EA029085B1 - Способ лечения иммуноопосредуемых и воспалительных заболеваний с помощью 3-[4-(4-морфолин-4-илметилбензилокси)-1-оксо-1,3-дигидроизоиндол-2-ил]пиперидин-2,6-диона - Google Patents

Abstract

Настоящее изобретение относится к способу лечения, профилактики или контроля за течением иммуноопосредуемого заболевания или воспалительного заболевания, где заболевание представляет собой волчанку, склеродермию, ознобленную волчанку или саркоидоз, к способу ослабления, ингибирования или профилактики симптомов системной красной волчанки и склеродермии и к способу улучшения модифицированного кожного показателя Роднана, где указанные способы включают введение пациенту эффективного количества соединения формулы I или его фармацевтически приемлемой соли, сольвата, гидрата, стереоизомера, таутомера или рацемической смеси. Изобретение также относится к способам модулирования активности B-клеток и Т-клеток, где способы включают приведение клетки в контакт с эффективным количеством (S)-3-(4-((4-(морфолинометил)бензил)окси)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-диона или его фармацевтически приемлемой соли, сольвата или гидрата

Description

изобретение относится к способу лечения, профилактики или контроля за течением иммуноопосредуемого заболевания или воспалительного заболевания, где заболевание представляет собой волчанку, склеродермию, ознобленную волчанку или саркоидоз, к способу ослабления, ингибирования или профилактики симптомов системной красной волчанки и склеродермии и к способу улучшения модифицированного кожного показателя Роднана, где указанные способы включают введение пациенту эффективного количества соединения формулы Ι или его фармацевтически приемлемой соли, сольвата, гидрата, стереоизомера, таутомера или рацемической смеси. Изобретение также относится к способам модулирования активности В-клеток и Т-клеток, где способы включают приведение клетки в контакт с эффективным количеством (3)-3-(4-((4-(морфолинометил)бензил)окси)-1-оксоизоиндолин-2ил)пиперидин-2,6-диона или его фармацевтически приемлемой соли, сольвата или гидрата

029085

1. Родственные заявки

По настоящей заявке испрашивается приоритет временной патентной заявке США № 61/722718, поданной 5 ноября 2012 г., и 61/681491, поданной 9 августа 2012 г., которые включены в настоящее описание в качестве ссылок в полном объеме.

2. Список последовательностей

Настоящая заявка подается со списком последовательностей, предоставленном в качестве файла с названием 12827-207-888_8едЕ151шд.1х1 размером 6571 байт, который создан 8 августа 2012 г. Список последовательностей включен в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме.

3. Область изобретения

Настоящее изобретение относится к способам лечения, профилактики и/или контроля за течением заболеваний, связанных с лейкоцитарной активностью, включая активность В-клеток и/или Т-клеток, моноцитов, макрофагов и других типов клеток лимфоидного или миелоидного ряда, например за течением иммуноопосредуемых заболеваний или воспалительных заболеваний, которые включают введение соединения I или его фармацевтически приемлемой соли, сольвата, гидрата, стереоизомера, таутомера или рацемических смесей, включая (8)-3-[4-(4-морфолин-4-илметилбензилокси)-1-оксо-1,3-дигидроизоиндол-2-ил]пиперидин-2,6-дион. Также изобретение относится к фармацевтическим композициям и режимам дозирования при таком лечении, профилактике и/или контроля за течением.

4. Уровень техники

Воспалительные и иммуноопосредуемые заболевания, которые модулируются лимфоцитарной активностью, включая активность В-клеток и/или Т-клеток, такие как волчанка, склеродермия, ознобленная (регию) волчанка, саркоидоз, синдром Шегрена, АЫСА-индуцируемый васкулит, антифосфолипидный синдром и миастения, остаются важными медицинскими задачами.

Волчанка или системная красная волчанка представляет собой группу аутоиммунных нарушений, которые могут вызывать хроническое воспаление в различных частях организма, особенно на коже, в суставах, крови и почках. Иммунная система организма в норме обеспечивает защиту белками, называемыми антителами, от вирусов, бактерий и других чужеродных материалов (т.е. антигенов). При аутоиммунном нарушении, таком как волчанка, иммунная система утрачивает способность распознавать антигены и собственные клетки и ткани, что может приводить к тому, что антитела, направленные против собственных клеток и тканей организма, образуют иммунные комплексы. Эти иммунные комплексы могут накапливаться в тканях и вызывать воспаление, повреждение тканей и/или боль. Три наиболее распространенных типа волчанки включают системную красную волчанку (8ЬЕ), кожную красную волчанку (СЬЕ) и волчанку, вызываемую лекарственными средствами. Более подробное описание волчанки или системной красной волчанки может быть найдено в \Уа11асе, 2000, ТЬе Ьирик Воок: А Ошбе Гог РаОепЦ апб Ткеи РашШез, ОхГогб ИшуегкИу Ргекк, пересмотренное и дополненное издание, которое включено в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме.

Склеродермия является редким заболеванием и встречается стабильно с частотой приблизительно 19 случаев на 1 млн человек. Точная причина склеродермии неизвестна. Патология включает аутоиммунные реакции и изменение функции эндотелиальных клеток и фибробластов. Системная склеродермия обычно начинается с утолщения кожи, обычно кожи пальцев, сопровождающегося феноменом Рейно. Болезнь Рейно, как правило, предшествует дальнейшим проявлениям системной склеродермии. На ранней стадии заболевания пораженная кожа может быть отекшей и мягкой. Обычной областью наибольшего утолщения и уплотнения кожи является лицо, руки и пальцы. Часто отмечается склеродактилия. При обследовании часто пальпируется фрикционное истирание сухожилий и оно может быть болезненным. На более поздней стадии заболевания могут появляться изъязвления и самоампутация пальцев. Нарушение моторики желудочно-кишечного тракта является признаком, часто проявляющимся изжогой или диареей с нарушением всасывания или псевдонепроходимостью. Впервые возникающая гипертензия или почечная недостаточность являются проявлениями связанного с заболеванием повреждения сосудов. Также возможны сердечная недостаточность или аритмия, вызванные фиброзом сердца (НасЬи11а Е., Ьаипау Ό., И1адпок1к апб с1акк1Йсабоп оГ кук!етю кс1егок1к, С1ш Кеу А11егду 1ттипо1 2010; 40 (2):78-83).

Основными проявлениями склеродермии и, в частности системной склеродермии, являются ненадлежащий чрезмерный синтез и отложение коллагена, эндотелиальная дисфункция, спазм, коллапс и облитерация, вызванные фиброзом. Для диагностики важным клиническим признаком является утолщение кожи проксимальнее пястно-фаланговых суставов. Феномен Рейно является частым, практически универсальным компонентом склеродермии. Его диагностируют по изменению цвета кожи под действием холода. Симптомами болезни Рейно являются ишемия и утолщение кожи.

Саркоидоз представляет собой заболевание, которое отличается образованием гранулемы, усиливаемым лимфоцитами и макрофагами, обычно классифицируемым как ответ Т-хелперов 1 типа. Полагают, что фактором, вносящим вклад в первоначальное воспаление легких, является сверхпродукция фактора некроза опухоли (ΤΝΕ)-α, 1Ь-8 и 1Ь-18. Ознобленная волчанка является хроническим обезображивающим кожным проявлением саркоидоза, в основном поражающим лицо. Лечение саркоидоз и связанной с ним ознобленной волчанки крайне ограничено, например, кортикостероиды обеспечивают лишь умеренную эффективность (ВаидЬтап Р.Р.. 1ибкоп М.А., Теийет А.8., Мо11ег Э.Р.. Бо\уег Е.Е. ТаНбот1б

- 1 029085

Гог сйгошс загсо10оз13. СНезЬ 2002 М; 122(1):227-32).

Остается необходимость в профилактических или терапевтических средствах, которые можно использовать для лечения или профилактики иммуноопосредуемых и воспалительных заболеваний, включая волчанку, склеродермию, ознобленную волчанку, саркоидоз, синдром Шегрена, АЫСАиндуцируемый васкулит, антифосфолипидный синдром и миастения.

5. Сущность изобретения

Настоящее изобретение относится к способам лечения, контроля за течением и/или профилактике иммуноопосредуемых или воспалительных заболеванияй, которые включают введение терапевтически эффективного количества соединения формулы I

или его фармацевтически приемлемой соли, сольвата, гидрата, стереоизомера, таутомера или рацемических смесей.

В одном из вариантов осуществления соединение представляет собой 3-[4-(4-морфолин-4илметилбензилокси)-1-оксо-1,3-дигидроизоиндол-2-ил]пиперидин-2,6-дион.

В одном из вариантов осуществления соединение представляет собой фармацевтически приемлемую соль 3-[4-(4-морфолин-4-илметилбензилокси)-1-оксо-1,3-дигидроизоиндол-2-ил]пиперидин-2,6диона.

В одном из вариантов осуществления соединение представляет собой гидрохлорид 3-[4-(4морфолин-4-илметилбензилокси)-1-оксо-1,3-дигидроизоиндол-2-ил]пиперидин-2,6-диона.

В одном из вариантов осуществления соединение представляет собой (8)-3-[4-(4-морфолин-4илметилбензилокси)-1-оксо-1,3-дигидроизоиндол-2-ил]пиперидин-2,6-дион со следующей структурой:

или его фармацевтически приемлемую соль, сольват, гидрат или таутомер.

В одном из вариантов осуществления соединение представляет собой (8)-3-[4-(4-морфолин-4илметилбензилокси)-1-оксо-1,3-дигидроизоиндол-2-ил]пиперидин-2,6-дион.

В одном из вариантов осуществления соединение представляет собой фармацевтически приемлемую соль (8)-3-[4-(4-морфолин-4-илметилбензилокси)-1-оксо-1,3-дигидроизоиндол-2-ил]пиперидин-2,6диона.

В одном из вариантов осуществления соединение представляет собой гидрохлорид (8)-3-[4-(4морфолин-4-илметилбензилокси)-1-оксо-1,3-дигидроизоиндол-2-ил]пиперидин-2,6-диона.

В определенных вариантах осуществления заболевание выбрано из волчанки, склеродермии.

В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к способам модулирования, например снижения, лейкоцитарной активности, включая активность В-клеток и/или Т-клеток, которые включают приведение В-клетки и/или Т-клетки в контакт с эффективным количеством соединения I.

В определенных вариантах осуществления соединение I вводят в комбинации с одним или несколькими терапевтическими средствами, т.е. фармацевтическими средствами, которые являются модуляторами лейкоцитарной активности, включая активность В-клеток и/или Т-клеток, моноцитов, макрофагов и других типов клеток лимфоидного или миелоидного ряда. Комбинации предусматривают одновременное, а также последовательное введение.

6. Краткое описание чертежей

На фиг. 1 показан эффект (8)-3-[4-(4-морфолин-4-илметилбензилокси)-1-оксо-1,3-дигидроизоиндо- 2 029085

2-ил]пиперидин-2,6-диона на дифференцировку плазмобластов и активированных В-клеток.

На фиг. 2 показан эффект (8)-3-[4-(4-морфолин-4-илметилбензилокси)-1-оксо-1,3-дигидроизоиндо2-ил]пиперидин-2,6-диона на жизнеспособность клеток в ходе дифференцировки плазмобластов.

На фиг. 3 показан эффект (8)-3-[4-(4-морфолин-4-илметилбензилокси)-1-оксо-1,3-дигидроизоиндо2-ил]пиперидин-2,6-диона на экспрессию факторов транскрипции в В-клетках и плазмоцитах.

На фиг. 4 показан эффект (8)-3-[4-(4-морфолин-4-илметилбензилокси)-1-оксо-1,3-дигидроизоиндо2-ил]пиперидин-2,6-диона на продукцию 1§С в культурах плазмобластов.

На фиг. 5А и 5В показан эффект (8)-3-[4-(4-морфолин-4-илметилбензилокси)-1-оксо-1,3-дигидроизоиндо-2-ил]пиперидин-2,6-диона на экспрессию факторов транскрипции в В-клетках и плазмоцитах.

На фиг. 6 показан эффект (8)-3-[4-(4-морфолин-4-илметилбензилокси)-1-оксо-1,3-дигидроизоиндо2-ил]пиперидин-2,6-диона на продукцию 1§С в культурах В-клеток на 4, 7 и 10 сутки.

На фиг. 7 показан эффект (8)-3-[4-(4-морфолин-4-илметилбензилокси)-1-оксо-1,3-дигидроизоиндо2-ил]пиперидин-2,6-диона отдельно и в комбинации с преднизолоном на продукцию 1§С дифференцированными ίη νίΐτο плазмобластами/плазмоцитами.

На фиг. 8 показан эффект (8)-3-[4-(4-морфолин-4-илметилбензилокси)-1-оксо-1,3-дигидроизоиндо2-ил]пиперидин-2,6-диона на экспрессию СО20/СЭ38 в ходе дифференцировки В-клеток на 7 сутки.

На фиг. 9 показан эффект (8)-3-[4-(4-морфолин-4-илметилбензилокси)-1-оксо-1,3-дигидроизоиндо2-ил]пиперидин-2,6-диона на жизнеспособность клеток в ходе дифференцировки плазмобластов.

На фиг. 10 показан эффект (8)-3-[4-(4-морфолин-4-илметилбензилокси)-1-оксо-1,3-дигидроизоиндо2-ил]пиперидин-2,6-диона на дифференцировку и функцию В-клеток в РВМС пациентов с 8ЬЕ ίη νίίτο.

На фиг. 11А и 11В показан эффект (8)-3-[4-(4-морфолин-4-илметилбензилокси)-1-оксо-1,3-дигидроизоиндо-2-ил]пиперидин-2,6-диона на продукцию 1§С и 1дМ, соответственно, в культурах В-клеток на 7 сутки.

На фиг. 12 показан эффект (8)-3-[4-(4-морфолин-4-илметилбензилокси)-1-оксо-1,3-дигидроизоиндо2-ил]пиперидин-2,6-диона на дифференцировку СЭ19+ В-клеток в плазмобласты/плазмоциты.

На фиг. 13 показан эффект (8)-3-[4-(4-морфолин-4-илметилбензилокси)-1-оксо-1,3-дигидроизоиндо2-ил]пиперидин-2,6-диона на популяции клеток крупного размера (окно р2) в анализе дифференцировки нормальных В-клеток.

На фиг. 14 показан эффект (8)-3-[4-(4-морфолин-4-илметилбензилокси)-1-оксо-1,3-дигидроизоиндо2-ил]пиперидин-2,6-диона на факторы транскрипции плазмоцитов в культуре для В-клеточной дифференцировки.

На фиг. 15А-15Е показан эффект (8)-3-[4-(4-морфолин-4-илметилбензилокси)-1-оксо-1,3дигидроизоиндо-2-ил]пиперидин-2,6-диона (20 нМ) на экспрессию факторов транскрипции плазмоцитами в культивируемых В-клетках на 7 сутки.

На фиг. 16 показан эффект (8)-3-[4-(4-морфолин-4-илметилбензилокси)-1-оксо-1,3-дигидроизоиндо2-ил]пиперидин-2,6-диона на экспрессию факторов транскрипции в СЭ38+ плазмобластах/плазмоцитах из дифференцирующихся РВМС пациента с 8ЬЕ.

На фиг. 17 показан эффект (8)-3-[4-(4-морфолин-4-илметилбензилокси)-1-оксо-1,3-дигидроизоиндо2-ил]пиперидин-2,6-диона (представленного на фигуре как соединение I) на СЭ44 МИ в культуре для Вклеточной дифференцировки на 7 сутки.

На фиг. 18 показан эффект (8)-3-[4-(4-морфолин-4-илметилбензилокси)-1-оксо-1,3-дигидроизоиндо2-ил]пиперидин-2,6-диона на клетки СО20^Н|?||/СО44^Н|д|1 в анализе дифференцировки нормальных В-клеток на 7 сутки.

На фиг. 19 показан эффект (8)-3-[4-(4-морфолин-4-илметилбензилокси)-1-оксо-1,3-дигидроизоиндо2-ил]пиперидин-2,6-диона (представленного как соединение I на фигуре) на СЭ83+ клетки и экспрессию СЭ83+ в культуре для В-клеточной дифференцировки на 4 и 7 сутки.

На фиг. 20 показан эффект (8)-3-[4-(4-морфолин-4-илметилбензилокси)-1-оксо-1,3-дигидроизоиндо2-ил]пиперидин-2,6-диона (представленного как соединение I на фигуре) на экспрессию ί-цепи 1§ в культуре для В-клеточной дифференцировки.

На фиг. 21 проиллюстрирован эффект 3-[4-(4-морфолин-4-илметилбензилокси)-1-оксо-1,3дигидроизоиндо-2-ил]пиперидин-2,6-диона на продукцию определенных цитокинов и хемокинов в стимулированных антителом против СЭ3 Т-клетках человека, выраженный как абсолютное продуцированное количество.

На фиг. 22 проиллюстрирован эффект 3-[4-(4-морфолин-4-илметилбензилокси)-1-оксо-1,3дигидроизоиндо-2-ил]пиперидин-2,6-диона на продукцию определенных цитокинов и хемокинов в стимулированных антителом против СЭ3 Т-клетках человека, выраженный как процент от контроля.

На фиг. 23 проиллюстрирован эффект (К)-3-[4-(4-морфолин-4-илметилбензилокси)-1-оксо-1,3дигидроизоиндо-2-ил]пиперидин-2,6-диона на продукцию определенных цитокинов и хемокинов в стимулированных антителом против СЭ3 Т-клетках человека, выраженный как абсолютное продуцированное количество.

На фиг. 24 проиллюстрирован эффект (К)-3-[4-(4-морфолин-4-илметилбензилокси)-1-оксо-1,3дигидроизоиндо-2-ил]пиперидин-2,6-диона на продукцию определенных цитокинов и хемокинов в сти- 3 029085

мулированных антителом против СЭ3 Т-клетках человека, выраженный как процент от контроля.

На фиг. 25 проиллюстрирован эффект (8)-3-[4-(4-морфолин-4-илметилбензилокси)-1-оксо-1,3дигидроизоиндо-2-ил]пиперидин-2,6-диона на продукцию определенных цитокинов и хемокинов в стимулированных антителом против СЭ3 Т-клетках человека, выраженный как абсолютное продуцированное количество.

На фиг. 26 проиллюстрирован эффект (8)-3-[4-(4-морфолин-4-илметилбензилокси)-1-оксо-1,3дигидроизоиндо-2-ил]пиперидин-2,6-диона на продукцию определенных цитокинов и хемокинов в стимулированных антителом против СЭ3 Т-клетках человека, выраженный как процент от контроля.

На фиг. 27 проиллюстрировано ингибирование 3-[4-(4-морфолин-4-илметилбензилокси)-1-оксо-1,3дигидроизоиндо-2-ил]пиперидин-2,6-дионом продукции определенных цитокинов и хемокинов в стимулированных липополисахаридом мононуклеарных клетках периферической крови.

На фиг. 28 проиллюстрировано усиление продукции 3-[4-(4-морфолин-4-илметилбензилокси)-1оксо-1,3-дигидроизоиндо-2-ил]пиперидин-2,6-дионом определенных цитокинов и хемокинов в стимулированных липополисахаридом мононуклеарных клетках периферической крови.

На фиг. 29 проиллюстрировано ингибирование (К)-3-[4-(4-морфолин-4-илметилбензилокси)-1-оксо1,3-дигидроизоиндо-2-ил]пиперидин-2,6-дионом продукции определенных цитокинов и хемокинов в стимулированных липополисахаридом мононуклеарных клетках периферической крови.

На фиг. 30 проиллюстрировано усиление (К)-3-[4-(4-морфолин-4-илметилбензилокси)-1-оксо-1,3дигидроизоиндо-2-ил]пиперидин-2,6-дионом продукции определенных цитокинов и хемокинов в стимулированных липополисахаридом мононуклеарных клетках периферической крови.

На фиг. 31 проиллюстрировано ингибирование (8)-3-[4-(4-морфолин-4-илметилбензилокси)-1-оксо1,3-дигидроизоиндо-2-ил]пиперидин-2,6-дионом продукции определенных цитокинов и хемокинов в стимулированных липополисахаридом мононуклеарных клетках периферической крови.

На фиг. 32 проиллюстрировано усиление (8)-3-[4-(4-морфолин-4-илметилбензилокси)-1-оксо-1,3дигидроизоиндо-2-ил]пиперидин-2,6-дионом продукции определенных цитокинов и хемокинов в стимулированных липополисахаридом мононуклеарных клетках периферической крови.

На фиг. 33 проиллюстрировано усиление 3-[4-(4-морфолин-4-илметилбензилокси)-1-оксо-1,3дигидроизоиндо-2-ил]пиперидин-2,6-дионом продукции ΙΡΝ-γ ΝΚ-клетками в ответ на иммобилизованный 1§О и 1Ь-2, выраженное как абсолютное продуцированное количество.

На фиг. 34 проиллюстрировано усиление (К)-3-[4-(4-морфолин-4-илметилбензилокси)-1-оксо-1,3дигидроизоиндо-2-ил]пиперидин-2,6-дионом продукции ΙΡΝ-γ ΝΚ-клетками в ответ на иммобилизованный 1§О и 1Ь-2, выраженное как абсолютное продуцированное количество.

На фиг. 35 проиллюстрировано усиление (8)-3-[4-(4-морфолин-4-илметилбензилокси)-1-оксо-1,3дигидроизоиндо-2-ил]пиперидин-2,6-дионом продукции ΙΡΝ-γ ΝΚ-клетками в ответ на иммобилизованный 1§О и 1Ь-2, выраженное как абсолютное продуцированное количество.

На фиг. 36 проиллюстрировано усиление 3-[4-(4-морфолин-4-илметилбензилокси)-1-оксо-1,3дигидроизоиндо-2-ил]пиперидин-2,6-дионом продукции ΙΡΝ-γ ΝΚ-клетками в ответ на иммобилизованный 1§О и 1Ь-2, выраженное как процент от количества ΙΡΝ-γ, продуцированного в присутствии 1 мкм помалидомида.

На фиг. 37 проиллюстрировано усиление (К)-3-[4-(4-морфолин-4-илметилбензилокси)-1-оксо-1,3дигидроизоиндо-2-ил]пиперидин-2,6-дионом продукции ΙΡΝ-γ ΝΚ-клетками в ответ на иммобилизованный Ι§0 и 7-2, выраженное как процент от количества ΙΡΝ-γ, продуцированного в присутствии 1 мкм помалидомида.

На фиг. 38 проиллюстрировано усиление (8)-3-[4-(4-морфолин-4-илметилбензилокси)-1-оксо-1,3дигидроизоиндо-2-ил]пиперидин-2,6-дионом продукции ΙΡΝ-γ ΝΚ-клетками в ответ на иммобилизованный Ι§0 и 7-2, выраженное как процент от количества ΙΡΝ-γ, продуцированного в присутствии 1 мкм помалидомида.

На фиг. 39 показан эффект соединений, описанных в настоящем описании, на индуцируемую факторами роста пролиферацию клеток эндотелия пупочных сосудов человека.

На фиг. 40 показан эффект соединений, описанных в настоящем описании, на индуцируемое факторами роста образование трубки из эндотелиальных клеток пупочных сосудов человека.

На фиг. 41 показан эффект соединений, описанных в настоящем описании, на индуцируемую факторами роста инвазию клеток эндотелия пупочных сосудов человека.

На фиг. 42 показан эффект (8)-3-[4-(4-морфолин-4-илметилбензилокси)-1-оксо-1,3-дигидроизоиндо2-ил]пиперидин-2,6-диона на толщину кожи очага повреждения на модели индуцируемого блеомицином фиброза кожи на мышах (профилактика запускаемого воспалением фиброза).

На фиг. 43 показаны микрофотографии окрашенных гематоксилином и эозином срезов кожи, демонстрирующие толщину кожи очага повреждения на модели индуцируемого блеомицином фиброза кожи на мышах (профилактика запускаемого воспалением фиброза).

На фиг. 44 показан эффект (8)-3-[4-(4-морфолин-4-илметилбензилокси)-1-оксо-1,3-дигидроизоиндо2-ил]пиперидин-2,6-диона на количество α-8ΜΑ + миофибробласты в коже очага повреждения на моде- 4 029085

ли индуцируемого блеомицином фиброза кожи на мышах (профилактика индуцируемого воспалением фиброза).

На фиг. 45 показан эффект исследуемых соединений на толщину кожи очага повреждения на модели индуцируемого блеомицином фиброза кожи на мышах (регрессия развившегося фиброза).

На фиг. 46 показаны микрофотографии окрашенных гематоксилином и эозином срезов кожи очагов повреждения на модели индуцируемого блеомицином фиброза кожи на мышах (регрессия развившегося фиброза).

На фиг. 47 показано снижение количеств α-8ΜΑ + миофибробласты в коже очага повреждения на модели индуцируемого блеомицином фиброза кожи на мышах (регрессия развившегося фиброза).

На фиг. 48А показано уменьшение толщины кожи (8)-3-[4-(4-морфолин-4-илметилбензилокси)-1оксо-1,3-дигидроизоиндо-2-ил]пиперидин-2,6-дионом у мышей Т8К-1.

На фиг. 48В показано снижение относительного содержания гидроксипролина посредством (8)-3[4-(4-морфолин-4-илметилбензилокси)-1-оксо-1,3-дигидроизоиндо-2-ил]пиперидин-2,6-диона у мышей Т8К-1.

На фиг. 49А показано модулирование СТОР (8)-3-[4-(4-морфолин-4-илметилбензилокси)-1-оксо1,3-дигидроизоиндо-2-ил] пиперидин-2,6-дионом.

На фиг. 49В показано модулирование ΡΑΙ-1 (8)-3-[4-(4-морфолин-4-илметилбензилокси)-1-оксо1,3-дигидроизоиндо-2-ил] пиперидин-2,6-дионом.

На фиг. 49С показано модулирование СОЬ1А (8)-3-[4-(4-морфолин-4-илметилбензилокси)-1-оксо1,3-дигидроизоиндо-2-ил] пиперидин-2,6-дионом.

