CN103797131A - 生物标志物组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

可以评估生物标志物用于诊断、治疗相关或预后方法以鉴定表型，如病症或疾病，或者疾病的阶段或进程，选择用于疾病、病症、疾病阶段和病症阶段的候选治疗方案，并且用于确定治疗效果。来自体液的循环生物标志物可以用于生理状态的分型或确定表型。这些包括核酸、蛋白质和循环结构，如囊泡，以及核酸-蛋白质复合物。

Description

生物标志物组合物和方法
交叉参考
本申请要求2011年6月16日提交的美国临时专利申请No.61/497,895；2011年6月20日提交的No.61/499,138；2011年6月27日提交的No.61/501,680；2011年7月8日提交的No.61/506,019；2011年7月11日提交的No.61/506,606；2011年7月11日提交的No.61/506,598；2011年7月14日提交的No.61/507,989；2011年7月25日提交的No.61/511,455；2011年8月15日提交的No.61/523,763；和2011年8月23日提交的No.61/526,623的权益；将该申请全部按引用并入本文中作为参考。
本申请是2012年6月7日提交的国际专利申请PCT/US2012/041387的部分继续，该国际专利申请要求2011年6月7日提交的美国临时专利申请No.61/494,196；2011年6月7日提交的No.61/494,355；和2011年7月14日提交的No.61/507,989的权益；将该申请全部按引用并入本文中作为参考。
本申请还是2012年2月17日提交的国际专利申请PCT/US2012/025741的部分继续，该国际专利申请要求美国临时专利申请2011年2月24日提交的No.61/446,313；2011年6月27日提交的No.61/501,680；2011年4月4日提交的No.61/471，417；2011年8月15日提交的No.61/523,763；和2011年2月22日提交的No.61/445,273的权益；将该申请全部按引用并入本文中作为参考。
本申请还是2011年8月18日提交的国际专利申请PCT/US2011/048327的部分继续，该国际专利申请要求美国临时专利申请2010年8月18日提交的No.61/374,951；2010年9月2日提交的No.61/379,670；2010年9月9日提交的No.61/381,305；2010年9月15日提交的No.61/383，305；2010年10月8日提交的No.61/391,504；2010年10月15日提交的No.61/393,823；2010年11月9日提交的No.61/411,890；2010年11月17日提交的No.61/414,870；2010年11月23日提交的No.61/416,560；2010年12月10日提交的No.61/421,851；2010年12月15日提交的No.61/423,557；2010年12月29日提交的No.61/428,196的权益；将该申请全部按引用并入本文中作为参考。
本申请还是2011年3月1日提交的国际专利申请PCT/US2011/026750的部分继续，该申请声称是2009年11月12日提交的美国专利申请系列No.12/591,226的部分继续申请，其要求美国临时申请2008年11月12日提交的No.61/114,045；2008年11月12日提交的No.61/114,058；2008年11月13日提交的No.61/114,065；2009年2月9日提交的No.61/151，183；2009年10月2日提交的No.61/278,049；2009年10月9日提交的No.61/250,454；和2009年10月19日提交的No.61/253,027的权益；并且该申请还要求美国临时申请2010年3月1日提交的No.61/274,124；2010年6月22日提交的No.61/357,517；2010年7月15日提交的No.61/364,785的权益；将所有申请全部按引用并入本文中作为参考。
本申请还是2011年4月6日提交的国际专利申请PCT/US2011/031479的部分继续，该国际专利申请要求美国临时专利申请2010年4月6日提交的No.61/321,392；2010年4月6日提交的No.61/321,407；2010年5月6日提交的No.61/332,174；2010年5月25日提交的No.61/348,214；2010年5月26日提交的No.61/348,685；2010年6月11日提交的No.61/354,125；2010年6月16日提交的No.61/355,387；2010年6月21日提交的No.61/356,974；2010年6月22日提交的No.61/357,517；2010年7月8日提交的No.61/362,674；2010年11月12日提交的No.61/413,377；2010年4月9日提交的No.61/322,690；2010年5月13日提交的No.61/334,547；2010年7月15日提交的No.61/364,785；2010年8月2日提交的No.61/370,088；2010年9月2日提交的No.61/379,670；2010年9月9日提交的No.61/381,305；2010年9月15日提交的No.61/383,305；2010年10月8日提交的No.61/391,504；2010年10月15日提交的No.61/393,823；2010年11月9日提交的No.61/411,890和2010年11月23日提交的No.61/416,560的权益；将所有申请全部按引用并入本文中作为参考。
发明背景
用于诸如癌症的状况和疾病的生物标志物包括生物分子，如蛋白质、肽、脂质、RNA、DNA和它们的变体及修饰。
特定生物标志物(例如DNA、RNA和蛋白质)的鉴定可以提供用于诊断、预后或治疗诊断(theranosis)状况或疾病的生物印记。生物标志物可在体液中检测，包括循环DNA、RNA、蛋白质和囊泡。循环生物标志物包括蛋白质(诸如PSA和CA125)以及核酸(诸如SEPT9DNA和PCA3信使RNA(mRNA))。循环生物标志物可以与循环囊泡相关。囊泡是从细胞上脱落的膜包封的结构，并且可见于多种体液中，包括血液、血浆、血清、乳汁、腹水、支气管肺泡灌洗液和尿液。囊泡可作为蛋白质、RNA、DNA、病毒和朊病毒的运送载体而参与细胞之间的通讯。微RNA是调控信使RNA转录和降解的短RNA。微RNA已经在体液中发现并且已经观察到其作为从肿瘤细胞上脱落的囊泡内的组分。对与疾病相关的循环生物标志物(包括囊泡和/或微RNA)的分析可有助于检测疾病或其严重程度、确定疾病的易感性以及进行治疗决策。
生物样品中存在的囊泡提供了生物标志物的来源，例如，所述标志物存在于囊泡内(囊泡有效负载)或存在于囊泡的表面上。囊泡的特征(例如尺寸、表面抗原、细胞源的确定、有效负载)还可提供诊断、预后或治疗诊断的结果输出。仍然存在对可用于检测和治疗疾病的生物标志物进行鉴定的需求。与囊泡相关的微RNA、蛋白质和其它生物标志物以及囊泡的特征可提供诊断、预后或治疗诊断。
本发明提供了用于通过检测作为疾病或疾病进展的指征的生物标志物而表征表型的方法和系统。所述生物标志物可以是循环生物标志物，包括但不限于囊泡标志物、蛋白质、核酸、mRNA或/和微RNA。生物标志物可以是核酸-蛋白质复合物。
发明概述
本文公开了用于通过分析循环生物标志物(诸如生物样品中存在的囊泡、微RNA或蛋白质)来表征表型的方法和组合物。表征受试者或个体的表型可以包括但不限于疾病或状况的诊断、疾病或状况的预后、疾病阶段或状况阶段的确定、药物效力、生理状况、器官危困或器官排斥、疾病或状况进展、与疾病或状况的治疗相关关联性或者特定的生理或生物状态。
在一个方面中，本发明提供了鉴定生物印记的方法，其包括：(a)测定生物样品中一种或多种生物标志物的存在或水平，其中所述一种或多种生物标志物包含选自表5的一种或多种生物标志物；和(b)鉴定包括所述一种或多种生物标志物的存在或水平的生物印记。该方法可以进一步包括将所述生物印记与参照生物印记相比较，其中将该比较用于表征癌症。所述参照生物印记可以来自未患癌症的受试者。参照生物印记可以来自该受试者。例如，参照生物印记可以来自受试者的非恶性样品，如正常的邻近组织，或在一段时间过程中取自受试者的不同样品。表征可以包括鉴定受试者中癌症的存在或风险，或鉴定受试者中的癌症是转移性的或侵袭性的。所述比较步骤可以包括确定生物印记是否相对于参照生物印记有所改变，由此提供癌症的预后、诊断或治疗诊断确定。
在一些实施方案中，所述一种或多种生物标志物选自miR-22、let7a、miR-141、miR-182、miR-663、miR-155、mirR-125a-5p、miR-548a-5p、miR-628-5p、miR-517*、miR-450a、miR-920、hsa-miR-619、miR-1913、miR-224*、miR-502-5p、miR-888、miR-376a、miR-542-5p、miR-30b*、miR-1179及其组合。例如，所述一种或多种生物标志物可以选自miR-22、let7a、miR-141、miR-920、miR-450a及其组合。所述生物印记可以用于表征前列腺癌。
在其他实施方案中，所述一种或多种生物标志物包括选自由表20-24任一中的基因组成的组的信使RNA(mRNA)及其组合。例如，所述一种或多种生物标志物可以包括选自A2ML1、BAX、C10orf47、Clort162、CSDA、EIFC3、ETFB、GABARAPL2、GUK1、GZMH、HIST1H3B、HLA-A、HSP90AA1、NRGN、PRDX5、PTMA、RABAC1、RABAGAP1L、RPL22、SAP18、SEPW1、SOX1及其组合的mRNA。所述一种或多种生物标志物还可以选自A2ML1、GABARAPL2、PTMA、RABAC1、SOX1、EFTB及其组合。所述生物印记可以用于表征前列腺癌。
所述一种或多种生物标志物可以选自CA-125、CA19-9、c-反应蛋白、CD95、FAP-1、EGFR、EGFRvIII、阿朴脂蛋白AI、阿朴脂蛋白CIII、肌红蛋白、腱生蛋白C、MSH6、封闭蛋白(claudin)-3、封闭蛋白-4、小窝蛋白-1、凝血因子III、CD9、CD36、CD37、CD53、CD63、CD81、CD136、CD147、Hsp70、Hsp90、Rab13、桥粒芯胶蛋白(Desmocollin)-1、EMP-2、CK7、CK20、GCDF15、CD82、Rab-5b、膜联蛋白V、MFG-E8、HLA-DR、miR200微RNA、miR-200c及其组合。例如，所述一种或多种生物标志物选自CA-125、CA19-9、c-反应蛋白、CD95、FAP-1及其组合。所述生物印记可以用于表征卵巢癌。
在一些实施方案中，所述一种或多种生物标志物选自hsa-miR-574-3p、hsa-miR-141、hsa-miR-432、hsa-miR-326、hsa-miR-2110、hsa-miR-181a-2*、hsa-miR-107、hsa-miR-301a、hsa-miR-484、hsa-miR-625*及其组合。所述生物印记可以用于表征前列腺癌，如用于检测前列腺癌的存在。所述一种或多种生物标志物还可以选自hsa-miR-582-3p、hsa-miR-20a*、hsa-miR-375、hsa-miR-200b、hsa-miR-379、hsa-miR-572、hsa-miR-513a-5p、hsa-miR-577、hsa-miR-23a*、hsa-miR-1236、hsa-miR-609、hsa-miR-17*、hsa-miR-130b、hsa-miR-619、hsa-miR-624*、hsa-miR-198及其组合。所述生物印记可以用于表征前列腺癌，如用于区分转移性和非转移性前列腺癌。
在另一个实施方案中，所述一种或多种生物标志物包括miR-497及其组合。所述生物印记可以用于表征肺癌。
所述一种或多种生物标志物可以是选自由AQP2、BMP5、C16orf86、CXCT13、DST、ERCC1、GNAO1、KIHL5、MA P4K1、NELL2、PENK、PGF、POU3F1、PRSS21、SCML1、SEMGG1、SMAKCD3、SNAI2、TAF1C、TNNT3及其组合组成的组的信使RNA(mRNA)。所述生物印记可以用于表征前列腺癌，如用于区分前列腺癌与非癌样品。
在一些实施方案中，所述一种或多种生物标志物包括选自由ADRB2、ARG2、C22orf32、CYorf14、EIF1AY、FEV、KLK2、KLK4、LRRC26、MAOA、NLGN4Y、PNPLA7、PVRL3、SIM2、SLC30A4、SLC45A3、STX19、TRIM36、TRPM8及其组合组成的组的信使RNA(mRNA)。所述生物印记可以用于表征前列腺癌，如用于区分前列腺癌与非前列腺癌样品，如乳腺癌样品。
在其他实施方案中，一种或多种生物标志物包括选自由ADRB2、BAIAP2L2、C19orf33、CDX1、CEACAM6、EEF1A2、ERN2、FAM110B、FOXA2、KLK2、KLK4、LOC389816、LRRC26、MIPOL1、SLC45A3、SPDEF、TRIM31、TRIM36、ZNF613及其组合组成的组的信使RNA(mRNA)。所述生物印记可以用于表征前列腺癌，如用于区分前列腺癌与非前列腺癌样品，如结肠直肠癌样品。
在再其他的实施方案中，一种或多种生物标志物包括选自由ASTN2、CAB39L、CRIP1、FAM110B、FEV、GSTP1、KLK2、KLK4、LOC389816、LRRC26、MUC1、PNPLA7、SIM2、SLC45A3、SPDEF、TRIM36、TRPV6、ZNF613及其组合组成的组的信使RNA(mRNA)。所述生物印记可以用于表征前列腺癌，如用于区分前列腺癌与非前列腺癌样品，如肺癌样品。
所述一种或多种生物标志物还可以是识别以上mRNA之一的微RNA。例如，微RNA可以选自miRs-26a＋b、miR-15、miR-16、miR-195、miR-497、miR-424、miR-206、miR-342-5p、miR-186、miR-1271、miR-600、miR-216b、miR-519家族、miR-203及其组合。
在另一个方面中，本发明提供了一种方法，其包括：(a)从生物样品分离一种或多种核酸-蛋白质复合物；(b)用所述一种或多种核酸-蛋白质复合物测定一种或多种核酸生物标志物的存在或水平；和(c)鉴定包括所述一种或多种核酸生物标志物的存在或水平的生物印记。所述方法可以进一步包括将所述生物印记与参照生物印记相比较，其中所述比较用于表征癌症。参照生物印记可以来自未患癌症的受试者。参照生物印记可以来自该受试者。例如，所述参照生物印记可以来自受试者的非恶性样品，如正常的邻近组织，或在一段时间过程中取自受试者的不同样品。所述表征可以包括鉴定受试者中癌症的存在或风险，或鉴定受试者中的癌症是转移性的或侵袭性的。所述比较步骤可以包括确定生物印记相对于参照生物印记是否有所改变，由此提供用于癌症的预后、诊断或治疗诊断确定。
所述核酸-蛋白质复合物可以包含选自一种或多种Argonaute家族成员、Ago1、Ago2、Ago3、Ago4、GW182(TNRC6A)、TNRC6B、TNRC6C、HNRNPA2B1、HNRPAB、ILF2、NCL(核仁素)、NPM1(核磷蛋白)、RPL10A、RPL5、RPLP1、RPS12、RPS19、SNRPG、TROVE2、阿朴脂蛋白、阿朴脂蛋白A、apo A-I、apo A-II、apo A-IV、apo A-V、阿朴脂蛋白B、apo B48、apo B100、阿朴脂蛋白C、apo C-I、apo C-II、apoC-III、apo C-IV、阿朴脂蛋白D(ApoD)、阿朴脂蛋白E(ApoE)、阿朴脂蛋白H(ApoH)、阿朴脂蛋白L、APOL1、APOL2、APOL3、APOL4、APOL5、APOL6、APOLD1及其组合的一种或多种蛋白质。例如，所述一种或多种蛋白质可以选自一种或多种Argonaute家族成员、Ago1、Ago2、Ago3、Ago4、GW182(TNRC6A)及其组合。一种或多种蛋白质还可以选自Ago2、阿朴脂蛋白I、GW182(TNRC6A)及其组合。
所述核酸-蛋白质复合物可以包含一种或多种微RNA。在一个实施方案中，一种或多种微RNA可以是表5中的一种或多种微RNA。例如，所述一种或多种微RNA可以选自miR-22、miR-16、miR-148a、miR-92a、miR-451、let7a及其组合。在一个实施方案中，所述核酸-蛋白质复合物包含一种或多种选自Ago2、阿朴脂蛋白I、GW182(TNRC6A)及其组合的蛋白质；并且所述一种或多种微RNA包括选自miR-16和miR-92a及其组合的一种或多种微RNA。所述生物印记可以用于表征前列腺癌，如用于区分前列腺癌与非癌样品。
在再另一个方面，本发明提供了一种方法，其包括：(a)检测来自生物样品的微囊泡群体中的一种或多种蛋白质生物标志物；(b)确定与所检测的微囊泡群体相关的一种或多种核酸生物标志物的存在或水平；和(c)鉴定包括所述一种或多种核酸的存在或水平的生物印记。例如，所述一种或多种核酸生物标志物的水平可以相对于所述一种或多种蛋白质生物标志物的水平标准化。所述方法可以进一步包括将所述生物印记与参照生物印记相比较，其中所述比较用于表征癌症。所述参照生物印记可以来自未患癌症的受试者。所述参照生物印记可以来自该受试者。例如，所述参照生物印记可以来自受试者的非恶性样品，如正常的邻近组织，或在一段时间过程中取自受试者的不同样品。所述表征可以包括鉴定受试者中癌症的存在或风险，或鉴定受试者中癌症是转移性的或侵袭性的。所述比较步骤可以包括确定生物印记是否相对于参照生物印记有改变，由此提供用于癌症的预后、诊断或治疗诊断确定。
在一个实施方案中，所述一种或多种蛋白质生物标志物包括选自PCSA、Ago2、CD9及其组合的一种或多种蛋白质。所述一种或多种核酸生物标志物可以是选自miR-22、miR-16、miR-148a、miR-92a、miR-451、let7a及其组合的一种或多种微RNA。例如，所述一种或多种蛋白质生物标志物可以包括PCSA和Ago2；并且所述一种或多种核酸生物标志物可以包括miR-22。作为另一个实例，所述一种或多种蛋白质生物标志物可以包括PCSA和/或CD9；并且所述一种或多种核酸生物标志物可以包括miR-22。在另一个实施方案中，所述一种或多种蛋白质生物标志物包括PCSA；并且所述一种或多种核酸生物标志物包括选自表22-24的信使RNA(mRNA)。所述生物印记可以用于表征前列腺癌，如用于区分前列腺癌与非癌样品。
所述生物印记可以包括从一种或多种蛋白质生物标志物和一种或多种核酸生物标志物的水平的比例计算的评分。在一个实施方案中，所述一种或多种蛋白质生物标志物包括PCSA和PSMA，并且一种或多种核酸生物标志物包括miR-22和let7a。在这种情况中，计算评分可以包括取以下的总和：(a)微囊泡亚群中的miR-22有效负载的水平除以与微囊泡亚群相关的PCSA蛋白的水平的第一倍数；(b)微囊泡亚群中let7a有效负载的水平除以与微囊泡亚群相关的PCSA蛋白的水平的第二倍数；和(c)与微囊泡亚群相关的PSMA蛋白的水平的第三倍数。可以选择所述第一、第二和第三倍数来优化确定生物印记。在一个实施方案中，第一倍数和第二倍数可以都是10。第三倍数可以是1。
在所述系统的方法的实施方案中，所述生物样品包括体液。合适的体液不限于外周血、血清、血浆、腹水、尿液、脑脊液(CSF)、痰、唾液、骨髓、滑液、房水、羊水、耳垢、乳汁、支气管肺泡灌洗液、精液、前列腺液、考珀液(cowper’s fluid)或预射精液、女性射出液、汗液、排泄物、毛发、泪液、囊液、胸腔积液和腹水液、心包液、淋巴、食物糜、乳糜、胆汁、间质液、经血、脓、皮脂、呕吐物、阴道分泌物、粘膜分泌物、稀便、胰液、鼻腔灌洗液、支气管抽吸液、囊胚腔液或脐带血。例如，生物样品可以包括尿液、血液或血液衍生物。
在所述系统的方法的一些实施方案中，所述生物样品包括组织样品、来自组织样品的细胞或从这些细胞释放的循环生物标志物。例如，可以进行本发明的方法来鉴定针对组织样品的生物印记。所述生物样品可以包括细胞培养物样品，例如，所述样品可以包括培养的细胞和/或包含从这些培养的细胞释放的循环生物标志物的培养基。所述组织样品或培养物样品可以是癌样品，或可以包括肿瘤样品或肿瘤细胞。
在本发明的方法中，生物样品可以含有一种或多种微囊泡。在一些实施方案中，一种或多种生物标志物与一种或多种微囊泡相关。一种或多种微囊泡可以具有10nm至2000nm的直径，例如，20nm至1500nm，20nm至1000nm，20nm至500nm，或20nm至200nm。
可以使用本文中公开的或本领域已知的方法从样品中分离一种或多种微囊泡。在实施方案中，一种或多种微囊泡经受尺寸排阻色谱、密度梯度离心、差速离心、纳米膜超滤、免疫吸附捕获、亲和纯化、亲和捕获、亲和选择、免疫分析、ELISA、微流体分离、流式细胞分析或其组合。
可以将一种或多种微囊泡接触一种或多种结合剂。在一些实施方案中，所述一种或多种结合剂包含核酸、DNA分子、RNA分子、抗体、抗体片段、适体、类肽、zDNA、肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA)、凝集素、肽、枝状物、膜蛋白标记剂、化学化合物或其组合。例如，结合剂可以是抗体或适体。一种或多种结合剂可以用于捕获和/或检测一种或多种微囊泡。在一个实施方案中，一种或多种结合剂结合一种或多种微囊泡上的一种或多种表面抗原。一种或多种表面抗原可以包含一种或多种蛋白质。
该一种或多种蛋白质可以是目标囊泡上的任何有用的生物标志物，如本文中公开的那些。在一个实施方案中，一种或多种蛋白质包括一种或多种细胞特异性或癌症特异性的囊泡标志物，例如，CD9、CD63、CD81、PSMA、PCSA、B7H3、EpCam或者表4或5中的蛋白质。一种或多种蛋白质还可以包括一般囊泡标志物，例如，四跨膜蛋白(tetraspanin)、CD9、CD63、CD81、CD63、CD9、CD81、CD82、CD37、CD52、Rab-5b、膜联蛋白V、MFG-E8或表3的蛋白质中的一种或多种。在一个实施方案中，一种或多种蛋白质包括表3-5任一中的一种或多种蛋白质。
一种或多种结合剂可以用于捕获一种或多种微囊泡。捕获的微囊泡可以用于进一步的评估。例如，可以评价微囊泡内的有效负载。微囊泡有效负载包括一种或多种核酸、肽、蛋白质、脂质、抗原、碳水化合物和/或蛋白聚糖。所述核酸可包含一种或多种DNA、mRNA、微RNA、snoRNA、snRNA、rRNA、tRNA、siRNA、hnRNA或shRNA。在一个实施方案中，一种或多种生物标志物包括一种或多种捕获的微囊泡内的有效负载。例如，一种或多种生物标志物可以包括mRNA有效负载。一种或多种生物标志物还可以包括微RNA有效负载。一种或多种生物标志物还可以包括蛋白质有效负载，例如，内膜蛋白质或可溶性蛋白质。
本发明的方法可以在体外进行，例如，使用体外生物样品或细胞培养物样品。
在进一步的实施方案中，所分析的癌症可以是肺癌，包括非小细胞肺癌和小细胞肺癌(包括小细胞癌(燕麦细胞癌)、混合小细胞/大细胞癌和复合性小细胞癌)、结肠癌、乳腺癌、前列腺癌、肝癌、胰癌(pancreascancer)、脑癌、肾癌、卵巢癌、胃癌(stomach cancer)、皮肤癌、骨癌、胃癌(gastric cancer)、乳腺癌、胰腺癌(pancreatic cancer)、胶质瘤、成胶质细胞瘤、肝细胞癌、乳头状肾癌、头颈鳞状上皮细胞癌、白血病、淋巴瘤、骨髓瘤或实体肿瘤。
在实施方案中，通过本发明方法表征的癌症包括急性成淋巴细胞性白血病；急性骨髓性白血病；肾上腺皮质癌；AIDS相关癌症；AIDS相关淋巴瘤；肛门癌；阑尾癌；星形细胞瘤；非典型畸胎样瘤/横纹肌样瘤；基底细胞癌；膀胱癌；脑干胶质瘤；脑肿瘤(包括脑干胶质瘤、中枢神经系统非典型畸胎样瘤/横纹肌样瘤、中枢神经系统胚胎性瘤、星形细胞瘤、颅咽管瘤、成室管膜母细胞瘤、室管膜瘤、髓母细胞瘤、髓上皮瘤、中度分化的松果体实质肿瘤、幕上原始神经外胚层肿瘤和成松果体细胞瘤)；乳腺癌；支气管肿瘤；伯基特氏淋巴瘤；原发部位不明的癌症；类癌瘤；原发部位不明的癌瘤；中枢神经系统非典型畸胎样瘤/横纹肌样瘤；中枢神经系统胚胎性肿瘤；宫颈癌；儿童期癌症；脊索瘤；慢性淋巴细胞性白血病；慢性骨髓性白血病；慢性骨髓增殖紊乱；结肠癌；结直肠癌；颅咽管瘤；皮肤T细胞淋巴瘤；内分泌胰岛细胞瘤；子宫内膜癌；成室管膜母细胞瘤；室管膜瘤；食管癌；成感觉神经细胞瘤(esthesioneuroblastoma)；尤文氏肉瘤；颅外生殖细胞瘤；性腺外生殖细胞肿瘤；肝外胆管癌；胆囊癌；胃的(胃)癌；胃肠道类癌肿瘤；胃肠道间质细胞瘤；胃肠道间质瘤(GIST)；妊娠滋养细胞肿瘤；神经胶质瘤；毛细胞白血病；头颈癌；心脏癌；霍奇金淋巴瘤；喉咽癌；眼内黑色素瘤；胰岛细胞瘤；卡波济氏肉瘤；肾癌；朗格汉斯细胞组织细胞增生症；喉癌；唇癌；肝癌；恶性纤维组织细胞瘤骨癌；髓母细胞瘤；髓上皮瘤；黑色素瘤；Merkel细胞癌；Merkel细胞皮肤癌；间皮瘤；隐匿原发性的转移性鳞状颈癌；口腔癌；多发性内分泌肿瘤综合征；多发性骨髓瘤；多发性骨髓瘤/浆细胞肿瘤；蕈样肉芽肿；骨髓发育异常综合征；骨髓增生性肿瘤；鼻腔癌；鼻咽癌；神经母细胞瘤；非霍奇金淋巴瘤；非黑色素瘤皮肤癌；非小细胞肺癌；口癌；口腔癌；口咽因癌；骨肉瘤；其它脑和脊髓肿瘤；卵巢癌；卵巢上皮癌；卵巢生殖细胞肿瘤；卵巢低恶性潜在肿瘤；胰腺癌；乳头状瘤病；副鼻窦癌；甲状旁腺癌；盆腔癌；阴茎癌；咽癌；中度分化的松果体实质肿瘤；成松果体细胞瘤；垂体瘤；浆细胞肿瘤/多发性骨髓瘤；胸膜肺母细胞瘤；原发性中枢神经系统(CNS)淋巴瘤；原发性肝细胞肝癌；前列腺癌；直肠癌；肾癌；肾细胞(肾)癌；肾细胞癌；呼吸道癌；视网膜母细胞瘤；横纹肌肉瘤；唾液腺癌症；Sézary综合征；小细胞肺癌；小肠癌；软组织肉瘤；鳞状细胞癌；鳞状颈癌；胃(胃的)癌；幕上原始神经外胚层肿瘤；T细胞淋巴瘤；睾丸癌；咽喉癌；胸腺癌；胸腺瘤；甲状腺癌；移行细胞癌；肾盂和输尿管的移行细胞癌；滋养细胞肿瘤；输尿管癌；尿道癌；子宫癌；子宫肉瘤；阴道癌；外阴癌；巨球蛋白血症；或Wilm’s肿瘤。例如，所述癌症可以是前列腺癌、肺癌、乳腺癌、结肠直肠癌或卵巢癌。
本发明的方法可以在体外进行，例如，使用体外生物样品或细胞培养物样品。
在一个方面中，本发明提供了进行本发明任一方法的试剂。在一个相关方面中，本发明提供了试剂盒，其包含进行本发明任一方法的试剂。试剂可以是结合剂，包括但不限于一种或多种生物标志物的抗体或适体。例如，试剂可以是能够结合表3-5、9-11、16-27、29或31-32任一个中的至少一种生物标志物的结合剂。在一些实施方案中，将结合剂直接标记或配置成进行间接标记。
在另一个方面中，本发明提供了分离的PCSA+囊泡。该囊泡可以含有有效负载，其包含一种或多种选自miR-22、let7a、miR-141、miR-182、miR-663、miR-155、mirR-125a-5p、miR-548a-5p、miR-628-5p、miR-517*、miR-450a、miR-920、hsa-miR-619、miR-1913、miR-224*、miR-502-5p、miR-888、miR-376a、miR-542-5p、miR-30b*、miR-1179及其组合的微RNA。该囊泡还可以含有有效负载，其包含选自表20-24任一个的一种或多种信使RNA(mRNA)。
在再另一个方面中，本发明提供了一种组合物，其包含：(a)寡核苷酸，其包含栓系于基质上的第一部分、与目标微RNA序列至少75％互补的第二部分和包含标记的第三部分，其中第二部分位于第一部分和第三部分之间；和(b)微RNA。基质可以是本文中公开的基质，例如，平面基质、柱或珠。在一些实施方案中，寡核苷酸的第二部分与目标微RNA序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％互补。寡核苷酸的第二部分可以与(b)中的微RNA至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％互补。
在一些实施方案中，寡核苷酸的第三部分是直接标记的。在其他实施方案中，寡核苷酸的第三部分是间接标记的。寡核苷酸的第三部分可以生物素化，例如，以促进包含抗生蛋白链菌素的标记(如抗生蛋白链菌素-phycoerytherin(PE)(SAPE))的结合。可以使用任何有用的标记。例如，寡核苷酸的第三部分可以包含荧光标记、放射性标记或酶标记。
在一个实施方案中，(b)中的微RNA是处于与蛋白质的复合物中。所述蛋白质可以选自Argonaute家族成员、Ago1、Ago2、Ago3、Ago4、GW182(TNRC6A)、TNRC6B、TNRC6C、HNRNPA2B1、HNRPAB、ILF2、NCL(核仁素)、NPM1(核磷蛋白)、RPL10A、RPL5、RPLP1、RPS12、RPS19、SNRPG、TROVE2、阿朴脂蛋白、阿朴脂蛋白A、apo A-I、apoA-II、apo A-IV、apo A-V、阿朴脂蛋白B、apo B48、apo B100、阿朴脂蛋白C、apo C-I、apo C-II、apo C-III、apo C-IV、阿朴脂蛋白D(ApoD)、阿朴脂蛋白E(ApoE)、阿朴脂蛋白H(ApoH)、阿朴脂蛋白L、APOL1、APOL2、APOL3、APOL4、APOL5、APOL6和APOLD1。例如，微RNA可以被Ago1、Ago2、Ago3和Ago4中的一个或多个结合。蛋白质可以呈现出核溶解活性(nucleolytic activity)。蛋白质可以包含重组蛋白质。作为非限制性实例，蛋白质可以包含重组Ago2(rAgo2)。
在一些实施方案中，组合物包含生物样品。微RNA也可以从生物样品分离。分离的微RNA可以处于与蛋白质(如以上那些，包括Ago1、Ago2、Ago3和Ago4)的核蛋白复合物中。生物样品可以包括体液。有用的体液的非限制性实例包括外周血、血清、血浆、腹水、尿液、脑脊液(CSF)、痰、唾液、骨髓、滑液、房水、羊水、耳垢、乳汁、支气管肺泡灌洗液、精液、前列腺液、考珀液或预射精液、女性射出液、汗液、排泄物、毛发、泪液、囊液、胸腔积液和腹水液、心包液、淋巴、食物糜、乳糜、胆汁、间质液、经血、脓、皮脂、呕吐物、阴道分泌物、粘膜分泌物、稀便、胰液、鼻腔灌洗液、支气管抽吸液、囊胚腔液或脐带血。例如，生物样品可以包括尿液、血液或血液衍生物。
在相关方面中，本发明提供了一种方法，其包括：(i)提供如以上教导的组合物；(ii)在允许微RNA结合寡核苷酸的条件下孵育所述组合物；和(iii)检测标记从基质切割的量。在一个实施方案中，检测标记从基质切割的量包括检测在步骤(ii)之前和之后与基质接触的标记的量。在另一个实施方案中，标记从基质切割表示与微RNA复合的蛋白质的存在。蛋白质可以是如以上所述的那些的蛋白质，包括Ago1、Ago2、Ago3和Ago4。可以在切割反应发生之前和之后观察标记从基质切割的量。或者，可以实时观察标记从基质切割的量。
通过引用并入
本说明书中提及的所有公开、专利和专利申请均以引用方式并入本文，其引用的程度如同各单个公开、专利或专利申请均特定地且单独地表明以引用的方式并入一般。
附图简述
图1A描述了鉴定包含核酸的生物印记以表征表型的方法。图1B描述了鉴定囊泡或囊泡群体的生物印记以表征表型的方法。
图2详细描述了通过评估囊泡生物印记而表征表型的方法。图2A为涂敷有捕获抗体的平面基底的简图，所述的捕获抗体捕获表达该蛋白质的囊泡。所述捕获抗体是针对囊泡蛋白质(其对源自病变细胞的囊泡(“疾病囊泡”)具有或不具有特异性)的。所述检测抗体与捕获的囊泡结合并提供荧光信号。所述检测抗体可检测通常与囊泡相关的抗原，或检测与细胞源或疾病(如癌症)相关的抗原。图2B为涂敷有捕获抗体的珠的简图，所述捕获抗体捕获表达该蛋白质的囊泡。所述的捕获抗体是针对囊泡蛋白质(其对于源自病变细胞的囊泡(“疾病囊泡”)具有或不具有特异性)的。所述检测抗体与捕获的囊泡结合并提供荧光信号。所述检测抗体可检测通常与囊泡相关的抗原，或检测与细胞源或疾病(如癌症)相关的抗原。图2C为筛选方案的实例，其可以通过使用如图2B中所示的珠以多重方式实施。图2D示出了捕获或检测囊泡以表征表型的说明性示意图。图2E示出了用于评估囊泡有效负载以表征表型的说明性方案。
图3详细说明了可以在本发明的一些示例性实施方案中使用的计算机系统。
图4详细说明了使用检测来自受试者的囊泡的基于珠的方法描述结果的方法。在给定强度下捕获的珠的数量为囊泡以怎样的频率在所述强度下表达检测蛋白质的指示。对于给定的珠而言，信号的强度越强，则检测蛋白质的表达越多。该图显示了通过将正常的患者组合到一条曲线中而将癌症患者组合到另一条曲线中，并使用生物统计分析区分所述曲线而得到的归一化的图。对由各个个体得到的数据归一化以考虑由检测仪器所读取的珠的数量的差异，将这些数据加和，然后再次归一化以考虑各群体中的不同样品数。
图5说明了通过评估TMPRSS2-ERG表达使用EpCam对来自血浆的前列腺癌细胞源囊泡的捕获。将VcaP纯化的囊泡掺入到正常血浆中，然后与涂敷有EpCam或同种型对照抗体的Dynal磁珠一起孵育。由Dynal珠上直接分离RNA。使用来自各样品的等体积RNA来进行RT-PCR以及随后的Taqman分析。
图6描述了使用CD9珠捕获的miR-21或miR-141表达的柱状图。将得自前列腺癌患者的1ml血浆、250ng/ml的LNCaP或正常的纯化囊泡与CD9涂敷的Dynal珠孵育。由所述的珠和珠上清液中分离RNA。此外，对一个样品(#6)不进行捕获以用于比较。使用qRT-PCR测量微RNA的表达，并比较各样品的平均CT值。CD9捕获改善了前列腺癌样品中miR-21和miR-141的检测。
图7详细说明了使用MoFlo XDP进行的囊泡分离和鉴定。
图8是检测样品中囊泡的示意图，其中使用微球平台评估所希望的囊泡的存在或水平。图8A是使用基于柱的过滤方法从血浆中分离囊泡的示意图，其中所述分离的囊泡随后使用微球平台进行评估。图8B是由于诸如超离心这样的高速离心而导致囊泡膜压缩的示意图。图8C是使用激光检测对结合于微球的囊泡进行检测的示意图。
图9A详细说明了囊泡生物印记区分正常前列腺和PCa样品的能力。癌症标志物包括EpCam和B7H3。一般囊泡标志物包括CD9、CD81和CD63。前列腺特异性标志物包括PCSA。PSMA可以与PCSA一样使用。据发现所述测试对于PCa对比正常样品具有96％的灵敏度和95％的特异性。图9B在Y轴上示出了正常和前列腺癌患者中图9A的囊泡标志物的平均荧光强度(MFI)。
图10是用于囊泡前列腺癌分析的决策树的示意图，以用于确定样品对于前列腺癌是否为阳性。
图11显示了根据所述决策树针对前列腺癌的囊泡检测分析相对于使用提高的PSA水平进行检测的结果。
图12说明了从对照和PCa样品分离的囊泡中的miR-145的水平。
图13A-13B详细说明了使用微RNA确认来自基于囊泡的前列腺癌诊断分析的假阴性。图13A详细说明了使用囊泡中的miR分析以将假阴性转换成真阳性的示意图，由此改善了灵敏度。图13B详细说明了使用囊泡中的miR分析以将假阳性转换成为真阴性的示意图，由此改善特异性。miR-107(图13C)和miR-141(图13D)的归一化水平在Y轴上针对所述囊泡诊断分析所得的真阳性(TP)、所述囊泡诊断分析所得的真阴性(TN)、所述囊泡诊断分析所得的假阳性(FP)和所述囊泡诊断分析所得的假阴性(FN)示出。miR-107和miR-141可以用于图13A和图13B中所示的方案中。
图14说明了结肠直肠癌(CRC)细胞系和患者样品中的KRAS测序。样品包括从细胞系(图14B)或从患者的组织样品(图14D)获得的基因组DNA，或从细胞系(图14A)或患者的血浆样品(图14C)脱落的囊泡内的RNA有效负载获得的cDNA。
图15说明了来自人血浆的微RNA的免疫沉淀。图1SA显示了人血浆的各种部分中检测到的平均miR-16量。“(Beads)”是使用针对Argonaute2(Ago2)、阿朴脂蛋白A1(ApoA1)、GW182和IgG对照的抗体共同免疫沉淀的miR-16的含量。“Dyna”是指使用Dynabead蛋白G的免疫沉淀，而“Magna”是指Magnabind蛋白G珠。“supernt”是免疫沉淀反应的上清液中检测的miR-16的量。对于详细内容，参见实施例。图15B与图15A相同，除了检测了miR-92a。
图16说明了用PE标记的抗-PCSA抗体和FITC标记的抗-Ago2抗体染色的复合物的流式分选。
图17说明了人血浆样品中PCSA/Ago2阳性复合物中微RNA的检测。血浆样品来自患有前列腺癌(PrC)的受试者或正常对照(正常)。图17A显示了来自人血浆的总循环微囊泡群体中的miR-22拷贝数。图17B显示了使用针对PCSA和Argonaute2(Ago2)的抗体来分选血浆源的复合物。分离RNA且miR-22的拷贝数在PCSA/Ago2双阳性事件的群体中测定。图17C显示了对于每个血浆样品通过流式细胞术计数的PCSA/Ago2双阳性事件的数目。图17D对于每个血浆样品显示miR-22拷贝数除以PCSA/Ago2阳性事件总数的结果。这获得了每个PCSA/Ago2双阳性复合物的miR-22拷贝数。
图18说明了用抗-CD9和/或抗-PCSA染色的循环微囊泡(cMV)的流式细胞分析。图18A说明了使用CD9和PCSA的标记抗体分析血浆源的cMV。图18B说明了使用抗-CD9和抗-PCSA的双重免疫沉淀后双阳性CD9/PCSA cMV的富集。比较图18A和图18B之间区域R7中的双阳性群体。图18C说明了使用针对PCSA的标记抗体分析血浆源的cMV。图18D说明了使用抗PCSA的抗体的单一免疫沉淀后PCSA阳性事件的富集。比较图18C和图18D之间区域R4中的群体。
图19说明了各种不同血浆部分中miR-22的水平。图19A说明了如通过ABI Taqman检测试剂盒(Assay ID#000398)测定的未改变血浆中的miR-22拷贝数。图19B说明了如通过ABI Taqman检测试剂盒测定的从患者血浆浓缩的总循环微囊泡群体中的miR-22拷贝数。图19C说明了使用从抗-CD9柱释放的起始材料在抗-PCSA柱上保留的miR-22拷贝数。图19D说明了如使用基于珠的分析测定的相对于样品匹配PCSAMFI的miR-22拷贝数。用于双重免疫沉淀的癌症和正常输入血浆的平均PCSA MFI信号分别是161.67和729.17。图19E说明了输入血浆中的miR-22拷贝数。图19F说明了来自图19E的输入血浆的保留在抗-PCSA柱上的cMV的miR-22拷贝数。图19G说明了如使用基于珠的分析测定的相对于样品匹配PCSA MFI的miR-22拷贝数。用于单一IP的癌症和正常血浆的平均PCSA MFI信号分别是69.17和526.5。
图20A-C说明了使用源自PCSA和PSMA蛋白的水平以及与分离自血浆的cMV相关的miR-22和let7a微RNA的评分来区分PCa和正常(非PCa)样品。图20A显示了对于正常和癌症样品计算的评分的曲线图。图20B显示了图20A的数据，其中将正常分成正常组(无前列腺病症)、非典型组、炎症组和高等级前列腺上皮内瘤组(高等级PIN，或HGPIN)，并且将癌症分成确定为观察等待(WW)或癌症的组。图20C显示了用该数据产生的ROC曲线。AUC为0.77。
图21显示了用于不同样品群体中miR-920(图21A)和miR-450a(图21B)的差异表达的曲线图。样品包含从血浆分离的PCSA表达cMV中的微RNA。与前列腺癌(“癌症”)和正常(“正常”)相比，miR-920在混杂疾病(即，高等级PIN(“hgpin”)和炎性疾病(“炎症”))中过表达。与其他相比，miR-450在癌症中下调。
图22说明了来自囊泡mRNA有效负载水平的微阵列谱分析的选定mRNA的减去原始背景的荧光值的点图。在每个图中，Y轴显示了减去原始背景的荧光值(原始BGsub荧光)。X轴显示了四个正常对照血浆和四个来自前列腺癌患者的血浆的点图。所示的mRNA为A2ML1(图22A)、GABARAPL2(图22B)、PTMA(图22C)、RABAC1(图22D)、SOX1(图22E)和ETFB(图22F)。
图23A-23B说明了从非复发前列腺癌和转移性前列腺癌样品分离的囊泡中miR-141(图23A)和miR-375(图23B)的水平，如X轴上所示。使用Taqman分析检测了从囊泡分离的miR。P值显示于曲线下方。Y轴显示了检测的miR的拷贝数。
图24A和24B说明了使用患者血样来区分肺癌和正常(非肺癌)的微RNA miR-497。Y-轴显示了0.1ml样品中的miR-497拷贝数。在图24A中，水平线表示1154个拷贝的拷贝数。在图24B中，水平线表示1356的拷贝数。图24C是用于通过检验循环微囊泡(cMV)中的miR-497水平区分非-小细胞肺癌和正常血浆样品的受试者工作特征(ROC)曲线。数据对应于图24B。
图25A是结合于载玻片的Vcap-衍生微囊泡的电子显微照片。图25B是Vcap-衍生的微囊泡的扫描电子显微照片，而图25C是结合于用聚-L-赖氨酸涂覆的聚苯乙烯珠的Vcap微囊泡的扫描电子显微照片。图25D说明了按照样品收集实验方案中详细说明的处理成血浆的血液。
图26说明了微RNA功能分析。图26A显示了标记的合成RNA分子261-266和含有感兴趣的目标微RNA267的核蛋白复合物。图26B证明了在被核蛋白复合物267识别时，在目标识别位点263处的合成RNA分子的切割，由此释放标记265-266。图26C-E说明了来自各种来源的输入核蛋白复合物。
发明详述
本文公开了用于表征生物样品(如，来自细胞培养物、生物体或受试者的样品)的表型的方法和系统。可通过评估一种或多种生物标志物表征所述表型。所述生物标志物可与囊泡或囊泡群体关联，其为存在的囊泡表面抗原或囊泡有效负载。如本文所使用的，囊泡有效负载包含封装于囊泡内的实体。囊泡相关的生物标志物可包含膜结合的和可溶的生物标志物。所述生物标志物还可以是循环生物标志物，诸如在体液中评估的核酸(例如，微RNA)或蛋白质/多肽，或其功能性片段。除非另行说明，本文中提及囊泡或生物标志物组分而使用的术语“纯化的”或“分离的”指的是这些组分从细胞或生物体中部分或完全地纯化和分离。此外，除非另行说明，所称的使用结合剂进行的囊泡分离包括将囊泡与所述结合剂结合，无论该结合是否使得所述囊泡与起始材料中的其它生物实体完全分离。
通过分析循环生物标志物(如核酸生物标志物)而表征表型的方法描述于图1A的方案6100A中，其为非限制性说明实例。在第一步骤6101中获得生物样品，如体液、组织样品或细胞培养物。从所述样品中分离核酸6103。所述核酸可以是DNA或RNA，如微RNA。对这些核酸的评估可提供该表型的生物印记。通过对与目标表型(如疾病对比健康、治疗前和治疗后)相关的核酸取样，可测定作为表型的指示的一种或多种核酸标志物。本发明的各个方面涉及通过评估在所述样品中存在的一种或多种核酸分子(如微RNA)而确定生物印记6105，其中所述生物印记对应于预定的表型6107。图1B详细说明了使用囊泡分离所述核酸分子的方案6100B。在一个实施例中，获得了生物样品6102，并且从所述样品中分离一种或多种囊泡6104，如来自特定细胞源的囊泡和/或与特定疾病状态相关的囊泡。通过表征与所述囊泡关联的表面抗原和/或测定所述囊泡中存在的组分(“有效负载”)的存在或水平而分析所述囊泡6106。除非另行说明，本文所使用的术语“抗原”通常指的是可被结合剂结合的生物标志物，无论所述结合剂是抗体、适体、凝集素或用于所述生物标志物的其它结合剂，并且无论这些生物标志物是否在宿主中引发免疫应答。囊泡有效负载可以是蛋白质(包括肽和多肽)和/或核酸(如DNA和RNA)。RNA有效负载包括信使RNA(mRNA)和微RNA(本文中亦称为miRNA或miR)。根据所述囊泡的生物印记表征表型6108。在本发明的另一个说明性方法中，方案6100A和6100B一起实施以表征表型。在这样的方案中，评估了囊泡和核酸(如微RNA)，从而表征所述表型。
在一个相关的方面，本文提供了用于发现生物标志物的方法，其包括评估一个样品中的囊泡表面标志物或有效负载标志物以及将所述标志物与另一样品进行比较。在所述样品之间区分的标志物可用作本发明的生物标志物。这些样品可以来自受试者或受试者组。例如，所述组可以是，例如，对于给定疾病或失调的给定治疗的已知反应者和非反应者。发现区分所述已知反应者和非反应者的生物标志物提供了关于患者是否可能对治疗(诸如治疗剂，如药物或生物制品)有反应的生物印记。
表型
本文公开了通过分析囊泡(诸如膜囊泡)来表征个体的表型的产品和方法。表型可以为患者的任何可观察的特征或性状，例如疾病或状况、疾病阶段或状况阶段、疾病或状况的易感性、疾病阶段或状况的预后、生理状态或对治疗的反应。表型可以由受试者的基因表达及环境因素的影响以及这二者之间的相互作用引起，以及由对核酸序列的外遗传修饰引起。
受试者中的表型可以通过从受试者获得生物样品并分析所述样品中的一种或多种囊泡来表征。例如，表征受试者或个体的表型可以包括检测疾病或状况(包括症状前的早期阶段检测)，确定疾病或状况的预后、诊断或治疗诊断，或者确定疾病或状况的阶段或进程。表征表型还可以包括鉴定针对特定疾病、状况、疾病阶段或状况阶段的适当治疗或治疗效力、疾病进展的预测和可能性分析，特别是疾病重新发生、转移扩散或疾病复发。表型还可以为状况或疾病(例如癌症或肿瘤)的临床上独特的类型或亚型。表型的确定还可以为生理状况的确定、器官危境或器官排斥(例如移植后)的评估。本文所述的产品和方法允许在个体的基础上评估受试者，其可以提供在治疗中的更有效和更经济的决策的益处。
在一个方面，本发明涉及生物样品的分析以鉴定生物印记，从而预测受试者是否可能对疾病或失调的治疗有反应。表征表型包括预测所述受试者的响应者/无响应者状态，其中响应者对疾病的治疗有反应而无响应者对所述治疗无反应。可在所述受试者中分析囊泡并与已知对治疗有反应或没有反应的先前受试者的囊泡分析进行比较。如果所述受试者中的囊泡生物印记与已知对所述治疗有反应的先前受试者更为接近，则所述受试者可表征或预测为所述治疗的响应者。类似地，如果所述受试者中的囊泡生物印记与对所述治疗无反应的此前受试者更为接近，则所述受试者可表征或预测为所述治疗的无响应者。所述治疗可以针对任意适当的疾病、失调或其它状况。在与响应者/无响应者状态相关的囊泡生物印记已知的情况下，所述方法可用于任意疾病情况中。
本发明所使用的术语“表型”可以指贡献于囊泡生物印记的任何性状或特征，该生物印记使用本发明的方法而鉴定。例如，表型可以是患者可能对治疗有反应的标识，或更广义地其可为基于针对获自受试者的样品鉴定的生物印记的诊断、预后或治疗诊断确定。
在一些实施方案中，所述的表型包括疾病或状况，如表1中所列的那些。例如，所述的表型可包括肿瘤、赘生物或癌症的存在或发生肿瘤、赘生物或癌症的可能性。通过本文所述的产品或方法检测或评估的癌症包括但不限于乳腺癌、卵巢癌、肺癌、结肠癌、增生性息肉、腺瘤、结肠直肠癌、高度异型增生(high grade dysplasia)、低度异型增生(loW gradedysplasia)、前列腺增生、前列腺癌、黑色素瘤、胰腺癌、脑癌(例如成胶质细胞瘤)、血液恶性肿瘤、肝细胞癌、宫颈癌、子宫内膜癌、头颈癌、食管癌、胃肠道间质瘤(GIST)、肾细胞癌(RCC)或胃癌。所述的结肠直肠癌可以为CRC Dukes B或CRC Dukes C-D。所述的血液恶性肿瘤可以为B细胞慢性淋巴细胞性白血病、B细胞淋巴瘤-DLBCL、B细胞淋巴瘤-DLBCL-生发中心样、B细胞淋巴瘤-DLBCL-活化B细胞样以及伯基特氏淋巴瘤。
所述表型可以是恶变前状况，诸如光化性角化病、萎缩性胃炎、白斑病、增殖性红斑、淋巴瘤样肉芽肿病、白血病前期、纤维症、宫颈非典型增生、子宫颈非典型增生、着色性干皮病、巴雷特食管、结肠直肠息肉或有可能发展成为恶性肿瘤的其它异常组织生长或病灶。诸如HIV和HPV的转化型病毒感染也提供了可根据本发明进行评估的表型。
通过本发明的方法表征的癌症可包括但不限于，癌瘤、肉瘤、淋巴瘤或白血病、生殖细胞瘤、胚细胞瘤或其它癌症。癌瘤包括但不限于，上皮肿瘤、鳞状细胞肿瘤鳞状细胞癌、基底细胞肿瘤基底细胞癌、移行细胞乳头状瘤和癌、腺瘤和腺癌(腺体)、腺瘤、腺癌、革囊胃胰岛瘤(linitisplastica insulinoma)、高血糖素瘤、胃泌素瘤、血管活性肠肽瘤、胆管癌、肝细胞癌、囊性腺样癌、阑尾类癌瘤、泌乳素瘤、大嗜酸粒细胞瘤、许特莱氏细胞腺瘤(hurthle cell adenoma)、肾细胞癌、格拉维茨瘤(grawitztumor)、多发性内分泌腺瘤、子宫内膜腺瘤、附件和皮肤附件肿瘤、粘液表皮样肿瘤、囊性、粘液性和浆液性肿瘤、囊腺瘤、腹膜假粘液瘤、导管、小叶和髓质肿瘤、腺泡细胞肿瘤、复合上皮肿瘤、沃辛肿瘤(warthin′s tumor)、胸腺瘤、特化生殖腺肿瘤、性索间质瘤、泡膜细胞瘤、粒膜细胞瘤、卵巢含睾丸母细胞瘤、支持细胞睾丸间质细胞瘤、血管球瘤、副神经节瘤、嗜铬细胞瘤、血管神经肌瘤、痣与黑色素瘤、黑素细胞痣、恶性黑色素瘤、黑色素瘤、结节性黑色素瘤、发育不良痣、恶性痣性黑色素瘤、浅表扩散性黑色素瘤以及恶性肢端着色斑性黑色素瘤。肉瘤包括但不限于，Askin’s肿瘤、葡萄状肉瘤(botryodies)、软骨肉瘤、尤文氏肉瘤、恶性血管内皮细胞瘤、恶性神经鞘瘤、骨肉瘤、软组织肉瘤，其包括：腺泡状软组织肉瘤、血管肉瘤、叶状囊肉瘤、皮肤纤维肉瘤、硬纤维瘤、促结缔组织增生性小圆形细胞瘤、上皮样肉瘤、骨外软骨肉瘤、骨外骨肉瘤、纤维肉瘤、血管外皮细胞瘤、血管肉瘤、卡波济氏肉瘤、平滑肌肉瘤、脂肪肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、神经纤维肉瘤、横纹肌肉瘤和滑膜肉瘤。淋巴瘤和白血病包括但不限于，慢性淋巴细胞性白血病/小淋巴细胞性淋巴瘤、B细胞幼淋巴细胞性白血病、淋巴浆细胞性淋巴瘤(lymphoplasmacyticlymphoma)(诸如
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巨球蛋白血症)、脾边缘区淋巴瘤、浆细胞骨髓瘤、浆细胞瘤、单克隆免疫球蛋白沉积病、重链病、亦称为malt淋巴瘤的结外边缘区B细胞淋巴瘤、结节性边缘区B细胞淋巴瘤(nmzl)、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、纵隔(胸腺)大B细胞淋巴瘤、血管内大B细胞淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤/白血病、T细胞幼淋巴细胞性白血病、T细胞大颗粒淋巴细胞白血病、侵袭性NK细胞白血病、成人T细胞性白血病/淋巴瘤、结外NK/T细胞淋巴瘤，鼻型、肠病型T细胞淋巴瘤、肝脾T细胞淋巴瘤、母细胞性NK细胞淋巴瘤、蕈样霉菌病/塞泽里综合征(sezary syndrome)、原发性皮肤CD30阳性T细胞淋巴组织增生性疾病、原发性皮肤间变性大细胞淋巴瘤、淋巴瘤样丘疹病、血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤、外周T细胞淋巴瘤、非指定、间变性大细胞淋巴瘤、典型霍奇金淋巴瘤(结节性硬化、混合细胞性、富淋巴细胞、淋巴细胞耗尽或非耗尽)以及结节性淋巴细胞为主型霍奇金淋巴瘤。生殖细胞肿瘤包括但不限于，生殖细胞瘤、无性细胞瘤、精原细胞瘤、非生殖细胞瘤性生殖细胞瘤、胚胎癌、内胚窦肿瘤、绒毛膜癌、畸胎瘤、多胚瘤和成性腺细胞瘤。胚细胞瘤包括但不限于，肾母细胞瘤、成神经管细胞瘤和视网膜母细胞瘤。其它癌症包括但不限于，唇癌、喉癌、咽癌、舌癌、唾液腺癌、胃癌、腺癌、甲状腺癌(延髓和乳头状甲状腺癌)、肾癌、肾实质癌、子宫颈癌、子宫体癌、子宫内膜癌、绒毛膜癌、睾丸癌、泌尿系癌、黑色素瘤、脑肿瘤(如胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、脑膜瘤、髓母细胞瘤和外周神经外胚层肿瘤)、胆囊癌、支气管癌、多发性骨髓瘤、基底细胞癌、畸胎瘤、视网膜母细胞瘤、脉络膜黑色素瘤、精原细胞瘤、横纹肌肉瘤、颅咽管瘤(craniopharyngeoma)、骨肉瘤、软骨肉瘤、肌肉瘤、脂肪肉瘤、纤维肉瘤、尤文氏肉瘤和浆细胞瘤。
在进一步的实施方案中，进行分析的癌症可以是肺癌，其包括非小细胞肺癌和小细胞肺癌(包括小细胞癌(燕麦细胞癌)、小细胞/大细胞混合癌以及复合性小细胞癌)、结肠癌、乳腺癌、前列腺癌、肝癌、胰腺癌、脑癌、肾癌、卵巢癌、胃癌、皮肤癌、骨癌、胃的癌、乳腺癌、胰腺癌、胶质细胞瘤、胶质母细胞瘤、肝细胞癌、乳头状癌肾癌、头颈部鳞状细胞癌、白血病、淋巴瘤、骨髓瘤或实体肿瘤。
在实施方案中，所述癌症包括急性成淋巴细胞性白血病；急性骨髓性白血病；肾上腺皮质癌；AIDS相关癌症；AIDS相关淋巴瘤；肛门癌；阑尾癌；星形细胞瘤；非典型畸胎样瘤/横纹肌样瘤；基底细胞癌；膀胱癌；脑干胶质瘤；脑肿瘤(包括脑干胶质瘤、中枢神经系统非典型畸胎样瘤/横纹肌样瘤、中枢神经系统胚胎样瘤、星形细胞瘤、颅咽管瘤、成室管膜母细胞瘤、室管膜瘤、髓母细胞瘤、髓上皮瘤、中度分化的松果体实质肿瘤、幕上原始神经外胚层肿瘤和成松果体细胞瘤)；乳腺癌；支气管肿瘤；伯基特氏淋巴瘤；原发部位不明癌；类癌瘤；原发部位不明肿瘤；中枢神经系统非典型畸胎样瘤/横纹肌样瘤；中枢神经系统胚胎性肿瘤；宫颈癌；儿童期癌症；脊索瘤；慢性淋巴细胞性白血病；慢性骨髓性白血病；慢性骨髓增殖紊乱；结肠癌；结肠直肠癌；颅咽管瘤；皮肤T细胞淋巴瘤；内分泌胰岛细胞瘤；子宫内膜癌；成室管膜母细胞瘤；室管膜瘤；食管癌；成感觉神经细胞瘤；尤文氏肉瘤；颅外生殖细胞瘤；性腺外生殖细胞肿瘤；肝外胆管癌；胆囊癌；胃的(胃)癌；胃肠道类癌肿瘤；胃肠道间质细胞瘤；胃肠道间质瘤(GIST)；妊娠滋养细胞肿瘤；神经胶质瘤；毛细胞白血病；头颈癌；心脏癌；霍奇金淋巴瘤；喉咽癌；眼内黑色素瘤；胰岛细胞瘤；卡波济氏肉瘤；肾癌；朗格汉斯细胞组织细胞增生症；喉癌；唇癌；肝癌；恶性纤维组织细胞瘤骨癌；髓母细胞瘤；髓上皮瘤；黑色素瘤；Merkel细胞癌；Merkel细胞皮肤癌；间皮瘤；隐匿原发性的转移性鳞状颈癌；口腔癌；多发性内分泌肿瘤综合征；多发性骨髓瘤；多发性骨髓瘤/浆细胞肿瘤；蕈样肉芽肿；骨髓发育异常综合征；骨髓增生性肿瘤；鼻腔癌；鼻咽癌；神经母细胞瘤；非霍奇金淋巴瘤；非黑色素瘤皮肤癌；非小细胞肺癌；口癌；口腔癌；口咽癌；骨肉瘤；其它脑和脊髓肿瘤；卵巢癌；卵巢上皮癌；卵巢生殖细胞肿瘤；卵巢低恶性潜在肿瘤；胰腺癌；乳头状瘤病；副鼻窦癌；甲状旁腺癌；盆腔癌；阴茎癌；咽癌；中度分化的松果体实质肿瘤；成松果体细胞瘤；垂体瘤；浆细胞肿瘤/多发性骨髓瘤；胸膜肺母细胞瘤；原发性中枢神经系统(CNS)淋巴瘤；原发性肝细胞肝癌；前列腺癌；直肠癌；肾癌；肾细胞(肾)癌；肾细胞癌；呼吸道癌；视网膜母细胞瘤；横纹肌肉瘤；唾液腺癌症；Sézary综合征；小细胞肺癌；小肠癌；软组织肉瘤；鳞状细胞癌；鳞状颈癌；胃(胃的)癌；幕上原始神经外胚层肿瘤；T细胞淋巴瘤；睾丸癌；咽喉癌；胸腺癌；胸腺瘤；甲状腺癌；移行细胞癌；肾盂和输尿管的移行细胞癌；滋养细胞肿瘤；输尿管癌；尿道癌；子宫癌；子宫肉瘤；阴道癌；外阴癌；
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巨球蛋白血症或肾母细胞瘤。本发明的方法可用于表征这些及其它癌症。因此，对表型的表征可提供本文公开的癌症之一的诊断、预后和治疗诊断。
所述的表型还可以为炎性疾病、免疫疾病或自身免疫疾病。例如，所述的疾病可以为炎性肠病(IBD)、克罗恩氏病(CD)、溃疡性结肠炎(UC)、盆腔炎症、脉管炎、银屑病、糖尿病、自身免疫性肝炎、多发性硬化症、重症肌无力、I型糖尿病、类风湿性关节炎、牛皮癣、系统性红斑狼疮(SLE)、桥本甲状腺炎、格雷夫斯病、强直性脊柱炎、Sjogrens病、CREST综合征、硬皮病、风湿病、器官排斥反应、原发性硬化性胆管炎或脓毒症。
所述的表型还可以包括心血管疾病，例如动脉粥样硬化、充血性心力衰竭、易损斑块、中风或局部缺血。所述的心血管疾病或状况可以为高血压、狭窄症、血管阻塞或血栓形成事件。
所述的表型还可以包括神经疾病，例如多发性硬化症(MS)、帕金森氏病(PD)、阿尔兹海默氏病(AD)、精神分裂症、双相型障碍、抑郁症、孤独症、朊病毒病、皮克病、痴呆、亨廷顿病(HD)、唐氏综合征、脑血管疾病、Rasmussen脑炎、病毒性脑膜炎、神经精神性系统性红斑狼疮(NPSLE)、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、克雅氏病、Gerstmann-Straussler-Scheinker病、传染性海绵状脑病、缺血再灌注损伤(例如中风)、脑外伤、微生物感染或慢性疲劳综合征。所述的表型还可以为诸如纤维肌痛、慢性神经病理性疼痛或周围神经病理性疼痛的状况。
所述的表型还可以包括感染性疾病，例如细菌、病毒或酵母菌感染。例如，所述的疾病或状况可以为惠普尔氏病、朊病毒病、肝硬化、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、HIV、肝炎、梅毒、脑膜炎、疟疾、结核病或流行性感冒。可以评估囊泡中的病毒蛋白质(例如HIV或HCV样颗粒)从而表征病毒状况。
所述的表型还可以包括围产期或妊娠相关的状况(例如先兆性子痫或早产)、代谢疾病或状况(例如与铁代谢有关的代谢疾病或状况)。例如，可以测定在囊泡中的铁调素(hepcidin)从而表征铁缺乏。所述的代谢疾病或状况还可以为糖尿病、炎症或围产期状况。
本发明的方法可以用于表征这些疾病和失调和表征可通过包含一个或多个生物标志物的候选生物印记评价的其他疾病和失调。因此，表征表型可以提供本文中公开的疾病和失调之一的诊断、预后或治疗诊断。
在本发明的各个实施方案中，用于本文中公开的任何病症或疾病的生物印记可以包含几个不同的标志物类别之一中的一种或多种生物标志物，其中所述类别包括以下的一种或多种：1)疾病特异性标志物；2)细胞-或组织-特异性生物标志物；3)囊泡-特异性标志物(例如，一般囊泡生物标志物)；4.血管生成-特异性生物标志物；和5)免疫调节生物标志物。本文中公开了所有这些标志物的实例，并且它们是本领域普通技术人员已知的。此外，鉴定为在特定疾病或病症中具有作用的本领域已知的生物标志物适于用作本发明的组合物和方法中的靶标。在进一步的实施方案中，这样的生物标志物可以全部是所有囊泡表面标志物，或囊泡表面标志物和囊泡有效负载标志物(即，囊泡包裹的分子)的组合。此外，如本文中所述，所评估的生物样品可以是任何生物流体，或可以包含这样的生物流体内存在的单个组分(例如，囊泡、核酸、蛋白质或其复合物)。
受试者
可通过分析从受试者获得的生物样品中的一种或多种囊泡(如多种囊泡)来确定受试者的一种或多种表型。受试者或患者可以包括但不限于哺乳动物，例如牛、鸟、犬、马、猫、绵羊、猪或灵长动物(包括人及非人灵长动物)。受试者还可以包括：由于濒危而变得重要的哺乳动物，例如西伯利亚虎；或者具有经济意义的动物(例如用于人消费的农场饲养动物)，或对人类而言具有社会意义的动物(例如作为宠物或在动物园中饲养的动物)。此类动物的实例包括但不限于：食肉动物，例如猫和狗；猪，包括畜养猪、食用猪和野猪；反刍动物或有蹄类动物，例如牛、公牛、绵羊、长颈鹿、鹿、山羊、野牛、骆驼或马。此外，还包括濒危的或在动物园中饲养的鸟；以及禽类，和更特别的是家养的禽类，即，家禽，例如火鸡和鸡、鸭、鹅、珍珠鸡。还包括家养的猪和马(包括赛马)。此外，与商业活动有关的任何动物种类也都被包括在内，例如与农业、水产业和其它活动有关的动物，所述行业中为了经济生产率和/或食物链的安全而常规实施疾病监测、诊断和疗法的选择。
所述的受试者可以患有先前存在的疾病或状况，例如癌症。或者，所述的受试者可以并未患任何已知的先前存在的状况。所述的受试者还可以对现有或过去的治疗是非反应性的，例如对癌症的治疗是非反应性的。
样品
得自所述受试者的生物样品可以为任何体液或生物流体。例如，所述的生物样品可以为任何生物流体包括但不限于外周血、血清、血浆、腹水、尿、脑脊液(CSF)、痰、唾液、骨髓、滑液、房水、羊水、耳垢、乳汁、支气管肺泡灌洗液、精液(包括前列腺液)、考珀液或预射精液、女性射出液、汗液、排泄物、毛发、泪液、囊液、胸腔积液和腹水液、心包液、淋巴液、食物糜、乳糜、胆汁、间质液、经血、脓液、皮脂、呕吐物、阴道分泌物、粘膜分泌物、稀便、胰液、鼻腔灌洗液、支气管肺抽吸液或其它灌洗液。生物样品还可以包括囊胚腔、脐带血或母体循环血(其可以为胎儿来源或母体来源的)。所述的生物样品还可以为组织样品或组织活检样品，从中可获得囊泡和其它循环生物标志物。例如，可以培养得自样品的细胞，并且从所述培养物中分离囊泡(例如参见实施例1)。在各个实施方案中，可由这些生物样品直接评估本发明公开的生物标志物和/或生物印记(如，对核酸或者多肽生物标志物或其功能性片段的存在或水平的鉴定)，其使用各种方法，诸如，从血液、血浆、血清或任意前述生物样品中提取核酸分子，使用蛋白质或抗体阵列鉴定多肽(或功能性片段)生物标志物，以及本领域中已知用于鉴定和评估核酸和多肽分子的其它阵列、测序、PCR和蛋白质组技术。此外，可以首先分离或富集这些样品中存在的一种或多种成分，并且进一步处理以评估选定生物标志物的存在或水平，例如，评估给定的生物印记。例如，可以在针对蛋白质和/或核酸生物标志物对微囊泡进行分型之前，从样品分离微囊泡。
表1列出了疾病、状况或生物学状态的说明性实例，以及可以对其中的囊泡进行分析的生物样品的相应列表。
表1：针对各种疾病、状况或生物学状态，用于囊泡分析的生物样品的实例
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Figure BPA0000184824780000301
