ES2800026T3 - Tratamiento de enfermedades inmunitarias e inflamatorias - Google Patents

Tratamiento de enfermedades inmunitarias e inflamatorias Download PDF

Info

Publication number
ES2800026T3
ES2800026T3 ES13752753T ES13752753T ES2800026T3 ES 2800026 T3 ES2800026 T3 ES 2800026T3 ES 13752753 T ES13752753 T ES 13752753T ES 13752753 T ES13752753 T ES 13752753T ES 2800026 T3 ES2800026 T3 ES 2800026T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
compound
cells
oxo
disease
cell
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES13752753T
Other languages
English (en)
Inventor
Peter Schafer
Rajesh Chopra
Anita Gandhi
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Celgene Corp
Original Assignee
Celgene Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Celgene Corp filed Critical Celgene Corp
Application granted granted Critical
Publication of ES2800026T3 publication Critical patent/ES2800026T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/535—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with at least one nitrogen and one oxygen as the ring hetero atoms, e.g. 1,2-oxazines
    • A61K31/5375—1,4-Oxazines, e.g. morpholine
    • A61K31/5377—1,4-Oxazines, e.g. morpholine not condensed and containing further heterocyclic rings, e.g. timolol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/535—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with at least one nitrogen and one oxygen as the ring hetero atoms, e.g. 1,2-oxazines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D413/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms
    • C07D413/14—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms containing three or more hetero rings

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Un compuesto para su uso en un procedimiento para tratar, prevenir o controlar una enfermedad inmunitaria o una enfermedad inflamatoria, donde el procedimiento comprende administrar a un paciente que lo necesite una cantidad efectiva de dicho compuesto, y donde el compuesto es un compuesto de fórmula I **(Ver fórmula)** o una sal, solvato, hidrato, estereoisómero, tautómero o mezcla racémica farmacéuticamente aceptable de los mismos, y en donde la enfermedad es lupus, esclerodermia, lupus pernio, sarcoidosis, síndrome de Sjögren, vasculitis inducida por ANCA, síndrome antifosfolípido o miastenia grave.

