JP6318152B2 - セレブロン関連タンパク質を利用して薬物効能を決定する方法 - Google Patents
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Description
2012年6月29日及び2012年9月4日にそれぞれ出願された、どちらも「セレブロン関連タンパク質を利用して薬物効能を決定する方法(Methods for Determining Drug Efficacy Using Cereblon-Associated Proteins)」という名称の米国仮特許出願第61/666,703号及び第61/696,752号に基づく優先権が本明細書において主張される。上述の出願は、引用によりその全体として本明細書に組み込まれる。
免疫調節化合物の効能を決定する方法が本明細書に与えられる。セレブロン関連タンパク質(cereblon-associated proteins)を、癌及び炎症性疾患に対する臨床的感度並びに薬物に対する患者の応答のバイオマーカーとして使用する方法も本明細書に提供される。該方法を実施するためのキットがさらに与えられる。
(3.1 癌の病理生物学)
癌は、主に、ある正常な組織から誘導された異常な細胞の数の増加、これら異常な細胞による隣接組織の浸潤、又は悪性細胞の所属リンパ節及び遠位部位へのリンパ性若しくは血行性の広がり(転移)により特徴づけられる。臨床データ及び分子生物学的試験は、癌が小さな新生物発生前の変化で始まる多段階のプロセスであり、それが特定の条件下で新生物形成に進行し得ることを示している。新生物性病変はクローン的に発生し、特に新生細胞が宿主の免疫監視機構を免れる条件下では、浸潤、増殖、転移、及び異質性の能力を増加し得る。Roitt, I., Brostoff, J及びKale, D.の文献(Immunology, 17.1-17.12 (第3版, Mosby, St. Louis, Mo., 1993)。
炎症は、宿主の防御及び免疫媒介性疾患の進行において基本的な役割を果たしている。炎症反応は、損傷(例えば、外傷、虚血、及び外来粒子)及び感染(例えば、細菌又はウイルス感染)に応答して、化学伝達物質(例えば、サイトカイン及びプロスタグランジン)及び炎症細胞(例えば、白血球)を含む複雑な事象のカスケードにより開始される。炎症反応は、血流の増加、毛細血管透過性の増加、及び食細胞の流入を特徴とする。これらの事象は、損傷又は感染の部位で腫脹、発赤、熱感(ヒートパターンの変化)、及び化膿を生じさせる。
セレブロン(CRBN)は、植物からヒトまで保存されている442-アミノ酸タンパク質である。ヒトでは、CRBN遺伝子は、常染色体劣性非症候群性精神遅滞(ARNSMR)の候補遺伝子として特定されてきた。Higgins, J.J.らの文献(Neurology, 2004, 63 :1927-1931)を参照されたい。CRBNは、最初に、ラットの脳においてカルシウム活性化カリウムチャネルタンパク質(SLO1)と相互作用するRGSを含有する新規のタンパク質として特性化され、後に、AMPK7及びDDB1と共に網膜において電位依存型クロライドチャネル(CIC-2)と相互作用することが示された。Jo, S.らの文献(J. Neurochem, 2005, 94: 1212-1224);Hohberger B.らの文献(FEBS Lett, 2009, 583:633-637); Angers S.らの文献(Nature, 2006, 443:590-593)を参照されたい。DDB1は、最初、損傷DNA結合タンパク質2(DDB2)と会合するヌクレオチド除去修復タンパク質として特定された。その活性欠損は、色素性乾皮症相補群E(XPE)を有する患者において修復欠損を引き起こす。DDB1は、ユビキチン化、及びその後の標的タンパク質のプロテアソーム分解を媒介する多くの異なるDCX(DDB1-CUL4-X-ボックス)E3ユビキチン-タンパク質リガーゼ複合体の構成要素として機能するようにも見える。CRBNは、大脳皮質の疾患に対する治療剤の開発の標的としても特定されている。WO2010/137547A1号を参照されたい。
異常なTNF-α産生と関連する疾患を治療するために安全かつ効果的に使用することができる化合物を提供する目的で多くの研究が実施されている。例えば、Marriott, J.B.らの文献(Expert Opin. Biol. Ther., 2001, 1(4):1-8); G.W. Mullerらの文献(J Med Chem., 1996, 39(17): 3238-3240);及びG.W. Mullerらの文献(Bioorg & Med Chem Lett., 1998, 8: 2669-2674)を参照されたい。いくつかの研究は、LPS刺激されたPBMCによるTNF-α産生を強力に阻害する能力について選択された化合物群に集中している。L.G. Corralらの文献(Ann. Rheum. Dis., 1999, 58:(Suppl I)1107-1113)。これらの化合物は、TNF-αの強力な阻害だけでなく、LPS誘導性の単球IL1β及びIL12産生の顕著な阻害も示す。LPS誘導性IL6も、部分的だが、そのような化合物によって阻害される。これらの化合物は、LPS誘導性IL10の強力な刺激因子である。同上。
一実施態様において、化合物が免疫調節性であるか否かを決定する方法であって、(a)第1の細胞を該化合物と接触させること;(b)工程(a)の該第1の細胞から第1の試料を得ること;(c)該第1の試料中のCRBN関連タンパク質のレベルを決定すること;及び(d)工程(c)のCRBN関連タンパク質のレベルを基準試料から得られた同じタンパク質のレベルと比較することを含む方法であって、基準と比較したレベルの変化が免疫調節化合物としての該化合物の効能を示す方法が本明細書に提供される。特定の実施態様において、工程(a)における接触はインビトロで実施される。他の実施態様において、工程(a)における接触はインビボで実施される。一実施態様において、細胞は、該化合物と、例えば、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、若しくは55分、又は1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、若しくは24時間、又は2若しくは 3日以上の期間、接触させられる。いくつかの実施態様において、細胞は、末梢血単核細胞、B細胞、T細胞、単球、又は顆粒球である。他の実施態様において、細胞は、腫瘍細胞又は癌細胞、例えば、リンパ腫、骨髄腫、又は白血病である。一実施態様において、腫瘍又は癌細胞は細胞系から得られる。
(6.1 定義)
本明細書では、特記されない限り、「治療する(treat)」、「治療する(treating)」、及び「治療」という用語は、患者が特定の癌に罹患している間に行なわれる行為であって、癌の重症度を軽減するか、又は癌の進行を遅延化若しくは緩徐化する行為を意味する。
及び免疫学の従来技術を利用し、該技術は、当業者の能力の範囲内である。そのような技術は、文献において十分に説明されている。参照用の特に好適なテキストの例としては、以下のものが挙げられる:Sambrookらの文献((1989)「分子クローニング;実験マニュアル(Molecular Cloning; A Laboratory Manual)」(第2版)); D.N Glover編の文献((1985)「DNAクローニング(DNA Cloning)」, I巻及びII巻); M.J. Gait編の文献((1984)「オリゴヌクレオチド合成(Oligonucleotide Synthesis)」); B.D. Hames及びSJ. Higgins編の文献((1984)「核酸ハイブリダイゼーション(Nucleic Acid Hybridization)」); B.D. Hames及びS.J. Higgins編の文献((1984)「転写及び翻訳(Transcription and Translation)」);R.I. Freshney編の文献((1986)「動物細胞培養;固定化細胞及び酵素(Animal Cell Culture; Immobilized Cells and Enzymes)」(IRL Press, 1986));「細胞の免疫化学法及び分子生物学(Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology)」(Academic Press, London); Scopesの文献(1987)(「タンパク質精製:原理及び実践(Protein Purification: Principles and Practice)」(第2版; Springer Verlag, N.Y.));並びにD.M. Weir及びC. C. Blackwell編の文献((1986)「実験免疫学のハンドブック(Handbook of Experimental Immunology)」, I巻〜IV巻)。
