CN112912516A - 监测对治疗的反应的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于监测个体对多发性骨髓瘤治疗的反应的方法、以及用于治疗个体的多发性骨髓瘤的方法。更具体地，这些方法包括确定由多发性骨髓瘤治疗调节的基因的表达、和将测试样品中该基因的exRNA水平与对照谱中的exRNA水平进行比较，其中该测试样品中该基因的表达与对照相比有改变指示该个体对该治疗有反应。
Description
技术领域
本发明涉及用于监测或确定骨髓瘤治疗功效的方法和试剂盒、以及治疗个体的多发性骨髓瘤的方法。
相关申请
本申请要求澳大利亚临时申请AU 2018903749的优先权，将其全部内容通过引用特此并入。
背景技术
多发性骨髓瘤(MM)是一种由遍及骨髓(BM)的多灶性肿瘤沉积表征的不可治愈的血液系统恶性病。在疾病进展期间，克隆浆细胞演变出独立于BM环境而生长的能力，并且因此在BM外增殖，表现为髓外多发性骨髓瘤和/或浆细胞白血病。
几乎所有MM中都存在核型不稳定和染色体数目异常。涉及免疫球蛋白(IgH)基因和FGFR3/MMSET、CCND1、CCND3或MAF的原发性易位发生在疾病发病期间，并且涉及MYC基因的继发性易位发生在疾病进展期间。
MM的治疗通过蛋白酶体抑制剂和免疫调节剂的实施已经取得了显著的进展，然而，因为细胞通过积累在疾病初期期间通常不存在的突变而获得对全身性疗法的抗性，该疾病仍然不能治愈。对疗法的抗性通常通过MM细胞的遗传进化来介导，更具抗性的克隆具有生长和生存优势。
诊断和预后预测的当前实践是进行连续的BM活检，但是从活检获得的遗传信息被一种或多种肿瘤的已知的克隆间和克隆内异质性干扰。
需要用于确定多发性骨髓瘤的诊断、预后预测和/或监测治疗功效的改进方法或替代方法。
在本说明书中对任何现有技术的提及并不是承认或暗示此现有技术形成任何管辖权的公知常识的一部分，或者此现有技术可合理地预期被理解为被认为与本领域技术人员已知的其他现有技术是相关的和/或与之组合。
发明内容
本发明提供了一种确定个体中多发性骨髓瘤治疗的成功可能性的方法，该方法包括：
-提供已经接受多发性骨髓瘤治疗的个体，其中该治疗包括来那度胺；
-在来自该个体的包含细胞外RNA(exRNA)的测试样品中，确定来自cereblon、ikaros和aiolos中的一个或多个的exRNA水平；
-将该测试样品中来自cereblon、ikaros和aiolos中的一个或多个的exRNA水平与在多发性骨髓瘤治疗之前的多发性骨髓瘤患者中代表exRNA的对照谱进行比较；
-当该测试样品中来自cereblon、ikaros和aiolos中的一个或多个的exRNA水平响应于来那度胺治疗而保持不变或并未增加时，确定该治疗可能未成功。
本发明提供了一种确定个体中多发性骨髓瘤治疗的成功可能性的方法，该方法包括：
-提供已经接受多发性骨髓瘤治疗的个体，其中该治疗包括来那度胺；
-在来自该个体的细胞外RNA(exRNA)的测试样品中，确定来自cereblon、ikaros和aiolos中的一个或多个的exRNA水平；
-将该测试样品中cereblon、ikaros和aiolos中的一个或多个的水平与在多发性骨髓瘤治疗之前的多发性骨髓瘤患者中代表exRNA的对照谱进行比较；
-当该测试样品中来自cereblon、ikaros和aiolos中的一个或多个的exRNA水平响应于来那度胺治疗而增加时，确定该治疗可能成功。
本发明还提供了一种用于确定个体对多发性骨髓瘤治疗的早期反应的方法，该方法包括：
-提供已经接受多发性骨髓瘤治疗的个体，其中该治疗包括来那度胺；
-在开始该治疗之后不超过20天的时间点，在获得自该个体的包含细胞外RNA(exRNA)的测试样品中，确定来自cereblon、ikaros和aiolos中的一个或多个的exRNA水平；
-将该测试样品中来自cereblon、ikaros和aiolos中的一个或多个的exRNA水平与在多发性骨髓瘤治疗之前的多发性骨髓瘤患者中代表exRNA的对照谱进行比较；
其中该测试样品中cereblon、ikaros和aiolos中的一个或多个的水平与对照相比有增加指示该个体对该治疗有反应。优选地，从开始治疗起小于15或10天、并且更优选地5天或更短获得测试样品。
本发明还提供了一种用于预测已经接受多发性骨髓瘤治疗的个体总体生存的可能性的方法，该方法包括：
-在获得自接受该治疗后的个体的、包含exRNA的测试样品中，确定来自cereblon、ikaros和aiolos中的一个或多个的exRNA水平；
-将该测试样品中来自cereblon、ikaros和aiolos中的一个或多个的exRNA水平与在多发性骨髓瘤治疗之前的多发性骨髓瘤患者中代表exRNA的对照谱进行比较；
其中该测试样品中来自cereblon、ikaros和aiolos中的一个或多个的exRNA水平与对照相比增加与受试者和之后时间的无复发生存或总体生存的可能性增加相关，
从而预测该个体总体生存的可能性。
本发明还提供了一种用于预测已经接受多发性骨髓瘤治疗的个体的总体生存可能性的方法，该方法包括：
-在获得自接受该治疗后的个体的、包含exRNA的测试样品中，确定来自cereblon、ikaros和aiolos中的一个或多个的exRNA水平；
-将该测试样品中来自cereblon、ikaros和aiolos中的一个或多个的exRNA水平与在多发性骨髓瘤治疗之前的多发性骨髓瘤患者中代表exRNA的对照谱进行比较；
-其中该测试样品中来自基因的cereblon、ikaros和aiolos中的一个或多个的水平与对照相比降低与受试者和之后时间的无复发生存或总体生存的可能性降低相关，
从而预测该个体总体生存的低可能性。
本发明提供了一种用于提供对治疗方案有反应的患有多发性骨髓瘤的个体的预后的方法，该方法包括：
-在获得自接受该治疗后的个体的、包含exRNA的测试样品中，确定来自cereblon、ikaros和aiolos中的一个或多个的exRNA水平；
-将该测试样品中来自cereblon、ikaros和aiolos中的一个或多个的exRNA水平与接受多发性骨髓瘤治疗之前的多发性骨髓瘤患者中代表exRNA的对照谱进行比较；
-其中该测试样品中来自cereblon、ikaros和aiolos中的一个或多个的exRNA水平与对照相比有增加指示该个体的预后对该治疗方案有反应，
从而提供该个体对该治疗方案有反应的预后。
在本发明的任何方面或实施例中，可以使用方法来提供对治疗方案的无复发生存、总体生存、四年生存、或其他临床或生化可检测的反应的预后。
在本文所述的本发明的任何方面或实施例中，总体生存的高可能性是至少95％、94％、93％、92％、91％、90％、85％、80％、75％或70％。
在本文所述的本发明的任何方面或实施例中，总体生存的低可能性是小于60％、55％、54％、53％、52％、51％、50％、49％、48％、47％、46％、45％或44％。
在本发明的任何方面或实施例中，可以使用方法来提供对治疗方案的无复发生存、总体生存、四年生存、或其他临床或生化可检测的反应的预后。
本发明提供了一种治疗个体的多发性骨髓瘤的方法，该方法包括：
-提供已经接受多发性骨髓瘤治疗的个体，其中该治疗包括来那度胺；
-在来自该个体的包含细胞外RNA(exRNA)的测试样品中，确定cereblon、ikaros和aiolos中的一个或多个的表达；
-将该测试样品中cereblon、ikaros和aiolos中的一个或多个的表达与在多发性骨髓瘤治疗之前的多发性骨髓瘤患者中代表exRNA的对照谱进行比较；
-当该测试样品中cereblon、ikaros和aiolos中的一个或多个的表达响应于治疗而降低、保持不变或并未增加时，向该个体施用替代性治疗。
本发明提供了一种治疗个体的多发性骨髓瘤的方法，该方法包括：
-提供已经接受多发性骨髓瘤治疗的个体，其中该治疗包括来那度胺；
-在来自该个体的包含细胞外RNA(exRNA)的测试样品中，确定cereblon、ikaros和aiolos中的一个或多个的表达；
-将该测试样品中cereblon、ikaros和aiolos中的一个或多个的表达与在多发性骨髓瘤治疗之前的多发性骨髓瘤患者中代表exRNA的对照谱进行比较；
-当该测试样品中cereblon、ikaros和aiolos中的一个或多个的表达响应于该治疗而增加时，继续施用该治疗。
本发明提供了一种用来那度胺治疗个体的方法，该方法包括：
-提供患有多发性骨髓瘤、或怀疑患有多发性骨髓瘤的个体；
-向该个体施用多发性骨髓瘤治疗，其中该治疗包括来那度胺；
-在施用该治疗后，在获得自该个体的包含细胞外RNA(exRNA)的测试样品中，确定cereblon、ikaros和aiolos中的一个或多个的表达；
-将该测试样品中cereblon、ikaros和aiolos中的一个或多个的表达与在多发性骨髓瘤治疗之前的多发性骨髓瘤患者中代表exRNA的对照谱进行比较；
-当该测试样品中cereblon、ikaros和aiolos中的一个或多个的表达响应于该治疗而增加时，继续施用该治疗(包括来那度胺)；或
-当该测试样品中cereblon、ikaros和aiolos中的一个或多个的表达响应于治疗而降低、保持不变或并未增加时，向该个体施用替代性治疗，
从而治疗该个体。
优选地，测量来自cereblon和ikaros的exRNA水平，并且当来自cereblon和ikaros两者的exRNA水平增加时，继续治疗；或可替代地，当来自cereblon和ikaros两者的exRNA水平降低或保持不变时，向个体施用替代性治疗。
在任何实施例中，cereblon、ikaros和aiolos全部三者的exRNA的表达或水平增加时，指示个体对治疗有反应，并且可以继续治疗。优选地，至少cereblon的表达增加，更优选地cereblon和ikaros水平增加。
在某些实施例中，还确定了来自干扰素调节因子4(IRF4)的exRNA水平；并且当来自ikaros的exRNA水平增加且来自IRF4的exRNA水平降低时，继续治疗。可替代地，当还确定了来自IRF4的exRNA水平时，当来自ikaros的exRNA没有变化或降低、且IRF4的水平增加或没有变化时，施用替代性治疗。
当IRF4的水平与测试样品相比降低时，这指示个体对治疗有反应。因此，在优选的实施例中，确定了cereblon、ikaros、aiolos、和IRF4全部四者的exRNA的表达或水平。当cereblon、ikaros和aiolos中的至少一个的表达增加、和/或IRF4的表达降低时，这指示个体对治疗有反应并且可以继续治疗。优选地，至少cereblon的表达增加，并且至少IRF4的表达降低。
在本发明的任何实施例中，已经接受多发性骨髓瘤治疗的个体是患有复发性和/或难治性的多发性骨髓瘤的个体，包括对先前治疗没有反应的个体。在某些实施例中，先前治疗可以是来那度胺，但其未与阿扎胞苷或地塞米松组合。