本发明的方法可用于使用血液样品或血液衍生物表征表型。血液衍生物包括血浆和血清。血浆是全血的液体组分，并且约占总血液体积的55％。其主要由水和溶液中的少量矿物质、盐类、离子、营养物质和蛋白质组成。在全血中，红细胞、白细胞和血小板悬浮于血浆中。血清指的是不含纤维蛋白原或其它凝血因子的血浆(即，全血减去细胞和凝血因子)。
所述生物样品可通过第三方获得，诸如不进行所述生物标志物的分析的一方，无论是对生物样品的直接评估或通过对得自所述生物样品的一种或多种囊泡进行分型。例如，所述的样品可以通过样品所来源的患者的临床医生、医师或其它保健管理人员获得。或者，所述的生物样品可以由分析囊泡的同一方获得。此外，进行分析的生物样品在防腐条件下归档(如，冷冻)或者储存。
用于生物标志物分析的生物样品的体积可以在0.1-20mL的范围内，例如低于约20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1或0.1mL。
体液样品可用作为表征表型的样品。例如，可对样品中的生物标志物进行评估以提供疾病的诊断、预后和/或治疗诊断。所述生物标志物可以是循环生物标志物，诸如循环蛋白质或核酸。所述生物标志物还可与囊泡或囊泡群体相关。本发明的方法可应用于评估一种或多种囊泡，以及一种或多种可存在于生物样品或受试者中的不同囊泡群体。生物样品中一种或多种生物标志物的分析可用于确定是否应获取另外的生物样品以进行分析。例如，对体液样品中一种或多种囊泡的分析可有助于确定是否应获取组织活检样品。
来自患者的样品可在保持循环生物标志物和其中所包含的其它目标实体以用于随后的分析的条件下进行采集。在一个实施方案中，使用CellSave Preservative Tubes(CellSave Preservative Tube)(Veridex，NorthRaritan，NJ)、PAXgene Blood DNA Tubes(Blood DNA Tubes)(QIAGENGmbH，Germany)和RNAlater(QIAGEN GmbH，Germany)中的一种或多种处理所述样品。
CellSave Preservative Tubes(CellSave管)是无菌的真空采血管。各管包含溶液，所述溶液包含Na2EDTA和细胞保存剂。EDTA吸附钙离子，由此可降低或消除血液凝结。所述保存剂保持上皮细胞和其它细胞的形态和细胞表面抗原表达。可根据制造商提供的方案中的描述实施所述采集和处理。各管经排空以抽取静脉全血，其根据本领域的技术人员所知的标准放血程序进行。CellSave管公开于美国专利No.5，466,574；5，512,332；5,597,531；5,698,271；5,985，153；5,993,665；6，120,856；6，136，182；6,365，362；6,551,843；6,620,627；6,623,982；6,645,731；6,660,159；6,790,366；6,861,259；6,890,426；7,011,794；7,282,350；7，332,288；5，849，517和5,459,073中，其各自以引用方式全文并入本文。
所述PAXgene Blood DNA管(PAXgene管)是用于采集核酸分离用的全血的塑料真空管。该管可用于血液采集、全血样本的运输和贮存以及对其中所包含的核酸的分离，如DNA或RNA。血液以标准的放血方案采集进入包含添加剂的真空管中。可根据制造商提供的方案中的描述实施所述采集和处理。PAXgene管公开于美国专利申请No.5,906,744；4,741,446；4,991、4,991，104中，其各自均以引用方式全文并入本文。
所述RNAlater RNA Stabilization Reagent(RNAlater)用于对组织中的RNA进行直接稳定化。RNA在收获的样品中可能是不稳定的。水性RNAlater试剂渗透组织和其它生物样品，由此稳定和保护其中所包含的RNA。这种保护有助于确保下游分析反映在该组织或其它样品中的RNA表达特征。在采集后立即将所述样品浸入适当体积的RNAlater试剂中。可根据制造商提供的方案中的描述实施所述采集和处理。根据制造商，所述试剂在37℃下保持RNA最长达1天，在18-25℃下7天或在2-8℃下4周，从而允许无需液氮或干冰而对样品进行处理、运输、贮存和运送。所述样品也可置于-20℃或-80℃下，例如进行存档贮存。保存的样品可用于分析任意类型的RNA，包括但不限于总RNA、mRNA和微RNA。RNAlater还可用于采集可用于DNA、RNA和蛋白质分析的样品。RNAlater公开于美国专利申请No.5,346,994中，其各以引用方式全文并入本文。
囊泡
本发明的方法可包括评估一种或多种囊泡，其包括评估囊泡群体。如本文所使用的，囊泡是从细胞上脱落的膜囊泡。囊泡或膜囊泡包括但不限于：循环微囊泡(cMV)、微囊泡、外来体、纳米囊泡、树状细胞胞外体(dexosome)、水泡、水疱、前列腺小体、微粒、管腔内囊泡、膜片段、管腔内核内体囊泡、核内体样囊泡、胞吐囊泡、核内体囊泡、核内体的囊泡、凋亡小体、多囊泡体、分泌囊泡、磷脂囊泡、脂质体囊泡、argosome、texasome、secresome、耐体(tolerosome)、黑色素体、癌小体(oncosome)或胞吐的囊泡。此外，尽管囊泡可通过不同的细胞过程产生，本发明的方法并不限于或依赖于任何一种机制，只要这些囊泡存在于生物样品中并且能够通过本发明公开的方法进行表征即可。除非另行说明，否则使用某一种类的囊泡的方法可应用于其它类型的囊泡。囊泡包含球状结构，其具有环绕内腔的类似于细胞膜的脂质双层，所述内腔可包含有时被称为有效负载的可溶性组分。在一些实施方案中，本发明的方法使用了外来体，其为直径约40-100nm的小的分泌囊泡。对于膜囊泡(包括类型和特征)的综述参见thery等，Nat Rev Immunol.2009年8月；9(8)：581-93。不同类型囊泡的一些性质包括表2中的性质：
表2：囊泡性质
Figure BPA0000184824780000331
Figure BPA0000184824780000341
缩写：磷脂酰丝氨酸(PPS)；电子显微法(EM)
囊泡包括脱落的膜结合颗粒，或称“微粒”，其源自于质膜或内膜。囊泡可以从细胞释放进入细胞外环境中。释放囊泡的细胞包括但不限于源自或衍生自外胚层、内胚层或中胚层的细胞。所述细胞可发生遗传的、环境的和/或任意其它的变异或变化。例如，所述细胞可为肿瘤细胞。囊泡可反映来源细胞的任何变化，并且由此而反映起源细胞(如，具有各种遗传突变的细胞)中的变化。在一种机制中，当细胞膜的片段自发地内陷并最终被胞吐时，囊泡在细胞内生成(例如参见Keller等，Immunol.Lett.107(2)：102-8(2006)。囊泡还包括脂质双层膜所结合的细胞源的结构，其由突出的外翻(起泡)分离和质膜部分的封闭所产生，或者由包含各种肿瘤来源的膜结合蛋白质的任何细胞内膜结合囊泡结构的输出而生成，其中所述膜结合蛋白质包括源自宿主循环的表面结合分子，该分子选择性地结合肿瘤源蛋白质以及包含在囊泡腔中的分子，其包括但不限于肿瘤衍生的微RNA或细胞内蛋白质。水泡和起泡在Charras等，Nature Reviews Molecular and Cell Biology，第9卷第11章，p.730-736(2008)中有进一步的描述。从肿瘤细胞上脱落进入循环或体液中的囊泡可称作为“循环肿瘤源囊泡”。当这种囊泡是外来体时，其可被称为循环肿瘤源外来体(CTE)。在一些情况下，囊泡可源自特定细胞源。CTE，如细胞源特异性囊泡一样，一般具有一种或多种独特的生物标志物，其允许所述CTE或细胞源特异性囊泡例如从体液中分离且某些时候以特异性方式分离。例如，使用细胞或组织特异性标志物以鉴定细胞源。本文公开了这些细胞或组织特异性标志物的实例并且其可进一步见于组织特异性基因表达和调控(TiGER)数据库(Tissue-specific Gene Expressionand Regulation Database)，其可获自bioinfo.wilmer.jhu.edu/tiger/；Liu等(2008)TiGER：a database for tissue-specific gene expression and regulation.BMC Bioinformatics.9：271；组织分布数据库(TissueDistributionDB)，可获自genome.dkfz-heidelberg.de/menu/tissue_db/index.html。
囊泡可具有超过约10nm、20nm或30nm的直径。囊泡可具有超过40nm、50nm、100nm、200nm、500nm、1000nm、1500nm、2000nm或超过10,000nm的直径。囊泡可具有约20-2000nm、约20-1500nm、约30-1000nm、约30-800nm、约30-200nm或约30-100nm的直径。在一些实施方案中，所述囊泡具有低于10,000nm、2000nm、1500nm、1000nm、800nm、500nm、200nm、100nm、50nm、40nm、30nm、20nm或低于10nm的直径。本文在提及数值时所使用的术语“约”意指高于或低于所述数值10％的变化属于所指明数值的范围内。各种类型的囊泡的典型大小在表2中示出。可评估囊泡以测量单一囊泡或多个囊泡的直径。例如，可测定囊泡群体的直径范围或囊泡群体的平均直径。囊泡直径可使用本领域中已知的方法评估，如，诸如电子显微术这样的成像技术。在一个实施方案中，使用光学粒子检测(optical particle detection)测定一种或多种囊泡的直径。例如，参见2010年7月6日授权的题为“OpticalDetection and Analysis of Particles”的美国专利7,751,053；以及2010年7月15日授权的题为“Optical Detection and Analysis of Particles”的美国专利7,399,600。
在一些实施方案中，在没有生物样品的先行分离、纯化或浓缩的情况下直接从所述生物样品分析囊泡。例如，样品中的囊泡量本身可提供生物印记，其提供诊断、预后或治疗诊断的确定。或者，可在分析前从样品中分离、捕获、纯化或浓缩样品中的囊泡。如所说明的，本文所使用的分离、捕获或纯化包括与样品中的其它组分分开的部分分离、部分捕获或部分纯化。囊泡分离可使用本文所述的各种技术实施，如，色谱、过滤、离心、流式细胞法、亲和捕获(如，捕获到平面或珠)和/或使用微流体技术。
可以通过将囊泡特征与参照进行比较而评估囊泡如外来体以提供表型表征。在一些实施方案中，评估了囊泡上的表面抗原。所述表面抗原可提供囊泡的解剖学起源和/或细胞的指示，以及其它表型信息，如肿瘤状态。例如，其中针对指示结肠直肠来源和癌症存在的表面抗原评估患者样品(如，体液，诸如血液、血清或血浆)中发现的囊泡。所述表面抗原可包含可在囊泡膜表面上检测到的任何信息性生物实体，其包括但不限于表面蛋白质、脂质、碳水化合物和其它膜组分。例如，对表达肿瘤抗原的结肠源囊泡的阳性检测可表示所述患者患有结肠直肠癌。据此，本发明的方法可用于表征与解剖学或细胞起源相关的任意疾病或状况，其通过评估，例如，获自受试者的一种或多种囊泡的疾病特异性和细胞特异性生物标志物而完成。
在另一个实施方案中，对一种或多种囊泡有效负载进行评估以提供表型表征。囊泡的有效负载包含在包封于所述囊泡内的情况下可检测的任何信息性生物实体，其包括但不限于蛋白质和核酸，如，基因组的或cDNA、mRNA或其功能性片段，以及微RNA(miR)。此外，本发明的方法涉及检测囊泡表面抗原(在囊泡有效负载以外进行或排除囊泡有效负载)以提供表型表征。例如，可使用对于囊泡表面抗原特异性的结合剂(如抗体或适体)鉴定囊泡，并且可进一步评估结合的囊泡以鉴定其中揭示的一种或多种有效负载组分。根据本文所述，具有目标表面抗原或具有目标有效负载的囊泡的水平可与参照进行比较以表征表型。例如，与参照对比，癌症相关表面抗原或囊泡有效负载(如肿瘤相关mRNA或微RNA)在样品中的过表达可指示所述样品中癌症的存在。根据所需目标样品的选择以及目标样品与所希望的参照样品的比较，所评估的生物标志物可存在或不存在、提高或降低。目标样品的非限制实例包括：疾病；治疗/未治疗；不同时间点，如在纵向研究中；并且参照样品的非限制实例：非疾病；不同时间点；以及对候选治疗的敏感或耐受性。
微RNA
可在生物样品或获自这类生物样品的囊泡中评估各种生物标志物分子。微RNA包含通过本发明的方法评估的一类生物标志物。在本文中亦称为miRNA或miR的微RNA是长约21-23个核苷酸的短RNA链。miRNA由基因编码，其由DNA转录但并不翻译成为蛋白质并且因此包含非编码RNA。miR由称作原miRNA(pri-miRNA)的原始转录物加工而成为称作前miRNA(pre-miRNA)的短茎环结构，并且最终加工成所获得的单链miRNA。前miRNA一般形成在自体互补区域中折回到自身的结构。这些结构随后在动物中由核酸酶DIcer加工，或在植物中由DCL1加工。成熟的miRNA分子与一种或多种信使RNA(mRNA)分子部分地互补并且可发挥调控蛋白质翻译的功能。经鉴定的miRNA序列可在公开可得的数据库中获得，诸如www.microRNA.org、www.mirbase.org或www.mirz.unibas.ch/cgi/miRNA.cgi。
通常根据命名惯例“mir-[数字]”而对miRNA赋予编号。miRNA的编号根据其相对于此前鉴定的miRNA种类的发现顺序而设定。例如，如果最后公布的miRNA为mir-121，则下一个被发现的miRNA将被命名为mir-122，等等。当miRNA被发现与来自不同生物体的已知miRNA同源时，其命名可以提供[生物体标识]-mir-[数字]的形式的任选生物体标识符。标识符包括用于智人的hsa和用于小鼠的mmu。例如，mir-121的人同源物可称为hsa-mir-121，而小鼠同源物可称为mmu-mir-121和大鼠同源物可称为mo-mir-121等。
成熟微RNA通常赋予前缀“miR”，而基因或前体miRNA赋予前缀“mir”。例如，mir-121是miR-121的前体。当差异的miRNA基因或前体被加工成为相同的成熟miRNA时，所述基因/前体可通过编号的后缀描述。例如，mir-121-1和mir121-2可以指被加工成为miR-121的不同基因或前体。字母后缀用于标示紧密相关的成熟序列。例如，mir-121a和mir-121b可分别被加工成为紧密相关的miRNA miR-121a和miR-121b。在本发明的情况中，本文中使用前缀mir-*或miR-*指称的任何微RNA(miRNA或miR)被认为涵盖了前体和/或成熟种类，除非另行明确说明。
有时观察到两种成熟miRNA序列源自于相同的前体。当序列之一比另一种更为丰富时，“*”后缀可用于指示较不常见的变体。例如，miR-121应是主要的产物，而miR-121*是于前体的相对臂上发现的较不常见的变体。如果未识别出主要变体，则可通过对于来自前体5′臂的变体的后缀“5p”以及对于来自3′臂的变体的后缀“3p”来区分所述miR。例如，miR-121-5p源自于前体的5’臂，而miR-121-3p源自于3′臂。较不常见的情况下，5p和3p变体分别被称为正义(“s”)和反义(“as”)形式。例如，miR-121-5p可称为miR-121-s，而miR-121-3p可称为miR-121-as。
上述命名惯例已经随时间发生演化并且是一般性指导而非绝对规定。例如，miRNA的let-和lin-家族继续使用这些名称指代。用于前体/成熟形式的mir/miR惯例依然是指导原则，并且应考虑上下文以确定是指何种形式。miR命名的进一步细节可见于www.mirbase.org或Ambros等，A uniform systemfor microRNA annotation，RNA9：277-279(2003)。
植物miRNA遵循不同的命名惯例，其描述于Meyers等，Plant Cell.200820(12)：3186-3190中。
基因调控中涉及大量miRNA，并且miRNA是不断增长的非编码RNA类别的一部分，其现在被认为是基因控制的主要层级。在某些情况下，miRNA可通过嵌入其靶mRNA的3′-UTR中的调控位点而干扰翻译，从而导致了翻译的阻遏。靶标识别涉及靶位点与该miRNA的种子区域(所述miRNA5′端的2-8位)的互补碱基配对，尽管种子互补性的精确程度未被准确地测定并且可通过3′配对进行改变。在其它情况下，miRNA与小干扰RNA(siRNA)类似地发挥功能，并且结合于完全互补的mRNA序列以破坏靶转录物。
多种miRNA的表征显示它们影响多种过程，包括早期发育、细胞增殖和细胞死亡、细胞凋亡和脂肪代谢。例如，已经显示某些miRNA(诸如lin-4、let-7、mir-14、mir-23和bantam)在细胞分化和组织发育中起关键作用。其它miRNA据信由于它们差异的空间和时间表达模式而具有类似重要的作用。
可获自miRBase(www.mirbase.org)的miRNA数据库包含已发表miRNA序列和注释的可检索数据库。关于miRBase的进一步信息可见于下列文章，各文章全文以引用的方式并入本文：Griffiths-Jones等，miRBase：toolsfor microRNA genomics.NAR200836(DatabaseIssue)：D154-D158；Griffiths-Jones等，miRBase：microRNA sequences，targets and gene nomenclature.NAR200634(Database Issue)：D140-D144；以及Griffiths-Jones，S.The microRNA Registry.NAR200432(DatabaseIssue)：D109-D111。代表性miRNA包含于miRBase的第16期(Release16)中，其自2010年6月起可得。
根据本文所述，微RNA已知参与癌症和其它疾病并且可进行评估以用于表征样品中的表型。例如，参见，Ferracin等，Micromarkers：miRNAs in cancer diagnosis and prognosis，Exp Rev Mol Diag，2010年4月，第10卷，第3期，第297-308页；Fabbri，miRNAs as molecular biomarkersof cancer，Exp Rev Mol Diag，2010年5月，第10卷，第4期，第435-444页。分离和表征囊泡和miR的技术对于本领域的技术人员是已知的。除本文提供的方法外，另外的方法可见于2011年2月15日授权的题为“METHODS FOR ASSESSING RNA PATTERNS”的美国专利No.7，888，035，以及2010年11月30日提交的题为“METHODS ANDSYSTEMS FOR ISOLATING，STORING，AND ANALYZING VESICLES”的国际专利申请No.PCT/US2010/058461以及2011年1月13日提交的题为“DETECTION OF GASTROINTESTINAL DISORDERS”的PCT/US2011/021160，各申请全文以引用的方式并入本文。
循环生物标志物
循环生物标志物包括在体液(如血液、血浆、血清)中可检测的生物标志物。循环癌症生物标志物的实例包括心肌肌钙蛋白T(cTnT)、前列腺癌的前列腺特异性抗原(PSA)以及卵巢癌的CA125。本发明的循环生物标志物包括可于体液中检测的任意适当生物标志物，其包括但不限于蛋白质、核酸(如DNA、mRNA和微RNA)、脂质、碳水化合物和代谢物。循环生物标志物可包括未与细胞相结合的生物标志物，诸如膜结合的、包埋于膜片段中的、生物复合物的部分或游离于溶液中的生物标志物。在一个实施方案中，循环生物标志物是与患者生物液体中存在的一种或多种囊泡相关的生物标志物。
已经鉴定出用于表征各种表型的循环生物标志物。例如，参见Ahmed N等，Proteomic-based identification of haptoglobin-1precursor as anovel circulating biomarker of ovarian cancer.Br.J.Cancer2004：Mathelin等，Circulating proteinic biomarkers and breast cancer，Gynecol Obstet Fertil.2006年7-8月；34(7-8)：638-46.2006年7月28日电子出版；Ye等，Recenttechnical strategies to identify diagnostic biomarkersfor ovarian cancer.Expert Rev Proteomics.2007年2月；4(1)：121-31；Carney，Circulatingoncoproteins HER2/neu，EGFR and CAIX(MN)as novel cancer biomarkers.Expert Rev Mol Diagn.2007年5月；7(3)：309-19；Gagnon，Discovery andapplication of protein biomarkers for ovarian cancer，Curr Opin ObstetGynecol.2008年2月；20(1)：9-13；Pasterkamp等，Immune regulatory cells：circulating biomarker factories in cardiovascular disease.Clin Sci(Lond).2008年8月；115(4)：129-31；Fabbri，miRNAs as molecular biomarkers ofcancer，Exp Rev Mol Diag，2010年5月，Vol.10，No.4，435-444页；PCT专利公开号WO/2007/088537；美国专利7,745,150和7,655,479；美国专利公开号20110008808、20100330683、20100248290、20100222230、20100203566、20100173788、20090291932、20090239246、20090226937、20090111121、20090004687、20080261258、20080213907、20060003465、20050124071和20040096915，各公开全文以引用的方式并入本文。
囊泡富集
可以在分析之前和/或期间分离、纯化、浓缩或另外地富集囊泡或囊泡群体。除非另行说明，本文中提及囊泡或生物标志物组分而使用的术语“纯化的”或“分离的”或相似的术语意图包括这些组分从细胞或生物体的部分的或完全的纯化和分离。囊泡的分析可以包括定量生物样品的一种或多种囊泡群体的量。例如，可以对囊泡的异质群体进行定量，或者可以由囊泡的异质群体分离均质的囊泡群体(例如具有特定生物标志物分布、特定的生物印记或源自特定的细胞类型的囊泡群体)，并进行定量。如本文所述，囊泡分析还可以包括定量地或定性地检测囊泡的一种或多种特定的生物标志物分布或生物印记。
囊泡可以储存和归档例如在生物流体库(bio-fluid bank)中，并根据需要取回以用于分析。此外，囊泡还可以由之前已经由活体或死亡的受试者中采集或储存的生物样品分离得到。此外，囊泡可以由已经按照King等，Breast Cancer Res7(5)：198-204(2005)中所述收集的生物样品分离得到。囊泡可以由归档的或储存的样品分离得到。或者，囊泡可以由生物样品中分离得到并且不经储存或归档样品而进行分析。此外，第三方可以获得或储存所述生物样品，或者获得或储存所述囊泡以用于分析。
富集的囊泡群体可以由生物样品得到。例如，可以使用尺寸排阻色谱、密度梯度离心、差速离心、纳米膜超滤、免疫吸附捕获、亲和纯化、微流体分离或它们的组合来从生物样品浓缩或分离囊泡。
可以使用尺寸排阻色谱(例如凝胶渗透柱)、离心或密度梯度离心以及过滤方法。例如，可以通过差速离心、阴离子交换和/或凝胶渗透色谱(例如在美国专利No.6,899,863和6,812,023中所述的)、蔗糖密度梯度、细胞器电泳(例如在美国专利No.7，198,923中所述的)、磁激活细胞分选术(MACS)或纳米膜超滤浓缩器来分离囊泡。还可以使用分离或浓缩方法的各种结合。
高丰度蛋白质(例如白蛋白和免疫球蛋白)可能妨碍囊泡从生物样品的分离。例如，可以使用利用了多种抗体的系统来从生物样品分离囊泡，所述抗体对于生物样品(例如血液)中所存在的最丰富的蛋白质是特异性的。这种系统可以一次性地除去几种蛋白质，由此显现出较低丰度的物质，例如细胞源特异性的囊泡。
这种类型的系统可以用于从生物样品(例如血液、脑脊液或尿液)分离囊泡。此外，还可以通过在Chromy等J Proteome Res2004；3：1120-1127中所述的高丰度蛋白质的去除方法来增强生物样品中囊泡的分离。在另一个实施方案中，还可以根据Zhang等，Mol Cell Proteomics2005；4：144-155所述的使用糖肽捕获去除血清蛋白质，而增强生物样品中囊泡的分离。此外，可以如Pisitkun等，Proc NatlAcad Sci U SA，2004；101：13368-13373中所述通过差速离心、然后与针对细胞质或抗细胞质的表位的抗体相接触来分离来自生物样品(例如尿液)的囊泡。
还可以通过使用声处理(例如通过施加超声波)、去污剂、其它膜活化剂或它们的任何组合来增强生物样品中囊泡的分离或富集。例如，可以将超声能量施加到潜在的肿瘤位点，并且不被理论所限制，可以增加组织中囊泡的释放，从而可以使用本文公开的一种或多种方法来分析或评估来自生物样品的富集的囊泡群体。
样品处理
通过本文描述的检测循环生物标志物的方法(如抗体亲和分离)，必要时可使用各种浓缩或分离程序优化所得结果的一致性。这些步骤可包括搅拌(诸如振荡或涡旋)、不同的分离技术(诸如基于聚合物如PEG的分离)和在过滤和其它步骤期间浓缩至不同水平。本领域的技术人员应当了解，这些处理可在测试包含囊泡的样品的各个不同阶段进行。在一个实施方案中，所述样品自身(如，体液，诸如血浆或血清)进行涡旋。在一些实施方案中，在一个或多个样品处理步骤(如，囊泡分离)进行之后对所述样品进行涡旋。可根据需要在一些或全部适当的样品处理步骤中进行搅拌。可在各个不同步骤中引入添加剂以改善所述处理，例如，控制目标生物标志物的聚集或降解。
还可按照需要通过使用各种不同试剂处理所述样品而优化所述结果。这些试剂包括用于控制聚集的添加剂或用于调节pH或离子强度的添加剂。控制聚集的添加剂包括封闭剂(诸如牛血清白蛋白(BSA)和牛奶)、离液剂(如盐酸胍)和去污剂或表面活性剂。可用的离子型去污剂包括十二烷基硫酸钠(SDS，月桂基硫酸钠(SLS))、月桂醇聚醚硫酸钠(SLS，月桂基醚硫酸钠(SLES))、月桂基硫酸铵(ALS)、西曲溴铵(cetrimoniumbromide)、西曲氯铵(cetrimonium chloride)、西曲硬脂酸铵(cetrimoniumstearate)等。可用的非离子(两性离子)去污剂包括聚乙二醇、聚山梨醇酯20(亦称为吐温20)、其它聚山梨醇酯类(如40、60、65、80等)、Triton-X(如X100、X114)、3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸(CHAPS)、CHAPSO、脱氧胆酸、脱氧胆酸钠、NP-40、糖苷类、辛基-硫代葡萄糖苷、麦芽糖苷等。在一些实施方案中，Pluronic F-68(一种显示降低血小板聚集的表面活性剂)被用于在分离和/或检测期间处理包含囊泡的样品。F68可在0.1％至10％的浓度下使用，例如，1％、2.5％或5％的浓度。可使用各种酸、碱、缓冲剂或盐调节所述溶液的pH和/或离子强度，其包括但不限于，氯化钠(NaCl)、磷酸盐缓冲盐水(PBS)、tris缓冲的盐水(TBS)、磷酸钠、氯化钾、磷酸钾、柠檬酸钠和盐水-柠檬酸钠(SSC)缓冲剂。在一些实施方案中，以0.1％至10％的浓度添加NaCl，例如1％、2.5％或5％的最终浓度。在一些实施方案中，以0.005％至2％的浓度添加吐温20，例如0.05％、0.25％或0.5％的最终浓度。用于本发明的封闭剂包含惰性蛋白质，如乳蛋白、脱脂干乳蛋白(non-fat dry milk protein)、白蛋白、BSA、酪蛋白或血清，诸如新生牛血清(NBCS)、山羊血清、兔血清或鲑鱼血清。所述蛋白质可以0.1％至10％的浓度加入，如1％、2％、3％、3.5％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％的浓度。在一些实施方案中，BSA以0.1％至10％的浓度加入，如1％、2％、3％、3.5％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％的浓度。在一个实施方案中，根据2005年7月13日提交的美国专利申请11/632946中给出的方法处理所述样品，该申请全文以引用的方式并入本文。可使用可商购的封闭剂，诸如来自Pierce(Thermo Fisher Scientific，Rockford，IL的分部)的SuperBlock、StartingBlock、Protein-Free。在一些实施方案中，以0.1％至10％的浓变加入SSC/去污剂(如，具有0.5％的吐温20或0.1％的Triton-X100的20XSSC)，例如以1.0％或5.0％的浓度。
可根据需要使用本文所述的方案和处理的各种不同组合优化检测囊泡和其它循环生物标志物的方法。可通过搅拌、分离方法和添加剂的各种不同组合优化检测方案。在一些实施方案中，在分离步骤之前和之后涡旋患者样品，并且使用封闭剂(包括BSA和/或F68)处理所述样品。这些处理可减少大聚集物或者蛋白质或其它生物碎片的形成，并且因此提供了更为一致的检测结果输出。
过滤和超滤
可通过以过滤模块过滤来自受试者的生物样品并从所述过滤模块收集包含囊泡的渗余物而从所述生物样品分离囊泡，从而从生物样品中分离囊泡。所述方法可包括，通过包含过滤器的过滤模块过滤来自受试者的生物样品，并从所述过滤模块收集包含囊泡的渗余物，由此从所述生物样品分离囊泡。在一个实施方案中，所述过滤器截留超过约100千道尔顿的分子。
所述方法可进一步包括测定囊泡的生物印记。所述方法还可进一步包括将渗余物应用于多种基底，其中各个基底偶联于一种或多种捕获剂，并且所述多种基底的各个亚组包含不同于所述多种基底的另一亚组的捕获剂或捕获剂组合。
本文还提供了测定样品中的囊泡的生物印记的方法，其包括：通过过滤模块过滤来自患有病症的受试者的生物样品，从所述过滤模块收集包含一种或多种囊泡的渗余物，并且测定所述一种或多种囊泡的生物印记。在一个实施方案中，所述过滤模块包含截留超过约100或150千道尔顿的分子的过滤器。
本文公开的方法可进一步包括表征受试者的表型，其通过以过滤模块过滤来自受试者的生物样品，从所述过滤模块收集包含一种或多种囊泡的渗余物；检测所述一种或多种囊泡的生物印记；以及根据所述生物印记表征患者的表型而实现，其中表征具有至少70％的灵敏度。在一些实施方案中，表征包括测定具有所述生物印记的一种或多种囊泡的量。此外，所述表征可具有约80％至100％的灵敏度。
本文还提供了用于多种囊泡的多重分析的方法。在一些实施方案中，所述方法包括通过过滤模块过滤来自患者的生物样品；从所述过滤模块收集包含所述多种囊泡的渗余物；将所述多种囊泡应用于多种捕获剂，其中所述多种捕获剂偶联于多个基底，并且所述多个基底的各亚组与所述多种基底的另一亚组差异标记；捕获所述多种囊泡的至少一个亚组；以及针对所述被捕获囊泡的至少一个亚组确定生物印记。在一个实施方案中，各个基底偶联于一种或多种捕获剂，并且所述多个基底的各个亚组包含与所述多个基底的另一亚组相比不同的捕获剂或捕获剂组合。在一些实施方案中，所述多个基底的至少一个亚组本征地标记，如包含一种或多种标记。所述基底可以是颗粒或珠，或其任意组合。在一些实施方案中，过滤器截留超过9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450或500千道尔顿的分子。在一个实施方案中，所述过滤模块包含过滤器，其截留超过约100或150千道尔顿的分子。在一个实施方案中，所述过滤模块包含截留超过约9、20、100或150千道尔顿的分子的过滤器。
在一些实施方案中，用于多种囊泡的多重分析的方法包括通过过滤模块过滤来自受试者的生物样品，其中所述过滤模块包含截留超过约100千道尔顿的分子的过滤器；从所述过滤模块收集包含所述多种囊泡的渗余物；将所述多种囊泡应用于多种捕获剂，其中所述多种捕获剂偶联于微阵列；在所述微阵列上捕获所述多种囊泡的至少一个亚组；以及对于所捕获囊泡的至少一个亚组确定生物印记。在一些实施方案中，过滤器截留超过9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450或500千道尔顿的分子。在一个实施方案中，所述过滤模块包含过滤器，其截留超过约100或150千道尔顿的分子。在一个实施方案中，所述过滤模块包含过滤器，其截留超过约9、20、100或150千道尔顿的分子。
可在通过过滤进行分离之前净化所述生物样品。净化包括选择性地除去细胞碎片和其他不需要的材料。例如，可除去细胞碎片和可能干扰循环生物标志物检测的其他成分。所述净化可通过低速离心进行，诸如约5,000×g、4,000×g、3,000×g、2,000×g、1,000×g或更低。随后对包含所述囊泡的上清液或净化的生物样品进行收集和过滤以从所述净化生物样品分离囊泡。在一些实施方案中，生物样品在通过过滤分离囊泡之前不进行净化。
在一些实施方案中，从样品分离囊泡不使用高速离心，如超离心。例如，分离可能不需要使用诸如约100,000×g或更高的离心速度。在一些实施方案中，从样品分离囊泡使用了低于50,000×g、40,000×g、30,000×g、20,000×g、15,000×g、12,000×g或10,000×g的离心速度。
多种适用的过滤器构型可以用于过滤目标样品。在一些实施方案中，用于从生物样品分离循环生物标志物的过滤模块是基于纤维的滤芯。例如，所述纤维可以是中空的聚合纤维，如聚丙烯中空纤维。可通过使用诸如蠕动泵这样的泵设备将样品流体(诸如本发明公开的生物流体)泵送进入所述过滤模块，从而将生物样品引入所述模块中。泵流速可变，诸如约0.25、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9或10mL/分钟。可以根据过滤模块的构型，例如，大小和通过量，来调节流速。
所述过滤模块可以是膜过滤模块。例如，所述膜过滤模块可包含滤片膜，诸如装配于搅拌腔仪器(如包含磁力搅拌器)中的亲水聚偏二氟乙烯(PVDF)滤片膜。在一些实施方案中，所述样品由于在所述滤膜任一侧所建立的压力梯度而通过过滤器。
所述过滤器可包含具有低疏水吸附性和/或高亲水特性的材料。例如，所述过滤器可具有保留囊泡而透过大多数蛋白质的平均孔径以及亲水性的表面，由此限制蛋白质吸附。例如，所述过滤器可包含选自由聚丙烯、PVDF、聚乙烯、聚氟乙烯、纤维素、二醋酸纤维素、聚乙烯醇和乙烯-乙烯醇(
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Kuraray Co.，Okayama，Japan)组成的组的材料。可用于过滤器中的其它材料包括但不限于，聚砜和聚醚砜。
所述过滤模块可具有截留超过约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、400或500千道尔顿(kDa)的分子的过滤器，诸如具有约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、400或500kDa的MWCO(分子量截止值)的过滤器。可以使用具有9kDa、20kDa和/或150kDa的MWCO范围的超滤膜。在一些实施方案中，过滤模块中的过滤器具有约0.01μm至约0.15μm的平均孔径，并且在一些实施方案中，具有约0.05μm至约0.12μm的平均孔径。在一些实施方案中，所述这滤器具有约0.06μm、0.07μm、0.08μm、0.09μm、0.1μm、0.11μm或0.2μm的平均孔径。
所述过滤模块可以是可商购的柱，诸如通常用于浓缩蛋白质或用于分离蛋白质(例如，超滤)的柱。实例包括但不限于，来自Millpore(Billerica，MA)的柱，诸如离心过滤器，或来自
Figure BPA0000184824780000472
(Rockford，IL)的柱，诸如Pierce Concentrator过滤器装置。来自Pierce的可用柱包括具有9kDa、20kDa和/或150kDa的MWCO的一次性超滤离心装置。这些浓缩器由与圆锥装置焊接的高性能再生纤维素膜组成。所述过滤器可以是如美国专利6,269,957或6,357,601中描述的，两个申请全文均以引用的方式并入本文。
可从所述过滤模块收集包含被分离的囊泡的渗余物。可通过从所述过滤器上冲洗所述渗余物而收集该渗余物。不受理论的束缚，选择具有亲水表面特性的过滤器组成并由此限制蛋白质吸附可用于更为简易地收集所述渗余物并且将严苛或耗时的收集技术的使用降至最低。
可如本发明进一步描述的，随后将所收集的渗余物用于随后的分析，诸如评估所述渗余物中的一种或多种囊泡的生物印记。可在所收集的渗余物上直接实施所述分析。或者，可在对一种或多种囊泡进行分析之前进一步浓缩或纯化所收集的渗余物。例如，可使用尺寸排阻色谱、密度梯度离心、差速离心、免疫吸附捕获、亲和纯化、微流体分离或它们的组合，诸如本发明描述的，进一步浓缩所述渗余物或从所述渗余物中进一步分离囊泡。在一些实施方案中，所述渗余物可进行另一步过滤。或者，在使用过滤器分离囊泡之前，使用尺寸排阻色谱、密度梯度离心、差速离心、免疫吸附捕获、亲和纯化、微流体分离或它们的组合来浓缩或分离所述囊泡。
过滤器的组合可以用于浓缩和分离生物标志物。例如，可以首先将生物样品通过具有约0.01μm至约2μm，约0.05μm至约1.5μm的孔隙率或孔径大小的过滤器过滤，然后将样品过滤。例如，在通过具有截留超过约50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、400或500千道尔顿(kDa)的分子的过滤器(诸如具有约50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、400或500的MWCO(分子量截止值)的过滤器)的过滤模块过滤生物样品之前，可首先通过具有约0.01μm至约2μm、约0.05μm至约1.5μm的孔隙或孔径的过滤器过滤所述生物样品。在一些实施方案中，所述过滤器具有约0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9或2.0um的孔径。所述过滤器可以是针筒过滤器。因此，在一个实施方案中，所述方法包括在通过包含截留超过约100或150千道尔顿的分子的过滤器的过滤模块过滤所述样品之前通过过滤器(诸如针筒过滤器)过滤所述生物样品，其中所述针筒过滤器具有超过约1μm的孔隙。在一个实施方案中，所述过滤器是1.2μM的过滤器并且在过滤之后将所述样品通过具有150kDa截止值的7ml或20ml的浓缩器柱。
所述过滤模块可以是微流体设备的部件。亦可以称为“芯片实验室”系统、生物医学微电子机械系统(bioMEM)或多部件集成系统的微流体装置可用于分离和分析囊泡。这类系统使得允许囊泡结合、生物标志物检测的处理过程以及其它过程(诸如本发明进一步描述的过程)微型化和区室化。
微流体装置还可通过包含过滤模块而用于囊泡分离。例如，微流体装置可使用一个或多个通道以根据生物样品的大小将囊泡从生物样品分离。可将生物样品引入一个或多个微流体通道，其选择性地允许囊泡通过。所述微流体装置可进一步包含结合剂或超过一个过滤模块以根据所述囊泡的特性(例如，大小、形状、可变形性、生物标志物分布或生物印记)选择囊泡。
结合剂
结合剂(也称为结合试剂)包括能够结合目标生物标志物的试剂。结合剂可以是目标生物标志物特异性的，意思是该试剂能够结合靶标生物标志物。靶标可以是本文中公开的任何有用生物标志物，如囊泡表面上的生物标志物。在一些实施方案中，靶标是单一分子，如单一蛋白质，以使得结合剂对于该单一蛋白质是特异性的。在其他实施方案中，靶标可以是一组分子，如具有相似表位或部分的家族或蛋白质，以使得结合剂对该家族或该组的蛋白质是特异性的。分子组还可以是一类分子，如蛋白质、DNA或RNA。结合剂可以是用于通过结合囊泡的组分或生物标志物来捕获囊泡的捕获剂。在一些实施方案中，捕获剂包含结合囊泡上的抗原的抗体或其片段，或适体。捕获剂可以任选结合基底和用于分离囊泡，如本文中进一步描述的。
结合剂是结合循环生物标志物(诸如囊泡或囊泡的组分)的试剂。所述结合剂可用作为捕获剂和/或检测剂。捕获剂可结合和捕获循环生物标志物，诸如，通过结合囊泡的组分或生物标志物而进行。例如，所述捕获剂可以是捕获抗体或捕获抗原，其结合于囊泡上的抗原。检测剂可结合于循环生物标志物，由此帮助对所述生物标志物的检测。例如，包含与基底相隔离的抗体或适体的捕获剂可用于捕获样品中的囊泡，并且包含携带标记的抗体或适体的检测剂可用于通过对检测剂的标记物的检测而检测所捕获的囊泡。在一些实施方案中，使用识别相同囊泡生物标志物的捕获剂和检测剂评估囊泡。例如，可使用四跨膜蛋白捕获囊泡群体(诸如通过使用结合于基底的抗CD9抗体)，并且可使用荧光标记的抗CD9抗体标记所捕获的囊泡从而检测所捕获的囊泡。在其它实施方案中，使用识别不同囊泡生物标志物的捕获剂和检测剂评估囊泡。例如，可使用细胞特异性标志物捕获囊泡群体(诸如通过使用结合于基底的抗PCSA抗体)，并且可使用荧光标记的抗CD9抗体标记所捕获的囊泡从而检测所捕获的囊泡。类似地，可使用一般囊泡标志物捕获囊泡群体(诸如通过使用结合于基底的抗CD9抗体)，并且可使用针对细胞特异性或疾病特异性标志物的荧光标记抗体标记所捕获的囊泡从而检测所捕获的囊泡。
结合剂识别的生物标志物在本文中有时候称为抗原。除非另外特意指出，本文中所用的抗原意思是包括能够被结合剂结合的任何实体，而与结合剂的类型或生物标志物的免疫原性无关。抗原进一步包括其功能性片段。例如，抗原可以包括能够被结合剂结合的蛋白质生物标志物，包括能够被结合剂结合的蛋白质的片段。
在一个实施方案中，使用结合于囊泡上的生物标志物的捕获剂捕获囊泡。根据本发明进一步描述的，所述捕获剂可偶联于基底并且用于分离囊泡。在一个实施方案中，将捕获剂用于对存在于基底或样品中的囊泡的亲和捕获或分离。
可以在从生物样品中浓缩或分离囊泡之后使用结合剂。例如，在分离或检测具有特定生物印记的囊泡之前，可首先从生物样品分离囊泡。可使用所述生物标志物的结合剂分离或检测具有特定生物印记的囊泡。可从囊泡的异质群体中分离或检测具有特定生物印记的囊泡。或者，可在不进行事先的分离或浓缩步骤的情况下对包含囊泡的生物样品使用结合剂。例如，将结合剂用于直接从生物样品分离或检测具有特定生物印记的囊泡。
结合剂可以是核酸、蛋白质或可结合囊泡组分的其它分子。所述结合剂可以包含DNA、RNA、单克隆抗体、多克隆抗体、Fab、Fab′、单链抗体、合成抗体、适体(DNA/RNA)、类肽、zDNA、肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA)、凝集素、合成或天然形成的化学化合物(包括但不限于药物、标记试剂)、枝状物或它们的组合。例如，所述结合剂可以是捕获抗体。在本发明的实施方案中，所述结合剂包括膜蛋白标记剂。例如，参见，公开于Alroy等的美国专利公开号US2005/0158708中的膜蛋白标记剂。在一个实施方案中，根据本发明描述分离或捕获囊泡，并且将一种或多种膜蛋白标记剂用于检测所述囊泡。
在某些情况下，可以使用单一的结合剂来分离或检测囊泡。在其它情况中，可以使用不同结合剂的组合来分离或检测囊泡。例如，可以使用至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、50、75或100种不同的结合剂来从生物样品中分离或检测囊泡。此外，根据下文中进一步描述，用于囊泡的一种或多种不同的结合剂可以形成囊泡的生物印记。
还可以使用不同的结合剂来进行复用。例如，可以通过使用不同的结合剂来分离或检测各种囊泡群体从而实施多于一种囊泡群体的分离或检测。不同的结合剂可以与不同的颗粒结合，其中所述不同的颗粒被标记。在另一个实施方案中，可以将包含不同结合剂的阵列用于多重分析，其中所述不同的结合剂被差异地标记，或者可以根据结合剂在阵列上的位置来确定。可以在标记物或检测方法的最高分辨能力下完成复用，如下文中所述。可将所述结合剂用于检测囊泡，诸如用于检测细胞源特异性囊泡。一种结合剂或多种结合剂本身可形成结合剂分布，其提供了囊泡的生物印记。一种或多种结合剂可选自2011年4月6日提交的发明名称为“用于疾病的循环生物标志物”的国际专利申请系列No.PCT/US2011/031479的图2，将该申请全部按引用并入本文中作为参考。例如，如果在囊泡的异质群体的囊泡差异检测或分离中使用2种、3种、4种或更多种结合剂检测或分离囊泡群体，则所述囊泡群体的特定结合剂分布提供了该特定囊泡群体的生物印记。可使用多种结合剂以多重方式检测囊泡。因此，所述结合剂还可用于形成囊泡的生物印记。所述生物印记可用于表征表型。
所述结合剂可以是凝集素。凝集素是选择性地结合多糖和糖蛋白的蛋白质，且广泛地分布于植物和动物中。例如，为分离囊泡可使用来自雪花莲(Galanthus nivalis)的雪莲花凝集素(“GNA”)形式的凝集素、来自黄水仙(Narcissus pseudonarcissus)的黄水仙凝集素(“NPA”)形式的凝集素或来自蓝绿藻类椭孢念珠藻(Nostoc ellipsosporum)的名为“蓝藻抗病毒蛋白(cyanovirin)”的凝集素(Boyd等，Antimicrob Agents Chemother41(7)：15211530，1997；Hammar等，Ann N YAcad Sci724：166169,1994；Kaku等，Arch Biochem Biophys279（2)：298304，1990)。这些凝集素可结合于具有高甘露糖含量的糖蛋白(Chervenak等Biochemistry34(16)：56855695，1995)。高甘露糖糖蛋白指的是具有α-1→3或α-1→6甘露糖-甘露糖键形式的甘露糖-甘露糖连接的糖蛋白。
所述结合剂可以是结合一种或多种凝集素的物质。凝集素捕获可应用于生物标志物组织蛋白酶D的分离，这是因为其为能够结合凝集素雪莲花凝集素(GNA)以及伴刀豆蛋白A(ConA)的糖基化蛋白质。
使用凝集素以捕获囊泡的方法和装置描述于2010年11月30日提交的题为“METHODS AND SYSTEMS FOR ISOLATING，STORING，ANDANALYZING VESICLES”的国际专利申请PCT/US2010/058461；2009年12月3日提交的题为“AFFINITY CAPTURE OF CIRCULATINGBIOMARKERS”的PCT/US2009/066626；2010年6月4日提交的题为“METHODS AND MATERIALS FOR ISOLATING EXOSOMES”的PCT/US2010/037467；以及2007年3月9日提交的题为“EXTRACORPOREAL REMOVAL OF MICROVESICULARPARTICLES”的PCT/US2007/006101，各个申请全文均以引用的方式并入本文。
结合剂可以为抗体。例如，可以使用对囊泡上存在的一种或多种抗原具有特异性的一种或多种抗体来分离囊泡。例如，囊泡可在其表面上具有CD63，并且针对CD63的抗体或捕获抗体可以用于分离所述囊泡。或者，源自肿瘤细胞的囊泡可表达EpCam，可以使用针对EpCam和CD63的抗体来分离所述囊泡。用于分离囊泡的其它抗体可包括针对CD9、PSCA、TNFR、CD63、B7H3、MFG-E8、EpCam、Rab、CD81、STEAP、PCSA、PSMA或5T4的抗体或捕获抗体。用于分离囊泡的其它抗体可包括针对DR3、STEAP、epha2、TMEM211、MFG-E8、组织因子(TF)、unc93A、A33、CD24、NGAL、EpCam、MUC17、TROP2或TETS的抗体或捕获抗体。
在一些实施方案中，所述捕获剂是针对CD9、CD63、CD81、PSMA、PCSA、B7H3、EpCam、PSCA、ICAM、STEAP或EGFR的抗体。捕获剂还可用于鉴定囊泡的生物标志物。例如，捕获剂如针对CD9的抗体识别CD9作为囊泡的生物标志物。在一些实施方案中可使用多种捕获剂，诸如在多重分析中。所述多种捕获剂可包括针对CD9、CD63、CD81、PSMA、PCSA、B7H3、EpCam、PSCA、ICAM、STEAP和EGFR中的一种或多种的结合剂。在一些实施方案中，所述多种捕获剂包括针对CD9、CD63、CD81、PSMA、PCSA、B7H3、MFG-E8和/或EpCam的结合剂。在再其它的实施方案中，所述多种捕获剂包括针对CD9、CD63、CD81、PSMA、PCSA、B7H3、EpCam、PSCA、ICAM、STEAP和/或EpCam的结合剂。所述多种捕获剂包括针对TMEM211、MFG-E8、组织因子(TF)和/或CD24的结合剂。
本文所提及的抗体可以为免疫球蛋白分子或免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即，包含特异性地结合抗原的抗原结合位点的分子和合成抗体。免疫球蛋白分子可以为免疫球蛋白分子的任何种类(例如IgG、IgE、IgM、IgD或IgA)或亚类。抗体包括但不限于多克隆抗体、单克隆抗体、双特异性抗体、合成抗体、人源化抗体或嵌合抗体、单链抗体、Fab片段和F(ab′)2片段、Fv或Fv′部分、由Fab表达文库产生的片段、抗独特型(抗-Id)抗体或者上文所述的任意抗体的表位结合片段。如果抗体优先地与抗原结合，并且例如与另一种分子具有低于约30％、20％、10％、5％或1％的交叉反应性，则该抗体，或者通常情况下的任何分子，“特异性地结合”抗原(或其它分子)。
结合剂还可以为多肽或肽。多肽以最广义的理解使用，并且可以包括亚单元氨基酸、氨基酸类似物或拟肽的序列。所述的亚单元可以通过肽键连接。所述的多肽可以为天然存在的、天然存在多肽的加工形式(例如通过酶促消化)、化学合成的多肽或重组表达的。可以使用标准的技术对用于本发明的方法中的多肽进行化学合成。所述的多肽可以包含D-氨基酸(其对L-氨基酸特异性蛋白酶具有抗性)、D-和L-氨基酸的组合、β氨基酸或各种其它设计或非天然存在的氨基酸(例如β-甲基氨基酸、Cα-甲基氨基酸和Nα-甲基氨基酸等)，从而赋予特定的性质。合成的氨基酸可以包括对应赖氨酸的鸟氨酸及对应亮氨酸或异亮氨酸的正亮氨酸。此外，所述的多肽可以具有拟肽键，例如酯键，从而制备具有新性质的多肽。例如，可以生成引入了还原肽键(即，R1-CH2-NH-R2，其中R1和R2为氨基酸残基或序列)的多肽。可以将还原肽键作为二肽亚单元引入。这种多肽对蛋白酶活性具有抗性，并且在体内具有延长的半衰期。多肽还可以包括类肽(N-取代的甘氨酸)，其中侧链侧接到沿分子主链的氮原子上，而并非如在氨基酸中一样与α-碳相连。在本申请的全文中，多肽和肽意图可互换地使用，即，在使用术语肽的情况下，其还可以包括多肽，而在使用术语多肽的情况下，其还可包括肽。术语“蛋白质”在整个本申请中也意图与术语“多肽”和“肽”可互换使用，除非另外特意指出。
可使用结合剂分离、捕获或检测囊泡。所述结合剂可以是结合囊泡“管家蛋白(housekeeping protein)”或一般囊泡生物标志物的物质。所述生物标志物可以为CD63、CD9、CD81、CD82、CD37、CD53、Rab-5b、膜联蛋白V或MFG-E8。四跨膜蛋白，具有四个跨膜结构域的膜蛋白家族，可用作为一般囊泡标志物。所述四跨膜蛋白包括CD151、CD53、CD37、CD82、CD81、CD9和CD63。哺乳动物中已经鉴定了超过30种四跨膜蛋白，其包括TSPAN1(TSP-1)、TSPAN2(TSP-2)、TSPAN3(TSP-3)、TSPAN4(TSP-4、NAG-2)、TSPAN5(TSP-5)、TSPAN6(TSP-6)、TSPAN7(CD231、TALLA-1、A15)、TSPAN8(CO-029)、TSPAN9(NET-5)、TSPAN10(视素蛋白(Oculospanin))、TSPAN11(CD151样)、TSPAN12(NET-2)、TSPAN13(NET-6)、TSPAN14、TSPAN15(NET-7)、TSPAN16(TM4-B)、TSPAN17、TSPAN18、TSPAN19、TSPAN20(UP1b、UPK1B)、TSPAN21(UP1a、UPK1A)、TSPAN22(RDS、PRPH2)、TSPAN23(ROM1)、TSPAN24(CD151)、TSPAN25(CD53)、TSPAN26(CD37)、TSPAN27(CD82)、TSPAN28(CD81)、TSPAN29(CD9)、TSPAN30(CD63)、TSPAN31(SAS)、TSPAN32(TSSC6)、TSPAN33和TSPAN34。其它常见的囊泡标志物包括表3中列出的标志物。可使用任意这些蛋白质作为囊泡标志物。此外，在鉴定针对疾病或病症的候选生物印记中，可以选择本文或表3中公开的任一种标志物，其中所述一种或多种选定的生物标志物在涉及疾病或病症的机制中具有直接或间接的作用或功能。
表3：来自多种细胞类型的囊泡中观察到的蛋白质
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所述结合剂还可以是结合源自特定细胞类型(诸如肿瘤细胞)或特定细胞源的囊泡的物质(如，针对组织因子、EpCam、B7H3、RAGE、或CD24的结合剂)。用于分离或检测囊泡的结合剂可以是用于选自2011年4月6日提交的发明名称为“用于疾病的循环生物标志物”的国际专利申请系列No.PCT/US2011/031479的图1的抗原的结合剂，将该申请全部按引用并入本文中作为参考。囊泡的结合剂还可以选自国际专利申请系列No.PCT/US2011/031479的图2中所列的那些。所述结合剂可以针对抗原，诸如四跨膜蛋白、MFG-E8、膜联蛋白V、5T4、B7H3、小窝蛋白、CD63、CD9、E-钙粘蛋白、组织因子、MFG-E8、TMEM211、CD24、PSCA、PCSA、PSMA、Rab-5B、STEAP、TNFR1、CD81、EpCam、CD59、CD81、ICAM、EGFR或CD66。用于血小板的结合剂可以是糖蛋白，诸如GpIa-IIa、GpIIb-IIIa、GpIIIb、GpIb或GpIX。结合剂可以针对包含CD9、Erb2、Erb4、CD81、Erb3、MUC16、CD63、DLL4、HLA-Drpe、B7H3、IFNAR、5T4、PCSA、MICB、PSMA、MFG-E8、Muc1、PSA、Muc2、Unc93a、VEGFR2、EpCAM、VEGF A、TMPRSS2、RAGE、PSCA、CD40、Muc17、IL-17-RA和CD80的一种或多种的抗原。例如，结合剂是可以是CD9、CD63、CD81、B7H3、PCSA、MFG-E8、MUC2、EpCam、RAGE和Muc17的一种或多种。可以使用一种或多种结合剂(例如针对两种或更多种抗原的一种或多种结合剂)来分离或检测囊泡。可以根据分离或检测衍生自特定细胞类型的囊泡或细胞源特异性囊泡的需要来选择所用的结合剂。
结合剂还可以与固体表面或基底直接或间接连接。固体表面或基底可以是结合剂可直接或间接附接的任意可物理分离的固体，包括但不限于通过微阵列和孔、颗粒(例如珠)、柱、光纤、拭子、玻璃和改性的或功能化的玻璃、石英、云母、重氮化的膜(纸或尼龙)、聚甲醛、纤维素、醋酸纤维素、纸、陶瓷、金属、类金属、半导体材料、量子点、涂敷的珠或颗粒、其它色谱材料、磁性颗粒所提供的表面；塑料(包括丙烯酸类、聚苯乙烯、苯乙烯或其它材料的共聚物、聚丙烯、聚乙烯、聚丁烯、聚亚安酯、聚四氟乙烯(PTFE，
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)等)、多糖、尼龙或硝基纤维素、树脂、二氧化硅或基于二氧化硅的材料(包括硅和改性硅)、碳、金属、无机玻璃、塑料、陶瓷、导电聚合物(包括诸如聚吡咯和聚吲哚这样的聚合物)所提供的表面；微结构或纳米结构的表面，例如核酸铺盖的阵列、纳米管、纳米线或者纳米颗粒装饰的表面；或者多孔表面或凝胶，例如甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺、糖聚合物、纤维素、硅酸盐或者其它纤维状或链状聚合物。此外，如本领域中已知的，可以使用具有多种材质(包括聚合物，如右旋糖苷、丙烯酰胺、明胶或琼脂糖)的钝化或化学衍生化的涂层来涂敷基底。这些涂层可以有助于将阵列用于生物样品。
例如，用于分离囊泡的抗体可以结合于固体基底如孔，如市售可得的平板(例如得自Nunc，Milan，Italy)。可以使用抗体涂覆各孔。在一些实施方案中，用于分离囊泡的抗体与诸如阵列的固体基底结合。所述的阵列可以具有预定的分子相互作用、结合岛、生物分子、区带、域的空间排列，或者结合岛或者分布于离散区域内的结合剂的空间排列。此外，术语阵列在本文中可以用于指在表面上排列的多矩阵，例如可以为表面上具有阵列的多个拷贝的情况。这种具有多阵列的表面还可以称为多重阵列或重复阵列。
阵列通常含有可寻址的部分，其可以通过结合事件来检测实体例如样品中的囊泡的存在。阵列可以称为微阵列。阵列或微阵列包括但不限于DNA微阵列，如cDNA微阵列、寡核苷酸微阵列和SNP微阵列、微RNA阵列、蛋白质微阵列、抗体微阵列、组织微阵列、细胞微阵列(也称为转染微阵列)、化学化合物微阵列和碳水化合物阵列(糖阵列)。DNA阵列通常包含可寻址的核苷酸序列，其可以结合样品中存在的序列。微RNA阵列，例如，来自路易斯维尔大学的MMChips阵列或来自Agilent的商业系统，可以用于检测微RNA。蛋白质微阵列可以用于鉴定蛋白质-蛋白质相互作用，包括但不限于鉴定蛋白激酶的底物、转录因子蛋白激活，或用于鉴定生物活性小分子的靶标。蛋白质阵列可以包含不同蛋白质分子(通常抗体)或结合目标蛋白质的核苷酸序列的阵列。在非限制性实例中，蛋白质阵列可以用于检测在其表面上具有特定蛋白质的囊泡。抗体阵列包含点在蛋白质芯片上的抗体，其用作捕获分子来检测来自样品的蛋白质或其他生物材料，例如，来自细胞或组织溶解溶液。例如，抗体阵列可以用于检测来自体液(例如，血清或尿液)的囊泡相关生物标志物。组织微阵列包含以阵列方式装配的独立地组织核心，以允许进行多重组织学分析。细胞微阵列，也称为转染微阵列，包含各种捕获剂，如抗体、蛋白质或脂质，其可以与细胞相互作用以促进在可寻址位置上的捕获。由于囊泡和细胞膜之间的相似性，细胞阵列还可以用于捕获囊泡。化学化合物微阵列包含化学化合物的阵列，并且可以用于检测结合该化合物的蛋白质或其他生物材料。碳水化合物阵列(糖阵列)包含碳水化合物的阵列，并且可以用于检测例如结合糖部分的蛋白质。本领域技术人员将认识到根据本发明可以使用相似技术或改进。
结合剂还可以与颗粒结合，例如珠或微球。例如，对囊泡组分具有特异性的抗体可以与颗粒结合，并且抗体结合的颗粒用于从生物样品分离囊泡。在一些实施方案中，所述的微球可以为磁性的或荧光标记的。此外，用于分离囊泡的结合剂可以为固体基底本身。例如，可以使用胶乳珠，例如醛/硫酸盐珠(Interfacial Dynamics，Portland，OR)。
此外，还可以使用与磁珠结合的结合剂来分离囊泡。例如，可以收集来自患者的生物样品(例如血清)以用于结肠癌筛查。所述的样品可以与偶联到磁微珠上的抗-CCSA-3(结肠癌特异性抗原)一起孵育。低密度的微柱可以放置在MACS分离器的磁场中，然后用缓冲溶液(例如Tris缓冲盐水)洗涤该柱。然后，可以将磁性免疫复合物施加到柱上，并丢弃未结合的非特异性的物质。可以通过从分离器中移除柱并将其放置在收集管上来回收CCSA-3选择的囊泡。可以将缓冲剂加入到所述的柱上，并可以通过施加与该柱一起提供的柱塞来释放磁性标记的囊泡。可以在IgG洗脱缓冲液中稀释分离的囊泡，然后可以将复合物离心从而将微珠与囊泡分离。可将分离的细胞源特异性囊泡的沉淀重悬浮于缓冲液(例如磷酸盐缓冲盐水)中，并进行定量。或者，由于抗体捕获的细胞源特异性囊泡与磁微珠之间的强吸附力，可以使用蛋白水解酶(例如胰蛋白酶)来释放捕获的囊泡而无需离心。可以将蛋白水解酶与抗体捕获的细胞源特异性囊泡一起孵育至少足以释放所述囊泡的时间。
用于分离囊泡的结合剂(例如抗体)优选地与包含目标囊泡的生物样品接触至少足以使所述结合剂结合所述囊泡的组分的时间。例如，抗体可以与生物样品接触由数秒至数天的各种时间段，包括但不限于约10分钟、30分钟、1小时、3小时、5小时、7小时、10小时、15小时、1天、3天、7天或10天。