Description

DESCRIPCIÓN
Tratamiento de enfermedades inmunitarias e inflamatorias
1. CAMPO
En esta invención se proporciona 3-[4-(4-morfolin-4-ilmetilbenciloxi)-1 -oxo-1,3-dihidro-isoindo-2-il]piperidina-2,6-diona para su uso en procedimientos para tratar la prevención o el manejo de enfermedades inmunitarias o enfermedades inflamatorias. Las composiciones farmacéuticas y los regímenes de dosificación para su uso en dicho tratamiento, prevención y/o control también se describen en esta invención.
2. ANTECEDENTES
Las enfermedades inflamatorias e inmunitarias moduladas por la actividad linfocítica, incluida la actividad de las células B y/o células T, como lupus, esclerodermia, lupus pernio, sarcoidosis, síndrome de Sjogren, vasculitis inducida por ANCA, síndrome antifosfolípido y miastenia grave, continúan siendo importantes problemas médicos
El lupus o el lupus eritematoso es una colección de trastornos autoinmunes que pueden causar inflamación crónica en varias partes del cuerpo, especialmente la piel, las articulaciones, la sangre y los riñones. El sistema inmunitario del cuerpo normalmente produce proteínas llamadas anticuerpos para proteger al cuerpo contra virus, bacterias y otros materiales extraños (es decir, antígenos). En un trastorno autoinmune como el lupus, el sistema inmunitario pierde la capacidad de distinguir entre los antígenos y sus propias células y tejidos y puede producir anticuerpos dirigidos contra sus propias células y tejidos para formar complejos inmunes. Estos complejos inmunes pueden acumularse en los tejidos y causar inflamación, lesiones en los tejidos y/o dolor. Los tres tipos más comunes de lupus incluyen lupus eritematoso sistémico (LES), lupus eritematoso cutáneo (CLE) y lupus inducido por fármacos. Se pueden encontrar descripciones más detalladas de lupus o lupus eritematoso en Wallace, 2000, The Lupus Book: A Guide for Patients and Their Families, Oxford University Press, Edición revisada y expandida.
La esclerodermia es una enfermedad rara con una incidencia estable de aproximadamente 19 casos por 1 millón de personas. Se desconoce la causa exacta de la esclerodermia. Las anormalidades implican autoinmunidad y alteración de la función de las células endoteliales y los fibroblastos. La esclerodermia sistémica generalmente comienza con un engrosamiento de la piel, generalmente de los dedos, acompañado del fenómeno de Raynaud. La enfermedad de Raynaud generalmente precede a otras manifestaciones de esclerodermia sistémica. Al principio de la enfermedad, la piel afectada puede estar hinchada y suave. La ubicación habitual del mayor engrosamiento y endurecimiento de la piel es la cara, manos y dedos. La esclerodactilia está frecuentemente presente. Los roces de fricción del tendón a menudo son palpables en el examen y pueden ser dolorosos. Con una enfermedad más avanzada, pueden producirse úlceras digitales y autoamputación. La dismotilidad gastrointestinal es una característica, a menudo manifestada por acidez estomacal o por diarrea con malabsorción o seudoobstrucción. La hipertensión de inicio nuevo o la insuficiencia renal son manifestaciones de la lesión vascular asociada. La insuficiencia cardíaca o la arritmia también son posibles debido a la fibrosis cardíaca. (Hachulla E, Launay D, Diagnosis and classification of systemic sclerosis, Clin Rev Allergy Immunol 2010; 40(2):78-83).
Las principales manifestaciones de la esclerodermia y, en particular, de la esclerosis sistémica son la síntesis y depósito excesivos inadecuados de colágeno, la disfunción endotelial, el espasmo, el colapso y la obliteración por fibrosis. En términos de diagnóstico, un parámetro clínico importante es el engrosamiento de la piel proximal a las articulaciones metacarpofalángicas. El fenómeno de Raynaud es un componente frecuente y casi universal de la esclerodermia. Se diagnostica por cambios de color de la piel tras la exposición al frío. La isquemia y el engrosamiento de la piel son síntomas de la enfermedad de Raynaud.
La sarcoidosis es una enfermedad caracterizada por la formación de granulomas, potenciada por linfocitos y macrófagos, generalmente clasificada como una respuesta T-helper tipo 1. Se cree que la sobreproducción de factor de necrosis tumoral (TNF)-a, IL-8 e IL-18 por los macrófagos alveolares es un factor que contribuye a la inflamación pulmonar subyacente. El lupus pernio es una manifestación crónica de desfragmentación cutánea de sarcoidosis, que afecta principalmente a la cara. La sarcoidosis y el lupus pernio asociado tienen opciones de tratamiento limitadas, como los corticosteroides, que ofrecen un beneficio modesto (Baughman RP, Judson MA, Teirstein AS, Moller DR, Lower EE. Thalidomide for chronic sarcoidosis. Chest. Julio de 2002; 122(1 ):227-32).
Khanna, Expert review of Dermatology, vol. 6, N. ° 3, páginas 287-302, describe el diagnóstico y el tratamiento de la esclerodermia sistémica y localizada. El documento WO 2011/100380 describe derivados de 4'-arilmetoxi isoindolina para el tratamiento de enfermedades de la piel, trastornos pulmonares y trastornos relacionados con TNF-a.
Sigue existiendo la necesidad de medicamentos profilácticos o terapéuticos que puedan usarse para tratar o prevenir enfermedades inmunitarias e inflamatorias, como lupus, esclerodermia, lupus pemio, sarcoidosis, síndrome de Sjogren, vasculitis inducida por ANCA, síndrome antifosfolípido y miastenia grave.
3. RESUMEN
En esta invención se proporciona un compuesto para su uso en un procedimiento para tratar, prevenir o controlar una enfermedad inmunitaria o una enfermedad inflamatoria, donde el procedimiento comprende administrar a un paciente que lo necesite una cantidad efectiva de dicho compuesto, y donde el compuesto es un compuesto de fórmula I
Figure imgf000003_0001
o una sal, solvato, hidrato, estereoisómero, tautómero o mezcla racémica farmacéuticamente aceptable de los mismos, y en donde la enfermedad es lupus, esclerodermia, lupus pernio, sarcoidosis, síndrome de Sjogren, vasculitis inducida por ANCA, síndrome antifosfolípido o miastenia grave.
En una realización, el compuesto es 3-[4-(4-morfolin-4-ilmetil-benciloxi)-1 -oxo-1,3-dihidro-isoindol-2-il]-piperidina-2,6-diona.
En una realización, el compuesto es una sal farmacéuticamente aceptable de 3-[4-(4-morfolin-4-ilmetil-benciloxi)-1-oxo-1,3-dihidro-isoindol-2-il]-piperidina-2, 6-diona.
En una realización, el compuesto es clorhidrato de 3-[4-(4-morfolin-4-ilmetil-benciloxi)-1 -oxo-1,3-dihidro-isoindol-2-il]-piperidina-2,6-diona.
En una realización, el compuesto es (S)-3-[4-(4-morfolin-4-ilmetil-benciloxi)-1 -oxo-1,3-dihidro-isoindol-2-il]-piperidina-2,6-diona, que tiene la siguiente estructura:
Figure imgf000004_0001
o una sal, solvato, hidrato o tautómero farmacéuticamente aceptable del mismo;
En una realización, el compuesto es (S)-3-[4-(4-morfolin-4-ilmetil-benciloxi)-1-oxo-1,3-dihidro-isoindol-2-il]-piperidina-2,6-diona.
En una realización, el compuesto es una sal farmacéuticamente aceptable de (S)-3-[4-(4-morfolin-4-ilmetil-benciloxi)-1 -oxo-1,3-dihidro-isoindol-2-il]-piperidina-2,6-diona.
En una realización, el compuesto es (S)-3-[4-(4-morfolin-4-ilmetil-benciloxi)-1-oxo-1,3-dihidro-isoindol-2-il]-piperidina-2,6-diona clorhidrato.
En una realización, el compuesto es (fi)-3-[4-(4-morfolin-4-ilmetil-benciloxi)-1-oxo-1,3-dihidro-isoindol-2-il]-piperidina-2,6-diona, que tiene la siguiente estructura:
Figure imgf000004_0002
Compuesto IB
o una sal, solvato, hidrato o tautómero farmacéuticamente aceptable del mismo;
En una realización, el compuesto es (fl)-3-[4-(4-morfolin-4-ilmetil-benciloxi)-1-oxo-1,3-dihidro-isoindol-2-il]-piperidina-2,6-diona.
En una realización, el compuesto es una sal farmacéuticamente aceptable de (fi)-3-[4-(4-morfolin-4-ilmetil-benciloxi)-1 -oxo-1,3-dihidro-isoindol-2-il]-piperidina-2,6-diona.
En una realización, el compuesto es clorhidrato de (fl)-3-[4-(4-morfolin-4-ilmetil-benciloxi)-1-oxo-1,3-dihidro-isoindol-2-il]-piperidina-2,6-diona.
En ciertas realizaciones, la enfermedad se selecciona de entre lupus, esclerodermia, síndrome de Sjogren, vasculitis inducida por ANCA, síndrome antifosfolípido y miastenia grave.
También se describen en esta invención procedimientos de modulación, por ejemplo, la reducción, la actividad leucocitaria, incluida la actividad de las células B y/o T, los monocitos, los macrófagos y otros tipos celulares linfoides o derivadas de la mieloide, que comprenden el contacto de las células B y/o T con una cantidad efectiva del compuesto I.
También se describen en esta invención composiciones farmacéuticas, formas de dosificación unitarias únicas y kits adecuados para su uso en el tratamiento, prevención, mejora y/o control de enfermedades, trastornos y/o afecciones asociadas a enfermedades inmunitarias e inflamatorias asociadas, que comprenden el compuesto I, opcionalmente en combinación con uno o más agentes terapéuticos diferentes.
En ciertas realizaciones, el compuesto I se administra en combinación con uno o más agentes terapéuticos, es decir, agentes farmacéuticos que son moduladores de la actividad leucocítica, incluida la actividad de las células B y/o células T, monocitos, macrófagos y otros tipos ceulares linfoides o mieloides. Las combinaciones abarcan la administración simultánea y secuencial.
4. BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
La FIG. 1 representa el efecto de (S)-3-[4- (4-morfolin-4-ilmetilbenciloxi)-1-oxo-1,3-dihidro-isoindo-2-il]piperidina-2.6- diona en plasmablasto y la diferenciación de células B activadas.
La FIG. 2 representa el efecto de (S)-3-[4- (4-morfolin-4-ilmetilbenciloxi)-1-oxo-1,3-dihidro-isoindo-2-il]piperidina-2.6- diona en la viabilidad celular durante diferenciación de plasmablastos.
La FIG. 3 representa el efecto de (S)-3-[4- (4-morfolin-4-ilmetilbenciloxi)-1-oxo-1,3-dihidro-isoindo-2-il]piperidina-2.6- diona en la expresión del factor de transcripción de las células B y del plasma.
La FIG. 4 representa el efecto de (S)-3-[4- (4-morfolin-4-ilmetilbenciloxi)-1-oxo-1,3-dihidro-isoindo-2-il]piperidina-2.6- diona en la producción de IgG en cultivos de plasmablastos.
Las FIG. 5A y 5B representan el efecto de (S)-3-[4- (4-morfolin-4-ilmetilbenciloxi)-1-oxo-1,3-dihidro-isoindo-2-il]piperidina-2,6-diona en la expresión del factor de transcripción de las células B y del plasma.
La FIG. 6 representa el efecto de (S)-3-[4- (4-morfolin-4-ilmetilbenciloxi)-1-oxo-1,3-dihidro-isoindo-2-il]piperidina-2.6- diona en la producción de IgG en cultivos de células B los días 4, 7 y 10.
La FIG. 7 representa el efecto de (S)-3-[4- (4-morfolin-4-ilmetilbenciloxi)-1-oxo-1,3-dihidro-isoindo-2-il]piperidina-2.6- diona, solo y en combinación con prednisolona, en la producción de IgG por medio de blastos plasmáticos/células plasmáticas diferenciadas in vitro.
La FIG. 8 representa el efecto de (S)-3-[4- (4-morfolin-4-ilmetilbenciloxi)-1-oxo-1,3-dihidro-isoindo-2-il]piperidina-2.6- diona en la expresión de CD20/CD38 durante la diferenciación de las células B en el día 7.
La FIG. 9 representa el efecto de (S)-3-[4- (4-morfolin-4-ilmetilbenciloxi)-1-oxo-1,3-dihidro-isoindo-2-il]piperidina-2.6- diona en la viabilidad celular durante diferenciación de plasmablastos.
La FIG. 10 representa el efecto de (S)-3-[4-(4-morfolin-4-ilmetilbenciloxi)-1 -oxo-1,3-dihidro-isoindo-2-il]piperidina-2.6- diona en la diferenciación y la función de las células B en el PBMC del paciente con LES in vitro.
Las FIG. 11A y 11B representan el efecto de (S)-3-(4-(4-morfolin-4-ilmetilbenciloxi)-1-oxo-1,3-dihidro-isoindo-2-il]piperidina-2,6-diona en la producción de IgG e IgM, respectivamente, en cultivos de células B el día 7.
La FIG. 12 representa el efecto de (S)-3-[4-(4-morfolin-4-ilmetilbenciloxi)-1 -oxo-1,3-dihidro-isoindo-2-il]piperidina-2,6-diona en la diferenciación de la célula B CD19+ en blastos plasmáticos/células de plasma.
La FIG. 13 representa el efecto de (S)-3-[4-(4-morfolin-4-ilmetilbenciloxi)-1 -oxo-1,3-dihidro-isoindo-2-il]piperidina-2.6- diona en la población de células de gran tamaño (puerta p2) en el ensayo de diferenciación de células B normales.
La FIG. 14 representa el efecto de (S)-3-[4-(4-morfolin-4-ilmetilbenciloxi)-1 -oxo-1,3-dihidro-isoindo-2-il]piperidina-2,6-diona en los factores de transcripción de las células plasmáticas en el cultivo de diferenciación de células B.
Las FIG. 15A-15E representan el efecto de (S)-3-[4- (4-morfolin-4-ilmetilbenciloxi)-1-oxo-1,3-dihidro-isoindo-2-il]piperidina-2,6-diona (20 nM) en la expresión del factor de transcripción de las células plasmáticas en los cultivos de células B del día 7.
La FIG. 16 representa el efecto de (S)-3-[4-(4-morfolin-4-ilmetilbenciloxi)-1 -oxo-1,3-dihidro-isoindo-2-il]piperidina-2,6-diona en la expresión de los factores de transcripción en las células plasmablásticas/plasmáticas CD38+ a partir de la diferenciación del PBMC del paciente con LES.
La FIG. 17 representa el efecto de (S)-3-[4-(4-morfolin-4-ilmetilbenciloxi)-1 -oxo-1,3-dihidro-isoindo-2-il]piperidina-2.6- diona (representado como compuesto I en la figura) en el IMF CD44 en el cultivo de diferenciación de células B del día 7.
La FIG. 18 representa el efecto de (S)-3-[4-(4-morfolin-4-ilmetilbenciloxi)-1 -oxo-1,3-dihidro-isoindo-2-il]piperidina-2.6- diona en las células CD20alta/CD44alta en el ensayo de diferenciación de células B normales del día 7.
La FIG. 19 representa el efecto de (S)-3-[4-(4-morfolin-4-ilmetilbenciloxi)-1-oxo-1,3-dihidro-isoindo-2-il]piperidina-2.6- diona (representado como compuesto I en la figura) en las células CD83+ y su expresión en el cultivo de diferenciación de células B del día 4 y del día 7.
La FIG. 20 representa el efecto de (S)-3-[4-(4-morfolin-4-ilmetilbenciloxi)-1 -oxo-1,3-dihidro-isoindo-2-il]piperidina-2.6- diona (representado como compuesto I en la figura) en la expresión de la cadena Ig J durante el cultivo de diferenciación de células B.
La FIG. 21 ilustra el efecto de 3-[4-(4-morfolin-4-ilmetilbenciloxi)-1 -oxo-1,3-dihidro-isoindo-2-il]piperidina-2,6-diona en la producción de ciertas citoquinas y quimioquinas en células T humanas estimuladas por anti CD3, expresada como cantidad absoluta producida.
La FIG. 22 ilustra el efecto de 3-[4-(4-morfolin-4-ilmetilbenciloxi)-1 -oxo-1,3-dihidro-isoindo-2-il]piperidina-2,6-diona en la producción de ciertas citoquinas y quimioquinas en células T humanas estimuladas por anti CD3, expresada como porcentaje de control.
La FIG. 23 ilustra el efecto de (R)-3-[4-(4-morfolin-4-ilmetilbenciloxi)-1-oxo-1,3-dihidro-isoindo-2-il]piperidina-2,6-diona en la producción de ciertas citoquinas y quimioquinas en células T humanas estimuladas por anti CD3, expresada como cantidad absoluta producida.
La FIG. 24 ilustra el efecto de (R)-3-[4-(4-morfolin-4-ilmetilbenciloxi)-1-oxo-1,3-dihidro-isoindo-2-il]piperidina-2,6-diona en la producción de ciertas citoquinas y quimioquinas en células T humanas estimuladas contra el CD3, expresada como porcentaje de control.
La FIG. 25 ilustra el efecto de (S)-3-[4-(4-morfolin-4-ilmetilbenciloxi)-1-oxo-1,3-dihidro-isoindo-2-il]piperidina-2,6-diona en la producción de ciertas citoquinas y quimioquinas en células T humanas estimuladas contra el CD3, expresada como cantidad absoluta producida.
La FIG. 26 ilustra el efecto de (S)-3-[4-(4-morfolin-4-ilmetilbenciloxi)-1-oxo-1,3-dihidro-isoindo-2-il]piperidina-2,6-diona en la producción de ciertas citoquinas y quimioquinas en células T humanas estimuladas por anti CD3, expresada como porcentaje de control.
La FIG. 27 ilustra la inhibición de la producción de ciertas citoquinas y quimioquinas en células mononucleares de sangre periférica estimuladas con lipopolisacárido por 3-[4-(4-morfolin-4-ilmetilbenciloxi)-1 -oxo-1,3-dihidro-isoindo-2-il]piperidina-2,6-diona.
La FIG. 28 ilustra la mejora de la producción de ciertas citoquinas y quimioquinas en células mononucleares de sangre periférica estimuladas con lipopolisacárido por 3-[4-(4-morfolin-4-ilmetilbenciloxi)-1 -oxo-1,3-dihidro-isoindo-2-il]piperidina-2,6-diona.
La FIG. 29 ilustra la inhibición de la producción de ciertas citoquinas y quimioquinas en células mononucleares de sangre periférica estimuladas con lipopolisacárido por (R)-3-[4-(4-morfolin-4-ilmetilbenciloxi)-1-oxo-1,3-dihidroisoindo-2-il]piperidina-2,6-diona.
La FIG. 30 ilustra la mejora de la producción de ciertas citoquinas y quimioquinas en células mononucleares de sangre periférica estimuladas con lipopolisacárido por (R)-3-[4-(4-morfolin-4-ilmetilbenciloxi)-1-oxo-1,3-dihidroisoindo-2-il]piperidina-2,6-diona.
La FIG. 31 ilustra la inhibición de la producción de ciertas citoquinas y quimioquinas en células mononucleares de sangre periférica estimuladas con lipopolisacárido por (S)-3-[4-(4-morfolin-4-ilmetilbenciloxi)-1-oxo-1,3-dihidroisoindo-2-il]piperidina-2,6-diona.
La FIG. 32 ilustra la mejora de la producción de ciertas citoquinas y quimioquinas en células mononucleares de sangre periférica estimuladas con lipopolisacárido por (S)-3-[4-(4-morfolin-4-ilmetilbenciloxi)-1-oxo-1,3-dihidroisoindo-2-il]piperidina-2,6-diona.
La FIG. 33 ilustra la mejora de la producción de IFN-gamma de células NK en respuesta a IgG e IL-2 inmovilizadas, expresadas como cantidad absoluta producida, por 3-[4-(4-morfolin-4-ilmetilbenciloxi)-1 -oxo-1,3- dihidro-isoindo-2-il]piperidina-2,6-diona.
La FIG. 34 ilustra la mejora de la producción de IFN-gamma de células NK en respuesta a IgG e IL-2 inmovilizadas, expresada como cantidad absoluta producida, por (R)-3-[4- (4-morfolin-4-ilmetilbenciloxi)-1-oxo-1,3-dihidroisoindo-2-il]piperidina-2,6-diona.
La FIG. 35 ilustra la mejora de la producción de IFN-gamma de células NK en respuesta a IgG e IL-2 inmovilizadas, expresadas como cantidad absoluta producida, por (S)-3-[4-(4-morfolin-4-ilmetilbenciloxi)-1-oxo-1,3- dihidroisoindo-2-il]piperidina-2,6-diona.
La FIG. 36 ilustra el aumento de la producción de IFN-gamma de las células NK en respuesta a la IgG y la IL-2 inmovilizadas, expresado como porcentaje de la cantidad de IFN-gamma producida en presencia de 1 pm de pomalidomida, por 3-[4-(4-morfolina-4-ilmetilbenziloxi)-1 -oxo-1,3-dihidro-isoindo-2-il]piperidina-2,6-diona.
La FIG. 37 ilustra la mejora de la producción de IFN-Gamma de células NK en respuesta a IgG e IL-2 inmovilizadas, expresada como porcentaje de la cantidad de IFN-gamma producida en presencia de pomalidomida de 1 pm, por (R) -3-[4-(4-morfolin-4-ilmetilbenciloxi)-1-oxo-1,3-dihidro-isoindo-2-il]piperidina-2,6-diona.
La FIG. 38 ilustra la mejora de la producción de IFN-Gamma de células NK en respuesta a IgG e IL-2 inmovilizadas, expresada como porcentaje de la cantidad de IFN-gamma producida en presencia de pomalidomida de 1 pm, por (S) -3-[4-(4-morfolin-4-ilmetilbenciloxi)-1-oxo-1,3-dihidro-isoindo-2-il]piperidina-2,6-diona.
La FIG. 39 representa el efecto de los compuestos proporcionados en esta invención sobre la proliferación de células endoteliales vasculares umbilicales humanas inducidas por factor de crecimiento.
La FIG. 40 representa el efecto de los compuestos proporcionados en esta invención sobre la formación del tubo de células endoteliales vasculares umbilicales humanas inducidas por factor de crecimiento.
La FIG. 41 representa el efecto de los compuestos proporcionados en esta invención sobre la invasión de células endoteliales vasculares umbilicales humanas inducidas por factor de crecimiento.
La FIG. 42 representa el efecto de (S)-3-[4-(4-morfolin-4-ilmetilbenciloxi)-1 -oxo-1,3-dihidro-isoindo-2-il]piperidina-2.6- diona sobre el grosor dérmico de la piel lesionada en el modelo de ratón con fibrosis dérmica inducida por bleomicina (prevención de la fibrosis impulsada por la inflamación).
La FIG. 43 muestra fotomicrografías de secciones de la piel teñida con hematoxilina y eosina que muestran el grosor dérmico de la piel lesionada en el modelo de ratón con fibrosis dérmica inducida por bleomicina (prevención de la fibrosis impulsada por la inflamación).
La FIG. 44 describe el efecto de la (S)-3-[4-(4-morfolina-4-ilmetilbenziloxi)-1 -oxo-1,3-dihidro-isoindo-2-il]piperidina-2.6- diona en el número de alfa-SMA miofibroblastos en la piel lesionada en el modelo de ratón con fibrosis dérmica inducida por bleomicina (prevención de la fibrosis impulsada por la inflamación).
La FIG. 45 representa el efecto de los compuestos probados en el grosor dérmico de la piel lesionada en el modelo de ratón con fibrosis dérmica inducida por bleomicina (regresión de la fibrosis establecida).
La FIG. 46 muestra fotomicrografías de secciones de la piel teñida con hematoxilina y eosina que muestran el grosor dérmico de la piel lesionada en el modelo de ratón con fibrosis dérmica inducida por bleomicina (regresión de la fibrosis establecida).
La FIG. 47 representa la reducción en el número de alfa-SMA miofibroblastos en la piel lesionada en el modelo de ratón con fibrosis dérmica inducida por bleomicina (regresión de la fibrosis establecida).
La FIG. 48A representa la reducción del grosor dérmico por (S)-3-[4- (4-morfolin-4-ilmetilbenciloxi)-1-oxo-1,3-dihidro-isoindo-2-il]piperidina-2,6-diona en ratones TSK-1.
La FIG. 48B representa la reducción de los contenidos relativos de hidroxiprolina por (S)-3-[4- (4-morfolin-4-ilmetilbenciloxi)-1 -oxo-1,3-dihidro-isoindo-2-il]piperidina-2,6-diona en ratones TSK-1.
La FIG. 49A representa la modulación de CTGF por (S)-3-[4- (4-morfolin-4-ilmetilbenciloxi)-1-oxo-1,3-dihidroisoindo-2-il]piperidina-2,6-diona.
La FIG. 49b representa la modulación de PAI-1 por (S)-3-[4- (4-morfolin-4-ilmetilbenciloxi)-1-oxo-1,3-dihidroisoindo-2-il]piperidina-2,6-diona.
La FIG. 49C representa la modulación de COL1A por (S)-3-[4- (4-morfolin-4-ilmetilbenciloxi)-1-oxo-1,3-dihidroisoindo-2-il]piperidina-2,6-diona.
La FIG. 49d representa la modulación de aSMA por (S)-3-[4- (4-morfolin-4-ilmetilbenciloxi)-1-oxo-1,3-dihidroisoindo-2-il]piperidina-2,6-diona.
La FIG. 49E representa la modulación de CCMP por (S)-3-[4- (4-morfolin-4-ilmetilbenciloxi)-1-oxo-1,3-dihidroisoindo-2-il]piperidina-2,6-diona.
La FIG. 49F representa la modulación de TGFB1 por (S)-3-[4- (4-morfolin-4-ilmetilbenciloxi)-1-oxo-1,3-dihidroisoindo-2-il]piperidina-2,6-diona.
La FIG. 50 representa la modulación de COL1, aSMA y FN por (S)-3-[4-(4-morfolin-4-ilmetilbenciloxi)-1-oxo-1,3-dihidro-isoindo-2-il]piperidina-2,6-diona.
La FIG. 51 representa la modulación de MMP1 y PAI por (S)-3-[4-(4-morfolin-4-ilmetilbenciloxi)-1-oxo-1,3-dihidroisoindo-2-il]piperidina-2,6-diona .
La FIG. 52 representa la modulación de Dnmt1 por (S)-3-[4- (4-morfolin-4-ilmetilbenciloxi)-1-oxo-1,3-dihidroisoindo-2-il]piperidina-2,6-diona.
La FIG. 53 representa el nivel de expresión de ARNm de cereblon en fibroblastos normales y SSc.
La FIG. 54 representa el nivel de expresión de ARNm de cereblon en tejidos cutáneos normales y SSc.
5. DESCRIPCIÓN DETALLADA
A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en esta invención tienen el mismo significado que comúnmente es entendido por un experto habitual en la materia. En el caso de que haya una pluralidad de definiciones para un término en esta invención, prevalecerán las de esta sección a menos que se indique lo contrario.
Como se usa en esta invención, y a menos que se indique lo contrario, los términos «tratar», «trato» y «tratamiento» se refieren a aliviar o reducir la gravedad de una enfermedad o un síntoma asociado con la enfermedad o afección que se está tratando.
Como se usa en esta invención, «prevenir», «prevención» y otras formas de la palabra incluyen la inhibición del inicio o la progresión de una enfermedad o trastorno o un síntoma de la enfermedad o trastorno particular. En algunas realizaciones, los sujetos con antecedentes familiares de cáncer son candidatos para regímenes preventivos. En general, en el contexto del cáncer, el término «prevención» se refiere a la administración del fármaco antes de la aparición de signos o síntomas de un cáncer, particularmente en sujetos con riesgo de cáncer.
Como se usa en esta invención, y a menos que se indique otra cosa, el término «control» abarca la prevención de la reaparición de la enfermedad o el trastorno concreto en un sujeto que lo haya padecido, alargando el tiempo que un sujeto que haya padecido la enfermedad o el trastorno permanece en remisión, la reducción de las tasas de mortalidad de los sujetos y/o el mantenimiento de una reducción de la gravedad o evitar un síntoma asociado a la enfermedad o el trastorno que se esté tratando.
Como se usa en esta invención, «sujeto» significa un animal, típicamente un mamífero, que incluye un ser humano. Como se usa en esta invención, «paciente» significa un sujeto humano.
Como se usa en esta invención, y a menos que se especifique lo contrario, los términos «cantidad terapéuticamente efectiva» y «cantidad efectiva» de un compuesto se refieren a una cantidad suficiente para proporcionar un beneficio terapéutico en el tratamiento, prevención y/o control de una enfermedad, para retrasar o minimizar uno o más síntomas asociados con la enfermedad o trastorno a tratar. Los términos «cantidad terapéuticamente efectiva» y «cantidad efectiva» pueden abarcar una cantidad que mejora la terapia global, reduce o evita síntomas o causas de enfermedad o trastorno o aumenta la eficacia terapéutica de otro agente terapéutico.
Como se usa en esta invención, y a menos que se especifique lo contrario, el término «cantidad profilácticamente efectiva» de un compuesto es una cantidad suficiente para prevenir una enfermedad o afección, o uno o más síntomas asociados con la enfermedad o afección, o prevenir su recurrencia. Una cantidad profilácticamente efectiva de un compuesto significa una cantidad de agente terapéutico, solo o combinado con otros agentes, que proporciona un beneficio profiláctico en la prevención de la enfermedad. El término «cantidad profilácticamente efectiva» puede abarcar una cantidad que mejora la profilaxis general o aumenta la eficacia profiláctica de otro agente profiláctico.
Como se usa en esta invención y, a menos que se indique lo contrario, el término «sal farmacéuticamente aceptable» incluye, pero no se limita a, una sal de un grupo ácido que puede estar presente en los compuestos proporcionados en esta invención. Bajo ciertas condiciones ácidas, el compuesto puede formar una amplia variedad de sales con diversos ácidos inorgánicos y orgánicos. Los ácidos que pueden usarse para preparar sales farmacéuticamente aceptables de tales compuestos básicos son aquellos que forman sales que comprenden aniones farmacológicamente aceptables que incluyen, pero no se limitan a, acetato, bencenosulfonato, benzoato, bicarbonato, bitartrato, bromuro, edetato de calcio, camsilato, carbonato, cloruro, bromuro, yoduro, citrato, diclorhidrato, edetato, edisilato, estolato, esilato, fumarato, gluceptato, gluconato, glutamato, glucolilarsanilato, hexilresorcinato, hidrabamina, hidroxinaftoato, isetionato, lactato, lactobionato, malato, maleato, maleato, maleato, maleato , metilsulfato, muscate, napsilato, nitrato, pantotenato, fosfato / difosfato, poligalacturonato, salicilato, estearato, succinato, sulfato, tanato, tartrato, teoclato, trietioduro y pamoato.
Como se usa en esta invención y, a menos que se indique lo contrario, el término «hidrato» significa un compuesto proporcionado en esta invención o una sal del mismo, incluyendo además una cantidad estequiométrica o no estequiométrica de agua unida por fuerzas intermoleculares no covalentes. Los hidratos pueden ser cristalinos o no cristalinos.
Como se usa en esta invención y, a menos que se indique lo contrario, el término «solvato» significa un solvato formado a partir de la asociación de una o más moléculas de disolvente al compuesto proporcionado en esta invención El término «solvato» incluye hidratos (por ejemplo, monohidrato, dihidrato, trihidrato, tetrahidrato y similares). Los solvatos pueden ser cristalinos o no cristalinos.
Como se usa en esta invención, y a menos que se especifique lo contrario, el término «estereoisómero» abarca todos los compuestos enantioméricamente/estereoméricamente puros y enantioméricamente/estereoméricamente enriquecidos proporcionados en esta invención.
Como se usa en esta invención, y a menos que se indique lo contrario, la expresión «estereoméricamente puro» o «enantioméricamente puro» significa que un compuesto comprende un estereoisómero y está sustancialmente libre de su contraestereoisómero o enantiómero. Por ejemplo, un compuesto es estereométricamente o enantiométricamente puro cuando contiene un 80 %, 90 % o 95 % o más de un estereoisómero y un 20 %, 10 % o 5 % o menos del estereoisómero contrario. En ciertos casos, un compuesto proporcionado en esta invención se considera ópticamente activo o estereoméricamente/enantioméricamente puro (es decir, sustancialmente la forma R o sustancialmente la forma S) con respecto a un centro quiral cuando el compuesto es aproximadamente 80 % ee (exceso enantiomérico) o mayor, preferiblemente, igual o mayor que 90 % ee con respecto a un centro quiral particular, y más preferiblemente 95 % ee con respecto a un centro quiral particular.
Como se usa en esta invención, y a menos que se indique lo contrario, el término «enriquecido estereoméricamente» o «enriquecido enantioméricamente» abarca mezclas racémicas, así como otras mezclas de estereoisómeros de compuestos proporcionados en esta invención (por ejemplo, R/S = 30/70, 35/65, 40/60, 45/55, 55/45, 60/40, 65/35 y 70/30).
Los términos «coadministración» y «en combinación con» incluyen la administración de dos o más agentes terapéuticos (por ejemplo, el compuesto I proporcionado en esta invención y otro modulador de la actividad leucocítica, que incluye la actividad de células B y/o células T, monocitos, macrófagos y otros tipos de células derivadas de linfoides o mieloides u otro agente activo) simultánea, concurrente o secuencialmente sin límites de tiempo específicos. En una realización, el compuesto I y al menos otro agente están presentes en la célula o en el cuerpo del sujeto al mismo tiempo o ejercen su efecto biológico o terapéutico al mismo tiempo. En una realización, los agentes terapéuticos están en la misma composición o forma de dosificación unitaria. En otra realización, los agentes terapéuticos están en composiciones separadas o formas de dosificación unitarias.
Una «célula B» es un linfocito que madura dentro de la médula ósea e incluye una célula B ingenua, una célula B de memoria o una célula B efectora (células plasmáticas). La célula B en esta invención puede ser una célula B normal o no maligna.
Una «célula T» es un linfocito que madura en el timo e incluye una célula T auxiliar, una célula T de memoria y una célula T citotóxica.
Como se usa en esta invención, «supervivencia general» se refiere al tiempo desde la aleatorización hasta la muerte por cualquier causa, y se mide en la población por intención de tratar. La supervivencia general puede evaluarse en estudios controlados aleatorios.
Como se usa en esta invención, «tasa de respuesta objetiva» se refiere a la proporción de pacientes con síntomas de esclerodermia predefinidos reducidos al final de un período de tiempo predefinido. La duración de la respuesta generalmente se mide desde el momento de la respuesta inicial hasta la progresión documentada de la esclerodermia.
Como se usa en esta invención, «tiempo de progresión» significa el tiempo desde la aleatorización hasta la progresión objetiva de la esclerodermia. En ciertas realizaciones, el tiempo de progresión no incluye muertes.
Como se usa en esta invención, «supervivencia libre de progresión» significa el tiempo desde la aleatorización hasta la progresión objetiva de la esclerodermia o la muerte.
Como se usa en esta invención, «tiempo hasta el fracaso del tratamiento» significa cualquier punto final que mida el tiempo desde la aleatorización hasta la interrupción del tratamiento por cualquier motivo, incluida la progresión de la enfermedad, la toxicidad del tratamiento y la muerte.
Como se usa en esta invención, «mortalidad» significa una medida del número de muertes en una población dada.
Como se usa en esta invención, «mortalidad respiratoria» significa pacientes que mueren de hipoxemia aguda u otro deterioro respiratorio específico que resulta en la muerte, como la necesidad de ventilación mecánica que conduce a la muerte, paro respiratorio o cualquier otro evento en un sujeto que se considera de naturaleza respiratoria.
Como se usa en esta invención, «hospitalización respiratoria» significa aquellos hospitalizados por deterioro en el estado pulmonar según lo documentado en las notas de ingreso al hospital del paciente u otra opinión médica.
Como se usa en esta invención, «puntuación de la piel de Rodnan modificada» significa un sistema de puntuación numérico validado para evaluar el grosor de la piel dérmica.
Como se usa en esta invención, «grosor de la piel» significa piel dura o endurecida que puede evaluarse usando una variedad de técnicas que incluyen durómetro y mRSS
Como se usa en esta invención, «induración de la piel» significa piel endurecida, roja, inflamada, engrosada o sensible.
Como se usa en esta invención, «índice de calidad de vida dermatológica» significa una evaluación de la calidad o vida relacionada con los síntomas de la piel para un paciente que tiene esclerodermia.
Como se usa en esta invención, «función pulmonar» significa cualquier medición de flujo espiratorio forzado, capacidad vital forzada, FEV 25-75 %, volúmenes pulmonares o capacidad vital.
Como se usa en esta invención, «capacidad de difusión de monóxido de carbono» significa una evaluación de la absorción de monóxido de carbono a través de la membrana alveolar-capilar. Puede ser un indicador de la capacidad de los pulmones para transferir oxígeno de los pulmones al torrente sanguíneo.
Como se usa en esta invención, «índice de disnea de Mahler» significa un instrumento que proporciona una medición clínica de la falta de aliento.
Como se usa en esta invención, «puntaje del cuestionario respiratorio de Saint George» significa un instrumento que mide la calidad de vida en pacientes con enfermedad pulmonar.
Como se usa en esta invención, «puntaje del consorcio del ensayo clínico de esclerodermia de UCLA en el tracto gastrointestinal» significa un cuestionario administrado a pacientes que tienen esclerodermia para evaluar los síntomas gastrointestinales asociados con la esclerodermia (esclerosis sistémica).
Como se usa en esta invención, «dilatación mediada por flujo» significa cualquier medición de la función endotelial vascular en un paciente que tiene esclerodermia.
Como se usa en esta invención, «distancia de caminata de seis minutos» significa cualquier evaluación de la distancia que un paciente con esclerodermia puede caminar dentro de los 6 minutos o cualquier procedimiento estandarizado para evaluar la capacidad de caminar durante un período fijo de tiempo o distancia.
Como se usa en esta invención, pomalidomida se refiere al siguiente compuesto:
Figure imgf000011_0001
5.1 COMPUESTO I
En ciertas realizaciones, el compuesto I para uso en los procedimientos proporcionados en esta invención, incluida la terapia de combinación, y en las composiciones descritas en esta invención es un compuesto de fórmula:
Figure imgf000011_0002
o una sal, solvato, hidrato, estereoisómero, tautómero o mezclas racémicas farmacéuticamente aceptables de los mismos.
En una realización, el compuesto es (S)-3-[4-(4-morfolin-4-ilmetil-benciloxi)-1-oxo-1,3-dihidro-isoindol-2-il]-piperidina-2,6-diona, que tiene la siguiente estructura:
o una sal, solvato, hidrato o tautómero farmacéuticamente aceptable del mismo;
En una realización, el compuesto es (S)-3-[4-(4-morfolin-4-ilmetil-benciloxi)-1-oxo-1,3-dihidro-isoindol-2-il]-piperidina-2,6-diona.
En una realización, el compuesto es una sal farmacéuticamente aceptable de (S)-3-[ 4-(4-morfolin-4-ilmetil-benciloxi)-1 -oxo-1,3-dihidro-isoindol-2-il]-piperidina-2,6-diona.
En una realización, el compuesto es (S)-3-[4-(4-morfolin-4-ilmetil-benciloxi)-1-oxo-1,3-dihidro-isoindol-2-il]-piperidina-2,6-diona clorhidrato.
En una realización, el compuesto es (fi)-3-[4-(4-morfolin-4-ilmetil-benciloxi)-1-oxo-1,3-dihidro-isoindol-2-il]-piperidina-2,6-diona, que tiene la siguiente estructura:
Figure imgf000012_0001
Compuesto IB
o una sal, solvato, hidrato o tautómero farmacéuticamente aceptable del mismo;
En una realización, el compuesto es (fi)-3-[4-(4-morfolin-4-ilmetil-benciloxi)-1-oxo-1,3-dihidro-isoindol-2-il]-piperidina-2,6-diona.
En una realización, el compuesto es una sal farmacéuticamente aceptable de (fi)-3-[4-(4-morfolin-4-ilmetil-benciloxi)-1 -oxo-1,3-dihidro-isoindol-2-il]-piperidina-2,6-diona.
En una realización, el compuesto se selecciona de 3-[4-(4-morfolin-4-ilmetil-benciloxi)-1 -oxo-1,3-dihidro-isoindol-2-il]-piperidina-2,6-diona, clorhidrato de 3-[4-(4-morfolin-4-ilmetilbenciloxi)-1-oxo-1,3-dihidro-isoindo-2-il]piperidina-2,6-diona, (R)-3-[4- (4-morfolin-4-ilmetilbenciloxi)-1-oxo-1,3-dihidro-isoindo-2-il]piperidina-2,6-diona, clorhidrato de (R)-3-[4- (4-morfolin-4-ilmetilbenciloxi)-1 -oxo-1,3-dihidro-isoindo-2-il]piperidina-2,6-diona, (S)-3-[4- (4-morfolin-4-ilmetilbenciloxi)-1 -oxo-1,3-dihidro-isoindo-2-il]piperidina-2,6-diona y clorhidrato de (S)-3-[4- (4-morfolin-4-ilmetilbenciloxi)-1-oxo-1,3-dihidro-isoindo-2-il]piperidina-2,6-diona.
El compuesto I o una sal, solvato, hidrato, estereoisómero, tautómero o mezclas racémicas farmacéuticamente aceptables de los mismos se pueden preparar por procedimientos conocidos por un experto en la técnica, por ejemplo, de acuerdo con el procedimiento descrito en la publicación de los Estados Unidos N. ° 2011/0196150.
Un procedimiento ejemplar para la preparación se describe en el Ejemplo 1.
5.2 COMPUESTO 1 PARA USO EN PROCEDIMIENTOS DE TRATAMIENTO
En esta invención se describe el compuesto 1 para su uso en procedimientos de tratamiento, prevención y/o control de enfermedades, trastornos y/o afecciones asociadas con enfermedades inmunitarias e inflamatorias que comprenden administrar una cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto I o una sal, solvato, hidrato, estereoisómero, tautómero o mezclas racémicas farmacéuticamente aceptables de los mismos a un paciente que lo necesite. En ciertas realizaciones, la enfermedad o trastorno se selecciona de entre lupus, esclerodermia, síndrome de Sjogren, vasculitis inducida por ANCA, síndrome antifosfolípido y miastenia grave. En ciertas realizaciones, la enfermedad es lupus o esclerodermia.
La sensibilidad del compuesto I o una sal, solvato, hidrato, estereoisómero, tautómero o mezclas racémicas farmacéuticamente aceptables de los mismos se puede estudiar en varios ensayos in vivo e in vitro, incluidos los modelos animales conocidos por los expertos en la materia para las enfermedades inmunitarias e inflamatorias que incluyen, pero no se limitan al modelo de ratón MRL/MpJ-Faslpr/J de lupus eritematoso sistémico, el modelo de ratón NZBWF1/J de lupus eritematoso sistémico, el modelo de fibrosis cutánea inducida por bleomicina y el modelo murino de ratón de piel tirante-1 (Tsk-1).
5.2.1 Tratamiento de la esclerodermia
En ciertas realizaciones, se proporciona en esta invención el compuesto 1 para uso en procedimientos de tratamiento, prevención y/o control de la esclerodermia o un síntoma del mismo, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva del compuesto I o una sal, solvato, hidrato, estereoisómero, tautómero o mezclas racémicas farmacéuticamente aceptables de los mismos a un paciente que tiene esclerodermia. En una realización, se proporciona en esta invención el compuesto 1 para uso en procedimientos de tratamiento, prevención y/o manejo de la esclerodermia o un síntoma del mismo, que comprende administrar una cantidad efectiva de (S)-3-[4- (4-morfolin-4-ilmetilbenciloxi)-1-oxo-1,3-dihidro-isoindo-2-il]piperidina-2,6-diona o una sal farmacéuticamente aceptables del mismo.
En ciertas realizaciones, en esta invención se proporciona el compuesto 1 para su uso en procedimientos de prevención de la esclerodermia o un síntoma de la misma, que comprende administrar una cantidad efectiva del compuesto I o una sal, solvato, hidrato, estereoisómero, tautómero o mezclas racémicas farmacéuticamente aceptables de los mismos a un paciente en riesgo de tener esclerodermia. En una realización, se proporciona en esta invención el compuesto 1 para uso en procedimientos de prevención de la esclerodermia o un síntoma del mismo, que comprende administrar una cantidad efectiva de (S)-3-[4- (4-morfolin-4-ilmetilbenciloxi)-1-oxo-1,3-dihidro-isoindo-2-il]piperidina-2,6-diona o una sal farmacéuticamente aceptables del mismo.
En ciertas realizaciones, la esclerodermia es esclerodermia localizada, sistémica, limitada o difusa.
En ciertas realizaciones, la esclerodermia sistémica comprende el síndrome de CREST (calcinosis, síndrome de Raynaud, disfunción esofágica o dismotilidad, esclerodactilia, telangiectasia). La esclerodermia también se conoce como esclerosis sistémica o esclerosis sistémica progresiva. En ciertas realizaciones, en esta invención se proporciona el compuesto 1 para uso en procedimientos de tratamiento o prevención de la enfermedad o el síndrome de Raynaud. En ciertas realizaciones, la esclerosis sistémica comprende enfermedad pulmonar por esclerodermia, crisis renal por esclerodermia, manifestaciones cardíacas, debilidad muscular (incluida la fatiga o CREST limitado), dismotilidad y espasmo gastrointestinal y anomalías en el sistema nervioso central, periférico y autónomo (incluido el síndrome del túnel carpiano acompañado de neuralgia del trigémino). También incluye la discapacidad general, incluida la depresión, y el impacto en la calidad de vida.
En ciertas realizaciones, la esclerodermia limitada se limita a las manos, la cara, el cuello o combinaciones de los mismos.