优选地，在开始治疗的20天内进行将测试样品中的基因的表达与对照谱进行比较、并且确定停止或继续治疗的步骤。更优选地，在开始治疗后小于15天、小于10天、小于5天或小于3天进行比较的步骤。
在以上本发明的任何实施例中，一种方法包括：当个体对治疗没有反应时停止个体接受的初始治疗，并且开始对个体进行替代性治疗。
在以上本发明的另外的方面，在个体对所施用的治疗没有反应的情况下，则包括施用一种或多种替代性药物来治疗个体的步骤。优选地，治疗包括施用与先前施用至患者的药物不同的一种或多种药物，使得改变该个体对多发性骨髓瘤的总体治疗。在一些实施例中，先前施用至患者的一种或多种药物补充有一种或多种另外的药物。在替代性实施例中，先前施用的一种或多种药物用一种或多种替代性药物替换。
在任何实施例中，向个体施用替代性治疗包括停止施用第一治疗。可替代地，替代性治疗可以包括另外的药物来补充第一治疗。
在本发明的任何实施例中，这些方法包括确定预期或已知受治疗调节的一个或多个另外的基因的表达。
在任何实施例中，包含exRNA的测试样品或exRNA的测试样品是获得自含有exRNA的个体的任何生物样品。在任何实施例中，提供exRNA的测试样品的步骤可以涉及直接从个体获得生物样品，以及从该生物样品提取exRNA。生物样品可以选自：静脉血(外周血)、唾液、乳汁、尿液、精液、月经血、和阴道分泌物。优选地，含有exRNA的生物样品是外周血的样品。因此，在任何实施例中，提供exRNA的测试样品的步骤可以包括直接从个体获得外周血样品，以及从血液样品提取exRNA。
在本发明的任何实施例中，测试样品可以包含exRNA、基本上由其组成、或由其组成。
在本发明的任何实施例中，获得外周血的测试样品的步骤可以涉及直接从个体获得外周血样品。
在任何实施例中，对照谱是从患有多发性骨髓瘤或已经接受多发性骨髓瘤治疗的个体获得的任何生物样品，其中该生物样品含有exRNA。生物样品可以选自：静脉血(外周血)、唾液、乳汁、尿液、精液、月经血、和阴道分泌物。优选地，含有exRNA的生物样品是外周血的样品。
在任何实施例中，含有exRNA的对照生物样品获得自接受多发性骨髓瘤治疗之前的个体。在替代性实施例中，对照谱获得自数据库，该数据库包含来自一个或多个多发性骨髓瘤患者的生物样品中的exRNA水平，该生物样品是在这些患者接受多发性骨髓瘤治疗之前获得的。
优选地，在个体接受多发性骨髓瘤治疗之前1、2、5、10、20、30或更多天获得对照谱。
在本发明的任何实施例中，对照样品可以包含exRNA、基本上由其组成、或由其组成。
在本发明的任何实施例中，确定基因的表达或比较基因的表达水平可以是使用标准技术(包括定量RT-PCR和微滴式数字PCR(ddPCR))来确定相对于对照蛋白的表达倍数变化。可替代地，确定或比较基因表达包括确定每体积生物样品中表达的基因的拷贝数。在某些实施例中，确定基因的表达或比较基因的表达水平包括确定或比较每ml外周血样品中基因的拷贝。
应当理解的是，确定基因的表达可以涉及检测源自基因的RNA的一部分或片段，而不是全长RNA转录物。换句话说，本发明考虑了鉴定足够长度的RNA分子以确认来自如本文所述的基因的转录物的表达。
在本发明的任何实施例中，在预期的检测中至少0.01、0.05、0.1、0.5、1、2或更高的exRNA基因表达水平的倍数变化(例如正向调节基因的倍数增加、和负向调节基因的倍数降低)可以被解释为提供了个体对治疗有反应的指示。
本发明提供了一种用于监测个体对多发性骨髓瘤治疗的反应的方法，该方法包括：
-提供已经接受多发性骨髓瘤治疗的个体，其中该治疗包括IMid；
-在来自该个体的细胞外RNA(exRNA)的测试样品中，确定基因cereblon、ikaros和aiolos中的一个或多个的表达；
-将该测试样品中cereblon、ikaros和aiolos中的一个或多个的表达与在多发性骨髓瘤治疗之前的多发性骨髓瘤患者中代表exRNA的对照谱进行比较；
其中该测试样品中cereblon、ikaros和aiolos中的一个或多个的表达与对照相比有增加指示该个体对该治疗有反应。
本发明提供了一种用于预测个体对多发性骨髓瘤治疗有反应的可能性的方法，该方法包括：
-提供已经接受多发性骨髓瘤治疗的个体，其中该治疗包括IMid；
-在来自该个体的细胞外RNA(exRNA)的测试样品中，确定基因cereblon、ikaros和aiolos中的一个或多个的表达；
-将该测试样品中cereblon、ikaros和aiolos中的一个或多个的表达与在多发性骨髓瘤治疗之前的多发性骨髓瘤患者中代表exRNA的对照谱进行比较；
其中该测试样品中cereblon、ikaros和aiolos中的一个或多个的表达与对照相比有增加指示该个体对该治疗有反应。
本发明提供了一种用于监测个体对多发性骨髓瘤治疗的反应的方法，该方法包括：
-提供来自已经接受多发性骨髓瘤治疗的个体的exRNA的测试样品，其中该治疗包括IMid；
-在该测试样品中，确定基因cereblon、ikaros和aiolos中的一个或多个的表达；
-提供对照谱，其含有来自在接受该治疗之前的个体中基因cereblon、ikaros和aiolos的exRNA表达的数据；
-将该测试样品中基因cereblon、ikaros和aiolos中的一个或多个的表达与该对照谱进行比较；
其中该测试样品中基因cereblon、ikaros和aiolos中的一个或多个的表达与对照相比有增加指示该个体对该治疗有反应。
本发明提供了一种用于确定个体对多发性骨髓瘤治疗的早期反应的方法，该方法包括：
-在来自已经接受多发性骨髓瘤治疗的个体的细胞外RNA(exRNA)的测试样品中，确定基因cereblon、ikaros和aiolos中的一个或多个的表达，其中该治疗包括Imid；
-将该测试样品中cereblon、ikaros和aiolos中的一个或多个的表达与在多发性骨髓瘤治疗之前的多发性骨髓瘤患者中代表exRNA的对照谱进行比较；
其中该测试样品中cereblon、ikaros和aiolos中的一个或多个的表达与对照相比有增加指示该个体对该治疗有反应。优选地，在开始多发性骨髓瘤治疗后小于20天获得测试样品。更优选地，从开始治疗起小于15或10天、并且更优选地5天或更短获得测试样品。
优选地，在个体接受多发性骨髓瘤治疗之前1、2、5、10、20、30或更多天获得对照谱。
在任何实施例中，确定至少cereblon的表达和ikaros的表达、或cereblon和aiolos的表达。在任何实施例中，确定了cereblon、ikaros、和aiolos中的全部三者的表达，并且来自所有三种基因的exRNA的增加指示个体对治疗有反应。
在一个实施例中，对照谱是获得自接受多发性骨髓瘤治疗之前的个体的外周血的样品。在替代性实施例中，对照谱获得自数据库，该数据库包含来自一个或多个多发性骨髓瘤患者的I外周血中的exRNA水平，该生物样品是在这些患者接受多发性骨髓瘤治疗之前获得的。
优选地，IMid选自来那度胺(lenalidomide)、泊马度胺(pomolidomide)、沙利度胺(thalidomide)和阿普斯特(apremilast)。
在任何实施例中，多发性骨髓瘤治疗进一步包括用去甲基化剂(hypomethylatingagent)治疗。在一个实施例中，去甲基化剂包括阿扎胞苷。
可替代地，多发性骨髓瘤治疗选自：阿扎胞苷和来那度胺的组合，或阿扎胞苷、来那度胺和地塞米松的组合。
在本发明的任何实施例中，已经接受多发性骨髓瘤治疗的个体是患有复发性和/或难治性的多发性骨髓瘤的个体，包括对先前治疗没有反应的个体，该先前治疗包括来那度胺，但其未与阿扎胞苷或地塞米松组合。
本发明提供了一种治疗个体的多发性骨髓瘤的方法，该方法包括：
-提供已经接受多发性骨髓瘤治疗的个体，其中该治疗包括来那度胺；
-在来自该个体的细胞外RNA(exRNA)的测试样品中，确定来自cereblon、ikaros和aiolos中的一个或多个的exRNA水平；
-将该测试样品中来自cereblon、ikaros和aiolos中的一个或多个的exRNA水平与在多发性骨髓瘤治疗之前的多发性骨髓瘤患者中代表exRNA的对照谱进行比较；
-当该测试样品中来自cereblon、ikaros和aiolos中的一个或多个的exRNA水平响应于来那度胺治疗而保持不变或并未增加时，向该个体施用替代性治疗。
本发明提供了一种治疗个体的多发性骨髓瘤的方法，该方法包括：
-提供已经接受多发性骨髓瘤治疗的个体，其中该治疗包括来那度胺；
-在来自该个体的细胞外RNA(exRNA)的测试样品中，确定来自cereblon、ikaros和aiolos中的一个或多个的exRNA水平；
-将该测试样品中cereblon、ikaros和aiolos中的一个或多个的水平与在多发性骨髓瘤治疗之前的多发性骨髓瘤患者中代表exRNA的对照谱进行比较；
-当该测试样品中来自cereblon、ikaros和aiolos中的一个或多个的exRNA水平响应于来那度胺治疗而增加时，继续向该个体施用该治疗。
优选地，测量来自cereblon和ikaros的exRNA水平，并且当来自cereblon和ikaros两者的exRNA水平增加时，继续治疗；或可替代地，当来自cereblon和ikaros两者的exRNA水平降低或保持不变时，向个体施用替代性治疗。
在某些实施例中，还确定了来自干扰素调节因子4(IRF4)的exRNA水平；并且当来自ikaros的exRNA水平增加且来自IRF4的exRNA水平降低时，继续治疗。可替代地，当还确定了来自IRF4的exRNA水平时，当来自ikaros的exRNA没有变化或降低、且来自IRF4的exRNA水平增加或没有变化时，施用替代性治疗。
在某些实施例中，还确定了来自TGFβ1(转录生长因子β1)的exRNA水平；并且当来自ikaros的exRNA水平增加且来自TGFβ1的exRNA水平增加时，继续治疗。可替代地，当还确定了来自TGFβ1的exRNA水平时，当来自ikaros的exRNA没有变化或降低、且来自TGFβ1的exRNA水平降低或没有变化时，施用替代性治疗。
本发明提供了一种治疗个体的多发性骨髓瘤的方法，该方法包括：
-提供已经接受多发性骨髓瘤治疗的个体，其中该治疗包括来那度胺；
-在来自个体的细胞外RNA(exRNA)的测试样品中，确定编码由来那度胺正向调节的蛋白质的基因的表达；
-将该测试样品中该基因的表达与在多发性骨髓瘤治疗之前的多发性骨髓瘤患者中代表exRNA的对照谱进行比较；
-当该测试样品中该基因的表达响应于来那度胺治疗而保持不变或并未降低时，向该个体施用替代性治疗。
优选地，编码由来那度胺激活的蛋白质的基因、或由来那度胺正向调节的基因选自由以下组成的组：Cereblon、ikaros、aiolos、和TGFβ1。
