KR20200058606A

KR20200058606A - 면역-관련 및 염증성 질환의 치료

Info

Publication number: KR20200058606A
Application number: KR1020207014533A
Authority: KR
Inventors: 피터 에이취. 샤퍼; 라제쉬 쵸프라; 아니타 간디
Original assignee: 셀진 코포레이션
Priority date: 2012-08-09
Filing date: 2013-08-08
Publication date: 2020-05-27
Also published as: SG11201500983RA; EA201590342A1; JP2015527349A; CA3092279A1; RS60416B1; KR20210073616A; BR112015002272A2; PH12015500276A1; IL237070B; HRP20200836T1; NI201500013A; CA3092279C; MX2015001686A; LT2882441T; US20210340132A1; DK2882441T3; AU2013299625B2; CA2881113A1; ES2800026T3; CN104703605A

Abstract

면역-관련 질환 또는 염증성 질환에서 B 세포 및/또는 T 세포, 단핵구, 대식세포, 및 기타 림프구 또는 골수-유래 세포 타입의 활성을 비롯한 백혈구 활성을 조절하기 위한 화합물 및 조성물의 사용 방법이 본원에서 제공된다. 상기 방법에서 사용하기 위한 약학 조성물 및 투약법이 또한 본원에서 제공된다.

Description

면역-관련 및 염증성 질환의 치료{TREATMENT OF IMMUNE-RELATED AND INFLAMMATORY DISEASES}

1. 관련 출원

본 출원은 2012년 11월 5일 출원된 미국 임시 특허 출원 제61/722,718호 및 2012년 8월 9일 출원된 미국 임시 특허 출원 제61/681,491호의 이익을 주장하며, 상기 임시 출원은 그 전문이 본원에 참고로 원용된다.

2. 서열 목록

본 출원은 12827-207-888_SeqListing.txt (작성일: 2012년 8월 8일; 크기: 6,571 바이트) 파일명으로 제출된 서열 목록과 함께 출원된다. 서열 목록은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.

3. 기술분야

(S)-3-[4-(4-모르폴린-4-일메틸벤질옥시)-1-옥소-1,3-디하이드로-이소인도-2-일]피페리딘-2,6-디온을 포함한 화합물 I 또는 그의 약학적으로 허용되는 염, 용매화물, 수화물, 입체이성질체, 호변이성질체 또는 라세미 혼합물을 투여하는 것을 포함하는, B 세포 및/또는 T 세포, 단핵구, 대식세포, 및 기타 림프구 또는 골수-유래 세포 타입의 활성을 비롯한 백혈구 활성과 관련된 질환, 예를 들어 면역-관련 질환 또는 염증성 질환의 치료, 예방 및/또는 관리 방법이 본원에서 제공된다. 상기 치료, 예방 및/또는 관리를 위한 약학 조성물 및 투약법이 또한 본원에서 제공된다.

4. 배경기술

B 세포 및/또는 T 세포의 활성을 비롯한 림프구 활성에 의해 조절되는 염증 및 면역-관련 질환, 예컨대 루푸스, 경피증, 동상성 루푸스, 유육종증, 쇼그렌 증후군 (Sjoegren syndrome), ANCA-유발성 혈관염, 항인지질 증후군 및 중증 근무력증은 계속해서 중요한 의학적 문제이다.

루푸스 또는 홍반성 루푸스는 신체의 다양한 부위, 특히 피부, 관절, 혈액, 및 신장에서 만성 염증을 초래할 수 있는 자가면역 장애의 집합체이다. 신체의 면역 체계는 보통 바이러스, 박테리아, 및 기타 외래 물질 (즉, 항원)에 대하여 신체를 방어하기 위해 항체라 불리는 단백질을 만든다. 자가면역 장애, 예컨대 루푸스에서, 면역 체계는 항원과 그의 자가 세포 및 조직 간의 차이를 인식하는 능력을 상실하고 그의 자가 세포 및 조직을 공격하는 항체를 만들어 면역 복합체를 형성할 수 있다. 이러한 면역 복합체는 조직에 축적되어 염증, 조직 손상 및/또는 통증을 초래할 수 있다. 루푸스의 가장 일반적인 3가지 유형에는 전신성 홍반성 루푸스 (SLE), 피부 홍반성 루푸스 (CLE) 및 약물-유발성 루푸스가 포함된다. 루푸스 또는 홍반성 루푸스에 관한 보다 상세한 설명은 문헌 [Wallace, 2000, The Lupus Book: A Guide for Patients and Their Families, Oxford University Press, Revised and Expanded Edition]에서 찾아볼 수 있고, 상기 문헌은 그 전문이 본원에 참고로 원용된다.

경피증은 백만명 당 대략 19명의 안정된 이환수를 갖는 희귀 질환이다. 경피증의 정확한 원인은 알려지지 않았다. 이상이 자가면역 및 내피 세포 및 섬유모세포 기능의 변경을 수반한다. 전신성 경피증은 통상적으로 레이노 현상(Raynaud's phenomenon)을 동반한, 보통은 손가락의 피부 비후로 시작된다. 레이노 질환에 이어서 전형적으로 전신성 경피증의 추가 징후가 나타난다. 질환 초기에는 병에 걸린 피부가 붓고 연화될 수 있다. 피부가 가장 비후해지고 경화되는 일반적인 부위는 얼굴, 손 및 손가락이다. 수지경화증이 흔히 나타난다. 힘줄 마찰음이 종종 검사시에 감지될 수 있고 통증이 있을 수 있다. 질환이 더 진행됨에 따라, 손발가락 궤양 및 자가절단이 발생할 수 있다. 위장관 운동장애는 종종 속쓰림, 또는 흡수장애나 가성-폐색(pseudo-obstruction)을 동반한 설사가 나타나는 것이 한 특징이다. 새로 발병하는 고혈압 또는 신부전증이 관련 혈관 손상의 징후이다. 심부전증 또는 부정맥 또한 심장 섬유증으로 인해 가능하다 (Hachulla E, Launay D, Diagnosis and classification of systemic sclerosis, Clin Rev Allergy Immunol 2010; 40(2):78-83).

경피증 및 특히 전신성 경화증의 주요 징후는 부적절하게 과도한 콜라겐 합성 및 침착, 내피 기능이상, 연축, 허탈 및 섬유화에 의한 소멸이다. 진단의 측면에서, 중요한 임상학적 파라미터는 중수지절 관절 기부에서의 피부 비후이다. 레이노 현상은 경피증의 흔한, 매우 보편적인 요소이다. 이는 한랭 노출시 피부색 변화로 진단된다. 허혈 및 피부 비후는 레이노 질환의 증상이다.

유육종증은 육아종 형성이 특징이고, 림프구 및 대식세포에 의해 증가하며, 보통 T-헬퍼(helper) 타입 1 반응으로 분류되는 질환이다. 폐포 대식세포에 의한 종양 괴사 인자 (TNF)-α, IL-8, 및 IL-18의 과잉생성이 근본 폐 염증에 대한 기여 요인인 것으로 생각된다. 동상성 루푸스는 유육종증의 만성적인 피부의 흉한 상태이며, 주로 얼굴에 영향을 미친다. 유육종증 및 관련 동상성 루푸스는 코르티코스테로이드와 같이 치료 선택이 제한적이고, 그저 보통 정도의 혜택만을 제공할 뿐이다(Baughman RP, Judson MA, Teirstein AS, Moller DR, Lower EE. Thalidomide for chronic sarcoidosis. Chest. 2002 Jul;122(1):227-32).

루푸스, 경피증, 동상성 루푸스, 유육종증, 쇼그렌 증후군, ANCA-유발성 혈관염, 항인지질 증후군 및 중증 근무력증을 비롯한 면역-관련 및 염증성 질환을 치료하거나 예방하는 데에 사용될 수 있는 예방 또는 치료 약물이 여전히 필요하다.

5. 개요

치료 유효량의 하기 화학식 I의 화합물, 또는 그의 약학적으로 허용되는 염, 용매화물, 수화물, 입체이성질체, 호변이성질체 또는 라세미 혼합물을 투여하는 것을 포함하는, 면역-관련 및 염증성 질환과 관련된 질환, 장애 및/또는 상태의 치료, 관리, 완화 및/또는 예방 방법이 본원에서 제공된다.

[화학식 I]

일 실시양태에서, 화합물은 3-[4-(4-모르폴린-4-일메틸-벤질옥시)-1-옥소-1,3-디하이드로-이소인돌-2-일]-피페리딘-2,6-디온이다.

일 실시양태에서, 화합물은 3-[4-(4-모르폴린-4-일메틸-벤질옥시)-1-옥소-1,3-디하이드로-이소인돌-2-일]-피페리딘-2,6-디온의 약학적으로 허용되는 염이다.

일 실시양태에서, 화합물은 3-[4-(4-모르폴린-4-일메틸-벤질옥시)-1-옥소-1,3-디하이드로-이소인돌-2-일]-피페리딘-2,6-디온 하이드로클로라이드이다.

일 실시양태에서, 화합물은 하기 구조를 가지는 (S)-3-[4-(4-모르폴린-4-일메틸-벤질옥시)-1-옥소-1,3-디하이드로-이소인돌-2-일]-피페리딘-2,6-디온, 또는 그의 약학적으로 허용되는 염, 용매화물, 수화물 또는 호변이성질체이다:

일 실시양태에서, 화합물은 (S)-3-[4-(4-모르폴린-4-일메틸-벤질옥시)-1-옥소-1,3-디하이드로-이소인돌-2-일]-피페리딘-2,6-디온이다.

일 실시양태에서, 화합물은 (S)-3-[4-(4-모르폴린-4-일메틸-벤질옥시)-1-옥소-1,3-디하이드로-이소인돌-2-일]-피페리딘-2,6-디온의 약학적으로 허용되는 염이다.

일 실시양태에서, 화합물은 (S)-3-[4-(4-모르폴린-4-일메틸-벤질옥시)-1-옥소-1,3-디하이드로-이소인돌-2-일]-피페리딘-2,6-디온 하이드로클로라이드이다.

일 실시양태에서, 화합물은 하기 구조를 가지는 (R)-3-[4-(4-모르폴린-4-일메틸-벤질옥시)-1-옥소-1,3-디하이드로-이소인돌-2-일]-피페리딘-2,6-디온, 또는 그의 약학적으로 허용되는 염, 용매화물, 수화물 또는 호변이성질체이다:

일 실시양태에서, 화합물은 (R)-3-[4-(4-모르폴린-4-일메틸-벤질옥시)-1-옥소-1,3-디하이드로-이소인돌-2-일]-피페리딘-2,6-디온이다.

일 실시양태에서, 화합물은 (R)-3-[4-(4-모르폴린-4-일메틸-벤질옥시)-1-옥소-1,3-디하이드로-이소인돌-2-일]-피페리딘-2,6-디온의 약학적으로 허용되는 염이다.

일 실시양태에서, 화합물은 (R)-3-[4-(4-모르폴린-4-일메틸-벤질옥시)-1-옥소-1,3-디하이드로-이소인돌-2-일]-피페리딘-2,6-디온 하이드로클로라이드이다.

특정 실시양태에서, 질환은 루푸스, 경피증, 쇼그렌 증후군, ANCA-유발성 혈관염, 항인지질 증후군 및 중증 근무력증으로부터 선택된다.

일 실시양태에서, B 세포 및/또는 T 세포를 유효량의 화합물 I과 접촉시키는 것을 포함하는, B 세포 및/또는 T 세포, 단핵구, 대식세포, 및 기타 림프구 또는 골수-유래 세포 타입의 활성을 비롯한 백혈구 활성의 조절, 예를 들어 감소 방법이 본원에서 제공된다.

또한, 화합물 I을, 임의로 1종 이상의 다른 치료제와 함께 포함하는, 면역-관련 및 염증성 질환과 관련된 질환, 장애 및/또는 상태의 치료, 예방, 완화 및/또는 관리에 사용하기에 적합한 약학 조성물, 단일 단위 투여 형태, 및 키트가 본원에서 제공된다.

특정 실시양태에서, 화합물 I은 B 세포 및/또는 T 세포, 단핵구, 대식세포, 및 기타 림프구 또는 골수-유래 세포 타입의 활성을 비롯한 백혈구 활성의 조절제인 1종 이상의 치료제, 즉 약제와 조합되어 투여된다. 조합은 동시 투여뿐 아니라 순차적 투여도 포함한다.

6. 도면의 간단한 설명
도 1은 (S)-3-[4-(4-모르폴린-4-일메틸벤질옥시)-1-옥소-1,3-디하이드로-이소인도-2-일]피페리딘-2,6-디온이 형질모세포 및 활성화 B 세포 분화에 미치는 효과를 도시한다.
도 2는 (S)-3-[4-(4-모르폴린-4-일메틸벤질옥시)-1-옥소-1,3-디하이드로-이소인도-2-일]피페리딘-2,6-디온이 형질모세포 분화동안 세포 생존능에 미치는 효과를 도시한다.
도 3은 (S)-3-[4-(4-모르폴린-4-일메틸벤질옥시)-1-옥소-1,3-디하이드로-이소인도-2-일]피페리딘-2,6-디온이 B 및 형질 세포 전사 인자의 발현에 미치는 효과를 도시한다.
도 4는 (S)-3-[4-(4-모르폴린-4-일메틸벤질옥시)-1-옥소-1,3-디하이드로-이소인도-2-일]피페리딘-2,6-디온이 형질모세포 배양물에서 IgG 생성에 미치는 효과를 도시한다.
도 5A 및 5B는 (S)-3-[4-(4-모르폴린-4-일메틸벤질옥시)-1-옥소-1,3-디하이드로-이소인도-2-일]피페리딘-2,6-디온이 B 및 형질 세포 전사 인자의 발현에 미치는 효과를 도시한다.
도 6은 (S)-3-[4-(4-모르폴린-4-일메틸벤질옥시)-1-옥소-1,3-디하이드로-이소인도-2-일]피페리딘-2,6-디온이 B 세포 배양물에서 4, 7 및 10일째에 IgG 생성에 미치는 효과를 도시한다.
도 7은 (S)-3-[4-(4-모르폴린-4-일메틸벤질옥시)-1-옥소-1,3-디하이드로-이소인도-2-일]피페리딘-2,6-디온이 단독으로 및 프레드니솔론과 조합하여 시험관내-분화된 형질모세포/형질 세포에 의한 IgG 생성에 미치는 효과를 도시한다.
도 8은 (S)-3-[4-(4-모르폴린-4-일메틸벤질옥시)-1-옥소-1,3-디하이드로-이소인도-2-일]피페리딘-2,6-디온이 B 세포 분화동안 7일째에 CD20/CD38 발현에 미치는 효과를 도시한다.
도 9는 (S)-3-[4-(4-모르폴린-4-일메틸벤질옥시)-1-옥소-1,3-디하이드로-이소인도-2-일]피페리딘-2,6-디온이 형질모세포 분화동안 세포 생존능에 미치는 효과를 도시한다.
도 10은 (S)-3-[4-(4-모르폴린-4-일메틸벤질옥시)-1-옥소-1,3-디하이드로-이소인도-2-일]피페리딘-2,6-디온이 시험관내 SLE 환자 PBMC의 기능 및 B 세포 분화에 미치는 효과를 도시한다.
도 11A 및 11B는 (S)-3-[4-(4-모르폴린-4-일메틸벤질옥시)-1-옥소-1,3-디하이드로-이소인도-2-일]피페리딘-2,6-디온이 B 세포 배양물에서 7일째에 IgG 및 IgM 생성에 미치는 효과를 각각 도시한다.
도 12는 (S)-3-[4-(4-모르폴린-4-일메틸벤질옥시)-1-옥소-1,3-디하이드로-이소인도-2-일]피페리딘-2,6-디온이 CD19+ B 세포의 형질모세포/형질 세포로의 분화에 미치는 효과를 도시한다.
도 13은 정상 B 세포 분화 검정에 있어서 (S)-3-[4-(4-모르폴린-4-일메틸벤질옥시)-1-옥소-1,3-디하이드로-이소인도-2-일]피페리딘-2,6-디온이 대형 세포 집단(게이트 p2)에 미치는 효과를 도시한다.
도 14는 B 세포 분화 배양시 (S)-3-[4-(4-모르폴린-4-일메틸벤질옥시)-1-옥소-1,3-디하이드로-이소인도-2-일]피페리딘-2,6-디온이 형질 세포 전사 인자에 미치는 효과를 도시한다.
도 15A 내지 15E는 (S)-3-[4-(4-모르폴린-4-일메틸벤질옥시)-1-옥소-1,3-디하이드로-이소인도-2-일]피페리딘-2,6-디온(20 nM)이 7일 배양된 B 세포에서 형질 세포 전사 인자의 발현에 미치는 효과를 도시한다.
도 16은 (S)-3-[4-(4-모르폴린-4-일메틸벤질옥시)-1-옥소-1,3-디하이드로-이소인도-2-일]피페리딘-2,6-디온이 SLE 환자의 분화 PBMC 유래 CD38+ 형질모세포/형질 세포에서 전사 인자의 발현에 미치는 효과를 도시한다.
도 17은 (S)-3-[4-(4-모르폴린-4-일메틸벤질옥시)-1-옥소-1,3-디하이드로-이소인도-2-일]피페리딘-2,6-디온(도면에 화합물 I로서 표시)이 7일 B 세포 분화 배양에서 CD44 MFI에 미치는 효과를 도시한다.
도 18은 (S)-3-[4-(4-모르폴린-4-일메틸벤질옥시)-1-옥소-1,3-디하이드로-이소인도-2-일]피페리딘-2,6-디온이 7일 정상 B 세포 분화 검정에서 CD20^high/CD44^high세포에 미치는 효과를 도시한다.
도 19는 (S)-3-[4-(4-모르폴린-4-일메틸벤질옥시)-1-옥소-1,3-디하이드로-이소인도-2-일]피페리딘-2,6-디온(도면에 화합물 I로서 표시)이 4일 및 7일 B 세포 분화 배양에서 CD83+ 세포 및 발현에 미치는 효과를 도시한다.
도 20은 (S)-3-[4-(4-모르폴린-4-일메틸벤질옥시)-1-옥소-1,3-디하이드로-이소인도-2-일]피페리딘-2,6-디온(도면에 화합물 I로서 표시)이 B 세포 분화 배양중에 IgJ 쇄 발현에 미치는 효과를 도시한다.
도 21은 3-[4-(4-모르폴린-4-일메틸벤질옥시)-1-옥소-1,3-디하이드로-이소인도-2-일]피페리딘-2,6-디온이 항-CD3-자극 인간 T 세포에서의 특정 시토카인 및 케모카인의 생성에 미치는 효과를 도시한다(생성된 절대량으로 표시됨).
도 22는 3-[4-(4-모르폴린-4-일메틸벤질옥시)-1-옥소-1,3-디하이드로-이소인도-2-일]피페리딘-2,6-디온이 항-CD3-자극 인간 T 세포에서의 특정 시토카인 및 케모카인의 생성에 미치는 효과를 도시한다(대조군에 대한 백분율로서 표시됨).
도 23은 (R)-3-[4-(4-모르폴린-4-일메틸벤질옥시)-1-옥소-1,3-디하이드로-이소인도-2-일]피페리딘-2,6-디온이 항-CD3-자극 인간 T 세포에서의 특정 시토카인 및 케모카인의 생성에 미치는 효과를 도시한다(생성된 절대량으로 표시됨).
도 24는 (R)-3-[4-(4-모르폴린-4-일메틸벤질옥시)-1-옥소-1,3-디하이드로-이소인도-2-일]피페리딘-2,6-디온이 항-CD3-자극 인간 T 세포에서의 특정 시토카인 및 케모카인의 생성에 미치는 효과를 도시한다(대조군에 대한 백분율로서 표시됨).
도 25는 (S)-3-[4-(4-모르폴린-4-일메틸벤질옥시)-1-옥소-1,3-디하이드로-이소인도-2-일]피페리딘-2,6-디온이 항-CD3-자극 인간 T 세포에서의 특정 시토카인 및 케모카인의 생성에 미치는 효과를 도시한다(생성된 절대량으로 표시됨).
도 26은 (S)-3-[4-(4-모르폴린-4-일메틸벤질옥시)-1-옥소-1,3-디하이드로-이소인도-2-일]피페리딘-2,6-디온이 항-CD3-자극 인간 T 세포에서의 특정 시토카인 및 케모카인의 생성에 미치는 효과를 도시한다(대조군에 대한 백분율로서 표시됨).
도 27은 3-[4-(4-모르폴린-4-일메틸벤질옥시)-1-옥소-1,3-디하이드로-이소인도-2-일]피페리딘-2,6-디온에 의한 지질다당류-자극 말초 혈액 단핵 세포에서의 특정 시토카인 생성 및 케모카인 생성의 억제를 도시한다.
도 28은 3-[4-(4-모르폴린-4-일메틸벤질옥시)-1-옥소-1,3-디하이드로-이소인도-2-일]피페리딘-2,6-디온에 의한 지질다당류-자극 말초 혈액 단핵 세포에서의 특정 시토카인 생성 및 케모카인 생성의 증강을 도시한다.
도 29는 (R)-3-[4-(4-모르폴린-4-일메틸벤질옥시)-1-옥소-1,3-디하이드로-이소인도-2-일]피페리딘-2,6-디온에 의한 지질다당류-자극 말초 혈액 단핵 세포에서의 특정 시토카인 생성 및 케모카인 생성의 억제를 도시한다.
도 30은 (R)-3-[4-(4-모르폴린-4-일메틸벤질옥시)-1-옥소-1,3-디하이드로-이소인도-2-일]피페리딘-2,6-디온에 의한 지질다당류-자극 말초 혈액 단핵 세포에서의 특정 시토카인 생성 및 케모카인 생성의 증강을 도시한다.
도 31은 (S)-3-[4-(4-모르폴린-4-일메틸벤질옥시)-1-옥소-1,3-디하이드로-이소인도-2-일]피페리딘-2,6-디온에 의한 지질다당류-자극 말초 혈액 단핵 세포에서의 시토카인 생성 및 케모카인 생성의 억제를 도시한다.
도 32는 (S)-3-[4-(4-모르폴린-4-일메틸벤질옥시)-1-옥소-1,3-디하이드로-이소인도-2-일]피페리딘-2,6-디온에 의한 지질다당류-자극 말초 혈액 단핵 세포에서의 특정 시토카인 생성 및 케모카인 생성의 증강을 도시한다.
도 33은 3-[4-(4-모르폴린-4-일메틸벤질옥시)-1-옥소-1,3-디하이드로-이소인도-2-일]피페리딘-2,6-디온에 의한, 고정화 IgG 및 IL-2에 반응한 NK 세포 IFN-감마 생성의 증강을 도시한다(생성된 절대량으로 표시됨).
도 34는 (R)-3-[4-(4-모르폴린-4-일메틸벤질옥시)-1-옥소-1,3-디하이드로-이소인도-2-일]피페리딘-2,6-디온에 의한, 고정화 IgG 및 IL-2에 반응한 NK 세포 IFN-감마 생성의 증강을 도시한다(생성된 절대량으로 표시됨).
도 35는 (S)-3-[4-(4-모르폴린-4-일메틸벤질옥시)-1-옥소-1,3-디하이드로-이소인도-2-일]피페리딘-2,6-디온에 의한, 고정화 IgG 및 IL-2에 반응한 NK 세포 IFN-감마 생성의 증강을 도시한다(생성된 절대량으로 표시됨).
도 36은 3-[4-(4-모르폴린-4-일메틸벤질옥시)-1-옥소-1,3-디하이드로-이소인도-2-일]피페리딘-2,6-디온에 의한, 고정화 IgG 및 IL-2에 반응한 NK 세포 IFN-감마 생성의 증강을 도시한다(1 ㎛ 포말리도마이드의 존재하에 생성된 IFN-감마 양의 백분율로서 표시됨).
도 37은 (R)-3-[4-(4-모르폴린-4-일메틸벤질옥시)-1-옥소-1,3-디하이드로-이소인도-2-일]피페리딘-2,6-디온에 의한, 고정화 IgG 및 IL-2에 반응한 NK 세포 IFN-감마 생성의 증강을 도시한다(1 ㎛ 포말리도마이드의 존재하에 생성된 IFN-감마 양의 백분율로서 표시됨).
도 38은 (S)-3-[4-(4-모르폴린-4-일메틸벤질옥시)-1-옥소-1,3-디하이드로-이소인도-2-일]피페리딘-2,6-디온에 의한, 고정화 IgG 및 IL-2에 반응한 NK 세포 IFN-감마 생성의 증강을 도시한다(1 ㎛ 포말리도마이드의 존재하에 생성된 IFN-감마 양의 백분율로서 표시됨).
도 39는 본원에서 제공된 화합물이 성장 인자-유발성 인간 제혈관 내피 세포 증식에 미치는 효과를 도시한다.
도 40은 본원에서 제공된 화합물이 성장 인자-유발성 인간 제혈관 내피 세포관 형성에 미치는 효과를 도시한다.
도 41은 본원에서 제공된 화합물이 성장 인자-유발성 인간 제혈관 내피 세포 침입에 미치는 효과를 도시한다.
도 42는 (S)-3-[4-(4-모르폴린-4-일메틸벤질옥시)-1-옥소-1,3-디하이드로-이소인도-2-일]피페리딘-2,6-디온이 블레오마이신 진피 섬유증 마우스 모델에서 병변 피부의 진피 두께에 미치는 효과를 도시한다(염증 유발성 섬유증의 예방).
도 43은 블레오마이신 진피 섬유증 마우스 모델에서 병변 피부의 진피 두께를 보여주는, 헤마톡실린 및 에오신 염색된 피부 절편의 현미경 사진을 도시한다(염증 유발성 섬유증의 예방).
도 44는 (S)-3-[4-(4-모르폴린-4-일메틸벤질옥시)-1-옥소-1,3-디하이드로-이소인도-2-일]피페리딘-2,6-디온이 블레오마이신 진피 섬유증 마우스 모델에서 병변 피부중 알파-SMA + 근섬유모세포의 수에 미치는 효과를 도시한다(염증 유발성 섬유증의 예방).
도 45는 시험된 화합물이 블레오마이신 진피 섬유증 마우스 모델에서 병변 피부의 진피 두께에 미치는 효과를 도시한다(진행된 섬유증의 퇴행).
도 46은 블레오마이신 진피 섬유증 마우스 모델에서 병변 피부의 진피 두께를 보여주는, 헤마톡실린 및 에오신 염색된 피부 절편의 현미경 사진을 도시한다(진행된 섬유증의 퇴행).
도 47은 블레오마이신 진피 섬유증 마우스 모델에서 병변 피부중 알파-SMA + 근섬유모세포의 수에 미치는 효과를 도시한다(진행된 섬유증의 퇴행).
도 48A는 TSK-1 마우스에서 (S)-3-[4-(4-모르폴린-4-일메틸벤질옥시)-1-옥소-1,3-디하이드로-이소인도-2-일]피페리딘-2,6-디온에 의한 진피 두께의 감소를 도시한다.
도 48B는 TSK-1 마우스에서 (S)-3-[4-(4-모르폴린-4-일메틸벤질옥시)-1-옥소-1,3-디하이드로-이소인도-2-일]피페리딘-2,6-디온에 의한 상대적인 하이드록시프롤린 함량의 감소를 도시한다.
도 49A는 (S)-3-[4-(4-모르폴린-4-일메틸벤질옥시)-1-옥소-1,3-디하이드로-이소인도-2-일]피페리딘-2,6-디온에 의한 CTGF의 조절을 도시한다.
도 49B는 (S)-3-[4-(4-모르폴린-4-일메틸벤질옥시)-1-옥소-1,3-디하이드로-이소인도-2-일]피페리딘-2,6-디온에 의한 PAI-1의 조절을 도시한다.
도 49C는 (S)-3-[4-(4-모르폴린-4-일메틸벤질옥시)-1-옥소-1,3-디하이드로-이소인도-2-일]피페리딘-2,6-디온에 의한 COL1A의 조절을 도시한다.
도 49D는 (S)-3-[4-(4-모르폴린-4-일메틸벤질옥시)-1-옥소-1,3-디하이드로-이소인도-2-일]피페리딘-2,6-디온에 의한 aSMA의 조절을 도시한다.
도 49E는 (S)-3-[4-(4-모르폴린-4-일메틸벤질옥시)-1-옥소-1,3-디하이드로-이소인도-2-일]피페리딘-2,6-디온에 의한 CCMP의 조절을 도시한다.
도 49F는 (S)-3-[4-(4-모르폴린-4-일메틸벤질옥시)-1-옥소-1,3-디하이드로-이소인도-2-일]피페리딘-2,6-디온에 의한 TGFB1의 조절을 도시한다.
도 50은 (S)-3-[4-(4-모르폴린-4-일메틸벤질옥시)-1-옥소-1,3-디하이드로-이소인도-2-일]피페리딘-2,6-디온에 의한 COL1, aSMA 및 FN의 조절을 도시한다.
도 51은 (S)-3-[4-(4-모르폴린-4-일메틸벤질옥시)-1-옥소-1,3-디하이드로-이소인도-2-일]피페리딘-2,6-디온에 의한 MMP1 및 PAI의 조절을 도시한다.
도 52는 (S)-3-[4-(4-모르폴린-4-일메틸벤질옥시)-1-옥소-1,3-디하이드로-이소인도-2-일]피페리딘-2,6-디온에 의한 Dnmt1의 조절을 도시한다.
도 53은 정상 및 SSc 섬유모세포에서의 세레블론의 mRNA 발현 수준을 도시한다.
도 54는 정상 및 SSc 피부 조직에서의 세레블론의 mRNA 발현 수준을 도시한다.

