CN104703605A - 免疫相关和炎性疾病的治疗 - Google Patents

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Abstract

本文提供了在免疫相关疾病或炎性疾病中利用化合物和组合物来调节白细胞活性，包括B细胞和/或T细胞、单核细胞、巨噬细胞及其他淋巴源或髓源细胞类型的活性的方法。本文还提供了在所述方法中使用的药物组合物和剂量施用方案。

Description

免疫相关和炎性疾病的治疗
相关申请
本发明申请主张2012年11月5日提交的美国临时专利申请第61/722,718号和2012年8月9日提交的美国临时专利申请第61/681,491号的优先权，以上专利申请以其全部内容作为参考并入本文。
序列表
本发明申请与作为2012年8月8日生成的文件名为12827-207-888_seqlisting.txt，大小为6571字节的序列表一起提交。该序列表以其全部内容作为参考并入本文。
技术领域
本文提供了治疗、预防和/或控制与白细胞活性有关的疾病(例如，免疫相关疾病或炎性疾病)的方法，所述白细胞活性包括B细胞和/或T细胞、单核细胞、巨噬细胞及其他淋巴源或髓源细胞类型的活性，其包括施用化合物I或其可药用盐、溶剂化物、水合物、立体异构体、互变异构体或外消旋混合物，包括(S)-3-[4-(4-吗啉-4-基甲基苄氧基)-1-氧-1,3-二氢-异吲哚-2-基]哌啶-2,6-二酮。本文还提供了用于这种治疗、预防和/或控制的药物组合物和剂量方案。
发明背景
由淋巴细胞活性(包括B细胞和/或T细胞的活性)调节的炎性疾病和免疫相关性疾病(如狼疮、硬皮病、冻疮样狼疮、结节病、干燥综合症、ANCA-诱导的血管炎、抗磷脂综合症和重症肌无力)继续是重要的医学问题。
狼疮或红斑狼疮是可以引起身体不同部位，尤其是皮肤、关节、血液和肾脏内的慢性炎症的一系列自身免疫性疾病。人体的免疫系统通常产生称为抗体的蛋白质以保护身体免受病毒、细菌和其他外源材料(即抗原)。在自身免疫性病症(如狼疮)中，免疫系统失去了区分抗原和其自身细胞和组织的能力，并可以使抗体对准其自身细胞和组织，形成免疫复合物。这些免疫复合物可以在组织中堆积并引起炎症、组织损伤和/或疼痛。最常见的三种类型的狼疮包括系统性红斑狼疮(SLE)、皮肤型红斑狼疮(CLE)和药物诱导的狼疮。狼疮或红斑狼疮的更详细的说明可见于Wallace,2000，The Lupus Book:A Guide for Patients and Their Families,Oxford UniversityPress(修订和扩增版)，其以其全部内容作为参考并入本文。
硬皮病是一种发病率稳定(每百万人约19例)的罕见疾病。硬皮病的确切病因尚不清楚。异常情况包括自身免疫以及内皮细胞和成纤维细胞功能的改变。系统性硬皮病通常始于皮肤增厚(通常是指部的皮肤增厚)，伴有雷诺氏现象。雷诺氏病通常早于系统性硬皮病的其他表现。在该疾病的早期，受感染的皮肤可能浮肿变软。最能发生皮肤增厚和硬化的部位通常是脸部、手部和指部。经常出现的是指硬皮病。诊查中肌腱摩擦音常易察觉，并可产生疼痛。随着疾病进一步发展，可能发生指部溃疡和自动断离。胃肠蠕动障碍是该疾病的一种特征，往往表现为心口灼热，或伴有吸收不良或假性梗阻的腹泻。新发高血压或肾功能不全是相关血管损伤的表现。由于心肌纤维化，心脏衰竭或心律不齐也是可能的。(Hachulla E,LaunayD,Diagnosis and classification of systemic sclerosis,Clin Rev Allergy Immunol2010；40(2):78-83)。
硬皮病，具体地全身性硬化症的主要表现是胶原不合适的过量合成和沉积、内皮功能障碍、痉挛、虚脱和纤维化闭塞(obliteration by fibrosis)。就诊断而言，一项重要的临床参数是近掌指关节的皮肤增厚。雷诺氏现象是硬皮病常见，几乎是普遍的组成部分。其通过冷暴露后的肤色变化进行诊断。缺血和皮肤增厚是雷诺氏病的症状。
结节病是以肉芽瘤形成为特征，通过淋巴细胞和巨噬细胞加重的疾病，其通常分类为辅助性T细胞1型应答(T-helper type 1response)。肺泡巨噬细胞的肿瘤坏死因子(TNF)-α、IL-8和IL-18的过量产生被认为是潜在肺部炎症的成因。冻疮样狼疮是结节病的慢性皮肤损伤表现，其主要影响面部。结节病和相关冻疮样狼疮具有有限的治疗选择，如皮质类固醇，其仅提供适度的益处(Baughman RP,Judson MA,Teirstein AS,Moller DR,Lower EE.Thalidomide for chronic sarcoidosis.Chest.2002年7月；122(1):227-32)。
仍然需要可用于治疗或预防免疫相关疾病和炎性疾病(包括狼疮、硬皮病、冻疮样狼疮、结节病、干燥综合症、ANCA-诱导的血管炎、抗磷脂综合症和重症肌无力)的预防性或治疗性药物。
发明概述
本文提供了治疗、控制、改善和/或预防与免疫相关疾病和炎性疾病有关的疾病、病症和/或病况的方法，包括施用治疗有效量的式I的化合物
或其可药用盐、溶剂化物、水合物、立体异构体、互变异构体或外消旋混合物。
在一种实施方式中，所述化合物为3-[4-(4-吗啉-4-基甲基-苄氧基)-1-氧-1,3-二氢-异吲哚-2-基]-哌啶-2,6-二酮。
在一种实施方式中，所述化合物为3-[4-(4-吗啉-4-基甲基-苄氧基)-1-氧-1,3-二氢-异吲哚-2-基]-哌啶-2,6-二酮的可药用盐。
在一种实施方式中，所述化合物为3-[4-(4-吗啉-4-基甲基-苄氧基)-1-氧-1,3-二氢-异吲哚-2-基]-哌啶-2,6-二酮盐酸盐。
在一种实施方式中，所述化合物为具有以下结构的(S)-3-[4-(4-吗啉-4-基甲基-苄氧基)-1-氧-1,3-二氢-异吲哚-2-基]-哌啶-2,6-二酮：
或其可药用盐、溶剂化物、水合物或互变异构体。
在一种实施方式中，所述化合物为(S)-3-[4-(4-吗啉-4-基甲基-苄氧基)-1-氧-1,3-二氢-异吲哚-2-基]-哌啶-2,6-二酮。
在一种实施方式中，所述化合物为(S)-3-[4-(4-吗啉-4-基甲基-苄氧基)-1-氧-1,3-二氢-异吲哚-2-基]-哌啶-2,6-二酮的可药用盐。
在一种实施方式中，所述化合物为(S)-3-[4-(4-吗啉-4-基甲基-苄氧基)-1-氧-1,3-二氢-异吲哚-2-基]-哌啶-2,6-二酮盐酸盐。
在一种实施方式中，所述化合物为具有以下结构的(R)-3-[4-(4-吗啉-4-基甲基-苄氧基)-1-氧-1,3-二氢-异吲哚-2-基]-哌啶-2,6-二酮：
或其可药用盐、溶剂化物、水合物或互变异构体。
在一种实施方式中，所述化合物为(R)-3-[4-(4-吗啉-4-基甲基-苄氧基)-1-氧-1,3-二氢-异吲哚-2-基]-哌啶-2,6-二酮。
在一种实施方式中，所述化合物为(R)-3-[4-(4-吗啉-4-基甲基-苄氧基)-1-氧-1,3-二氢-异吲哚-2-基]-哌啶-2,6-二酮的可药用盐。
在一种实施方式中，所述化合物为(R)-3-[4-(4-吗啉-4-基甲基-苄氧基)-1-氧-1,3-二氢-异吲哚-2-基]-哌啶-2,6-二酮盐酸盐。
在某些实施方式中，所述疾病选自狼疮、硬皮病、干燥综合征(syndrome)、ANCA-诱导的血管炎、抗磷脂综合征和重症肌无力。
在一种实施方式中，本文提供了调节，例如，降低白细胞活性的方法，所述白细胞活性包括B细胞和/或T细胞、单核细胞、巨噬细胞及其他淋巴源或髓源细胞类型的活性，所述方法包括将B细胞和/或T细胞与有效量的化合物I接触。
本文还提供了适合在治疗、预防、改善和/或控制与免疫相关疾病和炎性疾病相关的疾病、病症和/或病况中使用的药物组合物，单一单位剂量形式和试剂盒，其包含任选地与一种或多种其他治疗剂结合的化合物I。
在某些实施方式中，将化合物I与一种或多种治疗剂，即，作为白细胞活性，包括B细胞和/或T细胞、单核细胞、巨噬细胞及其他淋巴源或髓源细胞类型的活性的调节剂的药物试剂结合施用。所述组合包括同时和顺序施用。
附图说明
图1示出了(S)-3-[4-(4-吗啉-4-基甲基苄氧基)-1-氧-1,3-二氢-异吲哚-2-基]哌啶-2,6-二酮对浆母细胞和活化的B细胞分化的作用。
图2示出了(S)-3-[4-(4-吗啉-4-基甲基苄氧基)-1-氧-1,3-二氢-异吲哚-2-基]哌啶-2,6-二酮对浆母细胞分化期间的细胞存活力的作用。
图3示出了(S)-3-[4-(4-吗啉-4-基甲基苄氧基)-1-氧-1,3-二氢-异吲哚-2-基]哌啶-2,6-二酮对B细胞和浆细胞转录因子表达的作用。
图4示出了(S)-3-[4-(4-吗啉-4-基甲基苄氧基)-1-氧-1,3-二氢-异吲哚-2-基]哌啶-2,6-二酮对浆母细胞培养中IgG产生的作用。
图5A和5B示出了(S)-3-[4-(4-吗啉-4-基甲基苄氧基)-1-氧-1,3-二氢-异吲哚-2-基]哌啶-2,6-二酮对B细胞和浆细胞转录因子表达的作用。
图6示出了(S)-3-[4-(4-吗啉-4-基甲基苄氧基)-1-氧-1,3-二氢-异吲哚-2-基]哌啶-2,6-二酮对B细胞培养4天、7天和10天时的IgG产生的作用。
图7示出了单独的或与泼尼松龙结合的(S)-3-[4-(4-吗啉-4-基甲基苄氧基)-1-氧-1,3-二氢-异吲哚-2-基]哌啶-2,6-二酮对体外分化的浆母细胞/浆细胞的IgG产生的作用。
图8示出了(S)-3-[4-(4-吗啉-4-基甲基苄氧基)-1-氧-1,3-二氢-异吲哚-2-基]哌啶-2,6-二酮对B细胞分化第7天时的CD20/CD38表达的作用。
图9示出了(S)-3-[4-(4-吗啉-4-基甲基苄氧基)-1-氧-1,3-二氢-异吲哚-2-基]哌啶-2,6-二酮对浆母细胞分化期间的细胞存活力的作用。
图10示出了(S)-3-[4-(4-吗啉-4-基甲基苄氧基)-1-氧-1,3-二氢-异吲哚-2-基]哌啶-2,6-二酮对体外SLE患者PBMC中B细胞分化和功能的作用。
图11A和11B分别示出了(S)-3-[4-(4-吗啉-4-基甲基苄氧基)-1-氧-1,3-二氢-异吲哚-2-基]哌啶-2,6-二酮对B细胞培养第7天时的IgG和IgM产生的作用。
图12示出了(S)-3-[4-(4-吗啉-4-基甲基苄氧基)-1-氧-1,3-二氢-异吲哚-2-基]哌啶-2,6-二酮对CD19+B细胞向浆母细胞/浆细胞分化的作用。
图13示出了(S)-3-[4-(4-吗啉-4-基甲基苄氧基)-1-氧-1,3-二氢-异吲哚-2-基]哌啶-2,6-二酮对正常B细胞分化测定中大尺寸细胞群体(gate p2)的作用。
图14示出了(S)-3-[4-(4-吗啉-4-基甲基苄氧基)-1-氧-1,3-二氢-异吲哚-2-基]哌啶-2,6-二酮对B细胞分化培养中浆细胞转录因子的作用。
图15A-15E示出了(S)-3-[4-(4-吗啉-4-基甲基苄氧基)-1-氧-1,3-二氢-异吲哚-2-基]哌啶-2,6-二酮(20nM)对第7天培养的B细胞中浆细胞转录因子表达的作用。
图16示出了(S)-3-[4-(4-吗啉-4-基甲基苄氧基)-1-氧-1,3-二氢-异吲哚-2-基]哌啶-2,6-二酮对来自分化SLE患者PBMC的CD38+浆母细胞/浆细胞中的转录因子表达的作用。
图17示出了(S)-3-[4-(4-吗啉-4-基甲基苄氧基)-1-氧-1,3-二氢-异吲哚-2-基]哌啶-2,6-二酮(在图中表示为化合物I)对B细胞分化培养第7天时CD44MFI的作用。
图18示出了(S)-3-[4-(4-吗啉-4-基甲基苄氧基)-1-氧-1,3-二氢-异吲哚-2-基]哌啶-2,6-二酮对正常B细胞分化测定第7天时的CD20高/CD44高细胞的作用。
图19示出了(S)-3-[4-(4-吗啉-4-基甲基苄氧基)-1-氧-1,3-二氢-异吲哚-2-基]哌啶-2,6-二酮(在图中表示为化合物I)对B细胞分化培养第4天和第7天时的CD83+细胞和表达的作用。
图20示出了(S)-3-[4-(4-吗啉-4-基甲基苄氧基)-1-氧-1,3-二氢-异吲哚-2-基]哌啶-2,6-二酮(在图中表示为化合物I)对B细胞分化培养期间的Ig J链表达的作用。
图21示出了3-[4-(4-吗啉-4-基甲基苄氧基)-1-氧-1,3-二氢-异吲哚-2-基]哌啶-2,6-二酮对抗CD3-刺激的人T细胞中某些细胞因子和趋化因子的产生(表示为绝对产量)的作用。
图22示出了3-[4-(4-吗啉-4-基甲基苄氧基)-1-氧-1,3-二氢-异吲哚-2-基]哌啶-2,6-二酮对抗CD3-刺激的人T细胞中某些细胞因子和趋化因子的产生(表示为对照的百分比)的作用。
图23示出了(R)-3-[4-(4-吗啉-4-基甲基苄氧基)-1-氧-1,3-二氢-异吲哚-2-基]哌啶-2,6-二酮对抗CD3-刺激的人T细胞中某些细胞因子和趋化因子的产生(表示为绝对产量)的作用。
图24示出了(R)-3-[4-(4-吗啉-4-基甲基苄氧基)-1-氧-1,3-二氢-异吲哚-2-基]哌啶-2,6-二酮对抗CD3-刺激的人T细胞中某些细胞因子和趋化因子的产生(表示为对照的百分比)的作用。
图25示出了(S)-3-[4-(4-吗啉-4-基甲基苄氧基)-1-氧-1,3-二氢-异吲哚-2-基]哌啶-2,6-二酮对抗CD3-刺激的人T细胞中某些细胞因子和趋化因子的产生(表示为绝对产量)的作用。
图26示出了(S)-3-[4-(4-吗啉-4-基甲基苄氧基)-1-氧-1,3-二氢-异吲哚-2-基]哌啶-2,6-二酮对抗CD3-刺激的人T细胞中某些细胞因子和趋化因子的产生(表示为对照的百分比)的作用。
图27示出了3-[4-(4-吗啉-4-基甲基苄氧基)-1-氧-1,3-二氢-异吲哚-2-基]哌啶-2,6-二酮对脂多糖刺激的周围血单核细胞中某些细胞因子和趋化因子的产生的抑制。
图28示出了3-[4-(4-吗啉-4-基甲基苄氧基)-1-氧-1,3-二氢-异吲哚-2-基]哌啶-2,6-二酮对脂多糖刺激的周围血单核细胞中某些细胞因子和趋化因子的产生的提高。
图29示出了(R)-3-[4-(4-吗啉-4-基甲基苄氧基)-1-氧-1,3-二氢-异吲哚-2-基]哌啶-2,6-二酮对脂多糖刺激的周围血单核细胞中某些细胞因子和趋化因子的产生的抑制。
图30示出了(R)-3-[4-(4-吗啉-4-基甲基苄氧基)-1-氧-1,3-二氢-异吲哚-2-基]哌啶-2,6-二酮对脂多糖刺激的周围血单核细胞中某些细胞因子和趋化因子的产生的提高。
图31示出了(S)-3-[4-(4-吗啉-4-基甲基苄氧基)-1-氧-1,3-二氢-异吲哚-2-基]哌啶-2,6-二酮对脂多糖刺激的周围血单核细胞中某些细胞因子和趋化因子的产生的抑制。
图32示出了(S)-3-[4-(4-吗啉-4-基甲基苄氧基)-1-氧-1,3-二氢-异吲哚-2-基]哌啶-2,6-二酮对脂多糖刺激的周围血单核细胞中某些细胞因子和趋化因子的产生的提高。
图33示出了3-[4-(4-吗啉-4-基甲基苄氧基)-1-氧-1,3-二氢-异吲哚-2-基]哌啶-2,6-二酮对响应于固定的IgG和IL-2的NK细胞IFN-γ的产生(表示为绝对产量)的提高。
图34示出了(R)-3-[4-(4-吗啉-4-基甲基苄氧基)-1-氧-1,3-二氢-异吲哚-2-基]哌啶-2,6-二酮对响应于固定的IgG和IL-2的NK细胞IFN-γ的产生(表示为绝对产量)的提高。
图35示出了(S)-3-[4-(4-吗啉-4-基甲基苄氧基)-1-氧-1,3-二氢-异吲哚-2-基]哌啶-2,6-二酮对响应于固定的IgG和IL-2的NK细胞IFN-γ的产生(表示为绝对产量)的提高。
图36示出了3-[4-(4-吗啉-4-基甲基苄氧基)-1-氧-1,3-二氢-异吲哚-2-基]哌啶-2,6-二酮对响应于固定的IgG和IL-2的NK细胞IFN-γ的生产(表示为在存在1μm泊马度胺的情况下产生的IFN-γ的量的百分比)的提高。
图37示出了(R)-3-[4-(4-吗啉-4-基甲基苄氧基)-1-氧-1,3-二氢-异吲哚-2-基]哌啶-2,6-二酮对响应于固定的IgG和IL-2的NK细胞IFN-γ的产生(表示为在存在1μm泊马度胺的情况下产生的IFN-γ的量的百分比)的提高。
图38示出了(S)-3-[4-(4-吗啉-4-基甲基苄氧基)-1-氧-1,3-二氢-异吲哚-2-基]哌啶-2,6-二酮对响应于固定的IgG和IL-2的NK细胞IFN-γ的产生(在存在1μm泊马度胺的情况下产生的IFN-γ的量的百分比)的提高。
图39示出了本文所提供的化合物对生长因子诱导的人脐静脉血管内皮细胞增殖的作用。
图40示出了本文所提供的化合物对生长因子诱导的人脐静脉血管内皮细胞小管形成的作用。
图41示出了本文所提供的化合物对生长因子诱导的人脐静脉血管内皮细胞侵袭的作用。
图42示出了(S)-3-[4-(4-吗啉-4-基甲基苄氧基)-1-氧-1,3-二氢-异吲哚-2-基]哌啶-2,6-二酮对博来霉素皮肤纤维化小鼠模型中病变皮肤的表皮厚度的影响(预防炎症驱使的纤维化)。
图43示出了博来霉素皮肤纤维化小鼠模型中病变皮肤的表皮厚度的苏木素伊红染色的皮肤切片显微照片(预防炎症驱使的纤维化)。
图44示出了(S)-3-[4-(4-吗啉-4-基甲基苄氧基)-1-氧-1,3-二氢-异吲哚-2-基]哌啶-2,6-二酮对博来霉素皮肤纤维化小鼠模型中病变皮肤中的α-SMA+肌成纤维细胞的数目的影响(预防炎症驱使的纤维化)。
图45示出了测试化合物对博来霉素皮肤纤维化小鼠模型中病变皮肤的表皮厚度的影响(所建立的纤维化的消退)。
图46示出了博来霉素皮肤纤维化小鼠模型中病变皮肤的表皮厚度的苏木素伊红染色的皮肤切片显微照片(所建立的纤维化的消退)。
图47示出了博来霉素皮肤纤维化小鼠模型中病变皮肤中的α-SMA+肌成纤维细胞数目的减少(所建立的纤维化的消退)。
图48A示出了TSK-1小鼠中(S)-3-[4-(4-吗啉-4-基甲基苄氧基)-1-氧-1,3-二氢-异吲哚-2-基]哌啶-2,6-二酮对表皮厚度的减小。
图48B示出了TSK-1小鼠中(S)-3-[4-(4-吗啉-4-基甲基苄氧基)-1-氧-1,3-二氢-异吲哚-2-基]哌啶-2,6-二酮对相对羟脯氨酸含量的减少。
图49A示出了(S)-3-[4-(4-吗啉-4-基甲基苄氧基)-1-氧-1,3-二氢-异吲哚-2-基]哌啶-2,6-二酮对CTGF的调节。
图49B示出了(S)-3-[4-(4-吗啉-4-基甲基苄氧基)-1-氧-1,3-二氢-异吲哚-2-基]哌啶-2,6-二酮对PAI-1的调节。
图49C示出了(S)-3-[4-(4-吗啉-4-基甲基苄氧基)-1-氧-1,3-二氢-异吲哚-2-基]哌啶-2,6-二酮对COL1A的调节。
图49D示出了(S)-3-[4-(4-吗啉-4-基甲基苄氧基)-1-氧-1,3-二氢-异吲哚-2-基]哌啶-2,6-二酮对aSMA的调节。
图49E示出了(S)-3-[4-(4-吗啉-4-基甲基苄氧基)-1-氧-1,3-二氢-异吲哚-2-基]哌啶-2,6-二酮对CCMP的调节。
图49F示出了(S)-3-[4-(4-吗啉-4-基甲基苄氧基)-1-氧-1,3-二氢-异吲哚-2-基]哌啶-2,6-二酮对TGFB1的调节。
图50示出了(S)-3-[4-(4-吗啉-4-基甲基苄氧基)-1-氧-1,3-二氢-异吲哚-2-基]哌啶-2,6-二酮对COL1、aSMA和FN的调节。
图51示出了(S)-3-[4-(4-吗啉-4-基甲基苄氧基)-1-氧-1,3-二氢-异吲哚-2-基]哌啶-2,6-二酮对MMP1和PAI的调节。
图52示出了(S)-3-[4-(4-吗啉-4-基甲基苄氧基)-1-氧-1,3-二氢-异吲哚-2-基]哌啶-2,6-二酮对Dnmt1的调节。
图53示出了正常和SSc成纤维细胞中Cereblon的mRNA表达水平。
图54示出了正常和SSc皮肤组织中Cereblon的mRNA表达水平。
发明详述
除非另外定义，否则本文所使用的所有技术和科学名词的含义与本领域技术人员通常理解的含义相同。所有专利、专利申请、公开的专利申请及其他公开文献以其全部内容作为公开并入本文。如果本文的术语存在多个定义，除非另有说明，否则以本节中的那些为准。
如本文所使用的并且除非另外说明，术语“治疗”是指与正在治疗的疾病或病况有关的疾病或症状的减轻或严重程度的降低。
如本文所使用的，“预防”以及该单词的其他形式包括对疾病或病症或特定疾病或病症的症状的发生或发展的抑制。在一些实施方式中，具有癌症家族病史的受试者是预防性方案的候选。通常，在癌症的背景中，术语“预防”是指在癌症的病征或症状发生前，特别是在具有癌症风险的受试者中发生前的药物施用。
如本文所使用的并且除非另外说明，术语“控制”涵盖了对患有特定疾病或病症的受试者中所述特定疾病或病症复发的预防，延长患有所述疾病或病症的受试者保持缓解的时间，降低所述受试者的死亡率和/或维持与正在控制的疾病或病况有关的症状严重程度的降低或维持避免所述症状。
如本文所使用的，“受试者”表示动物，通常是哺乳动物，包括人。如本文所使用的，“患者”表示人受试者。
如本文所使用的并且除非另作说明，术语化合物的“治疗有效量”和“有效量”表示在疾病的治疗、预防和/或控制中足以提供治疗益处或者足以延缓或最大程度降低与待治疗疾病或病症有关的一种或多种症状的量。术语“治疗有效量”和“有效量”可以涵盖改善整体疗法，降低或避免疾病或病症的症状或原因，或者提高另一种治疗剂的治疗效力的量。