优选地，编码由来那度胺抑制的蛋白质的基因、或由来那度胺负向调节的基因是IRF4。
本发明提供了IMid在制造用于治疗个体的多发性骨髓瘤的药物中的用途，其中通过本文所述的本发明的任何方法已经确定该个体可能对治疗有反应。
本发明提供了IMid，用于在治疗个体的多发性骨髓瘤中使用，其中通过本文所述的本发明的任何方法已经确定该个体可能对治疗有反应。
本发明提供了一种用于确定个体将对多发性骨髓瘤治疗有反应的可能性的方法，其中该治疗包括免疫调节酰亚胺(IMid)化合物，该方法包括：
-确定来源于个体的肿瘤细胞和非肿瘤细胞两者的、包含exRNA的测试样品中ikaros的表达，该个体已经诊断出或怀疑患有多发性骨髓瘤；
其中该测试样品中存在ikaros的表达指示该患者将对该治疗有反应；并且
其中该测试样品中不存在ikaros的表达指示该患者将对该治疗没有反应。
本发明提供了一种用于确定个体将对多发性骨髓瘤治疗有反应的可能性的方法，其中该治疗包括免疫调节酰亚胺(IMid)化合物和去甲基化剂，该方法包括：
-确定来自个体的exRNA的测试样品中cereblon的表达，该个体已经诊断出或怀疑患有多发性骨髓瘤；
其中该测试样品中cereblon的高表达水平指示该患者将对该治疗没有反应，并且
其中该测试样品中cereblon的低表达水平指示该患者将对该治疗有反应。
本发明提供了一种用于确定个体将对多发性骨髓瘤治疗有反应的可能性的方法，其中该治疗包括免疫调节酰亚胺(IMid)化合物和去甲基化剂，该方法包括：
-确定来自个体的细胞外RNA(exRNA)的测试样品中cereblon的表达，该个体先前已经接受IMid治疗；
其中该测试样品中cereblon的高表达水平指示该患者将对该治疗没有反应，该治疗包含免疫调节酰亚胺(IMid)化合物和去甲基化剂，并且
其中该测试样品中cereblon的低表达水平指示该个体将对该治疗有反应，该治疗包含免疫调节酰亚胺(IMid)化合物和去甲基化剂。
在一个实施例中，该方法进一步包括确定ikaros和aiolos中的一个或多个的表达，并且其中当该个体在治疗之前具有cereblon的低表达水平加上ikaros和/或aiolos的高水平时，指示该个体将可能对治疗有反应。相反地，在治疗之前，个体具有cereblon的高表达水平加上ikaros和/或aiolos的低水平的情况下，指示该个体将可能对治疗没有反应。
在一个实施例中，该方法进一步包括确定SPARC的表达，并且其中该个体在治疗之前具有cereblon的低表达水平加上SPARC的高水平时，指示该个体将可能对该治疗有反应。相反地，在治疗之前具有cereblon表达的高水平加上SPARC的低水平的情况下，指示个体将可能对治疗没有反应。
优选地，个体(确定对IMid和去甲基化剂治疗有反应)先前已经接受IMid治疗。
本领域技术人员应当理解，术语“高表达水平”和“低表达水平”旨在作为相对术语，并且应在具体患者组的上下文中使用。在上下文中，例如，“高表达水平”可被认为是指在获得自患有多发性骨髓瘤的个体的给定样品中并且与多发性骨髓瘤患者总体组群中同一基因的平均或典型表达水平相比，基因exRNA转录物的高拷贝数。
更具体地，如本文所用，“cereblon的高表达水平”可以指exRNA的样品中cereblon转录物的拷贝数为至少400、至少450、优选地大于470个拷贝/mL(优选地，/mL血浆)。
如本文所用，“cereblon的低表达水平”可以指exRNA的样品中cereblon转录物的拷贝数为小于400、小于300、或小于100个拷贝/mL(优选地，/mL血浆)。
如本文所用，“ikaros的高表达水平”可以指exRNA的样品中ikaros转录物的拷贝数为至少80、至少100、优选地大于120个拷贝/mL(优选地，/mL血浆)。
如本文所用，“ikaros的低表达水平”可以指exRNA的样品中ikaros转录物的拷贝数为小于80、小于50、或小于20个拷贝/mL(优选地，/mL血浆)。
如本文所用，“aiolos的高表达水平”可以指exRNA的样品中aiolos转录物的拷贝数为至少200、至少240、优选地大于250个拷贝/mL(优选地，/mL血浆)。
如本文所用，“aiolos的低表达水平”可以指exRNA的样品中aiolos转录物的拷贝数为小于200、小于100、或小于50个拷贝/mL(优选地，/mL血浆)。
如果低于在患有多发性骨髓瘤但是对来那度胺治疗有反应的个体中观察到的拷贝数的20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更低，则通常认为是“低”拷贝数。
如果高于在患有多发性骨髓瘤但是对来那度胺治疗没有反应的个体中观察到的拷贝数的20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更高，则通常认为是“高”拷贝数。
优选地，IMid选自来那度胺(lenalidomide)、泊马度胺(pomolidomide)、沙利度胺(thalidomide)和阿普斯特(apremilast)。
在任何实施例中，多发性骨髓瘤治疗选自由以下组成的组：阿扎胞苷，来那度胺，阿扎胞苷和来那度胺的组合，或阿扎胞苷、来那度胺和地塞米松的组合。
本发明还提供了一种用于在监测个体对多发性骨髓瘤治疗的反应中使用的试剂盒，该试剂盒包含：
-用于检测对应于一个或多个基因的exRNA水平的装置；
-用于从个体的外周血样品中分离或提取exRNA的试剂。
优选地，试剂盒还包含在如本文所述的本发明方法中使用该试剂盒的书面说明。
优选地，用于检测来自一个或多个基因的exRNA水平的装置是用来与来自该一个或多个基因的序列杂交、或对来自该一个或多个基因的序列进行扩增的一个或多个核酸探针或引物。优选的是，探针是寡核苷酸探针，其通过互补碱基配对的方式与该一个或多个基因的序列内的其靶位点结合。为免生疑，在本发明的上下文中，寡核苷酸探针的定义不包括全长基因(或其互补序列)。
如本文所用，除非上下文另有要求，否则术语“包含”及该术语的变型诸如“包括”和“含有”并不旨在排除进一步的添加物、组分、整体或步骤。
前述段落中所述的本发明的进一步方面和这些方面的进一步实施例将从以举例方式给出并参考附图的以下描述中变得清楚。
附图说明
图1：基线exRNA水平是预后的生物标志
筛选时前5个exRNA的随机森林分析(基线)(A)最佳拟合分类OS树，其指示筛选时具有低CRBN水平和高IKZF3水平的患者的进展风险低(0.44)，而具有高CRBN和低SPARC水平的患者的进展风险最高(3.3)；(B)基于分类树所标识的组的OS的卡普兰-迈耶(Kaplan-Meier)图(p＝0.000003)；(C)基于由CRBN、IKZF1和IKZF3组成的限制分类树的PFS的卡普兰-迈耶图，其指示筛选时高水平的CRBN是不利预后的指标(p＝0.014)；(D)基于由CRBN、IKZF1和IKZF3组成的限制分类树的OS的卡普兰-迈耶图，其指示筛选时具有高水平CRBN的患者的进展风险更高(p＝0.005)。
图2：C1D5时的改变可用作对疗法有反应的生物标志
在C1D5时具有倍数变化的前5个exRNA的随机森林分析(A)最佳拟合分类PFS树，其指示IKZF1的倍数变化≥0.5加上IRF4的倍数变化<-0.07与低风险PFS(0.49)相关，而IKZF1的倍数变化<0.05与高风险PFS相关(2.1)；(B)基于分类树所标识的组的PFS的卡普兰-迈耶图(p＝0.0051)，其指示IKZF1表达的增加是对疗法有反应的良好预后生物标志；(C)最佳拟合分类OS树，其指示IKZF1的倍数变化≥0.05加上TGFB1的倍数变化≥0.081与低风险OS(0.42)相关，而IKZF1的倍数变化<0.05与高风险OS相关(2.7)；(D)基于分类树所标识的组的OS的卡普兰-迈耶图(p＝0.0001)，其指示在C1D5时具有IKZF1增加的患者的OS进展风险更低；(E)基于由CRBN、IKZF1和IKZF3组成的限制分类树的PFS的卡普兰-迈耶图，其指示C1D5时IKZF1的增加水平<0.05指示更高风险的进展(PFS，p＝0.0085)；(F)基于由CRBN、IKZF1和IKZF3组成的限制分类树的PFS的卡普兰-迈耶图，其指示C1D5时IKZF1的增加水平<0.05指示更高风险的进展(OS)，并且指示具有增加的IKZF1和CRBN的患者的进展风险低(OS，p＝0.0001)；(G)用受限于CRBN、IKZF1和IKZF3的建树来评估筛选时和C1D5时的exRNA的组合分析；PFS的卡普兰-迈耶图表明，筛选时具有低CRBN和高IKZF1的患者比具有高CRBN水平和低C1D5 CRBN水平的患者表现更好(p＝0.002)；(H)在筛选和C1D5倍数变化的组合分析中，基于限制分类树的OS的卡普兰-迈耶图表明，筛选时具有低CRBN和高IKZF3的患者比具有高CRBN水平和低C1D5 CRBN水平的患者表现更好(p＝0.0001)。
图3：患者中预后不良的生物标志的鉴定
外周血(PL)可以解决多灶性浆细胞恶性病中的空间异质性，其中BM可以仅具有位点特异性。PL是cfDNA和exRNA两者的来源，这两者均可以用作生物标志以预测参与试验的患者的反应。在筛选和对治疗有反应时对exRNA的分析指示，与作为多发性骨髓瘤治疗的直接靶标或间接靶标对应于的基因的exRNA变化是对治疗的反应的重要预测指标。
具体实施方式
现在将详细地参照本发明的某些实施例。虽然本发明将结合实施例来进行描述，但是应当理解的是，不意图将本发明限于那些实施例。相反，本发明旨在涵盖可以包括在如权利要求所限定的本发明范围内的所有替代方案、修改方案以及等效方案。
本领域技术人员应认识到类似于或等同于本文所述的那些的可以在本发明的实践中使用的许多方法和材料。本发明绝不限于所述的方法和材料。
应当理解的是，在本说明书中披露和限定的本发明可扩展至所提及的或者从文本部分和附图部分显而易见的单个特征的两个或更多个的所有替代性组合。所有这些不同组合构成本发明的多个替代性方面。
多发性骨髓瘤(MM)是一种多灶性遗传学异质的克隆性浆细胞恶性病，诊断时存在于骨髓内多个髓内部位。在疾病进展期间，浆细胞演变出独立于BM环境而生长的能力，并且因此在BM外增殖，表现为髓外(EM)MM和/或浆细胞白血病(PCL)。MM的诊断和监测依赖于连续骨髓活检和定量血液和/或尿液中疾病负担的生物标志，即克隆免疫球蛋白(副蛋白，PP)和/或同种型限制的游离轻链(无血清轻链、SFLC或本周蛋白尿)。
多发性骨髓瘤患者的突变特征常规上利用了在空间和时间上受限制的单部位骨髓活检。因此，多发性骨髓瘤的诊断和监测典型地依赖于连续骨髓活检。现在越来越认识到，这种方法可能无法捕获这种多灶性疾病的空间和时间遗传异质性。