7. 상세한 설명

달리 정의하지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술 용어 및 과학 용어는 당업자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 모든 특허, 출원, 공개 출원 및 기타 공보는 그 전문이 참고로 포함된다. 본원에서 한 용어에 대하여 여러 개의 정의가 있을 경우에, 달리 명시하지 않는 한, 본 섹션에서의 정의가 우선한다.

본원에서 사용된 용어 "치료하다", "치료하는" 및 "치료"는 별도의 언급이 없으면, 치료하는 질환 또는 질환과 관련된 증상 또는 상태의 중증도를 완화시키거나 경감시키는 것을 말한다.

본원에서 사용된 "예방하다", "예방" 및 상기 용어의 기타 형태는 질환 또는 장애 또는 특정 질환 또는 장애의 증상의 시작 또는 진행의 억제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 암의 가족력이 있는 대상체가 예방 치료법의 후보이다. 일반적으로, 암의 경우에, 용어 "예방하는"이란, 특히 암의 발병 위험이 있는 대상체에서 암의 징후 또는 증상의 시작 전에 약물을 투여하는 것을 말한다.

본원에서 사용된 용어 "관리하는"은 별도의 언급이 없으면, 특정 질환 또는 장애에 걸린 적이 있는 대상체에서 그러한 질환 또는 장애의 재발을 예방하고/하거나, 질환 또는 장애에 걸린 적이 있는 대상체가 관해기에 있는 기간을 연장하고/하거나, 대상체의 사망률을 감소시키고/시키거나, 관리하는 질환 또는 상태와 관련된 증상의 중증도 경감 또는 모면을 유지하는 것을 포함한다.

본원에서 사용된 "대상체"는 동물, 전형적으로 인간을 비롯한 포유동물을 의미한다. 본원에서 사용된 "환자"는 인간 대상체를 의미한다.

본원에서 사용된, 화합물의 "치료 유효량" 및 "유효량"이라는 용어는 별도로 기재되지 않는 한, 질환의 치료, 예방 및/또는 관리에서 치료학적 이점을 제공하고, 치료하는 질환 또는 장애와 관련된 하나 이상의 증상을 지연시키거나 최소화하기에 충분한 양을 말한다. 용어 "치료 유효량" 및 "유효량"은 전체 요법을 개선하거나, 질환 또는 장애의 증상 또는 원인을 경감시키거나 피하거나, 또는 또다른 치료제의 치료 효능을 증강시키는 양을 포함할 수 있다.

본원에서 사용된, 화합물의 "예방 유효량"이라는 용어는 별도로 기재되지 않는 한, 질환 또는 상태, 또는 질환 또는 상태와 관련된 하나 이상의 증상을 예방하거나, 또는 그의 재발을 예방하기에 충분한 양이다. 화합물의 예방 유효량은 질환의 예방에서 예방학적 이점을 제공하는, 단독의 또는 다른 제제와 조합된 치료제의 양을 의미한다. 용어 "예방 유효량"은 전체 예방법을 개선하거나 또는 또다른 예방 제제의 예방 효능을 증강시키는 양을 포함할 수 있다.

본원에서 사용된 용어 "약학적으로 허용되는 염"은 별도의 언급이 없으면, 비제한적으로 본원에서 제공된 화합물에 존재할 수 있는 산성기의 염을 포함한다. 특정한 산성 조건하에서, 화합물은 다양한 무기산 및 유기산과 각종 염을 형성할 수 있다. 이러한 염기성 화합물의 약학적으로 허용되는 염을 제조하기 위해 사용될 수 있는 산은 아세테이트, 벤젠술포네이트, 벤조에이트, 바이카보네이트, 바이타르트레이트, 브로마이드, 칼슘 에데테이트, 캄실레이트, 카보네이트, 클로라이드, 브로마이드, 아이오다이드, 시트레이트, 디하이드로클로라이드, 에데테이트, 에디실레이트, 에스톨레이트, 에실레이트, 푸마레이트, 글루셉테이트, 글루코네이트, 글루타메이트, 글리콜릴아르사닐레이트, 헥실레조르시네이트, 히드라바민, 하이드록시나프토에이트, 이세티오네이트, 락테이트, 락토비오네이트, 말레이트, 말리에이트, 만델레이트, 메탄술포네이트 (메실레이트), 메틸술페이트, 무스케이트, 납실레이트, 니트레이트, 판토테네이트, 포스페이트/디포스페이트, 폴리갈락투로네이트, 살리실레이트, 스테아레이트, 숙시네이트, 술페이트, 탄네이트, 타르트레이트, 테오클레이트, 트리에티오다이드, 및 파모에이트를 포함하나, 이들로 제한되지는 않는, 약리학적으로 허용되는 음이온을 포함하는 염을 형성하는 것들이다.

본원에서 사용된 용어 "수화물"은 별도의 언급이 없으면, 비공유 분자간 힘에 의해 결합된 화학량론적 또는 비-화학량론적 양의 물을 추가로 포함하는 본원에서 제공된 화합물 또는 그의 염을 의미한다. 수화물은 결정질 또는 비결정질일 수 있다.

본원에서 사용된 용어 "용매화물"은 별도의 언급이 없으면, 본원에서 제공된 화합물에 하나 이상의 용매 분자가 회합하여 형성된 용매화물을 의미한다. 용어 "용매화물"은 수화물 (예를 들어, 일수화물, 이수화물, 삼수화물, 사수화물 등)을 포함한다. 용매화물은 결정질 또는 비결정질일 수 있다.

본원에서 사용된, 용어 "입체이성질체"는 별도의 언급이 없으면, 본원에서 제공된, 모든 거울상이성질체적으로/입체이성질체적으로 순수한 화합물 및 거울상이성질체적으로/입체이성질체적으로 풍부화된 화합물을 포함한다.

본원에서 사용된 용어 "입체이성질체적으로 순수한" 또는 "거울상이성질체적으로 순수한"이란 별도의 언급이 없으면, 화합물이 1종의 입체이성질체를 포함하고 그의 반대 입체이성질체 또는 거울상이성질체는 실질적으로 존재하지 않음을 의미한다. 예를 들어, 화합물이 80%, 90%, 또는 95% 또는 그 초과의 1종의 입체이성질체 및 20%, 10%, 또는 5% 또는 그 미만의 반대 입체이성질체를 함유하는 경우에, 화합물은 입체이성질체적으로 또는 거울상이성질체적으로 순수하다. 특정의 경우에, 화합물이 특정 키랄 중심에 대하여 약 80% 이상의 ee (거울상이성질체적 과잉), 바람직하게는 90% 이상의 ee, 보다 바람직하게는 특정 키랄 중심에 대하여 95%의 ee인 경우에, 본원에서 제공된 화합물은 그러한 특정 키랄 중심에 대하여 광학 활성이거나 입체이성질체적으로/거울상이성질체적으로 순수한 (즉, 실질적으로 R-형 또는 실질적으로 S-형) 것으로 간주된다.

본원에서 사용된 용어 "입체이성질체적으로 풍부화된" 또는 "거울상이성질체적으로 풍부화된"이란 별도의 언급이 없으면, 본원에서 제공된 화합물의 라세미 혼합물 및 입체이성질체의 다른 혼합물을 포함한다 (예를 들어, R/S = 30/70, 35/65, 40/60, 45/55, 55/45, 60/40, 65/35 및 70/30).

용어 "공동-투여" 및 "~과 조합된"이란 2종 이상의 치료제 (예를 들어, 본원에서 제공된 화합물 I 또는 조성물 및 B 세포 및/또는 T 세포, 단핵구, 대식세포, 및 기타 림프구 또는 골수-유래 세포 타입의 활성을 비롯한 백혈구 활성의 또다른 조절제 또는 다른 활성제)를, 동시에, 함께, 또는 특정한 시한 없이 순차적으로 투여하는 것을 포함한다. 일 실시양태에서, 화합물 I 및 1종 이상의 다른 제제는 세포에서 또는 대상체의 신체에서 동시에 존재하거나, 또는 그의 생물학적 효과 또는 치료학적 효과를 동시에 발휘한다. 일 실시양태에서, 치료제(들)는 동일한 조성물 또는 단위 투여 형태에 존재한다. 또다른 실시양태에서, 치료제(들)는 별개의 조성물 또는 단위 투여 형태에 존재한다.

"B 세포"는 골수에서 성숙하는 림프구이며, 나이브(naive) B 세포, 기억 B 세포, 또는 이펙터(effector) B 세포 (형질 세포)를 포함한다. 본원에서, B 세포는 정상 또는 비악성 B 세포일 수 있다.

"T 세포"는 흉선에서 성숙하는 림프구이며, 헬퍼(helper) T 세포, 기억 T 세포, 및 세포독성 T 세포를 포함한다.

본원에서 사용된 "전체 생존기간"은 랜덤화했을 때부터 임의의 원인으로 인한 사망까지의 시간을 말하고, 전체 치료군(intent-to-treat population)에서 측정된다. 전체 생존기간은 랜덤 통제 연구에서 평가할 수 있다.

본원에서 사용된 "객관적 반응률"은 사전에 정해진 기간이 종료되었을 때 사전에 정해진 경피증 증상이 경감된 환자의 비율을 말한다. 반응 기간은 보통 초기 반응부터 공식적인 경피증 진행까지 측정된다.

본원에서 사용된 "진행까지의 시간"은 랜덤화했을 때부터 객관적인 경피증 진행까지의 시간을 의미한다. 특정 실시양태에서, 진행까지의 시간은 사망을 포함하지 않는다.

본원에서 사용된 "무진행 생존기간"은 랜덤화했을 때부터 객관적인 경피증 진행 또는 사망까지의 시간을 의미한다.

본원에서 사용된 "치료 실패까지의 시간"은 랜덤화했을 때부터, 질환 진행, 치료 독성 및 사망을 비롯한 임의의 원인으로 인한 치료 중단까지의 시간을 측정하는 임의의 종점(들)을 의미한다.

본원에서 사용된 "사망률"은 주어진 피험자군에서 사망자수의 척도를 의미한다.

본원에서 사용된 "호흡기계 사망률"은 급성 저산소증 또는 사망을 초래하는 다른 특정 호흡 부전, 예컨대 사망에 이르는 기계적 인공호흡을 필요로 하는 사건, 호흡 정지, 또는 사실상 호흡기 때문인 것으로 간주되는 대상체에서의 임의의 다른 사건으로 사망하는 환자를 의미한다.

본원에서 사용된 "호흡기계 입원"은 환자의 입원 기록 또는 다른 의학적 견해에 의해 공식화된 폐 부전 상태로 인해 입원하는 것을 의미한다.

본원에서 사용된 "수정 로드난(Rodnan) 피부 점수"는 진피 피부 두께를 평가하는, 점수 수치를 정하는 공인된 시스템을 의미한다.

본원에서 사용된 "피부 두께"는 듀로미터(durometer) 및 mRSS를 비롯한 다양한 기술을 사용하여 평가할 수 있는 경화 또는 경결된 피부를 의미한다.

본원에서 사용된 "피부 경결"은 경화되거나, 붉어지거나, 염증이 생기거나, 비후되거나, 또는 민감해진 피부를 의미한다.

본원에서 사용된 "피부과적 삶의 질 지수"는 경피증 환자의 피부 증상과 관련된 삶의 질의 평가를 의미한다.

본원에서 사용된 "폐 기능"은 노력성 호기 유량, 노력성 폐활량, FEV 25-75%, 폐용량 또는 폐활량의 임의의 측정치를 의미한다.

본원에서 사용된 "일산화탄소 확산능"은 폐포-모세관막을 통한 일산화탄소 흡수량의 평가를 의미한다. 이는 산소를 폐로부터 혈류로 전달하는 폐의 능력을 측정하는 것에 대한 대용물일 수 있다.

본원에서 사용된 "말러(Mahler) 호흡곤란 지수"는 숨가쁨(shortness of breath)의 임상학적 측정을 제공하는 척도를 의미한다.

본원에서 사용된 "세인트 조지(Saint George) 호흡기 설문 점수"는 폐 질환에 걸린 환자의 삶의 질을 측정하는 척도를 의미한다.

본원에서 사용된 "UCLA 경피증 임상 시험 컨소시움 위장관 점수"는 경피증(전신성 경화증)과 관련된 위장관 증상을 평가하기 위해 경피증 환자에게 실시된 설문을 의미한다.

본원에서 사용된 "혈류-매개 혈관확장"은 경피증 환자에서 혈관 내피 기능의 척도를 의미한다.

본원에서 사용된 "6분 보행 거리"는 경피증 환자가 6분 이내에 보행할 수 있는 거리의 평가 또는 정해진 시간 또는 거리 동안 보행할 수 있는 능력을 평가하는 임의의 정규화된 절차를 의미한다.

본원에서 사용된 포말리도마이드는 하기 화합물을 가리킨다.

7.1 화합물 I

특정 실시양태에서, 조합 요법을 비롯하여 본원에서 제공된 방법 및 본원에서 제공된 조성물에 사용하기 위한 화합물 I은 하기 화학식의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염, 용매화물, 수화물, 입체이성질체, 호변이성질체 또는 라세미 혼합물이다:

일 실시양태에서, 화합물은 3-[4-(4-모르폴린-4-일메틸-벤질옥시)-1-옥소-1,3-디하이드로-이소인돌-2-일]-피페리딘-2,6-디온, 3-[4-(4-모르폴린-4-일메틸벤질옥시)-1-옥소-1,3-디하이드로-이소인도-2-일]피페리딘-2,6-디온 하이드로클로라이드, (R)-3-[4-(4-모르폴린-4-일메틸벤질옥시)-1-옥소-1,3-디하이드로-이소인도-2-일]피페리딘-2,6-디온, (R)-3-[4-(4-모르폴린-4-일메틸벤질옥시)-1-옥소-1,3-디하이드로-이소인도-2-일]피페리딘-2,6-디온 하이드로클로라이드, (S)-3-[4-(4-모르폴린-4-일메틸벤질옥시)-1-옥소-1,3-디하이드로-이소인도-2-일]피페리딘-2,6-디온 및 (S)-3-[4-(4-모르폴린-4-일메틸벤질옥시)-1-옥소-1,3-디하이드로-이소인도-2-일]피페리딘-2,6-디온 하이드로클로라이드로부터 선택된다.

화합물 I 또는 그의 약학적으로 허용되는 염, 용매화물, 수화물, 입체이성질체, 호변이성질체 또는 라세미 혼합물은 당업자에게 공지된 방법, 예를 들어 미국 공개 제2011/0196150호에 개시된 절차에 따라 제조할 수 있으며, 상기 문헌은 그 전문이 본원에 참고로 원용된다.

예시적인 제조방법이 실시예 1에 기술되었다.

7.2 치료 방법

치료 유효량의 화합물 I 또는 그의 약학적으로 허용되는 염, 용매화물, 수화물, 입체이성질체, 호변이성질체 또는 라세미 혼합물을, 면역-관련 및 염증성 질환과 관련된 질환, 장애 및/또는 상태의 치료, 예방 및/또는 관리를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 면역-관련 및 염증성 질환과 관련된 질환, 장애 및/또는 상태의 치료, 예방 및/또는 관리 방법이 본원에서 제공된다. 특정 실시양태에서, 질환은 루푸스, 경피증, 쇼그렌 증후군, ANCA-유발성 혈관염, 항인지질 증후군 및 중증 근무력증으로부터 선택된다. 특정 실시양태에서, 질환은 루푸스 또는 경피증이다.

화합물 I 또는 그의 약학적으로 허용되는 염, 용매화물, 수화물, 입체이성질체, 호변이성질체 또는 라세미 혼합물의 감수성은, 비제한적으로 전신성 홍반성 루푸스의 MRL/MpJ-Faslpr/J 마우스 모델, 전신성 홍반성 루푸스의 NZBWF1/J 마우스 모델, 블레오마이신-유발성 피부 섬유증 모델, 및 뮤린 타이트 스킨(tight skin)-1 (Tsk-1) 마우스 모델을 비롯하여, 면역-관련 및 염증성 질환에 대하여 당업자에게 공지된 동물 모델을 포함하는 다양한 생체내 및 시험관내 검정에서 연구할 수 있다.

7.2.1 경피증의 치료

특정 실시양태에서, 치료 유효량의 화합물 I 또는 그의 약학적으로 허용되는 염, 용매화물, 수화물, 입체이성질체, 호변이성질체 또는 라세미 혼합물을 경피증 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 경피증 또는 그의 증상의 치료, 예방 및/또는 관리 방법이 본원에서 제공된다. 일 실시양태에서, 유효량의 (S)-3-[4-(4-모르폴린-4-일메틸벤질옥시)-1-옥소-1,3-디하이드로-이소인도-2-일]피페리딘-2,6-디온 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 투여하는 것을 포함하는, 경피증 또는 그의 증상의 치료, 예방 및/또는 관리 방법이 본원에서 제공된다.

특정 실시양태에서, 유효량의 화합물 I 또는 그의 약학적으로 허용되는 염, 용매화물, 수화물, 입체이성질체, 호변이성질체 또는 라세미 혼합물을 경피증의 발병 위험이 있는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 경피증 또는 그의 증상의 예방 방법이 본원에서 제공된다. 일 실시양태에서, 유효량의 (S)-3-[4-(4-모르폴린-4-일메틸벤질옥시)-1-옥소-1,3-디하이드로-이소인도-2-일]피페리딘-2,6-디온 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 투여하는 것을 포함하는, 경피증 또는 그의 증상의 예방 방법이 본원에서 제공된다.

특정 실시양태에서, 경피증은 국소성, 전신성, 제한성 또는 미만성 경피증이다.

특정 실시양태에서, 전신성 경피증은 CREST 증후군 (석회증, 레이노 증후군, 식도 기능이상 또는 운동장애, 수지경화증, 모세혈관확장증)을 포함한다. 경피증은 또한 전신성 경화증 또는 진행성 전신성 경화증이라고도 한다. 특정 실시양태에서, 레이노 질환 또는 증후군의 치료 또는 예방 방법이 본원에서 제공된다. 특정 실시양태에서, 전신성 경화증은 경피증 폐 질환, 경피증 신발증(renal crisis), 심장병 징후, 근력 약화 (피로 또는 제한성 CREST 포함), 위장관 운동장애 및 연축, 및 중추 신경계, 말초 신경계 및 자율 신경계의 이상 (수근관 증후군에 이어지는 삼차 신경병증 포함)을 포함한다. 전신성 경화증은 또한 우울증을 비롯한 일반적인 장애, 및 삶의 질에 미치는 영향을 포함한다.

특정 실시양태에서, 제한성 경피증은 손, 얼굴, 목 또는 이들의 조합으로 제한된다.

특정 실시양태에서, 미만성 경피증은 피부 조임을 포함하고, 또한 손목 (또는 팔꿈치) 위에서 발생한다. 특정 실시양태에서, 미만성 전신성 경화증은 내부 장기 섬유증을 포함하지만, 피부 조임은 없는 경피증 없는 전신성 경화증(sine scleroderma); 또는 가족성 진행성 전신성 경화증이다.

일 실시양태에서, 경피증은 소모성, 예컨대 질환-관련 소모성을 동반하지 않는다.

일 실시양태에서, 유효량의 화합물 I을, 경피증의 하기 증상 중 하나 이상의 경감, 억제 또는 예방을 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 경피증의 하기 증상 중 하나 이상의 경감, 억제 또는 예방 방법이 본원에서 제공된다: (i) 피부 (예를 들어, 사지, 예컨대 손, 얼굴 및 발)의 점진적인 경화, 비후, 및 조임; (ii) 피부 변색; (iii) 사지 무감각; (iv) 번들거리는 피부; (v) 백묵같이 하얀 유체로 분출되는 피부 표면 아래의 백색 소괴(small white lump); (vi) 레이노 식도 기능이상 (한랭 또는 감정적 스트레스에 노출시에 혈관의 연축에 의해 초래되는 손의 통증, 무감각 및/또는 색 변화); (vii) 모세혈관확장증 (예를 들어 손, 손바닥, 팔목, 얼굴 및 입술에서의 홍반점); (viii) 관절 통증 및/또는 강직; (ix) 손 및 발의 종창; (x) 피부 가려움증; (xi) 손가락의 강직화 및 컬링(curling); (xii) 특정 관절, 예컨대 손가락 관절 및 팔꿈치 바깥쪽의 궤양 (욕창); (xiii) 소화 장애, 예컨대 속쓰림, 연하 장애, 설사, 과민성 장, 및 변비; (xiv) 피로 및 허약; (xv) 숨가쁨; (xvi) 관절염; (xvii) 탈모; (xviii) 내부 장기 문제; (xix) 손발가락 궤양; 또는 (xx) 손발가락 자가절단.

특정 이론에 구애됨이 없이, 화합물 I 또는 그의 약학적으로 허용되는 염, 용매화물, 수화물, 입체이성질체, 호변이성질체 또는 라세미 혼합물은 Th1 면역 반응을 증강시키며, Th2 면역 반응을 억제하고, 이는 피부에서 항섬유화 효과를 초래할 수 있을 것으로 생각된다.

추가로, 유효량의 화합물 I 또는 그의 약학적으로 허용되는 염, 용매화물, 수화물, 입체이성질체, 호변이성질체 또는 라세미 혼합물을 경피증 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 경피증 환자의 피부 두께를 개선하거나 감소시키는 방법이 본원에서 제공된다. 일 실시양태에서, 피부 두께는 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90% 또는 그 초과의 값만큼 감소한다.

추가로, 유효량의 화합물 I 또는 그의 약학적으로 허용되는 염, 용매화물, 수화물, 입체이성질체, 호변이성질체 또는 라세미 혼합물을, 경피증과 관련된 하나 이상의 임상학적 종점의 달성을 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 경피증과 관련된 하나 이상의 임상학적 종점을 달성하는 방법이 본원에서 제공된다.

추가로, 유효량의 화합물 I 또는 그의 약학적으로 허용되는 염, 용매화물, 수화물, 입체이성질체, 호변이성질체 또는 라세미 혼합물을 경피증 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 경피증 환자의 전체 생존기간, 객관적 반응률, 진행까지의 시간, 무진행 생존기간 및/또는 치료 실패까지의 시간을 증가시키는 방법이 본원에서 제공된다.

추가로, 유효량의 화합물 I 또는 그의 약학적으로 허용되는 염, 용매화물, 수화물, 입체이성질체, 호변이성질체 또는 라세미 혼합물을 경피증 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 경피증 환자의 사망률, 호흡기계 사망률 및/또는 호흡기계 입원을 감소시키는 방법이 본원에서 제공된다.

추가로, 유효량의 화합물 I 또는 그의 약학적으로 허용되는 염, 용매화물, 수화물, 입체이성질체, 호변이성질체 또는 라세미 혼합물을 경피증 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 경피증 환자의 수정 로드난 피부 점수의 개선 방법이 본원에서 제공된다. 일 실시양태에서, 수정 로드난 피부 점수의 개선은 5, 10, 15 또는 20점 또는 그 초과의 값이다.

추가로, 유효량의 화합물 I 또는 그의 약학적으로 허용되는 염, 용매화물, 수화물, 입체이성질체, 호변이성질체 또는 라세미 혼합물을 경피증 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 경피증 환자의 피부 경결을 개선하거나 감소시키는 방법이 본원에서 제공된다.

추가로, 유효량의 화합물 I 또는 그의 약학적으로 허용되는 염, 용매화물, 수화물, 입체이성질체, 호변이성질체 또는 라세미 혼합물을 경피증 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 경피증 환자의 피부과적 삶의 질 지수의 개선 방법이 본원에서 제공된다.

추가로, 유효량의 화합물 I 또는 그의 약학적으로 허용되는 염, 용매화물, 수화물, 입체이성질체, 호변이성질체 또는 라세미 혼합물을 경피증 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 경피증 환자의 폐 기능 개선 방법이 본원에서 제공된다.

추가로, 유효량의 화합물 I 또는 그의 약학적으로 허용되는 염, 용매화물, 수화물, 입체이성질체, 호변이성질체 또는 라세미 혼합물을 경피증 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 경피증 환자의 일산화탄소 확산능의 향상 방법이 본원에서 제공된다. 일 실시양태에서, 환자의 일산화탄소 확산능은 폐의 일산화탄소 확산능 (D_Lco)이 약 10%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90% 또는 그 초과의 값으로 향상됨으로써 개선된다.

추가로, 유효량의 화합물 I 또는 그의 약학적으로 허용되는 염, 용매화물, 수화물, 입체이성질체, 호변이성질체 또는 라세미 혼합물을 경피증 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 경피증 환자의 말러 호흡곤란 지수의 개선 방법이 본원에서 제공된다. 일 실시양태에서, 말러 호흡곤란 지수의 개선은 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10점 또는 그 초과의 값이다.

추가로, 유효량의 화합물 I 또는 그의 약학적으로 허용되는 염, 용매화물, 수화물, 입체이성질체, 호변이성질체 또는 라세미 혼합물을 경피증 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 경피증 환자의 세인트 조지 호흡기 설문 점수의 개선 방법이 본원에서 제공된다. 일 실시양태에서, 세인트 조지 호흡기 설문 점수의 개선은 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52점 또는 그 초과의 값이다.

추가로, 유효량의 화합물 I 또는 그의 약학적으로 허용되는 염, 용매화물, 수화물, 입체이성질체, 호변이성질체 또는 라세미 혼합물을 경피증 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 경피증 환자의 UCLA 경피증 임상 시험 컨소시움 위장관 점수의 개선 방법이 본원에서 제공된다.

추가로, 유효량의 화합물 I 또는 그의 약학적으로 허용되는 염, 용매화물, 수화물, 입체이성질체, 호변이성질체 또는 라세미 혼합물을 경피증 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 경피증 환자 또는 경피증 환자군의 손발가락 궤양의 치료 또는 예방 방법이 본원에서 제공된다.

추가로, 유효량의 화합물 I 또는 그의 약학적으로 허용되는 염, 용매화물, 수화물, 입체이성질체, 호변이성질체 또는 라세미 혼합물을 경피증 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 경피증 환자의 혈류-매개 혈관확장의 개선 방법이 본원에서 제공된다.

추가로, 유효량의 화합물 I 또는 그의 약학적으로 허용되는 염, 용매화물, 수화물, 입체이성질체, 호변이성질체 또는 라세미 혼합물을 경피증 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 경피증 환자의 6분 보행 거리의 개선 또는 증가 방법이 본원에서 제공된다. 일 실시양태에서, 6분 보행 거리의 개선은 약 200 m, 약 250 m, 약 300 m, 약 350 m, 약 400 m 또는 그 초과의 값이다.

7.2.2 홍반성 루푸스의 치료

특정 실시양태에서, 치료 유효량의 화합물 I 또는 그의 약학적으로 허용되는 염, 용매화물, 수화물, 입체이성질체, 호변이성질체 또는 라세미 혼합물을 홍반성 루푸스 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 홍반성 루푸스 또는 그의 증상의 치료, 예방 및/또는 관리 방법이 본원에서 제공된다. 일 실시양태에서, 유효량의 (S)-3-[4-(4-모르폴린-4-일메틸벤질옥시)-1-옥소-1,3-디하이드로-이소인도-2-일]피페리딘-2,6-디온 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 홍반성 루푸스 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 홍반성 루푸스 또는 그의 증상의 치료, 예방 및/또는 관리 방법이 본원에서 제공된다.

일 실시양태에서, 유효량의 화합물 I 또는 그의 약학적으로 허용되는 염, 용매화물, 수화물, 입체이성질체, 호변이성질체 또는 라세미 혼합물을 홍반성 루푸스의 발병 위험이 있는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 홍반성 루푸스 또는 그의 증상의 예방 방법이 본원에서 제공된다. 일 실시양태에서, 유효량의 (S)-3-[4-(4-모르폴린-4-일메틸벤질옥시)-1-옥소-1,3-디하이드로-이소인도-2-일]피페리딘-2,6-디온 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 홍반성 루푸스 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 홍반성 루푸스 또는 그의 증상의 예방 방법이 본원에서 제공된다.

특정 실시양태에서, 전신성 홍반성 루푸스 (SLE), 피부 홍반성 루푸스 (CLE) 또는 약물-유발성 루푸스의 치료, 예방 및/또는 관리 방법이 본원에서 제공된다.

용어 "전신성 홍반성 루푸스"는 본원에서 SLE 및 루푸스와 혼용하여 사용되고, 당업계에 공지된 질환의 모든 징후 (관해기 및 발적 포함)를 말한다. SLE에서, B 림프구의 비정상적인 과활성 및 면역글로불린 감마 (IgG) 자가항체의 비정상적인 대량 생성이 핵심적인 역할을 한다. 이러한 병리학적 과정은 Ig-코팅된 세포의 격리 및 파괴, 보체 단백질의 고정 및 절단, 및 케모탁신, 혈관 작용성 펩티드 및 파괴 효소의 조직으로의 방출을 초래한다 (문헌 [Hahn BH. Systemic Lupus Erythematosus. In: Kasper DL, Braunwald E, Fauci AS, Hauser SL, Longo DL, Jameson, JL, editors. In: Harrison's Principles of Internal Medicine (16th edition). New York (US): McGraw-Hill; 2005. pp.1960-1967]).

SLE의 증상은 사람마다 다르며, 증상이 나타났다 사라졌다 할 수 있다. 대부분의 환자에서, 증상은 관절 통증 및 종창을 동반한다. 흔히 병에 걸리는 관절은 손가락, 손, 손목 및 무릎이다. 일부 환자는 관절염이 발생한다. 다른 일반적인 증상은 다음을 포함한다: 심호흡시 흉통, 피로, 다른 원인이 없는 발열, 전신 불편감, 불안감, 또는 반감 (불쾌감), 탈모, 구강염, 림프절 종창, 일광 과민증, 피부 발진 - 협부 및 콧대에 걸쳐서 "나비" 발진이 SLE에 걸린 사람들의 거의 절반에서 발생하고, 일부 환자는 발진이 일광하에서 악화되고, 발진이 또한 확산될 수 있다.