На фиг. 49Ό показано модулирование а8МА (8)-3-[4-(4-морфолин-4-илметилбензилокси)-1-оксо1,3-дигидроизоиндо-2-ил] пиперидин-2,6-дионом.

На фиг. 49Е показано модулирование ССМР (8)-3-[4-(4-морфолин-4-илметилбензилокси)-1-оксо1,3-дигидроизоиндо-2-ил] пиперидин-2,6-дионом.

На фиг. 49Е показано модулирование ТОРВ1 (8)-3-[4-(4-морфолин-4-илметилбензилокси)-1-оксо1,3-дигидроизоиндо-2-ил] пиперидин-2,6-дионом.

На фиг. 50 показано модулирование СОЬ1, а8МА и ΡΝ (8)-3-[4-(4-морфолин-4илметилбензилокси)-1 -оксо-1,3-дигидроизоиндо-2-ил]пиперидин-2,6-дионом.

На фиг. 51 показано модулирование ММР1 и ΡΑΙ (8)-3-[4-(4-морфолин-4-илметилбензилокси)-1оксо-1,3-дигидроизоиндо-2-ил]пиперидин-2,6-дионом.

На фиг. 52 показано модулирование Όηιηΐ1 (8)-3-[4-(4-морфолин-4-илметилбензилокси)-1-оксо-1,3дигидроизоиндо-2-ил]пиперидин-2,6-дионом.

На фиг. 53 показан уровень экспрессии мРНК цереблона в нормальных фибробластах и фибробластах при 88с.

На фиг. 54 показан уровень экспрессии мРНК цереблона в нормальных тканях кожи и тканях кожи при 88с.

7. Подробное описание

Если не определено иначе, все технические и научные термины, используемые в настоящем описании, имеют то же значение, которое обычно подразумевает специалист в данной области. Все патенты, заявки, опубликованные заявки и другие публикации включены в качестве ссылок в полном объеме. В случае когда существует несколько определений термина в настоящем описании, преобладают термины, определенные в этом разделе, если нет иных указаний.

Как используется в настоящем изобретении и если нет иных указаний, термины "лечить", "осуществление лечения" и "лечение" относятся к облегчению или уменьшению тяжести заболевания или симптома, связанных с подвергаемым лечению заболеванием или состоянием.

Как используется в настоящем изобретении, "профилактика" и другие формы этих слов включают ингибирование возникновения или прогрессирования заболевания или нарушения или симптома конкретного заболевания или нарушения. В некоторых вариантах осуществления индивидуумы со злокачественной опухолью в семейным анамнезе являются кандидатами для профилактических мероприятий. Как правило, в контексте злокачественной опухоли термин "профилактика" относится к введению лекарственного средства перед появлением признаков или симптомов злокачественной опухоли, в частности, у индивидуумов с риском возникновения злокачественной опухоли.

Как используется в настоящем изобретении и если нет иных указаний, термин "контроль за течением" включает профилактику рецидива конкретного заболевания или нарушения у индивидуума, который страдал им, продление времени, в течение которого у индивидуума, который страдал заболеванием или нарушением, сохраняется ремиссия, снижение смертности у индивидуумов, и/или сохраняется снижение тяжести или профилактики симптома, связанного с заболеванием или состоянием, в отношении которых проводят контроль.

Как используется в настоящем изобретении, "индивидуум" означает животное, как правило, млекопитающее, включая человека. Как используется в настоящем изобретении, "пациент" означает человека.

Как используется в настоящем изобретении и если нет иных указаний, термины "терапевтически эффективное количество" и "эффективное количество" соединения относятся к количеству, достаточно- 5 029085

му для обеспечения терапевтического эффекта при лечении, профилактике и/или контроле за течением заболевания, для замедления или минимизации одного или нескольких симптомов, связанных с заболеванием или нарушением, в отношении которых проводят лечение. Термины "терапевтически эффективное количество" и "эффективное количество" могут включать количество, которое улучшает общую терапию, снижает или предотвращает симптомы или причины заболевания или нарушения или усиливает терапевтическую эффективность другого лекарственного средства.

Как используется в настоящем изобретении и если нет иных указаний, термин "профилактически эффективное количество" соединения представляет собой количество, достаточное для профилактики заболевания или состояния, или одного или нескольких симптомов, связанных с заболеванием или состоянием, или для профилактики его рецидива. Профилактически эффективное количество соединения означает количество лекарственного средства, отдельно или в комбинации с другими средствами, которое обеспечивает профилактический эффект при профилактике заболевания. Термин "профилактически эффективное количество" может включать количество, которое улучшает профилактику в целом или усиливает профилактическую эффективность другого профилактического средства.

Как используется в настоящем изобретении и если нет иных указаний, термин "фармацевтически приемлемая соль" включает, но ими не ограничивается, кислую соль, которая может присутствовать в соединениях, описанных в настоящем описании. В определенных кислых условиях соединение может образовывать широкое множество солей с различными неорганическими и органическими кислотами. Кислоты, которые можно использовать для получения фармацевтически приемлемых солей таких основных соединений, представляют собой кислоты, которые образуют соли, содержащие фармакологически приемлемые анионы, включая, но ими не ограничиваясь, ацетат, бензолсульфонат, бензоат, бикарбонат, битартрат, бромид, эдетат кальция, камсилат, карбонат, хлорид, бромид, йодид, цитрат, дигидрохлорид, эдетат, эдизилат, эстолат, эсилат, фумарат, глуцептат, глюконат, глутамат, гликолиларсанилат, гексилрезорцинат, гидрабамин, гидроксинафтоат, изетионат, лактат, лактобионат, малат, малеат, манделат, метансульфонат (мезилат), метилсульфат, мускат, напсилат, нитрат, пантотенат, фосфат/дифосфат, полигалактоуронат, салицилат, стеарат, сукцинат, сульфат, таннат, тартрат, теоклат, триэтиодид и памоат.

Как используется в настоящем изобретении и если нет иных указаний, термин "гидрат" означает соединение, описанное в настоящем описании, или его соль, дополнительно включающее стехиометрическое или нестехиометрическое количество воды, которая связана нековалентными межмолекулярными силами. Г идраты могут быть кристаллическими или некристаллическими.

Как используется в настоящем изобретении и если нет иных указаний, термин "сольват" означает сольват, образовавшийся путем связи одной или нескольких молекул растворителя с соединением, описанным в настоящем описании. Термин "сольват" включает гидраты (например, моногидрат, дигидрат, тригидрат, тетрагидрат и т.п.). Сольваты могут быть кристаллическими или некристаллическими.

Как используется в настоящем изобретении и если нет иных указаний, термин "стереоизомер" включает все энантиомерно/стереомерно чистые и энантиомерно/стереомерно обогащенные соединения, описанные в настоящем описании.

Как используется в настоящем изобретении и если нет иных указаний, термин "стереомерно чистый" или "энантиомерно чистый" означает, что соединение содержит один стереоизомер и, по существу, свободно от его противоположного стереоизомера или энантиомера. Например, соединение является стереомерно или энантиомерно чистым, когда соединение содержит 80, 90 или 95% или более одного стереоизомера и 20, 10 или 5% или менее противоположного стереоизомера. В определенных случаях соединение, описанное в настоящем описании, считают оптически активным или стереомерно/энантиомерно чистым (т.е., по существу, К-форма или, по существу, δ-форма) в отношении хирального центра, когда соединение имеет приблизительно 80% ее (избыток энантиомера) или более, предпочтительно, равный или более 90% ее в отношении конкретного хирального центра, и более предпочтительно 95% ее в отношении конкретного хирального центра.

Как используется в настоящем изобретении и если нет иных указаний, термин "стереомерно обогащенный" или "энантиомерно обогащенный" включает рацемические смеси, а также другие смеси стереомеров соединений, описанных в настоящем описании (например, К/δ = 30/70, 35/65, 40/60, 45/55, 55/45, 60/40, 65/35 и 70/30).

Термины "совместное введение" и "в комбинации с" включают введение двух или более лекарственных средств (например, соединение I или композиция, описанные в настоящем описании, и другой модулятор лейкоцитарной активности, включая активность В-клеток и/или Т-клеток, моноцитов, макрофагов и других типов клеток лимфоидного и миелоидного ряда или другого активного средства) совместно, одновременно или последовательно без конкретных временных пределов. В одном из вариантов осуществления соединение I и по меньшей мере одно другое средство присутствуют в клетке или в организме индивидуума одновременно или проявляют свой биологический или терапевтический эффект одновременно. В одном из вариантов осуществления лекарственное средство(а) находятся в одной и той же композиции или отдельной лекарственной форме. В другом варианте осуществления лекарственное средство(а) находятся в разных композициях или отдельных лекарственных формах.

"В-клетка" представляет собой лимфоцит, который созревает в костном мозге, и включает наивную

- 6 029085

В-клетку, В-клетку памяти или эффекторную В-клетку (плазмоциты). В-клетка, описанная в настоящем описании, может представлять собой нормальную или незлокачественную В-клетку.

"Т-клетка" представляет собой лимфоцит, который созревает в тимусе и включает хелперную Тклетку, Т-клетку памяти и цитотоксическую Т-клетку.

Как используется в настоящем изобретении, "общая выживаемость" относится к времени от рандомизации до гибели по любой причине и общую выживаемость определяют в популяции всех включенных в исследование пациентов. Общую выживаемость можно оценивать в рандомизированных контролируемых испытаниях.

Как используется в настоящем изобретении "частота объективных ответов" относится к доле пациентов со сниженными заданными симптомами склеродермии в конце заданного периода времени. Длительность ответа обычно измеряют от времени первоначального ответа до подтвержденного документально прогрессирования склеродермии.

Как используется в настоящем изобретении, "время до прогрессирования" означает время от рандомизации до объективного прогрессирования склеродермии. В определенных вариантах осуществления время до прогрессирования не включает смерть.

Как используется в настоящем изобретении, "выживаемость без прогрессирования" означает время от рандомизации до объективного прогрессирования склеродермии или смерти.

Как используется в настоящем изобретении, "время до констатации отсутствия эффекта терапии" означает любой конечный результат(ы), определяющий время от рандомизации до прекращения лечения по любой причине, включая прогрессирование заболевания, токсичность лечения и смерть.

Как используется в настоящем изобретении, "смертность" означает показатель количества смертей в данной популяции.

Как используется в настоящем изобретении, "респираторная смертность" означает пациентов, которые погибают от острой гипоксемии или другого конкретного респираторного ухудшения, приводящего к смерти, такого как потребность в искусственной вентиляции, приводящая к смерти, остановка дыхания или любое другое событие у индивидуума, считающееся респираторным по своей природе.

Как используется в настоящем изобретении, "респираторная госпитализация" означает пациентов, госпитализированных вследствие ухудшения легочного статуса, документированного в записях при госпитализации или в другом медицинском заключении.

Как используется в настоящем изобретении, "модифицированный кожный показатель Роднана" означает проверенную числовую оценочную систему для оценки толщины дермы кожи.

Как используется в настоящем изобретении, "толщина кожи" означает плотную или уплотненную кожу, которую можно оценивать с использованием различных способов, включая дюрометр и шК8§.

Как используется в настоящем изобретении, "уплотнение кожи" означает кожу, которая является затвердевшей, красной, воспаленной, утолщенной или болезненной.

Как используется в настоящем изобретении, "дерматологический индекс качества жизни" означает оценку качества жизни, связанную с кожными симптомами, у пациента, страдающего склеродермией.

Как используется в настоящем изобретении, "легочная функция" означает любой показатель из скорости форсированного выдоха, форсированной жизненной емкости, РЕУ 25-75%, объемов легких или жизненной емкости.

Как используется в настоящем изобретении, "диффузионная способность по монооксиду углерода" означает оценку усвоения монооксида углерода через альвеолярно-капиллярную мембрану. Она может быть посредником для измерения способности легких переносить кислород из легких в кровоток.

Как используется в настоящем изобретении, "индекс одышки по МаЫет" означает инструмент, который обеспечивает клиническое измерение затруднения дыхания.

Как используется в настоящем изобретении, "анкета больницы святого Георгия при патологии органов дыхания" означает инструмент, который определяет качество жизни пациентов с легочным заболеванием.

Как используется в настоящем изобретении, "показатель желудочно-кишечного тракта консорциума по клиническим испытаниям склеродермии ИСЬЛ" означает анкетирование, проводимое у пациентов со склеродермией, для оценки желудочно-кишечных симптомов, связанных со склеродермией (системной склеродермией).

Как используется в настоящем изобретении, "поток-опосредованное расширение" означает любой показатель функции сосудистого эндотелия у пациента, страдающего склеродермией.

Как используется в настоящем изобретении, "испытание шестиминутной ходьбы" означает любую оценку расстояния, которое может пройти пациент, имеющий склеродермию, в течение 6 мин или любую стандартизованную методику для оценки способности ходить в течение фиксированного периода времени или на фиксированное расстояние.

Как используется в настоящем изобретении, помалидомид относится к следующему соединению:

- 7 029085

В определенных вариантах осуществления соединение I для применения в способах, описанных в настоящем описании, включая комбинированную терапию, и в композициях, описанных в настоящем описании, представляет собой соединение формулы

или его фармацевтически приемлемую соль, сольват, гидрат, стереоизомер, таутомер или рацемические смеси.

В одном из вариантов осуществления соединение представляет собой (3)-3-[4-(4-морфолин-4илметилбензилокси)-1-оксо-1,3-дигидроизоиндол-2-ил]пиперидин-2,6-дион со следующей структурой:

СоединениеΙΑ

или его фармацевтически приемлемую соль, сольват, гидрат или таутомер.

В одном из вариантов осуществления соединение представляет собой (3)-3-[4-(4-морфолин-4илметилбензилокси)-1-оксо-1,3-дигидроизоиндол-2-ил]пиперидин-2,6-дион.

В одном из вариантов осуществления соединение представляет собой фармацевтически приемлемую соль (3)-3-[4-(4-морфолин-4-илметилбензилокси)-1-оксо-1,3-дигидроизоиндол-2-ил]пиперидин-2,6диона.

В одном из вариантов осуществления соединение представляет собой гидрохлорид (3)-3-[4-(4морфолин-4-илметилбензилокси)-1-оксо-1,3-дигидроизоиндол-2-ил]пиперидин-2,6-диона.

В одном из вариантов осуществления соединение выбрано из 3-[4-(4-морфолин-4-илметилбензилокси)-1-оксо-1,3-дигидроизоиндол-2-ил]пиперидин-2,6-диона, гидрохлорида 3-[4-(4-морфолин-4илметилбензилокси)-1-оксо-1,3-дигидроизоиндо-2-ил]пиперидин-2,6-диона, (3)-3-[4-(4-морфолин-4илметилбензилокси)-1-оксо-1,3-дигидроизоиндо-2-ил]пиперидин-2,6-диона и гидрохлорида (3)-3-[4-(4морфолин-4-илметилбензилокси)-1-оксо-1,3-дигидроизоиндо-2-ил]пиперидин-2,6-диона.

Соединение I или его фармацевтически приемлемую соль, сольват, гидрат, стереоизомер, таутомер или рацемические смеси можно получать способами, известными специалисту в данной области, например, по методике, описанной в публикации США № 2011/0196150, полное содержание которой включено в настоящее описание в качестве ссылки.

Пример способа получения описан в примере 1.

7.2. Способы лечения

Настоящее изобретение относится к способам лечения, профилактики и/или контроля за течением заболеваний, нарушений и/или состояний, связанных с иммуноопосредуемыми и воспалительными заболеваниями, которые включают введение терапевтически эффективного количества соединения I или его фармацевтически приемлемой соли, сольвата, гидрата, стереоизомера, таутомера или рацемических смесей пациенту. В определенных вариантах осуществления заболевание представляет собой волчанку или склеродермию.

Чувствительность соединения I или его фармацевтически приемлемой соли, сольвата, гидрата, стереоизомера, таутомера или рацемических смесей можно исследовать в различных анализах ΐη νίνο и ΐη νΐίΓο, включая модели на животных, известные специалисту в данной области, для иммуноопосредуемых и воспалительных заболеваний, включая, но ими не ограничиваясь, модель системной красной волчанки

- 8 029085

на мышах МКЬ/Мр1-Ра81рг/1, модель системной красной волчанки на мышах ΝΖΒΑΡ1/1, модель индуцируемого блеомицином фиброза кожи и модель на мышах ΙίβΙιΙ 8кш-1 (Ткк-1).

7.2.1. Лечение склеродермии

В определенных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способам лечения, профилактики и/или контроля за течением склеродермии или ее симптома, которые включают введение терапевтически эффективного количества соединения I или его фармацевтически приемлемой соли, сольвата, гидрата, стереоизомера, таутомера или рацемических смесей пациенту, страдающему склеродермией. В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к способам лечения, профилактики и/или контроля за течением склеродермии или ее симптома, которые включают введение пациенту эффективного количества (§)-3-[4-(4-морфолин-4-илметилбензилокси)-1-оксо-1,3-дигидроизоиндо-2-ил]пиперидин-2,6-диона или его фармацевтически приемлемой соли.

В определенных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способам профилактики склеродермии или ее симптома, которые включают введение эффективного количества соединения I или его фармацевтически приемлемой соли, сольвата, гидрата, стереоизомера, таутомера или рацемических смесей, пациенту с риском возникновения склеродермии. В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к способам профилактики склеродермии или ее симптома, которые включают введение эффективного количества (§)-3-[4-(4-морфолин-4-илметилбензилокси)-1-оксо-1,3дигидроизоиндо-2-ил]пиперидин-2,6-диона или его фармацевтически приемлемой соли.

В определенных вариантах осуществления склеродермия представляет собой локализованную, системную, ограниченную или диффузную склеродермию.

В определенных вариантах осуществления системная склеродермия включает СРЕ§Т-синдром (кальциноз, синдром Рейно, дисфункция или нарушение подвижности пищевода, склеродактилия, телеангиэктазия). Склеродермия также известна как системная склеродермия или прогрессирующая системная склеродермия. В определенных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способам лечения или профилактики болезни или синдрома Рейно. В определенных вариантах осуществления системная склеродермия включает склеродермическое заболевание легких, склеродермический почечный криз, сердечные проявления, мышечную слабость (включая усталость или ограниченный СРЕ8Т), нарушение подвижности и спазм желудочно-кишечного тракта, и аномалии в центральной, периферической и автономной нервной системе (включая синдром запястного канала, за которым следует невралгия тройничного нерва). Также она включает общее бессилие, в том числе депрессию и влияние на качество жизни.

В определенных вариантах осуществления ограниченная склеродермия ограничивается руками, лицом, шеей или их комбинациями.

В определенных вариантах осуществления диффузная склеродермия включает утолщение кожи и также возникает выше запястьев (или локтей). В определенных вариантах осуществления диффузная системная склеродермия представляет собой склеродермию без склеродермы, включающую фиброз внутренних органов без уплотнения кожи; или семейную прогрессирующую системную склеродермию.

В одном из вариантов осуществления склеродермия не связана с истощением, таким как вызванное заболеванием истощение.

В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к способам уменьшения, ингибирования или профилактики одного или нескольких из следующих симптомов склеродермии: (ί) постепенное уплотнение, утолщение и стягивание кожи (например, на конечностях, например руках, на лице и на ступнях); (ίί) обесцвечивание кожи; (ίίί) онемение конечностей; (ίν) блестящая кожа; (ν) небольшие белые образования под поверхностью кожи, которые прорываются мелово-белой жидкостью; (νί) дисфункция пищевода Рейно (боль, онемение и/или изменение цвета рук, вызываемое спазмом кровеносных сосудов под действием холода или эмоциональной нагрузки); (νίί) телеангиэктазия (красные пятна, например, на руках, ладонях, предплечьях, лице и губах); (νίίί) боль и/или скованность суставов; (ίχ) опухание рук и ступней; (х) кожный зуд; (χί) скованность и скручивание пальцев; (χίί) язвы (нарывы) на внешней поверхности определенных суставов, таких как суставы пальцев и локти; (χίίί) проблемы с пищеварением, такие как изжога, затрудненность глотания, диарея, раздраженный кишечник и запор; (χίν) усталость и слабость; (χν) затрудненность дыхания; (χνί) артрит; (χνίί) потеря волос; (χνίίί) проблемы с внутренними органами; (χίχ) изъязвления пальцев; или (хх) аутоампутация пальцев, которые включают введение эффективного количества соединения I пациенту.

Без связи с какой-либо конкретной теорией полагают, что соединение I или его фармацевтически приемлемая соль, сольват, гидрат, стереоизомер, таутомер или рацемические смеси усиливают иммунный ответ по типу ТЫ и подавляют иммунный ответ по типу ТЬ2, что может приводить к антифибротическим эффектам на коже.

Кроме того, настоящее изобретение относится к способам увеличения или снижения толщины кожи пациента, страдающего склеродермией, которые включают введение эффективного количества соединения I или его фармацевтически приемлемой соли, сольвата, гидрата, стереоизомера, таутомера или рацемических смесей пациенту. В одном из вариантов осуществления толщина кожи снижается приблизительно на 20%, приблизительно на 25%, приблизительно на 30%, приблизительно на 40%, приблизитель- 9 029085

но на 50%, приблизительно на 60%, приблизительно на 70% приблизительно на 80%, приблизительно на 90% или более.

Кроме того, настоящее изобретение относится к способам достижения одного или нескольких клинических конечных результатов, связанных со склеродермией, которые включают введение эффективного количества соединения I или его фармацевтически приемлемой соли, сольвата, гидрата, стереоизомера, таутомера или рацемических смесей пациенту.

Кроме того, настоящее изобретение относится к способам повышения общей выживаемости, частоты объективных ответов, времени до прогрессирования, выживаемости без прогрессирования и/или времени до констатации отсутствия эффекта терапии у пациента, страдающего склеродермией, которые включают введение пациенту эффективного количества соединения I или его фармацевтически приемлемой соли, сольвата, гидрата, стереоизомера, таутомера или рацемических смесей.

Кроме того, настоящее изобретение относится к способам снижения смертности, респираторной смертности и/или респираторной госпитализации у пациента, страдающего склеродермией, которые включают введение пациенту эффективного количества соединения I или его фармацевтически приемлемой соли, сольвата, гидрата, стереоизомера, таутомера или рацемических смесей.

Кроме того, настоящее изобретение относится к способам улучшения модифицированного кожного показателя Роднана у пациента, страдающего склеродермией, которые включают введение пациенту эффективного количества соединения I или его фармацевтически приемлемой соли, сольвата, гидрата, стереоизомера, таутомера или рацемических смесей. В одном из вариантов осуществления улучшение модифицированного кожного показателя Роднана составляет 5, 10, 15 или 20 баллов или более.

Кроме того, настоящее изобретение относится к способам улучшения или уменьшения толщины кожи у пациента, страдающего склеродермией, которые включают введение пациенту эффективного количества соединения I или его фармацевтически приемлемой соли, сольвата, гидрата, стереоизомера, таутомера или рацемических смесей. В одном из вариантов осуществления толщина кожи снижается приблизительно на 20%, приблизительно на 25%, приблизительно на 30%, приблизительно на 40%, приблизительно на 50%, приблизительно на 60%, приблизительно на 70%, приблизительно на 80%, приблизительно на 90% или более.

Кроме того, настоящее изобретение относится к способам улучшения или снижения уплотнения кожи у пациента, страдающего склеродермией, которые включают введение пациенту эффективного количества соединения I или его фармацевтически приемлемой соли, сольвата, гидрата, стереоизомера, таутомера или рацемических смесей.

Кроме того, настоящее изобретение относится к способам улучшения дерматологического индекса качества жизни у пациента, страдающего склеродермией, которые включают введение пациенту эффективного количества соединения I или его фармацевтически приемлемой соли, сольвата, гидрата, стереоизомера, таутомера или рацемических смесей.

Кроме того, настоящее изобретение относится к способам улучшения легочной функции у пациентов, страдающих склеродермией, которые включают введение пациенту эффективного количества соединения I или его фармацевтически приемлемой соли, сольвата, гидрата, стереоизомера, таутомера или рацемических смесей.

Кроме того, настоящее изобретение относится к способам улучшения диффузионной способности по моноокиси углерода у пациента, страдающего склеродермией, которые включают введение пациенту эффективного количества соединения I или его фармацевтически приемлемой соли, сольвата, гидрата, стереоизомера, таутомера или рацемических смесей. В одном из вариантов осуществления диффузионная способность по монооксиду углерода улучшается вследствие улучшения диффузионной способности легких для монооксида углерода (Э[ со) приблизительно на 10%, приблизительно на 20%, приблизительно на 25%, приблизительно на 30%, приблизительно на 40%, приблизительно на 50%, приблизительно на 60%, приблизительно на 70%, приблизительно на 80%, приблизительно на 90% или более.

Кроме того, настоящее изобретение относится к способам улучшения индекса одышки по МаЫег у пациента, страдающего склеродермией, которые включают введение пациенту эффективного количества соединения I или его фармацевтически приемлемой соли, сольвата, гидрата, стереоизомера, таутомера или рацемических смесей. В одном из вариантов осуществления улучшение индекса одышки по МаЫег составляет 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 баллов или более.

Кроме того, настоящее изобретение относится к способам улучшения показателя опросника больницы святого Г еоргия при патологии органов дыхания у пациента, страдающего склеродермией, которые включают введение пациенту эффективного количества соединения I или его фармацевтически приемлемой соли, сольвата, гидрата, стереоизомера, таутомера или рацемических смесей. В одном из вариантов осуществления улучшение показателя анкеты больницы святого Георгия при патологии органов дыхания составляет 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52 баллов или более.

Кроме того, настоящее изобретение относится к способам улучшения показателя желудочнокишечного тракта консорциума по клиническим испытаниям склеродермии ИСЬЛ у пациента, страдающего склеродермией, которые включают введение пациенту эффективного количества соединения I или его фармацевтически приемлемой соли, сольвата, гидрата, стереоизомера, таутомера или рацемических

- 10 029085

смесей.