如本文所使用的并且除非另作说明，术语化合物的“预防有效量”是足以预防疾病或病况，或与疾病或病况有关的一种或多种症状，或者预防其复发的量。化合物的预防有效量表示在疾病预防中提供预防益处的单独或与其他试剂结合的治疗剂的量。术语“预防有效量”可以涵盖改善整体预防或者提高另一种预防剂的预防效力的量。
如本文所使用的并且除非另外说明，术语“可药用盐”包括(但不限于)可以存在于本文所提供的化合物中的酸性基团的盐。在某些酸性条件下，该化合物可以与多种无机和有机酸形成各种各样的盐。可以用于制备这类碱性化合物的可药用盐的酸是那些形成包括药理学可用的阴离子的盐的酸，所述盐包括(但不限于)乙酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、碳酸氢盐、酒石酸氢盐、溴化物、乙二胺四乙酸钙、樟脑磺酸盐、碳酸盐、氯化物、溴化物、碘化物、柠檬酸盐、二氢氯化物、乙二胺四乙酸盐、乙二磺酸盐、丙酸酯十二烷硫酸盐、乙磺酸盐、延胡索酸盐、葡庚糖酸盐、葡糖酸盐、谷氨酸盐、乙醇酰基对氨基苯基砷酸盐(glycollylarsanilate)、己基苯间二酚盐(hexylresorcinate)、哈胺、羟萘甲酸盐、羟乙基磺酸盐、乳酸盐、乳糖酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、扁桃酸盐、甲磺酸盐、甲基硫酸盐、肉豆蔻盐(muscate)、萘磺酸盐、硝酸盐、泛酸盐、磷酸盐/二磷酸盐、聚半乳糖醛酸盐、水杨酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、单宁酸盐、酒石酸盐、茶氯酸盐(teoclate)、三乙基碘化物(triethiodide)和双羟萘酸盐。
如本文所使用的并且除非另外说明，术语“水合物”是指本文所提供的化合物或其盐，其还包含通过非共价分子间力结合的化学计量或非化学计量的量的水。所述水合物可以是晶体或非晶体的。
如本文所使用的并且除非另外说明，术语“溶剂化物”表示由一种或多种溶剂分子与本文所提供的化合物结合所形成的溶剂化物。术语“溶剂化物”包括水合物(例如，一水合物、二水合物、三水合物、四水合物等)。所述溶剂化物可以是晶体或非晶体的。
如本文所使用的并且除非另作说明，术语“立体异构体”包含本文所提供的所有对映异构体/立体异构体纯的以及对映异构体/立体异构体富集的化合物。
如本文所使用的并且除非另外说明，术语“立体异构体纯的”或“对映异构体纯的”是指化合物包含一种立体异构体并且基本上不含其相对的立体异构体或对映异构体。例如，当化合物包含80％、90％或95％或更多的一种立体异构体以及20％、10％或5％或更少的相对的立体异构体时，该化合物是立体异构体或对映异构体纯的。在某些情况下，当本文所提供的化合物相对于特定手性中心为约80％ee(对映异构体过量)或更大，优选地等于或大于90％ee，并且更优选地，相对于特定手性中心为95％ee时，则该化合物被认为相对于手性中心是光学活性或立体异构体/对映异构体纯的(即基本上是R构型或基本上是S构型)。
如本文所使用的并且除非另外说明，术语“立体异构体富集的”或“对映异构体富集的”包括本文所提供的化合物的立体异构体的外消旋混合物及其他混合物(例如，R/S＝30/70、35/65、40/60、45/55、55/45、60/40、65/35和70/30)。
术语“共施用”和“结合”包括两种或更多种治疗剂(例如，本文所提供的化合物I或组合物和白细胞活性，包括B细胞和/或T细胞、单核细胞、巨噬细胞及其他淋巴源或髓源细胞类型的活性的另一种调节剂或其他活性剂)的没有具体时间限制的同时、并行或顺序施用。在一种实施方式中，化合物I和至少一种其他试剂同时存在于细胞中或受试者体内并且同时发挥它们的生物学或治疗效果。在一种实施方式中，所述治疗剂处于相同组合物或单位剂量形式中。在另一种实施方式中，所述治疗剂处于单独的组合物或单位剂量形式中。
“B细胞”是在骨髓内成熟的淋巴细胞，并且包括初始B细胞、记忆B细胞或效应B细胞(浆细胞)。本文的B细胞可以是正常的或非恶性的B细胞。
“T细胞”是在胸腺内成熟的淋巴细胞，并且包括辅助性T细胞、记忆T细胞和细胞毒性T细胞。
如本文所使用的“整体生存期”是指从随机取样至因任何原因死亡的时间，并且在意向治疗人群中测量。可以在随机对照研究中评价整体生存期。
如本文所使用的“客观反应率”是指在预定时间段结束时，具有减少的预定硬皮病症状的患者的比例。通常，反应持续时间是从初始反应时间至记录的硬皮病进展所测量的。
如本文所使用的“进展时间”是指从随机取样到客观硬皮病进展为止的时间。在某些实施方式中，进展时间不包括死亡时间。
如本文所使用的“没有进展的生存期”是指从随机取样到客观硬皮病进展或死亡为止的时间。
如本文所使用的“治疗失败时间”是指测量从随机取样到因各种原因(包括疾病进展、治疗毒性和死亡)停止治疗的时间的任何终点。
如本文所使用的“死亡率”是指给定人群中死亡数量的量度。
如本文所使用的“呼吸系统疾病死亡率”是指死于急性低氧血症或其他导致死亡的具体呼吸系统恶化情况(如需要机械通气导致死亡、呼吸骤停或在本质上被认为进行呼吸的受试者体内的任何其他事件)的患者数。
如本文所使用的“呼吸系统疾病入院情况”是指根据患者入院注意事项或其他医学意见备案，因肺部状态恶化而住院的那些患者。
如本文所使用的“改良的Rodnan皮肤评分”是指评价真皮皮肤厚度的验证的数值评分系统。
如本文所使用的“皮肤厚度”是指可以使用多种技术(包括硬度计和mRSS)评价的坚硬或硬结的皮肤。
如本文所使用的“皮肤硬结”是指硬化、发红、发炎、变厚或变嫩的皮肤。
如本文所使用的“皮肤病生活质量指数”是指对与硬皮病患者的皮肤症状有关的质量或生活的评价。
如本文所使用的“肺功能”是指对用力呼气流量、用力肺活量、FEV25-75％、肺容量或肺活量的任何量度。
如本文所使用的“一氧化碳扩散能力”是指对穿过肺泡-毛细血管膜的一氧化碳的吸收的评价。它可以代表对将氧气从肺部输送到血流的肺部能力的量度。
如本文所使用的“Mahler呼吸困难指数”是指提供气促临床测量的手段。
如本文所使用的“圣乔治呼吸系统疾病问卷评分”是指测量肺病患者的生活质量的手段。
如本文所使用的“UCLA硬皮病临床试验聚生体胃肠道评分”是指提供给硬皮病患者以评价与硬皮病(全身性硬化症)有关的消化系统症状的问卷。
如本文所使用的“流量调节的扩张”是指对硬皮病患者体内血管内皮功能的任何量度。
如本文所使用的“六分钟步行距离”是指对硬皮病患者在6分钟内可以步行的距离进行的任何评价或评价固定时间段或距离的步行能力的任何标准化程序。
如本文所使用的，泊马度胺是指以下化合物：
7.1 化合物I
在某些实施方式中，在本文所提供的方法，包括组合疗法以及在本文提供的组合物中使用的化合物I为下式所表示的化合物：
或其可药用盐、溶剂化物、水合物、立体异构体、互变异构体或外消旋混合物。
在一种实施方式中，所述化合物为(S)-3-[4-(4-吗啉-4-基甲基-苄氧基)-1-氧-1,3-二氢-异吲哚-2-基]-哌啶-2,6-二酮，其具有以下结构：
或其可药用盐、溶剂化物、水合物或互变异构体。
在一种实施方式中，所述化合物为(S)-3-[4-(4-吗啉-4-基甲基-苄氧基)-1-氧-1,3-二氢-异吲哚-2-基]-哌啶-2,6-二酮。
在一种实施方式中，所述化合物为(S)-3-[4-(4-吗啉-4-基甲基-苄氧基)-1-氧-1,3-二氢-异吲哚-2-基]-哌啶-2,6-二酮的可药用盐。
在一种实施方式中，所述化合物为(S)-3-[4-(4-吗啉-4-基甲基-苄氧基)-1-氧-1,3-二氢-异吲哚-2-基]-哌啶-2,6-二酮盐酸盐。
在一种实施方式中，所述化合物为具有以下结构的(R)-3-[4-(4-吗啉-4-基甲基-苄氧基)-1-氧-1,3-二氢-异吲哚-2-基]-哌啶-2,6-二酮：
或其可药用盐、溶剂化物、水合物或互变异构体。
在一种实施方式中，所述化合物为(R)-3-[4-(4-吗啉-4-基甲基-苄氧基)-1-氧-1,3-二氢-异吲哚-2-基]-哌啶-2,6-二酮。
在一种实施方式中，所述化合物为(R)-3-[4-(4-吗啉-4-基甲基-苄氧基)-1-氧-1,3-二氢-异吲哚-2-基]-哌啶-2,6-二酮的可药用盐。
在一种实施方式中，所述化合物选自3-[4-(4-吗啉-4-基甲基-苄氧基)-1-氧-1,3-二氢-异吲哚-2-基]-哌啶-2,6-二酮、3-[4-(4-吗啉-4-基甲基苄氧基)-1-氧-1,3-二氢-异吲哚-2-基]哌啶-2,6-二酮盐酸盐、(R)-3-[4-(4-吗啉-4-基甲基苄氧基)-1-氧-1,3-二氢-异吲哚-2-基]哌啶-2,6-二酮、(R)-3-[4-(4-吗啉-4-基甲基苄氧基)-1-氧-1,3-二氢-异吲哚-2-基]哌啶-2,6-二酮盐酸盐、(S)-3-[4-(4-吗啉-4-基甲基苄氧基)-1-氧-1,3-二氢-异吲哚-2-基]哌啶-2,6-二酮和(S)-3-[4-(4-吗啉-4-基甲基苄氧基)-1-氧-1,3-二氢-异吲哚-2-基]哌啶-2,6-二酮盐酸盐。
可以通过本领域技术人员已知的方法，例如，根据US专利公开第2011/0196150号所述的程序制备化合物I或其可药用盐、溶剂化物、水合物、立体异构体、互变异构体或外消旋混合物，所述专利的全部内容作为参考并入本文。
实施例1中描述了制备的示例性方法。
7.2 治疗方法
本文提供了治疗、预防和/或控制与免疫相关疾病和炎性疾病有关的疾病、病症和/或病况的方法，包括向对其有需要的患者施用治疗有效量的化合物I或其可药用盐、溶剂化物、水合物、立体异构体、互变异构体或外消旋混合物。在某些实施方式中，所述疾病选自狼疮、硬皮病、干燥综合症、ANCA-诱导的血管炎、抗磷脂综合征和重症肌无力。在某些实施方式中，所述疾病为狼疮或硬皮病。
可以在多种体内和体外测定中研究化合物I或其可药用盐、溶剂化物、水合物、立体异构体、互变异构体或外消旋混合物的敏感性，其包括本领域技术人员已知的免疫相关疾病和炎性疾病的动物模型，其包括(但不限于)系统性红斑狼疮的MRL/MpJ-Faslpr/J小鼠模型、系统性红斑狼疮的NZBWF1/J小鼠模型、博来霉素诱导的皮肤纤维化模型和鼠紧绷皮肤-1(Tsk-1)小鼠模型。
7.2.1 硬皮病的治疗
在某些实施方式中，本文提供了治疗、预防和/或控制硬皮病或其症状的方法，包括向硬皮病患者施用治疗有效量的化合物I或其可药用盐、溶剂化物、水合物、立体异构体、互变异构体或外消旋混合物。在一种实施方式中，本文提供了治疗、预防和/或控制硬皮病或其症状的方法，其包括施用有效量的(S)-3-[4-(4-吗啉-4-基甲基苄氧基)-1-氧-1,3-二氢-异吲哚-2-基]哌啶-2,6-二酮或其可药用盐。
在某些实施方式中，本文提供了预防硬皮病或其症状的方法，包括向具有患硬皮病风险的患者施用有效量的化合物I或其可药用盐、溶剂化物、水合物、立体异构体、互变异构体或外消旋混合物。在一种实施方式中，本文提供了预防硬皮病或其症状的方法，其包括施用有效量的(S)-3-[4-(4-吗啉-4-基甲基苄氧基)-1-氧-1,3-二氢-异吲哚-2-基]哌啶-2,6-二酮或其可药用盐。
在某些实施方式中，硬皮病是局灶性硬皮病、系统性硬皮病、局限性硬皮病或弥漫性硬皮病。
在某些实施方式中，系统性硬皮病包括CREST综合症(钙质沉着症、雷诺氏综合征、食道功能障碍或蠕动障碍、指硬皮病、毛细血管扩张)。硬皮病也称为全身性硬化症或进行性全身性硬化症。在某些实施方式中，本文提供了治疗或预防雷诺氏病(Raynaud's syndrome)或综合征的方法。在某些实施方式中，全身性硬化症包括硬皮病肺病、硬皮病肾脏危象、心脏表现、肌肉无力(包括疲劳或局限性CREST)、胃肠蠕动障碍和痉挛以及中枢、周围和自主神经系统异常(包括腕管综合征，继之以三叉神经痛)。它还包括全身无力(general disability)(包括抑郁症)以及对生活质量的影响。
在某些实施方式中，局限性硬皮病限于手部、脸部、颈部或其组合。
在某些实施方式中，弥漫性硬皮病包括皮肤紧绷并且还发生在腕部(或肘部)以上。在某些实施方式中，所述弥漫性全身性硬化症是无皮肤硬化的硬皮病(包括内脏器官纤维化，但无皮肤紧绷)；或家族性进行性全身性硬化症。
在一种实施方式中，硬皮病与消瘦(例如与疾病相关的消瘦)不相关。
在一种实施方式中，本文提供了用于减少、抑制或预防硬皮病的一种或多种以下症状的方法:(i)皮肤(例如，四肢，如手部、脸部和足部内皮肤)逐渐硬化、增厚和紧绷；(ii)皮肤变色；(iii)四肢麻木；(iv)皮肤发亮；(v)皮肤表面下，喷发垩白液体的白色小肿块；(vi)雷诺氏食道功能障碍(Raynaud’s esophagaeal dysfunction)(暴露于冷或情绪压力时由血管痉挛导致的手部疼痛、麻木和/或变色)；(vii)毛细血管扩张(例如，手部、掌部、前臂、脸部和唇部上的红色斑点)；(viii)关节疼痛和/或僵硬；(ix)手部和足部肿胀；(x)皮肤瘙痒；(xi)指部僵硬和弯曲；(xii)某些关节外部(例如指节和肘部)上有溃疡(疮)；(xiii)消化问题，例如心口灼热、吞咽困难、腹湾、肠易激和便秘；(xiv)疲劳和虚弱；(xv)气短；(xvi)关节炎；(xvii)脱发；(xviii)内脏问题；(xix)指部溃疡；(xx)指部自动断离，所述方法包括向对其有需要的患者施用有效量的化合物I。
不受任何特定的理论的束缚，据信化合物I或其可药用盐、溶剂化物、水合物、立体异构体、互变异构体或外消旋混合物增强了Thl免疫应答，并且抑制了Th2免疫应答，这可以在皮肤内产生抗纤维化作用。
本文还提供了用于改善或减小硬皮病患者皮肤更厚的方法，其包括向所述患者施用有效量的化合物I或其可药用盐、溶剂化物、水合物、立体异构体、互变异构体或外消旋混合物。在一种实施方式中，所述皮肤厚度减小了约20％、约25％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或更多。
本文还提供了用于实现与硬皮病相关的一个或多个临床终点的方法，包括向对其有需要的患者施用有效量的化合物I或其可药用盐、溶剂化物、水合物、立体异构体、互变异构体或外消旋混合物。
本文还提供了用于延长硬皮病患者的整体存活期、客观反应率、进展时间、无恶化存活期和/或治疗失败时间的方法，包括向所述患者施用有效量的化合物I或其可药用盐、溶剂化物、水合物、立体异构体、互变异构体或外消旋混合物。
本文还提供了用于减少硬皮病患者的死亡率、呼吸系统疾病死亡率和/或呼吸系统疾病入院情况的方法，包括向所述患者施用有效量的化合物I或其可药用盐、溶剂化物、水合物、立体异构体、互变异构体或外消旋混合物。
本文还提供了用于改善硬皮病患者的改良Rodnan皮肤评分的方法，包括向所述患者施用有效量的化合物I或其可药用盐、溶剂化物、水合物、立体异构体、互变异构体或外消旋混合物。在一种实施方式中，改良Rodnan皮肤评分的改善为5、10、15或20分或更多。
本文还提供了用于改善或减小硬皮病患者的皮肤厚度的方法，包括向所述患者施用有效量的化合物I或其可药用盐、溶剂化物、水合物、立体异构体、互变异构体或外消旋混合物。在一种实施方式中，所述皮肤厚度减小了约20％、约25％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或更多。
本文还提供了用于改善或减小硬皮病患者的皮肤硬结的方法，包括向所述患者施用有效量的化合物I或其可药用盐、溶剂化物、水合物、立体异构体、互变异构体或外消旋混合物。
本文还提供了用于改善硬皮病患者的皮肤病生活质量指数的方法，包括向所述患者施用有效量的化合物I或其可药用盐、溶剂化物、水合物、立体异构体、互变异构体或外消旋混合物。
本文还提供了用于改善硬皮病患者的肺功能的方法，包括向所述患者施用有效量的化合物I或其可药用盐、溶剂化物、水合物、立体异构体、互变异构体或外消旋混合物。
本文还提供了用于改善硬皮病患者的一氧化碳扩散能力的方法，包括向所述患者施用有效量的化合物I或其可药用盐、溶剂化物、水合物、立体异构体、互变异构体或外消旋混合物。在一种实施方式中，患者的一氧化碳扩散能力通过肺部一氧化碳扩散能力(DLco)的改善得以改善，该DLco的改善为约10％、约20％、约25％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或更多。
本文还提供了用于改善硬皮病患者的Mahler呼吸困难指数(MahlerDyspnea index)的方法，包括向所述患者施用有效量的化合物I或其可药用盐、溶剂化物、水合物、立体异构体、互变异构体或外消旋混合物。在一种实施方式中，Mahler呼吸困难指数的改善为4、5、6、7、8、9或10分或更多。
本文还提供了用于改善硬皮病患者的圣乔治呼吸系统疾病问卷评分(Saint George's Respiratory Questionnaire score)的方法，包括向所述患者施用有效量的化合物I或其可药用盐、溶剂化物、水合物、立体异构体、互变异构体或外消旋混合物。在一种实施方式中，圣乔治呼吸系统疾病问卷评分的改善为4、8、12、16、20、24、28、32、36、40、44、48、52分或更多。
本文还提供了用于改善硬皮病患者的UCLA硬皮病临床试验聚生体胃肠道评分(UCLA scleroderma clinical trial consortium gastrointestinal tractscore)的方法，包括向所述患者施用有效量的化合物I或其可药用盐、溶剂化物、水合物、立体异构体、互变异构体或外消旋混合物。
本文还提供了用于治疗或预防硬皮病患者或患者群体的指部溃疡的方法，包括向所述患者施用有效量的化合物I或其可药用盐、溶剂化物、水合物、立体异构体、互变异构体或外消旋混合物。
本文还提供了用于改善硬皮病患者的流量调节的扩张的方法，包括向所述患者施用有效量的化合物I或其可药用盐、溶剂化物、水合物、立体异构体、互变异构体或外消旋混合物。
本文还提供了改善或延长硬皮病患者的六分钟步行距离的方法，包括向所述患者施用有效量的化合物I或其可药用盐、溶剂化物、水合物、立体异构体、互变异构体或外消旋混合物。在一种实施方式中，六分钟步行距离的改善为约200米、约250米、约300米、约350米、约400米或更多。
7.2.2 红斑狼疮的治疗
在某些实施方式中，本文提供了治疗、预防和/或控制红斑狼疮或其症状的方法，其包括向红斑狼疮患者施用治疗有效量的化合物I或其可药用盐、溶剂化物、水合物、立体异构体、互变异构体或外消旋混合物。在某些实施方式中，本文提供了治疗、预防和/或控制红斑狼疮或其症状的方法，其包括向红斑狼疮患者施用治疗有效量的(S)-3-[4-(4-吗啉-4-基甲基苄氧基)-1-氧-1,3-二氢-异吲哚-2-基]哌啶-2,6-二酮或其可药用盐。
在一种实施方式中，本文提供了预防红斑狼疮或其症状的方法，包括向具有患红斑狼疮风险的患者施用有效量的化合物I或其可药用盐、溶剂化物、水合物、立体异构体、互变异构体或外消旋混合物。在一种实施方式中，本文提供了预防红斑狼疮或其症状的方法，其包括向具有患红斑狼疮风险的患者施用有效量的(S)-3-[4-(4-吗啉-4-基甲基苄氧基)-1-氧-1,3-二氢-异吲哚-2-基]哌啶-2,6-二酮或其可药用盐。
在某些实施方式中，本文提供了用于治疗、预防和/或控制系统性红斑狼疮(SLE)、皮肤型红斑狼疮(CLE)和药物性狼疮的方法
在本文中短语“系统性红斑狼疮”与SLE和狼疮可互换使用并且是指本领域中已知的该疾病的所有表现(包含缓解和发作)。在SLE中，B淋巴细胞活性异常过强以及免疫球蛋白γ(IgG)自身抗体的大规模异常生产发挥了关键作用。这种病理过程导致涂覆有Ig的细胞被俘获(sequestration)并破坏，补体蛋白被固定并裂解，以及化学吸引素、血管活性肽和破坏性酶被释放进入组织(Hahn BH.Systemic Lupus Erythematosus.In:Kasper DL,Braunwald E,Fauci AS,Hauser SL,Longo DL,Jameson,JL主编.In:Harrison's Principles of Internal Medicine(第16版).New York(US):McGraw-Hill；2005.第1960-1967页)。
SLE的症状因人而异，并且可以来来去去。对多数患者来说，所述症状包括关节疼痛和肿胀。经常受影响的关节为指部、手部、腕部以及膝部。一些患者患有关节炎。其他常见的症状包括：深呼吸时胸部疼痛、疲劳、没有其他原因的发烧、全身不适、不安或病感(不适感)、脱发、口疮、淋巴结肿大、对日光敏感、皮疹-面颊和鼻梁上的“蝶形”皮疹影响约半数的SLE患者，对一些患者来说，该皮疹在日光下变得更糟，并且该皮疹还可以广泛分布。
其他症状取决于身体的哪一部分受到影响，并且可以包括以下情况：
脑部和神经系统：头痛、麻木、刺痛、癫痫发作、视力问题、人格改变，
消化道：腹痛、恶心和呕吐，
心脏：异常的心律(心律不齐)，
肺部：咳血和呼吸困难，和
皮肤：肤色有斑、寒冷时指部变色(雷诺氏现象)。