다른 증상은 병에 걸리는 신체 부위에 좌우되고, 하기를 포함할 수 있다.

뇌 및 신경계: 두통, 무감각, 자통, 발작, 시각 문제, 인격 변환,

소화관: 복통, 오심, 및 구토,

심장: 심장 박동 이상 (부정맥),

폐: 각혈 및 호흡 곤란, 및

피부: 고르지 않은 피부색, 한랭에 의해 색이 변화하는 손가락 (레이노 현상).

일부 환자는 피부 증상만을 갖는다. 이는 원판상 루푸스라 한다.

일 실시양태에서, 중등도, 중증, 또는 초중증 SLE의 치료 방법이 본원에서 제공된다. 본원에서 사용된 용어 "중증 SLE"는 환자가 하나 이상의 중증 또는 생명을 위협하는 증상 (예컨대, 용혈성 빈혈, 광범위한 심장 또는 폐 침습, 신장 질환, 또는 중추 신경계 침습)을 갖는 SLE 상태를 말한다.

추가로, 유효량의 화합물 I 또는 그의 약학적으로 허용되는 염, 용매화물, 수화물, 입체이성질체, 호변이성질체 또는 라세미 혼합물을, SLE와 관련된 하나 이상의 임상학적 종점의 달성을 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, SLE와 관련된 하나 이상의 임상학적 종점의 달성 방법이 본원에서 제공된다.

추가로, 유효량의 화합물 I 또는 그의 약학적으로 허용되는 염, 용매화물, 수화물, 입체이성질체, 호변이성질체 또는 라세미 혼합물을 SLE 환자에게 투여하는 것을 포함하는, SLE 환자의 전체 생존기간, 객관적 반응률, 진행까지의 시간, 무진행 생존기간 및/또는 치료 실패까지의 시간을 증가시키는 방법이 본원에서 제공된다.

특정 실시양태에서, 화합물 I 또는 그의 약학적으로 허용되는 염, 용매화물, 수화물, 입체이성질체, 호변이성질체 또는 라세미 혼합물은 일차 인간 기억 CD19+ B-세포의 형질모세포 단계로의 분화 억제제로서 작용한다. 특정 이론에 구애됨이 없이, 화합물 I 또는 그의 약학적으로 허용되는 염, 용매화물, 수화물, 입체이성질체, 호변이성질체 또는 라세미 혼합물은 세포를 미성숙 단계에서 차단함으로써, 고수준의 면역글로불린을 생성할 수 있는 형질모세포의 개수를 감소시키는 것으로 생각된다. 이러한 분화 배양에서 상기 작용의 기능면에서의 결과는 면역글로불린 G (IgG) 및 면역글로불린 M (IgM) 생성의 감소이다.

특정 실시양태에서, 화합물 I 또는 그의 약학적으로 허용되는 염, 용매화물, 수화물, 입체이성질체, 호변이성질체 또는 라세미 혼합물은 일차 인간 기억 CD19+ B-세포의 형질모세포 단계로의 분화 능력을 억제한다. 특정 실시양태에서, 화합물 I 또는 그의 약학적으로 허용되는 염, 용매화물, 수화물, 입체이성질체, 호변이성질체 또는 라세미 혼합물은 단기 배양에서 성숙 CD138+ 형질 세포에 유의한 영향을 미치지 않는다. 특정 실시양태에서, 화합물 I 또는 그의 약학적으로 허용되는 염, 용매화물, 수화물, 입체이성질체, 호변이성질체 또는 라세미 혼합물은 인터페론 조절 인자 4 (IRF4), 림프구-유발성 성숙 단백질 (BLIMP), X-box-단백질-1 (XBP-1) 및 B 세포 림프종 6 (Bcl6)을 비롯한 B 세포 분화 인자를 억제한다.

7.2.3 기타 면역-관련 질환 또는 장애의 치료

추가로, 화합물 I 또는 그의 약학적으로 허용되는 염, 용매화물, 수화물, 입체이성질체, 호변이성질체 또는 라세미 혼합물을 사용한 기타 면역-관련 질환 또는 상태의 치료, 관리 또는 예방 방법이 본원에서 제공된다. 일 실시양태에서, (S)-3-[4-(4-모르폴린-4-일메틸벤질옥시)-1-옥소-1,3-디하이드로-이소인도-2-일]피페리딘-2,6-디온 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 사용한, 기타 면역-관련 질환 또는 상태의 치료, 예방 또는 관리 방법이 본원에서 제공된다. 특정 실시양태에서, 예를 들어, 화합물 I 또는 그의 약학적으로 허용되는 염, 용매화물, 수화물, 입체이성질체, 호변이성질체 또는 라세미 혼합물을, 부적절하거나 바람직하지 않은 면역 반응에 의해 초래되거나 또는 그와 상관이 있는 질환 또는 장애, 예를 들어 면역억제에 의해 유리하게 치료될 수 있는 질환, 장애 또는 상태를 갖는 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 개체의 치료 방법이 본원에서 제공된다. 특정 실시양태에서, (S)-3-[4-(4-모르폴린-4-일메틸벤질옥시)-1-옥소-1,3-디하이드로-이소인도-2-일]피페리딘-2,6-디온 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을, 부적절하거나 바람직하지 않은 면역 반응에 의해 초래되거나 또는 그와 상관이 있는 질환 또는 장애, 예를 들어 면역억제에 의해 유리하게 치료될 수 있는 질환, 장애 또는 상태를 갖는 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 개체의 치료 방법이 본원에서 제공된다.

다양한 특정 실시양태에서, 상기 면역-관련 질환은 쇼그렌 증후군, ANCA-유발성 혈관염, 항인지질 증후군, 중증 근무력증, 애디슨병(Addison's disease), 원형 탈모증, 강직성 척추염, 항인지질 항체 증후군, 항인지질 증후군 (일차 또는 이차), 천식, 자가면역성 위염, 자가면역성 용혈성 빈혈, 자가면역성 간염, 자가면역성 내이 질환, 자가면역성 림프증식성 질환, 자가면역성 혈소판감소성 자반병, 발로병(Balo disease), 베체트병(Behcet's disease), 수포성 유천포창, 심근증, 셀리악병(celiac disease), 샤가스병(Chagas disease), 만성 염증성 탈수초성 다발성신경병증, 반흔성 유천포창 (예를 들어, 점막 유천포창), 한랭 응집소병, 데고스병(degos disease), 포진성 피부염, 원발성 혼합 한랭글로불린증, 굿파스튜어 증후군(Goodpasture's syndrome), 그라브병(Graves' disease), 길랑-바레 증후군(Guillain-Barre syndrome), 하시모토(Hashimoto) 갑상선염 (하시모토병; 자가면역성 갑상선염), 특발성 폐 섬유증, 특발성 혈소판감소성 자반병, IgA 신장병, 소아 관절염, 편평태선, 메니에르병(Meniere disease), 혼합 결합 조직병, 반상 경피증, 기면증, 신경근긴장증, 소아 자가면역성 신경정신 장애 (PANDA), 심상성 천포창, 악성 빈혈, 결절성 다발동맥염, 다발연골염, 류마티스성 다발성 근육통, 원발성 무감마글로불린증, 원발성 담즙성 간경변증, 레이노병 (레이노 현상), 라이터 증후군(Reiter's syndrome), 재발성 다발연골염, 류마티스성 발열, 쇼그렌 증후군, 전신근강직 증후군 (뫼르슈-볼트만 증후군(Moersch-Woltmann syndrome)), 다카야수(Takayasu) 동맥염, 측두 동맥염 (거대 세포 동맥염), 포도막염, 혈관염 (예를 들어, 홍반성 루푸스와 무관한 혈관염), 백반증, 및/또는 베게너(Wegener) 육아종증으로부터 선택되는 하나 이상이다.

7.2.4 신장 장애가 있는 환자의 치료

특정 실시양태에서, 신장 기능에 장애가 있는 환자에서의 질환을 치료, 예방 및/또는 관리하는 방법이 본원에서 제공된다. 특정 실시양태에서, 질환, 노화 또는 기타 환자 요인을 들 수 있으나 이들로 한정되지 않는 것에 기인한 신장 기능에 장애가 있는 환자에 대해 적절한 투여량의 조절을 제공하는 방법이 본원에서 제공된다.

특정 실시양태에서, 치료 유효량의 본원에서 제공하는 화합물을 신장 기능에 장애가 있는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 신장 기능에 장애가 있는 환자에게서 본원에서 제공하는 질환 또는 그의 증상의 치료, 예방 및/또는 관리 방법이 본원에서 제공된다. 일 실시양태에서, 치료 유효량의 (S)-3-[4-(4-모르폴린-4-일메틸벤질옥시)-1-옥소-1,3-디하이드로-이소인도-2-일]피페리딘-2,6-디온 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 신장 기능 장애 질환이 재발된 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 신장 기능에 장애가 있는 환자에게서 재발 질환 또는 그의 증상의 치료, 예방 및/또는 관리 방법이 본원에서 제공된다.

일 실시양태에서, 유효량의 본원에서 제공하는 화합물을 신장 기능에 장애의 재발의 위험이 있는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 신장 기능에 장애가 있는 환자에게서 재발의 예방 방법이 본원에서 제공된다. 일 실시양태에서, 유효량의 (S)-3-[4-(4-모르폴린-4-일메틸벤질옥시)-1-옥소-1,3-디하이드로-이소인도-2-일]피페리딘-2,6-디온 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 신장 기능에 장애의 재발의 위험이 있는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 신장 기능에 장애가 있는 환자에게서 재발의 예방 방법이 본원에서 제공된다.

본원에서 제공되는 모든 실시양태에서, 신장의 손상이 있는 환자가 치료되는 경우, 신장의 손상이 있는 환자는 포말리도마이드 또는 그의 대사물을 제거하는 능력이 저하되어 있기 때문에, 신장의 손상이 있는 환자에게 정상 환자 (예를 들어, 신장 장애가 없는 환자) 보다 더 낮은 용량의 화합물을 투여하는 것이 필요하다. 따라서 일 실시양태에서, 정상 환자에게 투여되는 용량보다 더 낮은 본원에서 제공되는 화합물의 용량으로 신장의 손상이 있는 환자를 치료하는 방법이 본원에서 제공된다.

특정 실시양태에서, 화합물의 치료 또는 예방 유효량은 약 0.005 내지 약 1,000 mg/일, 약 0.01 내지 약 500 mg/일, 약 0.01 내지 약 250 mg/일, 약 0.01 내지 약 100 mg/일, 약 0.1 내지 약 100 mg/일, 약 0.5 내지 약 100 mg/일, 약 1 내지 약 100 mg/일, 약 0.01 내지 약 50 mg/일, 약 0.1 내지 약 50 mg/일, 약 0.5 내지 약 50 mg/일, 약 1 내지 약 50 mg/일, 약 0.02 to 약 25 mg/일, 또는 약 0.05 내지 약 10 mg/일이다.

7.3 투여량 및 투약량

환자에게 투여되는 화합물 I 또는 그의 약학적으로 허용되는 염, 용매화물, 수화물, 입체이성질체, 호변이성질체 또는 라세미 혼합물의 용량은 매우 광범위하게 달라질 수 있으며, 의료인의 판단에 의해 결정될 수 있다. 화합물 I 또는 그의 약학적으로 허용되는 염, 용매화물, 수화물, 입체이성질체, 호변이성질체 또는 라세미 혼합물의 용량은 치료, 예방 또는 관리하고자 하는 특정 징후; 환자의 연령 및 상태; 및 사용되는 제2 활성제 (사용될 경우)의 양과 같은 인자에 따라 달라진다. 일반적으로, 화합물 I 또는 그의 약학적으로 허용되는 염, 용매화물, 수화물, 입체이성질체, 호변이성질체 또는 라세미 혼합물은 환자에서 약 0.005 mg/환자의 체중 (kg) 내지 약 10 mg/환자의 체중 (kg)의 용량으로 하루에 1 내지 4회 또는 그 초과의 횟수로 투여될 수 있지만, 상기 투여량은 환자의 연령, 체중 및 의학적 상태 및 투여 유형에 따라 적절히 달라질 수 있다. 일 실시양태에서, 용량은 약 0.01 mg/환자의 체중 (kg) 내지 약 5 mg/환자의 체중 (kg), 약 0.05　mg/환자의 체중 (kg) 내지 약 1 mg/환자의 체중 (kg), 약 0.1　mg/환자의 체중 (kg) 내지 약 0.75 mg/환자의 체중 (kg) 또는 약 0.25 mg/환자의 체중 (kg) 내지 약 0.5 mg/환자의 체중 (kg)이다.

일 실시양태에서, 하나의 용량이 하루에 제공된다. 임의의 주어진 경우에, 투여되는 화합물 I 또는 그의 약학적으로 허용되는 염, 용매화물, 수화물, 입체이성질체, 호변이성질체 또는 라세미 혼합물의 양은 활성 성분의 용해도, 사용 제형 및 투여 경로와 같은 인자에 따라 달라질 것이다. 일 실시양태에서, 국소 적용 농도는 약 0.01 내지 10 μM의 세포내 노출 또는 농도를 제공한다.

특정 실시양태에서, 화합물 I 또는 그의 약학적으로 허용되는 염, 용매화물, 수화물, 입체이성질체, 호변이성질체 또는 라세미 혼합물은 하루에 약 0.1 mg 내지 약 1000 mg의 양으로 사용되고, 통상적인 방식으로 (예를 들어, 치료, 예방 또는 관리 기간의 날마다 동일한 양이 투여됨), 순환 방식으로 (예를 들어, 1주의 투약, 1주의 휴약), 또는 치료, 예방 또는 관리 과정 동안에 증가하거나 감소하는 양으로 조정될 수 있다. 다른 실시양태에서, 용량은 약 1 mg 내지 약 300 mg, 약 0.1 mg 내지 약 150 mg, 약 1 mg 내지 약 200 mg, 약 10 mg 내지 약 100 mg, 약 0.1 mg 내지 약 50 mg, 약 1 mg 내지 약 50 mg, 약 10 mg 내지 약 50 mg, 약 20 mg 내지 약 30 mg, 또는 약 1 mg 내지 약 20 mg일 수 있다. 다른 실시양태에서, 용량은 약 0.1 mg 내지 약 100 mg, 약 0.1 mg 내지 약 50 mg, 약 0.1 mg 내지 약 25 mg, 약 0.1 mg 내지 약 20 mg, 약 0.1 mg 내지 약 15 mg, 약 0.1 mg 내지 약 10 mg, 약 0.1 mg 내지 약 7.5 mg, 약 0.1 mg 내지 약 5 mg, 약 0.1 mg 내지 약 4 mg, 약 0.1 mg 내지 약 3 mg, 약 0.1 mg 내지 약 2 mg, 또는 약 1 mg 내지 약 1 mg일 수 있다.

7.4 조합 요법

화합물 I 또는 그의 약학적으로 허용되는 염, 용매화물, 수화물, 입체이성질체, 호변이성질체 또는 라세미 혼합물은 본원에서 제공된 방법 및 조성물에서 다른 약리학적 활성 화합물 ("제2 활성제")과 조합될 수 있다. 특정 조합은 특정 유형의 질환 또는 장애, 및 그러한 질환 또는 장애와 관련된 상태 및 증상의 치료에서 상승적으로 작용할 수 있다. 화합물 I 또는 그의 약학적으로 허용되는 염, 용매화물, 수화물, 입체이성질체, 호변이성질체 또는 라세미 혼합물은 또한 특정 제2 활성제와 관련된 역효과를 완화시키는 작용을 할 수 있고, 그 반대의 경우도 있을 수 있다.

1종 이상의 제2 활성 성분 또는 활성제가 본원에서 제공된 방법 및 조성물에 사용될 수 있다. 제2 활성제는 거대 분자 (예를 들어, 단백질) 또는 소분자 (예를 들어, 합성 무기, 유기금속, 또는 유기 분자)일 수 있다.

또다른 실시양태에서, 본원에서 제공된 치료 방법은 제2 치료제의 투여를 포함하고, 여기서 제2 치료제는 항염증성 약물, 예를 들어 스테로이드성 항염증성 약물 또는 비스테로이드성 항염증성 약물 (NSAID), 아세트아미노펜, 나프록센, 이부프로펜, 아세틸살리실산 등이다. NSAID가 투여되는 보다 구체적인 실시양태에서, 양성자 펌프 억제제 (PPI), 예를 들어 오메프라졸이 또한 투여될 수 있다. 일 실시양태에서, 항염증제는 코르티코스테로이드이다. 또다른 실시양태에서, 항염증제는 콜히친이다.

또다른 실시양태에서, 제2 치료제는 면역조절 화합물 또는 면역억제 화합물, 예컨대 아자티오프린 (이무란(Imuran)™, 아자산(Azasan)™), 메토트렉세이트 (류마트렉스(Rheumatrex)™, 트렉살(Trexall)™), 페니실라민 (데펜(Depen)™, 쿠프리민(Cuprimine)™), 사이클로포스파미드 (시톡산(Cytoxan)™), 미코페날레이트 (셀셉트(CellCept)™, 미포르틱(Myfortic)™), 보센탄 (트라클리어(Tracleer)®), 프레드니손 (델타손(Deltasone)™, 리퀴드 프레드(Liquid Pred)™), 및 PDE5 억제제이다. 병에 걸린 개체가 손발가락 궤양 및 폐 고혈압을 갖는 또다른 실시양태에서, 혈관확장제, 예컨대 프로스타시클린 (일로프로스트(iloprost))이 투여될 수 있다.

또다른 실시양태에서, 제2 치료제는 HDAC 억제제, 예컨대 로미뎁신, 보리노스타트, 파노비노스타트, 발프로산, 또는 벨리노스타트; 또는 생물학적 약제, 예컨대 인터류킨, 면역조절 단일클론 항체, 또는 바실루스 칼메트 게렝(bacillus Calmette-Guerin)(BCG)이다.

또다른 실시양태에서, 제2 치료제는 ActRII 수용체의 억제제 또는 액티빈-ActRII 억제제이다. ActRII 수용체의 억제제는 ActRIIA 억제제 및 ActRIIB 억제제를 포함한다. ActRII 수용체의 억제제는 ActRII의 액티빈-결합 도메인을 포함하는 폴리펩티드일 수 있다. 특정 실시양태에서, 액티빈-결합 도메인을 포함하는 폴리펩티드는 항체의 Fc 부분에 연결된다 (즉, ActRII 수용체의 액티빈-결합 도메인을 포함하는 폴리펩티드 및 항체의 Fc 부분을 포함하는 접합체가 생성됨). 특정 실시양태에서, 액티빈-결합 도메인은 연결기, 예를 들어 펩티드 연결기를 통해 항체의 Fc 부분에 연결된다.

인간 Fc 도메인에 융합된 액티빈-결합 ActRIIA 폴리펩티드의 예가 서열 1에 제공된다.

서열 1

Fc 도메인에 융합된 ActRIIB의 가용성 세포외 도메인을 포함하는 융합 단백질의 예가 서열 2에 제공된다.

서열 2

액티빈 또는 ActRIIA 결합을 위해 선택되는 비-항체 단백질의 추가 예 및 그의 설계 및 선택 방법은 WO/2002/088171호, WO/2006/055689호, WO/2002/032925호, WO/2005/037989호, US 2003/0133939호, 및 US 2005/0238646호에서 찾아볼 수 있고, 상기 출원은 그 전문이 본원에 참고로 원용된다.

일 실시양태에서, ActRII 수용체의 억제제는 ACE-11이다. 또다른 실시양태에서, ActRII 수용체의 억제제는 ACE-536이다.

질환 또는 그의 증상의 치료에 적합한, 상기 치료제의 임의의 조합이 투여될 수 있다. 이러한 치료제는 화합물 I 또는 그의 약학적으로 허용되는 염, 용매화물, 수화물, 입체이성질체, 호변이성질체 또는 라세미 혼합물과 조합되어, 동시에 또는 별개의 치료 과정으로서 투여될 수 있다.

7.5 순환 요법

특정 실시양태에서, 본원에서 제공된 화합물 I 또는 그의 약학적으로 허용되는 염, 용매화물, 수화물, 입체이성질체, 호변이성질체 또는 라세미 혼합물은 환자에게 순환 방식으로 투여된다. 순환 요법은 일정 기간 동안 활성제를 투여한 후에, 일정 기간 동안 휴약기를 갖고 (즉, 투여 중단), 이러한 순차적 투여를 반복하는 것을 포함한다. 순환 요법은 하나 이상의 요법에 대한 내성 발생을 감소시키고/시키거나, 요법 중 하나의 부작용을 피하거나 감소시키고/시키거나, 치료의 효능을 개선할 수 있다.

그에 따라, 일 실시양태에서, 본원에서 제공된 화합물은 약 1주 또는 2주의 휴약기를 두고, 4 내지 6주의 주기로 매일 단일 용량 또는 분할 용량이 투여된다. 순환 요법은 또한 투약 주기의 빈도, 횟수 및 기간의 증가를 허용한다. 따라서, 또다른 실시양태는 본원에서 제공된 화합물이 단독 투여될 때 전형적인 주기보다 더 많은 주기 동안 그 화합물이 투여되는 것을 포함한다. 또다른 실시양태에서, 본원에서 제공된 화합물은 제2 활성제가 또한 투여되지 않는 환자에서 용량-제한 독성을 전형적으로 초래할 주기보다 더 많은 횟수의 주기 동안 투여된다.

일 실시양태에서, 본원에서 제공된 화합물은 1일 약 0.03 mg 내지 약 10 mg의 용량으로 3 또는 4주 동안 연속적으로 매일 투여된 후에, 1 또는 2주의 휴약기가 이어진다. 다른 실시양태에서, 용량은 약 0.1 mg 내지 약 8 mg, 약 0.3 mg 내지 약 6 mg, 약 1 mg 내지 약 4 mg, 또는 약 2 mg일 수 있고, 휴약기가 이어진다.

일 실시양태에서, 본원에서 제공된 화합물 및 제2 활성 성분은 경구 투여되고, 본원에서 제공된 화합물의 투여는 4 내지 6주의 주기 동안에 제2 활성 성분보다 30 내지 60분 전에 발생한다. 또다른 실시양태에서, 본원에서 제공된 화합물 및 제2 활성 성분의 조합은 매 주기마다 약 90분에 걸쳐 정맥내 주입에 의해 투여된다.

전형적으로, 조합 치료가 환자에게 실시되는 주기의 횟수는 약 1 내지 약 24주기, 약 2 내지 약 16주기, 또는 약 3 내지 약 4주기일 수 있다.

7.5 바이오마커

특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 다양한 질환 또는 장애의 치료를 위한 바이오마커가 본원에서 제공된다. 일 실시양태에서, 바이오마커는 B 세포의 표면에서 발견되는 분자인 분화-44의 클러스터 ("CD44")이다. 또다른 실시양태에서, 바이오마커는 B 세포의 표면에서 발견되는 분자인 분화-83의 클러스터 ("CD83")이다. 다른 실시양태에서, 바이오마커는 CD44 및 CD83의 조합이다.

본원에서 제공되는 단백질 바이오마커의 수준은 당업계에 공지된 임의의 방법으로 검출 또는 정량될 수 있다. 특정 실시양태에서, 항체-기반법이 채용된다. 특정 실시양태에서, 검출 또는 정량 방법은 면역블롯팅 (웨스턴 블롯), 효소-연결 면역흡수 분석 (ELISA), 면역조직화학, 유세포 계수법, 세포계수 비드 어레이, 또는 질량 분광학이다.

특정 실시양태에서, 검출 또는 정량 방법은 면역블롯팅 (웨스턴 블롯)이다. 특정 실시양태에서, 검출 또는 정량 방법은 효소-연결 면역흡수 분석 (ELISA)이다. 특정 실시양태에서, 검출 또는 정량 방법은 직접 ELISA이다. 특정 실시양태에서, 검출 또는 정량 방법은 간접 ELISA이다. 특정 실시양태에서, 검출 또는 정량 방법은 샌드위치 ELISA이다. 특정 실시양태에서, 검출 또는 정량 방법은 면역조직화학이다. 특정 실시양태에서, 검출 또는 정량 방법은 유세포 계수법이다. 특정 실시양태에서, 검출 또는 정량 방법은 세포계수 비드 어레이이다. 특정 실시양태에서, 검출 또는 정량 방법은 질량 분광학이다.

특정 실시양태는 치료 화합물로 질환, 장애, 또는 상태를 치료하는 것에 반응 가능성이 있는 대상체를 확인하는 방법을 포함한다. 특정 실시양태에서, 방법은 대상체 유래 생물학적 샘플내에 바이오마커의 수준을 결정하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 바이오마커는 CD44이다. 특정 실시양태에서, 바이오마커는 CD83이다.

특정 실시양태에서, 치료 화합물로 질환, 장애, 또는 상태를 치료하는 것에 반응 가능성이 있는 대상체를 확인하는 방법은 a) 대상체 유래 생물학적 샘플내에 CD44, CD83 또는 이들의 조합인 바이오마커의 수준을 결정하는 단계; 및 b) 대상체 유래 생물학적 샘플내의 바이오마커 수준을 바이오마커의 기준 수준과 비교하는 단계를 포함하고; 여기서 대상체 유래 생물학적 샘플내의 바이오마커 수준이 바이오마커의 기준 수준과 비교하여 변경되었다면 대상체는 치료에 대해 반응 가능성이 있다.

특정 실시양태에서, 치료 화합물로 질환, 장애, 또는 상태를 치료하는 것에 반응 가능성이 있는 대상체를 확인하는 방법은 a) 대상체 유래 생물학적 샘플내에 CD44, CD83 또는 이들의 조합인 바이오마커의 수준을 결정하는 단계; b) 대조 샘플내에 바이오마커의 수준을 결정하는 단계; 및 c) 대상체 유래 생물학적 샘플내의 바이오마커 수준을 대조 샘플내의 바이오마커 수준과 비교하는 단계를 포함하고; 여기서 대상체 유래 생물학적 샘플내의 바이오마커 수준이 대조 샘플내의 바이오마커 수준과 비교하여 변경되었다면, 대상체는 치료에 대해 반응 가능성이 있다.

특정 실시양태에서, 치료 화합물로 질환, 장애, 또는 상태를 치료하는 것에 반응 가능성이 있는 대상체를 확인하는 방법은 a) 대상체 유래 생물학적 샘플내에 CD83인 바이오마커의 수준을 결정하는 단계; 및 b) 대상체 유래 생물학적 샘플내의 바이오마커 수준을 바이오마커의 기준 수준과 비교하는 단계를 포함하고; 여기서 대상체 유래 생물학적 샘플내의 바이오마커 수준이 바이오마커의 기준 수준보다 더 높다면, 대상체는 치료에 대해 반응 가능성이 있다.

특정 실시양태에서, 치료 화합물로 질환, 장애, 또는 상태를 치료하는 것에 반응 가능성이 있는 대상체를 확인하는 방법은 a) 대상체 유래 생물학적 샘플내에 CD83인 바이오마커의 수준을 결정하는 단계; b) 대조 샘플내에 바이오마커의 수준을 결정하는 단계; 및 c) 대상체 유래 생물학적 샘플내의 바이오마커 수준을 대조 샘플내의 바이오마커 수준과 비교하는 단계를 포함하고; 여기서 대상체 유래 생물학적 샘플내의 바이오마커 수준이 대조 샘플내의 바이오마커 수준보다 더 높다면, 대상체는 치료에 대해 반응 가능성이 있다.

특정 실시양태에서, 치료 화합물로 질환, 장애, 또는 상태를 치료하는 것에 반응 가능성이 있는 대상체를 확인하는 방법은 a) 대상체 유래 생물학적 샘플내에 CD44인 바이오마커의 수준을 결정하는 단계; 및 b) 대상체 유래 생물학적 샘플내의 바이오마커 수준을 바이오마커의 기준 수준과 비교하는 단계를 포함하고; 여기서 대상체 유래 생물학적 샘플내의 바이오마커 수준이 바이오마커의 기준 수준보다 더 낮다면, 대상체는 치료에 대해 반응 가능성이 있다.

특정 실시양태에서, 치료 화합물로 질환, 장애, 또는 상태를 치료하는 것에 반응 가능성이 있는 대상체를 확인하는 방법은 a) 대상체 유래 생물학적 샘플내에 CD44인 바이오마커의 수준을 결정하는 단계; b) 대조 샘플내에 바이오마커의 수준을 결정하는 단계; 및 c) 대상체 유래 생물학적 샘플내의 바이오마커 수준을 대조 샘플내의 바이오마커 수준과 비교하는 단계를 포함하고; 여기서 대상체 유래 생물학적 샘플내의 바이오마커 수준이 대조 샘플내의 바이오마커 수준보다 더 낮다면, 대상체는 치료에 대해 반응 가능성이 있다.

특정 실시양태에서, 치료 화합물에 의한 질환, 장애, 또는 상태의 치료에 대해 대상체의 반응성을 예측하는 방법은 a) 대상체 유래 생물학적 샘플내에 CD44, CD83 또는 이들의 조합인 바이오마커의 수준을 결정하는 단계; 및 b) 생물학적 샘플내의 바이오마커 수준을 바이오마커의 기준 수준과 비교하는 단계를 포함하고; 여기서 대상체 유래 생물학적 샘플내의 바이오마커 수준과 바이오마커의 기준 수준 간의 차이는 치료에 대한 대상체의 반응성과 상관성이 있다.