一実施態様において、化合物が免疫調節性であるか否かを決定する方法であって、(a)第1の細胞を該化合物と接触させること;(b)工程(a)の該第1の細胞から第1の試料を得ること;(c)該第1の試料中のCRBN関連タンパク質のレベルを決定すること;及び(d)工程(c)のCRBN関連タンパク質のレベルを基準試料から得られた同じタンパク質のレベルと比較することを含む方法であって、基準と比較したレベルの変化が免疫調節化合物としての該化合物の効能を示す方法が本明細書に提供される。特定の実施態様において、工程(a)における接触はインビトロで実施される。他の実施態様において、工程(a)における接触はインビボで実施される。一実施態様において、細胞は、該化合物と、例えば、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、若しくは55分、又は1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、若しくは24時間、又は2若しくは3日以上の期間、接触させられる。いくつかの実施態様において、細胞は、末梢血単核細胞、B細胞、T細胞、単球、又は顆粒球である。他の実施態様において、細胞は、腫瘍細胞又は癌細胞、例えば、リンパ腫、骨髄腫、又は白血病である。一実施態様において、腫瘍又は癌細胞は細胞系から得られる。
特定の実施態様において、生体試料からのCRBN又はCRBN関連タンパク質のタンパク質レベルを検出及び定量化する方法であって、(a)該試料を、免疫特異的にCRBN又はCRBN関連タンパク質に結合する第1の抗体と接触させること;(b)第1の抗体に結合した該試料を、免疫特異的にCRBN又はCRBN関連タンパク質に結合する第2の抗体であって、該第1の抗体とは異なるCRBN又はCRBN関連タンパク質上のエピトープに免疫特異的に結合する、検出可能な標識を有する第2の抗体と接触させること;(c)該試料に結合した第2の抗体の存在を検出すること;及び(d)第2の抗体中の検出可能な標識の量に基づいて、CRBN又はCRBN関連タンパク質のタンパク質レベルを決定することを含む方法が本明細書に提供される。
特定の実施態様において、本明細書に提供される種々の方法は、対象又は個体(例えば、患者)からの試料(例えば、生体試料)を利用する。対象は、患者、例えば、多発性骨髄腫、白血病、若しくはリンパ腫などの血液癌;炎症又は微少残存病変の患者であり得る。対象は、哺乳動物、例えば、ヒトであり得る。対象は、男性でも女性でもよく、成人でも小児でも乳児でもよい。試料は、疾患若しくは障害の活動期の間の時間でも、疾患又は障害が非活動性である時にでも分析できる。特定の実施態様において、対象から2つ以上の試料を得ることができる。
特定の実施態様において、本明細書に提供される方法に使用される試料は、複数の細胞を含む。そのような細胞は、あらゆる種類の細胞、例えば、幹細胞、血液細胞(cesll)(例えば、末梢血単核細胞)、リンパ球、B細胞、T細胞、単球、顆粒球、免疫細胞、又は腫瘍細胞若しくは癌細胞を含み得る。腫瘍生検材料又は腫瘍外植片などの腫瘍細胞若しくは癌細胞又は腫瘍組織。T細胞(Tリンパ球)には、例えば、ヘルパーT細胞(エフェクターT細胞又はTh細胞)、細胞傷害性T細胞(CTL)、メモリーT細胞、及び制御性T細胞がある。一実施態様において、本明細書に提供される方法に使用される細胞は、例えば、フローサイトメトリーにより検出されるCD3+T細胞である。該方法に使用されるT細胞の数は、単一の細胞から約109細胞の範囲になり得る。B細胞(Bリンパ球)には、例えば、血漿B細胞、メモリーB細胞、B1細胞、B2細胞、辺縁帯B細胞、及び濾胞性B細胞がある。B細胞は、免疫グロブリン(抗体、B細胞受容体)を発現し得る。一実施態様において、本明細書に提供される方法に使用される細胞は、例えば、フローサイトメトリーにより検出されるCD20+B細胞である。
mRNAレベルを検出又は定量化するいくつかの方法が当分野に公知である。例示的な方法には、ノーザンブロット、リボヌクレアーゼプロテクションアッセイ、PCR系の方法などがある。mRNA配列、例えば、CRBN若しくはCRBN関連タンパク質のmRNA又はその断片を使用して、少なくとも部分的に相補的であるプローブを調製できる。次いで、プローブを使用して、PCR系の方法、ノーザンブロッティング、ディップスティックアッセイなどの任意の好適なアッセイを利用して、試料中のmRNA配列を検出できる。
タンパク質検出及び及び定量化のいくつかの方法を利用して、CRBN又はCRBN関連タンパク質のレベルを測定できる。任意の好適なタンパク質定量化方法を利用できる。いくつかの実施態様において、抗体系の方法が利用される。利用できる例示的な方法には、イムノブロッティング(ウェスタンブロット)、酵素結合免疫吸着法(ELISA)、免疫組織化学、フローサイトメトリー、サイトメトリックビーズアレイ、質量分析法などがあるがこれらに限定されない。直接ELISA、間接ELISA、及びサンドイッチELISAを含む数種のELISAが通常使用される。
本明細書に提供される方法のための化合物には、特定の癌を含む数種のヒトの疾患の治療に有用になり得る化合物の群である、「IMiD」(登録商標)(Celgene社)として知られる化合物を含む免疫調節化合物があるがこれらに限定されない。
代表的な化合物は下記の式のものである:
XとYの一方はC=Oであり、XとYの他方はC=O又はCH2であり;
(i)R1、R2、R3、及びR4のそれぞれは、互いに独立に、ハロ、1〜4つの炭素原子のアルキル、又は1〜4つの炭素原子のアルコキシであり、或いは(ii)R1、R2、R3、及びR4の1つは-NHR5であり、R1、R2、R3、及びR4の残りは水素であり;
R5は、水素又は1〜8つの炭素原子のアルキルであり;
R6は、水素、1〜8つの炭素原子のアルキル、ベンジル、又はハロであり;
但し、X及びYがC=Oであり、且つ(i)R1、R2、R3、及びR4のそれぞれがフルオロであるか、又は(ii)R1、R2、R3、若しくはR4の1つがアミノである場合、R6が水素以外であることを条件とする)。
代表的な化合物は、式IIのもの、並びにその医薬として許容し得る塩、水和物、溶媒和物、クラスレート、エナンチオマー、ジアステレオマー、ラセミ混合物、及び立体異性体の混合物である:
XとYの一方はC=Oであり、他方はCH2又はC=Oであり;
R1は、H、(C1-C8)アルキル、(C3-C7)シクロアルキル、(C2-C8)アルケニル、(C2-C8)アルキニル、ベンジル、アリール、(C0-C4)アルキル-(C1-C6)ヘテロシクロアルキル、(C0-C4)アルキル-(C2-C5)ヘテロアリール、C(O)R3、C(S)R3、C(O)OR4、(C1-C8)アルキル-N(R6)2、(C1-C8)アルキル-OR5、(C1-C8)アルキル-C(O)OR5、C(O)NHR3、C(S)NHR3、C(O)NR3R3'、C(S)NR3R3'、又は(C1-C8)アルキル-O(CO)R5であり;
R2は、H、F、ベンジル、(C1-C8)アルキル、(C2-C8)アルケニル、又は(C2-C8)アルキニルであり;
R3及びR3'は、独立に、(C1-C8)アルキル、(C3-C7)シクロアルキル、(C2-C8)アルケニル、(C2-C8)アルキニル、ベンジル、アリール、(C0-C4)アルキル-(C1-C6)ヘテロシクロアルキル、(C0-C4)アルキル-(C2-C5)ヘテロアリール、(C0-C8)アルキル-N(R6)2、(C1-C8)アルキル-OR5、(C1-C8)アルキル-C(O)OR5、(C1-C8)アルキル-O(CO)R5、又はC(O)OR5であり;
R4は、(C1-C8)アルキル、(C2-C8)アルケニル、(C2-C8)アルキニル、(C1-C4)アルキル-OR5、ベンジル、アリール、(C0-C4)アルキル-(C1-C6)ヘテロシクロアルキル、又は(C0-C4)アルキル-(C2-C5)ヘテロアリールであり;
R5は、(C1-C8)アルキル、(C2-C8)アルケニル、(C2-C8)アルキニル、ベンジル、アリール、又は(C2-C5)ヘテロアリールであり;
R6の各出現は、独立に、H、(C1-C8)アルキル、(C2-C8)アルケニル、(C2-C8)アルキニル、ベンジル、アリール、(C2-C5)ヘテロアリール、又は(C0-C8)アルキル-C(O)O-R5であるか、或いはR6基は共にヘテロシクロアルキル基を形成でき;
nは、0又は1であり;且つ
*は、キラル炭素中心を表す)。
R2は、H又は(C1-C8)アルキルであり;且つ
R3は、(C1-C8)アルキル、(C3-C7)シクロアルキル、(C2-C8)アルケニル、(C2-C8)アルキニル、ベンジル、アリール、(C0-C4)アルキル-(C1-C6)ヘテロシクロアルキル、(C0-C4)アルキル-(C2-C5)ヘテロアリール、(C5-C8)アルキル-N(R6)2;(C0-C8)アルキル-NH-C(O)O-R5;(C1-C8)アルキル-OR5、(C1-C8)アルキル-C(O)OR5、(C1-C8)アルキル-O(CO)R5、又はC(O)OR5であり;他の変数は同じ定義を有する。