结合剂，如对2011年4月6日提交的发明名称为“用于疾病的循环生物标志物”的国际专利申请系列No.PCT/US2011/031479的图1中所列的抗原特异性的抗体，将该申请全部按引用并入本文中作为参考，或国际专利申请系列No.PCT/US2011/031479的图2中所列的结合剂，可以被标记以促进检测。合适的标记物包括但不限于磁性标记物、荧光部分、酶、化学发光探针、金属颗粒、非金属胶状颗粒、聚合物染料颗粒、颜料分子、颜料颗粒、电化学活性物质、半导体纳米晶体或其它纳米颗粒(包括量子点或金颗粒)、荧光团、量子点或放射性标记物。蛋白质标记物包括绿色荧光蛋白(GFP)及其变体(例如，青色荧光蛋白和黄色荧光蛋白)；和发光蛋白，如荧光素酶，如以下所述的。放射性标记物包括但不限于放射性同位素(放射性核素)，例如3H、11C、14C、18F、32p、35S、64Cu、68Ga、86y、99Tc、111In、123I、124I、125I、131I、133Xe、177Lu、211At或213Bi。荧光标记包括但不限于稀土螯合物(例如，铕螯合物)，罗丹明；荧光素类，包括但不限于FITC、5-羧基荧光素、6-羧基荧光素；罗丹明类，包括但不限于TAMRA；丹酰；丽丝胺(Lissamine)；花青素；藻红蛋白；德克萨斯红；Cy3、Cy5、dapoxyl、NBD、Cadcade黄、丹酰、PyMPO、芘、7-二乙基氨基香豆素3-羧酸和其他香豆素衍生物、MarinaBlueTM、Pacific BlueTM、Cascade BlueTM、2-蒽磺酰、PyMPO、3，4，9，10-二萘嵌苯-四羧酸、2,7-二氟荧光素(Oregon GreenTM488-X)、5-羧基荧光素、Texas RedTM-X、Alexa Fluor430、5-羧基四甲基罗丹明(5-TAMRA)、6-羧基四甲基罗丹明(6-TAMRA)、BODIPY FL、bimane和Alexa Fluor350、405、488、500、514、532、546、555、568、594、610、633、647、660、680、700和750，及其衍生物，以及其它。参见，例如，“TheHandbook--A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies”，第10版，可在互联网probes.invitrogen.com/handbook上获得。所述荧光标记物可以是FAM、dRHO、5-FAM、6FAM、dR6G、JOE、HEX、VIC、TET、dTAMRA、TAMRA、NED、dROX、PET、BHQ、Gold540和LIZ中的一种或多种。
结合剂可以直接或间接标记，例如，所述的标记物通过生物素-抗生蛋白链菌素与抗体连接。或者，抗体未标记，而是随后在第一抗体与目标抗原结合后与标记的第二抗体接触。
例如，各种酶-底物标记物是可得的或被公开的(例如参见美国专利No.4,275，149)。酶通常催化发色底物的化学改变，其可以使用各种技术测量。例如，酶可以催化底物的颜色变化，其可进行分光光度法测量。或者，酶可以改变底物的荧光或化学发光。酶标记物的实例包括荧光素酶(例如萤火虫荧光素酶和细菌荧光素酶；美国专利No.4,737,456)、荧光素、2,3-二氢酞嗪二酮、苹果酸脱氢酶、脲酶、过氧化物酶(例如辣根过氧化物酶(HRP))、碱性磷酸酶(AP)、β-半乳糖苷酶、葡萄糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶(例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶以及葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)、杂环氧化酶(例如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶)、乳过氧化物酶、微过氧化物酶等。酶-底物组合的实例包括但不限于：使用过氧化氢酶作为底物的辣根过氧化物酶(HRP)，其中过氧化氢酶氧化染料前体(例如邻苯二胺(OPD)或3，3′，5，5′-四甲基联苯胺盐酸盐(TMB))；使用对硝基苯基磷酸盐作为发色底物的碱性磷酸酶(AP)；以及使用发色底物(例如对硝基苯基-β-D-半乳糖苷酶)或发荧光底物(4-甲基伞形基-β-D-半乳糖苷酶)的β-D-半乳糖苷酶(β-D-Gal)。
根据所用的分离或检测方法，所述的结合剂可以与固体表面或基底(例如阵列、颗粒、孔和上文所述的其它基底)连接。用于将抗体与细胞表面直接化学偶联的方法在本领域中是已知，并且可以包括例如使用戊二醛或马来酰亚胺活化的抗体进行偶联。用于使用多步过程进行化学偶联的方法包括生物素化、使用例如三硝基苯酚(TNP)或地高辛配基的琥珀酰亚胺酯来偶联这些化合物。可以通过例如使用D-生物素基-N-羟基琥珀酰亚胺来完成生物素化。琥珀酰亚胺基团在pH值高于7，并且优选在约pH8.0至约pH8.5之间的条件下与氨基基团有效地反应。可以通过例如使用二硫苏糖醇处理细胞然后加入生物素马来酰亚胺而完成生物素化。
流式细胞分析
还可以使用流式细胞分析来实施使用颗粒如珠或微球对囊泡的分离或检测。可以使用流式细胞分析来分选悬浮于流体流中的微观颗粒。当颗粒通过时，它们可以选择性地带电并在它们离开时可以偏转到独立的流路径中。因此，有可能以高精确度和速度分离来自原始混合物(例如生物样品)的群体。流式细胞分析允许对流过光学/电子检测装置的单细胞的物理和/或化学特征同时进行多参数分析。单频率(颜色)的光束(通常为激光)指向在流体动力学聚焦的流体流上。多个检测器瞄准于流体流经过光束的点；一个与该光束重合(正向散射或FSC)并且几个垂直于该光束(侧向散射或SSC)以及一个或多个荧光检测器。
通过光束的各悬浮颗粒以某种方式散射光线，并且颗粒中的荧光化学物质可以被激发以发射频率低于光源的光。散射光与荧光的这种组合被检测器所拾取，并通过分析各检测器(各个荧光发射峰一个检测器)处亮度的波动，有可能推断关于各单个颗粒的物理和化学结构的各种因素。FSC与细胞尺寸相关，而SSC取决于微粒的内部复杂性，例如细胞核的形状、细胞质颗粒物的量和类型或者膜的粗糙度。一些流式细胞仪无需荧光而仅使用光散射来进行测量。
流式细胞仪可以以“实时”的方式每秒分析几千个颗粒，并且可以主动地分开并分离具有指定性质的颗粒。它们提供了在各分析阶段中对于大量单一细胞的设定参数的高通量自动化的定量和分离。流式细胞仪可以具有多个激光和荧光检测器，从而允许使用多种标记物以按照目标群体的表型更精确地对其加以指定。因此，流式细胞仪(诸如多色流式细胞仪)可用于检测具有多种荧光标记或颜色的一种或多种囊泡。在一些实施方案中，所述流式细胞仪还可分选或分离不同囊泡群体，诸如根据大小或根据不同的标志物。
所述流式细胞仪可具有一种或多种激光，诸如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多种激光。在一些实施方案中，所述流式细胞仪可检测多于一种颜色或荧光标记，诸如至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20种不同颜色或荧光标记。例如，所述流式细胞仪可具有至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个荧光检测器。
可用于检测或分析一种或多种囊泡、用于分选或分离不同的囊泡群体的商购可得的流式细胞仪的实例包括但不限于MoFloTM XDP CellSorter(Beckman Coulter，Brea，CA)、MoFloTM Legacy Cell Sorter(BeckmanCoulter，Brea，CA)、BD FACSAriaTM Cell Sorter(BD Biosciences，San Jose，CA)、BDTM LSRII(BD Biosciences，San Jose，CA)以及BD FACSCaliburTM(BD Biosciences，San Jose，CA)。根据下文进一步描述的，使用多色或多荧光细胞计数仪可用于囊泡的多重分析。在一些实施方案中，所述流式细胞仪可分选，并且因此根据一种或多种特征收集或分选超过一种囊泡群体。例如，两种囊泡群在大小上不同，从而使各个群体中的囊泡具有相似的大小范围并且可被差异地检测或分选。在另一个实施方案中，两种不同的囊泡群体进行差异标记。
可将得自流式细胞仪的数据以1维的方式作图从而得到柱状图，或者以2维的方式如点状图或使用较新的软件以3维方式来观察。这些点上的区域可以通过一系列亚集提取(其称为门控)来顺序分离。存在用于诊断和临床目的的特定的门控方案，特别是涉及血液学。这些图通常以对数比例完成。因为不同荧光染料的发射谱重叠，所以在检测器处的信号不得不通过电学以及计算方式来补偿。用于标记生物标志物的荧光团可包括Ormerod，Flow Cytometry第2版，Springer-Verlag，New York(1999)和Nida等，Gynecologic Oncology2005；4889-894中所述的荧光团，其以引用的方式并入本文。
多重分析
多重实验包括可在单一分析中同时测量多种分析物的实验。可以以多重方式评估囊泡和相关生物标志物。不同的结合剂可以用于复用不同的循环生物标志物，例如，微RNA、蛋白质或囊泡群体。可以使用不同的结合剂来分离或检测不同的生物标志物，例如，不同的囊泡群体。可以使用不同的信号标记物(例如荧光团、量子点或放射性标记物，如上文所描述的)标记生物样品中的各群体。所述的标记物可以与结合剂直接偶联，或者间接用于检测结合囊泡的结合剂。在多重分析中检测的群体数量取决于标记物的分辨能力和信号的总和，因为与两种或更多种亲和元件结合的两种以上的差异标记的囊泡群体可以产生总和的信号。
可以进行至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、50、75或100种不同循环生物标志物的复用。例如，对细胞源具有特异性的一种囊泡群体可以与对不同细胞源具有特异性的第二种囊泡群体一起分析，其中各群体以不同标记物标记。或者，具有特定的生物标志物或生物印记的囊泡群体可以与具有不同生物标志物或生物印记的第二种囊泡群体一起分析。在某些情况下，可在单一分析中评估数百种或数千种囊泡。
在一个实施方案中，通过将包含多于一种囊泡群体的多种囊泡施加到多个基底(例如珠)上来进行多重分析。各珠与一种或多种捕获剂偶联。将多个珠分为亚组，其中具有相同捕获剂或捕获剂组合的珠形成珠的亚组，从而使珠的各个亚组具有不同于另一个珠亚组的捕获剂或捕获剂组合。然后，所述的珠可以用于捕获包含与所述捕获剂相结合的组分的囊泡。所述不同亚组可以用于捕获不同的囊泡群体。然后，可以通过检测一种或多种生物标志物来分析捕获的囊泡。
流式细胞分析可以与基于颗粒或基于珠的分析方法组合使用。可以使用多参数免疫分析方法或其它高通量的检测分析方法(其使用与高度灵敏自动化技术相容的具有同源配基的珠涂层以及具有特异活性的报告分子)。例如，各亚组中的珠与另一亚组的珠是差异标记的。在基于颗粒的分析系统中，用于囊泡的结合剂或捕获剂(例如捕获抗体)可以固定于可编址的珠或微球上。用于各单个结合分析(例如当结合剂为抗体时的免疫分析)的各结合剂可以与截然不同类型的微球(即，微珠)偶联，并且结合分析反应发生在微球的表面上。微球可以根据不同的标记物而相区别，例如与具有不同捕获剂的另一种微球相比，具有特定捕获剂的微球具有不同的信号标记。例如，微球可以染色为具有离散的荧光强度，从而使得具有特定结合剂的微球的荧光强度不同于具有不同结合剂的另一种微球的荧光强度。可以使用不同的标记差异地检测被不同捕获剂结合的生物标志物。
微球可以使用至少2种不同的标记物或染料进行标记或染色。在一些实施方案中，使用至少3、4、5、6、7、8、9或10种不同的标记物对所述的微球进行标记。多种微球中的不同微球可以具有多于一种的标记或染料，其中各个微球亚组具有各种不同比例和组成的标记物或染料，从而允许检测具有不同结合剂的不同微球。例如，各种不同比例和组成的标记物和染料可以允许不同的荧光强度。或者，各种不同比例和组成可以用于产生不同的检测模式以鉴定结合剂。所述的微球可进行外部标记或染色，或者可以具有内在的荧光或信号标记。珠可以单独地加载它们合适的结合剂，并因此可以根据差异标记的微球(不同的结合剂与其偶联)上的不同结合剂来分离不同的囊泡群体。
在另一个实施方案中，可以使用平面基底进行多重分析，其中所述的基底包含多种捕获剂。所述的多种捕获剂可以捕获一种或多种囊泡群体，并检测所捕获囊泡的一种或多种生物标志物。根据下文进一步描述的，平面基底可以为微阵列或其它基底。
结合剂
可以使用针对囊泡的新型组分的结合剂(例如对于目标囊泡特异性的新抗原的抗体)来分离或检测囊泡。可以使用与基底(例如阵列或多个颗粒)结合的已知组成的不同测试化合物来分离或鉴别对目标囊泡特异性的新抗原，其可以允许仅使用小部分空间而对大量的化学/结构空间进行充分取样。所鉴定的新抗原还可作为所述囊泡的生物标志物发挥作用。例如，针对细胞源特异性的囊泡鉴定的新抗原可以为有用的生物标志物。
对于接触样品所使用的术语“剂”或“试剂”可以表示任何设计用来结合、杂交、缔合或以另外的方式检测目标分子或帮助目标分子检测的实体，包括目标多肽、肽、核酸分子、瘦素(leptin)、脂质或按照本文中所述的或本领域已知的可以检测的任何其他生物实体。这样的剂/试剂的实例是本领域公知的，并且包括但不限于通用的或特异性的核酸引物、核酸探针、抗体、适体、类肽、肽核酸、锁核酸、凝集素、树枝状聚合物(dendrimer)、化学化合物或本文所述的或本领域已知的其他实体。
可以通过针对测试化合物筛选均质的或异质的囊泡群体来鉴定结合剂。由于基底表面上各测试化合物的组成是已知的，所以这构成了对亲和性元件的筛选。例如，测试化合物阵列在基底可编址位置上的特定位置处包含测试化合物，并可以用于鉴定用于囊泡的一种或多种结合剂。基于核心序列或结构的较小变化，测试化合物可以全部是不相关的或者是相关的。不同的测试化合物可以包括给定测试化合物的变体(例如多肽的异型体)、结构上或组成上不相关的测试化合物或它们的组合。
测试化合物可以是类肽、多糖、有机化合物、无机化合物、聚合物、脂质、核酸、多肽、抗体、蛋白质、多糖或其它化合物。所述的测试化合物可以为天然的或合成的。所述的测试化合物可以包含基于多种键或键组合(例如酰胺、酯、醚、硫醇、自由基加成、金属配位等)的线性或分支的杂聚合化合物、枝状结构、环形结构、腔结构或者具有多个临近的连接位点从而在进行特别加入时起到支架作用的其它结构，或者由它们组成。可以使用本领域中的标准方法将测试化合物点样于基底上或进行原位合成。此外，所述的测试化合物可以以组合方式进行点样或原位合成以检测有用的相互作用，例如协同结合。
所述的测试化合物可以为具有已知的氨基酸序列的多肽，因此，对测试化合物与囊泡的结合进行检测可以导致对可以用作结合剂的已知氨基酸序列的多肽的鉴定。例如，可以将囊泡的均质群体施加到载玻片上的点样阵列上(包含数种至1,000,000种具有可变氨基酸长度的测试多肽)。所述的多肽可以通过C-末端与表面连接。所述多肽的序列可以由19种氨基酸(不包括半胱氨酸)随机生成。结合反应可以包括非特异性的竞争剂(例如使用另一种染料标记的过量的细菌蛋白质)，从而可以测定针对各多肽结合靶的特异性比率。可以选择具有最高特异性和结合的多肽。各点上多肽的身份是已知的，且由此可以容易地鉴定。一旦鉴定出对所述均质囊泡群体(例如细胞源特异性囊泡)具有特异性的新抗原，则随后在下文所述的方法中可以使用这些抗原分离这类细胞源特异性囊泡。
此外，还可以使用阵列来鉴定作为囊泡结合剂的抗体。测试抗体可以与阵列连接，并针对异质囊泡群体进行筛选以鉴定可以用于分离或鉴定囊泡的抗体。此外，还可以使用抗体阵列来筛选均质的囊泡群体(例如细胞源特异性囊泡)。除了鉴定抗体以分离或检测均质的囊泡群体之外，还可以鉴定对均质的群体具有特异性的一种或多种蛋白质生物标志物。可以使用市售可得的平台，其具有连接于所述阵列的预选的测试抗体或定制选择的测试抗体。例如，可以使用前列腺癌细胞源的囊泡来筛选来自Full Moon Biosystems的抗体阵列，其将针对Bcl-XL、ERCC1、角蛋白15、CD81/TAPA-1、CD9、上皮特异性抗原(ESA)和肥大细胞糜蛋白酶的抗体鉴定为结合剂，并且所鉴定的蛋白质可以用作所述囊泡的生物标志物。生物标志物可以在囊泡中或囊泡上存在或不存在、表达不足或过表达、突变或修饰，并且用于表征状况。
还可以通过肽阵列鉴定待用作结合剂的抗体或合成抗体。另一种方法是使用通过抗体噬菌体展示产生合成抗体。抗体(例如Fab)的M13噬菌体文库作为与外壳蛋白的融合体呈现在噬菌体颗粒的表面上。各噬菌体颗粒呈现独特的抗体，并且还包封了包含编码DNA的载体。可以构建高度多样的文库，并作为噬菌体库而表示，其可以用于选择结合固定的抗原的抗体。固定的抗原保持了抗原结合噬菌体，而未结合的噬菌体通过洗涤除去。可以通过大肠杆菌宿主的感染来扩增保持的噬菌体库，并可将扩增的库用于另外轮次的选择，从而最终得到抗原结合克隆占优势的群体。在这一阶段，可以分离单个噬菌体克隆并进行DNA测序，从而解码呈现的抗体的序列。通过使用噬菌体展示以及本领域中已知的其它方法，可以产生针对囊泡的高亲和性设计抗体。
基于珠的分析还可以用于鉴定新型结合剂以分离或检测囊泡。测试抗体或肽可以与颗粒偶联。例如，珠可以与抗体或肽偶联，并用于检测和定量在囊泡群体的表面上表达的蛋白质，从而发现并特异性地选择可以靶向来自特定组织或肿瘤类型的囊泡的新型抗体。可以通过使用市售可得的试剂盒根据制造商提供的说明书使器官源(organic origin)的任何分子成功地与聚苯乙烯珠偶联。各珠的组都可以以特定可检测的波长发色，并且各组都可以与已知的抗体或肽连接，其中所述的抗体或肽可以用于特异性地测量哪些珠与外来体蛋白质连接，从而与之前偶联的抗体或肽的表位相匹配。所述的珠可以离散的荧光强度染色，使得具有不同强度的各个珠具有上文所述的不同结合剂。
例如，根据经验确定的动态分析范围，可以将纯化的囊泡制剂在分析缓冲液中稀释至合适的浓度。可以制备足量体积的偶联珠，并将大约1μl的抗体偶联珠等分至孔中和调节至最终体积约50μl。一旦将抗体偶联的珠加入到真空相容板中，可对该珠进行洗涤以确保合适的结合条件。然后，可以将适量体积的囊泡制剂加入到待测试的各孔中并孵育所述混合物，例如15-18小时。可以使用检测抗体稀释溶液制备足量体积的检测抗体，并与所述混合物孵育1小时或所需的时间。随后，在加入由抗生蛋白链菌素藻红蛋白构成的检测抗体(生物素表达)混合物之前洗涤所述珠。然后，可以洗涤珠，并真空抽吸几次，然后使用与仪器一起提供的软件在悬液阵列系统上进行分析。之后，可以从该分析阐明可用于选择性地提取囊泡的抗原的身份。
使用了成像系统的分析可以用于检测并定量在囊泡的表面上表达的蛋白质，从而发现并特异性地选择和富集来自特定组织、细胞或肿瘤类型的囊泡。可以使用与多孔多重碳涂覆板偶联的抗体、肽或细胞。可以通过使用列于图案化的碳工作表面上的捕获抗体实现对孔中的多种分析物进行同时测量。然后，可以在具有增强电-化学发光板的电极孔中，使用以试剂标记的抗体检测分析物。器官源的任何分子可以成功地与所述碳涂覆板偶联。可以通过该分析鉴定出囊泡表面上表达的蛋白质，并可将其作为靶标用于特异性地选择和富集来自特定组织或肿瘤类型的囊泡。
所述结合剂还可以为适体，其指的是可与其互补序列之外的分子结合的核酸。适体一般包含30-80个核酸并且对于特定的靶分子可以具有高亲和性(所报道的Kd介于10-11-10-6摩尔/1)。可以使用指数富集的配体系统进化(SELEX)鉴定用于靶标的适体(Tuerk＆Gold，Science249：505-510，1990；Ellington＆SzostaK，Nature346：：818-822，1990)，例如在美国专利No.5,270,163，6,482，594，6,291，184，6,376，190以及US6,458，539中所述的。可以将核酸文库与目标囊泡相接触，并将特异性地与所述靶结合的那些核酸与文库中剩余的核酸(其不能特异性地结合所述靶)分开。将分开的核酸扩增以产生配体富集库。多轮的结合、分开和扩增(即，选择)实现了对具有所需活性的一种或多种适体的鉴定。用于鉴定适体从而分离囊泡的另一种方法在美国专利No.6,376,190中有所描述，所述文献描述了通过文库中核酸与化学合成的肽的结合而使得该核酸的频率增加或降低。还可以使用改进的方法，例如在美国专利公开No.20090264508中所描述的Laser SELEX或deSELEX。
如本文中关于结合剂使用的术语“特异性的”意思是试剂对其靶标具有比对其他靶标更高的亲和性，通常具有高得多的亲和性，但不需要结合剂对其靶标是绝对特异性的。
微流体装置
用于分离或鉴定囊泡的方法可以与微流体装置组合使用。可以使用微流体装置实施诸如本文所述的分离或检测囊泡的方法。亦可称为“芯片实验室”系统、生物医学微电子机械系统(bioMEM)或多部件集成系统的微流体装置可用于分离和分析囊泡。这类系统使得允许囊泡结合、生物印记检测以及其它过程微型化和区室化。
微流体装置还可以用于通过大小差异或亲和选择来分离囊泡。例如，微流体装置可以根据大小或者通过使用用于从生物样品分离囊泡的一种或多种结合剂而使用一个或多个通道从生物样品分离囊泡。可以将生物样品引入到一个或多个微流体通道中，其选择性地允许囊泡通过。可以根据囊泡的性质(例如囊泡的大小、形状、可变形性或生物印记)来进行选择。
在一个实施方案中，可以将囊泡的异质群体引入到微流体装置中，并可以得到一种或多种不同的均质囊泡群体。例如，不同的通道可以具有不同的大小选择或结合剂以选择不同的囊泡群体。因此，微流体装置可以分离多种囊泡，其中该多种囊泡的至少一个亚组包含不同于所述多种囊泡的另一个亚组的生物印记。例如，所述的微流体装置可以分离至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90或100个不同的囊泡亚组，其中各囊泡亚组包含不同的生物印记。
在一些实施方案中，所述的微流体装置可以包含允许囊泡的进一步富集或选择的一个或多个通道。在通过第一通道后已经富集的囊泡群体可以被引入到第二通道中，其允许所需囊泡或囊泡群体通过以进一步富集，例如通过存在于第二通道中的一种或多种结合剂。
可以与微流体装置一起使用基于阵列的分析和基于珠的分析。例如，结合剂可以与珠偶联，并且可以在微流体装置中实施所述珠与囊泡之间的结合反应。此外，还可以使用微流体装置进行复用。不同的区室可以包含针对不同的囊泡群体的不同结合剂，其中各群体为不同细胞源特异性的囊泡群体。在一个实施方案中，各群体具有不同的生物印记。可以在微流体装置中实施微球与囊泡之间的杂交反应，并且反应混合物可以被输递到检测装置中。所述的检测装置(例如双或多激光检测系统)可以为所述微流体系统的部分，并且可以通过各珠或微球的色彩编码使用激光来鉴定各珠或微球，而另一束激光可以检测与各珠相关的杂交信号。
任何合适的微流体装置可以用于本发明的方法中。可用于囊泡或经适应以用于囊泡的微流体装置的实例包括但不限于描述于美国专利No.7,591,936、7,581,429、7,579,136、7,575,722、7,568,399、7,552,741、7,544,506、7,541,578、7,518,726、7,488,596、7,485,214、7,467,928、7,452,713、7,452,509、7,449,096、7,431,887、7,422,725、7,422,669、7,419,822、7,419,639、7,413,709、7,411,184、7,402,229、7,390,463、7,381,471、7,357,864、7,351,592、7,351,380、7,338,637、7,329,391、7,323,140、7,261,824、7,258,837、7,253,003、7,238,324、7,238,255、7,233,865、7,229,538、7,201,881、7,195,986、7,189,581、7,189,580、7,189,368、7,141,978、7,138,062、7,135,147、7,125,711、7,118,910、7,118,661、7,640,947、7,666,361、7,704,735；以及国际专利公开号WO2010/072410中的那些装置；各专利或申请全文以引用的方式并入本文。用于本发明所公开方法的另一实例描述于Chen等，“Microfluidicisolation and transcriptome analysis of serum vesicles，”Lab on a Chip，2009年12月8日D0I：10.1039/b916199f中。
用于本发明中的其他微流体装置包括含有弹性体层、阀和泵的装置，包括但不限于U.S.专利No.5,376,252，6,408,878，6,645,432，6,719,868，6,793,753，6,899,137，6,929,030，7,040,338，7,118,910，7,144,616，7,216,671，7,250,128，7,494,555，7,501,245，7,601,270，7,691,333，7,754,010，7,837,946；U.S.专利申请No.2003/0061687，2005/0084421，2005/0112882，2005/0129581，2005/0145496，2005/0201901，2005/0214173，2005/0252773，2006/0006067；和EP专利No.0527905和1065378中公开的那些；将每篇申请按引用并入本文中作为参考。在一些情况中，许多或全部装置由弹性体材料构成。特定的装置设计成进行热循环反应(例如，PCR)，这样的装置包括一个或多个弹性体阀以调切通过装置的溶液流动。装置可以包括反应位点的阵列，由此允许进行多个反应。因此，装置可以用于以多重方式评价循环微RNA，包括从囊泡分离的微RNA。在一个实施方案中，微流体装置包括(a)弹性体基质中形成的多个第一流动通道；(b)弹性体基质中形成的多个第二流动通道，其与所述多个第一流动通道交叉以限定反应位点的阵列，每个反应位点位于第一和第二流动通道之一的交叉点处；(c)沿着多个第一和第二流动通道放置并且在反应位点之间间隔开的多个分离阀，其可以被致动以将每个反应位点内的溶液与其他反应位点处的溶液分隔开，其中分离阀包括一个或多个控制通道，其每自与一个或多个流动通道重叠和交叉；和(d)用于同时致动阀以将反应位点彼此分隔的装置。在本发明的范围内设想了所述装置的基础结构的各种改变。可以通过使用PCR方法在每个反应位点中检测微RNA。例如，所述方法可以包括以下步骤的步骤：(i)提供微流体装置，所述微流体装置包括：具有通过通道彼此流体连通的第一末端和第二末端的第一流体通道；多个流体通道，每个流体通道终止于端壁；其中每个流体通道从第一流体通道分支并且与第一流体通道流体连通，其中从第一流体通道进入流体通道之一的含水流体可以只通过第一流体通道流出流体通道；和，与第一流体通道流体连通的进口，该进口用于引入样品流体；其中每个流体通道与阀相关联，所述阀闭合时将流体通道的一端与第一流体通道分隔离，由此在阀和端壁之间形成分离的反应位点；控制通道；其中每个阀是可偏斜的膜，其在将致动力施加于控制通道时偏转到与阀相关联的流体通道中，由此将阀关闭；并且其中在致动力施加于控制通道时，各流体通道中的阀关闭，使得在各个流体通道中产生分离的反应位点；(ii)将样品流体引入进口中，样品流体填充流体通道；(iii)启动阀以将样品流体分入流体通道内的分开部分中；(iv)扩增样品流体中的核酸；(v)分析样品流体的部分以确定是否扩增产生了反应。样品流体可以含有可扩增的核酸靶标，例如，微RNA，并且条件可以是聚合酶链式反应(PCR)条件，以使得反应产生待形成的PCR产物。
在一个实施方案中，用于检测微RNA的PCR是数字PCR，其描述于Brown等，U.S.专利No.6,143,496，发明名称为“Method of sampling，amplifying and quantifying segment of nucleic acid，polymerase chainreaction assembly having nanoliter-sized chambers and methods of tillingchambers”，和Vogelstein等，U.S.专利No.6,446,706，发明名称为“DigitalPCR”，在此将两篇申请全部按引用并入本文中作为参考。在数字PCR中，将样品进行分配以使得样品内的单个核酸分子定位并集中于许多分开的区域内，如上述的微流体装置的反应位点。样品的分配使得可以通过根据Poisson的估算来计数分子。结果，各个部分将含有“0”或“1”分子，或者阴性或阳性反应。在PCR扩增后，可以通过计数含有PCR终产物，阳性反应的区域来定量核酸。在常规PCR中，起始拷贝数与PCR扩增循环的数量成比例。然而，数字PCR不是依赖于扩增循环数来测定初始样品量，从而消除了对定量目标核酸的不确定指数数据的依赖性并且提供了绝对定量。因此，所述方法可以提供灵敏的方法来检测样品中的微RNA。
在一个实施方案中，用于分离或检测囊泡的微流体装置包括宽度小于约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55或60mm或者宽度介于2-60、3-50、3-40、3-30、3-20或4-20mm之间的通道。微通道可具有小于约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、45、50、55、60、65或70μm或者介于约10-70、10-40、15-35或20-30μm的深度。此外，微通道具有小于约1、2、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5或10em的长度。所述微流体装置可在其顶板上具有沟槽，其宽度小于约40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、65、70、75或80μm或介于约40-80、40-70、40-60或45-55μm之间。所述沟槽的深度可小于约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45或50μm，如介于约1-50、5-40、5-30、3-20或5-15μm之间。
所述微流体装置可具有连接于通道表面或存在于通道中的一种或多种结合剂。例如，所述微通道可具有一种或多种捕获剂，诸如针对EpCam、CD9、PCSA、CD63、CD81、PSMA、B7H3、PSCA、ICAM、STEAP和EGFR的捕获剂。在一个实施方案中，微通道表面用抗生物素蛋白处理，并且可向所述通道中注入经生物素化的捕获剂(诸如抗体)以结合抗生物素蛋白。在其他实施方案中，捕获剂存在于微流体装置的室或其他部件中。捕获剂还可以连接可以进行操纵的珠子以通过微流体通道移动。在一个实施方案中，捕获剂连接磁珠。该珠可以使用磁体操纵。
可将生物样品流入所述微流体装置或微通道中，其流速为如至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45或50μ1每分钟，如介于约1-50、5-40、5-30、3-20或5-15μl每分钟之间。所述微流体装置中可捕获和直接检测一种或多种囊泡。或者，所捕获的囊泡可在分析前释放并且离开所述微流体装置。在另一个实施方案中，在所述微通道中裂解一种或多种被捕获的囊泡并可以分析裂解物，例如，用于检验囊泡内的有效负载。可使裂解缓冲液流过所述通道并裂解所捕获的囊泡。例如，可将裂解缓冲液流入所述装置或微通道，其流速为如至少约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、26、27、28、29、30、35、40、45或50μ1每分钟，如介于约1-50、5-40、10-30、5-30或10-35μl每分钟之间。可收集并分析所述裂解物，诸如进行RT-PCR、PCR、质谱、Western印迹或其它分析以检测所述囊泡的一种或多种生物标志物。
本文中所述的各种分离和检测系统可以用于分离或检测循环生物标志物，如囊泡，其提供关于这些疾病和失调的诊断、预后、疾病分级、治疗诊断、响应者/无响应者状态的预测、疾病监控、治疗监控等的信息。分离技术的组合在本发明的范围内。在非限制性实例中，样品可以通过色谱柱运行，以基于如电泳迁移率大小这样的特性来分离囊泡，并且然后可以将囊泡通过微流体装置。可以在这些步骤之前、之中或之后使用结合剂。
细胞和疾病特异性囊泡
本文所公开的结合剂可以用于分离或检测囊泡，例如细胞源囊泡或具有特定生物印记的囊泡。所述结合剂可用于从样品分离或检测异质囊泡群体或可用于从异质囊泡群体分离或检测均质囊泡群体，例如具有特定生物印记的细胞源特异性囊泡。
可分析均质囊泡群体(诸如细胞源特异性囊泡)并用于表征受试者的表型。细胞源特异性囊泡为源自特定细胞类型的囊泡，其可以包含但不限于特定组织的细胞、来自特定的目标肿瘤或者目标疾病组织的细胞、循环肿瘤细胞或者母体或胎儿来源的细胞。所述的囊泡可以源自肿瘤细胞或肺细胞、胰腺细胞、胃细胞、肠细胞、膀胱细胞、肾细胞、卵巢细胞、睾丸细胞、皮肤细胞、结肠直肠细胞、乳腺细胞、前列腺细胞、脑细胞、食管细胞、肝细胞、胎盘细胞或胎儿细胞。所述分离的囊泡还可以来自特定的样品类型，例如尿囊泡。
生物样品的细胞源特异性囊泡可以使用对细胞源具有特异性的一种或多种结合剂来分离。用于分析疾病或状况的囊泡可以使用对该疾病或状况的生物标志物具有特异性的一种或多种结合剂来分离。
在对细胞源特异性囊泡进行分离和检测之前，可以按照上文所述将囊泡浓缩，诸如通过离心、色谱或过滤，从而在分离细胞源特异性囊泡之前得到异质囊泡群体。或者，在分离细胞源囊泡之前所述的囊泡未经浓缩，或者所述的生物样品并未针对囊泡进行富集。
图1B说明了描绘用于分离或鉴定细胞源特异性囊泡的一种方法6100B的流程图。首先，在步骤6102中，由受试者获得生物样品。所述的样品可以得自第三方，或者得自实施所述分析的同一方。然后，在步骤6104中从生物样品分离细胞源特异性囊泡。随后在步骤6106中分析经分离的细胞源特异性囊泡，并在步骤6108中针对特定的表型来鉴定生物标志物或生物印记。所述的方法可以用于多种表型。在一些实施方案中，在步骤6104之前，将囊泡由生物样品浓缩或分离，从而得到均质的囊泡群体。例如，可以使用离心、色谱、过滤或上文所述的其它方法来分离异质囊泡群体，然后使用特别地用于分离或鉴定源自特定细胞类型的囊泡的一种或多种结合剂。
可以通过使用以高度的特异性与细胞源特异性囊泡相结合的一种或多种结合剂来从受试者的生物样品分离细胞源特异性囊泡。在某些情况下，可以使用单一结合剂来分离细胞源特异性囊泡。在其它情况中，可以使用结合剂的组合来分离细胞源特异性囊泡。例如，可以使用至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、50、75或100种不同的结合剂来分离细胞源的囊泡。因此，可以通过使用单一或多种结合剂来鉴定囊泡群体(例如具有相同的结合剂谱的囊泡)。
可以根据一种或多种结合剂针对对于细胞源(例如与肿瘤、自身免疫疾病、心血管疾病、神经疾病、感染或其它疾病或失调相关的细胞源)特异性的目标抗原的特异性来选择这些结合剂。所述细胞源可来自对于诊断、预后、疾病分级、治疗诊断、响应者/无响应者状态的预测、疾病监控、治疗监控等提供这些疾病或失调相关的信息的细胞。所述细胞源还可以来自有可用于发现用于其中的生物标志物的细胞。可以单独使用或组合地使用以分离细胞源特异性囊泡、疾病特异性囊泡或肿瘤特异性囊泡的抗原的非限制实例如2011年4月6日提交的发明名称为“Circulating Biomarkers for Disease”的国际专利申请系列No.PCT/US2011/031479的图1所示，将该申请全部按引用并入本文中作为参考，并在本文中还将进行描述。所述的抗原可以包含结合剂可接触的膜结合抗原。所述的抗原可以为与表征表型相关的生物标志物。
本领域的技术人员应当了解，本发明包括可用于分离信息性囊泡的任何可适用抗原。根据本文概述的，可选择识别表面抗原和/或其片段的结合剂，如抗体、适体和凝集素。所述结合剂可识别对于所需细胞类型或位置特异性的抗原，和/或识别与所需细胞相关的生物标志物。所述细胞可以是，例如，肿瘤细胞、其它患病细胞、用作为疾病标志物的细胞，诸如活化的免疫细胞等。本领域的技术人员应当了解，针对任意目标细胞的结合剂可用于分离与这些细胞相关的囊泡。本领域的技术人员应进一步了解，本文公开的结合剂可用于检测目标囊泡。作为非限制实例，针对囊泡生物标志物的结合剂可直接或间接标记以检测被一种或多种相同或不同的结合剂所结合的囊泡。
可用于结合与癌症、自身免疫疾病、心血管疾病、神经疾病、感染或其它疾病或失调相关的囊泡的结合剂的许多靶标在表4中示出。可使用该表中的抗原之一鉴定源自与所列的失调之一相关的细胞的囊泡。所述结合剂(如抗体或适体)可识别所列抗原的表位、其片段，或者结合剂可针对任意适当的组合使用。也可识别与所述疾病或失调相关的其它抗原以鉴定所述囊泡。本领域的技术人员应当了解，本发明包括可用于评估信息性囊泡的任意可适用抗体以用于分离、捕获或检测，从而鉴定囊泡。
表4：用于鉴定各种疾病和失调的说明性抗原
Figure BPA0000184824780000761
Figure BPA0000184824780000771
Figure BPA0000184824780000781
之前的表4，以及本文中公开的其他生物标志物列表是说明性的，并且申请人考虑结合各种不同疾病状态或状况之间公开的各种生物标志物。例如，本发明的方法可以使用各种不同疾病或病症之间的各种生物标志物，其中生物标志物可用于提供诊断、预后或治疗诊断印记。在一个实施方案中，本文中公开的或本领域已知的血管生成、炎性或免疫相关的抗原(或生物标志物)可以用于本发明的方法中以筛选生物印记鉴定中的生物样品。实际上，申请人评价微囊泡群体的多重方法的灵活性促进了评价不同病症或疾病的各种标志物(并且在一些情况中，重叠的标志物)，这些不同病症或疾病的病因学可能共有特定的细胞和生物学机制，例如，涉及针对血管生成或者免疫应答调控或调节的生物标志物的不同癌症。这些重叠生物标志物与组织或细胞特异性生物标志物的组合，连同微囊泡相关的生物标志物一起，提供了一系列强有力工具用于实施本发明的方法和组合物。
使用上文所述的方法，可使用新型结合剂来分离细胞源特异性的囊泡。此外，还可以使用基于这些囊泡的细胞结合伴体或结合剂的分离方法来从生物样品分离细胞源特异性的囊泡。这些细胞结合伴体可以包括但不限于肽、蛋白质、RNA、DNA、适体、细胞或血清相关的蛋白质，它们仅在存在一种或多种特异性生物标志物时结合这些囊泡。可以使用单一的结合伴体或结合剂、或者结合伴体或结合剂的组合来实施细胞源特异性的囊泡的分离或检测，所述的伴体或结合剂的单独使用或组合使用产生细胞源特异性的分离或检测。这些结合剂的非限制实例在2011年4月6日提交的发明名称为“Circulating Biomarkers for Disease”的国际专利申请系列No.PCT/US2011/031479的图2中提供，将该申请全部按引用并入本文中作为参考。例如，可以使用一种或多种结合剂分离用于表征乳腺癌的囊泡，其中所述的结合剂包括但不限于雌激素、孕酮、曲妥珠单抗、CCND1、MYC PNA、IGF-1PNA、MYC PNA、SC4适体(Ku)、AII-7适体(ERB2)、半乳凝集素-3、粘蛋白型O-聚糖、L-PHA、半乳凝集素-9或者它们的任何组合。
结合剂还可以根据i)对细胞源特异性囊泡具特异性的抗原的存在，ii)对细胞源特异性的囊泡具特异性的标志物的不存在，或者iii)对细胞源特异性的囊泡具特异性的生物标志物的表达水平而用于分离或检测细胞源特异性的囊泡。可将异质囊泡群体施加于涂覆有特异性结合剂的表面上，其中所述的结合剂被设计成排除或确认囊泡的细胞源特征。各种结合剂如抗体可以列于固体表面或基底上，并且可以使所述异质囊泡群体与所述的固体表面或基底接触足以发生相互作用的时间。然后，与所述阵列表面或基底上的给定抗体位置的特异性结合或非结合可以用于鉴定对给定细胞源具有特异性的囊泡群体的抗原特异性特征。即，结合事件可以给出存在具有结合的抗体识别的抗原的囊泡的信号。相反，缺乏结合事件可以给出不存在具有结合的抗体识别的抗原的囊泡的信号。
根据上文所述，可以使用磁捕获方法、荧光激活细胞分选术(FACS)或激光细胞计数法以一种或多种结合剂来富集或分离细胞源特异性的囊泡。磁捕获方法可以包括但不限于使用磁性激活细胞分选器(MACS)微珠或磁柱。可以使用的免疫亲和与磁性颗粒方法的实例在美国专利No.4,551,435、4,795,698、4,925,788、5,108,933、5,186,827、5,200,084或5,158,871中有所描述。还可以根据美国专利No.7,399,632中所述的一般方法，通过使用对囊泡具特异性的抗原的组合来分离细胞源特异性的囊泡。
相对于生物样品，用于分离或另外地富集所述细胞源特异性囊泡的任何其它适当方法也可以与本发明组合使用。例如，尺寸排阻色谱(例如凝胶渗透柱)、离心或密度梯度离心以及过滤方法可以与本文所述的抗原选择方法组合使用。也可按照Koga等，Anticancer Research，25：3703-3708(2005)、Taylor等，Gynecologic Oncology，110：13-21(2008)、Nanjee等，ClinCHem，2000；46：：207-223或美国专利No.7,232,653中所描述的方法来分离所述细胞源特异性囊泡。
可以分离和/或检测囊泡以提供诊断、预后、疾病分级、治疗诊断、响应者/无响应者状态的预测、疾病监控、治疗监控等。在一种实施方案中，从患有疾病或失调的细胞分离囊泡，例如，源自肿瘤或恶性生长、自体免疫疾病部位、心血管疾病、神经疾病或感染的细胞。在一些实施方案中，分离的囊泡源自与这些疾病或失调相关的细胞，例如，在所述疾病的病因学中发挥作用的免疫细胞，并且对所述细胞的分析提供了诊断、预后、疾病分级、治疗诊断、响应者/无响应者状态的预测、疾病监控、治疗监控等与这些疾病或失调相关的信息。囊泡进一步可用于发现新的生物标志物。如本文中所述的，通过鉴定与囊泡相关的生物标志物，可以评价分离的囊泡以用于表征表型。
在一些实施方案中，本发明的方法涉及通过评价来自个体的生物样品中存在的一个或多个微囊泡群体来表征个体中癌症的存在或癌症发生的可能性。可以使用本文中公开的或本领域实践的一种或多种方法来分离微囊泡。
通过将微囊泡群体的生物标志物特征或生物印记与参照样品相比较来提供测试样品的诊断、预后或治疗诊断表征，这样的微囊泡群体可以各自单独地或共同地提供用于个体的疾病表型表征。
可以从例如本文中公开的各种生物样品和体液来评价囊泡群体。
生物标志物评价
在本发明的一个方面中，通过分析生物样品和确定样品中的一个或多个循环生物标志物群体(例如，循环囊泡、蛋白或核酸)的存在、水平、量或浓度来表征患者的表型。在一些实施方案中，表征包括确定样品中的循环生物标志物与参照相比是否改变，参照也可以称为标准或对照。改变可以包括样品和参照之间任何可测量的差异，包括但不限于绝对存在或不存在、定量水平、与参照相比的相对水平，例如，所有存在的囊泡的水平、管家标志物的水平和/或掺入(spiked-in)标志物的水平、升高的水平、降低的水平、过表达、表达不足、差异表达、突变或其他改变的序列、修饰(糖基化、磷酸化、表观遗传变化)等。在一些实施方案中，在测定量之前，从样品中纯化或浓缩循环生物标志物。除非另外指出，如本文中所用的“纯化的”或“分离的”指的是部分或完全纯化或分离。在其他实施方案中，从样品直接评价循环生物标志物，没有之前的纯化或浓缩。循环囊泡可以是细胞源特异性囊泡或具有特异性生物印记的囊泡。生物印记包括生物标志物的特定模式，例如，表示希望检测到的表型(如疾病表型)的生物标志物模式。生物印记可以包含一种或多种循环生物标志物。可在表征表型，如诊断、预后、治疗诊断或预测响应者/无响应者状态时，使用生物印记。在一些实施方案中，生物印记用于确定生理或生物学状态，如妊娠或妊娠阶段。生物印记还可以用于确定治疗效力、疾病或状况的阶段或者疾病或状况的进展。例如，一种或多种囊泡的量可以与疾病阶段或进程的递进成正比或反比。所检测的囊泡量还可用于监测疾病或状况的进展或监测患者对治疗的反应。
可以通过将循环生物标志物的水平与参照水平或值相比较来评估循环生物标志物。参照值对于物理或时间终点而言可以是特定的。例如，参照值可以来自与进行样品评估的同一受试者，或者参照值可以得自代表性的样品群体(例如来自并未表现出疾病症状的正常患者的样品)。因此，参照值可以提供可将其与在给定样品中分析的生物印记的受试者样品读数相比较的阈值测量值。可以根据由对应于特定同龄组的多组样品而汇集的数据来设定这种参照值，其中所述的同龄组包括但不限于年龄(例如新生儿、婴儿、青少年、青年、中年成人、老年以及不同年龄的成人)、人种/种族群组、正常人对患病受试者、吸烟者、非吸烟者、接受治疗的受试者对未治疗的受试者、具有相似诊断或治疗的特定受试者个体或组的不同治疗时间点或其组合。此外，通过对特定个体测定不同治疗时间点的生物印记，可监测所述个体对治疗的反应或者监测个体进行治疗的疾病或状况的进展。
参照值可以基于由相同的患者评估的样品以便提供个体跟踪。在一些实施方案中，来自受试者的样品中的生物印记的频繁检测提供了与之前对于该患者建立的参照值更好的比较。使用这样的时间过程测量允许医生更准确地评价受试者的疾病阶段或进展，并且因此获知更好的治疗决定。在一些情况中，随着时间比较受试者自身的生物印记时，生物印记的变化降低，因此允许对于该受试者限定个性化的阈值，例如，进行诊断的阈值。时间上的患者内变化使得每个个体为疾病或生理状态的最佳分析起到其自身纵向对照的作用。作为说明性的实例，考虑随着时间测量受试者血液中源自前列腺细胞的囊泡水平。患者血液中前列腺衍生囊泡的水平的激增(spike)可以表示前列腺细胞的过度增殖，例如，由于前列腺癌引起的。
可以针对不具有特定的表型的未受影响的个体(具有不同的年龄、种族背景和性别)，通过测定未受影响的个体中的目标生物印记来建立参照值。例如，参照群体的参照值可以用作在测试受试者中检测一种或多种循环生物标志物群体的基线。如果来自受试者的样品具有与所述的参照值相似的水平或值，则所述的受试者可以鉴定为未患有所述疾病，或者发生所述疾病的低可能性。
或者，可以针对具有特定表型的个体，通过在具有所述表型的个体中测定一种或多种囊泡群体的量来建立参照值或水平。此外，可以针对特定的表型创建值的指数。例如，不同的疾病阶段可以具有不同的值，诸如得自具有不同疾病阶段的个体。可以将受试者的值与所述的指数比较，并且可以确定所述疾病的诊断或预后，例如其中受试者的水平与该指数最相关的疾病的阶段或进程。在其它实施方案中，针对疗效创建了值的指数。例如，可以建立患有特定疾病的个体的囊泡水平，并注明对于该个体而言什么样的治疗是有效的。所述的水平可以用于创建与受试者的值进行比较的值，并可针对该个体选择处理或治疗，例如，通过从所述水平预测所述受试者可能是治疗为响应者或非响应者。
在一些实施方案中，可以使用特异性地靶向特定癌症的生物标志物的抗原来分离或检测循环生物标志物，从而针对未受所述特定癌症影响的个体来确定参照值。作为非限制性实例，可使用与针对未受影响个体所描述的相同技术检查患有不同阶段结肠直肠癌和非癌息肉的个体，并且可测定各组的循环囊泡水平。在一些实施方案中，所述水平被定义为来自于以至少一式两份或一式三份重复进行的至少两个独立实验的平均值±标准偏差。可使用统计检验进行这些组间的比较以确定区分所观察到的生物标志物的统计显著性。在一些实施方案中，使用参数统计检验确定统计显著性。所述参数统计检验可包括但不限于，部分析因设计、方差分析(ANOVA)、t检验、最小二乘法、皮尔逊相关、简单线性回归、非线性回归、多元线性回归或多元非线性回归。或者，所述参数统计检验可包含单因素方差分析、双因素方差分析或重复测量方差分析。在其它实施方案中，使用非参数统计检验确定统计显著性。其实例包括但不限于，威尔科克森符号秩检验(Wilcoxon signed-rank test)、曼-惠特尼检验(Mann-Whitney test)、Kruskal-Wallis检验、弗里德曼检验(Friedmantest)、斯皮尔曼秩次相关系数(Spearman ranked order correlationcoefficient)、Kendall Tau分析和非参数回归检验。在一些实施方案中，统计显著性在低于0.05、0.01、0.005、0.001、0.0005或0.0001的p值下确定。还可针对多重比较校正p值，例如使用邦弗朗尼校正(Bonferronicorrection)、其改进方法或本领域的技术人员所知的其它技术，如Hochberg校正、Holm-Bonferroni校正、
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校正、Dunnett′s校正或Tukey’s多重比较。在一些实施方案中，为进行来自各群体的生物标志物的检验后比较，在ANOVA后进行了Tukey’s校正。
还可以建立参照值以用于疾病的复发监测(或MS中的恶化阶段)、用于治疗反应监测或用于预测响应者/非响应者状态。
在一些实施方案中，使用人工囊泡(本文亦称为合成囊泡)测定囊泡的参照值。用于制备人工囊泡的方法为本领域的技术人员所知，如使用脂质体。可使用公开于US20060222654和US4448765中的方法制备人工囊泡，其全文以引用的方式并入本文。可使用已知标志物构建人工囊泡以利于捕获和/或检测。在一些实施方案中，在处理前将人工囊泡掺入身体样品中。可在处理期间跟踪完整合成囊泡的水平(例如，使用过滤或本文公开的其它分离方法)以提供初始样品对处理样品的囊泡量的对照。类似地，人工囊泡可在任意处理步骤之前或之后掺入样品中。在一些实施方案中，人工囊泡用于校准用于囊泡分离和检测的设备。
人工囊泡可经制备和使用对照以测试分析(诸如基于珠的分析)的可行性。所述人工囊泡与所述珠和与检测抗体结合。因此，所述人工囊泡包含各个抗体结合的氨基酸序列/构象。所述人工囊泡可包含抗体结合的纯化蛋白质或合成肽序列。所述人工囊泡可以是能够使生物分子与之连接的珠，如聚苯乙烯珠。如果所述珠具有可用的羧基基团，则所述蛋白质或肽可经由可用的氨基基团结合于所述珠，诸如使用碳二亚胺偶联。
在另一个实施方案中，所述人工囊泡可以是涂覆有抗生物素蛋白的聚苯乙烯珠，并且生物素在合成时或通过生物素-马来酰亚胺化学反应置于所选择的蛋白质或肽。将置于珠上的蛋白质/肽可以在将要使用所述人工囊泡的应用所特有的比率下混合在一起，并随后与所述珠偶联。这些人工囊泡可随后作为捕获珠和检测抗体之间的连接发挥作用，由此而提供了对照用以显示所述分析的组分工作正常。
所述的值可以为定量的值或定性的值。所述的值可以为囊泡水平的直接量度(例如质量/体积)，或者为间接量度，诸如特异性生物标志物的量。所述的值可以为定量的，例如数值。在其它实施方案中，所述的值为定性的，例如没有囊泡、低水平的囊泡、中等水平的囊泡、高水平的囊泡或其变型。
参照值可以储存在数据库中，并可以根据循环生物标志物的水平或量(例如囊泡或微RNA的总量)或者囊泡或微RNA特定群体的量(例如细胞源特异性的囊泡或微RNA或来自具有特定生物印记的囊泡的微RNA)而作为参照用于疾病或状况的诊断、预后、治疗诊断、疾病分级、疾病监控、治疗监控、响应者/无响应者状态的预测。在一个说明性实例中，对确定癌症诊断的方法加以考虑。来自患有或未患所述癌症的参照受试者的囊泡或其他循环生物标志物受到评估并且储存在数据库中。所述参照受试者提供了指示所述癌症或另一状态(如健康状态)的生物印记。随后分析来自测试受试者的样品并且将微RNA生物印记与所述数据库中的生物印记进行比较。如果所述受试者的生物印记与指示癌症的参照值更为紧密地相关，则可作出癌症的诊断。相反，如果所述受试者的生物印记与指示健康状态的参照值更为紧密地相关，则可确定所述受试者未患有所述疾病。本领域的技术人员应当了解，该实例是非限制性的并且可被扩展用于评估其它表型，如其它疾病、预后、治疗诊断、疾病分级、疾病监控、治疗监控或响应者/非响应者状态预测等等。
可通过检测循环生物标志物(如，囊泡)，包括与囊泡相关的生物标志物，如表面抗原或有效负载，而确定用于表征表型的生物印记。可在囊泡内评估有效负载，例如，蛋白质或RNA物质，如mRNA或微RNA。或者，在不将有效负载从囊泡中分离的情况下对样品中的有效负载进行分析以表征所述表型。存在许多的分析技术可用于评估囊泡。在一些实施方案中，可以根据本领域已知的方法使用质谱分析法、流式细胞术、免疫细胞化学染色、Western印迹、电泳、色谱或x射线晶体学来鉴定囊泡的水平。例如，可以按照Clayton等，Journal of ImmunologicalMethods2001；163-174中所述的，使用流式细胞术对囊泡进行鉴定和定量测量，所述的文献全文以引用方式并入本文。根据上文所述可以使用结合剂来确定囊泡的水平。例如，囊泡的结合剂可以被标记，然后检测标记物并用于确定样品中囊泡的量。如上文所述，所述的结合剂可以结合于基底，诸如阵列或颗粒。或者，可以直接标记囊泡。
电泳标签或eTag可以用于测定囊泡的量。eTag为与核酸或抗体连接的小荧光分子，并被设计为分别与一种特定核酸序列或蛋白质结合。在eTag与其靶标结合后，使用酶将结合的eTag从靶标上切下。由释放的eTag(称为“报告物”)产生的信号与样品中靶核酸或蛋白质的量成比例。可以通过毛细管电泳鉴定eTag报告物。各eTag报告物的独特的电荷-质量比(即，其电荷除以其分子量)使得其在毛细管电泳读数上以特定的峰显示。由此，通过将eTag靶向于囊泡的特定生物标志物，可以测定囊泡的量或水平。
可以由异质囊泡群体(例如样品中的总囊泡群体)来确定囊泡水平。或者，由均质的囊泡群体或实质上均质的囊泡群体来确定囊泡水平，诸如特定细胞源囊泡的水平，如来自前列腺癌细胞的囊泡。在再其它的实施方案中，测定具有特定的生物标志物或生物标志物组合(例如对前列腺癌具有特异性的生物标志物)的囊泡的水平。测定囊泡水平可以与确定囊泡的生物标志物或生物标志物组合结合实施。或者，可以在确定囊泡的生物标志物或生物标志物组合之前或者之后来测定囊泡的量。
对囊泡量的测定可以以多重方式来分析。例如，可以测定多于一种囊泡群体例如具有不同生物标志物或生物标志物组合的不同细胞源特异性囊泡)的量，如本文所公开的那些。
通常使用统计学手段评估诊断或相关检验的性能。可通过测量灵敏度、特异性和相关度量而评估所述表征的性能。例如，可分析目标循环生物标志物的水平以表征表型，如检测疾病。测定了所述分析对于检测所述疾病的灵敏度和特异性。
真阳性是具有特征(如疾病或失调)被正确地鉴别为具有所述特征的受试者。假阳性是被所述测试而不当地鉴定为具有所述特征而不具有所述特征的受试者。真阴性是被所述测试正确地鉴定为不具有所述特征的不具有所述特征的受试者。假阴性是具有所述特征而被所述测试不当地鉴定为不具有该特征的人。所述测试区分这些类别的能力提供了测试性能的度量。
测试的特异性被定义为真阴性数目除以实际阴性(即，真阴性和假阳性之和)数目。特异性是多少受试者被正确地鉴别为阴性的量度。100％的特异性意味着所述测试识别出所有实际阴性，例如，全部健康人士应被识别为健康。较低的特异性表明更多的阴性会被确定为阳性。
测试的灵敏度被定义为真阳性数目除以实际阳性(即，真阳性和假阴性之和)数目。灵敏度是多少受试者被正确地鉴别为阳性的量度。100％的灵敏度意味着所述测试识别出全部实际阳性一例如，全部患病人士应被识别为患病。较低的灵敏度表明较多的阳性会错误地确定为阴性。
测试的精确性被定义为真阳性和真阴性的数目除以全部真阳性和假阳性以及全部真阴性和假阴性之和。其提供了一个将灵敏度和特异性度量相结合的数值。
在特定的辨识阈值下确定灵敏度、特异性和精确性。例如，前列腺癌(PCa)检测的常用阈值是血清中4ng/mL的前列腺特异抗原(PSA)。等于或高于所述阈值的PSA水平被认为对于PCa是阳性并且之下的任意水平被认为是阴性。随着阈值变化，灵敏度和特异性也发生变化。例如，随着检测癌症的阈值提高，特异性提高，这是因为更为难于将受试者认作阳性，其导致了更少的假阳性。与此同时，灵敏度将降低。受试者工作特征曲线(ROC曲线)是随着阈值变化，二元分类法系统的真阳性率(即灵敏度)对假阳性率(即，1-特异性)的示意图。所述ROC曲线显示了灵敏度和特异性如何随着阈值变化而变化。ROC曲线的曲线下面积(AUC)提供了指示在阈值的整个范围上的测试性能的总计数值。所述AUC等于分类法将随机选择的阳性样本分级为高于随机选择的阴形样本的概率。0.5的AUC表明所述测试具有50％的适当分级的概率，其相当于无辨识力(掷硬币也有50％的正确分级概率)。1.0的AUC意味着所述测试适当地对全部受试者分级(分类)。AUC等同于Wilcoxon秩检验。
根据本发明的生物印记可以用于以至少50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69或70％的灵敏度(例如，以至少71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86或87％的灵敏度)表征表型。在一些实施方案中，所述表型以至少87.1、87.2、87.3、87.4、87.5、87.6、87.7、87.8、87.9、88.0或89％的灵敏度进行表征，例如至少90％的灵敏度。所述的表型可以以至少91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的灵敏度进行表征。
根据本发明的生物印记可以用于以至少50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96或97％的特异性(例如以至少97.1、97.2、97.3、97.4、97.5、97.6、97.7、97.8、97.8、97.9、98.0、98.1、98.2、98.3、98.4、98.5、98.6、98.7、98.8、98.9、99.0、99.1、99.2、99.3、99.4、99.5、99.6、99.7、99.8、99.9或100％的特异性)表征受试者的表型。
根据本发明的生物印记可以用于以至少50％的灵敏度和至少60、65、70、75、80、85、90、95、99或100％的特异性；至少55％的灵敏度和至少60、65、70、75、80、85、90、95、99或100％的特异性；至少60％的灵敏度和至少60、65、70、75、80、85、90、95、99或100％的特异性；至少65％的灵敏度和至少60、65、70、75、80、85、90、95、99或100％的特异性；至少70％的灵敏度和至少60、65、70、75、80、85、90、95、99或100％的特异性；至少80％的灵敏度和至少60、65、70、75、80、85、90、95、99或100％的特异性；至少85％的灵敏度和至少60、65、70、75、80、85、90、95、99或100％的特异性；至少86％的灵敏度和至少60、65、70、75、80、85、90、95、99或100％的特异性；至少87％的灵敏度和至少60、65、70、75、80、85、90、95、99或100％的特异性；至少88％的灵敏度和至少60、65、70、75、80、85、90、95、99或100％的特异性；至少89％的灵敏度和至少60、65、70、75、80、85、90、95、99或100％的特异性；至少90％的灵敏度和至少60、65、70、75、80、85、90、95、99或100％的特异性；至少91％的灵敏度和至少60、65、70、75、80、85、90、95、99或100％的特异性；至少92％的灵敏度和至少60、65、70、75、80、85、90、95、99或100％的特异性；至少93％的灵敏度和至少60、65、70、75、80、85、90、95、99或100％的特异性；至少94％的灵敏度和至少60、65、70、75、80、85、90、95、99或100％的特异性；至少95％的灵敏度和至少60、65、70、75、80、85、90、95、99或100％的特异性；至少96％的灵敏度和至少60、65、70、75、80、85、90、95、99或100％的特异性；至少97％的灵敏度和至少60、65、70、75、80、85、90、95、99或100％的特异性；至少98％的灵敏度和至少60、65、70、75、80、85、90、95、99或100％的特异性；至少99％的灵敏度和至少60、65、70、75、80、85、90、95、99或100％的特异性；或基本上为100％的灵敏度和至少60、65、70、75、80、85、90、95、99或100％的特异性来表征受试者的表型(例如基于微RNA水平或其它特征)，例如，基于循环生物标志物的水平或其它特征。
根据本发明的生物印记可以用于以至少60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96或97％的精确性(例如以至少97.1、97.2、97.3、97.4、97.5、97.6、97.7、97.8、97.8、97.9、98.0、98.1、98.2、98.3、98.4、98.5、98.6、98.7、98.8、98.9、99.0、99.1、99.2、99.3、99.4、99.5、99.6、99.7、99.8、99.9或100％的精确性)表征受试者的表型。
在一些实施方案中，根据本发明的生物印记可以用于以至少0.60、0.61、0.62、0.63、0.64、0.65、0.66、0.67、0.68、0.69、0.70、0.71、0.72、0.73、0.74、0.75、0.76、0.77、0.78、0.79、0.80、0.81、0.82、0.83、0.84、0.85、0.86、0.87、0.88、0.89、0.90、0.91、0.92、0.93、0.94、0.95、0.96或0.97的AUC(例如以至少0.971、0.972、0.973、0.974、0.975、0.976、0.977、0.978、0.978、0.979、0.980、0.981、0.982、0.983、0.984、0.985、0.986、0.987、0.988、0.989、0.99、0.991、0.992、0.993、0.994、0.995、0.996、0.997、0.998、0.999或1.00的AUC)表征受试者的表型。
此外，可以以至少50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％的置信度确定用于测定特异性、灵敏度、精确性或AUC的置信水平。
其它相关性能的量度包括阳性和阴性概率比[阳性LR＝灵敏度/(1-特异性)；阴性LR＝(1-灵敏度)/特异性]。这些量度还可用于估量根据本发明的方法的测试性能。
分类