특정 실시양태에서, 치료 화합물에 의한 질환, 장애, 또는 상태의 치료에 대해 대상체의 반응성을 예측하는 방법은 a) 대상체 유래 생물학적 샘플내에 CD44, CD83 또는 이들의 조합인 바이오마커의 수준을 결정하는 단계; b) 대조 샘플내에 바이오마커의 수준을 결정하는 단계; 및 c) 대상체 유래 생물학적 샘플내의 바이오마커 수준을 대조 샘플내의 바이오마커 수준과 비교하는 단계를 포함하고; 여기서 대상체 유래 생물학적 샘플내의 바이오마커 수준과 대조 샘플내의 바이오마커 수준 간의 차이는 치료에 대한 대상체의 반응성과 상관성이 있다.

특정 실시양태에서, 치료 화합물에 의한 질환, 장애, 또는 상태의 치료에 대해 대상체의 반응성을 예측하는 방법은 a) 대상체 유래 생물학적 샘플내에 CD83인 바이오마커의 수준을 결정하는 단계; 및 b) 생물학적 샘플내의 바이오마커 수준을 바이오마커의 기준 수준과 비교하는 단계를 포함하고, 여기서 바이오마커의 기준 수준과 비교하여 대상체 유래 생물학적 샘플내 바이오마커의 수준 증가는 치료에 대한 대상체의 반응성 증가와 상관성이 있다.

특정 실시양태에서, 치료 화합물에 의한 질환, 장애, 또는 상태의 치료에 대해 대상체의 반응성을 예측하는 방법은 a) 대상체 유래 생물학적 샘플내에 CD83인 바이오마커의 수준을 결정하는 단계; b) 대조 샘플내에 바이오마커의 수준을 결정하는 단계; 및 c) 대상체 유래 생물학적 샘플내의 바이오마커 수준을 대조 샘플내의 바이오마커 수준과 비교하는 단계를 포함하고; 여기서 대조 샘플내의 바이오마커 수준과 비교하여 대상체 유래 생물학적 샘플내 바이오마커의 수준 증가는 치료에 대한 대상체의 반응성 증가와 상관성이 있다.

특정 실시양태에서, 치료 화합물에 의한 질환, 장애, 또는 상태의 치료에 대해 대상체의 반응성을 예측하는 방법은 a) 대상체 유래 생물학적 샘플내에 CD44인 바이오마커의 수준을 결정하는 단계; 및 b) 생물학적 샘플내의 바이오마커 수준을 바이오마커의 기준 수준과 비교하는 단계를 포함하고, 여기서 바이오마커의 기준 수준과 비교하여 대상체 유래 생물학적 샘플내 바이오마커의 수준 감소는 치료에 대한 대상체의 반응성 증가와 상관성이 있다.

특정 실시양태에서, 치료 화합물에 의한 질환, 장애, 또는 상태의 치료에 대해 대상체의 반응성을 예측하는 방법은 a) 대상체 유래 생물학적 샘플내에 CD44인 바이오마커의 수준을 결정하는 단계; b) 대조 샘플내에 바이오마커의 수준을 결정하는 단계; 및 c) 대상체 유래 생물학적 샘플내의 바이오마커 수준을 대조 샘플내의 바이오마커 수준과 비교하는 단계를 포함하고; 여기서 대조 샘플내의 바이오마커 수준과 비교하여 대상체 유래 생물학적 샘플내 바이오마커의 수준 감소는 치료에 대한 대상체의 반응성 증가와 상관성이 있다.

특정 실시양태에서, 화합물로 처리된 대상체에서 질환, 장애, 또는 상태의 치료 효능을 관찰하는 방법은 a) 대상체로부터 제1 생물학적 샘플을 수득하는 단계; b) 제1 생물학적 샘플내에 CD 44, CD83 또는 이들의 조합인 바이오마커의 수준을 결정하는 단계; c) 치료 화합물을 대상체에게 투여하는 단계; d) 그후 대상체로부터 제2 생물학적 샘플을 수득하는 단계; e) 제2 생물학적 샘플내에 바이오마커의 수준을 결정하는 단계; 및 f) 제1 및 제2 생물학적 샘플내에 바이오마커의 수준을 비교하는 단계를 포함하고; 여기서 대상체의 제2 생물학적 샘플내 바이오마커의 수준이 대상체의 제1 생물학적 샘플내 바이오마커의 수준과 비교하여 변경되었다면, 대상체는 치료에 반응성이다.

특정 실시양태에서, 화합물로 처리된 대상체에서 질환, 장애, 또는 상태의 치료 효능을 관찰하는 방법은 a) 대상체로부터 제1 생물학적 샘플을 수득하는 단계; b) 제1 생물학적 샘플내에 CD83인 바이오마커의 수준을 결정하는 단계; c) 치료 화합물을 대상체에게 투여하는 단계; d) 그후 대상체로부터 제2 생물학적 샘플을 수득하는 단계; e) 제2 생물학적 샘플내에 바이오마커의 수준을 결정하는 단계, 및 f) 제1 및 제2 생물학적 샘플내에 바이오마커의 수준을 비교하는 단계를 포함하고; 여기서 대상체의 제2 생물학적 샘플내 바이오마커의 수준이 대상체의 제1 생물학적 샘플내 바이오마커의 수준보다 더 높다면, 대상체는 치료에 반응성이다.

특정 실시양태에서, 화합물로 처리된 대상체에서 질환, 장애, 또는 상태의 치료 효능을 관찰하는 방법은 a) 대상체로부터 제1 생물학적 샘플을 수득하는 단계; b) 제1 생물학적 샘플내에 CD44인 바이오마커의 수준을 결정하는 단계; c) 치료 화합물을 대상체에게 투여하는 단계; d) 그후 대상체로부터 제2 생물학적 샘플을 수득하는 단계; e) 제2 생물학적 샘플내에 바이오마커의 수준을 결정하는 단계, 및 f) 제1 및 제2 생물학적 샘플내에 바이오마커의 수준을 비교하는 단계를 포함하고; 여기서 대상체의 제2 생물학적 샘플내 바이오마커의 수준이 대상체의 제1 생물학적 샘플내 바이오마커의 수준보다 더 낮으면, 대상체는 치료에 반응성이다

특정 실시양태에서, 치료 화합물에 의한 질환, 장애, 또는 상태의 치료시 대상체의 순응성을 관찰하는 방법은 a) 대상체로부터 생물학적 샘플을 수득하는 단계; b) 생물학적 샘플내에 CD44, CD83 또는 이들의 조합인 바이오마커의 수준을 결정하는 단계; 및 c) 상기 바이오마커의 수준을 대상체 유래 비처리 대조 샘플내의 바이오마커 수준과 비교하는 단계를 포함하고; 여기서 대조 샘플내의 바이오마커 수준과 비교하여 생물학적 샘플내의 바이오마커 수준이 변하였다면 대상체는 치료에 순응성을 나타낸다.

특정 실시양태에서, 치료 화합물에 의한 질환, 장애, 또는 상태의 치료시 대상체의 순응성을 관찰하는 방법은 a) 대상체로부터 생물학적 샘플을 수득하는 단계; b) 생물학적 샘플내에 CD83인 바이오마커의 수준을 결정하는 단계; 및 c) 상기 바이오마커의 수준을 대상체 유래 비처리 대조 샘플내의 바이오마커 수준과 비교하는 단계를 포함하고; 여기서 대조 샘플내의 바이오마커 수준과 비교하여 생물학적 샘플내의 바이오마커 수준이 증가하였다면 대상체는 치료에 순응성을 나타낸다.

특정 실시양태에서, 치료 화합물에 의한 질환, 장애, 또는 상태의 치료시 대상체의 순응성을 관찰하는 방법은 a) 대상체로부터 생물학적 샘플을 수득하는 단계; b) 생물학적 샘플내에 CD44인 바이오마커의 수준을 결정하는 단계; 및 c) 상기 바이오마커의 수준을 대상체 유래 비처리 대조 샘플내의 바이오마커 수준과 비교하는 단계를 포함하고; 여기서 대조 샘플내의 바이오마커 수준과 비교하여 생물학적 샘플내의 바이오마커 수준이 감소하였다면 대상체는 치료에 순응성을 나타낸다.

특정 실시양태에서, 치료 화합물은 면역조절 화합물이다. 특정 실시양태에서, 치료 화합물은 3-[4-(4-모르폴린-4-일메틸-벤질옥시)-1-옥소-1,3-디하이드로-이소인돌-2-일]-피페리딘-2,6-디온 하이드로클로라이드, 또는 그의 약학적으로 허용되는 염, 용매화물, 수화물, 입체이성질체, 호변이성질체 또는 라세미 혼합물이다. 일 실시양태에서, 화합물은 (S)-3-[4-(4-모르폴린-4-일메틸-벤질옥시)-1-옥소-1,3-디하이드로-이소인돌-2-일]-피페리딘-2,6-디온, 또는 그의 약학적으로 허용되는 염, 용매화물 또는 수화물이다

7.6 약학 조성물 및 투여 형태

약학 조성물이 개개의 단일 단위 투여 형태의 제조에 사용될 수 있다. 본원에서 제공된 약학 조성물 및 투여 형태는 본원에서 제공된 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염, 용매화물, 수화물, 입체이성질체, 라세미체, 클라트레이트, 또는 전구약물을 포함한다. 약학 조성물 및 투여 형태는 1종 이상의 부형제를 추가로 포함할 수 있다.

본원에서 제공된 약학 조성물 및 투여 형태는 또한 1종 이상의 추가 활성 성분을 포함할 수 있다. 임의적인 제2, 또는 추가의 활성 성분의 예는 상기에 기재되어 있다.

본원에서 제공된 단일 단위 투여 형태는 환자에게 경구, 점막 (예를 들어, 비내, 설하, 질, 협측, 또는 직장), 비경구 (예를 들어, 피하, 정맥내, 볼루스 주사(bolus injection), 근육내, 또는 동맥내), 국소 (예를 들어, 점안액제 또는 다른 안과 제제), 경피 또는 피부통과 투여하기에 적합하다. 투여 형태의 예에는 정제; 캐플릿제(caplet); 캡슐제, 예컨대 연질 탄성 젤라틴 캡슐제; 사셰제(cachet); 트로키제(troche); 로젠지제(lozenge); 분산액제; 좌제; 분말제; 에어로졸제 (예를 들어, 비내 스프레이 또는 흡입기); 겔제; 현탁액제 (예를 들어, 수성 또는 비수성 액체 현탁액제, 수중유 에멀젼제, 또는 유중수 액체 에멀젼제), 용액제, 및 엘릭시르제(elixir)를 비롯한 환자에게 경구 또는 점막 투여하기에 적합한 액체 투여 형태; 환자에게 비경구 투여하기에 적합한 액체 투여 형태; 국소 투여에 적합한 점안액제 또는 다른 안과 제제; 및 재구성하여 환자에게 비경구 투여하기에 적합한 액체 투여 형태를 제공할 수 있는 멸균 고체 (예를 들어, 결정질 또는 무정형 고체)가 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다.

투여 형태의 조성, 형상 및 유형은 전형적으로 그의 용도에 따라 달라질 것이다. 예를 들어, 질환의 급성 치료에서 사용되는 투여 형태는 그에 포함되는 활성 성분 중 1종 이상을, 동일 질환의 만성 치료에서 사용되는 투여 형태보다 더 많은 양으로 함유할 수 있다. 마찬가지로, 비경구 투여 형태는 그에 포함되는 활성 성분 중 1종 이상을, 동일한 질환을 치료하는 데에 사용되는 경구 투여 형태보다 더 적은 양으로 함유할 수 있다. 사용되는 특정한 투여 형태가 서로 달라지는 상기 방법 및 기타 방법은 당업자에게 자명할 것이다. 예를 들어, 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 20^th ed., Mack Publishing, Easton PA (2000)]을 참조한다.

일 실시양태에서, 약학 조성물 및 투여 형태는 1종 이상의 부형제를 포함한다. 적합한 부형제는 조제 업계의 숙련자에게 주지이고, 적합한 부형제의 비제한적 예가 본원에서 제공된다. 특정 부형제가 약학 조성물 또는 투여 형태에 도입하기에 적합한지의 여부는, 비제한적으로 투여 형태가 환자에게 투여될 방법을 비롯하여, 당업계에 널리 공지된 다양한 인자에 따라 달라진다. 예를 들어, 경구 투여 형태, 예컨대 정제는 비경구 투여 형태를 위해 사용하기에 적합치 않은 부형제를 함유할 수 있다. 특정 부형제의 적합성은 또한 투여 형태의 특정 활성 성분에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 일부 활성 성분의 분해가 일부 부형제, 예컨대 락토스에 의해 또는 물에 노출되었을 때 촉진될 수 있다. 1급 또는 2급 아민을 포함하는 활성 성분이 특히 이러한 분해 촉진에 취약하다. 그에 따라, 락토스, 다른 단당류 또는 이당류를, 함유하더라도, 매우 소량 함유하는 약학 조성물 및 투여 형태가 제공된다. 본원에서 사용된 용어 "락토스-무함유"란, 락토스가 존재하더라도, 존재하는 락토스의 양이 활성 성분의 분해 속도를 실질적으로 증가시키기에는 불충분함을 의미한다.

락토스-무함유 조성물은 당업계에 주지인 부형제를 포함할 수 있고, 예를 들어 미국 약전 (USP) 25-NF20 (2002)에 나열되어 있다. 일반적으로, 락토스-무함유 조성물은 활성 성분, 결합제/충전제, 및 윤활제를 약학상 적합하고 약학적으로 허용되는 양으로 포함한다. 일 실시양태에서, 락토스-무함유 투여 형태는 활성 성분, 미정질 셀룰로스, 호화 전분, 및 마그네슘 스테아레이트를 포함한다.

또한, 물이 일부 화합물의 분해를 촉진할 수 있기 때문에, 활성 성분을 포함하는 무수성 약학 조성물 및 투여 형태가 제공된다. 예를 들어, 물의 첨가 (예를 들어, 5%)는 시간 경과에 따른 제형의 보관 수명 또는 안정성과 같은 특성을 결정하기 위해 장기 보관을 모의하는 수단으로서 약학 업계에서 널리 용인되고 있다. 예를 들어, 문헌 [Jens T. Carstensen, Drug Stability: Principles & Practice, 2d. Ed., Marcel Dekker, NY, NY, 1995, pp. 379-80]을 참조한다. 실제로, 물 및 열은 일부 화합물의 분해를 촉진한다. 따라서, 수분 및/또는 습도가 제형의 제조, 관리, 포장, 보관, 운송, 및 사용 동안에 일반적으로 직면하게 되므로, 물이 제형에 미치는 영향은 매우 중요할 수 있다.

무수성 약학 조성물 및 투여 형태는 무수성 또는 저수분 함유 성분 및 저수분 또는 저습도 조건을 사용하여 제조할 수 있다. 락토스 및 1급 또는 2급 아민을 포함하는 1종 이상의 활성 성분을 포함하는 약학 조성물 및 투여 형태는, 제조, 포장, 및/또는 보관 동안에 수분 및/또는 습도와의 실질적인 접촉이 예상된다면 무수성이다.

무수성 약학 조성물은 그의 무수 특성이 유지되도록 제조하고 보관되어야 한다. 따라서, 일 실시양태에서, 무수성 조성물을 물에의 노출을 방지하는 것으로 공지된 재료를 사용하여 포장함으로써, 적합한 방식의 키트에 포함될 수 있도록 한다. 적합한 포장재의 예에는 밀봉형 호일, 플라스틱, 단위 용량 용기 (예를 들어, 바이알), 블리스터팩(blister pack), 및 스트립팩(strip pack)이 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다.

또한, 활성 성분의 분해 속도를 감소시키는 1종 이상의 화합물을 포함하는 약학 조성물 및 투여 형태가 제공된다. 본원에서 "안정화제"로 칭해지는 이러한 화합물에는 산화방지제, 예컨대 아스코르브산, pH 완충액, 또는 염 완충액이 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다.

부형제의 양 및 유형과 마찬가지로, 투여 형태에서 활성 성분의 양 및 특정 유형은, 비제한적으로 투여 형태가 환자에게 투여되는 경로와 같은 인자에 따라 달라질 수 있다. 일 실시양태에서, 투여 형태는 본원에서 제공된 화합물을 약 0.10 내지 약 500 mg의 양으로 포함한다. 다른 실시양태에서, 투여 형태는 본원에서 제공된 화합물을 약 0.1, 1, 2, 5, 7.5, 10, 12.5, 15, 17.5, 20, 25, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 또는 500 mg의 양으로 포함한다.

다른 실시양태에서, 투여 형태는 제2 활성 성분을 1 내지 약 1000 mg, 약 5 내지 약 500 mg, 약 10 내지 약 350 mg, 또는 약 50 내지 약 200 mg의 양으로 포함한다. 물론, 제2 활성제의 특정량은 사용되는 특정 제제, 치료 또는 관리하는 질환 또는 장애, 및 본원에서 제공된 화합물, 및 환자에게 함께 투여되는 임의적인 추가 활성제의 양(들)에 따라 달라질 것이다.

6.6.1 경구 투여 형태

경구 투여에 적합한 약학 조성물은 별개의 투여 형태, 예컨대 비제한적으로 정제 (예를 들어, 저작 정제), 캐플릿제, 캡슐제, 및 액제 (예를 들어, 가향 시럽제)로서 제공될 수 있다. 이러한 투여 형태는 소정량의 활성 성분을 함유하고, 당업자에게 널리 공지된 조제 방법으로 제조할 수 있다. 일반적으로, 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 20th ed., Mack Publishing, Easton PA (2000)]을 참조한다.

본원에서 제공된 경구 투여 형태는 활성 성분을 통상적인 약학 컴파운딩 기술에 따라 1종 이상의 부형제와의 친밀 혼합물로 조합함으로써 제조된다. 부형제는 투여에 바람직한 제제의 형태에 따라 다양한 형태를 취할 수 있다. 예를 들어, 경구 액제 또는 에어로졸제 투여 형태에 사용하기에 적합한 부형제에는 물, 글리콜, 오일, 알콜, 향미제, 보존제, 및 착색제가 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다. 고체 경구 투여 형태 (예를 들어, 분말제, 정제, 캡슐제, 및 캐플릿제)에 사용하기에 적합한 부형제의 예에는 전분, 당, 미정질 셀룰로스, 희석제, 과립화제, 윤활제, 결합제, 및 붕해제가 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다.

일 실시양태에서, 경구 투여 형태는 정제 또는 캡슐제이고, 이 경우에 고체 부형제가 사용된다. 또다른 실시양태에서, 정제는 표준 수성 또는 비수성 기술로 코팅될 수 있다. 이러한 투여 형태는 임의의 조제 방법으로 제조할 수 있다. 일반적으로, 약학 조성물 및 투여 형태는 활성 성분을 액체 담체, 미분 고체 담체, 또는 이 둘 다와 균일하고 친밀하게 혼합한 다음, 생성물을 필요에 따라 목적하는 형태로 성형함으로써 제조된다.

예를 들어, 정제는 압축 또는 성형에 의해 제조할 수 있다. 압축 정제는, 유동이 자유로운 형태, 예컨대 분말 또는 과립 형태의 활성 성분을, 임의로 부형제와 혼합하여 적합한 기기에서 압축함으로써 제조할 수 있다. 성형 정제는 비활성 액체 희석제로 습윤화된 분말 화합물의 혼합물을 적합한 기기에서 성형함으로써 제조할 수 있다.

본원에서 제공된 경구 투여 형태에 사용될 수 있는 부형제의 예에는 결합제, 충전제, 붕해제, 및 윤활제가 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다. 약학 조성물 및 투여 형태에 사용하기에 적합한 결합제에는 옥수수 전분, 감자 전분, 또는 다른 전분, 젤라틴, 천연 및 합성 검, 예컨대 아카시아, 나트륨 알기네이트, 알긴산, 다른 알기네이트, 분말 트래거캔스(tragacanth), 구아검(guar gum), 셀룰로스 및 그의 유도체 (예를 들어, 에틸 셀룰로스, 셀룰로스 아세테이트, 카복시메틸 셀룰로스 칼슘, 나트륨 카복시메틸 셀룰로스), 폴리비닐 피롤리돈, 메틸 셀룰로스, 호화 전분, 하이드록시프로필 메틸 셀룰로스 (예를 들어, No. 2208, 2906, 2910), 미정질 셀룰로스, 및 이들의 혼합물이 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다.

미정질 셀룰로스의 적합한 형태에는 아비셀(AVICEL)-PH-101, 아비셀-PH-103, 아비셀 RC-581, 아비셀-PH-105 (FMC 코포레이션, 아메리칸 비스코스 디비전(American Viscose Division), 아비셀 세일즈(Avicel Sales) (미국 펜실베니아주 마르쿠스훅)로부터 입수가능함)로서 판매되는 물질 및 이들의 혼합물이 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다. 한 특정 결합제는 아비셀 RC-581로서 판매되는, 미정질 셀룰로스와 나트륨 카복시메틸 셀룰로스의 혼합물이다. 적합한 무수성 또는 저수분 부형제 또는 첨가제에는 아비셀-PH-103™ 및 스타치(Starch) 1500 LM이 포함된다.

본원에서 제공된 약학 조성물 및 투여 형태에 사용하기에 적합한 충전제의 예에는 탈크, 탄산칼슘 (예를 들어, 과립 또는 분말), 미정질 셀룰로스, 분말 셀룰로스, 덱스트레이트, 카올린, 만니톨, 규산, 소르비톨, 전분, 호화 전분, 및 이들의 혼합물이 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다. 일 실시양태에서, 약학 조성물 중의 결합제 또는 충전제는 약학 조성물 또는 투여 형태의 약 50 내지 약 99 중량%로 존재한다.

붕해제는 수성 환경에 노출시 붕해되는 정제를 제공하기 위해 조성물에 사용될 수 있다. 너무 많은 붕해제를 함유하는 정제는 보관시 붕해될 수 있고, 반면에 붕해제를 너무 적게 함유하는 정제는 목적하는 속도로 또는 목적하는 조건하에서 붕해되지 않을 수 있다. 따라서, 활성 성분의 방출을 불리하게 변경하는 너무 많지도 너무 적지도 않은 충분량의 붕해제가 고체 경구 투여 형태를 형성하기 위해 사용될 수 있다. 사용되는 붕해제의 양은 제형의 유형에 따라 달라지고, 당업자가 용이하게 결정할 수 있다. 일 실시양태에서, 약학 조성물은 붕해제 약 0.5 내지 약 15 중량%, 또는 붕해제 약 1 내지 약 5 중량%를 포함한다.

약학 조성물 및 투여 형태에 사용될 수 있는 붕해제에는 한천-한천, 알긴산, 탄산칼슘, 미정질 셀룰로스, 크로스카멜로스 나트륨, 크로스포비돈, 폴라크릴린 칼륨, 나트륨 전분 글리콜레이트, 감자 또는 타피오카 전분, 다른 전분, 호화 전분, 다른 전분, 점토, 다른 알긴, 다른 셀룰로스, 검 및 이들의 혼합물이 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다.

약학 조성물 및 투여 형태에 사용될 수 있는 윤활제에는 칼슘 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 광유, 경질 광유, 글리세린, 소르비톨, 만니톨, 폴리에틸렌 글리콜, 다른 글리콜, 스테아르산, 나트륨 라우릴 술페이트, 탈크, 수소화된 식물성 오일 (예를 들어, 땅콩유, 면실유, 해바라기유, 참깨유, 올리브유, 옥수수유, 및 대두유), 아연 스테아레이트, 에틸 올리에이트, 에틸 라우레이트, 한천, 및 이들의 혼합물이 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다. 추가 윤활제에는, 예를 들어 실로이드 실리카겔 (에어로실(AEROSIL)200, 미국 메릴랜드주 볼티모어에 소재하는 W.R. 그레이스 컴파니(W.R. Grace Co.) 제조), 합성 실리카의 응고 에어로졸 (미국 텍사스주 플라노에 소재하는 데구사 컴파니(Degussa Co.) 판매), CAB-O-SIL (미국 매사추세츠주 보스톤에 소재하는 캐보트 컴파니(Cabot Co.)에 의해 판매되는 발열성 이산화규소 제품), 및 이들의 혼합물이 포함된다. 사용되는 경우, 윤활제는 이들이 도입되는 약학 조성물 또는 투여 형태의 약 1 중량% 미만의 양으로 사용될 수 있다.

일 실시양태에서, 고체 경구 투여 형태는 본원에서 제공된 화합물, 무수성 락토스, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 스테아르산, 콜로이드성 무수성 실리카, 및 젤라틴을 포함한다.

6.6.2 조절 방출 투여 형태

활성 성분, 예컨대 본원에서 제공된 화합물은 당업자에게 주지인 조절 방출 수단 또는 전달 장치에 의해 투여될 수 있다. 그 예에는, 각각이 본원에 참고로 원용된 미국 특허 제3,845,770호; 제3,916,899호; 제3,536,809호; 제3,598,123호; 및 제4,008,719호; 제5,674,533호; 제5,059,595호; 제5,591,767호; 제5,120,548호; 제5,073,543호; 제5,639,476호; 제5,354,556호; 제5,639,480호; 제5,733,566호; 제5,739,108호; 제5,891,474호; 제5,922,356호; 제5,972,891호; 제5,980,945호; 제5,993,855호; 제6,045,830호; 제6,087,324호; 제6,113,943호; 제6,197,350호; 제6,248,363호; 제6,264,970호; 제6,267,981호; 제6,376,461호; 제6,419,961호; 제6,589,548호; 제6,613,358호; 제6,699,500호에 개시된 것들이 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다. 이러한 투여 형태는, 예를 들어 하이드로프로필메틸 셀룰로스, 다른 중합체 매트릭스, 겔, 투과성 막, 삼투 시스템, 다층 코팅, 미세입자, 리포좀, 미소구체, 또는 이들의 조합을 사용하여 다양한 비율로 목적하는 방출 프로파일을 제공하는 1종 이상의 활성 성분의 지연 또는 조절 방출을 제공하기 위해 사용될 수 있다. 본원에서 제공된 활성 성분과 함께 사용하기 위해, 본원에 기재된 것들을 비롯하여 당업자에게 공지된 적합한 조절 방출 제형이 용이하게 선택될 수 있다. 따라서, 제공된 조성물은 경구 투여에 적합한 단일 단위 투여 형태, 예컨대 비제한적으로 조절 방출용으로 적합화된 정제, 캡슐제, 젤라틴 캡슐제, 및 캐플릿제를 포함한다.

모든 조절 방출 약학 제품은 그의 비조절 대응물에 의해 달성되는 것보다 약물 요법을 개선한다는 공통의 목표를 갖는다. 이상적으로, 의학적 치료에서 최적으로 설계된 조절 방출 제제의 사용은 상태를 치유 또는 조절하기 위해 최소의 약물 물질을 최소의 시간 내에 사용하는 것을 특징으로 한다. 조절 방출 제형의 이점은 약물의 활성 연장, 투여 빈도 감소, 및 대상체 순응성의 증가를 포함한다. 또한, 조절 방출 제형은 작용 시작 시점 또는 다른 특성, 예컨대 약물의 혈중 수준에 영향을 주도록 사용될 수 있고, 따라서 부작용 (예를 들어, 역효과)의 발생에 영향을 줄 수 있다.

대부분의 조절 방출 제형은 목적하는 치료 효과를 즉각적으로 발생시키는 약물 (활성 성분)의 양을 초기에 방출하고, 또한 상기 수준의 치료 또는 예방 효과를 장시간에 걸쳐 유지하기 위해 약물의 다른 양을 점진적으로 계속해서 방출하도록 설계된다. 이러한 일정한 수준의 약물을 체내에서 유지하기 위해, 약물은 체내에서 대사되어 그로부터 배출되는 약물의 양을 대체하는 속도로 투여 형태로부터 방출되어야 한다. 활성 성분의 조절 방출은 pH, 온도, 효소, 물 또는 다른 생리학적 조건 또는 화합물을 포함하나, 이들로 제한되지는 않는 다양한 조건에 의해 활성화될 수 있다.

특정 실시양태에서, 약물은 정맥내 주입, 이식형 삼투 펌프, 경피 패치, 리포좀, 또는 다른 투여 방식을 사용하여 투여될 수 있다. 일 실시양태에서, 펌프가 사용될 수 있다 (문헌 [Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201 (1987)]; [Buchwald et al., Surgery 88:507 (1980)]; [Saudek et al., N. Engl. J. Med. 321:574 (1989)] 참조). 또다른 실시양태에서, 중합체 물질이 사용될 있다. 또다른 실시양태에서, 조절 방출 시스템은 대상체에서 숙련된 의료인에 의해 결정된 적절한 부위에 위치할 수 있고, 즉 전신 용량의 일정 분량만을 필요로 한다 (예를 들어, 문헌 [Goodson, Medical Applications of Controlled Release, vol. 2, pp. 115-138 (1984)] 참조). 다른 조절 방출 시스템이 문헌 [Langer, Science 249:1527-1533 (1990)]에서 논의되었다. 활성 성분은 체액에 불용성인 외부 중합체 막, 예를 들어 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 에틸렌/프로필렌 공중합체, 에틸렌/에틸 아크릴레이트 공중합체, 에틸렌/비닐아세테이트 공중합체, 실리콘 고무, 폴리디메틸 실록산, 네오프렌 고무, 염소화 폴리에틸렌, 폴리비닐클로라이드, 비닐 아세테이트, 비닐리덴 클로라이드, 에틸렌 및 프로필렌과의 비닐클로라이드 공중합체, 이오노머 폴리에틸렌 테레프탈레이트, 부틸 고무 에피클로로히드린 고무, 에틸렌/비닐 알콜 공중합체, 에틸렌/비닐 아세테이트/비닐 알콜 삼원공중합체, 및 에틸렌/비닐옥시에탄올 공중합체에 의해 둘러싸인 고체 내부 매트릭스, 예를 들어 폴리메틸메타크릴레이트, 폴리부틸메타크릴레이트, 가소화 또는 비가소화 폴리비닐클로라이드, 가소화 나일론, 가소화 폴리에틸렌테레프탈레이트, 천연 고무, 폴리이소프렌, 폴리이소부틸렌, 폴리부타디엔, 폴리에틸렌, 에틸렌-비닐아세테이트 공중합체, 실리콘 고무, 폴리디메틸실록산, 실리콘 카보네이트 공중합체, 친수성 중합체, 예컨대 아크릴산 및 메타크릴산 에스테르의 하이드로겔, 콜라겐, 가교화 폴리비닐알콜 및 가교되고 부분 가수분해된 폴리비닐 아세테이트에 분산될 수 있다. 그에 의해, 활성 성분은 방출 속도 조절 단계에서 외부 중합체 막을 통해 확산된다. 이러한 비경구 조성물 중 활성 성분의 백분율은 그의 특이성, 및 대상체의 요구에 상당히 좌우된다.