一些患者仅具有皮肤症状。这称为盘状狼疮。
在一种实施方式中，本文提供了治疗中度、重度或极重度SLE的方法。如本文所使用的术语“重度SLE”是指这样一种SLE病况，其中患者具有一种或多种重度或危及生命的症状(如溶血性贫血、广泛的心脏或肺部受累、肾病或中枢神经系统受累)。
本文还提供了用于实现与SLE相关的一个或多个临床终点的方法，包括向对其有需要的患者施用有效量的化合物I或其可药用盐、溶剂化物、水合物、立体异构体、互变异构体或外消旋混合物。
本文还提供了用于延长SLE患者的整体存活期、客观反应率、进展时间、无恶化存活期和/或治疗失败时间的方法，包括向所述患者施用有效量的化合物I或其可药用盐、溶剂化物、水合物、立体异构体、互变异构体或外消旋混合物。
在某些实施方式中，化合物I或其可药用盐、溶剂化物、水合物、立体异构体、互变异构体或外消旋混合物作为原代人记忆CD19+B细胞分化为浆母细胞阶段的抑制剂。不受任何特定的理论的束缚，据信化合物I或其可药用盐、溶剂化物、水合物、立体异构体、互变异构体或外消旋混合物阻滞早熟阶段的细胞，从而减少能够产生高水平的免疫球蛋白的浆母细胞的数目。这种效果的一种功能后果便是在这些分化培养物中免疫球蛋白G(IgG)和免疫球蛋白M(IgM)的产量降低。
在某些实施方式中，化合物I或其可药用盐、溶剂化物、水合物、立体异构体、互变异构体或外消旋混合物抑制原代人记忆CD19+B细胞向浆母细胞阶段分化的能力。在某些实施方式中，化合物I或其可药用盐、溶剂化物、水合物、立体异构体、互变异构体或外消旋混合物对短期培养物中的成熟CD138+浆细胞无显著影响。在某些实施方式中，化合物I或其可药用盐、溶剂化物、水合物、立体异构体、互变异构体或外消旋混合物抑制B细胞分化因子，其包括干扰素调节因子4(IRF4)、淋巴细胞诱导的成熟蛋白(BLIMP)、X盒蛋白-1(XBP-1)和B细胞淋巴瘤6(Bcl6)。
7.2.3 其他免疫相关疾病或病症的治疗
本文还提供了使用化合物I或其可药用盐、溶剂化物、水合物、立体异构体、互变异构体或外消旋混合物来治疗、控制或预防其他免疫相关疾病或病症的方法。在某些实施方式中，本文提供了使用(S)-3-[4-(4-吗啉-4-基甲基苄氧基)-1-氧-1,3-二氢-异吲哚-2-基]哌啶-2,6-二酮或其可药用盐来治疗、控制或预防其他免疫相关疾病或病况的方法。在某些实施方式中，例如，本文提供了治疗患有疾病或病症的个体的方法，其中所述疾病或病症是由不适当的或不希望的免疫应答所引起的或与之相关的，例如，可以有利地通过免疫抑制法治疗的疾病、病症或病况，其包括向所述个体施用化合物I或其可药用盐、溶剂化物、水合物、立体异构体、互变异构体或外消旋混合物。在某些实施方式中，本文提供了治疗患有疾病或病症的个体的方法，其中所述疾病或病症是由不适当的或不希望的免疫应答所引起的或与之相关的，例如，可以有利地通过免疫抑制法治疗的疾病、病症或病况，其包括向所述个体施用(S)-3-[4-(4-吗啉-4-基甲基苄氧基)-1-氧-1,3-二氢-异吲哚-2-基]哌啶-2,6-二酮或其可药用盐。
在多种具体的实施方式中，所述免疫相关疾病是选自以下的一种或多种：干燥综合症、ANCA-诱导的血管炎、抗磷脂综合征、重症肌无力、阿狄森氏病、斑秃、强直性脊柱炎、抗磷脂抗体综合症、抗磷脂综合症(原发性或继发性)、哮喘、自身免疫性胃炎、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、自身免疫性内耳病、自身免疫性淋巴组织增生病、自身免疫性血小板减少性紫癜、巴洛病、贝切特氏病、大疱性类天疱疮、心肌病、脂泻病、恰加斯氏病、慢性炎性脱髓鞘性多神经病、疤痕性类天疱疮(例如，粘膜类天疱疮)、冷凝集素病、德戈斯病、疱疫样皮炎(dermatitishepatiformis)、特发性混合型冷沉淀球蛋白血症、古德帕斯彻氏综合症、格雷夫斯氏病、Guillain-Barre综合症、桥本氏甲状腺炎(桥本氏病；自身免疫性甲状腺炎)、特发性肺纤维化、特发性血小板减少性紫癜、IgA肾病、幼年型关节炎、扁平苔癣、Ménière病、混合性结缔组织病、硬斑病(morphea)、发作性睡病、神经性肌强直、小儿自身免疫性神经精神障碍(PANDA)、寻常天疱疮、恶性贫血病、多发性结节性动脉炎、多软骨炎、风湿性多肌痛、原发性无γ球蛋白血症、原发性胆汁性肝硬变、雷诺疾病(雷诺现象)、莱特尔氏综合症、复发性多软骨炎、风湿热、斯耶格伦氏综合症、僵人综合症(Moersch-Woltmann综合症)、高安氏动脉炎、颞动脉炎(巨细胞性动脉炎)、葡萄膜炎、血管炎(例如，与红斑狼疮无关的血管炎)、白癜风和/或韦格内氏肉芽肿症。
7.2.4 肾损害患者的治疗
在某些实施方式中，本文提供了治疗、预防和/或控制肾功能损害患者中本文所提供的疾病的方法。在某些实施方式中，本文提供了由于(但不限于)疾病、衰老或其他患者因素，对具有肾功能损害的患者提供适当剂量调整的方法。
在某些实施方式中，本文提供了治疗、预防和/或控制肾功能损害患者中本文所提供的疾病或其症状的方法，包括向所述肾功能损害患者施用治疗有效量的本文所提供的化合物。在一种实施方式中，本文提供了治疗、预防和/或控制肾功能损害患者中复发疾病或其症状的方法，其包括向具有复发疾病的肾功能损害患者施用治疗有效量的(S)-3-(4-((4-吗啉代甲基)苄基)氧)-1-氧代异二氢吲哚-2-基)哌啶-2,6-二酮或其可药用盐。
在一种实施方式中，本文提供了预防肾功能损害患者中复发的方法，包括向具有复发风险的所述肾功能损害患者施用有效量的本文所提供的化合物。在一种实施方式中，本文提供了预防肾功能损害患者中复发的方法，包括向具有复发风险的肾功能损害患者施用有效量的(S)-3-(4-((4-吗啉代甲基)苄基)氧)-1-氧代异二氢吲哚-2-基)哌啶-2,6-二酮或其可药用盐。
在本文所提供的所有实施方式中，当治疗肾损害患者时，需要向所述肾损害患者施用比施用于正常患者(例如，无肾损害的患者)的剂量低的化合物剂量，这是因为肾损害患者清除泊马度胺或其代谢产物能力的降低。因此，在一种实施方式中，本文提供了用低于施用于正常患者的剂量的本文所提供的化合物的剂量治疗肾损害患者的方法。
在某些实施方式中，化合物的治疗或预防有效量为从约0.005至约1000mg/天，从约0.01至约500mg/天，从约0.01至约250mg/天，从约0.01至约100mg/天，从约0.1至约100mg/天，从约0.5至约100mg/天，从约1至约100mg/天，从约0.01至约50mg/天，从约0.1至约50mg/天，从约0.5至约50mg/天，从约1至约50mg/天，从约0.02至约25mg/天或者从约0.05至约10mg/天。
7.3 剂量和剂量施用量
待施用至患者的化合物I或其可药用盐、溶剂化物、水合物、立体异构体、互变异构体或外消旋混合物的剂量是相当广泛多变的并且可以取决于保健医师的判断。基于以下因素，化合物I或其可药用盐、溶剂化物、水合物、立体异构体、互变异构体或外消旋混合物的剂量是不同的，如：要治疗、预防或控制的具体适应症；患者的年龄和状况；以及所使用的第二活性剂(若有)的量。一般说来，化合物I或其可药用盐、溶剂化物、水合物、立体异构体、互变异构体或外消旋混合物可以按约0.005mg/kg患者体重至约10mg/kg患者体重的剂量每日向患者施用1到4次或更多次，但是上述剂量可以根据患者的年龄、体重和医学状况以及施用类型来进行适当改变。在一种实施方式中，所述剂量为约0.01mg/kg患者体重至约5mg/kg患者体重，约0.05mg/kg患者体重至约1mg/kg患者体重，约0.1mg/kg患者体重至约0.75mg/kg患者体重或约0.25mg/kg患者体重至约0.5mg/kg患者体重。
在一种实施方式中，每日给予一个剂量。在任何给定的情况下，所施用的化合物I或其可药用盐、溶剂化物、水合物、立体异构体、互变异构体或外消旋混合物的量将取决于诸如活性成分的溶解度、所使用的制剂以及施用途径等因素。在一种实施方式中，局部浓度的应用提供了约0.01-10μM的细胞内暴露或浓度。
在某些实施方式中，化合物I或其可药用盐、溶剂化物、水合物、立体异构体、互变异构体或外消旋混合物按从约0.1mg/天至约1000mg/天的量使用，并且可以以常规方式(例如，治疗、预防或控制期的每天施用相同的量)、按周期(例如，使用1周，停用1周)或按在治疗、预防或控制过程中增加或降低的量进行调整。在其他实施方式中，所述剂量可以是从约1mg至约300mg，从约0.1mg至约150mg，从约1mg至约200mg，从约10mg至约100mg，从约0.1mg至约50mg，从约1mg至约50mg，从约10mg至约50mg，从约20mg至约30mg或者从约1mg至约20mg。在其他实施方式中，所述剂量可以是从约0.1mg至约100mg，从约0.1mg至约50mg，从约0.1mg至约25mg，从约0.1mg至约20mg，从约0.1mg至约15mg，从约0.1mg至约10mg，从约0.1mg至约7.5mg，从约0.1mg至约5mg，从约0.1mg至约4mg，从约0.1mg至约3mg，从约0.1mg至约2mg或者从约1mg至约1mg。
7.4 组合疗法
在本文提供的方法和组合物中，化合物I或其可药用盐、溶剂化物、水合物、立体异构体、互变异构体或外消旋混合物可以结合其他药理学活性化合物(“第二活性剂”)。某些组合可以在治疗特定类型的疾病或病症和与这些疾病或病症相关的病况和症状中起协同作用。化合物I或其可药用盐、溶剂化物、水合物、立体异构体、互变异构体或外消旋混合物还可以减轻与某些第二活性剂有关的副作用，反之亦然。
一种或多种第二活性成分或试剂可以用于本文所提供的方法和组合物。第二活性剂可以是大分子(例如，蛋白质)或小分子(例如，合成的无机、有机金属或有机分子)。
在另一实施方式中，本文所提供的治疗方法包括施用第二治疗剂，其中所述第二治疗剂是抗炎药，例如，甾族抗炎药或非甾族抗炎药(NSAID)、对乙酰氨基酚、萘普生、布洛芬、乙酰水杨酸等。在其中施用NSAID的更具体的实施方式中，还可以施用质子泵抑制剂(PPI)，例如，奥美拉唑。在一种实施方式中，抗炎剂是皮质类固醇。在另一种实施方式中，抗炎剂是秋水仙碱。
在另一实施方式中，所述第二治疗剂是免疫调节性化合物或免疫抑制剂化合物，如硫唑嘌呤(ImuranTM、AzasanTM)、氨甲喋呤(RheumatrexTM、TrexallTM)、青霉胺(DepenTM、CuprimineTM)、环磷酰胺(CytoxanTM)、麦考酚酯(mycophenalate)(CellCeptTM、MyforticTM)、波生坦强的松(DeltasoneTM、Liquid PredTM)和PDE5抑制剂。在另一实施方式中，其中受影响的个体患有指部溃疡和肺性高血压症，可以施用血管扩张剂，如前列环素(伊洛前列素)。
在另一种实施方式中，所述第二治疗剂是HDAC抑制剂，如罗米地辛、伏立诺他、帕比司他、丙戊酸或贝利司他；或者生物剂，如白介素、免疫调节性单克隆抗体或卡介苗(BCG)。
在另一实施方式中，所述第二治疗剂是ActRII受体抑制剂或活化素-ActRII抑制剂。ActRII受体抑制剂包括ActRIIA抑制剂和ActRIIB抑制剂。ActRII受体抑制剂可以是包含ActRII活化素结合域的多肽。在某些实施方式中，包含活化素结合域的多肽被连接到抗体的Fc部分(即生成包含ActRII受体的包含活化素结合域的多肽和抗体的Fc部分的结合物)。在某些实施方式中，所述活化素结合域通过接头(例如，肽接头)连接到抗体的Fc部分。
在SEQ ID NO:1中提供了融合至人Fc域的示例性活化素结合ActRIIA多肽。
SEQ ID NO:1
ILGRSETQECLFFNANWEKDRTNQTGVEPCYGDKDKRRHCFATWKNISGSIEIVKQGCWLDDINCYDRTDCVEKKDSPEVYFCCCEGNMCNEKFSYFPEMEVTQPTSNPVTPKPPTGGGTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPVPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
在SEQ ID NO：2中提供了融合至Fc域的包含可溶性ActRIIB胞外域的示例性融合蛋白。
SEQ ID NO:2
ETRECIYYNANWELERTNQSGLERCEGEQDKRLHCYASWRNSSGTIELVKKGCWDDDFNCYDRQECVATEENPQVYFCCCEGNFCNERFTHLPEAGGPEVTYEPPPTGGGTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
选择用于活化素或ActRIIA结合的非抗体蛋白的其他实例以及用于设计和选择该非抗体蛋白的方法见于WO/2002/088171、WO/2006/055689、WO/2002/032925、WO/2005/037989、US 2003/0133939和US 2005/0238646，以上每篇专利以其全部内容作为参考并入本文。
在一种实施方式中，ActRII受体的抑制剂是ACE-11。在另一种实施方式中，ActRII受体的抑制剂为ACE-536。
可以施用适合于治疗疾病或其症状的上述治疗剂的任何组合。这些治疗剂可以与化合物I或其可药用盐、溶剂化物、水合物、立体异构体、互变异构体或外消旋混合物任意组合同时或作为单独的治疗过程施用。
7.5 循环疗法
在某些实施方式中，将本文所提供的化合物I或其可药用盐、溶剂化物、水合物、立体异构体、互变异构体或外消旋混合物循环施用至患者。循环疗法包括施用一种活性剂一段时间，接着休息(即停止施用)一段时间，并重复这种顺序施用。循环疗法可以降低对一种或多种疗法的抗性的发展，避免或减小其中一种疗法的副作用和/或改善治疗效力。
因此，在一种实施方式中，在4-6个周(其中停止施用约1或2周)内以单个或分开剂量每日施用本文所提供的化合物。循环疗法还允许增加剂量施用循环的频率、次数和长度。因此，另一种实施方式包括当单独施用本文所提供的化合物时，施用循环比通常的要多。在另一种实施方式中，本文所提供的化合物以比通常将引起患者剂量限制性毒性的更多的循环次数施用，并且该患者未施用第二活性成分。
在一种实施方式中，按从约0.03mg至约10mg/天的剂量每天并连续施用本文所提供的化合物3或4周，接着休息1或2周。在其他实施方式中，所述剂量可以是从约0.1mg至约8mg，从约0.3mg至约6mg，从约1mg至约4mg，或者约2mg，接着休息。
在一种实施方式中，在4-6周的循环中，口服施用本文所提供的化合物和第二活性成分，其中在施用第二活性成分之前30-60分钟，施用本文所提供的化合物。在另一种实施方式中，本文所提供的化合物和第二活性成分的组合在每次循环内通过静脉输注施用约90分钟。
通常，将组合治疗施用于患者的循环次数将为约1至约24次循环，约2至约16次循环，或约4至约3次循环。
7.6 生物标志物
在某些实施方式中，本文提供了用于治疗本文所提供的多种疾病或病症的生物标志物。在一种实施方式中，所述生物标志物是分化抗原簇-44(“CD44”)，它是存在于B细胞表面的分子。在另一种实施方式中，所述生物标志物是分化抗原簇-83(“CD83”)，它是存在于B细胞表面的分子。在其他实施方式中，所述生物标志物是CD44和CD83的组合。
可以通过本领域中已知的任何方法检测或定量本文所提供的蛋白生物标志物的水平。在某些实施方式中，使用了基于抗体的方法。在某些实施方式中，检测或定量方法是免疫印迹法(免疫印迹)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、免疫组织化学法、流式细胞术、流式微珠阵列或质谱法。
在某些实施方式中，检测或定量方法是免疫印迹法(免疫印迹)。在某些实施方式中，检测或定量方法为酶联免疫吸附测定(ELISA)。在某些实施方式中，检测或定量方法为直接ELISA。在某些实施方式中，检测或定量方法为间接ELISA。在某些实施方式中，检测或定量方法为夹心ELISA。在某些实施方式中，检测或定量方法为免疫组织化学法。在某些实施方式中，检测或定量方法为流式细胞术。在某些实施方式中，检测或定量方法为流式微珠阵列。在某些实施方式中，检测或定量方法为质谱法。
某些实施方式包括鉴别可能对使用治疗化合物治疗疾病、病症或病况有反应的受试者的方法。在某些实施方式中，所述方法包括确定来自受试者的生物样品中生物标志物的水平。在某些实施方式中，所述生物标志物为CD44。在某些实施方式中，所述生物标志物为CD83。
在某些实施方式中，鉴别可能对使用治疗化合物治疗疾病、病症或病况有反应的受试者的方法包括：a)确定来自受试者的生物样品中生物标志物的水平，其中所述生物标志物为CD44、CD83或其组合；和b)将来自受试者的生物样品中生物标志物的水平与生物标志物的参比水平相比较；其中如果与生物标志物的参比水平相比，来自受试者的生物样品中生物标志物的水平发生改变，则该受试者可能对治疗有反应。
在某些实施方式中，鉴别可能对使用治疗化合物治疗疾病、病症或病况有反应的受试者的方法包括：a)确定来自受试者的生物样品中生物标志物的水平，其中所述生物标志物为CD44、CD83或其组合；b)确定对照样品中生物标志物的水平；和c)将来自受试者的生物样品中生物标志物的水平与对照样品中生物标志物的水平相比较；其中如果与对照样品中生物标志物的水平相比，来自受试者的生物样品中生物标志物的水平发生改变，则该受试者可能对治疗有反应。
在某些实施方式中，鉴别可能对使用治疗化合物治疗疾病、病症或病况有反应的受试者的方法包括：a)确定来自受试者的生物样品中生物标志物的水平，其中所述生物标志物为CD83；和b)将来自受试者的生物样品中生物标志物的水平与生物标志物的参比水平相比较；其中如果来自受试者的生物样品中生物标志物的水平高于生物标志物的参比水平，则该受试者可能对治疗有反应。
在某些实施方式中，鉴别可能对使用治疗化合物治疗疾病、病症或病况有反应的受试者的方法包括：a)确定来自受试者的生物样品中生物标志物的水平，其中所述生物标志物为CD83；b)确定对照样品中生物标志物的水平；和c)将来自受试者的生物样品中生物标志物的水平与对照样品中生物标志物的水平相比较；其中如果来自受试者的生物样品中生物标志物的水平高于对照样品中生物标志物的水平，则该受试者可能对治疗有反应。
在某些实施方式中，鉴别可能对使用治疗化合物治疗疾病、病症或病况有反应的受试者的方法包括：a)确定来自受试者的生物样品中生物标志物的水平，其中所述生物标志物为CD44；和b)将来自受试者的生物样品中生物标志物的水平与生物标志物的参比水平相比较；其中如果来自受试者的生物样品中生物标志物的水平低于生物标志物的参比水平，则该受试者可能对治疗有反应。
在某些实施方式中，鉴别可能对使用治疗化合物治疗疾病、病症或病况有反应的受试者的方法包括：a)确定来自受试者的生物样品中生物标志物的水平，其中所述生物标志物为CD44；b)确定对照样品中生物标志物的水平；和c)将来自受试者的生物样品中生物标志物的水平与对照样品中生物标志物的水平相比较；其中如果来自受试者的生物样品中生物标志物的水平低于对照样品中生物标志物的水平，则该受试者可能对治疗有反应。
在某些实施方式中，预测受试者对使用治疗化合物治疗疾病、病症或病况的反应的方法包括：a)确定来自受试者的生物样品中生物标志物的水平，其中所述生物标志物为CD44、CD83或其组合；和b)将所述生物样品中生物标志物的水平与生物标志物的参比水平相比较；其中来自受试者的生物样品中生物标志物的水平与生物标志物的参比水平之间的差异与受试者对治疗的反应相关。
在某些实施方式中，预测受试者对使用治疗化合物治疗疾病、病症或病况的反应的方法包括：a)确定来自受试者的生物样品中生物标志物的水平，其中所述生物标志物为CD44、CD83或其组合；b)确定对照样品中生物标志物的水平；和c)将来自受试者的生物样品中生物标志物的水平与对照样品中生物标志物的水平相比较；其中来自受试者的生物样品中生物标志物的水平与对照样品中生物标志物的水平之间的差异与受试者对治疗的反应相关。
在某些实施方式中，预测受试者对使用治疗化合物治疗疾病、病症或病况的反应的方法包括：a)确定来自受试者的生物样品中生物标志物的水平，其中生物标志物为CD83；和b)将生物样品中生物标志物的水平与生物标志物的参比水平相比较，其中与生物标志物的参比水平相比来自受试者的生物样品中生物标志物水平的提高与受试者对治疗的反应的提高相关。
在某些实施方式中，预测受试者对使用治疗化合物治疗疾病、病症或病况的反应的方法包括：a)确定来自受试者的生物样品中生物标志物的水平，其中生物标志物为CD83；b)确定对照样品中生物标志物的水平；和c)将来自受试者的生物样品中生物标志物的水平与对照样品中生物标志物的水平相比较；其中与对照样品中生物标志物的水平相比来自受试者的生物样品中生物标志物水平的提高与受试者对治疗的反应的提高相关。
在某些实施方式中，预测受试者对使用治疗化合物治疗疾病、病症或病况的反应的方法包括：a)确定来自受试者的生物样品中生物标志物的水平，其中生物标志物为CD44；和b)将生物样品中生物标志物的水平与生物标志物的参比水平相比较，其中与生物标志物的参比水平相比来自受试者的生物样品中生物标志物水平的降低与受试者对治疗的反应的提高相关。