XとYの一方はC=Oであり、他方はCH2又はC=Oであり;
Rは、H又はCH2OCOR'であり;
(i)R1、R2、R3、又はR4のそれぞれは、互いに独立に、ハロ、1〜4つの炭素原子のアルキル、又は1〜4つの炭素原子のアルコキシであり、或いは(ii)R1、R2、R3、又はR4の1つはニトロ又は-NHR5であり、R1、R2、R3、又はR4の残りは水素であり;
R5は、水素又は1〜8つの炭素のアルキルであり、
R6は、水素、1〜8つの炭素原子のアルキル、ベンゾ、クロロ、又はフルオロであり;
R'はR7-CHR10-N(R8R9)であり;
R7は、m-フェニレン又はp-フェニレン又は-(CnH2n)-であり、式中nは0〜4の値を有し;
R8とR9のそれぞれは、互いに独立に、水素又は1〜8つの炭素原子のアルキルであり、或いはR8とR9は共にテトラメチレン、ペンタメチレン、ヘキサメチレン、又は-CH2CH2X1CH2CH2-であり、式中X1は-O-、-S-、又は-NH-であり;
R10は、水素、8つの炭素原子のアルキル、又はフェニルであり;且つ
*は、キラル炭素中心を表す)。
XとYの一方はC=Oであり、XとYの他方はC=O又はCH2であり;
(i)R1、R2、R3、又はR4のそれぞれは、互いに独立に、ハロ、1〜4つの炭素原子のアルキル、又は1〜4つの炭素原子のアルコキシであり、或いは、(ii)R1、R2、R3、及びR4の1つは-NHR5であり、R1、R2、R3、及びR4の残りは水素であり;
R5は、水素又は1〜8つの炭素原子のアルキルであり;
R6は、水素、1〜8つの炭素原子のアルキル、ベンゾ、クロロ、又はフルオロであり;
R7は、m-フェニレン又はp-フェニレン又は-(CnH2n)-であり、式中nは0〜4の値を有し;
R8とR9のそれぞれは、互いに独立に、水素又は1〜8つの炭素原子のアルキルであり、或いはR8とR9は共に、テトラメチレン、ペンタメチレン、ヘキサメチレン、又は-CH2CH2X1CH2CH2-であり、式中X1は-O-、-S-、又は-NH-であり;且つ
R10は、水素、8つの炭素原子のアルキル、又はフェニルである)。
XとYの一方はC=Oであり、XとYの他方はC=O又はCH2であり;
R1、R2、R3、及びR4のそれぞれは、互いに独立に、ハロ、1〜4つの炭素原子のアルキル、又は1〜4つの炭素原子のアルコキシであり、或いは(ii)R1、R2、R3、及びR4の1つは、ニトロ又は保護されたアミノであり、R1、R2、R3、及びR4の残りは水素であり;且つ
R6は、水素、1〜8つの炭素原子のアルキル、ベンゾ、クロロ、又はフルオロである)。
XとYの一方はC=Oであり、XとYの他方はC=O又はCH2であり;
(i)R1、R2、R3、及びR4のそれぞれは、互いに独立に、ハロ、1〜4つの炭素原子のアルキル、又は1〜4つの炭素原子のアルコキシであり、或いは(ii)R1、R2、R3、及びR4の1つは-NHR5であり、R1、R2、R3、及びR4の残りは水素であり;
R5は、水素、1〜8つの炭素原子のアルキル、又はCO-R7-CH(R10)NR8R9であり、式中、R7、R8、R9、及びR10のそれぞれは本明細書で定義された通りであり;且つ
R6は、1〜8つの炭素原子のアルキル、ベンゾ、クロロ、又はフルオロである)。
XとYの一方はC=Oであり、XとYの他方はC=O又はCH2であり;
R6は、水素、1〜8つの炭素原子のアルキル、ベンジル、クロロ、又はフルオロであり;
R7は、m-フェニレン、p-フェニレン、又は-(CnH2n)-であり、式中nは0〜4の値を有し;
R8とR9のそれぞれは、互いに独立に、水素又は1〜8つの炭素原子のアルキルであり、或いは、R8とR9は共に、テトラメチレン、ペンタメチレン、ヘキサメチレン、又は-CH2CH2X1CH2CH2-であり、式中X1は-O-、-S-、又は-NH-であり;且つ
R10は、水素、1〜8つの炭素原子のアルキル、又はフェニルである)。
Yは、酸素又はH2であり、且つ
R1、R2、R3、及びR4のそれぞれは、互いに独立に、水素、ハロ、1〜4つの炭素原子のアルキル、1〜4つの炭素原子のアルコキシ、又はアミノである)。
R1及びR2の第1は、ハロ、アルキル、アルコキシ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、シアノ、又はカルバモイルであり、R1及びR2の第2は、第1とは独立に、水素、ハロ、アルキル、アルコキシ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、シアノ、又はカルバモイルであり、且つ
R3は、水素、アルキル、又はベンジルである)。
R1及びR2の第1は、ハロ、1〜4つの炭素原子のアルキル、1〜4つの炭素原子のアルコキシ、各アルキルが1〜4つの炭素原子のものであるジアルキルアミノ、シアノ、又はカルバモイルであり;R1及びR2の第2は、第1とは独立に、水素、ハロ、1〜4つの炭素原子のアルキル、1〜4つの炭素原子のアルコキシ、アルキルが1〜4つの炭素原子のものであるアルキルアミノ、各アルキルが1〜4つの炭素原子のものであるジアルキルアミノ、シアノ、又はカルバモイルであり;且つ
R3は、水素、1〜4つの炭素原子のアルキル、又はベンジルである)。具体的な例には、1-オキソ-2-(2,6-ジオキソピペリジン-3-イル)-4-メチルイソインドリンがあるが、これに限定されない。
R3は、水素、1〜4つの炭素原子のアルキル、又はベンジルである)。
X1とX2の一方は、ニトロ、又はNH-Zであり、X1又はX2の他方は水素であり;
R1及びR2のそれぞれは、互いに独立に、ヒドロキシ又はNH-Zであり;
R3は、1〜6つの炭素のアルキル、ハロ、又は水素であり;
Zは、水素、フェニル、1〜6つの炭素のアシル、又は1〜6つの炭素のアルキルであり;且つ
nは、0、1、又は2の値を有し;且つ
-COR2と-(CH2)nCOR1が異なる場合、C*と明示された炭素原子はキラリティの中心を構成する)。
X1とX2の一方は1〜6つの炭素のアルキルであり;
R1及びR2のそれぞれは、互いに独立に、ヒドロキシ又はNH-Zであり;
R3は、1〜6つの炭素のアルキル、ハロ、又は水素であり;
Zは、水素、フェニル、1〜6つの炭素のアシル、又は1〜6つの炭素のアルキルであり;且つ
nは、0、1、又は2の値を有し;且つ
-COR2と-(CH2)nCOR1が異なる場合、C*と明示された炭素原子はキラリティの中心を構成する)。
代表的な化合物は下記式のものである:
*で明示された炭素原子はキラリティの中心を構成し;
Xは、-C(O)-又は-CH2-であり;
R1は、1〜8つの炭素原子のアルキル又は-NHR3であり;
R2は、水素、1〜8つの炭素原子のアルキル、又はハロゲンであり;且つ
R3は、水素、
非置換若しくは1〜8つの炭素原子のアルコキシ、ハロ、アミノ、若しくは1〜4つの炭素原子のアルキルアミノにより置換された1〜8つの炭素原子のアルキル、
3〜18の炭素原子のシクロアルキル、
非置換若しくは1〜8つの炭素原子のアルキル、1〜8つの炭素原子のアルコキシ、ハロ、アミノ、若しくは1〜4つの炭素原子のアルキルアミノにより置換されたフェニル、
非置換若しくは1〜8つの炭素原子のアルキル、1〜8つの炭素原子のアルコキシ、ハロ、アミノ、若しくは1〜4つの炭素原子のアルキルアミノ、若しくは-COR4により置換されたベンジルであり、
式中、R4は、水素、
非置換若しくは1〜8つの炭素原子のアルコキシ、ハロ、アミノ、若しくは1〜4つの炭素原子のアルキルアミノにより置換された1〜8つの炭素原子のアルキル、
3〜18の炭素原子のシクロアルキル、
非置換若しくは1〜8つの炭素原子のアルキル、1〜8つの炭素原子のアルコキシ、ハロ、アミノ、若しくは1〜4つの炭素原子のアルキルアミノに置換されたフェニル、又は
非置換若しくは1〜8つの炭素原子のアルキル、1〜8つの炭素原子のアルコキシ、ハロ、アミノ、若しくは1〜4つの炭素原子のアルキルアミノに置換されたベンジルである)。
R1は、水素;ハロ;-(CH2)nOH;1つ以上のハロにより任意に置換されている(C1-C6)アルキル;1つ以上のハロにより任意に置換されている(C1-C6)アルコキシ;又は-(CH2)nNHRaであり、
式中、Raは、水素;
1つ以上のハロにより任意に置換されている(C1-C6)アルキル;
-(CH2)n-(6〜10員のアリール);
-C(O)-(CH2)n-(6〜10員のアリール)又は-C(O)-(CH2)n-(6〜10員のヘテロアリール)(ここで、該アリール又はヘテロアリールは、下記の1つ以上により任意に置換されている:ハロ;-SCF3;それ自体1つ以上のハロにより任意に置換されている(C1-C6)アルキル;又はそれ自体1つ以上のハロにより任意に置換されている(C1-C6)アルコキシ);
-C(O)-(C1-C8)アルキル(ここで、該アルキルは、1つ以上のハロにより任意に置換されている);
-C(O)-(CH2)n-(C3-C10-シクロアルキル);
-C(O)-(CH2)n-NRbRc(ここで、Rb及びRcは、それぞれ独立に:
水素;