根据本发明的生物印记可用于对样品分类。辨识分析技术对于本领域的技术人员是已知的。例如，可将样品分类为或预测为针对用于给定疾病或失调的给定治疗的响应者或非响应者。多种统计分类技术对于本领域的技术人员是已知的。在监督学习方法中，使用统计分类方法分析了来自两个或更多组的样品组。可以发现可用于建立区分所述两个或更多组的分类器的生物标志物。随后可分析新的样品从而使所述分类器可将所述新样品与所述两个或更多组中的一组相关联。常用的监督分类器包括但不限于神经网络(多层感知器)、支持向量机、k紧邻算法、高斯混合模型、高斯法、朴素贝叶斯法(naive Bayes)、决策树和径向基函数(RBF)分类器。线性分类法包括费雪线性判别(Fisher′s linear discriminant)、逻辑回归、朴素贝叶斯分类器、感知器和支持向量机(SVM)。用于本发明的其它分类器包括二次分类器、k紧邻算法、增强算法、决策树、随机森林法、神经网络、模式识别、贝叶斯网络(Bayesian networks)和隐马尔可夫模型(Hidden Markov models)。技术人员应了解，这些和其它分类器(包括对其中任意分类器的改进)被设想在本发明的范围之内。
使用监督方法进行的分类通常按下列方法实施：
为解决监督学习的给定问题(如，学习识别手写字体)，必须考虑各种不同步骤：
1.获得训练集。这可包括，例如，来自患有或未患疾病或失调的受试者、已知对于治疗有反应或无反应的受试者、其疾病有发展或无发展的受试者等等的样品。所述训练样品用于“训练”所述分类器。
2.确定学习函数(learned function)的输入“特征”表示。所述学习函数的准确性取决于如何表示输入对象。一般将输入对象转化成为特征向量，其包含对于所述对象描述性的多个特征。由于维数灾难(curse ofdimensionality)的缘故，特征的数目不应过大；但是应大到足以精确地预测输出。所述特征可包括一组生物标志物，诸如源自本文描述的囊泡的生物标志物。
3.确定学习函数的结构以及对应的学习算法。选择学习算法，例如，人工神经网络、决策树、贝叶斯分类器或支持向量机。所述学习算法用于建立该分类器。
4.建立所述分类器。学习算法运行被收集的训练集。可通过优化在所述训练集的亚集(称为验证集)在的性能或通过交叉验证而调整所述学习算法的参数。在参数调整和学习之后，可在原始样品的测试集(其与所述训练集分离)上测量所述算法的性能。
一旦如上所述确定分类器，则其可用于对样品分类，例如，以本发明的方法进行分析的受试者的样品。例如，可使用患有和未患疾病的参照受试者中的目标循环生物标志物水平的数据作为所述训练集和测试集而建立分类器。对来自测试受试者的样品中所见的循环生物标志物水平进行评估并且所述分类器用于将所述受试者分类为患有或未患所述疾病。另举一例，可使用已发现对于特定疾病有反应或无反应的参照受试者中的目标囊泡生物标志物水平的数据作为所述训练集和测试集而建立分类器。对来自测试受试者的样品中所见的囊泡生物标志物水平进行评估并且将所述分类器用于将所述受试者分类为患有或未患所述疾病。
也可将非监督学习方法用于本发明。聚类法是一种非监督学习方法，其中聚类算法在不使用标记的情况下将一系列样品进行关联。最为类似的样本被分类成“群”。可将新样本分类到群中并且由此与其最为紧密关联的其它成员归类。本领域的技术人员所熟知的大量聚类算法可用于本发明，诸如层次聚类法。
生物印记
据本发明通过评估囊泡群体而获得生物印记，包括表面和有效负载的囊泡相关生物标志物和/或循环生物标志物，包括微RNA和蛋白质。源自受试者的生物印记可用于表征所述受试者的表型。生物印记可进一步包括一种或多种另外的生物标志物的水平，例如，循环生物标志物或与目标囊泡相关的生物标志物。目标囊泡的生物印记可包括存在于所述囊泡上的特定抗原或生物标志物。所述生物印记还可包括一种或多种抗原或生物标志物，其作为囊泡中的有效负载被携带，包括进行检验的微RNA。所述生物印记可以包含存在于囊泡(其具有在囊泡中检测的一种或多种生物标志物)上的一种或多种抗原或生物标志物的组合。所述生物印记可进一步包含除生物标志物以外的关于囊泡的其它信息。这些信息可包括囊泡大小、循环半衰期、代谢半衰期以及体内或体外的特定活性。所述生物印记可包含所述生物标志物或用于建立分类器的其它特征。
在一些实施方案中，直接在生物样品中检测微RNA。例如，体液中的RNA可使用市售的试剂盒进行分离，诸如mirVana试剂盒(AppliedBiosystems/Ambion，Austin，TX)、MagMAXTM RNA分离试剂盒(AppliedBiosystems/Ambion，Austin，TX)以及QIAzol Lysis Reagent and RNeasyMidi试剂盒(Qiagen Inc.，Valencia CA)。可根据下文描述使用阵列或PCR技术测定微RNA的特定种类。
在一些实施方案中，对囊泡的微RNA有效负载进行评估以表征表型。可以纯化或浓缩所述囊泡，然后确定所述生物印记。例如，可分离细胞源特异性囊泡并测定其生物印记。或者，可以在未经先行纯化或浓缩的情况下直接从样品测定囊泡的生物印记。本发明的生物印记可以用于确定疾病或状况的诊断、预后或治疗诊断，或者本文所述的类似量度。生物印记还可以用于确定治疗效力、疾病或状况的阶段、或疾病或状况的进程、或响应者/非响应者状态。此外，生物印记可以用于确定生理状态，例如妊娠。
可以对囊泡中或囊泡本身的囊泡特征进行评估以确定生物印记。所述的特征可以用于诊断、检测或确定疾病的阶段或进程，疾病或状况的治疗意义，或者用于表征生理状态。这些特征包括但不限于囊泡的水平或量、囊泡的大小、对囊泡半衰期变化的时效评估、循环囊泡半衰期、囊泡的代谢半衰期或者囊泡的活性。
生物印记中可包括的生物标志物包括一种或多种蛋白质或肽(例如提供了蛋白质印记)、核酸(例如，如所述的RNA印记或DNA印记)、脂质(例如脂质印记)或者它们的组合。在一些实施方案中，所述的生物印记还可以包括存在于囊泡中的药物或药物代谢物的类型或量(例如，提供了药物印记)，因为这些药物可以由所述生物样品所获自的受试者摄入，这产生了携带所述药物或所述药物的代谢物的囊泡。
生物印记还可包括一种或多种生物标志物的表达水平、存在、不存在、突变、变异体、拷贝数量变化、截短、重复、修饰或分子关联。遗传变异体或核苷酸变体指的是基因或cDNA序列在特定基因座的变化或改变，其包括但不限于，编码和非编码区中的核苷酸碱基缺失、插入、倒位和置换。缺失可以是单核苷酸碱基的缺失、所述基因的核苷酸序列的一部分或一个区域的缺失或者完整基因序列的缺失。插入可以是一个或多个核苷酸碱基的插入。所述遗传变异体可存在于转录调控区域、mRNA的非翻译区域、外显子、内含子或外显子/内含子连接区域。所述遗传变异体可以导致或不导致终止密码子、移码、氨基酸缺失、改变的基因转录物剪接形式或改变的氨基酸序列。
在实施方案中，包括囊泡中的核酸有效负载在内的核酸生物标志物进行核苷酸变体的评估。所述核酸生物标志物可包含一种或多种RNA物质，例如，mRNA、miRNA、snoRNA、snRNA、rRNA、tRNA、siRNA、hnRNA、shRNA、增强子RNA(enhancer RNA)(eRNA)或其组合。类似地，可评估DNA有效负载以形成DNA印记。
RNA印记或DNA印记还可包括突变的外遗传修饰，或存在于囊泡中的RNA或DNA的遗传变异体分析。外遗传修饰包括DNA甲基化模式。例如，参见Lesche R.和Eckhardt F.，DNA methylation markers：aversatile diagnostic tool for routine clinical use.Curr Opin Mol Ther.2007年6月；9(3)：222-30，其全文以引用的方式并入本文。因此，生物标志物可以是DNA片段的甲基化状态。
生物印记可以包括与一种或多种其它印记(包括但不限于mRNA印记、DNA印记、蛋白质印记、肽印记、抗原印记或它们的任何组合)相结合的一种或多种miRNA印记。例如，所述的生物印记可以包含一种或多种miRNA生物标志物以及一种或多种DNA生物标志物、一种或多种mRNA生物标志物、一种或多种snoRNA生物标志物、一种或多种蛋白质生物标志物、一种或多种肽生物标志物、一种或多种抗原生物标志物、一种或多种抗原生物标志物、一种或多种脂质生物标志物或者它们的任意组合。
生物印记可以包含一种或多种抗原或结合剂的组合((例如结合一种或多种结合剂的能力)，诸如分别列于2011年4月6日提交的发明名称为“Circulating Biomarkers for Disease”的国际专利申请系列No.PCT/US2011/031479的图1和图2中，将该申请全部按引用并入本文中，或本文别处描述的那些。所述的生物印记可以进一步包含一种或多种其它的生物标志物，例如但不限于miRNA、DNA(例如单链DNA、互补DNA或非编码DNA)或mRNA。囊泡的生物印记可以包含一种或多种抗原(例如如国际专利申请系列No.PCT/US2011/031479的图1所示)、一种或多种结合剂(例如如国际专利申请系列No.PCT/US2011/031479的图2所示)以及针对状况或疾病的一种或多种生物标志物(例如如国际专利申请系列No.PCT/US2011/031479的图3-60所示)的组合。所述的生物印记可以包含一种或多种生物标志物(例如miRNA)以及对癌细胞具有特异性的一种或多种抗原(例如，如国际专利申请系列No.PCT/US2011/031479的图1所示)。
在一些实施方案中，用于本方法中的囊泡具有特异于所述细胞源的生物印记，并且用于得到疾病特异性或生物状态特异性的诊断、预后或治疗相关生物印记(其为细胞源代表性的)。在其它实施方案中，囊泡具有对于给定的疾病或生理状况特异性的生物印记，其不同于用于诊断、预后、分期、治疗相关性测定或生理状态表征的细胞源生物印记。生物印记还可包含细胞源特异性和非特异性的囊泡的组合。
生物印记可以用于评估诊断标准，例如疾病的存在、疾病分期、疾病监测、疾病分级或检测的监控，疾病的转移、复发或进展。生物印记还可在临床上用于进行涉及治疗模式的决策，包括治疗干预。生物印记可以进一步在临床上用于作出治疗决策，包括是否实施手术，或者与手术一起应该使用何种治疗标准(例如术前或术后)。作为说明性实例，指示癌症的侵袭性形式的循环生物标志物生物印记可能需要更为激进的手术措施和/或更为激进的治疗方案以治疗所述患者。
生物印记可以用于治疗相关的诊断，从而提供可用于诊断疾病或选择正确的治疗方案的测试，例如提供治疗诊断。治疗诊断包括诊断测试，其提供影响疾病状态的疗法或治疗的能力。治疗诊断测试以与诊断或预后测试分别提供诊断或预后相类似的方式提供了治疗诊断。本文所使用的治疗诊断涵盖了任意所需形式的治疗相关测试，其包括预测医学、个性化医疗、综合医学、药物诊断学(pharmacodiagnostics)和Dx/Rx伙伴(Dx/Rx partnering)。治疗相关测试可以用于预测和评估个体受试者中的药物反应，即，提供个性化的医疗。预测药物反应可确定受试者是否是候选治疗剂的可能响应者或可能非响应者，例如，在所述受试者暴露于所述治疗或另外地用所述治疗进行处理之前。评估药物反应可以监测对药物的反应，例如，在开始治疗后的一段时期内监测受试者的改善或改善的缺乏。治疗相关测试可用于针对治疗方法选择受试者，所述的受试者特别可能受益于所述的治疗或者特别有可能在个体受试者中提供具有治疗效力的早期或客观的指征。因此，本文公开的生物印记可以指示应改变治疗以选择更有希望的治疗，由此避免了拖延有益治疗的巨大代价并避免了施用无效药物的经济成本和病痛成本。
此外，治疗相关诊断还可以用于对多种疾病或失调的临床诊断和管理，所述疾病或失调包括但不限于心血管疾病、癌症、感染性疾病、脓毒症、神经疾病、中枢神经系统相关疾病、血管内相关疾病以及自身免疫相关疾病。治疗相关诊断还有助于对药物毒性、药物抗性或药物反应的预测。可开发任意适当诊断测试形式的治疗相关测试，其包括但不限于(例如)免疫组织化学测试方法、临床化学、免疫分析、基于细胞的技术、核酸测试或躯体成像方法。治疗相关测试可以进一步包括但不限于，有助于治疗确定的测试、监测治疗毒性测试或对治疗的反应的测试。因此，生物印记可用于预测或监测受试者对于治疗的反应。在开始、去除或改变特定治疗之后，可在不同的时间点对受试者测定生物印记。
在一些实施方案中，根据生物标志物(即，目标微RNA、囊泡和/或生物标志物)的一种或多种组分的量的变化、特定生物标志物的一种或多种组分的量或针对所述组分而检测的生物标志物作出受试者是否对治疗有反应的测定或预测。在另一个实施方案中，通过在不同时间点测定生物标志物而监测受试者的状况。确定状况的进程、消退或复发。也可在一段时程上测量对治疗的反应。因此，本发明提供了在受试者中监测疾病的状态或其它医学状况的方法，其包括从来自所述受试者的生物样品分离和检测生物印记，检测特定生物印记的组分的总量或者检测一种或多种组分的生物印记(诸如生物标志物的存在、不存在或表达水平)。所述生物印记可用于监测所述疾病或状况的状态。
还可以鉴定一种或多种新的囊泡生物印记。例如，可以从响应药物治疗或治疗方案的受试者分离一种或多种囊泡，并且与参照(如对药物治疗或治疗方案没有反应的另一名受试者)相比。可以确定生物印记之间的差异，并且用于鉴定其他受试者为对特定的药物或治疗方案的响应者或非响应者。
在一些实施方案中，生物印记用于确定特定疾病或状况是否对于药物具有抗性。如果受试者对药物具有抗性，医生无需将宝贵的时间浪费在这种药物治疗上。为获得对药物选择或治疗方案的早期验证，对于得自受试者的样品确定生物印记。所述生物印记用于评估特定受试者的疾病是否具有与药物抗性相关的生物标志物。这种确定能够使医生将关键的时间以及患者的经济资源投入到有效的治疗中。
此外，生物印记可以用于评估受试者是否患有疾病、是否处于发生疾病的风险中或者用于评估疾病的阶段或进程。例如，生物印记可以用于评估受试者是否患有前列腺癌或者结肠癌，或本文中所述的其他癌症。此外，生物印记可以用于确定疾病或状况的阶段，例如结肠癌。
此外，对囊泡(例如异质囊泡群体)的量以及一种或多种均质囊泡群体(例如具有相同生物印记的囊泡群体)的量进行测定可以用于表征表型。例如，对样品中囊泡的总量(即，非细胞类型特异性的)进行测定以及对一种或多种不同细胞源特异性囊泡的存在的确定可以用于表征表型。根据下文中进一步描述的，可以根据正常受试者与具有目标表型的受试者的比较来确定阈值或者参照值或量，并且根据所确定的阈值或参照值确定标准。不同的标准可以用于表征表型。
一种标准可以是基于样品中异质囊泡群体的量。在一个实施方案中，一般囊泡标志物(例如CD9、CD81和CD63)可以用于测定样品中囊泡的量。可检测CD9、CD81、CD63或其组合的表达水平并且如果所述水平高于阈值水平，则满足所述标准。在另一个实施方案中，如果CD9、CD81、CD63或其组合的水平低于阈值或参照值，则满足所述标准。在另一实施方案中，所述的标准可以基于囊泡的量是否高于阈值或参照值。另一种标准可以基于具有特定生物印记的囊泡的量。如果具有所述特定生物印记的囊泡的量低于阈值或参照值，则满足所述标准。在另一个实施方案中，如果具有所述特定生物印记的囊泡的量高于阈值或参照值，则满足所述标准。此外，标准还可以基于源自特定细胞类型的囊泡的量。如果所述的量低于阈值或参照值，则满足所述标准。在另一个实施方案中，如果所述的量高于阈值，则满足所述标准。
在非限制性实例中，考虑通过检测生物标志物PCSA或PSCA而测定来自前列腺细胞的囊泡，和如果所检测的PCSA或PSCA的水平高于阈值水平则满足标准。阈值可以是来自对照细胞系或对照受试者的样品中相同标志物的水平。另一种标准可以基于源自癌细胞或包含一种或多种癌症特异性生物标志物的囊泡的量。例如，可测定生物标志物B7H3、EpCam或两者，并且如果所检测的B7H3和/或EpCam的水平高于阈值水平或处于预定范围内则满足标准。如果所述的量低于或高于阈值或参照值，则满足所述标准。标准也可以为结果的可靠性，例如满足质量控制措施或值。测试样品中检测的B7H3和/或EpCam的量超过对照样品中这些标志物的量可以指示癌症存在于所述测试样品中。
如所描述的，可将对多种标志物的分析加以结合以评估是否满足标准。在说明性实例中，通过检测一般囊泡标志物CD9、CD63和CD81中的一种或多种、包括PCSA和PSMA在内的一种或多种的前列腺上皮标志物以及一种或多种癌症标志物(如B7H3和/或EpCam)，将生物印记用于评估受试者是否患有前列腺癌。与未患前列腺癌的对照个体的样品相比，来自受试者的样品中标志物的较高水平表明了所述受试者中前列腺癌的存在。在一些实施方案中，以多重方式评估所述多种标志物。
技术人员应当了解，这些基于满足所描述的标准的规则可应用于任意适当的生物标志物。例如，所述标准可应用于囊泡特征，诸如存在的囊泡量、存在的具有特定生物印记的囊泡量、存在的囊泡有效负载生物标志物的量、存在的微RNA或其它循环生物标志物的量，等等。可测定适当生物标志物的比率。作为说明性实例，所述标准可以是囊泡表面蛋白与另一种囊泡表面蛋白的比率、囊泡表面蛋白与微RNA的比率、一种囊泡群体与另一种囊泡群体的比率、一种循环生物标志物与另一种循环生物标志物的比率，等等。
可以根据满足多种有用标准来表征受试者的表型。在一些实施方案中，至少一种标准用于各生物标志物。在一些实施方案中，使用至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90或至少100种标准。例如，就癌症的表征而言，当所述受试者被诊断为患有癌症时，可以使用多种不同的标准：1)是否来自受试者的样品中微RNA的量高于参照值；2)是否细胞类型特异性囊泡(即，源自特定的组织或器官的囊泡)中的微RNA的量高于参照值；或者3)是否具有一种或多种癌症特异性生物标志物的囊泡中微RNA的量高于参照值。如果微RNA的量低于所述参照值或与之相同，可应用类似的规则。所述的方法可以进一步包括质量控制措施，从而在所述的样品满足所述质量控制措施的情况下为受试者提供结果。在一些实施方案中，如果满足所述标准但是质量控制存疑，则重新评估所述受试者。
在其它实施方案中，针对多种生物标志物的评估测定了单一量度，并且所述度量与参照值进行比较。作为举例，对前列腺癌的测试可包括将PSA的水平乘以血样中的miR-141的水平。如果所述水平的积超过阈值，则满足所述标准，这表明癌症的存在。另举一例，针对一般囊泡标志物的多种结合剂可携带相同的标记物，如，相同的荧光团。可将所检测的标记物水平与阈值进行比较。
在相同类型的多种生物标志物以外，可将标准应用于多个类型的生物标志物。例如，可将一种或多种循环生物标志物(如RNA、DNA、肽)、囊泡、突变等的水平与参照进行比较。生物印记的不同成分可具有不同的标准。作为非限制性实例，用于诊断癌症的生物印记可包括一种miR物质与参照相比的过表达以及囊泡表面抗原与另一参照相比的表达不足。
可以通过比较囊泡的量、囊泡的结构或囊泡的任意其它信息性特征来确定生物印记。可以使用透射电子显微法(例如参见Hansen等，JournalofBiomechanics31，Supplement1：134-134(1)(1998))或扫描电子显微法评估囊泡的结构。可以使用方法和技术的多种不同组合或者对一种或多种囊泡的分析来确定受试者的表型。
生物印记可以包括但不限于生物标志物的存在或不存在、拷贝数、表达水平或者活性水平。其它有用的生物印记成分包括生物标志物的突变(例如影响转录或翻译产物活性的突变，诸如置换、缺失或插入突变)、变异体或翻译后修饰的存在。蛋白质生物标志物的翻译后修饰包括但不限于所述生物标志物的酰化、乙酰化、磷酸化、泛素化、脱乙酰作用、烷基化、甲基化、酰胺化、生物素化、γ-羧基化、谷氨酰胺化、糖基化、甘氨酰化、羟基化、亚铁血红素部分的共价连接、碘化、异戊二烯化、脂化、异戊烯化、GPI锚定形成、肉豆蔻酰化、法尼基化、香叶酰基香叶酰化、核苷酸或其衍生物的共价连接、ADP-核糖基化、黄素连接、氧化、棕榈酰化、聚乙二醇化、磷脂酰肌醇的共价连接、磷酸泛酰巯基乙胺化、多唾液酸化、焦谷氨酸形成、通过脯氨酰异构酶的脯氨酸外消旋化、tRNA介导的氨基酸添加(例如精氨酰化)、硫酸化、硫酸基团添加到酪氨酸上或者硒化。
本文所述的方法还可以用于鉴定与疾病、状况或生理状态有关的生物印记。所述的生物印记还可以用于确定受试者是否患有癌症或者是否处于发生癌症的风险中。处于发生癌症的风险中的受试者可以包括可能易感的受试者或者具有前症状早期阶段疾病的受试者。
还可以利用生物印记来针对其它疾病提供诊断或治疗的决断，所述的其它疾病包括但不限于自身免疫疾病、炎性肠病、心血管疾病、神经系统紊乱(如，阿尔兹海默氏病)、帕金森氏病、多发性硬化症、脓毒症、胰腺炎或者在2011年4月6日提交的发明名称为“CirculatingBiomakers for Disease”的国际专利申请系列No.PCT/US2011/031479的图3-58中所列的任何疾病、状况或症状，该申请在此通过引用全文引入。
所述的生物印记还可以用于从外周血、脐带血或羊水鉴定给定的妊娠状态或不利的妊娠结果(例如对唐氏综合征具有特异性的miRNA印记)，例如先兆子痫、早产、胎膜早破、宫内生长迟缓或反复流产。所述的生物印记还可以用于指示母亲、所有发育阶段的胎儿、植入前胚胎或新生儿的健康情况。
生物印记可以用于前症状的诊断。此外，所述的生物印记可以用于检测疾病、确定疾病的阶段或进程、确定疾病的复发、确认治疗方法、确定治疗方法的效力或者评价与年纪或环境暴露有关的个体生理状态。
监测囊泡的生物印记还可用于鉴定受试者的毒性暴露，其包括但不限于早期暴露或暴露于未知的或未鉴定的毒剂的情形。不被任何一种作用机制的特定理论所束缚，囊泡可以从损伤细胞上脱落，并在这一过程中对细胞的特定内含物进行区室化，包括膜成分以及吞没的细胞质内含物。暴露于毒性剂/化学制品的细胞可能增加囊泡的脱落以排出毒性剂或其代谢物，由此导致提高的囊泡水平。因此，监测囊泡水平、囊泡生物印记或这两者允许评估个体对潜在毒性剂的反应。
通过检测一种或多种特异性抗原、结合剂、生物标志物或它们的任何组合，可将囊泡和/或本发明的其它生物标志物用于鉴定药物诱导的毒性或受损器官的状态。囊泡的水平、囊泡生物印记的变化或这两者可以用于监测个体急性、慢性或职业性暴露于多种毒性剂的情况，所述毒性剂包括但不限于药物、抗生素、工业化学制品、毒性抗生素代谢物、草药、日用化学制品以及通过天然形成或自然合成由其它生物体产生的化学物质。此外，生物印记可以用于鉴定状况或疾病，其包括未知起源的癌症，也称为不明原发部位的癌症(CUP)。
可以如此前描述的从生物样品分离囊泡从而得到异质囊泡群体。然后，将异质囊泡群体与涂覆有特异性结合剂的基底相接触，所述的结合剂设计为排除或鉴定对给定细胞源具有特异性的囊泡群体的抗原特异性特征。此外，按照上文所述的，囊泡的生物印记可以与细胞的癌症状态关联。在受试者中抑制癌症的化合物可以引起可随时间或治疗过程通过对囊泡进行系列分离而监测的变化，例如囊泡的生物印记的变化。可以监测具有特定生物印记的囊泡水平或囊泡水平的变化。
在一个方面中，表征受试者的表型包括确定受试者是否可能响应或不响应治疗的方法。本发明的方法还包括确定可用于预测患者是否可能响应或不响应的新的生物印记。响应治疗的一名或多名受试者(响应者)和对相同治疗没有响应的一名或多名受试者(非响应者)可以进行他们的囊泡的探查。可以进行探查来鉴定囊泡生物印记，其将患者分类成目标治疗的响应者或非响应者。在一些方面中，分析了囊泡的存在、量和有效负载。囊泡的有效负载包括，例如，内部蛋白质、核酸(如，miRNA)、脂质或碳水化合物。
在响应者而不在非响应者中生物印记的存在与否可用于治疗诊断。可针对以下一种或多种分析来自响应者的样品：囊泡量、独特囊泡亚组或种类的量、这些囊泡中的生物标志物、这些囊泡的生物印记，等等。在一种情况下，针对一种或多种miRNA(诸如miRNA122、miR-548c-5p、miR-362-3p、miR-422a、miR-597、miR-429、miR-200a和/或miR-200b)的存在和/或量分析来自响应者和非响应者的囊泡，诸如微囊泡或外来体。响应者和非响应者之间生物印记的差异可用于治疗诊断。在另一个实施方案中，从具有疾病或状况的受试者获得囊泡。还从未有该疾病或状况的受试者获得囊泡。针对独特的生物印记而对来自两组受试者的囊泡进行分析，所述独特生物印记与该组中的全部受试者相关但不与来自另一组的受试者相关。这些生物印记或生物标志物随后可用作为针对所述状况或疾病存在与否的诊断，或用于将所述受试者归类于所述组中的一个组(患有/未患疾病、侵袭性/非侵袭性疾病、响应者/非响应者的组，等)。
在一个方面中，表征受试者的表型包括将疾病分期的方法。本发明的方法还包括确定用于分期中的新的生物印记。在说明性的实例中，对来自患有I期癌症的患者和患有II期或III期的同一种癌症的患者的囊泡进行分析。在一些实施方案中，在患有转移性疾病的患者中分析囊泡。鉴定了来自各组患者的囊泡之间的生物标志物或生物印记的差异(例如，来自III期癌症的囊泡可能具有一种或多种基因或miRNA的提高表达)，由此鉴定区分疾病不同阶段的生物印记或生物标志物。随后可将该生物印记用于对患有所述疾病的患者进行分期。
在一些情况中，通过在一段时间内分析来自患者的囊泡来确定生物印记，例如，每日、每半周、每周、两周、每半个月、每月、每两月、每半个季度、每季度、每半年、每两年或每年进行分析。例如，可以随着时间监控进行给定治疗的患者中的生物印记，以检测指示治疗的响应者或非响应者的印记。相似地，具有不同疾病阶段的患者随着时间探查其囊泡。可比较所述囊泡在各时间点处的有效负载或物理性质。因此时间模式可形成随后可用于治疗诊断、诊断、预后、疾病分级、治疗监控、疾病监控或作出响应者/非响应者状态预测的生物印记。只作为说明性的实例，囊泡中生物标志物(如miR122)随时程提高的量与转移性癌症相关，这与与非转移性癌症相关的囊泡中生物标志物随时程不变的量相反。时程可持续超过至少1周、2周、3周、4周、1个月、6周、8周、2个月、10周、12周、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、一年、18个月、2年或至少3年。
囊泡的水平、具有特定生物印记的囊泡的水平或囊泡的生物印记也可以用于评估针对状况的治疗效力。例如，囊泡的水平、具有定生物印记的囊泡的水平或囊泡的生物印记可以用于评估癌症治疗的效力，例如化疗、放疗或者可用于抑制受试者中的癌症的任何其它治疗方法。此外，生物印记可以用于筛选分析以鉴定对囊泡的生物印记具有调控性作用的候选物或测试化合物或试剂(例如蛋白质、肽、拟肽、类肽、小分子或其它药物)。通过所述的筛选分析所鉴定的化合物可以用于(例如)调节状况或疾病，例如抑制、改善、治疗或预防状况或疾病。
例如，囊泡的生物印记可以得自对特定的癌症正进行成功治疗的患者。可以对得自未使用相同的药物进行治疗的癌症患者的细胞进行培养，并从所述培养物获得囊泡以用于确定生物印记。所述的细胞可以使用测试化合物处理，并且可以将得自所述培养物的囊泡的生物印记与得自进行成功治疗的患者的囊泡的生物印记进行比较。可以选择产生与正进行成功治疗的患者的生物印记相似的生物印记的测试化合物以用于进一步的研究。
此外，囊泡的生物印记还可以用于监测试剂(例如药物化合物)在临床试验中对生物印记的影响。此外，监测囊泡的水平、囊泡生物印记的变化或这两者也可以用于评估测试化合物的效力的方法，例如用于抑制癌细胞的测试化合物。
除了诊断或证实发生疾病、病症或症状的存在或风险外，本文中公开的方法和组合物还提供了用于优化患有该疾病、病症或症状的患者的治疗的系统。囊泡的水平、囊泡的生物印记或这两者还可以用于确定特定治疗干预(药物的或非药物的)的有效性以及用于改变所述的干预从而1)降低发生不利结果的风险，2)增强干预的有效性或者3)鉴别抗性状态。因此，除了诊断或证实疾病、状况或症状的存在或发生风险外，本文所公开的方法和组合物还提供了用于优化对患有所述的疾病、状况或症状的受试者的治疗的系统。例如，可以通过鉴定囊泡的生物印记来确定治疗疾病、状况或症状的治疗相关途径(其通过将诊断和治疗加以整合从而改善受试者的实时治疗)。
鉴定囊泡的水平、囊泡生物印记或这两者的测试方法可以用于鉴定最适于特定治疗的患者，并对药物如何良好地发挥作用提供反馈，从而优化治疗方案。例如，在妊娠诱导的高血压和相关状况中，治疗相关的诊断可以随时间灵活地监测重要参数的变化(例如细胞因子和/或生长因子的水平)，从而优化治疗。
在FDA、MDA、EMA、USDA和EMEA所定义的研究用药物的临床试验情况中，通过本文所公开的生物印记确定的治疗相关的诊断可以为优化试验设计、监测效力以及增加药物安全性提供关键的信息。例如，就试验设计而言，治疗相关的诊断可以用于患者分级、患者资格的确定(入组/排除)、同质治疗组的创建、以及对经优化以匹配病例对照同龄组的患者样品的选择。因此，该治疗相关的诊断可以提供患者效力富集(patient efficacy enrichment)的手段，由此将试验募集所需的个体数量降至最低。例如，就效力而言，治疗相关的诊断可以用于监测治疗诊断治疗并评估效力标准。或者，就安全性而言，治疗相关的诊断可以用于预防不良药物反应或避免医疗错误以及监测对治疗方案的顺应性。
在一些实施方案中，本发明提供了鉴定针对进行临床试验的治疗的响应者和非响应者的方法，其包括在参与所述临床试验的患者中检测包含循环生物标志物的生物印记，以及鉴定在响应者和非响应者之间不同的生物印记。在进一步的实施方案中，在药物初治受试者中测量所述生物印记并将其用于预测所述受试者应为响应者或非响应者。所述预测可根据所述药物初治受试者的生物印记是否与经鉴定为响应者的临床试验受试者更为紧密地关联，由此而预测所述药物初治受试者应为响应者。相反地，如果所述药物初治受试者的生物印记与经鉴定为非响应者的临床试验受试者更为紧密地关联，则本发明的方法可预测所述药物初治受试者应为非响应者。因此，所述预测可用于对所述治疗的潜在响应者和非响应者加以区分。在一些实施方案中，所述预测用于指导疗程，如，通过帮助治疗医师决定是否施用所述药物。在一些实施方案中，所述预测用于指导对参与进一步临床试验的患者的选择。在非限制性实例中，在II期试验中预测响应者/非响应者状态的生物印记可用于选择进行III期试验的患者，由此而提高了III期患者群体中有反应的可能性。技术人员应当了解，所述方法可经调整用于鉴定生物印记，从而根据除响应者/非响应者状态之外的标准对受试者加以区分。在一个实施方案中，所述标准是治疗安全性。因此，根据上文遵循所述方法以鉴定对所述治疗有可能具有或不会具有不良状况的受试者。在非限制性实例中，在II期试验中预测安全性特征的生物印记可用于选择进行III期试验的患者，由此提高了所述III期患者群体中的治疗安全性特征。
因此，所述囊泡水平、囊泡生物印记或两者均可用于监测药效、测定对给定药物的反应或抗性或者两者，从而增强了药物安全性。例如，在结肠癌中，囊泡一般从结肠癌细胞上脱落并且可从外周血中分离并用于分离一种或多种生物标志物，如KRAS mRNA，其可随后进行测序以检测KRAS突变。在mRNA生物标志物的情况中，所述mRNA可以逆转录成为cDNA并进行测序(例如通过Sanger测序、焦磷酸测序、NextGen测序、RT-PCR分析)，从而确定是否存在赋予药物(例如西妥昔单抗或帕尼单抗)抗性的突变。在另一个实施例中，从生物样品中分离从肺癌细胞上特异性地脱落的囊泡，并将其用于分离肺癌的生物标志物，例如EGFRmRNA。将EGFR mRNA加工成cDNA并测序，从而确定是否存在EGFR突变(其显示出对用于肺癌的特定药物治疗的抗性或反应)。
可以将一种或多种生物印记分组，从而使所获得的有关特定组中的生物印记集的信息为进行临床相关决策提供合理基础，例如但不限于诊断、预后或治疗管理，例如治疗选择。
与大多数诊断性标志物一样，使用足以作出正确的医学判断的最少数量的标志物通常是理想的。这防止了在等待进一步分析的治疗延误以及时间和资源的不适当使用。
此外，本文公开了对样品(例如血清和组织生物库)实施回顾性分析的方法，以达到将定性和定量性质(例如囊泡的生物印记)与疾病状态、疾病阶段、进展、预后方面的临床结果；治疗效力或选择；或者生理状况相关联的目的。此外，本文所公开的方法和组合物用于对样品(例如在临床试验中由个体收集的血清和/或组织)的前瞻性分析，以达到将定性和定量的囊泡生物印记与疾病状态、疾病阶段、进展、预后方面的临床结果；治疗效力或选择；或者生理状况相关联的目的。如本文所用，囊泡的生物印记可用于鉴定细胞源特异性的囊泡。此外，生物印记可以根据囊泡的表面标志物分布或囊泡的内含物来确定。
用于根据本发明表征表型的生物印记可包含多种成分(如，微RNA、囊泡或其它生物标志物)或特征(如，囊泡大小或形态)。所述生物印记可以包含至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50、75或100种成分或特征。具有多于一种成分或特征(例如至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50、75或100种成分)的生物印记可以在表征表型方面提供更高的灵敏度和/或特异性。在一些实施方案中，与评估较少成分或特征的情况相比，评估多种成分或特征提供了增强的灵敏度和/或特异性。另一方面，使用足以作出正确的医学判断的最少数量的成分或特征通常是理想的。更少的标志物可避免对分类器的统计学过拟合并且可防止在等待进一步分析的治疗延误以及时间和资源的不适当使用。因此，本发明的方法包括确定成分或特征的最佳数量。
根据本发明的生物印记可用于以上述的灵敏度、特异性、精确性或类似的性能度量来表征表型。所述生物印记还可用于建立分类器以将样品归类为属于某一组，诸如属于患有或未患疾病的组、患有侵袭性疾病或未患侵袭性疾病的组、响应者或非响应者的组。在一个实施方案中，分类器用于确定受试者是否患有侵袭性或非侵袭性癌症。在前列腺癌的示例性情况下，这可辅助医师确定是否对所述癌症进行观察(即，开具“观察等待”处方)或者实施前列腺切除术。在另一个实施方案中，分类器用于确定乳腺癌患者是否有可能对他莫昔芬有反应或无反应，从而辅助医师确定是否使用他莫昔芬或另一药物治疗所述患者。
生物标志物
用于表征表型的生物印记可以包含一种或多种生物标志物。所述生物标志物可以是循环标志物、膜相关标志物或存在于囊泡内或囊泡表面上的成分。这些生物标志物包括但不限于核酸(例如RNA(mRNA、miRNA等)或DNA)、蛋白质、肽、多肽、抗原、脂质、碳水化合物或蛋白聚糖。
所述的生物印记可以包括生物标志物(例如2011年4月6日提交的发明名称为“Circulating Biomarkers for Disease”的国际专利申请系列No.PCT/US2011/031479的图1、3-60中所列的任何一种或多种生物标志物，将该申请全部按引用并入本文中)的存在或不存在、表达水平、突变状态、遗传变体状态或任何修饰(例如表观遗传修饰、翻译后修饰)。所述的生物印记可以包括生物标志物(例如图1、3-60中所列的任何一种或多种生物标志物)的存在或不存在、表达水平、突变状态、遗传变体状态或任何修饰(例如外遗传修饰、翻译后修饰)。可以将生物标志物的表达水平与对照或参照相比，以确定样品中生物标志物的过表达或表达不足(或者上调或下调)。在一些实施方案中，所述对照或参照水平包括得自不具有或未表现出状况或疾病的受试者的对照样品中的相同生物标志物(例如miRNA)的量。在另一个实施方案中，所述对照或参照水平包括不同生物学状况(诸如患病对未患病状态)中水平受到最低影响(如果有影响的话)的管家标志物的水平。在又另一个实施方案中，所述对照或参照水平包括同一受试者中但是在不同时间点采集的样品中相同标志物的水平。本文描述了其它类型的对照。
核酸生物标志物包括各种RNA或DNA物质。例如，所述的生物标志物可以为mRNA、微RNA(miRNA)、小核仁RNA(snoRNA)、小核RNA(snRNA)、核糖体RNA(rRNA)、不均一核RNA(hnRNA)、核糖体RNA(rRNA)、siRNA、转运RNA(tRNA)或shRNA。所述的DNA可以为双链DNA、单链DNA、互补DNA或非编码DNA。miRNA是短的核糖核酸(RNA)分子，其平均长约22个核苷酸。miRNA作为转录后调节剂发挥作用，其结合靶信使RNA(mRNA)的3′非翻译区(3′UTR)中的互补序列，这可导致基因沉默。一种miRNA可作用于1000种mRNA。miRNA在负向调控中发挥多种作用，例如，转录物降解和隔离、翻译压制，并且还可在正向调控中发挥作用，例如，转录和翻译激活。通过影响基因调控，miRNA可影响许多生物过程。在不同的细胞类型和组织中发现不同的表达miRNA集。
用于本发明的生物标志物进一步包括肽、多肽或蛋白质，这些术语在全文中可互换地使用，除非另行注明。在一些实施方案中，所述蛋白质生物标志物包括其修饰状态、截短、突变、表达水平(诸如，与参照水平相比过表达或表达不足)和/或翻译后修饰，例如上文所述。在非限制性实例中，疾病的生物印记可包括具有特定翻译后修饰的蛋白质，其在与所述疾病关联的样品中比不与其关联的样品中更为普遍。
生物印记可以包括多种相同类型的生物标志物(例如两种不同的微RNA或mRNA物质)，或者一种或多种不同类型的生物标志物(例如mRNA、miRNA、蛋白质、肽、配体和抗原)。
一种或多种生物印记可以包括选自2011年4月6日提交的发明名称为“Circulating Biomarkers for Disease”的国际专利申请系列No.PCT/US2011/031479的图1、3-60中所列的至少一种生物标志物，将该申请全部按引用并入本文中。特定细胞源生物印记可以包括一种或多种生物标志物。国际专利申请系列No.PCT/US2011/031479的图3-58描绘了其中罗列了多种疾病或状况特异性生物标志物的表，其中所述的生物标志物可由囊泡得到并分析。所述的生物标志物还可以为CD24、中期因子(midkine)、铁调素、TMPRSS2-ERG、PCA-3、PSA、EGFR、EGFRvIII、BRAF变体、MET、cKit、PDGFR、Wnt、β-连环蛋白、K-ras、H-ras、N-ras、Raf、N-myc、c-myc、IGFR、PI3K、Akt、BRCA1、BRCA2、PTEN、VEGFR-2、VEGFR-1、Tie-2、TEM-1、CD276、HER-2、HER-3或HER-4。此外，所述的生物标志物还可以为膜联蛋白V、CD63、Rab-5b或小窝蛋白或者miRNA，例如let-7a、miR-15b、miR-16、miR-19b、miR-21、miR-26a、miR-27a、miR-92、miR-93、miR-320或miR-20。此外，所述的生物标志物还可以为在PCT公开号No.WO2009/100029中所公开的任何基因或其片段，例如其中的表3-15中所列的那些。
在另一个实施方案中，囊泡包括源自罕见细胞的细胞片段或细胞碎片，如PCT公开No.WO2006054991中所述的。可以针对囊泡评估一种或多种生物标志物，如CD146、CD105、CD31、CD133、CD106或其组合。在一个实施方案中，将针对一种或多种生物标志物的捕获剂用于分离或检测囊泡。在一些实施方案中，针对囊泡评估生物标志物CD45、细胞角蛋白(CK)8、CK18、CK19、CK20、CEA、EGFR、GUC、EpCAM、VEGF、TS、Muc-1或其组合中的一种或多种。在一个实施方案中，肿瘤来源的囊泡是CD45-、CK+并且包含核酸，其中膜囊泡不存在CD45，或具有CD45的低表达或检测，具有可检测的细胞角蛋白(如CK8、CK18、CK19或CK20)的表达和可检测的核酸表达。
在整个申请中公开了可以作为囊泡生物印记的部分来评估的许多有用的生物标志物，包括但不限于CD9、EphA2、EGFR、B7H3、PSM、PCSA、CD63、STEAP、CD81、ICAM1、A33、DR3、CD66e、MFG-E8、TROP-2、乳腺球蛋白、Hepsin、NPGP/NPFF2、PSCA、5T4、NGAL、EpCam、神经激肽受体-1(NK-1或NK-1R)、NK-2、Pai-1、CD45、CD10、HER2/ERBB2、AGTR1、NPY1R、MUC1、ESA、CD133、GPR30、BCA225、CD24、CA15.3(MUC1分泌的)、CA27.29(MUC1分泌的)、NMDAR1、NMDAR2、MAGEA、CTAG1B、NY-ESO-1、SPB、SPC、NSE、PGP9.5、P2RX7、NDUFB7、NSE、GAL3、骨桥蛋白、CHI3L1、IC3b、间皮素、SPA、AQP5、GPCR、hCEA-CAM、PTP IA-2、CABYR、TMEM211、ADAM28、UNC93A、MUCl7、MUC2、ILl0R-β、BCMA、HVEM/TNFRSF14、Trappin-2Elafin、ST2/IL1R4、TNFIF14、CEACAM1、TPA1、LAMP、WF、WH1000、PECAM、BSA、TNFR或其组合。
在本文所公开的方法和组合物中可用于评估的其它生物标志物包括与美国专利No.6329179和7,625,573；美国专利公开号No.2002/106684、2004/005596、2005/0159378、2005/0064470、2006/116321、2007/0161004、2007/0077553、2007/104738、2007/0298118、2007/0172900、2008/0268429、2010/0062450、2007/0298118、2009/0220944和2010/0196426；美国专利申请No.12/524,432、12/524,398、12/524,462；加拿大专利CA2453198；以及国际PCT专利公开No.WO1994022018、WO2001036601、WO2003063690、WO2003044166、WO2003076603、WO2005121369、WO2005118806、WO/2005/078124、WO2007126386、WO2007088537、WO2007103572、WO2009019215、WO2009021322、WO2009036236、WO2009100029、WO2009015357、WO2009155505、WO2010/065968和WO2010/070276中所公开的状况或生理状态相关的生物标志物；各专利或申请全文以引用的方式并入本文。这些专利和申请中公开的生物标志物(包括囊泡生物标志物和微RNA)可作为用于表征表型(诸如提供癌症或其它疾病的诊断、预后或治疗诊断)的印记的一部分进行评估。此外，本文公开的方法和技术可用于评估生物标志物，包括囊泡生物标志物和微RNA。
可用于在本文公开的方法和组合物中进行评估的另一组可用生物标志物包括与癌症诊断、预后或治疗诊断相关的生物标志物，如公开于美国专利6,692,916、6,960,439、6,964,850、7,074,586；美国专利申请No.11/159,376、11/804,175、12/594,128、12/514,686、12/514,775、12/594,675、12/594,911、12/594,679、12/741,787、12/312,390；以及国际PCT专利申请No.PCT/US2009/049935、PCT/US2009/063138、PCT/US2010/000037中的；各专利或申请全文以引用的方式并入本文。有用的生物标志物进一步包括针对炎性疾病在美国专利申请No.10/703，143和US10/701，391中；针对类风湿关节炎在11/529,010中；针对多发性硬化症在11/454,553和11/827,892中；针对移植排斥反应在11/897,160中；针对狼疮在12/524,677中；针对骨关节炎的PCT/US2009/048684中；针对感染性疾病和脓毒症在10/742,458中；针对脓毒症在12/520，675中描述的；各专利或申请全文以引用的方式并入本文。这些专利和申请中公开的生物标志物(包括微RNA)可作为用于表征表型(诸如提供癌症或其它疾病的诊断、预后或治疗诊断)的印记的部分进行评估。此外，本文公开的方法和技术可用于评估生物标志物，包括囊泡生物标志物和微RNA。
可在本文公开的方法和组合物中用于评估的再另外的生物标志物包括与Wieczorek等.Isolation and characterization of an RNA-proteolipidcomplex associated with the malignant state in humans，Proc Natl Acad SciU S A.1985年5月；82(10)：3455-9；Wieczorek等.Diagnostic andprognostic value of RNA-proteolipid in sera of patients with malignantdisordersfolloWing therapy：first clinical evaluation of a noveltumor marker，Cancer Res.1987年12月1日；47(23)：6407-12；Escola等Selectiveenrichment of tetraspan proteins on the internal vesicles of multivesicularendosomes and on exosomes secreted by human B-lymphocytes.J.Biol.Chem.(1998)273：20121-27；Pileri等Binding of hepatitis C virus to CD81Science，(1998)282：938-41)；Kopreski等Detection of Tumor MessengerRNA in the Serum of Patients with Malignant Melanoma，Clin.Cancer Res.(1999)5：1961-1965；Carr等Circulating Membrane Vesicles in LeukemicBlood，Cancer Research，(1985)45：5944-51；Weichert等CytoplasmicCD24expression in colorectal cancer independently correlates withshortened patient survival.Clinical Cancer Research，2005，11：6574-81)；Iorio等MicroRNA gene expression deregulation in human breast cancer.Cancer Res(2005)65：7065-70；Taylor等Tumour-derived exosomes andtheir role in cancer-associated T-cell signaling defects British J Cancer(2005)92：305-11；Valadi等Exosome-mediated transfer of mRNAs andnicroRNAs is a novel mechanisn of genetic exchange between cells NatureCell Biol(2007)9：654-59；Taylor等Pregnancy-associated exosomes andtheit modulation of T cell signaling J Immunol(2006)176：1534-42；Koga等Purification，characterization and biological significance oftumor-derived exosomes Anticancer Res(2005)25：3703-08；Seligson等Epithelial cell adhesion molecule(KSA)expression：pathobiology and itsrole as an independent predictor of survival in renal cell carcinoma ClinCancer Res(2004)10：2659-69；Clayton等(Antigen-presenting cellexosomesare protected from complement-mediated lysis by expression ofCD55and CD59.Eur J Immunol(2003)33：522-31)；Simak等CellMembrane Microparticles in Blood and Blood Products：PotentiallyPathogenic Agents and Diagnostic Markers Trans Med Reviews(2006)20：1-26；Choi等Proteomic analysis of microvesicles derived from humancolorectal cancer cells J Proteome Res(2007)6：4646-4655；Iero等Tumour-released exosomes and their implications in cancer immunity CellDeath Diff(2008)15：80-88；Baj-Krzyworzeka等Tumour-derivedmicrovesicles carry severalsurface determinants and mRNA of tumour cellsand transfer some of these determinants to monocytes Cencer ImmunolImmunother(2006)55：808-18；Admyre等B cell-derived exosomes canpresent allergen peptides and activate allergen-specific T cells to proliferateand produce TH2-like cytokines J Allergy Clin Immunol(2007)120：1418-1424；Aoki等Identification and characterization ofmicrovesicles secneted by3T3-Ll adipocyres：redox-and hormone dependentinduction of milk fat globule-epidermal growth factor8-associatedmicrovesicles Endocrinol(2007)148：3850-3862；Baj-Krzyworzeka等Tumour-derived microvesicles carry several surface determinants and mRNAof tumour cells and transfer some of these determinants to monocytes CencerImmunol Immunother(2006)55：808-18；Skog等Glioblastomamnicrovesicles transport RNA and proteins that promote tumour growth andprovide diagnostic biomarkers Nature Cell Biol(2008)10：1470-76；E1-Hefnawy等Characterization of amplifiable，circulating RNA in plasmaand its potential as a tool for cancer diagnostics Clin Chem(2004)50：564-573；Pisitkun等.Proc NatlAcad Sci U SA，2004；101：13368-13373；Mitchell等.Can urinary exosomes act as treatmentresponse markers in Prostate Cancer？，Journal ofTranslational Medicine2009，7：4；Clayton等.Human Tumor-Derived Exosomes Selectively ImpairLymphocyte Responses to Interleukin-2，Cancer Res2007；67：(15).2007年8月1日；Rabesandratana等Decay-acceleratingfactor(CD55)andmembrrane inhibitor ofreactive lysis(CD59)are released within exosomesduring In vitro maturation of reticulocytes.Blood91：2573-2580(1998)；Lamparski等Production and characterization of clinical grade exosomesderived from dendritic cells.J Immunol Methods270：211-226(2002)；Keller等CD24isamarker ofexosomes secreted into urine and amnioticfluid.Kidney Int’l72：1095-1102(2007)；Runz等Malignantascites-derived exosomes of ovarian carcinoma patients contain CD24andEpCAM.Gyn Oncol107：563-571(2007)；Redman等Circulatingmicroparticles in notmal pregnancy and preeclampsia placenta.29：73-77(2008)；Gutwein等Cleavage of L1in exosomes and apoptotic membranevesicles released from ovarian carcinoma cells.Clin Cancer Res11：2492-2501(2005)；Kristiansen等.CD24is an independent prognosticmarker of survival in nonsmall cell lung cancer patients，Brit J Cancer88：231-236(2003)；Lim and Oh，The Role of CD24in Various HumanEpithelial Neoplasias，Pathol Res Pract201：479-86(2005)；Matutes等.TheImmunophenotype of Splenic Lymphoma with Villous Lymphocytes and itsRelevance to the Differential Diagnosls With Other B-Cell Disorders，Blood83：1558-1562(1994)；Pirruccello and Lang，Differential Expression ofCD24-Related Epitopes in Mycosis Fungoides/Sezary Syndrome：A PotentialMarker for Circulating Sezary Cells，Blood76：2343-2347(1990)中公开的状况或生理状态相关的生物标志物。这些出版物中公开的生物标志物(包括囊泡生物标志物和微RNA)可作为用于表征表型(诸如提供癌症或其它疾病的诊断、预后或治疗诊断)的印记的一部分进行评估。此外，本文公开的方法和技术可用于评估生物标志物，包括囊泡生物标志物和微RNA。
可在本文公开的方法和组合物中用于评估的再另外的生物标志物包括与Raiendran等，Proc Natl Acad Sci U S A2006；103：11172-11177、Taylor等，Gynecol Oncol2008；110：13-21、Zhou等，Kidney Int2008；74：：613-621，Buning等，Immunology2008、Prado等J Immunol2008；181：1519-1525、Vella等(2008)Vet Immunol Immunopathol124(3-4)：385-93、Gould等(2003).Proc Natl Acad Sci USA100(19)：10592-7、Fang等(2007).PLoS Biol5(6)：e158，Chen，B.J.and R.A.Lamb(2008).Virology372(2)：221-32，Bhatnagar，S.and J.S.Schorey(2007).J BiolChem282(35)：25779-89、Bhatnagar等(2007)Blood110(9)：3234-44、Yuyama等(2008).J Neurochem105(1)：217-24、Gomes等(2007).Neurosci Lett428(1)：43-6、Nagahama等(2003).Autoimmunity36(3)：125-31、Taylor，D.D.，S.Akyol等(2006).J Immunol176(3)：1534-42、Peche等(2006).Am J Transplant6(7)：1541-50、Iero，M，MValenti等(2008).Cell Death and Differentiation15：80-88、Gesierich，S.，I.Berezoversuskiy等(2006)，Cancer Res66(14)：7083-94、Clayton，A.，A.Turkes等(2004).Faseb J18(9)：977-9、Skriner.，K.Adolph等(2006).Arthritis Rheum54(12)：3809-14、Brouwer，R.，G.J.Pruijn等(2001).Arthritis Res3(2)：102-6、Kim，S.H.，N.Bianco等(2006).Mol Ther13(2)：289-300、Evans，C.H.，S.C.Ghivizzani等(2000).Clin Orthop Relat Res(379Suppl)：S300-7、Zhang，H.G.，C.Liu等(2006).J Immunol176(12)：7385-93、Van Niel，G.，J.Mallegol等(2004).Gut52：1690-1697、Fiasse，R.和O.Dewit(2007).Expert Opinion on Therapeutic Patents17(12)：1423-1441(19)中公开的状况或生理状态相关的生物标志物。这些出版物中公开的生物标志物(包括囊泡生物标志物和微RNA)可作为用于表征表型(诸如提供癌症或其它疾病的诊断、预后或治疗诊断)的印记的一部分进行评估。此外，本文公开的方法和技术可用于评估生物标志物，包括囊泡生物标志物和微RNA。
在另一个方面中，本发明提供了评价癌症的方法，包括检测来自受试者的样品中的一种或多种循环生物标志物的水平，所述生物标志物选自CD9、HSP70、Ga13、MIS、EGFR、ER、ICB3、CD63、B7H4、MUC1、DLL4、CD81、ERB3、VEGF、BCA225、BRCA、CA125、CD174、CD24、ERB2、NGAL、GPR30、CYFRA21、CD31、cMET、MUC2或ERB4.CD9、HSP7、Ga13、MIS、EGFR、ER、ICB3、CD63、B7H4、MUC1、DLL4、CD81、ERB3、VEGF、BCA225、BRCA、BCA200、CA125、CD174、CD24、ERB2、NGAL、GPR30、CYFRA21、CD31、cMET、MUC2或ERB4。在另一个实施方案中，一种或多种循环生物标志物选自CD9、EphA2、EGFR、B7H3、PSMA、PCSA、CD63、STEAP、STEAP、CD81、B7H3、STEAP1、ICAM1(CD54)、PSMA、A33、DR3、CD66e、MFG-8e、EphA2、Hepsin、TMEM211、EphA2、TROP-2、EGFR、乳腺球蛋白、Hepsin、NPGP/NPFF2、PSCA、5T4、NGAL、NK-2、EpCam、NGAL、NK-1R、PSMA、5T4、PAI-1和CD45。在再另一个实施方案中，一种或多种循环生物标志物选自CD9、MIS Rii、ER、CD63、MUC1、HER3、STAT3、VEGFA、BCA、CA125、CD24、EPCAM和ERBB4。可以从这些组中评价多种有用的生物标志物，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多种。在一些实施方案中，一种或多种生物标志物是Cal3、BCA200、OPN和NCAM中的一种或多种，例如，Gal3和BCA200，OPN和NCAM，或全部四种。评价癌症可以包括诊断、预后或治疗诊断癌症。癌症可以是乳腺癌。标志物可以与囊泡或囊泡群体相关。例如，一种或多种循环生物标志物可以是囊泡表面抗原或囊泡有效负载。囊泡表面抗原可以进一步用作捕获抗原、检测抗原或两者。