在某些实施方式中，预测受试者对使用治疗化合物治疗疾病、病症或病况的反应的方法包括：a)确定来自受试者的生物样品中生物标志物的水平，其中生物标志物为CD44；b)确定对照样品中生物标志物的水平；和c)将来自受试者的生物样品中生物标志物的水平与对照样品中生物标志物的水平相比较；其中与对照样品中生物标志物的水平相比来自受试者的生物样品中生物标志物水平的减少与受试者对治疗的反应的提高相关。
在某些实施方式中，监控用治疗化合物治疗的受试者中疾病、病症或病况的治疗效力的方法，其包括：a)从受试者获得第一生物样品；b)确定第一生物样品中生物标志物的水平，其中所述生物标志物为CD44、CD83或其组合；c)向受试者施用治疗化合物；d)此后，从受试者获得第二生物样品；e)确定第二生物样品中生物标志物的水平；和f)将第一和第二生物样品中生物标志物的水平相比较；其中如果与受试者的第一生物样品中生物标志物的水平相比，受试者的第二生物样品中生物标志物的水平发生改变，则受试者对治疗有反应。
在某些实施方式中，监控用治疗化合物治疗的受试者中疾病、病症或病况的治疗效力的方法，其包括：a)从受试者获得第一生物样品，b)确定第一生物样品中生物标志物的水平，其中所述生物标志物为CD83；c)向受试者施用治疗化合物，d)此后，从受试者获得第二生物样品，e)确定第二生物样品中生物标志物的水平，和f)将第一和第二生物样品中生物标志物的水平相比较，其中如果受试者的第二生物样品中生物标志物的水平高于受试者的第一生物样品中生物标志物的水平，则受试者对治疗有反应。
在某些实施方式中，监控用治疗化合物治疗的受试者中疾病、病症或病况的治疗效力的方法，其包括：a)从受试者获得第一生物样品，b)确定第一生物样品中生物标志物的水平，其中所述生物标志物为CD44；c)向受试者施用治疗化合物，d)此后，从受试者获得第二生物样品，e)确定第二生物样品中生物标志物的水平，和f)将第一和第二生物样品中生物标志物的水平相比较；其中如果受试者的第二生物样品中生物标志物的水平低于受试者的第一生物样品中生物标志物的水平，则受试者对治疗有反应。
在某些实施方式中，监控受试者对使用治疗化合物治疗疾病、病症或病况的依从性的方法，其包括：a)从受试者获得生物样品；b)确定生物样品中生物标志物的水平，其中所述生物标志物为CD44、CD83或其组合；和c)将生物标志物的水平与来自受试者的对照未处理的样品中生物标志物的水平相比较；其中与对照样品中生物标志物的水平相比，生物样品中生物标志物的水平的变化表明受试者对治疗的依从性。
在某些实施方式中，监控受试者对使用治疗化合物治疗疾病、病症或病况的依从性的方法，其包括：a)从受试者获得生物样品；b)确定生物样品中生物标志物的水平，其中所述生物标志物为CD83；和c)将生物标志物的水平与来自受试者的对照未处理的样品中生物标志物的水平相比较；其中与对照样品中生物标志物的水平相比，生物样品中生物标志物的水平的提高表明受试者对治疗的依从性。
在某些实施方式中，监控受试者对使用治疗化合物治疗疾病、病症或病况的依从性的方法，其包括：a)从受试者获得生物样品；b)确定生物样品中生物标志物的水平，其中所述生物标志物为CD44；和c)将生物标志物的水平与来自受试者的对照未处理的样品中生物标志物的水平相比较；其中与对照样品中生物标志物的水平相比，生物样品中生物标志物的水平的减少表明受试者对治疗的依从性。
在某些实施方式中，所述治疗化合物为免疫调节化合物。在某些实施方式中，所述治疗化合物为3-[4-(4-吗啉-4-基甲基-苄氧基)-1-氧-1,3-二氢-异吲哚-2-基]-哌啶-2,6-二酮盐酸盐或其可药用盐、溶剂化物、水合物、立体异构体、互变异构体或外消旋混合物。在一种实施方式中，所述化合物为(S)-3-[4-(4-吗啉-4-基甲基-苄氧基)-1-氧-1,3-二氢-异吲哚-2-基]-哌啶-2,6-二酮或其可药用盐、溶剂化物或水合物。
7.7 药物组合物和剂量形式
药物组合物可以在各个、单一单位剂量形式的制剂中使用。本文所提供的药物组合物和剂量形式包括本文所提供的化合物，或其可药用盐、溶剂化物、水合物、立体异构体、外消旋物、笼形物或前体药物。药物组合物和剂量形式还可以包含一种或多种赋形剂。
本文所提供的药物组合物和剂量形式还可以包含一种或多种其他活性成分。以上公开了任选的第二或其他活性成分的实例。
本文所提供的单一单位剂量形式适合于口服、粘膜(例如，鼻、舌下、阴道、口腔或直肠)、肠胃外(例如，皮下、静脉内、推注、肌内或动脉内)、局部(例如，滴眼剂或其他眼科制剂)、透真皮或透皮施用至患者。剂量形式的实例包括(但不限于)：片剂；囊片；胶囊，如弹性明胶软胶囊；扁囊剂；锭剂；糖锭；分散剂；栓剂；粉剂；喷雾剂(例如，鼻腔喷雾或吸入器)；凝胶剂；适合于口服或粘膜施用至患者的液体剂量形式，其包括混悬液(例如，水性或非水性液体混悬液、水包油乳剂或油包水液体乳剂)、溶液和酏剂；适合于肠胃外施用至患者的液体剂量形式；适合于局部施用的滴眼剂或其他眼科制剂；以及可以复原以提供适合于肠胃外施用至患者的液体剂量形式的无菌固体(例如，晶体或无定形固体)。
剂量形式的组成、形状和类型通常将根据它们的用途而改变。例如，与疾病的长期治疗所使用的剂量形式相比，相同疾病的急性治疗所使用的剂量形式可以包含更大量的一种或多种活性成分。类似地，与用于治疗相同疾病的口服剂量形式相比，肠胃外剂量形式可以包含较小量的一种或多种活性成分。使用具体剂量形式的这些和其他方式将是彼此不同的，这对本领域的技术人员来说是显而易见的。参见，例如，Remington’sPharmaceutical Sciences,第20版,Mack Publishing,Easton PA(2000)。
在一种实施方式中，药物组合物和剂量形式包含一种或多种赋形剂。适合的赋形剂对于药学领域技术人员来说是熟知的，并且本文提供了适合的赋形剂的非限制性实例。特定赋形剂是否适合掺入到药物组合物或剂量形式中取决于本领域中熟知的多种因素，其包括(但不限于)所述剂量形式将施用给患者的方式。例如，口服剂量形式(如片剂)可能含有不适合于在肠胃外剂量形式中使用的赋形剂。特定赋形剂的适合性还可以取决于所述剂量形式中具体的活性成分。例如，通过一些赋形剂(如乳糖)，或者当暴露于水时，可以加快一些活性成分的分解。包含伯胺或仲胺的活性成分对这种加速分解是特别敏感的。因此，提供了药物组合物和剂量形式，其含有少量(如果有的话)乳糖、其他单糖或二糖。如本文所使用的，术语“不含乳糖的”是指所存在的乳糖的量(如果有的话)不足以显著提高活性成分的降解速率。
不含乳糖的组合物可以包含本领域熟知的并且在(例如)美国药典(USP)25-NF20(2002)中所列的赋形剂。一般说来，不含乳糖的组合物包含药物相容的并且药物可用的量的活性成分、粘结剂/填充剂和润滑剂。在一种实施方式中，不含乳糖的剂量形式包含活性成分、微晶纤维素、预胶凝淀粉和硬脂酸镁。
由于水可以有利于一些化合物的降解，因此还提供了包含活性成分的无水药物组合物和剂量形式。例如，在药学领域中加入水(例如，5％)作为模拟长期储存的方式以确定制剂随时间的特性(如货架期或稳定性)是广泛接受的。参见，例如，Jens T.Carstensen,Drug Stability:Principles&Practice,第2版,Marcel Dekker,NY,NY,1995,第379-80页。实际上，水和热加快了一些化合物的分解。因此，水对制剂的影响可以是显著的，这是因为在制剂的生产、处理、包装、存储、运输和使用期间一般会遇到水分和/或潮气。
可以使用无水或含有低水分的成分以及低水分或低湿度条件制备无水药物组合物和剂量形式。如果预期在生产、包装和/或存储期间会与水分和/或潮气发生显著接触，则包含乳糖和至少一种含有伯氨或仲胺的活性成分的药物组合物和剂量形式是无水的。
应制备和存储无水药物组合物从而维持其无水性质。因此，在一种实施方式中，使用已知防止暴露于水的材料包装无水组合物从而使它们可以包含在适合的配方试剂盒中。适合的包装的实例包括，但不限于，气密性箔片、塑料制品、单位剂量容器(例如，小瓶)、泡罩包装和条状包装。
还提供了药物组合物和剂量形式，其包含一种或多种降低活性成分分解速率的化合物。这些化合物(在本文中称为“稳定剂”)包括，但不限于，抗氧化剂(如抗坏血酸)、pH缓冲剂或盐缓冲剂。
像赋形剂的量和类型一样，剂量形式中活性成分的量和特定类型可以根据因素而不同，如，但不限于，其向患者施用的途径。在一种实施方式中，剂量形式包含约0.10至约500mg的量的本文所提供的化合物。在其他实施方式中，剂量形式包含约0.1、1、2、5、7.5、10、12.5、15、17.5、20、25、50、100、150、200、250、300、350、400、450或500mg的量的本文所提供的化合物。
在其他实施方式中，剂量形式包含1至约1000mg，约5至约500mg，约10至约350mg或约50至约200mg的量的第二活性成分。当然，第二活性剂的具体的量将取决于所使用的具体试剂、待治疗或控制的疾病或病症和本文所提供的化合物的量，以及同时施用至患者的任何任选的其他活性剂。
7.7.1 口服剂量形式
适合于口服的药物组合物可以作为分开的剂量形式提供，如(但不限于)片剂(例如，咀嚼片)、囊片剂、胶囊和液体剂(例如，调味糖浆)。这些剂量形式含有预定量的活性成分，并且可以通过本领域技术人员熟知的药学方法制备。一般地，参见，Remington's Pharmaceutical Sciences,第20版,Mack Publishing,Easton PA(2000)。
本文所提供的口服剂量形式是根据常规药物混合技术通过将活性成分与至少一种赋形剂密切混合制备的。根据施用所期望的制剂形式，赋形剂可以采取多种形式。例如，适用于在口服液体或气溶胶剂量形式中使用的赋形剂包括，但不限于，水、乙二醇、油剂、醇、调味剂、防腐剂和着色剂。适用于在固体口服剂量形式(例如，粉剂、片剂、胶囊剂和囊片)中使用的赋形剂的实例包括，但不限于，淀粉、糖、微晶纤维素、稀释剂、成粒剂、润滑剂、粘结剂和崩解剂。
在一种实施方式中，口服剂量形式是片剂或胶囊，在这种情况下，采用固体赋形剂。在另一种实施方式中，可以通过标准水性或非水性技术涂覆片剂。可以通过任何药学方法制备这些剂量形式。一般地，通过将活性成分与液体载体、细碎的固体载体或两者均匀并且密切地混合，然后如有必要将产物成形为所需的外观来制备药物组合物和剂量形式。
例如，可以通过挤压或模制制备片剂。可以通过将任选地与赋形剂混合的自由流动形式(如粉末或颗粒)的活性成分在适合的机械中挤压来制备压制片剂。可以通过将用惰性液体稀释剂湿润的粉末化合物的混合物在适合的机械中模制来制备模制片剂。
可以在本文所提供的口服剂量形式中使用的赋形剂的实例包括，但不限于，粘结剂、填充剂、崩解剂和润滑剂。适合在药物组合物和剂量形式中使用的粘结剂包括，但不限于，玉米淀粉、马铃薯淀粉或其他淀粉、明胶、天然和合成树胶，如阿拉伯胶、海藻酸钠、海藻酸、其他海藻酸盐、粉末黄芪胶、瓜耳豆胶、纤维素及其衍生物(例如，乙基纤维素、醋酸纤维素、羧甲基纤维素钙、羧甲基纤维素钠)、聚乙烯基吡咯烷酮、甲基纤维素、预胶凝淀粉、羟丙基甲基纤维素(例如，No.2208、2906、2910)、微晶纤维素及其混合物。
适合的微晶纤维素的形式包括，但不限于，作为AVICEL-PH-101、AVICEL-PH-103、AVICEL RC-581、AVICEL-PH-105出售的材料(得自FMCCorporation,American Viscose Division,Avicel Sales,Marcus Hook,PA)及其混合物。具体的粘合剂是微晶纤维素和作为AVICEL RC-581出售的羧甲基纤维素钠的混合物。适合的无水或低水分赋形剂或添加剂包括AVICEL-PH-103TM和淀粉1500LM。
适合在本文所提供的药物组合物和剂量形式中使用的填充剂的实例包括，但不限于，滑石粉、碳酸钙(例如，颗粒或粉末)、微晶纤维素、粉末纤维素、葡聚糖结合剂、白陶土、甘露醇、硅酸、山梨糖醇、淀粉、预胶凝淀粉及其混合物。在一种实施方式中，药物组合物中的粘结剂或填充剂以所述药物组合物或剂量形式的约50至约99wt％存在。
可以在所述组合物中使用崩解剂以提供当暴露于水相环境时分解的片剂。含有过多崩解剂的片剂可能会在储存时分解，而含有过少的那些可能不会以所需的速率或者在所需的条件下分解。因此，可以使用既不多也不少的不会有害地改变活性成分释放的足够量的崩解剂来形成固体口服剂量形式。所使用的崩解剂的量根据制剂类型而改变，并且是本领域那些技术人员易于分辨的。在一种实施方式中，药物组合物包含约0.5至约15wt％的崩解剂，或约1至约5wt％的崩解剂。
可以在药物组合物和剂量形式中使用的崩解剂包括，但不限于，琼脂、海藻酸、碳酸钙、微晶纤维素、交联羧甲纤维素钠、交聚维酮、波拉克林钾、淀粉羟基乙酸钠、马铃薯或木薯淀粉、其他淀粉、预胶凝淀粉、其他淀粉、粘土、其他褐藻胶、其他纤维素、树胶及其混合物。
可以在药物组合物和剂量形式中使用的润滑剂包括，但不限于，硬脂酸钙、硬脂酸镁、矿物油、轻质矿物油、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇、聚乙二醇、其他二醇类、硬脂酸、十二烷基硫酸钠、滑石粉、氢化植物油(例如，花生油、棉子油、葵花子油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油)、硬脂酸锌、油酸乙酯、月桂酸乙酯、琼脂及其混合物。其他润滑剂包含(例如)syloid硅胶(AEROSIL200，由W.R.Grace Co.(Baltimore,MD)生产)、合成二氧化硅凝聚型气溶胶(由Degussa Co.of Plano,TX出售)、CAB-O-SIL(由Cabot Co.of Boston,MA出售的焦化二氧化硅产品)及其混合物。如果非要使用，则润滑剂可以以小于其所掺入的药物组合物或剂量形式的约1wt％的量使用。
在一种实施方式中，固体口服剂量形式包括本文所提供的化合物、无水乳糖、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、硬脂酸、胶体无水氧化硅和明胶。
7.7.2 缓释剂量形式
可以通过缓释方式或通过本领域那些技术人员熟知的递送装置施用活性成分，如本文所提供的化合物。实例包括，但不限于，美国专利No.3845770；3916899；3536809；3598123；和4008719；5674533；5059595；5591767；5120548；5073543；5639476；5354556；5639480；5733566；5739108；5891474；5922356；5972891；5980945；5993855；6045830；6087324；6113943；6197350；6248363；6264970；6267981；6376461；6419961；6589548；6613358；6699500中所述的那些，以上每篇专利作为参考并入本文。通过以不同的比例使用(例如)羟丙基甲基纤维素、其他聚合物基质、凝胶、渗透膜、渗透系统、多层涂层、微粒、脂质体、微球或它们的组合以提供所需的释放分布图，这些剂量形式可以用于提供一种或多种活性成分的缓慢或控制释放。可以容易地选择包括本文所述的那些在内的本领域那些技术人员已知的适合的缓释制剂以用于和本文所提供的活性成分一起使用。因此，所提供的组合物包括适合于口服的单一单位剂量形式，例如，但不限于，适合于缓释的片剂、胶囊、软胶囊(gelcaps)和囊片剂。
所有缓释药物产品具有共同的目标：改善药物疗法以优于其不缓释的对应物。理想地，在医学治疗中优化设计的缓释制剂的使用的特征在于在最短的时间内使用最少的药物物质来治愈或控制病况。缓释制剂的优势包括延长的药物活性、降低的剂量频率和提高的受试者依从性。另外，缓释制剂可以用于影响作用或其他特征的发生时间，如药物的血液水平，并因此可以影响副作用(例如，不良作用)的发生。
大部分缓释制剂设计在开始时释放快速产生所需治疗效果的药物(活性成分)量，并逐渐和不断地释放其他量的药物以在延长的一段时间内维持这种治疗或预防效果的水平。为了在体内维持药物的这种恒定水平，必须以将替代代谢掉和从体内排出的药物量的速率从所述剂量形式中释放药物。可以通过多种条件刺激活性成分的缓释，其包括，但不限于，pH、温度、酶、水或其他生理条件或化合物。
在某些实施方式中，可以使用静脉输注、可植入渗透泵、透真皮贴剂、脂质体或其他施用方式施用。在一种实施方式中，可以使用泵(参见，Sefton,CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14:201(1987)；Buchwald等人,Surgery 88:507(1980)；Saudek等人,N.Engl.J.Med.321:574(1989))。在另一种实施方式中，可以使用聚合物材料。在另一种实施方式中，可以按技术医师决定的适当位点，将控释系统放置在受试者中，即因此仅需全身剂量的一小部分(参见，例如，Goodson,Medical Applications of Controlled Release,第2卷，第115-138页(1984))。在Langer的综述中讨论了其他缓释系统(Science249:1527-1533(1990))。可以将活性成分分散在不溶于体液的固体基质中，例如，聚甲基丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸丁酯、增塑或未增塑的聚氯乙烯、增塑尼龙、增塑的聚对苯二甲酸乙二醇酯、天然橡胶、聚异戊二烯、聚异丁烯、聚丁二烯、聚乙烯、乙烯-乙酸乙烯酯共聚物、硅酮橡胶、聚二甲基硅氧烷、硅酮碳酸酯共聚物、亲水性聚合物，如丙烯酸和甲基丙烯酸酯类的水凝胶、胶原、围绕有外部高分子膜的交联聚乙烯醇和交联的部分水解的聚乙酸乙烯酯，如聚乙烯、聚丙烯、乙烯/丙烯共聚物、乙烯/丙烯酸乙酯共聚物、乙烯/乙酸乙烯酯共聚物、硅酮橡胶、聚二甲基硅氧烷、氯丁橡胶、氯化聚乙烯、聚氯乙烯、氯乙烯与乙酸乙烯酯共聚物、偏二氯乙烯、乙烯和丙烯、离聚物聚对苯二甲酸乙二醇酯、丁基橡胶表氯醇橡胶、乙烯/乙烯醇共聚物、乙烯/乙酸乙烯酯/乙烯醇三元共聚物和乙烯/乙烯氧基乙醇共聚物。然后，活性成分在释放速率控制步骤中扩散通过外部聚合物膜。这类肠胃外组合物中活性成分的百分比高度依赖其特定性质以及受试者的需要。
7.7.3 肠胃外剂量形式
肠胃外剂量形式可以通过多种途径施用至患者，包括，但不限于，皮下、静脉内(包括推注)、肌内和动脉内施用。在一些实施方式中，肠胃外剂量形式的施用绕过了患者对污染物的天然防御，并因此，在该实施方式中，肠胃外剂量形式是无菌的或者能够在施用至患者前灭菌。肠胃外剂量形式的实例包括，但不限于，注射用溶液、溶解或悬浮在注射用可药用载体中的干产品、注射用混悬剂和乳剂。
可用于提供肠胃外剂量形式的适合的载体对于本领域技术人员来说是熟知的。实例包括，但不限于：注射用水USP；水性载体，例如，但不限于，氯化钠注射液、林格氏注射液、葡萄糖注射液、葡萄糖和氯化钠注射液以及乳酸林格氏注射液；水溶性载体，例如，但不限于，乙醇、聚乙二醇和聚丙二醇；和非水载体，例如，但不限于，玉米油、棉花子油、花生油、芝麻油、油酸乙酯、豆蔻酸异丙酯和苯甲酸苄酯。
提高本文所公开的一种或多种活性成分溶解度的化合物也可以加入到肠胃外剂量形式中。例如，环糊精及其衍生物可用于提高本文所提供的化合物的溶解度。参见，例如，美国专利No.5134127，该专利作为参考并入本文。
6.6.4 局部和粘膜剂量形式
本文所提供的局部和粘膜剂量形式包括，但不限于，喷雾剂、气雾剂、溶液、乳液、混悬液、滴眼剂或其他眼科制剂或者其他本领域技术人员已知的形式。参见，例如，Remington’s Pharmaceutical Sciences,第16、18和20版,Mack Publishing,Easton PA(1980,1990and 2000)；和Introduction toPharmaceutical Dosage Forms,第4版,Lea&Febiger,Philadelphia(1985)。适用于治疗口腔内粘膜组织的剂量形式可以配制成漱口药或口腔凝胶剂。
本文所涵盖的可用于提供局部和粘膜剂量形式的适合的赋形剂(例如，载体和稀释剂)和其他材料对于药学领域的那些技术人员来说是熟知的，并且取决于将施用给定药物组合物或剂量形式的特定组织。在一种实施方式中，赋形剂包括，但不限于，水、丙酮、乙醇、乙二醇、丙二醇、1,3-丁二醇、豆蔻酸异丙酯、棕榈酸异丙酯、矿物油及其混合物，以形成无毒并且可药用的溶液、乳剂或凝胶剂。还可以将增湿剂或湿润剂加入到药物组合物和剂量形式中。其他成分的实例在本领域中是熟知的。参见，例如，Remington’s Pharmaceutical Sciences,第16版、第18版和第20版,MackPublishing,Easton PA(1980,1990and 2000)。
