccc tggcacgctg ggacttattc ctgtgtggca gaaaacattc 1260
ttggtactgg acagaggggc ccgggagctg agctggatgt ccagtatcct cccaagaagg 1320
tgaccacagt gattcaaaac cccatgccga ttcgagaagg agacacagtg accctttcct 1380
gtaactacaa ttccagtaac cccagtgtta cccggtatga atggaaaccc catggcgcct 1440
gggaggagcc atcgcttggg gtgctgaaga tccaaaacgt tggctgggac aacacaacca 1500
tcgcctgcgc acgttgtaat agttggtgct cgtgggcctc ccctgtcgcc ctgaatgtcc 1560
agtatgcccc ccgagacgtg agggtccgga aaatcaagcc cctttccgag attcactctg 1620
gaaactcggt cagcctccaa tgtgacttct caagcagcca ccccaaagaa gtccagttct 1680
tctgggagaa aaatggcagg cttctgggga aagaaagcca gctgaatttt gactccatct 1740
ccccagaaga tgctgggagt tacagctgct gggtgaacaa ctccatagga cagacagcgt 1800
ccaaggcctg gacacttgaa gtgctgtatg cacccaggag gctgcgtgtg tccatgagcc 1860
cgggggacca agtgatggag gggaagagtg caaccctgac ctgtgagagt gacgccaacc 1920
ctcccgtctc ccactacacc tggtttgact ggaataacca aagcctcccc caccacagcc 1980
agaagctgag attggagccg gtgaaggtcc agcactcggg tgcctactgg tgccagggga 2040
ccaacagtgt gggcaagggc cgttcgcctc tcagcaccct tactgtctac tatagcccgg 2100
agaccatcgg caggcgagtg gctgtgggac tcgggtcctg cctcgccatc ctcatcctgg 2160
caatctgtgg gctcaagctc cagcgacgtt ggaagaggac acagagccag caggggcttc 2220
aggagaattc cagcggccag agcttctttg tgaggaataa aaaggttaga agggcccccc 2280
tctctgaagg cccccactcc ctgggatgct acaatccaat gatggaagat ggcattagct 2340
acaccaccct gcgctttccc gagatgaaca taccacgaac tggagatgca gagtcctcag 2400
agatgcagag acctccccgg acctgcgatg acacggtcac ttattcagca ttgcacaagc 2460
gccaagtggg cgactatgag aacgtcattc cagattttcc agaagatgag gggattcatt 2520
actcagagct gatccagttt ggggtcgggg agcggcctca ggcacaagaa aatgtggact 2580
atgtgatcct caaacattga cactggatgg gctgcagcag aggcactggg ggcagcgggg 2640
gccagggaag tccccgagtt tccccagaca ccgccacatg gcttcctcct gcgtgcatgt 2700
gcgcacacac acacacacac gcacacacac acacacacac tcactgcgga gaaccttgtg 2760
cctggctcag agccagtctt tttggtgagg gtaaccccaa acctccaaaa ctcctgcccc 2820
tgttctcttc cactctcctt gctacccaga aatcatctaa atacctgccc tgacatgcac 2880
acctcccctg ccccaccagc ccactggcca tctccacccg gagctgctgt gtcctctgga 2940
tctgctcgtc attttccttc ccttctccat ctctctggcc ctctacccct gatctgacat 3000
ccccactcac gaatattatg cccagtttct gcctctgagg gaaagcccag aaaaggacag 3060
aaacgaagta gaaaggggcc cagtcctggc ctggcttctc ctttggaagt gaggcattgc 3120
acggggagac gtacgtatca gcggcccctt gactctgggg actccgggtt tgagatggac 3180
acactggtgt ggattaacct gccagggaga cagagctcac aataaaaatg gctcagatgc 3240
cacttcaaag aaaaaaaaaa 3260
<210> 261
<211> 1616
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 261
gccaaggctg gggcagggga gtcagcagag gcctcgctcg ggcgcccagt ggtcctgccg 60
cctggtctca cctcgctatg gttcgtctgc ctctgcagtg cgtcctctgg ggctgcttgc 120
tgaccgctgt ccatccagaa ccacccactg catgcagaga aaaacagtac ctaataaaca 180
gtcagtgctg ttctttgtgc cagccaggac agaaactggt gagtgactgc acagagttca 240
ctgaaacgga atgccttcct tgcggtgaaa gcgaattcct agacacctgg aacagagaga 300
cacactgcca ccagcacaaa tactgcgacc ccaacctagg gcttcgggtc cagcagaagg 360
gcacctcaga aacagacacc atctgcacct gtgaagaagg ctggcactgt acgagtgagg 420