本发明进一步提供了预测对治疗剂的响应的方法，包括检测来自受试者的样品中一种或多种循环生物标志物的水平，所述循环生物标志物选自CD9、HSP70、Gal3、MIS、EGFR、ER、ICB3、CD63、B7H4、MUC1、DLL4、CD81、ERB3、VEGF、BCA225、BRCA、CA125、CD174、CD24、ERB2、NGAL、GPR30、CYFRA21、CD31、cMET、MUC2或ERB4。生物标志物还可以选自CD9、EphA2、EGFR、B7H3、PSMA、PCSA、CD63、STEAP、STEAP、CD81、B7H3、STEAP1、ICAM1(CD54)、PSMA、A33、DR3、CD66e、MFG-8e、EphA2、Hepsin、TMEM211、EphA2、TROP-2、EGFR、乳腺球蛋白、Hepsin、NPGP/NPFF2、PSCA、5T4、NGAL、NK-2、EpCam、NGAL、NK-1R、PSMA、5T4、PAI-1和CD45。在再另一个实施方案中，一种或多种循环生物标志物选自CD9、MIS Rii、ER、CD63、MUC1、HER3、STAT3、VEGFA、BCA、CA125、CD24、EPCAM和ERB B4。可以从这些组中评价多种有用的生物标志物，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多种。在一些实施方案中，一种或多种生物标志物是Cal3、BCA200、OPN和NCAM中的一种或多种，例如，Gal3和BCA200，OPN和NCAM或全部四种。治疗剂可以是用于治疗癌症的治疗剂。癌症可以是乳腺癌。标志物可以与囊泡或囊泡群体相关。例如，一种或多种循环生物标志物可以是囊泡表面抗原或囊泡有效负载。囊泡表面抗原可以进一步用作捕获抗原、检测抗原或两者。
各种方法或平台可以用于评价或检测本文中鉴定的生物标志物。这样的方法或平台的实例包括但不限于使用抗体阵列、微珠或本文中公开的或本领域已知的其他方法来检测一种或多种生物标志物。例如，可以将一种或多种生物标志物的捕获抗体或适体结合至阵列或珠上。然后使用可检测剂检测捕获的囊泡。在一些实施方案中，使用识别在整个囊泡群体检测的一般囊泡生物标志物的试剂(例如，抗体或适体)来检测捕获的囊泡，一般囊泡生物标志物例如为四跨膜蛋白或MFG-E8。这些可以包括四跨膜蛋白类，如CD9、CD63和/或CD81。在其他实施方案中，使用对于囊泡源(例如，组织或器官的类型)特异性的标志物来检测捕获的囊泡。在一些实施方案中，使用CD31检测捕获的囊泡，CD31是用于内皮来源的细胞或囊泡的标志物。按照需要，用于捕获的生物标志物也可以用于检测，反之亦然。
本发明的方法可以用于评估各种疾病或病症，其中生物标志物对应于各种这样的疾病或病症。例如，本发明的方法应用于评估一种或多种癌症，如本文中公开的那些，其中方法包括检测来自受试者的样品中一种或多种循环生物标志物的水平，所述循环生物标志物选自5T4(滋养细胞)、ADAM10、AGER/RAGE、APC、APP(β-淀粉状蛋白)、ASPH(A-10)、B7H3(CD276)、BACE1、BAI3、BRCA1、BDNF、BIRC2、C1GALT1、CA125(MUC16)、钙调蛋白1、CCL2(MCP-1)、CD9、CD10、CD127(IL7R)、CD174、CD24、CD44、CD63、CD81、CEA、CRMP-2、CXCR3、CXCR4、CXCR6、CYFRA21、derlin1、DLL4、DPP6、E-CAD、EpCaM、EphA2(H-77)、ER(1)ESR1α、ER(2)ESR2β、Erb B4、Erbb2、erb3(Erb-B3)、PA2G4、FRT(FLT1)、Gal3、GPR30(G-结合的ER1)、HAP1、HER3、HSP-27、HSP70、IC3b、IL8、insig、连接盘状球蛋白、角蛋白15、KRAS、乳腺球蛋白、MART1、MCT2、MFGE8、MMP9、MRP8、Muc1、MUC17、MUC2、NCAM、NG2(CSPG4)、Ngal、NHE-3、NT5E(CD73)、ODC1、OPG、OPN、p53、PARK7、PCSA、PGP9.5(PARK5)、PR(B)、PSA、PSMA、RAGE、STXBP4、生存素、TFF3(分泌的)、TIMP1、TIMP2、TMEM211、TRAF4(骨架)、TRAIL-R2(死亡受体5)、TrkB、Tsg101、UNC93a、VEGF A、VEGFR2、YB-1、VEGFR1、GCDPF-15(PIP)、BigH3(TGFb1-诱导蛋白)、5HT2B(血清素受体2B)、BRCA2、BACE1、CDH1-钙粘蛋白。该方法可以包括检测指定的靶生物标志物的蛋白质、RNA或DNA。可以从生物流体直接评价一种或多种标志物，如本文中公开的那些流体，或可以评价其与囊泡的相关性，例如，作为囊泡表面抗原或作为囊泡有效负载(例如，可溶性蛋白质、mRNA或DNA)。使用本发明的方法和组合物测定的特定生物印记可以包括多种有用的生物标志物，例如，生物印记可以包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多种不同生物标志物(或在一些情况中，相同生物标志物的不同分子，如蛋白质和核酸)。囊泡表面抗原还可以用作捕获抗原、检测抗原或两者，如本文中或按引用并入的申请中公开的。
本发明的方法和组合物应用于评估癌症的各个方面，包括鉴定癌症的不同信息性方面，例如，鉴定指示转移、血管生成的生物印记，或将相同肿瘤或肿瘤谱系的不同阶段、类别或亚类归类。
此外，本发明的方法包括确定疾病或病症是否影响受试者的免疫调节。例如，一种或多种针对免疫调节的循环生物标志物可以是CD45、FasL、CTLA4、CD80和CD83中的一种或多种。一种或多种针对转移的循环生物标志物可以是Muc1、CD147、TIMP1、TIMP2、MMP7和MMP9中的一种或多种。一种或多种针对血管生成的生物标志物可以是HIF2a、Tie2、Ang1、DLL4和VEGF2中的一种或多种。可以从这些组中评价多种有用的生物标志物，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多种。癌症可以是乳腺癌。标志物可以与囊泡或囊泡群体相关。例如，一种或多种循环生物标志物可以是囊泡表面抗原或囊泡有效负载。囊泡表面抗原可以进一步用作捕获抗原、检测抗原或两者。
生物印记可以包括DLL4或cMET。δ-样4(DLL4)是Notch-配体并且在血管生成过程中上调。cMET(也称为c-Met、MET或MNNG HOS转化基因)是编码膜受体酪蛋白激酶的原癌基因，其配体是肝细胞生长因子(HGF)。MET蛋白有时候称为肝细胞生长因子受体(HGFR)。MET通常在上皮细胞上表达，并且不适当的激活可以引发肿瘤生长、血管生成和转移。DLL4和cMET可以用作检测囊泡群体的生物标志物。
可以由囊泡得到并分析的生物标志物包括miRNA(miR)、miRNA*无义(miR*)以及其它RNA(包括但不限于mRNA、preRNA、priRNA、hnRNA、snRNA、siRNA、shRNA)。miRNA生物标志物不仅包括其miRNA和微RNA*无义，而且包括其前体分子：原微RNA(原miR)和前微RNA(前miR)。miRNA的序列可以自公开可得的数据库得到，例如http：//www.mirbase.org/、http：//www.microma.org/或者任何其它可得的数据库。除非注明，术语miR、miRNA和微RNA在整个说明书中可互换使用，除非标注。在一些实施方案中，本发明的方法包括分离囊泡，并且评价分离囊泡内的miRNA有效负载。所述生物标志物还可以是核酸分子(如DNA)、蛋白质或肽。可以测定所述生物标志物的存在或不存在、表达水平、突变(例如基因突变，如缺失、易位、重复、核苷酸或氨基酸置换等)。还可以分析生物标志物的任何表观遗传调控或拷贝数变异。
进行分析的一种或多种生物标志物可以为特定组织或细胞来源、疾病或生理状态的指示。此外，本文所描述的一种或多种生物标志物的存在、不存在或表达水平可以与受试者的表型(包括疾病、状况、预后或药效)相关。下文给出的特定生物标志物和生物印记构成了各疾病、状况比较、状况和/或生理状态的非包含性实例。此外，针对表型所评估的一种或多种生物标志物可以为细胞源特异性的囊泡。
用于表征表型的一种或多种miRNA可以选自在PCT公开号No.WO2009/036236中所述的miRNA。例如，在其中表I-VI(图6-11)中所列的一种或多种miRNA可以用于表征结肠腺癌、结肠直肠癌、前列腺癌、肺癌、乳腺癌、b-细胞淋巴瘤、胰腺癌、弥漫性大BCL癌、CLL、膀胱癌、肾癌、乏氧肿瘤、子宫肌瘤、卵巢癌、丙型肝炎病毒相关肝细胞癌、ALL、阿尔兹海默氏病、骨髓纤维变性、骨髓纤维化、真性红细胞增多症、血小板增多症、HIV或HIV-I潜伏，如本文中进一步描述的。
可以在囊泡中检测一种或多种miRNA。所述一种或多种miRNA可以为miR-223、miR-484、miR-191、miR-146a、miR-016、miR-026a、miR-222、miR-024、miR-126和miR-32。此外，还可以在PBMC中检测一种或多种miRNA。所述一种或多种miRNA可以为miR-223、miR-150、miR-146b、miR-016、miR-484、miR-146a、miR-191、miR-026a、miR-019b或miR-020a。所述一种或多种miRNA可以用于表征特定的疾病或状况。例如，对于膀胱癌疾病而言，可以检测一种或多种miRNA，例如miR-223、miR-26b、miR-221、miR-103-1、miR-185、miR-23b、miR-203、miR-17-5p、miR-23a、miR-205或它们的任何组合。所述的一种或多种miRNA可以被上调或过表达。
在一些实施方案中，所述的一种或多种miRNA用于表征乏氧肿瘤。所述的一种或多种miRNA可以为miR-23、miR-24、miR-26、miR-27、miR-103、miR-107、miR-181、miR-210或miR-213，并且可以上调。一种或多种miRNA还可以用于表征子宫肌瘤。例如，用于表征子宫肌瘤的一种或多种miRNA可以为let-7家族的成员、miR-21、miR-23b、miR-29b或miR-197。所述的miRNA可以被上调。
还可以通过一种或多种miRNA表征骨髓纤维变性，例如miR-190(其可以上调)；miR-31、miR-150和miR-95(其可以受到下调)；或者它们的任何组合。此外，还可以通过检测一种或多种miRNA来表征骨髓纤维化、真性红细胞增多症或血小板增多症，例如但不限于miR-34a、miR-342、miR-326、miR-105、miR-149、miR-147或者它们的任何组合。所述的一种或多种miRNA可以下调。
可以通过评估囊泡的一种或多种生物标志物来表征的表型的其它实例在下文中进一步描述。
可以使用探针检测一种或多种生物标志物。探针可以包括寡核苷酸(例如DNA或RNA)、适体、单克隆抗体、多克隆抗体、Fab、Fab′、单链抗体、合成抗体、类肽、zDNA、肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA)、凝集素、合成或天然形成的化学化合物(包括但不限于药物或标记试剂)、枝状物或它们的组合。可以通过例如直接标记来直接检测所述的探针，或者通过例如标记试剂来间接检测所述的探针。所述的探针可以选择性地识别生物标志物。例如，作为寡核苷酸的探针可以选择性地与miRNA生物标志物杂交。
在多个方面中，本发明用于对受试者的疾病或失调进行诊断、治疗诊断、预后、疾病分级、治疗监控或作出响应者/非响应者状态预测。本发明包括对来自受试者的囊泡进行评估，其包括评估存在于所述囊泡上的生物标志物和/或评估所述囊泡中的有效负载，诸如蛋白质、核酸或其它生物分子。可使用囊泡进行评估并且与疾病或失调相关的任何适当的生物标志物可用于实施本发明的方法。此外，可使用任何适当的技术评估本文所述的囊泡。可根据本发明的方法进行评估的对于特定疾病的示例性生物标志物包括2011年4月6日提交的发明名称为“CirculatiingBiomaerkers for Disease”的国际专利申请系列No.PCT/US2011/031479中所述的生物标志物。
可以评价本文中所述的任一类型的生物标志物或特定的生物标志物以鉴定生物印记或鉴定候选生物印记。示例性生物标志物包括但不限于表5中的那些。如本文中所公开的，该表中的标志物可以用于捕获和/或检测用于表征表型的囊泡。在一些情况中，可以使用多种捕获和/或检测剂以增强表征。可以作为蛋白质或mRNA来检测标志物，其可以是自由循环的或是在与其他生物分子的复合物中的。可以作为囊泡表面抗原或和囊泡有效负载来检测标志物。“说明性类别”表示标志物是已知标志物的指示。本领域技术人员将认识到，在特定的情况中，标志物也可以用于替代的设置中。例如，用于表征一种类型疾病的标志物也可以适当地用于表征另一种疾病。考虑了可以用作来自不同谱系的肿瘤的生物标志物的肿瘤标志物的非限制性实例。
表5：说明性的囊泡相关生物标志物
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本公开提供了各种生物标志物，其可以在确定给定测试样品的生物印记中进行评价，并且其包括评价与各种癌症以及癌症的状态(例如，转移性的v.非转移性的)相关的多肽和/或核酸生物标志物。
在一个实例中，可以通过确定一种或多种生物标志物的存在或水平来针对癌症评价测试样品，所述生物标志物包括但不限于CA-125、CA19-9和c-反应蛋白。癌症可以是生殖道的癌症，例如，卵巢癌。所述一种或多种生物标志物可以进一步包括一种或多种物标志物，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多种生物标志物，包括CD95、FAP-1、miR-200微RNA、EGFR、EGFRvIII、阿朴脂蛋白AI、阿朴脂蛋白CIII、肌红蛋白、腱生蛋白C、MSH6、封闭蛋白-3、封闭蛋白-4、小窝蛋白-1、凝血因子III、CD9、CD36、CD37、CD53、CD63、CD81、CD136、CD147、Hsp70、Hsp90、Rab13、桥立芯胶蛋白-1、EMP-2、CK7、CK20、GCDF15、CD82、Rab-5b、膜联蛋白V、MFG-E8和HLA-DR中的一种或多种。MiR-200微RNA(即，miR-200微RNA家族)包括miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-141和miR-429。这样的评价可以包括确定对于本文中公开的每一种生物标志物的蛋白质、核酸或两者的存在或水平。
CD95(也称为Fas、Fas抗原、Fas受体、FasR、TNFRSF6、APT1或APO-1)是原型死亡受体，其通过诱导细胞凋亡调节主要在免疫系统中的组织动态平衡。在癌症进展过程中，CD95常常下调并且赋予细胞对细胞凋亡的抗性，由此暗示CD95的丧失作为用于肿瘤逃逸机制的部分。CD95的致瘤活性通过涉及JNK和Jun的途径来介导。FAP-1(也称为Fas-相关磷酸酶1、蛋白质酪氨酸磷酸酶、13型非-受体(APO-1/CD95(Fas)-相关磷酸酶)、PTPN13)是蛋白质酪氨酸磷酸酶(PTP)家族的成员。已经报道了FAP-1与CD95的相互作用，并且使CD95脱磷酸，由此暗示了在Fas介导的程序化细胞死亡中的作用。MiR-200家族成员可以调节CD95和FAP-1。参见Schickel等，miR-200c regulates inductionof apoptosis through CD95by targeting FAP-1.Mol.Cell.，38，908-915(2010)，将该出版物的全部内容按引用并入本文中。
本文中公开的本发明的方法可以使用生物样品中存在的微囊泡群体的CD95和/或FAP-1表征或分型，以确定癌症的存在或患癌症的倾向，包括但不限于本文中公开的任何癌症。包括多种生物标志物的多重分析的本发明方法使用CD95和/或FAP-1生物标志物表征，以及本文中公开的其他生物标志物，包括但不限于miR-200微RNA(例如，miR-200c)。在一个实施方案中，评价来自个体的生物测试样品以确定CD95和/或FAP-1蛋白的存在和水平，或CD95+和/或FAP-1+循环微囊泡(“cMV”)群体的存在或水平，并且将该存在或水平与参照(例如，来自无病或正常、预治疗或不同治疗时间点的样品)相比较。将这种比较用于表征测试样品。例如，将测试样品中CD95蛋白、FAP-1蛋白、CD95+cMV和/或FAP-1+cMV的存在或水平与参照的比较用于确定疾病表型或预测对治疗的响应/非响应。在相关实施方案中，进一步评价cMV群体以确定miR-200微RNA的存在或水平，其在参照样品的训练集中预先确定以用来指示疾病或其他预后、治疗诊断或诊断结果。与非癌症参照相比，测试样品中提高的FAP-1水平可以指示癌症的存在，或侵袭性更高的癌症的存在。与非癌症参照相比，降低的CD95或miR200家族成员(如，miR-200c)的水平可以指示癌症的存在，或侵袭性更高的癌症的存在。可以通过免疫沉淀、流式细胞术或本文中公开的或本领域已知的其他分离方法来分离待评价的cMV群体。
在相关方面中，本发明提供了一种表征癌症的方法，其包括检测一种或多种生物标志物的水平，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22种生物标志物，所述生物标志物选自A2ML1、BAX、C10orf47、Clorf162、CSDA、EIFC3、ETFB、GABARAPL2、GUK1、GZMH、HIST1H3B、HLA-A、HSP90AA1、NRGN、PRDX5、PTMA、RABAC1、RABAGAP1L、RPL22、SAP18、SEPW1、SOX1及其组合。一种或多种生物标志物可以包括PTMA(前胸腺素，α)，前胸腺素/旁胸腺腺素家族的成员，其分割成胸腺素α-1并且在免疫调节中具有作用。胸腺素α-1在至少35个国家中被批准用于乙肝和丙肝的治疗，并且还批准包含在疫苗中以增强其他疾病治疗中的免疫应答。在一个实施方案中，生物标志物包含mRNA。可以从已经按照本文中所述分离的囊泡中分离mRNA。在一些实施方案中，例如，通过过滤或离心分离样品中的总囊泡群体。还可以通过亲和性，例如，使用对于一般囊泡生物标志物、疾病生物标志物或细胞特异性生物标志物的结合剂，来分离囊泡。可以将生物标志物的水平与对照(如，不带癌的样品)相比较，其中将生物标志物的水平相对于对照的变化用来表征癌症。癌症可以是前列腺癌。
在一个实施方案中，本发明评价的癌症包括前列腺癌，并且将微RNA(miR)用于区分转移性vs.非转移性前列腺癌。前列腺癌分期是将扩散超出前列腺的癌症风险分类的过程。这样的扩散与用局部疗法(如，外科手术或放疗)治愈的可能性相关。这样的预后分类中考虑的信息是基于临床和病理学因素，包括身体检查、成像研究、血液检验和/或活体组织检查。
用于前列腺癌分期的最常见方案是由美国癌症联合委员会(American Joint Committee on Cancer)公布的，并且称为TNM系统。TNM系统评价肿瘤的大小、涉及的淋巴结的范围、转移，并且还考虑癌症等级。与许多其他癌症一样，这些癌症通常按照期来分组，例如，I-IV期。通常，I期疾病是出于其他原因(如，良性前列腺肥大)取出前列腺组织时在小部分样品中偶然发现的癌症，并且细胞非常接近正常细胞和腺体指检时感觉正常。在II期中，涉及更多的前列腺，并且在腺体内可感觉到团块。在III期中，肿瘤已经通过前列腺囊扩散，并且可在腺体表面上感觉到团块。在IV期疾病中，肿瘤已经侵袭附近结构，或已经扩散至淋巴结或其他器官。
Whitmore-Jewett期是现在不太常用的另一种分期方案。Gleason分级系统是基于来自活检的细胞含量和组织结构，其提供了疾病的破坏性潜能和最终预后的估计。
TNM肿瘤分类系统可以用于描述受试者体内癌症的程度。T描述肿瘤的大小并且其是否侵袭附近的组织，N描述涉及到的局部淋巴结，而M描述远处的转移。TNM通过国际抗癌联盟(Intemational Union AgainstCancer)(UICC)来维持，并且被美国癌症联合委员会(AJCC)和国际妇产科学联盟(International Federation of Gynecology and Obstetrics)所使用。本领域技术人员理解不是所有肿瘤具有TNM分类，如，例如，脑肿瘤。通常，T(a是(0)，1-4)作为原发性肿瘤的大小或直接程度来测量。N(0-3)指的是扩散至局部淋巴结的程度：N0表示局部淋巴结不存在肿瘤细胞，N1表示肿瘤细胞扩散至最近的或少量的局部淋巴结中，N2表示肿瘤细胞扩散至N1和N3之间的程度；N3表示肿瘤细胞扩散至最远的或大量的局部淋巴结中。M(0/1)指的是转移的存在：MX表示未评价远转移；M0表示不存在远转移；M1表示转移已经发生于远端器官(超出局部淋巴结)。M1可以进一步如下描述：M1a表示癌症已经扩散至超出局部淋巴结的淋巴结；Mlb表示癌症已经扩散至骨；而M1c表示癌症已经扩散至其他部位(无论骨累及如何)。还可以评价其他参数。G(1-4)指的是癌细胞的等级(即，如果它们看上去与正常细胞相似，则它们是低等级的，而如果它们显示出差的分化，则是高等级的)。R(0/1/2)指的是手术的完全性(即，无癌细胞的切除边界，或没有)。L(0/1)指的是侵袭至淋巴管中。V(0/1)指的是侵袭至静脉中。C(1-4)指的是V的确定性(质量)的调整因子。
常常使用Gleason评分系统来评价前列腺肿瘤。Gleason评分系统是基于由病理学家评价的显微肿瘤模式，同时解释活检样本。当前列腺癌存在于活检组织中时，Gleason评分是基于正常腺组织结构(即，腺体的形状、大小和分化)的损失程度。经典Gleason评分系统具有五个基本组织模式，其在技术上称为肿瘤“等级”。通过等级来表示由癌症引起的这种正常腺体结构损失的显微确定，数字范围从1至5，5是最差等级。等级1通常是其中癌性前列腺非常类似于正常前列腺组织。腺体是小的、形态良好的并且紧密包装的。在等级2下，组织仍然具有形态良好的腺体，但它们较大并且在其间具有更多的组织，而在等级3下，组织仍然具有可识别的腺体，但细胞较暗。在高放大倍数下，等级3样品中的这些细胞中的一些已经离开了腺体，并且开始侵袭周围组织。等级4样品具有带有很少可识别腺体的组织，并且许多细胞正在侵袭周围组织。对于等级5样品，组织不具有可识别腺体，并且常常是遍布周围组织的细胞片层。
区分转移性和非转移性前列腺癌的miR相对于非转移性样品在转移性样品中是过表达的。或者，区分转移性和非转移性前列腺癌的miR相对于转移性样品在非转移性样品中是过表达的。用于区分转移性前列腺癌的有用的miR包括一种或多种，例如，1、2、3、4、5、6、7或8种miR，其选自miR-495、miR-10a、miR-30a、miR-570、miR-32、miR-885-3p、miR-564和miR-134。在另一个实施方案中，用于区分转移性前列腺癌的miR包括一种或多种，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14种miR，其选自hsa-miR-375、hsa-miR-452、hsa-miR-200b、hsa-miR-146b-5p、hsa-miR-1296、hsa-miR-17*、hsa-miR-100、hsa-miR-574-3p、hsa-miR-20a*、hsa-miR-572、hsa-miR-1236、hsa-miR-181a、hsa-miR-937和hsa-miR-23a*。在再另一个实施方案中，有用的用于区分转移性前列腺癌的miR包括，例如，1、2、3、4、5、6、7、8或9种miR，其选自hsa-miR-200b、hsa-miR-375、hsa-miR-582-3p、hsa-miR-17*、hsa-miR-1296、hsa-miR-20a*、hsa-miR-100、hsa-miR-452和hsa-miR-577。用于区分转移性前列腺癌的miR可以是一种或多种，例如，1、2、3或4种miR，其选自miR-141、miR-375、miR-200b和miR-574-3p。
在一个方面中，将微RNA(miR)用于区分癌症和非癌症样品。可以针对囊泡内包含的miR有效负载来分析源自患者样品的囊泡。样品可以是体液，包括精液、尿液、血液、血清或血浆。样品还可以包括组织或活检样品。多种不同的方法可用于检测miR。在一些实施方案中，将miR组的阵列用于同时探查多种miR的表达。Exiqon mIRCURY LNA微RNA PCR系统组(Exiqon，Inc.，Woburn，MA)可以用于这样的目的。区分癌症的miR可以相对于对照在癌症样品中是过表达的。有用的用于区分癌与非癌的miR包括一种或多种，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13种miR，其选自hsa-miR-574-3p、hsa-miR-331-3p、hsa-miR-326、hsa-miR-181a-2*、hsa-miR-130b、hsa-miR-301a、hsa-miR-141、hsa-miR-432、hsa-miR-107、hsa-miR-628-5p、hsa-miR-625*、hsa-miR-497和hsa-miR-484。在另一个实施方案中，有用的用于区分癌与非癌的miR包括一种或多种，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种miR，其选自hsa-miR-574-3p、hsa-miR-141、hsa-miR-331-3p、hsa-miR-432、hsa-miR-326、hsa-miR-2110、hsa-miR-107、hsa-miR-130b、hsa-miR-301a和hsa-miR-625*。在再另一个实施方案中，有用的用于区分癌与非癌的miR包括一种或多种，例如，1、2、3、4、5、6、7、8或9种miR，其选自hsa-miR-107、hsa-miR-326、hsa-miR-432、hsa-miR-574-3p、hsa-miR-625*、hsa-miR-2110、hsa-miR-301a、hsa-miR-141或hsa-miR-373*。癌症可以包括以上所列的那些癌症。在示例性实施方案中，癌症是前列腺癌，并且微RNA(miR)用于区分前列腺癌和非癌症样品。
该方法考虑评价循环生物标志物的组合。例如，来自抗体阵列的多种标志物和miR分析可以用于区分前列腺癌与正常、BPH与PCa或转移性vs.非转移性疾病。以这种方式，可以获得提高的灵敏度、特异性和/或准确性。在一些实施方案中，在患者样品中检测一种或多种miR的水平，例如，1、2、3、4、5或6种miR，其选自hsa-miR-432、hsa-miR-143、hsa-miR-424、hsa-miR-204、hsa-miR-581f和hsa-miR-451，以评估前列腺癌的存在。这些miR中的任一种在患有PCa的患者中可能是升高的，但具有＜4.0ng/ml的血清PSA。在一个实施方案中，本发明提供了评价前列腺癌的方法，包括确定来自受试者的样品中一种或多种miR的水平，例如，1、2、3、4、5或6种miR，其选自hsa-miR-432、hsa-miR-143、hsa-miR-424、hsa-miR-204、hsa-miR-581f和hsa-miR-451。样品可以是体液，例如，血液、血浆或血清。可以在分离自样品的囊泡中分离miR。受试者可以具有低于一定阈值的PSA水平，如血液样品中2.0、2.2、2.4、2.6、2.8、3.0、3.2、3.4、3.6、3.8、4.0、4.2、4.4、4.6、4.8、5.0、5.2、5.4、5.6、5.8或6.0ng/ml。比参照样品中高的miR水平可以指示样品中PCa的存在。在一些实施方案中，参照包括来自未患PCa的受试者的对照样品中一种或多种miR的水平。在一些实施方案中，参照包括来自患有PCa并且PSA水平≥一定阈值的受试者的对照样品中一种或多种miR的水平，所述阈值如2.0、2.2、2.4、2.6、2.8、3.0、3.2、3.4、3.6、3.8、4.0、4.2、4.4、4.6、4.8、5.0、5.2、5.4、5.6、5.8或6.0ng/ml。阈值可以是4.0ng/ml。
在本发明的一些实施方案中，评价患者样品中的囊泡以提供诊断、预后或治疗诊断结果。患者样品的囊泡分析包括检测囊泡表面生物标志物，例如，表面抗原，和/或囊泡有效负载，例如，mRNA和微RNA，如本文中所述的。用于囊泡分析的方法呈现于2009年11月12日提交的并且发明名称为“METHODS AND SYSTEMS OF USING EXOSOMESFOR DETERMINING PHENOTYPES”的PCT专利申请PCT/US09/06095；2010年7月7日提交的并且发明名称为“METHODSAND SYSTEMS OF USING VESICLES FOR DETERMININGPHENOTYPES”的U.S.临时专利申请61/362，674；和2010年10月15日提交的并且发明名称为“DETECTION OF GI CANCERS”的U.S.临时专利申请61/393，823中，将这些申请全部按引用并入本文中。
在一个方面中，本发明包括鉴定来自所述受试者的生物样品中一种或多种囊泡的生物印记的方法，其中所述生物印记包括囊泡表面抗原和囊泡有效负载的分析。所述表面抗原可以包括表面蛋白，并且囊泡有效负载可以包括微RNA。例如，可以使用识别囊泡表面抗原的结合剂来捕获囊泡，并且可以评价这些捕获囊泡内的微RNA。因此，生物印记可以包括用于捕获的表面抗原以及囊泡内的微RNA。生物印记可以用于诊断、预后或治疗诊断目的。例如，生物印记可以是鉴定癌症、鉴定侵袭性或转移性癌症或者鉴定可能响应于候选治疗剂的癌症的印记。
作为说明性实例，考虑了使用B7H3的抗体来捕获样品中的囊泡并然后评价捕获囊泡内的miR-141水平的方法。在该实例中，生物印记包括在其表面呈现B7H3的外来体内的miR-141水平。根据样品中的B7H3+囊泡的水平以及样品内miR-141的水平，生物印记可以指示样品含有癌症、含有侵袭性癌症、可能响应于特定的化疗剂等。
在一个实施方案中，评价受试者中的癌症的方法包括：鉴定来自所述受试者的生物样品中一种或多种囊泡的生物印记，包括：确定一种或多种一般囊泡蛋白质生物标志物的水平；确定一种或多种细胞特异性蛋白质生物标志物的水平；确定一种或多种疾病特异性蛋白质生物标志物的水平；和确定囊泡中一种或多种微RNA生物标志物的水平，其中所述表征包括将所述样品中所述生物标志物的水平与参照相比以确定所述受试者是否可能易患或患有癌症。可以在单一试验中以多重方式检测蛋白质生物标志物。微RNA生物标志物也可以在单一试验中以多重方式来检测。在一些情况中，细胞特异性和疾病特异性生物标志物可以重叠，例如，一种生物标志物可以用于鉴定来自特定细胞来源的癌症。所述生物样品可以是体液，如血液、血清或血浆。
在一个实例中，本发明的方法包括用于前列腺癌的诊断测试，其包括从来自患者的血液样品分离囊泡以检测指示前列腺癌存在或不存在的囊泡。血液可以是血清或血浆。通过用识别特定囊泡表面抗原的“捕获抗体”的捕获来分离囊泡。用于前列腺癌诊断分析的表面抗原包括四跨膜蛋白CD9、CD63和CD81(其通常存在于血液中的囊泡上，并且因此作为一般囊泡生物标志物)、前列腺特异性生物标志物PSMA和PCSA以及癌症特异性生物标志物B7H3。在一些情况中，EpCam也用作癌症特异性生物标志物，或替代B7H3。捕获抗体可以栓系于基底上。在一个实施方案中，基底包括荧光标记的珠，其中珠对于各捕获抗体进行差异标记。如果需要，可以评价检测囊泡的有效负载以表征癌症。
如上所述，可以评价本发明的生物标志物以鉴定生物印记。在一个方面中，本发明提供了一种方法，其包括：确定生物样品中一种或多种生物标志物的存在或水平，其中所述一种或多种生物标志物包括选自表5的一种或多种生物标志物；并且鉴定包括该一种或多种生物标志物的存在或水平的生物印记。在一些实施方案中，所述方法进一步包括将该生物印记与参照生物印记相比较，其中该比较用于表征癌症，包括本文中公开的或本领域已知的癌症。参照生物印记可以来自未患癌的受试者。参照生物印记还可以来自该受试者，例如，来自正常的邻近组织或来自另一个时间点获取的样品。本文中公开了表征癌症的各种方式。例如，表征癌症可以包括鉴定受试者中癌症的存在或风险，或鉴定受试者中癌症是转移性的或侵袭性的。比较步骤包括确定生物印记相对于参照生物印记是否有所变化，由此提供癌症的预后、诊断或治疗诊断表征。所述生物样品包括体液，包括但不限于本文中公开的体液。例如，体液可以包括尿液、血液或血液衍生物。
一种或多种生物标志物可以是选自miR-22、let7a、miR-141、miR-182、miR-663、miR-155、mirR-125a-5p、miR-548a-5p、miR-628-5p、miR-517*、miR-450a、miR-920、hsa-miR-619、miR-1913、miR-224*、miR-502-5p、miR-888、miR-376a、miR-542-5p、miR-30b*、miR-1179及其组合的一种或多种生物标志物，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种或更多种。在一个实施方案中，一种或多种生物标志物选自miR-22、let7a、miR-141、miR-920、miR-450a及其组合。一种或多种生物标志物，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种或更多种生物标志物，可以是选自本文中表20-24任一个中的基因组成的组的信使RNA(mRNA)及其组合。例如，一种或多种生物标志物可以包括1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种或更多种选自A2ML1、BAX、C10orf47、Cl orf162、CSDA、EIFC3、ETFB、GABARAPL2、GUK1、GZMH、HIST1H3B、HLA-A、HSP90AA1、NRGN、PRDX5、PTMA、RABAC1、RABAGAP1L、RPL22、SAP18、SEPW1、SOX1及其组合的信使RNA(mRNA)。一种或多种生物标志物可以包括1、2、3、4、5或6种选自A2ML1、GABARAPL2、PTMA、RABAC1、SOX1、EFTB及其组合的信使RNA(mRNA)。一种或多种生物标志物可以作为微囊泡群体的有效负载来分离。群体可以是来自样品的微囊泡总群或特定群体，如PCSA+群体。在一个实施方案中，所述方法用于评价前列腺癌。例如，所述方法可以用于区分包括前列腺癌的样品与不带前列腺癌的样品。
在一个实施方案中，一种或多种生物标志物，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种或更多种生物标志物，选自CA-125、CA19-9、c-反应蛋白、CD95、FAP-1、EGFR、EGFRvIII、阿朴脂蛋白AI、阿朴脂蛋白CIII、肌红蛋白、腱生蛋白C、MSH6、封闭蛋白-3、封闭蛋白-4、小窝蛋白-1、凝血因子III、CD9、CD36、CD37、CD53、CD63、CD81、CD136、CD147、Hsp70、Hsp90、Rab13、桥粒芯胶蛋白-1、EMP-2、CK7、CK20、GCDF15、CD82、Rab-5b、膜联蛋白V、MFG-E8、HLA-DR、miR200微RNA、miR-200c及其组合。一种或多种生物标志物可以包括1、2、3、4或5种选自CA-125、CA19-9、c-反应蛋白、CD95、FAP-1及其组合的生物标志物。一种或多种生物标志物可以从样品直接分离，或作为微囊泡群体的表面抗原或有效负载来分离。在一个实施方案中，所述方法用于评价卵巢癌。例如，所述方法可以用于区分包含卵巢癌的样品与不带卵巢癌的样品。或者，所述方法可以用于区分具有不同分期或预后的卵巢癌。
在另一个实施方案中，一种或多种生物标志物，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多种生物标志物，选自hsa-miR-574-3p、hsa-miR-141、hsa-miR-432、hsa-miR-326、hsa-miR-2110、hsa-miR-181a-2*、hsa-miR-107、hsa-miR-301a、hsa-miR-484、hsa-miR-625*及其组合。所述方法可以用于评价前列腺癌。例如，所述方法可以用于区分包含前列腺癌的样品与不带前列腺癌的样品。在再另一个实施方案中，一种或多种生物标志物，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多种生物标志物，选自hsa-miR-582-3p、hsa-miR-20a*、hsa-miR-375、hsa-miR-200b、hsa-miR-379、hsa-miR-572、hsa-miR-513a-5p、hsa-miR-577、hsa-miR-23a*、hsa-miR-1236、hsa-miR-609、hsa-miR-17*、hsa-miR-130b、hsa-miR-619、hsa-miR-624*、hsa-miR-198及其组合。例如，所述方法可以用于区分包含转移性前列腺癌的样品与具有非转移性前列腺癌的样品。所述一种或多种生物标志物可以作为微囊泡群体的有效负载来分离。
一种或多种生物标志物可以是miR-497。所述方法可以用于评价肺癌。例如，所述方法可以用于区分肺癌样品与非癌样品。所述一种或多种生物标志物可以作为微囊泡群体的有效负载来分离。
一种或多种生物标志物，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多种生物标志物，可以包括选自AQP2、BMP5、C16orf86、CXCL13、DST、ERCC1、GNAO1、KLHL5、MAP4K1、NELL2、PENK、PGF、POU3F1、PRSS21、SCML1、SEMG1、SMARCD3、SNAI2、TAF1C、TNNT3及其组合的信使RNA(mRNA)。mRNA可以从微囊泡分离。所述方法可以用于表征前列腺癌，如区分前列腺癌样品与不带癌的正常样品。在另一个实施方案中，一种或多种生物标志物，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多种生物标志物，可以包括选自ADRB2、ARG2、C22orf32、CYorf14、EIF1AY、FEV、KLK2、KLK4、LRRC26、MAOA、NLGN4Y、PNPLA7、PVRL3、SIM2、SLC30A4、SLC45A3、STX19、TRIM36、TRPM8及其组合的信使RNA(mRNA)。mRNA可以从微囊泡分离。所述方法可以用于表征前列腺癌，如区分前列腺癌样品与具有另一种癌症的样品，例如，乳腺癌。在再另一个实施方案中，一种或多种生物标志物，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多种生物标志物，包括选自ADRB2、BAIAP2L2、C19orf33、CDX1、CEACAM6、EEF1A2、ERN2、FAM110B、FOXA2、KLK2、KLK4、LOC389816、LRRC26、MIPOL1、SLC45A3、SPDEF、TRIM31、TRIM36、ZNF613及其组合的信使RNA(mRNA)。mRNA可以从微囊泡分离。所述方法可以用于表征前列腺癌，如区分前列腺癌样品与具有另一种癌症的样品，例如，结肠直肠癌。在再另一个实施方案中，一种或多种生物标志物，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多种生物标志物，包括选自ASTN2、CAB39L、CRIP1、FAM110B、FEV、GSTP1、KLK2、KLK4、LOC389816、LRRC26、MUC1、PNPLA7、SIM2、SLC45A3、SPDEF、TRIM36、TRPV6、ZNF613及其组合的信使RNA(mRNA)。mRNA可以从微囊泡分离。所述方法可以用于表征前列腺癌，如区分前列腺癌样品与具有另一种癌症的样品，例如，肺癌。一种或多种生物标志物还可以是调节用于表征前列腺癌的一种或多种mRNA的微RNA。例如，一种或多种生物标志物，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多种生物标志物，可以包括选自miRs-26a+b、miR-15、miR-16、miR-195、miR-497、miR-424、miR-206、miR-342-5p、miR-186、miR-1271、miR-600、miR-216b、miR-519家族、miR-203及其组合的微RNA。微RNA可以作为微囊泡群体的有效负载来评价。
本发明还提供了通过评价生物标志物复合物来鉴定生物印记的方法。在一个方面中，所述方法包括从生物样品分离一种或多种核酸-蛋白质复合物；确定一种或多种核酸生物标志物与一种或多种核酸-蛋白质复合物的存在或水平；并且鉴定包括该一种或多种核酸生物标志物的存在或水平的生物印记。在一些实施方案中，所述生物印记还可以包括一种或多种蛋白质或复合物的其他成分的存在或水平。可以使用本文中公开的或本领域已知的方法从生物样品分离核酸-蛋白质复合物。例如，可以通过亲和性选择，如通过免疫沉淀、柱色谱或流式细胞术，使用复合物成分的结合剂来分离复合物。结合剂可以如本文中所述的，例如，复合物蛋白质成分的抗体或适体。在一些实施方案中，所述方法进一步包括将生物印记与参照生物印记相比较，其中该比较用于表征癌症，包括本文中公开的或本领域已知的癌症。参照生物印记可以来自未患癌的受试者。参照生物印记还可以来自该受试者，例如，来自正常邻近组织或来自另一个时间点获取的样品。本文中公开了表征癌症的各种方式。例如，表征癌症可以包括鉴定受试者中癌症的存在或风险，或鉴定受试者中癌症是转移性的或侵袭性的。比较步骤包括确定生物印记相对于参照生物印记是否有所变化，由此提供癌症的预后、诊断或治疗诊断表征。所述生物样品包括体液，包括但不限于本文中公开的体液。例如，体液可以包括尿液、血液或血液衍生物。
在一个实施方案中，核酸-蛋白质复合物包含一种或多种蛋白质，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种或更多种蛋白，其选自一个或多个Argonaute家族成员、Ago1、Ago2、Ago3、Ago4、GW182(TNRC6A)、TNRC6B、TNRC6C、HNRNPA2B1、HNRPAB、ILF2、NCL(核仁素)、NPM1(核磷蛋白)、RPL10A、RPL5、RPLP1、RPS12、RPS19、SNRPG、TROVE2、阿朴脂蛋白、阿朴脂蛋白A、apo A-I、apo A-II、apo A-IV、apo A-V、阿朴脂蛋白B、apo B48、apo B100、阿朴脂蛋白C、apo C-I、apo C-II、apo C-III、apo C-IV、阿朴脂蛋白D(ApoD)、阿朴脂蛋白E(ApoE)、阿朴脂蛋白H(ApoH)、阿朴脂蛋白L、APOL1、APOL2、APOL3、APOL4、APOL5、APOL6、APOLD1及其组合。例如，核酸-蛋白质复合物可以包括选自一个或多个Argonaute家族成员、Ago1、Ago2、Ago3、Ago4、GW182(TNRC6A)及其组合的一种或多种蛋白。核酸-蛋白质复合物包含选自Ago2、阿朴脂蛋白I、GW182(TNRC6A)及其组合的一种或多种蛋白。
在多种实施方案中，核酸-蛋白质复合物中的一种或多种核酸包括一种或多种微RNA。例如，所述一种或多种微RNA，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或更多种微RNA可以是表5中的微RNA。一种或多种微RNA可以包括选自miR-22、miR-16、miR-148a、miR-92a、miR-451、let7a及其组合的一种或多种微RNA，例如，1、2、3、4、5或6种微RNA。可以评价所述的一种或多种微RNA以表征，例如，诊断、预后或治疗诊断癌症，包括但不限于前列腺癌。
在一个实施方案中，核酸-蛋白质复合物包含选自Ago2、阿朴脂蛋白I、GW182(TNRC6A)及其组合的一种或多种蛋白质；并且一种或多种微RNA包括一种或多种选自miR-16和miR-92a及其组合的微RNA。为了表征前列腺癌，可以评价所述的一种或多种微RNA。
本发明进一步提供了确定生物印记的方法，包括检测目标微囊泡群体中的核酸。囊泡群体可以是生物样品中整个群体或亚群体，如具有特定表面抗原的亚群体。该方法包括检测来自生物样品的微囊泡群体中的一种或多种蛋白质生物标志物；确定与检测的微囊泡群体相关的一种或多种核酸生物标志物的存在或水平；和鉴定包括一种或多种核酸的存在或水平的生物印记。用于检测微囊泡群体、检测蛋白质和评价核酸的技术可以是本文中公开的或是本领域已知的。例如，可以通过针对一种或多种蛋白质的亲和性选择来分离微囊泡，并且可以从选择的微囊泡分离核酸。可以将一种或多种核酸生物标志物的水平相对于一种或多种蛋白质标志物的水平或微囊泡群体的水平标准化。在一些实施方案中，所述方法进一步包括将生物印记与参照生物印记相比较，其中该比较用于表征癌症，包括本文中公开的或本领域已知的癌症。参照生物印记可以来自未患癌症的受试者。参照生物印记还可以来自该受试者，例如，来自正常的邻近组织或来自另一个时间点获取的样品。本文中公开了表征癌症的各种方式。例如，表征癌症可以包括鉴定受试者中癌症的存在或风险，或鉴定受试者中癌症是转移性的或侵袭性的。比较步骤包括确定生物印记相对于参照生物印记是否有所变化，由此提供癌症的预后、诊断或治疗诊断表征。所述生物样品包括体液，包括但不限于本文中公开的体液。例如，体液可以包括尿液、血液或血液衍生物。
用于检测微囊泡群体中的一种或多种蛋白质生物标志物的蛋白质可以包括本文中公开的一种或多种生物标志物，如表3-5或9-11中公开的。例如，所述一种或多种蛋白质可以选自PCSA、Ago2、CD9及其组合。例如，所述一种或多种蛋白质可以是PCSA、Ago2、CD9、PCSA和Ago2、PCSA和CD9、Ago2和CD9或者PCSA、Ago2和CD9的全部。另一种一般囊泡标志物如表3中的一般囊泡标志物，例如四跨膜蛋白质如CD63或CD81，可以替换CD9或在CD9之外使用。这样的多生物标志物可以用于鉴定具有特定来源的微囊泡群体。例如，PCSA可以鉴定前列腺源的囊泡，而CD9鉴定除细胞碎片以外的囊泡。PCSA、PSMA、PSCA、KLK2或PBP(前列腺结合蛋白)可以用作生物标志物来表征前列腺癌。
所述一种或多种核酸生物标志物可以包括一种或多种本文中公开的核酸，如表5中公开的。在一个实施方案中，所述一种或多种核酸包括一种或多种微RNA。例如，所述一种或多种微RNA可以选自miR-22、miR-16、miR-148a、miR-92a、miR-451和let7a中的1、2、3、4、5或6种。在一个实施方案中，所述一种或多种蛋白质生物标志物包括PCSA和Ago2；而所述一种或多种核酸生物标志物包括miR-22。在另一个实施方案中，所述一种或多种蛋白质生物标志物包括PCSA和/或CD9；而所述一种或多种核酸生物标志物包括miR-22。该方法可以用于表征癌症，如前列腺癌，例如，用于区分癌症样品与非癌样品。
在其他实施方案中，所述一种或多种核酸包括mRNA。可以作为微囊泡内的有效负载来评价mRNA。例如，所述一种或多种核酸生物标志物包括选自表5的信使RNA(mRNA)。mRNA还可以选自表22-24中的任一个。在一些实施方案中，所述一种或多种蛋白质生物标志物包括PCSA；而所述一种或多种核酸生物标志物包括选自表22-24任一个中的信使RNA(mRNA)。该方法可以用于表征癌症，如前列腺癌，例如，用于区分癌症样品与非癌样品。
可以将一种或多种核酸生物标志物的水平相对于一种或多种蛋白质生物标志物的水平标准化。在一个实施方案中，生物印记包括从该一种或多种蛋白质生物标志物和一种或多种核酸生物标志物的水平的比率计算的评分。例如，可以将核酸的水平除以蛋白质的水平。
可以从多种蛋白质和多种核酸计算所述评分。在一个实施方案中，所述一种或多种蛋白质生物标志物包括PCSA和PSMA，而一种或多种核酸生物标志物包括miR-22和let7a。该方法用于表征前列腺癌，例如，用于区分前列腺癌样品与非前列腺癌样品。所述评分可以取以下的总和：a)微囊泡亚群体中miR-22有效负载的水平除以与微囊泡亚群体相关的PCSA蛋白质的水平的第一倍数；b)微囊泡亚群体中let7a有效负载的水平除以与微囊泡亚群体相关的PCSA蛋白质的水平的第二倍数；和c)与微囊泡亚群体相关的PSMA蛋白质的水平的第三倍数。可以选择第一、第二和第三倍数来最大化该方法区分前列腺癌的能力。例如，倍数可以为约0.0001、0.001、0.1、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、100、1000或10000。在一个实施方案中，第一倍数为10，第二倍数为10，而第三倍数为1。所述评分可以为该总和的平均，如：
评分＝平均(10*miR22/PCSA MFI，10*let-7a/PCSA MFI，PSMA MFI)
本领域技术人员将理解，计算该评分可以包括总和的单调变换。对于其他情况中的其他生物标志物可以研发相似的评分等式，如使用可选的生物标志物来表征其他癌症。
通过选择用于比较的适当参照样品，所鉴定的生物印记可以提供诊断结果(例如，参照样品是正常的或非疾病的)、预后(例如，参照样品是用于差或良好的疾病结果、侵袭性等等)或诊断治疗(例如，参照样品来自对选择的治疗响应或非响应的同龄组)。
可以用于本发明的方法中的另外的生物标志物包括2012年2月17日提交的国际专利申请PCT/US2012/025741；2011年8月18日提交的国际专利申请PCT/US2011/048327；2011年3月1日提交的国际专利申请PCT/US2011/026750和2011年4月6日提交的国际专利申请PCT/US2011/031479中公开的那些，各专利申请通过引用全文并入。
基因融合
囊泡的所评估的一种或多种生物标志物可以为基因融合体。融合基因为通过将两个之前独立的基因并列而建立的杂合基因。这可以通过染色体易位或倒位、删除或通过反式剪接来形成。所得的融合基因可以导致基因的异常时间和空间表达，例如引起细胞生长因子、血管生成因子、肿瘤启动剂或有助于细胞的肿瘤转化和肿瘤生成的其它因子的异常表达。所述的融合基因可以由于以下的并置而致癌的：1)邻接于细胞生长因子、肿瘤启动剂或促进癌形成的其它基因的编码区域的一个基因的强启动子区域，从而导致提高的基因表达；或者2)由于两个不同基因的编码区域的融合，导致嵌合的基因并由此得到具有异常活性的嵌合蛋白质。
融合基因的实例为BCR-ABL，其为～90％的慢性骨髓性白血病(CML)和急性白血病亚组中的特征性分子异常(Kurzrock等，Annals ofInternal Medicine2003；138(10)：819-830)。BCR-ABL是由于染色体9和22之间的易位所导致的。所述的易位将BCR基因的5’区与ABL1的3’区域合在一起，从而得到嵌合的BCR-ABL1基因，其编码具有组成型活性的酪氨酸激酶活性的蛋白质(Mittleman等，Nature Reviews Cancer2007；7(4)：233-245)。异常的酪氨酸激酶活性导致了失调的细胞信号转导、细胞生长和细胞存活、细胞凋亡抗性和细胞因子非依赖性，所有这些都造成白血病的病理生理(Kurzrock等，Annals of Internal Medicine2003；138(10)：819-830)。
另一个融合基因为IGH-MYC，其为～80％的伯基特氏淋巴瘤的标志性特征(Ferry等Oncologist2006；11(4)：375-83)。造成该结果的原因事件是染色体8与14之间的易位，从而使c-Myc致癌基因与免疫球蛋白重链基因的强启动子相邻，导致c-myc过表达(Mittleman等，NatureReviews Cancer2007；7(4)：233-245)。c-myc重排是淋巴瘤生成的关键事件，这是由于其导致持久的增殖状态。其对于通过细胞循环、细胞分化、细胞凋亡和细胞粘附的进程具有广泛的作用(Ferry等Oncologist2006；11(4)：375-83)。
多种频发的融合基因已经收录于Mittleman数据库(cgap.nci.nih.gov/Chromosomes/Mitelman)中，并且可以在囊泡中进行评估，而且可以用于表征表型。所述的基因融合体可以用于表征血液恶性肿瘤或上皮肿瘤。例如可以检测TMPRSS2-ERG、TMPRSS2-ETV和SLC45A3-ELK4融合并用于表征前列腺癌；并且可以检测ETV6-NTRK3和ODZ4-NRG1用于表征乳腺癌。
此外，评估融合基因的存在或不存在或者表达水平可以用于诊断表型(例如癌症)以及监测治疗反应以选择治疗。例如，BCR-ABL融合基因的存在不仅为用于诊断CML的特征，而且为用于治疗CML的Novartis药物甲磺酸伊马替尼(Gleevec)(其为受体酪氨酸激酶抑制剂)的靶标。伊马替尼的治疗导致分子应答(BCR-ABL+血细胞的消失)，以及BCR-ABL+CML患者中改善的无进展存活(Kanrarjian等，ClinicalCancer Research2007；13(4)：1089-1097)。
针对基因融合体的存在、不存在或表达水平来评估囊泡可以是通过针对基因融合体的存在、不存在或表达水平评估异质的囊泡群体。或者，所评估的囊泡可以源自特定的细胞类型，例如细胞源特异性囊泡，如上文所述。可评估用以表征表型的融合体的应用的实例包括2011年4月6日提交的发明名称为“Circulating Biomarkers for Disease”的国际专利申请系列No.PCT/US2011/031479中所述的那些，将该申请全部按引用并入本文中。
基因相关MiRNA生物标志物
已知使用与特定转录产物相互作用并且可以进行评价来表征表型的miRNA生物标志物的说明性实例包括2011年4月6日提交的发明名称为“Circulating Biomarkers for Disease”的国际专利申请系列No.PCT/US2011/031479中所述的那些，将该申请全部按引用并入本文中。
核酸-蛋白质复合生物标志物
已经发现了人血浆中的微RNA与循环微囊泡、Argonaute蛋白以及HDL和LDL复合物相关。参见，例如，Arroyo等，Argonaute2complexescarry a population of circulating microRNAs independent of vesicles inhuman plasma.Proc Natl Acad Sci USA.2011.108：5003-08.Epub2011年3月7日；Collino等，Microvesicles derived from adult human bonemarrow and tissue specific mesenchymal stem cells shuttle selected patternofmiRNAs.PLOS One.20105(7)：e11803。蛋白质的Argonaute蛋白家族在RNA干扰(RNAi)基因沉默中起着作用。Argonaute蛋白结合短RNA，如微RNA(miRNA)或短干扰RNA(siRNA)，并且抑制其互补mRNA的翻译。它们还涉及转录基因沉默(TGS)，其中称为抗基因RNA或agRNA的短RNA指引互补启动子区域的转录抑制。Argonaute家族成员包括Argonaute1(“真核生物翻译启动因子2C，1”、EIF2C1、AGO1)、Argonaute2(“真核生物翻译启动因子2C，2”、EIF2C2、AGO2)、Argonaute3(“真核生物翻译启动因子2C，3”、EIF2C3、AGO3)和Argonaute4(“真核生物翻译启动因子2C，4”、EIF2C4、AGO4)。已经鉴定出几个Argonaute异型体。Argonaute2是RNA-诱导沉默复合物(RISC)内的效应蛋白，其中它在微RNA沉默途径中靶信使RNA的沉默中起着作用。
蛋白GW182与微囊泡相关，并且也具有结合所有人Argonaute蛋白(例如，Ago1、Ago2、Ago3、Ago4)及其相关miRNA的能力。参见，例如，Gibbings等，Multivesicular bodies associate with components ofmiRNA effector complexes and modulate miRNA activity，Nat Cell Biol200911：1143-1149.Epub2009年8月16日；Lazzaretti等，TheC-terminal domains of human TNRC6A，TNRC6B，and TNRC6C silencebound transcripts independently of Argonaute proteins.RNA.200915：1059-66.Epub2009年4月21日。GW182，其由TNRC6A基因(含6A的三核苷酸重复)编码，通过RNA干扰(RNAi)和微RNA途径在转录后基因沉默中起作用。TNRC6B和TNRC6C也是含6三核苷酸重复家族的成员，且在基因沉默中起着相似作用。GW182与称为GW-体或P-体的胞质体中的mRNA和Argonaute蛋白相关。GW182涉及翻译的miRNA-依赖性抑制，并且通过argonaute家族蛋白用于互补mRNA的siRNA-依赖性核苷酸内切的切割。
在一个方面中，本发明提供了表征表型的方法，包括分析核酸-蛋白质复合生物标志物。如本文中所用的，核酸-蛋白质复合物包含至少一种核酸和至少一种蛋白质，并且还可以包括其他成分，如脂质。核酸-蛋白质复合物可以与囊泡结合。在一个实施方案中，分离RNA-蛋白质复合物，并且测定结合的RNA的水平，其中将该水平用于表征表型，例如，提供诊断、预后、治疗诊断或其他表型，如本文中所述的。RNA可以是微RNA。已经发现了微RNA与囊泡和蛋白质结合。在一些情况中，这种结合可以用于保护miRNA免受RNA酶或其他因素引起的降解。可以检测样品中的各种微RNA群体的含量，包括但不限于，囊泡相关miR、Ago相关miR、细胞源囊泡相关miR、循环Ago-结合的miR、循环HDL结合的miR和总miR含量。
用于分离复合物的蛋白质标志物可以是一种或多种Argonaute蛋白，或与Argonaute家族成员相关的其他蛋白质。这些包括但不限于Argonaute蛋白Ago1、Ago2、Ago3、Ago4及其各种异型体。蛋白质生物标志物可以是GW182(TNRC6A)、TNRC6B和/或TNRC6C。蛋白质生物标志物可以是与P-体或GW-体相关的蛋白，如SW182、argonaute、脱帽酶或RNA螺旋酶。参见，例如，Kulkarni等，On track with P-bodies.Biochem Soc Trans2010，38：242-251。蛋白质生物标志物还可以是HNRNPA2B1(异源核核糖核蛋白a2/b1)、HNRPAB(异源核核糖核蛋白A/B)、ILF2(白细胞间介素增强子结合因子2，45kda)、NCL(核仁素)、NPM1(Nucleophosmin(核磷蛋白b23，numatrin))、RPL10A(核糖体蛋白110a)、RPL5(核糖体蛋白15)、RPLP1(核糖体蛋白，大，p1)、RPS12(核糖体蛋白s12)、RPS19(核糖体蛋白s19)、SNRPG(小核核糖核蛋白多肽g)、TROVE2(Trove结构域家族，成员2)。参见Wang等，Export of microRNAs and microRNA-protective protein bymammalian cells.Nucleic Acids Res.38：7248-59.Epub2010年7月7日。蛋白质生物标志物还可以是阿朴脂蛋白，其是结合脂质(油溶性物质，如脂肪和胆固醇)以形成脂蛋白的蛋白质，其将脂质通过淋巴和循环系统转运脂质。参见Vicker等，MicroRNAs are transported in plasma anddelivered to recipient cells by high-density lipoproteins，Nat Cell Biol201113：423-33，Epub2011年3月20日。阿朴脂蛋白可以是阿朴脂蛋白A(包括apo A-I、apo A-II和apo A-V)、阿朴脂蛋白B(包括apo B48和apoB100)、阿朴脂蛋白C(包括apo C-I、apo C-II、apo C-III和apo C-IV)、阿朴脂蛋白D(ApoD)、阿朴脂蛋白E(Apo E)、阿朴脂蛋白H(ApoH)或其组合。阿朴脂蛋白可以是阿朴脂蛋白L，包括APOL1、APOL2、APOL3、APOL4、APOL5、APOL6、APOLD1或其组合。阿朴脂蛋白L(Apo L)属于高密度脂蛋白家族，其在胆固醇转运中起着关键作用。蛋白质生物标志物可以是脂蛋白的成分，如乳糜微粒、非常低密度脂蛋白(VLDL)、中密度脂蛋白(IDL)、低密度脂蛋白(LDL)和/或高密度脂蛋白(HDL)的成分。在一个实施方案中，蛋白质生物标志物是LDL或HDL的成分。该成分可以是ApoE。成分可以是ApoA1。蛋白质生物标志物可以是一般囊泡标志物，如四跨膜蛋白或表3中所列的其他蛋白质，包括但不限于CD9、CD63和/或CD81。蛋白质生物标志物可以是癌症标志物，如EpCam、B7H3和/或CD24。蛋白质生物标志物可以是组织特异性生物标志物，如前列腺生物标志物PSCA、PCSA和/或PSMA。这些或其他有用的蛋白质生物标志物的组合可以用于分离特异性的目标复合物群体。