对MM疗法有反应的评估常规上是通过连续监测骨髓活检中血清游离轻链和/或副蛋白以及多发性骨髓瘤细胞的比例来进行。类似地，此方法在以下能力方面受到限制：基于某些突变或生物标志的存在，提供关于潜在肿瘤生物学和特定反应的信息。
与常规方法相反，本发明提供了一种用于确定个体是否对多发性骨髓瘤治疗有反应的非侵入性方法。特别地，本发明的方法允许在开始治疗的数天内早期评估患者的预后和对治疗的反应。
因此，本发明允许更可靠地确定患者的预后，并且允许特定治疗与疾病中存在的遗传改变相匹配。特别地，本发明的方法使得在一种治疗方法不再有效的情况下能够进行早期干预，有利于调整治疗方案，从而使患者对无效但可能具有显著副作用的治疗的不必要地暴露最小化。
诸位发明人已经发现，通过分析来自1b期试验的注释样品组，基于exRNA水平的早期改变来预测患者的预后是可能的。更具体地，诸位发明人已经利用了由多发性骨髓瘤患者接受的治疗所调节的基因的exRNA的定量分析，并且确定在治疗后立即改变exRNA水平可以帮助确定对治疗的反应。
因此，诸位发明人发现，exRNA提供了治疗成功的早期指示，使得在开始治疗的几天之内确定个体是否可以从治疗中受益是可能的。至今，尚无针对多发性骨髓瘤患者的临床试验评估过exRNA在预测对疗法的早期反应中的潜在效用。因此，本发明提供了一种新颖且明显有利的方法，用于提供有关患者对治疗的反应的早期反馈。在治疗方案的如此早期就获得有关治疗反应的反馈的能力为临床医生提供了宝贵的建议，而且也为患者提供了宝贵的时间，使得可以将没有反应的患者转移到替代性治疗计划中，而无需进行进一步治疗。
因此，本发明还为护理患有多发性骨髓瘤的受试者的临床医生或医师提供了有关对治疗的反应的可能性和总体生存的信息。基于本发明的方法的结果，临床医生或医师可以：
(i)避免用受试者不太可能有反应的治疗方案治疗该受试者；
(ii)避免用将提供副作用并且不太可能在治疗疾病中提供任何益处的治疗方案来治疗受试者；
(iii)让患者参与针对多发性骨髓瘤的新疗法的临床试验，
(iv)用替代性疗法，例如靶向替代性致癌信号传导途径的疗法来治疗受试者；
(v)与受试者讨论可能的治疗和结果情况；
(vi)为鉴定为具有低反应或低生存率的受试者提供更常规或更广泛的治疗后监控；和/或
(vii)以增加的信心(治疗可能为受试者提供益处)继续治疗鉴定为可能有反应的受试者。
生物标志
技术人员将熟悉用于确定表达水平的方法，包括其中的变化，包括以下生物标志的拷贝数的变化：
如本文所用，“cereblon”(也称为CRBN、MRT2或MRT2A)是指从植物到人保守的442个氨基酸的蛋白。存在蛋白cereblon(CRBN)的至少两种亚型，分别长442和441个氨基酸。人蛋白的UniProt登录代码是Q96SW2。在人类中，CRBN最初被表征为一种含RGS的新颖蛋白，它与大鼠脑中的钙激活钾通道蛋白(SLO 1)相互作用，并且后来显示在具有AMPK7和DDBI的视网膜中与电压门控氯离子通道(CIC-2)相互作用。(参见Jo等人，J Neurochem，[神经化学杂志]2005,94:1212-1224)。CRBN也已经被鉴定为开发用于大脑皮层疾病的治疗剂的靶标。(参见WO 2010/137547)。在本发明的任何实施例中，所鉴定的CRBN的形式包括CRBN的亚型。
如本文所用，ikaros(IKZF1)是指“DNA结合蛋白Ikaros”，也称为“Ikaros家族锌指蛋白1”。该蛋白是在人类中由IKZF1基因编码的。Ikaros在造血系统中显示出关键功能，并且其功能丧失与淋巴样白血病的发展有关。特别地，近年来已经发现Ikaros是涉及人B细胞急性淋巴母细胞性白血病的主要肿瘤抑制因子。IKZF1在粒细胞、B细胞、CD4和CD8 T细胞、以及NK细胞中上调，并且在有核红细胞、巨核细胞和单核细胞中下调。在Ikaros基因敲除小鼠中，由于相关基因Aiolos(IKZF3)的后期补偿性表达，在小鼠发育的后期产生了T细胞而不是B细胞。Ikaros点突变小鼠由于贫血而具有胚胎致死性；它们在终末红细胞和粒细胞分化方面存在严重缺陷，并且巨噬细胞形成过多。已经描述了此基因的若干个编码不同亚型的可变剪接的转录物变体。所有亚型共享共同的C末端结构域，其含有两个锌指基序，这对于异源或同源二聚化并且对于与其他蛋白相互作用是必需的。然而，这些亚型在结合DNA并且含有核定位信号的N末端锌指基序的数量方面不同，导致成员具有和不具有DNA结合特性。只有很少的亚型含有必需的三个或更多个N末端锌基序，这些基序赋予与靶基因的启动子中具体核心DNA序列元件的高亲和力结合。非DNA结合亚型主要发现于细胞质中，并被认为充当了主要的不利因素。
如本文所用，aiolos(IKZF3或ZNFN1A3)是指“锌指蛋白Aiolos”，也称为Ikaros家族锌指蛋白3，是在人类中由IKZF3基因编码的蛋白。该基因编码锌指蛋白的Ikaros家族的成员。该蛋白家族的三个成员(Ikaros、Aiolos和Helios)是参与淋巴细胞发育调节的造血特异性转录因子。此基因产物是转录因子，其对于调节B淋巴细胞的增殖和分化很重要。Ikaros和Aiolos均可以参与染色质重建。Aiolos对B淋巴细胞中基因表达的调节很复杂，因为它似乎需要顺序形成Ikaros同二聚体、Ikaros/Aiolos异二聚体、和Aiolos同二聚体。已经描述了编码不同亚型的至少六个替代性转录物。
如本文所用，IRF4是指干扰素调节因子4，也称为MUM1，是在人类中由IRF4基因编码的蛋白。其他同义词包括LSIRF、NF-EM5、和SHEP8。IRF4是一种参与急性白血病的转录因子。该基因密切相关于色素沉着：皮肤对日晒的敏感性、雀斑、蓝眼睛、和棕色头发。
如本文所用，TGFβ1是指转化生长因子β1，其是细胞因子的转化生长因子β超家族的多肽成员。TGFβ1也称为CED、DPD1、LAP、TGFB、TGFβ，是一种分泌性蛋白，具有许多细胞功能，包括控制细胞生长、细胞增殖、细胞分化、和细胞凋亡。在人类中，TGF-β1由TGFB1基因编码。TGF-β是一组多功能肽，控制许多细胞类型中的增殖、分化、和其他功能。TGF-β在诱导转化中与TGFA协同作用。它还充当负性自泌生长因子。TGF-β激活和信号传导的失调可能导致细胞凋亡。许多细胞合成TGF-β，并且几乎所有细胞都具有该肽的特异性受体。TGF-β1、TGF-β2、和TGF-β3均通过同一受体信号传导系统发挥功能。
如本文所用，SPARC是指骨粘连蛋白(ON)，也称为酸性分泌性蛋白并且富含半胱氨酸(SPARC)，或称为基底膜蛋白40(BM-40)。它是在人类中由SPARC基因编码的蛋白。骨粘连蛋白是结合钙的骨骼中的糖蛋白。它在骨形成期间由成骨细胞分泌，启动矿化并促进矿物质晶体形成。除骨矿物质钙以外，骨粘连蛋白还显示对胶原蛋白具有亲和力。已经发现骨粘连蛋白过表达与壶腹癌和慢性胰腺炎之间存在相关性。
exRNA
细胞外RNA(也称为exRNA或外体RNA)描述了存在于转录它们的细胞的外部的RNA种类。exRNA可以发现于体液中，例如静脉血、唾液、乳汁、尿液、精液、月经血、和阴道分泌物中。“细胞外RNA”定义了一组若干类型的RNA，其功能是多种多样的，但是它们在细胞外环境中存在着共同的属性。exRNA可能包括以下类型的RNA：信使RNA(mRNA)、转移RNA(tRNA)、微小RNA(miRNA)、小干扰RNA(siRNA)和长非编码RNA(lncRNA)。
尽管尚未完全理解，但是生物样品中发现的exRNA群体被认为由以下构成：来自健康和不健康(例如肿瘤)的细胞的exRNA。因此，观察给定基因的exRNA谱中的改变可以提供对所接受治疗的全身反应(健康细胞和肿瘤细胞的贡献)的快照(snap-shot)。
如本文所用的“无细胞核酸”或“exRNA”是已从细胞释放或以其他方式从细胞逃逸到细胞所驻留的血液或其他体液中的核酸，优选(基因组的或线粒体的)RNA。从体液(如外周血)中提取或分离无细胞核酸(例如RNA)不涉及存在于体液中的任何细胞的破裂。无细胞RNA可以是从体液中分离的RNA，其中体液中的全部或基本上全部颗粒材料(如细胞或细胞碎片)已经被除去。
可以使用技术(包括例如Lo等人,美国专利6,258,540；Huang等人,MethodsMol.Biol[分子生物学方法],444:203-208(2008)等，将其通过引用并入本文)从外周血样品中提取无细胞核酸，例如RNA(exRNA)。通过举非限制性实例的方式，外周血可以收集在EDTA或Streck BCT RNA管中，之后可以通过离心分级成血浆、白细胞和红细胞组分。根据制造商的方案，可以使用QIAamp DNA血液迷你试剂盒(QIAamp DNA Blood Mini Kit)(凯杰公司(Qiagen)，瓦伦西亚(Valencia)，加利福尼亚州)、QIAamp循环核酸试剂盒(凯杰公司(Qiagen)，希尔登(Hilden)，德国)、或类似试剂盒提取存在于无细胞血浆级分中的DNA(例如从0.5至2.0mL)。优选地根据制造商的建议，例如使用Turbo无DNA试剂盒(赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific)，马塞诸塞州，美国)或类似试剂盒处理exRNA样品，从而除去任何污染的基因组DNA。
如本文所用，术语“核酸”是指掺入核糖核酸或其类似物的单元的任何分子，优选聚合物分子。核酸可以是单链的或双链的。
如本文所用的术语“分离的”或“部分纯化的”在核酸的情况下是指从至少一种其他组分(例如，核酸或多肽)中分离的核酸，其他组分与如在其天然来源中发现的核酸一起存在和/或当由细胞表达时与核酸一起存在。化学合成的核酸或使用体外转录/翻译合成的核酸被认为是“分离的”。
如本文所用，核酸分子的一“部分”是指由该分子包含的连续的一组核苷酸。一部分可以包含由分子包含的核苷酸的全部或仅子集。一部分可以是双链的或单链的。
如本文所用，“扩增的产物”、“扩增产物”或“扩增子”是指由扩增反应产生的寡核苷酸，这些寡核苷酸是特定靶核酸模板链和/或其互补序列的一部分拷贝，这些寡核苷酸在核苷酸序列中对应于模板核酸序列和/或其互补序列。扩增产物可以进一步包含对引物具有特异性的序列，并且该序列侧接作为靶核酸和/或其互补序列的一部分的序列。如本文所述的扩增的产物通常是双链DNA，尽管可以提及其单链。
在本文所述的本发明的任何方法中，可以通过如本文所述的任何方法，例如PCR、微阵列、测序等的形式来评估或确定样品中以下项的量、水平、存在：(a)循环的无细胞的肿瘤来源的核酸、或循环肿瘤游离核酸，或(b)无细胞核酸，或(c)exRNA。