Кроме того, настоящее изобретение относится к способам лечения или профилактики изъязвления пальцев у пациента или в популяции пациентов, страдающих склеродермией, которые включают введение пациенту эффективного количества соединения I или его фармацевтически приемлемой соли, сольвата, гидрата, стереоизомера, таутомера или рацемических смесей.

Кроме того, настоящее изобретение относится к способам улучшения поток-опосредованного расширения у пациента, страдающего склеродермией, которые включают введение пациенту эффективного количества соединения I или его фармацевтически приемлемой соли, сольвата, гидрата, стереоизомера, таутомера или рацемических смесей.

Кроме того, настоящее изобретение относится к способам улучшения или увеличения расстояния, пройденного в испытании шестиминутной ходьбы, у пациента, страдающего склеродермией, которые включают введение пациенту эффективного количества соединения I или его фармацевтически приемлемой соли, сольвата, гидрата, стереоизомера, таутомера или рацемических смесей. В одном из вариантов осуществления увеличение расстояния, пройденного в испытании шестиминутной ходьбы, составляет приблизительно 200 м, приблизительно 250 м, приблизительно 300 м, приблизительно 350 м, приблизительно 400 м или более.

7.2.2. Лечение красной волчанки

В определенных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способам лечения, профилактики и/или контроля за течением красной волчанки или ее симптома, которые включают введение терапевтически эффективного количества соединения I или его фармацевтически приемлемой соли, сольвата, гидрата, стереоизомера, таутомера или рацемических смесей пациенту, страдающему красной волчанкой. В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к способам лечения, профилактики и/или контроля за течением красной волчанки или ее симптома, которые включают введение терапевтически эффективного количества (§)-3-[4-(4-морфолин-4-илметилбензилокси)-1-оксо-1,3дигидроизоиндо-2-ил]пиперидин-2,6-диона или его фармацевтически приемлемой соли пациенту, имеющему красную волчанку.

В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к способам профилактики красной волчанки или ее симптома, которые включают введение эффективного количества соединения I или его фармацевтически приемлемой соли, сольвата, гидрата, стереоизомера, таутомера или рацемических смесей пациенту, который имеет риск наличия красной волчанки. В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к способам профилактики красной волчанки или ее симптома, которые включают введение эффективного количества (§)-3-[4-(4-морфолин-4-илметилбензилокси)-1оксо-1,3-дигидроизоиндо-2-ил]пиперидин-2,6-диона или его фармацевтически приемлемой соли пациенту, который имеет риск наличия красной волчанки.

В определенных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способам лечения, профилактики и/или контроля за течением системной красной волчанки (8ЬЕ), кожной красной волчанки (СЬЕ) или индуцированной лекарственным средством волчанки.

Выражение "системная красная волчанка" используют в настоящем описании взаимозаменяемо с терминами "8ЬЕ" и "волчанка", и это выражение относится ко всем проявлением заболевания, как известно в данной области (включая ремиссии и обострения). При 8ЬЕ ключевую роль играют патологическая гиперактивность Β-лимфоцитов и массивная патологическая продукция аутоантител иммуноглобулинов-γ ОдС). Этот патологический процесс приводит к секвестрации и разрушению покрытых Ц клеток, фиксации и расщеплению белков системы комплемента и высвобождению хемотаксинов, вазоактивных пептидов и деструктивных ферментов в ткани (Найп ΒΗ. ЗуЧспие Ьирик ЕтуШешаФкик. Какрег ОЕ ВгаиитаШ Е, Раис1 Αδ, Наикег 8Ь, Ьоидо ЭР йппекои Ж, ебйотк. Наткоп'к Рттщркк оГ !Шегпа1 Мебюте (161Ь ебйюп). Хеи Уогк (υδ): МсСтаи-НШ; 2005, рр.1960-1967).

Симптомы δΕ-Е изменяются от человека к человеку и могут появляться и проходить. У большинства пациентов симптомы включают боль и опухание суставов. Часто поражаемыми суставами являются пальцы, руки, запястья и колени. У некоторых пациентов развивается артрит. Другие распространенные симптомы включают: боль в груди при глубоком вдохе, усталость, лихорадка тревожность или плохое самочувствие (недомогание), потеря волос, изъязвления полости рта, опухание лимфатических узлов, чувствительность к солнцу, кожную сыпь - сыпь в форме "бабочки" на щеках и переносице поражает приблизительно половину людей с δΕ-Е. у некоторых пациентов сыпь ухудшается под действием солнечного света, сыпь также может быть широко распространенной.

Другие симптомы зависят от того, какая часть организма поражена, и к ним относятся следующие симптомы:

головной мозг и нервная система: головные боли, онемение, ощущение покалывания, судорожные припадки, проблемы со зрением, изменение личности;

пищеварительный тракт: боль в животе, тошнота и рвота; сердце: патологические сердечные ритмы (аритмии); легкие: кровохарканье и затруднение дыхания;

кожа: пятнистая кожа, пальцы, которые изменяют цвет на холоде (феномен Рейно).

- 11 029085

Некоторые пациенты имеют только кожные симптомы. Это называют дискоидной волчанкой.

В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к способам лечения умеренной, тяжелой или очень тяжелой §ЬЕ. Термин "тяжелая §ЬЕ", как используется в настоящем изобретении, относится к состоянию 8ЬЕ, если пациент имеет один или несколько тяжелых или угрожающих жизни симптомов (таких как гемолитическая анемия, обширное вовлечение сердца и легких, заболевание почек или вовлечение центральной нервной системы).

Кроме того, настоящее изобретение относится к способам достижения одного или нескольких клинических конечных результатов, связанных с 8ЬЕ, которые включают введение эффективного количества соединения I или его фармацевтически приемлемой соли, сольвата, гидрата, стереоизомера, таутомера или рацемических смесей пациенту.

Кроме того, настоящее изобретение относится к способам повышения общей выживаемости, частоты объективных ответов, времени до прогрессирования, выживаемости без прогрессирования и/или времени до констатации отсутствия эффекта терапии у пациента, имеющего 8ЬЕ, которые включают введение пациенту эффективного количества соединения I или его фармацевтически приемлемой соли, сольвата, гидрата, стереоизомера, таутомера или рацемических смесей.

В определенном варианте осуществления соединение I или его фармацевтически приемлемая соль, сольват, гидрат, стереоизомер, таутомер или рацемические смеси действуют как ингибиторы дифференцировки первичных СЭ19+ В-клеток памяти человека в стадию плазмобластов. Без связи с какой-либо конкретной теорией полагают, что соединение I или его фармацевтически приемлемая соль, сольват, гидрат, стереоизомер, таутомер или рацемические смеси блокируют клетки на незрелой стадии, тем самым снижая количества плазмобластов, которые способны продуцировать высокие уровни иммуноглобулинов. Функциональным следствием этого эффекта является сниженная продукция иммуноглобулина О ДдО) и иммуноглобулина М ДдМ) в этих культурах для дифференцировки.

В определенных вариантах осуществления соединение I или его фармацевтически приемлемая соль, сольват, гидрат, стереоизомер, таутомер или рацемические смеси ингибируют способность первичных СЭ19+ В-клеток памяти человека дифференцироваться в стадию плазмобласта. В определенных вариантах осуществления соединение I или его фармацевтически приемлемая соль, сольват, гидрат, стереоизомер, таутомер или рацемические смеси не имеют значительного эффекта на зрелые СЭ138+ клетки плазмы в кратковременных культурах. В определенных вариантах осуществления соединение I или его фармацевтически приемлемая соль, сольват, гидрат, стереоизомер, таутомер или рацемические смеси ингибируют факторы дифференцировки В-клеток, включая регулирующий интерферон фактор 4 (ГКЕ4), индуцируемый лимфоцитами белок созревания (ВЫМР), белок Х-бокс 1 (ХВР-1) и белок В-клеточной лимфомы 6 (Ве16).

7.3. Дозировки и вводимые количества

Доза соединения I или его фармацевтически приемлемой соли, сольвата, гидрата, стереоизомера, таутомера или рацемических смесей, вводимых пациенту, широко изменяется и может зависеть от мнения осуществляющего медицинскую помощь практикующего специалиста. Дозы соединения I или его фармацевтически приемлемой соли, сольвата, гидрата, стереоизомера, таутомера или рацемических смесей изменяются в зависимости от таких факторов, как: конкретное подвергаемое лечению, профилактике или контролю за течением показание; возраст и состояние пациента; и количество второго используемого активного средства, при его наличии. Как правило, соединение I или его фармацевтически приемлемую соль, сольват, гидрат, стереоизомер, таутомер или рацемические смеси можно вводить пациенту от одного до четырех или более раз в сутки в дозе приблизительно 0,005 мг/кг массы тела пациента до приблизительно 10 мг/кг массы тела пациента, однако описанная выше дозировка может соответствующим образом изменяться в зависимости от возраста, массы тела и медицинского состояния пациента и типа введения. В одном из вариантов осуществления доза составляет от приблизительно 0,01 до приблизительно 5 мг/кг массы тела пациента, от приблизительно 0,05 до приблизительно 1 мг/кг массы тела пациента, от приблизительно 0,1 до приблизительно 0,75 мг/кг массы тела пациента или от приблизительно 0,25 до приблизительно 0,5 мг/кг массы тела пациента.

В одном из вариантов осуществления вводят одну дозу в сутки. В любом данном случае вводимое количество соединения I или его фармацевтически приемлемой соли, сольвата, гидрата, стереоизомера, таутомера или рацемических смесей будет зависеть от таких факторов, как растворимость активного компонента, используемый состав и путь введения. В одном из вариантов осуществления применение концентрации для местного введения обеспечивает внутриклеточную экспозицию или концентрацию приблизительно 0,01-10 мкМ.

В определенных вариантах осуществления соединение I или его фармацевтически приемлемую соль, сольват, гидрат, стереоизомер, таутомер или рацемические смеси используют в количестве от приблизительно 0,1 до приблизительно 1000 мг в сутки, и его можно подбирать так, чтобы вводить общепринятым путем (например, одно и то же количество, вводимое каждые сутки периода лечения, профилактики или контроля за течением), курсами (например, одна неделя с введением, одна неделя без введения), или в количестве, которое увеличивается или снижается в ходе лечения, профилактики или контроля за течением. В других вариантах осуществления доза может составлять от приблизительно 1 до при- 12 029085

близительно 300 мг, от приблизительно 0,1 до приблизительно 150 мг, от приблизительно 1 до приблизительно 200 мг, от приблизительно 10 до приблизительно 100 мг, от приблизительно 0,1 до приблизительно 50 мг, от приблизительно 1 до приблизительно 50 мг, от приблизительно 10 до приблизительно 50 мг, от приблизительно 20 до приблизительно 30 мг или от приблизительно 1 до приблизительно 20 мг. В других вариантах осуществления доза может составлять от приблизительно 0,1 до приблизительно 100 мг, от приблизительно 0,1 до приблизительно 50 мг, от приблизительно 0,1 до приблизительно 25 мг, от приблизительно 0,1 до приблизительно 20 мг, от приблизительно 0,1 до приблизительно 15 мг, от приблизительно 0,1 до приблизительно 10 мг, от приблизительно 0,1 до приблизительно 7,5 мг, от приблизительно 0,1 до приблизительно 5 мг, от приблизительно 0,1 до приблизительно 4 мг, от приблизительно 0,1 до приблизительно 3 мг, от приблизительно 0,1 до приблизительно 2 мг или от приблизительно 1 до приблизительно 1 мг.

7.4. Комбинированная терапия

Соединение I или его фармацевтически приемлемую соль, сольват, гидрат, стереоизомер, таутомер или рацемические смеси можно комбинировать с другими фармакологически активными соединениями ("вторые активные средства") в способах и композициях, описанных в настоящем описании. Определенные комбинации могут действовать синергично при лечении конкретных типов заболеваний или нарушений, состояний и симптомов, связанных с такими заболеваниями или нарушениями. Соединение I или его фармацевтически приемлемая соль, сольват, гидрат, стереоизомер, таутомер или рацемические смеси также могут действовать, смягчая неблагоприятные эффекты, связанные со вторыми активными средствами, и наоборот.

В способах и композициях, описанных в настоящем описании, можно использовать один или несколько активных ингредиентов или средств. Вторые активные вещества могут представлять собой высокомолекулярные соединения (например, белки) или низкомолекулярные соединения (например, синтетические неорганические, металлоорганические или органические молекулы). В другом варианте осуществления способ лечения, описанный в настоящем описании, включает введение второго лекарственного средства, где второе лекарственное средство представляет собой противовоспалительное лекарственное средство, например стероидное противовоспалительное лекарственное средство, или нестероидное противовоспалительное средство (Ы8ЛГО), ацетаминофен, напроксен, ибупрофен, ацетилсалициловую кислоту и т.п. В более конкретном варианте осуществления, в котором вводят Ν8ΑΙΌ, также можно вводить ингибитор протонного насоса (РИ), например омепразол. В одном из вариантов осуществления противовоспалительное средство представляет собой кортикостероид. В другом варианте осуществления противовоспалительное средство представляет собой колхицин. В другом варианте осуществления второе лекарственное средство представляет собой иммуномодулирующее соединение или иммунодепрессивное соединение, такое как азатиоприн Дтигаи™, Л/азап^|Л1)· метотрексат (КЬеитаПех™, Тгеха11™), пеницилламин Щереи™, Сиρ^^т^ηе™)· циклофосфамид (Су1охап™), микофеналат (Се11Сер1™, МуГоШс™), босентан (Тгас1еег®), преднизон (ОеИазоие™, ЫдиН Ргей™), и ингибитор ΡΌΕ5. В другом варианте осуществления, где страдающий индивидуум имеет изъязвления пальцев и легочную гипертензию, можно вводить сосудорасширяющее средство, такое как простациклин (илопрост).

Можно вводить любую комбинацию упомянутых выше лекарственных средств, подходящих при лечении заболеваний или их симптомов. Такие лекарственные средства можно вводить в любой комбинации с соединением I или его фармацевтически приемлемой солью, сольватом, гидратом, стереоизомером, таутомером или рацемическими смесями, в одно и то же время или в качестве отдельного курса лечения.

7.5. Курсовая терапия

В определенных вариантах осуществления соединение I или его фармацевтически приемлемую соль, сольват, гидрат, стереоизомер, таутомер или рацемические смеси, описанные в настоящем описании, вводят пациенту курсами. Курсовая терапия вовлекает введение активного вещества в течение периода времени, за которым следует период покоя (т.е. прекращение введения) в течение некоторого периода времени и повторение этого последовательного введения. Курсовая терапия может снижать развитие устойчивости к одному или нескольким способам терапии, предотвращать или уменьшать побочные эффекты одного из способов терапии и/или повышать эффективность лечения.

Следовательно, в одном из вариантов осуществления соединение, описанное в настоящем описании, вводят каждые сутки в качестве однократной или разделенных доз курсом из от четырех до шести недель с периодом покоя, составляющим приблизительно неделю или две недели. Курсовая терапия, кроме того, позволяет увеличивать частоту, количество и длительность курсов введения. Таким образом, другой вариант осуществления включает введение соединения по настоящему изобретению в течение большего количества курсов, чем обычное количество курсов при введении его отдельно. В другом варианте осуществления соединение по настоящему изобретению вводят в течение большего количества курсов, которое обычно вызывает ограничивающую дозу токсичность у пациента, которому второй активный ингредиент не вводят.

В одном из вариантов осуществления соединение, описанное в настоящем описании, вводят каждые

- 13 029085

сутки и непрерывно в течение трех или четырех недель в дозе от приблизительно 0,03 до приблизительно 10 мг в сутки с последующим периодом покоя, составляющим одну или две недели. В других вариантах осуществления доза может составлять от приблизительно 0,1 до приблизительно 8 мг, от приблизительно 0,3 до приблизительно 6 мг, от приблизительно 1 до приблизительно 4 мг или приблизительно 2 мг, с последующим периодом покоя.

В одном из вариантов осуществления соединение, описанное в настоящем описании, и второй активный ингредиент вводят перорально, причем введение соединения, описанного в настоящем описании, происходит за 30-60 мин до введения второго активного ингредиента, в ходе курса из от четырех до шести недель. В другом варианте осуществления комбинацию соединения, описанного в настоящем описании, и второго активного ингредиента вводят путем внутривенной инфузии в течение приблизительно 90 мин в ходе каждого курса.

Как правило, количество курсов, в ходе которых проводят комбинированное введение пациенту, составляет от приблизительно одного до приблизительно 24 курсов, от приблизительно двух до приблизительно 16 курсов или от приблизительно четырех до приблизительно трех курсов.

7.6. Фармацевтические композиции и дозированные формы

Фармацевтические композиции можно использовать для получения отдельных лекарственных форм. Фармацевтические композиции и дозированные формы, описанные в настоящем описании, включают соединение, описанное в настоящем описании, или его фармацевтически приемлемую соль, сольват, гидрат, стереоизомер, рацемат, клатрат или пролекарство. Фармацевтические композиции и дозированные формы, кроме того, могут содержать один или несколько эксципиентов.

Фармацевтические композиции и дозированные формы, описанные в настоящем описании, также могут содержать один или несколько дополнительных активных ингредиентов. Примеры необязательных вторых или дополнительных активных ингредиентов описаны выше.

Отдельные лекарственные формы, описанные в настоящем описании, подходят для перорального введения, введения на слизистую оболочку (например, назального, сублингвального, вагинального, буккального или ректального), парентерального (например, подкожного, внутривенного, в виде болюсной инъекции, внутримышечного или внутриартериального), местного (например, глазные капли или другие офтальмологические препараты), трансдермального или чрескожного введения пациенту. Примеры дозированных форм включают, но не ограничиваются ими, таблетки; таблетки в форме капсул; капсулы, такие как мягкие эластичные желатиновые капсулы; крахмальные капсулы; лепешки; пастилки; дисперсии; суппозитории; порошки; аэрозоли (например, назальные аэрозоли или ингаляторы); гели; жидкие дозированные формы, подходящие для перорального введения или введения на слизистую оболочку пациента, включая суспензии (например, водные или неводные жидкие суспензии, эмульсии типа "масло-вводе", или жидкие эмульсии "вода-в-масле"), растворы и эликсиры; жидкие дозированные формы, подходящие для парентерального введения пациенту; глазные капли или другие офтальмологические препараты, подходящие для местного введения; и стерильные твердые вещества (например, кристаллические или аморфные твердые вещества), которые можно разбавлять, получая жидкие дозированные формы, подходящие для парентерального введения пациенту.

Композиция, форма и тип дозированных форм обычно изменяются в зависимости от их применения. Например, дозированная форма, используемая для неотложного лечения заболевания, может содержать более высокие количества одного или нескольких активных ингредиентов, которые она содержит, чем дозированная форма, используемая для длительного лечения того же заболевания. Аналогично, парентеральная дозированная форма может содержать меньшие количества одного или нескольких активных ингредиентов, которые она содержит, чем пероральная дозированная форма, используемая для лечения того же заболевания. Эти и другие способы применения, в которых используются конкретные дозированные формы, отличаются друг от друга и будут понятны специалистам в данной области. См., например, РепипдЮпк РЬаттасеийса1 Баеисек, 181Π ей., Маск РиЬНкЫид, ЕаИоп РА (1990).

В одном из вариантов осуществления фармацевтические композиции и дозированные формы содержат один или несколько эксципиентов. Подходящие эксципиенты хорошо известны специалистам в области фармацевтики, и неограничивающие примеры подходящих эксципиентов описаны в настоящем описании. Пригодность конкретного эксципиента для включения в фармацевтическую композицию или дозированную форму зависит от множества факторов, известных в данной области, включая, но ими не ограничиваясь, способ, которым дозированную форму будут вводить пациенту. Например, пероральные дозированные формы, такие как таблетки, могут содержать эксципиенты, не пригодные для применения в парентеральных дозированных формах. Пригодность конкретного эксципиента также может зависеть от конкретных активных ингредиентов в дозированной форме. Например, разложение некоторых активных ингредиентов может быть ускорено посредством некоторых эксципиентов, таких как лактоза, или под воздействием воды. Активные ингредиенты, которые содержат первичные или вторичные амины, являются особенно чувствительными к такому ускоренному разложению. Следовательно, предусматриваются фармацевтические композиции и дозированные формы, которые содержат небольшое количество или даже не содержат лактозы или других моносахаридов или дисахаридов. Как используют в настоящем описании, термин "не содержащий лактозы" означает, что количество имеющейся лактозы, если она

- 14 029085

имеется, является недостаточным для существенного повышения уровня деградации активного ингредиента.

Не содержащие лактозы композиции могут содержать эксципиенты, которые хорошо известны в данной области и приведены, например, в и.8. РЬагтасоре1а (И8Р) 25-ΝΡ20 (2002). В общем, не содержащие лактозы композиции содержат активные ингредиенты, связующее вещество/наполнитель и смазывающее вещество в фармацевтически совместимых и фармацевтически приемлемых количествах. В одном из вариантов осуществления не содержащие лактозы дозированные формы содержат активные ингредиенты, микрокристаллическую целлюлозу, прежелатинизированный крахмал и стеарат магния.

Также предусматриваются безводные фармацевтические композиции и дозированные формы, содержащие активные ингредиенты, поскольку вода может способствовать деградации некоторых соединений. Например, добавление воды (например, 5%) широко принято в фармацевтической области в качестве способа моделирования длительного хранения в целях определения свойств, таких как срок хранения или стабильность составов с течением времени. См., например, 1еп8 Т. СагНешеп. Эгид 81аЬПйу: Ргшс1р1е8 & Ргасйсе, 2й. Ей., Магсе1 Эеккег, ΝΥ, ΝΥ, 1995, рр. 379-80. В действительности, вода и нагревание ускоряют разложение некоторых соединений. Таким образом, эффект воды на состав может быть значительным, поскольку жидкость и/или влага часто встречаются в ходе получения, обработки, упаковывания, хранения, транспортировки и применения составов.

Безводные фармацевтические композиции и дозированные формы можно получать с использованием безводных или содержащих низкое количество влаги ингредиентов и в условиях с низким содержанием жидкости или низким содержанием влаги. Фармацевтические композиции и дозированные формы, которые содержат лактозу и по меньшей мере один активный ингредиент, который содержит первичный или вторичный амин являются безводными, если ожидается существенный контакт с влагой и/или жидкостью в ходе получения, упаковывания и/или хранения.

Безводную фармацевтическую композицию следует получать и хранить так, чтобы поддерживать безводные условия. Таким образом, в одном из вариантов осуществления настоящее изобретение охватывает безводные композиции, упакованные с использованием материалов, о которых известно, что они препятствуют воздействию воды, так что их можно включать в подходящие составные наборы. Примеры приемлемых упаковочных материалов включают, но не ограничиваются ими, герметичную фольгу, пластик, контейнеры для единичной дозы (например, ампула), блистерную упаковку и контурную упаковку.

Также предусматриваются фармацевтические композиции и дозированные формы, которые содержат одно или несколько соединений, которые уменьшают скорость деградации активного ингредиента. Такие соединения, которые в настоящем описании называют "стабилизаторами", включают, но не ограничиваются ими, антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота, рН-буферы или солевые буферы.

Подобно количествам и типам эксципиентов количества и конкретные типы активных ингредиентов в дозированной форме могут различаться в зависимости от факторов, таких как, но ими не ограничиваясь, способ, посредством которого ее вводят пациентам. В одном из вариантов осуществления дозированные формы включают соединение, описанное в настоящем описании, в количестве от приблизительно 0,10 до приблизительно 500 мг. В других вариантах осуществления дозированные формы включают соединение, описанное в настоящем описании, в количестве приблизительно 0,1, 1, 2, 5, 7,5, 10, 12,5, 15, 17,5, 20, 25, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450 или 500 мг.

В других вариантах осуществления дозированные формы содержат второй активный ингредиент в количестве от 1 до приблизительно 1000 мг, от приблизительно 5 до приблизительно 500 мг, от приблизительно 10 до приблизительно 350 мг или от приблизительно 50 до приблизительно 200 мг. Безусловно, конкретное количество второго активного средства будут зависеть от конкретного используемого средства, заболеваний или нарушения, подвергаемых лечению или контролю за течением, и количества(количеств) соединения, описанного в настоящем описании, и любых необязательных дополнительных активных веществ, в текущее время вводимых пациенту.

7.6.1. Пероральные дозированные формы

Фармацевтические композиции, которые подходят для перорального введения, могут быть предоставлены в качестве отдельных дозированных форм, таких как, но не ограничиваются ими, таблетки (например, жевательные таблетки), таблетки в форме капсул, капсулы и жидкости (например, сиропы с вкусовыми добавками). Такие дозированные формы содержат заданные количества активных ингредиентов и их можно получать способами фармацевтики, хорошо известными специалистам в данной области. См., главным образом, Кешшдоп'к РкагтасеиИса1 8с1епсе8, 201Н ей., Маск РиЬйкПпд, ЕаНоп РА (2000).

Пероральные дозированные формы, описанные в настоящем описании, получают комбинированием активных ингредиентов в однородной смеси по меньшей мере с одним эксципиентом в соответствии с общепринятыми способами получения фармацевтических препаратов. В зависимости от формы препарата, который намереваются вводить, эксципиентам можно придавать большое разнообразие форм. Например, эксципиенты, приемлемые для применения в пероральных жидких или аэрозольных дозированных формах, включают, но не ограничиваются ими, воду, гликоли, масла, спирты, ароматизаторы, консерванты и красители. Примеры наполнителей, подходящих для применения в твердых пероральных дозированных формах (например, порошках, таблетках, капсулах и таблетках в форме капсул), включают,

- 15 029085

но не ограничиваются ими, крахмалы, сахара, микрокристаллическую целлюлозу, разбавители, гранулирующие средства, смазывающие вещества, связующие вещества и дезинтегрирующие вещества.

В одном из вариантов осуществления пероральные дозированные формы представляют собой таблетки или капсулы, в случае которых используют твердые эксципиенты. В другом варианте осуществления на таблетки можно наносить покрытие стандартными способами нанесения водного и неводного покрытия. Такие дозированные формы можно получать любыми способами фармацевтики. В общем, фармацевтические композиции и дозированные формы получают, равномерно и однородно смешивая активные ингредиенты с жидкими носителями, мелкоизмельченными твердыми носителями или и с теми, и с другими, а затем, если необходимо, придавая продукту желательную форму.