可以通过使用复合物的一种或多种成分的结合剂来分离核酸-蛋白质复合物。用于分离蛋白质的各种技术是本领域技术人员已知的和/或在本文中提供了，包括但不限于亲和性分离、免疫捕获、免疫沉淀和流式细胞术。结合剂可以是任何合适的结合剂，包括本文中所述的那些，如一种或多种结合剂包含核酸、DNA分子、RNA分子、抗体、抗体片段、适体、类肽、zDNA、肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA)、凝集素、肽、树状分子、膜蛋白标记剂、化学化合物或其组合。在一个实施方案中，结合剂包含抗体、抗体偶联物、抗体片段和/或适体。对于可以与本发明一起使用的评价蛋白质-核酸复合物的其他方法，还可以参见Wang等，Export of microRNAs and microRNA-protective protein by mammaliancells.Nucleic Acids Res.38：7248-59.Epub2010年7月7日；Keene等，RIP-Chip：the isolation and identification of mRNAs，microRNAs andprotein components of ribonucleoprotein complexes from cell extracts.NatProtoc20061：302-07；Hafner，Transcriptome-wide identification ofRNA-binding protein and microRNA target sites by PAR-CLIP.Cell2010141：129-41。
本发明进一步提供了鉴定在与蛋白质的复合物中发现的miRNA的方法。在一个实施方案中，如上所述分离蛋白质-核酸复合物群体。评估群体的miRNA含量。该方法可以用于各种目标样品(例如，患病的、未患病的、响应者、非响应者)，并且可以将样品中的miRNA含量进行比较以鉴定样品之间差异的miRNA。本文中提供了检测miRNA的方法(阵列、pcr等)。根据本文中的方法，所鉴定的miRNA可以用于表征表型。例如，用于发现的样品可以是癌症和非癌症血浆样品。可以鉴定区分癌症和非癌症样品的蛋白质复合的miRNA，并且可以评价区别miRNA以检测血浆样品中的癌症。
本发明还提供了通过从含囊泡样品除去非有效负载miR，然后评估囊泡内的miR含量来区分囊泡内的微RNA有效负载的方法。可以使用RNA酶或其它降解miRNA的实体从样品中除去miR。在一些实施方案中，在RNA酶处理之前，用试剂处理样品以从蛋白质复合物中除去微RNA。所述试剂可以是降解蛋白质的酶，例如，蛋白酶，如Proteinase K或胰蛋白酶，或任何其他合适的酶。根据本文中的方法，通过评估与游离miRNA或循环蛋白质复合物中的miRNA分开的囊泡包含的微RNA部分，所述方法可以用于表征表型。
生物标志物检测
根据本文公开的，可通过检测循环生物标志物，例如，微RNA、蛋白质、囊泡或其它生物标志物的存在、水平或浓度定性地或定量地检测生物印记。可使用本领域的技术人员所知的多种技术检测这些生物印记成分。例如，可通过微阵列分析、聚合酶链反应(PCR)(包括基于PCR的方法，例如实时聚合酶链反应(RT-PCR)、定量实时聚合酶链反应(Q-PCR/qPCR)等)、与等位基因特异性探针的杂交、酶突变检测、连接酶链反应(LCR)、寡核苷酸连接分析(OLA)、流式细胞异源双链分析、错配的化学切割、质谱、核酸测序、单链构象多态性(SSCP)、变性梯度凝胶电泳(DGGE)、温度梯度凝胶电泳(TGGE)、限制片段长度多态性、基因表达的系列分析(SAGE)或它们的组合检测生物标志物。可在检测前扩增生物标志物，诸如核酸。还可通过免疫分析、免疫印迹、免疫沉淀、酶联免疫吸附分析(ELISA，EIA)、放射免疫分析(RIA)、流式细胞法或电子显微法(EM)检测生物标志物。
根据本文所述的，可使用捕获剂和检测剂检测生物印记。捕获剂可包含抗体、适体或识别生物标志物并且可用于捕获所述生物标志物的其它实体。可被捕获的生物标志物包括循环生物标志物，如，体液的溶液中的蛋白质、核酸、脂质或生物复合物。类似地，所述捕获剂可用于捕获囊泡。检测剂可包含抗体或识别生物标志物并且可用于检测所述生物标志物囊泡或者识别囊泡并且可用于检测囊泡的其它实体。在一些实施方案中，所述检测剂被标记并且对标记物进行检测，由此而检测所述生物标志物或囊泡。所述检测剂可以是结合剂，如抗体或适体。在其它实施方案中，所述检测剂包含小分子，诸如膜蛋白标记剂。例如，参见，公开于Alroy等的美国专利公开号US2005/0158708中的膜蛋白标记剂。在实施方案中，根据本发明描述分离或捕获囊泡，并且将一种或多种膜蛋白标记剂用于检测所述囊泡。在许多情况下，由所述捕获剂和检测剂所识别的抗原或其它囊泡部分是可互换的。作为一个非限制性实例，考虑在其表面上具有细胞源特异性抗原和在其表面具有癌症特异性抗原的囊泡。在一种情况下，所述囊泡可使用针对所述细胞源特异性抗原的抗体进行捕获(例如通过将捕获抗体系留于基底上)，并且所述囊泡随后使用针对所述癌症特异性抗原的抗体进行检测(例如通过使用荧光染料标记所述检测抗体并且检测所述染料发射的荧光辐射)。在另一种情况下，所述囊泡可使用针对所述癌症特异性抗原的抗体进行捕获(例如通过将所述捕获抗体锚定于基底上)，并且所述囊泡随后使用针对所述细胞源特异性抗原的抗体进行检测(例如通过使用荧光染料标记所述检测抗体并且检测所述染料发射的荧光辐射)。
在一些实施方案中，捕获剂和检测剂两者识别同一生物标志物。可根据情况使用该方案。在一个实施方案中，所述生物标志物足以检测目标囊泡，例如，足以捕获细胞源特异性囊泡。在其它实施方案中，所述生物标志物是多功能的，如，具有细胞源特异性和癌症特异性特性。所述生物标志物可以与同样用于捕获和检测的其它生物标志物协调使用。
检测生物标志物的一种方法包括如上文所述从生物样品纯化或分离异质囊泡群体并且进行夹心分析(sandwich assay)。可以使用捕获剂捕获所述群体中的囊泡。所述捕获剂可以是捕获抗体，诸如初级抗体。所述捕获抗体可结合于基底，例如阵列、孔或颗粒。可使用检测剂(诸如检测抗体)检测捕获或结合的囊泡。例如，所述检测抗体可以针对所述囊泡的抗原。所述的检测抗体可以直接标记和检测。或者，所述检测剂可间接标记和检测，诸如通过可与所述检测剂反应的酶连接的二级抗体。可加入检测试剂或检测底物，并检测反应，例如PCT公开号No.WO2009092386中所描述的。在其中所述结合剂结合Rab-5b并且所述检测剂结合或检测CD63或小窝蛋白-1的说明性实例中，所述捕获剂可以是抗Rab5b抗体并且所述检测剂可以是抗CD63或抗小窝蛋白-1抗体。在一些实施方案中，所述捕获剂结合CD9、PSCA、TNFR、CD63、B7H3、MFG-E8、EpCam、Rab、CD81、STEAP、PCSA、PSMA或5T4。例如，所述捕获剂可以是针对CD9、PSCA、TNFR、CD63、B7H3、MFG-E8、EpCam、Rab、CD81、STEAP、PCSA、PSMA或5T4的抗体。所述捕获剂还可以是针对MFG-E8、膜联蛋白V、组织因子、DR3、STEAP、epha2、TMEM211、unc93A、A33、CD24、NGAL、EpCam、MUC17、TROP2或TETS的抗体。所述检测剂可以是结合或检测CD63、CD9、CD81、B7H3或EpCam的试剂，诸如针对CD63、CD9、CD81、B7H3或EpCam的检测抗体适体。捕获剂和/或检测剂的各种不同组合可协调使用。在一个实施方案中，所述捕获剂包含PCSA、PSMA、B7H3并且可任选地包含EpCam，并且所述检测剂包含一种或多种一般囊泡生物标志物，例如四跨膜蛋白，诸如CD9、CD63和CD81。在另一个实施方案中，所述捕获剂包含TMEM211和CD24，并且所述检测剂包含一种或多种四跨膜蛋白，诸如CD9、CD63和CD81。在另一个实施方案中，所述捕获剂包含CD66和EpCam，并且所述检测剂包含一种或多种四跨膜蛋白，诸如CD9、CD63和CD81。捕获剂和/或检测剂可以是包含CD9、Erb2、Erb4、CD81、Erb3、MUC16、CD63、DLL4、HLA-Drpe、B7H3、IFNAR、5T4、PCSA、MICB、PSMA、MFG-E8、Muc1、PSA、Muc2、Unc93a、VEGFR2、EpCAM、VEGF A、TMPRSS2、RAGE*、PSCA、CD40、Muc17、IL-17-RA和CD80中的一种或多种的抗原。例如，捕获剂和/或检测剂可以是CD9、CD63、CD81、B7H3、PCSA、MFG-E8、MUC2、EpCam、RAGE和Muc17中的一种或多种。提高数量的这些四跨膜蛋白和/或其它一般囊泡标志物在某些情况下可改善所述检测信号。也可使用夹心方法检测蛋白质或其它循环生物标志物。可收集所述捕获的囊泡和用于分析其中所包含的有效负载，如mRNA、微RNA、DNA和可溶性蛋白。
在一些实施方案中，所述捕获剂结合或靶向于EpCam、B7H3、RAGE或CD24，并且在所述囊泡上检测的一种或多种生物标志物是CD9和/或CD63。在一个实施方案中，所述捕获剂结合或靶向于EpCam，并且在所述囊泡上检测的一种或多种生物标志物是CD9、EpCam和/或CD81。单一捕获剂可以选自CD9、PSCA、TNFR、CD63、B7H3、MFG-E8、EpCam、Rab、CD81、STEAP、PCSA、PSMA或5T4。所述单一捕获剂还可以是针对DR3、STEAP、epha2、TMEM211、unc93A、A33、CD24、NGAL、EpCam、MUC17、TROP2、MFG-E8、TF、膜联蛋白V或TETS的抗体。在一些实施方案中，所述单一捕获剂选自PCSA、PSMA、B7H3、CD81、CD9和CD63。
在其它实施方案中，所述捕获剂靶向于PCSA，并且在捕获的囊泡上检测的一种或多种生物标志物是B7H3和/或PSMA。在其它实施方案中，所述捕获剂靶向于PSMA，并且在捕获的囊泡上检测的一种或多种生物标志物是B7H3和/或PCSA。在其它实施方案中，所述捕获剂靶向于B7H3，并且在捕获的囊泡上检测的一种或多种生物标志物是PSMA和/或PCSA。在再另外的实施方案中，所述捕获剂靶向于CD63，并且在捕获的囊泡上检测的一种或多种生物标志物是CD81、CD83、CD9和/或CD63。本文所公开的不同捕获剂和生物标志物组合可用于表征表型，诸如检测、诊断或预后疾病，如癌症。在一些实施方案中，可使用靶向于EpCam的捕获剂及CD9和CD63的检测；使用靶向于PCSA的捕获剂及B7H3和PSMA的检测；或者使用CD63的捕获剂及CD81的检测来分析囊泡，从而表征前列腺癌。在其它实施方案中，使用靶向于CD63的捕获剂及CD63的检测或者靶向于CD9的捕获剂与CD63的检测偶联将囊泡用于表征结肠癌。技术人员应当了解，捕获剂和检测剂的靶标可互换使用。在说明性实例中，考虑了靶向于PCSA的捕获剂和靶向于B7H3和PSMA的检测剂。由于全部这些标志物可用于检测PCa源的囊泡，可以通过所述捕获剂靶向于B7H3或PSMA并且可通过检测剂识别PCSA。例如，在一些实施方案中，所述检测剂靶向于PCSA，并且用于捕获所述囊泡的一种或多种生物标志物包含B7H3和/或PSMA。在其它实施方案中，所述捕获剂靶向于PSMA，并且用于捕获所述囊泡的一种或多种生物标志物包含B7H3和/或PCSA。在其它实施方案中，所述检测剂靶向于B7H3，并且用于捕获所述囊泡的一种或多种生物标志物包含PSMA和/或PCSA。在一些实施方案中，本发明提供了使用针对PSMA、B7H3和/或PCSA的捕获剂和/或检测剂在体液中检测前列腺癌细胞的方法。所述体液可包含血液，其包括血清或血浆。所述体液可包含射出液或精子。在另外的实施方案中，检测前列腺癌的方法进一步使用针对CD81、CD83、CD9和/或CD63的捕获剂和/或检测剂。所述方法还提供了表征GI失调的方法，其包括使用DR3、STEAP、epha2、TMEM211、unc93A、A33、CD24、NGAL、EpCam、MUC17、TROP2和TETS中的一种或多种捕获囊泡，以及使用一种或多种一般囊泡抗原(诸如CD81、CD63和/或CD9)检测所捕获的囊泡。另外的试剂可改善测试性能，如，改善测试精确性或AUC，其通过提供额外的生物分辨力和/或通过降低实验噪音而实现。
用于本发明的检测生物标志物的技术包括使用平面基底，诸如阵列(如生物芯片或微阵列)，其具有固定于所述基底上的分子以作为辅助对特定生物印记的检测的捕获剂。所述阵列可作为用于分析一种或多种生物标志物或囊泡的试剂盒的一部分而提供。对上文所述的及2011年4月6日提交的发明名称为“Circulating Biomarkers for disease”的国际专利申请系列No.PCT/US2011/031479(该申请通过引用全文并入)的图1或3-60中示出的生物标志物进行鉴定的分子可以包含在用于检测和诊断疾病(包括症状前疾病)的阵列中。在一些实施方案中，阵列包含定制阵列，其包含经选择以特异性地识别目标生物标志物的生物分子。可改进定制阵列以检测提高统计性能的生物标志物，如对在多元预测模型(如，逻辑回归、辨识分析或回归树模型)中产生改善的交叉验证错误率的生物印记进行鉴定的额外生物分子。在一些实施方案中，构建了定制阵列以研究疾病、状况或症状的生物学并且对限定生理状态下的生物印记进行分型。用于包含在所述定制阵列的标志物可根据统计标准加以选择，例如在区分表型或生理状态中具有所需水平的统计显著性。在一些实施方案中，选用p值＝0.05的标准显著性以排除或包括在所述微阵列中的生物分子。所述p值可针对多重比较进行校正。作为说明性实例，从来自患有或未患疾病的受试者的样品中提取的核酸可与高密度微阵列杂交，所述微阵列结合数千种基因序列。与具有或不具所述疾病的样品之间具有显著不同水平的核酸可被选为生物标志物以区分样品是否具有所述疾病。可构建定制阵列以检测被选择的生物标志物。在一些实施方案中，定制阵列包含低密度微阵列，其指的是具有较低数量(如，数十或数百种，而非数千种)的可编址结合剂的阵列。可在基底上形成低密度阵列。在一些实施方案中，定制的低密度阵列使用在平板孔内的PCR扩增，如，
Figure BPA0000184824780001871
Gene Expression Assays(Life TechnologiesCorporation，Carlsbad，CA的Applied Biosystems)。
平面阵列通常以阵列形式包含生物分子的可编址位置(例如便签(pad)、地址或微位置)。阵列的大小应取决于所述阵列的构成和最终用途。可以制备包含2种不同的分子至数千种不同分子的阵列。通常，所述的阵列包含2种至多至100,000种或更多种分子，这取决于所述阵列的最终用途以及制造方法。用于本发明的微阵列包含至少一种生物分子，该分子鉴定或捕获存在于目标生物印记中的生物标志物，例如微RNA或构成所述生物印记的其它生物分子或囊泡。在一些阵列中，使用了具有不同或相同组成的多个基底。因此，平面阵列可包含多个较小的基底。
本发明可使用多类型的阵列以检测生物标志物，例如，与目的生物印记相关的生物标志物。可用的阵列或微阵列包括但不限于DNA微阵列(诸如cDNA微阵列、寡核苷酸微阵列和SNP微阵列)、微RNA阵列、蛋白质微阵列、抗体微阵列、组织微阵列、细胞微阵列(亦称为转染微阵列)、化学化合物微阵列以及碳水化合物阵列(糖阵列)。这些阵列在以上更详尽地描述。在一些实施方案中，微阵列包含生物芯片，其提供了识别分子(如抗体)的高密度固定化阵列，其中对生物标志物结合进行间接监测(如通过荧光)。图2A示出了说明性配置，其中针对目标囊泡抗原的捕获抗体系留于表面上。随后使用针对相同或不同目标囊泡抗原的检测抗体检测所捕获的囊泡。在可用的和理想的情况下，可使用系留的适体取代所述捕获抗体。示出了荧光检测剂。可类似地使用其它检测剂，例如，酶学反应、可检测纳米颗粒、放射标记等。在其它实施方案中，阵列包含参与通过生物化学或分子间相互作用与通过质谱(MS)进行的检测相结合而捕获蛋白质的形式。可从表面洗脱所述囊泡并可以分析其有效负载，如微RNA。
可用于检测生物印记的一种或多种生物标志物的阵列或微阵列可根据描述于美国专利No.6,329,209；6,365,418；6,406,921；6,475,808和6,475,809以及美国专利申请系列No.10/884,269中的方法制备，其各自全文以引用的方式并入本文。可使用描述于这些专利中的方法制备用于检测本文所述的生物标志物的特定选组的定制阵列。可商购的微阵列也可用于实施本发明的方法，其包括但不限于来自Affymetrix(SantaClara，CA)、Illumina(San Diego，CA)、Agilent(Santa Clara，CA)、Exiqon(Denmark)或Invitrogen(Carlsbad，CA)的那些微阵列。定制阵列和/或商业化阵列包括用于如本文所述的检测蛋白质、核酸以及其它生物分子和实体(如细胞、囊泡、病毒)的阵列。
在一些实施方案中，待固定于阵列上的分子包括蛋白质或肽。一种或多种类型的蛋白质可以被固定在表面上。在特定实施方案中，使用使蛋白质的变性最小化、使蛋白质的活性变化最小化或者使蛋白质与其所固定的表面之间的相互作用最小化的方法和材料来固定所述的蛋白质。
可用的阵列表面可以为任何所需的形状、形式或大小。表面的非限制实例包括芯片、连续的表面、弧形表面、柔性表面、薄膜、平板、薄片或管。表面可以具有一平方微米至大约500cm2的面积。表面的面积、长度和宽度可以根据待实施分析的需求而变化。需要考虑的因素可以包括(例如)操作的简易性、形成表面的材料的限制、检测系统的需要、沉积系统(例如阵列仪)的需要等。
在特定的实施方案中，希望的是使用物理手段来分离多组或多个阵列的结合岛或固定的生物分子：这种物理分离有助于将不同的组或阵列暴露于不同的目标溶液。因此，在特定的实施方案中，阵列处于具有任意数量的孔的微孔板中。在这样的实施方案中，所述孔的底可以起到形成阵列的表面的作用，或者阵列可以在其它表面上形成然后被放置在孔中。在特定的实施方案中，例如其中使用不具有孔的表面的情况下，可以形成结合岛或者可将分子固定在表面上和衬垫上，其具有空间排列的洞以使它们对应于所述岛或使生物分子可以被置于表面上。这种衬垫优选为液体密封的。衬垫可以在制备阵列的过程中的任何时间放置在表面上，并且如果对组或阵列的隔离不再是必需的，则可以除去。
在一些实施方案中，固定的分子可以结合与固定分子接触的生物样品中存在的一种或多种生物标志物或囊泡。在一些实施方案中，所述的固定分子修饰了接触于所述固定分子的一种或多种囊泡中存在的分子，或者被该分子所修饰。与所述样品接触一般包括将所述样品覆盖于所述阵列上。
可以使用本领域已知的检测技术来检测溶液中或固定在阵列上的分子的修饰或结合。这些技术的实例包括免疫技术，例如竞争性结合分析和夹心分析；使用诸如共焦扫描仪、共焦显微镜或基于CCD的系统之类的装置以及诸如荧光、荧光偏振(FP)、荧光共振能量转移(FRET)、全内反射荧光(TIRF)、荧光相关谱(FCS)之类的技术进行的荧光检测；比色/光谱技术；表面等离子共振(通过该技术可以测量被表面所吸附的物质质量的变化)；使用放射性同位素的技术，包括传统的同位素结合以及闪烁迫近分析法(SPA)；质谱，例如基质辅助激光解吸/电离质谱(MALDI)和MALDI飞行时间(TOF)质谱；椭圆光度法，其为测量蛋白质薄膜厚度的光学方法；石英晶体微天平(QCM)，其为测量吸附在表面上的材料质量的极灵敏的方法；扫描探针显微法，例如原子力显微法(AFM)和扫描力显微法(SEM)；以及诸如电化学、阻抗技术、声学技术、微波和IR/Raman检测这样的技术。例如参见Mere L等，″Miniaturized FRETassays and microfluidics：key components for ultra-high-throughputscreening，″Drug Discovery Today4(8)：363-369(1999)及其引用的文献；Lakowicz J R，Principles of Fluorescence Spectroscopy，第2版，PlenumPress(1999)或Jain KK：Integrative Omics，Pharmacoproteomics，andHuman Body Fluids.In：Thongboonkerd V编辑，Proteomics of HumanBody Fluids：Principles，Methods and Applications.Volume1：Totowa，N.J.：Humana Press，2007，各文献全文均以引用方式并入本文。
微阵列技术可以与质谱(MS)分析和其它工具相结合。质谱的电喷雾的接口可以与微流体设备中的毛细管集成。例如，一种市售可得的系统包含eTag报告物，其为具有独特且良好定义的电泳迁移率的荧光标记物；各个标记物通过可切割的键而与生物或化学探针偶联。各个eTag报告物的不同的迁移率定址使得这些标记物的混合物能够通过毛细管电泳快速地解卷积和定量。该系统可以对同一样品同时进行基因表达、蛋白质表达和蛋白质功能的分析，Jain KK；Integrative Omics，Pharmacoproteomics，and Human Body Fluids.In：Thongboonkerd V编辑，Proteomics of Human Body Fluids：Principles，Methods and Applications.第1卷：Totowa，N.J.：Humana Press，2007，其全文以引用方式并入本文。
生物芯片可包括用于微流体或纳米流体分析的组分。微流体装置可用于分离或分析生物标志物，诸如测定生物印记。微流体系统允许对用于分离、捕获或检测囊泡、检测微RNA、检测循环生物标志物、检测生物印记中的一种或多种过程以及其它过程微型化和区室化。在所述系统的至少一个方面，所述的微流体装置可以使用一种或多种检测试剂，并且该检测试剂可以用于检测一种或多种生物标志物。在一个实施方案中，所述装置检测分离的或结合的囊泡上的生物标志物。各种探针、抗体、蛋白质或其它结合剂可用于检测微流体系统中的生物标志物。所述检测剂可以固定于所述微流体装置的不同区室内或通过所述装置的各个通道而进入杂交或检测反应中。
微流体装置中的囊泡可在所述微流体装置中裂解并对其内含物进行检测，诸如蛋白质或核酸，如DNA或RNA，诸如miRNA或mRNA。所述核酸可在所述微流体装置中在检测前扩增或直接检测。因此，微流体系统也可被用于对各种不同标记物的检测进行多重检测。在一个实施方案中，在所述微流体装置中捕获囊泡，所捕获的囊泡被裂解，并且测定来自所述囊泡有效负载的微RNA的生物印记。所述生物印记可进一步包含用于捕获所述囊泡的捕获剂。
新型的纳米加工技术开启了生物传感应用(其依赖于高密度、精确的阵列的加工，例如基于核苷酸的芯片和另外称为异质纳米阵列的蛋白质阵列)的可能性。纳米流体允许将微芯片中流体分析物的量进一步减少至纳升水平，并且本文所用的芯片称为纳米芯片。(例如参见Unger M等，Biotechniques1999；27(5)：1008-14、Kartalov EP等，Biotechniques2006；40(1)：85-90，各文献全文以引用方式并入本文。)目前，市售可得的纳米芯片提供了简单的单步骤分析，例如总胆固醇、总蛋白质或葡萄糖分析，其可以通过将样品与试剂相结合，混合并监测反应来运行。基于液相色谱(LC)和纳米LC分离的无凝胶分析方法(Cutillas等，Proteomics，2005；5：101-112以及Cutillas等，Mol Cell Proteomics2005；4：1038-1051，各文献全文以引用方式并入本文)可以与纳米芯片结合使用。
适用于鉴定疾病、病症、症状或生理状态的阵列可以包括在试剂盒中。试剂盒可以包括，作为非限制性实例，一种或多种用于制备固定在结合岛或阵列的区域上的分子的试剂、用于检测囊泡与固定分子的结合的试剂和使用说明书。
本文进一步提供了有助于检测生物样品中的特定生物印记的快速检测装置。所述装置可以将生物样品的制备与聚合酶链式反应(PCR)集成在芯片上。所述装置可有助于检测生物样品中囊泡的特定生物印记，并且其实例如Pipper等，Angewandte Chemie，47(21)，p.3900-3904(2008)中描述的提供，其全文以引用方式并入本文。可以使用用于诊断应用的微/纳米电化学系统(MEMS/NEMS)传感器和口服流体来引入囊泡的生物印记，如在Li等，Adv Dent Res18(1)：3-5(2005)中所述，其全文以引用方式并入本文。
作为平面阵列的替代，使用微粒的分析(例如基于珠的测定，如本文所述)可以与流式细胞术结合使用。可以使用多参数分析或其它高通量的检测分析(其使用了具有同源配体的珠涂层以及具有与高度灵敏性自动化技术相一致的特定活性的报告分子)。在基于珠的分析系统中，在可寻址微球上固定用于生物标志物或囊泡的结合剂，诸如捕获剂(例如捕获抗体)。用于各单个结合分析的各种结合剂可与不同类型的微球(即，微珠)偶联，并且分析反应在微球的表面上发生，例如图2B所描述的。用于囊泡的结合剂可以是与珠偶联的捕获抗体。具有离散荧光强度的染色微球独立地加载它们适宜的结合剂或捕获探针。根据需要可以将携带不同结合剂的不同组的珠汇聚在一起，从而形成定制珠阵列。然后，将珠阵列在单个反应容器中与所述样品孵育以进行分析。可以使用的或者经适应以用于本发明的微流体装置的实例包括但不限于本文所描述的那些。
可以使用基于荧光的报告系统检测所述的生物标志物与固定的捕获分子或结合剂的产物形成(例如参见图2A-B)。所述的生物标志物可以以荧光团直接标记，或者通过第二荧光标记的捕获生物分子进行检测。可以在流式细胞仪中测量衍生自捕获的生物标志物的信号强度。流式细胞仪可首先通过其单独的颜色编码鉴定各微球。例如，不同的珠可以染色有离散的荧光强度，使得具有不同强度的各个珠具有不同结合剂。所述的珠可以使用至少2种不同的标记物或染料进行标记或染色。在一些实施方案中，使用至少3、4、5、6、7、8、9或10种不同的标记物对所述的珠进行标记。此外，具有多于一种标记物或染料的珠还可以具有不同比例和组成的标记物或染料。所述的珠可进行外部标记或染色，或者可以具有内在的荧光或信号标记物。
各单个珠上捕获的生物标志物的量可以通过对结合的靶特异性的第二颜色荧光来测量。这允许在同一实验中由单一的样品得到多种靶的多重定量。可以相对标准的微滴定ELISA过程比较灵敏度、可靠性和精确性，或者可以加以改善。基于珠的系统的益处在于囊泡的捕获生物分子或结合剂与不同的微球单独偶联提供了复用的能力。例如，根据图2C所描述，5种不同的待检测的(通过针对抗原的抗体进行检测，例如CD63，CD9，CD81，B7H3和EpCam)生物标志物与20种生物标志物(针对该标志物来捕获囊泡(使用捕获抗体，例如针对CD9、PSCA、TNFR、CD63、B7H3、MFG-E8、EpCam、Rab、CD81、STEAP、PCSA、PSMA、5T4和/或CD24的抗体)的组合可以得到大约100种待检测的组合。根据图2C中作为“EpCam2×”、“CD632×”所示出的，针对单一靶标的多种抗体可用于探测针对各种表位的检测。在另一个实例中，多重分析包括使用针对CD24的结合剂捕获囊泡并且使用针对CD9、CD63和/或CD81的结合剂检测所捕获的囊泡。可使用检测剂(诸如抗体)检测所捕获的囊泡。根据本文所述，所述的检测试剂可以直接或间接标记。
可以对至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、50、75或100种不同的生物标志物进行复用。例如，可以使用多种差异标记的颗粒来进行异质囊泡群体的分析。可以有至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50、75或100种差异标记的颗粒。所述的颗粒可以外部标记(例如使用标签)，或者它们可以内在地标记。各差异标记的颗粒可以与囊泡的捕获剂偶联，例如结合剂，从而捕获囊泡。可选择多种捕获剂以表征目标表型，其包括针对一般囊泡生物标志物、细胞源特异性生物标志物和疾病生物标志物的捕获剂。随后可通过多种结合剂检测所捕获囊泡的一种或多种生物标志物。可对所述结合剂进行直接标记以辅助检测。或者，可通过第二试剂标记所述结合剂。例如，所述结合剂可以是针对所述囊泡上的生物标志物的抗体。所述结合剂与生物素连接。第二试剂包含与报告物连接的抗生蛋白链菌素，并且可被加入以检测所述生物标志物。在一些实施方案中，可以针对至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、50、75或100种不同的生物标志物来分析所捕获的囊泡。例如，多种检测剂(即，捕获的囊泡或囊泡群体的多种生物标志物的检测)可以增加所得的信号，允许提高的灵敏度、特异性或者这二者，并且使用较少量的样品。例如，与使用较少数量检测标志物(如单一标志物)相比，使用超过一种一般囊泡标志物进行的检测可改善所述信号。为进行说明，使用针对CD9、CD63和/或CD81中的两种或三种的标记的结合剂检测囊泡与单独使用所述四跨膜蛋白中的任意一种进行的检测相比可以改善所述信号。
基于免疫分析的方法或夹心分析也可用于检测囊泡的生物标志物。一个实例包括ELISA。结合剂或捕获剂可与孔结合。例如，针对囊泡抗原的抗体可与孔连接。可根据本文描述的方法检测所捕获的囊泡上的生物标志物。图2A示出了夹心型免疫分析的说明性示意图。捕获抗体可以针对目标囊泡抗原，如一般囊泡生物标志物、细胞源标志物或疾病标志物。在该图中，使用针对目标囊泡抗原的荧光标记抗体检测所捕获的囊泡。可使用多种捕获抗体，如，在阵列上的可区分地址或免疫分析板的不同孔中使用。所述检测抗体可以针对所述捕获抗体相同的抗原，或可针对其它标志物。所述捕获抗体可以由替代的结合剂取代，诸如系留的适体或凝集素，和/或所述检测抗体可以被类似地取代，例如，被可检测的(如，标记的)适体、凝集素或其它结合蛋白质或实体取代。在一个实施方案中，针对一般囊泡生物标志物、细胞源标志物和/或疾病标志物的一种或多种捕获剂可与针对一般囊泡生物标志物(诸如四跨膜蛋白，包括但不限于CD9、CD63和CD81中的一种或多种)的检测剂一起使用。
图2D示出了根据本发明的方法分析囊泡的说明性示意图。捕获剂用于捕获囊泡，检测剂用于检测所捕获的囊泡，并且所述捕获和检测抗体的水平或存在用于表征表型。捕获剂、检测剂和表征表型可以是本文所述的任意一种。例如，捕获剂包括系留于基底上的抗体或适体，其识别目标囊泡抗原，检测剂包括针对目标囊泡抗原的标记抗体或适体，并且表征表型包括对疾病的诊断、预后或治疗诊断。在图2D i)中示出的示意图中，使用针对一般囊泡生物标志物的一种或多种捕获剂捕获囊泡群体(6300)。随后使用针对细胞源生物标志物的检测剂(6301)和/或针对疾病特异性生物标志物的检测剂(6302)标记所捕获的囊泡。如果仅使用细胞源检测剂(6301)，用于表征所述表型(6303)的生物印记可包括所述一般囊泡标志物(6300)和所述细胞源生物标志物(6301)。如果仅使用疾病检测剂(6302)，用于表征所述表型(6303)的生物印记可包括所述一般囊泡标志物(6300)和所述疾病生物标志物(6302)。或者，使用检测剂检测细胞源生物标志物(6301)和疾病特异性生物标志物(6302)。在这种情况下，用于表征所述表型(6403)的生物印记可包括所述一般囊泡标志物(6300)、所述细胞源生物标志物(6301)和所述疾病生物标志物(6302)。所述生物标志物组合经选择以表征目标表型并且可选自本文所述的生物标志物和表型。
在图2D ii)中示出的示意图中，使用针对细胞源生物标志物(6310)和/或疾病生物标志物(6311)的一种或多种捕获剂捕获囊泡群体。随后使用针对一般囊泡生物标志物的检测剂(6312)检测所捕获的囊泡。如果仅使用了细胞源捕获剂(6310)，用于表征所述表型的生物印记(6313)可包括所述细胞源生物标志物(6310)和所述一般囊泡标志物(6312)。如果仅使用了疾病生物标志物捕获剂(6311)，用于表征所述表型的生物印记(6313)可包括所述疾病生物标志物(6311)和所述一般囊泡生物标志物(6312)。或者，针对一种或多种细胞源生物标志物(6310)和一种或多种疾病特异性生物标志物(6311)的捕获剂被用于捕获囊泡。在该情况下，用于表征所述表型的生物印记(6313)可包括所述细胞源生物标志物(6310)、所述疾病生物标志物(6311)和所述一般囊泡标志物(6313)。所述生物标志物组合经选择以表征目标表型并且可选自本文所述的生物标志物和表型。
可分析包含生物标志物的囊泡有效负载以表征表型。有效负载包含生物实体，其包含在囊泡膜内。这些实体包括但不限于核酸(如mRNA、微RNA或DNA片段)；蛋白质(如可溶蛋白和膜相关蛋白)；碳水化合物；脂质；代谢物；以及各种小分子，如激素。所述有效负载可以是细胞环境的一部分，其在囊泡形成于所述细胞环境时被包封。在本发明的一些实施方案中，除检测囊泡表面抗原之外还分析了所述有效负载。可根据上文所述捕获特定的囊泡群体，随后所捕获的囊泡中的有效负载可用于表征表型。例如，可进一步分离在基底上捕获的囊泡以评估其中的有效负载。或者，对样品中的囊泡进行检测和分选而不捕获。可进一步分离用该方式检测的囊泡以评估其中的有效负载。在一个实施方案中，通过流式细胞法分选囊泡群体并且分析了所分选的囊泡中的有效负载。在图2E iii)中示出的示意图中，使用一种或多种细胞源生物标志物(6320)、疾病生物标志物(6321)和一般囊泡标志物(6322)捕获和/或检测囊泡群体(6320)。还可以使用一种或多种血管生成或免疫调节生物标志物来检测囊泡。评估了分离的囊泡的有效负载(6323)。在所述有效负载中检测的生物印记可用于表征表型(6324)。在一个非限制性实例中，可使用针对一种或多种目标囊泡抗原的抗体在来自患者的血浆样品中分析囊泡群体。所述抗体可以是系留于基底上以分离所需囊泡群体的捕获抗体。或者，所述抗体可以直接标记并且通过使用流式细胞法进行分选对所标记的囊泡进行分离。从所述被分离的囊泡群体中提取的微RNA或mRNA的存在或水平可用于检测生物印记。所述生物印记随后用于诊断、预后或治疗诊断所述患者。
在其它实施方案中，在未首先捕获或检测囊泡亚群的情况下在囊泡群体中分析囊泡有效负载。例如，根据本文所述，通常可使用离心、过滤、色谱或其它技术从样品中分离囊泡。此后可分析所分离的囊泡的有效负载以检测生物印记并且表征表型。在图2E iv)中示出的示意图中，分离了囊泡群体(6330)并且评估了所分离的囊泡的有效负载(6331)。在所述有效负载中检测的生物印记可用于表征表型(6332)。在非限制性实例中，使用尺寸排阻和膜过滤从来自患者的血浆样品中分离囊泡群体。从所述囊泡群体中提取的微RNA或mRNA的存在或水平用于检测生物印记。所述生物印记随后用于诊断、预后或治疗诊断所述患者。
表征表型的方法可以使用技术的组合来评价目标样品中的囊泡群体。在一个实施方案中，将样品分成各个等份试样，并且单独地分析各等份试样。例如，测定一个或多个等份试样的蛋白质含量，并且测定一个或多个其他等份试样的微RNA含量。可以结合蛋白质含量和微RNA含量来表征表型。在另一个实施方案中，分离目标囊泡，并且评估其中的有效负载。例如，可以使用目标表面标志物的结合剂，通过亲和性分离(如，流式细胞免疫沉淀，或其他免疫捕获技术)来分离具有给定表面标志物的囊泡群体。然后可以针对生物标志物来评价分离的囊泡，如表面含量或有效负载。具有给定表面标志物的囊泡的生物标志物特征可以用于表征表型。作为非限制性实例，PCSA+捕获剂可以用于分离前列腺特异性囊泡群体。可以从PCSA+囊泡评价表面抗原的水平，所述抗原如PCSA自身、PSMA、B7H3或EpCam。还可以评价PCSA+中的有效负载的水平，例如，微RNA或mRNA含量。可以从PCSA+囊泡群体中标志物的组合构建生物印记。
可以通过质谱或流式细胞法来分析肽或蛋白质生物标志物。可以根据本领域众所周知的程序通过免疫细胞化学染色、Western印迹、电泳、SDS-PAGE、色谱、x射线晶体学或其它蛋白质分析技术进行囊泡的蛋白质组分析。在其它实施方案中，可以使用Chromy等，J Proteome Res，2004；3：：1120-1127(其全文以引用方式并入本文)中所述的2D差异凝胶电泳或者使用Zhang等，Mol Cell Proteomics，2005；4：144-155(其全文以引用方式并入本文)中所述的液相色谱质谱来分析囊泡的蛋白质生物印记。囊泡可以进行基于活性的蛋白质分型，其描述于，例如，Berger等，Am J Pharmacogenomics，2004；4：371-381中，其全文以引用方式并入本文。在其它实施方案中，囊泡可以使用Pisitkun等，Proc NatlAcad Sci USA，2004；101：13368-13373中所述的纳米喷雾液相色谱-串联质谱来分型，其全文以引用方式并入本文。在另一个实施方案中，囊泡使用串联质谱(MS)(例如液相色谱/MS/MS(LC-MS/MS)分型，其使用，例如，LTQ和LTQ-FT离子阱质谱仪。可以按照Smalley等，J Proteome Res，2008；7：2088-2096所述比较谱计数来确定蛋白质的身份并评估相对的量，其全文以引用方式并入本文。
还可以鉴定循环蛋白质生物标志物的表达或囊泡内的蛋白质有效负载。后一分析可任选地在使用针对目标捕获群体的捕获剂进行的特定囊泡的分离之后进行。在一个实施方案中，使用免疫细胞化学染色以分析蛋白质表达。所述样品可以重悬浮于缓冲液中，使用细胞离心法在粘性玻片上在100×g下离心(例如)3分钟，以准备用于免疫细胞化学染色。可以将细胞离心涂片空气干燥过夜，并储存在-80C下直至进行染色。然后使用无血清封闭试剂固定并封闭玻片。之后，将所述的玻片与特定抗体一起孵育，从而检测目标蛋白质的表达。在一些实施方案中，所述的囊泡在进行蛋白质表达分析之前未经纯化、分离或浓缩。
包含生物印记的囊泡有效负载可以通过分析所述囊泡中的代谢物标志物或代谢物来鉴定。已经描述了各种代谢物定向的方法，例如代谢物靶分析、代谢物分型或者代谢物指纹，例如参见Denkert等，MolecularCancer2008；7：4598-4617、Ellis等，Analyst2006；8：875-885、Kuhn等，Clinical Cancer Research2007；24：7401-7406、Fiehn O.，Comp FunctGenomics2001；2：155-168、Fancy等，Rapid Commun Mass Spectrom20(15)：2271-80(2006)、Lindon等，Pharm Res，23(6)：1075-88(2006)、Holmes等，Anal Chem.2007年4月1日；79(7)：2629-40.2007年2月27日电子出版，Erratum in：Anal Chem.2008年8月1日；80(15)：6142-3、Stanley等，Anal Biochem.2005年8月15日；343(2)：195-202.，
Figure BPA0000184824780001981
等，J Biol Chem.2003年11月14日；278(46)：45915-23，各文献全文以引用方式并入本文。
可以通过Jain Kk：Integrative Omics，Pharmacoproteomics，andHuman Body Fluids.In：ThongboonkerdV编辑Proteomics orHuman BodyFluids：Principles，Methods and Applications.Volume1：Totowa，N.J.：HumanaPress，2007中所述的系统来分析肽，其全文以引用方式并入本文。该系统可以生成在体液以及囊泡中存在的蛋白质的灵敏分子指纹。商业应用(包括色谱/质谱以及人体中所有的稳定代谢物的基准文库的使用，例如Paradigm Genetic’s Human Metabolome Project)可以用于确定代谢物生物印记。用于分析代谢谱的其它方法可以包括在美国专利No.6,683,455(Metabometrix)、美国专利申请公开号No.20070003965和20070004044(Biocrates LifeScience)中所述的方法和装置，各文献全文以引用方式并入本文。其它蛋白质组分型技术在Kennedy，Toxicol Lett120：：379-384(2001)、Berven等，Curr Pharm Biotechnol7(3)：147-58(2006)、Conrads等，Expert Rev Proteomics2(5)：693-703、Decramer等，World J Urol25(5)：457-65(2007)、Decramer等，Mol Cell Proteomics7(10)：1850-62(2008)、Decramer等，Contrib Nephrol，160：127-41(2008)、Diamandis，J Proteome Res5(9)：2079-82(2006)、Immler等，Proteomics6(10)：2947-58(2006)、Khan等，J Proteome Res5(10)：2824-38(2006)、Kumar等，Biomarkers11(5)：385-405(2006)、Noble等，Breast Cancer ResTreat104(2)：：191-6(2007)、Omenn，Dis Markers20(3)：131-4(2004)、Powell等，Expert Rev Proteomics3(1)：63-74(2006)、Rai等，Arch PatholLab Med126(12)：1518-26(2002)、Ramstrom等，Proteomics，3(2)：184-90(2003)、Tammen等，Breast Cancer Res Treat，79(1)：83-93(2003)、Theodorescu等，Lancet Oncol，7(3)：230-40(2006)或Zurbig等，Electrophoresis，27(11)：2111-25(2006)中有所描述。
对于mRNA、miRNA或其它小RNA的分析而言，可以使用用于分离核酸的任何其它已知的方法分离总RNA，例如在美国专利申请公开号No.2008132694中所述的方法，其全文以引用方式并入本文。所述的方法包括但不限于用于实施基于膜的RNA纯化的试剂盒，该试剂盒是市售可得的。通常，试剂盒可以用于由细胞和组织进行小规模RNA制备(30mg或更少)，用于由细胞和组织进行中等规模RNA制备(250mg组织)，以及用于由细胞和组织进行大规模RNA制备(最多1g)。用于有效地分离包含小RNA的总RNA的其它市售可得的试剂盒也是可得的。这些方法可用于从囊泡中分离核酸。
或者，可以使用美国专利No.7,267,950中所述的方法来分离RNA，其全文以引用方式并入本文。美国专利No.7,267,950描述了由生物系统(细胞、细胞片段、细胞器、组织、器官或生物体)中提取RNA的方法，其中将包含RNA的溶液与RNA可以结合的基底相接触，并通过施加负压而由所述的基底上回收RNA。或者，可以使用在美国专利申请No.20050059024(其描述了小RNA分子的分离)中所述的方法来分离RNA，其全文以引用方式并入本文。其它方法在美国专利申请No.20050208510、20050277121、20070238118中有所描述，其各自均以引用方式全文并入本文。
在一个实施方案中，可以在由样品分离的囊泡的mRNA上进行mRNA表达分析。在一些实施方案中，所述的囊泡为细胞源特异性的囊泡。由囊泡所产生的表达模式可以指示给定的疾病状态、疾病阶段、治疗相关性印记或生理状况。
在一个实施方案中，一旦分离得到总RNA，则可以合成cDNA，并根据制造商的方案来进行针对特定mRNA靶的qRT-PCR分析(例如Applied Biosystem’s
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分析)，或者进行表达微阵列以在一个实验中观察高度复用的表达标志物集。用于建立基因表达谱的方法包括测定由基因(其可以编码蛋白质或肽)所产生的RNA的量。这可以通过定量逆转录酶PCR(qRT-PCR)、竞争性RT-PCR、实时RT-PCR、差示RT-PCR、Northern印迹分析或其它相关测试来完成。虽然可以使用单独的PCR反应来实施所述的这些技术，但是还可以扩增由mRNA产生的互补DNA(cDNA)或互补RNA(cRNA)，并通过微阵列对其进行分析。
可以使用适用于检测生物样品中mRNA表达水平的任何适当的技术(包括但不限于Northern印记分析、RT-PCR、qRT-PCR、原位杂交或微阵列分析)来测量样品中miRNA产物的水平。例如，通过使用基因特异性的引物和靶cDNA，qRT-PCR实现了对少量的靶miRNA进行的灵敏且定量的miRNA测量(通过单重或多重分析)，或者可以使平台适应于过使用96孔或384孔平板形式实施高通量的测量。例如参见Ross JS等，Oncologist.2008May；13(5)：477-93，其全文以引用方式并入本文。大量不同的阵列构型以及用于产生微阵列的方法是本领域的技术人员已知的，并且描述于美国专利中，诸如：美国专利No.5,445,934；5,532,128；5,556,752；5,242,974；5,384,261；5,405,783；5,412,087；5,424,186；5,429,807；5,436,327；5,472,672；5,527,681；5,529,756；5,545,531；5,554,501；5,561,071；5,571,639；5,593,839；5,599,695；5,624,711；5,658,734或5,700,637，其各自以引用方式全文并入本文。miRNA分型的其它方法在Taylor等，Gynecol Oncol.2008年7月；110(1)：13-21、Gilad等，PLoS ONE.2008年9月5日；3(9)：e3148、Lee等，Annu Rev Pathol.2008年9月25日以及Mitchell等，Proc Natl Acad Sci U S A.20087月29日；105(30)：10513-8、Shen R等，BMC Genomics.2004年12月14日；5(1)：94、Mina L等，Breast Cancer Res Treat.2007年6月；103(2)：197-208、Zhang L等，Proc Natl Acad Sci U S A.2008年5月13日；105(19)：7004-9、Ross JS等，Oncologist.2008年5月；13(5)：477-93、Schetter AJ等，JAMA.2008年1月30日；299(4)：：425-36、Staudt LM，NEngl J Med2003；348：1777-85、Mulligan G等，Blood2007年4月15日；109(8)：3177-88.2006年12月21日电子出版、McLendon R等，Nature.2008年10月23日；455(7216)：1061-8，以及美国专利No.5,538,848、5,723,591、5,876,930、6,030,787、6,258,569和5,804,375中有所描述，各文献全文以引用方式并入本文。在一些实施方案中，微RNA组阵列用于同步探询多种miR的表达。Exiqon mIRCURY LNA微RNA PCR系统组(Exiqon，Inc.，Woburn，MA)或来自Applied Biosystem的
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微RNA分析和分析系统(Foster City，CA)可用于这些目的。
微阵列技术允许同时测量数千个转录物或miRNA的稳态mRNA或miRNA水平，由此提供了用于鉴定效果(例如对非受控细胞增殖的发作、阻断或调控)的有力工具。可以使用诸如cDNA阵列和寡核苷酸阵列的双微阵列技术。这些分析的结果通常为由标记探针接收的信号强度的量度，其中所述标记探针用于检测来自样品的cDNA序列，该序列与所述微阵列上已知位置的核酸序列杂交。所述信号的强度通常与cDNA的量成比例，因此与在所述样品细胞中表达的mRNA或miRNA的量成比例。大量的此类技术是可得和可用的。用于测定基因表达的方法可见于Linsley等的美国专利No.6,271,002、Friend等的美国专利No.6,218,122、Peck等的美国专利No.6,218,114或者Wang等的美国专利No.6,004,755，其各自全文以引用方式并入本文。
可以通过对比这些强度来进行表达水平的分析。这可以通过生成测试样品中基因的表达强度与对照样品中基因的表达强度的比例矩阵来进行。所述的对照样品可以用作参照，并且可以使用考虑年龄、种族和性别的不同参照。不同的参照可以用于不同的状况或疾病、以及疾病或状况的不同阶段以及用于确定疗效。
例如，源自疾病组织的mRNA或miRNA(包括分离自患病组织的mRNA或miRNA)的基因表达强度可以与相同类型正常组织中的相同实体的表达强度作对比(例如患病乳腺组织样品对正常乳腺组织样品)。这些表达强度的比例指示了在所述测试样品与对照样品之间基因表达的倍数变化。或者，如果正常情况下囊泡并不存在于正常组织(例如乳腺)中，则如本领域已知的，可以使用绝对定量方法来定义所存在的miRNA分子的数量而无需由源自正常组织的囊泡分离的miRNA或mRNA。
此外，还可以以多种方式展示基因表达谱。常用的方法是将原始荧光强度或比例矩阵排列于树枝形图中，其中竖列表示测试样品和横行表示基因。对数据进行排列以使具有相似表达谱的基因彼此相邻。以颜色显示各基因的表达比例。例如，比例低于1(表示下调)可以显示为光谱的蓝色部分，而比例大于1(表示上调)可以显示为光谱的红色部分的颜色。市售可得的计算机软件程序可以用于展示这些数据。
被认为是差异表达的mRNA或miRNA在患病患者中相对于无疾病个体可以是过表达或表达不足的。过表达或表达不足是相对的术语，是指发现mRNA或miRNA的表达量相对于某些基线具有可检测的差异(在用于测量的系统中高出噪声影响的部分)。在这种情况下，所述的基线为非疾病个体的测量mRNA/miRNA表达。患病细胞中的目标mRNA/miRNA相对于使用相同的测量方法得到的基线水平则是过表达或表达不足的。就这一方面而言，患病的是指身体状态的改变，这种改变会在发生细胞未受控的增殖的同时打断或干扰身体功能的正确执行，或者具有干扰肌体功能正确执行的潜在可能。当个体的基因型或表型的某些方面与疾病的发生相一致时，其被诊断为患有这种疾病。然而，进行诊断或预后的活动包括对疾病/状态问题的确定，诸如确定复发或转移的可能性以及进行治疗监测。在治疗监测中，通过对比一段时间内基因的表达来确定mRNA/miRNA的表达说是否已经变为或者是否正在变为与正常组织更加一致的模式，从而对给定的疗程的效果作出临床判断。
根据杂交微阵列探针的强度测量值的倍数变化来区分过表达和表达不足的水平。为进行该区分2×差异是优选的，或者小于0.05的p值。即，在mRNA/miRNA在疾病/复发对正常/非复发细胞中差异表达之前，疾病细胞被发现产生了高出或低于所述正常细胞至少2倍的强度。倍数差异越大，所述基因作为诊断或预后的工具的应用则越优选。针对本发明的表达谱所选的mRNA/miRNA具有的表达水平通过超出了使用临床试验仪器的背景信号的量产生了与正常或非调控基因的信号可区分的信号。
统计数值可以用于可信地将调控的mRNA/miRNA与非调控的mRNA/miRNA和噪声加以区分。统计学测试发现在多种样品组之间mRNA/miRNA具有最显著的差异。Student′s t检验为稳定的统计检验的实例，其可以用于发现两组之间的显著差异。p值越低，基因在不同组之间显示出差异的证据则越可信。尽管如此，由于微阵列一次测量了多于一种的mRNA/miRNA，同时可以实施数万次统计学检验。鉴于此，很少可能偶然地观察到小的p值，并可以使用Sidak校正以及随机/轮排实验作出针对这一情况的调整。根据t-检验的小于0.05的p值为基因具有显著差异的证据。更可信的证据为在包括Sidak校正的因素后p值小于0.05。对于各组中的大量样本而言，在随机/轮排检验之后p值小于0.05是具有显著性差异的最可信证据。
在一个实施方案中，可以通过由统计显著数量的患者得到循环生物标志物表达数据；对所述的数据进行线性判别分析从而得到所选的生物标志物；并将加权的表达水平应用于具有判别函数因子的所选生物标志物以得到可以用作后验概率得分的预测模型，由此形成能够进行诊断、预后、治疗相关的或者生理状态特异性的生物印记得分的后验概率得分的方法。此外，其它分析工具也可以用于解答相同的问题，例如逻辑回归和神经网络方法。
例如，以下说明可以用于线性判别分析：
其中
I(psid)＝括号内所包括的探针集以2为底的强度的对数。d(cp)＝疾病阳性类的判别函数。d(CN)＝疾病阴性类的判别函数。
P(CP)＝疾病阳性类的后验p值。
P(CN)＝疾病阴性类的后验p值。
模式识别的多种其它众所周知的方法是可用的。以下参考文献提供了一些实例：加权表决：Golub等(1999)；支持向量机：Su等(2001)；以及Ramaswamy等(2001)；k紧邻算法：Ramaswamy(2001)；以及相关系数：var′tVeer等(2002)，所有文献全文均以引用方式并入本文。
可以建立下文进一步描述的生物印记集合，使得所述集合中的生物标志物的组合相对于单独的生物标志物或生物标志物的随机选择的组合而言具有改善的灵敏度和特异性。在一个实施方案中，可以以倍数差异反映生物印记集合的灵敏度，例如通过在疾病状态中相对于正常状态的转录物表达所表现的。特异性可反映于对转录物表达的信号与目标状况之间的相关性进行的统计学测量中。例如，标准差异可以用作这种度量。在考虑将一组生物标志物包含在生物印记集合中，表达测量中的小标准差异与较高的特异性相关。此外，变异的其它测量(例如相关系数)也可以用于这种能力。
可以用于选择mRNA/miRNA的另一个参数为绝对信号差异的测量值的使用，其中所述的mRNA/miRNA会产生高于非调控mRNA/miRNA或噪声的信号。由调控的mRNA/miRNA表达物所产生的信号与正常的或非调控基因(在绝对值基础上)所产生的信号具有至少20％的差异。更优选的是，这种mRNA/miRNA会产生与正常的或非调控的mRNA/miRNA具有至少30％的差异的表达谱。
此外，还可以通过由生物样品进行扩增来检测和测量miRNA，并且可以使用在美国专利No.7,250,496，美国申请公开号No.20070292878，20070042380或20050222399及其中所引用的参考文献中所述的方法来测量miRNA，其各自以引用方式全文并入本文。可如2011年2月15日授权的题为“METHODS FOR AS SES SING RNA PATTERNS”的美国专利No.7,888,035评估微RNA，该申请全文以引用的方式并入本文。
可以使用本领域技术人员已知的各种技术将微RNA水平标准化。例如，可以使用2-△△CT方法(Applied Biosystems User Bulletin N°2)进行miRNA表达的相对定量。还可以将微RNA的水平相对于管家核酸标准化，如管家mRNA、微RNA或snoRNA。可以与本发明一起使用的用于标准化miRNA水平的更多方法进一步描述于Vasilescu，MicroRNAfingerprints identifymiR-150as a plasma prognostic marker in patients withsepsis.PLoS One.2009年10月12日；4(10)：e7405；以及Peltier和Latham，Normalization of microRNA expression levels in quantitativeRT-PCR assays：identification of suitable reference RNA targets in normaland cancerous human solid tissues.RNA.2008年5月；14(5)：844-52.Epub2008年3月28日；将每篇参考文献全部按引用并入本文中。
可以在生物印记分析中使用肽核酸(PNA)，其为合成核酸类似物的新种类，其中磷酸-糖多核苷酸主链被柔性的假肽聚合物取代。PNA能够以高亲和性和特异性杂交于互补RNA和DNA序列并且对于核酸酶与蛋白酶的降解具有高度抗性。肽核酸(PNA)是引人注目的探针新种类，其具有对人类染色体进行快速原位鉴定以及检测拷贝数变异(CNV)的细胞遗传学的应用。多色肽核酸-荧光原位杂交(PNA-FISH)方案已经描述用于鉴定几种人CNV相关的失调和感染性疾病。PNA还可以作为分子诊断的工具用于以肿瘤靶向的放射性核素-PNA-肽嵌合体非侵入性地测量致癌性mRNA。使用PNA的方法在Pellestor F等，Curr Pharm Des.2008；14(24)：2439-44、Tian X等，Ann N Y Acad Sci.2005年11月；1059：106-44、Paulasova P与Pellestor F，A nnales de Génétique，47(2004)349-358、Stender H.Expert Rev Mol Diagn.2003年9月；3(5)：649-55.综述、Vigneault等，Nature Methods，5例，777-779(2008)中有进一步的描述，各参考文献均全文以引用方式并入本文。这些方法可以用于筛选从囊泡分离得到的遗传物质。当对细胞源特异性的囊泡应用这些技术时，它们可以用于鉴定与细胞源直接相关的给定分子信号。
可以对mRNA和DNA(包括由囊泡鉴定的那些)进行突变分析。对于RNA来源的靶或生物标志物的突变分析而言，所述的RNA(mRNA、miRNA或其它RNA)可以被逆转录成为cDNA并随后进行测序或分析，诸如针对已知的SNP(例如通过Taqman SNP分析)或单核苷酸突变进行测序和测定，以及使用测序来观察插入或删除从而确定在所述细胞源中存在的突变。多重连接依赖性的探针扩增(MLPA)可以替代地用于在小的特定目标区域中鉴定CNV的目的。例如，一旦由分离的结肠癌特异性囊泡得到总RNA，则可以合成cDNA，并且KRAS基因的外显子2和3的特异性引物可以用于扩增包含KRAS基因的密码子12、13和61的这两个外显子。用于PCR扩增的相同引物可以在ABI3730上用于BigDye Terminator序列分析，从而鉴定KRAS的外显子2和3中的突变。已知这些密码子中的突变赋予对药物如西妥昔单抗和帕尼单抗的抗性。实施突变分析的方法在Maheswaran S等，2008年7月2日(10.1056/NEJMoa0800668)和Orita，M等，PNAS1989，(86)：2766-70中有所描述，各文献均全文以引用方式并入本文。
实施突变分析的其它方法包括miRNA测序。鉴定和miRNA分型的应用可以通过克隆技术、以及使用毛细管DNA测序或“下一代”测序技术来实施。当前可用的新型测序技术允许鉴定低丰度miRNA或者在样品之间表现中度表达差异的miRNA，其可能不为基于杂交的方法所检出。这些新的测序技术包括在Nakano等2006，Nucleic Acids Res.2006；34：D731-D735.doi：10.1093/nar/gkj077中所述的大规模平行签名测序(MPSS)方法、Margulies等2005，Nature.2005；437：376-380中所述的Roche/454平台或着Berezikov等Nat.Genet.2006b；38：1375-1377中所述的Illumina测序平台，各文献均全文以引用方式并入本文。
用于确定生物印记的其它方法包括通过等位基因特异性PCR(其包括特异性的引物以用于同时扩增和区分基因的两个等位基因)、单链构象多态性(SSCP)(其涉及基于序列中的微小差异对单链核苷酸进行电泳分离)以及DNA和RNA适体来测定生物印记。DNA和RNA适体为短的寡核苷酸序列，该序列可以根据其以高度的亲和性结合特定分子的能力由随机库中选择。使用适体的方法在Ulrich H等，Comb Chem HighThroughput Screen.2006年9月；9(8)：619-32、Ferreira CS等，Anal BioanalVhem.2008年2月；390(4)：1039-50、Ferreira CS等，Tumour Biol.2006；27(6)：289-301中有所描述，各文献均全文以引用方式并入本文。
还可以使用荧光原位杂交(FISH)技术来检测生物标志物。使用FISH来检测和定位特定DNA序列、在组织样品中定位特定mRNA或者鉴定染色体异常的方法在Shaffer DR等，Clin Cancer Res.2007年4月1日；13(7)：2023-9、Cappuzo F等，Journal of Thoracic Oncology，第2卷，第5期2007年5月，Moroni M等，Lancet Oncol.2005年5月；6(5)：279-86中有所描述，各文献均全文以引用方式并入本文。
在图2E中给出了针对其有效负载分析囊泡群体的说明性示意图。在一个实施方案中，本发明的方法包括表征表型，其通过捕获囊泡(6330)和测定其中所包含的微RNA物质的水平(6331)完成从而表征所述表型(6332)。
包含循环生物标志物或囊泡的生物印记可包含针对其的结合剂。所述的结合剂可以为DNA、RNA、适体、单克隆抗体、多克隆抗体、Fab、Fab′、单链抗体、合成抗体、适体(DNA/RNA)、类肽、zDNA、肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA)、凝集素、合成或天然存在的化学化合物(包括但不限于药物和标记试剂)。
按照上文所述，结合剂可以通过与囊泡的组分相结合而用于分离或检测所述囊泡。所述的结合剂可以用于检测囊泡，例如检测细胞源特异性的囊泡。一种或多种结合剂其自身可形成结合剂谱，其提供了囊泡的生物印记。例如，如果在异质囊泡群体的囊泡差异检测或分离中使用2种、3种、4种或更多种结合剂检测或分离囊泡群体，针对所述囊泡群体的特定结合剂谱提供了所述特定囊泡群体的生物印记。