可以使用本文所述的任何方法或例如聚合酶链式反应(PCR)或特别是定量聚合酶链式反应(qPCR)或微滴式数字聚合酶链式反应(ddPCR)来定量核酸的量。QPCR是一项基于聚合酶链式反应的技术，并且用于扩增和同时定量靶向的核酸分子。QPCR允许既检测又定量(当归一化为DNA输入或另外的归一化基因时，作为绝对拷贝数或相对量)DNA样品中的特定序列。该程序遵循聚合酶链式反应的一般原则，另外的特征是定量扩增的DNA，因为它在每个扩增循环后实时积累在反应中。QPCR描述于例如Kurnit等人(美国专利号6,033,854)、Wang等人(美国专利号5,567,583和5,348,853)、Ma等人(The Journal of AmericanScience[美国科学杂志],2(3),2006)、Heid等人(Genome Research[基因组研究]986-994,1996)、Sambrook和Russell(Quantitative PCR,Cold Spring Harbor Protocols[定量PCR，冷泉港方案],2006)和Higuchi(美国专利号6,171,785和5,994,056)中。将这些的内容通过引用以其全文并入本文。
优选地，使用微滴式数字PCT技术确定核酸样品的量，该技术可以并入绝对定量而无需参考样品。
如本文所用，Tm是50％的靶序列与完全匹配的探针结合时的温度(在确定的离子强度和pH下)。就此而言，在pH 7下在约0.02M或更低的盐浓度下，本发明的探针的Tm优选高于40℃且优选低于70℃、更优选约53℃。预混合的结合溶液是可用的(例如，来自CLONTECH实验室公司(CLONTECH Laboratories,Inc.)的EXPRESSHYB杂交溶液(EXPRESSHYBHybridisation Solution))，并且可以根据制造商的说明书进行结合。可替代地，本领域技术人员可以设想出这些结合条件的变体。
结合后，在严格(优选高严格)条件下洗涤除去未结合的核酸分子。典型的严格洗涤条件包括在55℃-65℃下在含有0.1％SDS的0.5-2x SSC的溶液中洗涤。典型的高严格洗涤条件包括在55℃-65℃下在含有0.1％SDS的0.1-0.2x SSC的溶液中洗涤。技术人员可以容易地设想出等效条件，例如通过用SSPE代替洗涤溶液中的SSC。
除了杂交条件的严格性外，杂交特异性可能受多种探针设计因素的影响，包括总体序列相似性、错配碱基的分布和位置以及由探针和靶序列形成的RNA双链体的自由能。
核酸序列的“互补序列”经由互补碱基配对与所述核酸序列结合。非编码(反义)核酸链也被称为“互补链”，因为它经由互补碱基配对与编码(有义)链结合。
在一个方面，探针可以被固定到支持物或平台上。固定探针为探针提供物理位置，并且可以用于将探针固定在所希望的位置和/或促进探针的回收或分离。
支持物可以是由例如玻璃或塑料制成的刚性固体支持物，或者支持物可以是膜，如尼龙或硝酸纤维素膜。3D基质是用于与本发明一起使用的合适的支持物-例如，聚丙烯酰胺或PEG凝胶。
在一个实施例中，支持物可以处于一个或多个珠或微球的形式，例如处于液珠微阵列的形式。合适的珠或微球是可商购的(例如，路明克斯集团(Luminex Corp.)，奥斯丁，德克萨斯州)。珠的表面可以被羧化以附着RNA。珠或微球可以被独特地识别，从而使得能够根据其独特的特征(例如，通过珠尺寸或颜色、或独特的标记)进行分选。在一个方面，珠/微球内部用荧光团(例如，红色和/或红外荧光团)染色并且可以通过它们不同的荧光强度而彼此区分。
在一个方面，在使基因的核苷酸序列与所述寡核苷酸探针接触之前，该方法进一步包括扩增基因或其互补序列的一部分从而产生扩增子的步骤。
如果样品较小和/或包含RNA序列的异质集合，则可能需要扩增靶核酸。
扩增可以通过本领域已知的方法进行，并且优选通过ddPCR进行。技术人员应能够确定促进核酸序列扩增的合适条件。
因此，在一个方面，使用一对序列特异性引物进行扩增，其中所述引物通过互补碱基配对与基因或其互补序列中的靶位点结合。在合适的DNA聚合酶和DNA前体(dATP、dCTP、dGTP和dTTP)的存在下，延伸引物，从而开始合成与靶核酸的单链互补的新核酸链。引物因此驱动基因或其互补序列的一部分的扩增，从而产生扩增子。此扩增子包含探针所结合的靶序列，或者可以直接测序以鉴定如本文所述的一个或多个突变的存在。
为免生疑，在本发明的上下文中，寡核苷酸引物的定义不包括全长基因(或其互补序列)。
引物对包含正向和反向寡核苷酸引物。正向引物是与靶核酸的互补非编码(反义)链结合的引物，并且反向引物是与靶核酸的相应编码(有义)链结合的引物。
引物使用常规软件(如Primer Express(应用生物系统公司(AppliedBiosystems)))基于所希望的参数的选择被设计用于与靶基因序列结合。就此而言，优选的是，结合条件使得提供高水平的特异性。引物的解链温度(Tm)优选超过50℃且最优选是约60℃。本发明的引物优选与靶核酸结合，但是优选被筛选以使自身互补性和二聚体形成(引物与引物的结合)最小化。
正向和反向寡核苷酸引物典型地为1至40个核苷酸长。使用更短的引物是有利的，因为这使得能够更快地退火至靶核酸。
正向引物优选地至少10个核苷酸长、更优选地至少15个核苷酸长、更优选地至少18个核苷酸长、最优选地至少20个核苷酸长，并且正向引物优选地长达35个核苷酸长、更优选地长达30个核苷酸长、更优选地长达28个核苷酸长、最优选地长达25个核苷酸长。在一个实施例中，正向引物约20-21个核苷酸长。
反向引物优选至少10个核苷酸长、更优选地至少15个核苷酸长、更优选地至少20个核苷酸长、最优选地至少25个核苷酸长，并且反向引物优选地长达35个核苷酸长、更优选地长达30个核苷酸长、最优选地长达28个核苷酸长。在一个实施例中，反向引物约26个核苷酸长。
“聚合酶链式反应”或“PCR”意指用于通过DNA的互补链的同时引物延伸使特定DNA序列体外扩增的反应。换句话说，PCR是用于制备侧接引物结合位点的靶核酸的多个拷贝或复制体的反应，这样的反应包括以下步骤的一次或多次重复：(i)使靶核酸变性，(ii)使引物退火至引物结合位点，和(iii)在核苷三磷酸的存在下通过核酸聚合酶延伸引物。通常，该反应在热循环仪中通过针对每个步骤优化的不同温度进行循环。具体的温度、每个步骤的持续时间以及步骤之间的变化率取决于本领域普通技术人员众所周知的许多因素，例如由以下参考文献所例示的：McPherson等人编辑,PCR:A Practical Approach[PCR：实用方法]和PCR2:A Practical Approach[PCR2：实用方法](IRL Press[IRL出版社]，牛津，分别是1991年和1995年)。例如，在使用Taq DNA聚合酶的常规PCR中，双链靶核酸可以在>90℃的温度下变性，引物在范围50℃-75℃的温度下退火，并且引物在范围72℃-78℃的温度下延伸。术语“PCR”包括该反应的派生形式，包括但不限于RT-PCR、实时PCR、巢式PCR、定量PCR、多重PCR等。反应体积的范围从几百纳升(例如，200nl)至几百μl(例如，200μl)。“逆转录PCR”或“RT-PCR”意指之前进行逆转录反应的PCR，该反应将靶RNA转化为互补的单链DNA，然后将其扩增，例如Tecott等人,美国专利5,168,038，将该专利通过引用并入本文。“实时PCR”意指当反应进行时监测反应产物(即扩增子)的量的PCR。有许多形式的实时PCR，其主要区别在于用于监测反应产物的检测化学反应，例如Gelfand等人,美国专利5,210,015(“taqman”)；Wittwer等人,美国专利6,174,670和6,569,627(嵌入染料)；Tyagi等人,美国专利5,925,517(分子信标)；将这些专利通过引用并入本文。用于实时PCR的检测化学反应综述于Mackay等人,Nucleic Acids Research[核酸研究],30:1292-1305(2002)中，也将其通过引用并入本文。“巢式PCR”意指两阶段PCR，其中第一次PCR的扩增子变成使用一组新的引物的第二次PCR的样品，这些引物中的至少一个与第一扩增子的内部位置结合。如本文所用，关于巢式扩增反应的“初始引物”意指用于产生第一扩增子的引物，并且“次级引物”意指用于产生第二或巢式扩增子的一个或多个引物。“多重PCR”意指其中多个靶序列(或单个靶序列和一个或多个参考序列)在同一反应混合物中同时进行的PCR，例如Bernard等人,Anal.Biochem.[分析生物化学],273:221-228(1999)(双色实时PCR)。通常，针对被扩增的每个序列采用不同的引物组。典型地，多重PCR中靶序列的数目在从2至50、或从2至40、或从2至30的范围内。“定量PCR”意指设计用于测量样品或标本中一个或多个特定靶序列的丰度的PCR。定量PCR包括此类靶序列的绝对定量和相对定量。
使用一个或多个参考序列或内部标准进行定量测量，该参考序列或内部标准可以单独测定或与靶序列一起测定。参考序列对于样品或样本可以是内源的或外源的，并且在后一种情况下，可以包含一个或多个竞争模板。典型的内源参考序列包括以下基因的转录物区段：β-肌动蛋白、GAPDH、p2-微球蛋白、核糖体RNA等。用于定量PCR的技术是本领域普通技术人员众所周知的，如在通过引用并入本文的以下参考文献中所例示的：Freeman等人,Biotechniques[生物技术],26:112-126(1999)；Becker-Andre等人,Nucleic AcidsResearch[核酸研究],17:9437-9447(1989)；Zimmerman等人,Biotechniques[生物技术],21:268-279(1996)；Diviacco等人,Gene[基因],122:3013-3020(1992)；Becker-Andre等人,Nucleic Acids Research[核酸研究],17:9437-9446(1989)；等等。
“微滴式数字PCR”(ddPCR)是指一种数字PCR测定，其通过计算封装在支持PCR扩增的、离散的体积确定的油包水微滴分区中的核酸分子来测量绝对定量(Hindson等人(2011)Anal Chem[分析化学]83:8604-8610，将其全部内容通过引用特此并入)。单个ddPCR反应可以由每孔至少20,000个划分的微滴构成。
“微滴”或“油包水微滴”是指微滴式数字PCR测定的单独分区。微滴使用均质测定化学和类似于广泛用于实时PCR应用的工作流程来支持一种或多种模板分子的PCR扩增(Hinson等人,2011,Anal.Chem.[分析化学]83:8604-8610；Pinheiro等人,2012,Anal.Chem.[分析化学]84:1003-1011)。
可以使用进行数字PCR测定的任何平台进行微滴式数字PCR，数字PCR测定通过计算封装在支持PCR扩增的、离散的体积确定的油包水微滴分区中的核酸分子来测量绝对定量。微滴式数字PCR的策略可以总结如下：将样品稀释并划分为成千上万个单独的反应室(油包水微滴)中，使得每个都含有目的核酸分子的一个副本或不含副本。含有靶扩增子(即目的核酸分子)的检测到的“阳性”微滴的数量对比不含有靶标扩增子(即目的核酸分子)的“阴性”微滴的数量，可以用于确定原始样品中目的核酸分子的拷贝数。微滴式数字PCR系统的实例包括伯乐公司(Bio-Rad)的QX100TM微滴式数字PCR系统，其将含有核酸模板的样品划分为20,000纳升大小的微滴；以及RainDance公司的RainDropTM数字PCR系统，该系统将含有核酸模板的样品划分为1,000,000至10,000,000皮升大小的微滴。