En ciertas realizaciones, la esclerodermia difusa comprende el estiramiento de la piel y también se produce por encima de las muñecas (o codos). En ciertas realizaciones, la esclerosis sistémica difusa es esclerodermia sinusoidal, que comprende fibrosis de órganos internos, pero sin estiramiento de la piel; o esclerosis sistémica progresiva familiar.
En una realización, la esclerodermia no está asociada con el desgaste, como el desgaste relacionado con la enfermedad.
También se describen en esta invención métodos para la reducción, inhibición o prevención de uno o más de los siguientes síntomas de esclerodermia: (i) endurecimiento, engrosamiento y estiramiento gradual de la piel (por ejemplo, en extremidades, como las manos, la cara y los pies); (ii) decoloración de la piel; (iii) entumecimiento de las extremidades; (iv) piel brillante; (v) pequeños bultos blancos debajo de la superficie de la piel que erupcionan en un líquido blanco calcáreo; (vi) disfunción esofágica de Raynaud (dolor, entumecimiento y / o cambios de color en las manos causados por el espasmo de los vasos sanguíneos al exponerse al frío o al estrés emocional); (vii) telangiectasia (manchas rojas en, por ejemplo, manos, palmas, antebrazos, cara y labios); (viii) dolor y / o rigidez de las articulaciones; (ix) hinchazón de las manos y pies; (x) picazón de la piel; (xi) rigidez y curvatura de los dedos; (xii) úlceras (llagas) en el exterior de ciertas articulaciones, como nudillos y codos; (xiii) problemas digestivos, como acidez estomacal, dificultad para tragar, diarrea, intestino irritable y estreñimiento; (xiv) fatiga y debilidad; (xv) dificultad para respirar; (xvi) artritis; (xvii) pérdida de cabello; (xviii) problemas de órganos internos; (xix) úlceras digitales; o (xx) autoamputación digital, que comprende administrar una cantidad efectiva de compuesto I a un paciente que lo necesite.
Sin limitarse a ninguna teoría en particular, se cree que el compuesto I o una sal, solvato, hidrato, estereoisómero, tautómero o mezclas racémicas farmacéuticamente aceptables de los mismos mejora la respuesta inmune Th1 y suprime la respuesta inmune Th2, lo que puede provocar efectos antifibróticos en la piel
Además, se describen en esta invención procedimientos para mejorar o reducir el grosor de la piel de un paciente que tiene esclerodermia, que comprende administrar una cantidad efectiva del compuesto I o una sal, solvato, hidrato, estereoisómero, tautómero o mezclas racémicas farmacéuticamente aceptables de los mismos. Por ejemplo, el grosor de la piel se reduce en aproximadamente un 20 %, aproximadamente un 25 %, aproximadamente un 30 %, aproximadamente un 40 %, aproximadamente un 50 %, aproximadamente un 60 %, aproximadamente un 70 %, aproximadamente un 80 %, aproximadamente un 90 % o más.
Además, se describen en esta invención procedimientos para lograr uno o más puntos finales clínicos asociados con la esclerodermia que comprenden administrar una cantidad efectiva del compuesto I o una sal, solvato, hidrato, estereoisómero, tautómero o mezclas racémicas farmacéuticamente aceptables de los mismos a un paciente que lo necesite.
Además, se describen en esta invención procedimientos para aumentar la supervivencia general, la tasa de respuesta objetiva, el tiempo de progresión, la supervivencia libre de progresión y/o el tiempo hasta el fracaso del tratamiento de un paciente con esclerodermia que comprende administrar una cantidad efectiva del compuesto I o una sal, solvato, hidrato, estereoisómero, tautómero o mezclas racémicas farmacéuticamente aceptables de los mismos para el paciente.
Además, se describen en esta invención procedimientos para disminuir la mortalidad, la mortalidad respiratoria y/o la hospitalización respiratoria de un paciente que tiene esclerodermia, que comprende administrar una cantidad efectiva del compuesto I o una sal, solvato, hidrato, estereoisómero, tautómero o mezclas racémicas farmacéuticamente aceptables de los mismos al paciente.
Además, se describen en esta invención procedimientos para mejorar la puntuación de la piel de Rodnan modificada de un paciente que tiene esclerodermia, que comprende administrar una cantidad efectiva del compuesto I o una sal, solvato, hidrato, estereoisómero, tautómero o mezclas racémicas farmacéuticamente aceptables de los mismos al paciente. Por ejemplo, la mejora en la puntuación de la piel de Rodnan modificada es de 5, 10, 15 o 20 puntos o más.
Además, se describen en esta invención procedimientos para mejorar o reducir el grosor de la piel de un paciente que tiene esclerodermia, que comprende administrar una cantidad efectiva del compuesto I o una sal, solvato, hidrato, estereoisómero, tautómero o mezclas racémicas farmacéuticamente aceptables de los mismos. Por ejemplo, el grosor de la piel se reduce en aproximadamente un 20 %, aproximadamente un 25 %, aproximadamente un 30 %, aproximadamente un 40 %, aproximadamente un 50 %, aproximadamente un 60 %, aproximadamente un 70 %, aproximadamente un 80 %, aproximadamente un 90 % o más.
Además, se describen en esta invención procedimientos para mejorar o reducir la induración de la piel de un paciente que tiene esclerodermia, que comprende administrar una cantidad efectiva del compuesto I o una sal, solvato, hidrato, estereoisómero, tautómero o mezclas racémicas farmacéuticamente aceptables de los mismos al paciente.
Además, se describen en esta invención procedimientos para mejorar el índice de calidad de vida dermatológica de un paciente que tiene esclerodermia, que comprende administrar una cantidad efectiva del compuesto I o una sal, solvato, hidrato, estereoisómero, tautómero o mezclas racémicas farmacéuticamente aceptables de los mismos al paciente.
Además, se describen en esta invención procedimientos para mejorar la función pulmonar de un paciente que tiene esclerodermia, que comprende administrar una cantidad efectiva del compuesto I o una sal, solvato, hidrato, estereoisómero, tautómero o mezclas racémicas farmacéuticamente aceptables de los mismos al paciente.
Además, se describen en esta invención procedimientos para mejorar la capacidad de difusión de monóxido de carbono de un paciente que tiene esclerodermia, que comprende administrar una cantidad efectiva del compuesto I o una sal, solvato, hidrato, estereoisómero, tautómero o mezclas racémicas farmacéuticamente aceptables de los mismos al paciente. Por ejemplo, la capacidad de difusión de monóxido de carbono de un paciente se mejora mediante una mejora en la capacidad de difusión del pulmón para el monóxido de carbono (Dlco) de aproximadamente el 10 %, aproximadamente el 20 %, aproximadamente el 25 %, aproximadamente el 30 %, aproximadamente el 40 % aproximadamente el 50 %, aproximadamente el 60 %, aproximadamente el 70 % aproximadamente el 80 %, aproximadamente el 90 % o más.
Además, se describen en esta invención procedimientos para mejorar el índice de disnea de Mahler de un paciente que tiene esclerodermia, que comprende administrar una cantidad efectiva del compuesto I o una sal, solvato, hidrato, estereoisómero, tautómero o mezclas racémicas farmacéuticamente aceptables de los mismos al paciente. Por ejemplo, la mejora en el índice de disnea de Mahler es de 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 puntos o más.
Además, se describen en esta invención procedimientos para mejorar la puntuación del Cuestionario respiratorio de Saint George de un paciente con esclerodermia que comprende administrar una cantidad efectiva del compuesto I o una sal, solvato, hidrato, estereoisómero, tautómero o mezclas racémicas farmacéuticamente aceptables de los mismos al paciente. Por ejemplo, la mejora en la puntuación del Cuestionario respiratorio de Saint George es 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52 puntos o más.
Además, se describen en esta invención procedimientos para mejorar la puntuación del tracto gastrointestinal del consorcio de ensayos clínicos de esclerodermia de UCLA de un paciente que tiene esclerodermia, que comprende administrar una cantidad efectiva del compuesto I o una sal, solvato, hidrato, estereoisómero, tautómero o mezclas racémicas farmacéuticamente aceptables de los mismos al paciente.
Además, se proporciona en esta invención el compuesto 1 para su uso en procedimientos para tratar o prevenir la úlcera digital de un paciente o población de pacientes que tiene esclerodermia, que comprende administrar una cantidad efectiva del compuesto I o una sal, solvato, hidrato, estereoisómero, tautómero o mezclas racémicas farmacéuticamente aceptables de los mismos al paciente.
Además, se proporciona en esta invención el compuesto 1 para uso en procedimientos que mejoran la dilatación mediada por flujo de un paciente que tiene esclerodermia, que comprende administrar una cantidad efectiva del compuesto I o una sal, solvato, hidrato, estereoisómero, tautómero o mezclas racémicas farmacéuticamente aceptables de los mismos al paciente.
Además, se describen en esta invención procedimientos que mejoran o aumentan la distancia de caminata de seis minutos de un paciente que tiene esclerodermia, que comprende administrar una cantidad efectiva del compuesto I o una sal, solvato, hidrato, estereoisómero, tautómero o mezclas racémicas farmacéuticamente aceptables de los mismos al paciente. Por ejemplo, la mejora en la distancia de caminata de seis minutos es de aproximadamente 200 metros, aproximadamente 250 metros, aproximadamente 300 metros, aproximadamente 350 metros, aproximadamente 400 metros o más.
5.2.2 Tratamiento del lupus eritematoso
En ciertas realizaciones, se proporciona en esta invención el compuesto 1 para su uso en procedimientos de tratamiento, prevención y/o control del lupus eritematoso o un síntoma del mismo, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva del compuesto I o una sal, solvato, hidrato, estereoisómero, tautómero o mezclas racémicas farmacéuticamente aceptables de los mismos a un paciente con lupus eritematoso. En una realización, se proporciona en esta invención el compuesto 1 para uso en procedimientos de tratamiento, prevención y/o control del lupus eritematoso o un síntoma del mismo, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de (S)-3-[4- (4-morfolin-4-ilmetilbenciloxi)-1-oxo-1,3-dihidro-isoindo-2-il]piperidina-2,6-diona o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para un paciente que tiene lupus eritematoso.
En una realización, se proporciona en esta invención el compuesto 1 para uso en procedimientos para prevenir el lupus eritematoso o un síntoma del mismo, que comprende administrar una cantidad efectiva del compuesto I o una sal, solvato, hidrato, estereoisómero, tautómero o mezclas racémicas farmacéuticamente aceptables de los mismos a un paciente en riesgo de tener lupus eritematoso. En una realización, se proporciona en esta invención el compuesto 1 para uso en procedimientos para prevenir el lupus eritematoso o un síntoma del mismo, que comprende administrar una cantidad efectiva de (S)-3-[4- (4-morfolin-4-ilmetilbenciloxi)-1-oxo-1,3-dihidro-isoindo-2-il]piperidina-2,6-diona o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para un paciente en riesgo de tener lupus eritematoso.
En ciertas realizaciones, se proporciona en esta invención el compuesto 1 para uso en procedimientos para tratar, prevenir y/o controlar el lupus eritematoso sistémico (LES), el lupus eritematoso cutáneo (CLE) o el lupus inducido por fármacos.
La frase «lupus eritematoso sistémico» se usa indistintamente en esta invención con LES y lupus y se refiere a todas las manifestaciones de la enfermedad como se conoce en la técnica (incluidas remisiones y brotes). En el LES, la hiperactividad anormal de los linfocitos B y la producción masiva anormal de autoanticuerpos gamma (IgG) de inmunoglobulina desempeñan un papel clave. Este proceso patológico trae como resultado la captura y la destrucción de células recubiertas con Ig, la fijación y la escisión de las proteínas del complemento y la liberación de quimiotaxinas, péptidos vasoactivos y enzimas destructivas en los tejidos (Hahn BH. Systemic Lupus Erythematosus. En: Kasper DL, Braunwald E, Fauci AS, Hauser SL, Longo DL, Jameson, JL, editors. En: Harrison's Principies of Internal Medicine (16th edition). New York (US): McGraw-Hill; 2005. pp.1960-1967).
Los síntomas del LES varían de persona a persona y pueden aparecer y desaparecer. En la mayoría de los pacientes, los síntomas incluyen dolor e hinchazón de las articulaciones. Las articulaciones frecuentemente afectadas son los dedos, las manos, las muñecas y las rodillas. Algunos pacientes desarrollan artritis. Otros síntomas comunes incluyen: dolor en el pecho al respirar profundamente, fatiga, fiebre sin otra causa, molestia generalizada, malestar o sensación de malestar (indisposición), pérdida de cabello, llagas en la boca, ganglios linfáticos inflamados, sensibilidad a la luz solar, erupción cutánea: una erupción "mariposa" sobre las mejillas y el puente de la nariz afecta a aproximadamente la mitad de las personas con LES; en algunos pacientes, la erupción empeora con la luz solar y la erupción también puede estar muy extendida.
Otros síntomas dependen de la parte del cuerpo afectada y pueden incluir los siguientes:
Cerebro y sistema nervioso: dolores de cabeza, entumecimiento, hormigueo, convulsiones, problemas de visión, cambios de personalidad,
Tracto digestivo: dolor abdominal, náuseas y vómitos,
Corazón: ritmos cardíacos anormales (arritmias),
Pulmón: tos con sangre y dificultad para respirar, y
Piel: color de piel con parches, dedos que cambian de color cuando hace frío (fenómeno de Raynaud).
Algunos pacientes solo tienen síntomas en la piel. Esto se llama lupus discoide.
En una realización, se proporciona en esta invención el compuesto 1 para uso en procedimientos de tratamiento de LES moderado, severo o muy severo. El término «LES grave», como se usa en esta invención, se refiere a una condición de LES en la que el paciente tiene uno o más síntomas graves o potencialmente mortales (como anemia hemolítica, compromiso extenso de corazón o pulmón, enfermedad renal o compromiso del sistema nervioso central).
Además, se describen en esta invención procedimientos para lograr uno o más puntos finales clínicos asociados con LES que comprenden administrar una cantidad efectiva del compuesto I o una sal, solvato, hidrato, estereoisómero, tautómero o mezclas racémicas farmacéuticamente aceptables de los mismos a un paciente que lo necesite.
Además, se describen en esta invención procedimientos para aumentar la supervivencia general, la tasa de respuesta objetiva, el tiempo hasta la progresión, la supervivencia libre de progresión y/o el fracaso del tiempo hasta el tratamiento de un paciente con LES que comprende administrar una cantidad eficaz del compuesto I o una sal, solvato, hidrato, estereoisómero, tautómero o mezclas racémicas farmacéuticamente aceptables de los mismos para el paciente.
En cierta realización, el compuesto I o una sal, solvato, hidrato, estereoisómero, tautómero o mezclas racémicas farmacéuticamente aceptables de los mismos actúa como un inhibidor de la diferenciación de células B CD19+ de memoria humana primaria en relación con la etapa de plasmablastos. Sin estar ligado a ninguna teoría particular, se cree que el compuesto I o una sal, solvato, hidrato, estereoisómero, tautómero o mezclas racémicas farmacéuticamente aceptables de los mismos bloquea las células en una etapa prematura, lo que reduce el número de plasmablastos que son capaces de producir altos niveles de inmunoglobulina. Una consecuencia funcional de este efecto es la reducción de la producción de inmunoglobulina G (IgG) e inmunoglobulina M (IgM) en estos cultivos de diferenciación.
En ciertas realizaciones, el compuesto I o una sal, solvato, hidrato, estereoisómero, tautómero o mezclas racémicas farmacéuticamente aceptables de los mismos inhibe la capacidad de las células B CD19+ de memoria humana primaria para diferenciarse de la etapa de plasmablastos. En ciertas realizaciones, el compuesto I o una sal, solvato, hidrato, estereoisómero, tautómero o mezclas racémicas farmacéuticamente aceptables de los mismos no tiene un efecto significativo sobre las células plasmáticas CD138+ maduras en cultivos a corto plazo. En ciertas realizaciones, el compuesto I o una sal, solvato, hidrato, estereoisómero, tautómero o mezclas racémicas farmacéuticamente aceptables de los mismos inhibe los factores de diferenciación de las células B, incluido el factor regulador de interferón 4 (IRF4), la proteína de maduración inducida por linfocitos (BLIMP), la proteína 1 X-box (XBP-1) y el linfoma de células B 6 (Bcl6).
5.2.3 Tratamiento de otras enfermedades o trastornos inmunitarios
Además, se describen en esta invención procedimientos para tratar, controlar o prevenir otras enfermedades o afecciones inmunitarias usando el compuesto I o una sal, solvato, hidrato, estereoisómero, tautómero o mezclas racémicas farmacéuticamente aceptables de los mismos. Por ejemplo, en esta invención se proporcionan procedimientos para tratar, controlar o prevenir otras enfermedades o afecciones inmunitarias utilizando (S)-3-[4-(4-morfolin-4-ilmetilbenciloxi)-1-oxo-1,3-dihidro-isoindo-2-il]piperidina-2,6-diona o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. Por ejemplo, se describe en esta invención un procedimiento para tratar a un individuo que tiene una enfermedad o trastorno, donde la enfermedad o trastorno es causado por, o está asociado con, una respuesta inmune inapropiada o indeseable, p.ej, una enfermedad, trastorno o afección que puede tratarse beneficiosamente por inmunosupresión, que comprende administrar al compuesto I o una sal, solvato, hidrato, estereoisómero, tautómero o mezclas racémicas farmacéuticamente aceptables de los mismos. Por ejemplo, se describe en esta invención un procedimiento para tratar a un individuo que tiene una enfermedad o trastorno, donde la enfermedad o trastorno es causado por, o está asociado con, una respuesta del sistema inmunológico inapropiada o no deseada, por ejemplo, una enfermedad, trastorno o afección que puede tratarse de manera beneficiosa mediante inmunosupresión, que comprende administrar al individuo (S)-3-[4-(4-morfolin-4-ilmetilbenciloxi)-1 -oxo-1,3-dihidro-isoindo-2-il]piperidina-2,6-diona o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
En diversas realizaciones específicas, se proporciona en esta invención el compuesto 1 para uso en procedimientos para tratar, prevenir o controlar una enfermedad inmunitaria seleccionada del síndrome de Sjogren, vasculitis inducida por ANCA, síndrome antifosfolípido y miastenia grave. También se describen en esta invención otras enfermedades inmunitarias como espondilitis, síndrome de anticuerpo antifosfolipídico, síndrome antifosfolipídico (primario o secundario), asma, gastritis autoinmune, anemia hemolítica autoinmune, hepatitis autoinmune, enfermedad autoinmune del oído interno, enfermedad linfoproliferativa autoinmune, púrpura trombocitopénica autoinmune, enfermedad de Balo, enfermedad de Behcet, penfigoide bulloso, cardiomiopatía, enfermedad celíaca, enfermedad de Chagas, polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica, penfigoide cicatricial (por ejemplo, penfigoide de membrana mucosa), enfermedad de la aglutinina fría, enfermedad de Degos, dermatitis hepatiforme, crioglobulinemia mixta esencial, síndrome de Goodpasture, enfermedad de Graves, síndrome de Guillain-Barré, tiroiditis de Hashimoto (enfermedad de Hashimoto; tiroiditis autoinmune), fibrosis pulmonar idiopática, púrpura trombocitopénica idiopática, nefropatía por IgA, artritis juvenil, liquen plano, enfermedad de Méniere, enfermedad de tejido conectivo mixto, morfea, narcolepsia, neuromiotonía, trastornos neuropsiquiátricos autoinmunes pediátricos (PANDA), pénfigo vulgar, anemia perniciosa, poliarteritis nodosa, policondritis, polimialgia reumática, agammaglobulinemia primaria, cirrosis biliar primaria, enfermedad de Raynaud (fenómeno de Raynaud), síndrome de Reiter, policondritis recidivante, fiebre reumática, síndrome de la persona rígida (síndrome de Moersch-Woltmann), arteritis de Takayasu, arteritis temporal (arteritis de células gigantes), uveítis, vasculitis (por ejemplo, vasculitis no asociada con lupus eritematoso), vitiligo y/o granulomatosis de Wegener.
5.2.4 Tratamiento para pacientes con insuficiencia renal
También se describen en esta invención procedimientos para tratar, prevenir y/o controlar una enfermedad proporcionada en esta invención en pacientes con insuficiencia renal. También se describen en esta invención procedimientos para proporcionar ajustes de dosis apropiados para pacientes con insuficiencia renal debido, entre otros, a enfermedades, envejecimiento u otros factores del paciente.
También se describen en esta invención procedimientos para tratar, prevenir y/o controlar una enfermedad proporcionada en esta invención, o un síntoma de la misma, en pacientes con insuficiencia renal que comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto proporcionado en esta invención al paciente con insuficiencia renal. También se describen en esta invención procedimientos para tratar, prevenir y/o controlar la enfermedad reincidente, o un síntoma de la misma, en pacientes con insuficiencia renal que comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de (S)-3-(4-((4-morfolinometil) bencil) oxi)-1 -oxoisoindolin-2-il) piperidina-2,6-diona o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo a un paciente con enfermedad reincidente con insuficiencia renal.
También se describen en esta invención procedimientos para prevenir una recaída en pacientes con insuficiencia renal, que comprenden administrar una cantidad efectiva de un compuesto proporcionado en esta invención a un paciente con insuficiencia renal con riesgo de sufrir una recaída. También se describen en esta invención procedimientos para prevenir una recaída en pacientes con insuficiencia renal, que comprenden administrar una cantidad efectiva de (S)-3-(4-((4-morfolinometil) bencil)oxi)-1-oxoisoindolin-2-il)piperidina-2,6-diona o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, a un paciente con insuficiencia renal con riesgo de recaída.
Como se describe en esta invención, cuando se trata a un paciente con insuficiencia renal, es necesario administrar al paciente con insuficiencia renal una dosis del compuesto inferior a la dosis administrada a un paciente normal (p.ej, un paciente sin insuficiencia renal) debido a la disminución de la capacidad del paciente con insuficiencia renal para eliminar la pomalidomida o sus metabolitos. Por lo tanto, también se describe en esta invención un procedimiento para tratar a un paciente con insuficiencia renal con una dosis de un compuesto proporcionado en esta invención inferior a la dosis administrada a un paciente normal.
Por ejemplo, una cantidad terapéuticamente o profilácticamente efectiva del compuesto es de aproximadamente 0,005 a aproximadamente 1,000 mg por día, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 500 mg por día, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 250 mg por día, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 100 mg por día, de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 100 mg por día, de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 100 mg por día, de aproximadamente 1 a aproximadamente 100 mg por día, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 50 mg por día, de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 50 mg por día, de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 50 mg por día, de aproximadamente 1 a aproximadamente 50 mg por día, de aproximadamente 0,02 a aproximadamente 25 mg por día o de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 10 mg por día.
5.3 DOSIFICACIONES Y CANTIDADES DE DOSIFICACIÓN
La dosis del compuesto I o una sal, solvato, hidrato, estereoisómero, tautómero o mezclas racémicas farmacéuticamente aceptables de los mismos para administrar a un paciente es bastante variable y puede estar sujeta a la opinión de un profesional de la salud. Las dosis del compuesto I o una sal, solvato, hidrato, estereoisómero, tautómero o mezclas racémicas farmacéuticamente aceptables de los mismos varían dependiendo de factores tales como: indicación específica a tratar, prevenir o controlar; edad y condición de un paciente; y la cantidad de segundo agente activo utilizado, si lo hay. En general, el compuesto I o una sal, solvato, hidrato, estereoisómero, tautómero o mezclas racémicas farmacéuticamente aceptables de los mismos se pueden administrar de una a cuatro o más veces al día en una dosis de aproximadamente 0,005 mg/kg del peso corporal de un paciente a aproximadamente 10 mg/kg del peso corporal de un paciente, pero la dosificación anterior puede variar adecuadamente dependiendo de la edad, el peso corporal y la afección médica del paciente y el tipo de administración. En una realización, la dosis es aproximadamente 0,01 mg/kg del peso corporal de un paciente a aproximadamente 5 mg/kg del peso corporal de un paciente , aproximadamente 0,05 mg/kg del peso corporal de un paciente a aproximadamente 1 mg/kg del peso corporal de un paciente , aproximadamente 0,1 mg/kg del peso corporal de un paciente a aproximadamente 0,75 mg/kg del peso corporal de un paciente o aproximadamente 0,25 mg/kg del peso corporal de un paciente a aproximadamente 0,5 mg/kg del peso corporal de un paciente.
En una realización, se administra una dosis por día. En cualquier caso, la cantidad administrada del compuesto I o una sal, solvato, hidrato, estereoisómero, tautómero o mezclas racémicas farmacéuticamente aceptables de los mismos dependerá de factores tales como la solubilidad del componente activo, la formulación utilizada y la vía de administración. En una realización, la aplicación de una concentración tópica proporciona exposiciones intracelulares o concentraciones de aproximadamente 0,01 - 10 pM.
En ciertas realizaciones, el compuesto I o una sal, solvato, hidrato, estereoisómero, tautómero o mezclas racémicas farmacéuticamente aceptables de los mismos se usa en una cantidad de aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 1000 mg por día, y se puede ajustar de manera convencional (p.ej, la misma cantidad administrada cada día del período de tratamiento, prevención o control), en ciclos (p.ej, una semana sí, una semana no), o en una cantidad que aumente o disminuya en el transcurso del tratamiento, prevención o control. En otras realizaciones, la dosis puede ser de entre aproximadamente 1 mg y aproximadamente 300 mg, entre aproximadamente 0,1 mg y aproximadamente 150 mg, entre aproximadamente 1 mg y aproximadamente 200 mg, entre aproximadamente 10 mg y aproximadamente 100 mg, entre aproximadamente 0,1 mg y aproximadamente 50 mg, entre aproximadamente 1 mg y aproximadamente 50 mg, entre aproximadamente 10 mg y aproximadamente 50 mg, entre aproximadamente 20 mg y aproximadamente 30 mg o entre aproximadamente 1 mg y aproximadamente 20 mg. En otras realizaciones, la dosis puede ser de aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 100 mg, de aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 50 mg, de aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 25 mg, de aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 20 mg, de aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 15 mg, de aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 10 mg, de aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 7,5 mg, de aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 5 mg, de aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 4 mg, de aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 3 mg, de aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 2 mg, o de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 1 mg.
5.4 TERAPIA DE COMBINACIÓN
El compuesto I o una sal, solvato, hidrato, estereoisómero, tautómero o mezclas racémicas farmacéuticamente aceptables de los mismos se puede combinar con otros compuestos farmacológicamente activos («segundos agentes activos») en los procedimientos y composiciones proporcionados en esta invención. Ciertas combinaciones pueden actuar de forma sinérgica en el tratamiento de enfermedades o trastornos de tipos particulares, y afecciones y síntomas asociados con dichas enfermedades o trastornos. El compuesto I o una sal, solvato, hidrato, estereoisómero, tautómero o mezclas racémicas farmacéuticamente aceptables de los mismos también puede funcionar para aliviar los efectos adversos asociados con ciertos segundos agentes activos, y viceversa.
Uno o más segundos ingredientes o agentes activos se pueden utilizar en los procedimientos y las composiciones provistos en esta invención. Los segundos agentes activos pueden ser moléculas grandes (por ejemplo, proteínas) o moléculas pequeñas (por ejemplo, moléculas inorgánicas sintéticas, organometálicas u orgánicas).
En otra realización, el procedimiento de tratamiento proporcionado en esta invención comprende la administración de un segundo agente terapéutico, donde el segundo agente terapéutico es un fármaco antiinflamatorio, p.ej., un medicamento antiinflamatorio esteroideo, o un medicamento antiinflamatorio no esteroideo (AINE), acetaminofeno, naproxeno, ibuprofeno, ácido acetilsalicílico y similares. En una realización más específica en la que se administra un AINE, un inhibidor de la bomba de protones (PPI), por ejemplo, omeprazol también puede administrarse. En una realización, el agente antiinflamatorio es un corticosteroide. En otra realización, el agente antiinflamatorio es colchicina.
En otra realización, el segundo agente terapéutico es un compuesto inmunomodulador o un compuesto inmunosupresor como azatioprina (Imuran ™ , Azasan ™ ), metotrexato (Rheumatrex ™ , Trexall ™ ), penicilamina (Depen ™ , Cuprimine ™ ), ciclofosfamida (Cytoxan ™ ) , micofenolato (CellCept ™ , Myfortic ™ ), bosentán (Tracleer®), prednisona (Deltasone ™ , Liquid Pred ™ ) y un inhibidor de PDE5. En otra realización, donde el individuo afectado tiene ulceraciones digitales e hipertensión pulmonar, se puede administrar un vasodilatador tal como prostaciclina (iloprost).
En otra realización, el segundo agente terapéutico es un inhibidor de HDAC, tal como romidepsina, vorinostat, panobinostat, ácido valproico o belinostat; o un agente biológico, como una interleucina, un anticuerpo monoclonal inmunomodulador o el bacilo Calmette-Guérin (BCG).
En otra realización, el segundo agente terapéutico es un inhibidor de los receptores ActRII o un inhibidor de activina-ActRII. Los inhibidores de los receptores ActRII incluyen inhibidores de ActRIIA e inhibidores de ActRIIB. Los inhibidores de los receptores ActRII pueden ser polipéptidos que comprenden dominios de unión a activina de ActRII. En ciertas realizaciones, el dominio de unión a activina que comprende polipéptidos está unido a una porción Fc de un anticuerpo (es decir., se genera un conjugado que comprende un dominio de unión a activina que comprende el polipéptido de un receptor ActRII y una porción Fc de un anticuerpo). En ciertas realizaciones, el dominio de unión a activina está conectado a una porción Fc de un anticuerpo a través de un conector, por ejemplo, un conector peptídico.
Un polipéptido de ActRIIA de unión a activina ejemplar fusionado a un dominio Fc humano se proporciona en SEQ ID NO: 1.
SEQ ID NO:l
ILGRSETQECLFFNANWEKDRTNQTGVEPCYGDKDKRRHCFATWKNISGS
IEIVKQGCWLDDINCYDRTDCVEKKDSPEVYFCCCEGNMCNEKFSYFPEM
EVTQPTSNPVTPKPPTGGGTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMI
SRTPEVTC VVVDV SHEDPEVKFNWYYDGVEVHNAKTKPREEQYN STYRVV
SVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPVPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPP
SREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGS
FFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
En la SEQ ID NO: 2 se proporciona una proteína de fusión ejemplar que comprende un dominio extracelular soluble de ActRIIB fusionado a un dominio Fc.
SEQ ID NO:2
ETRECIY YN AN WELERTN Q S GLERCEGEQDKRLHC Y AS WRN S S GTIEL VK
KGCWDDDFNCYDRQECVATEENPQVYFCCCEGNFCNERFTHLPEAGGPEV
TYEPPPTGGGTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCV
VVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQD
WLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQ
VSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV
DKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
Otros ejemplos de proteínas no anticuerpo seleccionadas para la unión a activina o ActRIIA y procedimientos para el diseño y la selección de las mismas se encuentran en los documentos WO/2002/088171, WO/2006/055689, WO/2002/032925, WO/2005/037989, US 2003/0133939y US 2005/0238646.
En una realización, el inhibidor de los receptores ActRII es ACE-11. En otra realización, el inhibidor de los receptores ActRII es ACE-536.
Se puede administrar cualquier combinación de los agentes terapéuticos anteriores, adecuados para el tratamiento de las enfermedades o síntomas de las mismas. Dichos agentes terapéuticos pueden administrarse en cualquier combinación con el compuesto I o una sal, solvato, hidrato, estereoisómero, tautómero o mezclas racémicas farmacéuticamente aceptables de los mismos, al mismo tiempo o como un tratamiento separado.
5.5 TERAPIA CÍCLICA
En ciertas realizaciones, el compuesto I o una sal, solvato, hidrato, estereoisómero, tautómero o mezclas racémicas farmacéuticamente aceptables de los mismos proporcionados en esta invención se administra cíclicamente a un paciente. La terapia cíclica implica la administración de un agente activo durante un período de tiempo, seguido de un descanso (es decir, la interrupción de la administración) durante un período de tiempo, y la repetición de esta administración secuencial. La terapia cíclica puede reducir el desarrollo de resistencia a una o más de las terapias, evitar o reducir los efectos secundarios de una de las terapias y/o mejorar la eficacia del tratamiento.
Por consiguiente, en una realización, un compuesto proporcionado en esta invención se administra diariamente en una dosis única o dividida en un ciclo de cuatro a seis semanas con un período de descanso de aproximadamente una semana o dos semanas. La terapia cíclica permite además aumentar la frecuencia, el número y la duración de los ciclos de dosificación. Por lo tanto, otra realización abarca la administración de un compuesto proporcionado en esta invención durante más ciclos que los típicos cuando se administra solo. En otra realización, un compuesto proporcionado en esta invención se administra en una mayor cantidad de ciclos que la que usualmente provocaría toxicidad que limita la dosis en un paciente al que no se administra también un segundo ingrediente activo.
En una realización, un compuesto proporcionado en esta invención se administra a diario y de forma continua durante tres o cuatro semanas en una dosis de entre aproximadamente 0,03 mg y aproximadamente 10 mg por día, seguido de un descanso de una o dos semanas. En otras realizaciones, la dosis puede ser de aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 8 mg, de aproximadamente 0,3 mg a aproximadamente 6 mg, de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 4 mg, o aproximadamente 2 mg, seguido de un descanso.
En una realización, un compuesto proporcionado en esta invención y un segundo ingrediente activo se administran por vía oral, con la administración del compuesto proporcionado en esta invención 30 a 60 minutos antes del segundo ingrediente activo, durante un ciclo de cuatro a seis semanas. En otra realización, la combinación de un compuesto proporcionado en esta invención y un segundo ingrediente activo se administra por infusión intravenosa durante aproximadamente 90 minutos por cada ciclo.
Típicamente, el número de ciclos durante los cuales se administra el tratamiento combinado a un paciente será de aproximadamente uno a aproximadamente 24 ciclos, de aproximadamente dos a aproximadamente 16 ciclos, o de aproximadamente cuatro a aproximadamente tres ciclos.
5.6 BIOMARCADORES
También se describen en esta invención biomarcadores para el tratamiento de diversas enfermedades o trastornos proporcionados en esta invención. Por ejemplo, el biomarcador es un grupo de diferenciación-44 («CD44»), una molécula que se encuentra en la superficie de las células B. Por ejemplo, el biomarcador es un grupo de diferenciación-83 («CD83»), una molécula que se encuentra en la superficie de las células B. En otras realizaciones, el biomarcador es una combinación de CD44 y CD83.
Los niveles de los biomarcadores de proteínas descritos en esta invención pueden detectarse o cuantificarse mediante cualquier procedimiento conocido en la técnica. Por ejemplo, se utilizan procedimientos basados en anticuerpos. Por ejemplo, el procedimiento de detección o cuantificación es la inmunotransferencia (western blot), un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), inmunohistoquímica, citometría de flujo, una matriz de microesferas citométricas o espectroscopía de masas.
Por ejemplo, el procedimiento de detección o cuantificación es la inmunotransferencia (western blot). Por ejemplo, el procedimiento de detección o cuantificación es un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA). Por ejemplo, el procedimiento de detección o cuantificación es un ELISA directo. Por ejemplo, el procedimiento de detección o cuantificación es un ELISA indirecto. Por ejemplo, el procedimiento de detección o cuantificación es un ELISA sandwich. Por ejemplo, el procedimiento de detección o cuantificación es la inmunohistoquímica. Por ejemplo, el procedimiento de detección o cuantificación es la citometría de flujo. Por ejemplo, el procedimiento de detección o cuantificación es una matriz de cuentas citométricas. Por ejemplo, el procedimiento de detección o cuantificación es la espectroscopía de masas.
Ciertos ejemplos incluyen procedimientos para identificar a un sujeto que probablemente responda a un tratamiento de una enfermedad, trastorno o afección con un compuesto de tratamiento. Por ejemplo, el procedimiento implica determinar el nivel de un biomarcador en una muestra biológica del sujeto. Por ejemplo, el biomarcador es CD44. Por ejemplo, el biomarcador es CD83.
Por ejemplo, los procedimientos para identificar a un sujeto que es probable que responda a un tratamiento de una enfermedad, trastorno o afección con un compuesto de tratamiento, comprenden: a) determinar el nivel de un biomarcador en una muestra biológica del sujeto, en donde el biomarcador es CD44, CD83 o una combinación de los mismos; y b) comparar el nivel del biomarcador en la muestra biológica del sujeto con un nivel de referencia del biomarcador; donde es probable que el sujeto responda al tratamiento si el nivel del biomarcador en la muestra biológica del sujeto se altera en comparación con el nivel de referencia del biomarcador.
Por ejemplo, los procedimientos para identificar a un sujeto que es probable que responda a un tratamiento de una enfermedad, trastorno o afección con un compuesto de tratamiento, comprenden: a) determinar el nivel de un biomarcador en una muestra biológica del sujeto, en donde el el biomarcador es CD44, CD83 o una combinación de los mismos; b) determinar el nivel del biomarcador en una muestra de control; y c) comparar el nivel del biomarcador en la muestra biológica del sujeto con el nivel del biomarcador en la muestra de control; donde es probable que el sujeto responda al tratamiento si el nivel del biomarcador en la muestra biológica del sujeto se altera en comparación con el nivel del biomarcador en la muestra de control.
Por ejemplo, los procedimientos para identificar a un sujeto que es probable que responda a un tratamiento de una enfermedad, trastorno o afección con un compuesto de tratamiento, comprenden: a) determinar el nivel de un biomarcador en una muestra biológica del sujeto, en donde el biomarcador es CD83; y b) comparar el nivel del biomarcador en la muestra biológica del sujeto con un nivel de referencia del biomarcador; donde es probable que el sujeto responda al tratamiento si el nivel del biomarcador en la muestra biológica del sujeto es mayor que el nivel de referencia del biomarcador.
Por ejemplo, los procedimientos para identificar a un sujeto que es probable que responda a un tratamiento de una enfermedad, trastorno o afección con un compuesto de tratamiento, comprenden: a) determinar el nivel de un biomarcador en una muestra biológica del sujeto, en donde el el biomarcador es CD83; b) determinar el nivel del biomarcador en una muestra de control; y c) comparar el nivel del biomarcador en la muestra biológica del sujeto con el nivel del biomarcador en la muestra de control; donde es probable que el sujeto responda al tratamiento si el nivel del biomarcador en la muestra biológica del sujeto es mayor que el nivel del biomarcador en la muestra de control.
Por ejemplo, los procedimientos para identificar a un sujeto que es probable que responda a un tratamiento de una enfermedad, trastorno o afección con un compuesto de tratamiento, comprenden: a) determinar el nivel de un biomarcador en una muestra biológica del sujeto, en donde el biomarcador es CD44; y b) comparar el nivel del biomarcador en la muestra biológica del sujeto con un nivel de referencia del biomarcador; donde es probable que el sujeto responda al tratamiento si el nivel del biomarcador en la muestra biológica del sujeto es menor que el nivel de referencia del biomarcador.
Por ejemplo, los procedimientos para identificar a un sujeto que es probable que responda a un tratamiento de una enfermedad, trastorno o afección con un compuesto de tratamiento, comprenden: a) determinar el nivel de un biomarcador en una muestra biológica del sujeto, en donde el biomarcador es CD44; b) determinar el nivel del biomarcador en una muestra de control; y c) comparar el nivel del biomarcador en la muestra biológica del sujeto con el nivel del biomarcador en la muestra de control; donde es probable que el sujeto responda al tratamiento si el nivel del biomarcador en la muestra biológica del sujeto es inferior al nivel del biomarcador en la muestra de control.