Например, таблетку можно получать прессованием или формованием. Прессованные таблетки можно получать прессованием в подходящем устройстве активных ингредиентов в сыпучей форме, такой как порошок или гранулы, необязательно смешанных с эксципиентом. Формованные таблетки можно получать путем формования в подходящем устройстве смеси порошкованного соединения, смоченного инертным жидким разбавителем.

Примеры эксципиентов, которые можно использовать в пероральных дозированных формах, описанных в настоящем описании, включают, но не ограничиваются ими, связующие вещества, наполнители, дезинтегрирующие вещества и смазывающие вещества.

Связующие вещества, подходящие для применения в фармацевтических композициях и дозированных формах, включают, но не ограничиваются ими, кукурузный крахмал, картофельный крахмал или другие крахмалы, желатин, природные и синтетические камеди, такие как гуммиарабик, альгинат натрия, альгиновая кислота, другие альгинаты, порошковая трагакантовая камедь, гуаровая камедь, целлюлозу и ее производные (например, этилцеллюлозу, ацетат целлюллозы, карбоксиметилцеллюлозу кальция, карбоксиметилцеллюлозу натрия), поливинилпирролидон, метилцеллюлозу, прежелатинизированный крахмал, гидроксипропилметилцеллюлозу, (например, Νο. 2208, 2906, 2910), микрокристаллическую целлюлозу и их смеси.

Подходящие формы микрокристаллической целлюлозы включают, но не ограничиваются ими, материалы, продаваемые как АУГСЕЬ-РН-101, А\!СР1.-Р11-103 АУТСЕЬ КС-581, А\!СР1.-Р11-105 (доступные от РМС Согрогайоп, Атепсап УРсо^с Όίνίδίοη, Ανίοοί §а1е8, Магеиз Ноок, РА) и их смеси. Конкретное связующее вещество представляет собой смесь микрокристаллической целлюлозы и карбоксиметилцеллюлозы натрия (продаваемая как АУТСЕЬ КС-581). Приемлемые безводные эксципиенты или эксципиенты с низким содержанием влаги включают АУ1СЕЕ-РН-103™ и крахмал 1500 ЬМ.

Примеры наполнителей, подходящих для применения в фармацевтических композициях и дозированных формах, описанных в настоящем описании, включают, но не ограничиваются ими, тальк, карбонат кальция (например, гранулы или порошок), микрокристаллическую целлюлозу, порошковую целлюлозу, декстраты, каолин, маннит, кремниевую кислоту, сорбитол, крахмал, прежелатизинированный крахмал и их смеси. В одном из вариантов осуществления связующее вещество или наполнитель в фармацевтических композициях предоставлены в количестве от приблизительно 50 до приблизительно 99 вес.% фармацевтической композиции или дозированной формы.

Дезинтегрирующие вещества можно использовать в композициях для получения таблеток, которые дезинтегрируют под действием водного окружения. Таблетки, в которых содержится слишком много дезинтегрирующего вещества, могут дезинтегрировать при хранении, в то время как таблетки, которые содержат его слишком мало, могут не дезинтегрировать с требуемой скоростью или в требуемых условиях. Таким образом, для получения твердых пероральных дозированных форм можно использовать достаточное количество дезинтегрирующего вещества, которое не является ни чрезмерным, ни недостаточным для того, чтобы отрицательным образом изменить высвобождение активных ингредиентов. Количество применяемого дезинтегрирующего вещества изменяется в зависимости от типа препарата и его без труда определит специалист в данной области. В одном из вариантов осуществления фармацевтические композиции содержат от приблизительно 0,5 до приблизительно 15 мас.% дезинтегрирующего вещества или от приблизительно 1 до приблизительно 5 мас.% дезинтегрирующего вещества.

Дезинтегрирующие вещества, которые можно использовать в фармацевтических композициях и дозированных формах, включают, но ими не ограничиваются, агар-агар, альгиновую кислоту, карбонат кальция, микрокристаллическую целлюлозу, кроскармелозу натрия, кросповидон, полакрилин калия, натрия крахмала гликолят, картофельный или маниоковый крахмал, другие крахмалы, прежелатинизированный крахмал, другие крахмалы, глины, другие альгины, другие виды целлюлозы, камеди и их смеси.

Смазывающие вещества, которые можно использовать в фармацевтических композициях и дозированных формах, включают, но ими не ограничиваются, стеарат кальция, стеарат магния, минеральное масло, легкое минеральное масло, глицерин, сорбит, маннит, полиэтиленгликоль, другие гликоли, стеариновую кислоту, лаурилсульфат натрия, тальк, гидрогенизованное растительное масло (например, арахисовое масло, хлопковое масло, подсолнечное масло, кунжутное масло, оливковое масло, кукурузное масло и соевое масло), стеарат цинка, этилолеат, этиллауриат, агар и их смеси. Дополнительные смазывающие вещества включают, например, силоидный силикагель (АЕКОИЬ 200, производимый К. Сгасе Со., ВаШтоге, МО), коагулированный аэрозоль из синтетического диоксида кремния (продавае- 16 029085

мый Эеди^а Со. о£ Ρίαηο. ТХ), САБ-О-§1Ь (пирогенный диоксид кремния, который представляет собой продукт, продаваемый СаЬо1 Со. о£ ВоДоп. МА) и их смеси.

Смазывающие вещества, если их вообще используют, можно использовать в количестве менее приблизительно 1 вес.% фармацевтических композиций или дозированных форм, в состав которых они включены.

В одном из вариантов осуществления твердая дозированная форма содержит соединение, описанное в настоящем описании, безводную лактозу, микрокристаллическую целлюлозу, поливинилпирролидон, стеариновую кислоту, коллоидный безводный диоксид кремния и желатин.

7.6.2. Дозированные формы с контролируемым высвобождением

Активные ингредиенты, такие как соединения, описанные в настоящем описании, можно вводить с помощью средств контролируемого высвобождения или с помощью устройств для доставки, которые хорошо известны специалистам в данной области. Примеры включают, но не ограничиваются ими, средства и устройства, описанные в патентах США №№ 3845770; 3916899; 3536809; 3598123; 4008719; 5674533; 5059595; 5591767; 5120548; 5073543; 5639476; 5354556; 5639480; 5733566; 5739108; 5891474; 5922356; 5972891; 5980945; 5993855; 6045830; 6087324; 6113943; 6197350; 6248363; 6264970; 6267981; 6376461; 6419961; 6589548; 6613358; 6699500, каждый из которых включен в настоящее описание в качестве ссылки. Такие дозированные формы можно использовать для обеспечения медленного или контролируемого высвобождения одного или нескольких активных ингредиентов с использованием, например, гидропропилметилцеллюлозы, других полимерных матриц, гелей, проницаемых мембран, осмотических систем, многослойных покрытий, микрочастиц, липосом, микросфер или их комбинации для обеспечения желаемого профиля высвобождения в различных соотношениях. Подходящие составы с контролируемым высвобождением, известные средним специалистам в данной области, включая составы, описанные в настоящем описании, можно без каких-либо сложностей выбрать для применения с активными ингредиентами, описанными в настоящем описании. Таким образом, композиции, описанные в настоящем описании, охватывают отдельные лекарственные формы, подходящие для перорального введения, такие как, но ими не ограничиваясь, таблетки, капсулы, желатиновые капсулы и таблетки в форме капсул, которые адаптированы для контролируемого высвобождения.

Все фармацевтические продукты с контролируемым высвобождением имеют общее назначение, связанное с улучшением лекарственной терапии по сравнению с терапией, достигаемой при применении неконтролируемых аналогов. В идеальном случае, применение оптимально разработанного препарата с контролируемым высвобождением характеризуется минимальным количеством лекарственного вещества, используемого для лечения или контроля состояния в течение минимального периода времени. Преимущества препаратов с контролируемым высвобождением включают продолжительную активность лекарственного средства, снижение частоты дозирования и повышение соблюдения режима и схемы лечения индивидуумом. Кроме того, препараты с контролируемым высвобождением можно использовать для влияния на время начала действия или другие характеристики, такие как уровень лекарственного средства в крови, и, таким образом, можно влиять на возникновение побочных (например, неблагоприятных) эффектов.

Большинство препаратов с контролируемым высвобождением разработано для первоначального высвобождения количества лекарственного средства (активного ингредиента), которое быстро вызывает требуемый терапевтический эффект, и постепенного и непрерывного высвобождения других количеств лекарственного средства для поддержания этого уровня терапевтического или профилактического эффекта в течение продолжительного периода времени. В целях поддержания этого постоянного уровня лекарственного средства в организме лекарственное средство должно высвобождаться из дозированной формы со скоростью, которая будет заменять количество лекарственного средства, метаболизируемого и экскретируемого из организма. Контролируемое высвобождение активного ингредиента может стимулироваться различными условиями, включая, но ими не ограничиваясь, рН, температуру, ферменты, воду или другие физиологические условия или соединения.

В определенных вариантах осуществления лекарственное средство можно вводить с использованием внутривенной инфузии, имплантируемого осмотического насоса, трансдермального пластыря, липосом или других способов введения. В одном из вариантов осуществления можно использовать насос (см., 8ейоп, СкС Стй. Кей Вюшеб. Епд. 14:201 (1987); Висйта1б е1 а1., Битдету 88:507 (1980); Баибек е1 а1., N. Епд1. 1. Меб. 321:574 (1989)). В другом варианте осуществления можно использовать полимерные материалы. В другом варианте осуществления систему с контролируемым высвобождением можно помещать в соответствующую область индивидуума, определенную специалистом в данной области, т.е. таким образом, требуется только часть системной дозы (см., например, Оообкоп, Мебюа1 АррПсаОош ой Соп1го11еб Ке1еа8е, уо1. 2, рр. 115-138 (1984)). Другие системы с контролируемым высвобождением рассмотрены в обзоре Ьапдет (§аепсе 249:1527-1533 (1990)). Активный ингредиент может быть диспергирован в твердом внутреннем матриксе, например полиметилметакрилате, полибутилметакрилате, пластифицированном или непластифицированном поливинилхлориде, пластифицированном нейлоне, пластифицированном полиэтилентерефталате, природном каучуке, полиизопрене, полиизобутилене, полибутадиене, полиэтилене, сополимерах этилен-винилацетат, силиконовых каучуках, полидиметилсилоксанах, силикон- 17 029085

карбонатных сополимерах, гидрофильных полимерах, таких как гидрогели, сложных эфирах актиловой и метакриловой кислоты, коллагене, сшитом поливиниловом спирте и сшитом частично гидролизованном поливинилацетате, который окружен наружной полимерной мембраной, например полиэтиленом, полипропиленом, сополимерами этилен/пропилен, сополимерах этилен/этилакрилат, сополимерах этилен/винилацетат, силиконовыми камедями, полидиметилсилоксанами, неопреновым каучуком, хлорированным полиэтиленом, поливинилхлоридом, сополимерами винилхлорида с винилацетатом, винилиденхлоридом, этиленом и пропиленом, ионсодержащим полиэтилентерефталатом, бутилкаучуком, эпихлоргидриновыми каучуками, сополимером этилен/виниловый спирт, терполимером этилен/винилацетат/виниловый спирт и сополимером этилен/винилоксиэтанол, которая нерастворима в жидкостях организма. Затем активный ингредиент диффундирует через наружную полимерную мембрану на стадии с контролируемой скоростью высвобождения. Процент активного ингредиента в таких парентеральных композициях в высокой степени зависит от их конкретной природы, а также от потребностей индивидуума.

7.6.3. Парентеральные дозированные формы

Парентеральные дозированные формы можно вводить пациентам различными способами, включая, но ими не ограничиваясь, подкожное, внутривенное (включая болюсную инъекцию), внутримышечное и внутриартериальное введение. В некоторых вариантах осуществления введение парентеральной дозированной формы обходит природную защиту пациентов от загрязнителей, и, таким образом, в этих вариантах осуществления парентеральные дозированные формы предпочтительно стерильны или их можно стерилизовать перед введением пациенту. Примеры парентеральных дозированных форм включают, но не ограничиваются ими, готовые растворы для введения, сухие продукты, готовые к разведению или суспендированию в фармацевтически приемлемом носителе для инъекции, готовые суспензии для инъекции, и эмульсии.

Приемлемые носители, которые можно использовать для получения парентеральных дозированных форм, хорошо известны специалистам в данной области. Их примеры включают, но не ограничиваются ими, воду для инъекций И8Р; водные носители, такие как, но ими не ограничиваясь, раствор хлорида натрия для инъекций, раствор Рингера для инъекций, раствор декстрозы для инъекций, раствор декстрозы и хлорида натрия для инъекций и лактатный раствор Рингера для инъекций; растворимые в воде носители, такие как, но ими не ограничиваясь, этиловый спирт, полиэтиленгликоль и полипропиленгликоль; неводные носители, такие как, но ими не ограничиваясь, кукурузное масло, хлопковое масло, арахисовое масло, кунжутное масло, этилолеат, изопропилмиристат и бензилбензоат.

Соединения, которые повышают растворимость одного или нескольких активных ингредиентов, описанных в настоящем описании, также можно включать в парентеральные дозированные формы. Например, циклодекстрин и его производные можно использовать для повышения растворимости соединения, описанного в настоящем описании. См., например, патент США № 5134127, который включен в настоящее описание в качестве ссылки.

7.6.4. Дозированные формы для местного и мукозального применения

Дозированные формы для местного и мукозального применения, описанные в настоящем описании, включают, но не ограничиваются ими, распыляемые растворы, аэрозоли, растворы, эмульсии, суспензии или другие формы, известные специалисту а данной области. См., например, РеиипДогА РЬагп1асеиИса1 8с1епсе8, 161Ь, 18ΐ1ι апб 201к ебк, Маск РиЪНкЫпд, Еа§1оп РА (1980, 1990 апб 2000); и 1п1гобис1юп 1о Ркатш1асеикса1 Иокаде Рогпъ. 41к еб., Ьеа & РеЫдет, РЫ1абе1рЫа (1985). Дозированные формы, подходящие для нанесения на слизистые ткани полости рта, можно получать в виде жидкостей для полоскания рта или в виде гелей для полости рта.

Приемлемые эксципиенты (например, носители и разбавители) и другие вещества, которые можно использовать для получения дозированных форм для местного и мукозального применения, охватываемых настоящим изобретением, хорошо известны специалистам в области фармацевтики и зависят от конкретной ткани, на которую данная фармацевтическая композиция или дозированная форма будет нанесена. В одном из вариантов осуществления эксципиенты включают, но не ограничиваются ими, воду, ацетон, этанол, этиленгликоль, пропиленгликоль, бутан-1,3-диол, изопропилмиристат, изопропилпальмитат, минеральное масло и их смеси для получения растворов, эмульсий или гелей, которые являются нетоксичными и фармацевтически приемлемыми. Также в фармацевтические композиции и дозированные формы можно добавлять увлажняющие или смачивающие вещества. Примеры дополнительных ингредиентов хорошо известны в данной области. См., например, РепипдЮп'к, РкагтасеиИса1 8с1епсе8, 16* 18* апб 20* ебз., Маск РиЪкзИпд, ЕакЮп РА (1980, 1990 апб 2000).

Для повышения доставки одного или нескольких активных ингредиентов также можно корректировать рН фармацевтической композиции или дозированной формы. Также для повышения доставки можно корректировать полярность растворителя в носителе, его ионную силу или тоничность. Также для повышения доставки в фармацевтические композиции или дозированные формы можно добавлять соединения, такие как стеараты, для изменения гидрофильности или липофильности одного или нескольких активных ингредиентов. В других вариантах осуществления стеараты могут служить в качестве липидного носителя в препарате в качестве эмульгатора или поверхностно-активного вещества или в каче- 18 029085

стве вещества для повышения доставки или для усиления проникновения. В других вариантах осуществления для дополнительной коррекции качеств конечной композиции можно использовать соли, сольваты, гидраты, пролекарства, клатраты или стереоизомеры активных ингредиентов.

8. Примеры

Нижеследующие примеры предоставлены в качестве иллюстрации, а не для ограничения. В примерах исследуемое соединение относится к (8)-3-[4-(4-морфолин-4-илметилбензилокси)-1-оксо-1,3дигидроизоиндо-2-ил]пиперидин-2,6-диону.

8.1. Пример 1. Получение гидрохлорида (8)-3-[4-(4-морфолин-4-илметилбензилокси)-1-оксо-1,3дигидроизоиндо-2-ил]пиперидин-2,6-диона

8.1.1. Метиловый эфир 3-гидрокси-2-метилбензойной кислоты

3-Гидрокси-2-метилбензойную кислоту (105 г, 690 ммоль) добавляли к МеОН (800 мл) в 2-л круглодонной колбе с тремя горлышками, оборудованной конденсатором, термометром и элементом магнитной мешалки, а затем добавляли МеОН (250 мл). К описанному выше раствору добавляли Η₂δΟ₄ (10 мл, 180 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при 62°С в течение 17 ч. Растворитель удаляли в вакууме. Осадок (200 мл) медленно добавляли в воду (600 мл) при комнатной температуре, образовывалось белое твердое вещество. Суспензию перемешивали на ледяной бане в течение 30 мин и фильтровали. Твердое вещество промывали водой (5x250 мл) и сушили с получением метилового эфира 3-гидрокси-2метилбензойной кислоты в виде белого твердого вещества (100 г, выход 87%). Соединение использовали на следующей стадии без дальнейшей очистки: ЬСМ8 МН=167; ¹Н ЯМР (ДМСО-б₆) δ 2,28 (с, 3Η, СН₃), 3,80 (с, 3Н, СН₃), 6,96-7,03 (м, 1Н, Аг), 7,09 (т, 1=7,8 Гц, 1Н, Аг), 7,14-7,24 (м, 1Н, Аг), 9,71 (с, 1Н, ОН).

8.1.2. Метиловый эфир 3-(трет-бутилдиметилсиланилокси)-2-метилбензойной кислоты

В 1-л колбу КВ с тремя горлышками, оборудованную элементом магнитной мешалки и термометром, добавляли ΌΜΡ (300 мл), метил 3-гидрокси-2-метилбензоат (90 г, 542 ммоль) и имидазол (92 г, 1,354 ммоль). К описанному выше раствору частями добавляли ТВБМ8-С1 (90 г, 596 ммоль) для контроля внутренней температуры на уровне 15-19°С в течение 20 мин, после добавления внутренняя температура падала ниже 1°С. Ледяную баню удаляли и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 16 ч. Реакционную смесь добавляли к ледяной воде (500 мл) и полученный раствор разделяли на две части (700 мл х2). Каждую часть экстрагировали ЕЮАс (700 мл). Каждый органический слой промывали холодной водой (350 мл) и насыщенным солевым раствором (350 мл). Органические слои объединяли и сушили над Μ§δΟ₄. Объединенный органический слой концентрировали с получением метилового эфира 3-(трет-бутилдиметилсиланилокси)-2-метилбензойной кислоты в виде светлокоричневого масла (160 г, выход неочищенного вещества 100%). Соединение использовали на следующей стадии без дальнейшей очистки: ^СΜδ МН=281; ¹Н ЯМР (ДМСО-б₆) δ -0,21 (с, 6Н, СН₃, СН₃), 0,730,84 (м, 9Н, СН₃, СН₃, СН₃), 2,10 (с, 3Н, СН₃), 3,60 (с, 3Н, СН₃), 6,82 (дд, 1Н, Аг), 6,97 (т, 1=7,9 Гц, 1Н, Аг), 7,13 (дд, I = 1,1, 7,7 Гц, 1Н, Аг).

8.1.3. Метиловый эфир 2-бромметил-3-(трет-бутилдиметилсиланилокси)бензойной кислоты

- 19 029085

ΝΒδ (49,8 г, 280 ммоль) добавляли к метил 3-(трет-бутилдиметилсилилокси)-2-метилбензоату (78,4 г, 280 ммоль) в метилацетате (500 мл) при комнатной температуре с получением суспензии оранжевого цвета. Полученную реакционную смесь нагревали на масляной бане при 40°С и освещали с помощью лампы солнечного света мощностью 300 Вт в течение 4 ч. Реакционную смесь охлаждали и промывали раствором Να₂8ϋ₃ (2x600 мл, 50% насыщенная концентрация), водой (500 мл) и насыщенным солевым раствором (600 мл). Органический слой сушили над М§§0₄ и обесцвечивали углем. Органический слой концентрировали с получением метилового эфира 2-бромметил-3-(трет-бутилдиметилсиланилокси)бензойной кислоты в виде светло-коричневого масла (96 г, выход неочищенного вещества 91%). Соединение использовали на следующей стадии без дальнейшей очистки: ЬСМ§ М-Вг=279; ¹Н ЯМР (ДМСО-б₆) δ 0,05-0,11 (м, 6Н, СН₃, СН₃), 0,82 (с, 9Н, СН₃, СН₃, СН₃), 3,65 (с, 3Н, СН₃), 4,74 (с, 2Н, СН₂), 6,94 (дд, 1=1,3, 8,1 Гц, 1Н, А), 7,10-7,20 (м, 1Н, Аг), 7,21-7,29 (м, 1Н, Аг).

8.1.4. Метиловый эфир 4-карбамоилмасляной кислоты

К перемешиваемому раствору метил 2-(бромметил)-3-(трет-бутилдиметилсилилокси)бензоата (137,5 г, 325 ммоль) в ацетонитриле (1100 мл) в 2-л круглодонной колбе добавляли гидрохлорид метил4,5-диамино-5-оксопентаноата (70,4 г, 358 ммоль). К суспензии добавляли ΌΙΡΕΑ (119 мл, 683 ммоль) через капельную воронку в течение 10 мин и суспензию перемешивали при комнатной температуре в течение 1 ч, а затем смесь нагревали на масляной бане при 40°С в течение 23 ч. Реакционную смесь концентрировали в вакууме. Осадок перемешивали в простом эфире (600 мл), белое твердое вещество выпадало в осадок. Смесь фильтровали и твердое вещество промывали простым эфиром (400 мл). Фильтрат промывали НС1 (1н., 200 мл), №-1НС.'0₃ (насыщенный, 200 мл) и насыщенным солевым раствором (250 мл). Водный слой и основный слой держали по отдельности. Затем твердое вещество далее промывали простым эфиром (250 мл) и жидкость промывали описанным выше кислым раствором и основным раствором. Два органических слоя объединяли и концентрировали в вакууме с получением метилового эфира 4-[4-(трет-бутилдиметилсиланилокси)-1-оксо-1,3-дигидроизоиндол-2-ил]-4-карбамоилмасляной кислоты в виде коричневого масла (152 г, выход неочищенного вещества 115%, чистота 77% при Н-ЯМР). Соединение использовали на следующей стадии без дальнейшей очистки: ЬСМ§ МН = 407.

8.1.5. Метиловый эфир 4-карбамоил-4-(4-гидрокси-1-оксо-1,3-дигидроизоиндол-2-ил)масляной кислоты

К перемешиваемому холодному раствору метил-5-амино-4-(4-(трет-бутилдиметилсилилокси)-1оксоизоиндолин-2-ил)-5-оксопентаноата (152 г, 288 ммоль) в ПМР (500 мл) и воде (55 мл) добавляли К₂С0₃ (19,89 г, 144 ммоль) частями в течение 5 мин. Полученную реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 40 мин. Реакционную смесь охлаждали на ледяной бане. К смеси медленно добавляли НС1 (12М, 23,99 мл, 288 ммоль). После добавления к смеси добавляли ацетонитрил (280 мл), и твердое вещество выпадало в осадок. Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 10 мин и фильтровали. Твердое вещество промывали ацетонитрилом (50 мл х4). Фильтрат концентрировали в высоком вакууме с получением желтого масла (168 г). Масло растворяли в ацетонитриле (600 мл) и перемешивали при комнатной температуре в течение 10 мин. Смесь фильтровали и твердое вещество промывали ацетонитрилом (25 мл х2). Фильтрат концентрировали в высоком вакууме с получением желтого масла (169 г), которое добавляли к смеси воды (1200 мл) и простого эфира (1000 мл). Смесь перемешивали в течение 3 мин и слои разделяли. Водный раствор концентрировали в высоком вакууме и осадок перемешивали в ацетонитриле (160 мл) и после перемешивания в течение ночи образовывалось белое твердое вещество. Смесь фильтровали с получением метилового эфира 4-карбамоил-4-(4- 20 029085

гидрокси-1-оксо-1,3-дигидроизоиндол-2-ил)масляной кислоты в виде белого твердого вещества (46 г, выход 54%). Фильтрат концентрировали и осадок кристаллизовали в ацетонитриле (60 мл) с получением дополнительного метилового эфира 4-карбамоил-4-(4-гидрокси-1-оксо-1,3-дигидроизоиндол-2ил)масляной кислоты в виде белого твердого вещества (11,7 г, выход 14%). Фильтрат концентрировали и осадок очищали 18СО-хроматографией с получением дополнительного метилового эфира 4-карбамоил-4(4-гидрокси-1-оксо-1,3-дигидроизоиндол-2-ил)масляной кислоты в виде белого твердого вещества (13,2 г, выход 15%). Всего было получено 70,9 г продукта с выходом 83%: ЬСМ8 МН = 293; ¹Н ЯМР (ДМСО06) δ 1,95-2,34 (м, 4Н, СН₂, СН₂), 3,51 (с, 3Н, СН₃), 4,32 (д, 1=17,6 Гц, 1Н, СНН), 4,49 (д, 1=17,4 Гц, 1Н, СНН), 4,73 (дд, 1=4,7, 10,2 Гц, 1Н, СНН), 6,99 (дд, 1=0,8, 7,9 Гц, 1Н, Аг), 7,10-7,23 (м, 2Н, Аг, NНН), 7,257,38 (м, 1Н, Аг), 7,58 (с, 1Н, NНН), 10,04 (с, 1Н, ОН).