数字微滴式PCR(ddPCR)利用了微流体和表面活性剂化学领域的最新发展。将反应混合物分成约20000个微滴，将其PCR扩增，PCR后进行荧光标记，并且在自动微滴流式细胞仪中读取。基于荧光强度，将每个微滴分配正值和负值(1或0)。通过流式细胞仪读取正值和负值的量，并且将其用于计算浓度和95％泊松置信水平。数字微滴式PCR(ddPCR)提供的基本优点很多，包括(a)动态范围增加，(b)检测模板DNA小变化的精度改善，(c)具有耐受大范围扩增效率的能力，以及(d)具有测量绝对DNA/RNA浓度的能力。
技术人员将熟悉使用本文所述的或者是本领域技术人员熟悉的任何方法，定量exRNA水平之后，用于确定exRNA水平的倍数变化的方法。
在本发明的任何方法中，通过测量exRNA水平的倍数变化，或cereblon、ikaros、aiolos、IRF4或由个体接受的治疗所调节的其他基因中的一个或多个的拷贝数变化，可以确定治疗是否成功，或可以确定个体的积极预后的可能性。
如本文所用，“参考分数”、“截断值”、“生存截断”或“树截断(tree cut-off)”可互换使用。优选地，在用多发性骨髓瘤方案治疗之后，根据具有已知的多发性骨髓瘤结果、优选地生存(例如总体生存，1年、2年、3年或4年生存)的患者的组群，预先确定或确定参考分数。用以下规则，参考分数将受试者分为两个亚组之一：在治疗正向调节的基因中exRNA水平增加或者治疗负向调节的基因中exRNA水平降低的情况下，将患者分配到具有反应的高可能性(例如，积极预后的高可能性、无进展生存的高可能性或总体生存的高可能性)的组中。另一方面，在治疗负向调节的基因中exRNA水平增加或不变，或者治疗正向调节的基因中exRNA水平降低或不变的情况下，将患者分配到具有反应的低可能性(例如，无进展生存的低可能性、或总体生存的低可能性)的组中。
优选地，参考分数将受试者分为具有至少95％、94％、93％、92％、91％、90％、85％、80％、75％或70％的总体生存的高可能性的组，或具有小于60％、55％、54％、53％、52％、51％、50％、49％、48％、47％、46％、45％或44％的总体生存的低可能性的组。可以使用本领域已知的统计方法来确定参考分数，例如，树结构递归分区统计模型或中值。可以使用卡普兰-迈耶法进行生存分析，并且可以使用时序检验(例如实例中所述)来比较来自两个亚组的两个生存曲线。
卡普兰-迈耶法(也称为乘积极限估算器)根据寿命数据来估计生存函数。在医学研究中，它可用于测量治疗后一定时间内存活的患者比例。
卡普兰-迈耶法的生存函数图是一系列递减的水平步长，在样本量足够大的情况下，该步长接近该群体的真实生存函数连续的不同采样观测值(“喀哒声(clicks)”)之间的生存函数值假定为恒定。
卡普兰-迈耶曲线的一个重要优点是该方法可以考虑“删失”的数据—在观察到最终结果之前的样本损失(例如，如果患者退出研究)。在该图上，小的竖直刻度标记指示损失，在此处患者数据已删失。当没有发生截断或删失时，卡普兰-迈耶曲线等价于经验分布。
可以使用卡普兰-迈耶法进行生存分析(如本文实例中所述)。
用于监测疾病进展和治疗功效的方法
本发明可以用于诊断、监测个体的疾病进展或治疗功效。
监测疾病进展或治疗功效可以是患有任何类型的多发性骨髓瘤的个体，包括阴燃或无痛多发性骨髓瘤、活动性多发性骨髓瘤、多发性孤立性浆细胞瘤、髓外浆细胞瘤、分泌性、非分泌性、IgGλ或κ轻链(LC)类型。由多发性骨髓瘤中的骨髓瘤细胞制备的最常见的免疫球蛋白(Ig)是IgG、IgA和IgM，较少见地涉及IgD或IgE。
本发明的方面(如监测疾病进展或治疗功效)可能在没有常规外周血生物标志(例如，没有副蛋白、或本文(包括实例)所述的或本领域已知的其他标志)是可检测的个体中是特别有用的。
本发明的方法典型地包括将来自个体的exRNA(有时称为“测试样品”)与对照谱中的exRNA进行比较。
在一些情况下，“对照谱”可以包括来自不患有任何临床或生化可检测的多发性骨髓瘤的一个或多个个体的外周血样品的exRNA水平。在此类情况下，不患有任何临床或生化可检测的多发性骨髓瘤的一个或多个个体的外周血样品在本文中被称为“对照样品”。“对照谱”可以源于除不存在多发性骨髓瘤外通常与选择用于确定他们是否患有多发性骨髓瘤的个体相同或非常相似的个体。通常使用用于测量测试样品中的exRNA的相同测定形式来测量来自获得对照谱的一个或多个个体的外周血的对照样品中对应于特定基因的exRNA。
应该理解的是，对照谱也可以源于取测试样品的同一个体，但是在不同的时间点，例如一年或几年前。这样，对照谱还可以包括在个体接受多发性骨髓瘤治疗之前、或在多发性骨髓瘤治疗期间的早期阶段的个体的exRNA水平。因此，这种对照谱形成个体中exRNA水平的基线或基础水平谱，可以将其与测试样品进行比较。
用于测量疾病进展或监测治疗功效的对照谱可以从取测试样品的同一个体产生，但是在不同的时间点，例如一年或几年前。因此，这种对照谱形成个体中exRNA(特别地，对应于来自由个体接受的治疗所调节的基因的exRNA)水平的基线或基础水平谱。
在本说明书中，治疗失败(或认为个体对治疗没有反应)包括在接受治疗(例如化疗)方案的同时疾病进展而没有经历任何短暂改善、在接受一个或多个周期的治疗方案后没有客观反应或在接受治疗方案的同时具有有限的反应但随后进展。对疗法没有反应的骨髓瘤也可被称为“难治性多发性骨髓瘤”。难治性骨髓瘤可能出现在对治疗疗法从未出现反应的患者中，或者可能出现在最初对治疗有反应但是在复发后对治疗没有反应的患者中。
在本说明书中，除非另有说明，“复发”意指经过一段时间的改善后癌症的体征和症状恢复。
在本说明书中，治疗成功(或认为个体对治疗有反应)包括疾病的稳定、或疾病进展的减慢或停止。“对治疗的反应”是指治疗性治疗，其中目的是减缓(减轻)不希望的生理改变或障碍。为了本发明的目的，有益的或所希望的临床结果包括但不限于症状缓解、疾病程度减轻、疾病状态稳定化(即，未恶化)、疾病进展延迟或减缓、疾病状态改善或缓和以及减轻(无论是部分减轻还是全部减轻)，无论是可检测的还是不可检测的。治疗还可以意指与不接受治疗的预期生存相比延长生存。治疗可以不必致使疾病或障碍完全清除，但是可以减少或最小化感染的并发症和副作用以及疾病或障碍的进展。
如本文所用，个体对治疗的积极反应包括个体的无进展生存增加。可替代地，个体对治疗的积极反应包括个体的总体生存增加。因此，本发明也可用于预测接受/需要多发性骨髓瘤治疗的个体的总体生存或无进展生存。
如本文所用，“总体生存(OS)”是指从诊断患有疾病(例如，癌症)或开始治疗该疾病的日期起，诊断患有该疾病的患者存活的时间长度。在临床试验中，测量总体生存是了解新治疗效果的一种方式。
“总体生存”或“OS”是本领域技术人员熟知的，并且是指事件发生后(优选地在治疗方案开始或结束后)患者的命运，尽管有可能患者的死因不是直接由疾病(癌症)所导致。换句话说，它是指患者将不会因多发性骨髓瘤而死亡的预后，优选地在至少1年、至少2年、至少3年、至少4年、至少5年、至少10年或至少15年内。
如本文所用，“无进展生存”(PFS)是指在疾病(例如癌症)的治疗期间和之后，患者患有该疾病但是没有恶化的时间长度。在临床试验中，测量无进展生存是了解新治疗效果的一种方式。
“预后”通常是指对多发性骨髓瘤的可能病程或结果的预报或预测。如本文所用，预后包括以下任一种或多种的预报或预测：易感或诊断为多发性骨髓瘤的患者的生存期，易感或诊断为多发性骨髓瘤的患者的无复发生存期、无进展生存期，易感或诊断为多发性骨髓瘤的患者组的反应率，和/或易感或诊断为多发性骨髓瘤的患者或患者组的反应持续时间。预后还包括预测对多发性骨髓瘤治疗(例如常规的多发性骨髓瘤疗法，例如包括去甲基化剂(例如氮杂胞苷)和IMid(例如来那度胺)、及其组合的治疗方案)的有利反应。如本领域技术人员将理解的，预测可以不必对100％所评估的受试者正确。然而，该术语要求可以将统计上绝大部分受试者鉴定为具有给定结果的可能性增加。
“对治疗方案的反应”是指对治疗(例如常规多发性骨髓瘤疗法)的临床上或生化上有利的可检测的反应。典型地，有利的反应是在治疗后的某个之后时间点(例如治疗后1、2、3或4年)测量为生存。
虽然本发明可用于人类中，但是本发明对于治疗性兽用目的也是有用的。本发明可用于家畜或农场动物，诸如牛、羊、马和家禽；宠物，诸如猫和狗；以及动物园的动物。
本发明包括监测多发性骨髓瘤治疗的功效，其中治疗包括但不限于施用以下中的任一种或多种：地塞米松、环磷酰胺、沙利度胺、来那度胺(Lenalinomide)、依托泊苷、顺铂、伊沙佐米(Ixazomib)、硼替佐米、威罗非尼(Vemurafinib)、瑞格色替(Rigosertib)、曲美替尼、帕比司他、氮杂胞苷、派姆单抗(Pembrolizumab)、尼鲁单抗(Nivolumumab)、度伐鲁单抗或自体干细胞移植(ASCT)。
治疗可以包括一种或多种药物、或两种或更多种药物的任何组合，包括按以下组合：地塞米松、环磷酰胺、依托泊苷和顺铂(DCEP)；地塞米松、环磷酰胺、依托泊苷、顺铂和沙利度胺(T-DCEP)；氮杂胞苷和来那度胺(Rd)、伊沙佐米-环磷酰胺-地塞米松(ICd)；或硼替佐米、环磷酰胺和地塞米松(VCD)。治疗可以包括与另外的药物组合的DCEP、T-DCEP、Rd、Icd或VCD的组合。
本发明还包括基于确定或监测接受多发性骨髓瘤治疗的个体的突变状态的结果来调整或修改多发性骨髓瘤治疗。调整或修改可以包括从治疗方案中移除特定的一种或多种药物并用一种或多种替代性药物替换该药物。可替代地，调整或修改可以包括为现有治疗补充另外的药物。
在任何实施例中，替换或补充治疗包括施用以下中的任一种或多种：地塞米松、环磷酰胺、沙利度胺、来那度胺、泊马度胺、依托泊苷、顺铂、硼替佐米、卡非佐米、考比替尼(Cobimetinib)、伊沙佐米、司美替尼、曲美替尼、威罗菲尼、帕比司他、伏立诺他、氮杂胞苷、维奈托克(Venetoclax)、达雷木单抗、派姆单抗、尼鲁单抗、度伐鲁单抗或自体干细胞移植(ASCT)。替换或补充治疗还可以包括施用以下的组合中的任一种或多种：地塞米松、环磷酰胺、依托泊苷和顺铂(DCEP)；地塞米松、环磷酰胺、依托泊苷、顺铂和沙利度胺(T-DCEP)；来那度胺和地塞米松(Rd)、伊沙佐米-环磷酰胺-地塞米松(ICd)；或硼替佐米、环磷酰胺和地塞米松(VCD)。治疗可以包括与另外的药物组合的DCEP、T-DCEP、Rd、Icd或VCD的组合。