Por ejemplo, los procedimientos para predecir la capacidad de respuesta de un sujeto a un tratamiento de una enfermedad, trastorno o afección con un compuesto de tratamiento, comprenden: a) determinar el nivel de un biomarcador en una muestra biológica del sujeto, en donde el biomarcador es CD44 , CD83 o una combinación de los mismos; y b) comparar el nivel del biomarcador en la muestra biológica con un nivel de referencia del biomarcador; en donde la diferencia entre el nivel del biomarcador en la muestra biológica del sujeto y el nivel de referencia del biomarcador se correlaciona con la capacidad de respuesta del sujeto al tratamiento.
Por ejemplo, los procedimientos para predecir la capacidad de respuesta de un sujeto a un tratamiento de una enfermedad, trastorno o afección con un compuesto de tratamiento, comprenden: a) determinar el nivel de un biomarcador en una muestra biológica del sujeto, en donde el biomarcador es CD44 , CD83 o una combinación de los mismos; b) determinar el nivel del biomarcador en una muestra de control; y c) comparar el nivel del biomarcador en la muestra biológica del sujeto con el nivel del biomarcador en la muestra de control; en donde la diferencia entre el nivel del biomarcador en la muestra biológica del sujeto y el nivel del biomarcador en la muestra de control se correlaciona con la capacidad de respuesta del sujeto al tratamiento.
Por ejemplo, los procedimientos para predecir la capacidad de respuesta de un sujeto a un tratamiento de una enfermedad, trastorno o afección con un compuesto de tratamiento, comprenden: a) determinar el nivel de un biomarcador en una muestra biológica del sujeto, en donde el biomarcador es CD83 ; y b) comparar el nivel del biomarcador en la muestra biológica con un nivel de referencia del biomarcador, donde un mayor nivel del biomarcador en la muestra biológica del sujeto en comparación con el nivel de referencia del biomarcador se correlaciona con una mayor capacidad de respuesta del sujeto al tratamiento.
Por ejemplo, los procedimientos para predecir la capacidad de respuesta de un sujeto a un tratamiento de una enfermedad, trastorno o afección con un compuesto de tratamiento, comprenden: a) determinar el nivel de un biomarcador en una muestra biológica del sujeto, en donde el biomarcador es CD83; b) determinar el nivel del biomarcador en una muestra de control; y c) comparar el nivel del biomarcador en la muestra biológica del sujeto con el nivel del biomarcador en la muestra de control; en donde un mayor nivel del biomarcador en la muestra biológica del sujeto en comparación con el nivel del biomarcador en la muestra de control se correlaciona con una mayor capacidad de respuesta del sujeto al tratamiento.
Por ejemplo, los procedimientos para predecir la capacidad de respuesta de un sujeto a un tratamiento de una enfermedad, trastorno o afección con un compuesto de tratamiento, comprenden: a) determinar el nivel de un biomarcador en una muestra biológica del sujeto, en donde el biomarcador es CD44 ; y b) comparar el nivel del biomarcador en la muestra biológica con un nivel de referencia del biomarcador, donde un nivel disminuido del biomarcador en la muestra biológica del sujeto en comparación con el nivel de referencia del biomarcador se correlaciona con una mayor capacidad de respuesta del sujeto al tratamiento.
Por ejemplo, los procedimientos para predecir la capacidad de respuesta de un sujeto a un tratamiento de una enfermedad, trastorno o afección con un compuesto de tratamiento, comprenden: a) determinar el nivel de un biomarcador en una muestra biológica del sujeto, en donde el biomarcador es CD44; b) determinar el nivel del biomarcador en una muestra de control; y c) comparar el nivel del biomarcador en la muestra biológica del sujeto con el nivel del biomarcador en la muestra de control; en donde un menor nivel del biomarcador en la muestra biológica del sujeto en comparación con el nivel del biomarcador en la muestra de control se correlaciona con una mayor capacidad de respuesta del sujeto al tratamiento.
Por ejemplo, los procedimientos para controlar la eficacia de un tratamiento de una enfermedad, trastorno o afección en un sujeto tratado con un compuesto de tratamiento, comprenden: a) obtener una primera muestra biológica del sujeto; b) determinar el nivel de un biomarcador en la primera muestra biológica, en donde el biomarcador es CD44, CD83 o una combinación de los mismos; c) administrar el compuesto de tratamiento al sujeto; d) luego obtener una segunda muestra biológica del sujeto; e) determinar el nivel del biomarcador en la segunda muestra biológica; y f) comparar los niveles del biomarcador en la primera y segunda muestra biológica; en donde el sujeto responde al tratamiento si el nivel del biomarcador en la segunda muestra biológica del sujeto se altera en comparación con el nivel del biomarcador en la primera muestra biológica del sujeto.
Por ejemplo, los procedimientos para controlar la eficacia de un tratamiento de una enfermedad, trastorno o afección en un sujeto tratado con un compuesto de tratamiento, comprenden: a) obtener una primera muestra biológica del sujeto; b) determinar el nivel de un biomarcador en la primera muestra biológica, en donde el biomarcador es CD83; c) administrar el compuesto de tratamiento al sujeto; d) luego obtener una segunda muestra biológica del sujeto; e) determinar el nivel del biomarcador en la segunda muestra biológica y f) comparar los niveles del biomarcador en la primera y segunda muestra biológica; en donde el sujeto responde al tratamiento si el nivel del biomarcador en la segunda muestra biológica del sujeto es mayor que el nivel del biomarcador en la primera muestra biológica del sujeto.
Por ejemplo, los procedimientos para controlar la eficacia de un tratamiento de una enfermedad, trastorno o afección en un sujeto tratado con un compuesto de tratamiento, comprenden: a) obtener una primera muestra biológica del sujeto; b) determinar el nivel de un biomarcador en la primera muestra biológica, en donde el biomarcador es CD44; c) administrar el compuesto de tratamiento al sujeto; d) luego obtener una segunda muestra biológica del sujeto; e) determinar el nivel del biomarcador en la segunda muestra biológica; y f) comparar los niveles del biomarcador en la primera y segunda muestra biológica; en donde el sujeto responde al tratamiento si el nivel del biomarcador en la segunda muestra biológica del sujeto es menor que el nivel del biomarcador en la primera muestra biológica del sujeto.
Por ejemplo, los procedimientos para controlar el cumplimiento de un sujeto con un tratamiento de una enfermedad, trastorno o afección con un compuesto de tratamiento, comprenden: a) obtener una muestra biológica del sujeto; b) determinar el nivel de un biomarcador en la muestra biológica, en donde el biomarcador es CD44, CD83 o una combinación de los mismos; y c) comparar el nivel del biomarcador con el nivel del biomarcador en una muestra control no tratada del sujeto; en donde el cambio en el nivel del biomarcador en la muestra biológica en comparación con el nivel del biomarcador en la muestra de control indica el cumplimiento del sujeto con el tratamiento.
Por ejemplo, los procedimientos para controlar el cumplimiento de un sujeto con un tratamiento de una enfermedad, trastorno o afección con un compuesto de tratamiento, comprenden: a) obtener una muestra biológica del sujeto; b) determinar el nivel de un biomarcador en la muestra biológica, en donde el biomarcador es CD83; y c) comparar el nivel del biomarcador con el nivel del biomarcador en una muestra control no tratada del sujeto; en donde un nivel mayor del biomarcador en la muestra biológica en comparación con el nivel del biomarcador en la muestra de control indica el cumplimiento del sujeto con el tratamiento.
Por ejemplo, los procedimientos para controlar el cumplimiento de un sujeto con un tratamiento de una enfermedad, trastorno o afección con un compuesto de tratamiento, comprenden: a) obtener una muestra biológica del sujeto; b) determinar el nivel de un biomarcador en la muestra biológica, en donde el biomarcador es CD44; y c) comparar el nivel del biomarcador con el nivel del biomarcador en una muestra control no tratada del sujeto; en donde un nivel menor del biomarcador en la muestra biológica en comparación con el nivel del biomarcador en la muestra de control indica el cumplimiento del sujeto con el tratamiento.
Por ejemplo, el compuesto de tratamiento es un compuesto inmunomodulador. En ciertas realizaciones, el compuesto de tratamiento es clorhidrato de 3-[4-(4-morfolin-4-ilmetil-benciloxi)-1-oxo-1,3-dihidro-isoindol-2-il]-piperidina-2,6-diona, o una sal, solvato, hidrato, estereoisómero, tautómero o mezclas racémicas farmacéuticamente aceptables de los mismos. En una realización, el compuesto es (S)-3-[4-(4-morfolin-4-ilmetil-benciloxi)-1-oxo-1,3-dihidro-isoindol-2-il]-piperidina-2,6-diona, o una sal farmacéuticamente aceptable, solvato o hidrato del mismo.
5.7 COMPOSICIONES FARMACÉUTICAS Y FORMAS DE DOSIFICACIÓN
Pueden usarse composiciones farmacéuticas en la preparación de formas de dosificación individuales de una única unidad. Las composiciones farmacéuticas y las formas de dosificación descritas en esta invención comprenden un compuesto proporcionado en esta invención, o una sal, solvato, hidrato, estereoisómero, racemato, clatrato o profármaco farmacéuticamente aceptable del mismo. Las composiciones farmacéuticas y las formas de dosificación además pueden comprender uno o más excipientes.
Las composiciones farmacéuticas y las formas de dosificación descritas en esta invención también pueden comprender uno o más ingredientes activos adicionales. Se describen anteriormente ejemplos de ingredientes activos adicionales o segundos ingredientes activos.
Las formas de dosificación unitarias descritas en este documento son adecuadas para administración oral, mucosa (por ejemplo, nasal, sublingual, vaginal, bucal o rectal), parenteral (por ejemplo, cubcutánea, intravenosa, inyección en bolo, intramuscular o intraarterial), tópica (por ejemplo, gotas para los ojos u otras preparaciones oftálmicas), transdérmica o transcutánea a un paciente. Los ejemplos de formas de dosificación incluyen, pero no se limitan a: comprimidos; comprimidos oblongos; cápsulas, tales como cápsulas elásticas blandas de gelatina; obleas; pastillas; píldoras; dispersiones; supositorios; polvos; aerosoles (por ejemplo, pulverizadores nasales o inhaladores); geles; formas de dosificación líquidas adecuadas para la administración por vía oral o mucosal a un paciente, que incluyen suspensiones (porejemplo, suspensiones líquidas acuosas o no acuosas, emulsiones de aceite en agua, o emulsiones líquidas de agua en aceite), soluciones, y elixires; formas de dosificación líquidas adecuadas para la administración parenteral a un paciente; colirios u otras preparaciones oftálmicas adecuadas para administración tópica; y sólidos estériles (por ejemplo, sólidos amorfos o cristalinos) que pueden reconstituirse para proporcionar formas de dosificación líquidas adecuadas para la administración parenteral a un paciente.
La composición, forma y tipo de formas de dosificación variarán normalmente dependiendo de su uso. Por ejemplo, una forma de dosificación usada en el tratamiento agudo de una enfermedad puede contener cantidades mayores de uno o más de los ingredientes activos que comprende que una forma de dosificación usada en el tratamiento crónico de la misma enfermedad. De manera similar, una forma de dosificación parenteral puede contener cantidades más pequeñas de uno o más de los ingredientes activos que comprende que una forma de dosificación oral utilizada para tratar la misma enfermedad. Estas y otras maneras en que se usan formas de dosificación específicas variarán entre sí y serán fácilmente evidentes para los expertos en la materia. Véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 20a ed., Mack Publishing Co., Easton PA (2000).
Por ejemplo, las composiciones farmacéuticas y las formas de dosificación comprenden uno o más excipientes. Los excipientes adecuados son bien conocidos por los expertos en la técnica de la farmacia y en esta invención se proporcionan ejemplos no limitativos de excipientes adecuados. Si un excipiente particular es adecuado para su incorporación en una composición farmacéutica o forma de dosificación depende de una variedad de factores muy conocidos en la técnica incluyendo, pero no se limitan a, la manera en la que la forma de dosificación se administrará a un paciente. Por ejemplo, las formas de dosificación orales tales como comprimidos pueden contener excipientes que no son adecuados para uso en formas de dosificación parenterales. La idoneidad de un excipiente particular también puede depender de los ingredientes activos específicos en la forma de dosificación. Por ejemplo, la descomposición de algunos ingredientes activos puede acelerarse mediante algunos excipientes tales como lactosa, o cuando se exponen al agua. Los ingredientes activos que comprenden aminas primarias o secundarias son particularmente susceptibles a dicha descomposición acelerada. Por consiguiente, se describen composiciones farmacéuticas y formas de dosificación que contienen poca lactosa, si es que contienen, u otros mono o disacáridos. Como se usa en esta invención, la expresión "sin lactosa" significa que la cantidad de lactosa presente, si la hay, es insuficiente para aumentar considerablemente la velocidad de degradación de un ingrediente activo.
Las composiciones sin lactosa de la invención pueden comprender excipientes que son conocidos en la técnica y se enumeran, por ejemplo, en la Farmacopea de Estados Unidos (USP) 25-NF20 (2002). En general, las composiciones sin lactosa comprenden ingredientes activos, un aglutinante/relleno y un lubricante en cantidades farmacéuticamente compatibles y farmacéuticamente aceptables. Por ejemplo, las formas de dosificación sin lactosa comprenden ingredientes activos, celulosa microcristalina, almidón gelatinizado previamente y estearato de magnesio.
También se describen composiciones farmacéuticas anhidras y formas de dosificación que comprenden ingredientes activos, ya que el agua puede facilitar la degradación de algunos compuestos. Por ejemplo, la adición de agua (por ejemplo, el 5 %) es ampliamente aceptada en las técnicas farmacéuticas como un medio para simular el almacenamiento a largo plazo con el fin de determinar características tales como la vida media o la estabilidad de las formulaciones con el transcurso del tiempo. Véase, por ejemplo, Jens T. Carstensen, Drug Stability: Principles & Practice, 2a Ed., Marcel Dekker, NY, NY, 1995, pp. 379-80. En efecto, el agua y el calor aceleran la descomposición de algunos compuestos. Por lo tanto, el efecto del agua en una formulación puede ser de gran importancia ya que la hidratación y/o la humedad se observan comúnmente durante la fabricación, manipulación, envasado, almacenamiento, envío y uso de formulaciones.
Las composiciones farmacéuticas y formas de dosificación anhidras pueden prepararse usando ingredientes anhidros o con baja humedad que contienen ingredientes y condiciones de bajo contenido en agua o baja humedad. Las composiciones farmacéuticas y las formas de dosificación que comprenden lactosa y al menos un ingrediente activo que comprende una amina primaria o secundaria son anhidras si se espera un contacto considerable con la humedad y/o el contenido en agua durante la fabricación, el envasado y/o el almacenamiento.
Una composición farmacéutica anhidra debe prepararse y almacenarse de manera que se mantenga su naturaleza anhidra. Por consiguiente, las composiciones anhidras se envasan mediante el uso de materiales conocidos para impedir la exposición al agua de modo que estas puedan incluirse en kits de formulación adecuados. Algunos ejemplos de empaques adecuados incluyen, de modo no taxativo, láminas herméticamente selladas, plásticos, recipientes para dosis unitarias (por ejemplo, viales), envases de blíster y envases de tiras.
También se describen composiciones farmacéuticas y formas de dosificación que comprenden uno o más compuestos que reducen la velocidad a la que se descompondrá un ingrediente activo. Estos compuestos, que se denominan en la presente «estabilizadores», incluyen, entre otros, antioxidantes tales como ácido ascórbico, amortiguadores de pH o amortiguadores de sales.
Como las cantidades y tipos de excipientes, las cantidades y tipos específicos de ingredientes activos en una forma de dosificación pueden ser diferentes dependiendo de factores tales como, pero no se limitan a, la vía por la que se va a administrar a pacientes. Por ejemplo, las formas de dosificación comprenden un compuesto proporcionado en esta invención en una cantidad de aproximadamente 0,10 a aproximadamente 500 mg. Por ejemplo, las formas de dosificación proporcionadas en esta invención comprenden un compuesto en una cantidad de aproximadamente 0,1, 1,2, 5, 7,5, 10, 12,5, 15, 17,5, 20, 25, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450 o 500 mg.
Por ejemplo, las formas de dosificación comprenden el segundo ingrediente activo en una cantidad de entre 1 y aproximadamente 1000 mg, entre aproximadamente 5 y aproximadamente 500 mg, entre aproximadamente 10 y aproximadamente 350 mg o entre aproximadamente 50 y aproximadamente 200 mg. Por supuesto, la cantidad específica del segundo agente activo dependerá del agente específico utilizado, las enfermedades o trastornos que se estén tratando o controlando, y las cantidades de un compuesto proporcionado en esta invención y cualquier agente activo opcional adicional que se administre simultáneamente al paciente.
5.7.1 Formas de dosificación oral
Las composiciones farmacéuticas que son adecuadas para la administración por vía oral pueden proporcionarse como formas de dosificación discretas, tal como, pero no se limitan a, comprimidos (por ejemplo, comprimidos masticables), comprimidos oblongos, cápsulas y líquidos (por ejemplo, jarabes aromatizados). Dichas formas de dosificación contienen cantidades predeterminadas de ingredientes activos y se pueden preparar a través de procedimientos de farmacia conocidos por los expertos en la técnica. Véase en general, Remington's Pharmaceutical Sciences, 20a ed., Mack Publishing, Easton PA (2000).
Las formas de dosificación orales descritas en esta invención se preparan combinando los ingredientes activos en una mezcla íntima con al menos un excipiente de acuerdo con las técnicas de composición farmacéuticas convencionales. Los excipientes pueden adoptar una diversidad de formas que dependen de la forma de preparación deseada para la administración. Por ejemplo, los excipientes adecuados para su uso en formas de dosificación líquidas orales o de aerosoles incluyen, de modo no taxativo, agua, glicoles, aceites, alcoholes, agentes saborizantes, conservantes y agentes colorantes. Algunos ejemplos de excipientes adecuados para su uso en formas de dosificación orales sólidas (por ejemplo, polvos, comprimidos, cápsulas y pastillas) incluyen, de modo no taxativo, almidones, azúcares, celulosa microcristalina, diluyentes, agentes de granulación, lubricantes, aglutinantes y agentes de desintegración.
Por ejemplo, las formas de dosificación oral son comprimidos o cápsulas, en cuyo caso se emplean excipientes sólidos. Por ejemplo, los comprimidos se pueden recubrir mediante técnicas convencionales acuosas o no acuosas. Dichas formas de dosificación pueden prepararse por cualquiera de los procedimientos de farmacia. En general, las composiciones farmacéuticas y las formas de dosificación se preparan mediante una mezcla uniforme y profunda del ingrediente activo con vehículos líquidos o vehículos sólidos divididos finamente, o ambos, y a continuación, si fuera necesario, mediante el moldeado del producto en la presentación deseada.
Por ejemplo, un comprimido puede prepararse por compresión o moldeo. Los comprimidos prensados pueden prepararse comprimiendo en una máquina adecuada los ingredientes activos en una forma de flujo libre tal como polvo o gránulos, opcionalmente mezclado con un excipiente. Los comprimidos moldeados se pueden fabricar moldeando en una máquina adecuada una mezcla del compuesto en polvo humedecido con un diluyente líquido inerte.
Algunos ejemplos de excipientes que pueden utilizarse en las formas de dosificación orales descritas en esta invención incluyen, entre otros, aglutinantes, rellenos, desintegrantes y lubricantes. Los aglutinantes adecuados para su uso en composiciones farmacéuticas y formas de dosificación incluyen, entre otros, almidón de maíz, almidón de papa u otros almidones, gelatina, gomas naturales y sintéticas tales como acacia, alginato de sodio, ácido algínico, otros alginatos, tragacanto en polvo, goma guar, celulosa y sus derivados (por ejemplo, etilcelulosa, acetato de celulosa, carboximetilcelulosa de calcio, carboximetilcelulosa de sodio), polivinilpirrolidona, metilcelulosa, almidón pregelatinizado, hidroxipropil metilcelulosa (por ejemplo, n.° 2208, 2906, 2910), celulosa microcristalina y mezclas de estos.
Las formas adecuadas de celulosa microcristalina incluyen, entre otras, los materiales comercializados como AVICEL-PH-101, AVICEL-PH-103 AVICEL RC-581, AVICEL-Ph -105 (disponibles de FMC Corporation, American Viscose Division, Avicel Sales, Marcus Hook, PA), y mezclas de los mismos. Un aglutinante específico es una mezcla de celulosa microcristalina y carboximetilcelulosa de sodio comercializado como AVICEL RC-581. Los aditivos o excipientes anhidros o de baja humedad adecuados incluyen AVICEL-PH-103™ y Almidón 1500 LM.
Algunos ejemplos de rellenos adecuados para su uso en las composiciones farmacéuticas y formas de dosificación descritas en esta invención incluyen, entre otros, talco, carbonato de calcio (por ejemplo, gránulos o polvo), celulosa microcristalina, celulosa en polvo, dextratos, caolín, manitol, ácido salicílico, sorbitol, almidón, almidón pregelatinizado y mezclas de estos. El aglutinante o relleno en las composiciones farmacéuticas está presente en de aproximadamente el 50 a aproximadamente el 99 por ciento en peso de la composición farmacéutica o forma de dosificación.
Los disgregrantes pueden usarse en las composiciones para proporcionar comprimidos que se desintegran cuando se exponen a un entorno acuoso. Los comprimidos que contienen demasiado disgregante pueden disgregarse en el almacenamiento, mientras que aquellos que contienen demasiado poco disgregante pueden no disgregarse a una velocidad deseada o en las condiciones deseadas. Así, una cantidad suficiente de disgregante que no es demasiado alta ni demasiado baja para alterar perjudicialmente la liberación de los ingredientes activos podrían usarse para formar formas de dosificación orales sólidas. La cantidad de desintegrante utilizado varía de acuerdo con el tipo de formulación y es fácilmente discernible por los expertos en la técnica. Por ejemplo, las composiciones farmacéuticas comprenden entre aproximadamente 0,5 y aproximadamente 15 por ciento en peso de desintegrante, o entre aproximadamente 1 y aproximadamente 5 por ciento en peso de desintegrante.
Los desintegrantes que se pueden utilizar en composiciones farmacéuticas y formas de dosificación incluyen, entre otros, agar-agar, ácido algínico, carbonato de calcio, celulosa microcristalina, croscarmelosa de sodio, crospovidona, polacrilina potásica, glicolato de almidón de sodio, almidón de papa o tapioca, otros almidones, almidón pregelatinizado, otros almidones, arcillas, otras alginas, otras celulosas, gomas y mezclas de los mismos.
Los lubricantes que se pueden utilizar en las composiciones farmacéuticas y formas de dosificación incluyen, entre otros, estearato de calcio, estearato de magnesio, aceite mineral, aceite mineral ligero, glicerina, sorbitol, manitol, polietilenglicol, otros glicoles, ácido esteárico, laurilsulfato de sodio, talco, aceite vegetal hidrogenado (por ejemplo, aceite de maní, aceite de semilla de algodón, aceite de girasol, aceite de sésamo, aceite de oliva, aceite de maíz y aceite de soja), estearato de zinc, oleato de etilo, laureato de etilo, agar o mezclas de los mismos. Los lubricantes adicionales incluyen, por ejemplo, un gel de sílice siloide (AEROSIL 200® (sílice), fabricado por W.R. Grace Co. de Baltimore, MD), un aerosol coagulado de sílice sintética (comercializado por Degussa Co. de Plano, TX), CAB-O-SIL® (un producto de dióxido de silicio pirogénico vendido por Cabot Co. de Boston, MA), y mezclas de los mismos. Si se utilizan, los lubricantes se pueden utilizar en una cantidad menor que alrededor de 1 por ciento en peso de las composiciones farmacéuticas o formas de dosificación a las cuales se incorporan.
Por ejemplo, una forma de dosificación oral sólida comprende un compuesto proporcionado en esta invención, lactosa anhidra, celulosa microcristalina, polivinilpirrolidona, ácido esteárico, sílice coloidal anhidra y gelatina.
5.7.2 Formas de dosificación de liberación controlada
Los ingredientes activos tales como los compuestos proporcionados en esta invención pueden administrarse por medios de liberación controlada o por dispositivos de administración que son bien conocidos por los expertos en la materia. Algunos ejemplos incluyen, entre otros, los descritos en las patentes estadounidenses N.°: 3.845.770; 3.916.899; 3.536.809; 3.598.123; y 4.008.719; 5.674.533; 5.059.595; 5.591.767; 5.120.548; 5.073.543; 5.639.476; 5.354.556; 5.639.480; 5.733.566; 5.739.108; 5.891.474; 5.922.356; 5.972.891; 5.980.945; 5.993.855; 6.045.830; 6.087.324; 6.113.943; 6.197.350; 6.248.363; 6.264.970; 6.267.981; 6.376.461; 6.419.961; 6.589.548; 6.613.358; 6.699.500. Dichas formas de dosificación pueden usarse para proporcionar una liberación lenta o controlada de uno o más ingredientes activos usando, por ejemplo, hidropropilmetilcelulosa, otras matrices de polímero, geles, membranas permeables, sistemas osmóticos, recubrimientos con múltiples capas, micropartículas, liposomas, microesferas, o una combinación de los mismos para proporcionar el perfil de liberación deseado en proporciones variadas. Las formulaciones de liberación controlada adecuadas conocidas por los expertos en la materia, incluyendo las que se describen en esta invención, se pueden seleccionar fácilmente para su uso con los ingredientes activos proporcioandos en esta invención. Por lo tanto, las composiciones descritas abarcan formas de dosificación unitarias únicas para administración oral tales como comprimidos, cápsulas, cápsulas gel, y comprimidos oblongos, las cuales se pueden adaptar para liberación controlada o inmediata.
Los productos farmacéuticos de liberación controlada tienen un fin común de mejorar la terapia de fármaco sobre lo logrado por sus contrapartes no controladas. De manera ideal, el uso de una preparación de liberación controlada diseñada de forma óptima en el tratamiento médico se caracteriza porque se emplea un mínimo de sustancia farmacológica para curar o controlar la afección en una cantidad mínima de tiempo. Las ventajas de las formulaciones de liberación controlada incluyen la actividad prolongada del fármaco, la frecuencia de dosificación reducida, y el cumplimiento mejorado por parte del sujeto. Además, las formulaciones de liberación controlada pueden usarse para influir en el momento de inicio de la acción u otras características, tales como niveles en sangre del fármaco, y por lo tanto puede afectar a la aparición de efectos secundarios (por ejemplo, adversos).
La mayoría de las formulaciones de liberación controlada están diseñadas para liberar inicialmente una cantidad de fármaco (ingrediente activo) que inmediatamente produce el efecto terapéutico deseado, y libera de forma gradual y continua otras cantidades de fármaco para mantener este nivel de efecto terapéutico o profiláctico durante un período de tiempo prolongado. Para mantener este nivel de fármaco constante en el cuerpo, el fármaco debe liberarse de la forma de dosificación a una velocidad que reemplazará la cantidad de fármaco que se metaboliza y excreta del cuerpo. La liberación controlada de un ingrediente activo se puede estimular mediante diversas condiciones que incluyen, entre otras, pH, temperatura, enzimas, agua u otras condiciones o compuestos fisiológicos.
Por ejemplo, el fármaco puede administrarse usando infusión intravenosa, una bomba osmótica implantable, un parche transdérmico, liposomas u otros modos de administración. En una realización, se puede usar una bomba (ver, Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201 (1987); Buchwald y col., Surgery 88:507 (1980); Saudek y col., N. Engl. J. Med.
321:574 (1989)). Por ejemplo, se pueden usar materiales poliméricos. Por ejemplo, un sistema de liberación controlada se puede colocar en un sujeto en un sitio apropiado determinado por un profesional experto, es decir, que requiere solo una fracción de la dosis sistémica (ver, por ejemplo, Goodson, Medical Applications of Controlled Release, vol. 2, pp. 115-138 (1984)). Otros sistemas de liberación controlada se analizan en la revisión de Langer (Science 249:1527-1533 (1990))). El ingrediente activo se puede dispersar en una matriz interna sólida, por ejemplo, polimetilmetacrilato, polibutilmetacrilato, policloruro de polivinilo plastificado o no plastificado, nylon plastificado, polietilenreftalato plastificado, caucho natural, poliisopreno, poliisobutileno, copolímeros de polibutadieno, polietileno, etileno-acetato de vinilo, copolímeros de silicona, polidimetilsiloxanos como hidrocarburos, como los hidrocarburos de los polímeros de estereofenilatos ácido acrílico y metacrílico, colágeno, alcohol polivinílico reticulado y acetato de polivinilo parcialmente hidrolizado reticulado, que está rodeado por una membrana polimérica externa, por ejemplo, copolímeros de polietileno, polipropileno, etileno / propileno, copolímeros de etileno / acrilato de etilo, copolímeros de etileno / acetato de vinilo , cauchos de silicona, polidimetilsiloxanos, caucho de neopreno, polietileno clorado, cloruro de polivinilo, copolímeros de cloruro de vinilo con acetato de vinilo, cloruro de vinilideno, etileno y propileno, tereftalato de polietileno de ionómero, cauchos de epiclorohidrina de caucho butílico, copolimato de etileno / alcohol vinílico, terpolímero de etileno / acetato de vinilo / alcohol vinílico y copolímero de etileno / viniloxietanol, que es insoluble en los fluidos corporales. El ingrediente activo a continuación se difunde a través de la membrana polimérica externa en una etapa de control de la velocidad de liberación. El porcentaje de ingrediente activo en tales composiciones parenterales depende en gran medida de la naturaleza específica de las mismas, así como de las necesidades del sujeto.
5.7.3 Formas de dosificación parenterales
Las formas de dosificación parenteral se pueden administrar a los pacientes por varias vías que incluyen, pero no se limitan a, subcutánea, intravenosa (incluida la inyección de bolo), intramuscular e intraarterial. Por ejemplo, la administración de una forma de dosificación parenteral evita las defensas naturales de los pacientes contra los contaminantes y, por lo tanto, en estas realizaciones, las formas de dosificación parenterales son estériles o pueden esterilizarse antes de la administración a un paciente. Algunos ejemplos de formas de dosis parenteral incluyen, entre otros, soluciones listas para inyección, productos secos listos para disolverse o suspenderse en un vehículo farmacéuticamente aceptable para inyección, suspensiones listas para inyección y emulsiones.
Los vehículos adecuados que se pueden utilizar para proporcionar formas de dosificación parenterales son conocidos por los expertos en la técnica. Algunos ejemplos incluyen, entre otros: agua para inyección USP; vehículos acuosos tales como, pero sin limitación, Inyección de Cloruro Sódico, Inyección de Ringer, Inyección de Dextrosa, Inyección de Dextrosa y Cloruro Sódico, e Inyección de Ringer con Lactato; vehículos miscibles en agua tales como, pero sin limitación, alcohol etílico, polietilenglicol y polipropilenglicol; y vehículos no acuosos tales como, pero sin limitación, aceite de maíz, aceite de semilla de algodón, aceite de cacahuete, aceite de sésamo, oleato de etilo, miristato de isopropilo y benzoato de bencilo.
Los compuestos que aumentan la solubilidad de uno o más de los ingredientes activos descritos en esta invención también pueden incorporarse en las formas de dosificación parenteral. Por ejemplo, la ciclodextrina y sus derivados pueden usarse para aumentar la solubilidad de un compuesto proporcionado en esta invención. Véase, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.134.127.
5.7.4 Formas de dosificación tópicas y por mucosas
Las formas de dosificación tópica y mucosa descritas en esta invención incluyen, pero no se limitan a, aerosoles, soluciones, emulsiones, suspensiones, colirios u otras preparaciones oftálmicas, u otras formas conocidas por un experto en la técnica. Ver, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, ediciones 16, 18 y 20, Mack Publishing, Easton PA (1980, 1990 y 2000); y Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms, 4th ed., Lea & Febiger, Philadelphia (1985). Las formas de dosificación adecuadas para tratar los tejidos mucosos dentro de la cavidad oral pueden formularse como enjuagues bucales o geles orales.
Los excipientes adecuados ( por ejemplo, vehículos y diluyentes) y otros materiales que pueden usarse para proporcionar formas de dosificación tópicas y mucosales son bien conocidos por los expertos en las técnicas farmacéuticas y dependen del tejido particular al que se aplicará una composición farmacéutica o forma de dosificación dada. Por ejemplo, los excipientes incluyen, entre otros, agua, acetona, etanol, etilenglicol, propilenglicol, butano-1,3-diol, miristato de isopropilo, palmitato de isopropilo, aceite mineral, y mezclas de los mismos para formar soluciones, emulsiones o geles, que son no tóxicos y farmacéuticamente aceptables. También se pueden agregar humectantes a las composiciones farmacéuticas o formas de dosificación. Ejemplos de ingredientes adicionales son bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, ediciones 16, 18 y 20, Mack Publishing, Easton PA (1980, 1990 y 2000).
También es posible ajustar el pH de una composición farmacéutica o forma de dosificación para mejorar el suministro de uno o más ingredientes activos. Además, la polaridad de un vehículo disolvente, su resistencia iónica o su tonicidad puede ajustarse para mejorar el suministro. También pueden agregarse compuestos, tales como estearatos, a las composiciones farmacéuticas o formas de dosificación para alterar la hidrofilicidad o lipofilicidad de uno o más de los ingredientes activos para mejorar la administración. Por ejemplo, los estearatos pueden servir como un vehículo lipídi
5.7.5 KITS
Los ingredientes activos proporcionados en esta invención a menudo no se administran a un paciente al mismo tiempo o por la misma vía de administración. También se describen en esta invención kits que pueden simplificar la administración de cantidades apropiadas de ingredientes activos.
Por ejemplo, un kit comprende una forma de dosificación de un compuesto proporcionado en esta invención. Los kits pueden comprender además ingredientes activos adicionales tales como otros compuestos antiinflamatorios, inmunomoduladores o inmunosupresores, o una combinación de los mismos. Los ejemplos de los ingredientes activos adicionales incluyen, pero no se limitan a, los descritos en esta invención.
Por ejemplo, los kits pueden comprender además dispositivos que se usan para administrar los ingredientes activos. Los ejemplos de estos dispositivos incluyen, pero no se limitan a, jeringas, bolsas de goteo, parches e inhaladores.
Los kits además pueden comprender células o sangre para trasplante así como vehículos farmacéuticamente aceptables que pueden utilizarse para administrar uno o más ingredientes activos. Por ejemplo, si se proporciona un ingrediente activo en una forma sólida que debe reconstituirse para una administración parenteral, el kit puede comprender un recipiente sellado o un vehículo adecuado en el que el ingrediente activo puede disolverse para formar una solución estéril libre de particulados que es adecuada para la administración parenteral. Los ejemplos de vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen, pero no se limitan a: agua para inyección USP; vehículos acuosos tales como, pero sin limitación, Inyección de Cloruro Sódico, Inyección de Ringer, Inyección de Dextrosa, Inyección de Dextrosa y Cloruro Sódico, e Inyección de Ringer con Lactato; vehículos miscibles en agua tales como, pero sin limitación, alcohol etílico, polietilenglicol y polipropilenglicol; y vehículos no acuosos tales como, pero sin limitación, aceite de maíz, aceite de semilla de algodón, aceite de cacahuete, aceite de sésamo, oleato de etilo, miristato de isopropilo y benzoato de bencilo.
6. EJEMPLOS
Los siguientes ejemplos se proporcionan a título de ilustración, no de limitación. En los ejemplos, el compuesto de ensayo se refiere a (S)-3-[4-(4-morfolin-4-ilmetilbenciloxi)-1-oxo-1,3-dihidro-isoindo-2-il]piperidina-2,6-diona.
6.1 EJEMPLO 1: PREPARACIÓN DE CLORHIDRATO DE (S) -3- T4-(4-MORFOLIN-4-ILMETILBENCILOXI) -1-OXO-1.3-DIHIDRO-ISOINDO-2-IL1 PIPERIDINA-2.6-DIONA (ejemplo de referencia)
Figure imgf000032_0001
6.1.1 Éster metílico del ácido 3-hidroxi-2-metil-benzoico
Figure imgf000032_0002
Se añadió ácido 3-hidroxi-2-metilbenzoico (105 g, 690 mmol) a MeOH (800 ml) en un matraz de fondo redondo de tres bocas de 2 litros equipado con condensador, termómetro y barra de agitación, seguido de la adición de MeOH (250 ml). H2SO4 (10 ml, 180 mmol) se añadió a la solución anterior. Se agitó la mezcla de reacción a 62 °C durante 17 horas. El disolvente se eliminó al vacío. El residuo (200 ml) se añadió a agua (600 ml) lentamente a temperatura ambiente y se formó un sólido blanco. La suspensión se agitó en un baño de hielo durante 30 minutos y se filtró. El sólido se lavó con agua (5 x 250 ml) y se secó para dar éster metílico del ácido 3-hidroxi-2-metil-benzoico como un sólido blanco (100 g, 87 % de rendimiento). El compuesto se usó en la siguiente etapa sin purificación adicional: LCMS MH = 167; 1H RMN (DMSO-de) 52,28 (s, 3H, CH3), 3,80 (s, 3H, CH3), 6,96 - 7,03 (m, 1H, Ar), 7,09 (t, J = 7,8 Hz, 1H, Ar), 7,14 -7,24 (m, 1H, Ar), 9,71 (s, 1H, OH).
6.1.2 Éster metílico del ácido 3-(terc-butil-dimetil-silaniloxi)-2-metil-benzoico
Figure imgf000033_0001
A un matraz RB de tres bocas de 1 litro equipado con una barra de agitación y un termómetro, se añadieron DMF (300 ml), 3-hidroxi-2-metilbenzoato de metilo (90 g, 542 mmol) e imidazol (92 g, 1,354 mmol). TBDMS-Cl (90 g, 596 mmol) se añadió a la solución anterior en porciones para controlar la temperatura interna entre 15-19 °C durante 20 minutos, y después de la adición, la temperatura interna cayó por debajo de 1 °C. El baño de hielo se retiró y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 16 horas. La mezcla de reacción se añadió a agua con hielo (500 ml), y la solución resultante se dividió en dos porciones (700 ml x 2). Cada porción se extrajo con EtOAc (700 ml). Cada capa orgánica se lavó con agua fría (350 ml) y salmuera (350 ml). Las capas orgánicas se combinaron y se secaron con MgSO4. La capa orgánica combinada se concentró para dar éster metílico del ácido 3-(terc-butildimetil-silaniloxi)-2-metil-benzoico como un aceite marrón claro (160 g, 100 % de rendimiento bruto). El compuesto se usó en la siguiente etapa sin purificación adicional. LCMS MH = 281; 1H RMN (DMSO-d6) ó -0,21 (s, 6H, CH3 , CH3), 0,73 - 0,84 (m, 9H, CH3 , CH3 , CH3), 2,10 (s, 3H, CH3), 3,60 (s, 3H, CH3), 6,82 (dd, 1H, Ar), 6,97 (t, J = 7,9 Hz, 1H, Ar), 7,13 (dd, J = 1,1,7,7 Hz, 1H, Ar).
6.1.3 Ester metílico del ácido 2-bromometil-3-(terc-butil-dimetil-silaniloxi) -benzoico
Figure imgf000033_0002
Se añadió NBS (49,8 g, 280 mmol) a 3-(terc-butil dimetilsililoxi)-2-metilbenzoato de metilo (78,4 g, 280 mmol) en acetato de metilo (500 ml) a temperatura ambiente para dar una suspensión de color naranja. La mezcla de reacción resultante se calentó en un baño de aceite a 40 °C y se hizo brillar con una bombilla de 300 wt de luz solar a reflujo durante 4 horas. La mezcla de reacción se enfrió y se lavó con una solución de Na2SO3 (2 x 600 ml, concentración saturada al 50 %), agua (500 ml) y salmuera (600 ml). La capa orgánica se secó con MgSO4 y se decoloró por carbón. La capa orgánica se concentró para dar éster metílico del ácido 2-bromometil-3- (terc-butil-dimetil-silaniloxi)-benzoico como un aceite marrón claro (96 g, 91 % de rendimiento bruto). El compuesto se usó en la siguiente etapa sin purificación adicional. LCMS M-Br = 279; 1H RMN (DMSO-de) 50,05 - 0,11 (m, 6H, CH3 , CH3), 0,82 (s, 9H, CH3 , CH3 , CH3), 3,65 (s, 3H, CH3), 4,74 (s, 2H, CH2), 6,94 (dd, J = 1,3, 8,1 Hz, 1H, Ar), 7,10 - 7,20 (m, 1H, Ar), 7,21 - 7,29 (m, 1 H, Ar).
6.1.4 Ester metílico del ácido 4-carbamoil-butírico
Figure imgf000033_0003