cctgtgagag ctgtgtcctg caccgctcat gctcgcccgg ctttggggtc aagcagattg 480
ctacaggggt ttctgatacc atctgcgagc cctgcccagt cggcttcttc tccaatgtgt 540
catctgcttt cgaaaaatgt cacccttgga caagctgtga gaccaaagac ctggttgtgc 600
aacaggcagg cacaaacaag actgatgttg tctgtggtcc ccaggatcgg ctgagagccc 660
tggtggtgat ccccatcatc ttcgggatcc tgtttgccat cctcttggtg ctggtcttta 720
tcaaaaaggt ggccaagaag ccaaccaata aggcccccca ccccaagcag gaaccccagg 780
agatcaattt tcccgacgat cttcctggct ccaacactgc tgctccagtg caggagactt 840
tacatggatg ccaaccggtc acccaggagg atggcaaaga gagtcgcatc tcagtgcagg 900
agagacagtg aggctgcacc cacccaggag tgtggccacg tgggcaaaca ggcagttggc 960
cagagagcct ggtgctgctg ctgctgtggc gtgagggtga ggggctggca ctgactgggc 1020
atagctcccc gcttctgcct gcacccctgc agtttgagac aggagacctg gcactggatg 1080
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cttgtattaa agacagaggc agaagtttgg tggtggtggt gttggggtat ggtttagtaa 1200
tatccaccag accttccgat ccagcagttt ggtgcccaga gaggcatcat ggtggcttcc 1260
ctgcgcccag gaagccatat acacagatgc ccattgcagc attgtttgtg atagtgaaca 1320
actggaagct gcttaactgt ccatcagcag gagactggct aaataaaatt agaatatatt 1380
tatacaacag aatctcaaaa acactgttga gtaaggaaaa aaaggcatgc tgctgaatga 1440
tgggtatgga actttttaaa aaagtacatg cttttatgta tgtatattgc ctatggatat 1500
atgtataaat acaatatgca tcatatattg atataacaag ggttctggaa gggtacacag 1560
aaaacccaca gctcgaagag tggtgacgtc tggggtgggg aagaagggtc tggggg 1616
<210> 262
<211> 733
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 262
aaacagcagg aaatagaaac ttaagagaaa tacacacttc tgagaaactg aaacgacagg 60
ggaaaggagg tctcactgag caccgtccca gcatccggac accacagcgg cccttcgctc 120
cacgcagaaa accacacttc tcaaaccttc actcaacact tccttcccca aagccagaag 180
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aggtccaccg tgatcaacat ccacagcgag acctccgtgc ccgaccatgt cgtctggtcc 300
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aaaaaaaaaa aaa 733
<210> 263
<211> 3537
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 263
ggcccctcga gcctcgaacc ggaacctcca aatccgagac gctctgctta tgaggacctc 60
gaaatatgcc ggccagtgaa aaaatcttgt ggctttgagg gcttttggtt ggccaggggc 120
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cgaagctcaa attccgagaa ttgagctctg ttgattctta gaactggggt tcttagaagt 240
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acccgccatg ccagtgatgt tcttctcaac cttaatcgtc tccggagtcg agacatcttg 420
actgatgttg tcattgttgt gagccgtgag cagtttagag cccataaaac ggtcctcatg 480
gcctgcagtg gcctgttcta tagcatcttt acagaccagt tgaaatgcaa ccttagtgtg 540
atcaatctag atcctgagat caaccctgag ggattctgca tcctcctgga cttcatgtac 600
acatctcggc tcaatttgcg ggagggcaac atcatggctg tgatggccac ggctatgtac 660
ctgcagatgg agcatgttgt ggacacttgc cggaagttta ttaaggccag tgaagcagag 720
atggtttctg ccatcaagcc tcctcgtgaa gagttcctca acagccggat gctgatgccc 780
caagacatca tggcctatcg gggtcgtgag gtggtggaga acaacctgcc actgaggagc 840
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tgtgatagtg ccaggccagt ccctggtgag tacagccggc cgactttgga ggtgtccccc 1080
aatgtgtgcc acagcaatat ctattcaccc aaggaaacaa tcccagaaga ggcacgaagt 1140