1つ以上のハロにより任意に置換されている(C1-C6)アルキル;
1つ以上のハロにより任意に置換されている(C1-C6)アルコキシ;又は
下記の1つ以上により任意に置換されている6〜10員のアリールである:ハロ;それ自体1つ以上のハロにより任意に置換されている(C1-C6)アルキル;又はそれ自体1つ以上のハロにより任意に置換されている(C1-C6)アルコキシ);
-C(O)-(CH2)n-O-(C1-C6)アルキル;又は
-C(O)-(CH2)n-O-(CH2)n-(6〜10員のアリール)であり
R2は、水素;-(CH2)nOH;フェニル;-O-(C1-C6)アルキル;又は1つ以上のハロにより任意に置換されている(C1-C6)アルキルであり;
R3は、水素;又は1つ以上のハロにより任意に置換されている(C1-C6)アルキルであり;且つ
nは、0、1、又は2である)。
Xは、C=O又はCH2であり;
R1は-Y-R3であり;
R2はH又は(C1-C6)アルキルであり;
Yは、それぞれが任意に1つ以上のハロゲンにより置換されていてよい6〜10員のアリール、ヘテロアリール、若しくは複素環;又は結合であり;
R3は:-(CH2)n-アリール、-O-(CH2)n-アリール、又は-(CH2)n-O-アリール(ここで、該アリールは、任意に下記の1つ以上により置換されている:それ自体1つ以上のハロゲンにより任意に置換されている(C1-C6)アルキル;それ自体1つ以上のハロゲンにより置換されている(C1-C6)アルコキシ;オキソ;アミノ;カルボキシル;シアノ;ヒドロキシル;ハロゲン;重水素;(C1-C6)アルキル、(C1-C6)アルコキシ、若しくはハロゲンの1つ以上により任意に置換されている6〜10員のアリール若しくはヘテロアリール;-CONH2;又は-COO-(C1-C6)アルキル(ここで、該アルキルは、1つ以上のハロゲンにより任意に置換されてよい));
-(CH2)n-複素環、-O-(CH2)n-複素環、又は-(CH2)n-O-複素環(ここで、該複素環は、下記の1つ以上により任意に置換されている:それ自体1つ以上のハロゲンにより任意に置換されている(C1-C6)アルキル;それ自体1つ以上のハロゲンにより置換されている(C1-C6)アルコキシ;オキソ;アミノ;カルボキシル;シアノ;ヒドロキシル;ハロゲン;重水素;(C1-C6)アルキル、(C1-C6)アルコキシ、若しくはハロゲンの1つ以上により任意に置換されている6〜10員のアリール若しくはヘテロアリール;-CONH2;又は-COO-(C1-C6)アルキル(ここで、該アルキルは、1つ以上のハロゲンにより任意に置換されてよい));又は
-(CH2)n-ヘテロアリール、-O-(CH2)n-ヘテロアリール、又は-(CH2)n-O-ヘテロアリール(ここで、該ヘテロアリールは、下記の1つ以上により任意に置換されている:それ自体1つ以上のハロゲンにより任意に置換されている(C1-C6)アルキル;それ自体1つ以上のハロゲンにより置換されている(C1-C6)アルコキシ;オキソ;アミノ;カルボキシル;シアノ;ヒドロキシル;ハロゲン;重水素;(C1-C6)アルキル、(C1-C6)アルコキシ、若しくはハロゲンの1つ以上により任意に置換されている6〜10員のアリール若しくはヘテロアリール;-CONH2;若しくは-COO-(C1-C6)アルキル(ここで、該アルキルは、1つ以上のハロゲンにより任意に置換されてよい))であり;且つ
nは、0、1、2、又は3である)。
本明細書に提供される方法を実施するためのキット及び組成物も企図される。特定の実施態様において、免疫調節化合物の効能を決定するのに有用なキットが本明細書に提供される。特定の実施態様において、化合物が免疫調節性であるか否かを決定するのに有用なキットが本明細書に提供される。特定の実施態様において、疾患又は障害の治療における化合物の効能(efficary)を評価するのに有用なキットが本明細書に提供される。いくつかの実施態様において、免疫調節化合物の効果を決定するのに有用なキットが本明細書に提供される。特定の実施態様において、効果的なリンパ腫、白血病、多発性骨髄腫、固形腫瘍、非ホジキンリンパ腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、急性骨髄芽球性白血病、慢性リンパ性白血病、骨髄異形成症候群、又はメラノーマの治療の可能性を予測するのに有用なキット又は1種以上の化合物(例えば、薬物)による治療の有効性をモニターするのに有用なキットが本明細書に提供される。該キットは、固体担体、及び生体試料中の少なくとも1種のバイオマーカーのタンパク質発現を検出する手段を含む。そのようなキットは、例えば、ディップスティック、メンブラン、チップ、ディスク、試験片、フィルター、微小球体、スライド、マルチウェルプレート、又は光ファイバーを利用し得る。キットの固体担体は、例えば、プラスチック、ケイ素、金属、樹脂、ガラス、メンブラン、粒子、沈殿物、ゲル、ポリマー、シート、球体、多糖、キャピラリー、フィルム、プレート、又はスライドであり得る。生体試料は、例えば、細胞培養物、細胞系、組織、口腔組織、胃腸組織、器官、細胞小器官、生物学的流体、血液試料、尿試料、又は皮膚試料であり得る。生体試料は、例えば、リンパ節生検、骨髄生検、又は末梢血腫瘍細胞の試料であり得る。
本発明の特定の実施態様は、下記の非限定的な実施例により説明される。
(7.1.1 Aiolos抗体のコンジュゲーション及び試験)
この実施例は、Aiolos抗体と、本明細書に提供される方法の特定の実施態様において使用されるAlexa Fluor 647とのコンジュゲーション及びコンジュゲートされた抗体の試験を説明する。簡単に述べると、Aiolos 0-21 ウサギポリクローナル抗体(SantaCruz社製カタログ番号sc-101982)又は他の好適なポリクローナル抗体若しくはモノクローナル抗体をAlexa Fluor 647に直接コンジュゲートし、次いで、陽性対照(末梢血)及び陰性対照細胞系での特異性を試験する。細胞を、BD Lyse/Fixと、それに続いてBD Perm Buffer Iにより固定化する。抗体の特異性を、被験化合物のある場合とない場合で実施する。
目的:PBMC中の表面マーカー発現を維持しながら対象とする全マーカーの検出のための最適な方法を決定する。PBMC又は新鮮な正常ドナー全血を、担体対照又は1マイクロモルの化合物Bで2時間処理し、次いで下記の通り処理する。未処理のMM-BMMCも使用する。
新鮮な正常ドナー全血試料の安定性を検討する。5つ(5)の正常ドナー全血試料(基本発現のみ)を抜き取り、先の実施例により決定した方法により固定化する。固定化された試料を2つのアリコートに分ける。1つのアリコートは4℃で1時間置き、他方は-20℃で1時間置く。これらの試料を直ちに(第0日)試験する。残りのアリコートを4℃又は-20℃で保存し、生体外で第1日、生体外で第2日、生体外で第3日に試験する。
アッセイの繰り返し精度を決定するために、上記の安定性を試験した同じ5-NWB試料を、三連で1時点で試験する。これらの試料を、三連で、第0日4℃調製試料で試験した。操作者間の精度を試験するために、同じ試料を、同じ日に第2の操作者により処理する。分析には、CD19+a、CD3+、及び総CD45+リンパ球集団中のAiolosの定量的な発現レベルを含み、(MEFLで報告)する。平均、標準偏差、及び%CVを、反復実験間及び操作者間で計算する。
この実施例は、FACS分析を利用した細胞系及びPBMC中のAiolosの決定を表す。
カニクイザル(M.ファスシキュラリス(M. fascicularis))血液から、2.5mlの全血あたりおよそ1000万(10×106)単核細胞(PBMC)が得られる(Non Human Primate Reagent Source, Bostonによるプロトコルに従う)。カニクイザルの血液からPBMCを単離した後、およそ7×106細胞を、タンパク質分析用に小分けし、3×106細胞をmRNA分析用に使用した。
図4に示される通り、カニクイザルにおける試験を2相に分けた:第I相(試験物品、化合物B塩酸塩による7日の経口実施(doing))、それに続いて28日の試験物品無投薬期間、及び最後に第II相(試験物品による28日の経口投薬)。この試験の第I相の目的は、化合物Bの薬力学作用の始まり及び期間を決定することであった。この試験の第II相の目的は、化合物Bの薬力学作用と安全性/忍容性の関係を調査することであった。さらに、化合物Bの毒物動態特性を決定した。試験した化合物Bの投与量は、0.75mg/kg1日1回、隔日、又は4日投薬3日投薬なしであった。試験物品及び対照物品を、適切な動物に、強制経口投与により、上述の投与計画に従って、第I相の第1日から第7日及び第II相の第1日から第28日に投与した。第I相と第II相は、少なくとも28日の無投薬期間により分けた。各動物の投与体積は、直近の体重測定に基づいていた。経鼻胃/経口胃チューブを鼻腔(経鼻胃)又は口腔(経口胃)に通して挿入し、下部食道中に胃まで進めた。動物を、用量投与のために一時的に拘束し(例えば、手作業で)、鎮痛剤を使用しなかった。各動物/投与には、使い捨ての滅菌シリンジ及び経鼻胃/経口胃チューブを使用した。各投与の後に、およそ5mLの水道水を流した。投薬製剤を、用量投与の間に連続的に撹拌した。フローサイトメトリーにより分析した末梢血単核細胞サブセットは、CD45+/CD3+/CD20+/CD16+、CD45+/CD20+、CD45+/CD3+、CD45+/CD3+/CD4+、CD45+/CD3+/CD8+、CD45+/CD3-/CD16+、CD45+/CD3-/CD14+であった。抗KLH抗体力価をELISAにより評価した(図5)。