A una solución agitada de 2- (bromometil)-3-(terc-butildimetilsililoxi) benzoato de metilo (137,5 g, 325 mmol) en acetonitrilo (1100 ml) en un matraz de fondo redondo de 2 l, se añadió clorhidrato de metil 4,5-diamino-5-oxopentanoato (70,4 g, 358 mmol). A la suspensión se le añadió DIPEA (119 ml, 683 mmol) a través de un embudo de adición durante 10 minutos y la suspensión se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora antes de calentar la mezcla en un baño de aceite a 40 °C durante 23 horas. La mezcla de reacción se concentró al vacío. El residuo se agitó en éter (600 ml) y precipitó un sólido blanco. Se filtró la mezcla y se lavó el sólido con éter (400 ml). El filtrado se lavó con HCl (1 N, 200 ml), NaHCÜ3 (sat. 200 ml) y salmuera (250 ml). La capa de ácido acuosa y la capa básica se mantuvieron por separado. A continuación, el sólido se lavó adicionalmente con éter (250 ml) y el líquido se lavó con la solución ácida anterior y la solución básica. Las dos capas orgánicas se combinaron y se concentraron al vacío para dar ester metílico del ácido 4-[4-(terc-butil-dimetil-silaniloxi)-1 -oxo-1,3-dihidro-isoindol-2-il]-4-carbamoil-butírico como un aceite marrón (152 g, 115 % de rendimiento bruto, 77 % de pureza por H RMN). El compuesto se usó en la siguiente etapa sin purificación adicional: LCMS MH = 407.
6.1.5 Ester metílico del ácido 4-carbamoil-4-(4-hidroxi-1-oxo-1,3-dihidro-isoindol-2-il) -butírico
Figure imgf000034_0001
A una solución fría agitada de 5-amino-4-(4-(terc-butildimetilsililoxi)-1 -oxoisoindolin-2-il) -5-oxopentanoato de metilo (152 g, 288 mmol) en DMF (500 ml) y agua (55 ml), se le agregó por K2CO3 (19,89 g, 144 mmol) en porciones durante 5 minutos. La mezcla de reacción resultante se agitó a temperatura ambiente durante 40 minutos. La mezcla de reacción se enfrió en un baño de hielo. A la mezcla se añadió lentamente HCl (12 M, 23,99 ml, 288 mmol). Después de la adición, se añadió acetonitrilo (280 ml) a la mezcla y precipitó un sólido. La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 10 minutos y se filtró. El sólido se lavó con acetonitrilo (50 ml x 4). El filtrado se concentró a alto vacío para dar un aceite amarillo (168 g). El aceite se disolvió en acetonitrilo (600 ml) y se agitó a temperatura ambiente durante 10 minutos. La mezcla se filtró y el sólido se lavó con acetonitrilo (25 ml x 2). El filtrado se concentró a alto vacío para dar un aceite amarillo (169 g), que se añadió a una mezcla de agua (1200 ml) y éter (1000 ml). La mezcla se agitó durante 3 minutos y las capas se separaron. La solución acuosa se concentró a alto vacío y el residuo se agitó en acetonitrilo (160 ml) y se formó un sólido blanco después de agitar durante la noche. La mezcla se filtró para dar éster metílico del ácido 4-carbamoil-4-(4-hidroxi-1 -oxo-1,3-dihidro-isoindol-2-il) -butírico como un sólido blanco (46 g, 54 % de rendimiento). El filtrado se concentró y el residuo se cristalizó adicionalmente en acetonitrilo (60 ml) para dar más éster metílico del ácido 4-carbamoil-4-(4-hidroxi-1 -oxo-1,3-dihidro-isoindol-2-il)-butírico como un sólido blanco (11,7 g, 14 % de rendimiento). El filtrado se concentró y el residuo se purificó por cromatografía ISCÜ para dar más éster metílico del ácido 4-carbamoil-4- (4-hidroxi-1 -oxo-1,3-dihidro-isoindol-2-il) -butírico como un blanco sólido (13,2 g, 15 % de rendimiento). El producto total obtenido fue 70,9 g con un rendimiento del 83 %: LCMS MH = 293; 1H RMN (DMSÜ-de) ó 1,95 - 2,34 (m, 4H, CH2 , CH2), 3,51 (s, 3H, CH3), 4,32 (d, J = 17,6 Hz, 1 H, CHH), 4,49 (d, J = 17,4 Hz, 1 H, CHH), 4,73 (dd, J = 4,7, 10,2 Hz, 1H, CHH), 6,99 (dd, J = 0,8, 7,9 Hz, 1H, Ar), 7,10 - 7,23 (m, 2H, Ar, NHH), 7,25 - 7,38 (m, 1H, Ar), 7,58 (s, 1H, NHH), 10,04 (s, 1H, OH).
6.1.6 3-(4-((4-(morfolinometil) bencil) oxi)-1-oxoisoindolin-2-il)piperidina-2,6-diona
Figure imgf000034_0002
Etapa 1: a la solución de 3-(4-h¡drox¡-1-oxo-1,3-d¡h¡dro-¡so¡ndol-2-¡l) -piper¡d¡na-2,6-diona (2,5 g, 8,56 mmol) en THF (60 ml) se añad¡ó tr¡fen¡lfosf¡na (polímero soportado 1,6 mmol / g, 12 g, 18,8 mmol). Se ag¡tó la mezcla a temperatura amb¡ente durante 15 m¡nutos. Se añad¡ó azod¡carbox¡lato de d¡¡soprop¡lo (3,96 ml, 18,8 mmol) a 0 °C, y la mezcla se ag¡tó a 0 °C durante 30 m¡nutos. Se añad¡ó (4-morfol¡n-4-¡lmet¡l-fen¡l)-metanol (2,62 g, 12,4 mmol) a 0 °C, y la mezcla se dejó calentar a temperatura amb¡ente y se agitó a temperatura amb¡ente durante la noche. Se f¡ltró la mezcla de reacc¡ón y se concentró el f¡ltrado. El ace¡te resultante se pur¡f¡có en una columna de gel de síl¡ce elu¡da con cloruro de met¡leno y metanol (grad¡ente, el producto sal¡ó a metanol al 6 %) para dar éster metíl¡co del ác¡do 4-carbamo¡l-4-[4-(4-morfol¡n-4-¡lmet¡l-benc¡lox¡) -1-oxo-1,3-dihidro-isoindol-2-il] -butír¡co (2,2 g, 54 % de rend¡m¡ento). El producto se usó en la s¡gu¡ente etapa s¡n purificación ad¡c¡onal.
Paso 2: A la soluc¡ón de THF (50 ml) de éster metíl¡co del ác¡do 4-carbamo¡l-4-[4-(4-morfol¡n-4-¡lmet¡l-benc¡lox¡) -1-oxo-1,3-dihidro-isoindol-2-il]-butírico se añad¡ó éster (2,2 g, 4,57 mmol) de terc-butóx¡do de potas¡o (0,51 g, 4,57 mmol) a 0 °C. La mezcla se agitó a 0 °C durante 10 m¡nutos y se ¡nact¡vó con HCl 1N (5 ml, 5 mmol) segu¡do de NaHCÜ3 saturado (25 ml). La mezcla se extrajo con EtOAc (2 x 50 ml). Se lavó la capa orgán¡ca con agua (30 ml), salmuera (30 ml), se secó sobre MgSO4 y se concentró. Al sól¡do resultante se le añad¡ó EtOAc (10 ml) segu¡do de hexano (10 ml) con ag¡tac¡ón. La suspens¡ón se f¡ltró para dar 3-(4-((4- (morfol¡nomet¡l) benc¡l) oxi)-1-oxoisoindolin-2-¡l)p¡per¡d¡na-2,6-d¡ona como un sól¡do blanco (1,5 g, 73 % de rend¡m¡ento). HPLC: Waters Symmetry C18, 5gm, 3,9 x 150 mm, 1 mL/m¡n, 240 nm, grad¡ente a 95/5 aceton¡tr¡le/0,1 % H3 PO4 ¡n 5 m¡n,: tR = 4,78 m¡n (97,5 %); mp: 210-212 °C; 1H RMN (DMSO-ds) 5 1,86 - 2,09 (m, 1H, CHH), 2,29 - 2,38 (m, 4H, CH2 ,CH2), 2,44 (dd, J = 4,3, 13,0 Hz, 1H, CHH), 2,53 - 2,64 (m, 1H, CHH), 2,82 - 2,99 (m, 1H, CHH), 3,46 (s, 2H, CH2), 3,52 - 3,61 (m, 4H, CH2 ,CH2), 4,18 -4,51 (m, 2H, CH2), 5,11 (dd, J = 5,0, 13,3 Hz, 1H, NCH), 5,22 (s, 2H, CH2), 7,27 - 7,38 (m, 5H, Ar), 7,40 - 7,53 (m, 3H, Ar), 10,98 (s, 1H, NH) 13C RMN (DMSO-ds) 522,36, 31,21,45,09, 51,58, 53,14, 62,10, 66,17, 69,41, 114,97, 115,23, 127,64, 128,99, 129,81, 129,95, 133,31, 135,29, 137,68, 153,50, 168,01, 170,98, 172,83; LCMS: 465; Anál¡s¡s calculado para C25H27N3O5 + 0,86 H2O: C, 64,58; H, 6,23; N, 9,04; Se encontró: C, 64,77; H, 6,24; N, 8,88.
(S)-3-(4-((4-(morfol¡nomet¡l) benc¡l) ox¡)-1 -oxo¡so¡ndol¡n-2-¡l)p¡per¡d¡na-2,6-d¡ona y (R)-3-(4-((4-(morfol¡nomet¡l) benc¡l) ox¡)-1-oxo¡so¡ndol¡n-2-¡l)p¡per¡d¡na-2,6-d¡ona se prepararon a part¡r de 3-(4-((4- (morfol¡nomet¡l) benc¡lo ) ox¡)-1-oxo¡so¡ndol¡n-2-¡l) p¡per¡d¡na-2,6-d¡ona por separac¡ón qu¡ral.
6.2 EJEMPLO 2: EFECTO EN LA EXPRESIÓN DE FACTORES DE TRANSCRIPCIÓN EN EL MODELO DE DIFERENCIACION DE CELULAS B HUMANAS PRIMARIAS
En este ejemplo, el efecto de (S)-3-[4-(4-morfol¡n-4-¡lmet¡lbenc¡lox¡)-1 -oxo-1,3-d¡h¡dro-¡so¡ndo-2-¡l]p¡per¡d¡na-2,6-d¡ona (compuesto de ensayo) sobre la expres¡ón de factores de transcr¡pc¡ón controlando la d¡ferenc¡ac¡ón de células plasmát¡cas y la producc¡ón de ¡nmunoglobul¡nas, usando un s¡stema de cult¡vo de d¡ferenc¡ac¡ón de células B humanas in vitro.
L n r r l z n n m l
Figure imgf000035_0001
Figure imgf000036_0001
Se obtuvieron 50 ml de la capa leucocitaria de donantes sanos del Blood Center de Nueva Jersey. Las muestras de Lupus PBMC de LES se obtuvieron de Conversant Bio (Huntsville, Alabama 35806).
Los si uientes reactivos de cultivo celular se usaron en este estudio.
Figure imgf000036_0002
Los si uientes fueron utilizados en el análisis de citometría de fluo.
Figure imgf000036_0003
Se utilizaron los siguientes cebadores de genes para RT-PCR:
Figure imgf000037_0001
6.2.1 Purificación de hPBMCs
Se dividieron en alícuotas de cincuenta ml de capa leucocitaria humana, 25 ml cada una en dos tubos cónicos de 50 ml y se añadieron 25 ml de HBSS estéril a cada tubo cónico. Los tubos se mezclaron suavemente por inversión. Quince ml de Ficoll-Paque Plus (GE Healthcare; cat # 17-1440-02) a temperatura ambiente se dividieron en alícuotas en cuatro tubos cónicos de 50 ml. A continuación, se colocaron en capas suave y lentamente 25 ml de la mezcla de capa leucocitaria / HBSS sobre el Ficoll. Las muestras se centrifugaron a 450 rpm durante 35 minutos. El plasma que contiene la capa superior se pipeteó y se desechó. La interfaz que contiene células mononucleares se transfirió a dos tubos cónicos de 50 ml. Ambos tubos cónicos se llenaron hasta un volumen total de 50 ml con HBSS y se centrifugaron a 1200 rpm durante 10 minutos. Las células se lavaron nuevamente en HBSS y se centrifugaron a 1000 rpm durante 10 minutos. El sedimento celular se resuspendió con 20 ml de medio de células B (Iscoves 10 % PFBS, 1 % P/S y 5 pg/ml de insulina humana) y se contó en el contador celular.
6.2.2 Enriquecimiento de células B CD19+
Las PBMC purificadas se contaron y se dividieron en alícuotas a 2x108 células por tubo. Las células se centrifugaron a 1200 rpm durante 5 minutos y a continuación se descartaron los sobrenadantes. Las células se resuspendieron en 4 ml de Tampón Robosep (catálogo Stemcell Technologies # 20104) y se transfirieron a un tubo de fondo redondo de poliestireno de 14 ml (catálogo BD # 352057) y se mezclaron bien. Luego se agregaron 200 pL de cóctel de enriquecimiento de células B EasySep Human B (catálogo StemCell Technologies # 19054). Las muestras se agitaron en vórtex y se incubaron a temperatura ambiente durante 10 minutos. A continuación, se agregaron al tubo 300 pL de partículas magnéticas EasySep (en vórtice) (catálogo StemCell Technologies # 19054). Las muestras se agitaron en vórtex y se incubaron a temperatura ambiente durante 5 minutos. Después de 5 minutos de incubación, se añadieron 5 ml de tampón Robosep al tubo y se mezcló bien pipeteando hacia arriba y hacia abajo. El tubo se colocó inmediatamente en el imán plateado (catálogo StemCell Technologies # 19054) y se incubó a temperatura ambiente durante 5 minutos. Después de la incubación, en un movimiento continuo, se invirtió el imán y el tubo y se vertió la fracción deseada en un cónico de 50 ml. Estos procedimientos se repitieron para los PBMC restantes (por un donante) y se combinaron. La fracción combinada se centrifugó a 1200 rpm durante 5 minutos y luego se descartaron los sobrenadantes y las células se resuspendieron en 5 ml de medio de células B. Las células CD 19+ aisladas se contaron en el contador celular.
6.2.3 Ensayo de diferenciación de células B
Etapa 1 - Activación de células B - día 0 hasta el día 4: Prepare un cóctel fresco de células B agregando 50 pg / ml de transferrina humana a los medios de células B. (Iscoves 10 % PFBS, 1 % P / S y 5 pg / ml de insulina humana). Filtre el volumen requerido de medios necesarios para experimentar a través de un filtro de 0.22 pM. Agregue el cóctel de diferenciación de células B (concentración final): IL-2 humana recombinante (20U / ml), IL-10 (50 ng / ml), IL-15 (10 ng / ml), ligando CD40 / TNFSF5 / marcado con histidina (50 ng / ml), anticuerpo IgGI de ratón poliHistidina (5 pg / ml) y ODN 2006- ligando TLR9 humano (10 pg / ml) a las células. Cinco mililitros (1x105/ml) de células B CD19+ se añadieron a cada pocillo de una placa de fondo plano de 6 pocillos (recuento final de células = 5x105/pocillo). Se agregaron cinco pL (1x) ± compuesto / DMSO a cada pocillo de prueba (DMSO final al 0,1 %) y se incubaron a 37 °C durante 4 días.
Etapa 2 - Generación de plasmablastos - día 4 al día 7: las células se cosecharon y se contaron en el contador celular; Se retiró una alícuota para el análisis de flujo, las células restantes se lavaron con PBS. Prepare un cóctel fresco de células B agregando 1 pg/ml de transferrina humana a los medios de células B. (Iscoves 10 % PFBS, 1 % P / S y 5 pg / ml de insulina humana). Filtre el volumen requerido de medios necesarios para experimentar a través de un filtro de 0.22 pM. Agregue el cóctel de diferenciación de células B (concentración final): IL-2 humana recombinante (20U/ml), IL-10 (50 ng/ml), IL-15 (10 ng/ml), IL-6 (50 ng/ml) a las células. Agregue un cóctel de células B frescas y transfiera las células nuevamente a los pocillos originales y lleve el volumen nuevamente a 5 ml. Se agregaron cinco pL (1x) ± compuesto / DMSO a cada pocillo de prueba (DMSO final al 0,1 %) y se incubaron a 37 °C durante 4 días.
El día 7, las células se recogieron y se contaron en el contador celular. A continuación, las células se dividieron para análisis de flujo y las células restantes se lisaron con tampón RLT y se almacenaron a -80 °C para extracción de ARN y expresión génica. Los sobrenadantes se dividieron en partes alícuotas y se congelaron a -20 °C para los ensayos de inmunoglobulina.
6.2.4 Preparación de soluciones de stock de compuestos de ensayo y diluciones
Los compuestos de ensayo se pesaron y se disolvieron en DMSO 100 % estéril (dimetilsulfóxido; Research Organics, Cleveland, OH) para crear 40 mM de una solución madre. Se usaron diluciones de la reserva de 40 mM en el ensayo para obtener concentraciones finales de compuesto de ensayo basadas en el diseño experimental.
6.2.5 Extracción de ARN y expresión génica
Se recogieron células B diferenciadas (véanse los párrafos [00226]-[00227]) para la preparación de ácido ribonucleico total (ARN) con un instrumento de extracción de ARN Qiacube (Qiagen, Valencia, CA) usando kits de mini columna giratoria QIAGEN RNeasy. El ARN purificado se transcribió inversamente en ADNc con termociclador [MJ Research; Inc., St. Bruno, Quebec, Canadá) utilizando un kit de transcriptasa inversa (Applied Biosystems). El ensayo de expresión génica se llevó a cabo utilizando el sistema 7500 RT-PCR (Applied Biosystems) por triplicado. Se ejecutó un control de ensayo de expresión génica de gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa para cada muestra y se usó como control de normalización. Para cada gen, las muestras dentro de cada experimento se normalizaron al tratamiento con DMSO al 0,1 % solo para ese punto de tiempo particular.
Los sobrenadantes (del párrafo [00228]) fueron cosechados y analizados por ELISA para la producción de IgG e IgM (ZeptoMetrix Corp. Buffalo, Nueva York).
6.2.6 Fenotipado celular
Las células B diferenciadas (véanse los párrafos [00226] -[00227]) se recogieron, contaron y dividieron en alícuotas a aproximadamente 1x106 células o menos por cada tubo de 4 ml. Las células se lavaron 1X con tampón de tinción. A continuación, las células se bloquearon con suero humano al 10 % / PBS durante 20-30 minutos. Después del bloqueo, las células se centrifugaron durante 5 minutos a 1200 rpm y se descartaron los sobrenadantes. En los 100 pL del tampón restante, se agregaron 20 pL de varios anticuerpos de flujo BD Pharmigen de acuerdo con el diseño experimental. Las células se tiñeron durante 20-30 minutos a 4 °C. Luego, las células se lavaron 2X con tampón de tinción y se descartaron los sobrenadantes. A continuación, se añadieron 500 pl de tampón de tinción o PBS a los tubos. Las muestras fueron analizadas inmediatamente o puestas a 4 °C durante la noche. Las células se tiñeron con ratón anti CD20 y CD38, CD19 y CD27 humano, o con los respectivos controles de isotipo. Todas las muestras se analizaron utilizando un citómetro de flujo FACSCanto, el software de análisis FACSDiva (BD Bioscience) y el software FlowJo Analysis.
6.2.7 Análisis de viabilidad celular
Para determinar el recuento de células vivas, las células B (véanse los párrafos [00226] - [00227]) se tiñeron con azul de tripano al 0,4 % y las células vivas se contaron usando el contador de células automatizado Countess (Invitrogen) en muestras duplicadas.
Los datos fueron graficados usando el software GraphPad Prism 5.0. Los valores IC50 se calcularon mediante regresión no lineal, la respuesta a la dosis sigmoidal limita la parte superior al 100 % y la parte inferior al 0 % permitiendo una pendiente variable. Los resultados para los compuestos de ensayo en los ensayos de Ig se expresaron como el porcentaje de inhibición en relación con los valores de DMSO de control.
El compuesto de ensayo redujo de forma dependiente de la dosis el porcentaje de plasmablastos CD20-CD38+ y aumentó el porcentaje de células B activadas por CD20+CD38+. La población de plasmablastos (cuadrante 1) era del 30,4 % en el control DMSO en el día 7, y el compuesto de ensayo redujo la población al 27,3 % a 2 nM, 2,1 % a 20 nM y 0,4 % a 200 nM (FIG. 1). El compuesto de ensayo redujo la viabilidad de las células B durante los primeros 4 días de cultivo (FIG. 2). El efecto del compuesto de ensayo sobre B y la expresión del factor de transcripción de células plasmáticas se representa en la FIG. 3. El efecto del compuesto de ensayo sobre la producción de IgG en cultivos de plasmablastos se representa en la FIG. 4)
El compuesto de ensayo inhibió de manera dependiente de la dosis la expresión de los factores de transcripción de células plasmáticas IRF4, BLIMP 1 y XBP1 significativamente. El compuesto de ensayo mejoró el factor de transcripción de células B PAX5. El efecto del compuesto de ensayo sobre B y la expresión del factor de transcripción de células plasmáticas se representa en la FIG. 5A y 5B.
El compuesto de ensayo, la pomalidomida y la lenalidomida inhiben la producción de IgG con IC50 de 0,0018 qM, 0,049 |uM y 0,32 |uM, respectivamente. Los datos indicaron que el compuesto de ensayo es 27 veces más potente que la pomalidomida para inhibir la producción de IgG durante la diferenciación de plasmablast. El efecto del compuesto de ensayo sobre la producción de IgG en cultivos de células B en los días 4, 7 y 10 se representa en la FIG. 6. El efecto del compuesto de prueba, solo y en combinación con prednisolona, sobre la producción de IgG mediante blastos de plasma / células plasmáticas diferenciadas in vitro se representa en la FIG. 7. El efecto del compuesto de ensayo sobre la expresión de CD20 / CD38 durante la diferenciación de células B en el día 7 se representa en la FIG. 8. El efecto del compuesto de ensayo sobre la viabilidad celular durante la diferenciación de plasmablastos se representa en la FIG. 9.
En células mononucleares de sangre periférica aisladas por pacientes con lupus eritematoso sistémico (LES), el compuesto de ensayo inhibió la producción de IgG e IgM con IC50s de 3,2 nM y 0.9 nM, respectivamente. Estos hallazgos indicaron que el compuesto de ensayo tiene el potencial de inhibir la diferenciación de células B al linaje de células plasmáticas, y sugirieron que el compuesto de ensayo puede ser útil en el tratamiento de trastornos autoinmunes como el LES, que se caracterizan por la sobreproducción de autoanticuerpos. El efecto del compuesto de ensayo sobre la diferenciación y la función de las células B en células PBMC de pacientes con LES se representa en la FIG. 10. La Tabla 1 muestra el efecto del compuesto de ensayo sobre las producciones de IgG e IgM en células PBMC normales y pacientes con LES.
Las FIG. 11A y 11B representan el efecto del compuesto de ensayo sobre la producción de IgG e IgM humana, respectivamente, en cultivos de células B el día 7.
Tabla 1. Potencia ara la inhibición de la roducción normal LES PBMC de I G e I M
Figure imgf000040_0001
6.3 EJEMPLO 3: ENSAYO DE DIFERENCIACIÓN DE CÉLULAS B UTILIZANDO LA CITOMETRÍA DE FLUJO Y LA CITOMETRÍA DE ESCANEADO LÁSER
Materiales de cultivo celular: se cultivaron células B normales enriquecidas y células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de pacientes con LES en el sistema de diferenciación de células B in vitro con medio IMDM (Invitrogen) y FCS al 10 %, complementado con transferrina humana e insulina humana (Sigma) más cóctel de citoquina. El compuesto de ensayo se añadió al cultivo el día 0 y el día 4.
Protocolo de diferenciación de células B: las células B enriquecidas se aislaron de una capa leucocítica fresca (unidades enriquecidas en leucocitos) mediante centrifugación en gradiente de densidad Ficoll-Hypaque seguido de incubación con un kit de enriquecimiento de células B humanas de selección negativa EasySep (tecnologías de células madre). En resumen, 2 x 108/ ml de PBMC se mezclaron con 4 ml de tampón Robosep y se transfirieron a un tubo de fondo redondo de poliestireno de 14 ml. Se añadió un cóctel de enriquecimiento de células B EasySep Human B (200pl) por tubo, se agitó vorticialmente y se incubó a temperatura ambiente durante 10 minutos. Se añadieron partículas magnéticas EasySep (300 pl por tubo) y se agitaron en vórtex y se incubaron a temperatura ambiente durante 5 minutos. Se añadió tampón Robosep (5 ml) a cada tubo y se mezcló bien pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Se colocaron tubos en el imán de plata y se incubaron a temperatura ambiente durante 5 minutos. El imán y el tubo se recogieron y se invirtieron en un movimiento continuo, vertiendo la fracción deseada en un cónico de 50 ml. Las células se centrifugaron a 1200 rpm durante 5 minutos. Se vertió el sobrenadante y se añadieron 5 ml de medio de células B fresco. Después de contar las células, se retiró una alícuota para el análisis FACS y las células restantes se usaron para el cultivo. Las células B CD19 se aislaron a ~95 % de pureza según lo determinado por citometría de flujo. Las células B purificadas se colocaron en placas a 1 x 105 célula / ml en una placa estéril de 6 pocillos a 5 ml por pocillo. Todos los cultivos celulares se realizaron en medio IMDM (Invitrogen) y FCS al 10 %, suplementado con transferrina humana e insulina humana (Sigma). La activación de células B, la generación de PB y la generación de PC se realizaron en base al sistema in vitro modificado de diferenciación de células B en células plasmáticas. Todas las citoquinas humanas recombinantes IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-15, INF-a y CD40L y mAb anti-polihistidina se añadieron en las etapas de cultivo indicadas. Se agregaron diversas concentraciones del compuesto de ensayo (2, 20 y 200 nM) al cultivo el día 0 y el día 4. En el día 4, agrupar todas las células del mismo tratamiento, contar las células, eliminar las células para el análisis FACS y la preparación de citospina. Platear las células restantes a 2.5 x 105 célula/ml en una placa estéril de 6 pocillos a 5 ml por pocillo. Las PBMC de LES se cultivaron durante 7 días en condiciones para promover la diferenciación de células plasmáticas como células B normales.
Inmunofenotipaje para análisis de citometría de flujo: las células se tiñeron usando tinción de inmunofluorescencia directa multicolor para análisis de citometría de flujo. La tinción de la superficie se realizó antes de la fijación celular y la permeabilización. Se usaron células (50 pl; 1 x 106 células/ml en tampón de lavado, FBS al 2 % con NaN3 al 0,1 % en PBS) para cada tinción. Las células se tiñeron con mAb de control de isotipo (1 pg / 106 células) y se utilizaron mAb anti-CD20 conjugado con FITC multicolor y mAb anti-CD38 conjugado con PE, o mAb anti-CD44 conjugado con PerCP-Cy5.5, mAb anti-CD83 conjugado con PE para las células B activadas el día 4 (células CD20 c D38- ), y las PB del día 4 y las PB del día 7 (CD20-CD38 ), y otras tinciones, analizadas por citometría de flujo según las instrucciones del fabricante. Se realizó la tinción intracelular de las proteínas del factor de transcripción (BCL-6, IRF-4, BLIMP-1, PAX-5 y XBP-1) e IgJ de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. El análisis de citometría de flujo se realizó con un FACSCanto utilizando FACSDiva 6 (BD Biosciences). Para el análisis de datos, se utilizó el software Flowjo (Tree Star).
Preparación de Cytospin a partir de la suspensión de células individuales y la tinción de inmunofluorescencia para iCyte: Se preparó una suspensión celular de no más de 0,5 x 106 células/ml de PBS que contenía FBS al 2 %. Se cargaron hasta 200 pl de esta suspensión en cada cubeta y se centrifugaron a 800 rpm durante 3 minutos. La cubeta y el papel se separaron cuidadosamente sin dañar la nueva citospina y se procedió a la fijación inmediata o al secado. Las citospinas no fijadas se almacenaron durante un máximo de 2 días a temperatura ambiente. Las células en los portaobjetos se fijaron con concentraciones crecientes de EtOH y se dejaron secar antes de la tinción. Después de bloquear la unión no específica con suero normal (especie igual que el anticuerpo secundario), las secciones se incubaron con la mezcla de los siguientes anticuerpos monoclonales en una cámara humidificada a temperatura ambiente durante la noche: (i) anti CD38 humano como marcador de células de plasmablast, y (ii) anti-BCL-6, IRF-4, BLIMP-1, PAX5 y XBP-1 para proteínas del factor de transcripción. Después de los lavados, los portaobjetos se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente en la oscuridad con la mezcla de anticuerpos secundarios que se criaron en diferentes especies (con dos fluorocromos diferentes, es decir., Alexa Fluor-488 y Alexa Fluor-633). A continuación, los portaobjetos se enjuagaron en PBS, se realizó tinción de contraste con DAPI durante 20 minutos a temperatura ambiente, se cubrieron con un medio de montaje fluorescente antidesvanecimiento y se sellaron con esmalte de uñas. Los portaobjetos se almacenaron en la oscuridad a 4 °C. Para excluir los falsos positivos producidos por la unión no específica del anticuerpo secundario, todos los tejidos se trataron de la misma manera con tampón sustituyendo el anticuerpo primario. Se observó el color de la tinción del anticuerpo y se analizó la cantidad en las secciones de tejido usando iCyte.
Análisis cuantitativo de citometría de escaneo láser y análisis cuantitativo de fluorescencia: Se realizó una tinción de inmunofluorescencia de doble color en células que fueron citoespinadas en portaobjetos (Cytospin 4, Thermo scientific) basado en el procedimiento estándar de IHC. La captura de imágenes y el análisis cuantitativo de fluorescencia se realizaron utilizando una citometría de escaneo láser (citometría de imagen cuantitativa iCys, CompuCyte). Se establecieron dos pases (primer pase para 488 y segundo pase para 405/633). Se usó escaneo de baja resolución para el escaneo de mosaico y escaneo de alta resolución para el escaneo y análisis de regiones. En resumen, el portaobjetos se colocó en la etapa LSC y se seleccionó una región para escanear. El LSC utilizó el láser de argón que funciona a 5 mW. El portaobjetos se escaneó con el objetivo 20X. Las células se identificaron y seleccionaron contorneando en fluorescencia azul y un tamaño de célula mínimo, según lo determinado por la tinción DAPI. El umbral de detección de células se estableció para seleccionar células individuales en función de la dispersión de la luz de ángulo directo que se muestra en un gráfico de puntos del área de la célula frente a la integral de dispersión directa. Los eventos de dispersión de luz láser fueron capturados y utilizados para contornear celdas individuales dentro de la pantalla de datos de escaneo. La discriminación de contorno se estableció a partir de la porción nuclear de la celda escaneada de manera que aproximadamente el 67 % de la pixelación de dispersión de luz total se contorneó. Los voltajes de ganancia del detector PMT verde y rojo largo se configuran de modo que no se alcance una saturación máxima superior al 75 % del píxel máximo en los campos respectivos durante el escaneo. Después de establecer el área de escaneo, el portaobjetos se analizó utilizando un objetivo 40X. Se examinó un mínimo de 6 áreas de escaneo para cada portaobjetos. Se creó una galería de células mediante la reubicación de células de cada uno de los picos principales en el histograma de fluorescencia roja larga integrada. La composición morfológica de las células reubicadas se examinó con fines de garantía de calidad. Los datos se pueden analizar en modo integrado de fluorescencia logarítmica o en modo lineal de píxeles máximos. Diferentes poblaciones de células en el escaneo LSC se puntuaron como porcentaje e IMF, y comparación cuantitativa con controles DMSO.
Análisis de datos: FACSCanto analizó la superficie de citometría de flujo y las moléculas intracelulares. El análisis de datos fue realizado por Flowjo. Se observó el color de la tinción del anticuerpo y se analizó la cantidad en las secciones de tejido usando iCyte. Diferentes poblaciones de células en el escaneo FCM y LSC se puntuaron como porcentaje e IMF, y comparación cuantitativa con controles DMSO. Los datos se expresaron como media ± SEM. Todos los datos se graficaron usando GraphPad Prism 6.1 (GraphPad Software; San Diego, CA). El análisis estadístico se realizó mediante ANOVA de una vía (prueba de comparación múltiple de Dunnett) y prueba t de Student emparejada. Valores P menores o iguales a 0.05 se consideraron significativos.
Las células B se cultivaron usando el sistema in vitro modificado para la diferenciación de células B en células plasmáticas como se describió anteriormente. Se usaron mAb anti-CD20 conjugado con FITC multicolor y mAb anti-CD38 conjugado con PE para las células B activadas el día 4 (células CD20 CD38-) y plasmablastos (PB) del día 7 (CD20-CD38 ). Los datos de 3 experimentos separados representativos de 3 donantes se muestran en la Tabla 2. Los resultados mostraron que el compuesto de ensayo tuvo un efecto significativo sobre la diferenciación de células B al linaje de células de plasmablasto / plasma. Aumentó las células B activadas y redujo los plasmablastos, también redujo la viabilidad celular con el tiempo (Figuras 12A y 12B). Las células B activadas (células CD20+CD38-) tratadas con el compuesto de ensayo (20 nM) no cambiaron significativamente entre el día 4: (57,9 % ± 11,5 %) y el día 7 (50,5 % ± 8,6 %), pero el compuesto de ensayo aumentó significativamente las células B activadas en comparación con el control del vehículo (DMSO) en el día 4 (42,1 % ± 1,5 %, p <0,05) y en el día 7 (12,5 % ± 5,7 %, p <0,05). Mientras tanto, el compuesto de ensayo redujo significativamente los plasmablastos / células plasmáticas (CD20-CD38+) en el día 4 (4,8 % ± 2,3 %) y en el día 7 (9,7 % ± 5,4 %) en comparación con el control DMSO (día 4, 25,9 % ± 2,4 % p <0,05; y en el día 7, 54,8 % ± 5,0 %, p <0,001). Además, el compuesto de ensayo redujo la población de células de gran tamaño dependiente de la dosis (puerta p2) en el ensayo de diferenciación de células B normales (Figura 13). El porcentaje de células de gran tamaño en el día 4 del compuesto de ensayo tratado fue del 31,2 %, 23,1 % y 20,4 % para tratamientos 2 nM, 20 nM y 200 nM respectivamente. El porcentaje de células de gran tamaño en el día 7 del compuesto de ensayo tratado fue 34,9 %, 19,9 %) y 11,94 % para tratamientos 2 nM, 20 nM y 200 nM respectivamente. En comparación con el control DMSO, el número estaba en 35,5 % y 34,9 % en el día 4 y el día 7 respectivamente.
Tabla 2. El com uesto de ensa o inhibe la diferenciación de lasmablastos
Figure imgf000042_0001
El efecto del compuesto de ensayo sobre la expresión del factor de transcripción de células Bcell y plasma (BCL-6, IRF-4, BLIMP-1, PAX5 y XBP-1) se evaluó mediante el procedimiento de citometría de flujo. Las células B se cultivaron como se describe anteriormente y las células se recogieron el día 4, día 7 para la tinción de inmunofluorescencia. Las células se tiñeron primero para CD20 y CD38, y después de la permeabilización celular, se tiñeron para BCL-6, IRF-4, BLIMP-1, PAX5 y XBP-1, y a continuación se analizaron mediante la activación de linfocitos completos. Los datos de 3 experimentos representativos de 3 se muestran en la FIG. 14. Los resultados indicaron que el compuesto de ensayo (20 nM) causó un cambio en la expresión del factor de transcripción en plasmablastos / células plasmáticas. Disminuyó significativamente la expresión de IRF-4 (p <0,5), BLIMP-1 (p <0,05) y XBP-1 (p <0,05) en el día 4, pero aumentó significativamente BCL-6 (p <0,05) en el día 7.
La citometría de escaneo láser (iCyte) se usó para el análisis cuantitativo para confirmar los resultados de citometría de flujo descritos anteriormente. Las células B de donantes normales y PBMC de pacientes con LES se cultivaron como se describe en el procedimiento anterior. Las células se recolectaron en el día 4 y el día 7 para que las células citoespinaran a los portaobjetos, luego se siguió con una tinción de inmunofluorescencia doble como se describe en Procedimientos. CD38 (verde) se expresó por plasmablastos / células plasmáticas, el factor de transcripción (Rojo) BCL-6, IRF-4, BLIMP-1, PAX5 o XBP-1 se colocalizó en citoplasma o núcleo. Se realizó tinción de contraste en los núcleos con DAPI (azul). En las muestras de células B normales del día 7, en comparación con el control DMSO, el compuesto de ensayo (20 nM) aumentó significativamente la expresión de BCL-6 (FIG. 15A, p <0,01), disminuyó IRF-4 (FIG. 15B, p <0,001) y Bl IMP-1 (FIG. 15C, p <0,01) en población de linfocitos completos, e incrementó significativamente la expresión de BCL-6 (p <0,05), disminuyó la expresión de IRF-4 (p <0,001), BLIMP-1 (p <0,001) y PAX-5 (FIG. 15D, p <0,05) en células plasmablásticas/plasmáticas CD38+. No hubo cambio de XBP-1 (Figura 15E) en ambas poblaciones celulares. En pacientes con LES PBMC, se probaron tres factores de transcripción: BCL-6, IRF-4 y BLIMP-1. Los datos indicaron que el compuesto de ensayo tenía una actividad similar en estos factores de transcripción que con las células donantes sanas. El compuesto de ensayo dependía de la dosis, aumentó significativamente la expresión de BCL-6 e inhibió la expresión de IRF-4 y BLIMP-1 en células plasmablásticas/plasmáticas CD38+ para diferenciar PBMC de pacientes con LES del día 4 y del día 7 (Figura 16).
Usando el mismo sistema de diferenciación in vitrode células B, se investigó adicionalmente la actividad del compuesto de ensayo en la expresión de CD44 y CD83 en la diferenciación de células B. El mAb anti-CD20 conjugado con FITC multicolor, el mAb anti-CD44 conjugado con PerCP Cy5.5 y el mAb anti-CD83 conjugado con PE se usan para las células del día 4 y del día 7. El efecto del compuesto de ensayo se evaluó a partir de 3 experimentos separados representativos de 3 donantes. Los datos indicaron que el compuesto de ensayo tenía una intensidad de fluorescencia media (MFI) CD44 dependiente de la dosis y disminuyó significativamente (FIG. 17, p <0,01) en las muestras de diferenciación de células B del día 7, lo que se debió al agotamiento de las células CD20high/CD44high (FIG. 18). El porcentaje de células CD20high/ CD44high en el día 7 del tratamiento del compuesto de ensayo a 2 nM, 20 nM y 200 nM fue 18,4 %, 10,1 % y 6,6 % de forma repetitiva, en comparación con el control DMSO del 22,2 %. El agotamiento de las células CD44+ puede reducir la adhesión de leucocitos. El compuesto de ensayo también aumentó significativamente la población total de células CD83+ y mejoró la expresión de CD83+ (FIG. 19). El porcentaje de células CD83+ en el día 4 del tratamiento del compuesto de ensayo de 2 nM, 20 nM y 200 nM fue 24,1 % ± 2,1 %, 40,2 % ± 3,6 %, 49,5 % ± 4,4 % y 18,4 %. El porcentaje de células CD83+ en el día 7 del tratamiento del compuesto de ensayo de 2 nM, 20 nM y 200 nM fue 16,3 % ± 3,3 %, 36,1 % ± 3,4 % y 51,9 % ± 0,5 %, en comparación con DMSO a 13,4 % ± 2,4 % y 12,9 % ± 3,3 en el día 4 y día 7 respectivamente.
La expresión de cadena de IgJ de alto nivel en pacientes con artritis reumatoide (AR) predice la falta de respuesta al rituximab. Para evaluar si el compuesto de ensayo tiene alguna actividad en la producción de IgJ, las células también se usaron para la tinción intracelular de IgJ. Los resultados de tres donantes indicaron que el compuesto de ensayo redujo la expresión de la cadena Ig J de forma dependiente de la dosis y significativamente en cultivos de diferenciación de células B del día 4. No solo redujo el número de células positivas para IgJ (Día 4, 20 nM a 8,4 % ± 1,5 %, 200nM a 5,4 % ± 1,8 %; Día 7, 20 nM a 13,2 % ± 2,3 % y 200 nM a 7,2 % ± 1,3, respectivamente, en comparación con el control DMSO a 13,1 % ± 1,5 % y 14,4 % ± 4,3 en el día 4 y el día 7 respectivamente), pero también disminuyó la MFI de IgJ dentro de las células positivas (Figura 20). La reducción de IgJ y la producción de IgG, IgM puede ser un marcador potencial de respuesta al compuesto de ensayo en enfermedades como la AR.
6.4 EJEMPLO 4: EFECTO DE LOS COMPUESTOS DE ENSAYO EN LA PRODUCCIÓN DE CITOQUINA Y QUIMOCINA EN CÉLULAS T HUMANAS ESTIMULADAS POR ANTI CD3 HUMANO
Este ejemplo demuestra el efecto de (S)-3-[4- (4-morfolin-4-ilmetilbenciloxi)-1 -oxo-1,3-dihidro-isoindo-2-il]piperidina-2,6-diona, (R)-3-[4-(4-morfolin-4-ilmetilbenciloxi)-1 -oxo-1,3-dihidro-isoindo-2-il]piperidina-2,6-diona y 3-[4-(4-morfolin-4-ilmetilbenciloxi)-1-oxo-1,3-dihidro-isoindo-2-il]piperidina-2,6-diona en la producción de citoquinas y quimioquinas en células T humanas estimuladas por anti CD3 humano utilizando la tecnología Luminex multiplex.
Se utilizan las siguientes abreviaturas:
Abreviatura Explicación o definición
IL Interleucina
G-CSF Factor estimulante de colonias de granulocitos
GM-CSF Factor estimulante de colonias de macrófagos de granulocitos
IFN-y Interferón gamma
TNF-a Factor de necrosis tumoral alfa
RANTES Regulado en la activación, células T normales expresadas y secretadas
Los siguientes materiales se utilizaron en este estudio:
Medio RPMI-1640 suplementado con 10 % de FBS, 100 unidades / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina y L-glutamina 2 mM (Life Technologies)
Cóctel de enriquecimiento de células T humanas RosetteSep® (StemCell, Cat# 15061)
Luminex Human Cytokine / Chemokine 12-Plex Kit (Millipore, Cat # MPXHCYTO-60K-12)
Instrumento Luminex IS100 (Millipore)
Anticuerpo anti CD3 humano, clon OKT3 (eBioscience, Cat # 16-0037-85)
Los compuestos de ensayo se prepararon como soluciones madre de 4 mM en DMSO. Las células T se aislaron de la capa leucocitaria mediante selección negativa usando el cóctel de enriquecimiento de células T RosetteSep® según los procedimientos del fabricante.
Todas las placas de 96 pocillos se recubrieron previamente con 3gg/ml de anticuerpo anti CD3 humano en 100gl de PBS 1X durante 4 horas a 37 °C. Las placas se lavaron 3 veces con RPMI-1640 Complete Media antes del ensayo de células T. A continuación, las células T se sembraron en placas pre-recubiertas con anti-CD3 a una densidad de 2,5 x 105 células/pocillo en 180 gL de RPMI-1640 Complete Media. Las células se trataron con 20 gL de compuestos de ensayo titulados 10X a 10, 1, 0,1, 0,01, 0,001, 0,0001 y 0,00001 gM por duplicado. Las concentraciones finales de DMSO fueron 0,25 %. Las placas se incubaron durante 48 horas a 37 °C, 5 % de CO2. Después de 48 horas, los sobrenadantes se cosecharon y se probaron mediante un ensayo de matriz de perlas citométricas multiplex (CBA) para las siguientes citoquinas/quimioquinas: IL-2, IL-3, IL-5, IL-10, IL-13, IL-15 , IL-17A, GM-CSF, G-CSF, IFN-y, TNF-a y RANTES. Las placas CBA se analizaron en el instrumento Luminex IS100.
Los datos de cada donante se graficaron utilizando el software GraphPad Prism 5.0 y se expresaron como pg/ml ± SEM y % de control DMSO ± SEM.
Los compuestos de ensayo demostraron actividad inmunomoduladora en células T humanas primarias estimuladas con anti-CD3, alterando la producción de varias citoquinas y quimioquinas. Los niveles basales de citoquinas y quimioquinas producidas por células T humanas estimuladas incubadas con vehículo se presentan en la Tabla 3 a continuación.
Tabla 3: niveles basales de citoquinas y quimioquinas
Citoquina / Quimiocina Cantidad basal producida (pg/ml)
IL-2 31
IL- 38
IL-5 27
IL-10 449
IL-13 205
IL-17A 19
GM-CSF 132
IFN-y 1271
TNF-a 411
RANTES 314
Los compuestos de ensayo aumentaron la producción de IL-2, IL-3, IL-5, IL-10, IL-13, GM-CSF, IFN-y, RANTES y TNF-a en células T humanas estimuladas. La mejora de la producción por los compuestos de ensayo dependía en gran medida de la concentración para la mayoría de las citoquinas y quimioquinas, excepto IL-10 e IL-5. Los compuestos de ensayo aumentaron la producción de IL-10 a concentraciones más bajas, pero inhibieron la mejora de la producción de IL-10 a concentraciones más altas. Los compuestos de ensayo aumentaron la producción de IL-5 principalmente a una concentración única dentro del intervalo de concentraciones que aumentaron la producción de otras citoquinas. Se produjeron cantidades relativamente pequeñas de IL-2, IL-3, IL-5 e IL-17A en células de control en comparación con otras citoquinas y quimioquinas (Tabla 1). La producción de IL-17A no cambió mucho por los compuestos de ensayo. No se produjeron cantidades medibles de GCSF e IL-15 en células T humanas estimuladas. El efecto de 3-[4-(4-morfolin-4-ilmetilbenciloxi)-1-oxo-1,3-dihidro-isoindo-2-il]piperidina-2,6-diona en la producción de citoquinas y quimioquinas en células T humanas estimuladas por anti CD3, expresadas como cantidad absoluta producida y como porcentaje de células de control de vehículo se proporciona en las FIG. 21 y 22, respectivamente. El efecto de (R)-3-[4-(4-morfolin-4-ilmetilbenciloxi)-1 -oxo-1,3-dihidro-isoindo-2-il]piperidina-2,6-diona en la producción de citoquinas y quimioquinas en células T humanas estimuladas por anti CD3, expresadas como cantidad absoluta producida y como porcentaje de células de control de vehículo, se proporciona en las FIG. 23 y 24, respectivamente. El efecto de (S)-3-[4-(4-morfolin-4-ilmetilbenciloxi)-1 -oxo-1,3-dihidro-isoindo-2-il]piperidina-2,6-diona en la producción de citoquinas y quimioquinas en células T humanas estimuladas por anti CD3, expresadas como cantidad absoluta producida y como porcentaje de células de control de vehículo, se proporciona en las FIG. 25 y 26, respectivamente. La línea discontinua indica el nivel equivalente al doble de la producción basal (CE200) en las FIG. 22, 24 y 26.
6.5 EJEMPLO 5: ACTIVIDAD ANTIINFLAMATORIA