还可以调节药物组合物或剂量形式的pH以改善一种或多种活性成分的递送。另外，可以调节溶剂载体的极性、其离子强度或张度来改善递送。还可以将化合物(如硬脂酸酯)加入至药物组合物或剂量形式中以改变一种或多种活性成分的亲水性或亲油性，从而改善递送。在其他实施方式中，硬脂酸酯可以用作制剂的脂质载体，用作乳化剂或表面活性剂，或者用作递送增强剂或渗透增强剂。在其他实施方式中，可以使用活性成分的盐、溶剂化物、水合物、前体药物、笼形物或立体异构体以进一步调节所得组合物的性质。
6.6.5 试剂盒
在一种实施方式中，本文所提供的活性成分未同时或通过相同施用途径施用至患者。在另一种实施方式中，提供了试剂盒，所述试剂盒可以简化适量活性成分的施用。
在一种实施方式中，试剂盒包含本文所提供的化合物的剂量形式。试剂盒还可以包含其他活性成分，如其他抗炎、免疫调节或免疫抑制剂化合物或其组合。其他活性成分的实例包括，但不限于，本文所公开的那些。
在其他实施方式中，试剂盒还可以包含用于施用所述活性成分的装置。这些装置的实例包括，但不限于，注射器、滴注袋(drip bags)、贴片和吸入器。
试剂盒还可以包含用于移植的细胞或血液以及可用于施用一种或多种活性成分的药物可用的载体。例如，如果活性成分是以必须复原以用于肠胃外施用的固体形式提供的，则所述试剂盒可以包括适合载体的密封容器，在所述容器中，所述活性成分可以溶解以形成适合于肠胃外施用的不含颗粒的无菌溶液。药物可用的载体的实例包括，但不限于：注射用水USP；水性载体，例如，但不限于，氯化钠注射液、林格氏注射液、葡萄糖注射液、葡萄糖和氯化钠注射液以及乳酸林格氏注射液；水可混溶的载体，如(但不限于)乙醇、聚乙二醇和聚丙二醇；和非水载体，如(但不限于)玉米油、棉花子油、花生油、芝麻油、油酸乙酯、豆蔻酸异丙酯和苯甲酸苄酯。
实施例
通过非限制性说明介绍以下实施例。在实施例中，测试化合物是指(S)-3-[4-(4-吗啉-4-基甲基苄氧基)-1-氧-1,3-二氢-异吲哚-2-基]哌啶-2,6-二酮。
8.1 实施例1：(S)-3-[4-(4-吗啉-4-基甲基苄氧基)-1-氧-1,3-二氢-异吲哚 -2-基]哌啶-2,6-二酮盐酸盐的制备
7.1.1 3-羟基-2-甲基-苯甲酸甲酯
将3-羟基-2-甲基苯甲酸(105g，690mmol)加入到配备有冷凝器、温度计和搅拌棒的2L三颈圆底烧瓶中的MeOH(800mL)中，然后加入甲醇(250ml)。向上述溶液加入将H2SO4(10mL，180mmol)。将反应混合物在62℃搅拌17小时。真空下除去溶剂。将残余物(200mL)在室温下缓慢加入水(600mL)中，并形成白色固体。将混悬液在冰浴中搅拌30分钟并过滤。用水清洗(5×250mL)固体并干燥以提供白色固体状3-羟基-2-甲基-苯甲酸甲酯(100g，产率87％)。在下一步中使用所述化合物而无需进一步纯化：LCMS MH＝167；1H NMR(DMSO-d6)2.28(s,3H,CH3),3.80(s,3H,CH3),6.96-7.03(m,1H,Ar),7.09(t,J＝7.8Hz,1H,Ar),7.14-7.24(m,1H,Ar),9.71(s,1H,OH)。
7.1.2 3-(叔丁基-二甲基-硅烷基氧基)-2-甲基-苯甲酸甲酯
向配备有搅拌棒和温度计的1L三颈圆底烧瓶中加入DMF(300mL)、甲基3-羟基-2-甲基苯甲酸酯(90g，542mmol)和咪唑(92g，1.354mmol)。在20分钟内将TBDMS-Cl(90g，596mmol)部分地加入到上述溶液中，从而将内部温度控制在15-19℃之间，在加入后，将内部温度降低至1℃以下。除去冰浴，并将反应混合物在室温下搅拌16小时。将反应混合物加入到冰水(500mL)中，并将所得溶液分成两部分(700mL×2)。用EtOAc(700mL)萃取每个部分。用冷水(350mL)和盐水(350mL)清洗每个有机层。合并有机层并用MgSO4干燥。浓缩合并的有机层以提供浅棕色油状的3-(叔丁基-二甲基-硅烷基氧基)-2-甲基-苯甲酸甲酯(160g，粗产率100％)。在下一步中使用所述化合物而无需进一步纯化：LCMS MH＝281；1H NMR(DMSO-d6)-0.21(s,6H,CH3,CH3),0.73-0.84(m,9H,CH3,CH3,CH3),2.10(s,3H,CH3),3.60(s,3H,CH3),6.82(dd,1H,Ar),6.97(t,J＝7.9Hz,1H,Ar),7.13(dd,J＝1.1,7.7Hz,1H,Ar)。
7.1.3 2-溴甲基-3-(叔丁基-二甲基-硅烷基氧基)-苯甲酸甲酯
在室温下，将NBS(49.8g，280mmol)加入到乙酸甲酯(500mL)中的甲基3-(叔丁基-二甲基甲硅烷基氧基)-2-甲基苯甲酸酯(78.4g，280mmol)中以提供橙色混悬液。将所得反应混合物在40℃在油浴中加热并用300wt日光灯泡照射回流4小时。将反应混合物冷却，并用Na2SO3溶液(2×600mL，50％饱和浓度)、水(500mL)和盐水(600mL)清洗。用MgSO4干燥有机层，并用活性炭脱色。浓缩有机层以提供浅棕色油状的2-溴甲基-3-(叔丁基-二甲基-硅烷基氧基)-苯甲酸甲酯(96g，粗产率91％)。在下一步中使用所述化合物而无需进一步纯化：LCMS M-Br＝279；1H NMR(DMSO-d6)0.05-0.11(m,6H,CH3,CH3),0.82(s,9H,CH3,CH3,CH3),3.65(s,3H,CH3),4.74(s,2H,CH2),6.94(dd,J＝1.3,8.1Hz,1H,Ar),7.10-7.20(m,1H,Ar),7.21-7.29(m,1H,Ar)。
7.1.4 4-氨甲酰基-丁酸甲酯
在2L圆底烧瓶中，向甲基2-(溴甲基)-3-(叔丁基二甲基甲硅氧基)苯甲酸甲酯(137.5g，325mmol)在乙腈(1100mL)中的搅拌溶液中加入甲基4,5-二氨基-5-氧戊酸酯盐酸盐(70.4g，358mmol)。通过加料漏斗，在10分钟内向混悬液中加入DIPEA(119mL，683mmol)，并在将混合物在油浴中在40℃加热23小时前，将混悬液在室温下搅拌1小时。真空浓缩反应混合物。将残余物在乙醚(600mL)中搅拌，并沉淀出白色固体。将所述混合物过滤并用乙醚(400mL)清洗固体。用HCl(1N，200mL)、NaHCO3(饱和，200mL)和盐水(250mL)清洗滤液。分别保存酸的水溶液层和碱的水溶液层。然后，用乙醚(250mL)进一步清洗固体，并用上述酸溶液和碱溶液清洗液体。合并两有机层并真空浓缩以提供棕色油状的4-[4-(叔丁基-二甲基-硅烷基氧基)-1-氧-1,3-二氢-异吲哚-2-基]-4-氨甲酰基-丁酸甲酯(152g，115％的粗产率，H NMR鉴定的纯度为77％)。在下一步中使用所述化合物而无需进一步纯化：LCMS MH＝407。
7.1.5 4-氨甲酰基-4-(4-羟基-1-氧-1,3-二氢-异吲哚-2-基)-丁酸甲酯
在5分钟内，向甲基5-氨基-4-(4-(叔丁基二甲基甲硅氧基-1-氧代异二氢吲哚-2-基)-5-氧代戊酸酯(152g，288mmol)在DMF(500mL)和水(55mL)中的冷的搅拌溶液中部分加入K2CO3(19.89g，144mmol)。将所得反应混合物在室温下搅拌40分钟。将反应混合物在冰浴中冷却。向混合物中，缓慢加入HCl(12M，23.99mL，288mmol)。加入后，将乙腈(280mL)加入到混合物中并沉淀出固体。将混合物在室温下搅拌10分钟并过滤。用乙腈(50mL×4)清洗固体。在高度真空下浓缩滤液以提供黄色油(168g)。将油溶于乙腈(600mL)并在室温下搅拌10分钟。过滤混合物并用乙腈(25mL×2)清洗固体。在高度真空下浓缩滤液以提供黄色油(169g)，并将其加入到水(1200mL)和乙醚(1000mL)的混合物中。将混合物搅拌3分钟并分层。在高度真空下浓缩水溶液并将残余物在乙腈(160mL)中搅拌，并在搅拌过夜后形成白色固体。过滤混合物以提供白色固体状4-氨甲酰基-4-(4-羟基-1-氧-1,3-二氢-异吲哚-2-基)-丁酸甲酯(46g，54％得率)。浓缩滤液，并将残余物在乙腈(60mL)中进一步结晶以提供更多的白色固体状4-氨甲酰基-4-(4-羟基-1-氧-1,3-二氢-异吲哚-2-基)-丁酸甲酯(11.7g，14％得率)。浓缩滤液，并通过ISCO色谱法纯化残余物以提供更多的白色固体状4-氨甲酰基-4-(4-羟基-1-氧-1,3-二氢-异吲哚-2-基)-丁酸甲酯(13.2g，15％产率)。所得的总产物为70.9g，产率83％：LCMS MH＝293；1H NMR(DMSO-d6)1.95-2.34(m,4H,CH2,CH2),3.51(s,3H,CH3),4.32(d,J＝17.6Hz,1H,CHH),4.49(d,J＝17.4Hz,1H,CHH),4.73(dd,J＝4.7,10.2Hz,1H,CHH),6.99(dd,J＝0.8,7.9Hz,1H,Ar),7.10-7.23(m,2H,Ar,NHH),7.25-7.38(m,1H,Ar),7.58(s,1H,NHH),10.04(s,1H,OH)。
7.1.6 3-(4-((4-(吗啉代甲基)苄基)氧基)-1-氧代异二氢吲哚-2-基)哌啶-2,6-二酮
步骤1：向3-(4-羟基-1-氧-1,3-二氢-异吲哚-2-基)-哌啶-2,6-二酮(2.5g，8.56mmol)在THF(60mL)中的溶液中加入三苯膦(聚合物负载，1.6mmol/g，12g，18.8mmol)。将混合物在室温下搅拌15分钟。在0℃加入偶氮二甲酸二异丙酯(3.96mL，18.8mmol)，并将混合物在0℃搅拌30分钟。在0℃加入(4-吗啉-4-基甲基-苯基)甲醇(2.62g，12.4mmol)，并将混合物加热到室温并在室温下搅拌过夜。过滤反应混合物，并浓缩滤液。在硅胶柱上用二氯甲烷和甲醇洗脱(梯度，产物在6％甲醇流出)纯化所得的油以提供4-氨甲酰基-4-[4-(4-吗啉-4-基甲基-苄氧基)-1-氧-1,3-二氢-异吲哚-2-基]-丁酸甲酯(2.2g，54％产率)。在下一步中使用所述产物而无需进一步纯化。
步骤2：在0℃，向4-氨甲酰基-4-[4-(4-吗啉-4-基甲基-苄氧基)-1-氧-1,3-二氢-异吲哚-2-基)-丁酸甲酯(2.2g，4.57mmol)的THF溶液(50mL)中加入叔丁醇钾(0.51g，4.57mmol)。将混合物在0℃搅拌10分钟，并用1N HCl(5mL，5mmol)，然后用饱和NaHCO3(25mL)淬灭。用EtOAc(2×50mL)萃取混合物。用水(30mL)、盐水(30mL)清洗有机层，用MgSO4干燥并浓缩。边搅拌，边向所得固体中加入EtOAc(10mL)，然后加入己烷(10mL)。过滤混悬液以提供白色固体状3-(4-((4-(吗啉代甲基)苄基)氧基)-1-氧代异二氢吲哚-2-基)哌啶-2,6-二酮(1.5g，73％产率)。HPLC：Waters Symmetry C18，5μm，3.9×150mm，1mL/min，240nm，在5分钟内梯度至95/5乙腈/0.1％H3PO4，tR＝4.78min(97.5％)；mp：210-212℃；1H NMR(DMSO-d6)1.86-2.09(m,1H,CHH),2.29-2.38(m,4H,CH2,CH2),2.44(dd,J＝4.3,13.0Hz,1H,CHH),2.53-2.64(m,1H,CHH),2.82-2.99(m,1H,CHH),3.46(s,2H,CH2),3.52-3.61(m,4H,CH2,CH2),4.18-4.51(m,2H,CH2),5.11(dd,J＝5.0,13.3Hz,1H,NCH),5.22(s,2H,CH2),7.27-7.38(m,5H,Ar),7.40-7.53(m,3H,Ar),10.98(s,1H,NH)13C NMR(DMSO-d6)22.36,31.21,45.09,51.58,53.14,62.10,66.17,69.41,114.97,115.23,127.64,128.99,129.81,129.95,133.31,135.29,137.68,153.50,168.01,170.98,172.83；LCMS:465；Anal Calcd for C25H27N3O5+0.86H2O:C,64.58；H,6.23；N,9.04；Found:C,64.77；H,6.24；N,8.88。
通过手性分离，从3-(4-((4-(吗啉代甲基)苄基)氧基)-1-氧代异二氢吲哚-2-基)哌啶-2,6-二酮制备了(S)-3-(4-((4-(吗啉代甲基)苄基)氧基)-1-氧代异二氢吲哚-2-基)哌啶-2,6-二酮和(R)-3-(4-((4-(吗啉代甲基)苄基)氧基)-1-氧代异二氢吲哚-2-基)哌啶-2,6-二酮。
8.2 实施例2：对原代人B细胞分化模型中转录因子表达的影响
在本实施例中，使用体外人B细胞分化培养系统研究了(S)-3-[4-(4-吗啉-4-基甲基苄氧基)-1-氧-1,3-二氢-异吲哚-2-基]哌啶-2,6-二酮(测试化合物)对控制浆细胞分化以及免疫球蛋白生产的转录因子表达的影响。
在本实施例中使用了如下缩写：
缩写或专业术语 解释或定义
BCL6 B细胞淋巴瘤6蛋白
BLIMP-1 B-淋巴细胞诱导的成熟蛋白1
EtOH 乙醇
FBS 胎牛血清
DMSO 二甲亚砜
IRF-4 干扰素调节因子4
MFI 平均荧光强度
PAX5 成对盒蛋白Pax-5
SLE 系统性红斑狼疮
XBP-1 X-盒结合蛋白1
从Blood Center of New Jersey获得了来自健康供体的50ml血沉棕黄层SLE狼疮PBMC样本是从Conversant Bio(Huntsville,Alabama 35806)获得的。
在本研究中使用了下列细胞培养试剂。
项目 来源
Iscoves改良Dulbecco培养基 Invitrogen
胎牛血清 Lonza
人胰岛素 Sigma
人转铁蛋白 Sigma
青霉素/链霉素 Lonza
重组人IL-2 R&D Systems
重组人IL-6 R&D Systems
重组人IL-10 R&D Systems
重组人IL-15 R&D Systems
CD40配体/TNFSF5/组氨酸标签 R&D Systems
多组氨酸小鼠IgG1抗体 R&D Systems
ODN 2006-人TLR9配体 Invivogen
人干扰素αA PB干扰素来源
在流式细胞术分析中使用了下列试剂。
项目 来源
FITC抗人CD19 IBD Pharmigen
FITC抗人CD20 IBD Pharmigen
PE抗人CD27 IBD Pharmigen
PE抗人CD38 IBD Pharmigen
APC抗人CD38 IBD Pharmigen
FITC抗小鼠IgG1k同种型 IBD Pharmigen
PE抗小鼠IgG1k同种型 IBD Pharmigen
FITC抗小鼠IgG2bk同种型 IBD Pharmigen
APC抗小鼠IgG1k同种型 IBD Pharmigen
染色缓冲液 IBD Pharmigen
下列基因引物用于RT-PCR：
项目 来源
AICDA基因表达测定 Applied Biosystem
BCL6基因表达测定 Applied Biosystem
GAPDH基因表达测定 Applied Biosystem
IGJ基因表达测定 Applied Biosystem
IRF4基因表达测定 Applied Biosystem
PAX5基因表达测定 Applied Biosystem
PRDM1基因表达测定 Applied Biosystem
XBP1基因表达测定 Applied Biosystem
逆转录试剂盒 Applied Biosystem
Master Mix Applied Biosystem
7.2.1 hPBMC的纯化
将50ml人血沉棕黄层分成25ml等分试样，将两份分别放入50ml锥形管中并向每个锥形管中加入25ml无菌HBSS。通过颠倒轻轻混合该管。将15ml的室温Ficoll-Paque Plus(GE Healthcare；cat#17-1440-02)分成等分试样，放入四个50ml锥形管中。然后，25ml的血沉棕黄层/HBSS混合物在Ficoll上部轻轻并缓慢分层。将样品以450rpm离心35分钟。将包含上部分层的血浆吸除并弃去。将包含单核细胞的界面转入两个50ml锥形管中。用HBSS填充两个锥形管至总体积50ml并以1200rpm离心10分钟。在HBSS中再次清洗细胞并以1000rpm涡旋搅拌10分钟。用20mL B细胞培养基(Iscoves+10％PFBS、1％P/S和5μg/mL人胰岛素)再悬浮细胞沉淀物并用细胞计数器计数。
7.2.2 B细胞富集CD19+
将纯化的PBMC计数并以2×108个细胞/管等分。以1200rpm将细胞离心5分钟，然后弃去上清液。将细胞再悬浮于4mL Robosep缓冲液(StemcellTechnologies，目录号#20104)中，并且转移至14mL聚苯乙烯圆底管(BD，目录号#352057)并充分混合。然后，加入200μL EasySep人B细胞富集混合物(StemCell Technologies，目录号#19054)。将样品涡旋并在室温下孵育10分钟。然后，向该管加入300μL EasySep磁性颗粒(涡旋混合)(StemCellTechnologies，目录号#19054)。将样品涡旋并在室温下孵育5分钟。孵育5分钟后，向该管加入5mL Robosep缓冲液并通过移液器来回吸取充分混合。立即将该管放入银磁铁(StemCell Technologies，目录号#19054)中并在室温下孵育5分钟。孵育后，以一个连续动作翻转磁铁和管并将所需的组分倒入50mL锥形管。对其余的PBMC(每个供体)重复这些程序并合并。将合并的组分以1200rpm离心5分钟，然后丢弃上清液并将细胞再悬浮于5mL B细胞培养基中。用细胞计数器对分离的CD19+细胞计数。
7.2.3 B细胞分化测定
步骤1-B细胞活化-第0天至第4天：通过将50μg/mL人运铁蛋白加入到B细胞培养基(Iscoves+10％PFBS、1％P/S和5μg/mL人胰岛素)中制备新鲜的B细胞混合物。通过0.22μM过滤器过滤实验所需的所需体积的培养基。向细胞加入B细胞分化混合物(最终浓度)：重组人IL-2(20U/mL)、IL-10(50ng/mL)、IL-15(10ng/mL)、CD40配体/TNFSF5/组氨酸标签(50ng/mL)、多组氨酸小鼠IgGl抗体(5μg/mL)以及ODN 2006-人TLR9配体(10μg/mL)。向6孔平底板的每个孔中加入5ml(l×105/ml)的CD19+B细胞(最终细胞计数＝5×105/孔)。将5μL(1×)±化合物/DMSO加入到每个测试孔(0.1％最终DMSO)并在37℃孵育4天。
步骤2-浆母细胞生成-第4天至第7天：收获细胞并用细胞计数器计数；将移出等分试样进行流动分析，用PBS清洗剩余的细胞。通过将1μg/mL人转铁蛋白加入到B细胞培养基(Iscoves+10％PFBS、1％P/S和5μg/mL人胰岛素)中制备新鲜的B细胞混合物。通过0.22μM过滤器过滤实验需要的所需体积的培养基。向细胞添加B细胞分化混合物(最终浓度)：重组人IL-2(20U/mL)、IL-10(50ng/mL)、IL-15(10ng/mL)、IL-6(50ng/mL)。加入新鲜的B细胞混合物并将细胞转回原来的孔中并使体积恢复到5mL。将5μL(1×)±化合物/DMSO加入到每个测试孔(0.1％最终DMSO)在并在37℃孵育4天。
在第7天，收获细胞并用细胞计数器计数。然后，将细胞分出进行流动分析，并将剩余的细胞用RLT缓冲液裂解并在-80℃存储用于RNA提取和基因表达。将上清液分成等分试样并在-20℃冷冻以用于免疫球蛋白测定。
7.2.4 测试化合物储液的制备和稀释物
称取测试化合物并溶解于无菌100％DMSO(二甲亚砜；ResearchOrganics,Cleveland,OH)以产生40mM储液。基于实验设计,在测定中使用所述40mM储液的稀释物来获得最终的测试化合物浓度。
7.2.5 RNA提取和基因表达
收获分化的B细胞(参见[00226]-[00227]段)并使用QIAGEN RNeasy迷你离心柱试剂盒，用Qiacube RNA提取仪器(Qiagen,Valencia,CA)将其用于总核糖核酸(RNA)的制备。使用逆转录酶试剂盒(AppliedBiosystems)，用热循环仪(MJ Research；Inc.,St.Bruno,Quebec,Canada)将纯化的RNA逆转录至cDNA。使用7500RT-PCR系统(AppliedBiosystems)进行基因表达测定，重复三次。对每个样品进行3-磷酸甘油醛脱氢酶基因表达测定，并将其用作归一化对照。对于每种基因，将每个实验内的样品归一化为仅针对特定时间点的0.1％DMSO处理。
收获上清液(来自[00228]段)并通过ELISA分析IgG和IgM的产生(ZeptoMetrix Corp.Buffalo,NY)。
7.2.6 细胞分型