6.6.3 비경구 투여 형태

비경구 투여 형태는 피하, 정맥내 (볼루스 주사 포함), 근육내, 및 동맥내를 포함하나, 이들로 제한되지는 않는 다양한 경로에 의해 환자에게 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 비경구 투여 형태의 투여는 오염물질에 대한 환자의 자연적인 방어를 무시하기 때문에, 이러한 실시양태에서 비경구 투여 형태는 멸균성이거나, 환자에게 투여되기 전에 멸균될 수 있다. 비경구 투여 형태의 예에는 주사용 용액제, 약학적으로 허용되는 주사용 비히클에 바로 용해되거나 현탁되는 건조 제품, 주사용 현탁액제, 및 에멀젼제가 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다.

비경구 투여 형태를 제공하기 위해 사용될 수 있는 적합한 비히클은 당업자에게 주지이다. 그 예에는 USP 주사용수; 수성 비히클, 예컨대 비제한적으로 염화나트륨 주사액, 링거(Ringer) 주사액, 덱스트로스 주사액, 덱스트로스 및 염화나트륨 주사액, 및 젖산화된 링거 주사액; 수혼화성 비히클, 예컨대 비제한적으로 에틸 알콜, 폴리에틸렌 글리콜 및 폴리프로필렌 글리콜; 및 비수성 비히클, 예컨대 비제한적으로 옥수수유, 면실유, 땅콩유, 참깨유, 에틸 올리에이트, 이소프로필 미리스테이트 및 벤질 벤조에이트가 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다.

또한, 본원에 기재된 1종 이상의 활성 성분의 용해도를 증가시키는 화합물이 비경구 투여 형태에 도입될 수 있다. 예를 들어, 사이클로덱스트린 및 그의 유도체를 사용하여, 본원에서 제공된 화합물의 용해도를 증가시킬 수 있다. 예를 들어, 본원에 참고로 원용된 미국 특허 제5,134,127호를 참조한다.

6.6.4 국소 및 점막 투여 형태

본원에서 제공된 국소 및 점막 투여 형태에는 스프레이제, 에어로졸제, 용액제, 에멀젼제, 현탁액제, 점안액제 또는 다른 안과 제제, 또는 당업자에게 공지된 다른 형태가 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다. 예를 들어, 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 16^th, 18^th and 20^th eds., Mack Publishing, Easton PA (1980, 1990 and 2000)]; 및 [Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms, 4th ed., Lea & Febiger, Philadelphia (1985)]을 참조한다. 구강내 점막 조직을 치료하기에 적합한 투여 형태는 구강세척제 또는 경구용 겔제로서 제형화될 수 있다.

본원에 포함된 국소 및 점막 투여 형태를 제공하기 위해 사용될 수 있는 적합한 부형제 (예를 들어, 담체 및 희석제) 및 기타 물질은 약학 업계의 숙련자에게 주지이고, 주어진 약학 조성물 또는 투여 형태가 적용될 특정 조직에 좌우된다. 일 실시양태에서, 부형제에는 비독성이며 약학적으로 허용되는 용액제, 에멀젼제 또는 겔제를 형성하기 위한 물, 아세톤, 에탄올, 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 부탄-1,3-디올, 이소프로필 미리스테이트, 이소프로필 팔미테이트, 광유, 및 이들의 혼합물이 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다. 또한, 습윤제 또는 보습제가 약학 조성물 및 투여 형태에 첨가될 수 있다. 추가 성분의 예는 당업계에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 16^th, 18^th and 20^theds., Mack Publishing, Easton PA (1980, 1990 and 2000)]을 참조한다.

또한, 약학 조성물 또는 투여 형태의 pH를 조정하여 1종 이상의 활성 성분의 전달을 개선할 수 있다. 또한, 용매 담체의 극성, 그의 이온 세기, 또는 등장성을 조정하여 전달을 개선할 수 있다. 또한, 스테아레이트와 같은 화합물을 약학 조성물 또는 투여 형태에 첨가하여 1종 이상의 활성 성분의 친수성 또는 친지성을 변경함으로써 전달을 개선할 수 있다. 다른 실시양태에서, 스테아레이트는 제형을 위한 지질 비히클로서, 유화제 또는 계면활성제로서, 또는 전달-증강제 또는 침투-증강제로서 작용할 수 있다. 다른 실시양태에서, 생성되는 조성물의 특성을 추가로 조정하기 위해서 활성 성분의 염, 용매화물, 수화물, 전구약물, 클라트레이트 또는 입체이성질체를 사용할 수 있다.

6.6.5 키트

일 실시양태에서, 본원에서 제공된 활성 성분들은 환자에게 동시에 또는 동일한 투여 경로에 의해 투여되지 않는다. 또다른 실시양태에서, 활성 성분의 적정량 투여를 간소화할 수 있는 키트가 제공된다.

일 실시양태에서, 키트는 본원에서 제공된 화합물의 투여 형태를 포함한다. 키트는 추가 활성 성분, 예컨대 다른 항염증성, 면역조절 또는 면역억제 화합물, 또는 이들의 조합을 추가로 포함할 수 있다. 추가 활성 성분의 예에는 본원에 기재된 것들이 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다.

다른 실시양태에서, 키트는 활성 성분의 투여를 위해 사용되는 장치를 추가로 포함할 수 있다. 그러한 장치의 예에는 시린지, 드립 백(drip bag), 패치 및 흡입기가 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다.

키트는 이식용 세포 또는 혈액 뿐만 아니라, 1종 이상의 활성 성분을 투여하기 위해 사용될 수 있는 약학적으로 허용되는 비히클을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 활성 성분이 비경구 투여를 위해 재구성되어야 하는 고체 형태로 제공되는 경우, 키트는 활성 성분이 용해되어 비경구 투여에 적합한 미립자-무함유 멸균 용액을 형성할 수 있는 적합한 비히클의 밀봉 용기를 포함할 수 있다. 약학적으로 허용되는 비히클의 예에는 USP 주사용수; 수성 비히클, 예컨대 비제한적으로 염화나트륨 주사액, 링거 주사액, 덱스트로스 주사액, 덱스트로스 및 염화나트륨 주사액, 및 젖산화된 링거 주사액; 수혼화성 비히클, 예컨대 비제한적으로 에틸 알콜, 폴리에틸렌 글리콜 및 폴리프로필렌 글리콜; 및 비수성 비히클, 예컨대 비제한적으로 옥수수유, 면실유, 땅콩유, 참깨유, 에틸 올리에이트, 이소프로필 미리스테이트 및 벤질 벤조에이트가 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다.

8. 실시예

하기 실시예는 제한이 아닌, 예시 목적으로만 제공된다. 실시예에서, 시험 화합물은 (S)-3-[4-(4-모르폴린-4-일메틸벤질옥시)-1-옥소-1,3-디하이드로-이소인도-2-일]피페리딘-2,6-디온을 가리킨다.

8.1 실시예 1: ( S )-3-[4-(4-모르폴린-4-일메틸벤질옥시)-1-옥소-1,3-디하이드로-이소인도-2-일]피페리딘-2,6-디온 하이드로클로라이드의 제조

7.1.1: 3-하이드록시-2-메틸-벤조산 메틸 에스테르

3-하이드록시-2-메틸벤조산 (105 g, 690 mmol)을 응축기, 온도계 및 교반바가 장치된 2L 용량의 3구 둥근바닥 플라스크내 MeOH (800 mL)에 첨가한 뒤, 이어 MeOH (250 ml)를 첨가하였다. H₂SO₄ (10 mL, 180 mmol)를 상기 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 62℃에서 17시간 동안 교반하였다. 용매를 진공중에 제거하였다. 잔사 (200 mL)를 실온에서 물 (600 mL)에 천천히 첨가하고, 백색 고체를 얻었다. 현탁액을 빙조에서 30분간 교반하고, 여과하였다. 고체를 물로 세척하고 (5 x 250 mL), 건조하여 3-하이드록시-2-메틸-벤조산 메틸 에스테르를 백색 고체로 수득하였다 (100 g, 87% 수율). 화합물을 추가 정제없이 다음 단계에 사용하였다: LCMS MH = 167; ¹H NMR (DMSO-d₆) δ 2.28 (s, 3H, CH₃), 3.80 (s, 3H, CH₃), 6.96 - 7.03 (m, 1H, Ar), 7.09 (t, J = 7.8 Hz, 1H, Ar), 7.14 - 7.24 (m, 1H, Ar), 9.71 (s, 1H, OH).

7.1.2: 3-(tert-부틸-디메틸-실라닐옥시)-2-메틸-벤조산 메틸 에스테르

교반바 및 온도계가 장치된 1L 용량의 3구 둥근바닥 플라스크에 DMF (300 mL), 메틸 3-하이드록시-2-메틸벤조에이트 (90 g, 542 mmol) 및 이미다졸 (92 g, 1,354 mmol)을 첨가하였다. 상기 용액에 TBDMS-Cl (90 g, 596 mmol)을 20분간 내부 온도를 15-19℃로 조절하기 위해 여러번 나누어 첨가하고, 첨가를 마친 후, 내부 온도를 1℃ 아래로 떨어뜨렸다. 빙조를 제거하고, 반응 혼합물을 실온에서 16시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 빙수 (500 mL)에 첨가한 뒤, 생성된 용액을 두 부분 (700 mL x 2)으로 나누었다. 각 부분을 EtOAc (700 mL)로 추출하였다. 각 유기층을 냉수 (350 mL) 및 염수 (350 mL)로 세척하였다. 유기층을 합해 MgSO₄로 건조하였다. 합해진 유기층을 농축하여 3-(tert-부틸-디메틸-실라닐옥시)-2-메틸-벤조산 메틸 에스테르를 담갈색 오일로 수득하였다 (160 g, 100% 조 수율). 화합물을 추가 정제없이 다음 단계에 사용하였다: LCMS MH = 281; ¹H NMR (DMSO-d₆) δ -0.21 (s, 6H, CH₃, CH₃), 0.73 - 0.84 (m, 9H, CH₃, CH₃, CH₃), 2.10 (s, 3H, CH₃), 3.60 (s, 3H, CH₃), 6.82 (dd, 1H, Ar), 6.97 (t, J = 7.9 Hz, 1H, Ar), 7.13 (dd, J = 1.1, 7.7 Hz, 1H, Ar).

7.1.3: 2-브로모메틸-3-(tert-부틸-디메틸-실라닐옥시)-벤조산 메틸 에스테르

NBS (49.8 g, 280 mmol)를 실온에서 메틸 아세테이트 (500 mL) 중의 메틸 3-(tert-부틸 디메틸실릴옥시)-2-메틸벤조에이트 (78.4 g, 280 mmol)에 첨가하여 오렌지색 현탁액을 얻었다. 생성된 반응 혼합물을 40℃ 오일조에서 가열하고, 환류하에 4시간 동안 300 wt 태양광 전구로 조사하였다. 반응 혼합물을 식히고, Na₂SO₃ 용액 (2 x 600 mL, 50% 포화 농도), 물 (500 mL) 및 염수 (600 mL)로 세척하였다. 유기층을 MgSO₄로 건조하고, 차콜로 탈색하였다. 유기층을 농축하여 2-브로모메틸-3-(tert-부틸-디메틸-실라닐옥시)-벤조산 메틸 에스테르를 담갈색 오일로 수득하였다 (96 g, 91% 조 수율). 화합물을 추가 정제없이 다음 단계에 사용하였다: LCMS M-Br = 279; ¹H NMR (DMSO-d₆) δ 0.05 - 0.11 (m, 6H, CH₃, CH₃), 0.82 (s, 9H, CH₃, CH₃, CH₃), 3.65 (s, 3H, CH₃), 4.74 (s, 2H, CH₂), 6.94 (dd, J = 1.3, 8.1 Hz, 1H, Ar), 7.10 - 7.20 (m, 1H, Ar), 7.21 - 7.29 (m, 1H, Ar).

7.1.4: 4-카바모일-부티르산 메틸 에스테르

2L 용량의 둥근바닥 플라스크내에서 아세토니트릴 (1100 mL) 중 메틸 2-(브로모메틸)-3-(tert-부틸디메틸실릴옥시)벤조에이트 (137.5 g, 325 mmol)의 교반 용액에 메틸 4,5-디아미노-5-옥소펜타노에이트 하이드로클로라이드 (70.4 g, 358 mmol)를 첨가하였다. 현탁액에 DIPEA (119 ml, 683 mmol)를 부가 깔때기를 통해 10분간 첨가한 뒤, 현탁액을 실온에서 1시간 동안 교반하고, 혼합물을 40℃ 오일조에서 23시간 동안 가열하였다. 반응 혼합물을 진공하에 농축하였다. 잔사를 에테르 (600 mL)에서 교반하였고, 백색 고체가 석출되었다. 혼합물을 여과하고, 고체를 에테르 (400 mL)로 세척하였다. 여액을 HCl (1N, 200 mL), NaHCO₃ (포화, 200 mL) 및 염수 (250 mL)로 세척하였다. 수성산층 및 염기층을 별도로 유지하였다. 이어, 고체를 에테르 (250 mL)로 추가 세척하고, 액체를 상기 산 용액 및 염기 용액으로 세척하였다. 두 유기층을 합하고 진공하에 농축하여 4-[4-(tert-부틸-디메틸-실라닐옥시)-1-옥소-1,3-디하이드로-이소인돌-2-일]-4-카바모일-부티르산 메틸 에스테르를 갈색 오일로 수득하였다 (152g, 115% 조 수율, H NMR에 의한 순도 77%). 화합물을 추가 정제없이 다음 단계에 사용하였다: LCMS MH = 407.

7.1.5: 4-카바모일-4-(4-하이드록시-1-옥소-1,3-디하이드로-이소인돌-2-일)-부티르산 메틸 에스테르

DMF (500 mL) 및 물 (55 mL) 중 메틸 5-아미노-4-(4-(tert-부틸디메틸실릴옥시)-1-옥소이소인돌린-2-일)-5-옥소펜타노에이트 (152 g, 288 mmol)의 교반 냉각 용액에 K₂CO₃ (19.89 g, 144 mmol)을 5분간 나누어 첨가하였다. 생성된 반응 혼합물을 실온에서 40분 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 빙조에서 냉각하였다. 혼합물에 HCl (12M, 23.99 ml, 288 mmol)을 천천히 첨가하였다. 첨가후, 아세토니트릴 (280 mL)을 혼합물에 첨가하였고, 고체가 석출되었다. 혼합물을 실온에서 10분 동안 교반하고, 여과하였다. 고체를 아세토니트릴로 세척하였다 (50 mL x 4). 여액을 고진공하에 농축하여 황색 오일 (168 g)을 얻었다. 오일을 아세토니트릴 (600 mL)에 용해시키고, 실온에서 10분 동안 교반하였다. 혼합물을 여과하고, 고체를 아세토니트릴로 세척하였다 (25 mL x 2). 여액을 고진공하에 농축하여 황색 오일 (169 g)을 얻고, 물 (1200 mL) 및 에테르 (1000 mL)의 혼합물에 첨가하였다. 혼합물을 3분간 교반한 뒤, 층을 분리하였다. 수용액을 고진공하에 농축하고, 잔사를 아세토니트릴 (160 mL)에서 교반하고, 밤새 교반하여 백색 고체를 얻었다. 혼합물을 여과하여 4-카바모일-4-(4-하이드록시-1-옥소-1,3-디하이드로-이소인돌-2-일)-부티르산 메틸 에스테르를 백색 고체로 수득하였다 (46 g, 54% 수율). 여액을 농축하고, 잔사를 아세토니트릴 (60 mL)에서 추가 결정화하여 추가의 4-카바모일-4-(4-하이드록시-1-옥소-1,3-디하이드로-이소인돌-2-일)-부티르산 메틸 에스테르를 백색 고체로 수득하였다 (11.7 g, 14% 수율). 여액을 농축하고, 잔사를 ISCO 크로마토그래피에 의해 정제하여 추가의 4-카바모일-4-(4-하이드록시-1-옥소-1,3-디하이드로-이소인돌 -2-일)-부티르산 메틸 에스테르를 백색 고체로 수득하였다 (13.2 g, 15% 수율). 얻은 총 생성물은 70.9 g으로 수율 83%이다: LCMS MH = 293; ¹H NMR (DMSO-d₆) δ 1.95 - 2.34 (m, 4H, CH₂, CH₂), 3.51 (s, 3H, CH₃), 4.32 (d, J = 17.6 Hz, 1H, CHH), 4.49 (d, J = 17.4 Hz, 1H, CHH), 4.73 (dd, J = 4.7, 10.2 Hz, 1H, CHH), 6.99 (dd, J = 0.8, 7.9 Hz, 1H, Ar), 7.10 - 7.23 (m, 2H, Ar, NHH), 7.25 - 7.38 (m, 1H, Ar), 7.58 (s, 1H, NHH), 10.04 (s, 1H, OH).

7.1.6: 3-(4-((4-(모르폴리노메틸)벤질)옥시)-1-옥소이소인돌린-2-일)피페리딘-2,6-디온

단계 1: THF (60 mL) 중 3-(4-하이드록시-1-옥소-1,3-디하이드로-이소인돌-2-일)-피페리딘-2,6-디온 (2.5 g, 8.56 mmol)의 용액에 트리페닐 포스핀 (폴리머 담지, 1.6 mmol/g, 12 g, 18.8 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 15분 동안 교반하였다. 디이소프로필 아조디카복실레이트 (3.96 mL, 18.8 mmol)를 0℃에서 첨가하고, 혼합물을 0℃에서 30분 동안 교반하였다. (4-모르폴린-4-일메틸-페닐)-메탄올 (2.62 g,12.4 mmol)을 0℃에서 첨가하고, 혼합물을 실온으로 가온한 후, 실온에서 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 여과하고, 여액을 농축하였다. 생성된 오일을 실리카겔 상에서 메틸렌 클로라이드 및 메탄올 (구배, 생성물은 6% 메탄올로 나온다)로 용출하면서 정제하여 4-카바모일-4-[4-(4-모르폴린-4-일메틸-벤질옥시)-1-옥소-1,3-디하이드로-이소인돌-2-일]-부티르산 메틸 에스테르 (2.2 g, 54% 수율)를 수득하였다. 생성물을 추가 정제없이 다음 단계에 사용하였다.

단계 2: 4-카바모일-4-[4-(4-모르폴린-4-일메틸-벤질옥시)-1-옥소-1,3-디하이드로-이소인돌-2-일]-부티르산 메틸 에스테르 (2.2 g, 4.57 mmol)의 THF 용액 (50 mL)에 포타슘 t-부톡사이드 (0.51 g, 4.57 mmol)를 0℃에서 첨가하였다. 혼합물을 0℃에서 10분 동안 교반하고, 1N HCl (5 mL, 5mmol)에 이어 포화 NaHCO₃ (25 mL)로 퀀칭하였다. 혼합물을 EtOAc로 추출하였다 (2 x 50 mL). 유기층을 물 (30 mL), 염수 (30 mL)로 세척하고, MgSO₄로 건조한 후, 농축하였다. 생성된 고체에 EtOAc (10 mL)에 이어 헥산 (10 mL)을 교반하에 첨가하였다. 현탁액을 여과하여 3-(4-((4-(모르폴리노메틸)벤질)옥시)-1-옥소이소인돌린-2-일)피페리딘-2,6-디온을 백색 고체로 수득하였다 (1.5 g, 73% 수율). HPLC: Waters Symmetry C₁₈, 5 ㎛, 3.9 x 150 mm, 1 mL/분, 240 nm, 95/5 아세토니트릴/0.1% H₃PO₄로 5분 구배: t_R = 4.78 분 (97.5%); mp: 210-212℃; ¹H NMR (DMSO-d₆) δ 1.86 - 2.09 (m, 1H, CHH), 2.29 - 2.38 (m, 4H, CH₂,CH₂), 2.44 (dd, J = 4.3, 13.0 Hz, 1H, CHH), 2.53 - 2.64 (m, 1H, CHH), 2.82 - 2.99 (m, 1H, CHH), 3.46 (s, 2H, CH₂), 3.52 - 3.61 (m, 4H, CH₂,CH₂), 4.18 - 4.51 (m, 2H, CH₂), 5.11 (dd, J = 5.0, 13.3 Hz, 1H, NCH), 5.22 (s, 2H, CH₂), 7.27 - 7.38 (m, 5H, Ar), 7.40 - 7.53 (m, 3H, Ar), 10.98 (s, 1H, NH) ¹³C NMR (DMSO-d₆) δ 22.36, 31.21, 45.09, 51.58, 53.14, 62.10, 66.17, 69.41, 114.97, 115.23, 127.64, 128.99, 129.81, 129.95, 133.31, 135.29, 137.68, 153.50, 168.01, 170.98, 172.83; LCMS: 465; 분석 - C₂₅H₂₇N₃O₅+ 0.86 H₂O에 대한 이론치: C, 64.58; H, 6.23; N, 9.04; 실측치: C, 64.77; H, 6.24; N, 8.88.

3-(4-((4-(모르폴리노메틸)벤질)옥시)-1-옥소이소인돌린-2-일)피페리딘-2,6-디온으로부터 키랄 분리를 통해 (S)-3-(4-((4-(모르폴리노메틸)벤질)옥시)-1-옥소이소인돌린-2-일)피페리딘-2,6-디온 및 (R)-3-(4-((4-(모르폴리노메틸)벤질)옥시)-1-옥소이소인돌린-2-일)피페리딘-2,6-디온을 제조하였다.

8.2 실시예 2: 일차 인간 B 세포 분화 모델에서 전사 인자의 발현에 대한 효과

본 실시예에서는, (S)-3-[4-(4-모르폴린-4-일메틸벤질옥시)-1-옥소-1,3-디하이드로-이소인도-2-일]피페리딘-2,6-디온 (시험 화합물)이 형질 세포 분화를 조절하는 전사 인자의 발현 및 면역글로불린 생성에 미치는 효과를, 시험관내 인간 B-세포 분화 배양 시스템을 사용하여 연구하였다.

본 실시예에서 하기 약어가 사용되었다.

건강한 공여자로부터의 버피 코트 50 ml를 미국 뉴저지주에 소재하는 블러드 센터로부터 입수하였다. SLE 루푸스 PBMC 샘플을 컨버선트 바이오(Conversant Bio) (미국 앨라바마주 35806 훈츠빌)로부터 입수하였다.

세포 배양 시약을 본 연구에서 사용하였다.

유세포 계수 분석에서 하기가 사용되었다.

하기 유전자 프라이머가 RT-PCR을 위해 사용되었다.

7.2.1 hPBMC의 정제

인간 버피 코트 50 ml를 50 ml 용량의 원뿔형 시험관 2개에 각각 25 ml씩 분취하여 첨가하고, 멸균 HBSS 25 ml를 각각의 원뿔형 시험관에 첨가하였다. 시험관을 전도시켜 부드럽게 혼합하였다. 실온의 피콜-파크 플러스(Ficoll-Paque Plus) (GE 헬쓰케어; cat# 17-1440-02) 15 ml를 50 ml 용량의 원뿔형 시험관 4개에 분취하여 첨가하였다. 그 후에, 버피 코트/HBSS 혼합물 25 ml를 피콜의 상층에 부드럽게 서서히 층상화하였다. 샘플을 35분 동안 450 rpm에서 원심분리하였다. 혈장을 함유하는 상층을 피펫팅하여 버렸다. 단핵 세포를 함유하는 계면을 50 ml 용량의 원뿔형 시험관 2개로 옮겼다. 두 원뿔형 시험관을 HBSS로 총 50 ml 부피까지 충전하고, 10분 동안 1200 rpm에서 원심분리하였다. 세포를 HBSS로 다시 세척하고, 10분 동안 1000 rpm에서 회전시켰다. 세포 펠렛을 B 세포 배지 (이스코베스 + 10% PFBS, 1% P/S, 및 5 ㎍/mL의 인간 인슐린) 20 mL에 재현탁시키고, 세포 계수기에서 계수하였다.

7.2.2 B 세포 농축 CD19+

정제된 PBMC를 계수하여, 시험관마다 2 x 10⁸개의 세포로 분취하였다. 세포를 1200 rpm에서 5분 동안 원심분리한 후에, 상청액을 버렸다. 세포를 로보셉(Robosep) 완충액 (스템셀 테크놀로지즈 카탈로그 # 20104) 4 mL에 재현탁시키고, 14 mL 용량의 폴리스티렌 둥근 바닥 시험관 (BD 카탈로그 # 352057)으로 옮겨 잘 혼합하였다. 이어서, 이지셉(EasySep) 인간 B 세포 농축 칵테일 200 μL를 첨가하였다 (스템셀 테크놀로지즈 카탈로그 # 19054). 샘플을 와동시키고, 실온에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 그 후에, 이지셉 자기 입자 (와동) (스템셀 테크놀로지즈 카탈로그 # 19054) 300 μL를 시험관에 첨가하였다. 샘플을 와동시키고, 실온에서 5분 동안 인큐베이션하였다. 5분의 인큐베이션 후에, 로보셉 완충액 5 mL를 시험관에 첨가하고, 아래위로 피펫팅함으로써 잘 혼합하였다. 시험관을 즉시 은 자석 (스템셀 테크놀로지즈 카탈로그 # 19054)에 위치시켜, 실온에서 5분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후에, 하나의 연속 동작으로, 전도 자석 및 시험관을 목적하는 분획만큼 50 mL 용량의 원뿔형 시험관에 부었다. 상기 절차를 나머지 PBMC (공여 샘플마다)에도 반복하고 합쳤다. 합친 분획을 1200 rpm에서 5분 동안 원심분리한 후에, 상청액을 버리고, 세포를 B 세포 배지 5 mL에 재현탁시켰다. 단리된 CD19+ 세포를 세포 계수기에서 계수하였다.

7.2.3 B 세포 분화 검정

단계 1 - B 세포 활성화 - 0일 ~ 4일: 50 ㎍/mL의 인간 트랜스페린을 B 세포 배지 (이스코베스 + 10% PFBS, 1% P/S, 및 5 ㎍/mL의 인간 인슐린)에 첨가하여 새로운 B 세포 칵테일을 제조하였다. 실험을 위해 필요한 배지의 요구되는 부피를 0.22 μM 필터를 통해 여과하였다. B 세포 분화 칵테일 (최종 농도): 재조합 인간 IL-2 (20 U/mL), IL-10 (50 ng/mL), IL-15 (10 ng/mL), CD40 리간드/TNFSF5/히스티딘-표지 (50 ng/mL), 폴리히스티딘 마우스 IgG1 항체 (5 ㎍/mL), 및 ODN 2006-인간 TLR9 리간드 (10 ㎍/mL)를 세포에 첨가하였다. CD19+ B 세포 5 ml (1 x 10⁵/ml)를 6 웰 평바닥 플레이트의 각 웰에 첨가하였다 (최종 세포 카운트 = 5 x 10⁵/웰). 5 μL (1x) ± 화합물/DMSO를 각각의 시험 웰에 첨가하고 (0.1% 최종 DMSO), 37℃에서 4일 동안 인큐베이션하였다.

단계 2 - 형질모세포 발생 - 4일 ~ 7일: 세포를 수거하여 세포 계수기에서 계수하고; 분취물을 유동 분석을 위해 제거하고, 나머지 세포를 PBS로 세척하였다. 1 ㎍/ml의 인간 트랜스페린을 B 세포 배지 (이스코베스 + 10% PFBS, 1% P/S, 및 5 ㎍/mL의 인간 인슐린)에 첨가하여 새로운 B 세포 칵테일을 제조하였다. 실험을 위해 필요한 배지의 요구 부피를 0.22 μM 필터를 통해 여과하였다. B 세포 분화 칵테일 (최종 농도): 재조합 인간 IL-2 (20 U/mL), IL-10 (50 ng/mL), IL-15 (10 ng/mL), IL-6 (50 ng/mL)를 세포에 첨가하였다. 새로운 B 세포 칵테일을 첨가하고 세포를 다시 원래의 웰로 옮겨 부피가 5 mL가 되도록 하였다. 5 μL (1x) ± 화합물/DMSO를 각 시험 웰에 첨가하고 (0.1% 최종 DMSO), 37℃에서 4일 동안 인큐베이션하였다.

7일째에, 세포를 수거하여 세포 계수기에서 계수하였다. 그 후에, 세포를 유동 분석을 위해 분할하고, 나머지 세포를 RLT 완충액으로 용해시켜, RNA 추출 및 유전자 발현을 위해 -80℃에서 보관하였다. 상청액을 분취하고 면역글로불린 검정을 위해 -20℃에서 냉동시켰다.

7.2.4 시험 화합물 스톡 용액 및 희석액의 제조

시험 화합물을 칭량하고, 멸균 100% DMSO (디메틸 술폭시드; 리서치 오가닉스(Research Organics), 미국 오하이오주 클리브랜드)에 용해시켜, 40 mM 스톡 용액을 형성하였다. 40 mM 스톡의 희석액을 사용하여 검정에 실험 설계에 따른 최종 시험 화합물의 농도를 달성하였다.