作为说明性实例，可使用一种或多种结合剂检测用于表征癌症的囊泡，所述结合剂包括但不限于PSA、PSMA、PCSA、PSCA、B7H3、EpCam、TMPRSS2、mAB5D4、XPSM-A9、XPSM-A10、半乳凝集素-3、E-选择蛋白、半乳凝集素-1或E4(IgG2a K)，或它们的任何组合。
所述结合剂还可以是针对一般囊泡生物标志物，诸如“管家蛋白”或抗原。所述生物标志物可以是CD9、CD63或CD81。例如，所述结合剂可以是针对CD9、CD63或CD81的抗体。所述结合剂还可以是针对其它蛋白质，诸如组织特异性或癌症特异性囊泡。所述结合剂可以针对PCSA、PSMA、EpCam、B7H3或STEAP。所述结合剂可以针对DR3、STEAP、epha2、TMEM211、MFG-E8、膜联蛋白V、TF、unc93A、A33、CD24、NGAL、EpCam、MUC17、TROP2或TETS。例如，所述结合剂可以是针对PCSA、PSMA、EpCam、B7H3、DR3、STEAP、epha2、TMEM211、MFG-E8、膜联蛋白V、TF、unc93A、A33、CD24、NGAL、EpCam、MUC17、TROP2或TETS的抗体或适体。
通常，各种不同的蛋白质并非平均或均一地分布于囊泡壳上。囊泡特异性的蛋白质通常更为常见，而癌症特异性的蛋白质是较少见的。在一些实施方案中，囊泡的捕获使用更为常见的癌症特异性较低的蛋白质来完成，诸如一种或多种管家蛋白或抗原或一般囊泡抗原(如四跨膜蛋白)，并且在检测阶段使用一种或多种癌症特异性生物标志物和/或一种或多种细胞源特异性生物标志物。在另一个实施方案中，使用一种或多种癌症特异性生物标志物和/或一种或多种细胞源特异性生物标志物进行捕获，并且使用一种或多种管家蛋白或抗原或一般囊泡抗原(如四跨膜蛋白)进行检测。在实施方案中，对于捕获和检测使用相同的生物标志物。可使用针对相同生物标志物的不同结合剂，诸如结合抗原的不同表位的抗体或适体。
通过本领域已知的任何常规方法或根据本文所述，可鉴定另外的细胞结合伴体或结合剂，并且其可另外用作诊断、预后和治疗相关标志物。例如，可以使用本文中表3、4或5中所列的一种或多种结合剂来检测囊泡。例如，结合剂也可以用于一般囊泡生物标志物，如“管家蛋白”或抗原。一般囊泡生物标志物可以是CD9、CD63或CD81，或表3中的其他生物标志物。结合剂也可以用于其他蛋白质，如用于细胞源特异性或癌症特异性囊泡。作为非限制性实例，在前列腺癌的情况中，结合剂可以用于PCSA、PSMA、EpCam、B7H3、RAGE或STEAP。结合剂可以用于表4-5中的生物标志物。例如，结合剂可以是用于PCSA、PSMA、EpCam、B7H3、RAGE、STEAP或表4-5中的其他生物标志物的抗体或适体。
各种蛋白质可以不是均匀或均一地分布在囊泡表面上。例如，囊泡特异性蛋白质通常更常见，而癌症特异性蛋白质不太常见。在一些实施方案中，使用更常见的、较低癌症特异性的蛋白质，如管家蛋白或抗原，来完成囊泡的捕获，并且将癌症特异性蛋白质用于检测阶段中。根据检测系统的灵敏度，也可以使用相反的方法，其中使用针对一般囊泡标志物的结合剂捕获大的囊泡群体，然后用对目标亚群体特异性的检测剂来检测细胞特异性囊泡。
此外，通过本领域已知的任何常规方法或根据本文所述，可鉴定另外的细胞结合伴体或结合剂，并且其可另外被用作诊断、预后和治疗相关标志物。
微RNA功能性试验
如上所述，微RNA可以发现在体液如微囊泡中包裹的血液中、HDL和LDL颗粒以及核蛋白复合物(RNP)的成分中循环。可以使用可用技术如本文中描述的或本领域已知的来检测微RNA，所述技术包括但不限于RT-qPCR或下一代测序。然而，生物活性状态的微RNA被一种或多种Argonaute(“Ago”)蛋白(例如，Ago1、Ago2、Ago3或Ago4)结合并激活。本发明的一个方面涉及使得能够在单一反应中检测生物样品内靶微RNA的功能活性的组合物和方法。对于Ago蛋白家族的综述，参见，Hock和Meister，Genome Biology，2008，9：210。
更特别地，使用基底、合成RNA分子、标记和RISC(RNA-诱导的沉默复合物)反应缓冲成分以及任选的一种或多种分离的Ago蛋白来评价一种或多种核酸生物标志物(例如，微RNA)。可以用于本发明中的基底的实例包括但不限于平面基底、微珠、柱等，通过直接或间接连接将合成RNA分子的第一片段(例如，3’或5’端)栓系于所述基底上。这样的基底在本文中公开或是本领域已知的。可以使用本领域已知的方法来进行连接，例如，氨基-羧基偶联，如在Wittebolle等，Optimisationof the amino-carboxy coupling of oligonucleotides to beads used in liquidarrays，J Chem Tech Biotech81：476-480(2006)中所述的；这样的技术是本领域普通技术人员容易获知的。
其它的合成RNA分子的另一部分，例如，相对的3’或5’端，直接或间接连接标记或可检测分子。标记是能够检测的任何分子，并且这样的标记或可检测分子是本领域已知的，且包括但不限于：荧光标记、放射性标记或酶标记。这样的标记的其他实例在上文中公开。在基底栓系部分和标记部分之间，合成RNA分子包括与目标靶微RNA互补的片段或部分。按照所需的，互补片段可以优选与靶标微RNA互补，即，100％互补。可以操作互补片段与靶微RNA之间的结合程度，例如，以允许识别一种特定的靶微RNA或允许混杂地识别例如靶微RNA的家族。用于这样操作的方法在本文中公开或是本领域中已知的，例如，碱基对错配，或试验条件，如温度或盐浓度。例如，互补片段可以携带与靶微RNA的错配，例如，使得互补片段与靶微RNA至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％互补。该方法包括将标记和栓系的合成RNA分子与包含或怀疑包含目标靶微RNA的样品接触。如果靶微RNA存在于样品中，并且也结合Ago蛋白，则Ago-微RNA可以通过靶微RNA和互补区域之间的碱基配对与合成RNA分子结合。这样的结合有助于合成RNA分子通过Ago蛋白的内切核苷酸分裂活性切割。该切割将合成RNA分子的标记从基底释放。可以在接触包含靶微RNA的样品之前和之后检测与基底结合的标记的量。任何这样的标记量的差异指示输入样品中Ago-结合靶微RNA的量。
用于该试验的有用反应条件和缓冲剂是本领域已知的。在室温、25℃、30℃、37℃或高达42℃-45℃下进行反应，持续5min至过夜的任何时间，这取决于试验灵敏度和靶丰度。例如，反应可以在37℃下进行1-2h。参见，例如，Brown等，Target accessibility dictates the potencyof human RISC.Nature Structural＆Molecular Biology12，469-470(2005)；Robb等，Specific and potent RNAi in the nucleus of human cells.Nature Structural＆Molecular Biology12，133-137(2005)；Lima等，Binding and Cleavage Specificities of Human Argonaute2.J.Biol.Chem.2009284：26017-26028。
试验的示例性实施方案显示于图26中。如图26A中所示，合成RNA分子含有3’接头/延伸物区域262，中心miRNA靶向区域263和第二5’接头/延伸区域264。将RNA在3’端262上连接于基底，在此为微珠261，并且将5’端264与生物素266偶联。将中心miRNA靶向区域263设计成与目标miRNA序列互补。区域263可以与任何目标微RNA互补。在图26中所示的实例中，抗生蛋白链菌素-PE(藻红蛋白)265用于标记合成RNA的生物素端。如所描述的，可以使用其他标记方案。例如，5’端264可以用Cy3、Cy5或本文中公开的或本领域已知的其他可检测部分直接标记。作为另一个实例，5’端264可以通过与标记的另一个互补寡核苷酸碱基配对来间接标记。如果靶微RNA存在于样品中，并且与样品中的(例如，Ago1-4中的任一种)Ago蛋白267或加入其中的Ago蛋白267(如重组Ago2(rAgo2))结合/相连，靶微RNA将结合互补微RNA靶向区域263，并且随后通过Argonaute的内切核苷酸分裂活性在区域263处切割合成RNA。参见图26中的步骤268。一旦切割，合成RNA分子的标记端(在此为5’端)被释放，由此将生物素/抗生蛋白链菌素-PE复合物265-266与微珠261分离。参见图26B。接着，可以将基底微珠分离并洗涤以除去RNA的切割的和未栓系的末端，由此只留下保留未切割的且仍然标记的材料以及任何切割的但现在未标记的RNA。在该洗涤步骤后，PE信号的差异与初始试验中存在的Ago-结合靶微RNA267的浓度和活性相关。输入样品中Ago-结合的靶微RNA的量决定了切割的RNA的水平。例如，如果靶微RNA不存在，或存在但未以功能性形式结合Ago，则合成RNA靶区域263将保持未切割，而信号强度将不会变化。
可以使用该试验测试任何合适的RNA来源和/或预加载于Argonaute中的RNA。例如，输入样品可以是细胞溶解产物、体液、血液部分(其可以含有循环Argonaute，如结合miRNA的Ago2)、血浆、血清或分离的微囊泡。在一些实施方案中，将从样品免疫沉淀的Argonaute用作用于该试验的RNP复合物的输入来源。如果存在靶微RNA，并且加载于上述任一种来源的Argonaute中，合成的靶263被切割，并释放标记(例如，图26的实例中的生物素-抗生蛋白链菌素-PE265-266)。
图26C-E示意性地说明了可以用作该试验的输入的RNA的各种来源。图26C说明了结合于Ago蛋白269以形成核糖核酸复合物267的微RNA268。Ago蛋白可以是Ago1、Ago2、Ago3或Ago4。图26D说明了使用Ago的结合剂2610免疫沉淀Argonaute-微RNA复合物267。结合剂可以是对于特定Argonaute特异性的，例如，针对Ago2的抗体或适体。在其他实施方案中，结合剂识别超过一种Ago家族成员，例如，Ago1-4。在再其他的实施方案中，结合剂可以间接结合一种或多种Ago蛋白。例如，用于免疫沉淀的结合剂可以是GW182蛋白的抗体或适体，其与Ago蛋白形成复合物。图26E说明了Argonaute-微RNA复合物267的直接分析，例如，从细胞溶解物、体液或溶解的微囊泡。
或者，试验输入可以包括来自结合的样品来源的RNA，其然后接触Ago蛋白，如纯化的Ago，包括重组Ago(rAgo)。以这种方式，可以从任何合适的来源分离RNA，所述来源包括但不限于细胞溶解物、体液、血浆、浓缩血浆、微囊泡或HDL和LDL颗粒。一旦分离，Ago蛋白，例如，重组Argonaute2，可以用于结合样品中存在的小RNA。Ago结合的RNA可以用作试验的输入。
如上所述，将合成RNA分子的第三部分进行标记，并且因此互补片段的切割允许从基底除去标记。因此，从基质除去的标记的量对应于切割事件的数量。将认识到，检测切割事件的可选方法在本发明的范围内。在一个实施方案中，在允许切割反应发生后，将标记加入反应混合物中。按照以上的实例，在切割反应已经进行后，加入抗生蛋白链菌素-PE265。在另一个实例中，合成RNA分子的第三部分没有标记。相反，通过检测切割反应发生后柱子上保留的经切割合成RNA分子的量来观察切割事件。
可以在分裂反应发生之前和之后检测从基底释放的标记水平并且进行比较。或者，可以使用所述的方法观察切割反应的动力学。在一个实施方案中，实时检测从基底释放的标记的水平，由此揭示切割反应的动力学。
使用微RNA功能性试验，实质上可以使用含匹配的miRNA靶向区域的合成RNA筛选任何微RNA。可以使用连接于可区分微珠的多个合成靶标以单重或多重方式来进行该试验。
在一个实施方案中，将miR分析系统用于治疗性RNAi分子递送和作用模式确认。在此，RNAi分子系统性递送或以靶向方式递送至合适的细胞类型、组织或其他解剖学区域。可以分析靶组织以证实递送和证实RNAi治疗作用模式。例如，可以通过由于RNAi治疗剂的激活引起的由mRNA敲除直接驱动的表型结果来检测目标组织处治疗性RNAi分子的存在，或可选地，通过细胞的不相关凋亡或炎性响应来检测。最后，可以使用这种方法建立靶组织处激活的治疗性RNAi剂的IC50。
针对癌症的生物印记
如本文所述，包含循环生物标志物的生物印记可用于表征癌症。本章节给出了可用作生物印记(例如，用于前列腺、GI或卵巢癌症)的部分的生物标志物的非穷尽的列表。在一些实施方案中，所述循环生物标志物与囊泡或囊泡群体关联。例如，与囊泡关联的循环生物标志物可用于捕获和/或检测囊泡或囊泡群体。
应当理解，本文给出的生物标志物可用于其它疾病(如其它增殖性失调和其它细胞或组织起源的癌症)的生物印记中。例如，各种不同细胞类型中的转化可能由于共同事件所导致，如p53或其它肿瘤抑制因子的突变。包含细胞源生物标志物和癌症生物标志物的生物印记可用于进一步评估癌症的特性。转移性癌症的生物标志物可与细胞源生物标志物一起使用以评估转移性癌症。用于本发明的这些生物标志物包括Dawood，Novel biomarkers of metastatic cancer，Exp Rev Mol Diag2010年7月，第10卷，第5章，第581-590页中的那些生物标志物，该出版物全文以引用的方式并入本文。
本发明的生物印记可包含依据参照而为上调的、下调的或无变化的标志物。仅仅出于说明的目的，如果所述参照是正常样品，则在所述受试者的生物印记与所述参照相比无变化的情况下所述生物印记可表明所述受试者是正常的。或者，所述生物印记可包含突变的核酸或氨基酸序列，从而使正常参照和患病样品之间所述生物印记中成分的水平相同。在另一种情况下，所述参照可以是癌症样品，从而在所述受试者的生物印记基本上类似于所述参照的情况下该受试者的生物印记表示癌症。所述受试者的生物印记可同时包含与所述参照相比上调和下调的成分。仅仅出于说明目的，如果所述参照是正常样品，则癌症生物印记可同时包含上调的致癌基因和下调的肿瘤抑制基因。囊泡标志物也可在各种不同环境下差异地表达。例如，与非癌症囊泡相比，四跨膜蛋白可在癌症囊泡中过表达，而与癌症囊泡相比，MFG-E8可在非癌症囊泡中过表达。
治疗诊断
根据本文所公开，公开了用于通过评估一种或多种生物标志物(包括囊泡生物标志物和/或循环生物标志物)表征受试者的表型的方法。所述生物标志物可使用对本文公开的囊泡生物标志物进行多重分析的方法加以评估。表征表型可包括提供对受试者的治疗诊断，诸如确定受试者是否被预测对治疗具有反应或被预测对治疗无反应。对治疗有反应的受试者可命名为响应者，而无反应的受试者可命名为非响应者。根据但不限于状况的一种或多种症状的改善；现有治疗的一种或多种副作用的降低；与此前的或其它的治疗相比较一种或多种症状的改善或改善率的提高；或与未进行治疗或与此前的或其它的治疗相比更长的存活期，可认为罹患所述状况的受试者是所述治疗的响应者。例如，根据有益或所需的治疗后果可认为罹患状况的受试者是所述治疗的响应者，所述治疗后果包括但不限于，一种或多种症状的改善或缓解、疾病程度的降低、疾病状态的稳定化(即，未见恶化)、预防疾病的扩散、疾病进程的延迟或减慢、疾病状态的缓解或减轻以及病程缓解(无论部分或完全)，无论是可检测或非可检测的。治疗还包括与在未接受治疗或接受不同治疗的情况下所预期的存活期相比延长的存活期。
本文公开的系统和方法可用于为有需求的患者选择候选治疗。对疗法的选择可基于囊泡的一种或多种特征，诸如囊泡的生物印记、囊泡量或这两者。囊泡的定型或分型(诸如囊泡生物印记的身份、囊泡量或这两者)可用于为罹患状况的个体鉴定一种或多种候选治疗剂。例如，囊泡分型可用于确定受试者对于特定疗法(诸如在所述受试者罹患癌症的情况下的癌症疗法)是非响应者或响应者。
囊泡分型可用于对受试者提供治疗或预后，并且可根据所述诊断或预后选择疗法。或者，治疗选择可直接基于受试者的囊泡谱。此外，受试者的囊泡谱可用于追踪疾病的演化、用于评估药物效力、使现有治疗适应罹患疾病或状况的受试者或为罹患疾病或状况的受试者选择新的治疗。
受试者对治疗的反应可使用生物标志物进行评估，其包括囊泡、微RNA和其它循环生物标志物。在一个实施方案中，基于进行任何治疗前评估的受试者囊泡谱将所述受试者确定、分类或鉴定为非响应者或响应者。在预治疗期间，可将受试者分类为非响应者或响应者，由此而减少了不必要的治疗选项，并且避免了来自无效疗法的副作用。此外，可将所述受试者鉴定为对于特定治疗的响应者，并且由此囊泡分型可用于通过提供个性化治疗选项而延长受试者的存活期，改善所述受试者的症状或状况或这两者。因此，罹患状况的受试者可具有使用本文公开的一种或多种系统和方法由囊泡和其它循环生物标志物产生的生物印记，并且所述谱可随后用于确定受试者对于所述状况的特定治疗是否可能是非响应者或响应者。根据用于预测所述受试者对于最初设想用于治疗所述受试者状况的治疗是否为非响应者或响应者的生物标志物的使用，可为所述受试者选择设想用于治疗所述受试者的状况的特定治疗，或可选择其它可能更佳的治疗。
在一些实施方案中，罹患状况的受试者正受到治疗剂的治疗。可在治疗前和治疗期间的一个或多个时间点从所述受试者中获取样品。可评估包括来自所述样品的囊泡或其它生物标志物在内的生物印记并将其用于确定所述受试者对于所述药物的反应，诸如根据所述生物印记随时间的变化。如果所述受试者对于所述治疗无反应，例如，所述生物印记并未显示所述患者作出反应，则所述受试者可被分类为对于所述治疗无反应性，或为非响应者。类似地，可检测与恶化的状况相关的一种或多种生物标志物从而使所述生物印记指示患者未对所述治疗产生有利反应。在另一个实施例中，尽管进行了治疗，但与所述状况相关的一种或多种生物标志物保持不变，这显示了所述状况并未改善。因此，根据所述生物印记，可改变或调整对于所述受试者的治疗方案，包括选择不同治疗剂。
或者，可确定所述受试者对于所述治疗有反应，并且可将所述受试者分类为对于所述治疗具有反应性，或为响应者。例如，可检测与所述状况或失调的改善相关的一种或多种生物标志物。在另一实例中，与所述状况相关的一种或多种生物标志物有所变化，因而显示了改善。因此，现有的治疗可以继续。在另一个实施方案中，即使存在改善的迹象，在所述生物印记显示了另一类治疗可能更为有效的情况下可调整或改变现有的治疗。现有的治疗可结合另一治疗剂，可增加当前治疗剂的剂量，或选择不同的候选治疗或治疗剂。用于选择不同候选治疗的标准可取决于设置。在一个实施方案中，所述候选治疗可能已知对于现有治疗成功的受试者是有效的。在另一实施方案中，所述候选治疗可能已知对于具有类似生物印记的其它受试者是有效的。
在一些实施方案中，所述受试者正在受到第二、第三或更多类治疗，诸如癌症治疗。可在进行第二、第三或更多类治疗之前对所述受试者确定本发明的生物印记，以确定受试者对于所述第二、第三或更多类治疗是否为响应者或非响应者。在另一个实施方案中，在进行第二、第三或更多类治疗期间对所述受试者确定生物印记，从而确定受试者对于所述第二、第三或更多类治疗是否有反应。
本文所述的用于评估一种或多种囊泡的方法和系统可用于确定罹患状况的受试者是否对于治疗具有反应性，并且因此可用于选择改善所述状况的一种或多种症状的治疗；减少现有治疗的一种或多种副作用；与此前的或其它的治疗相比较提高一种或多种症状的改善或其改善速度；或与未进行治疗或与此前的或其它的治疗相比延长存活期。因此，本文所述的方法可通过提供个性化的治疗选项而用于延长受试者的存活期，和/或可为受试者减少不必要的治疗选项和不必要的副作用。
所述延长的存活期可以是提高的无疾病进展存活率(PFS)，其指的罹患疾病(如癌症)的个体或群体在开始疗程后保持无疾病进展的机率。其可以指在指定的时间期间后所述群体中疾病可能保持稳定(如，未显示进展迹象)的个体的百分比。无进展存活率是特定治疗有效性的指示。在其它实施方案中，所述延长的存活率是无疾病存活率(DFS)，其指的是罹患癌症的个体或个体组在开始特定治疗后保持无疾病的机率。其可以指在指定的时间期间后所述群体中可能无疾病的个体的百分比。无疾病存活率是特定治疗有效性的指示。可在通过类似的患者群体获得的无疾病存活率的基础上比较两种治疗策略。当描述癌症存活时，无疾病存活率通常与术语总体存活率一起使用。
根据本文所述通过囊泡分型选择的候选治疗可与非囊泡分型选择的治疗相比较，其通过将使用通过囊泡分型(B期)选择的疗法的无进展存活(PFS)与所述受试者刚刚发生进展的时间上最为接近的疗法的PFS(A期)加以比较而进行。在一种设定中，≥1.3的PFSB/PFSA比用于显示所述囊泡分型选择的疗法为受试者提供了益处(例如，参见RobertTempleClinical measurement in drug evaluation.Wu Ningano和G.T.Thicker编著，John Wiley and Sons Ltd.1995；Von Hoff D.D.ClinCan Res.4.：1079，1999；Dhani等，Clin Cancer Res.15：118-123，2009)。
对囊泡分型选择的治疗进行比较的其它方法可通过测定反应率(RECIST)和4个月无进展或死亡的受试者百分比而与非囊泡分型所选择的治疗进行比较。在PFS的数值的情况中使用的术语“约”指的是相对所述数值+/-百分之十(10％)的变动。与非囊泡分型选择的治疗相比，来自囊泡分型选择的治疗的PFS可扩大了至少10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或至少90％。在一些实施方案中，与非囊泡分型选择的治疗相比，来自囊泡分型选择的治疗的PFS可扩大至少100％、150％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％或至少约1000％。在又其它的实施方案中，所述PFS比率(囊泡分型选择的疗法或新治疗的PFS/此前疗法或治疗的PFS)为至少约1.3。在再其它的实施方案中，所述PFS比率至少约为1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9或2.0。在再其它的实施方案中，所述PFS比率至少约为3、4、5、6、7、8、9或10。
类似地，可在确定或未确定根据本发明的生物印记的情况下对其治疗进行选择的受试者中比较所述DFS。与非囊泡分型选择的治疗相比，来自囊泡分型选择的治疗的DFS可扩大至少10％、15％、20％、30％、
40％、50％、60％、70％、80％或至少90％。在一些实施方案中，与非囊泡分型选择的治疗相比，来自囊泡分型选择的治疗的DFS可扩大至少100％、150％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％或至少约1000％。在再其它的实施方案中，所述DFS比率(囊泡分型选择的疗法或新治疗的DFS/此前疗法或治疗的DFS)为至少约1.3。在再其它的实施方案中，所述DFS比率至少约为1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9或2.0。在再其它的实施方案中，所述DFS比率至少约为3、4、5、6、7、8、9或10。
在一些实施方案中，通过微囊泡分型选择的候选治疗并未在受试者中提高所述PFS比率或DFS比率；尽管囊泡分型向受试者提供了益处。例如，在一些实施方案中，无已知的治疗可用于所述受试者。在这些情况下，囊泡分型提供了在当前未鉴定出治疗的情况下鉴定了候选治疗的方法。所述囊泡分型可将PFS、DFS或寿命延长至少1周、2周、3周、4周、1个月、5周、6周、7周、8周、2个月、9周、10周、11周、12周、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、13个月、14个月、15个月、16个月、17个月、18个月、19个月、20个月、21个月、22个月、23个月、24个月或2年。所述囊泡分型可将PFS、DFS或寿命延伸至少21/2年、3年、4年、5年或更长。在一些实施方案中，本发明的方法改善了结果从而使受试者处于缓解中。
可通过其它量度检测治疗的效能。完全反应(CR)包含了所述疾病的完全消失：在检查、扫描或其它测试中未证明疾病。部分反应(PR)指的是在体内存留某些疾病，但是在病灶大小或数量上已经减少了30％或更多。稳定疾病(SD)指的是在病灶大小和数量上保持相对不变的疾病。通常情况下，在大小上低于50％的降低或轻微的提高可被描述为稳定疾病。进行性疾病(PD)指的是在治疗时所述疾病在大小或数量上有所提高。在一些实施方案中，根据本发明的囊泡分型导致了完全反应或部分反应。在一些实施方案中，本发明的方法导致了稳定疾病。在一些实施方案中，本发明能够实现稳定疾病，而非囊泡分型导致了进行性疾病。
根据本发明的生物印记的治疗诊断可针对表型，其包括但不限于本文所列举的那些表型。表征表型包括为受试者确定治疗诊断，诸如预测受试者是否可能对治疗具有反应(“响应者”)或是否对治疗无反应(“非响应者”)。根据本文所使用，将受试者鉴定为对于治疗的“响应者”或对于所述治疗的“非响应者”包含将所述受试者分别鉴定为可能对于所述治疗有反应，或可能对于所述治疗无反应，并且无需确定所述受试者的反应的明确预测。获自受试者的一种或多种囊泡或囊泡群体用于通过评估本文公开的生物标志物(如，表7中列出的生物标志物)而确定受试者对于特定治疗是否为非响应者或响应者。对生物标志物的高或低表达水平的检测或对生物标志物的突变的检测可用于为患有状况的受试者选择候选治疗，诸如药物干预。表7包含说明性状况以及对这些状况的药物干预。该表列出了影响所述干预效力的生物标志物。可使用本发明的方法评估所述生物标志物，如，作为循环生物标志物或与囊泡相关的生物标志物。
表7：针对病症的生物标志物和药物干预的实例
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癌症
囊泡生物印记可用于癌症的治疗诊断中，诸如鉴定罹患癌症的受试者对于特定的癌症治疗是否可能为响应者或非响应者。本方法可用于治疗诊断癌症包括本文所列的那些癌症(如，在上文“表型”部分)。这些癌症包括但不限于肺癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌(包括小细胞癌(燕麦细胞癌)、小细胞/大细胞癌以及混合性小细胞癌)、结肠癌、乳腺癌、前列腺癌、肝癌、胰腺癌、脑癌、肾癌、卵巢癌、胃癌、黑色素瘤、骨癌、胃癌、乳腺癌、胶质细胞瘤、胶质母细胞瘤、肝细胞癌、乳头状癌肾癌、头颈部鳞状细胞癌、白血病、淋巴瘤、骨髓瘤或其它实体肿瘤。
来自罹患癌症的受试者的样品中的循环生物标志物(包括与囊泡相关的标志物)的生物印记可用于为所述受试者选择候选治疗。可根据本文给出的本发明的方法确定所述生物印记。在一些实施方案中，候选治疗包括对所述癌症的护理标准。所述生物印记可用于确定受试者对于特定治疗或护理标准为非反应者或反应者。所述治疗可以是癌症的治疗，诸如放射治疗、手术治疗、化疗或其组合。所述癌症治疗可以是治疗剂诸如抗癌剂或化疗方案。用于本发明的方法的癌症治疗包括但不限于表8中所列出的治疗：
表8：癌症治疗
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根据表8所示，癌症治疗包括各种手术和药物治疗。抗癌剂包括药物，诸如小分子和生物制剂。本发明的方法可用于鉴定包含循环生物标志物的生物印记，其可随后用于治疗诊断目的，诸如监测治疗效力、将受试者分类为对于治疗的反应者或非反应者或选择候选治疗剂。本发明可用于为任意癌症治疗提供治疗诊断，其包括但不限于涉及表8-10中的癌症治疗的治疗诊断。可根据本发明的方法鉴定为候选治疗的癌症疗法包括但不限于表8-10中列出的化疗剂及其任意适当的组合。在一个实施方案中，所述治疗对于特定类型的癌症是特异性的，诸如表8中对于前列腺癌、结肠直肠癌、乳腺癌和肺癌所列出的治疗。在其它的实施方案中，所述治疗对于表现出特定的生物印记的肿瘤是特异性的，而无论其起源，如包含表9-10所列的标志物的生物印记。
本发明提供了监测癌症治疗的方法，其包括随时程(诸如治疗前和治疗后)或随着治疗后的时间鉴定受试者中的一系列生物印记。所述生物印记与参照进行比较以确定所述治疗的效力。在一个实施方案中，所述治疗选自表8-10，诸如放射、手术、化疗、生物疗法、新辅助疗法、辅助疗法或观察等待。所述参照可来自另一个体或个体组或来自相同受试者。例如，具有指示癌症治疗前的生物印记的受试者在成功的治疗后可具有指示健康状态的生物印记。相反，受试者在不成功的治疗后可具有指示癌症的生物印记。所述生物印记可随时间进行比较以确定所述受试者的生物印记是否指示状况的改善、恶化或无变化。如果所述癌症随时间恶化或无变化，则可能需要另外的治疗。例如，可在手术或放疗之外使用激素疗法以治疗更具侵袭性的前列腺癌。以下一种或多种miR可用于监测前列腺癌治疗效力的生物印记中：hsa-miR-1974、hsa-miR-27b、hsa-miR-103、hsa-miR-146a、hsa-miR-22、hsa-miR-382、hsa-miR-23a、hsa-miR-376c、hsa-miR-335、hsa-miR-142-5p、hsa-miR-221、hsa-miR-142-3p、hsa-miR-151-3p、hsa-miR-21、hsa-miR-16。以下出版物中所列的一种或多种miR可用于监测GI道癌症的治疗的生物印记中：Albulescu等，Tissular and可溶性的miRNAsfor diagnostic and therapyimprovement in digestive tract cancers，Exp Rev Mol Diag，11：1，101-120。
在一些实施方案中，本发明提供了鉴定来自受试者的样品中的生物印记以选择候选治疗剂的方法。例如，所述生物印记可表明药物相关靶标发生突变或差异性表达，由此而表明所述受试者对于特定治疗可能有反应或无反应。候选治疗可选自表8-10中确定的抗癌剂或治疗剂类别。在一些实施方案中，根据本方法确定的候选治疗选自至少以下治疗组成的组：5-氟尿嘧啶、阿巴瑞克、阿仑单抗、氨鲁米特、阿那曲唑、天冬酰胺酶、阿司匹林、ATRA、阿扎胞苷、贝伐单抗、蓓萨罗丁、比卡鲁胺、骨化三醇、卡培他滨、卡铂、塞来昔布、西妥昔单抗、化疗、胆骨化醇、顺铂、阿糖胞苷、达沙替尼、柔红霉素、地西他滨、多柔比星、表柔比星、厄洛替尼、依托泊苷、依西美坦、氟他胺、氟维司群体、吉非替尼、吉西他滨、戈那瑞林、戈舍瑞林、羟基脲、伊马替尼、伊立替康、拉帕替尼、来曲唑、亮脯利特、脂质体多柔比星、甲羟孕酮、甲地孕酮、醋酸甲地孕酮、氨甲蝶呤、丝裂霉素、nab-紫杉醇、奥曲肽、奥沙利铂、紫杉醇、帕尼单抗、培门冬酶、培美曲塞、喷司他丁、索拉非尼、舒尼替尼、他莫昔芬、紫杉烷类、替莫唑胺、托瑞米芬、曲妥珠单抗、VBMCP和长春新碱。
与选择候选治疗相类似，本发明还提供了确定到底是否对癌症进行治疗的方法。例如，前列腺癌可以是非侵袭性的疾病，其实质上可能不伤害受试者。伴随雄激素去除(激素降低)的放疗是治疗局部晚期前列腺癌的标准方法。激素疗法的病状包括性无能、潮热和性欲缺乏。此外，诸如前列腺切除术这样的治疗可具有诸如性无能或失禁这样的病状。因此，本发明提供了指示癌症的侵袭性或进展(如分期或等级)的生物印记。非侵袭性癌症或局部化癌症可能无需立即治疗而是可以进行观察，如，对前列腺癌的“观察等待”。而侵袭性或晚期病灶需同时地进行更为积极的治疗方案。
可检测的生物标志物的实例以及可选择或可能加以避免的治疗剂的实例列于表9中。例如，为患有前列腺癌的受试者鉴定生物印记，其中所述生物印记包含雄激素受体(AR)的水平。AR的过表达或过量产生(诸如囊泡中mRNA水平或蛋白质水平的高水平)为提供了所述受试者的候选治疗的确定。这些治疗包括用于治疗所述受试者的药物，诸如比卡鲁胺、氟他胺、亮脯利特或戈舍瑞林。所述受试者因此被确定为对于比卡鲁胺、氟他胺、亮脯利特或戈舍瑞林的反应者。在另一个说明性实例中，在来自罹患NSCLC的受试者的囊泡中检测出高水平的BCRPmRNA、蛋白质或两者。所述受试者因而可被确定为药物顺铂和卡铂的非反应者，或者所述药物被认为在所述受试者中对于治疗NSCLC效力低于其它药物并且不被选择用于治疗所述受试者。可在获自受试者的囊泡中评估下列任意生物标志物，并且所述生物标志物可以为包括但不限于一种或多种核酸、多肽、肽或拟肽物质的形式。在又另一个说明性实例中，KRAS、BRAF、PIK3CA和/或c-kit中的一种或多种的突变可用于选择候选治疗。例如，受试者中KRAS或BRAF的突变可表明西妥昔单抗和/或帕尼单抗可能在治疗所述受试者中较为低效。
表9：生物标志物、谱系和药物的实例
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可检测的生物标志物以及可根据所述生物印记加以选择或可能加以避免的其它治疗剂的实例列于表10中。例如，对于罹患癌症的受试者，在来自受试者的囊泡中检测到ADA的过表达用于将所述受试者分类为对于喷司他丁的响应者，或用于将喷司他丁鉴定为用于治疗所述受试者的药物。在另一个实施方案中，对于罹患癌症的受试者，在来自所述受试者的囊泡中检测到BCRP的过表达用于将所述受试者分类为对于顺铂、卡铂、伊立替康和托泊替康的无响应者，这意味着顺铂、卡铂、伊立替康和托泊替康被鉴定为对于治疗所述受试者非最佳的药物。
表10：生物标志物、药物和抗性的实例
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本发明的实施方案中使用的进一步药物关联与规则可见于2010年2月12日提交的美国专利申请12/658,770；2010年2月11日提交的国际PCT专利申请PCT/US2010/000407；2010年10月27日提交的国际PCT专利申请PCT/US2010/54366；以及2010年12月28日提交的美国临时专利申请61/427,788；全部申请全文以引用的方式并入本文。例如，参见PCT/US2010/54366中的“Table4：Rules Summary for TreatmentS election”。
任意药物关联靶标可以是用于提供治疗诊断的生物印记的一部分。包含可使用治疗剂(诸如小分子和生物制品)进行调节的靶的“可用药靶(druggable target)”是包含在本发明的生物印记中的候选者。药物关联靶标还可包括可导致对治疗的抗性的生物标志物，诸如表9和10中所示出的。所述生物印记可基于基因(如，DNA序列)和/或基因产物(如mRNA或蛋白质)或者所述药物关联靶标。这些核酸和/或多肽可就其存在与否、水平或量、活性、突变、序列、单倍型、重排、拷贝数或其它可测量特征中的可适用特征进行分型。所述基因或基因产物可与囊泡群体相关联，例如，作为囊泡表面标志物或囊泡有效负载。在一个实施方案中，本发明提供了治疗诊断癌症的方法，其包括鉴定生物印记(其包含一种或多种药物关联靶标的存在情况或水平)以及根据所述生物印记选择候选治疗剂。所述药物关联靶标可以是循环生物标志物、囊泡或囊泡相关生物标志物。由于药物关联靶标可能与组织或细胞源无关，因此包含药物关联靶标的生物印记可用于提供对于任意增殖性疾病的治疗诊断，诸如来自各种不同解剖学起源的癌症，包括未知源的癌症，诸如CUPS。
使用本发明的方法评估的药物关联靶标包括但不限于：ABCC1、ABCG2、ACE2、ADA、ADH1C、ADH4、AGT、AR、AREG、ASNS、BCL2、BCRP、BDCA1、βIII微管蛋白、BIRC5、B-RAF、BRCA1、BRCA2、CA2、小窝蛋白、CD20、CD25、CD33、CD52、CDA、CDKN2A、CDKN1A、CDKN1B、CDK2、CDW52、CES2、CK14、CK17、CK5/6、c-KIT、c-Met、c-Myc、COX-2、细胞周期蛋白D1、DCK、DHFR、DNMT1、DNMT3A、DNMT3B、E-钙粘蛋白、ECGF1、EGFR、EML4-ALK融合体、EPHA2、表皮调节素、ER、ERBR2、ERCC1、ERCC3、EREG、ESR1、FIT1、叶酸受体、FOLR1、FOLR2、FSHB、FSHPRH1、FSHR、FYN、GART、GNA11、GNAQ、GNRH1、GNRHR1、GSTP1、HCK、HDAC1、hENT-1、Her2/Neu、HGF、HIF1A、HIG1、HSP90、HSP90AA1、HSPCA、IGF-1R、IGFRBP、IGFRBP3、IGFRBP4、IGFRBP5、IL13RA1、IL2RA、KDR、Ki67、KIT、K-RAS、LCK、LTB、淋巴毒素β受体、LYN、MET、MGMT、MLH1、MMR、MRP1、MS4A1、MSH2、MSH5、Myc、NFKB1、NFKB2、NFKBIA、NRAS、ODC1、OGFR、p16、p21、p27、p53、p95、PARP-1、PDGFC、PDGFR、PDGFRA、PDGFRB、PGP、PGR、PI3K、POLA、POLA1、PPARG、PPARGC1、PR、PTEN、PTGS2、PTPN12、RAF1、RARA、ROS1、R RM1、R R M2、RRM2B、RXRB、RXRG、STK2、SPARC、SRC、SSTR1、SSTR2、SSTR3、SSTR4、SSTR5、存活素、TK1、TLE3、TNF、TOP1、TOP2A、TOP2B、TS、TUBB3、TXN、TXNRD1、TYMS、VDR、VEGF、VEGFA、VEGFC、VHL、YES1和ZAP70，及其任意组合。包括这些标志物中的一种或组合的生物印记可用于根据本发明表征表型，诸如提供治疗诊断。已知这些标志物在多种化疗剂对抗增殖性疾病的效力中发挥作用。因此，可对所述标志物进行评估以针对所述癌症独立于癌症来源或类型选择候选治疗。在一个实施方案中，本发明提供了针对癌症选择候选治疗剂的方法，其包括鉴定包含一种或多种药物关联靶标的水平或存在的生物印记，以及根据其对于具有所述生物印记的受试者的预期效力而选择候选治疗剂。所述一种或多种药物关联靶标可以是上文所列或表9-10中示出的靶标之一。在一些实施方案中，评估所述一种或多种药物关联靶标中的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35、40、45或至少50种。所述一种或多种药物关联靶可以核酸(如DNA、mRNA)或蛋白质的形式与囊泡相关，例如，作为囊泡表面标志物或囊泡有效负载。在一些实施方案中，评估了已知与所述一种或多种药物关联靶标相互作用的微RNA的存在或水平，其中已知抑制所述一种或多种药物关联靶标的高水平微RNA可表示所述一种或多种药物关联靶标的较低表达，并且由此提示了对针对所述药物关联靶标的治疗的反应可能较低。所述一种或多种药物关联靶标可以是循环生物标志物。所述一种或多种药物关联靶标可以在组织样品中评估。可通过将所述一种或多种药物关联靶标的存在和水平与参照值相比较而确定所述预期效力，其中高于所述参照的水平提示所述受试者可能是响应者。可使用分类算法确定所述预期效力，其中通过将已知对于所述候选治疗是响应者或无响应者的受试者中的一种或多种药物关联靶标的生物印记加以比较而训练所述分类器。所述一种或多种药物关联靶标与适当的候选靶标的分子关联示于本文的表9-10中以及2010年2月12日提交的美国专利申请12/658,770；2010年2月11日提交的国际PCT专利申请PCT/US2010/000407；2010年10月27日提交的国际PCT专利申请PCT/US2010/54366；2011年4月6日提交的并且发明名称为“Circulating Biomarkers for Disease”的国际专利申请系列No.PCT/US2011/031479；以及2010年12月28日提交的美国临时专利申请61/427,788之中；全部申请全文以引用的方式并入本文。
国际专利申请系列No.PCT/US2011/031479的表11，提供了根据本发明的方法进行分析的许多治疗诊断靶标的基因和对应的蛋白质代号和名称的列表。根据本领域的技术人员所理解，基因和蛋白质在科技文献中已经演变出大量的替代性名称。因此，PCT/US2011/031479的表11中的列举包含了说明性但非穷尽的汇总。基因别名和描述的进一步列表可使用多种在线数据库寻获，其包括(WWW.genecards.org)、HUGO Gene Nomenclature(WWW.genenames.org)、Entrez Gene(www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi？db＝gene)、UniProtKB/Swiss-Prot(www.uniprot.org)、UniProtKB/TrEMBL(www.uniprot.org)、OMIM(www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi？db＝OMIM)、GeneLoc(genecards.weizmann.ac.il/geneloc/)以及Ensembl(www.ensembl.org)。一般地，下文的基因代号和名称通常对应于HUGU所核准的代号和名称，并且蛋白质名称是由UniProtKB/Swiss-Prot建议的名称。还提供了常用代称。在蛋白质名称表示前体的情况下，还包含了成熟的蛋白质。在本申请的全文中，基因和蛋白质代号可互换地使用并且所述含义在必要时可从上下文推知。
作为说明，可以为罹患非小细胞肺癌的受试者选择治疗。可从来自所述受试者的囊泡评估一种或多种生物标志物，诸如但不限于，EGFR、切除修复交叉互补组1(ERCC1)、p53、Ras、p27、III类β微管蛋白、乳腺癌基因1(BRCA1)、乳腺癌基因1(BRCA2)以及核糖核苷还原酶信使1(RRM1)。根据所述一种或多种生物标志物的一种或多种特征，可将所述受试者确定为针对治疗(诸如但不限于厄洛替尼、卡铂、紫杉醇、吉非替尼或其组合)的响应者或无响应者。
在另一个实施方案中，可为罹患结肠直肠癌的受试者选择治疗，并且可从来自所述受试者的囊泡评估生物标志物，诸如但不限于K-ras。根据所述一种或多种生物标志物的一种或多种特征，可将所述受试者确定为针对治疗(诸如但不限于帕尼单抗、西妥昔单抗或其组合)的响应者或无响应者。
在另一个实施方案中，可以为罹患乳腺癌的受试者选择治疗。可从来自所述受试者的囊泡评估一种或多种生物标志物，诸如但不限于HER2、拓扑异构酶IIα、雌激素受体以及黄体激素受体。根据所述一种或多种生物标志物的一种或多种特征，可将所述受试者确定为针对治疗(诸如但不限于曲妥珠单抗、蒽环类、紫杉烷、甲氨蝶呤、氟尿嘧啶或其组合)的响应者或无响应者。
如所描述的，用于治疗诊断癌症的生物印记可包括对一种或多种生物标志物(其可以是蛋白质或核酸)的分析，包括mRNA或微RNA。可在体液中检测所述生物标志物，并且/或者可检测与囊泡相关的生物标志物，如，作为囊泡抗原或囊泡有效负载。在一个说明性的实例中，所述生物印记用于将受试者鉴定为对于酪氨酸激酶抑制剂的响应者或无响应者。所述生物标志物可以是在2010年4月19日提交的题为“METHOD S AND KITS TO PREDICT THERAPEUTIC OUTCOME OFTYROSINE KINASE INHIBITORS”的WO/2010/121238；或2009年2月19日提交的题为“SYSTEMS AND METHODS OF CANCER STAGINGAND TREATMENT”的WO/2009/105223中描述的一种或多种生物标志物，两申请全文均以引用的方式并入本文。
在一个方面，本发明提供了测定受试者对于酪氨酸激酶抑制剂是否可能有反应或无反应的方法，所述方法包括在来自所述受试者的样品的囊泡群体中鉴定一种或多种生物标志物，其中与参照相比所述一种或多种生物标志物在所述样品中的差异表达显示所述受试者对于所述酪氨酸激酶抑制剂是响应者或无响应者。在一个实施方案中，所述一种或多种生物标志物包含miR-497，其中miR-497表达的降低指示所述受试者是响应者(即，对于所述酪氨酸激酶抑制剂敏感)。在另一个实施方案中，所述一种或多种生物标志物包含miR-21、miR-23a、miR-23b和miR-29b中的一种或多种，其中所述微RNA的上调指示所述受试者可能是无响应者(即，对所述酪氨酸激酶抑制剂有抗性)。在一些实施方案中，所述一种或多种生物标志物包含hsa-miR-029a、hsa-let-7d、hsa-miR-100、hsa-miR-1260、hsa-miR-025、hsa-let-7i、hsa-miR-146a、hsa-miR-594-Pre、hsa-miR-024、FGFR1、MET、RAB25、EGFR、KIT和VEGFR2中的一种或多种。在另一个实施方案中，所述一种或多种生物标志物包含FGF1、HOXC10或LHFP，其中所述生物标志物的较高表达指示所述受试者是无响应者(即，对所述酪氨酸激酶抑制剂有抗性)。所述方法可用于测定癌症对于所述酪氨酸激酶抑制剂的敏感性，例如，非小细胞肺癌细胞、肾癌或GIST。所述酪氨酸激酶抑制剂可以是厄洛替尼、凡德他尼、舒尼替尼和/或索拉非尼，或通过类似作用机制工作的其它抑制剂。酪氨酸激酶抑制剂包括以特异性或非特异性方式抑制一种或多种酪氨酸激酶的作用的任何药物。酪氨酸激酶抑制剂包括小分子、抗体、肽或任意适当实体，其直接地、间接地、变构地或以任意其它方式抑制酪氨酸残基的磷酸化。酪氨酸激酶抑制剂的特定实例包括N-(三氟甲基苯基)-5-甲基异噁唑-4-甲酰胺、3-[(2,4-二甲基吡咯-5-基)亚甲基)二氢吲哚-2-酮、17-(烯丙氨基)-17-去甲氧基格尔德霉素、4-(3-氯-4-氟苯基氨基)-7-甲氧基-6-[3-(4-吗啉基)丙氧基]q-喹唑啉、N-(3-乙炔基苯基)-6,7-(2-甲氧基乙氧基)-4-喹唑啉胺、BIBX1382、2,3,9,10,11,12-六氢-10-(羟甲基)-10-羟基-9-甲基-9,12-环氧-y-1H-dCndolo[1,2,3-fg：3′,2′,1′-kl]吡咯并[3,4-i][1,6]苯并二氨芳辛-1-酮、SH268、染料木黄酮、STI57l、CEP2563、4-(3-氯苯基氨基)-5,6-二甲基-7H-吡咯并[2,3-d〕嘧啶甲烷磺酸酯、4-(3-溴-4-羟基苯基)氨基-6,7-二甲氧基喹唑啉、4-(4′-羟基苯基)氨基-6,7-二甲氧基喹唑啉、SU6668、STI571A、N-4-氯苯基-4-(4-吡啶基甲基)-1-酞嗪胺(phthalazinamine)、N-[2-(二乙胺基)乙基]-5-[(z)-(5-氟-1,2-二氢-2-氧代-3H-吲哚-3-亚基)甲基]-2,4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酰胺(通常称为舒尼替尼)、A-[-A-[[4-氯-3-(三氟甲基)苯基]-甲氨酰氨基]-苯氧基}-N-甲基-吡啶-2-甲酰胺(通常称为索拉非尼)、EMD121974和N-(3-乙炔基苯基)-6,7-双(2-甲氧基乙氧基)喹唑啉-4-胺(通常称厄洛替尼)。在一些实施方案中，所述酪氨酸激酶抑制剂对于表皮生长因子受体(EGFR)、VEGFR、PDGFRβ和/或FLT3具有抑制活性。
因此，可根据通过本发明的方法鉴定的生物印记为罹患癌症的受试者选择治疗。因此，所述生物印记可包含循环生物标志物(包括微RNA、囊泡或任何可用的囊泡相关生物标志物)的存在或水平。
可以使用本发明的方法用于其他疾病(包括心血管疾病、神经疾病和失调、免疫疾病和失调以及传染病)的治疗诊断的生物标志物描述于2011年4月6日提交的并且发明名称为“Circulating Biomarkers forDisease”的国际专利申请系列No.PCT/US2011/031479中，将该申请全部按引用并入本文中。
生物印记发现
本文中提供的系统和方法可以用于鉴定囊泡的新生物印记，如一种或多种用于表型的诊断、预后或治疗诊断的新生物标志物。在一个实施方案中，可以从具有表型的受试者分离一种或多种囊泡，并且确定该一种或多种囊泡的生物印记。所述生物印记可以与不具有所述表型的受试者进行比较。可以确定两种生物印记之间的差异并用于形成新的生物印记。然后新的生物印记可以用于鉴定另一名受试者为具有所述表型或不具有所述表型。
来自具有特定表型的受试者的生物印记之间的差异可以与来自不具有特定表型的受试者的生物印记相比较。一种或多种差异可以是囊泡的任何特征的差异。例如，样品中囊泡的水平或量、囊泡的半衰期、囊泡的循环半衰期、囊泡的代谢半衰期或囊泡的活性或者其组合在来自具有特定表型的受试者的生物印记与来自不具有特定表型的受试者的生物印记之间可以不同。
在一些实施方案中，一种或多种生物标志物在来自具有特定表型的受试者的生物印记与来自不具有特定表型的受试者的生物印记之间不同。例如，一种或多种生物标志物的表达水平、存在、不存在、突变、变体、拷贝数变异、平截、复制、修饰、分子缔合或其任何组合在来自具有特定表型的受试者的生物印记与来自不具有特定表型的受试者的生物印记之间可以不同。所述生物标志物可以是本文中公开的或可以用于表征生物实体的任何生物标志物，包括循环生物标志物，如蛋白质或微RNA、囊泡或者囊泡中或囊泡上存在的成分，如任何核酸(例如，RNA或DNA)、蛋白质、肽、多肽、抗原、脂质、碳水化合物或蛋白聚糖。
在一个方面中，本发明提供了发现新生物印记的方法，包括比较两个或更多个样品组之间的生物标志物以鉴定在样品组之间显示出差异的生物标志物。可以以小组形式评价多种标志物以潜在地提高单个标志物的性能。在一些实施方案中，以多重方式来评价多种标志物。可以使用统计学判别分析或本文中所用的分类方法来评价单个标志物和标志物组区分组的能力。最佳的标志物小组可以用作生物印记来表征分析的表型，如提供疾病或病症的诊断、预后或治疗诊断。优化可以基于各种标准，包括但不限于最大化ROC AUC、准确性、特定特异性下的灵敏度或特定灵敏度下的特异性。所述小组可以包括来自多种类型的生物标志物。例如，所述生物印记可以包括可用于捕获目标囊泡群体的囊泡抗原，并且所述生物印记可以进一步包括囊泡群体内的有效负载标志物，包括但不限于微RNA、mRNA或可溶性蛋白。最优组合可以鉴定为比较两种设置时具有最高ROC AUC值的那些囊泡抗原和有效负载标志物。作为另一个实例，除了评价通过分离外来体不能获得的循环生物标志物(如，循环蛋白质和/或微RNA)以外，通过评价囊泡群体来确定所述生物印记。
表型可以是本文中所列那些中的任何一种，例如，在上文的“表型”部分中所列的那些。例如，表型可以是增殖性失调，如癌症或非恶性生长、围产期或妊娠相关病症、传染病、神经失调、心血管疾病、炎性疾病、免疫疾病或自身免疫疾病。癌症包括但不限于肺癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌(包括小细胞癌(燕麦细胞癌)、混合小细胞/大细胞癌和混合性小细胞癌)、结肠癌、乳腺癌、前列腺癌、肝癌、胰腺癌、脑癌、肾癌、卵巢癌、胃癌、黑色素瘤、骨癌、胃的癌、乳腺癌、胶质细胞瘤、胶质母细胞瘤、肝细胞癌、乳头状肾癌、头颈部鳞状细胞癌、白血病、淋巴瘤、骨髓瘤或其它实体肿瘤。
可以评价本文中所描述的任何类型的生物标志物或特定的生物标志物来发现新的生物印记，例如，表3-5中的生物标志物。在一个实施方案中，选择用于发现的生物标志物包括本文中所列的细胞特异性生物标志物，包括但不限于2011年4月6日提交的发明名称为“CirculatingBiomarkers for Disease”的国际专利申请系列No.PCT/US2011/031479(将该申请按引用全文并入)的图1-60，表9-10或表16中所列的基因和微RNA。所述生物标志物可以包括一种或多种疾病相关的、药物相关的或预后的靶标，如表11中所列的。所述生物标志物可以包括一种或多种一般囊泡标志物、一种或多种细胞特异性囊泡标志物和/或一种或多种疾病特异性囊泡标志物。
表11：疾病-和药物-相关的生物标志物
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用于生物印记发现的生物标志物可以包括通常与囊泡相关的标志物，包括但不限于表11中的一种或多种囊泡生物标志物。其他生物标志物可以选自可在exocarta.ludwig.edu.au获得的ExoCarta数据库中公开的那些，其公开了在外来体中鉴定的蛋白质和RNA分子。还可以参见Mathivanan和Simpson，ExoCarta：A compendium of exosomal proteins andRNA.Proteomics.2009年11月，9(21)：4997-5000。
用于生物印记发现的生物标志物可以包括通常与囊泡相关的标志物，包括但不限于A33、a33n15、AFP、ALA、ALIX、ALP、膜联蛋白V、APC、ASCA、ASPH(246-260)、ASPH(666-680)、ASPH(A-10)、ASPH(D01P)、ASPH(D03)、ASPH(G-20)、ASPH(H-300)、AURKA、AURKB、B7H3、B7H4、BCA-225、BCNP1、BDNF、BRCA、CA125(MUC16)、CA-19-9、C-Bir、CD1.1、CD10、CD174(Lewis y)、CD24、CD44、CD46、CD59(MEM-43)、CD63、CD66e CEA、CD73、CD81、CD9、CDA、CDAC11a2、CEA、C-Erb2、C-erbB2、CRMP-2、CRP、CXCL12、CYFRA21-1、DLL4、DR3、EGFR、Epcam、EphA2、EphA2(H-77)、ER、ErbB4、EZH2、FASL、FRT、FRT c.f23、GDF15、GPCR、GPR30、Gro-α、HAP、HBD1、HBD2、HER3(ErbB3)、HSP、HSP70、hVEGFR2、iC3b、IL6Unc、IL-1B、IL6Unc、IL6R、IL8、IL-8、INSIG-2、KLK2、L1CAM、LAMN、LDH、MACC-1、MAPK4、MART-1、MCP-1、M-CSF、MFG-E8、MIC1、MIF、MIS RII、MMG、MMP26、MMP7、MMP9、MS4A1、MUC1、MUC1seq1、MUC1seq11A、MUC17、MUC2、Ncam、NGAL、NPGP/NPFF2、OPG、OPN、p53、p53、PA2G4、PBP、PCSA、PDGFRB、PGP9.5、PIM1、PR(B)、PRL、PSA、PSMA、PSME3、PTEN、R5-CD9Tube1、Reg IV、RUNX2、SCRN1、seprase、SERPINB3、SPARC、SPB、SPDEF、SRVN、STAT3、STEAP1、TF(FL-295)、TFF3、TGM2、TIMP-1、TIMP1、TIMP2、TMEM211、TMPRSS2、TNF-α、Trail-R2、Trail-R4、TrKB、TROP2、Tsg101、TWEAK、UNC93A、VEGFA和YPSMA-1中的一种或多种。所述生生物标志物可以包括NSE、TRIM29、CD63、CD151、ASPH、LAMP2、TSPAN1、SNAIL、CD45、CKS1、NSE、FSHR、OPN、FTH1、PGP9、ANNEXIN1、SPD、CD81、EPCAM、PTH1R、CEA、CYTO7、CCL2、SPA、KRAS、TWIST1、AURKB、MMP9、P27、MMP1、HLA、HIF、CEACAM、CENPH、BTUB、INTG b4、EGFR、NACC1、CYTO18、NAP2、CYTO19、ANNEXIN V、TGM2，ERB2、BRCA1、B7H3、SFTPC、PNT、NCAM、MS4A1，P53、INGA3、MUC2、SPA、OPN、CD63、CD9、MUC1、UNCR3、PAN ADH、HCG、TIMP、PSMA、GPCR、RACK1、PCSA、VEGF、BMP2、CD81、CRP、PRO GRP、B7H3、MUC1、M2PK、CD9、PCSA和PSMA中的一种或多种。所述生物标志物还可以包括TFF3、MS4A1、EphA2、GAL3、EGFR、N-gal、PCSA、CD63、MUC1、TGM2、CD81、DR3、MACC-1、TrKB、CD24、TIMP-1、A33、CD66CEA、PRL、MMP9、MMP7、TMEM211、SCRN1、TROP2、TWEAK、CDACC1、UNC93A、APC、C-Erb、CD10、BDNF、FRT、GPR30、P53、SPR、OPN、MUC2、GRO-1、tsg101和GDF15中的一种或多种。在实施方案中，所述用于发现生物印记的生物标志物包括2011年4月6日提交的并且发明名称为“CirCulatingBiomakers for disease”的国际专利申请系列No.PCT/US2011/031479的图99、100、108A-C、114A和/或115A-E中所示的那些中的一种或多种。
本领域技术人员将认识到本文中公开的或可以在两个目标样品或样品组之间比较的任何标志物可以用于发现针对可以比较的任何给定生物设置的新生物印记。
然后将一种或多种差异用于形成针对特定表型的候选生物印记，如病症的诊断、疾病或病症阶段的诊断、病症的预后或病症的治疗诊断。然后可以将新的生物印记用于鉴定其他受试者的表型。可以确定用于新受试者的囊泡的生物印记，并且与新生物印记相比较以确定受试者是否具有新生物印记从其鉴定的特定表型。
例如，可以将罹患癌症的受试者的生物印记与另一个未患癌症的受试者相比较。任何差异可以用于形成用于癌症诊断的新生物印记。在另一个实施方案中，可以将罹患晚期癌症的受试者的生物印记与另一个患有发展阶段较低的癌症的受试者相比较。任何差异可以用于形成用于癌症阶段分类的新生物印记。在再另一个实施方案中，可以将罹患晚期癌症的受试者的生物印记与另一个患有发展阶段较低的癌症的受试者相比较。任何差异可以用于形成用于癌症阶段分类的新生物印记。
在一个实施方案中，表型是耐药性或对治疗的非响应。可以从对特定治疗的非响应者分离一种或多种囊泡并且确定囊泡的生物印记。可以将获自非响应者的囊泡的生物印记与获自响应者的生物印记相比较。来自非响应者的生物印记之间的差异可以与来自响应者的生物印记相比较。一种或多种差异可以是囊泡的任何特征的差异。例如，样品中的囊泡的水平或量、囊泡的半衰期、囊泡的循环半衰期、囊泡的代谢半衰期、囊泡的活性或其任意组合在来自非响应者的生物印记和来自响应者的生物印记之间可以不同。
在一些实施方案中，一种或多种生物标志物在来自非响应者的生物印记和来自响应者的生物印记之间不同。例如，一种或多种生物标志物的表达水平、存在、不存在、突变、变体、拷贝数变异、平截、复制、修饰、分子缔合或其任何组合在来自非响应者的生物印记和来自响应者的生物印记之间可以不同。
在一些实施方案中，差异可以是囊泡中存在的药物或药物代谢物的量。响应者和非响应者都可以用治疗剂治疗。可以进行来自响应者的生物印记和来自非响应者的生物印记之间的比较，来自响应者的囊泡中存在的药物或药物代谢物的量与非响应者中存在的药物或药物代谢物的量不同。差异还可以在于药物或药物代谢物的半衰期。药物或药物代谢物的量或半衰期的差异可以用于形成鉴定非响应者和响应者的新生物印记。
可以通过利用物理化学特征来发现可用于本文中所述的方法和组合物中的囊泡。例如，可以通过大小，例如，通过过滤已知直径范围为30-120nm的生物物质，来发现囊泡。基于大小的发现方法，如差速离心、蔗糖梯度离心或过滤，已经用于囊泡的分离。
可以通过其分子组分来发现囊泡。基于分子特性的发现方法包括，但不限于，使用识别与囊泡相关的分子的抗体的免疫分离。例如，与囊泡相关的表面分子包括，但不限于，MHC-II分子、CD63、CD81、LAMP-1、Rab7或Rab5。
本领域已知的各种技术适用于囊泡的验证和表征。可用于囊泡的验证和表征的技术包括，但不限于，western印迹、电子显微镜、免疫组织化学、免疫电子显微镜、FACS(荧光激活细胞分选)、电泳(1维，2维)、液相色谱、质谱、MALDI-TOF(基质辅助激光解吸/离子化-飞行时间)、ELISA、LC-MS-MS和nESI(纳米电喷雾电离)。例如，U.S.专利No.2009/0148460描述了使用ELISA方法来表征囊泡。U.S.专利No.2009/0258379描述了从生物流体分离膜囊泡。
可以进一步分析囊泡的一种或多种核酸、脂质、蛋白质或多肽，如表面蛋白或肽，或囊泡内的蛋白质或肽。可以通过各种技术来鉴定候选肽，包括与纯化方法(如，液相色谱)偶联的质谱。然后可以分离肽，并且通过测序鉴定其序列。基于肽的准确质量预测序列的计算机程序也可以用于揭示从囊泡分离的肽的序列。例如，LTQ-Orbitrap质谱可以用于高灵敏度和高准确性的肽测序。已经描述了LTQ-Orbitrap方法(Simpson等，Expert Rev.Proteomics6：267-283，2009)，其通过引用全文并入本文中。
囊泡组合物
本文还提供了具有特定生物印记的分离的囊泡。分离的囊泡可以包含对特定的细胞类型特异性的或者用于表征表型的一种或多种生物标志物或生物印记，如上文所述。分离的囊泡还可以包含一种或多种生物标志物，其中与源自正常细胞(即，来自不具有目标表型的受试者的细胞)的分离囊泡相比，分离的囊泡的所述一种或多种生物标志物的表达水平较高、较低或相同。例如，分离的囊泡可以包含选自：B7H3、PSCA、MFG-E8、Rab、STEAP、PSMA、PCSA、5T4、miR-9、miR-629、miR-141、miR-671-3p、miR-491、miR-182、miR-125a-3p、miR-324-5p、miR-148b和miR-222中的一种或多种生物标志物，其中与源自正常细胞的囊泡相比，所述分离的囊泡的一种或多种生物标志物的表达水平更高。所述分离的囊泡可以包含选自所述组中的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、13、14、15、16、17、18或19种生物标志物。所述分离的囊泡可以进一步包含选自EpCam、B7H3、PSMA、PSCA、PCSA、CD63、CD59、CD81或CD9中的一种或多种生物标志物。