gatatgcact acagtgtggc tgagggcctc aaacctgctg ccccctcagc ccgaaatgcc 1200
ccctacttcc cttgtgacaa ggccagcaaa gaagaagaga gaccctcctc ggaagatgag 1260
attgccctgc atttcgagcc ccccaatgca cccctgaacc ggaagggtct ggttagtcca 1320
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gcctgcaact ggaagaaata caagttcatc gtgctcaaca gcctcaacca gaatgccaaa 1500
ccagaggggc ctgagcaggc tgagctgggc cgcctttccc cacgagccta cacggcccca 1560
cctgcctgcc agccacccat ggagcctgag aaccttgacc tccagtcccc aaccaagctg 1620
agtgccagcg gggaggactc caccatccca caagccagcc ggctcaataa catcgttaac 1680
aggtccatga cgggctctcc ccgcagcagc agcgagagcc actcaccact ctacatgcac 1740
cccccgaagt gcacgtcctg cggctctcag tccccacagc atgcagagat gtgcctccac 1800
accgctggcc ccacgttccc tgaggagatg ggagagaccc agtctgagta ctcagattct 1860
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gtacaggtgg cccacctccg tgcccatgtg cttatccaca ctggtgagaa gccctatccc 2220
tgtgaaatct gtggcacccg tttccggcac cttcagactc tgaagagcca cctgcgaatc 2280
cacacaggag agaaacctta ccattgtgag aagtgtaacc tgcatttccg tcacaaaagc 2340
cagctgcgac ttcacttgcg ccagaagcat ggcgccatca ccaacaccaa ggtgcaatac 2400
cgcgtgtcag ccactgacct gcctccggag ctccccaaag cctgctgaag catggagtgt 2460
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tgactttagt ctgcaaaatg aggaatgtat atgttttgtg ggaacagatg tttcttttgt 2820
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gtgttataac tactccggag acagggtttg gctgtgtcta aactgcatta ccgcgttgta 3480
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<210> 264
<211> 2613
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 264
tcccccctct taaaacacga tgcctcccag gatgctagtg gcaccactgc cactgcattt 60
cctgttggca gcagtgagca gtgaaaaccg aagcggcaga aggcagtggc agcaggcagt 120
ggcagcaggc agtggcccag gcagaaatag ctcccgcgcg attcactgga gccttccccg 180
ggccctggtc ccggctaccg ggactcgcgc gtccggatct caaaagcggc agaggccacc 240
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ccggggaagg ctgaccgcga tgccaggacg cgctcccctc cgcaccgtcc cgggcgccct 420
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taatcttttt tcagcaagga atgctccccg ccatgagttt tgatgggaaa attattttgg 960
aagagaagaa caaagtttct atggctccag atgggaatgg tggtctttat cgggcacttg 1020
cagcccagaa tattgtggag gatatggagc aaagaggcat ttggagcatt catgtctatt 1080
gtgttgacaa catattagta aaagtggcag acccacggtt cattggattt tgcattcaga 1140
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tggtttgccg agtggatgga gtttaccagg tggtagaata tagtgagatt tccctggcaa 1260
cagctcaaaa acgaagctca gacggacgac tgctgttcaa tgcggggaac attgccaacc 1320
atttcttcac tgtaccattt ctgagagatg ttgtcaatgt ttatgaacct cagttgcagc 1380
accatgtggc tcaaaagaag attccttatg tggataccca aggacagtta attaagccag 1440
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gctgggtcct caatgcaggg ggccatttca tagatgaaaa tggctctcgc cttccagcaa 1680
ttccccgctt gaaggatgcc aatgatgtac caatccaatg tgaaatctct cctcttatct 1740
cctatgctgg agaaggatta gaaagttatg tggcagataa agaattccat gcacctctaa 1800
tcatcgatga gaatggagtt catgagctgg tgaaaaatgg tatttgaacc agataccaag 1860