7.2.5 RNA 추출 및 유전자 발현

퀴아젠(Qiagen) RNeasy 미니 스핀-컬럼 키트를 채용한 퀴아큐브(Qiacube) RNA 추출 장치 (퀴아젠, 미국 캘리포니아주 발렌시아)로 총 리보핵산 (RNA)을 제조하기 위해 분화된 B 세포 (섹션 4.3.3 참조)를 수거하였다. 정제된 RNA를 역전사효소 키트 (어플라이드 바이오시스템)를 사용하여 열순환기 (MJ 리서치 인크.(MJ Research; Inc.), 캐나다 퀘벡주 세인트 브루노)에 의해 cDNA로 역전사시켰다. 유전자 발현 검정을 삼중으로 7500 RT-PCR 시스템 (어플라이드 바이오시스템)을 사용하여 수행하였다. 글리세르알데히드 3-포스페이트 데하이드로게나제 유전자 발현 검정 대조군을 각각의 샘플에 대하여 전개하여, 정규화 대조군으로서 사용하였다. 각각의 유전자에 대하여, 각 실험내 샘플을 특정 시점에서 0.1% DMSO로만 처리한 것에 정규화하였다.

상청액 (섹션 7.7)을 수거하여, ELISA에 의해 IgG 및 IgM 생성에 대해 분석하였다 (젭토메트릭스 코포레이션(ZeptoMetrix Corp.), 미국 뉴욕주 버팔로).

7.2.6 세포 표현형

분화된 B 세포 (섹션 7.7 참조)를 수거하고, 계수하여, 4 mL 용량의 시험관마다 약 1 x 10⁶개 이하의 세포로 분취하였다. 세포를 염색 완충액으로 1X 세척하였다. 그 후에, 세포를 10% 인간 혈청/PBS로 20 내지 30분 동안 차단하였다. 차단 후에, 세포를 5분 동안 1200 rpm에서 원심분리하고, 상청액을 버렸다. 나머지 완충액 100 μL에, 실험 설계에 따라 다양한 BD 파미젠 유동 항체 20 μL를 첨가하였다. 세포를 20 내지 30분 동안 4℃에서 염색하였다. 그 후에, 세포를 염색 완충액으로 2X 세척하고, 상청액을 버렸다. 이어서, 500 μL의 염색 완충액 또는 PBS를 시험관에 첨가하였다. 샘플을 즉시 분석하거나 또는 4℃에서 밤새 두었다. 세포를 마우스 항-인간 CD20 및 CD38, CD19 및 CD27, 또는 각각의 이소형 대조군으로 염색하였다. 모든 샘플을 FACScanto 유세포 계수기, FACSDiva 분석 소프트웨어 (BD 바이오사이언스), 및 FlowJo 분석 소프트웨어를 사용하여 분석하였다.

7.2.7 세포 생존능 분석

생세포 계수 측정을 위해, B 세포 (섹션 7.7 참조)를 0.4% 트리판 블루로 염색하고, 생세포를 카운테스(Countess) 자동화 세포 계수기 (인비트로젠)를 사용하여 2벌의 샘플에서 계수하였다.

데이터를 그래프패드 프리즘 (GraphPad Prism) 5.0 소프트웨어를 사용하여 그래프화하였다. IC₅₀ 값을, 최고점을 100%로 한정하고 최저점을 0%로 한정하며, 가변성 기울기를 허용하는 S자형-용량 반응의 비선형 회귀를 사용하여 계산하였다. Ig 검정에서 시험 화합물의 결과는 대조군 DMSO 값에 대한 억제 백분율로서 표시되었다.

시험 화합물은 용량 의존적으로 CD20-CD38+ 형질모세포의 비율을 감소시키고, CD20+CD38-활성화 B 세포의 비율을 증가시켰다. 형질모세포 집단 (quadrant 1)은 DMSO 대조군에서 7일째에 30.4%이었고, 시험 화합물은 집단을 2 nM에서 27.3%, 20 nM에서 2.1% 및 200 nM에서 0.4%로 감소시켰다 (도 1). 시험 화합물은 배양 최초 4일 동안 B 세포 생존능을 감소시켰다 (도 2). 시험 화합물이 B 및 형질 세포 전사 인자의 발현에 미치는 효과를 도 3에 도시하였다. 시험 화합물이 형질모세포 배양물에서 IgG 생성에 미치는 효과를 도 4에 도시하였다.

시험 화합물은 용량 의존적으로 형질 세포 전사 인자 IRF4, BLIMP1, 및 XBP1의 발현을 유의적으로 억제하였다. 시험 화합물은 B 세포 전사 인자 PAX5를 증강시켰다. 시험 화합물이 B 및 형질 세포 전사 인자의 발현에 미치는 효과를 도 5A 및 5B에 도시하였다.

시험 화합물, 포말리도마이드 및 레날리도마이드는 IgG 생성을 각각 0.0018 μM, 0.049 μM, 및 0.32 μM의 IC₅₀으로 억제하였다. 데이터는 형질모세포 분화동안 IgG 생성을 억제하는 데에 시험 화합물이 포말리도마이드보다 27-배 더 효능적임을 나타내었다. 시험 화합물이 4, 7 및 10일째에 B 세포 배양물에서 IgG 생성에 미치는 효과를 도 6에 도시하였다. 시험 화합물이 단독으로 및 프레드니솔론과 조합하여 시험관내-분화된 형질모세포/형질 세포에 의한 IgG 생성에 미치는 효과를 도 7에 도시하였다. 시험 화합물이 7일째에 B 세포 분화동안 CD20/CD38 발현에 미치는 효과를 도 8에 도시하였다. 시험 화합물이 형질모세포 분화동안 세포 생존능에 미치는 효과를 도 9에 도시하였다.

전신 홍반성 루푸스 (SLE) 환자로부터 단리된 말초 혈액 단핵 세포에서, 시험 화합물은 IgG 및 IgM 생성을 각각 3.2 nM 및 0.9 nM의 IC₅₀으로 억제하였다. 이러한 조사 결과는 시험 화합물이 B 세포의 형질 세포 계통으로의 분화를 억제할 가능성이 있음을 보여주고, 시험 화합물이 자가항체의 과잉생성을 특징으로 하는 SLE와 같은 자가면역 질환의 치료에 유용할 수 있음을 제시하는 것이다. 시험 화합물이 SLE 환자의 PBMC 세포에서 B 세포 분화 및 기능에 미치는 효과를 도 10에 도시하였다. 시험 화합물이 정상 및 SLE 환자의 PBMC 세포에서 IgG 및 IgM 생성에 미치는 효과를 표 1에 나타내었다.

도 11A 및 11B는 시험 화합물이 7일째 B 세포 배양물에서 인간 IgG 및 IgM 생성에 미치는 효과를 각각 도시한다.

IgG 및 IgM의 정상 및 SLE PBMC 생성의 억제 효능

	IgG IC₅₀ (nM)		IgM IC₅₀ (nM)
	SLE (n=3)	정상 (n=3)	SLE (n=3)	정상 (n=3)
시험 화합물	3.2	2.1	0.9	0.35
포말리도마이드	19	63	3.8	17
아프레밀라스트	>10,000	>10,000	>10,000	>10,000

8.3 실시예 3: 유세포 계수 및 레이저 주사 세포계수를 사용한 B 세포 분화 검정

세포 배양 재료: 농축 정상 B 세포 및 SLE 환자의 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 시토카인 칵테일과 함께 인간 트랜스페린 및 인간 인슐린 (시그마)이 보충된 IMDM 배지 (인비트론) 및 10% FCS가 있는 시험관내 B 세포 분화 시스템에서 배양하였다. 0일 및 4일째에 시험 화합물을 배양물에 첨가하였다.

B 세포 분화 프로토콜: 농축 B 세포를 피콜-히파크 (Ficoll-Hypaque) 밀도 구배 원심분리후 이지셉(EasySep) 음성 선택 인간 B 세포 농축 키트 (스템 세포 테크놀로지즈)와 배양한 뒤, 신선한 버피 코트 (백혈구 농축 유닛)로부터 단리하였다. 요약하면, 2 x 10⁸/ml PBMC를 4 ml의 로보셉(Robosep) 완충액과 혼합하여, 14 mL 용량의 폴리스티렌 둥근 바닥 시험관으로 옮겼다. 이지셉 인간 B 세포 농축 칵테일 (200 μL)을 각 시험관마다 첨가하여 와동시키고, 실온에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 이지셉 자기 입자를 첨가하여 (시험관당 300 μL), 와동시키고, 실온에서 5분 동안 인큐베이션하였다. 로보셉 완충액 (5 mL)을 각 시험관에 첨가하고, 아래위로 피펫팅함으로써 잘 혼합하였다. 시험관을 은 자석에 위치시켜, 실온에서 5분 동안 인큐베이션하였다. 자석 및 시험관을 집어 하나의 연속 동작으로 전도하여 목적하는 분획만큼 50 mL 용량의 원뿔형 시험관에 부었다. 세포를 1200 rpm에서 5분 동안 회전시켰다. 상청액을 버리고, 새로운 B 세포 배지 5 mL를 첨가하였다. 세포 계수후, 분취액을 FACS 분석을 위해 제거하고, 나머지 세포는 배양에 사용하였다. CD19+ B 세포는 유세포 계수에 의해 측정된 바, ~95% 순도로 단리되었다. 정제된 B 세포를 멸균 6 웰 플레이트내에 웰마다 5 ml씩 1 x 10⁵ 세포/ml로 플레이팅하였다. 모든 세포 배양은 인간 트랜스페린 및 인간 인슐린 (시그마)이 보충된 IMDM 배지 (인비트론) 및 10% FCS에서 수행하였다. B-세포 활성화, PB 발생 및 PC 발생은 B 세포의 형질 세포로의 분화를 위한 개조된 시험관내 시스템에 기초해 수행되었다. 모든 재조합 인간 시토카인 IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-15, INF-α, 및 CD40L 및 항-폴리히스티딘 mAb가 지정 배양 단계에서 첨가되었다. 0일 및 4일째에 다양한 농도의 시험 화합물 (2, 20 및 200 nM)이 배양물에 첨가되었다. 4일째, 동일한 처리로부터의 모든 세포를 함께 풀화하고, 세포 계수후, 세포를 FACS 분석 및 시토스핀 제조를 위해 제거하였다. 남은 세포를 멸균 6 웰 플레이트내에 웰마다 5 ml씩 2.5 x 10⁵ 세포/ml로 플레이팅하였다. SLE PBMC를 정상 B 세포로서 형질 세포 분화를 촉진하기 위한 조건하에서 7일 동안 배양하였다.

유세포 계수를 위한 면역표현형: 유세포 계수를 위해 세포를 다색 직접 면역형광 염색을 이용하여 염색하였다. 세포 고정화 및 투과화전에 표면 염색을 행하였다. 세포 (50 ㎕; 세척 완충액중 1 x 10⁶세포/ml, PBS중 2% FBS + 0.1% NaN₃)를 각 염색에 사용하였다. 세포는 이소타입의 대조 mAb (1 ㎍/10⁶ 세포) 및 다색 FITC-접합 항-CD20 mAb 및 PE-접합 항-CD38 mAb로 염색하거나, 또는 4일 활성화 B 세포 (CD20+CD38-세포), 및 4일 PB 및 7일 PB (CD20-CD38+)는 PerCP-Cy5.5 접합 항-CD44 mAb, PE-접합 항-CD83 mAb로 염색되고, 그밖에 제조사의 지시에 따라 유세포 계수법으로 분석되는 기타 염색이 채용되었다. 전사 인자 단백질 (BCL-6, IRF-4, BLIMP-1, PAX-5 및 XBP-1) 및 IgJ의 세포내 염색은 제조사의 지시에 따랐다. 유세포 계수를 FACSDiva 6 (BD 바이오사이언스)을 채용한 FACScanto를 사용하여 분석하였다. 데이터 분석에 Flowjo (Tree Star) 소프트웨어가 이용되었다.

단세포 현탁액으로부터 시토스핀의 제조 및 iCyte의 면역형광 염색: 2% FBS-함유 PBS 1 ml당 0.5 x 10⁶ 세포를 초과하지 않는 세포 현탁액을 제조하였다. 이 현탁액 200 ㎕ 이하를 각 큐벳에 로딩하고, 3분 동안 800 rpm에서 회전시켰다. 큐벳과 페이퍼를 새 시토스핀이 손상되지 않게 주의하여 분리한 후, 직접 고정화 또는 건조 처리하였다. 고정되지 않은 시토스핀을 실온에서 최대 2일간 저장하였다. EtOH의 농도를 증가시키면서 슬라이드 상에 세포를 고정시키고, 염색전에 건조시켰다. 정상 혈청 (이차 항체와 동일한 종)과의 비특이적 결합을 차단한 후, 절편들을 하기 단일클론 항체의 혼합물과 서늘한 방에 습윤 챔버에서 밤새 인큐베이션하였다: (i) 형질모세포 세포 마커로서 항-인간 CD38, 및 (ii) 전사 인자 단백질에 대한 항-BCL-6, IRF-4, BLIMP-1, PAX5 및 XBP-1. 세척후, 슬라이드를 (두 상이한 형광색소, 즉, 알렉사 플루오르(Alexa Fluor)-488 및 알렉사 플루오르-633을 가지는) 상이한 종에서 유래한 이차 항체의 혼합물과 1시간 동안 실온에서 어둡게 인큐베이션하였다. 이어 슬라이드를 PBS에서 헹구고, DAPI로 실온에서 20분 동안 대비염색한 후, 항-페이딩(anti-fade) 형광 봉입제로 커버슬립하고, 매니큐어로 봉하였다. 슬라이드를 4℃에서 암소에 보관하였다. 이차 항체의 비특이적 결합으로 생성되는 위 양성물을 배제하기 위해, 모든 조직을 일차 항체를 대신하는 완충액으로 동일하게 처리하였다. 염색된 항체의 색을 관찰하고, 조직 절편에서의 양을 iCyte로 분석하였다.

레이저 주사 세포계수 이미지 포착 및 형광 정량적 분석: 이색 면역형광 염색을 표준 IHC 방법에 준해 슬라이드 상에 시토스핀된 (시토스핀 4, Thermo Scientific(써모 사이언티픽)) 세포에서 수행하였다. 레이저 주사 세포계수 (iCys 정량적 이미지화 세포계수, CompuCyte)를 사용하여 이미지 포착 및 형광 정량적 분석을 수행하였다. 2 패스를 설정하였다 (488/633에 대해 일차 패스 및 405/633에 대해 이차 패스). 모자이크 스캔에 저해상도 스캔을 이용하고, 영역 스캔 및 분석에 고해상도 스캔을 이용하였다. 요약하면, 슬라이드를 LSC 스테이지에 위치시키고, 주사 영역을 선택하였다. LSC는 5 mW에서 작동하는 아르곤 레이저를 채용하였다. 20X 대물렌즈를 사용해 슬라이드를 스캔하였다. DAPI 염색으로 측정하여, 청색 형광에서의 윤곽형성과 최소 세포 크기로 세포를 식별하고 선별하였다. 전방 산란 적분에 대한 세포 영역의 점도표에 표시된 전각 광산란에 기초해 단세포를 선별하도록 세포 검출 역치를 설정하였다. 레이저 광 산란 이벤트를 포착하고, 스캔 데이터 디스플레이내 단세포 윤곽형성에 사용하였다. 총 광 산란 픽셀화의 약 67%가 윤곽화되도록 스캔된 세포의 핵 부분으로부터 윤곽차가 설정되었다. 각 필드에서 최대 픽셀의 75% 최대 포화를 넘지 않도록 녹색 및 긴 적색 PMT-검출기 이득 전압이 설정되었다. 스캔 면적의 수립후, 40X 대물렌즈를 사용해 슬라이드를 스캔하였다. 각 슬라이드에 대해 최소 6개의 주사 영역이 조사되었다. 적분된 긴 적색 형광의 막대그래프내 각 주요 피크로부터 세포의 재배치로 세포 갤러리를 제작하였다. 품질 보증을 위해, 재배치된 세포의 형태학상 조성을 조사하였다. 데이터는 적분된 로그 형광 모드 또는 선형 최대 픽셀 모드로 분석될 수 있다. LSC 주사에 있어서 상이한 세포 집단을 백분율 및 MFI, 및 DMSO 대조군에 대한 정량적 비교로서 평가하였다.

데이터 분석: 유세포 계수 표면 및 세포내 분자를 FACScanto에 의해 분석하였다. 데이터 분석을 Flowjo로 행하였다. 염색된 항체의 색을 관찰하고, iCyte를 사용하여 조직 절편에서의 양을 분석하였다. FCM 및 LSC 주사에 있어서 상이한 세포 집단을 백분율 및 MFI, 및 DMSO 대조군에 대한 정량적 비교로서 평가하였다. 데이터는 평균±SEM으로 나타내었다. 그래프패드 프리즘 6.1 (그래프패드 소포트웨어 (GraphPad Software); 미국 캘리포니아중 샌디에고)을 사용하여 모든 데이터를 그래프화하였다. 일원 분산 분석(One-Way ANOVA)(듀넷(Dunnett's) 다중 비교 검정), 및 대응 스튜던트 t 검정(student t test)을 사용하여 통계 분석을 수행하였다. P 값이 0.05 이하이면 유의적인 것으로 간주하였다.

상술된 바와 같은 B 세포의 형질 세포로의 분화를 위해 개조된 시험관내 시스템을 이용하여 B 세포를 배양하였다. 다색 FITC-접합 항-CD20 mAb 및 PE-접합 항-CD38 mAb를 4일 활성화 B 세포 (CD20+CD38-세포) 및 7일 형질모세포 (PB) (CD20-CD38+)에 사용하였다. 3 공여자의 대표적인 별도의 3 실험으로부터의 데이터를 표 2에 나타내었다. 결과는 시험 화합물이 B 세포의 형질모세포/형질 세포 계통으로의 분화에 대해 유의적인 효과를 가짐을 보여준다. 시간이 경과함에 따라 활성화 B 세포가 증가되었고, 형질모세포가 감소되었으며, 또한 세포 생존능이 감소되었다 (도 12A 및 12B). 시험 화합물 (20 nM)로 처리된 활성화 B 세포 (CD20+CD38-세포)는 4일 (57.9%±11.5%)과 7일 (50.5%±8.6%) 간에 유의적인 차가 없었으나, 시험 화합물은 4일 (42.1 %±1.5%, p < 0.05) 및 7일 (12.5%±5.7%, p < 0.05) 째에 활성화 B 세포를 비히클 (DMSO) 대조군에 비해 유의적으로 증가시켰다. 한편, 시험 화합물은 4일 (4.8 %±2.3%) 및 7일 (9.7%±5.4%) 째에 형질모세포/형질 세포 (CD20-CD38+)를 DMSO 대조군 (4일째, 25.9 %±2.4% p < 0.05; 및 7일째, 54.8%±5.0%, p < 0.001)에 비해 유의적으로 감소시켰다. 또, 시험 화합물은 정상 B 세포 분화 검정에서 대형 세포 집단 (게이트 p2)을 용량 의존적으로 격감시켰다 (도 13). 4일째에 처리된 시험 화합물의 대형 세포 비율은 2 nM, 20 nM 및 200 nM 처리에 대해 각각 31.2%, 23.1% 및 20.4%이었다. 7일째에 처리된 시험 화합물의 대형 세포 비율은 2 nM, 20 nM 및 200 nM 처리에 대해 각각 34.9%, 19.9% 및 11.94%이었다. DMSO 대조군과 비교시, 그 수는 4일 및 7일째에 각각 35.5% 및 34.9%이었다.

시험 화합물은 형질모세포의 분화를 억제한다

	4일		7일
	DMSO	시험 화합물	DMSO	시험 화합물
CD20-CD38++ 형질모세포/형질 세포, %	25.9±2.4	4.8±2.3	54.8±5.0	9.7±5.4
CD20+CD38+ 중간 세포, %	14.7±3.1	18.3±5.5	22.8±5.1	23±7.7
CD20+CD38- 활성화 B 세포, %	42.1±1.5	57.9±11.5	12.5±5.7	50.5±8.6

시험 화합물이 B 세포 및 형질 세포 전사 인자 (BCL-6, IRF-4, BLIMP-1, PAX5 및 XBP-1) 발현에 미치는 효과를 유세포 계수법으로 평가하였다. B 세포를 상술된 바와 같이 배양하고, 세포를 면역형광 염색을 위해 4일, 7일째에 수거하였다. 세포를 일차로 CD20 및 CD38에 대해 염색하고, 세포 투과후, BCL-6, IRF-4, BLIMP-1, PAX5 및 XBP-1에 대해 염색한 후, 전체 림프구에 대한 게이팅(gating)으로 분석하였다. 3의 대표적인 세 실험으로부터의 데이터를 도 14에 나타내었다. 결과는 시험 화합물 (20 nM)이 형질모세포/형질 세포에서 전사 인자 발현에 변화를 일으킴을 보여준다. 4째일에 IRF-4 (p < 0.5), BLIMP-1 (p < 0.05), 및 XBP-1 (p < 0.05) 발현이 유의적으로 저하되었지만, 7일째에 BCL-6 (p < 0.05) 발현이 유의적으로 증가되었다.

상술된 유세포 계수 결과를 확인하기 위해서 레이저 주사 세포계수 (iCyte)를 정량적 분석에 사용하였다. 정상 공여자로부터의 B 세포 및 SLE 환자로부터의 PBMC를 상기 방법에 기술된 바와 같이 배양하였다. 세포를 4일 및 7일째에 수거하고, 세포를 슬라이드에 대해 시토스핀화한 뒤, 방법편에 기술된 바와 같이 이중-면역형광 염색하였다. CD38 (녹색)을 형질모세포/형질 세포에 의해 발현시키고, 전사 인자 (Red) BCL-6, IRF-4, BLIMP-1, PAX5, 또는 XBP-1을 세포질 또는 핵에 공동 존재시켰다. 핵을 DAPI로 대비염색시켰다 (청색). 7일 정상 B 세포 샘플에서 시험 화합물 (20 nM)은 DMSO 대조군과 비교하여 전체 림프구 집단에서 유의적으로 BCL-6 발현을 증가시키고 (도 15A, p < 0.01), IRF-4 (도 15B, p < 0.001) 및 BLIMP-1 (도 15C, p < 0.01) 발현을 감소시키고, CD38+ 형질모세포/형질 세포에서 유의적으로 BCL-6 (p < 0.05) 발현을 증가시키고, IRF-4 (p < 0.001), BLIMP-1 (p < 0.001), 및 PAX-5 (도 15D, p < 0.05) 발현을 감소시켰다. 양 세포 집단에서 XBP-1의 변화는 없다 (도 15E). SLE 환자의 PBMC에서, 다음의 전사 인자가 시험되었다: BCL-6, IRF-4 및 BLIMP-1. 데이터는 시험 화합물이 이들 전사 인자에서 건강한 공여자 세포와 유사 활성을 가짐을 보여준다. 시험 화합물은 분화유도 4일 및 7일 SLE 환자의 PBMC 유래 CD38+ 형질모세포/형질 세포에서 용량 의존적이면서 유의적으로 BCL-6 발현을 증가시키고, IRF-4 및 BLIMP-1 발현을 억제하였다 (도 16).

동일한 B 세포 시험관내 분화 시스템을 이용하여, B 세포 분화에서 CD44 및 CD83 발현에 대한 시험 화합물의 활성을 추가 조사하였다. 다색 FITC-접합 항-CD20 mAb, PerCP Cy5.5-접합 항-CD44 mAb 및 PE-접합 항-CD83 mAb를 4일 및 7일 세포에 사용하였다. 시험 화합물의 효과를 3 공여자의 대표적인 별도의 3 실험으로부터 평가하였다. 데이터는 시험 화합물이 7일 B 세포 분화 샘플에서 CD44 평균 형광 강도 (MFI)를 용량-의존적이면서 유의적으로 저하시켰다고 나타내었으며 (도 17, p <0.01), 이는 CD20^high/CD44^high세포의 고갈에 의한 것이다 (도 18). 2 nM, 20 nM 및 200 nM 시험 화합물로의 처리 7일째에 CD20^high/CD44^high세포의 비율은 각각 18.4%, 10.1% 및 6.6%이었으며, 이에 비해 DMSO 대조군은 22.2%이었다. CD44+ 세포의 고갈은 백혈구 부착을 감소시킬 수 있다. 시험 화합물은 유의적으로 총 CD83+ 세포 집단을 증가시키고, CD83+ 발현을 증강시켰다 (도 19). 2 nM, 20 nM 및 200 nM 시험 화합물로의 처리 4일째에 CD83+ 세포의 비율은 24.1%±2.1%, 40.2%±3.6%, 49.5%±4.4% 및 18.4%이었다. 2 nM, 20 nM 및 200 nM 시험 화합물로의 처리 7일째에 CD83+ 세포의 비율은 16.3%±3.3%, 36.1%±3.4% 및 51.9%±0.5%이었으며, 이에 비해 DMSO는 4일 및 7일에 각각 13.4%±2.4% 및 12.9%±3.3이었다.

류마티스 관절염 (RA) 환자에서 고수준의 IgJ 쇄 발현은 리툭시맙에 대한 반응의 결여를 예측한다. 시험 화합물이 IgJ 생성에 어떤 활성이 있는지를 평가하기 위해, 세포가 IgJ 세포내 염색을 위해서도 또한 사용되었다. 세 공여자로부터의 결과는 시험 화합물이 4일 B 세포 분화 배양물에서 IgJ 쇄 발현을 용량 의존적이면서 유의적으로 감소시켰음을 보였다. IgJ-양성 세포의 수가 감소되었을 뿐만 아니라 (4일째, 20 nM에서 8.4%±1.5%, 200 nM에서 5.4%±1.8%; 7일째, 20 nM에서 13.2%±2.3% 및 200 nM에서 7.2%±1.3으로 각각, 이에 비해 DMSO 대조군은 4일 및 7일째에 각각 13.1%±1.5% 및 14.4%±4.3임), 양성 세포내 IgJ의 MFI도 또한 저하되었다 (도 20). IgJ 및 IgG, IgM 생성의 감소는 RA 등의 질환에서 시험 화합물에 대한 반응의 잠재적 마커일 수 있다.

8.4 실시예 4: 시험 화합물이 항-인간 CD3-자극 인간 T 세포에서 시토카인 및 케모카인 생성에 미치는 효과

본 실시예는 멀티플렉스 루미넥스(Luminex) 기술을 사용하여, (S)-3-[4-(4-모르폴린-4-일메틸벤질옥시)-1-옥소-1,3-디하이드로-이소인도-2-일]피페리딘-2,6-디온, (R)-3-[4-(4-모르폴린-4-일메틸벤질옥시)-1-옥소-1,3-디하이드로-이소인도-2-일]피페리딘-2,6-디온 및 3-[4-(4-모르폴린-4-일메틸벤질옥시)-1-옥소-1,3-디하이드로-이소인도-2-일]피페리딘-2,6-디온이 항-인간 CD3-자극 인간 T 세포에서 시토카인 및 케모카인의 생성에 미치는 효과를 입증한다.

하기 약어가 사용된다.

약어 설명 또는 정의

IL 인터류킨

G-CSF 과립구 집락 자극 인자

GM-CSF 과립구 대식세포 집락 자극 인자

IFN-γ 인터페론 감마

TNF-α 종양 괴사 인자 알파

RANTES 활성화에 대하여 조절된, 정상 T 세포 발현 및 분비

하기 물질이 본 연구에서 사용되었다.

10% FBS, 100 유닛/mL의 페니실린, 100 mg/mL의 스트렙토마이신 및 2 mM L-글루타민이 보충된 RPMI-1640 배지 (라이프 테크놀로지즈(Life Technologies))

로제테셉(RosetteSep)® 인간 T-세포 농축 칵테일 (스템셀(StemCell), Cat# 15061)

루미넥스 인간 시토카인/케모카인 12-플렉스 키트 (밀리포어(Millipore), Cat# MPXHCYTO-60K-12)

루미넥스 IS100 장치 (밀리포어)

항-인간 CD3 항체, OKT3 클론 (이바이오사이언스(eBioscience), Cat# 16-0037-85).

시험 화합물을 DMSO 중의 4 mM 스톡 용액으로서 제조하였다. T 세포를 로제테셉® T 세포 농축 칵테일을 사용하여 제조사의 절차에 따라 음성 선택에 의해 버피 코트(buffy coat)로부터 단리하였다.

모든 96-웰 플레이트를 1X PBS 100 μL 중의 3 ㎍/mL의 항-인간 CD3 항체로 4시간 동안 37℃에서 예비코팅하였다. 플레이트를 T 세포 검정 전에 RPMI-1640 완전 배지로 3회 세척하였다. 그 후에, T 세포를 항-CD3-예비코팅된 플레이트에서 RPMI-1640 완전 배지 180 μL 중에 2.5 x 10⁵개 세포/웰의 밀도로 플레이팅하였다. 세포를 10X 적정된 시험 화합물 20 μL로 10, 1, 0.1, 0.01, 0.001, 0.0001, 및 0.00001 μM에서 이중으로 처리하였다. 최종 DMSO 농도는 0.25%였다. 플레이트를 48시간 동안 37℃, 5% CO₂에서 인큐베이션하였다. 48시간 후에, 상청액을 수거하고, 다음 시토카인/케모카인에 대하여 멀티플렉스 세포계수 비드 어레이 (CBA) 검정으로 시험하였다: IL-2, IL-3, IL-5, IL-10, IL-13, IL-15, IL-17A, GM-CSF, G-CSF, IFN-γ, TNF-α, 및 RANTES. CBA 플레이트를 루미넥스 IS100 장치에서 분석하였다.