将分化的B细胞(参见[00226]-[00227]段)收获、计数并按约1×106个细胞/4mL管或更小的浓度分为等分试样。用染色缓冲液将细胞清洗1×。然后，再用10％人血清/PBS将细胞阻滞20-30分钟。阻滞后，以1200rpm将细胞离心5分钟并弃去上清液。根据实验设计，将20μL各种BD Pharmigen流式抗体加入100μL剩余的缓冲液中。在4℃将细胞染色20-30分钟。然后，用染色缓冲液将细胞清洗2×并弃去上清液。然后，向管中添加500μL染色缓冲液或PBS。立即分析样品或置于4℃过夜。用小鼠抗人CD20和CD38、CD19和CD27或各自的同种型对照对细胞染色。使用FACSCanto流式细胞仪、FACSDiva分析软件(BD Bioscience)和FlowJo分析软件分析所有样品。
7.2.7 细胞存活力分析
要测定活细胞数，用0.4％台盼蓝对B细胞(参见[00226]-[00227]段)染色并使用Countess自动细胞计数器(Invitrogen)对两个重复样品中的活细胞计数。
使用GraphPad Prism 5.0软件对数据作图。使用非线性回归、S形剂量响应，限制顶值为100％以及底值为0％，允许可变斜率，计算IC50值。Ig测定中测试化合物的结果表示为相对于对照DMSO值的抑制百分比。
测试化合物剂量依赖性地降低了CD20-CD38+浆母细胞的百分比，并提高了CD20+CD38-活化的B细胞的百分比。在第7天时，在DMSO对照中浆母细胞群体(象限1)为30.4％，并且测试化合物在2nM时将群体降低至27.3％，在20nM时降低至2.1％，并且在200nM时降低至0.4％(图1)。在培养前4天时，测试化合物降低了B细胞存活力(图2)。图3示出了测试化合物对B细胞和浆细胞转录因子表达的影响。图4示出了测试化合物对浆母细胞培养中IgG产生的影响。
测试化合物剂量依赖性地显著抑制了浆细胞转录因子IRF4、BLIMP1和XBP1的表达。测试化合物提高了B细胞转录因子PAX5。图5A和5B中示出了测试化合物对B细胞和浆细胞转录因子表达的影响。
测试化合物、泊马度胺和来那度胺抑制IgG产生，其IC50分别为0.0018μM、0.049μM和0.32μM。数据表明对于浆母细胞分化期间IgG的产生，测试化合物比泊马度胺有效27倍。图6示出了第4、7和10天时，测试化合物对B细胞培养中IgG产生的影响。图7示出了单独的测试化合物以及测试化合物与泼尼松龙结合对体外分化的浆母细胞/浆细胞的IgG产生的影响。图8示出了在B细胞分化第7天时，测试化合物对CD20/CD38表达的影响。图9示出了测试化合物对浆母细胞分化期间细胞存活力的影响。
在系统性红斑狼疮(SLE)患者分离的周围血单核细胞中，测试化合物抑制IgG和IgM产生，其IC50分别为3.2nM和0.9nM。这些发现表明测试化合物具有抑制B细胞分化为浆细胞系的潜能，并且表明测试化合物在以自身抗体过量产生为特征的自身免疫性病症(如SLE)的治疗中是有用的。图10示出了测试化合物对SLE患者PBMC细胞中B细胞分化和功能的影响。表1示出了测试化合物对正常和SLE患者PBMC细胞中IgG和IgM产生的影响。
图11A和11B分别示出了测试化合物对B细胞培养第7天时人IgG和IgM产生的影响。
表1.抑制正常和SLE PBMC的IgG和IgM产生的效力
8.3 实施例3：使用流式细胞术和激光扫描细胞术的B细胞分化测定
细胞培养材料：在具有IMDM培养基(Invitrogen)和10％FCS，并补充有人转铁蛋白和人胰岛素(Sigma)加细胞因子混合物的体外B细胞分化系统中培养富集的正常B细胞和SLE患者周围血单核细胞(PBMC)。在第0天和第4天，将测试化合物加入到培养物中。
B细胞分化规程：通过Ficoll-Hypaque密度梯度离心从新鲜的血沉棕黄层(白细胞富集的单元)分离富集的B细胞，然后用EasySep阴性选择人B细胞富集试剂盒(Stem cell technologies)孵育。简言之，将2×108/ml PBMC与4ml Robosep缓冲液混合并转移到14mL聚苯乙烯圆底管中。每管加入EasySep人B细胞富集混合物(200μL)、涡旋并在室温下孵育10分钟。加入EasySep磁性颗粒(300μL每管)并涡旋，并且在室温下孵育5分钟。向每管中加入Robosep缓冲液(5mL)，并通过上下吸取良好混合。将管置于银磁铁中并在室温下孵育5分钟。拿起磁铁和管并以一个连续的动作将其翻转，将所需的组分倒入50mL锥形管。将细胞以1200rpm离心5分钟。倒掉上清液，并加入5mL新鲜的B细胞培养基。在对细胞计数后，移除一等份进行FACS分析，并将剩余细胞用于培养。将CD19+B细胞分离至约95％纯度，如通过流式细胞术确定的。将纯化的B细胞以1×105个细胞/ml在无菌6孔板中铺板，每孔5ml。在补充有人转铁蛋白和人胰岛素(Sigma)的IMDM培养基(Invitrogen)和10％FCS中进行所有细胞培养。基于改良的B细胞分化为浆细胞的体外系统进行B细胞激活，PB产生和PC产生。在指定的培养步骤中，加入全部重组人细胞因子IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-15、INF-a和CD40L和抗多组氨酸mAb。在第0天和第4天，将不同浓度的测试化合物(2、20和200nM)加入到培养物中。在第4天，将来自相同处理的所有细胞混合在一起，细胞计数，并除去细胞进行FACS分析和细胞离心涂片器制备。将剩余的细胞以2.5×105个细胞/ml在无菌6孔板中铺板，每孔5ml。在促进浆细胞作为正常B细胞分化的条件下培养SLEPBMC。
用于流式细胞术分析的免疫表型：使用用于流式细胞术分析的多色直接免疫荧光染色对细胞染色。在细胞固定和透化前进行表面染色。将细胞(50μl；1×106个细胞/ml，在清洗缓冲液，添加了0.1％NaN3的2％FBS的PBS溶液中)用于每次染色。用同种型对照mAb(1μg/106个细胞)对细胞染色，并且将多色FITC–结合的抗CD20mAb和PE–结合的抗CD38mAb或PerCP-Cy5.5结合的抗CD44mAb、PE结合的抗CD83mAb用于第4天的激活B细胞(CD20+CD38-细胞)和第4天的PB和第7天的PB(CD20-CD38+)，并使用其他染色剂染色，并且根据生产商的说明通过流式细胞术进行分析。根据生产商的建议，进行转录因子蛋白(BCL-6、IRF-4、BLIMP-1、PAX-5和XBP-1)和IgJ的胞内染色。使用FACSDiva 6，通过FACSCanto(BD Biosciences)进行流式细胞术分析。对于数据分析，使用Flowjo(Tree Star)软件。
用于iCyte的单细胞混悬液和免疫荧光染色的细胞离心涂片器的制备：制备了含有2％FBS的PBS的不超过0.5×106个细胞/ml的细胞悬液。将高达200μl的这种混悬液加载到每个比色杯中并以800rpm离心3分钟。小心地分离比色杯和纸而不损害新鲜的细胞离心涂片器，并通过快速固定或干燥继续进行。在室温下，将未固定的细胞离心涂片器储存最长2天。染色前，用提高浓度的EtOH固定载玻片上的细胞并使其干燥。在用正常血清(与第二抗体相同种)阻断非特异性结合后，在冷藏室中的加湿室内将切片与以下单克隆抗体的混合物一起孵育过夜：(i)作为浆母细胞标志物的抗人CD38，和(ii)用于转录因子蛋白的抗BCL-6、IRF-4、BLIMP-1、PAX5和XBP-1。清洗后，将载玻片在黑暗中与在不同种中产生的第二抗体(使用两种不同的荧光染料，即Alexa Fluor-488和Alexa Fluor-633)的混合物一起孵育1小时。然后，在PBS中清洗载玻片，在室温下用DAPI复染20分钟，用抗褪色荧光封固剂盖片，并用指甲油密封。在4℃，将载玻片在黑暗中保存。为了排除第二抗体非特异性结合所产生的假阳性，以相同方式用替代第一抗体的缓冲液处理所有组织。观察抗体染色的颜色，并使用iCyte分析组织切片中的量。
激光扫描细胞计数图像捕获和荧光定量分析：对基于标准IHC法在载玻片(Cytospin 4,Thermo scientific)上细胞离心涂片的细胞进行双色免疫荧光染色。使用激光扫描细胞术(iCys定量成像细胞计数，CompuCyte)进行图像捕获和荧光定量分析。建立两条通道(pass)(第一通道用于488，第二通道用于405/633)。低分辨率扫描用于拼接扫描(mosaic scan)，高分辨率扫描用于区域扫描和分析。简言之，将载玻片放置在LSC平台上并选择区域进行扫描。LSC使用以5mW操作的氩激光器。使用20×物镜扫描载玻片。如通过DAPI染色确定的，通过在蓝色荧光和最小细胞尺寸上画出轮廓来鉴别和选择细胞。基于细胞面积相对于前向散射积分的点图中所显示的向前角光散射，设置细胞检测阈值以选择单细胞。采集激光-散射事件并将其用于绘制扫描数据显示内的单细胞。根据扫描细胞的核部分建立轮廓区别，从而将约67％的总光散射像素绘制轮廓。设置绿色和长红PMT-检测器增益电压，从而在扫描期间在各个视野中实现不超过75％的最大像素的最大饱和度。建立扫描区域后，使用40×物镜分析载玻片。对每个载玻片，检查最少6个扫描区域。通过来自整合的长红荧光的柱状图中每个主峰的细胞的重新定位来建立细胞图库(cell gallery)。出于质量保证的目的，检查重新定位的细胞的形态学组成。可以通过整合的对数荧光形式或线性最大像素形式分析数据。将LSC扫描中不同的细胞群体作为百分比和MFI评分，并与DMSO对照定量比较。
数据分析：通过FACSCanto分析流式细胞术表面和胞内分子。通过Flowjo完成数据分析。观察抗体染色的颜色，并使用iCyte分析组织切片中的量。将FCM和LSC扫描中不同的细胞群体作为百分比和MFI评分，并与DMSO对照定量比较。将数据表示为平均值±SEM。使用GraphPad Prism6.1(GraphPad Software；San Diego,CA)对所有数据作图。使用单因素方差分析(邓奈特多次对比检验)和配对学生氏t检验进行统计分析。认为p值小于或等于0.05是显著的。
使用如上所述的B细胞向浆细胞分化的改良的体外系统培养B细胞。将多色FITC-结合的抗CD20mAb和PE-结合的抗CD38mAb用于第4天活化的B细胞(CD20+CD38-细胞)和第7天的浆母细胞(PB)(CD20-CD38+)。表2中示出了来自代表3个供体的3个单独实验的数据。结果显示测试化合物对B细胞向浆母细胞/浆细胞系的分化具有显著影响。它增加了活化的B细胞并减少了浆母细胞，还随时间降低了细胞的存活力(图12A和12B)。在第4天(57.9％±11.5％)和第7天(50.5％±8.6％)之间，用测试化合物(20nM)处理的活化的B细胞(CD20+CD38-细胞)未显著改变，但当与载体(DMSO)对照在第4天(42.1％±1.5％，p<0.05)和第7天(12.5％±5.7％，p<0.05)相比时，测试化合物显著增加了活化的B细胞。同时，与DMSO对照(第4天，25.9％±2.4％，p<0.05；和在第7天，54.8％±5.0％，p<0.001)相比，测试化合物显著降低了第4天(4.8％±2.3％)和第7天(9.7％±5.4％)的浆母细胞/浆细胞。此外，在正常B细胞分化测定中，测试化合物以剂量依赖性的方式消除了大尺寸细胞群体(门控p2)。第4天时，对于2nM、20nM和200nM处理，测试化合物处理的大尺寸细胞的百分比分别为31.2％、23.1％和20.4％。第7天时，对于2nM、20nM和200nM处理，测试化合物处理的大尺寸细胞的百分比分别为34.9％、19.9％和11.94％。与DMSO对照相比，在第4天和第7天时，该数字分别为35.5％和34.9％。
表2.测试化合物抑制浆母细胞的分化
通过流式细胞法评价测试化合物对B细胞和浆细胞转录因子(BCL-6、IRF-4、BLIMP-1、PAX5和XBP-1)表达的影响。如上所述培养B细胞，并在第4天、第7天收获细胞进行免疫荧光染色。先对细胞进行CD20和CD38染色，并在细胞透化后，对BCL-6、IRF-4、BLIMP-1、PAX5和XBP-1染色，然后通过对全部淋巴细胞门控进行分析。图14中示出了3个的代表性的3个实验的数据。结果显示测试化合物(20nM)导致浆母细胞/浆细胞中转录因子表达的改变。它显著降低了第4天时IRF-4(p<0.5)、BLIMP-1(p<0.05)和XBP-1(p<0.05)的表达，但显著提高了第7天时BCL-6(p<0.05)的表达。
将激光扫描细胞术(iCyte)用于定量分析以确认上述流式细胞术的结果。如以上方法中所述，培养来自正常供体的B细胞和来自SLE患者的PBMC。在第4天和第7天收获细胞以用于将细胞离心涂片至载玻片，然后如方法中所述进行双重免疫荧光染色。通过浆母细胞/浆细胞表达CD38(绿色)，并将转录因子(红色)BCL-6、IRF-4、BLIMP-1、PAX5或XBP-1在细胞质或核中共定位。用DAPI(蓝色)复染核。在第7天的正常B细胞样品中，当与DMSO对照相比时，在全部淋巴细胞群体中，测试化合物(20nM)显著提高了BCL-6(图15A，p<0.01)，降低了IRF-4(图15B，p<0.001)和BLIMP-1(图15C，p<0.01)的表达，并且在CD38+浆母细胞/浆细胞中，显著提高了BCL-6(p<0.05)，降低了IRF-4(p<0.001)、BLIMP-1(p<0.001)和PAX-5(图15D，p<0.05)的表达。在两种细胞群体中，XBP-1无变化(图15E)。在SLE患者PBMC中，测试了三种转录因子：BCL-6、IRF-4和BLIMP-1。数据显示测试化合物在这些转录因子中具有与健康供体细胞类似的活性。测试化合物剂量依赖性地显著提高了BCL-6的表达，并且抑制来自分化第4天和第7天的SLE患者PBMC的CD38+浆母细胞/浆细胞中的IRF-4和BLIMP-1的表达(图16)。
使用相同的B细胞体外分化系统，进一步研究了测试化合物对B细胞分化中CD44和CD83的表达的活性。对第4天和第7天的细胞，使用多色FITC-结合的抗CD20mAb、PerCP Cy5.5-结合的抗CD44mAb和PE-结合的抗CD83mAb。根据3个供体的代表性的3个单独的实验，评价测试化合物的效果。数据显示在第7天的B细胞分化样品中，测试化合物剂量依赖性地并且显著地降低了CD44的平均荧光强度(MFI)(图17，p<0.01)，这是由于CD20高/CD44高细胞的减少所造成的(图18)。与DMSO对照的22.2％相比，在2nM、20nM和200nM的测试化合物处理的第7天时，CD20高/CD44高的百分比分别为18.4％、10.1％和6.6％。CD44+细胞的减少可以降低白细胞的附着。测试化合物还显著提高了总CD83+细胞群体和提高了CD83+的表达(图19)。2nM、20nM和200nM的测试化合物处理4天时，CD83+细胞的百分比为24.1％±2.1％，40.2％±3.6％，49.5％±4.4％和18.4％。与第4天和第7天时DMSO处理的13.4％±2.4％和12.9％±3.3相比，2nM、20nM和200nM的测试化合物处理第7天时CD83+细胞的百分比分别为16.3％±3.3％、36.1％±3.4％和51.9％±0.5％。
类风湿性关节炎(RA)患者中高水平IgJ链的表达预测缺乏对利妥昔单抗的反应。为了评价测试化合物是否对IgJ生产具有任何活性，还对细胞进行IgJ的胞内染色。来自三个供体的结果显示测试化合物剂量依赖性地并且显著地降低了第4天B细胞分化培养中Ig J链的表达。它不但降低了IgJ-阳性细胞的数目(与第4天和第7天时DMSO对照分别为13.1％±1.5％和14.4％±4.3相比，第4天时，20nM为8.4％±1.5％，200nM为5.4％±1.8％；第7天时，20nM为13.2％±2.3％，200nM为7.2％±1.3)，而且还降低了阳性细胞内IgJ的MFI(图20)。IgJ和IgG、IgM产生的降低可能是在如RA的疾病中，对测试化合物有反应的潜在标志物。
8.4 实施例4：测试化合物对抗人CD3-刺激的人T细胞中细胞因子和 趋化因子产生的影响
本实施例示出了使用多重Luminex技术的(S)-3-[4-(4-吗啉-4-基甲基苄氧基)-1-氧-1,3-二氢-异吲哚-2-基]哌啶-2,6-二酮、(R)-3-[4-(4-吗啉-4-基甲基苄氧基)-1-氧-1,3-二氢-异吲哚-2-基]哌啶-2,6-二酮和3-[4-(4-吗啉-4-基甲基苄氧基)-1-氧-1,3-二氢-异吲哚-2-基]哌啶-2,6-二酮对抗人CD3-刺激的人T细胞中细胞因子和趋化因子产生的影响。
使用了以下缩写：
缩写     解释或定义
IL       白介素
G-CSF    粒细胞集落刺激因子
GM-CSF   粒细胞巨噬细胞集落刺激因子
IFN-γ   干扰素γ
TNF-α   肿瘤坏死因子α
RANTES   激活、正常T细胞表达和分泌调节
本研究使用了以下材料：
补充有10％FBS、100单位/mL青霉素、100mg/mL链霉素和2mM L-谷氨酰胺的RPM1-1640培养基(Life Technologies)
人T-细胞富集混合物(StemCell,Cat#15061)
Luminex人细胞因子/趋化因子12-Plex试剂盒(Millipore,Cat#MPXHCYTO-60K-12)
Luminex IS100仪(Millipore)
抗人CD3抗体，OKT3克隆(eBioscience,Cat#16-0037-85)
将测试化合物制备成在DMSO中的4mM储液。根据生产商的程序，使用T细胞富集混合物，通过阴性选择分离T细胞。
在37℃，在100μL 1×PBS中，用3μg/mL抗人CD3抗体预涂覆所有96孔板4小时。在T细胞测定之前用RPMI-1640完全培养基清洗板三次。然后，在180μL RPM1-1640完全培养基中，以2.5×105个细胞/孔的密度，在抗CD3预涂覆的板中将T细胞铺板。用10、1、0.1、0.01、0.001、0.0001和0.00001μΜ的20μL 10×滴定的测试化合物处理细胞，重复两次。所述DMSO的最终浓度为0.25％。在37℃、5％CO2的条件下，孵育该板48小时。
48小时后，收获上清液并通过多重流式微珠阵列(CBA)测定进行以下细胞因子/趋化因子的测试：IL-2、IL-3、IL-5、IL-10、IL-13、IL-15、IL-17A、GM-CSF、G-CSF、IFN-γ、TNF-α和RANTES。
在Luminex IS100仪上分析CBA板。
使用GraphPad Prism 5.0软件将来自每个供体的数据作图并表示为平均值pg/mL±SEM以及DMSO对照的％±SEM。
测试化合物示出了抗CD3刺激的原代人T细胞中的免疫调节活性，其改变了一些细胞因子和趋化因子的产生。下表3示出了用载体孵育的刺激的人T细胞所产生的细胞因子和趋化因子的基线水平。
表3：细胞因子和趋化因子的基线水平
测试化合物提高了刺激的人T细胞中IL-2、IL-3、IL-5、IL-10、IL-13、GM-CSF、IFN-γ、RANTES和TNF-α的产生。对于大多数细胞因子和趋化因子来说，通过测试化合物对产生的提高在很大程度上是依赖于浓度的，但是IL-10和IL-5除外。测试化合物在低浓度下提高了IL-10的产生，但在高浓度下抑制了对IL-10产生的提高。测试化合物主要在提高其他细胞因子产生的浓度范围内的单个浓度下提高了IL-5的产生。与其他细胞因子和趋化因子相比，在对照细胞内产生了相对少量的IL-2、IL-3、IL-5和IL-17A(表1)。测试化合物不会显著改变IL-17A的产生。在刺激的人T细胞中，未产生可测量的量的GCSF和IL-15。分别在图21和22中提供了3-[4-(4-吗啉-4-基甲基苄氧基)-1-氧-1,3-二氢-异吲哚-2-基]哌啶-2,6-二酮对抗CD3-刺激的人T细胞中的细胞因子和趋化因子的产生的影响，其表示为所产生的绝对量和载体对照细胞的百分比。图23和24分别提供了(R)-3-[4-(4-吗啉-4-基甲基苄氧基)-1-氧-1,3-二氢-异吲哚-2-基]哌啶-2,6-二酮对抗CD3-刺激的人T细胞中细胞因子和趋化因子产生的影响，其表示为所产生的绝对量和载体对照细胞的百分比。图25和26分别提供了(S)-3-[4-(4-吗啉-4-基甲基苄氧基)-1-氧-1,3-二氢-异吲哚-2-基]哌啶-2,6-二酮对抗CD3-刺激的人T细胞中细胞因子和趋化因子产生的影响，其表示为所产生的绝对量和载体对照细胞的百分比。图22、24和26中的虚线表示水平等同于两倍的基线产量(EC200)。
8.5 实施例5：抗炎活性
在人周围血单核细胞(hPBMC)中研究了3-[4-(4-吗啉-4-基甲基-苄氧基)-1-氧-1,3-二氢-异吲哚-2-基]-哌啶-2,6-二酮、(R)-3-[4-(4-吗啉-4-基甲基-苄氧基)-1-氧-1,3-二氢-异吲哚-2-基]-哌啶-2,6-二酮和(S)-3-[4-(4-吗啉-4-基甲基苄氧基)-1-氧-1,3-二氢-异吲哚-2-基]哌啶-2,6-二酮的抗炎活性。使用Luminex技术确定该化合物的抑制(升高)浓度IC50，以对来自LPS刺激的健康人供体PBMC的促炎性细胞因子/趋化因子和IL-10(抗炎性细胞因子)进行同时分析(simultaneous profiling)。
来自健康供体的50ml血沉棕黄层得自新泽西州血液中心(East Orange,New Jersey)。脂多糖(菌株)(cat#L-1887)购自Sigma。用于Luminex xMAP技术的具有抗体结合珠的Milliplex试剂盒购自Millipore(Billerica,Massachusetts)并且在测定之前组合成多重形式。