8.1.6. 3-(4-((4-(Морфолинометил)бензил)окси)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион

Стадия 1: к раствору 3-(4-гидрокси-1-оксо-1,3-дигидроизоиндол-2-ил)пиперидин-2,6-диона (2,5 г, 8,56 ммоль) в ТНР (60 мл) добавляли трифенилфосфин (на полимерной подложке 1,6 ммоль/г, 12 г, 18,8 ммоль). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 15 мин. Добавляли диизопропилазодикарбоксилат (3,96 мл, 18,8 ммоль) при 0°С и смесь перемешивали при 0°С в течение 30 мин. Добавляли (4-морфолин-4-илметилфенил)метанол (2,62 г, 12,4 ммоль) при 0°С и смеси позволяли нагреться до комнатной температуры и ее перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Реакционную смесь фильтровали и фильтрат концентрировали. Полученное масло очищали на колонке с силикагелем, которую элюировали метиленхлоридом и метанолом (градиент, продукт выходил при 6% метаноле) с получением метилового сложного эфира 4-карбамоил-4-[4-(4-морфолин-4-илметилбензилокси)-1-оксо1,3-дигидроизоиндол-2-ил]масляной кислоты (2,2 г, выход 54%). Продукт использовали на следующей стадии без дальнейшей очистки.

Стадия 2: к раствору метилового эфира 4-карбамоил-4-[4-(4-морфолин-4-илметилбензилокси)-1оксо-1,3-дигидроизоиндол-2-ил]масляной кислоты (2,2 г, 4,57 ммоль) в (50 мл) добавляли трет-бутоксид калия (0,51 г, 4,57 ммоль) при 0°С. Смесь перемешивали при 0°С в течение 10 мин и гасили 1н. НС1 (5 мл, 5 ммоль), а затем насыщенным NаНСОз (25 мл). Смесь экстрагировали ЕЮАс (2x50 мл). Органический слой промывали водой (30 мл), насыщенным солевым раствором (30 мл), сушили над Мд8О₄ и концентрировали. К полученному твердому веществу добавляли ЕЮАс (10 мл), а затем гексан (10 мл) при перемешивании. Суспензию фильтровали с получением 3-(4-((4-(морфолинометил)бензил)окси)-1оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-диона в виде белого твердого вещества (1,5 г, выход 73%). ВЭЖХ: Аа£егз 8ушше£гу С₁₈, 5 мкм, 3,9x150 мм, 1 мл/мин, 240 нм, градиент до 95/5 ацетонитрила/0,1% Н₃РО₄ в течение 5 мин: ί_κ = 4,78 мин (97,5%); т.пл.: 210-212°С; ¹Н ЯМР (ДМСО-ф) δ 1,86-2,09 (м, 1Н, СНН), 2,292,38 (м, 4Н, СН2,СН2), 2,44 (дд, 1= 4,3, 13,0 Гц, 1Н, СНН), 2,53-2,64 (м, 1Н, СНН), 2,82-2,99 (м, 1Н, СНН), 3,46 (с, 2Н, СН₂), 3,52-3,61 (м, 4Н, С11₄,С110 4,18-4,51 (м, 2Н, СН₂), 5,11 (дд, 1=5,0, 13,3 Гц, 1Н, ΝΟΠ), 5,22 (с, 2Н, СН₂), 7,27-7,38 (м, 5Н, Аг), 7,40-7,53 (м, 3Н, Аг), 10,98 (с, 1Н, ΝΉ) ¹³С ЯМР (ДМСО-ф) δ 22,36, 31,21, 45,09, 51,58, 53,14, 62,10, 66,17, 69,41, 114,97, 115,23, 127,64, 128,99, 129,81, 129,95, 133,31, 135,29, 137,68, 153,50, 168,01, 170,98, 172,83; ЬСМ8: 465;

аналитически вычислено для С₂₅Н₂-^₃О₅ + 0,86 Н₂О: С, 64,58; Н, 6,23; Ν, 9,04; найдено: С, 64,77; Н, 6,24; Ν, 8,88.

(8)-3-(4-((4-(морфолинометил)бензил)окси)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион и (К)-3-(4((4-(морфолинометил)бензил)окси)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион получали из 3-(4-((4(морфолинометил)бензил)окси)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-диона посредством хирального разделения.

8.2. Пример 2. Эффект на экспрессию факторов транскрипции на модели дифференцировки первичных В-клеток человека.

В этом примере оценивали эффект (8)-3-[4-(4-морфолин-4-илметилбензилокси)-1-оксо-1,3дигидроизоиндо-2-ил]пиперидин-2,6-диона (исследуемое соединение) на экспрессию факторов транскрипции, контролирующих дифференцировку плазмоцитов, и продукцию иммуноглобулинов, с использованием культуральной системы для дифференцировки В-клеток человека ίη νίίΓΟ.

В этом примере используют следующие сокращения:

- 21 029085

Сокращение	или	Пояснение или определение
специальный	термин
ВСЪб		Белок В-клеточной лимфомы б
ВЫМР-1		Белок индуцируемого В-лимфоцитами созревания 1

ЕДОН	Этанол
ЕВ 5	Эмбриональная телячья сыворотка
ДМСО	Диметилсульфоксид
ΙΗΕ-4	Регулирующий интерферон фактор 4
ΜΕΙ	Средняя интенсивность флуоресценции
РАХ5	Белок парного бокса Рах-5
ЭРЕ	Системная красная волчанка
ХВР-1	Связывающий Х-бокс белок 1

50 мл лейкоцитарной пленки от здоровых доноров получали от Βίοοά Сеп!ег о£ №а 1егзеу. Образцы РВМС при волчанке 8ЬЕ получали от Сопуегзап! Βίο (Нип1зуШе, Л1аЬаша 35806).

В данном исследовании использовали следующие реагенты для культивирования клеток:

Вид продукта	Источник
Среда Дульбекко, модифицированная по способу Исков	Ιηνί-Ьгодеп
Эмбриональная телячья сыворотка	Ьопга
Инсулин человека	31дта
Трансферрин человека	ЗДдша
пенициллин/стрептомицин	Ьопга
Рекомбинантный ΙΡ.-2 человека	В & Ώ ЗузЬетз
Рекомбинантный 1Ь-б человека	В & Ώ ЗузЬетз
Рекомбинантный ΙΡ.-10 человека	В & ϋ ЗузЬешз
Рекомбинантный ΙΡ.-15 человека	В & ϋ ЗузЬетз
СО40-лиганд/ТИЕ5Е5/ меченный гистидином	В & Ώ ЗузЬетз
Меченное полигистидином 1д61-антитело мыши	В & Ώ ЗузЬетз
ΟϋΝ 2006- лиганд ТЬВ.9 человека	1пч1чодеп
Интерферон-альфа А человека	РВ ЬпЬегЬегоп зоигсе

В проточно-цитометрическом анализе использовали следующие реагенты:

Вид продукта	Источник
Е1ТС-антитело против СБ19 человека	ΙΒΌ РЬагшЬдеп
Е1ТС-антитело против СБ20 человека	ΙΒϋ РЬагшФдеп
РЕ-антитело против СБ27 человека	ΙΒϋ РЬагтФдеп
РЕ-антитело против СБ38 человека	ΙΒϋ РЬагтФдеп
АРС-антитело против СЬ38 человека	ΙΒϋ РЬагтФдеп
Е1ТС-антитело против изотипа 1дС1к мыши	ΙΒΌ РЬагтЬдеп
РЕ-антитело против изотипа 1дС1к мыши	ΙΒϋ РЬагтЬдеп
Е1ТС-антитело против изотипа 1дС2Ьк мыши	ΙΒϋ РЬагтЬдеп
АРС-антитело против изотипа 1дС1к мыши	ΙΒΏ РЬагтФдеп
Буфер для окрашивания	ΙΒϋ РЬагтФдеп

Для КТ-ПЦР использовали следующие праймеры для генов:

- 22 029085

Вид продукта	Источник
Анализ экспрессии гена ΑΙΟϋΑ	АррИеб Вбозузбет
Анализ экспрессии гена ВСЪб	АррИеб Вбозузбет
Анализ экспрессии гена 6ΑΡΏΗ	Аррббеб Вбозузбет
Анализ экспрессии гена 16Э	Аррббеб Вбозузбет
Анализ экспрессии гена ΙΗΒ4	Аррббеб Вбозузбет
Анализ экспрессии гена РАХ5	Аррббеб Вбозузбет
Анализ экспрессии гена ΡΚϋΜΙ	Аррббеб Вбозузбет
Анализ экспрессии гена ХВР1	Аррббеб Вбозузбет
Набор для обратной транскрипции	Аррббеб Вбозузбет
Основная смесь	Аррббеб Вбозузбет

8.2.1. Очистка ЬРВМС

Пятьдесят мл лейкоцитарной пленки человека распределяли аликвотами по 25 мл в две 50-мл конические пробирки и в каждую коническую пробирку добавляли 25 мл стерильного НВ88. Содержимое пробирок тщательно перемешивали переворачиванием. Пятьдесят мл Псой-Радие Р1ц§ (СЕ НеаН+саге (расположение); каталожный номер # 17-1440-02) комнатной температуры распределяли аликвотами в 50-мл конические пробирки. Затем осторожно и медленно наслаивали 25 мл смеси лейкоцитарная пленка/НВ88 над ПсоИ. Образцы центрифугировали при 450 об/мин в течение 35 мин. Верхний слой, содержавший плазму, отбирали пипеткой и отбрасывали. Поверхность контакта, содержавшую мононуклеарные клетки, переносили в две 50-мл конические пробирки. Обе конические пробирки заполняли до общего объема 50 мл посредством НВ88 и центрифугировали при 1200 об/мин в течение 10 мин. Клетки вновь промывали в НВ88 и центрифугировали при 1000 об/мин в течение 10 мин. Клеточный осадок ресуспендировали с помощью 20 мл среды для В-клеток (среда Исков + 10% РРВ8, 1% Р/8 и 5 мкг/мл инсулина человека) и подсчитывали на цитометре.

8.2.2. Увеличение содержания СБ19+ В-клеток

Очищенные РВМС подсчитывали и распределяли аликвотами в количестве 2х10⁸ клеток на пробирку. Клетки центрифугировали при 1200 об/мин в течение 5 мин, а затем супернатанты отбрасывали. Клетки ресуспендировали в 4 мл буфера КоЬозер (81ешее11 Тесйпо1о§1е§, каталожный номер # 20104) и переносили в 14-мл полистироловую круглодонную пробирку (ВО, каталожный номер # 352057) и хорошо перемешивали. Затем добавляли 200 мкл коктейля для увеличения содержания В-клеток человека (81ешСе11 Тесйпо1о§1е§, каталожный номер # 19054). Образцы встряхивали на устройстве для встряхивания и инкубировали при комнатной температуре в течение 10 мин. Далее в пробирку добавляли 300 мкл магнитных частиц Еа§у8ер (подвергнутых встряхиванию на устройстве для встряхивания) (81ешСе11 Тесйпо1о£1е§, каталожный номер # 19054). Образцы встряхивали на устройстве для встряхивания и инкубировали при комнатной температуре в течение 5 мин. После инкубации в течение 5 мин в пробирку добавляли 5 мл буфера КоЬозер и хорошо перемешивали пипетированием вверх и вниз. Пробирку сразу помещали в магнит 8йуег шадпе! (81ешСе11 Тесйпо1о§1е§, каталожный номер # 19054) и инкубировали при комнатной температуре в течение 5 мин. После инкубации одним непрерывным движением магнит и пробирку переворачивали и выливали желаемую фракцию в 50-мл коническую пробирку. Эти методики повторяли для оставшихся РВМС (на одного донора) и объединяли. Объединенную фракцию центрифугировали при 1200 об/мин в течение 5 мин, а затем супернатанты отбрасывали и клетки ресуспендировали в 5 мл среды для В-клеток. Выделенные СО19+ клетки подсчитывали на цитометре.

8.2.3. Анализ дифференцировки В-клеток

Стадия 1: активация В-клеток с 0 суток по 4 сутки: получали свежий коктейль В-клеток путем добавления 50 мкг/мл трансферрина человека в среду для В-клеток. (Среда Исков+10% РРВ8, 1% Р/8 и 5 мкг/мл инсулина). Фильтровали объем среды, требуемый для эксперимента, через 0,22-мкм фильтр. К клеткам добавляли коктейль для дифференцировки В-клеток (конечная концентрация): рекомбинантный П.-2 человека (20 Е/мл), 1Б-10 (50 нг/мл), Ш-15 (10 нг/мл), СО40-лиганд/Т№8Р5/меченный гистидином (50 нг/мл), меченное полигистидином 1§О1-антитело мыши (5 мкг/мл) и ΘΌΝ 2006-лиганд Т1.И9 человека (10 мкг/мл). Пять миллилитров (1х10⁵/мл) СО19+ В-клеток добавляли в каждую ячейку планшета с 6ячейками с плоским дном (конечное количество клеток = 5х10⁵/лунка). В каждую исследуемую ячейку добавляли 5 мкл (1х) ± соединение/ДМСО (конечная концентрация ДМСО - 0,1%) и инкубировали при 37°С в течение 4 суток.

Стадия 2: получение плазмобластов с 4 суток по 7 сутки: клетки собирали и подсчитывали на цитометре; аликвоту извлекали для проточного анализа, остальные клетки промывали РВ8. Приготавливали свежий коктейль В-клеток путем добавления 1 мкг/мл трансферрина человека в среду для В-клеток. (Среда Исков +10% РРВ8, 1% Р/8 и 5 мкг/мл инсулина человека). Фильтровали требуемый объем среды, необходимый для эксперимента, через 0,22-мкм фильтр. К клеткам добавляли коктейль для дифференци- 23 029085

ровки В-клеток (конечная концентрация): рекомбинантный 7-2 человека (20 Е/мл), 7-10 (50 нг/мл), 715 (10 нг/мл), 7-6 (50 нг/мл). Добавляли свежий коктейль В-клеток и клетки переносили обратно в исходные ячейки и объем доводили обратно до 5 мл. Пять мкл (1х) ± соединение/ДМСО добавляли в каждую исследуемую ячейку (конечная концентрация ДМСО - 0,1%) и инкубировали при 37°С в течение 4 суток.

На 7 сутки клетки собирали и подсчитывали на цитометре. Затем клетки разделяли для проточного анализа и оставшиеся клетки лизировали буфером КЬТ и хранили при -80°С для экстракции РНК и экспрессии генов. Супернатанты распределяли аликвотами и замораживали при -20°С для анализов иммуноглобулинов.

8.2.4. Получение исходных растворов и разведений исследуемых соединений

Исследуемые соединения взвешивали и растворяли в стерильном 100% ДМСО (диметилсульфоксид; РсхсагсН От§аи1С8, С1еуе1ап7 ОН) для получения 40 мМ исходного раствора. Разведения 40 мМ исходного раствора использовали в анализе для получения конечных концентраций исследуемых соединений, исходя из схемы эксперимента.

8.2.5. Экстракция РНК и экспрессия генов

Дифференцированные В-клетки собирали для получения общей рибонуклеиновой кислоты (РНК) с помощью устройства для экстракции РНК 01асиЬс (Οίαβοη, Уа1епс1а, СА) с использованием наборов с миницентрифужными колонками ΟΙΑΟΕΝ КЫеаку. Очищенную РНК подвергали обратной транскрипции в кДНК с помощью термоциклера |Μί Кекеатсй; 7с., δΐ Вгипо, ОиеЬес, Канада) с использованием набора с обратной транскриптазой (Аррйей ВюууЧепъ). Анализ экспрессии генов проводили с использованием системы 7500 КТ-РСК ууЧеш (Аррйей ВюууЧетД в трех экземплярах. Для каждого образца исследовали контроль анализа в виде экспрессии гена глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы и его использовали в качестве контроля для нормализации. Для каждого гена образцы в каждом эксперименте нормализовывали к обработке только 0,1% ДМСО для этого конкретного момента времени.

Супернатанты собирали и анализировали с помощью ЕЫ8А в отношении продукции Ι§Ο и Ι§Μ (КерЮМеНах Согр. ВиГГа1о, ΝΥ).

8.2.6. Фенотипирование клеток

Дифференцированные В-клетки собирали, подсчитывали и распределяли аликвотами в количестве приблизительно 1х10⁶ клеток или менее на 4-мл пробирку. Клетки промывали 1х буфером для окрашивания. Далее клетки блокировали 10% сывороткой человека/ΡΒδ в течение 20-30 мин. После блокирования клетки центрифугировали в течение 5 мин при 1200 об/мин и супернатанты отбрасывали. В 100 мкл оставшегося буфера добавляли 20 мкл различных антител ΒΌ РНагпидеп йоте в соответствии со схемой эксперимента. Клетки окрашивали в течение 20-30 мин при 4°С. Затем клетки промывали 2х буфером для окрашивания и супернатанты отбрасывали. Далее в пробирки добавляли 500 мкл буфера для окрашивания или ΡΒδ. Образцы сразу анализировали и помещали на 4°С на ночь. Клетки окрашивали антителом мыши против СЭ20 и СЭ38, СЭ19 и СЭ27 человека или соответствующими изотипическими контролями. Все образцы анализировали с использованием проточного цитометра ΡΑСδСаηΐо, аналитического программного обеспечения ЕАС8Э|уа (ΒΌ Вюкаепсе) и аналитического программного обеспечения Е1оте.То.

8.2.7. Анализ жизнеспособности клеток

Для определения количества живых клеток В-клетки окрашивали 0,4% трипановым синим и живые клетки подсчитывали с использованием автоматического цитометра Соип1е88 Дпуйтодеп) в дублированных образцах.

Данные наносили на график с использованием программного обеспечения ОтарЬРай Ргып 5.0. Величины 7₅₀ вычисляли с использованием нелинейной регрессии, сигмовидной кривой доза-ответ, ограничивающей сверху до 100% и снизу до 0%, допущения вариабельного наклона. Результаты для исследуемых соединений в анализах Ιβ выражали как процент ингибирования относительно контрольных величин для ДМСО.

Исследуемое соединение зависимым от дозы образом снижало процент СЭ20-СЭ38+ плазмобластов и увеличивало процент ί'.Ό20+ί'.Ό38- активированных В-клеток. Популяция плазмобластов (квадрант 1) составляла 30,4% в контроле в виде ДМСО на 7 сутки, и исследуемое соединение уменьшало популяцию до 27,3% в количестве 2 нМ, 2,1% в количестве 20 нМ, и 0,4% в количестве 200 нМ (фиг. 1). Исследуемое соединение снижало жизнеспособность В-клеток в ходе первых 4 суток культивирования (фиг. 2). Эффект исследуемого соединения на экспрессию факторов транскрипции В-клеток и плазмоцитов показан на фиг. 3. Эффект исследуемого соединения на продукцию ΙβΟ в культурах плазмобластов показан на фиг. 4.

Исследуемое соединение зависимым от дозы образом и значительно ингибировало экспрессию факторов транскрипции плазмоцитов: ΙΚΡ4, ВЫМР1, и ХВР1. Исследуемое соединение увеличивало уровень фактора транскрипции В-клеток РАХ5. Эффект исследуемого соединения на экспрессию факторов транскрипции В-клеток и плазмоцитов показан на фиг. 5А и 5В.

Исследуемое соединение, помалидомид и леналидомид ингибируют продукцию ΙβΟ с 7₅₀ 0,0018

- 24 029085

мкМ, 0,049 мкМ и 0,32 мкМ соответственно. Данные указывают на то, что исследуемое соединение является в 27 раз более эффективным, чем помалидомид, в отношении ингибирования продукции ЩЗ в ходе дифференцировки плазмобластов. Эффект исследуемого соединения на продукцию ЩЗ в культурах Βклеток на 4, 7 и 10 сутки показан на фиг. 6. Эффект исследуемого соединения, отдельно и в комбинации с преднизолоном, на продукцию ЩЗ дифференцированными ΐπ νίίτο плазмобластами/плазмоцитами показан на фиг. 7. Эффект исследуемого соединения на экспрессию СИ20/СИ38 в ходе дифференцировки Β-клеток на 7 сутки показан на фиг. 8. Эффект исследуемого соединения на жизнеспособность клеток во время дифференцировки плазмобластов показан на фиг. 9.

В мононуклеарных клетках периферической крови, выделенных от пациентов с системной красной волчанкой (8ЬЕ), исследуемое соединение ингибировало продукцию ЩЗ и ЩМ с ГС₅₀ 3,2 нМ и 0,9 нМ соответственно. Эти данные указывают на то, что исследуемое соединение имеет потенциал к ингибированию дифференцировки Β-клеток в росток плазмоцитов и позволяет предположить, что исследуемое соединение может быть подходящим для лечения аутоиммунных нарушений, таких как 8ЬЕ, которые характеризуются сверхпродукцией аутоантител. Эффект исследуемого соединения на дифференцировку и функцию Β-клеток в клетках РВМС пациента с 8ЬЕ показан на фиг. 10. Эффект исследуемого соединения на продукцию ЩЗ и !цМ в нормальных клетках РВМС и клетках РВМС пациента при 8ЬЕ показан в табл. 1.

На фиг. 11А и 11В показан эффект исследуемого соединения на продукцию ЩЗ и ^М человека, соответственно, в культурах Β-клеток на 7 сутки.

Таблица 1

Эффективность ингибирования продукции !д(3 и ^М нормальными РВМС и РВМС при 8ЬЕ

	1дС,	1С50 (нМ)	1дМ,	1С50 (нМ)
	ЗЬЕ	Нормальные	ЗЬЕ	Нормальные
	(п=3)	(п=3)	(п=3)	(п=3)
Исследуемое Соединение	3,2	2,1	0,9	0, 35
помалидомид	19	63	3,8	17
апремиласт	>10000	>10000	>10000	>10000

8.3. Пример 3. Анализ дифференцировки Β-клеток с использованием проточной цитометрии и лазерной сканирующей цитометрии.

Материалы для культивирования клеток: обогащенные нормальные Β-клетки и мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) пациента с 8ЬЕ культивировали в системе для дифференцировки Β-клеток ΐπ νίίτο со средой ШИМ (Ы^Игодеп) и 10% РС8, дополненной трансферрином человека и инсулином человека (81§ша), вместе с коктейлем цитокинов. Исследуемое соединение добавляли в культуру на 0 сутки и 4 сутки.

Протокол дифференцировки Β-клеток: обогащенные Β-клетки выделяли из свежей лейкоцитарной пленки (обогащенные лейкоцитами единицы количества) с помощью центрифугирования в градиенте плотности Р1со11-Нурацие с последующей инкубацией с набором для увеличения содержания Β-клеток человека с отрицательной селекцией Еа§у8ер (81еш се11 1есЬпо1о§1е§). В кратком изложении, 2х10⁸/мл РВМС смешивали с 4 мл буфера КоЬозер и переносили в 14-мл полистироловую круглодонную пробирку. Добавляли коктейль для увеличения содержания Β-клеток человека (200 мкл) на пробирку, встряхивали на устройстве для встряхивания и инкубировали при комнатной температуре в течение 10 мин. Добавляли магнитные частицы Еа§у8ер (300 мкл на пробирку), встряхивали на устройстве для встряхивания и инкубировали при комнатной температуре в течение 5 мин. В каждую пробирку добавляли буфер КоЬозер (5 мл) и хорошо перемешивали пипетированием вверх и вниз. Пробирки помещали в магнит 8Пуег шадпе! и инкубировали при комнатной температуре в течение 5 мин. Магнит и пробирку поднимали и одним непрерывным движением переворачивали, выливая желаемую фракцию в 50-мл коническую пробирку. Клетки центрифугировали при 1200 об/мин в течение 5 мин. Супернатант сливали и добавляли 5 мл свежей среды для Β-клеток. После подсчета клеток аликвоту извлекали для РАС8-анализа и оставшиеся клетки использовали для культивирования. СИ19+ Β-клетки выделяли до ~95% чистоты при определении проточной цитометрией. Очищенные Β-клетки высевали в количестве 1х10⁵ клеток/мл в стерильный 6-луночный планшет в количестве 5 мл на лунку. Все культивирования клеток проводили в среде ШИМ (Ы^Игодеп) и 10% РС8, дополненной трансферрином человека и инсулином человека (8£дта). Активацию Β-клеток, получение РВ и получение РС осуществляли на основе модифицированной системы ίη νίίΐΌ для дифференцировки Β-клеток в плазмоциты. Все рекомбинантные цитокины человека:

- 25 029085

1Ь-2, 1Ь-4, 1Ь-6, 1Ь-10, 1Ь-15, ΙΝΡ-α и СО40Ь и тАЬ против полигистидина добавляли на указанных стадиях культивирования. Различные концентрации исследуемого соединения (2, 20 и 200 нМ) добавляли в культуру на 0 сутки и 4 сутки. На 4 сутки все клетки после одной и той же обработки объединяли, клетки подсчитывали, отбирали клетки для РАС8-анализа и получения на цитоцентрифуге. Оставшиеся клетки высевали в концентрации 2,5х10⁵ клеток/мл в стерильный планшет с 6 ячейками в количестве 5 мл на лунку. РВМС при 8ЬЕ культивировали в течение 7 суток в условиях, ускоряющих дифференцировку плазмоцитов, в качестве нормальных В-клеток.

Иммунофенотипирование для проточного цитометрического анализа: клетки окрашивали с использованием красителя для многоцветной прямой иммунофлуоресценции для проточно-цитометрического анализа. Окрашивание поверхности проводили перед фиксацией клеток и увеличением их проницаемости. Клетки (50 мкл; 1х10⁶ клеток/мл в буфере для промывания, 2% РВ8 с 0,1% ΝηΝ₃ в РВ8) использовали для каждого окрашивания. Клетки окрашивали изотипическим контрольным тАЬ (1 мкг/10⁶ клеток) и многоцветными конъюгированным с Р1ТС тАЬ против СЭ20 и конъюгированным с РЕ тАЬ против ί'Ό38 или конъюгированное с РегСР-Су5.5 тАЬ против СЭ44, конъюгированное с РЕ тАЬ против СЭ83 использовали для активированных В-клеток на 4 сутки (ί'Ό20+ί'Ό38- клетки), и РВ на 4 сутки и РВ на 7 сутки (СО20-СЭ38+), и другого окрашивания, которое анализировали проточной цитометрией в соответствии с инструкциями изготовителя. Внутриклеточное окрашивание белков-факторов транскрипции (ВСЬ-6, ΙΚΡ-4, ВЫМР-1, РАХ-5 и ХВР-1) и 1дб проводили в соответствии с рекомендациями изготовителей. Проточный цитометрический анализ проводили с помощью РАС8Сап1о с использованием РАС8О1уа 6 (ВО Вюкшепсек). Для анализа данных использовали программное обеспечение Но\\)о (Тгее 81аг).