U266細胞をATCC(American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA)から得た。DF15細胞をJohn Shaughnessy (University of Arkansas, Little Rock, AR, USA)から得た。CD19+B細胞をHemaCare BioResearch Products社 (Van Nuys, CA)から得た。細胞を、10%(V/V)熱失活ウシ胎児血清(Gibco, Grand Island, NY, USA)を含み2mMのグルタミンを補ったRPMI-1640培地(Cellgro社製, Manassas, VA)で増殖させた。U266及びDF15細胞(8×105/ウェル)又はB細胞(4×105細胞/ウェル)を6ウェルプレートに蒔き、種々の時間及び濃度でレナリドミドとポマリドミドのいずれかで処理した。初代T細胞を、「RosetteSep」プロトコル(Stem Cell Technologies社, Vancouver, Canada)に従って、Ficollによる遠心分離によりヒト白血球(Blood Center of New Jersey, East Orange, NJ)から単離した。精製されたT細胞を、抗CD3抗体(Ebioscience社製, San Diego, CA)により刺激し、種々の時間及び濃度でレナリドミドとポマリドミドのいずれかで処理した。デキサメタゾン(Sigma社製, St. Louis, MO)、メルファラン(Sigma社製, St. Louis, MO)、及びボルテゾミブ (Selleck Chemicals社製, Houston, TX)処理は6時間であった。最終DMSO濃度は0.1%である。薬物添加の前に、細胞を、10μMのMG-132(Calbiochem Biochemicals社製, Billerica, MA)により30分間事前処理した。細胞を収集し、PBS中で洗浄し、細胞溶解物をSDS-PAGEゲル(Bio-Rad社製, Hercules, CA)上で分離した。メンブランを、抗Aiolos抗体(Santa Cruz Biotechnology社製, Dallas, TX)、抗Ikaros抗体(Millipore社製, Billerica, MA)、及び抗アクチン抗体(Sigma社製, St. Louis, MO;又はLI-COR Biosciences社製, Lincoln, NE)、並びに二次抗体(LI-COR Biosciences社製, Lincoln, NE)によりイムノブロットした。ブロットは、Odysseyイメージャー(LI-COR Biosciences社製, Lincoln, NE)により分析した。
ウェルあたり250万のU266多発性骨髄腫細胞(ATCC)を、6ウェルディッシュに蒔き、100mg/mLのシクロヘキシミド(Sigma社製, C4859)と共にインキュベートし、DMSO、10μMのレナリドミド、又は1μMのポマリドミドのいずれかで、0、1.5、3、又は6時間処理した。細胞溶解物を、10%TGX SDS-PAGEゲル(Bio-Rad社製)上で分離し、Aiolos(Santa Cruz社製, sc-10198)、Ikaros(Millipore社製, ABD16)、及びアクチン(Sigma社製, AC 15)用にブロットした。
初代T細胞を、「RosetteSep」プロトコル(Stem Cell Technologies社, Vancouver, Canada)に従って、Ficollによる遠心分離によって、ヒト白血球(Blood Center of New Jersey, East Orange, NJ)から単離した。精製したT細胞を、1μg/mLのPHA-L(Sigma社製, St. Louis, MO)で37℃で 24時間処理し、次いで、プログラム2100、電圧+15、幅+2パルスでNeon Transfection System(Invitrogen社製, Grand Island, NY)を利用し、siCRBN又はsiAiolos(Invitrogen社製)によりトランスフェクトした(200nM siRNA/100 μL T 緩衝液/ 8×106細胞/ショット×5ショット)。低GC含量siRNA(Invitrogen社製, Grand Island, NY)を陰性対照としてトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞をプールし、10% FBSを含む20ml RPMIを含む、OKT3(3μg/mL, eBioscience社製, San Diego, CA)被覆された10cmディッシュ中で、37℃で24時間培養した。細胞を、ウェスタンブロット(抗Aiolos: Santa Cruz社製, sc-10198, ロットC-0212)及びqRT-PCR(Applied Biosystem社製, 遺伝子発現CRBN Hs00372271_ml ; IKZF3 ID番号:Hs00232635_ml)により、CRBN又はAiolosノックダウン効率を測定するために回収した。細胞を、qRT-PCR(Applied Biosystem社製, 遺伝子発現ID番号:Hs00174114_ml)によりIL-2 RNAを測定するためにも回収した。siCRBNにトランスフェクトされた細胞におけるAiolos発現には、残りのsiCRBNにトランスフェクトされた細胞を、OKT3を事前結合した(3μg/mL)12ウェルTCプレートに、15×106細胞/3mL/ウェルで播種し、DMSO又は薬物により37℃で24時間処理し、ついでウェスタン分析のために回収した。Aiolos及びIkarosタンパク質発現を、Aiolosに対する抗体(Santa Cruz社製, Dallas, TX)及びIkarosに対する抗体(Millipore社製, Billerica, MA)を使用してイムノブロット分析により決定した。siAiolosにトランスフェクトされた細胞におけるIL-2産生には、残りのトランスフェクトされた細胞を、OKT3を事前結合した(3μg/mL)96ウェルTCプレートに、ウェルあたり2×106細胞で播種し、DMSO又は薬物により37℃で2日間処理した。上清を収集し、IL-2タンパク質をELISA(Thermo Scientific社製, Lafayette, CO)により検出した。
雌のSCIDマウス(Fox Chase SCID(登録商標), C.B-17/Icr-Prkdcscid, Charles River社製) (Wilmington, MA)の右脇腹に、50%マトリゲル(BD Biosciences社製)中の全部で1×107NCI-H929腫瘍細胞を皮下注射した。腫瘍が100〜150mgの平均サイズに達すると、各群の10匹のマウスをビヒクル(脱イオン水中の0.5%のカルボキシメチルセルロース:0.25% Tween 80)又は示される投与量の経口レナリドミドのいずれかにより毎日19日間処置した。健康状態並びに腫瘍の成長に関して、マウスをモニターした。全マウスの腫瘍をデジタルキャリパーにより測定し、体積を下記式により計算した:腫瘍体積(mm3)=長さ(mm)×幅(mm)2。サテライト群において、マウス(群あたり3匹)を、7日間、ビヒクル又は示された投与量の毎日の経口レナリドミドのいずれかにより処置し、腫瘍を摘出し、免疫組織化学分析のために急速冷凍した。