Se estudiaron actividades antiinflamatorias de 3-[4-(4-morfolin-4-ilmetil-benciloxi)-1 -oxo-1,3-dihidro-isoindol-2-il] -piperidina-2,6-diona, (R)-3-[4-(4-morfolin-4-ilmetil-benciloxi)-1 -oxo-1,3-dihidro-isoindol-2-il] -piperidina-2,6-diona y (S)-3-[4-(4-morfolin-4-ilmetilbenciloxi)-1-oxo-1,3-dihidro-isoindo-2-il]piperidina-2,6-diona en células mononucleares de sangre periférica humana (hPBMC ) La tecnología Luminex se utilizó para determinar la concentración inhibitoria (mejora), IC50 para los compuestos para el perfil simultáneo de citoquinas / quimioquinas proinflamatorias e IL-10 (citoquina antiinflamatoria) de PBMC de donantes humanos sanos estimulados con LPS.
Se obtuvieron 50 ml de la capa leucocitaria de donantes sanos del Blood Center de Nueva Jersey (East Orange, Nueva Jersey). El lipopolisacárido (cepa) (Cat# L-1887) se adquirió de Sigma. Los kits Milliplex con perlas unidas a anticuerpos para Luminex xMAP Technology se compraron de Millipore (Billerica, Massachusetts) y se combinaron en formato multiplex antes del ensayo.
6.5.1 Purificación de células mononucleares de sangre periférica humana
Se dividieron en alícuotas de 50 ml de capa leucocitaria humana de 25 ml cada una en dos tubos cónicos de 50 ml y se añadieron 25 ml de HBSS estéril a cada tubo cónico. Los tubos se mezclaron suavemente por inversión. Quince ml de Ficoll-Paque Plus (GE Healthcare (ubicación); cat# 17-1440-02) a temperatura ambiente se dividieron en alícuotas en cuatro tubos cónicos de 50 ml. A continuación, se colocaron en capas suave y lentamente 25 ml de la mezcla de capa leucocitaria / HBSS sobre el Ficoll. Las muestras se centrifugaron a 450 rpm durante 35 minutos. El plasma que contiene la capa superior se pipeteó y se desechó. La interfaz que contiene células mononucleares se transfirió a dos tubos cónicos de 50 ml. Ambos tubos cónicos se llenaron hasta un volumen total de 50 ml con HBSS y se centrifugaron a 1200 rpm durante 10 minutos. Las células se lavaron nuevamente en HBSS y se centrifugaron a 1000 rpm durante 10 minutos. La pastilla celular se resuspendió con 20 ml de medio RPMI completo (RPMI / suero humano al 5 % / 1x Penicilina-Estreptomicina-Glutamina) y se contó.
6.5.2 Tratamiento de células mononucleares de sangre periférica humana
Se añadieron cien pl (2x106 / ml) de hPBMC a cada pocillo de una placa de fondo plano de 96 pocillos (recuento final de células = 2x105 / pocillo) y se incubaron a 37 °C durante 1 hora. Se agregaron veinte pl (10x) de compuesto a cada pocillo de prueba y se agregaron veinte pl de medio que contenía DMSO al 2,5 % a cada pocillo de control ([DMSO] final = 0,25 %) y la placa se incubó durante 1 hora a 37 °C. A continuación, las células se estimularon con 8 0 pl de 2,5 ng / ml de LPS ([LPS] final = 1 ng / ml) y se incubaron durante 18 horas a 37 °C.
Se transfirieron 50 pl de sobrenadante de cada pocilio a 3 nuevas placas de 96 pocilios de fondo redondo y se almacenaron a -20 °C para el análisis Luminex. Se realizaron pozos duplicados para cada muestra.
6.5.3 Análisis Luminex
Las muestras de sobrenadante se analizaron para citoquinas en formato multiplex de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Millipore, Billerica, Ma 01821) utilizando un instrumento Luminex IS100. Los análisis de IL-12 y GM-CSF se realizaron en un formato de dos pliegues utilizando sobrenadantes puros, mientras que todas las demás citoquinas se realizaron en un formato multiplex utilizando sobrenadantes diluidos 1:20. El análisis de datos se realizó utilizando el software Upstate Beadview. Se calcularon los IC50 utilizando regresión no lineal, respuesta a la dosis sigmoidea, limitando la parte superior al 100 % y la inferior al 0 %, lo que permite una pendiente variable. Los EC50 se basaron en la restricción superior de las curvas sigmoidales que equivalía al 246,9 %, lo que representa la mejora promedio de IL-10 producida por la pomalidomida (control) a 10 pM y la restricción inferior al 100 %. Los IC50 se realizaron con GraphPad Prism v5.00. Los valores de los datos representan la media SEM (error estándar de la media) de n (número de experimentos por duplicado).
Como se demuestra por los datos en la Tabla 4 a continuación y las Figs. 27, 29 y 31, los compuestos de ensayo tienen potencias variadas para las inhibiciones de las múltiples citoquinas examinadas, por ejemplo, 11 -6, IL-8, IL-1 p, GM-CSF, MDC, MIP-1a, MIP-1p y TNF -a, en general. Además, estos compuestos aumentaron la producción de IL-10, MCP-1 y RANTES con diversas potencias como se proporciona en la Tabla 5 y las Figuras 28, 30 y 32.
Tabla 4: Resumen del erfil inhibidor de cito uinas de los com uestos de ensa o
Figure imgf000046_0001
Tabla 5: Resumen del erfil de cito uinas de: % medio de control a 0,1 M
Figure imgf000046_0002
6.6 EJEMPLO 6: EFECTO EN LA FUNCIÓN DE CÉLULAS ASESINAS NATURALES (NK) EN RESPUESTA A IGG / RITUXIMAB
En este ejemplo, se estudió la capacidad de los compuestos de ensayo para mejorar la función de las células NK humanas en respuesta a IgG / Rituximab. La actividad inmunomoduladora de los compuestos de ensayo se comparó en dos ensayos de funciones de células asesinas naturales (NK) (1) y producción de interferón gamma (IFN-y) inducida por IgG e IL-2.
Los materiales utilizados en el estudio y sus fuentes se proporcionan a continuación:
Capa leucocitaria de voluntarios sanos (Blood Center de Nueva Jersey)
Ficoll-Hypaque Plus (Fisher Scientific Co LLC, PA, Cat # 17144002)
RPMI-1640 Medio suplementado con 10 % de FBS (suero bovino fetal), 100 unidades / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina y L-glutamina 2 mM (Invitrogen, Cat # 21870-076)
Medio RPMI-1640 (sin rojo fenol) suplementado con 10 % de FBS, 100 unidades / ml de penicilina,
100 mg / ml de estreptomicina y L-glutamina 2 mM (Invitrogen, Cat # 11835-030)
Rituximab (Rituxan, Roche, Inc.) (Cat No. DIN 02241927, Lote No. B50177)
Suero AB humano (Gemini Bio Products, CA, Cat # 100-512)
Kit de ensayo de citotoxicidad no radioactiva CytoTox 96 (Promega, WI, Cat # G1780)
Cóctel RosetteSep Human NK Cell Enrichment (Stem Cell Technologies, Vancouver, BC, Cat # 15065) Ratón anti CD56+ humano APC conjugado (BD Biosciences, CA, Cat # 555518)
Inmunoglobulina G humana de suero (IgG) (Sigma, St. Louis, m O; Cat # 12511-10MG)
Human Recombinant IL-2 (R&D Systems, MN, Cat # 202-IL-050 / CF)
Kit de ELISA de IFN-gamma humano (ThermoFisher, Cat # PIEHIFNG5)
Se utilizaron las siguientes líneas celulares:
Tipo de célula B activada: linfoma difuso de células B grandes (ABC-DLBCL): células Riva (NCI, MD)
Tipo de célula B de centro germinal: linfoma difuso de células B grandes (GCB-DLBCL):
WSU-DLCL2 (Celgene Signal, CA)
Farage (ATCC, VA)
Linfoma folicular: DoHH2 (DSMZ, Alemania)
Linfoma de Burkitt (BL): Raji (At Cc , VA).
Las células NK de donantes sanos se aislaron de la sangre de la capa leucocitaria mediante selección negativa usando el cóctel de enriquecimiento de células RosetteSep NK (Stem Cell Technologies, Vancouver, BC) antes de la centrifugación en gradiente de densidad Ficoll-Hypaque (Fisher Scientific Co LLC, PA) según las instrucciones del fabricante. Las células CD56 NK se aislaron a ~85 % de pureza, según lo determinado por citometría de flujo (BD Biosciences, CA).
6.6.1 Ensayo de interferón-gamma (IFN-gamma) inducido por NK IgG
Se recubrieron placas de fondo plano de noventa y seis pocillos con 100 pg / ml de IgG humana (Sigma) durante la noche a 4 °C. Al día siguiente, la IgG no unida se lavó con 1X PBS frío. A continuación, las células NK se sembraron en placas de 96 pocillos recubiertas con IgG a 2 x 105 células por pocillo en 180 pl de medio RPMI - 1640 y se añadieron 10 ng/ml de rhIL - 2 (R & D Systems, MN). Los compuestos de ensayo se añadieron en un volumen de 20 pl de DMSO. Las concentraciones finales de los compuestos de ensayo fueron 0,0001, 0,001,0,01,0,1, 1 o 10 pM. Las concentraciones finales de DMSO fueron 0,25 %. Después de 48 horas, los sobrenadantes fueron cosechados y analizados por ELISA para la producción de IFN-y.
Los datos utilizados para determinar la capacidad de los compuestos de ensayo para mejorar la producción de IFN-y de células NK en respuesta a la estimulación de IgG inmovilizada y rhIL-2 se analizaron para cada donante utilizando el software GraphPad Prism v5.0. Los datos se presentan de dos maneras, (1) como la cantidad absoluta de IFN-y producida (pg / ml ± SEM) y (2) como el porcentaje de la cantidad de IFN-y producida en presencia de 1 pM de pomalidomida. El EC50 es la concentración del compuesto de ensayo que proporciona la producción de IFN-y semi máxima, con la producción máxima definida como la cantidad de IFN-y producida en presencia de pomalidomida 1 pM. Los valores de EC50 se calcularon utilizando una regresión no lineal, la respuesta sigmoidal a la dosis limitaba la parte superior al 100 % y la inferior al 0 % permitiendo una pendiente variable.
Tabla 6
Compuesto CE50
Racemato 0,037 pM
Enantiómero R 0,016 pM
Enantiómero S 0,012 pM
Los compuestos de ensayo aumentaron la producción de IFN-y de células NK de una manera dependiente de la dosis en respuesta a la estimulación de IgG e IL-2 inmovilizadas. Resultados para el racemato, enantiómeroR y enantiómero S se proporcionan en las Figs. 33-35 (expresado como pg / ml de I FN-y producido), respectivamente. Las figs. 36-38 proporcionan resultados expresados como un porcentaje del aumento de I FN-y producido en relación con el I FN-y producido en presencia de pomalidomida a 1 pM para el racemato, enantiómero R y enantiómero S, respectivamente. Cada valor trazado en las Figs. 33-38 representa la media de las determinaciones 12-14 ± SEM.
6.7 EJEMPLO 7: ENSAYOS DE PROLIFERACIÓN DE CÉLULAS ENDOTELIALES VASCULARES HUMANAS, FORMACIÓN DE TUBOS, MIGRACIÓN E INVASIÓN
En este ejemplo, racemato se refiere a 3-[4- (4-morfolin-4-ilmetilbenciloxi) -1 -oxo-1,3-dihidro-isoindo-2-il] piperidina-2.6- diona, enantiómero R se refiere a (R)-3-[4-(4-morfolin-4-ilmetilbenciloxi)-1-oxo-1,3-dihidro-isoindo-2-il]piperidina-2,6-diona y enantiómero S se refiere a (S)-3-[4-(4-morfolin-4-ilmetilbenciloxi)-1 -oxo-1,3-dihidro-isoindo-2-il]piperidina-2.6- diona.
Ensayo de proliferación de células endoteliales vasculares umbilicales humanas: Las células endoteliales vasculares umbilicales humanas se descongelaron y cultivaron en medio EGM2 hasta el paso 3 a 6 para todos los ensayos de proliferación. Las células endoteliales vasculares umbilicales humanas se tripsinizaron, se lavaron con medio FBS al 20 % / M199 y se sembraron en placas con el mismo medio a 104 células / 100 pl por pocillo en placas de cultivo celular de 96 pocillos. Las placas se incubaron durante la noche a 37 °C para permitir que las células se adhieran. Se dejó que las células pasaran hambre en medio FBS / M199 al 1 % durante 18 horas después de lavarlas con el mismo medio 3 veces. Para la optimización de la concentración de los factores de crecimiento en el ensayo de proliferación HUVEC, se añadieron 100 pl / pocillo de los factores de crecimiento diluidos en serie 2X, comenzando a 100 ng / ml, a los HUVEC por duplicado durante 72 horas a 37 °C en una incubadora de cultivo celular humidificada con 5 % de CO2. Para el análisis de los compuestos de ensayo, se realizó una dilución en serie de los compuestos de ensayo en 0,4 % de DMSO / 1 % de medio FBS / M199 por duplicado a partir del stock 10 mM. Cincuenta microlitros por pocillo de los compuestos de ensayo diluidos en serie (10, 1,0, 0,1, 0,01, 0,001, 0,0001, 0,00001 pM) se agregaron a las células durante 1 a 2 horas a 37 ° C. La concentración final de DMSO en las células es de 0,1 %. A continuación, se agregaron 50 pL de concentración final 4X de factores de crecimiento relativo a cada pocillo por duplicado durante 72 horas a 37 °C en una incubadora de cultivo celular humidificada con 5 % de CO2. La incorporación de timidina se midió agregando una microcuria de 3H-timidina (Amersham) en 20 pL de medio a cada pocillo y se incubó a 37 °C en una incubadora de cultivo celular humidificada con 5 % de CO2 por 5 a 6 horas. A continuación, las células fueron tratadas con tripsina y recolectadas en placas de filtro UniFilter GF / C (Perkin Elmer) usando el recolector de células (Tomtec). Después de que las placas se secaron al aire, se añadieron 20 pl / pocillo de Microscint 20 (Packard) y luego las placas se analizaron en TopCount NXT (Packard). Se contó cada pocillo durante un minuto. Los experimentos se realizaron por duplicado en cada uno de los 3 donantes.
Ensayo de formación de tubos de células endoteliales vasculares umbilicales humanas: Los compuestos se probaron en el ensayo de formación de tubos HUVEC inducido por factor de crecimiento. Las placas de formación de tubos se incubaron a 37 °C durante 30 minutos para que matrigel se polimerizara. Se dejó que los HUVEC pasaran hambre en medio basal BSA EBM2 al 0,1 % durante 5 horas después de lavarlas con el mismo medio 3 veces. Las células fueron tripsinizadas y centrifugadas. A continuación, se añadieron por duplicado 25 gl de compuestos diluidos en serie 4X (10, 1, 0,1, 0,01, 0,001, 0,0001, 0,00001 gM) con 50 gl de 2 x 104 células / pocillo a placas de formación de tubos recubiertas con matrigel. Se añadieron cincuenta gl de 4X VEGF (concentración final = 25 ng / ml) o bFGF (concentración final = 10 ng / ml) a las placas. Las células fueron incubadas durante la noche (~18 horas) a 37 °C en una incubadora humidificada. Las bandas de túbulos se tiñeron con calceína AM a 4 gg / gL en FBS / HBSS al 2 % durante 30 minutos y se tomaron imágenes por microscopía de fluorescencia. Los túbulos se cuantificaron mediante el programa de software de formación de tubos MetaMorph para el área y la longitud del tubo.
Ensayo de invasión de células endoteliales vasculares umbilicales humanas: en el ensayo de invasión HUVEC, la concentración de fibronectina humana se optimiza para proporcionar una estructura proteica adecuada para que las células adherentes se unan a la membrana y permitan la migración libre en respuesta a un estímulo angiogénico (por ejemplo, VEGF, bFGF, o HGF) en la cámara inferior de la placa de inserción. Se dejó que los HUVEC pasaran hambre en medio BSA EBM2 al 0,1 % durante 6 horas después de lavarlas con el mismo medio 3 veces. Las células fueron luego tripsinizadas y centrifugadas para eliminar la tripsina restante. A continuación, se agregaron de ~0,5 a 1 x 106 células en 125 gL / pocillo y 125 gL de 8X compuestos diluidos en serie (10, 1, 0,1, 0,01, 0,001 gM) a la cámara superior de las placas de inserción BD Falcon de 24 pocillos y 96 pocillos por duplicado y se incubaron durante ~1 a 2 horas. (Las placas contienen una membrana de PET microporosa bloqueante de fluorescencia [tamaño de poro de 3,0 gm] que se ha recubierto uniformemente con fibronectina humana.) Setecientos cincuenta microlitros de una solución madre de 1,33 X de VEGF (concentración final de 25 ng / ml), bFGF (concentración final de 10 ng / ml) o HGF (concentración final de 25 ng / ml) se añadieron a la cámara inferior. Las células se incubaron durante 22 ± 1 horas a 37 °C. Las células migradas se tiñeron con calceína AM a 4 gg/ml en HBSS que contenía FBS al 2 %, usando 500 gl / pocillo en placas de 24 pocillos y 200 gl / pocillo en placas de 96 pocillos. Las placas se incubaron a 37 °C durante 90 minutos y se leyeron en un lector de placa de fluorescencia.
El porcentaje de inhibición de la proliferación celular, la formación de tubos, la migración y la invasión se calculó restando el resultado del control de DMSO no estimulado de los resultados de la muestra de prueba, promediando todas las réplicas y normalizando al control de DMSO estimulado por factor de crecimiento (inhibición del 0 %). Los valores de IC50 se calcularon utilizando GraphPad Prism 5.0.
Resultados del ensayo de proliferación de células endoteliales vasculares umbilicales humanas: Los resultados del estudio de optimización del factor de crecimiento indicaron que las concentraciones óptimas de VEGF, bFGF y HGF para la inducción de la proliferación fueron 25, 10 y 25 ng / ml, respectivamente. Los compuestos de ensayo se examinaron con concentraciones de factor de crecimiento optimizadas y los resultados indicaron que el racemato, enantiómero S, y enantiómero R no inhibieron la proliferación de HUVEC inducida por VEGF, bFGF o HGF (figura 39). Sin embargo, se observó una mejora significativa de la proliferación en los HUVEC tratados con VEGF y HGF por enantiómero S (tratado con VEGF: 1 - 10 gM; tratado con HGF: 0,1 - 1 gM). También se observó una mejora significativa en los HUVEC tratados con bFGF por racemato (0,01 - 1 gM), y enantiómero R (0,1 - 1 gM). Los valores IC50 se resumen en la Tabla 7.
Tabla 7. Resumen de valores IC50 de estudios de proliferación de células endoteliales vasculares umbilicales humanas inducidas or factor de crecimiento
Figure imgf000049_0001
Resultados del ensayo de formación de tubos de células endoteliales vasculares umbilicales humanas: Los compuestos de ensayo mostraron una tendencia a inhibir la formación de tubos HUVEC inducidos por VEGF en términos de longitud y área del tubo (Figura 40). Todos los compuestos demostraron un efecto dependiente de la dosis sobre la formación de tubos HUVEC inducidos por VEGF. El Enantiómero R mostró una inhibición significativa (p <0,05 vs control DMSO estimulado) del área del tubo y la longitud a 10 pM. También hubo una tendencia de los compuestos a inhibir la formación de tubos HUVEC inducidos por bFGF en términos de longitud y área del tubo (Figura 40), aunque el efecto fue menos pronunciado que los efectos sobre la formación de tubos HUVEC inducidos por VEGF.
Resultados del ensayo de invasión de células endoteliales vasculares umbilicales humanas: 3-[4-(4-morfolin-4-ilmetilbenciloxi)-1 -oxo-1,3-dihidro-isoindo-2-il]piperidina-2,6-diona, (R)-3-[4- (4-morfolin-4-ilmetilbenciloxi)-1 -oxo-1,3-dihidro-isoindo-2-il]piperidina-2,6-diona y (S)-3-[4-(4-morfolin-4-ilmetilbenciloxi)-1 -oxo-1,3-dihidro-isoindo-2-il]piperidina-2,6-diona inhibieron significativamente la invasión de HUVEC inducida por VEGF-, bFGF- y HGF de una manera dependiente de la dosis (figura 41). Los compuestos fueron más potentes contra la invasión de HUVEC inducida por VEGF y bFGF que contra la invasión de HUVEC inducida por HGF (Tabla 8). El valor de IC50 fue <0,3 nM para la inhibición de la invasión de HUVEC inducida por VEGF por los compuestos de ensayo. El IC50 del racemato (0.4 nM) y el enantiómero S (<0.1 nM) fue más de diez veces más potente que el enantiómero R (13 nM) (Tabla 8).
Tabla 8. Resumen del efecto de los compuestos de ensayo sobre la invasión de células endoteliales vasculares m ili l h m n in i r l f r r imi n
Figure imgf000050_0001
6.8 EJEMPLO 8: ESTUDIO DEL MODELO DE RATÓN DE LUPUS / FIBROSIS
En este ejemplo, la sensibilidad (S)-3-[4- (4-morfolin-4-ilmetilbenciloxi)-1-oxo-1,3-dihidro-isoindo-2-il]piperidina-2,6-diona se probó en dos cepas de ratón propensas a lupus: Modelo de ratón MRL / MpJ-Faslpr / J de lupus eritematoso sistémico y modelo de ratón NZBWF1 / J de lupus eritematoso sistémico. El compuesto de ensayo se administró en ambos modelos a 30 mg / kg.
En el modelo de ratón MRL / MpJ-Faslpr / J de lupus eritematoso sistémico, las células B de sangre periférica no mostraron cambios en la semana 4. Las células esplénicas B mostraron un aumento del 37 % y el nivel de autoanticuerpos de ADN anti-bicatenario mostró una disminución del 25 % en la semana 4.
En el modelo de ratón NZBWF1 / J de lupus eritematoso sistémico, las células B de sangre periférica mostraron una disminución del 25 % en la semana 4, las células B esplénicas no mostraron cambios y el nivel de autoanticuerpos de ADN anti-bicatenario mostró un aumento del 86 % en la semana 4.
6.9 EJEMPLO 9: ESTUDIO DEL MODELO DE RATÓN DE FIBROSIS DERMAL
En este ejemplo, (S)-3-[4-(4-morfolin-4-ilmetilbenciloxi)-1 -oxo-1,3-dihidro-isoindo-2-il]piperidina-2,6-diona se probó en el modelo de fibrosis cutánea inducida por bleomicina utilizando regímenes de dosificación profilácticos y terapéuticos. La bleomicina es una terapia anticáncer anticuada que se ha demostrado que causa fibrosis pulmonar. En modelos animales, inducirá de manera similar lesiones y fibrosis en el lugar de la entrega.
Las siguientes abreviaturas se utilizan en este eem lo:
Figure imgf000051_0001
Se usaron ratones DBA / 2 en este estudio. Se utilizaron ocho animales por grupo de tratamiento en el estudio. Los ratones se mantuvieron en la casa de animales en condiciones estándar con comida y agua a voluntad.
El vehículo, 0,5 % de carboximetilcelulosa (CMC) / 0,25 % Tween 80, se preparó en H2O destilada y se disolvió durante la noche en un agitador magnético (agregue 0,5 g de CMC; Sigma # C9481) y 0,25 ml de Tween 80 (Sigma # P8074) a 99,75 ml para obtener un total de 100 ml de 0,5 % de CMC / 0,25 % de Tween 80).
El polvo del compuesto de ensayo se pesó y se suspendió fresco diariamente en el vehículo CMC al 0,5 % / Tween 80 al 0,25 %, para evitar la hidrólisis del fármaco en el medio acuoso. El compuesto fue suspendido, no disuelto, en este vehículo. La formulación se homogeneizó con una mano de mortero y mortero de teflón (triturador de tejidos Potter-Elvehjem) usando un homogeneizador de tejidos motorizado Eberbach. La concentración diaria de stock de fármacos utilizada en estos estudios fue de 3 mg / ml.
La bleomicina se obtuvo de la farmacia de la Universidad de Erlangen-Nuremberg y se preparó una vez por semana. La fibrosis de la piel se indujo en ratones DBA de 6 semanas de edad mediante inyecciones intracutáneas locales de 100 gl de bleomicina disuelta en NaCl al 0,9 %, a una concentración de 0,5 mg / ml, cada dos días en áreas definidas de 1,5 cm2 en la parte superior de la espalda
6.9.1 Diseño del estudio
El modelo de ratón de fibrosis dérmica inducida por bleomicina se usa ampliamente para evaluar la terapéutica antifibrótica. En este modelo, una fibrosis dérmica localizada es inducida por inyecciones intradérmicas con bleomicina cada dos días durante 3 semanas. Este modelo se asemeja a las primeras etapas inflamatorias de SSc. Para evaluar los posibles efectos sobre la prevención de la fibrosis, el tratamiento se inició simultáneamente con la primera inyección de bleomicina. Para estudiar el efecto del compuesto de ensayo en la prevención de la fibrosis dérmica inducida por bleomicina en vivo, los tratamientos se dividieron en los siguientes grupos:
• Grupo de control: inyección intradérmica de NaCl durante 3 semanas. El tratamiento consistió en la administración del vehículo (0,5 % CMC / 0.25 % Tween 80).
• Grupo de bleomicina no tratada: inyección intradérmica de bleomicina durante tres semanas. Administración del vehículo (0,5 % CMC / 0,25 % Tween 80).
• Grupo compuesto de ensayo: Inyección intradérmica de bleomicina durante tres semanas. El compuesto de ensayo se administró a 30 mg / kg; Po , QD.
• Grupo de control positivo: Inyección intradérmica de bleomicina durante tres semanas. Inyección de imatinib (50 mg / kg; IP, QD). Se ha demostrado previamente que el mesilato de imatinib ejerce potentes efectos antifibróticos en la fibrosis dérmica inducida por bleomicina. VerAkhmetshina A. y col., Arthritis Rheum 2009; 60 (1): 219-224.
Para evaluar la regresión de la fibrosis, se utilizó un modelo modificado de fibrosis dérmica inducida por bleomicina. Los ratones fueron sometidos previamente a una prueba de bleomicina para inducir una fibrosis cutánea robusta. Un grupo recibió tratamiento con el compuesto de ensayo, mientras que el desafío con bleomicina continuó durante tres semanas adicionales. El resultado de este grupo se comparó con ratones expuestos a bleomicina durante seis semanas (prevención de una progresión adicional) y a ratones expuestos a bleomicina durante tres semanas, seguido de NaCl durante tres semanas adicionales (inducción de regresión). Los siguientes grupos se utilizaron en el estudio de regresión:
• Grupo de control: Inyección intradérmica de NaCl durante seis semanas. El tratamiento de control consistió en la administración del vehículo.
• Grupo 1 de bleomicina no tratada (regresión): inyección intradérmica de bleomicina durante tres semanas seguida de inyecciones intradérmicas de NaCl durante otras tres semanas. El tratamiento consistió en la administración del vehículo. Bleomicina no tratada grupo 2 (prevención de la progresión): Inyección intradérmica de bleomicina durante seis semanas. El tratamiento consistió en la administración del vehículo.
• Grupo compuesto de ensayo: Inyección intradérmica de bleomicina durante seis semanas. El compuesto de ensayo se administró a 30 mg / kg; Po , QD.
• Grupo de control positivo: Inyección intradérmica de bleomicina durante seis semanas. Inyección de imatinib (50 mg / kg; IP, QD)
6.9.2 Procedimiento experimental
El grosor dérmico se determinó mediante tinción con hematoxilina y eosina y fibroblastos activados mediante el uso de inmunohistoquímica para la actina alfa mucosa lisa (a-SMA). El grosor dérmico, según lo determinado por la puntuación de la piel de Rodnan modificada, es actualmente el resultado primario más común en ensayos clínicos en humanos para agentes antifibróticos en SSc. Las secciones de piel se tiñeron con hematoxilina / eosina para una mejor visualización de la estructura del tejido. El grosor dérmico se analizó con un microscopio Nikon Eclipse 80i (Nikon, Badhoevedorp, Países Bajos) midiendo la distancia máxima entre la unión epidérmica-dérmica y la unión grasa dérmica-subcutánea en 4 secciones diferentes de piel en cada ratón. La evaluación fue realizada por 2 examinadores independientes.
Para la cuantificación de miofibroblastos, las secciones de piel se desparafinaron e incubaron con albúmina de suero bovino al 5 % durante 60 minutos. Las células positivas para a-SMA se detectaron mediante incubación con anticuerpos monoclonales anti-a-SMA (clon 1A4; Sigma-Aldrich, Steinheim, Alemania) durante 2 horas a temperatura ambiente seguido de incubación con peróxido de hidrógeno al 3 % durante 10 minutos. Los anticuerpos anti-conejo de cabra marcados con peroxidasa de rábano picante (Dako, Hamburgo, Alemania) se usaron como anticuerpos secundarios. La expresión de a-SMA se visualizó con tetrahidrocloruro de 3,3-diaminobencidina (Sigma-Aldrich). Se usaron anticuerpos monoclonales de ratón IgG (Calbiochem, San Diego, CA) como controles.
Además, la cantidad de colágeno en la piel lesionada se medirá con el ensayo de colágeno SirCol; El ARN y el plasma de todos los ratones se guardaron para análisis adicionales.
El compuesto de ensayo disminuye significativamente el grosor dérmico de la piel lesionada en el modelo de ratón con fibrosis dérmica inducida por bleomicina. El compuesto de ensayo a 30 mg / kg; PO, QD impidió significativamente el engrosamiento dérmico en aproximadamente un 25 ± 0,49 % (p <0,001, figura 42).
En la FIG. 43 se muestran fotomicrografías representativas de secciones de piel teñidas con hematoxilina y eosina. El grosor dérmico se evaluó midiendo la distancia máxima entre la unión epidérmica-dérmica y la unión grasa dérmicasubcutánea. La línea dibujada entre los puntos de unión muestra el grosor relativo en los grupos de tratamiento.
Para determinar el efecto de los tratamientos sobre la activación de fibroblastos, se contaron los miofibroblastos a­ SMA en secciones de piel lesionada. Como se muestra en la FIG. 44, el compuesto de ensayo a 30 mg / kg; PO, QD redujo el número de miofibroblastos en 24 ± 0,09 % (p <0,05). El imatinib a 50 mg / kg redujo el engrosamiento dérmico en un 60 ± 0,34 % (p <0,0001) y los números de miofibroblastos en un 81 ± 0,11 % (p <0,0001).
6.9.3 Efecto sobre la regresión de la fib rosis dérmica inducida por bleomicina
Los efectos inhibitorios del compuesto de ensayo sobre la progresión de la fibrosis también se confirmaron en el modelo de bleomicina modificado diseñado para investigar la posible regresión de la fibrosis. Como se muestra en la FIG. 45, el compuesto de ensayo a 30 mg / kg; PO, QD no tuvo efecto sobre el engrosamiento dérmico en el modelo de regresión. La FIG. 46 muestra fotomicrografías de secciones representativas de piel teñida con hematoxilina y eosina. El grosor dérmico se evaluó midiendo la distancia máxima entre la unión epidérmica-dérmica y la unión grasa dérmica-subcutánea. La línea dibujada entre los puntos de unión muestra el grosor relativo en los grupos de tratamiento. La figura 47 muestra que el compuesto de ensayo no tuvo un efecto sobre el número de miofibroblastos. El imatinib a 50 mg / kg redujo el grosor dérmico inducido por bleomicina en un 50 ± 0,3 % (p <0,0001) y los números de miofibroblastos en un 78 ± 0,15 % (p <0,0001).
6.10 EJEMPLO 10: EFECTO EN EL MODELO DE RATÓN TSK-1
Los efectos antifibróticos de (S)-3-[4- (4-morfolin-4-ilmetilbenciloxi)-1-oxo-1,3-dihidro-isoindo-2-il]piperidina-2,6-diona se probaron en el modelo murino de ratón de piel tirante-1 (Tsk-1).
Primero, también se investigaron los efectos inhibitorios del compuesto sobre la fibrosis en el modelo de ratón de piel tirante Tsk-1. Como se muestra en la Figura 48, el compuesto a 30 mg / kg redujo el engrosamiento hipodérmico en un 45 % (p < 0,001), en comparación con una reducción del 58 % por imatinib a 50 mg / kg (p < 0,001). El contenido elevado de colágeno de la piel, medido por los niveles de hidroxiprolina, se redujo 38 % por el compuesto y 67 % por imatinib (p < 0,001).
A continuación, para examinar el efecto del compuesto sobre la sobreexpresión de los genes de la vía TGF-p en la piel del ratón Tsk-1, se usó qRT-PCR para medir los niveles de ARNm para seis genes:CTGF, PAI-1, COL1A1, actina del músculo liso a (ALPHA SMA), proteína oligomérica del cartílago 1 (COMP) y TGFB1. La sobreexpresión se definió como el exceso de niveles de ARNm observados en la piel del ratón Tsk-1 en comparación con la piel normal del ratón pa / pa. Entre estos seis genes, solo cuatro (CTGF, PAI-1, COL1A1 y TGFB1) se expresaron a un nivel significativamente más alto en Tsk-1 en comparación con los ratones normales pa / pa. El compuesto (30 mg / kg) redujo significativamente la sobreexpresión de CTGF y COL1A1 en un 79 % (p <0,001) y 129 % (p <0,001), respectivamente (Figura 49). La sobreexpresión del gen PAI-1 y TGFB1 no fue inhibida por el compuesto. Estos resultados indican que el compuesto puede reducir la fibrosis de la piel al bloquear la sobreexpresión de algunos genes profibróticos dentro de la vía TGF-p.
Para examinar más a fondo el efecto del compuesto sobre la expresión de genes fibróticos de células normales (NL) y de esclerosis sistémica (SSc), se siguieron los siguientes procedimientos:
Cultivos celulares: Se cultivaron fibroblastos de piel humana normal y esclerodermia en DMEM que contenía suero bovino fetal (FBS) al 10 %. Las células se mantuvieron en un 5 % de CO2 humidificado, 95 % de incubadora de aire a 37 °C. Después de alcanzar la confluencia, las células se recolectaron con 0,05 % de tripsina y se subcultivaron. Las células fueron utilizadas en el paso tercero y quinto.
Diseño experimental: Las células se cultivaron hasta un 70-80 % de confluencia y se colocaron en estado de reposo mediante una reducción en la concentración de suero al 0,4 % durante la noche. Se probaron los efectos del compuesto sobre los efectos fibróticos de TGFp y sobre la expresión del gen fibrótico NL y SSc.
Efectos sobre la inducción de TGFB de la expresión génica fibrótica: Los fibroblastos NL se pretrataron con el compuesto durante 30 minutos seguido de la adición de TGF-p1 para observar los efectos del compuesto sobre la expresión del gen de fibrosis inducida por TGFp.
Efectos del compuesto sobre SSc-FB: Los fibroblastos SSc se trataron con el compuesto a diferentes concentraciones y se determinaron niveles de expresión génica de colágeno 1A1 (COL1), actina del músculo liso a (a-SMA), fibronectina (FN), metalopeptidasa de matriz 1 (MMP1), inhibidor del activador del plasminógeno (PAI), y ADN (citosina-5-)-metiltransferasa 1 (Dnmt1) 24 horas más tarde por PCR en tiempo real.
PCR cuantitativa en tiempo real: El ARN total se extrajo de las células usando el kit RNeasy. Se midió la concentración de ARN y se transcribió inversamente 1 pg de ARN a ADNc usando el kit de cadena RT-First. A continuación, el ADNc se amplificó usando los cebadores respectivos y la mezcla maestra de PCR verde Power SYBR. El amplicón (150-200 pb) fue detectado por el sistema de PCR en tiempo real ABI 7500. Todos los genes objetivo se normalizaron a GAPDH y se calcularon los cambios relativos de pliegue. Cada muestra se evaluó por triplicado.
Como se muestra en la Figura 50, la dosis del compuesto redujo de forma dependiente la expresión de ARNm de COL1, aSMA y FN en fibroblastos SSc. De manera similar, la expresión de PAI (Figura 51) y Dnmt1 (Figura 52) también se redujo de forma dependiente de la dosis por el compuesto en fibroblastos SSc. Como también se muestra en la Figura 51, la expresión de MMP-1 aumentó de forma dependiente de la dosis por el compuesto en fibroblastos SSc. Los resultados demuestran que el compuesto regula potentemente los factores fibróticos clave, lo que indica la eficacia del compuesto en el tratamiento de la SSc.
Además, se examinaron los niveles de cereblón en fibroblastos normales y SSc y tejidos de la piel. Como se muestra en las Figuras 53 y 54, se observaron niveles más altos de cereblón tanto en fibroblastos SSc como en tejidos de la piel en comparación con los tejidos normales. Esto indica que un nivel elevado de cereblon está involucrado en SSc.
6.11 EJEMPLO 11: CEREBLON DIANA PARA LAS DISCRASIAS DE CÉLULAS B
Se describió el efecto de (S)-3-[4- (4-morfolin-4-ilmetilbenciloxi)-1-oxo-1,3-dihidro-isoindo-2-il]piperidina-2,6-diona ("Compuesto IA") en la unión a CRBN, ubiquitination, y la proliferación celular. CRBN es un componente del complejo E3 ubiquitina ligasa que incluye CUL4A, DDB1 y ROC-1 y se descubrió que es la diana de unión molecular de la talidomida, lenalidomida y pomalidomida.
Los estudios de unión a CRBN se realizaron utilizando perlas conjugadas con análogo de talidomida en un ensayo competitivo. El CRBN endógeno de células de mieloma múltiple U266 humano ("MM") se midió incubando extractos celulares con concentraciones variables de compuesto IA o pomalidomida como control positivo. Las perlas de afinidad acopladas a un análogo de ácido de talidomida se incubaron con los extractos de U266 y, después del lavado exhaustivo de las perlas, se eluyeron las proteínas unidas. La unión de CRBN a las perlas de afinidad acopladas a talidomida se determinó por determinación cuantitativa de inmunotransferencia de CRBN.
La ubiquitinación de CRBN se midió en células HEK293T, que se transfectaron con una construcción CRBN etiquetada con His-biotina amino terminal, luego se incubaron previamente con compuestos durante una hora seguido de tratamiento con el inhibidor de proteasoma MG132 (para detener la degradación de proteínas ubiquitinadas). Las células se lisaron y procesaron para medir la ubiquitinación de CRBN por SDS-PAGE y análisis de inmunotransferencia usando un anticuerpo anti-ubiquitina. Los estudios de proliferación celular se llevaron a cabo en células de mieloma múltiple sensibles a la lenalidomida y refractarias. Las líneas celulares H929 MM resistentes o sensibles a lenalidomida se trataron con el compuesto IA durante 5 días, y luego se evaluó la proliferación y viabilidad celular mediante tinción con 7-aminoactinomicina D ("7-ADD"). La coestimulación de células T se midió en células T humanas primarias purificadas estimuladas usando anticuerpo anti-CD3 inmovilizado en cultivo celular durante 2 días, y la secreción de citoquinas se midió por ELISA.
La producción de inmunoglobulina M y G («IgG e IgM») se midió a partir de células mononucleares de sangre periférica de donante normal mediante cultivo en presencia de los factores de diferenciación de células B IL-2 humana recombinante (20U / ml), IL-10 (50 ng / ml) ), IL-15 (10 ng / ml), ligando CD40 marcado con His (50 ng / ml), anticuerpo poliHistidina IgG 1 de ratón (5 gg / ml) y ligando ODN 2006-TLR9 humano (10 gg / ml) durante 4 días, seguido de IL-2, IL-10, IL-15 e IL-6 (50 ng / ml) durante 3 días adicionales. IgM e IgG se midieron por ELISA.
En los estudios competitivos de unión a CRBN, la preincubación con pomalidomida a una concentración de 3 gM dio como resultado aproximadamente un 50 % menos de CRBN unido a las perlas de afinidad, mientras que el compuesto IA a una concentración de 0,1 gM dio como resultado una unión de CRBN similar. Los estudios de ubiquitinación de CRBN en las células HEK293T transfectadas dieron como resultado las siguientes potencias: compuesto IA IC50= 0,19 gM; lenalidomida IC50= 12,9 gM; y pomalidomida IC50= 21,6 gM. Los valores de IC50 para la inhibición de la proliferación por el compuesto IA cambiaron de 0,01 gM en la línea celular H929 parental y 0,04 gM en el subclón tratado con DMSO a 0,51-1,58 gM en los subclones resistentes a lenalidomida.
Una disminución del 50 % en el ciclo celular (fase S) fue evidente después de 24 horas de tratamiento de las células H929 con el compuesto IA. A las 48 horas, el compuesto IA disminuyó la expresión de la proteína survivina y retinoblastoma («pRB») y aumentó la expresión del inhibidor de la quinasa dependiente de ciclina p27. El compuesto IA coestimuló la producción de IL-2 por las células T con una EC50 de aproximadamente 0,29nM, en comparación con 10nM para pomalidomida. El compuesto IA inhibió la producción de IgM e IgG con un IC50 de 0,35 y 2,1nM, respectivamente, en comparación con 17nM y 63nM para pomalidomida.
Los resultados indican que el compuesto IA se une a CRBN con una afinidad aproximadamente 30 veces mayor que la pomalidomida e inhibe la ubiquitinación de CRBN con una potencia aproximadamente 110 veces mayor que la pomalidomida en este sistema. El compuesto IA es aproximadamente 34 veces más potente que la pomalidomida para coestimular la producción de IL-2 por las células T, y es de 30 a 48 veces más potente que la pomalidomida para inhibir la producción de inmunoglobulina.
6.12 EJEMPLO 12: INHIBICIÓN DE LA DIFERENCIACIÓN DE CÉLULAS B EN EL LINAJE DE CÉLULAS PLASMABLASTICAS Y PLASMATICAS
Los efectos de cereblon («CRBN») dirigidos a la diferenciación de las células B a los linajes de células plasmablásticas y plasmáticas, se desarrolló un modelo in vitro de diferenciación primaria de células B humanas.
Se cultivaron las células B humanas CD19 de sangre periférica de donantes normales, o PBMC de células mononucleares de sangre periférica total para pacientes con lupus eritematoso sistémico («LES») en presencia de interleucina («IL») - 2, agonista de IL-10, IL15, TLR9 y CD40L durante 4 días, seguido de IL-2, IL-6, IL-10 e IL-15 durante otros 3 días. Se contaron las células, se evaluó la viabilidad y se midió la expresión de CD20, CD38, CD44 y CD83 por citometría de flujo. Los factores de linaje de plasmablastos IRF-4, BLIMP-1, XBP-1 e IgJ, y los marcadores del centro germinal PAX-5 y BCL-6 se midieron por qRT-PCR. La expresión de la proteína intercelular se midió por citometría de escaneo láser. Las inmunoglobulinas secretadas IgG e IgM se midieron por ELISA.
En cultivos de células B normales, (S)-3-(4-((4-morfolinometil) bencil) oxi)-1 -oxoisoindolin-2-il) piperidina-2,6-diona («compuesto IS») redujo el porcentaje del total de células viables en estos cultivos después de 4 días a 69,6 % (p<0,05) o 35,8 % de control (P<0,001) a 20nM o 200nM compuesto IS, respectivamente. El compuesto IS disminuyó el porcentaje de plasmablastos CD20-CD38 viables en el día 7 de 30,4 % en cultivos de control de forma dependiente de la dosis a 27,3 %, 2,1 % y 0,4 % a 2nM, 20nM y 200nM, respectivamente. En el día 7, el análisis qRT-PCR mostró que el compuesto IS (20 nM) redujo la expresión de los factores de linaje de plasmablastos IRF-4, BLIMP-1, XBP-1 e IgJ a 20,5 %, 14,3 %, 15,1 % y 31,5 % de control, respectivamente (P<0,001).
Por citometría de flujo intracelular, el compuesto IS (20 nM) disminuyó significativamente la expresión de proteínas IRF-4 (P <0,5), BLIMP-1 (P <0,05) y XBP-1 (P <0,05) en el día 4, pero aumentó significativamente la expresión de proteína BCL- 6 (P <0,05) en el día 7. Por citometría de escaneo láser en el día 7, el compuesto IS (20 nM) redujo la expresión de proteína intracelular de células CD38 de IRF-4 (P<0,001) y BLIMP-1 (P<0,001), y aumentó la expresión de BCL-6 (P<0,05) (n = 3). El compuesto IS inhibió la producción de IgG secretada con un IC50 = 1,8nM (n = 3).
En PBMC de pacientes con LES, el compuesto IS (20 nM) tuvo efectos similares a los de las células B normales, reduciendo la expresión del gen BLIMP-1, XBP-1 e IgJ a 52,8 %, 49,2 % y 13,6 % de control, respectivamente (P< 0,001) (n = 3). El compuesto IS (20 nM) redujo significativamente la expresión de proteína intracelular plasmblástica CD38 de Bl IMP-1 (P<0,01) e IRF-4 (P<0,001), y aumentó BCL-6 (P<0,05) (n = 3). El compuesto IS inhibió la producción de IgM e IgG secretada por PBMC de pacientes con LES con IC50 de 0,9 nM y 3,2 nM, respectivamente (n = 3).
Estos resultados demuestran que el direccionamiento del coreceptor de sustrato del complejo de ubiquitina ligasa E3 CRBN con el compuesto inmunomodulador de molécula pequeña Compuesto IS da como resultado una inhibición potente de la diferenciación de células B al linaje de plasmablastos, como se muestra por una reducción en el porcentaje de células CD38 viables, una disminución en la expresión de genes y proteínas BLIMP-1, XBP-1, IRF-4 e IgJ, e inhibición de la producción de inmunoglobulinas secretadas. Estos datos implican al complejo CUL4-CRBN en la diferenciación de células B al linaje de células plasmáticas.
El presente invento no tiene un alcance limitado por las realizaciones específicas descritas aquí. De hecho, diversas modificaciones de la invención además de las descritas resultarán evidentes para los expertos en la técnica a partir de la descripción anterior y las figuras adjuntas. Dichas modificaciones están destinadas a caer dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Claims (14)