实例
方法：
统一治疗的MM患者
阿尔弗雷德医院人类伦理委员会(Alfred Hospital Human Ethics Committee)批准了一项1b期单中心研究，即口服AZA(一种去甲基化剂)与RD组合用于R/R MM患者的治疗；并且该研究提供了一个平台，可以出于进行相关研究的目的访问统一治疗的MM患者群体。总共招募了24个经过大量预治疗的R/R MM患者。在28天周期的第1-21天给予LEN(25mg)，并在第1、8、15和22天给予DEX(40mg)。按递增剂量给予AZA，其中初始剂量为100mg，持续1至14天，然后增加7天或50mg/组群，每28天周期从第1天至第21天不超过200mg的最大剂量。继续治疗直至出现进展或毒性、或撤消患者同意书。使用根据IMWG统一反应率标准的客观反应率(ORR)，将患者分为反应者(部分反应(PR)、非常好的部分反应(VGPR)或完全反应(CR))或非反应者(最小反应(MR)、稳定疾病(SD)和进展性疾病(PD))。从开始疗法之日起至因任何原因导致的复发/进展或死亡(以先发生者为准)之日测量无进展生存(PFS)。从首次开始疗法之日起测量总体生存(OS)。
相关研究-外周血(PB)收集和处理
遵循知情同意书或相关研究的目的，在筛选、第1周期第5天(C1D5)、C1D15、第3周期结束(EOC3)和EOC6时，收集Streck BCT DNA和RNA管(Streck公司，内布拉斯加州，美国)中的外周血PL。在此时间段后有反应的患者中，收集另外的PL样品。样品收集后，立即将管倒置，从而将血液与防腐剂混合在收集管中。在样品收集的24小时内，通过在820g离心10分钟(min)将PL与PB分离。收集上清液而不干扰细胞层，并且再次在16,000g离心10min以除去残留的细胞碎片，并且以1ml等分试样在-800C下储存，以便长期储存直至分离。
无细胞RNA提取
根据制造商的说明书，使用QIAamp循环核酸试剂盒(凯杰公司(Qiagen)，德国)，将冷冻PL样品用于exRNA提取。使用约3ml的PL进行提取。对于exRNA，遵循相同的程序，直到洗脱阶段。根据制造商的建议(赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific)，马塞诸塞州，美国)，使用Turbo无DNA的试剂盒，针对基因组DNA污染，对exRNA进行了处理。随后，用QUBIT Fluorometer 3.0以及高灵敏度DNA和RNA检测试剂盒(赛默飞世尔科技公司(ThermoFisher Scientific))对PL exRNA进行定量。用于QUBIT测定的最大输入量是5μl。将提取的exRNA在-80℃下储存直至进一步处理。
分离单核细胞和MM细胞
在筛选、C1D5、EOC3(或C4D1)、EOC6(C7D1)时，和在复发或进展时，收集EDTA管和BM抽吸物中的外周血单核细胞(PBMC)。如先前所述(Mithraprabhu等人,2014Epigenetics.[表观遗传学]9(11):1511-1520)，分别对来自MM患者的筛选时BM抽吸物和来自EDTA管的PB进行骨髓单核细胞(BMMNC)和PBMC的聚蔗糖(Ficoll)分离。将PBMC速冻为细胞沉淀，并且储存在-800C直至进一步分析。评估BMMNC以确定MM细胞比例(通过流式细胞术)，并且随后使用CD138+磁珠(美天旎生物技术公司(Miltenyi)，贝尔吉施格拉德巴赫(BergischGladbach)，德国；(Mithraprabhu等人201，同上))分离。将样品速冻并像之前一样储存。在参与该试验的24个患者中，有15个患者具有足够的CD138+供进一步分析。
exRNA基因表达的评估
为了进行cfRNA评估，基于先前公开的文献选择了12个基因。将一步ddPCR超级混合试剂盒(one-step ddPCR supermix kit)(伯乐公司(Biorad))用于定量评估，其中每个孔用2μL的cfRNA洗脱，样品一式两份。用于cfRNA追踪的所有引物均获得自伯乐公司(Biorad)，并且如Mithraprabhu等人(2019)Leukemia[白血病]33:2022-2033中所述。两个孔之间至少需要三个阳性微滴才能获得阳性结果。QuantasoftTM软件版本1.7使得能够确定反应中的拷贝数。1ml PL中的绝对拷贝数计算如下：如果存在A个拷贝/μl，并且总共制备了Bμl的PCR混合物，则PCR混合物中总共存在基因的A x B＝AB个拷贝。由于将2μl样品添加到反应混合物中，起始材料中存在AB/2＝C个拷贝/μl的基因。因此，如果将3ml的PL样品用于提取，并且按50μl体积洗脱cfRNA，则总共将存在50x C＝D个拷贝。最后，此患者的1ml PBPL中存在D/3＝E个基因拷贝。随后，从此值计算出从筛选到C1D5的倍数变化，从而评估这些基因的表达在处理后是否存在初始变化。
如果与筛选相比，C1D5中PL的拷贝数/ml增加，则将患者分类为“exRNA增加”；并且如果筛选时具有更多拷贝，则将患者分类为“exRNA降低”。将两个时间点均不表达基因的患者排除在生存分析之外。对于在BM或PBMC中的基因表达，除了选择的靶标外，还分析了四个参考基因：ACTB、RPL30、HPRT1和GAPDH。利用这四个参考基因的平均协调性，在所分析的特定时间点得出BM和PBMC中靶基因的归一化表达水平。
统计分析
随机生存森林方法(如在R包randomForestSRC 2.4.1中实施)用于鉴定与PFS和OS最密切相关的exRNA。确定了筛选时exRNA水平，和在C1D5时与筛选相比的exRNA倍数变化。
使用GraphPad Prism 7.0f进行所有统计分析。
结果：
筛选时高CRBN exRNA与高进展风险相关
在选择的16个基因中，进行了初步分析来确定PL中exRNA的存在，其中鉴定了一部分患者中没有可检测的RASD1和BCL2L10水平，并且因此被排除在进一步测试之外。使用ddPCR确定筛选时和C1D5时的14个基因的exRNA水平。计算这些基因在不同时间点的拷贝/ml的PL，并且进行随机森林分析。选择具有最高可变重要性度量的5-6种exRNA，以便包含在最拟合数据的单个分类树中。仅使用前5种exRNA的最佳拟合PFS树指示，BSG的中间水平似乎表明低风险PFS(p＝0.0162)。筛选时的最佳拟合OS分类树和卡普兰-迈耶图指示，低水平的CRBN加上高IKZF3与低风险相关，而高CRBN水平加上低水平SPARC与高风险相关(中值OS月数：分别是36对比3，p＝0.000003，图1A、1B)。当建树受限于CRBN、IKZF1和IKZF3时，低CRBN值(<470)加上高IKZF1(≥124)或高IKZF3(≥256)似乎分别与低PFS和OS风险相关(PFS的p＝0.014，OS的p＝0.005；图1C、1D)。筛选时具有高CRBN水平的患者与PFS和OS两者的高进展风险相关(图1C、1D)。为了鉴定exRNA的来源是PBMC还是BM，分析了反应者和非反应者在筛选时的CRBN、IKZF1、IKZF3和IRF4的水平比较，其中与非反应者筛选样品相比，反应者的PBMC中仅IKZF1显著增加。在整个BM筛选样品中，CRBN、IKZF1、IKZF3和IRF4的mRNA没有其他变化(数据未显示)。
增加的exRNA水平作为对疗法有反应的早期标志
与筛选相比，C1D5时的exRNA水平的改变与生存相关。如前所述，利用随机森林分析来选择前5个exRNA以拟合分类树。IKFZF1的倍数变化≥0.05加上IRF4的倍数变化<-0.07或TGFB1的倍数变化≥0.081分别与生存的低可能性相关(低风险的PFS或OS)，并且IKZF1的倍数变化<0.05与生存的高可能性相关(PFS和OS两者的高风险)(p＝0.0051PFS和p＝0.0001OS，图2A-2D)。当建树受限于CRBN、IKZF1和IKZF3的倍数变化时，在PFS和OS两者中IKZF1≥0.05与低风险相关(分别为p＝0.0085和p＝0.0001(图2E-2F))。此外，不考虑TGFB1，CRBN升高加上IKZF1不断增加的患者具有更好的OS的预后(p＝0.0001，图2F)。在PBMC和整个BM抽吸物中CRBN和IKZF1水平增加或降低的患者中，PFS或OS均没有显着差异。当分析筛选水平和倍数变化两者的组合来预测反应的生物标志时(其中建树受限于CRBN、IKZF1和IKZF3)，显示了具有高CRBN筛选水平加上治疗后CRBN低增加的患者的进展风险较高，而具有低CRBN加上高IKZF1或IKZF3的患者的进展风险最低(PFS，p＝0.002和OS，p＝0.0001，图2G，H)。
讨论：
循环核酸具有巨大的潜力，可以用作对疗法有反应的非侵入性癌症生物标志。在此研究中，已经探讨了exRNA用于预测MM患者针对疗法的预后的潜在效用。迄今为止，这是一项首次将exRNA作为注释癌症患者对疗法有反应的早期生物标志而进行全面分析和观察的研究。
探讨了已知由所接受的治疗(在此实例中，为LEN和CC-486)调节的具体基因的exRNA分析。已知像LEN等免疫调节(IMiD)药物与CRBN(CRL4CRBN E3连接酶复合物的底物受体)结合，增加CRBN对淋巴转录因子IKZF1和IKZF3的亲和力，由此导致其泛素化和降解增加。exRNA的随机森林分析指示，如果CRBN在C1D5时上调，则表明患者具有更好的预后并且可能对治疗有反应(图3)。因此，CRBN的调节是对疗法有反应的关键生物标志。
与ctDNA不同，无法确定exRNA的来源是否是MM细胞和/或微环境，这两者都可以由RD和/或CC-486调节。由于所用的治疗方法会引起MM和免疫细胞反应两者，分析exRNA(其是肿瘤和非肿瘤细胞的复合体)是合适的辅助工具。此外，当利用依赖于宿主免疫反应的药物时，这种类型的分析特别有价值。还可以通过治疗前后进行exRNA的下一代测序(NGS)来发现与具体治疗方法相关的生物标志，由此提供一种新颖的非侵入性方法，用来评估患者反应并且确定不同改变，这些改变不仅反映肿瘤细胞的失调，而且还反映免疫细胞和微环境的失调。
总之，使用此研究所用的exRNA进行的相关研究提供了对CC-486和LEN-DEX有反应的相关早期生物标志，这些生物标志易于评估并且是非侵入性的，从而为参与MM临床试验的患者提供了更具针对性的治疗方法。
Claims (47)
1.一种用于监测个体对多发性骨髓瘤治疗的反应的方法，该方法包括：
-提供已经接受多发性骨髓瘤治疗的个体，其中该治疗包括免疫调节酰亚胺(IMid)化合物；
-在来自该个体的细胞外RNA(exRNA)的测试样品中，确定基因cereblon、ikaros和aiolos中的一个或多个的水平；
-将该测试样品中cereblon、ikaros和aiolos中的一个或多个的水平与在多发性骨髓瘤治疗之前的多发性骨髓瘤患者中代表exRNA的对照谱进行比较；