Получение центрифугированных на цитоцентрифуге клеток из суспензии единичных клеток и иммунофлуоресцентное окрашивание для 1Су1е: получали суспензию клеток, содержащую не более 0,5х10⁶ клеток/мл, в РВ8, содержащем 2% РВ8. Вплоть до 200 мкл этой суспензии помещали в каждую кювету и центрифугировали при 800 об/мин в течение 3 мин. Кювету и бумагу осторожно отделяли без повреждения свежих центрифугированных на цитоцентрифуге клеток, а затем проводили либо незамедлительную фиксацию, либо высушивание. Нефиксированные центрифугированные на цитоцентрифуге клетки хранили в течение максимум 2 суток при комнатной температуре. Клетки на предметных стеклах фиксировали возрастающими концентрациями ЕЮН и позволяли им высохнуть перед окрашиванием. После блокирования неспецифического связывания нормальной сывороткой (тот же вид, что и у вторичного антитела), срезы инкубировали смесью следующих моноклональных антител в увлажненной камере в холодном помещении в течение ночи: (ί) антитело против ί'Ό38 человека в качестве маркера плазмобластов, и (ίί) антитела против ВСЬ-6, ΙΡΡ-4, ВЫМР-1, РАХ5 и ХВР-1 для белков-факторов транскрипции. После промывания предметные стекла инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре в темноте со смесью вторичных антител, которые были индуцированы в отличающихся видах (с двумя различными флуорохромами, т.е. А1еха Р1иог-488 и А1еха Р1иог-633). Затем предметные стекла промывали РВ8, подвергали контрастному окрашиванию ОЛР1 в течение 20 мин при комнатной температуре, покрывали покровными стеклами с препятствующей выцветанию флуоресцентной закрепляющей средой и закрепляли лаком для ногтей. Предметные стекла хранили в темноте при 4°С. Для исключения ложноположительных результатов, полученных путем неспецифического связывания вторичного антитела, все ткани обрабатывали сходным образом буфером, заменяющим первичное антитело. Цвет окрашивания антителом определяли и анализировали количество в срезах тканей с использованием Юу1е.

Получение изображений с помощью лазерного сканирующего цитометра и количественный анализ флуоресценции: двухцветное иммунофлуоресцентное окрашивание проводили на клетках, которые были подвергнуты цитоцентрифугированию на предметных стеклах (Су1окрш 4, ТЬегто каепЬйс), на основе стандартного способа 1НС. Получение изображения и количественный анализ флуоресценции проводили с использованием лазерной сканирующей цитометрии (количественная визуализирующая цитометрия Юук, СотрнСу1е). Проводили два прохождения (первое прохождение для 488 и второе прохождение для 405/633). Сканирование низкого разрешения использовали для мозаичного сканирования и сканирование высокого разрешения использовали для сканирования и анализа областей. В кратком изложении, предметное стекло помещали на столик Ь8С и выбирали область для сканирования. В Ь8С использовался аргоновый лазер, действующий при 5 мВт. Предметное стекло сканировали с использованием 20х объектива. Клетки идентифицировали и отбирали путем определения контура синей флуоресценции и минимального размера клеток, определяемого путем окрашивания ЭАРЕ Порог обнаружения клеток устанавливали для отбора единичных клеток, исходя из рассеяния света вперед, представленного на точечном графике площади клеток против интеграла рассеяния света вперед. События рассеяния света лазера фиксировали и использовали для определения контура единичных клеток на изображении данных сканирования. Различение контура осуществлялось для ядерной части сканируемой клетки так, чтобы контутрировалось приблизительно 67% от общей пикселизации рассеяния света. Напряжение усилия детектора РМТ в зеленой и дальней красной области были установлены так, чтобы во время сканирования достигалось не более 75% максимального насыщения максимальных пикселей. После установления области сканирования, предметное стекло анализировали с использованием объектива 40х . Исследовали мини- 26 029085

мум 6 областей сканирования для каждого предметного стекла. Создавали клеточную галерею путем перемещения клеток из каждого из основных пиков гистограммы интегрированной флуоресценции в дальней красной области. Морфологическую композицию перемещенных клеток исследовали на контроль качества. Данные можно анализировать либо в интегрированном логарифмическом режиме флуоресценции, либо в линейном максимальном пиксельном режиме. Различные популяции клеток при сканировании Б8С оценивали в качестве процента и МИ и количественного сравнения с контролями в виде ДМСО.

Анализ данных: поверхностные и внутриклеточные молекулы анализировали с помощью проточной цитометрии на РАС8СапЩ. Анализ данных проводили с помощью Πο^ο. Определяли цвет окрашивания антителом и количество анализировали в срезах ткани с использованием ^Суίе. Различные популяции клеток при сканировании РСМ и Б8С оценивали в качестве процента и МР1 и количественного сравнения с контролями в виде ДМСО. Данные выражали в качестве среднего значения ± 8ЕМ. Все данные наносили на график с использованием ОтарЬРай Рпзт 6.1 (ОтарЬРай 8οΓΐ\\αΐ'ο; 8ап ^^едο, СА). Статистический анализ проводили с использованием одностороннего ΑΝΟνΑ (критерий множественных сравнений Даннетта) и парного ί-критерия Стьюдента. Значимыми считали значения Р, меньшие или равные 0,05.

В-клетки культивировали с использованием модифицированной системы ίη νίΐίο для дифференцировки В-клеток в плазмоциты, как описано выше. Многоцветные конъюгированное с Р1ТС тАЬ против СЭ20 и конъюгированное с РЕ тАЬ против СЭ38 использовали для активированных В-клеток на 4 сутки (СП20+СЭ38- клетки) и плазмобластов на 7 сутки (РВ) (СП20-СЭ38+). Данные для 3 различных экспериментов, соответствующие 3 донорам, представлены в табл. 2. Результаты показали, что исследуемое соединение имело значительный эффект на дифференцировку В-клеток в росток плазмобластом/плазмоцитов. Оно увеличивало уровень активированных В-клеток и снижало уровень плазмобластов, а также снижало жизнеспособность клеток с течением времени (фиг. 12А и 12В). Активированные В-клетки (СП20+СЭ38- клетки), обработанные исследуемым соединением (20 нМ) не изменялись значительно между 4 сутками: (57,9±11,5%) и 7 сутками (50,5±8,6%), однако исследуемое соединение значительно увеличивало уровень активированных В-клеток по сравнению с контролем в виде носителя (ДМСО) на 4 сутки (42,1±1,5%, р<0,05) и 7 сутки (12,5±5,7%, р<0,05). Между тем, исследуемое соединение значительно снижало уровень плазмобластов/плазмоцитов (СП20-СЭ38+) на 4 сутки (4,8±2,3%) и на 7 сутки (9,7±5,4%) по сравнению с контролем в виде ДМСО (сутки 4, 25,9±2,4% р<0,05; и сутки 7, 54,8±5,0%, р<0,001). Более того, исследуемое соединение дозозависимым образом истощало популяцию клеток крупного размера (окно р2) в анализе дифференцировки нормальных В-клеток (фиг. 13). Процент клеток крупного размера на 4 сутки после обработки исследуемым соединением составлял 31,2, 23,1 и 20,4% для обработок 2, 20 и 200 нМ. Процент клеток крупного размера на 7 сутки после обработки исследуемым соединением составлял 34,9, 19,9 и 11,94% для обработок 2, 20 и 200 нМ. По сравнению с контролем в виде ДМСО количество составляло 35,5 и 34,9% на 4 сутки и 7 сутки соответственно.

Таблица 2

Исследуемое соединение ингибирует дифференцировку плазмобластов

	Сутки 4	Сутки 7
	ДМСО	Исследуемое соединение	ДМСО	Исследуемое соединение
Οϋ20-Οϋ38++ плазмобласты/плазмоциты,	25,9±2,4	4,8±2,3	54,8±5,0	9,7±5,4
О о
Οϋ20+Οϋ38+ промежуточные клетки, %	14,7±3,1	18,3 ± 5,5	22,8±5,1	23±7,7
Οϋ20+Οϋ38активированные В-клетки, О о	42,1±1,5	57,9 ± 11,5	12,5±5,7	50,5±8,6

Эффект исследуемого соединения на экспрессию факторов транскрипции В-клеток и плазмоцитов (ВСЬ-6, 1КР-4, ВЫМР-1, РАХ5 и ХВР-1) оценивали способом проточной цитометрии. В-клетки культивировали, как описано выше, и клетки собирали на 4 и 7 сутки для иммунофлуоресцентного окрашивания. Сначала клетки окрашивали на СЭ20 и СИ38, и после увеличения проницаемости клеток их окрашивали на ВСЬ-6, 1КР-4, ВЫМР-1, РАХ5 и ХВР-1, а затем анализировали путем ограничения цельных лимфоцитов. Данные для 3 экспериментов, являющихся репрезентативными для 3 доноров, показаны на фиг. 14. Результаты показали, что исследуемое соединение (20 нМ) вызывало сдвиг экспрессии факторов

- 27 029085

транскрипции в плазмобластах/плазмоцитах. Оно значительно снижало экспрессию ШЬ-4 (р<0,5), ВЫМР-1 (р<0,05) и ХВР-1 (р<0,05) на 4 сутки, но значительно увеличивало ВСЬ-6 (р<0,05) на 7 сутки.

Лазерную сканирующую цитометрию (|Су1е) использовали для количественного анализа в целях подтверждения результатов проточной цитометрии, описанных выше. В-клетки от нормальных доноров и РВМС от пациентов с §ЬЕ культивировали, как описано в способе выше. Клетки собирали на 4 и 7 сутки для осаждения клеток способом цитоцентрифугирования на предметные стекла, после чего проводили двойное иммунофлуоресцентное окрашивание, как описано в разделе "Способы". СЭ38 (зеленый) экспрессировался плазмобластами/плазмоцитами, факторы транскрипции (красный) ВСЬ-6, ΣΚΡ-4, ВЫМР-1, РАХ5 или ХВР-1 локализовались совместно в цитоплазме или ядре. Ядро подвергали контрастному окрашиванию ЭАР! (синий). На 7 сутки в образцах нормальных В-клеток по сравнению с контролем в виде ДМСО исследуемое соединение (20 нМ) значительно увеличивало экспрессию ВСЬ-6 (фиг. 15А, р<0,01), снижало экспрессию ШЬ-4 (фиг. 15В, р<0,001) и ВЫМР-1 (фиг. 15С, р<0,01) во всей популяции лимфоцитов, и значительно увеличивало экспрессию ВСЬ-6 (р<0,05), снижало экспрессию ΣΚΡ-4 (р<0,001), ВЫМР-1 (р<0,001) и РАХ-5 (фиг. 15Ό, р<0,05) в СЭ38+ плазмобластах/плазмоцитах. Отсутствовали изменения ХВР-1 (фиг. 15Е) в обеих клеточных популяциях. В РВМС пациентов §ЬЕ исследовали три фактора транскрипции: ВСЬ-6, ГКЕ-4 и ВЫМР-1. Данные показали, что исследуемое соединение имело сходную активность этих факторов транскрипции с клетками здоровых доноров. Исследуемое соединение дозозависимым образом и значительно увеличивало экспрессию ВСЬ-6 и ингибировало экспрессию ΣΚΡ-4 и ВЫМР-1 в СЭ38+ плазмобластах/плазмоцитах в дифференцирующихся РВМС пациента с 8ЬЕ на 4 и 7 сутки (фиг. 16).

С использованием той же системы дифференцировки В-клеток ίη νίίΓΟ далее исследовали активность исследуемого соединения в отношении экспрессии СЭ44 и СЭ83 при дифференцировке В-клеток. Многоцветное конъюгированное с ЫТС тАЬ против СЭ20. конъюгированное с РегСР Су5.5 тАЬ против СЭ44 и конъюгированное с РЕ тАЬ против СЭ83 использовали для клеток на 4 и 7 сутки. Эффект исследуемого соединения оценивали для 3 экспериментов, являющихся репрезентативными для 3 доноров. Данные показали, что исследуемое соединение имело дозозависимым образом и значительно сниженную среднюю интенсивность флуоресценции СЭ44 (МП) (фиг. 17, р<0,01) в образцах для дифференцировки В-клеток на 7 сутки, что было следствием истощения клеток СО20^Н|дН/СО44^Н|д|1 (фиг. 18). Процент клеток СП20^ЫдЬ/СП44^ЫдЬ на 7 сутки после обработки исследуемым соединением в концентрации 2, 20 и 200 нМ составил 18,4, 10,1 и 6,6% соответственно, по сравнению с контролем в виде ДМСО, в случае которого процент составил 22,2%. Истощение СЭ44+ клеток может снижать адгезию лейкоцитов. Исследуемое соединение также значительно увеличивало общую популяцию СЭ83+ клеток и усиливало экспрессию СЭ83+ (фиг. 19). Процент СЭ83+ клеток на 4 сутки после обработки исследуемым соединением в концентрации 2, 20 и 200 нМ составил 24,1±2,1%, 40,2±3,6%, 49,5±4,4% и 18,4%. Процент СО83+ клеток на 7 сутки после обработки исследуемым соединением в концентрации 2, 20 и 200 нМ составил 16,3±3,3%, 36,1±3,4% и 51,9±0,5%, по сравнению с ДМСО, для которого этот процент составил 13,4±2,4% и 12,9±3,3 на 4 сутки и 7 сутки соответственно.

Высокий уровень экспрессии [βί-цепи у пациентов с ревматоидным артритом (КА) прогнозирует отсутствие ответа на ритуксимаб. Для оценки того, имеет ли исследуемое соединение какую-либо активность в отношении продукции ЩЕ клетки также использовали для внутриклеточного окрашивания на !дЛ. Результаты для трех доноров показали, что исследуемое соединение дозозависимым образом и значительно снижало экспрессию ЦЬцепи в культурах для дифференцировки В-клеток на 4 сутки. Оно не только уменьшало количество ^-положительных клеток (4 сутки, 20 нМ на уровне 8,4± 1,5%, 200 нМ на уровне 5,4±1,8%; 7 сутки, 20 нМ на уровне 13,2±2,3% и 200 нМ на уровне 7,2±1,3 соответственно, по сравнению с контролем в виде ДМСО на уровне 13,1±1,5% и 14,4±4,3 на 4 сутки и 7 сутки соответственно), но также снижало МЫ !дЛ в положительных клетках (фиг. 20). Сниженная продукция [дЛ- !дО и !§М может быть потенциальным маркером ответа на исследуемое соединение при таких заболеваниях, как КА.

8.4. Пример 4. Эффект исследуемых соединений на продукцию цитокинов и хемокинов в стимулированных антителом против СЭ3 человека Т-клетках.

Этот пример демонстрирует эффект (§)-3-[4-(4-морфолин-4-илметилбензилокси)-1-оксо-1,3дигидроизоиндо-2-ил]пиперидин-2,6-диона, (К)-3-[4-(4-морфолин-4-илметилбензилокси)-1-оксо-1,3дигидроизоиндо-2-ил]пиперидин-2,6-диона и 3-[4-(4-морфолин-4-илметилбензилокси)-1-оксо-1,3дигидроизоиндо-2-ил]пиперидин-2,6-диона на продукцию цитокинов и хемокинов в стимулированных антителом против СЭ3 Т-клетках человека с использованием мультиплексной технологии Ьитшех.

Используют следующие сокращения.

ГЬ - интерлейкин,

О-С8Р - гранулоцитарный колониестимулирующий фактор,

ОМ-С8Р - гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор,

ΣΡΝ-γ - интерферон-гамма,

ΤΝΡ-α - фактор некроза опухоли-альфа,

- 28 029085

ΕΑΝΤΕδ - белок, регулируемый при активации, экспрессируемый и секретируемый нормальными Т-клетками.

В этом исследовании использовали следующие материалы.

Среда ΕΡΜΙ-1640, дополненная 10% ΡΒδ, 100 единиц/мл пенициллина, 100 мг/мл стрептомицина и 2 мМ Ь-глутамина (I л1е ТесЬпо1о§1е§).

Коктейль для увеличения содержания Т-клеток человека Ко§ейе8ер® (51ешСе11, каталожный номер # 15061).

12-плексный набор для определения цитокинов/хемокинов человека [лпшне'х (МйНроге, каталожный номер # МРХНСУТО-60К-12).

Устройство [лншпех Ιδ100 (МПИроге).

Антитело против С1)3 человека, клон ОКТЗ (еВюзшепсе, каталожный номер # 16-0037-85).

Исследуемые соединения получали в качестве исходных 4 мМ растворов в ДМСО. Т-клетки выделяли из лейкоцитарной пленки способом отрицательной селекции с использованием коктейля для увеличения содержания Т-клеток Ко§ейе8ер® по методикам изготовителя.

Все 96-луночные планшеты предварительно покрывали 3 мкг/мл антитела против СИЗ человека в 100 мкл 1х ΡΒδ в течение 4 ч при 37°С. Перед анализом Т-клеток планшеты промывали 3 раза полной средой ΕΡΜΙ-1640. Затем Т-клетки высевали в предварительно покрытые антителом против С1)3 планшеты при плотности 2,5х10⁵ клеток/лунка в 180 мкл полной среды ΕΡΜΙ-1640. Клетки обрабатывали 20 мкл 10х титрованных исследуемых соединений в концентрации 10, 1, 0,1, 0,01, 0,001, 0,0001 и 0,00001 мкМ в двух экземплярах. Конечные концентрации ДМСО составляли 0,25%. Планшеты инкубировали в течение 48 ч при 37°С, 5% СО₂. Через 48 ч супернатанты собирали и исследовали с помощью анализа с мультиплексными цитометрическими гранульными матрицами (СВА) в отношении следующих цитокинов/хемокинов: 1Ь-2, 1Ь-3, 1Ь-5, 1Ь-10, 1Ь-13, 1Ь-15, 1Ь-17А, СМ-С8Р, С-С8Р, ΙΡΝ-γ, ΤΝΡ-α и ΕΑΝΤΕδ.

Планшеты СОА анализировали на устройстве [лпшне'х Ιδ100.

Данные для каждого донора наносили на график с использованием программного обеспечения СгарНРас! Рпын 5.0 и выражали в качестве среднего значения в пг/мл ± δΕΜ и % от контроля в виде ДМСО ± δΕΜ.

Исследуемые соединения продемонстрировали иммуномодулирующую активность в стимулированных антителом против С1)3 первичных Т-клетках человека, изменяющую продукцию нескольких цитокинов и хемокинов. Исходные уровни цитокинов и хемокинов, продуцированных стимулированными Т-клетками человека, инкубированными с носителем, представлены в табл. 3 ниже.

Таблица 3

Исходные уровни цитокинов и хемокинов

Цитокин/Хемокин	Исходное продуцированное количество (пг/мл)
1Ъ-2	31
1Ъ-	38
1Ъ-5	27
1Ъ-10	449
1Ъ-13	205
1И-17А	19
СМ-СЗГ	132
ΙΕΝ-γ	1271
ΤΝΓ-α	411
ΚΑΝΤΕ5	314

Исследуемые соединения усиливали продукцию ΙΙ.-2, ΙΙ.-3, П.-5. ΙΕ-10, ΙΡ-13, СΜ-СδΡ, ΙΡΝ-γ, ΕΑΝΤΕδ и ΤΝΡ-α в стимулированных Т-клетках человека. Усиление продукции исследуемыми соединениями было в основном зависимым от концентрации для большинства цитокинов и хемокинов за исключением ΙΡ-10 и ΙΙ.-5. Исследуемые соединения усиливали продукцию ΙΡ-10 при более низких концентрациях, но ингибировали усиление продукции ΙΡ-10 при более высоких концентрациях. Исследуемые соединения усиливали продукцию ΙΡ-5 в основном при одной концентрации из диапазона концентраций, которые увеличивали продукции других цитокинов. По сравнению с другими цитокинами и хемокинами в контрольных клетках продуцировались относительно небольшие количества ΙΙ.-2, ΙΙ.-3, ΙΙ.-5 и ΙΡ-17Α (табл. 1). Продукция ΙΙ.-17Α не изменялась значительно исследуемыми соединениям. В стимулированных Т-клетках человека не продуцировались поддающиеся измерению количества ССδΡ и ΙΡ-15. Эффект

- 29 029085

3-[4-(4-морфолин-4-илметилбензилокси)-1-оксо-1,3-дигидроизоиндо-2-ил]пиперидин-2,6-диона на продукцию цитокинов и хемокинов в стимулированных антителом против СЭ3 Т-клетках человека, выраженный в качестве абсолютного продуцированного количества и в качестве процента от обработанных носителем контрольных клеток показан на фиг. 21 и 22 соответственно. Эффект (К)-3-[4-(4-морфолин-4илметилбензилокси)-1-оксо-1,3-дигидроизоиндо-2-ил]пиперидин-2,6-диона на продукцию цитокинов и хемокинов в стимулированных антителом против СЭ3 Т-клетках человека, выраженный в качестве абсолютного продуцированного количества и в качестве процента от обработанных носителем контрольных клеток, показан на фиг. 23 и 24 соответственно. Эффект (8)-3-[4-(4-морфолин-4-илметилбензилокси)-1оксо-1,3-дигидроизоиндо-2-ил]пиперидин-2,6-диона на продукцию цитокинов и хемокинов в стимулированных антителом против СЭ3 Т-клетках человека, выраженный в качестве абсолютного продуцированного количества и в качестве процента от обработанных носителем контрольных клеток, показан на фиг. 25 и 26 соответственно. Пунктирная линия обозначает уровень, эквивалентный удвоенной исходной продукции (ЕС₂₀₀), на фиг. 22, 24 и 26.

8.5. Пример 5. Противовоспалительная активность.

Противовоспалительную активность 3-[4-(4-морфолин-4-илметилбензилокси)-1 -оксо-1,3-дигидроизоиндол-2-ил]пиперидин-2,6-диона, (К)-3-[4-(4-морфолин-4-илметилбензилокси)-1-оксо-1,3-дигидроизоиндол-2-ил]пиперидин-2,6-диона и (8)-3-[4-(4-морфолин-4-илметилбензилокси)-1-оксо-1,3-дигидроизоиндо-2-ил]пиперидин-2,6-диона исследовали в мононуклеарных клетках периферической крови человека (ЬРВМС). Для определения ингибиторной (усиливающей) концентрации 1С₅₀ для соединений в целях одновременного определения профиля провоспалительных цитокинов/хемокинов и 1Б-10 (противовоспалительный цитокин) из стимулированных БР8 РВМС здорового человека-донора использовали технологию Битшех.

50 мл лейкоцитарной пленки здоровых доноров получали от В1оой Сейет о£ Ыете 1еткеу (Бак! Огапде, №\ν 1еткеу). Липополисахарид (штамм) (каталожный номер # Р-1887) приобретали от 81дта. Мультиплексные наборы с гранулами, с которыми связано антитело, для технологии Битшех хМАР приобретали от МПИроге (ВШепса, МаккасЬикейк) и комбинировали в мультиплексный формат перед анализом.

8.5.1. Очистка мононуклеарных клеток периферической крови человека

50 мл лейкоцитарной пленки человека распределяли аликвотами по 25 мл в две 50-мл конических пробирки и в каждую коническую пробирку добавляли 25 мл стерильного НВ88. Содержимое пробирок тщательно перемешивали переворачиванием. Пятьдесят мл Нсо11-Рас|ие Р1ик (ОБ НеаЙЬсате (расположение); каталожный номер # 17-1440-02) комнатной температуры распределяли аликвотами в 50-мл конические пробирки. Затем осторожно и медленно наслаивали 25 мл смеси лейкоцитарная пленка/НВ88 над Рюо11. Образцы центрифугировали при 450 об/мин в течение 35 мин. Верхний слой, содержавший плазму, отбирали пипеткой и отбрасывали. Поверхность контакта, содержавшую мононуклеарные клетки, переносили в две 50-мл конических пробирки. Обе конические пробирки заполняли до общего объема 50 мл посредством НВ88 и центрифугировали при 1200 об/мин в течение 10 мин. Клетки вновь промывали в НВ88 и центрифугировали при 1000 об/мин в течение 10 мин. Клеточный осадок ресуспендировали с помощью 20 мл полной среды РРМ1 (РРМ1/5% сыворотка человека/1 хреп/кйер/дЬй) и подсчитывали.

8.5.2. Обработка мононуклеарных клеток периферической крови

Сто мкл (2х10⁶/мл) ЬРВМС добавляли в каждую лунку 96-луночного планшета с плоским дном (конечное количество клеток = 2х10⁵/лунка) и инокулировали при 37°С в течение 1 ч. В каждую исследуемую лунку добавляли двадцать мкл (10х) соединения и в каждую контрольную лунку добавляли 20 мкл среды, содержавшей 2,5% ДМСО ([ДМСО]конечная = 0,25%) и планшет инкубировали в течение 1 ч при 37°С. Затем клетки стимулировали 80 мкл БР8 в концентрации 2,5 нг/мл ([БР8]конечная =1 нг/мл) и инкубировали в течение 18 ч при 37°С.

50 мкл супернатанта из каждой лунки переносили в 3 новых круглодонных 96-луночных планшета и хранили при -20°С для анализа Ьиттех. Для каждого образца проводили дублирование лунки.