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ataattgggc agtgaaataa atgtatcttc ttgtctctgg agtgtcaaaa aaaaaaaaaa 2340
aaaa 2344
<210> 272
<211> 3484
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 272
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ctgcttttgc ctggccgccc tagccgctgg ctcatccaag tggccttcgc cgctctcttg 120
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gctccgggtt ttcttaaatg ttttcttgga gccttaaaga tggagatgac agaaatgact 240
ggtgtgtcgc tgaaacgtgg ggcactggtt gtcgaagata atgacagtgg agtcccagtt 300
gaagagacaa aaaaacagaa gctgtcggaa tgcagtctaa ccaaaggtca agatgggcta 360
cagaatgact ttctgtccat cagtgaagac gtgcctcggc ctcctgacac tgtcagtact 420
gggaaaggtg gaaagaattc tgaggctcag ttggaagatg aggaagaaga ggaggaagat 480
ggactttcag aggagtgcga ggaggaggaa tcagagagtt ttgcagacat gatgaagcat 540
ggactcactg aggctgacgt aggcatcacc aagtttgtga gttctcatca agggttctcg 600
ggaatcttaa aagaaagata ctccgacttc gttgttcatg aaataggaaa agatggacgg 660
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tttacagttt tgacagctga agaaaagcag cgattggaag agctccagct gttcaaaaat 780
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catcaggcta tcaaatctct gtttccagga ttagagacaa aaacagagga tagggagggg 900
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cattcttggc caaaatctag gggaagttac tgccacttcg tactatataa ggaaaacaaa 1020
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ataactgcac aaagacttgc ccacctgaat aagtgcttga tgaactttaa gctagggaat 1200
ttcagctatc aaaaaaaccc actgaaattg ggagagcttc aaggaaacca cttcactgtt 1260
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<210> 273
<211> 3293
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 273
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Claims (23)
- (a) B-세포 림프종을 갖는 대상체로부터 수득한 B 림프종 세포를 포함하는 샘플에서 BCL6, IFITM1, CD40, RGS13, VNN2, LMO2, CD79B, CD22, BTG2, IGF1R, CD44, CTSC, EPDR1, UAP1 및 PUS7로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 마커 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
(b) 상기 대상체로부터의 샘플 및 공지된 클래스를 갖는 참조 샘플에서 상기 하나 이상의 마커 유전자의 발현 수준을 기반으로 K-최근접 이웃 분석을 이용하여 대상체를 반응성 대상체 또는 비-반응성 대상체로 분류하는 단계
를 포함하는, 항-CD40 항체 치료에 대한 B-세포 림프종을 갖는 대상체의 반응성을 예측하기 위한 방법. - 제1항에 있어서, 측정된 발현 수준이 표준화된 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 참조 샘플이 항-CD40 항체 치료에 대한 반응성이 시험된 대상체로부터 수득한 B 림프종 세포를 포함하는 샘플인 방법.
- 제3항에 있어서, 참조 샘플이 항-CD40 항체 치료에 대한 반응성이 예측된 대상체로부터의 샘플과 동일한 유형의 B 림프종 세포를 포함하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 적어도 12개, 적어도 13개, 적어도 14개, 또는 15개 모두의 마커 유전자의 발현 수준을 측정하고, 대상체를 분류하는데 사용하는 방법.
- 제5항에 있어서, BCL6, IFITM1, CD22, IGF1R, CD44, EPDR1 및 UAP1의 발현 수준을 측정하고, 대상체를 분류하는데 사용하는 방법.
- 제1항에 있어서, 단계 (b)에서 대상체의 분류를 (1) 파라미터 K를 결정하고; (2) 대상체로부터의 샘플에서 마커 유전자의 측정된 발현 수준과 각각의 참조 샘플에서 각각의 마커 유전자의 발현 수준 사이의 차이를 계산하고; (3) 대상체로부터의 샘플과 참조 샘플 사이의 절대차의 가중 평균 (WAAD)이 가장 작은 샘플을 선택함으로써 최근접 참조 샘플을 결정하고; (4) K-최근접 참조 샘플의 공지된 클래스를 기반으로 대상체의 클래스를 결정함으로써 수행하는 방법.
- 제7항에 있어서, 파라미터 K가 K-최근접 이웃 분석에서 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 13인 방법.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-CD40 항체 치료가 효능제 항-CD40 항체를 사용한 치료인 방법.