각 공여자로부터의 데이터를 그래프패드 프리즘 5.0 소프트웨어를 사용하여 그래프화하고, 평균 (pg/mL) ± SEM 및 DMSO 대조군에 대한 % ± SEM으로서 표시하였다.

시험 화합물은 다수의 시토카인 및 케모카인의 생성을 변경하는, 항-CD3 자극 일차 인간 T 세포에서의 면역조절 활성을 입증하였다. 비히클과 함께 인큐베이션한 자극 인간 T 세포에 의해 생성된 시토카인 및 케모카인의 기저 수준을 하기 표 3에 나타냈다.

시험 화합물은 자극 인간 T 세포에서 IL-2, IL-3, IL-5, IL-10, IL-13, GM-CSF, IFN-γ, RANTES, 및 TNF-α의 생성을 증강시켰다. 시험 화합물에 의한 생성 증강은, IL-10 및 IL-5를 제외한 대부분의 시토카인 및 케모카인에 대하여 매우 농도-의존성이었다. 시험 화합물은 저농도에서는 IL-10 생성을 증강시켰지만, 고농도에서는 IL-10 생성의 증강을 억제하였다. 시험 화합물은 다른 시토카인의 생성을 증가시키는 농도 범위 내의, 주로 단일 농도에서 IL-5 생성을 증가시켰다. 대조 세포에서는 기타 시토카인 및 케모카인에 비해 상대적으로 소량의 IL-2, IL-3, IL-5, 및 IL-17A가 생성되었다 (표 1). IL-17A의 생성은 시험 화합물에 의해 현저히 변화되지 않았다. 자극된 인간 T 세포에서 GCSF 및 IL-15은 측정가능한 양으로 생성되지 않았다. 3-[4-(4-모르폴린-4-일메틸벤질옥시)-1-옥소-1,3-디하이드로-이소인도-2-일]피페리딘-2,6-디온이 항-CD3-자극 인간 T 세포에서 시토카인 및 케모카인의 생성에 미치는 효과가 도 21 및 22에 각각 생성된 절대량 및 비히클 대조 세포에 대한 백분율로서 표시되어 제공되었다. (R)-3-[4-(4-모르폴린-4-일메틸벤질옥시)-1-옥소-1,3-디하이드로-이소인도-2-일]피페리딘-2,6-디온이 항-CD3-자극 인간 T 세포에서 시토카인 및 케모카인의 생성에 미치는 효과가 도 23 및 24에 각각 생성된 절대량 및 비히클 대조 세포에 대한 백분율로서 표시되어 제공되었다. (S)-3-[4-(4-모르폴린-4-일메틸벤질옥시)-1-옥소-1,3-디하이드로-이소인도-2-일]피페리딘-2,6-디온이 항-CD3-자극 인간 T 세포에서 시토카인 및 케모카인의 생성에 미치는 효과가 도 25 및 26에 각각 생성된 절대량 및 비히클 대조 세포에 대한 백분율로서 표시되어 제공되었다. 점선은 도 22, 24 및 26에서 기저 수준 생성의 2배에 해당하는 수준 (EC₂₀₀)을 나타낸다.

8.5 실시예 5: 항염증성 활성

3-[4-(4-모르폴린-4-일메틸-벤질옥시)-1-옥소-1,3-디하이드로-이소인돌-2-일]-피페리딘-2,6-디온, (R)-3-[4-(4-모르폴린-4-일메틸-벤질옥시)-1-옥소-1,3-디하이드로-이소인돌-2-일]-피페리딘-2,6-디온 및 (S)-3-[4-(4-모르폴린-4-일메틸벤질옥시)-1-옥소-1,3-디하이드로-이소인도-2-일]피페리딘-2,6-디온의 항염증성 활성을 인간 말초 혈액 단핵 세포 (hPBMC)에서 연구하였다. 루미넥스 기술을 사용하여, LPS-자극받은 건강한 인간 공여자 PBMC로부터의 염증 유발 시토카인/케모카인 및 IL-10 (항염증성 시토카인)의 동시 프로파일링을 위한 화합물의 억제 (증강) 농도 IC₅₀을 측정하였다.

건강한 공여자로부터의 버피 코트 50 ml를 미국 뉴저지주 (미국 뉴저지주 이스트 오렌지)에 소재하는 블러드 센터(Blood Center)로부터 입수하였다. 지질다당류 (strain) (Cat# L-1887)는 시그마사로부터 구입하였다. 루미넥스 xMAP 기술을 위한 항체 결합 비드를 갖는 밀리플렉스 키트(Milliplex kit)를 밀리포어 (미국 매사추세츠주 빌레리카)로부터 구입하여, 분석 전에 멀티플렉스 포맷과 조합하였다.

7.5.1 인간 말초 혈액 단핵 세포의 정제

인간 버피 코트 50 ml를 50 ml 용량의 원뿔형 시험관 2개에 각각 25 ml씩 분취하여 첨가하고, 멸균 HBSS 25 ml를 각 원뿔형 시험관에 첨가하였다. 시험관을 전도시켜 부드럽게 혼합하였다. 실온의 피콜-파크 플러스 (GE 헬쓰케어(GE Healthcare) (소재); cat# 17-1440-02) 15 ml를 50 ml 용량의 원뿔형 시험관 4개에 분취하여 첨가하였다. 그 후에, 버피 코트/HBSS 혼합물 25 ml를 피콜의 상층에 부드럽게 서서히 층상화하였다. 샘플을 35분 동안 450 rpm에서 원심분리하였다. 혈장을 함유하는 상층을 피펫팅하여 버렸다. 단핵 세포를 함유하는 계면을 50 ml 용량의 원뿔형 시험관 2개로 옮겼다. 두 원뿔형 시험관을 HBSS로 50 ml의 총 부피까지 충전하고, 10분 동안 1200 rpm에서 원심분리하였다. 세포를 HBSS로 다시 세척하고, 10분 동안 1000 rpm에서 회전시켰다. 세포 펠렛을 RPMI 완전 배지 (RPMI/5% 인간 혈청/1x pen./strep./glut.) 20 ml로 재현탁시키고 계수하였다.

7.5.2 인간 말초 혈액 단핵 세포의 처리

hPBMC 100 ㎕ (2 x 10⁶/ml)를 96 웰 평바닥 플레이트의 각 웰에 첨가하고 (최종 세포수 = 2 x 10⁵/웰), 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 화합물 20 ㎕ (10x)를 각 시험 웰에 첨가하고, 2.5% DMSO를 함유하는 배지 20 ㎕를 각 대조군 웰에 첨가하고 ([DMSO]최종 = 0.25%), 플레이트를 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 그 후에, 세포를 2.5 ng/ml의 LPS 80 ㎕로 자극하고 ([LPS]최종 = 1 ng/ml), 18시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다.

각각의 웰로부터의 상청액 50 ㎕를 3개의 새로운 둥근 바닥 96 웰 플레이트로 옮기고, 루미넥스 분석을 위해 -20℃에서 보관하였다. 각각의 샘플에 대하여 2벌의 웰을 작업하였다.

7.5.3 루미넥스 분석

상청액 샘플을 루미넥스 IS100 장치를 사용하여 제조사 (밀리포어, 미국 매사추세츠주 01821 빌레리카)의 지침에 따라 멀티플렉스 포맷으로 시토카인에 대하여 분석하였다. IL-12 및 GM-CSF 분석은 아무 것도 넣지 않은(neat) 상청액을 사용하여 2-플렉스 포맷으로 수행하였고, 반면에 모든 다른 시토카인은 1:20 희석된 상청액을 사용하여 멀티플렉스 포맷으로 수행하였다. 데이터 분석은 업스테이트 비드뷰(Upstate Beadview) 소프트웨어를 사용하여 수행하였다. IC₅₀을, 최고점을 100%로 한정하고 최저점을 0%로 한정하며, 가변성 기울기를 허용하는 S자형 용량-반응의 비선형 회귀를 사용하여 계산하였다. EC₅₀은 10 μM에서 포말리도마이드 (대조군)에 의해 제공되는 평균 IL-10 증강을 나타내는 246.9%에 해당하는 S자형 곡선의 상한 및 100%로의 하한을 토대로 한다. IC₅₀은 그래프패드 프리즘 v5.00을 사용하여 수행하였다. 데이터 값은 n (이중 실험의 횟수)의 평균 + SEM (평균의 표준 오차)을 나타낸다.

하기 표 4 및 도 27, 29 및 31의 데이터에 의해 입증되는 바와 같이, 시험 화합물은 일반적으로 시험한 여러 개의 시토카인, 예를 들어 Il-6, IL-8, IL-1β, GM-CSF, MDC, MIP-1α, MIP-1β, 및 TNF-α의 억제에 있어서 효력이 다양하였다. 또한, 시험 화합물은 표 5 및 도 28, 30 및 32에서 제공된 바와 같이, 다양한 효력으로 IL-10, MCP-1, 및 RANTES의 생성을 증강시켰다.

시험 화합물의 시토카인 억제 프로파일의 요약

시토카인	라세미체 IC_{50 (μM)}	R-거울상이성질체 IC₅₀(μM)	S-거울상이성질체 IC₅₀(μM)
IL-6	0.01	0.083	0.0038
IL-8	>10	>10	>10
IL-1β	0.00085	0.0062	0.00046
GM-CSF	0.0092	0.039	0.0022
MDC	0.0026	0.012	0.0021
MIP-1α	α0.19	0.45	0.028
MIP-1β	>10	>10	>10
TNF-α	0.0018	0.0095	0.00059

시토카인 프로파일 요약 - 0.1 μM에서의 대조군에 대한 평균 %

시토카인	라세미체 (대조군에 대한 %)	R-거울상이성질체 (대조군에 대한 %)	S-거울상이성질체 (대조군에 대한 %)
IL-10	371	442	379
MCP-1	208	223	233
RANTES	153	151	153

8.6 실시예 6: IGG/리툭시맙에 반응하는 인간 자연 살해 (NK) 세포 기능에 대한 효과

본 실시예에서는, 시험 화합물이 IgG/리툭시맙에 반응하여 인간 NK 세포 기능을 증강시키는 능력을 연구하였다. 시험 화합물의 면역조절 활성을 자연 살해 (NK) 세포 기능 (1) IgG- 및 IL-2-유발성 인터페론-감마 (IFN-γ) 생성의 두 검정에서 비교하였다.

본 연구에서 사용되는 물질 및 그의 공급처가 하기에 제공된다.

건강한 지원자로부터의 버피 코트 (미국 뉴저지주에 소재하는 블러드 센터)

피콜-하이파크 플러스(Ficoll-Hypaque Plus) (미국 펜실베니아주에 소재하는 피셔 사이언티픽 컴파니 엘엘씨(Fisher Scientific Co LLC), Cat # 17144002)

10% FBS (소 태아 혈청), 100 유닛/mL의 페니실린, 100 mg/mL의 스트렙토마이신, 및 2 mM L-글루타민이 보충된 RPMI-1640 배지 (인비트로젠, Cat # 21870-076)

10% FBS, 100 유닛/mL의 페니실린, 100 mg/mL의 스트렙토마이신, 및 2 mM L-글루타민이 보충된 RPMI-1640 배지 (페놀 레드 무함유) (인비트로젠, Cat # 11835-030)

리툭시맙 (리툭산(Rituxan), 로슈, 인코포레이티드(Roche, Inc.)) (Cat No. DIN 02241927, Lot No. B50177)

인간 AB+ 혈청 (미국 캘리포니아주에 소재하는 제미니 바이오 프로덕츠(Gemini Bio Products), Cat # 100-512)

사이토톡스(CytoTox) 96 비방사성 세포독성 검정 키트 (미국 위스콘신주에 소재하는 프로메가(Promega), Cat # G1780)

로제테셉 인간 NK 세포 농축 칵테일 (캐나다 브리티시 컬럼비아주 밴쿠버에 소재하는 스템 셀 테크놀로지즈(Stem Cell Technologies), Cat# 15065)

마우스 항-인간 CD56+ 접합 APC (미국 캘리포니아주에 소재하는 BD 바이오사이언시즈(BD Biosciences), Cat # 555518)

혈청으로부터의 인간 면역글로불린 G (IgG) (미국 미주리주 세인트 루이스에 소재하는 시그마; Cat # I2511-10MG)

인간 재조합 IL-2 (미국 미네소타주에 소재하는 R&D 시스템즈, Cat # 202-IL-050/CF)

인간 IFN-감마 ELISA 키트 (써모피셔(ThermoFisher), Cat # PIEHIFNG5).

하기 세포주를 사용하였다.

활성화된 B 세포-유사 - 미만성 거대 B 세포 림프종 (ABC-DLBCL): 리바(Riva) 세포 (미국 메릴랜드주에 소재하는 NCI)

배중심 B-세포-유사 - 미만성 거대 B 세포 림프종 (GCB-DLBCL):

WSU-DLCL2 (미국 캘리포니아주에 소재하는 셀진 시그널(Celgene Signal))

파라지(Farage) (미국 버지니아주에 소재하는 ATCC)

여포성 림프종: DoHH2 (독일에 소재하는 DSMZ)

버킷(Burkitt) 림프종 (BL): 라지(Raji) (미국 버지니아주에 소재하는 ATCC)

제조사의 지침에 따라 건강한 공여자로부터의 NK 세포를 로제테셉 NK 세포 농축 칵테일 (스템 셀 테크놀로지즈, 캐나다 브리티시 컬럼비아주 밴쿠버)을 사용하여 음성 선택에 의해 버피 코트 혈액으로부터 단리한 후에, 피콜-하이파크 (피셔 사이언티픽 컴파니 엘엘씨, 미국 펜실베니아주) 밀도 구배 원심분리하였다. CD56+ NK 세포는 유세포 계수법 (BD 바이오사이언시즈, 미국 캘리포니아주)에 의해 측정된 바, 약 85%의 순도로 단리되었다.

7.6.1 NK IgG-유발성 인터페론-감마 (IFN-감마) 검정

96-웰 평바닥 플레이트를 100 ㎍/mL의 인간 IgG (시그마)로 밤새 4℃에서 코팅하였다. 다음 날에, 비결합 IgG를 냉각 1X PBS를 사용하여 세척해냈다. 그 후에, NK 세포를 IgG-코팅된 96-웰 플레이트에서 RPMI-1640 배지 180 μL 중에 웰마다 2 x 10⁵개 세포로 플레이팅하고, 10 ng/mL의 rhIL-2 (R & D 시스템즈, 미국 미네소타주)를 첨가하였다. 시험 화합물을 DMSO 20 μL의 부피로 첨가하였다. 시험 화합물의 최종 농도는 0.0001, 0.001, 0.01, 0.1, 1, 또는 10 μM이었다. 최종 DMSO 농도는 0.25%였다. 48시간 후에, 상청액을 수거하고, IFN-γ 생성에 대하여 ELISA에 의해 분석하였다.

시험 화합물이 고정화 IgG 및 rhIL-2 자극에 반응하여 NK 세포 IFN-γ 생성을 증강시키는 능력을 측정하기 위해 사용된 데이터를 각각의 공여자에 대하여 그래프패드 프리즘 v5.0 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 데이터는 다음 두가지 방식으로 나타냈다: (1) IFN-γ가 생성되었다면 절대량 (pg/mL ± SEM)으로서, 또한 (2) 1 μM 포말리도마이드의 존재하에 생성된 IFN-γ의 양에 대한 백분율로서. EC₅₀은 IFN-γ의 최대 생성의 절반을 제공하는 시험 화합물의 농도이고, 최대 생성은 1 μM 포말리도마이드의 존재하에 생성된 IFN-γ의 양으로 정의된다. EC₅₀값을 최고점을 100%로 한정하고 최저점을 0%로 한정하며, 가변성 기울기를 허용하는 S자형 용량-반응의 비선형 회귀를 사용하여 계산하였다.

화합물	EC₅₀
라세미체 R-거울상이성질체 S-거울상이성질체	0.037 μM 0.016 μM 0.012 μM

시험 화합물은 용량 의존적 방식으로 고정화 IgG 및 IL-2 자극에 반응하는 NK 세포 IFN-γ 생성을 증강시켰다. 라세미체, R-거울상이성질체 및 S-거울상이성질체에 대한 결과를 각각 도 33 내지 35에 제공하였다 (생성된 IFN-γ의 pg/mL로 표시됨). 도 36 내지 38은 각각 1 μM 포말리도마이드의 존재하에 생성된 IFN-γ에 대한, 라세미체, R-거울상이성질체 및 S-거울상이성질체의 존재하에 생성된 IFN-γ의 증가 백분율로서 표시된 결과를 제공한다. 도 36 내지 38에서 플롯팅된 각각의 값은 12 내지 14회 측정의 평균 ± SEM을 나타낸다.

8.7 실시예 7: 인간 혈관 내피 세포 증식, 관 형성, 이동, 및 침입 검정

본 실시예에서, 라세미체는 3-[4-(4-모르폴린-4-일메틸벤질옥시)-1-옥소-1,3-디하이드로-이소인도-2-일]피페리딘-2,6-디온을 가리키고, R-거울상이성질체는 (R)-3-[4-(4-모르폴린-4-일메틸벤질옥시)-1-옥소-1,3-디하이드로-이소인도-2-일]피페리딘-2,6-디온을 가리키며, S-거울상이성질체는 (S)-3-[4-(4-모르폴린-4-일메틸벤질옥시)-1-옥소-1,3-디하이드로-이소인도-2-일]피페리딘-2,6-디온을 가리킨다.

인간 제혈관 내피 세포 증식 검정: 인간 제혈관 내피 세포를 해동하여 EGM2 배지에서 모든 증식 검정에 대해 3 내지 6 계대까지로 증식시켰다. 인간 제혈관 내피 세포를 트립신화하고, 20% FBS/M199 배지로 세척한 후, 동일한 배지로 96-웰 세포 배양 플레이트에 웰마다 10⁴ 세포/100 μL로 플레이팅하였다. 플레이트를 37℃에서 밤새 인큐베이션하여 세포가 부착되도록 하였다. 이어, 세포를 동일한 배지로 3회 세척한 후, 1% FBS/M199 배지에서 18시간 동안 굶겼다. HUVEC 증식 검정에서 성장 인자 농도의 최적화를 위해, 100 ng/mL에서 시작하여 2X 연속 희석된 성장 인자를 37℃ 및 5% CO₂의 습윤화 세포 배양 인큐베이터내에 HUVEC에 100 μL/웰로 72시간 동안 이중으로 첨가하였다. 시험 화합물을 분석하기 위해 0.4% DMSO/1% FBS/M199 배지내 시험 화합물의 연속 희석물을 10 mM 스톡으로부터 중복으로 만들었다. 세포에 연속 희석한 시험 화합물 (10, 1.0, 0.1, 0.01, 0.001, 0.0001, 0.00001 μM)을 웰마다 50 μL씩 37℃에서 1 내지 2시간 동안 첨가하였다. 세포내 최종 DMSO 농도는 0.1%이다. 이어서, 4X 최종 농도의 상대 성장 인자 50 μL를 37℃ 및 5% CO₂의 습윤화 세포 배양 인큐베이터내 각 웰에 72시간 동안 이중으로 첨가하였다. 20 μL 배지중 1 마이크로퀴리의 3H-티미딘 (아머샴(Amersham))을 각 웰에 첨가하고, 5% CO₂의 습윤화 세포 배양 인큐베이터에서 37℃로 5 내지 6시간 동안 인큐베이션하여 티미딘 도입을 측정하였다. 이어서 세포를 트립신화하고, 세포 하베스터 (톰텍(Tomtec))를 사용하여 유니필터 (UniFilter) GF/C 필터 플레이트 (퍼킨 엘머)에서 수거하였다. 플레이트를 공기 건조시킨 후, Microscint 20 (팩커드)을 웰마다 20 μL 첨가하고, 플레이트를 TopCount NXT (팩커드)에서 분석하였다. 각 웰을 1분 동안 계수하였다. 실험을 3개의 각 공여자에 대해 이벌로 수행하였다.

인간 제혈관 내피 세포관 형성 검정: 화합물을 성장 인자-유발성 HUVEC 관 형성 검정으로 시험하였다. 관 형성 플레이트를 마트리젤이 중합되도록 37℃에서 30분간 인큐베이션하였다. HUVEC를 동일한 배지로 3회 세척한 후, 0.1% BSA 기초 EBM2 배지에서 5시간 동안 굶겼다. 세포를 트립신화하고, 원심분리하였다. 이어서, 4X 연속 희석한 화합물 (10, 1, 0.1, 0.01, 0.001, 0.0001, 0.00001 μM) 25 μL를 마트리젤로 코팅된 관 형성 플레이트에 웰마다 2 x 10⁴ 세포 50 μL과 함께 이중으로 첨가하였다. 50 μL의 4X VEGF (최종 농도 = 25 ng/mL) 또는 bFGF (최종 농도 = 10 ng/mL)를 플레이트에 첨가하였다. 이어 세포를 습윤화 인큐베이터에서 37℃에서 밤새 (~18시간 동안) 인큐베이션하였다. 세관망을 칼세인 AM에 의해 2% FBS/HBSS 중에 4 ㎍/μL로 30분 동안 염색하고, 형광 현미경으로 사진을 찍었다. 세관을 메타모프(MetaMorph) 관 형성 소프트웨어 프로그램으로 관 면적 및 관 길이에 대해 정량화하였다.

인간 제혈관 내피 세포 침입 검정: HUVEC 침입 검정에서는, 부착 세포가 삽입 플레이트의 하부 챔버에서 혈관형성 자극 (예를 들어 VEGF, bFGF, 또는 HGF)에 반응하여 자유로이 이동하고 막에 부착하기에 적합한 단백질 구조를 제공하도록 인간 피브로넥틴의 농도를 최적화시켰다. HUVEC를 동일한 배지로 3회 세척한 후, 0.1% BSA EBM2 배지에서 6시간 동안 굶겼다. 이어 세포를 트립신화하고, 원심분리하여 잔류 트립신을 제거하였다. 이어서, 웰마다 125 μL중 ~0.5 내지 1 x 10⁶ 세포 및 8X 연속 희석 화합물 125 μL (10, 1, 0.1, 0.01, 0.001 μM)을 BD 팔콘 24-웰 및 96-웰 삽입 플레이트의 상부 챔버에 이중으로 첨가하고, ~1 내지 2시간 동안 인큐베이션하였다. (플레이트는 인간 피브로넥틴으로 균일하게 코팅된, 형광 차단, 미소다공성 [기공 크기 3.0 ㎛] PET 막을 가진다). VEGF (최종 농도 25 ng/mL), bFGF (최종 농도 10 ng/mL), 또는 HGF (최종 농도 25 ng/mL)의 1.33 X 스톡 용액 750 μL를 하부 챔버에 첨가하였다. 세포를 37℃에서 22±1시간 동안 인큐베이션하였다. 24-웰 플레이트에서 500 μL/웰 및 96-웰 플레이트에서 200 μL/웰을 채용하여, 이동 세포를 칼세인 AM에 의해 2% FBS를 함유하는 HBSS 중에 4 ㎍/mL로 염색하였다. 플레이트를 37℃에서 90분 동안 인큐베이션하고, 형광 플레이트 판독기에서 판독하였다.

시험 샘플 결과로부터 비자극 DMSO 대조군에 대한 결과를 제하고 모든 중복물의 평균을 내고 성장 인자-자극 DMSO 대조군 (0% 억제)에 정규화하여 세포 증식, 관 형성, 이동, 및 침입 억제의 백분율을 계산하였다. 그래프패드 프리즘 5.0를 사용하여 IC₅₀ 값을 계산하였다.

인간 제혈관 내피 세포 증식 검정 결과: 성장 인자 최적화 연구로부터의 결과는 증식 유발을 위한 VEGF, bFGF, 및 HGF의 최적의 농도가 각각 25, 10, 및 25 ng/mL임을 제시한다. 시험 화합물을 최적화 성장 인자 농도로 조사하였고, 라세미체, S-거울상이성질체, 및 R-거울상이성질체가 VEGF-, bFGF-, 또는 HGF-유발성 HUVEC 증식을 억제하지 못하였다는 결과를 얻었다 (도 39). 그러나, S-거울상이성질체에 의해 VEGF- 및 HGF-처리된 HUVEC에서 증식의 유의적인 증강이 관찰되었다 (VEGF-처리: 1 - 10 μM; HGF-처리: 0.1 - 1 μM). 또한, 라세미체 (0.01 - 1 μM), 및 R-거울상이성질체 (0.1 - 1 μM)에 의해서도 bFGF-처리된 HUVEC에서 유의적인 증강이 관찰되었다. IC₅₀ 값을 표 7에 요약하였다.

성장 인자-유발성 인간 제혈관 내피 세포 증식 연구로부터의 IC₅₀ 값 요약

시험 화합물	VEGF (25 ng/mL) IC₅₀ 값 (μM)	bFGF (10 ng/mL) IC₅₀ 값 (μM)	HGF (25 ng/mL) IC₅₀ 값 (μM)
라세미체	>100	99	24
R-거울상이성질체	>100	76	38
S-거울상이성질체	>100	52	51

인간 제혈관 내피 세포관 형성 검정 결과: 시험 화합물은 관 길이 및 관 면적 양자 면에서 VEGF-유발성 HUVEC 관 형성을 억제하는 경향을 나타내었다 (도 40). 모든 화합물은 VEGF-유발성 HUVEC 관 형성에 대해 용량-의존적 효과가 입증되었다. R-거울상이성질체는 10 μM에서 관 면적 및 길이의 유의적인 억제 (p < 0.05 vs 자극 DMSO 대조군)를 나타내었다. 화합물은 또한 관 길이 및 관 면적 양자 면에서 bFGF-유발성 HUVEC 관 형성을 억제하는 경향을 나타내었으나 (도 40), 그 효과는 VEGF-유발성 HUVEC 관 형성의 효과보다 덜 현저하였다.

인간 제혈관 내피 세포 침입 검정 결과: 3-[4-(4-모르폴린-4-일메틸벤질옥시)-1-옥소-1,3-디하이드로-이소인도-2-일]피페리딘-2,6-디온, (R)-3-[4-(4-모르폴린-4-일메틸벤질옥시)-1-옥소-1,3-디하이드로-이소인도-2-일]피페리딘-2,6-디온 및 (S)-3-[4-(4-모르폴린-4-일메틸벤질옥시)-1-옥소-1,3-디하이드로-이소인도-2-일]피페리딘-2,6-디온은 VEGF-, bFGF-, 및 HGF-유발성 HUVEC 침입을 용량-의존적 방식으로 유의적으로 억제하였다 (도 41). 화합물은 HGF-유발성 HUVEC 침입에 대해서 보다 VEGF- 및 bFGF-유발성 HUVEC 침입에 대해 훨씬 효능적이었다 (표 8). 시험 화합물에 의한 VEGF-유발성 HUVEC 침입 억제에 대한 IC₅₀ 값은 < 0.3 nM이었다. 라세미체 (0.4 nM) 및 S-거울상이성질체 (< 0.1 nM)의 IC₅₀은 R-거울상이성질체 (13 nM) 보다 10배 이상으로 효능적이었다 (표 8).

시험 화합물이 성장 인자-유발성 인간 제혈관 내피 세포 침입에 미치는 효과의 요약

시험 화합물	VEGF-유발성 침입 IC₅₀ 값 (μM)	bFGF-유발성 침입 IC₅₀ 값 (μM)	HGF-유발성 침입 IC₅₀ 값 (μM)
라세미체	0.00014	0.00042	0.59
R-부분입체이성체	< 0.0001	0.013	0.45
S-거울상이성질체	< 0.0001	< 0.0001	0.019

8.8 실시예 8: 루푸스/섬유증 마우스 모델 연구

본 실시예에서는, (S)-3-[4-(4-모르폴린-4-일메틸벤질옥시)-1-옥소-1,3-디하이드로-이소인도-2-일]피페리딘-2,6-디온의 감수성이 루푸스에 걸리기 쉬운 다음 두 마우스 주에서 시험되었다: 전신 홍반성 루푸스의 MRL/MpJ-Faslpr/J 마우스 모델 및 전신 홍반성 루푸스의 NZBWF1/J 마우스 모델. 시험 화합물은 양 모델에 30 mg/kg으로 투여되었다.

전신 홍반성 루푸스의 MRL/MpJ-Faslpr/J 마우스 모델에서는, 4주차에 말초 혈액 B 세포가 변화를 보이지 않았다. 4주차에 비장 B 세포는 37% 증가를 나타내었고, 항-이중가닥 DNA 자가항체 수준은 25% 감소를 나타내었다.

전신 홍반성 루푸스의 NZBWF1/J 마우스 모델에서는, 4주차에 말초 혈액 B 세포가 25% 감소를 나타내었고, 비장 B 세포는 변화를 보이지 않았으며, 항-이중가닥 DNA 자가항체 수준은 4주차에 86% 증가를 나타내었다.

8.9 실시예 9: 진피 섬유증 마우스 모델 연구

본 실시예에서는, (S)-3-[4-(4-모르폴린-4-일메틸벤질옥시)-1-옥소-1,3-디하이드로-이소인도-2-일]피페리딘-2,6-디온이 블레오마이신-유발성 피부 섬유증 모델에서 예방 및 치료 투여 방식을 모두 채용하여 시험되었다. 블레오마이신은 폐에서 섬유증을 일으키는 것으로 판명된 구시대 항암 치료제이다. 동물 모델에서, 이는 전달 부위에서 손상 및 섬유증을 유사하게 유발할 것이다.

본 실시예에서 하기 약어가 사용되었다.

DBA/2 마우스를 본 연구에서 사용하였다. 본 연구에서 처리군마다 8마리의 동물을 사용하였다. 마우스를 표준 조건하의 동물 우리에 넣고, 사료와 식수는 자유급이하였다.