8.5.3. Анализ Ьиттех

Образцы супернатанта анализировали в отношении цитокинов в мультиплексном формате в соответствии с инструкциями изготовителя (МПИроге, ВШепса, Ма 01821) с использованием устройства Биттех 18100. Анализы 1Б-12 и ОМ-С8Р проводили в дуплексном формате с использованием супернатантов в чистом виде, в то время как анализ всех других цитокинов проводили в мультиплексном формате с использованием супернатантов, разбавленных 1:20. Анализ данных проводили с использованием программного обеспечения ИркЮе Веай\ае\у. 1С₅₀ вычисляли с использованием нелинейной регрессии, сигмовидной кривой доза-ответ, ограничения сверху до 100% и снизу до 0%, допущения вариабельного наклона. ЕС₅₀ были основаны на ограничении сверху сигмовидных кривых, составляющем 246,9%, что соответствует среднему усилению 1Б-10, обеспеченному помалидомидом (контроль) при 10 мкМ и нижнего ограничения до 100%. 1С50 вычисляли с использованием ОгарЬРай Рпкт ν5.00. Данные соответствуют среднему значению + 8ЕМ (стандартная ошибка среднего значения) для η (количество дублированных экспериментов).

- 30 029085

Как демонстрируют данные в табл. 4 ниже и на фиг. 27, 29 и 31, исследуемые соединения, главным образом, имели изменяющуюся эффективность в отношении ингибирования множества исследованных цитокинов, 11-6, П.-8, ΣΕ-1 β, ОМ-С8Р, МОС, ΜΣΡ-1 α, ΜΣΡ-1β и ΤΝΡ-α. Также эти соединения усиливали продукцию Σ^-10· МСР-1 и ΚΆΝΤΕ8 с различной эффективностью, как описано в табл. 5 и на фиг. 28, 30 и 32.

Таблица 4

Обобщения профиля ингибирования цитокинов исследуемыми соединениями

Цитокин	Рацемат 1С5о (мкМ)	Λ-энантиомер 1С5о (мкМ)	5энантиомер 1С5о (мкМ)
1Ъ-б	0, 01	0, 083	0,0038
1Ъ-8	>10	>10	>10
ш-ΐβ	0,00085	0,0062	0,00046
СМ-СЗР	0,0092	0, 039	0,0022
МРС	0,0026	0, 012	0,0021
ΜΙΡ-1α	0, 19	0,45	0, 028
ΜΙΡ-1β	>10	>10	>10
ΤΝΡ-α	0,0018	0,0095	0,00059

Таблица 5

Обобщение профиля цитокинов - среднее значение % от контроля при 0,1 мкМ

Цитокин	Рацемат (% от контроля)	Л-энантиомер (% от контроля)	5-энантиомер (% от контроля)
1Ъ-10	371	442	379
МСР-1	208	223	233
ΚΑΝΤΕ3	153	151	153

8.6. Пример 6. Эффект на функцию природных киллеров (ΝΚ) в отсвет на АО/ритуксимаб.

В этом примере исследовали способность исследуемых соединений усиливать функцию ΝΚ-клеток

человека в ответ на ΣβО/ритуксимаб. Иммуномодулирующую активность исследуемых соединений сравнивали в двух анализах функций природных киллеров (ΝΚ): (1) индуцируемая АО и П.-2 продукция интерферона-гамма (ΊΡΝ-γ).

Ниже предоставлены использованные в исследовании материалы и их источники.

Лейкоцитарная пленка здоровых добровольцев (В1оос1 СеШег оГ \е\у 1егзеу).

РюоП-Нурацие Р1из (р1зНег 8с1еИ1йс Со БЬС, РА, каталожный номер # 17144002).

Среда ΚРΜΣ-1640· дополненная 10% РВ8 (эмбриональная телячья сыворотка), 100 единиц/мл пенициллина, 100 мг/мл стрептомицина и 2 мМ 1 .-глутамина (Ауйгоцелп каталожный номер # 21870-076).

Среда КРΜΣ-1640 (без фенолового красного), дополненная 10% РВ8, 100 единиц/мл пенициллина,

100 мг/мл стрептомицина и 2 мМ 1 .-глутамина (Ауйгоцелп каталожный номер # 11835-030).

Ритуксимаб (ритуксан, КосНе, Σис.) (каталожный номер № ^ΣN 02241927, № партии В50177).

АВ+ сыворотка человека (Оетш1 Вю Ргойис1з, СА, каталожный номер # 100-512).

Набор для нерадиоактивного анализа цитотоксичности Су!оТох 9 6 \оп (Рготеда, А!, каталожный

номер # 01780).

Коктейль для увеличения содержания ΝΚ-клеток человека (81ет Се11 ТесЬпоЬдхез, Уапсоиуег, ВС, каталожный номер # 15065).

Антитело мыши против СЭ56+ человека, конъюгированное с АРС (ВО Вюзшепсез, СА, каталожный номер # 555518).

Иммуноглобулин О человека (АСВ из сыворотки (8|цта, 8ί. Ьошз, МО; каталожный номер # ^51110МО).

Рекомбинантный Σ^-2 человека (К&О 8уз!етз, М^ каталожный номер # 202ЛЬ-050/СР).

Набор для ЕЫ8А на ΣΡN-гамма человека (ТЬегтоР1зЬег, каталожный номер # РΣΕНΣΡNО5). Использовали следующие клеточные линии:

подобные активированным В-клеткам - диффузная крупноклеточная В-клеточная лимфома (АВСО1.ВС1): клетки Кгуа (NСΣ· МО).

- 31 029085

Подобные В-клеткам зародышевого центра - диффузная крупноклеточная В-клеточная лимфома (ОСВ-ОЬВСЬ):

\Υδυ-Ι)ΙΧΊ.2 (Се1депе δΐ^Ι, СА).

Рагаде (АТСС, УА).

Фолликулярная лимфома: ОоНН2 (ΌδΜΖ, Германия).

Лимфома Беркитта (ВБ): Ка_р (АТСС, УА).

ΝΚ-клетки от здоровых доноров выделяли из лейкоцитарной пленки крови посредством отрицательной селекции с использованием коктейля для увеличения содержания ΝΚ-клеток Козей^ер ^1ет Се11 Тесйпо1од1ез, Уапсоиуег, ВС) перед центрифугированием в градиенте плотности с Р1со11-Нурацие (Р1зйег δ^ηίΐ& Со ББС, РА) в соответствии с инструкциями изготовителя. СЭ56+ ΝΚ-клетки выделяли до ~85% чистоты при определении проточной цитометрией (ВО Вюзшепсез, СА).

8.6.1. Анализ индуцированной 1§С продукции ΝΚ интерферона-гамма (ΙΓΝ-γ)

Девяносто шести-луночные плоскодонные планшеты покрывали 100 мкг/мл ^О человека ^1дта) в течение ночи при 4°С. На следующий день не связавшийся !дО смывали холодным 1х РΒδ. Затем в покрытые БО 96-луночные планшеты высевали ΝΚ-клетки в количестве 2х10⁵ клеток на лунку в 180 мкл среды КРМБ1640 и добавляли 10 нг/мл гЫБ-2 (К & Ό δузΐетз, ΜΝ). Добавляли исследуемые соединения в объеме 20 мкл ДМСО. Конечные концентрации исследуемых соединений составляли 0,0001, 0,001, 0,01, 0,1, 1 или 10 мкМ. Конечные концентрации ДМСО составляли 0,25%. Через 48 ч супернатанты собирали и анализировали с помощью ЕБКА в отношении продукции ΓΡΝ-γ.

Данные, использованные для определения способности исследуемых соединений усиливать продукцию ΓΡΝ-γ ΝΚ-клетками в ответ на стимуляцию иммобилизованным !дО и гЫБ-2, анализировали для каждого донора с использованием программного обеспечения ОгарНРаб Рпзт ν5.0. Данные представлены двумя способами: (1) в качестве абсолютной величины продуцированного ΖΡΝ-γ (пг/мл ± δЕΜ), и (2) в качестве процента от количества ΖΡΝ-γ, продуцированного в присутствии 1 мкМ помалидомида. ЕС₅₀ представляет собой концентрацию исследуемого соединения, обеспечивающую половину максимальной продукции ΡΡΝ-γ, при этом максимальную продукцию определяют как количество ΣΡΝ-γ, продуцированного в присутствии 1 мкМ помалидомида. Величины ЕС₅₀ вычисляли с использованием нелинейной регрессии, сигмоидальной кривой доза-ответ, ограничивающей сверху до 100% и снизу до 0%, допускающей вариабельный наклон.

Таблица 6

Соединение	ЕС5о
Рацемат	0,037 мкМ
Л-энантиомер	0,016 мкМ
5-энантиомер	0,012 мкМ

Исследуемые соединения усиливали продукцию ΝΚ-клетками ΣΡΝ-γ дозозависимым образом в ответ на стимуляцию иммобилизованным !дО и I^-2. Результаты для рацемата, К-энантиомера и δэнантиомера, показаны на фиг. 33-35 (выражены в качестве пг/мл продуцированного ΡΡN-γ) соответственно. На фиг. 36-38 показаны результаты, выраженные в качестве процента продуцированного на увеличенном уровне ΈΡΝ-γ относительно ΈΡΝ-γ, продуцированного в присутствии помалидомида в концентрации 1 мкМ, для рацемата, К-энантиомера и δ-энантиомера соответственно. Каждая величина, нанесенная на график на фиг. 33-38, соответствует среднему значению для 12-14 определений ± δЕΜ.

8.7. Пример 7. Анализы пролиферации эндотелиальных клеток сосудов человека, образования трубки, миграции и инвазии.

В этом примере рацемат относится к 3-[4-(4-морфолин-4-илметилбензилокси)-1-оксо-1,3дигидроизоиндо-2-ил]пиперидин-2,6-диону, К-энантиомер относится к (К)-3-[4-(4-морфолин-4илметилбензилокси)-1-оксо-1,3-дигидроизоиндо-2-ил]пиперидин-2,6-диону и δ-энантиомер относится к ^)-3-[4-(4-морфолин-4-илметилбензилокси)-1-оксо-1,3-дигидроизоиндо-2-ил]пиперидин-2,6-диону.

Анализ пролиферации эндотелиальных клеток пуповинной вены человека: эндотелиальные клетки пупочных сосудов размораживали и выращивали в среде ЕОМ2 до 3-6 пассажа для всех анализов пролиферации. Эндотелиальные клетки пупочных сосудов человека трипсинизировали, промывали 20% средой ΡΒδ/Μ199 и высевали в ту же среду в количестве 10⁴ клеток/100 мкл на лунку в 96-луночные планшеты для культивирования клеток. Планшеты инкубировали в течение ночи при 37°С, чтобы позволить клеткам прикрепиться. Затем клетки подвергали голоданию в среде 1% ΡΒδ/Μ199 в течение 18 ч после промывания этой же средой 3 раза. Для оптимизации концентрации факторов роста в анализе пролиферации НиУЕС, 100 мкл/лунка 2х серийных разведений факторов роста, начиная со 100 нг/мл, добавляли к НиУЕС в двух экземплярах на 72 ч при 37°С в инкубаторе для культивирования клеток с увлажнением с 5% СО₂. Для анализа исследуемых соединений проводили серийное разведение исследуемых соединений в среде 0,4% ДМСО/1% ΡΒδ/Μ199 в двух экземплярах из 10 мМ исходных растворов. К клеткам до- 32 029085

бавляли 50 мкл на лунку серийных разведений исследуемых соединений (10, 1,0, 0,1, 0,01, 0,001, 0,0001, 0,00001 мкМ) на 1-2 ч при 37°С. Конечная концентрация ДМСО в клетках составляет 0,1%. Затем в каждую лунку добавляли 50 мкл соответствующих факторов роста в 4х конечной концентрации на 72 ч при 37°С в инкубатора для клеточной культуры с увлажнением с 5% СО₂. Включение тимидина измеряли путем добавления в каждую лунку одного микрокюри 3Н-тимидина (АтегкЬат) в 20 мкл среды и инкубировали при 37°С в инкубаторе для клеточной культуры с увлажнением с 5% СО₂ в течение 5-6 ч. Затем клетки трипсинизировали и собирали в фильтрующие планшеты ИтРШег СР/С (Регкт Е1тег) с использованием харвестера клеток (Тот1ес). После высушивания планшетов воздухом добавляли 20 мкл/лунка Мюгоксш! 20 (Раскагй), а затем планшеты анализировали в ТорСоип! ΝΧΤ (Раскагй). Каждую лунку подсчитывали в течение одной минуты.

Эксперименты проводили в двух экземплярах у каждого из 3 доноров. Анализ образования трубки из эндотелиальных клеток пупочных сосудов человека: соединения исследовали в анализе индуцированного факторами роста образования трубки из НИУЕС. Планшеты для образования трубки инкубировали при 37°С в течение 30 мин для полимеризации матригеля. НИУЕС подвергали голоданию в основной среде ЕВМ2 с 0,1% В8А в течение 5 ч после промывания той же средой 3 раза. Клетки трипсинизировали и центрифугировали. Затем в планшеты для образования трубки, покрытые матригелем, добавляли 25 мкл 4х серийных разведений соединений (10, 1, 0,1, 0,01, 0,001, 0,0001, 0,00001 мкм) в двух экземплярах с 50 мкл 2х10⁴ клеток/лунка. В планшеты добавляли 50 мкл 4х УЕСР (конечная концентрация = 25 нг/мл) или ЬРСР (конечная концентрация = 10 нг/мл). Затем клетки инкубировали в течение ночи (~18 ч) при 37°С в инкубаторе с увлажнением. Сети трубочек окрашивали кальцеином АМ в концентрации 4 мкг/мкл в 2% РВ8/НВ88 в течение 30 мин и получали изображения с помощью флуоресцентной микроскопии. Трубочки количественно определяли с помощью программного обеспечения для определения образования трубок МеЮМогрк вычисляющего площадь трубок и длину трубок.

Анализ инвазии эндотелиальных клеток пупочных сосудов человека: в анализе инвазии НИУЕС концентрацию фибронектина человека оптимизируют для обеспечения подходящей белковой структуры для прикрепления прикрепляющихся клеток к мембране и обеспечения свободной миграции в ответ на ангиогенный стимул (например, УЕСР, ЬРСР или НСР) в нижней камере планшета с вставкой. НИУЕС подвергали голоданию в среде ЕВМ2 с 0,1% В8А в течение 6 ч после промывания той же средой 3 раза. Затем клетки трипсинизировали и центрифугировали для удаления оставшегося трипсина. Затем ~0,51 х 10⁶ клеток в 125 мкл/лунка и 125 мкл 8х серийных разведений соединений (10, 1, 0,1, 0,01, 0,001 мкМ) добавляли в верхнюю камеру 24-луночных и 96-луночных планшетов со вставкой ВИ Ра1соп в двух экземплярах и инкубировали в течение ~1-2 ч. (Планшеты содержат блокирующую флуоресценцию микропористую [размер пор 3,0 мкм] мембрану РЕТ, которая равномерно покрыта фибронектином человека). Затем в нижнюю камеру добавляли 750 мкл 1,33х исходного раствора УЕСР (конечная концентрация 25 нг/мл), ЬРСР (конечная концентрация 10 нг/мл) или НСР (конечная концентрация 25 нг/мл). Клетки инкубировали в течение 22±1 ч при 37°С. Мигрировавшие клетки окрашивали кальцеином АМ в концентрации 4 мкг/мл в НВ88, содержавшей 2% РВ8, с использованием 500 мкл/лунка в 24-луночных планшетах и 200 мкл/лунка в 96-луночных планшетах. Планшеты инкубировали при 37°С в течение 90 мин и считывали в устройстве для считывания флуоресценции планшетов.

Процентное ингибирование пролиферации клеток, образование трубки, миграцию и инвазию вычисляли путем вычитания результата для контроля в виде ДМСО без стимуляции из результатов для исследуемого образца, усреднения для всех реплик, и нормализации к стимулированному фактором роста контролю в виде ДМСО (0% ингибирование). Величины 1С₅₀ вычисляли с использованием СгарЬРай Рг18т 5.0.

Результаты анализа пролиферации эндотелиальных клеток пупочных сосудов человека: результаты исследования с оптимизацией факторов роста показали, что оптимальные концентрации УЕСР, ЬРСР и НСР для индукции пролиферации составляли 25, 10 и 25 нг/мл соответственно. Исследуемые соединения исследовали с помощью оптимизированных концентраций факторов роста и результаты показали, что рацемат, 8-энантиомер и К-энантиомер не ингибировали индуцируемую УЕСР, ЬРСР или НСР пролиферацию НИУЕС (фиг. 39). Однако происходило усиление пролиферации, наблюдаемое в случае обработанных УЕСР и НСР НИУЕС, с помощью 8-энантиомера (обработанные УЕСР: 1-10 мкМ; обработанные НСР: 0,1-1 мкМ). Также происходило значительное усиление, наблюдаемое в обработанных ЬРСР НИУЕС, с помощью рацемата (0,01-1 мкМ) и К-энантиомера (0,1-1 мкМ). Величины 1С₅₀ обобщенно представлены в табл. 7.

- 33 029085

Таблица 7

Обобщение величин 1С₅₀ из исследований индуцируемой факторами роста пролиферации эндотелиальных клеток пупочных сосудов человека

Исследуемые соединения	УЕСЕ (25 нг/мл), величины 1С5о (мкМ)	ЬЕСЕ (10 нг/мл) величины 1С5о (мкМ)	НСЕ (25 нг/мл), величины 1С5о (мкМ)
Рацемат	>100	99	24
кэнантиомер	>100	76	38
5энантиомер	>100	52	51

Результаты анализа образования трубки из эндотелиальных кленок пупочных сосудов человека: исследуемые соединения проявляли тенденцию в отношении ингибирования индуцируемого УЕОР образования трубки НИУЕС с точки зрения как длины трубки, так и площади трубки (фиг. 40). Все соединения продемонстрировали дозозависимый эффект на индуцируемое УЕОР образование трубки НиУЕС. Кэнантиомер продемонстрировал значительное ингибирование (р<0,05 против стимулированного контроля в виде ДМСО) площади и длины трубки при 10 мкМ. Также существовала тенденция к ингибированию индуцируемого ЬРОР образования трубки НиУЕС с точки зрения как длины трубки, так и площади трубки (фиг. 40), хотя этот эффект был менее выраженным, чем эффекты на индуцируемое УЕОР образование трубки НиУЕС.

Результаты анализа инвазии эндотелиальных клеток пупочных сосудов человека: 3-[4-(4-морфолин4-илметилбензилокси)-1-оксо-1,3-дигидроизоиндо-2-ил]пиперидин-2,6-дион, (К)-3-[4-(4-морфолин-4илметилбензилокси)-1-оксо-1,3-дигидроизоиндо-2-ил]пиперидин-2,6-дион и ^)-3-[4-(4-морфолин-4илметилбензилокси)-1-оксо-1,3-дигидроизоиндо-2-ил]пиперидин-2,6-дион значительно ингибировали индуцируемую УЕОР, ЬРОР и НОР инвазию НиУЕС дозозависимыми образом (фиг. 41). Соединения были более эффективными против индуцируемой УЕОР и ЬРОР инвазии НиУЕС, чем против индуцируемой НОР инвазии НиУЕС (табл. 8). Величина 1С₅₀ составляла <0,3 нМ для ингибирования индуцируемой УЕОР инвазии НиУЕС исследуемыми соединениями. 1С₅₀ рацемата (0,4 нМ) и δ-энантиомера (<0,1 нМ) более чем в десять раз превышала 1С50 К-энантиомера (13 нМ) (табл. 8).

Таблица 8

Обобщение эффектов исследуемых соединений на индуцируемую факторами роста инвазию эндотелиальных клеток пупочных сосудов человека

Исследуемые Соединения	Индуцируемая УЕСЕ инвазия, величины 1С50 (мкМ)	Индуцируемая ЬЕСЕ инвазия, величины 1С50 (мкМ)	Индуцируемая НСЕ инвазия, величины 1Сьо (мкМ)
Рацемат	0,00014	0,00042	0,59
кэнантиомер	< 0,0001	0, 013	0, 45
5энантиомер	< 0,0001	< 0,0001	0,019

8.8. Пример 8. Исследование на модели волчанки/фиброза на мышах.

В этом примере исследовали чувствительность к ^)-3-[4-(4-морфолин-4-илметилбензилокси)-1оксо-1,3-дигидроизоиндо-2-ил]пиперидин-2,6-диону в двух предрасположенных к волчанке линиях мышей: модель системной красной волчанки на мышах МКР/Мр1-Ра51рг/1 и модель системной красной волчанки на мышах \/В\\Т'В.1. Исследуемое соединение вводили в обеих моделях в количестве 30 мг/кг.

На модели системной красной волчанки на мышах МКР/Мр1-Ра51рг/1, В-клетки периферической крови продемонстрировали отсутствие изменений на 4 неделе. В-клетки селезенки продемонстрировали 37% увеличение, и уровень аутоантител против двухцепочечной ДНК продемонстрировал 25% снижение на 4 неделе.

На модели системной красной волчанки на мышах \/В\\'РР".1, В-клетки периферической крови продемонстрировали 25% снижение на 4 неделе, В-клетки селезенки продемонстрировали отсутствие изменений, и уровень аутоантител против двухцепочечной ДНК продемонстрировал 86% увеличение на

- 34 029085

4 неделе.

8.9. Пример 9. Исследование на модели фиброза кожи на мышах.

В этом примере (3)-3-[4-(4-морфолин-4-илметилбензилокси)-1-оксо-1,3-дигидроизоиндо-2ил]пиперидин-2,6-дион исследовали на модели индуцируемого блеомицином фиброза кожи с использованием как профилактических, так и терапевтических режимов дозирования. Блеомицин является устаревшим терапевтическим средством против злокачественной опухоли, которое, как было показано, вызывает фиброз легких. В моделях на животных он аналогичным образом индуцирует повреждение и фиброз в области доставки. В этом примере используют следующие сокращения:

Сокращение или специальный термин	Пояснение или определение
АПЮУА	Дисперсионный анализ
ОС-5МА	Альфа-актин гладких мышц
СМС	Карбоксиметилцеллюлоза
ЕСМ	Внеклеточный матрикс
ЫаС1	Хлорид натрия
п/о	перорально
<20	дозирование один раз в сутки
55с	Системная склеродермия

В этом исследовании использовали мышей ΌΒΑ/2. В исследовании использовали восемь животных на группу введения. Мышей держали в помещении для животных в стандартных условиях с доступом к пище и воде без ограничения.

Носитель, 0,5% карбоксиметилцеллюлоза (СМС)/0,25% Т^ееп 80, приготавливали в дистиллированной Н₂0 и растворяли в течение ночи с помощью магнитной мешалки (добавляли 0,5 г СМС (31дша #С9481) и 0,25 мл Т\уееп 80 (3щша #Р8074) до 99,75 мл так, чтобы получить общий объем 100 мл 0,5% СМС/0,25% Т^ееп 80).

Порошок исследуемого соединения отвешивали и суспендировали для получения свежей суспензии каждые сутки в носителе 0,5% СМС/0,25% Т\уееп 80, чтобы предотвратить гидролиз лекарственного средства в водной среде. Соединение суспендировалось, но не растворялось, в этом носителе. Состав гомогенизировали с помощью тефлонового пестика и ступки (гомогенизатор тканей Ройег-Еке!уеш) с использованием механизированного гомогенизатора тканей ЕЬегЬасЕ. Ежесуточная исходная концентрация лекарственного средства, используемая в этих исследованиях, составляла 3 мг/мл.

Блеомицин получали из аптеки ишуегзйу о£ Ег1апдеп-ЖгешЬегд и свежий раствор приготавливали один раз в неделю. Фиброз кожи индуцировали у мышей ΌΒΑ в возрасте 6 недель посредством местных внутрикожных инъекций 100 мкл блеомицина, растворенного в 0,9% №С1, в концентрации 0,5 мг/мл раз в двое суток в определенных областях площадью 1,5 см² в верхней части спины.

8.9.1. Схема исследования

Модель индуцируемого блеомицином фиброза кожи на мышах широко используют для оценки терапевтических средств против фиброза. В этой модели индуцируют локализованный фиброз кожи посредством внутрикожных инъекций блеомицина раз в двое суток в течение 3 недель. Эта модель напоминает ранние воспалительные стадии 33с. Для оценки потенциальных эффектов на профилактику фиброза, лечение начинали одновременно с первой инъекцией блеомицина. Для исследования эффекта исследуемого соединения на профилактику индуцируемого блеомицином фиброза ΐη νΐνο, введение проводили в следующих группах:

контрольная группа: внутрикожная инъекция №С1 в течение 3 недель. Введение состояло в введении носителя (0,5% СМС/0,25% Т\уееп 80),

группа блеомицина без лечения: внутрикожная инъекция блеомицина в течение трех недель. Введение носителя (0,5% СМС/0,25% Т\уееп 80),

группа исследуемого соединения: внутрикожная инъекция блеомицина в течение трех недель. Исследуемое соединение вводили в дозе 30 мг/кг; п/о, ΡΌ,

группа положительного контроля: внутрикожная инъекция блеомицина в течение трех недель. Инъекция иматиниба (50 мг/кг; в/б, ΟΙ)). Ранее было показано, что иматиниб мезилат проявляет мощные антифибротические эффекты при индуцируемом блеомицином фиброзе кожи. См. ΆΜιηκΊδΙιίικι А. е! а1., ΑτΐΕηΐΐδ КЕеиш 2009; 60 (1):219-224.

Для оценки регрессии фиброза использовали модифицированную модель индуцируемого блеомицином фиброза кожи. Мышей предварительно нагружали блеомицином для индукции стойкого фиброза кожи. В одной группе проводили введение исследуемого соединения, в то время как нагрузку блеомицином продолжали в течение дополнительных трех недель. Исход в этой группе сравнивали с мышами, которых нагружали блеомицином в течение шести недель (профилактика дальнейшего прогрессирова- 35 029085

ния), и с мышами, которых нагружали блеомицином в течение трех недель, а затем Ν;·ιΟ в течение дополнительных трех недель (индукция регрессии). В исследовании регрессии использовали следующие группы:

контрольная группа: внутрикожная инъекция Ν;·ιΟ в течение шести недель. Контрольное лечение состояло из введения носителя,

группа блеомицина 1 без лечения (регрессия): внутрикожная инъекция блеомицина в течение трех недель, а затем внутрикожные инъекции Ν;·ιΟ в течение дополнительных трех недель. Лечение состояло в ведении носителя,

група блеомицина 2 без лечения (профилактика прогрессирования): внутрикожная инъекция блеомицина в течение шести недель. Лечение состояло в введении носителя,

группа исследуемого соединения: внутрикожная инъекция блеомицина в течение шести недель. Исследуемое соединение вводили в дозе 30 мг/кг; п/о, ΟΌ,

группа положительного контроля: внутрикожная инъекция блеомицина в течение шести недель. Инъекция иматиниба (50 мг/кг; в/б, ΟΌ).