厚さ4ミクロンのホルマリン固定パラフィン包埋異種移植片腫瘍切片を、CRBNに対する抗体(ウサギモノクローナルCelgene CRBN65)、Aiolosに対する抗体(ウサギポリクローナル抗体;Santa Cruz社製, Dallas, Texas)、及びIkarosに対する抗体(ウサギポリクローナル抗体;Millipore社製, Billerica, MA)により、Bond-Max自動スライドストレイナー(strainer)(Leica Microsystems社製, Buffalo Grove, IL)及び関連するBond Polymer Refine Detection Kitを利用して染色した。抗原賦活化を、該装置上で、Epitope Retrieval 2(pH 9.0)により、20分間100℃で実施した。スライドを、内因性ペルオキシダーゼ活性に関して、Peroxide Blockにより5分間室温でブロックした。次いで、切片を、1:4000のCRBNに対する一次抗体、1:1000のAiolosに対する一次抗体、及び1:1000のIkarosに対する一次抗体と共に、15分間室温でインキュベートした。これらの一次抗体はウサギ宿主種であるので、一次抗体の後の工程は、マウス異種移植片成分に対する交差反応性を避けるためにプロトコルから除いた。陰性対照スライドには、Bond Primary Antibody Diluentを、一次抗体の代りに与えた。西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)で標識されたポリマーを、装置のデフォルト条件で適用し、ジアミノベンジジン四塩酸塩(DAB)を酵素基質として使用し、特異的な抗体局在化を可視化した。スライドをヘマトキシリンにより対比染色した。IHC染色強度を、0〜3のスケールで点数化した(0=陰性、1=弱い、2=中間、3=強い)。特異的な免疫反応性を持つ細胞の範囲(<1%=0、1〜25%=1、26〜75%=2、及び>75%=3)を記録した。免疫反応性強度の全体スコアを、強度と陽性細胞の範囲の積として計算した。
癌患者に、化合物Aを、0.5mg、1mg、1.5mg、2mg、2.5mg、3、又は3.5mgの投与量で投与した。血液試料を、投薬の直前並びに化合物Aの単一の投与の1.5時間後及び5時間後に採取した。末梢血単核細胞を、全血試料からficollにより単離し、DMSO中で生存可能に凍結した。細胞を、2mLの冷リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で2回洗浄し、2mLの冷BD Cytofix/cytoperm Bufferを加えて透過処理し、氷上で15分間インキュベートした。細胞を遠心分離し、BD perm/wash bufferで2回洗浄し、次いで、40μlのBD perm/wash bufferに再懸濁させた。細胞を、抗CD3抗体又は抗CD19抗体、及び20μlの抗Aiolos抗体(Santa Cruz Santa Cruz, ウサギポリクローナルIgG, カタログ番号sc-101982、染色緩衝液により1:200希釈)又は20μlの細胞に対する適切なアイソタイプ対照により染色した。細胞を完全に混合し、室温で30分間暗所でインキュベートし、BD perm/wash bufferで1回洗浄し、80μlのBD perm/wash bufferに再懸濁させ、フローサイトメーターでの分析の前に20μlの二次抗体を加えた。
3名のドナーからの初代T細胞を、ヒト白血球(Blood Center of New Jersey, East Orange, NJ)から、「RosetteSep」プロトコル(Stem Cell Technologies社, Vancouver, Canada)に従ってFicollによる遠心分離により単離した。精製されたT細胞を、抗CD3抗体(Ebioscience社製, San Diego, CA)により刺激し、6時間薬物処理し、収集し、Aiolos及びIkarosタンパク質発現を、ブロッキングペプチドと共に、又はなしで、Aiolosに対する抗体(Santa Cruz社製, Dallas, TX)及びIkarosによる抗体(Millipore社製, Billerica, MA)を使用してイムノブロット分析により決定した。
ジャーカット細胞を、プログラム1350で電圧+10、幅+3パルスでNeon Transfection System(Invitrogen社製, Grand Island, NY)を利用して、野生型完全長Aiolos及び異なるリジン突然変異完全長Aiolos DNA(Origene社製, 5μg DNA/100μL R 緩衝液/ 2×106細胞/ショット)によりトランスフェクトした。GFP対照DNA(Lonza社製)もトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞を、1mL RPMI+10% FBSを含む24ウェルプレートにおいて37℃で6時間培養し、次いで、DMSO又は薬物によりさらに48時間処理し、薬物処理細胞を、Aiolosに対する抗体(Santa Cruz社製, Dallas, TX)及びIkarosに対する抗体(Millipore社製, Billerica, MA)によるウェスタンブロットによりAiolos及びIkarosタンパク質発現を測定するために回収した。
健康なボランティアに、プラセボ(n=10)又は0.03mg、0.1mg、0.3mg、1mg、若しくは2mg(それぞれN=6)の投与量の化合物Bを投与した。1。血液試料を、投薬前、又は投薬後3時間、12時間、及び24時間に採取した。血液試料を溶解させ、1体積の血液を20体積の1×Lyse/Fix Buffer(BD Biosciences社製、カタログ番号 558049)と混合し、チューブを数回反転して完全に混合することにより、直ちに固定化した。この試料混合物を、37℃の水浴中で10分間インキュベートし、細胞を、800×gで5分間の遠心分離によりペレット化して、上清を吸引により除いた。細胞を、2mLの冷リン酸緩衝生理食塩水(PBS)により2回洗浄し、2mLの冷BD Cytofix/cytoperm Bufferを加えて透過処理し、氷上で15分間インキュベートした。細胞を遠心分離し、次いでBD perm/wash bufferで2回洗浄し、40μlのBD perm/wash bufferに再懸濁させた。細胞を、抗CD3抗体又は抗CD19抗体、及び20μlの抗Aiolos抗体(Santa Cruz Santa Cruz, ウサギポリクローナルIgG, カタログ番号sc-101982:染色緩衝液により1:200で希釈)、又は20μlの細胞に対する適切なアイソタイプ対照により染色した。細胞を完全に混合し、室温で30分間暗所でインキュベートし、BD perm/wash bufferで1回洗浄し、次いで、80μlのBD perm/wash bufferに再懸濁させ、フローサイトメーターでの分析の前に20μlの二次抗体を加えた。
ヒトB細胞を、StemCell Technologies社のB細胞単離キットを利用して、New Jersey Blood Centerから得た3名のドナーの全血から単離した。IKZFファミリータンパク質を、自動キャピラリー系Simple Western System Sally(Protein Simple)を利用して定量化した。100ngの細胞溶解物タンパク質又は組換え型タンパク質の段階希釈物を還元緩衝液中で、蛍光分子量(MW)標準と混合した。これらの試料を95℃に5分間加熱した後、試料を、それぞれのキャピラリーチューブに充填し、タンパク質を、MWサイズに基づいて、スタッキングマトリックス及び分離マトリックスを通して40分間250ボルトで分離した。次いで、タンパク質を、最適な光活性化捕捉化学作用を利用してキャピラリー壁に固定化した。タンパク質固定化の後、キャピラリーを、ブロッキング試薬と共に23分間インキュベートし、標的タンパク質を、特異的一次抗体及び西洋ワサビペルオキシダーゼ-コンジュゲート抗ウサギ二次抗体により(ProteinSimple)により探索した。ルミノールとペルオキシドの混合物(ProteinSimple)を加え、生じた化学ルミネセンスシグナルをCCDカメラにより捉え、Sally用のCompass Software(ProteinSimple)を利用してシグナル強度を定量化して分析した。次いで、各試料中のIkarosファミリータンパク質を、ヒト組換え型タンパク質の標準的な曲線に基づいて計算した。B-アクチンも、内部規格化対照として使用した。
PBMCを、正常なボランティア及び示された炎症疾患を有する患者の全血(Conversant Bio社製, Huntsville, Alabama)から単離した。次いで、細胞を、5%自己由来血清及び抗生物質を補ったRPMI-1640培地で24時間培養した。インキュベーションの後、1×106細胞を回収し、冷PBSで洗浄し、350μL RLT 緩衝液(Qiagen社製)により溶解した。細胞溶解物を、マイクロアレイによるRNA QC及び遺伝子発現分析のためにバーコード付きのチューブに移した。Affymetrix HG-U133 Plus 2.0アレイ実験を、The Covance Genomics Laboratory (Covance)で実施した。
32匹のカニクイザルを、無作為に4群に分けた。各群は4匹の雌と4匹の雄(n=8)を有した。サルの3つの群に、化合物Bを、それぞれ0.04、0.15、0.75mg/kgの投与量で経口投与した。残った群をビヒクル対照(脱イオン水中、0.5%カルボキシメチルセルロース:0.25% Tween 80)として使用した。1か月間の薬物による投薬の後、各サルからの全血をサンプリングし、PBMCを単離した。PBMC中のIkarosレベルを、上述の通り、自動キャピラリー系SimpleWestern System Sally(ProteinSimple)を利用して定量化した。複数の群の比較分析を、GraphPad Prism(登録商標)バージョン5.01(GraphPad Software社製, La Jolla, CA, USA)を利用して、一元分散分析と、それに続くダネットの事後検定により実施した。全ての分析で、P<0.05の値を有意であるとみなした。