비히클로서 0.5% 카복시메틸 셀룰로스 (CMC)/0.25% 트윈(Tween) 80을 증류수 중에 제조하고, 자석 교반기에서 밤새 용해시켰다 (CMC (시그마 #C9481) 0.5 g 및 트윈 80 (시그마 #P8074) 0.25 ml를 99.75 ml에 첨가하여 총 100 ml의 0.5% CMC/0.25% 트윈 80을 제조함).

시험 화합물 분말을 칭량하고, 수성 매질에서의 약물 가수분해를 피하기 위해 매일 새로 비히클 0.5% CMC/0.25% 트윈 80에 현탁시켰다. 화합물을 상기 비히클에 용해시키지 않고 현탁시켰다. 제형물을 테플론(Teflon) 막자 및 막자사발 (포터-엘베헴(Potter-Elvehjem) 조직 분쇄기)로 전동 에버바흐(Eberbach) 조직 균질화기를 사용하여 균질화하였다. 본 연구에서 사용된 1일 약물 스톡 농도는 3 mg/ml였다.

블레오마이신은 에어랑엔-뉘른베르크 대학(University of Erlangen-Nuremberg)의 실험실로부터 입수하고, 주 1회 새로 제조되었다. 6주령 DBA 마우스에서, 상부 등의 1.5 cm² 한정된 면적에 0.5 mg/ml의 농도로 0.9% NaCl에 용해된 블레오마이신 100 ㎕를 격일로 국소 피내 주사하여 피부 섬유증을 유발하였다.

7.9.1 연구 설계

블레오마이신 유발성 진피 섬유증의 마우스 모델이 항섬유증 치료의 평가를 위해 널리 사용되고 있다. 상기 모델에서, 국소성 진피 섬유증은 3주간 격일로 블레오마이신을 피내 주사함으로써 유발된다. 상기 모델은 SSc의 초기 염증 단계와 유사하다. 섬유증의 예방에 대한 잠재적 효과를 평가하기 위해, 최초 블레오마이신 주사와 동시에 처치를 개시하였다. 시험 화합물이 생체내에서 블레오마이신-유발성 진피 섬유증의 예방에 미치는 효과를 연구하기 위해, 치료를 하기 그룹으로 나누었다.

· 대조군: 3주간 NaCl의 피내 주사. 처치는 비히클 (0.5% CMC/0.25% 트윈 80)의 투여로 이루어졌다.

· 미처치 블레오마이신 그룹: 3주간 블레오마이신의 피내 주사. 비히클 (0.5% CMC/0.25% 트윈 80)의 투여.

· 시험 화합물 그룹: 3주간 블레오마이신의 피내 주사. 시험 화합물을 30 mg/kg; PO, QD 투여하였다.

· 양성 대조군: 3주간 블레오마이신의 피내 주사. 이마티닙 (50 mg/kg; IP, QD)의 주사. 이마티닙 메실레이트는 블레오마이신 유발성 진피 섬유증에서 강력한 항섬유화 작용을 하는 것으로 이미 확인되었다. 문헌 [Akhmetshina A. et al., Arthritis Rheum 2009; 60(1):219-224]을 참조한다.

섬유증의 퇴행을 평가하기 위해, 블레오마이신 유발성 진피 섬유증의 변형 모델을 사용하였다. 마우스에 블레오마이신을 예비-접종하여 강성 피부 섬유증을 유발하였다. 한 그룹이 시험 화합물로 처치되었으며, 그 동안에 블레오마이신 접종이 추가의 3주 동안 계속되었다. 상기 그룹의 결과를 6주간 블레오마이신을 접종한 마우스 (추가 진행의 예방), 및 3주간 블레오마이신을 접종한 후에, 추가 3주간 NaCl을 투여한 마우스 (퇴행 유도)와 비교하였다. 하기 그룹을 퇴행 연구에서 사용하였다.

· 대조군: 6주간 NaCl의 피내 주사. 대조군 처치는 비히클의 투여로 이루어졌다.

· 미처치 블레오마이신 그룹 1 (퇴행): 3주간 블레오마이신의 피내 주사 후에, 추가 3주간 NaCl의 피내 주사. 처치는 비히클의 투여로 이루어졌다. 미처치 블레오마이신 그룹 2 (진행 예방): 6주간 블레오마이신의 피내 주사. 처치는 비히클의 투여로 이루어졌다.

· 시험 화합물 그룹: 6주간 블레오마이신의 피내 주사. 시험 화합물을 30 mg/kg; PO, QD 투여하였다.

· 양성 대조군: 6주간 블레오마이신의 피내 주사. 이마티닙 주사 (50 mg/kg; IP, QD).

7.9.2 실험 절차

진피 두께를 헤마톡실린 및 에오신으로 염색하여 측정하고, 활성화된 섬유모세포를 알파 평활근 액틴 (α-SMA)에 대한 면역조직화학법을 사용하여 측정하였다. 수정 로드난 피부 점수로 결정되는 진피 두께가 현재 SSc에서의 항섬유화제에 대한 인간 임상 시험에서 가장 일반적인 일차 결과이다. 피부 절편을 조직 구조의 보다 양호한 가시화를 위해 헤마톡실린/에오신으로 염색하였다. 진피 두께는, 각각의 마우스의 4개의 상이한 피부 절편에서 표피-진피 경계부와 진피-피하 지방 경계부 사이의 최대 거리를 측정함으로써 니콘 이클립스(Nikon Eclipse) 80i 현미경 (니콘, 네덜란드 바드후베도르프)으로 분석하였다. 평가는 2명의 독립 검사원에 의해 수행되었다.

근섬유모세포의 정량화를 위해, 피부 절편을 탈파라핀화하고, 5% 소 혈청 알부민과 함께 60분 동안 인큐베이션하였다. α-SMA에 대하여 양성인 세포를, 단일클론 항-α-SMA 항체 (클론 1A4; 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich), 독일 스타인하임)와 함께 2시간 동안 실온에서 인큐베이션한 후에, 3% 과산화수소와 함께 10분 동안 인큐베이션함으로써 검출하였다. 호스래디시(horseradish) 과산화효소로 표지된 염소 항-토끼 항체 (다코(Dako), 독일 함부르크)를 2차 항체로서 사용하였다. α-SMA의 발현을 3,3'-디아미노벤지딘 테트라하이드로클로라이드 (시그마-알드리치)로 가시화하였다. 단일클론 마우스 IgG 항체 (칼바이오켐(Calbiochem), 미국 캘리포니아주 샌디에고)를 대조군으로서 사용하였다.

또한, 병변 피부의 콜라겐 양이 SirCol 콜라겐 검정으로 측정될 것이다; 모든 마우스의 RNA 및 혈장을 추가 분석을 위해 보관하였다.

시험 화합물은 블레오마이신 진피 섬유증 마우스 모델에서 병변 피부의 진피 두께를 상당히 감소시켰다. 시험 화합물 (30 mg/kg; PO, QD)은 진피 비후를 유의하게 대략 22 ± 0.49% (p < 0.001, 도 42) 예방하였다.

헤마톡실린 및 에오신 염색된 피부 절편의 대표적인 현미경 사진이 도 8에 도시되었다. 진피 두께를, 표피-진피 경계부와 진피-피하 지방 경계부 사이의 최대 거리를 측정함으로써 평가하였다. 경계점 사이에 그려진 선은 처치군에서의 상대적 두께를 보여준다.

섬유모세포 활성화에 대한 처치 효과를 측정하기 위해, 병변 피부 절편에서 α-SMA + 근섬유모세포를 계수하였다. 도 44에 도시된 바와 같이, 시험 화합물 (30 mg/kg; PO, QD)은 근섬유모세포의 개수를 24 ± 0.09% (p < 0.05) 감소시켰다. 이마티닙 (50 mg/kg)은 피부 비후를 60 ± 0.34% (p < 0.0001) 감소시켰고, 근섬유모세포 개수를 81 ± 0.11% (p < 0.0001) 감소시켰다.

7.9.3 블레오마이신 유발성 진피 섬유증의 퇴행에 미치는 효과

섬유증의 진행에 대한 시험 화합물의 억제 효과는 또한 섬유증의 잠재적인 퇴행을 조사하기 위해 설계된 변형 블레오마이신 모델에서도 확인되었다. 도 45에서 보여진 바와 같이, 시험 화합물 (30 mg/kg; PO, QD)은 퇴행 모델에서 피부 비후에 영향을 미치지 않았다. 도 46은 대표적인 헤마톡실린 및 에오신 염색된 피부 절편의 현미경 사진을 도시한다. 진피 두께를, 표피-진피 경계부와 진피-피하 지방 경계부 사이의 최대 거리를 측정함으로써 평가하였다. 경계점 사이에 그려진 선은 처치군에서의 상대적인 두께를 보여준다. 도 47은 시험 화합물이 근섬유모세포의 개수에 영향을 미치지 않음을 보여준다. 이마티닙 (50 mg/kg)은 블레오마이신 유발성 피부 비후를 50 ± 0.3% (p < 0.0001) 감소시켰고, 근섬유모세포 개수를 78 ± 0.15% (p < 0.0001) 감소시켰다.

8.10 실시예 10: 마우스 모델에서 TSK-1의 효과

뮤린 타이트 스킨(Tsk-1) 마우스 모델에서 (S)-3-[4-(4-모르폴린-4-일메틸벤질옥시)-1-옥소-1,3-디하이드로-이소인도-2-일]피페리딘-2,6-디온의 항섬유화 효과를 시험하였다.

먼저, Tsk-1 타이트 스킨 마우스 모델에서 화합물이 섬유증에 미치는 억제 효과를 조사하였다. 도 48에 도시된 바와 같이, 화합물은 30 mg/kg에서 피하 비후를 45% (p ≤ 0.001) 감소시켰으며, 이에 비해 이마티닙은 50 mg/kg에서 58% 감소시켰다 (p ≤ 0.001). 상승된 피부의 콜라겐 함량은 하이드록시프롤린 수준으로 측정된 경우, 화합물에 의해 38%, 이마티닙에 의해 67% 감소되었다 (p ≤ 0.001).

이어, 화합물이 Tsk-1 마우스 피부에서 TGF-β 경로 유전자의 과발현에 미치는 효과를 조사하기 위해, qRT-PCR을 이용하여 다음 6개 유전자에 대한 mRNA 수준을 측정하였다: CTGF, PAI-1, COL1A1, α-평활근 액틴 (알파 SMA), 연골 올리고머 단백질 1 (COMP), 및 TGFB1. 과발현은 정상 pa/pa 마우스 피부에 비해 Tsk-1 마우스 피부에서 mRNA 수준이 과잉 관찰되는 것으로서 정의된다. 상기 6개의 유전자중에서, 단 4개의 유전자 (CTGF, PAI-1, COL1A1, 및 TGFB1) 만이 Tsk-1에서 정상 pa/pa 마우스에 비해 유의적으로 더 높은 수준으로 발현되었다. 화합물 (30 mg/kg)은 CTGF 및 COL1A1의 과발현을 각각 79% (p ≤ 0.001) 및 129% (p ≤ 0.001)로 유의적으로 감소시켰다 (도 49). PAI-1 및 TGFB1 유전자 과발현은 화합물에 의해 억제되지 않았다. 이들 결과는 화합물이 TGF-β 경로 내 일부 섬유증 촉진 유전자의 과발현을 차단함으로써 피부 섬유증을 감소시킬 수 있음을 보여주는 것이다.

화합물이 정상 (NL) 및 전신 경화증 (SSc) 세포의 섬유성 유전자 발현에 미치는 효과를 추가로 조사하기 위해, 다음의 절차가 이어졌다:

세포 배양: 인간 정상 및 경피증 피부 섬유모세포를 10% 소 태아 혈청 (FBS)을 함유하는 DMEM에서 배양하였다. 세포를 습윤화 5% CO₂, 95% 공기 인큐베이터에서 37℃로 유지하였다. 컨플루언스(confluence)에 도달한 후, 세포를 0.05% 트립신으로 수거하고, 계대배양하였다. 세포를 3 내지 5번째 계대로 사용하였다.

실험 설계: 세포를 70-80% 컨플루언스로 증식시키고, 혈청 농도를 0.4%로 감소시켜 밤새 휴지 상태로 두었다. 화합물이 TGFβ 섬유증 효과 및 NL 및 SSc 섬유성 유전자 발현에 미치는 효과를 검사하였다.

TGFβ 유발 섬유성 유전자 발현에 미치는 효과: NL 섬유모세포를 화합물로 30분간 예비 처리한 뒤, TGF-β1을 첨가하여 화합물이 TGFβ 유발 섬유성 유전자 발현에 미치는 효과를 관찰하였다.

화합물이 SSc-FB에 미치는 효과: SSc 섬유모세포를 상이한 농도의 화합물로 처리하고, 24 시간후 콜라겐 1A1 (COL1), α-평활근 액틴 (α-SMA), 피브로넥틴 (FN), 기질 메탈로펩티다제 1 (MMP1), 플라스미노겐 활성체 억제제 (PAI), 및 DNA (시토신-5-)-메틸트랜스퍼라제 1(Dnmt1)의 유전자 발현 수준을 실시간 PCR로 결정하였다.

정량적 실시간 PCR: RNeasy 키트를 사용해 세포로부터 전체 RNA를 추출하였다. RNA 농도를 측정하고, RT-제1 스트랜드 키트를 사용하여 1 ug의 RNA를 cDNA로 역전사시켰다. 이어 cDNA를 각각의 프라이머 및 파워 SYBR 그린(Power SYBR Green) PCR 마스터 믹스를 사용하여 증폭시켰다. 앰플리콘 (150-200bp)을 ABI 7500 실시간 PCR 시스템으로 검출하였다. 모든 표적 유전자를 GAPDH로 정규화하고, 상대적 폴드 변화(fold change)를 계산하였다. 각 샘플을 삼중으로 평가하였다.

도 50에 도시된 바와 같이, 화합물은 SSc 섬유모세포에서 COL1, aSMA 및 FN mRNA의 발현을 용량 의존적으로 감소시켰다. 마찬가지로, PAI (도 51) 및 Dnmt1 (도 52)의 발현이 또한 SSc 섬유모세포에서 화합물에 의해 용량 의존적으로 감소되었다. 도 51에 도시된 바와 같이, MMP-1의 발현이 SSc 섬유모세포에서 화합물에 의해 용량 의존적으로 증가되었다. 결과는 화합물이 주요 섬유증 인자를 강력히 조절하고, 이는 SSc의 처리에서 화합물이 효능적임을 입증한다.

또한, 정상 및 SSc 섬유모세포 및 피부 조직내 세레블론 수준을 조사하였다. 도 53 및 54에 도시된 바와 같이, SSc 섬유모세포 및 피부 조직 모두에서 세레블론이 정상 조직에 비해 더 높은 수준으로 관찰되었다. 이는 세레블론의 수준 상승이 SSc에서 동반됨을 보여주는 것이다.

8.11 실시예 11: B 세포 질환에 대한 세레블론의 표적화

(S)-3-[4-(4-모르폴린-4-일메틸벤질옥시)-1-옥소-1,3-디하이드로-이소인도-2-일]피페리딘-2,6-디온 ("화합물 IA")이 CRBN 결합, 유비퀴틴화, 및 세포 증식에 미치는 효과를 프로파일링하였다. CRBN는 CUL4A, DDB1, 및 ROC-1을 포함하는 E3 유비퀴틴 리가제 복합체의 한 성분으로서, 탈리도미드, 레날리도마이드, 및 포말리도마이드의 분자 결합 표적인 것으로 밝혀졌다.

경합 분석에 탈리도미드 유사-접합 비드를 사용하여 CRBN에 대한 결합 연구를 수행하였다. 세포 추출물을 다양한 농도의 화합물 IA 또는 양성 대조군으로서 포말리도마이드와 인큐베이션하여 인간 U266 다발성 골수종 ("MM") 세포로부터의 내인성 CRBN을 측정하였다. 탈리도미드산 유사체에 커플링된 친화성 비드를 U266 추출물과 인큐베이션하고, 비드를 철저히 세척한 후, 결합된 단백질를 용출시켰다. 탈리도미드-커플링 친화성 비드에 대한 CRBN 결합을 정량적 CRBN 면역블롯 측정으로 결정하였다.

아미노-말단 His-비오틴-표지 CRBN 작제물로의 트랜스펙션 후, 화합물과 1 시간 예비인큐베이션하고, (유비퀴틴화 단백질 분해를 정지시키기 위해) MG132 프로테아좀 억제제로 처리한 HEK293T 세포에서 CRBN 유비퀴틴화를 측정하였다. 세포를 용해시키고, 처리하여 항-유비퀴틴 항체를 채용한 면역블롯 분석 및 SDS-PAGE에 의해 CRBN 유비퀴틴화를 측정하였다. 세포 증식 연구를 레날리도마이드-감수성 및 내화성 다발성 골수종 세포에서 수행하였다. 레날리도마이드-저항성 또는 감수성 H929 MM 세포주를 화합물 IA로 5일간 처리한 후, 세포 증식 및 생존능을 7-아미노액티노마이신 D ("7-ADD") 염색으로 평가하였다. 세포 배양에서 2일간 고정화 항-CD3 항체를 사용하여 자극된 정제한 일차 인간 T 세포에서 T-세포 공동 자극을 측정하고, ELISA에 의해 시토카인 분비를 측정하였다.

B 세포 분화 인자 재조합 인간 IL-2 (20 U/mL), IL-10 (50 ng/mL), IL-15 (10 ng/mL), His-표지 CD40 리간드 (50 ng/mL), 폴리히스티딘 마우스 IgG1 항체 (5 ㎍/mL), 및 ODN 2006-인간 TLR9 리간드 (10 ㎍/mL)의 존재하에 4일, 이어 IL-2, IL-10, IL-15, 및 IL-6 (50 ng/mL)의 존재하에 3일 동안 추가 배양하여 정상 공여자 말초 혈액 단핵 세포로부터 면역글로불린 M 및 G ("IgG 및 IgM") 생성을 측정하였다. ELISA에 의해 IgM 및 IgG를 측정하였다.

경합 CRBN 결합 연구에서, 포말리도마이드와 3 uM의 농도에서 예비인큐베이션하면 CRBN이 친화성 비드에 약 50% 미만 결합한 것에 반해, 화합물 IA는 0.1μM의 농도에서 유사한 CRBN 결합으로 이어졌다. 트랜스펙션된 HEK293T 세포에서 CRBN 유비퀴틴화 연구로 다음의 효능이 얻어졌다: 화합물 IA IC₅₀= 0.19 μM; 레날리도마이드 IC₅₀= 12.9 μM; 및 포말리도마이드 IC₅₀= 21.6 μM. 화합물 IA에 의한 증식 억제를 위한 IC₅₀ 값은 친(parental) H929 세포주에서의 0.01 μM 및 DMSO-처리 서브클론에서의 0.04 μM에서 레날리도마이드 저항성 서브클론에서의 0.51-1.58 μM로 변경되었다.

H929 세포를 화합물 IA로 처리하고 24 시간후에 세포 주기 (S-기)의 50%가 명백히 감소하였다. 48시간째에, 화합물 IA는 서비빈 및 망막아종 단백질 ("pRB")의 발현을 감소시켰고, 사이클린-의존성 키나제 억제제 p27의 발현을 증가시켰다. 화합물 IA는 T 세포에 의한 IL-2 생성을 약 0.29 nM의 EC₅₀로 공동-자극한 것에 비해, 포말리도마이드는 10 nM로 공동-자극하였다. 화합물 IA는 IgM 및 IgG 생성을 각각 0.35 및 2.1 nM의 IC₅₀으로 억제한 것에 비해, 포말리도마이드는 17 nM 및 63 nM로 억제하였다.

결과는 화합물 IA가 이 시스템에서 포말리도마이드보다 약 30-배 더 높은 친화성으로 CRBN에 결합하고 포말리도마이드보다 약 110-배 더 큰 효능으로 CRBN 유비퀴틴화를 억제함을 보여준다. 화합물 IA는 T 세포에 의한 IL-2 생성을 공동-자극하는데 포말리도마이드보다 약 34-배 더 효능적이고, 면역글로불린 생성을 억제하는데 포말리도마이드보다 30 내지 48-배 더 효능적이다.

8.12 실시예 12: B 세포의 형질모세포 및 형질 세포 계통으로의 분화 억제

B 세포의 형질모세포 및 형질 세포 계통으로의 분화를 표적으로 하는 세레블론 ("CRBN")의 효과를 위해, 시험관내 일차 인간 B 세포 분화 모델을 제작하였다.

정상 공여자로부터의 CD19+ 말초 혈액 인간 B 세포, 또는 전신 홍반성 루푸스 ("SLE") 환자의 전체 말초 혈액 단핵 세포 PBMC를 인터류킨 ("IL")-2, IL-10, IL15, TLR9 작용제, 및 CD40L의 존재하에 4일간 배양하고, 이어서 IL-2, IL-6, IL-10 및 IL-15와 3일 더 배양하였다. 유세포 계수법으로 세포를 계수하고, 생존능을 평가하고, CD20, CD38, CD44, 및 CD83의 발현을 측정하였다. qRT-PCR로 형질모세포 계통 인자 IRF-4, BLIMP-1, XBP-1, 및 IgJ, 및 배중심 마커 PAX-5 및 BCL-6을 측정하였다. 레이저 주사 세포계수법으로 세포내 단백질 발현을 측정하였다. ELISA에 의해 분비된 면역글로불린 IgG 및 IgM을 측정하였다.

정상 B 세포 배양물에서, (S)-3-(4-((4-모르폴리노메틸)벤질)옥시)-1-옥소이소인돌린-2-일)피페리딘-2,6-디온 ("화합물 I-S")은 4일 후 이들 배양물내 총 생존 세포의 백분율을 20 nM 또는 200 nM 화합물 I-S에서 대조군에 대해 각각 69.6% (P≤0.05) 또는 35.8% (P≤0.001) 감소시켰다. 화합물 I-S는 7일째에 생존 CD20-CD38+ 형질모세포의 비율을, 대조 배양물에서의 30.4%에서부터 2 nM, 20 nM, 및 200 nM에서 각각 27.3%, 2.1%, 및 0.4%로 용량-의존적인 방식으로 감소시켰다. 7일째에, qRT-PCR 분석은 화합물 I-S (20 nM)가 형질모세포 계통 인자 IRF-4, BLIMP-1, XBP-1의 발현, 및 IgJ 유전자 발현을 대조군에 대해 각각 20.5%, 14.3%, 15.1%, 및 31.5% 감소시킨 것으로 나타났다 (P≤0.001).

세포내 유세포 계수법에 의하면, 화합물 I-S (20 nM)는 4일째에 IRF-4 (P<0.5), BLIMP-1 (P<0.05), 및 XBP-1 (P<0.05) 단백질 발현을 유의적으로 감소시켰지만, 7일째에 BCL-6 (P<0.05) 단백질 발현을 유의적으로 증가시켰다. 7일째 레이저 주사 세포계수법에 의하면, 화합물 I-S (20 nM)는 F-4 (P≤0.001), 및 BLIMP-1 (P≤0.001)의 CD38+ 세포 세포내 단백질 발현을 감소시켰고, BCL-6 발현을 증가시켰다 (P≤0.05) (n=3). 화합물 I-S는 분비 IgG 생성을 IC50 = 1.8 nM (n=3)로 억제하였다.

SLE 환자 유래의 PBMC에서, 화합물 I-S (20 nM)는 정상 B 세포와 유사한 효력을 가졌으며, BLIMP-1, XBP-1, 및 IgJ 유전자 발현을 대조군에 대해 각각 52.8%, 49.2%, 및 13.6% 감소시켰다 (P≤0.001) (n=3). 화합물 I-S (20 nM)는 유의적으로 BLIMP-1 (P≤0.01) 및 IRF-4 (P≤0.001)의 CD38+ 형질모세포 세포내 단백질 발현을 감소시켰고, BCL-6 발현 (P≤0.05) (n=3)을 증가시켰다. 화합물 I-S는 SLE 환자의 PBMC에 의한 분비 IgM 및 IgG 생성을 각각 0.9 nM 및 3.2 nM (n=3)의 IC₅₀으로 억제하였다.

이들 결과는 생존 CD38+ 세포의 백분율 감소, BLIMP-1, XBP-1, IRF-4, 및 IgJ 유전자 및 단백질 발현의 감소, 및 분비 면역글로불린 생성의 억제로 보여지는 바와 같이, 소분자 면역조절 화합물인 화합물 I-S로 E3 유비퀴틴 리가제 복합체 기질 공동-수용체 CRBN을 표적화한 결과 B 세포의 형질모세포 계통으로의 분화가 강력히 억제됨을 입증한다. 이들 데이터는 CUL4-CRBN 복합체가 B 세포의 형질 세포 계통으로의 분화에 연루됨을 보여준다.

본 발명은 본원에 기재된 특정 실시양태에 의해 그 범주가 제한되지 않는다. 실제로, 기재된 실시양태 이외에, 상기 상세한 설명 및 첨부된 도면으로부터 본 발명의 다양한 변경이 당업자들에게는 명백할 것이다. 이러한 변경은 특허청구범위의 범주 내에 속하도록 의도된다.

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Claims

a) 대상체 유래 생물학적 샘플내의 CD44, CD83 또는 이들의 조합인 바이오마커의 수준을 결정하는 단계; 및
b) 대상체 유래 생물학적 샘플내의 바이오마커 수준을 바이오마커의 기준 수준과 비교하는 단계를 포함하고;
여기서 대상체 유래 생물학적 샘플내의 바이오마커 수준이 바이오마커의 기준 수준과 비교하여 변경되었다면, 대상체는 치료에 대해 반응 가능성이 있는 것인,
치료 화합물로 질환, 장애, 또는 상태를 치료하는 것에 반응 가능성이 있는 대상체를 확인하는 방법.
a) 대상체 유래 생물학적 샘플내의 CD44, CD83 또는 이들의 조합인 바이오마커의 수준을 결정하는 단계;
b) 대조 샘플내의 바이오마커의 수준을 결정하는 단계; 및
c) 대상체 유래 생물학적 샘플내의 바이오마커 수준을 대조 샘플내의 바이오마커 수준과 비교하는 단계를 포함하고;
여기서 대상체 유래 생물학적 샘플내의 바이오마커 수준이 대조 샘플내의 바이오마커 수준과 비교하여 변경되었다면, 대상체는 치료에 대해 반응 가능성이 있는 것인,
치료 화합물로 질환, 장애, 또는 상태를 치료하는 것에 반응 가능성이 있는 대상체를 확인하는 방법.
a) 대상체 유래 생물학적 샘플내의 CD44, CD83 또는 이들의 조합인 바이오마커의 수준을 결정하는 단계; 및
b) 생물학적 샘플내의 바이오마커 수준을 바이오마커의 기준 수준과 비교하는 단계를 포함하고;
여기서 대상체 유래 생물학적 샘플내의 바이오마커 수준과 바이오마커의 기준 수준 간의 차이는 치료에 대한 대상체의 반응성과 상관성이 있는 것인,
치료 화합물에 의한 질환, 장애, 또는 상태의 치료에 대해 대상체의 반응성을 예측하는 방법.
a) 대상체 유래 생물학적 샘플내의 CD44, CD83 또는 이들의 조합인 바이오마커의 수준을 결정하는 단계;
b) 대조 샘플내의 바이오마커의 수준을 결정하는 단계; 및
c) 대상체 유래 생물학적 샘플내의 바이오마커 수준을 대조 샘플내의 바이오마커 수준과 비교하는 단계를 포함하고;
여기서 대상체 유래 생물학적 샘플내의 바이오마커 수준과 대조 샘플내의 바이오마커 수준 간의 차이는 치료에 대한 대상체의 반응성과 상관성이 있는 것인,
치료 화합물에 의한 질환, 장애, 또는 상태의 치료에 대해 대상체의 반응성을 예측하는 방법.
a) 대상체 유래 제1 생물학적 샘플내의 CD44, CD83 또는 이들의 조합인 바이오마커의 수준을 결정하는 단계;
b) 치료 화합물을 투여받은 상기 대상체로부터 수득한 제2 생물학적 샘플내의 상기 바이오마커의 수준을 결정하는 단계; 및
c) 상기 제1 및 제2 생물학적 샘플내의 바이오마커의 수준을 비교하는 단계를 포함하고;
여기서 대상체의 제2 생물학적 샘플내의 바이오마커의 수준이 대상체의 제1 생물학적 샘플내의 바이오마커의 수준과 비교하여 변경되었다면, 대상체는 치료에 반응성인 것인,
치료 화합물로 처리된 대상체에서 질환, 장애, 또는 상태의 치료 효능을 관찰하는 방법.
a) 대상체 유래 생물학적 샘플내의 CD44, CD83 또는 이들의 조합인 바이오마커의 수준을 결정하는 단계; 및
b) 상기 바이오마커의 수준을 상기 대상체 유래 비처리 대조 샘플내의 바이오마커 수준과 비교하는 단계를 포함하고;
여기서 대조 샘플내의 바이오마커 수준과 비교하여 생물학적 샘플내의 바이오마커 수준이 변하였다면 대상체가 치료에 순응성을 나타내는 것인,
치료 화합물에 의한 질환, 장애, 또는 상태의 치료시 대상체의 순응성을 관찰하는 방법.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 치료 화합물이 면역조절 화합물인 방법.
제7항에 있어서, 치료 화합물이 (S)-3-(4-((4-(모르폴리노메틸)벤질)옥시)-1-옥소이소인돌린-2-일)피페리딘-2,6-디온인 방법.
제8항에 있어서, 치료 화합물이 (S)-3-(4-((4-(모르폴리노메틸)벤질)옥시)-1-옥소이소인돌린-2-일)피페리딘-2,6-디온 하이드로클로라이드인 방법.