REIVINDICACIONES
1. Un compuesto para su uso en un procedimiento para tratar, prevenir o controlar una enfermedad inmunitaria o una enfermedad inflamatoria, donde el procedimiento comprende administrar a un paciente que lo necesite una cantidad efectiva de dicho compuesto, y donde el compuesto es un compuesto de fórmula I
Figure imgf000062_0001
o una sal, solvato, hidrato, estereoisómero, tautómero o mezcla racémica farmacéuticamente aceptable de los mismos, y en donde la enfermedad es lupus, esclerodermia, lupus pernio, sarcoidosis, síndrome de Sjogren, vasculitis inducida por ANCA, síndrome antifosfolípido o miastenia grave.
2. El compuesto para uso de la reivindicación 1, en donde la enfermedad es lupus eritematoso sistémico, lupus eritematoso cutáneo, esclerodermia, lupus pernio, sarcoidosis o síndrome de Sjogren.
3. El compuesto para uso de la reivindicación 2, en donde la enfermedad es lupus eritematoso sistémico.
4. El compuesto para uso de la reivindicación 3, en donde el lupus eritematoso sistémico es lupus eritematoso sistémico severo.
5. El compuesto para uso de la reivindicación 2, en donde la enfermedad es lupus eritematoso cutáneo.
6. El compuesto para uso de la reivindicación 2, en donde la enfermedad es la esclerodermia.
7. El compuesto para uso de la reivindicación 6, en donde la esclerodermia es esclerodermia localizada, sistémica, limitada o difusa.
8. El compuesto para uso de la reivindicación 7, en donde la esclerodermia sistémica comprende el síndrome CREST.
9. El compuesto para uso de la reivindicación 2, donde la enfermedad es el síndrome de Sjogren.
10. El compuesto para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en donde el compuesto es (S)-3-[4- (4-morfolin-4-ilmetilbenciloxi)-1-oxo-1,3-dihidro-isoindo-2- yl]piperidina-2,6-diona de fórmula IA
Figure imgf000063_0001
o una sal, solvato, hidrato o tautómero farmacéuticamente aceptable del mismo.
11. El compuesto para uso de la reivindicación 10, en donde el compuesto es (S)-3-[4- (4-morfolin-4-ilmetilbenciloxi)-1-oxo-1,3-dihidro-isoindo-2-il]piperidina-2, 6-diona.
12. El compuesto para uso de la reivindicación 10, en donde el compuesto es clorhidrato de (S)-3-[4- (4-morfolin-4-ilmetilbenciloxi)-1 -oxo-1,3-dihidro-isoindo-2-il]piperidina-2, 6-diona.
13. El compuesto para uso de cualquiera de las reivindicaciones 1-12, en donde el procedimiento comprende además administrar un segundo agente activo, que es un compuesto antiinflamatorio o inmunomodulador.
14. El compuesto para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que la cantidad efectiva de dicho compuesto es de aproximadamente 0,005 mg / kg a aproximadamente 10 mg / kg del peso corporal del paciente.
ES13752753T 2012-08-09 2013-08-08 Tratamiento de enfermedades inmunitarias e inflamatorias Active ES2800026T3 (es)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261681491P 2012-08-09 2012-08-09
US201261722718P 2012-11-05 2012-11-05
PCT/US2013/054051 WO2014025958A2 (en) 2012-08-09 2013-08-08 Treatment of immune-related and inflammatory diseases