患者の試料から生存可能に凍結されたヒト初代B-CLL細胞を、AllCells社(Emeryville, California, USA)から入手し、10%ウシ胎児血清(FBS)(Invitrogen社製, Carlsbad, CA)を含むRoswell Park Memorial Institute(RPMI)-1640培地中で維持した。線維芽細胞を発現しているCD40L(Angela Pipernoからの寄贈, Rockefeller University, NY, NY)を20% FBSを補ったDMEM培地中で維持した。共培養の前に、CD40L線維芽細胞を、10μg/mLのマイトマイシンCにより3時間事前処理し、それに続いてPBSによる洗浄、及びAccutase解離を行った。次いで、細胞を、ウェル(プレートフォーマットあたり24ウェル)あたり6×105細胞の密度で再播種し、一晩増殖させて、単層の形成を可能にした。解凍した生存可能な初代B-CLL患者細胞を、メーカーが供給したプロトコルに従ってCFSE試薬(Vibrant CFDA SE Cell Tracer Kit, Invitrogen社製, Carlsbad, CA, USA)により事前染色し、ウェルあたり0.8〜1×106細胞で、10% FBS、5ng/mL rh-IL4、及び10ng/mL rh-IL10(Peprotech社製, USA)を補ったRPMI1640培地中の事前形成した単層のCD40L線維芽細胞に蒔いた。長期間の培養では、培地の半分を、3日ごとに新しくした。或いは、他のアッセイでは、B-CLL細胞を、事前染色なしにCD40L上で共培養した。
リンパ球(左のパネル)顆粒球(上部パネル)及び単球(右のパネル)における化合物BのAiolos発現の阻害における作用を図1に示す。それぞれ図2及び3に示される通り、化合物Bは、CD20+B細胞及びCD3+T細胞においてAiolos発現を有意に阻害した。図51A及びBに示される通り、化合物Bによる処理時にAiolosのいくらかの阻害がCD19+B細胞及びCD3+T細胞に観察されたが、0.3mgを超える投与量の化合物Bが有意なレベルでAiolos発現を阻害したことが見出された。
ユビキチン化されたタンパク質の質量分析法(Ubiscan):Cell Signaling Technology社のUbiScan(商標)プロテオミクスプラットフォームを利用して、プロテアソーム阻害薬MG132の存在下又は非存在下で、未処理(処理1)又は処理2若しくは処理3により処理された初代ヒトT細胞及び免疫調節化合物により処理されたMM細胞系におけるユビキチン化の違いを同定及び定量化した。UbiScan法は、CST社独自の免疫親和性精製法を利用するユビキチン化されたペプチドのプロテアーゼ消化タンパク質抽出物からの単離と、液体クロマトグラフィー、タンデム質量分析法(LC-MS/MS)によるペプチドの同定及び定量化を合わせたものである。ユビキチン化の定量化は、抗体免疫沈降法により回収されたユビキチン化されたペプチドの存在量に基づいている。各ユビキチン化されたペプチドの存在量又は強度情報は、MSIチャネルで測定されたそのペプチドのピーク高さに基づいている。計算された増加倍率の信頼度は、いくつかの因子に依存するが、重要な因子は、ユビキチン化されたペプチドの強度又はピーク高さである。試料を、LC-MS/MSにより、Orbitrap Velos質量分析計により分析した。各試料中のペプチドイオンのクロマトグラフィーピーク頂点強度を、その対応する抽出されたイオンクロマトグラムから誘導した。標識のない定量化を、各試料中の同じペプチドイオンのピーク強度を比較して、その対応する増加倍率を発生させることにより実施した。定性的データ評価は、主に、自動化されたプロセスであった。SORCERERプラットフォームの特定のスコア付け基準を満たし、確立された実験パラメーター内に含まれるペプチド帰属を、試験の最終結果において保持した。帰属のさらなる信頼性は、特定のペプチドが、不完全なプロテアーゼ消化による重複する配列、還元型及び/又は酸化型のメチオニン残基の存在、又は複数の荷電状態のユビキチン化されたペプチドの存在などの、同じ部位の同定を支持する冗長なSORCERERからの多数の証拠の線を含んでいた場合に得られた。独立に複数回同定されたペプチドは、カウント1のペプチドに比べて正しく帰属された確率が高い。しかし、低カウントのペプチド帰属も、その対応するSORCERERスコア及びデータ品質メトリクス(metrics)により示される通りそれらが充分な実験的証拠を有する場合、自信を持って同定されると考えるべきである(XCorr, DeltaCn, PP確率, 及び質量誤差)。図38に示される通り、ポマリドミド及びレナリドミドは、リジン203を含むAiolosペプチドのユビキチン化を増強させることが見出された。結果により、レナリドミド及びポマリドミドがAiolosの分解を促進することが示される。
レナリドミド及び任意に1種の(1)前駆体分子ニトロ-レナリドミドを、3つ(3)異なるリンカー及び1つの(1)捕捉スカフォールドを利用して合成し、全部で6つ(6)のCapture Compounds(商標)を合成した。Capture compounds は、ビオチン又は蛍光残基を引出し機能(pull-out function)として含み得る。これには、およそ24の合成工程が必要であった。4工程は、最適化されるリスクが中程度であった。20工程は、ルーチンの変換であり、最適化されるリスクが低かった。全てのCapture Compoundsを、精製及び分析して、構造上の同一性、純度、及び安定性を確認した。Capture Compoundsの光化学を、批判的に調査した。多発性骨髄腫細胞系溶解物を、最適化された捕捉条件を利用してCapture Compoundsと共にインキュベートし、明示された生物学的材料内の工程3の全Capture Compoundsのプロファイリングを実施した。適切な対照及びレナリドミドを利用する競合実験により、及び充分な量で与えられたおそらくは不活性なアナログにより、選択的な相互作用を確認した。この工程でのMS試料の数は、およそ100であった。工程6、工程4、及び工程5には、捕捉されたタンパク質の質量分析法分析と、それに続いて統計的及び定量的なLC-MSnデータ分析が伴った。これを基に、工程4でのアッセイの最適化を判断し、工程5での小分子と特異的に相互作用する全タンパク質のリストが生成するだろう。
細胞系(AU565、ZR 75-1、BT-474、EFM-192A、HCC1954、HCC70、MB436、及びBT549)を、標準的な細胞培養技術を利用して維持した。内因性Aiolos発現には、細胞を、3mL体積の培地にウェルあたり0.5×106細胞で6ウェルプレートに播種した。細胞を、一晩プレートに付着させた。細胞を、0、1、及び10μMの化合物Aに、明示された時間曝露させた。
リンパ腫OCI-LY10細胞からの異種移植片を、下記の実験に使用した。免疫組織化学を、Bond-Max自動スライド染色機(Leica Microsystems社製)で、関連するBond Polymer Refine Detection Kitを利用して実施した。厚さ4ミクロンのFFPE切片を該装置上で脱パラフィンした。抗原賦活化をEpitope Retrieval 2(pH 9.0)により20分間100℃で実施した。スライドを、内因性ペルオキシダーゼ活性に関して、Peroxide Blockにより5分間室温でブロックした。次いで、切片を、1/1000希釈のAiolosに対するウサギポリクローナル抗体(Santa Cruz社製, sc-101982)と共に、15分間室温でインキュベートし、それに続いてHRP標識ポリマーと共に8分間室温でインキュベートした。抗Aiolos抗体の酵素的検出を、過酸化水素基質及びジアミノベンジジン四塩酸塩(DAB)色素原により、室温で10分間実施した。スライドを、ヘマトキシリンにより5分間室温で対比染色した。
(7.7.1 FACSアッセイにより決定される全血における作用)
事前秤量した被験化合物を100% DMSOに溶解させ、100mM又は10mMストック濃度をつくった。100% DMSO中の化合物を、必要に応じて、10mM、1mM、0.1mM、0.01mM、0.001mMストック濃度に希釈した。化合物を、必要に応じて10μM、1μM、又は0.1μMの最終濃度で、ヘパリン処理されたヒト全血(1:1000希釈)に直接加えた。10(10)mlの全血を、50mLのコニカルチューブに移し、被験化合物で処理した。最終DMSO濃度は0.1%であった。血液を、1.5時間又は5時間、37℃、5%CO2でインキュベートした。各時点の後で、血液を、下記の通り、溶解/固定化し、透過処理し、洗浄し、Aiolosにより染色した。