7.5.1 人周围血单核细胞的纯化
将50ml人血沉棕黄层分成25ml等分试样，将两份分别放入50ml锥形管中并向每个锥形管中添加25ml无菌HBSS。通过翻转轻轻地混合该管。将15ml室温Ficoll-Paque Plus(GE Healthcare(地址)；cat#17-1440-02)分成等分试样，放入四个50ml锥形管中。然后，25ml的血沉棕黄层/HBSS混合物在Ficoll上部轻轻并缓慢分层。将样品以450rpm离心35分钟。将包含血浆的上层吸除并弃去。将包含单核细胞的界面转入两个50ml锥形管中。用HBSS填充两个锥形管至总体积50ml并以1200rpm离心10分钟。在HBSS中再次清洗细胞并以1000rpm旋转10分钟。用20ml RPMI完全培养基(RPMI/5％人血清/1×pen/strep/glut)再悬浮细胞颗粒并计数。
7.5.2 人周围血单核细胞的处理
将100μl(2×106/ml)hPBMC添加到96孔平底板的每个孔中(最终细胞计数＝2×105/孔)并在37℃孵育1h。将20μl(10×)化合物添加到每个测试孔中并将包含2.5％DMSO的20μl培养基添加到每个对照孔(最终[DMSO]＝0.25％)中，并将板在37℃孵育1小时。然后用80μl的2.5ng/mlLPS(最终[LPS]＝lng/ml)刺激细胞并在37℃孵育18小时。
将50μl上清液从每个孔转入到3个新的圆底96孔板并在-20℃储存进行Luminex分析。对于每个样品，重复进行两次。
7.5.3 Luminex分析
根据生产商(Millipore,Billerica,Ma 01821)的说明，使用Luminex IS100仪以多重形式分析上清液样品的细胞因子。使用纯的上清液，以双重形式进行IL-12和GM-CSF分析，同时使用1：20稀释的上清液，以多重形式进行所有其他细胞因子分析。使用Upstate Beadview软件进行数据分析。使用非线性回归、S形剂量响应，限制顶值为100％以及底值为0％，允许可变斜率，计算IC50。EC50基于S形曲线的上限值(等于246.9％，代表10μM时，泊马度胺(对照)产生的平均IL-10增加)以及达到100％的下限值。使用GraphPad Prism v5.00进行IC50。数值表示n个(重复试验的数目)的平均值+SEM(平均标准误差)。
如下表4和图27、29和31中的数据证明，一般地，测试化合物对所检验的多种细胞因子，例如，Il-6、IL-8、IL-1β、GM-CSF、MDC、MIP-1α、MIP-1β和TNF-α的抑制具有不同的效力。另外，如表5和图28、30和32中所提供的，这些化合物以不同的效力提高了IL-10、MCP-1和RANTES的产生。
表4：测试化合物的细胞因子抑制谱图总结
表5：细胞因子抑制谱图总结-0.1μM时对照的平均％
8.6 实施例6：对响应IgG/利妥昔单抗的人自然杀伤(NK)细胞功能 的影响
在本实施例中，研究了测试化合物提高对IgG/利妥昔单抗有反应的人NK细胞功能的能力。在对自然杀伤(NK)细胞功能的两次测定中比较了测试化合物的免疫调节活性：(1)IgG-和IL-2-诱导的干扰素-γ(IFN-γ)产生。
以下提供了在本研究中使用的材料以及它们的来源：
来自健康志愿者的血沉棕黄层(Blood Center of New Jersey)
Ficoll-Hypaque Plus(Fisher Scientific Co LLC,PA,Cat#17144002)
补充有10％FBS(胎牛血清)、100单位/mL青霉素、100mg/mL链霉素和2mM L-谷氨酰胺的RPMI-1640培养基(Invitrogen，Cat#21870-076)
补充有10％FBS、100单位/mL青霉素、100mg/mL链霉素和2mM L-谷氨酰胺的RPMI-1640培养基(无酚红)(Invitrogen,Cat#11835-030)
利妥昔单抗(Rituxan,Roche,Inc.)(Cat No.DIN 02241927，批号No.B50177)
人AB+血清(Gemini Bio Products,CA,Cat#100-512)
CytoTox 96非放射性细胞毒性测定试剂盒(Promega,WI,Cat#G1780)
RosetteSep人NK细胞富集混合物(Stem Cell Technologies,Vancouver,BC,Cat#15065)
小鼠抗人CD56+结合的APC(BD Biosciences,CA,Cat#555518)
来自血清的人免疫球蛋白G(IgG)(Sigma,St.Louis,MO；Cat#I2511-10MG)
人重组IL-2(R&D Systems,MN,Cat#202-IL-050/CF)
人IFN-γELISA试剂盒(ThermoFisher,Cat#PIEHIFNG5)
使用了以下细胞系：
活化的B细胞样弥散性大B细胞淋巴瘤(ABC-DLBCL)：Riva细胞(NCI,MD)
生发中心B细胞样弥散性大B细胞淋巴瘤(GCB-DLBCL)：
WSU-DLCL2(Celgene Signal,CA)
Farage(ATCC,VA)
滤泡性淋巴瘤：DoHH2(DSMZ,Germany)
伯基特氏淋巴瘤(BL)：Raji(ATCC,VA)。
在Ficoll-Hypaque(Fisher Scientific Co LLC,PA)密度梯度离心前，根据生产商的说明，使用RosetteSep NK细胞富集混合物(Stem CellTechnologies,Vancouver,BC)，通过阴性选择，从血沉棕黄层血液中分离得到来自健康供体的NK细胞。将CD56+NK细胞分离至约85％纯度，如通过流式细胞术(BD Biosciences,CA)所确定的。
7.6.1 NK IgG诱导的干扰素-γ(IFN-γ)测定
在4℃用100μg/mL的人IgG(Sigma)涂覆96孔平底板过夜。第二天，用1×冷PBS冲洗掉未结合的IgG。然后，在180μL RPMI-1640培养基中以2×105个细胞/孔，在IgG涂覆的96孔板中将NK细胞铺板，并加入10ng/mL的rhIL-2(R&D Systems,MN)。将测试化合物加入20μL体积的DMSO中。测试化合物的最终浓度为0.0001、0.001、0.01、0.1、1或10μΜ。DMSO的最终浓度为0.25％。48小时后，收获上清液并通过ELISA进行IFN-γ产生分析。
对每个供体，使用GraphPad Prism v5.0软件对用来确定测试化合物对固定化的IgG和rhIL-2刺激有反应而提高NK细胞IFN-γ产生的能力的数据进行分析。数据按两种方式表示：(1)表示为所产生的IFN-γ的绝对量(pg/mL±SEM)和(2)存在1μΜ泊马度胺时，表示为所产生的IFN-γ的量的百分比。EC50是提供最大IFN-γ产量一半时的测试化合物的浓度，其中最大产量定义为在存在1μM泊马度胺的情况下产生的IFN-γ的量。使用非线性回归、S形剂量响应，限制顶值为100％以及底值为0％，允许可变斜率，计算EC50值。
表6
测试化合物响应固定化的IgG和IL-2刺激而以剂量依赖性的方式提高了NK细胞IFN-γ的产生。分别在图33-35中提供了外消旋物、R-对映异构体和S-对映异构体的结果(表示为所产生的IFN-γ，pg/mL)。图36-38分别提供了表示为相对于存在1μM泊马度胺时所产生的IFN-γ，外消旋物、R-对映异构体和S-对映异构体对所产生的IFN-γ提高的百分比。图33-38中绘制的每个值表示12-14个测定值的平均值±SEM。
8.7 实施例7：人血管内皮细胞增殖、管形成、迁移和侵袭测定
在本实施例中，外消旋物是指3-[4-(4-吗啉-4-基甲基苄氧基)-1-氧-1,3-二氢-异吲哚-2-基]-哌啶-2,6-二酮，R-对映异构体是指(R)-3-[4-(4-吗啉-4-基甲基苄氧基)-1-氧-1,3-二氢-异吲哚-2-基]哌啶-2,6-二酮，S-对映异构体是指(S)-3-[4-(4-吗啉-4-基甲基苄氧基)-1-氧-1,3-二氢-异吲哚-2-基]哌啶-2,6-二酮。
人脐静脉血管内皮细胞增殖测定：对于所有增殖测定，将人脐静脉血管内皮细胞融化并在EGM2培养基中生长直至第3代至第6代。将人脐静脉血管内皮细胞胰蛋白酶化，用20％FBS/M199培养基清洗，并用相同培养基以104个细胞/100μL/孔向96孔细胞培养板铺板。将这些板在37℃孵育过夜以使细胞附着。然后，用相同培养基清洗3次后，将细胞在1％FBS/M199培养基中饥饿18小时。对于HUVEC增殖测定中生长因子浓度的优化，在37℃，在具有5％CO2的加湿细胞培养箱中，从100ng/mL开始，将100μL/孔2×连续稀释的生长因子加入到HUVEC中保持72小时，重复两次。对于测试化合物的分析，用10mM储液制备测试化合物在0.4％DMSO/1％FBS/M199培养基中的连续稀释，重复两次。在37℃，将50微升/孔的连续稀释的测试化合物(10、1.0、0.1、0.01、0.001、0.0001、0.00001μM)加入到细胞中1至2小时。细胞中最终的DMSO浓度是0.1％。然后，在37℃，在具有5％CO2的加湿的细胞培养箱中，将50μL 4×最终浓度的相对生长因子(relative growth factors)加入到每个孔中，保持72小时，重复两次。通过将1微居里3H-胸苷(Amersham)在20μL培养基中的溶液加入到每个孔中并在37℃，在具有5％CO2的加湿的细胞培养箱中孵育5至6小时来测量胸苷的掺入。然后，将细胞胰蛋白酶化，并使用细胞收集器(Tomtec)，将细胞收获到UniFilter GF/C滤板(Perkin Elmer)上。将板风干后，加入20μL/孔的Microscint 20(Packard)，然后在TopCount NXT(Packard)中分析板。每孔计数一分钟。在3个供体中的每一个中进行实验，重复两次。
人脐静脉血管内皮细胞管形成测定：在生长因子诱导的HUVEC管形成测定中测试化合物。将管形成板在37℃孵育30分钟，使matrigel聚合。用相同培养基清洗3次后，将HUVEC在0.1％BSA基础EBM2培养基中饥饿5小时。将细胞胰蛋白酶化并离心。然后，将25μL 4×连续稀释的化合物(10、1、0.1、0.01、0.001、0.0001、0.00001μM)加入至其中具有50μL 2×104个细胞/孔的matrigel涂覆的管形成板中，重复两次。将50μL 4×VEGF(最终浓度＝25ng/mL)或bFGF(最终浓度＝10ng/mL)加入到板中。然后，将细胞在37℃在加湿的孵育箱中孵育过夜(约18小时)。用4μg/μL钙黄绿素AM在2％FBS/HBSS中的溶液对小管网(tubule web)染色30分钟，然后通过荧光显微术拍摄图片。通过MetaMorph管形成软件程序对小管定量管面积和管长度。
人脐静脉血管内皮细胞侵袭测定：在HUVEC侵袭测定中，优化人纤连蛋白的浓度以提供适合于贴壁细胞附着在膜上的蛋白质结构并使其能够对插板下室中血管原刺激物(例如，VEGF、bFGF或HGF)有反应而自由迁移。用相同培养基清洗3次后，将HUVEC在0.1％BSA EBM2培养基中饥饿6小时。然后，将细胞胰蛋白酶化，并离心以除去剩余的胰蛋白酶。然后，将125μL约0.5至1×106个细胞/孔和125μL 8×顺序稀释的化合物(10、1、0.1、0.01、0.001μM)加入到BD Falcon 24孔和96孔插板的上室中，重复两次并孵育约1至2小时。(这些板含有已均匀涂覆了人纤连蛋白的荧光阻断微孔[3.0μm孔径]PET膜。)然后，将750微升1.33×VEGF(最终浓度25ng/mL)、bFGF(最终浓度10ng/mL)或HGF(最终浓度25ng/mL)储液加入到下室。将细胞在37℃孵育22±1小时。用4μg/mL钙黄绿素AM在含有2％FBS的HBSS中的溶液对迁移细胞染色，其中对24孔板使用500μL/孔，对96孔板使用200μl/孔。将板在37℃孵育90分钟，然后在荧光酶标仪中读数。
通过用测试样品结果减去未刺激的DMSO对照的结果，对所有重复求平均值，并归一化为生长因子-刺激的DMSO对照(0％抑制)来计算细胞增殖、管形成、迁移和侵袭的抑制百分比。通过使用GraphPad Prism 5.0计算IC50值。
人脐静脉血管内皮细胞增殖测定结果：生长因子优化研究的结果表明增殖诱导的最佳VEGF、bFGF和HGF浓度分别为25、10和25ng/mL。用优化的生长因子浓度检验测试化合物，结果表明外消旋物、S-对映异构体和R-对映异构体不抑制VEGF-、bFGF-或HGF-诱导的HUVEC增殖(图39)。然而，通过S-对映异构体，在VEGF-和HGF-处理的HUVEC中观察到增殖显著提高(VEGF-处理：1-10μM；HGF-处理：0.1-1μM)。通过外消旋物(0.01-1μM)和R-对映异构体(0.1-1μM)，在bFGF处理的HUVEC中也观察到了显著提高。
表7中总结了IC50值。
表7.生长因子-诱导的人脐静脉血管内皮细胞增殖研究的IC50值总结
人脐静脉血管内皮细胞管形成测定结果：就管长度和管面积来说，测试化合物显示出抑制VEGF-诱导的HUVEC管形成的趋势(图40)。所有化合物均显示出对VEGF-诱导的HUVEC管形成具有剂量依赖性影响。R-对映异构体在10μM显示出显著的管面积和长度抑制(相对于刺激的DMSO对照来说，p<0.05)。就管长度和管面积而言，化合物也存在抑制bFGF-诱导的HUVEC管形成的趋势(图40)，尽管该影响不如对VEGF诱导的HUVEC管形成的影响显著。
人脐静脉血管内皮细胞侵袭测定结果：3-[4-(4-吗啉-4-基甲基苄氧基)-1-氧-1,3-二氢-异吲哚-2-基]哌啶-2,6-二酮、(R)-3-[4-(4-吗啉-4-基甲基苄氧基)-1-氧-1,3-二氢-异吲哚-2-基]哌啶-2,6-二酮和(S)-3-[4-(4-吗啉-4-基甲基苄氧基)-1-氧-1,3-二氢-异吲哚-2-基]哌啶-2,6-二酮以剂量依赖性的方式显著抑制VEGF-、bFGF-和HGF-诱导的HUVEC侵袭(图41)。化合物对VEGF-和bFGF-诱导的HUVEC侵袭比对HGF-诱导的HUVEC侵袭更有效(表8)。测试化合物对VEGF诱导的HUVEC侵袭的抑制的IC50值为<0.3nM。外消旋物(0.4nM)和S-对映异构体(<0.1nM)的IC50比R-对映异构体(13nM)的有效10倍以上(表8)。
表8.测试化合物对生长因子-诱导的人脐静脉血管内皮细胞侵袭的影响总结
8.8 实施例8：狼疮/纤维化小鼠模型研究
在本实施例中，在两个易发狼疮的小鼠系：系统性红斑狼疮的MRL/MpJ-Faslpr/J小鼠模型和系统性红斑狼疮的NZBWF1/J小鼠模型中测试了(S)-3-[4-(4-吗啉-4-基甲基苄氧基)-1-氧-1,3-二氢-异吲哚-2-基]哌啶-2,6-二酮的敏感度。在两模型中，以30mg/kg施用测试化合物。
在系统性红斑狼疮的MRL/MpJ-Faslpr/J小鼠模型中，在4周时，周围血液B细胞显示无变化。在4周时，脾脏B细胞显示出37％的增加，抗双链DNA自身抗体水平显示出25％的降低。
在系统性红斑狼疮的NZBWF1/J小鼠模型中，在4周时，周围血液B细胞显示25％的减少，在4周时，脾脏B细胞显示无变化，抗双链DNA自身抗体水平显示出86％的增加。
8.9 实施例9：真皮纤维化小鼠模型研究
在本实施例中，使用预防和治疗剂量方案，在博来霉素-诱导的皮肤纤维化模型中测试了(S)-3-[4-(4-吗啉-4-基甲基苄氧基)-1-氧-1,3-二氢-异吲哚-2-基]哌啶-2,6-二酮。博来霉素是已显示会导致肺部纤维化的过时的抗癌治疗剂。在动物模型中，它将类似地在递送位点引起损伤和纤维化。
在本实施例中使用了如下缩写：
缩写或专业术语 解释或定义
ANOVA 方差分析
α-SMA α平滑肌肌动蛋白
CMC 羧甲基纤维素
ECM 细胞外基质
NaCl 氯化钠
PO 口服
QD 每天一次剂量施用
SSc 全身性硬化
在该研究中使用了DBA/2小鼠。在研究中，每个处理组使用8只动物。在标准条件下，将小鼠饲养在畜舍中，并自由进食和进水。
在蒸馏水中制备载体、0.5％羧甲基纤维素(CMC)/0.25％吐温80，并在磁力搅拌器上溶解过夜(加入0.5g CMC(Sigma#C9481)和0.25ml吐温80(Sigma#P8074)至99.75ml以制备总计100mL的0.5％CMC/0.25％吐温80)。
称出测试化合物粉末并在载体0.5％CMC/0.25％吐温80中每天新鲜悬浮配置以避免药物在水媒质中水解。化合物在该载体中悬浮，而不是溶解。使用机械化Eberbach组织匀浆器，通过聚四氟乙烯研棒和研钵(Potter-Elvehjem组织研磨器)使制剂匀质化。在这些研究中使用的每天的药物储液浓度为3mg/ml。
博来霉素得自University of Erlangen-Nuremberg的药店，并且每周新鲜配制一次。通过每隔一天在上背部1.5cm2的限定区域内局部皮内注射100μl溶于0.9％NaCl中的博来霉素(浓度0.5mg/ml)，在6周大的DBA小鼠中引起皮肤纤维化。
7.9.1 研究设计
博来霉素诱导的真皮纤维化的小鼠模型被广泛用于评价抗纤维化治疗。在该模型中，通过每隔一天皮内注射博来霉素3周来引起局灶性真皮纤维化。该模型类似于SSc的早期、炎性阶段。为评价对预防纤维化的潜在影响，与第一次博来霉素注射同时启动治疗。为研究测试化合物对预防体内博来霉素-诱导的真皮纤维化的影响，将治疗分为以下几组：
· 对照组：真皮内注射NaCl 3周。治疗包括施用载体(0.5％CMC/0.25％吐温80)。
· 未处理的博来霉素组：真皮内注射博来霉素3周。施用载体(0.5％CMC/0.25％吐温80)。
· 测试化合物组：真皮内注射博来霉素3周。以30mg/kg施用测试化合物；PO，QD。
· 阳性对照组：真皮内注射博来霉素3周。注射伊马替尼(50mg/kg；IP，QD)。先前已表明甲磺酸伊马替尼在博来霉素诱导的真皮纤维化中发挥了有效的抗纤维化作用。参见Akhmetshina A.等人，Arthritis Rheum2009；60(1):219-224。
为了评价纤维化的退化，使用了博来霉素诱导的真皮纤维化的改良模型。使小鼠预先经受博来霉素以引起稳健的皮肤纤维化。一组接受测试化合物的治疗，同时继续经受博来霉素达另外3周。将该组的结局与经受博来霉素6周的小鼠(预防进一步发展)和经受博来霉素3周接着经受NaCl另外3周(引起退化)的小鼠比较。在该退化研究中使用了以下几组：
· 对照组：真皮内注射NaCl 6周。对照治疗包括施用载体。
· 未处理的博来霉素1组(退化)：真皮内注射博来霉素3周，接着皮内注射NaCl另外3周。治疗包括施用载体。未处理的博来霉素2组(预防发展)：真皮内注射博来霉素6周。治疗包括施用载体。
· 测试化合物组：真皮内注射博来霉素6周。以30mg/kg施用测试化合物；PO，QD。
· 阳性对照组：真皮内注射博来霉素6周。注射伊马替尼(50mg/kg；IP，QD)。
7.9.2 实验程序
通过将免疫组织化学用于α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)，用苏木精和伊红染色以及激活的成纤维细胞来确定真皮厚度。如通过改良的Rodnan皮肤评分所确定的，真皮厚度是目前SSc中人类抗纤维化药剂的临床试验中最常见的首要结局。用苏木精/伊红对皮肤切片染色以得到更好的组织结构显象。用Nikon Eclipse 80i显微镜(Nikon,Badhoevedorp,The Netherlands)，通过测量每只小鼠4处不同皮肤切片的表皮-真皮结合处和真皮-皮下脂肪结合处之间的最大距离对真皮厚度进行分析。评价由2名独立的检查员执行。
为了定量肌成纤维细胞，将皮肤部分脱蜡并与5％牛血清白蛋白一起孵育60分钟。通过与单克隆抗-α-SMA抗体(克隆1A4；Sigma-Aldrich,Steinheim,Germany)在室温下孵育2小时，接着与3％过氧化氢一起孵育10分钟，检测α-SMA的阳性细胞。将用辣根过氧化物酶(Dako,Hamburg,Germany)标记的山羊抗兔抗体用作第二抗体。用3,3-二氨基联苯胺四盐酸盐(Sigma-Aldrich)使α-SMA的表达显象。将单克隆小鼠IgG抗体(Calbiochem,San Diego,CA)用作对照。
另外，用SirCol胶原蛋白测定测量受损皮肤中胶原蛋白的量；将所有小鼠的RNA和血浆存储，用于进一步分析。
在博来霉素真皮纤维化小鼠模型中，测试化合物显著降低了受损皮肤的真皮厚度。每日一次口服(PO，QD)30mg/kg的测试化合物，以约25±0.49％(p<0.001，图42)显著预防了真皮变厚。
苏木素伊红染色的皮肤部分的代表性显微照片如图43中所示。通过测量表皮-真皮结合处和真皮-皮下脂肪结合处之间的最大距离来评价真皮厚度。结合点之间所划的线示出了处理组中的相对厚度。