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2800026T3 true ES2800026T3 (es) 2020-12-23

Family

ID=49029213

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES13752753T Active ES2800026T3 (es) 2012-08-09 2013-08-08 Tratamiento de enfermedades inmunitarias e inflamatorias

Country Status (30)

Country Link
US (2) US10919883B2 (es)
EP (2) EP2882441B1 (es)
JP (2) JP6250671B2 (es)
KR (3) KR20210073616A (es)
CN (4) CN104703605A (es)
AU (1) AU2013299625B2 (es)
BR (1) BR112015002272A2 (es)
CA (2) CA3092279C (es)
CY (1) CY1123106T1 (es)
DK (1) DK2882441T3 (es)
EA (1) EA029085B1 (es)
ES (1) ES2800026T3 (es)
HK (1) HK1211474A1 (es)
HR (1) HRP20200836T1 (es)
HU (1) HUE049569T2 (es)
IL (1) IL237070B (es)
LT (1) LT2882441T (es)
MX (1) MX2015001686A (es)
NI (1) NI201500013A (es)
NZ (2) NZ628077A (es)
PH (1) PH12015500276A1 (es)
PL (1) PL2882441T3 (es)
PT (1) PT2882441T (es)
RS (1) RS60416B1 (es)
SG (1) SG11201500983RA (es)
SI (1) SI2882441T1 (es)
TW (1) TWI641371B (es)
UA (1) UA116992C2 (es)
WO (1) WO2014025958A2 (es)
ZA (1) ZA201500466B (es)

Families Citing this family (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RS58523B1 (sr) 2010-02-11 2019-04-30 Celgene Corp Derivati arilmetoksi izoindolina i kombinacije koje ih obuhvataju i postupci njihove upotrebe
AU2012236655B2 (en) 2011-03-28 2016-09-22 Deuterx, Llc, 2',6'-dioxo-3'-deutero-piperdin-3-yl-isoindoline compounds
US20150038511A1 (en) 2012-08-09 2015-02-05 Celgene Corporation Treatment of immune-related and inflammatory diseases
AU2014205043B2 (en) 2013-01-14 2018-10-04 Deuterx, Llc 3-(5-substituted-4-oxoquinazolin-3(4h)-yl)-3-deutero-piperidine-2,6-dione derivatives
US9695145B2 (en) 2013-01-22 2017-07-04 Celgene Corporation Processes for the preparation of isotopologues of 3-(4-((4- morpholinomethyl)benzyl)oxy)-1-oxoisoindolin-2-yl)piperidine-2,6-dione and pharmaceutically acceptable salts thereof
CA2941560A1 (en) 2013-03-14 2014-09-25 Deuterx, Llc 3-(substituted-4-oxo-quinazolin-3(4h)-yl)-3-deutero-piperidine-2,6-dione derivatives
WO2015179279A1 (en) * 2014-05-19 2015-11-26 Celgene Corporation Treatment of immune-related and inflammatory diseases
TWI745271B (zh) 2014-05-19 2021-11-11 美商西建公司 全身紅斑性狼瘡之治療
US9809603B1 (en) 2015-08-18 2017-11-07 Deuterx, Llc Deuterium-enriched isoindolinonyl-piperidinonyl conjugates and oxoquinazolin-3(4H)-yl-piperidinonyl conjugates and methods of treating medical disorders using same
SI3496739T1 (sl) 2016-07-15 2021-06-30 Acceleron Pharma Inc. Sestave, ki zajemajo polipeptide actriia, za uporabo pri zdravljenju pljučne hipertenzije
BR112020023756A2 (pt) * 2018-05-23 2021-02-09 Celgene Corporation tratamento de mieloma múltiplo e uso de biomarcadores para 4-(4-(4-(((2-(2,6-dioxopiperidin-3-il)-1-oxoisoindolin-4-il)oxi)metil)benzil)piperazin-1-il)-3-fluorobenzonitrila
CA3114401A1 (en) 2018-10-01 2020-04-09 Celgene Corporation Combination therapy for the treatment of cancer
MA54860A (fr) * 2019-01-28 2022-05-04 Sanofi Sa Méthodes de traitement du myélome multiple
US11255850B2 (en) 2019-03-28 2022-02-22 Alentic Microscience Inc. Bead-based analysis of a sample
US10684278B1 (en) 2019-03-28 2020-06-16 Alentic Microscience Inc. Bead-based analysis of a sample
US11609233B2 (en) 2019-03-28 2023-03-21 Alentic Microscience Inc. Indicator-based analysis of a sample
US11719700B2 (en) 2019-03-28 2023-08-08 Alentic Microscience Inc. Upconversion for microscopy
US20210154193A1 (en) * 2019-11-25 2021-05-27 PHPrecisionMed, LLC Pharmaceutical compositions for the treatment of pulmonary hypertension
WO2023097111A2 (en) * 2021-11-29 2023-06-01 Riptide Bioscience, Inc. Methods and compositions for treating calcinosis associated conditions
WO2024064646A1 (en) 2022-09-20 2024-03-28 Celgene Corporation Salts and solid forms of (s)- or racemic 3-(4-((4-(morpholinomethyl)benzyl)oxy)-1-oxoisoindolin-2-yl)piperidine-2,6-dione and methods of using the same

Family Cites Families (61)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3536809A (en) 1969-02-17 1970-10-27 Alza Corp Medication method
US3598123A (en) 1969-04-01 1971-08-10 Alza Corp Bandage for administering drugs
US3845770A (en) 1972-06-05 1974-11-05 Alza Corp Osmatic dispensing device for releasing beneficial agent
US3916899A (en) 1973-04-25 1975-11-04 Alza Corp Osmotic dispensing device with maximum and minimum sizes for the passageway
US4008719A (en) 1976-02-02 1977-02-22 Alza Corporation Osmotic system having laminar arrangement for programming delivery of active agent
ES8702440A1 (es) 1984-10-04 1986-12-16 Monsanto Co Un procedimiento para la preparacion de una composicion de polipeptido inyectable sustancialmente no acuosa.
IE58110B1 (en) 1984-10-30 1993-07-14 Elan Corp Plc Controlled release powder and process for its preparation
US5073543A (en) 1988-07-21 1991-12-17 G. D. Searle & Co. Controlled release formulations of trophic factors in ganglioside-lipsome vehicle
IT1229203B (it) 1989-03-22 1991-07-25 Bioresearch Spa Impiego di acido 5 metiltetraidrofolico, di acido 5 formiltetraidrofolico e dei loro sali farmaceuticamente accettabili per la preparazione di composizioni farmaceutiche in forma a rilascio controllato attive nella terapia dei disturbi mentali organici e composizioni farmaceutiche relative.
PH30995A (en) 1989-07-07 1997-12-23 Novartis Inc Sustained release formulations of water soluble peptides.
US5120548A (en) 1989-11-07 1992-06-09 Merck & Co., Inc. Swelling modulated polymeric drug delivery device
KR0166088B1 (ko) 1990-01-23 1999-01-15 . 수용해도가 증가된 시클로덱스트린 유도체 및 이의 용도
US5733566A (en) 1990-05-15 1998-03-31 Alkermes Controlled Therapeutics Inc. Ii Controlled release of antiparasitic agents in animals
US5580578A (en) 1992-01-27 1996-12-03 Euro-Celtique, S.A. Controlled release formulations coated with aqueous dispersions of acrylic polymers
TW333456B (en) 1992-12-07 1998-06-11 Takeda Pharm Ind Co Ltd A pharmaceutical composition of sustained-release preparation the invention relates to a pharmaceutical composition of sustained-release preparation which comprises a physiologically active peptide.
US5591767A (en) 1993-01-25 1997-01-07 Pharmetrix Corporation Liquid reservoir transdermal patch for the administration of ketorolac
US6087324A (en) 1993-06-24 2000-07-11 Takeda Chemical Industries, Ltd. Sustained-release preparation
IT1270594B (it) 1994-07-07 1997-05-07 Recordati Chem Pharm Composizione farmaceutica a rilascio controllato di moguisteina in sospensione liquida
DE69632684T2 (de) 1995-06-27 2005-06-09 Takeda Pharmaceutical Co. Ltd. Verfahren zur herstellung von zubereitungen mit verzögerter freisetzung
TW448055B (en) 1995-09-04 2001-08-01 Takeda Chemical Industries Ltd Method of production of sustained-release preparation
JP2909418B2 (ja) 1995-09-18 1999-06-23 株式会社資生堂 薬物の遅延放出型マイクロスフイア
US5980945A (en) 1996-01-16 1999-11-09 Societe De Conseils De Recherches Et D'applications Scientifique S.A. Sustained release drug formulations
US6264970B1 (en) 1996-06-26 2001-07-24 Takeda Chemical Industries, Ltd. Sustained-release preparation
US5635517B1 (en) 1996-07-24 1999-06-29 Celgene Corp Method of reducing TNFalpha levels with amino substituted 2-(2,6-dioxopiperidin-3-YL)-1-oxo-and 1,3-dioxoisoindolines
US6419961B1 (en) 1996-08-29 2002-07-16 Takeda Chemical Industries, Ltd. Sustained release microcapsules of a bioactive substance and a biodegradable polymer
CA2217134A1 (en) 1996-10-09 1998-04-09 Sumitomo Pharmaceuticals Co., Ltd. Sustained release formulation
PT839525E (pt) 1996-10-31 2004-10-29 Takeda Chemical Industries Ltd Preparacao de libertacao prolongada
DK0946169T3 (da) 1996-12-20 2003-04-22 Takeda Chemical Industries Ltd Fremgangsmåde til fremstilling af et præparat med vedvarende frigivelse
US5891474A (en) 1997-01-29 1999-04-06 Poli Industria Chimica, S.P.A. Time-specific controlled release dosage formulations and method of preparing same
EP1064277B1 (en) 1998-03-16 2005-06-15 Celgene Corporation 2-(2,6-dioxopiperidin-3-yl)isoindoline derivatives, their preparation and their use as inhibitors of inflammatory cytokines
US6613358B2 (en) 1998-03-18 2003-09-02 Theodore W. Randolph Sustained-release composition including amorphous polymer
KR19990085365A (ko) 1998-05-16 1999-12-06 허영섭 지속적으로 약물 조절방출이 가능한 생분해성 고분자 미립구 및그 제조방법
US6248363B1 (en) 1999-11-23 2001-06-19 Lipocine, Inc. Solid carriers for improved delivery of active ingredients in pharmaceutical compositions
US6984522B2 (en) 2000-08-03 2006-01-10 Regents Of The University Of Michigan Isolation and use of solid tumor stem cells
AU2002213251B2 (en) 2000-10-16 2007-06-14 Bristol-Myers Squibb Company Protein scaffolds for antibody mimics and other binding proteins
US7754208B2 (en) 2001-01-17 2010-07-13 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
US20030133939A1 (en) 2001-01-17 2003-07-17 Genecraft, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
ATE472609T1 (de) 2001-04-26 2010-07-15 Amgen Mountain View Inc Kombinatorische bibliotheken von monomerdomänen
GB0120441D0 (en) 2001-08-22 2001-10-17 Novartis Forschungsstiftung Model of autoimmune disease and methods for identifying anti autoimmune disease disorders
US7173032B2 (en) 2001-09-21 2007-02-06 Reddy Us Therapeutics, Inc. Methods and compositions of novel triazine compounds
EP1824796A4 (en) 2004-11-16 2010-02-17 Avidia Res Inst PROTEIN SKELETONS AND USES THEREOF
WO2007133725A1 (en) * 2006-05-12 2007-11-22 University Of Miami Biomarkers for detection and diagnosis of head and neck squamous cell carcinoma
US20080045485A1 (en) 2006-08-17 2008-02-21 Peter Muir Methods of diagnosing synovial disease in a mammal by detecting bacterial DNA in synovial tissues from dogs with inflammatory knee arthritis and degenerative anterior cruciate ligament rupture
NZ577111A (en) * 2006-12-15 2012-05-25 Abbott Lab Novel oxadiazole compounds
WO2008115516A2 (en) 2007-03-20 2008-09-25 Celgene Corporation 4'-o-substituted isoindoline derivatives and compositions comprising and methods of using the same
KR101436578B1 (ko) 2007-03-30 2014-09-01 슈 생-쥐스땡 척추 측만증의 발병 위험성을 측정하는 방법, 척추 측만증에 걸린 대상자를 계층화하는 방법, 척추 측만증에 걸린 대상자에 있어서 고정기의 효능을 평가하는 방법, 및 이를 위한 키트
JP5442185B2 (ja) * 2007-04-24 2014-03-12 日本メナード化粧品株式会社 感作性物質評価方法
AU2009231804B2 (en) * 2008-03-31 2015-06-04 Boston Medical Center Corporation Predictive marker for topoisomerase I inhibitors
EP2274617A4 (en) 2008-04-10 2011-11-09 Massachusetts Inst Technology METHODS FOR IDENTIFYING AND USING AGENTS TARGETING CANCER STEM CELLS
HUE029289T2 (en) 2008-12-05 2017-02-28 Abbvie Inc Sulfonamide derivatives as Bcl-2 selective apoptosis inducers for the treatment of cancer and immune diseases
US9617600B2 (en) 2009-04-18 2017-04-11 Genentech, Inc. Methods for assessing responsiveness of B-cell lymphoma to treatment with anti-CD40 antibodies
RS58523B1 (sr) * 2010-02-11 2019-04-30 Celgene Corp Derivati arilmetoksi izoindolina i kombinacije koje ih obuhvataju i postupci njihove upotrebe
KR20130056855A (ko) 2010-03-01 2013-05-30 카리스 라이프 사이언스 룩셈부르크 홀딩스 치료진단용 생물학적 지표들
WO2012024543A1 (en) 2010-08-18 2012-02-23 Caris Life Sciences Luxembourg Holdings Circulating biomarkers for disease
CN103492590A (zh) 2011-02-22 2014-01-01 卡里斯生命科学卢森堡控股有限责任公司 循环生物标志物
CN103797131A (zh) * 2011-06-16 2014-05-14 卡里斯生命科学卢森堡控股有限责任公司 生物标志物组合物和方法
JP6318152B2 (ja) 2012-06-29 2018-04-25 セルジーン コーポレイション セレブロン関連タンパク質を利用して薬物効能を決定する方法
US20150038511A1 (en) 2012-08-09 2015-02-05 Celgene Corporation Treatment of immune-related and inflammatory diseases
US20140343058A1 (en) 2012-08-09 2014-11-20 Celgene Corporation Treatment of systemic lupus erythematosus
UA117141C2 (uk) 2013-10-08 2018-06-25 Селджин Корпорейшн Склади (s)-3-(4-((4-(морфолінометил)бензил)оксі)-1-оксоізоіндолін-2-іл)піперидин-2,6-діону
TWI745271B (zh) 2014-05-19 2021-11-11 美商西建公司 全身紅斑性狼瘡之治療

Also Published As

Publication number Publication date
SG11201500983RA (en) 2015-04-29
EA201590342A1 (ru) 2015-07-30
JP2015527349A (ja) 2015-09-17
CA3092279A1 (en) 2014-02-13
RS60416B1 (sr) 2020-07-31
KR20210073616A (ko) 2021-06-18
BR112015002272A2 (pt) 2017-07-04
PH12015500276A1 (en) 2015-04-27
IL237070B (en) 2019-06-30
HRP20200836T1 (hr) 2020-08-07
NI201500013A (es) 2019-05-10
CA3092279C (en) 2023-08-08
MX2015001686A (es) 2015-04-10
LT2882441T (lt) 2020-07-27
US20210340132A1 (en) 2021-11-04
DK2882441T3 (da) 2020-05-25
AU2013299625B2 (en) 2018-02-01
CA2881113A1 (en) 2014-02-13
CN104703605A (zh) 2015-06-10
CY1123106T1 (el) 2021-10-29
US20140045844A1 (en) 2014-02-13
EP2882441B1 (en) 2020-04-29
SI2882441T1 (sl) 2020-08-31
KR20150039848A (ko) 2015-04-13
TWI641371B (zh) 2018-11-21
JP6595565B2 (ja) 2019-10-23
NZ727295A (en) 2018-06-29
TW201408298A (zh) 2014-03-01
JP2018070623A (ja) 2018-05-10
AU2013299625A1 (en) 2015-02-12
NZ628077A (en) 2017-04-28
WO2014025958A2 (en) 2014-02-13
KR102266509B1 (ko) 2021-06-16
EP2882441A2 (en) 2015-06-17
HK1211474A1 (en) 2016-05-27
KR20200058606A (ko) 2020-05-27
CA2881113C (en) 2020-10-27
CN114939119A (zh) 2022-08-26
EP3741372A1 (en) 2020-11-25
WO2014025958A3 (en) 2014-04-17
CN108938642A (zh) 2018-12-07
ZA201500466B (en) 2016-06-29
PT2882441T (pt) 2020-06-29
US10919883B2 (en) 2021-02-16
IL237070A0 (en) 2015-03-31
UA116992C2 (uk) 2018-06-11
PL2882441T3 (pl) 2020-09-21
CN115068484A (zh) 2022-09-20
EA029085B1 (ru) 2018-02-28
KR102118559B1 (ko) 2020-06-03
HUE049569T2 (hu) 2020-09-28
JP6250671B2 (ja) 2017-12-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2800026T3 (es) Tratamiento de enfermedades inmunitarias e inflamatorias
US11524950B2 (en) Treatment of immune-related and inflammatory diseases
US20170165266A1 (en) Use of 3-(5-amino-2-methyl-4-oxoquinazolin-3(4h)-yl)piperidine-2,6-dione in treatment of immune-related and inflammatory diseases
ES2661583T3 (es) Métodos y composiciones usando inhibidores de PDE4 para el tratamiento y gestión de enfermedades autoinmunes e inflamatorias
KR20080086527A (ko) 아미노이소인돌린 화합물을 사용하여 피부 루푸스를치료하는 방법
CN102725283A (zh) 作为蛋白激酶抑制剂的化合物和组合物
BR112016018341B1 (pt) Composto de triazina, seu uso para propósitos médicos, composição farmacêutica, inibidor de mpges1 e agente profilático ou terapêutico
ES2749433T3 (es) Apremilast para el tratamiento de una enfermedad hepática o una anomalía de la función hepática
US20220395577A1 (en) Methods and materials for modulating nrf2 pathway
ES2909904T3 (es) Agente profiláctico o terapéutico para el trastorno del espectro autista
WO2015179279A1 (en) Treatment of immune-related and inflammatory diseases
TW202340142A (zh) Ｇｃｌ抑制劑