事前に秤量された被験化合物を100% DMSOに溶解させて100mM又は10mMストック濃度をつくった。100% DMSO中の化合物を、必要に応じて、10mM、1mM、又は0.1ストック濃度に希釈した。化合物を、必要に応じて10μM、1μM、又は0.1μLの最終濃度で、ヘパリン処理されたヒト全血(1:1000希釈)に直接加えた。7(7)mlの全血を50mLのコニカルチューブに移し、被験化合物により処理した。血液を、1.5時間又は5時間、37℃、5%CO2でインキュベートした。各時点の後で、3.5mlの血液をBD Vacutainer CPT細胞調製チューブに移し、チューブを遺伝学的に(genetically)10回反転し、室温、1800 RCFで20分間遠心分離した。単核層を回収し、15mlコニカルチューブに移した(3×3.5mlのDMSO対照を3本のCPTチューブに加え、単核層を回収して、下記の工程のために合わせた)。チューブを冷PBSにより満たし、4℃、300 RCFで15分間遠心分離した。上清を廃棄し、細胞ペレットを2mlの凍結培地(10% DMSO+90% FBS)に再懸濁させた。細胞懸濁液をクライオバイアルに移し、Mr. Frosty(Fisher社製, カタログ番号15-350-50)に入れて、-80℃の冷凍庫O/Nに放置した。
被験化合物(ポマリドミド、レナリドミド、化合物A、及び化合物B)のAiolosの発現及びIkaros発現に対する作用を、上記図7に記載のウェスタンブロッティングに関連して利用された手順に類似の手順を利用して、化合物による処理後6時間でウェスタンブロット分析により評価した。図37に示される通り、程度は異なるが全ての化合物が、AiolosとIkarosの両方の発現を阻害することが示された。
U266、初代CD3+T細胞、及び初代CD19+B細胞中のAiolos及びIkaros発現の阻害におけるレナリドミド及びポマリドミドの作用を図39Aに示す。図39B及びCに示される通り、種々の濃度のレナリドミド及びポマリドミドは、6つのMM細胞系(OPM-2、RPMI-8226、LP-1、U266、H929、及びJJN3)において、Aiolos及びIkaros発現を有意に阻害した。各バーは、二連で試験された6細胞系の平均を表し、エラーバーは、1標準偏差を表す。
B細胞及びT細胞におけるAiolos発現に対する化合物Aの作用を、図47A及びBに示す。化合物A及び化合物Bを含む本明細書に提供される種々の化合物の、Aiolos及びIkarosに対する作用を図48A及びBに示す。結果は、化合物A及び化合物Bが、試験されたそれぞれの細胞全てにおいてAiolos及びIkarosの発現を低下させたことを示す。
B-CLL細胞を、先に述べたとおり、CD40L線維芽細胞と共培養し、それに続いて、DMSO、10μMのレナリドミド、1μMのポマリドミド、0.1μMの化合物A、及び0.1μMの化合物Bによる72時間の処理を行った。細胞を収集し、ウェスタンブロットにより分析した。CRBN、Aiolos、p21WAF-1、及びIRF4に対する化合物処理の作用を、3種の異なる患者細胞試料で評価した(図56A)。3つの患者試料は、CRBNタンパク質の類似の発現レベルを示す(図56Aの3つのウェスタンブロットのレーン1を比較せよ;図中でゲルは3つの独立した写真として示されているが、試料は同じメンブランに流した)。化合物による処理は、CRBNタンパク質レベルに影響しないか、又はいくつかの試料において、CRBNレベルのわずかな増加を誘発する。評価された3つの患者試料において、CRBNの下流にある提案されるIMiDの標的である転写因子、Aiolos及びIRF4のタンパク質レベルは下方制御され(図56A)、p21WAF-1タンパク質レベルは、レナリドミド、ポマリドミド、化合物A、及び化合物Bによる処理により上方制御された。Aiolos特異的抗体(Santa Cruz社製)を使用する、3つの異なるB-CLL患者共培養物におけるフローサイトメトリーにより示される通り(図56B)、Aiolos減少に対する化合物の作用は用量依存性であった。p21、IRF4、及びAiolosに対する作用は、細胞周期停止及び化合物処理により観察される増殖の阻害と一致している。
陰性対照siRNA又はCRBN特異的siRNAにより48時間トランスフェクトしたB-CLL細胞をCD40L線維芽細胞と共培養し、化合物により処理した。5日間の処理後、Aiolos及びIkarosタンパク質レベルを、フローサイトメトリーのウェスタンブロットにより測定した。3つの異なるB-CLL患者試料において、CRBNノックダウンは、Aiolos及びIkarosタンパク質レベルに対するIMiD化合物の作用を著しく低下させ、その分解を防止した(図57)。図57に示される通り、CRBNノックダウンが、CRBNの下流にある化合物の最も近い標的であるAiolos及びIkarosタンパク質レベルに対する化合物の阻害作用を低下させることが見出された。これらの結果は、骨髄腫及びT細胞における類似のデータと一致するものである。AiolosはB-CLL患者において過剰発現されており、それはB-CLLの生存能力に必要であり、Aiolos及びIkarosファミリーの転写因子の他のメンバーが、B-CLL細胞における良好な治療標的になり得ることを示唆している。
Claims (12)
- 化合物が対象において免疫応答を変えることができるか否かを決定する方法であって、
(a)第1の細胞を該化合物と接触させること;
(b)工程(a)の該第1の細胞から第1の試料を得ること;
(c)該第1の試料中のIKZF1(Ikaros)及び/又はIKZF3(Aiolos)のレベルを決定すること;及び
(d)工程(c)のIKZF1(Ikaros)及び/又はIKZF3(Aiolos)のレベルを基準試料から得られた同じタンパク質のレベルと比較することを含み、該基準と比較したレベルの変化が、該対象において免疫応答を変えることについての該化合物の効能を示し、
該化合物が、サリドマイド、レナリドミド、ポマリドミド、3-(5-アミノ-2-メチル-4-オキソ-4H-キナゾリン-3-イル)-ピペリジン-2,6-ジオン、又は3-(4-((4-(モルホリノメチル)ベンジル)オキシ)-1-オキソイソインドリン-2-イル)ピペリジン-2,6-ジオン、その立体異性体、又はその医薬として許容し得る塩、溶媒和物、水和物、共結晶、クラスレート、若しくは多形体である、前記方法。 - 工程(a)における前記接触がインビトロである、請求項1記載の方法。
- 工程(a)における前記接触がインビボである、請求項1記載の方法。
- 前記第1の細胞が、末梢血単核細胞、B細胞、T細胞、単球、又は顆粒球である、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
- 前記基準が、前記化合物と接触していない第2の細胞を使用して調製され、該第2の細胞が前記第1の細胞と同じ種類である、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
- 工程(c)が、
(i)工程(b)の前記第1の試料内の前記タンパク質を、免疫特異的にIKZF1又はIKZF3に結合する第1の抗体と接触させること;
(ii)該第1の抗体に結合した該タンパク質を、免疫特異的にIKZF1又はIKZF3に結合する第2の抗体であって、該第1の抗体とは異なる、IKZF1又はIKZF3上のエピトープに免疫特異的に結合する、検出可能な標識を有する前記第2の抗体と接触させること;
(iii)IKZF1又はIKZF3に結合した第2の抗体の存在を検出すること;及び
(iv)該第2の抗体中の検出可能な標識の量に基づいて、IKZF1又はIKZF3の量を決定することを含む、請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。 - 工程(c)が、
(i)前記第1の試料内のRNAを、該RNAに特異的に結合する配列を含むプライマーと接触させて、該RNAに相補的な配列を有する第1のDNA分子を生じさせること;
(ii)IKZF1又はIKZF3をコードする遺伝子のセグメントに相当するDNAを増幅させること;及び
(iii)該増幅されたDNAの量に基づいて、IKZF1又はIKZF3のRNAレベルを決定することを含む、請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。 - 前記化合物が、前記基準と比較して、IKZF1又はIKZF3のレベルを低下させる、請求項1〜7のいずれか一項記載の方法。
- 前記IKZF3のレベルが決定され、前記基準と比較される、請求項1〜8のいずれか一項記載の方法。
- 前記IKZF3が58kDaのタンパク質分子量を有する、請求項9記載の方法。
- 前記IKZF3が42kDaのタンパク質分子量を有する、請求項9記載の方法。
- 前記IKZF1のレベルが決定され、前記基準と比較される、請求項1〜8のいずれか一項記載の方法。
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