其中该测试样品中cereblon、ikaros和aiolos中的一个或多个的水平与对照相比有增加指示该个体对该治疗有反应。
2.一种用于监测个体对多发性骨髓瘤治疗的反应的方法，该方法包括：
-提供来自已经接受多发性骨髓瘤治疗的个体的exRNA的测试样品，其中该治疗包括IMid；
-在该测试样品中，确定cereblon、ikaros和aiolos中的一个或多个的水平；
-提供对照谱，其含有来自接受该治疗之前的个体中基因cereblon、ikaros和aiolos的exRNA水平的数据；
-将该测试样品中cereblon、ikaros和aiolos中的一个或多个的水平与该对照谱进行比较；
其中该测试样品中cereblon、ikaros和aiolos中的一个或多个的水平与对照相比有增加指示该个体对该治疗有反应。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中还确定了该测试样品中干扰素调节因子4(IRF4)的exRNA水平，其中该测试样品中IRF4的水平与对照样品相比有降低指示该个体对治疗有反应。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中还确定了该测试样品中转录生长因子β1(TGFβ1)的exRNA水平，其中该测试样品中TGFβ1的水平与对照样品相比有增加指示该个体对治疗有反应。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中在开始多发性骨髓瘤治疗后小于20天获得该测试样品。
6.根据权利要求5所述的方法，其中在开始多发性骨髓瘤治疗后小于15或10天获得该测试样品。
7.根据权利要求5所述的方法，其中在开始多发性骨髓瘤治疗后小于5天获得该测试样品。
8.根据权利要求5所述的方法，其中在开始多发性骨髓瘤治疗后小于4天获得该测试样品。
9.根据权利要求5所述的方法，其中在开始多发性骨髓瘤治疗后小于3天获得该测试样品。
10.根据权利要求5所述的方法，其中在开始多发性骨髓瘤治疗后小于2天获得该测试样品。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中该已经接受多发性骨髓瘤治疗的个体是患有复发性和/或难治性的多发性骨髓瘤的个体。
12.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中该个体对先前治疗没有反应。
13.根据权利要求12所述的方法，其中该先前治疗包括来那度胺，但其未与阿扎胞苷或地塞米松组合。
14.根据权利要求1至13中一项所述的方法，其中cereblon的水平增加指示该个体对该治疗有反应。
15.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中至少cereblon和ikaros的水平增加指示该个体对治疗有反应。
16.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中cereblon、ikaros和aiolos的水平增加指示该个体对治疗有反应。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的方法，其中该IMid选自来那度胺、泊马度胺、沙利度胺和阿普斯特。
18.根据权利要求1至17中任一项所述的方法，其中该IMid是来那度胺。
19.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其中该多发性骨髓瘤治疗进一步包括去甲基化剂。
20.根据权利要求19所述的方法，其中该去甲基化剂包括阿扎胞苷。
21.根据权利要求1至20中任一项所述的方法，其中该多发性骨髓瘤治疗选自：阿扎胞苷和来那度胺的组合，或阿扎胞苷、来那度胺和地塞米松的组合。
22.一种治疗个体的多发性骨髓瘤的方法，该方法包括：
-提供已经接受多发性骨髓瘤治疗的个体，其中该治疗包括IMid；
-在来自该个体的细胞外RNA(exRNA)的测试样品中，确定cereblon、ikaros和aiolos中的一个或多个的表达；
-将该测试样品中该基因的表达与在多发性骨髓瘤治疗之前的多发性骨髓瘤患者中代表exRNA的对照谱进行比较；
-当该测试样品中cereblon、ikaros和aiolos中的一个或多个的表达响应于该治疗而保持不变或并未增加时，停止该治疗并且开始对该个体进行替代性治疗。
23.一种治疗个体的多发性骨髓瘤的方法，该方法包括：
-提供已经接受多发性骨髓瘤治疗的个体，其中该治疗包括IMid；
-在来自该个体的细胞外RNA(exRNA)的测试样品中，确定cereblon、ikaros和aiolos中的一个或多个的表达；
-将该测试样品中cereblon、ikaros和aiolos中的一个或多个的表达与在多发性骨髓瘤治疗之前的多发性骨髓瘤患者中代表exRNA的对照谱进行比较；
-当该测试样品中cereblon、ikaros和aiolos中的一个或多个的表达响应于该治疗而增加时，继续该治疗。
24.根据权利要求22或23所述的方法，其中在开始治疗的20天内进行将该测试样品中cereblon、ikaros和aiolos中的一个或多个的表达与对照谱进行比较的步骤、以及停止该治疗或继续该治疗的步骤。
25.根据权利要求24所述的方法，其中在开始治疗后小于15天、小于10天、小于5天或小于3天进行比较的步骤。
26.根据权利要求22所述的方法，其中开始对该个体进行替代性治疗包括用一种或多种另外的药物补充治疗。
27.根据权利要求22所述的方法，其中开始对该个体进行替代性治疗包括用一种或多种替代性药物替换治疗。
28.根据权利要求26或27所述的方法，其中用于多发性骨髓瘤治疗的这些另外的药物或替代性药物选自由以下组成的组：地塞米松、环磷酰胺、沙利度胺、泊马度胺、依托泊苷、顺铂、伊沙佐米、硼替佐米、威罗非尼、维奈托克、曲美替尼、帕比司他、伏立诺他、氮杂胞苷、达雷木单抗、派姆单抗、尼鲁单抗、度伐鲁单抗或自体干细胞移植(ASCT)，或其组合。
29.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中exRNA的测试样品是获得自该个体的任何生物样品，该生物样品含有选自以下的exRNA：外周血、唾液、乳汁、尿液、精液、月经血、和阴道分泌物。
30.根据权利要求29所述的方法，其中该生物样品是外周血。
31.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中该对照谱是从患有多发性骨髓瘤或已经接受多发性骨髓瘤治疗的个体获得的任何生物样品，其中该生物样品含有exRNA。
32.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中含有exRNA的对照生物样品获得自接受多发性骨髓瘤治疗之前的个体。
33.根据权利要求1至32中任一项所述的方法，其中该对照谱获得自数据库，该数据库包含来自一个或多个多发性骨髓瘤患者的生物样品中的exRNA水平，该生物样品是在这些患者接受多发性骨髓瘤治疗之前获得的。
34.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在个体接受多发性骨髓瘤治疗之前1、2、5、10、20、30或更多天获得该对照谱。
35.一种用于确定个体将对多发性骨髓瘤治疗有反应的可能性的方法，其中该治疗包括免疫调节酰亚胺(IMid)化合物，该方法包括：
-确定来自个体的包含exRNA的测试样品中ikaros的表达，该个体已经诊断出或怀疑患有多发性骨髓瘤；
其中该测试样品中存在ikaros的表达指示该患者将对该治疗有反应；并且
其中该测试样品中不存在ikaros的表达指示该患者将对该治疗没有反应。
36.一种用于确定个体将对多发性骨髓瘤治疗有反应的可能性的方法，其中该治疗包括免疫调节酰亚胺(IMid)化合物和去甲基化剂，该方法包括：
-确定来自个体的exRNA的测试样品中cereblon的表达，该个体已经诊断出或怀疑患有多发性骨髓瘤；
其中该测试样品中cereblon的高表达水平指示该患者将对该治疗没有反应，并且
其中该测试样品中cereblon的低表达水平指示该患者将对该治疗有反应。
37.根据权利要求36所述的方法，其中该方法进一步包括确定ikaros和aiolos中的一个或多个的表达，并且其中当该个体在治疗之前具有cereblon的低表达水平加上ikaros和aiolos的高水平时，指示该个体将可能对治疗有反应。
38.根据权利要求36或37所述的方法，其中该方法进一步包括确定SPARC的表达，并且其中该个体在治疗之前具有cereblon的低表达水平加上SPARC的高水平时，指示该个体将可能对该治疗有反应。
39.根据权利要求36至38中任一项所述的方法，其中cereblon的高表达水平是指exRNA的样品中cereblon转录物的拷贝数为至少400、至少450、优选地大于470个拷贝/mL。
40.根据权利要求36至39中任一项所述的方法，其中cereblon的低表达水平是指exRNA的样品中cereblon转录物的拷贝数为小于400、小于300、或小于100个拷贝/mL。
41.根据权利要求35或37所述的方法，其中ikaros的高表达水平是指exRNA的样品中ikaros转录物的拷贝数为至少80、至少100、优选地大于120个拷贝/mL。
42.根据权利要求35或37所述的方法，其中ikaros的低表达水平是指exRNA的样品中ikaros转录物的拷贝数为小于80、小于50、或小于20个拷贝/mL。
43.根据权利要求35或37所述的方法，其中aiolos的高表达水平是指exRNA的样品中aiolos转录物的拷贝数为至少200、至少240、优选地大于250个拷贝/m。
44.根据权利要求35或37所述的方法，其中aiolos的低表达水平是指exRNA的样品中aiolos转录物的拷贝数为小于200、小于100、或小于50个拷贝/mL血浆。
45.根据权利要求35至44中任一项所述的方法，其中该IMid选自来那度胺、泊马度胺、沙利度胺和阿普斯特。
46.一种用于在监测个体对多发性骨髓瘤治疗的反应中使用的试剂盒，该试剂盒包含：
-用于检测对应于一个或多个基因的exRNA水平的装置；
-用于从个体的外周血样品中分离或提取exRNA的试剂。
47.根据权利要求46所述的试剂盒，该试剂盒进一步包含在根据权利要求1至45中任一项所述的方法中使用该试剂盒的书面说明。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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