8.9.2. Методика эксперимента

Толщину кожи определяли окрашиванием гематоксилином и эозином и активированные фибробласты определяли с использованием иммуногистохимии на α-актин гладких мышц ( а-§МА). Толщина кожи, определяемая по модифицированному кожному показателю Роднана, в настоящее время является наиболее распространенным первичным результатом в клинических испытаниях у человека для противофиброзных средств при §§с. Срезы кожи окрашивали гематоксилином/эозином для лучшей визуализации структуры ткани.

Толщину дермы анализировали с помощью микроскопа ΝίΚοη ЕсНрзе 80т (ΝίΚοη, ВаЛюетейогр, Нидерланды) путем измерения максимального расстояния между поверхностью контакта эпидермадерма и поверхностью контакта дерма-подкожный жир в 4 различных срезах кожи каждой мыши. Оценку проводили 2 независимых исследователя.

Для количественного определения миофибробластов срезы кожи депарафинизировали и инкубировали с 5% бычьим сывороточным альбумином в течение 60 мин. Клетки, положительные по а-§МА, определяли путем инкубации с моноклональными антителами против а-§МА (клон 1А4; §1§та-АШг1сЬ, ДешНепп, Германия) в течение 2 ч при комнатной температуре с последующей инкубацией с 3% пероксидом водорода в течение 10 мин. Антитела козы против антител кролика, меченные пероксидазой хрена (Эако, НатЬигд, Германия) использовали в качестве вторичных антител. Экспрессию а-§МА визуализировали с помощью 3,3-диаминобензидина тетрагидрохлорида (Ыдта-АИпсН). В качестве контролей использовали моноклональные [дС-антитела мыши (Са1ЫосЬет, §аη Э1едо, СА).

Кроме того, количество коллагена в коже очага повреждения будет измерено с помощью анализа коллагена 81гСо1; РНК и плазму всех мышей сохранили для дальнейших анализов.

Исследуемое соединение значительно уменьшает толщину кожи очага повреждения на модели индуцируемого блеомицином фиброза кожи на мышах. Исследуемое соединение в дозе 30 мг/кг; п/о, ΟΌ значительно препятствовало утолщению приблизительно на 25±0,49% (р<0,001, фиг. 42).

Репрезентативные микрофотографии окрашенных гематоксилином и эозином срезов кожи показаны на фиг. 43. Толщину дермы оценивали путем измерения максимального расстояния между поверхностью контакта эпидерма-дерма и поверхностью контакта дерма-подкожный жир. Линия между точками поверхности контакта демонстрирует относительную толщину в группах введения.

Для определения эффекта введения на активацию фибробластов, а-§МА + миофибробласты подсчитывали в срезах поврежденной кожи.

Как показано на фиг. 44, исследуемое соединение в дозе 30 мг/кг; п/о, ΟΌ, снижало количество миофибробластов на 24±0,09% (р<0,05).

Иматиниб в дозе 50 мг/кг снижал утолщение кожи на 60±0,34% (р<0,0001) и количества миофибробластов на 81±0,11% (р<0,0001).

8.9.3. Эффект на регрессию индуцируемого блеомицином фиброза кожи

Ингибиторные эффекты исследуемого соединения на прогрессирование фиброза также подтверждали в модифицированной модели с блеомицином, разработанной для исследования возможной регрессии фиброза. Как показано на фиг. 45, исследуемое соединение в дозе 30 мг/кг; п/о, ΟΌ не имело эффекта на утолщение кожи на модели регрессии. На фиг. 46 показаны микрофотографии репрезентативные окрашенные гематоксилином и эозином срезы кожи. Толщину дермы оценивали путем измерения максимального расстояния между поверхностью контакта эпидерма-дерма и поверхностью контакта дермаподкожный жир. Линия, проведенная между точками поверхностей контакта, демонстрирует относительную толщину в группах введения. На фиг. 47 показано, что исследуемое соединение не имело эффекта на количества миофибробластов. Иматиниб в дозе 50 мг/кг снижал индуцируемую блеомицином толщину кожи на 50±0,3% (р<0,0001) и количество миофибробластов на 78±0,15% (р<0,0001).

8.10. Пример 10. Эффект на модели на мышах Тзк-1.

Противофиброзные эффекты (§)-3-[4-(4-морфолин-4-илметилбензилокси)-1-оксо-1,3-дигидро- 36 029085

изоиндо-2-ил]пиперидин-2,6-дион на модели на мышах ΙίβΙιΙ 8кш-1 (Тзк-1).

Сначала исследовали ингибиторные эффекты соединения на фиброз на модели на мышах Ιφΐιΐ ккш Т§к-1. Как показано на фиг. 48, соединение в дозе 30 мг/кг снижало подкожное утолщение на 45% (р<0,001) по сравнению с 58% снижением в случае иматиниба в дозе 50 мг/кг (р <0,001). Оцененное содержание коллагена в коже при измерении по уровню гидроксипролина снижалось на 38% соединением, и на 67% иматинибом (р <0,001).

Далее для исследования эффекта соединения на сверхэкспрессию генов каскада ТОР-β в коже мышей Ткк-1 использовали цРТ-ПЦР для измерения уровней мРНК шести генов: СТОР, ΡΑΙ-1, СОЬ1А1, αактин гладких мышц (альфа-8МА), олигомерный белок хрящей 1 (СОМР), и ТОРВ1. Сверхэкспрессию определяли как избыток уровней мРНК, наблюдаемый в коже мышей Тзк-1. по сравнению с кожей нормальных мышей ра/ра. Среди этих шести генов только четыре (СТОР, ΡΑΙ-1, СОЬ1А1 и ТОРВ1) сверхэкспрессировались до значительно более высокого уровня у Ткк-1 по сравнению с нормальными мышами ра/ра. Соединение (30 мг/кг) значимо снижало сверхэкспрессию СТОР и СОЬ1А1 на 79% (р <0,001) и 129% (р <0,001) соответственно (фиг. 49). Сверхэкспрессия генов ΡΑΙ-1 и ТОРВ1 не ингибировалась соединением. Эти результаты указывают на то, что соединение может снижать фиброз кожи путем блокирования сверхэкспрессии некоторых профибротических генов в каскаде ТОР-β.

Для дальнейшего исследования эффекта соединения на экспрессию фибротических генов в нормальных клетках (ЫЬ) и клетках при системной склеродермии (88с), следовали следующим методикам.

Культивирование клеток: нормальные фибробласты кожи человека и фибробласты кожи при склеродермии культивировали в ΌΜΕΜ, содержащей 10% эмбриональную телячью сыворотку (РВ8). Клетки поддерживали в инкубаторе с 5% СО₂, 95% воздуха при 37°С. После достижения смыкания монослоя клетки собирали с помощью 0,05% трипсина и субкультивировали. Клетки использовали на 3-5 пассаже.

Схема эксперимента: клетки выращивали до смыкания монослоя на 70-80% и вводили в состояние покоя путем снижения концентрации сыворотки до 0,4% на ночь. Исследовали эффекты соединения на фибротические эффекты ТОР-β и на экспрессию фибротических генов в клетках ЫЬ и 88с.

Эффекты на индукцию ТОР-β экспрессии фибротических генов: фибробласты ЫЬ предварительно обрабатывали соединением в течение 30 мин, а затем добавляли ТОР-β 1 для определения эффектов соединения на индуцируемую ТОР-β экспрессию фибротических генов.

Эффекты соединения на 88с-РВ: фибробласты 88с обрабатывали соединением в различных концентрациях и определяли уровни экспрессии генов коллагена 1А1 (СОЬ1), α-актина гладких мышц (α8МА), фибронектина (РЫ), матриксной металлопептидазы 1 (ММР1), ингибитора активатора плазминогена (ΡΑΙ) и ДНК-(цитозин-5-)-метилтрансферазы 1 (ЭптИ) через 24 ч с помощью ПЦР в реальном времени.

Количественная ПЦР в реальном времени: общую РНК экстрагировали из клеток с использованием набора КЫеаку. Концентрацию РНК измеряли и 1 мкг РНК подвергали обратной транскрипции в кДНК с использованием набора КТ-РиЦ: Пгапй кй. Затем кДНК амплифицировали с использованием соответствующих праймеров и основной смеси для ПЦР Ρο\\όγ 8УВК Огееп ГСК МаПег Μίχ. Ампликон (150-200 п.н.) обнаруживали с помощью системы АВ1 7500 Кеа1 Типе Ρί'Κ 8у51ет. Все гены-мишени нормализовывали к 6ΑΡΩΗ и вычисляли относительные кратные изменения. Каждый образец оценивали в трех экземплярах.

Как показано на фиг. 50, соединение дозозависимым образом снижало экспрессию мРНК СОЬ1, а8МА и РЫ в фибробластах 88с. Аналогично, экспрессия ΡΑΙ (фиг. 51) и ЭптИ (фиг. 52) также дозозависимым образом снижалась соединением в фибробластах 88с. Как показано на фиг. 51, соединением дозозависимым образом увеличивало экспрессию ММР-1 в фибробластах 88с. Результаты демонстрируют, что соединение эффективно регулирует ключевые фибротические факторы, указывая на эффективность соединения для лечения 88с.

Кроме того, исследовали уровни цереблона в нормальных фибробластах и фибробластах 88с и тканях кожи 88с. Как показано на фиг. 53 и 54, более высокие уровни цереблона наблюдали как в фибробластах 88с, так и в тканях кожи 88с по сравнению с нормальными тканями. Это указывает на то, что повышенный уровень цереблона вовлечен в 88с.

8.11. Пример 11. Нацеливание на цереблон при В-клеточных дискразиях.

Определяли профиль эффекта (8)-3-[4-(4-морфолин-4-илметилбензилокси)-1-оксо-1,3дигидроизоиндо-2-ил]пиперидин-2,6-диона (соединение ΙΑ) на связывание СКВЫ, убиквитинилирование и пролиферацию клеток. СКВЫ является компонентом комплекса убиквитинлигазы Ε3, включающего СИЬ4А, ЭЭВ1 и КОС-1, было выявлено, что он является молекулярной мишенью, связываемой талидомидом, леналидомидом и помалидомидом.

Исследования связывания с СКВЫ проводили с использованием конъюгированных с аналогом талидомида гранул в конкурентном анализе. Эндогенный СКВЫ из клеток множественной миеломы (ММ) человека измеряли путем инкубации экстрактов клеток с различными концентрациями либо соединения ΙΑ, либо помалидомида в качестве положительного контроля. Аффинные гранулы, связанные с кислотным аналогом талидомида, инкубировали с экстрактами И266 и после тщательного промывания гранул

- 37 029085

элюировали связавшиеся белки. Связывание ί','ΡΒΝ со связанными с талидомидом аффинными гранулами определяли с помощью количественного определения СКЕА с использованием иммуноблоттинга.

Убиквитинилирование ί','ΡΒΝ измеряли в клетках НЕК293Т, которые были трансфицированы меченной на Ν-конце Ηίδ-биотином конструкцией ΟΚΒΝ, затем предварительно инкубировали с соединениями в течение 1 ч, а затем обрабатывали ингибитором протеасом МО132 (для остановки деградации убиквитинилированных белков). Клетки лизировали и обрабатывали для измерения убиквитинилирования ί','ΚΒΝ с помощью δΌδ-РАОЕ и иммуноблоттинга с использованием антитела против убиквитина. Исследования пролиферации клеток проводили в чувствительных и устойчивых к леналидомиду клетках множественной миеломы. Устойчивые или чувствительные к леналидомиду клеточные линии Н929 ММ обрабатывали соединением 1А в течение 5 суток, а затем оценивали пролиферацию и жизнеспособность клеток посредством окрашивания 7-аминоактиномицином И ("7-АИИ"). Костимуляцию Т-клеток измеряли в очищенных первичных Т-клетках человека, стимулированных с использованием иммобилизованного антитела против СИ3 в клеточной культуре в течение 2 суток и секрецию цитокинов измеряли с помощью ЕЫ8А.

Продукцию иммуноглобулинов М и О ("1дО и 1дМ") измеряли из мононуклеарных клеток периферической крови нормальных доноров путем культивирования в присутствии факторов дифференцировки В-клеток: рекомбинантного 1Ь-2 человека (20 Е/мл), 1Ь-10 (50 нг/мл), 1Ь-15 (10 нг/мл), НА-меченного лиганда СИ40 (50 нг/мл), 1дО1-антитела мыши с полигистидином (5 мкг/мл) и ΘΌΝ 2006-лиганда ТЬК9 человека (10 мкг/мл) в течение 4 суток, а затем с 1Ь-2, 1Ь-10, 1Ь-15 и 1Ь-6 (50 нг/мл) в течение дополнительных 3 суток. Измерение 1дМ и 1дО проводили с помощью ЕЬГЗА.

В конкурентных исследованиях связывания ί','ΡΒΝ предварительная инкубация с помалидомидом в концентрации 3 мкМ приводила к приблизительно на 50% меньшему количеству ΟΚΒΝ, связавшегося с аффинными гранулами, в то время как соединение 1А в концентрации 0,1 мкМ приводило к сходному связыванию ΟΚΒΝ. Исследования по убиквитинилированию ΟΚΒΝ в трансфицированных клетках НЕК293Т привели к следующей эффективности: соединение 1А 1С₅₀ = 0,19 мкМ; леналидомид 1С₅₀ = 12,9 мкМ и помалидомид 1С₅₀ = 21,6 мкМ. Величины 1С₅₀ для ингибирования пролиферации с помощью соединения 1А сдвигались от 0,01 мкМ в родительской клеточной линии Н929 и 0,04 мкМ в обработанном ДМСО субклоне до 0,51-1,58 мкМ в устойчивых к леналидомиду субклонах.

50% сокращение клеточного цикла (δ-фаза) было очевидным после обработки в течение 24 ч клеток Н929 соединением 1А. Через 48 ч соединение 1А снижало экспрессию сурвивина и ретинобластомного белка ("рКВ") и увеличивало экспрессию циклин-зависимого ингибитора киназ р27. Соединение 1А костимулировало продукцию 1Ь-2 Т-клетками с ЕС₅₀ приблизительно 0,29 нМ, по сравнению с 10 нМ для помалидомида. Соединение 1А ингибировало продукцию 1дМ и 1дО с 1С₅₀ 0,35 и 2,1 нМ соответственно, по сравнению с 17 нМ и 63 нМ для помалидомида.

Результаты указывают на то, что соединение 1А связывается с ί','ΚΒΝ с приблизительно в 30 раз более высокой аффинностью по сравнению с помалидомидом и ингибирует убиквитинилирование ΟΚΒΝ с приблизительно в 110 раз большей эффективностью, чем помалидомид, в этой системе. Соединение 1А является приблизительно в 34 раза более эффективным, чем помалидомид, в отношении костимуляции продукции 1Ь-2 Т-клетками, и оно является в 30-48 раз более эффективным, чем помалидомид, в отношении ингибирования продукции иммуноглобулина.

8.12. Пример 12. Ингибирование дифференцировки В-клеток в росток плазмобластов и плазмоцитов.

Для исследования эффектов нацеливания на цереблон ("СКВ№') в отношении дифференцировки Вклеток в ростки плазмобластов и плазмоцитов, была разработана модель дифференцировки первичных В-клеток человека ш уйго.

СИ19+ В-клетки периферической крови человека от нормальных доноров или общие мононуклеарные клетки периферической крови РВМС от пациентов с системной красной волчанкой ("§ЬЕ") культивировали в присутствии интерлейкина ("1Ь")-2, 1Ь-10, 1Ь15, агониста ТЬК9 и СИ40Ь в течение 4 суток, а затем с 1Ь-2, 1Ь-6, 1Ь-10 и 1Ь-15 в течение дополнительных 3 суток. Клетки подсчитывали, жизнеспособность оценивали и определяли экспрессию СИ20, СИ38, СИ44 и СИ83 с помощью проточной цитометрии. Факторы ростка плазмобластов ΙΚΡ-4, ВЬ1МР-1, ХВР-1 и 1д1 и маркеры зародышевого центра РАХ5 и ВСЬ-6 измеряли с помощью цКТ-ПЦР. Внутриклеточную экспрессию белка измеряли с помощью лазерной сканирующей цитометрии. Секретируемые иммуноглобулины 1дО и 1дМ измеряли с помощью ЕЬКА.

В культурах нормальных В-клеток (§)-3-(4-((4-морфолинометил)бензил)окси)-1-оксоизоиндолин-2ил)пиперидин-2,6-дион ("соединение Ι-δ") уменьшал процент всех жизнеспособных клеток в этих культурах после 4 суток до 69,6% (Р <0,05) или 35,8% от контроля (Р <0,001) при 20 нМ или 200 нМ соединения Ι-δ соответственно. Соединение Ι-δ дозозависимым образом снижало процент жизнеспособных СИ20-СИ38+ плазмобластов на 7 сутки с 30,4% в контрольных культурах до 27,3, 2,1 и 0,4% в концентрациях 2, 20 и 200 нМ соответственно. На 7 сутки анализ С|КТ-ПЦР продемонстрировал, что соединение Ι-δ (20 нМ) снижало экспрессию генов факторов ростка плазмобластов ΙΚΡ-4, ВЫМР-1, ХВР-1 и 1д1 до 20,5, 14,3, 15,1 и 31,5% от контроля соответственно (Р<0,001).

- 38 029085

При внутриклеточной проточной цитометрии соединение 1-8 (20 нМ) значимо снижало экспрессию белков 1КР-4 (Р<0,5), ВЫМР-1 (Р<0,05), и ХВР-1 (Р<0,05) на 4 сутки, но значимо увеличивало экспрессию белка ВСЬ-6 (Р<0,05) на 7 сутки. При лазерной сканирующей цитометрии на 7 сутки соединение 1-8 (20 нМ) снижало внутриклеточную экспрессию СЭ38+ клетками белков 1КР-4 (Р<0,001) и ВЫМР-1 (Р<0,001) и увеличивало экспрессию ВСЬ-6 (Р<0,05) (п=3). Соединение 1-8 ингибировало продукцию секретируемых 1§О с 1С₅₀=1,8 нМ (п=3).

В РВМС от пациентов с 8ЬЕ соединение 1-8 (20 нМ) имело сходные эффекты с эффектами в нормальных В-клетках, снижая экспрессию генов ВЫМР-1, ХВР-1 и 1дб до 52,8, 49,2 и 13,6% от контроля соответственно (Р <0,001) (п=3). Соединение 1-8 (20 нМ) значимо снижало экспрессию СЭ38+ плазмобластами внутриклеточных белков ВЫМР-1 (Р <0,01) и 1КР-4 (Р <0,001) и увеличивало экспрессию ВСЬ-6 (Р <0,05) (п=3). Соединение 1-8 ингибировало продукцию секретируемых 1дМ и 1§О в РВМС пациента с 8ЬЕ с 1С₅₀ 0,9 и 3,2 нМ соответственно (п=3).

Эти результаты демонстрируют, что нацеливание на субстратный корецептор СКВЫ комплекса убиквитинлигазы Е3 с помощью низкомолекулярного иммуномодулирующего соединения 1-8 приводит к мощному ингибированию дифференцировки В-клеток в росток плазмобластов, как показано по снижению процента жизнеспособных СЭ38+ клеток, снижению экспрессии генов и белков ВЫМР-1, ХВР-1, 1КР-4 и 1дб- и ингибированию продукции секретируемых иммуноглобулинов. Эти данные указывают на участие комплекса СиЬ4-СКВЫ в дифференцировке В-клеток в росток плазмоцитов.

Настоящее изобретение не ограничивается объемом конкретных вариантов осуществления, описанных в настоящем описании. Действительно, различные модификации изобретения в дополнение к описанным модификациям, будут очевидны специалистам в данной области из представленного выше описания и прилагаемых чертежей. Подразумевают, что такие модификации входят в объем прилагаемой формулы изобретения.

В настоящем описании цитированы различные публикации, патенты и патентные заявки, содержание которых включено в качестве ссылки в полном объеме.

Claims (20)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Способ лечения, профилактики или контроля за течением иммуноопосредуемого заболевания или воспалительного заболевания, который предусматривает введение пациенту эффективного количества соединения формулы I

   или его фармацевтически приемлемой соли, сольвата, гидрата, стереоизомера, таутомера или рацемической смеси, где заболевание представляет собой волчанку, склеродермию, ознобленную волчанку или саркоидоз.
2. 2. Способ по п.1, где соединение представляет собой (8)-3-(4-((4-(морфолинометил)бензил)окси)-1оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион или его фармацевтически приемлемую соль, сольват или гидрат.
3. 3. Способ по п.1, где соединение представляет собой (8)-3-(4-((4-(морфолинометил)бензил)окси)-1оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион.
4. 4. Способ по п.1, где соединение представляет собой гидрохлорид (8)-3-(4-((4(морфолинометил)бензил)окси)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-диона.
5. 5. Способ по любому из пп.1-4, где заболевание представляет собой системную красную волчанку, склеродермию, ознобленную волчанку или саркоидоз.
6. 6. Способ по п.5, где заболевание представляет собой системную красную волчанку.
7. 7. Способ по п.6, где заболевание представляет собой тяжелую системную красную волчанку.
8. 8. Способ по п.5, где заболевание представляет собой склеродермию.
9. 9. Способ по п.8, где склеродермия представляет собой локализованную, системную, ограниченную или диффузную склеродермию.
10. 10. Способ по п.9, где системная склеродермия включает синдром СКЕ8Т.
11. 11. Способ ослабления, ингибирования или профилактики симптома системной красной волчанки, который предусматривает введение пациенту с симптомом системной красной волчанки эффективного

    - 39 029085

    количества соединения, где симптом выбран из группы, состоящей из боли в суставах, опухания суставов, артрита, боли в груди при глубоком вдохе, усталости, лихорадки без какой-либо другой причины, общего дискомфорта, тревожности, потери волос, изъязвлений полости рта, опухания лимфатических узлов, чувствительности к солнечному свету, кожной сыпи, головных болей, онемения, ощущения покалываний, судорожных припадков, проблем со зрением, изменений личности, боли в животе, тошноты, рвоты, патологических сердечных ритмов, кровохаркания и затрудненности дыхания, пятнистой кожи и феномена Рейно, и где соединение представляет собой соединение формулы I

    или его фармацевтически приемлемую соль, сольват, гидрат, стереоизомер, таутомер или рацемическую смесь.
12. 12. Способ ослабления, ингибирования или профилактики симптома склеродермии, который предусматривает введение пациенту с симптомом склеродермии эффективного количества соединения, где симптом выбран из группы, состоящей из следующего: (ί) постепенное уплотнение, утолщение и стягивание кожи; (ίί) обесцвечивание кожи; (ίίί) онемение конечностей; (ίν) блестящая кожа; (ν) небольшие белые образования под поверхностью кожи, которые прорываются мелово-белой жидкостью; (νί) дисфункция пищевода Рейно; (νΐΐ) телеангиэктазия; (νΐΐΐ) боль и/или скованность суставов; (ίχ) опухание рук и ступней; (х) кожный зуд; (χί) скованность и скручивание пальцев; (χίί) язвы на внешней поверхности суставов пальцев и локтях; (χΐΐΐ) изжога, затрудненность глотания, диарея, раздраженный кишечник и запор; (χίν) усталость и слабость; (χν) затрудненность дыхания; (χνί) артрит; (χνίί) потеря волос; (χνΐΐΐ) проблемы с внутренними органами; (χίχ) изъязвления пальцев или (хх) аутоампутация пальцев, и где соединение представляет собой соединение формулы I

    или его фармацевтически приемлемую соль, сольват, гидрат, стереоизомер, таутомер или рацемическую смесь.
13. 13. Способ улучшения модифицированного кожного показателя Роднана у пациента, страдающего склеродермией, который предусматривает введение пациенту эффективного количества соединения I, имеющего формулу

    или его фармацевтически приемлемой соли, сольвата, гидрата, стереоизомера, таутомера или рацемической смеси.
14. 14. Способ по любому из пп.11-13, где соединение представляет собой (8)-3-(4-((4(морфолинометил)бензил)окси)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион или его фармацевтически приемлемую соль, сольват или гидрат.
15. 15. Способ по любому из пп.11-13, где соединение представляет собой (8)-3-(4-((4(морфолинометил)бензил)окси)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион.
16. 16. Способ по любому из пп.11-13, где соединение представляет собой гидрохлорид (8)-3-(4-((4- 40 029085

    (морфолинометил)бензил)окси)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-диона.
17. 17. Способ по любому из пп.1-16, дополнительно включающий введение второго активного средства, которое представляет собой противовоспалительное или иммуномодулирующее соединение.
18. 18. Способ по любому из пп.1-17, где эффективное количество составляет приблизительно 30 мг/кг массы тела пациента.
19. 19. Способ модулирования активности Β-клеток, который предусматривает приведение клетки в контакт с эффективным количеством (8)-3-(4-((4-(морфолинометил)бензил)окси)-1-оксоизоиндолин-2ил)пиперидин-2,6-диона или его фармацевтически приемлемой соли, сольвата или гидрата.
20. 20. Способ модулирования активности Т-клеток, который предусматривает приведение клетки в контакт с эффективным количеством (8)-3-(4-((4-(морфолинометил)бензил)окси)-1-оксоизоиндолин-2ил)пиперидин-2,6-диона или его фармацевтически приемлемой соли, сольвата или гидрата.

    С020 Г1ТС-А СЭ20 ГГГС-А

    СЭ20 ГГГС-А С020 ПТС-А