为了确定处理对成纤维细胞激活的影响，对受损皮肤部分的α-SMA+肌成纤维细胞计数。如图44所示，每日一次口服(PO，QD)30mg/kg的测试化合物将肌成纤维细胞的数目减少了24±0.09％(p<0.05)。50mg/kg的伊马替尼将真皮变厚降低了60±0.34％(p<0.0001)，并且将肌成纤维细胞数目减少了81±0.11％(p<0.0001)。
7.9.3 对博来霉素诱导的真皮纤维化退化的影响
在设计用于研究纤维化的可能退化的改良的博来霉素模型中，还确定了测试化合物对纤维化发展的抑制效果。如图45所示，在退化模型中，每天一次口服(PO，QD)30mg/kg的测试化合物对真皮变厚无效果。图46示出了代表性苏木素伊红染色的皮肤部分的显微照片。通过测量表皮-真皮结合处和真皮-皮下脂肪结合处之间的最大距离评价真皮厚度。结合点之间所划的线示出了处理组中的相对厚度。图47显示测试化合物对肌成纤维细胞数目无影响。50mg/kg的伊马替尼将博来霉素引起的真皮厚度降低了50±0.3％(p<0.0001)，并且将肌成纤维细胞数目减少了78±0.15％(p<0.0001)。
8.10 实施例10：TSK-1小鼠模型中的影响
在鼠紧皮-1(Tsk-1)小鼠模型中测试了(S)-3-[4-(4-吗啉-4-基甲基苄氧基)-1-氧-1,3-二氢-异吲哚-2-基]哌啶-2,6-二酮的抗纤维化作用。
首先，在Tsk-1紧皮小鼠模型中还研究了化合物对纤维化的抑制作用。如图48所示，与50mg/kg的伊马替尼的58％的降低相比(p≤0.001)，30mg/kg的化合物将皮下增厚降低了45％(p≤0.001)。如通过羟脯氨酸水平所测量的，化合物将皮肤升高的胶原蛋白含量降低了38％，伊马替尼降低了67％(p≤0.001)。
然后，为了检验化合物对Tsk-1鼠皮中TGF-β途径基因的过表达的影响，使用qRT-PCR测量了6种基因的mRNA水平：CTGF、PAI-1、COL1A1、α-平滑肌肌动蛋白(αSMA)、软骨寡聚蛋白1(COMP)和TGFB1。过表达定义为与正常pa/pa鼠皮相比，Tsk-1鼠皮中观察到的过量的mRNA水平。在这6种基因中，与正常的pa/pa小鼠相比，在Tsk-1中，仅有4种(CTGF、PAI-1、COL1A1和TGFB1)的表达是显著较高水平的。化合物(30mg/kg)将CTGF和COL1A1的过表达分别显著降低了79％(p≤0.001)和129％(p≤0.001)(图49)。化合物不会抑制PAI-1和TGFB1基因的过表达。这些结果表明化合物可以通过阻断TGF-β途径中的一些促纤维化基因(profibrotic gene)的过表达来减少皮肤纤维化。
为了进一步检验化合物对正常(NL)和全身性硬化(SSc)细胞的纤维化基因的表达的影响，进行以下程序：
细胞培养：将人正常的和硬皮病的皮肤成纤维细胞在含有10％胎牛血清(FBS)的DMEM中培养。将细胞维持在37℃的加湿的5％CO2，95％空气的孵育箱中。达到汇合后，用0.05％胰蛋白酶收获细胞并继代培养。使用第3至5代细胞。
实验设计：细胞生长至70-80％汇合，并通过将血清浓度减少至0.4％使其处于静止状态过夜。测试了化合物对TGFβ纤维化作用以及对NL和SSc纤维化基因表达的影响。
对纤维化基因表达的TGFβ诱导的影响：用化合物对NL成纤维细胞预处理30分钟，然后加入TGF-β1来观察化合物对TGFβ诱导的纤维化基因表达的影响。
化合物对SSc-FB的影响：用不同浓度的化合物处理SSc成纤维细胞，并在24小时后通过实时PCR确定胶原蛋白1A1(COL1)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、纤连蛋白(FN)、基质金属肽酶1(MMP1)、纤维蛋白溶酶原活化因子抑制剂(PAI)和DNA(胞嘧啶-5-)-甲基转移酶1(Dnmt1)的基因表达水平。
实时定量PCR：使用RNeasy试剂盒从细胞提取总RNA。测量RNA浓度，并使用RT-第一链试剂盒将1ug RNA逆转录为cDNA。然后，实验各自的引物和Power SYBR Green PCR Master Mix扩增cDNA。通过ABI7500实时PCR系统检测扩增子(150-200bp)。将所有目标基因归一化为GAPDH，并计算相对变化倍数。每个样品重复评价三次。
如图50所示，化合物剂量依赖性地降低SSc成纤维细胞中COL1、aSMA和FN mRNA的表达。类似地，化合物还剂量依赖性地降低了SSc成纤维细胞中的PAI(图51)和Dnmt1(图52)的表达。还如图51中所示，化合物剂量依赖性地提高了SSc成纤维细胞中MMP-1的表达。结果表明化合物有效地调节了关键的纤维化因子，这表明了化合物在SSc治疗中的效力。
另外，检查了正常和SSc成纤维细胞以及皮组织中的cereblon水平。如图53和54中所示，与正常组织相比，在SSc成纤维细胞和皮组织中观察到了较高水平的cereblon。这表明在SSc中涉及cereblon水平的升高。
8.11 实施例11：将CEREBLON靶向B细胞体液不调
测量了(S)-3-[4-(4-吗啉-4-基甲基苄氧基)-1-氧-1,3-二氢-异吲哚-2-基]哌啶-2,6-二酮(“化合物IA”)对CRBN结合、泛素化和细胞增殖的影响。CRBN是包括CUL4A、DDB1和ROC-1的E3泛素连接酶复合物的组分，并且发现它是沙利度胺、来那度胺和泊马度胺的分子结合靶标。
在竞争性测定中，使用沙利度胺类似物-结合珠进行了CRBN的结合研究。通过将细胞提取物与不同浓度的化合物IA或作为阳性对照的泊马度胺一起孵育来测量来自人U266多发性骨髓瘤(“MM”)细胞的内源CRBN。在彻底清洗珠后，将与沙利度胺酸性类似物偶联的亲合珠与U266提取物一起孵育，然后洗脱结合的蛋白。通过定量CRBN免疫印迹测定法确定结合至沙利度胺-偶联的亲合珠的CRBN。
在用氨基末端His-生物素-标记的CRBN构件转染，然后与化合物预孵育1小时，并随后用MG132蛋白酶体抑制剂处理(以阻止泛素化蛋白的降解)的HEK293T细胞中测量CRBN泛素化。将细胞裂解和处理以通过使用抗泛素抗体的SDS-PAGE和免疫印迹法分析测量CRBN泛素化。在来那度胺敏感性和难治性多发性骨髓瘤细胞中进行细胞增殖研究。用化合物IA处理抗来那度胺或来那度胺敏感性H929MM细胞系5天，然后通过7-氨基放线菌素D(“7-ADD”)染色评价细胞增殖和存活力。在使用固定化抗CD3抗体在细胞培养中刺激2天的纯化的原代人T细胞中测量T细胞共同刺激，并通过ELISA测量细胞因子分泌。
通过在存在B细胞分化因子重组人IL-2(20U/mL)、IL-10(50ng/mL)、IL-15(10ng/mL)、His-标记的CD40配体(50ng/mL)、多组氨酸小鼠IgG1抗体(5μg/mL)和ODN 2006-人TLR9配体(10μg/mL)的情况下培养4天，然后在存在IL-2、IL-10、IL-15和IL-6(50ng/mL)的情况下另外培养3天，从正常供体周围血单核细胞计算免疫球蛋白M和G(“IgG和IgM”)的产生。通过ELISA测量IgM和IgG。
在竞争性CRBN结合研究中，与浓度为3uM的泊马度胺预孵育导致与亲合珠结合的CRBN减少了约50％，同时0.1μM浓度的化合物IA导致了类似的CRBN结合。转染的HEK293T细胞中CRBN泛素化研究导致产生了以下效力：化合物IA IC50＝0.19μM；来那度胺IC50＝12.9μM；和泊马度胺IC50＝21.6μM。化合物IA的增殖抑制IC50值从亲本H929细胞系中的0.01μM和DMSO处理的亚克隆中的0.04μM改变至抗来那度胺的亚克隆中的0.51-1.58μM。
用化合物IA处理H929细胞24小时后，细胞周期(S期)中50％的减少是明显的。在48小时，化合物IA降低了生存素和成视网膜细胞瘤蛋白(“pRB”)的表达，并且提高了细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂p27的表达。与泊马度胺的10nM相比，化合物IA共刺激的T细胞的IL-2产生的EC50为约0.29nM。化合物IA抑制IgM和IgG的产生，与泊马度胺的17nM和63nM相比，其IC50分别为0.35和2.1nM。
结果表明在该系统中化合物IA结合至CRBN的亲合力比泊马度胺高约30倍，并且抑制CRBN泛素化的效力比泊马度胺大约110倍。对于共刺激通过T细胞的IL-2产生，化合物IA比泊马度胺有效约34倍，并且对于抑制免疫球蛋白的产生，比泊马度胺有效30至48倍。
8.12 实施例12：B细胞向浆母细胞和浆细胞系分化的抑制
对于cereblon(“CRBN”)靶标对B细胞向浆母细胞和浆细胞系的分化的影响，开发了体外原代人B细胞分化模型。
将来自正常供体的CD19+周围血液人B细胞和系统性红斑狼疮(“SLE”)患者的总周围血单核细胞在存在白介素(“IL”)-2、IL-10、IL15、TLR9激动剂和CD40L的情况下培养4天，然后在存在IL-2、IL-6、IL-10和IL-15的情况下培养另外3天。对细胞计数，评价存活力，并通过流式细胞术测量CD20、CD38、CD44和CD83的表达。通过qRT-PCR测量浆母细胞系因子IRF-4、BLIMP-1、XBP-1和IgJ以及生发中心标志物PAX-5和BCL-6。通过激光扫描细胞术测量胞内蛋白表达。通过ELISA测量分泌的免疫球蛋白IgG和IgM。
在正常B细胞培养中，20nM或200nM化合物I-S时，4天后，(S)-3-(4-((4-吗啉代甲基)苄基)氧)-1-氧代异二氢吲哚-2-基)哌啶-2,6-二酮分别将这些培养中的总活细胞百分比降低至对照的69.6％(p≤0.05)或35.8％(p≤0.001)。在第7天，化合物I-S将活的CD20-CD38+浆母细胞的百分比从对照培养中的30.4％以剂量依赖的方式分别降低至2nM、20nM和200nM的27.3％、2.1％和0.4％。在第7天，qRT-PCR分析显示化合物I-S(20nM)分别将浆母细胞系因子IRF-4、BLIMP-1、XBP-1和IgJ基因表达降低至对照的20.5％、14.3％、15.1％和31.5％(P≤0.001)。
通过胞内流式细胞术，化合物I-S(20nM)显著降低了第4天时IRF-4(P<0.5)、BLIMP-1(P<0.05)和XBP-1(P<0.05)的蛋白表达，但是显著提高了第7天时BCL-6(P<0.05)的蛋白表达。通过激光扫描细胞术，在第7天时，化合物I-S(20nM)降低了IRF-4(P≤0.001)和BLIMP-1(P≤0.001)的CD38+细胞胞内蛋白表达，并且提高了BCL-6的表达(P≤0.05)(n＝3)。化合物I-S抑制分泌的IgG的产生，其IC50＝1.8nM(n＝3)。
在来自SLE患者的PBMC中，化合物I-S(20nM)具有与正常B细胞中类似的作用，其分别将BLIMP-1、XBP-1和IgJ的基因表达降低至对照的52.8％、49.2％和13.6％(P≤0.001)(n＝3)。化合物I-S(20nM)显著降低了CD38+浆母细胞胞内蛋白BLIMP-1(P≤0.01)和IRF-4(P≤0.001)的表达，并且提高了BCL-6(P≤0.05)的表达(n＝3)。化合物I-S抑制SLE患者PBMC的分泌的IgM和IgG产生，其IC50分别为0.9nM和3.2nM(n＝3)。
这些结果表明用小分子免疫调节化合物化合物I-S靶向E3泛素连接酶复合物底物共受体CRBN导致有效抑制了B细胞向浆母细胞系的分化，如通过活的CD38+细胞的百分比的减少、BLIMP-1、XBP-1、IRF-4和IgJ基因和蛋白质表达的减少以及分泌的免疫球蛋白产生的抑制所示。这些数据表明在B细胞向浆细胞系的分化中存在CUL4-CRBN的复合物。
本发明未受限于本文所述的具体实施方式的范围。事实上，除所述那些以外，通过上述说明和附图，本发明的多种改变将对本领域技术人员是显而易见的。意在这些改变包括在所附权利要求的范围内。
在本文中引用了多篇出版物、专利和专利申请，以上出版物、专利和专利申请的公开内容以其全部内容并入本文作为参考。

Claims (29)

1.用于治疗、预防或控制免疫相关疾病或炎性疾病的方法，包括向对其有需要的患者施用有效量的式I的化合物
或其可药用盐、溶剂化物、水合物、立体异构体、互变异构体或外消旋混合物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述化合物为(S)-3-[4-(4-吗啉-4-基甲基苄氧基)-1-氧-1,3-二氢-异吲哚-2-基]哌啶-2,6-二酮或其可药用盐、固体形式、溶剂化物、水合物、互变异构体、立体异构体或外消旋物。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述化合物为(S)-3-[4-(4-吗啉-4-基甲基苄氧基)-1-氧-1,3-二氢-异吲哚-2-基]哌啶-2,6-二酮。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述化合物为(S)-3-[4-(4-吗啉-4-基甲基苄氧基)-1-氧-1,3-二氢-异吲哚-2-基]哌啶-2,6-二酮盐酸盐。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中，所述疾病为系统性红斑狼疮、硬皮病、冻疮样狼疮、结节病、干燥综合征、ANCA-诱导的血管炎、抗磷脂综合征或重症肌无力。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中，所述疾病为系统性红斑狼疮。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中，所述疾病为重症系统性红斑狼疮。
8.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中，所述疾病为硬皮病。
9.根据权利要求8所述的方法，其中，所述硬皮病为局灶性硬皮病、系统性硬皮病、局限性硬皮病或弥漫性硬皮病。
10.根据权利要求9所述的方法，其中，所述系统性硬皮病包括CREST综合征。
11.用于减少、抑制或预防系统性红斑狼疮的症状的方法，包括向患有系统性红斑狼疮的症状的患者施用有效量的化合物，其中，所述症状选自：关节疼痛、关节肿胀、关节炎、深呼吸时胸部疼痛、疲劳、无其他原因的发烧、全身不适、不安、脱发、口疮、淋巴结肿大、对日光敏感、皮疹、头痛、麻木、刺痛、癫痫发作、视力问题、人格改变、腹痛、恶心、呕吐、心律异常、咳血和呼吸困难、肤色有斑和雷诺氏现象，并且其中所述化合物对应于式I
或其可药用盐、溶剂化物、水合物、立体异构体、互变异构体或外消旋混合物。
12.用于减少、抑制或预防硬皮病的症状的方法，包括向患有硬皮病的症状的患者施用有效量的化合物，其中所述症状选自：(i)皮肤逐渐硬化、增厚和紧绷；(ii)皮肤变色；(iii)四肢麻木；(iv)皮肤发亮；(v)皮肤表面下，喷发垩白液体的白色小肿块；(vi)雷诺氏食道功能障碍；(vii)毛细血管扩张；(viii)关节疼痛和/或僵硬；(ix)手部和足部肿胀；(x)皮肤瘙痒；(xi)指部僵硬和弯曲；(xii)某些关节外部(如，指节和肘部)上有溃疡；(xiii)消化问题，如心口灼热、吞咽困难、腹泻、肠易激和便秘；(xiv)疲劳和虚弱；(xv)气短；(xvi)关节炎；(xvii)脱发；(xviii)内脏问题；(xix)指部溃疡；以及(xx)指部自动断离，并且其中所述化合物对应于式I
或其可药用盐、溶剂化物、水合物、立体异构体、互变异构体或外消旋混合物。
13.用于改善硬皮病患者的改良的Rodnan皮肤评分、减小或改善其皮肤厚度、减小或改善其皮肤硬结、改善其肺功能、改善其皮肤病生活质量指数、改善其一氧化碳扩散能力、改善其Mahler呼吸困难指数、改善其圣乔治呼吸系统疾病问卷评分、改善其UCLA硬皮病临床试验聚生体胃肠道评分、改善其流量调节的扩张或改善或延长其六分钟步行距离的方法，包括向所述患者施用有效量的具有下式的化合物I：
或其可药用盐、溶剂化物、水合物、立体异构体、互变异构体或外消旋混合物。
14.根据权利要求11-13中任一项所述的方法，其中，所述化合物为(S)-3-[4-(4-吗啉-4-基甲基苄氧基)-1-氧-1,3-二氢-异吲哚-2-基]哌啶-2,6-二酮或其可药用盐、固体形式、溶剂化物、水合物、互变异构体、立体异构体或外消旋物。
15.根据权利要求11-13中任一项所述的方法，其中，所述化合物为(S)-3-[4-(4-吗啉-4-基甲基苄氧基)-1-氧-1,3-二氢-异吲哚-2-基]哌啶-2,6-二酮。
16.根据权利要求11-13中任一项所述的方法，其中，所述化合物为(S)-3-[4-(4-吗啉-4-基甲基苄氧基)-1-氧-1,3-二氢-异吲哚-2-基]哌啶-2,6-二酮盐酸盐。
17.根据权利要求1-16中任一项所述的方法，还包括施用第二活性剂，所述第二活性剂为抗炎化合物或免疫调节化合物。
18.根据权利要求1-17中任一项所述的方法，其中，所述有效量为约0.005mg/kg至约10mg/kg患者体重。
19.用于调节B细胞活性的方法，包括使所述细胞与有效量的(S)-3-[4-(4-吗啉-4-基甲基苄氧基)-1-氧-1,3-二氢-异吲哚-2-基]哌啶-2,6-二酮或其可药用盐、固体形式、溶剂化物、水合物、互变异构体、立体异构体或外消旋物接触。
20.用于调节T细胞活性的方法，包括使所述细胞与有效量的(S)-3-[4-(4-吗啉-4-基甲基苄氧基)-1-氧-1,3-二氢-异吲哚-2-基]哌啶-2,6-二酮或其可药用盐、固体形式、溶剂化物、水合物、互变异构体、立体异构体或外消旋物接触。
21.鉴别可能对使用治疗化合物治疗疾病、病症或病况有反应的受试者的方法，包括：
a)确定来自所述受试者的生物样品中生物标志物的水平，其中所述生物标志物为CD44、CD83或其组合；和
b)将来自所述受试者的生物样品中生物标志物的水平与所述生物标志物的参比水平相比较；
其中，如果与所述生物标志物的参比水平相比，来自所述受试者的生物样品中生物标志物的水平发生改变，则所述受试者可能对所述治疗有反应。
22.鉴别可能对使用治疗化合物治疗疾病、病症或病况有反应的受试者的方法，包括：
a)确定来自所述受试者的生物样品中生物标志物的水平，其中所述生物标志物为CD44、CD83或其组合；
b)确定对照样品中生物标志物的水平；和
c)将来自所述受试者的生物样品中生物标志物的水平与对照样品中生物标志物的水平相比较；
其中，如果与对照样品中生物标志物的水平相比，来自所述受试者的生物样品中生物标志物的水平发生改变，则所述受试者可能对所述治疗有反应。
23.预测受试者对使用治疗化合物治疗疾病、病症或病况的反应的方法，包括：
a)确定来自所述受试者的生物样品中生物标志物的水平，其中所述生物标志物为CD44、CD83或其组合；和
b)将所述生物样品中生物标志物的水平与所述生物标志物的参比水平相比较；
其中，来自所述受试者的生物样品中生物标志物的水平与所述生物标志物的参比水平之间的差异与所述受试者对所述治疗的反应相关。
24.预测受试者对使用治疗化合物治疗疾病、病症或病况的反应的方法，包括：
a)确定来自所述受试者的生物样品中生物标志物的水平，其中所述生物标志物为CD44、CD83或其组合；
b)确定对照样品中生物标志物的水平；和
c)将来自所述受试者的生物样品中生物标志物的水平与所述对照样品中生物标志物的水平相比较；
其中，来自所述受试者的生物样品中生物标志物的水平与所述对照样品中生物标志物的水平之间的差异与所述受试者对所述治疗的反应相关。
25.监控使用治疗化合物治疗的受试者中疾病、病症或病况的治疗效力的方法，包括：
a)从所述受试者获得第一生物样品；
b)确定所述第一生物样品中生物标志物的水平，其中所述生物标志物为CD44、CD83或其组合；
c)向所述受试者施用所述治疗化合物；
d)此后，从所述受试者获得第二生物样品；
e)确定所述第二生物样品中生物标志物的水平，和
f)将所述第一和第二生物样品中生物标志物的水平相比较；
其中，如果与所述受试者的所述第一生物样品中生物标志物的水平相比，所述受试者的所述第二生物样品中生物标志物的水平发生改变，则所述受试者对所述治疗有反应。
26.监控受试者对使用治疗化合物治疗疾病、病症或病况的依从性的方法，包括：
a)从所述受试者获得生物样品；
b)确定所述生物样品中生物标志物的水平，其中所述生物标志物为CD44、CD83或其组合；和
c)将所述生物标志物的水平与来自所述受试者的对照未处理的样品中生物标志物的水平相比较；
其中，与所述对照样品中生物标志物的水平相比，所述生物样品中生物标志物的水平的变化表明所述受试者对所述治疗的依从性。
27.根据权利要求21至36中任一项所述的方法，其中，所述治疗化合物为免疫调节化合物。
28.根据权利要求27所述的方法，其中，所述治疗化合物为(S)-3-(4-((4-(吗啉代甲基)苄基)氧基)-1-氧代异二氢吲哚-2-基)哌啶-2,6-二酮。
29.根据权利要求28所述的方法，其中，所述治疗化合物为(S)-3-(4-((4-(吗啉代甲基)苄基)氧基)-1-氧代异二氢吲哚-2-基)哌啶-2,6-二酮。
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