- 제9항에 있어서, 효능제 항-CD40 항체가 CD40을 자극하고, CD40과 CD40 리간드 사이의 상호작용을 향상시키는 것인 방법.
- 제9항에 있어서, 효능제 항-CD40 항체가 서열 1에 제시된 중쇄 아미노산 서열 및 서열 2에 제시된 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
- 제9항에 있어서, 효능제 항-CD40 항체가 CD40을 자극하고, CD40과 CD40 리간드 사이의 상호작용을 향상시키지 않거나 억제하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 B 세포 림프종이 미만성 거대 B-세포 림프종 (DLBCL)인 방법.
- 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 B 세포 림프종이 비-호지킨 (Hodgkin) 림프종인 방법.
- 제14항에 있어서, 상기 비-호지킨 림프종이 여포성 림프종, 외투 세포 림프종, 변연부 림프종 또는 소림프구성 림프종인 방법.
- 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플이 포르말린 고정된 파라핀 포매된 생검 샘플인 방법.
- 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 마커 유전자의 발현 수준을 하나 이상의 마커 유전자의 RNA 전사체의 수준에 의해 측정하는 방법.
- 제17항에 있어서, RNA 전사체를 qRT-PCR에 의해 측정하는 방법.
- 제17항에 있어서, RNA 전사체를 마이크로어레이에 의해 측정하는 방법.
- 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 마커 유전자의 발현 수준을 하나 이상의 마커 유전자의 단백질 발현의 수준에 의해 측정하는 방법.
- B-세포 림프종을 갖는 대상체로부터의 B 림프종 세포를 포함하는 샘플에서 BCL6, IFITM1, CD40, RGS13, VNN2, LMO2, CD79B, CD22, BTG2, IGF1R, CD44, CTSC, EPDR1, UAP1 및 PUS7로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 마커 유전자의 발현 수준을 측정하기 위한 시약, 및 상기 대상체로부터의 샘플 및 공지된 클래스를 갖는 참조 샘플에서 상기 하나 이상의 마커 유전자의 발현 수준을 기반으로 K-최근접 이웃 분석을 이용하여 대상체를 반응성 대상체 또는 비-반응성 대상체로 분류하기 위한 설명서를 포함하는, 항-CD40 항체 치료에 대한 B-세포 림프종을 갖는 대상체의 반응성을 예측하기 위한 키트.
- 제21항에 있어서, 시약이 상기 하나 이상의 마커 유전자의 발현 수준을 qRT-PCR에 의해 검출하기 위한 적어도 한 쌍의 프라이머 및 프로브를 포함하는 것인 키트.
- 제22항에 있어서, 상기 프라이머 및 프로브의 쌍이 서열 102, 103 및 104; 서열 108, 109 및 110; 서열 27, 28 및 29; 서열 60, 61 및 62; 서열 93, 94 및 95; 서열 24, 25 및 26; 서열 57, 58 및 59; 서열 90, 91 및 92; 서열 114, 115 및 116; 서열 126, 127 및 128; 서열 30, 31 및 32; 서열 63, 64 및 65; 서열 96, 97 및 98; 서열 12, 13 및 14; 서열 45, 46 및 47; 서열 78, 79 및 80; 서열 141, 142 및 143; 서열 150, 151 및 152; 서열 159, 160 및 161; 서열 15, 16 및 17; 서열 48, 49 및 50; 서열 81, 82 및 83; 서열 9, 10 및 11; 서열 42, 43 및 44; 서열 75, 76 및 77; 서열 6, 7 및 8; 서열 39, 40 및 41; 서열 72, 73 및 74; 서열 174, 175 및 176; 서열 180, 181 및 182; 서열 186, 187 및 188; 서열 165, 166 및 167; 서열 168, 169 및 170; 서열 171, 172 및 173; 서열 21, 22 및 23; 서열 54, 55 및 56; 서열 87, 88 및 89; 서열 129, 130 및 131; 서열 132, 133 및 134; 서열 135, 136 및 137; 서열 138, 139 및 140; 서열 147, 148 및 149; 서열 156, 157 및 158; 서열 177, 178 및 179; 서열 183, 184 및 185; 및 서열 189, 190 및 191로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 키트.
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