本文还提供了包含分离的囊泡的组合物。所述的组合物可以包含一种或多种分离的囊泡。例如，所述的组合物可以包含多种囊泡或者囊泡的一个或多个群体。所述的组合物可以为囊泡明显富集的。例如，所述的组合物基本上不存在细胞碎片、细胞、非外来体蛋白质、肽或核酸(例如所述囊泡中不包含的生物分子)。所述细胞碎片、细胞、非外来体蛋白质、肽或核酸可能与囊泡一起存在于生物样品中。基本上不存在细胞碎片、细胞、非外来体蛋白质、肽或核酸(例如非包含于所述囊泡中的生物学分子)的组合物可以通过本文所公开的任何方法得到，例如通过使用针对一种或多种囊泡的一种或多种结合剂或捕获剂。所述的囊泡可以占总组合物的重量或质量的至少30、40、50、60、70、80、90、95或99％。所述组合物的囊泡可以为异质的或均质的囊泡群体。例如，均质的囊泡群体包括对于一种或多种性质或特征而言为均质的囊泡。例如，所述的一种或多种特征可以选自：一种或多种相同的生物标志物、基本上相似或一致的生物印记、源自相同的细胞类型、特定大小的囊泡以及它们的组合。
因此，在一些实施方案中，所述的组合物包含明显富集的囊泡群体。所述的组合物可以对于就一种或多种性质或特征而言至少30、40、50、60、70、80、90、95或99％均质的囊泡群体为富集的。例如，所述的一种或多种特征可以选自：一种或多种相同的生物标志物、基本上相似或一致的生物印记、源自相同的细胞类型、特定大小的囊泡以及它们的组合。例如，所述的囊泡群体可以通过全部具有特定的生物印记、具有相同的生物标志物、具有相同的生物标志物组合或者源自相同的细胞类型而成为均质的。在一些实施方案中，所述的组合物包括基本上均质的囊泡群体，例如，具有特定生物印记、源自特定的细胞或者这二者的群体。
囊泡群体可以包含一种或多种相同的生物标志物。所述的生物标志物可以为任何成分，例如，任何核酸(例如RNA或DNA)、蛋白质、肽、多肽、抗原、脂质、碳水化合物或蛋白聚糖。例如，群体中的各囊泡可以包含相同或一致的一种或多种生物标志物。在一些实施方案中，各囊泡包含相同的1、2、3、4、5、6、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、50、75或100种生物标志物。
包含相同或一致的生物标志物的囊泡群体可以包括所述群体中的各囊泡具有相同的所述生物标志物的存在或不存在、表达水平、突变状态或修饰。例如，富集的囊泡群体可以包含其中各囊泡具有存在的相同生物标志物、缺乏的相同生物标志物、相同的生物标志物表达水平、相同的生物标志物修饰或者相同的生物标志物突变的囊泡。生物标志物的相同表达水平可以指定量或定性量度，例如，与参照水平相比，所述群体中的囊泡对于生物标志物是表达不足的、过表达的或者具有相同的表达水平。
或者，生物标志物的相同表达水平可以为代表对于群体中各囊泡相似的生物标志物表达的数值。例如，各囊泡的miRNA的拷贝数、蛋白质的量或者mRNA的水平可以对于群体中的各囊泡在数量上是近似的，使得各囊泡的数量值与所述群体中各其它囊泡的量相差±1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20％，只要这种变异是合适的即可。
在一些实施方案中，所述的组合物包含明显富集的囊泡群体，其中在所述富集群体中的囊泡具有基本上相似或一致的生物印记。所述的生物印记可以包含一种或多种囊泡特征，例如囊泡的水平或量、囊泡半衰期变异的时间评价、循环囊泡半衰期、囊泡的代谢半衰期或者囊泡的活性。所述的生物印记还可以包括生物标志物的存在或不存在、表达水平、突变状态或修饰，诸如本文所述的那些。
所述群体中各囊泡的生物印记可以至少30、40、50、60、70、80、90、95或99％相同。在一些实施方案中，各囊泡的生物印记为100％相同。在所述富集的群体中各囊泡的生物印记可以具有相同的1种、2种、3种、4种、5种、6种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、11种、12种、13种、14种、15种、16种、17种、18种、19种、20种、25种、50种、75种或100种特征。例如，在富集的群体中囊泡的生物印记可以为第一生物标志物存在、第二生物标志物存在以及第三生物标志物表达不足。相同的群体中的另一囊泡可以为100％相同，即具有存在的相同第一和第二生物标志物以及第三生物标志物表达不足。或者，相同群体中的囊泡可以具有相同的第一和第二生物标志物，但是没有第三生物标志物的表达不足。
在一些实施方案中，所述的组合物包含明显富集的囊泡群体，其中所述的囊泡源自相同的细胞类型。例如，所述的囊泡可以全部源自特定组织的细胞、来自特定目标肿瘤或目标疾病组织的细胞、循环肿瘤细胞或者母体或胎儿起源的细胞。所述的囊泡可以全部源自肿瘤细胞。所述的囊泡可以全部源自相同的组织或细胞，包括但不限于肺、胰腺、胃、肠、膀胱、肾、卵巢、睾丸、皮肤、结肠直肠、乳腺、前列腺、脑、食管、肝脏、胎盘或胎儿细胞。
包含明显富集的囊泡群体的组合物还可以包含特定大小的囊泡。例如，所述的囊泡可以全部具有大于约10、20或30nm的直径。它们可以全部具有约10-1000nm，例如，约30-800nm、约30-200nm或者约30-100nm的直径。在一些实施方案中，所述的囊泡可以全部具有小于10,000nm、1000nm、800nm、500nm、200nm、100nm或50nm的直径。
对于一种或多种特征而言为均质的囊泡群体可以占所述组合物的总囊泡群体的至少约30、40、50、60、70、80、90、95或99％。在一些实施方案中，包含明显富集的囊泡群体的组合物与所述组合物所来源的生物样品中囊泡的浓度相比，前者包含至少2、3、4、5、10、20、25、50、100、250、500或1000倍的囊泡浓度。在再其它的实施方案中，所述的组合物可以进一步包含第二富集的囊泡群体，其中对于如本文所述的一种或多种特征而言，所述的囊泡群体为至少30％均质的。
可以使用多重分析来获得对于多于一种囊泡群体(例如至少2、3、4、5、6、7、8、9、10种囊泡群体)明显富集的组合物。各明显富集的囊泡群体可以占所述组合物的重量或质量的至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、46、47、48或49％。在一些实施方案中，明显富集的囊泡群体占所述组合物的重量或质量的至少约30、40、50、60、70、80、90、95或99％。
明显富集的囊泡群体可以通过使用本文所公开的一种或多种方法、工艺或系统来获得。例如，由样品中分离囊泡群体可以通过使用针对囊泡的一种或多种生物标志物的一种或多种结合剂来实施，例如使用靶向于囊泡的两种或更多种生物标志物的两种或更多种结合剂。可以使用一种或多种捕获剂来获得明显富集的囊泡群体。可以使用一种或多种检测试剂来鉴定明显富集的囊泡群体。
在一个实施方案中，具有特定生物印记的囊泡群体是通过使用针对所述生物印记的生物标志物的一种或多种结合剂而获得的。可以分离所述囊泡，从而得到包含具有特定生物印记的明显富集的囊泡群体的组合物。在另一个实施方案中，具有特定目标生物印记的囊泡群体可以通过使用针对并非目标生物印记的成分的生物标志物的一种或多种结合剂来获得。因此，所述的结合剂可以用于除去不具有目标生物印记的囊泡，并且所得的组合物对于具有特定目标生物印记的囊泡群体而言是明显富集的。所得的组合物可以基本上不存在包含所述结合剂针对的生物标志物的囊泡。
2011年4月6日提交的并且发明名称为“Circulating Biomarkers forDisease”的国际专利申请系列No.PCT/US2011/031479，将该申请全部按引用并入本文中。
检测系统和试剂盒
还提供了配置为确定囊泡的一种或多种生物印记的检测系统。该检测系统可以用于检测异质囊泡群体或者一种或多种均质囊泡群体。所述的检测系统可以配置为检测多种囊泡，其中所述多种囊泡的至少一个亚组包含不同于所述多种囊泡的另一个亚组的生物印记。所述的检测系统检测至少2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、15种、20种、25种、30种、40种、50种、60种、70种、80种、90种或100种不同的囊泡亚组，其中各囊泡亚组包含不同的生物印记。例如，检测系统(例如使用了本文所公开的一种或多种方法、工艺和组合物)可以用于检测至少2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、15种、20种、25种、30种、40种、50种、60种、70种、80种、90种或100种不同的囊泡群体。
所述的检测系统可以被配置为评估一种或多种囊泡的至少2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、15种、20种、25种、30种、40种、50种、60种、70种、80种、90种、100种、1000种、2500种、5000种、7500种、10,000种、100,000种、150,000种、200,000种、250,000种、300,000种、350,000种、400,000种、450,000种、500,000种、750,000种或1,000,000种不同的生物标志物。在一些实施方案中，所述的一种或多种生物标志物选自表3-5中的任一个，或者如本文所公开的生物标志物。所述的检测系统可以配置为评估特定的囊泡群体，例如来自特定细胞源的囊泡；或者用于评估多种特定的囊泡群体，其中各囊泡群体具有特定的生物印记。
所述的检测系统可以为低密度检测系统或高密度检测系统。例如，低密度检测系统可以检测最多达1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种或10种不同的囊泡群体，而高密度检测系统可以检测至少大约15种、20种、25种、50种或100种不同的囊泡群体。在另一个实施方案中，低密度检测系统可以检测最多达约100种、200种、300种、400种或500种不同的生物标志物，而高密度检测系统可以检测至少大约750种、1000种、2000种、3000种、4000种、5000种、6000种、7000种、8000种、9,000种、10,000种、15,000种、20,000种、25,000种、50,000种或100,000种不同的生物标志物。在又另一个实施方案中，低密度检测系统可以检测至多大约100种、200种、300种、400种或500种不同的生物印记或生物标志物组合，而高密度检测系统可以检测至少大约750种、1000种、2000种、3000种、4000种、5000种、6000种、7000种、8000种、9,000种、10,000种、15,000种、20,000种、25,000种、50,000种或100,000种生物印记或生物标志物组合。
所述的检测系统可以包含选择性地与囊泡杂交的探针。所述的检测系统可以包含用于检测囊泡的多种探针。在一些实施方案中，多种探针用于检测异质囊泡群体中的囊泡的量。在再其它的实施方案中，多种探针用于检测均质的囊泡群体。多种探针可以用于分离或检测至少两种不同的囊泡亚组，其中各囊泡亚组包含不同的生物印记。
检测系统(例如使用了本文所公开的一种或多种方法、工艺和组合物)可以包含多种探针，这些探针配置用于检测或分离(例如使用本文所公开的一种或多种方法、工艺和组合物)至少2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、15种、20种、25种、30种、40种、50种、60种、70种、80种、90种或100种不同的囊泡亚组，其中各囊泡亚组包含不同的生物印记。
例如，检测系统可以包含多种探针，这些探针被配置用于检测至少2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、15种、20种、25种、30种、40种、50种、60种、70种、80种、90种或100种不同的囊泡群体。所述的检测系统可以包含多种探针，这些探针被配置用于选择性地与一种或多种囊泡的至少2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、15种、20种、25种、30种、40种、50种、60种、70种、80种、90种、100种、1000种、2500种、5000种、7500种、10,000种、100,000种、150,000种、200,000种、250,000种、300,000种、350,000种、400,000种、450,000种、500,000种、750,000种或1,000,000种不同的生物标志物杂交。在一些实施方案中，所述的一种或多种生物标志物选自表3-5中的任一个，或者如本文所公开的生物标志物。所述多种探针可以被配置用于评估特定的囊泡群体，例如来自特定细胞源的囊泡；或者用于评估多种特定的囊泡群体，其中各囊泡群体具有特定的生物印记。
所述的检测系统可以为包含用于检测囊泡的探针的低密度检测系统或高密度检测系统。例如，低密度检测系统可以包含用于检测至多1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种或10种不同的囊泡群体的探针，而高密度检测系统可以包含用于检测至少大约15种、20种、25种、50种或100种不同的囊泡群体的探针。在另一个实施方案中，低密度检测系统可以包含用于检测至多约100种、200种、300种、400种或500种不同的生物标志物的探针，而高密度检测系统可以包含用于检测至少约750种、1000种、2000种、3000种、4000种、5000种、6000种、7000种、8000种、9,000种、10,000种、15,000种、20,000种、25,000种、50,000种或100,000种不同的生物标志物的探针。在再另一个实施方案中，低密度检测系统可以包含用于检测最多达约100种、200种、300种、400种或500种不同的生物印记或生物标志物组合的探针，而高密度检测系统可以包含用于检测至少约750种、1000种、2000种、3000种、4000种、5000种、6000种、7000种、8000种、9,000种、10,000种、15,000种、20,000种、25,000种、50,000种或100,000种生物印记或生物标志物组合的探针。
所述的探针可以特异性地用于检测特定的囊泡群体，例如具有特定生物印记的囊泡以及上文所述的囊泡。此外，还提供了用于检测前列腺特异性囊泡的多种探针。多个探针可以包含用于检测表3-5中的生物标志物的探针。多个探针还可以包含一个或多个用于检测表3-5中的一种或种生物标志物的探针。
用于检测囊泡的一种或多种miRNA的多种探针可以包含用于检测一种或多种以下miRNA的探针：miR-9、miR-629、miR-141、miR-671-3p、miR-491、miR182、miR-125a-3p、miR-324-5p、miR-148b和miR-222。在另一个实施方案中，所述多种探针包含用于检测EpCam、CD9、PCSA、CD63、CD81、PSMA、B7H3、PSCA、ICAM、STEAP和EGFR的一种或多种探针。在一些实施方案中，所述多种探针包含用于检测EpCam、CD9、PCSA、CD63、CD81、PSMA和B7H3的一种或多种探针。在其它实施方案中，所述多种探针包含用于检测EpCam、CD9、PCSA、CD63、CD81、PSMA、B7H3、PSCA、ICAM、STEAP和EGFR的一种或多种探针。在又另一个实施方案中，所述多种探针的一个亚组是针对EpCam、CD9、PCSA、CD63、CD81、PSMA、B7H3、PSCA、ICAM、STEAP和EGFR中的一种或多种的捕获剂，并且另一个亚组用于检测CD9、CD63和CD81中的一种或多种。多种探针还可包含用于检测miR-92a-2*、miR-147、miR-574-5p或其组合的一种或多种探针。多种探针还可包含用于检测miR-548c-5p、miR-362-3p、miR-422a、miR-597、miR-429、miR-200a、miR-200b或其组合的一种或多种探针。多种探针还可包含用于检测EpCam、CK和CD45的一种或多种探针。在一些实施方案中，所述一种或多种探针可以是捕获剂。在另一个实施方案中，所述探针可以是检测剂。在又另一个实施方案中，所述多种探针包含捕获剂和检测剂。
所述的探针(诸如捕获剂)可以与固定基底连接，例如阵列或珠。或者，所述的探针(诸如检测剂)是非连接的。所述的检测系统可以为基于阵列的系统、测序系统、基于PCR的系统或者基于珠的系统，例如上文所述的系统。所述的检测系统也可以为上文所述的微流体装置。
所述的检测系统可以为试剂盒的部分。或者，所述的试剂盒可以包括一种或多种探针组或者多种探针，如本文中所述。所述的试剂盒可以包括用于检测囊泡或多种囊泡(例如异质群体中的囊泡)的探针。所述的试剂盒可以包括用于检测均质的囊泡群体的探针。例如，所述的试剂盒可以包括用于检测特定细胞源囊泡群体或者具有相同的特定生物印记的囊泡群体的探针。
计算机系统
可以针对分子特征来分析囊泡，例如通过测定一种或多种生物标志物的量、存在或不存在。所生成的数据可以用于产生生物印记，其可以通过计算机系统储存并分析，例如图3所示。此外，分析生物印记或者将生物印记与一种或多种表型相关联也可以通过计算机系统来实施(例如通过使用计算机可执行逻辑)。
计算机系统(例如图3中所示)可以用于在分析后传送数据和结果。因此，图3为示出了代表性示例逻辑设备的简图，通过该设备可分析来自囊泡的结果并报告或产生所述分析。图3示出了计算机系统(或数字装置)800以接收或储存由囊泡产生的数据、分析所述数据以产生一种或多种生物印记和产生一种或多种生物印记(或表型表征)的报告。此外，所述的计算机系统还可以对所产生的生物印记实施比较和分析，并传送所得的结果。或者，所述的计算机系统可以接受囊泡分析的原始数据(例如通过网络传送数据)，并进行分析。
计算机系统800可以理解为能够从介质811和/或网络端口805读取指令的逻辑设备，其可以任选地与具有固定介质812的服务器809连接。图3中所示的系统包括CPU801、磁盘驱动器803、任选的输入装置诸如键盘815和/或鼠标816，以及任选的监视器807。与本地或远和位置的服务器809的数据通信可以通过所示的通信媒介来实现。所述的通信媒介可以包括传送和/或接收数据的任何手段。例如，通信媒介可以为网络连接、无线连接或互联网连接。这种连接可以在万维网上提供通信。可以想象，关于本发明的数据可以在这些网络或连接上进行传送，以便被某方822所接收和/或审阅。接收方822可以是但不限于个体、医疗保健提供者或者医疗保健管理者。因此，有关测试结果的信息和数据可以这个世界的任何地方产生并被传送至不同地点。例如，当在不同的建筑物、城市、州、国家、大陆或海外进行分析时，测试结果的信息和数据可根据上文所述生成并形成为可传送的形式。因此，可传送形式的测试结果可被输入美国以到达接收方822。因此，本发明还涵盖了用于产生针对来自个体的一种或多种样品的诊断的可传送形式的信息。所述方法包括的步骤有：(1)根据本发明的方法由所述样品确定诊断、预后或治疗诊断等等；以及(2)将所述确定步骤的结果体现为可传送形式。所述可传送形式是所述生产方法的产物。在一个实施方案中，计算机可读介质包括适用于传送生物样品分析的结果(例如生物印记)的介质。所述的媒介可以包括涉及囊泡的结果(例如受试者的生物印记)，其中所述的结果是使用本文所述的方法得到的。
实施例
实施例1：囊泡从前列腺癌细胞系的纯化
在包含20％FBS(胎牛血清)和1％P/S/G的培养基中，将前列腺癌细胞系培养3-4天。然后在4℃下，将细胞在400×g下预离心10分钟。保留上清液，并在4℃下在2000×g下离心20分钟。可以使用MilliporeCentricon Plus-70(编号UFC710008Fisher)浓缩包含囊泡的上清液。
在室温下，用30ml的PBS以1000×g将离心超滤管预洗涤3分钟。然后，将15-70ml预离心细胞培养物上清液倒入到浓缩杯(ConcentrateCup)中，并在室温下在Swing BucketAdapter(Fisher编号75-008-144)中以1000×g离心30分钟。
将收集杯(Collection Cup)中的穿流物倒出。使用任意的额外上清液将所述浓缩杯中的体积调至60ml。在室温下将所述浓缩杯以1000×g离心30分钟以浓缩细胞上清液。
通过加入70ml PBS洗涤所述浓缩杯，并在1000×g下离心30-60分钟直到剩余约2ml。通过将浓缩物倒置于小的样品杯中并在4℃下离心1分钟来从过滤器除去囊泡。使用PBS将体积调至25ml。此刻的囊泡是浓缩的，并被加至30％蔗糖垫上。
为了制作垫，将4ml Tris/30％蔗糖/D2O溶液(30g无蛋白酶的蔗糖、2.4g Tris碱、50ml D2O，滴加10N NCL将pH调节至7.4，使用D2O将体积调节至100ml，通过0.22um过滤器进行灭菌)加载到30ml V型底薄壁超离心管的底部。在所述蔗糖垫上方，在不扰动界面的情况下轻柔地加入稀释的25ml浓缩囊泡，并在4℃下以100,000×g离心75分钟。使用10ml移液管小心地除去蔗糖垫上方的～25ml，并用细尖移液管(SAMCO233)收集～3.5ml的囊泡，然后转移至新的超离心管中，其中加有30ml PBS。在4℃下以100,000×g将所述的管离心70分钟。小心地倒出上清液。将团块重悬浮于200ul PBS中，并可以储存在4℃下或者用于分析。BCA分析法(1∶2)可以用于测定蛋白质的含量，Western印迹或电子显微法可以用于确定囊泡的纯化。
实施例2：囊泡从VCaP和22Rvl的纯化
通过首先用等体积的PBS(1ml)稀释血浆，通过超离心收集来自前列腺脊椎肿瘤(VCaP)和22Rvl(其为人前列腺癌细胞系，源自人前列腺癌异种移植物(CWR22R))的囊泡。将稀释的流体转移至15ml Falcon离心管中，并在4℃下以2000×g离心30分钟。将上清液(～2ml)转移至超离心管5.0ml PA薄壁管(Sorvall#03127)中，并在4℃下以12000×g离心45分钟。
将上清液(～2ml)转移至新的5.0ml超离心管中，并加入2.5ml PBS以填充至最大体积，然后在4℃下以110,000×g离心90分钟。倒出上清液而不扰乱团块，将该团块重悬浮于1ml PBS中。加入4.5ml PBS而将所述的管填充至最大的体积，并在4℃下在110,000×g下离心70分钟。
倒出上清液而不搅乱团块，并且加入另外1ml PBS以洗涤团块。加入4.5ml PBS而将体积增大至最大体积，并在4℃下以110,000×g离心70分钟。使用P-1000移液管除去上清液，直到所述管底为～100μl的PBS。使用P-200移液管除去～90μl残留物，并通过使用P-20移液管将使用～10μl PBS残留物收集的团块轻柔地吸取到微离心管中。使用另外5μl新鲜PBS从干燥管的底部洗出残留的团块，并收集到微离心管中，并悬浮于磷酸盐缓冲盐(PBS)中至浓度为500μg/ml。
实施例3：血浆的收集和囊泡的纯化
通过标准的穿刺将血液收集到7ml K2-EDTA管中。在4℃的离心机(SORVALL Legend RT+离心机)中，以400g将该样品离心10分钟，从而由血细胞中分离出血浆。通过小心地吸取，将上清液(血浆)转移至15ml Falcon离心管中。在2,000g下将血浆离心20分钟，并收集上清液。
对于存储，将大约1ml的血浆(上清液)等分到冷冻管中，放置于干冰中以使它们冻结，并储存在-80℃下。在纯化囊泡之前，如果样品储存在-80℃下，则在冷水浴中解冻样品5分钟。手动将所述样品颠倒混合，从而使不溶物质消散。
在第一次预离心中，使用等体积的PBS(例如，使用2ml PBS稀释大约2ml的血浆)稀释血浆。将稀释液转移至15ml Falcon管中，并在4℃下以2000×g离心30分钟。
对于第二次预离心，将上清液(大约4ml)小心地转移至50ml Falcon管中，并在Sorval离心机中在4℃下以12,000×g离心45分钟。
在分离步骤中，使用P1000移液管将上清液(大约2ml)小心地转移至5.0ml超离心PA薄壁管(Sorvall#03127)中，并使用另外0.5ml PBS填充至最大体积。在4℃下将所述管以110,000×g离心90分钟。
在第一次洗涤中，倒出上清液而不扰乱团块。用1ml PBS将该团块重悬浮或者洗涤，并使用另外4.5ml PBS将所述管填充至最大体积。在4℃下将所述管以110,000×g离心70分钟。通过重复相同的步骤进行第二次洗涤。
通过使用P-1000移液管除去上清液直到所述管底为大约100μlPBS来收集囊泡。用P-200移液管除去大约90μl PBS并丢弃。通过使用P-20移液管轻柔地吸取来收集团块和剩余的PBS。使用另外5μl新鲜PBS从所述干燥管的底部洗出残留的团块，并收集到微离心管中。
实施例4：使用抗体偶联的微球和直接偶联的抗体来分析囊泡
本实施例展示了与抗体偶联的微粒的使用，其中所述的抗体捕获所述囊泡。例如，参见图2A。抗体(检测抗体)与标记物直接偶联，并用于检测捕获囊泡上的生物标志物。
首先，选择抗体偶联的微球集(Luminex，Austin，TX)。所述的微球集可以包含各种抗体，并因此可以进行复用。通过涡旋混超声处理大约20秒使所述微球重悬浮。通过在Startblock(Pierce(37538))中将偶联的微球原液稀释至终浓度为各集100个微球/μL来制备工作微球混合物。50μL工作微球混合物用于各个孔。PBS-1％BSA或PBS-BN(PBS，1％BSA，0.05％叠氮化物，pH7.4)可以用作分析缓冲剂。
将1.2μm Millipore滤板用100μl/孔的PBS-1％BSA(Sigma(P3688-10PAK+0.05％叠氮化钠(S8032)))预润湿，并通过真空歧管(vacuum manifold)吸取。将50μl等份的所述工作微球混合物分配于该滤板(Millipore Multiscreen HTS(MSBVN1250))的合适的孔中。将50μl等份的标准品或样品分配到合适的孔中。覆盖该滤板，并在室温下在平板振动器上孵育60分钟。用密封覆盖所述的滤板，放置在回旋振动器上，并设定在900下持续15-30秒以使所述珠重悬浮。之后，将速度设定在550下持续孵育的时间。
通过真空歧管对上清液进行吸取(在所有的吸取步骤中都低于5英寸汞柱)。将各孔乙用100μl的PBS-1％BSA(Sigma(P3688-10PAK+0.05％叠氮化钠(S8032)))洗涤2次，并通过真空歧管吸取。将微球重悬浮于50μL的PBS-1％BSA(Sigma(P3688-10PAK+0.05％叠氮化钠(S8032)))中。将PE偶联的检测抗体在PBS-1％BSA(Sigma(P3688-10PAK+0.05％叠氮化钠(S8032)))中稀释至4μg/mL(或适当的浓度)。(注：各反应需要50μL的稀释检测抗体。)将50μl等份的经稀释的检测抗体加入到各孔中。覆盖滤板，并在室温下在平板振动器上孵育60分钟。用密封物覆盖所述的滤板，放置在回旋振动器上，并设定在900下持续15-30秒以使所述珠重悬浮。之后，将速度设定在550下持续孵育的时间。通过真空歧管对上清液进行吸取。将各孔用100μl的PBS-1％BSA(Sigma(P3688-10PAK+0.05％叠氮化钠(S8032)))洗涤2次，并通过真空歧管吸取。将微球重悬浮于100μL的PBS-1％BSA(Sigma(P3688-10PAK+0.05％叠氮化钠(S8032)))中。根据所述系统的指南在Luminex分析仪上分析所述的微球。
实施例5：使用抗体偶联的微球和生物素化的抗体来分析囊泡
本实施例展示了与抗体偶联的微粒的使用，其中所述的抗体捕获所述囊泡。抗体(检测抗体)生物化。与抗生蛋白链菌素偶联的标记物用于检测生物标志物。
首先，选择合适的抗体偶联的微球集(Luminex，Austin，TX)。通过涡旋和超声处理大约20秒使所述微球重悬浮。通过在Startblock(Pierce(37538))中将该偶联的微球原液稀释至终浓度为各集50个微球/μL来制备工作微球混合物。(注：每个孔中需要50μL工作微球混合物。)StartBlock中的珠应该封闭30分钟并且不超过1小时。
将1.2μm Millipore滤板用100μl/孔的PBS-1％BSA+叠氮化物(PBS-BN)((Sigma(P3688-10PAK+0.05％叠氮化钠(S8032)))预润湿，并通过真空歧管吸取。将50μl等份的所述工作微球混合物分配于该滤板(Millipore Multiscreen HTS(MSBVN1250))的合适的孔中。将50μl等份的标准品或样品分配到合适的孔中。用密封物覆盖该滤板，并在室温下在滤板振动器上孵育60分钟。将覆盖的滤板放置在回旋振动器上，并设定在900下持续15-30秒以重悬浮所述珠。之后，将速度设定在550下持续孵育的时间。
通过真空歧管对上清液进行吸取(在所有的吸取步骤中都低于5英寸汞柱)。可以使用Pall真空歧管进行吸取。当将该滤板放置在所述歧管上时，将阀门放置在完全关闭(full off)位置处。为了缓慢地吸取，将阀门开放以从所述孔中吸取流体，为了将100μl的样品和珠完全由孔中吸出，需要大约3秒。一旦所述样品抽干，按压歧管上的排空按钮(purgebutton)，从而从滤板释放残留的真空压力。
将各孔用100μl的PBS-1％BSA+叠氮化物(PBS-BN)(Sigma(P3688-10PAK+0.05％叠氮化钠(S8032)))洗涤2次，并通过真空歧管吸取。将所述微球重悬浮于50μL的PBS-1％BSA+叠氮化物(PBS-BN)((Sigma(P3688-10PAK+0.05％叠氮化钠(S8032)))中。
将生物素化的检测抗体在PBS-1％BSA+叠氮化物(PBS-BN)(Sigma(P3688-10PAK+0.05％叠氮化钠(S8032)))中稀释至4μg/mL。(注：各反应需要50μL稀释的检测抗体。)将50μl等份的经稀释的检测抗体加入到各孔中。
用密封物覆盖该滤板，并在室温下在板振荡器上孵育60分钟。将所述板放置在定轨振荡上，并设定在900下持续15-30秒，从而重悬浮所述珠。之后，在孵育的时间内将速度设定在550下。
通过真空歧管对上清液进行吸取。可以使用Pall真空歧管完成吸取。当将该板放置在所述歧管上时，将阀门置于完全关闭(full off)位置处。为了缓慢地吸取，将阀门开放以从孔中吸取流体，为了将100μl的样品和珠完全由孔中吸出，需要大约3秒。一旦全部样品排干，便按压歧管上的清空按钮(purge button)，从而从该板释放残余真空压力。
将各孔用100μl的PBS-1％BSA+叠氮化物(PBS-BN)(Sigma(P3688-10PAK+0.05％叠氮化钠(S8032)))洗涤2次，并通过真空歧管吸取。将所述微球重悬浮于50μl的PBS-1％BSA(Sigma(P3688-10PAK+0.05％叠氮化钠(S8032)))中。
将抗生蛋白链菌素-R-藻红蛋白受体(分子探针1mg/ml)在PBS-1％BSA+叠氮化物(PBS-BN)中稀释至4μg/mL。对各反应使用50μl稀释的抗生蛋白链菌素-R-藻红蛋白。将50μl等份的经稀释的抗生蛋白链菌素-R-藻红蛋白加入到各孔中。
用密封物覆盖该滤板，并在室温下在板振荡器上孵育60分钟。将所述板放置在定轨振荡器上，并设定在900下持续15-30秒，从而重悬浮所述珠。之后，在孵育的时间内将速度设定在550下。
通过真空歧管对上清液进行吸取。可以使用Pall真空歧管完成吸取。当将该板放置在所述歧管上时，将阀门置于完全关闭位置处。为了缓慢地吸取，将阀门开放以从孔中吸取流体，为了将100μl的样品和珠完全由孔中吸出，需要大约3秒。一旦全部样品排干，便按压歧管上的清空按钮，从而从该板释放残余真空压力。
将各孔用100μl的PBS-1％BSA+叠氮化物(PBS-BN)(Sigma(P3688-10PAK+0.05％叠氮化钠(S8032)))洗涤2次，并通过真空歧管吸取。将所述微球重悬浮于100μl的PBS-1％BSA+叠氮化物(PBS-BN)(Sigma(P3688-10PAK+0.05％叠氮化钠(S8032)))中，并根据所述系统指南在Luminex分析仪上进行分析。
实施例6：囊泡从血浆中进行的浓缩
器材与设备：Pall life sciences Acrodisc，25mm注射器式滤器w/1.2um，Versapor膜(无菌)，部件编号：4190；Pierce浓缩器7ml/150K MWCO(分子量截止值)，部件编号：89922；BD注射器式滤器，10ml，部件编号：305482；Sorvall Legend RT Plus系列桌面离心机，具有15ml吊桶式转头；PBS，pH7.4，Sigma号P3813-10PAK，其制备于无菌分子级的水中；共聚物1.7ml微离心管，USA Scientific，编号1415-2500。用于试剂的水是无菌过滤的分子级的水(Sigma，编号W4502)。对受试者血浆的操作在生物安全柜中进行。
程序：
1.对血浆样品的过滤过程
1.1.从-80℃(-65℃至-85℃)冰箱中取出血浆样品。
1.2.在室温的水中解冻样品(10-15分钟)。
1.3.通过从其包装中取出必要数量而准备注射器和滤器。
1.4.拉动内芯以将4mL无菌分子级水吸入所述注射器中。将1.2μm的滤器附着于注射器的顶端并且使内容物通过所述滤器到达所述7ml/150K MWCO Pierce柱上。
1.5.盖上所述柱并且置于所述吊桶离心机中以1000×g在SorvallLegend RT plus离心机中在20℃(16℃-24℃)下离心4分钟。
1.6.当进行离心时，将该滤器从注射器上拆下。随后将内芯从注射器中取出。
1.7.丢弃管的穿流液并且轻柔地在纸巾上轻轻敲打柱以除去任何残余的水分。
1.8.测量并记录所有血浆样品的初始体积。具有低于900μl体积的样品可能不进行处理。
1.9.将开放注射器和滤器置于开放Pierce柱上。在注射器的开口端充以5.2mL的1×PBS并且用移液器将血浆混入PBS三至四次。
1.10.再度置入注射器内芯并且缓慢地压迫该内芯直至所述注射器的内容物已经通过所述滤器进入了所述Pierce柱上。内容物应当逐滴地通过所述滤器。
2.微囊泡浓缩离心方案
2.1.在20℃(16℃-24℃)下以2000×g离心7ml/150K MWCO Pierce柱60分钟或直至体积降至250-300μl。如果需要，以另外15分钟增量进行离心以达到所需体积。
2.2.在离心结束时，在所述柱上用移液器混合15×(避免产生气泡)并且取出体积(300μL或更少)和转移至新的1.7mL共聚物管内。
2.3.所述血浆浓缩物的最终体积取决于血浆的初始体积。如果所述原始血浆体积是1ml，则将血浆浓缩至300μl。如果原始血浆体积低于1ml，则浓缩物体积应与该比率相一致。例如，如果原始体积为900μl，则浓缩物的体积为270μl。所遵循的方程为：x＝(y/1000)×300，其中x是浓缩物的最终体积并且y是初始血浆体积。
2.4.记录所述样品体积并向所述样品加入1×PBS以制备最终样品体积。
2.5.在4℃(2℃至8℃)下储存浓缩的微囊泡样品。
计算：
1.浓缩的血浆样品的最终体积
x＝(y/1000)×300，其中x是浓缩物的最终体积并且y是初始血浆体积。
实施例7：使用磁珠捕获囊泡
使用按照实施例2所述分离的囊泡。将大约40μl的所述囊泡与大约5μg(～50μl)EpCam抗体涂敷的Dynal珠(Invitrogen，Carlsbad，CA)和50μl起始材料块(Starting Block)一起孵育。在45℃下，将所述囊泡和珠在振荡孵育器中进行2小时振荡孵育。将装有Dynal珠的管在磁力分离器上放置1分钟，并除去上清液。将所述的珠洗涤2次，并且每次都除去上清液。将珠洗涤2次，并且每次都弃去上清液。
实施例8：对囊泡中mRNA转录物的检测
使用Qiagen miRneasyTM试剂盒(编号No.217061)，根据制造商的说明书分离来自实施例7的珠结合囊泡的RNA。
在QIAzolTM裂解试剂(Qiagen编号No.79306)中匀浆所述囊泡。在加入氯仿之后，通过离心将匀合物分离成水相和有机相。RNA分配于上部水相中，而DNA分配于中间相中和蛋白质分配于下部有机相或中间相中。对上部水相进行萃取，并加入乙醇从而对于所有超过18核苷酸(nt)的RNA分子提供合适的结合条件。然后，将所述样品施加到RNeasyTM Mini离心柱上，其中全部的RNA结合到膜上，并有效地洗去苯酚和其它污染物。然后，在不含RNA酶的水中洗脱高质量的RNA。
使用Taqman TMPRSS：ERG融合体转录物分析法(Kirsten D.Mertz等Neoplasia.2007年3月；9(3)：200-206.)来测量来自VCAP珠捕获的囊泡的RNA。使用Taqman SPINK1转录物分析法(Scott A.Tomlins等Cancer Cell2008年6月13(6)：519-528)来测量来自22Rv1珠捕获的囊泡的RNA。此外，针对两组囊泡RNA来测量GAPDH转录物(对照转录物)。
较高的CT值表明较低的转录物表达。循环阈值(CT)的1单位的变化等同于2的倍数变化，3单位的CT差异等同于4的倍数变化等等，其可以通过下式计算：2^CT1-CT2.。本实验显示出融合体转录物TMPRSS：ERG表达的CT差异以及使用IgG2阴性对照珠捕获的等同物(图5)。22RV1囊泡中SPINK1转录物的相同比较显示出，对于倍数变化70.5的6.14的CT差异。使用GAPDH的结果是类似的(未显示)。
实施例9：从受试者获取血清样品
血液从受试者(健康受试者和患有癌症的受试者)中采集于EDTA管、柠檬酸盐管或10ml的Vacutainer SST plus血液采集管(BD367985或BD366643，BD Biosciences)中。在采集后2小时内处理血液以进行血浆分离。
将样品在室温下放置至少30分钟，最长2小时。通过在4℃下以1,000-1，300×g离心15-20分钟而完成对血凝块的分离。除去血清并将其以500μl等份分散于500-750μl冷冻管内。在-80℃下储存样本。
在给定的设置(sitting)，抽取的血液量可介于～20至～90ml之间。将来自几个EDTA管的血液汇合并且转移至无RNA酶/DNA酶的50-ml锥底管中(Greiner)，并在Hettich Rotanta460R桌面型离心机内在室温下以1,200×g离心10分钟。将血浆转移至新管中，在所述团块上方留下0.5Gm的固定高度的血浆上清液以避免扰动团块。将血浆等份分样，在各等份间进行颠倒混合，并且存储于-80℃。
实施例10：从人血浆和血清样品分离RNA
在冰上融化400μl的人血浆或血清并且使用等体积的2×变性溶液(Ambion)对其裂解。使用mirVana PARIS试剂盒根据制造商的液体样品方案(Ambion)分离RNA，所述方案经修改从而以等体积的酸-苯酚氯仿(如Ambion试剂盒提供的)提取样品两次。根据制造商的方案使用105μl的Ambion洗脱溶液洗脱RNA。从各柱上回收的洗脱液的平均体积约为80μl0
还使用了所述mirVana PARIS(Ambion)方案的放大版本：在冰上融化10ml的血浆，将2份5-ml的等分试样转移至50-ml的管内，使用等体积的mirVana PARIS2×变性溶液(Ambion)进行稀释，通过涡旋30秒而进行充分混合，并且在冰上孵育5分钟。随后将等体积(10ml)的酸/苯酚/氯仿加至各等分试样中。所得到的溶液进行1分钟的涡旋并且在JA17转子中在20℃下以8,000rpm离心5分钟。重复所述酸/苯酚/氯仿提取3次。所产生的水相体积与1.25倍体积的100％分子纯级乙醇进行充分混合并且以700-μl等分试样依次流过mirVana PARIS柱。根据制造商的方案洗涤所述柱并且以105μl的洗脱缓冲液(95℃)洗脱RNA。使用Nanodrop对总计1.5μl的洗脱液进行定量。
实施例11：使用qRT-PCR对来自血浆和血清的RNA中miRNA水平 的测量
来自给定样品的RNA分离的约～80μl洗脱液的固定体积1.67μlRNA溶液作为输入物用于逆转录(RT)反应中。对于从400-μl血浆或血清样品分离RNA的样品，例如，1.67μl RNA溶液代表了对应于(1.67/80)×400＝8.3μl血浆或血清的RNA。为生成与已知miRNA对应的化学合成的RNA寡核苷酸的标准曲线，在水中制备了不同稀释度的各寡核苷酸从而使进入RT反应的最终输入物具有1.67μl的体积。输入物RNA使用TaqMan miRNA逆转录试剂盒和miRNA特异性茎环引物(Applied BioSystems)在小规模RT反应中逆转录，所述反应由1.387μlH2O、0.5μl10×逆转录缓冲液、0.063μl RNA酶抑制剂(20单位/μl)、0.05μl100mM dNTP(含dTTP)、0.33μl Multiscribe逆转录酶以及1.67μl输入物RNA组成；除所述输入物RNA之外的成分可以制备成为较大体积的主混合物，反应使用Tetrad2Peltier热循环仪(BioRad)在16℃下30分钟、42℃下30分钟以及85℃下5分钟而进行。实时PCR在AppliedBioSystems7900HT热循环仪上进行，95℃下10分钟，继之以40个循环的95℃下15秒与60℃下1分钟。使用SDS相对定量软件，版本2.2.2(Applied BioSystems)分析数据，其使用自动Ct设置用于指定基线和Ct测定的阈值。
还可修改所述方案以包括预扩增步骤，诸如用于检测miRNA。将1.25-μl未稀释RT产物的等分试样与3.75μl的预扩增PCR试剂[每次反应包含2.5μl的TaqMan PreAmp主混合物(2×)和1.25μl的0.2×TaqManmiRNAAssay(稀释于TE中)]混合以产生5.0-μl预扩增PCR，其在Tetrad2Peltier热循环仪(RioRad)上通过加热至95℃10分钟，继之以14个循环的95℃下15秒和60℃下4分钟而进行。稀释所述预扩增PCR产物(通过向所述5μl的预扩增反应产物中加入20μl的H2O)，随后将2.25μl的所述稀释物引入所述实时PCR中并根据所述进行。
实施例12：从囊泡提取微RNA
根据本文所述，微RNA从分离自受试者样品的囊泡中提取。例如，参见实施例6。本文中给出了用于分离和浓缩囊泡的方法。本实施例中的方法也可用于从受试者样品中分离微RNA而无需先行分离囊泡。
使用Trizol的方案
本方案将来自Qiagen Inc.，Valencia CA的QIAzol裂解试剂和RNeasy Midi试剂盒用于从浓缩的囊泡中提取微RNA。所述方法的步骤包括：
1.向50μl囊泡浓缩物中加入2μl的RNA酶A，在37℃下孵育20分钟。
2.加入700μl的QIAzol裂解试剂，涡旋1分钟。加入QIAzol之后将25fmol/μL的秀丽隐杆线虫微RNA(1μl)掺入样品中，为各总样品制备75fmol/μL的掺入物(合计三个等份)。
3.在55℃下孵育5分钟。
4.加入140μl氯仿并且剧烈振荡15秒。
5.在冰上冷却2-3分钟。
6.在4℃下以12,000×g离心15分钟。
7.将水相(300μL)转移至新管内并且加入1.5倍体积的100％EtOH(即，450μL)。
8.将最多4ml样品吸入置于15ml收集管的RNeasy Midi离心柱中(将来自3份50μl浓缩物的裂解物合并)。
9.在室温下以2700×g离心5分钟。
10.从所述离心中弃去穿流液(flowthrough)。
11.将1ml的RWT缓冲液加入柱内并且在室温下以2700×g离心5分钟。不使用Midi试剂盒中提供的RW1缓冲液。RW1缓冲液可洗去miRNA。RWT缓冲液在来自Qiagen Inc的Mini试剂盒中提供。
12.弃去穿流液。
13.将1ml的RPE缓冲液加至所述柱上并且在室温下以2700×g离心2分钟。
14.重复步骤12和13。
16.将柱置入新的15ml收集管中并且加入150ul洗脱缓冲液。在室温下孵育3分钟。
17.在室温下以2700×g离心3分钟。
18.涡旋样品并且转移至1.7mL管内。将提取的样品存储于-80℃。
改良的Trizol方案
1.添加Epicentre RNA酶A至229μg/ml的终浓度(，ancompany，Madison，WI)。(例如，向150ul的浓缩物中，加入450μl PBS和28.8μl Epicentre RNA酶A[5μg/μi])。简短涡旋。在37℃下孵育20min。使用反移液操作，以100μl的增量等分“小样(babies)”。
2.将离心温度设定为4℃。
3.将750μl的Trizol LS加入每个100μl样品中，并且立即涡旋。
5.在室温(RT)下，在工作台上孵育5min。
6.在MixMate中，在RT和1400rpm下，将所有样品涡旋30min。在涡旋的同时，将BCP相分离剂加入平板上。
7.将试管简短离心。将样品转移至收集微管架。
8.将150μl BCP加入平板中的样品中。将平板盖上，并且强烈振荡15sec。
9.在RT下孵育3min。
10.在4℃和6,000xg下离心15min。将离心温度重新设定为24℃(RT)。
11.将500ul100％EtOH加入新的S-block的合适孔中。将200μl水相转移至新的S-block中，通过吸移10X来混合水/EtOH。
12.简短离心。
13.将RNeasy96(Qiagen，Inc.，Valencia，CA)平板置于新的S-block的顶端。将水/EtoH样品混合物吸移至RNeasy96平板的孔中。用AirPore胶带将RNeasy96平板密封。
14.在RT和6000rpm(～5600xg)下旋转4min。避免温度低于24℃。
15.通过丢弃穿流液清空S-block，并且除去AirPore胶带。
14.将700μl Buffer RPE加入平板中，用AirPore胶带密封，并且在6,000和RT下离心4min。清空S-block，并且除去AirPore胶带。
15.将500μl Buffer RPE加入平板中，用AirPore胶带密封，并且在6,000和RT下离心4min。清空S-block，并且除去AirPore胶带。
16.将再一个500μl Buffer RPE加入平板中，用AirPore胶带密封，并且在6,000和RT下离心10min。清空S-block，并且除去AirPore胶带。
17.将Rneasy96平板置于干净的洗脱微管架上。吸移30μl无RN酶的水至Rneasy96平板的柱上。用AirPore胶带密封。
18.使水在柱上停留5min。
19.将柱在6,000rpm下离心4min以洗脱RNA。用洗脱微管帽将微管盖上。将小样集合在一起。
20.存储于-80℃
使用MagMax的方案
本方案将来自Applied Biosystems/Ambion，Austin，TX的MagMAXTM RNA分离试剂盒用于从浓缩的囊泡提取微RNA。所述方法的步骤包括：
1.加入700ml的QIAzol裂解试剂，并且涡旋1分钟。
2.在室温下于实验台上孵育5分钟。
3.加入140μl氯仿并且剧烈振荡15秒。
4.在实验台上孵育2-3分钟。
5.在4℃下以12,000×g离心15分钟。
6.将水相转移至深孔板中并且加入1.25倍体积的100％异丙醇。
7.振荡MagMAXTM结合珠孔。将10μl的RNA结合珠吸入各孔。
8.搜集两个洗脱板和两个另外的深孔板。
9.将一个洗脱板标为“Elution”并将另一个标为“Tip Comb”。
10.将一个深孔板标为“lst Wash2”并将另一个标为“2nd Wash2”。
11.在两个Wash2深孔板中填充150μl的Wash2，确保事前加入乙醇进行洗涤。向与样品数量相同的孔中进行填充。
12.在MagMax Particle Processor上选择适当的收集程序。
13.按下启动并且加载各适当的板。
14.将样品转移至微离心管。
15.涡旋并且存储于-80℃。样品中应可见残留的珠。
实施例13：微RNA阵列
可使用阵列形式(包括高密度和低密度阵列)分析样品中的微RNA水平。阵列分析可用于在所需的设定下发现差异表达，例如，通过分析多种miR在两个样品中的表达并且进行统计分析以确定那些在所述样品间差异表达的并且可由此而用于生物印记中的miR。所述阵列还可用于鉴定在单一样品中一种或多种微RNA的存在或水平，用以通过鉴定所述样品中的生物印记而表征表型。本实施例描述了可商购获得的系统，其可用于实施本发明的方法。
Taqman低密度阵列
根据需要将TaqMan低密度阵列(TLDA)miRNA卡用于比较各个不同样品组中miRNA的表达。使用来自Applied Biosystems，Foster City，CA的
Figure BPA0000184824780002881
微RNA分析和阵列系统收集和分析所述miRNA。根据制造商提供的MegaplexTM Pools Quick Reference Card方案使用AppliedBiosystems的
Figure BPA0000184824780002882
人微RNA阵列。
Exiq on mIRCURY LNA微RNA
根据需要将Exiqon miRCURY LNATM Universal RT microRNA PCRHuman Panels I和II(Exiqon，Inc，Woburn，MA)用于比较各个不同样品组中的miRNA表达。所述Exiqon384孔平板包括750种miR。将样品针对对照引物进行归一化，所述对照引物针对来自Universal cDNA合成试剂盒(UniSp6CP)的合成RNA掺入物(spike-in)。将结果针对板间校准探针进行归一化。
对任一系统，实施了质量控制标准(quality control standards)。将各个探针在对于各指标的三个数据集上的归一化的值加以平均。具有高于20％的平均CV％的探针不用于分析。对结果进行配对t检验以发现两个样品组间差异表达的miR。使用Benjamini和Hochberg错误发现率检验校正P值。使用GeneSpring软件(Agilent Technologies，Inc.，Santa Clara，CA)分析结果。
实施例14：囊泡中的微RNA谱
按照实施例1-3所述，通过超离心由22Rvl、LNCaP、Vcap和正常血浆(由16名供者汇合得到)收集囊泡。使用Exiqon miR分离试剂盒(编码No.300110、300111)提取RNA。按照BCA分析测定使用等量的囊泡(30μg)。
将等体积(5μl)用于微RNA的逆转录反应。将该逆转录酶反应物在81μl的不含核酸酶的水中稀释，然后向各单独的miR分析中加入9μl的这一溶液。据发现MiR-629仅在PCa(前列腺癌)囊泡中表达，并且在正常的血浆囊泡中事实上不可检测。据发现MiR-9在所有的PCa细胞系中高度过表达(根据拷贝数测量，超出正常～704倍)，而在正常的血浆囊泡中具有极低的表达。
实施例15：磁性EpCam捕获的囊泡的微RNA谱
将实施例7的珠结合囊泡置于QIAzolTM Lysis Reagent(Qiagen编号79306)中。加入等份的125fmol秀丽隐杆线虫(c.elegans)miR-39。使用Qiagen miRneasyTM试剂盒(编号217061)，根据制造商的说明分离RNA，并在30ul不含RNA酶的水中洗脱。
使用Veriti96孔热循环仪，将10μl纯化的RNA放置到miR-9、miR-141和miR-629的预扩增反应物中。使用1：5稀释的预扩增溶液建立用于miR9(ABI4373285)、miR-141(ABI4373137)和miR-629(ABI4380969)以及秀丽隐杆线虫miR-39(ABI4373455)的qRT-PCR反应。将各样品的结果相对秀丽隐杆线虫的结果进行归一化。
实施例16：CD9捕获的囊泡的微RNA谱
使用CD9涂覆的Dynal珠(Invitrogen，Carlsbad，CA)替代实施例15中使用的EpCam涂覆的珠。将得自前列腺癌受试者的囊泡、LNCaP或正常的纯化的囊泡与CD9涂覆的珠一起孵育，并按照实施例15所述分离RNA。通过qRT-PCR检测miR-21和miR-141的表达，并且所得结果描绘于图6中。
实施例17：使用过滤模块进行的囊泡分离
将6mL PBS加入1mL血浆中。随后通过1.2微米(μm)Pall注射器滤器将所述样品直接置于100kDa MWCO(Millipore，Billerica，MA)、具有150kDa MWCO的7ml柱(
Figure BPA0000184824780002901
Rockford，IL)、具有100kDaMWCO的15ml柱(Millipore，Billerica，MA)或具有150kDa MWCO的20ml柱(Rockford，IL)中。
管进行离心60至90分钟直至体积约为250μl0收集渗余物并加入PBC以将所述样品调至最高300μl。随后将50μl的样品用于进一步囊泡分析，诸如进一步描述于以下实施例中的分析。
实施例18：对使用滤器而分离的囊泡进行的多重分析
按照实施例17所述，将使用本文中所述的方法得到的囊泡样品用于多重分析。例如，参见以下的实施例23-24。所述捕获抗体是CD9、CD63、CD81、PSMA、PCSA、B7H3和EpCam。所述检测抗体针对生物标志物CD9、CD81和CD63或者B7H3和EpCam。
实施例19：囊泡的流式细胞术分析
使用MoFlo XDP(Beckman Coulter，Fort Collins，CO，USA)分析了纯化的血浆囊泡并且使用Summit4.3软件(Beckman Coulter)分析中位荧光强度。使用抗体直接标记囊泡，或可以加入珠或微球(如，包括BDFACS的7色设置中的磁性聚苯乙烯，编号335775)。可使用针对以下囊泡抗原的结合剂检测囊泡：CD9(小鼠抗人CD9，MAB1880，R＆DSystems，Minneapolis，MN，USA)、PSM(小鼠抗人PSM，sc-73651，Santa Cruz，Santa Cruz，CA，USA)、PCSA(小鼠抗人前列腺细胞表面抗原，MAB4089，Millipore，MA，USA)、CD63(小鼠抗人CD63，556019，BD Biosciences，San Jose，CA，USA)、CD81(小鼠抗人CD81，555675，BD Biosciences，San Jose，CA，USA)、B7-H3(山羊抗人B7-H3，AF1027，R＆D Systems，Minneapolis，MN，USA)、EpCAM(小鼠抗人EpCAM，MAB9601，R＆D Systems，Minneapolis，MN，USA)。可使用针对所需囊泡抗原的荧光标记抗体检测囊泡：例如，FITC、藻红蛋白(PE)和Cy7通常用于标记所述抗体。
为使用多重微球捕获抗体，所述微球可获自Luminex(Austin，TX，USA)并且使用获自Pierce Thermo的Sulfo-NHS和EDC(分别为编号No.24510和No.22981，Rockford，Ill，USA)以micros偶联于所需抗体。
在室温下将纯化的囊泡(10ug/ml)与5，000个微球进行1小时振荡孵育。在1700rpm下使用FACS缓冲液(0.5％FBS/PBS)洗涤所述样品10分钟。在室温下将所述检测抗体按制造商推荐浓度进行一小时振荡孵育。在使用FACS缓冲液以1700mm进行10分钟的另一次洗涤之后，将所述样品重悬浮于100ul FACS缓冲液中并在FASC仪上运行。
此外，当使用微球检测囊泡时，被标记的囊泡可根据其检测抗体成分而分选入不同管内。例如，通过使用FITC或PE标记的微球，第一管包含不具检测剂的微球群体，第二管包含具有PE检测剂的群体，第三管包含具有FITC检测剂的群体，并且第四管包含具有PE和FITC检测剂的群体。所分选的囊泡群体可受到进一步的分析，例如，通过检测有效负载(诸如mRNA、微RNA或蛋白质内容物)而进行分析。
图7示出了使用MoFlo XDP进行的囊泡分离和鉴定。在这一组实验中，存在约3000个仅具缓冲剂的触发事件(即约为大囊泡大小的微颗粒)。存在约46,000个具未染色囊泡的触发事件(43,000个大小足以散射激光的囊泡)。存在500,000个具染色囊泡的触发事件。使用针对四跨膜蛋白CD9、CD63和CD81的检测剂(均以FITC进行标记)检测了囊泡。较小囊泡可在其受到检测剂染色时被检测到。
通过对特定的囊泡群体的分选而进行的物理分离有助于其它研究，诸如对部分或完全纯化的囊泡群体的微RNA分析。
实施例20：囊泡的抗体检测
使用本文所述的技术，通过使用抗体涂敷的珠检测受试者样品中的囊泡来评估所述样品中的囊泡。使用了以下总体方案：
a.在护理地点(如，临床诊所、医师工作场所、医院)从受试者抽取血液。
b.所述血液的血浆部分用于进一步的分析。
c.为除去大颗粒和分离包含囊泡的部分，对血浆样品进行过滤(例如，使用0.8或1.2微米(μm)的注射器式滤器)并随后通过尺寸排阻柱(如具有150kDa的分子量截留值)。图8A中示出了总体的图解。根据图8B所示，过滤相对于超离心是优选的。不受理论的束缚，高速离心可去除弱锚定于膜中的蛋白质靶标，这与更为牢固地锚定于膜中的四跨膜蛋白相反，并且高速离心可减少囊泡中的细胞特异性靶标，则其在对所述囊泡的生物印记的后续分析中将不被检测。
d.将所述囊泡部分与偶联于针对目标标志物的“捕获”抗体的珠一直进行孵育。随后使用经标记的“检测”抗体(如藻红蛋白或FITC偶联的抗体)对捕获的囊泡加标签。所述珠也可进行标记。
e.检测所述样品中捕获和加标签的囊泡。可根据图8C所示检测荧光标记的珠和检测抗体。标记的珠和标记的检测抗体的使用允许通过捕获抗体对具有与其结合的囊泡的珠进行评估。
f.对数据进行分析。可针对特定捕获抗体的中位荧光强度(MFI)设定阈值。该捕获抗体高于所述阈值的读数可表示特定的表型。作为说明性实例，对于癌症标志物的捕获抗体来说，高于阈值的MFI可表示癌症在受试者样品中的存在。
在图8中，所述珠816流过毛细管811。不同波长的双重激光器812的使用允许在检测器813处独立地检测捕获抗体818(通过源自所述珠的荧光信号)以及中位荧光强度(MFI)(由标记的检测抗体819产生)。如所示的，与不同目标捕获抗体偶联的标记的珠(各珠以不同荧光物进行标记)的使用允许在单一分析中对不同囊泡817群体进行多重分析。激光1815允许对珠类型(即，捕获抗体)进行检测，而激光2814允许对检测抗体进行测量，其可包括一般囊泡标志物，诸如四跨膜蛋白(包括CD9、CD63和CD81)。不同珠群体和激光的使用允许在单一分析中对多种不同的囊泡群体同时进行多重分析。
实施例21：前列腺癌的检测
高质量训练集样品获自商业供应商。所述样品包含来自42例正常前列腺、42例PCa和15例BPH受试者的血浆。所述PCa样品包括4例III期和其余的II期。所述样品在全部实验室工作完成之前处于盲法中。
通过过滤以除去超过1.5微米的颗粒，继之使用中空纤维膜管进行柱离心和纯化，从而从所述样品获得囊泡。使用如上文所述的基于珠的多重分析系统分析所述样品。
分析了针对以下蛋白质的抗体：
a.一般囊泡(MV)标志物：CD9、CD81和CD63
b.前列腺MV标志物：PCSA
c.癌症相关MV标志物：EpCam和B7H3
样品被要求通过以下质量测试：如果多重中位荧光强度(MFI)PSCA+MFI B7H3+MFI EpCam＜200，则样品由于缺乏高于背景的信号而废弃。在所述训练集中，6个样品(3个正常样品和3个前列腺癌样品)未达到足够的质量评分而被排除。MFI的上限还进行了如下设定：如果EpCam的MFI＞6300，则测试超出该上限评分并且样品视为非癌症(即，对于所述测试目的的“阴性”)。
根据对6种针对训练集蛋白质的抗体的MFI评分结果对所述样品进行分类，其中必须满足以下条件以使样品归类为PCa阳性：
a.一般MV标志物的平均MFI＞1500
b.PCSA MFI＞300
c.B7H3MFI＞550
d.EpCam MFI介于550与6300之间
使用所述84个正常和PCa训练数据样品，所述测试对于PCA相对正常样品被发现具有98％的灵敏度和95％的特异性。参见图9A。图9B中示出了与正常相比PCa样品提高的MFI。与传统PSA和PCA3测试相比，本实施例中的PCa测试可在每1000位筛查的正常男性中使220位男性免受不必要的活组织切片检查之苦。
实施例22：微球囊泡前列腺癌分析方案
在本实施例中，囊泡PCa测试是用于检测蛋白质生物标志物集的基于微球的免疫分析，所述蛋白质生物标志物存在于来自患有前列腺癌受试者的血浆的囊泡上。所述测试使用针对下列蛋白质生物标志物的特异性抗体：CD9、CD59、CD63、CD81、PSMA、PCSA、B7H3和EpCAM。通过抗体涂覆的微球捕获囊泡后，将藻红蛋白标记的抗体用于检测囊泡特异性生物标志物。根据这些抗体与来自受试者血浆的囊泡的结合水平进行对前列腺癌存在与否的确定。
按照以上所述分离囊泡。
微球
将特定抗体与微球(Luminex)相偶联，之后将所述微球组合以制备微球主混合物，其由L100-C105-01、L100-C115-01、L100-C119-01、L100-C120-01、L100-C122-01、L100-C124-01、L100-C135-01以及L100-C175-01组成。
Figure BPA0000184824780002941
Classification Calibration MicrospheresL100-CAL1(Luminex)作为设备校准试剂用于Luminex LX200仪器。
Figure BPA0000184824780002951
Reporter Calibration Microspheres L100-CAL2(Luminex)作为设备报告校准试剂用于Luminex LX200仪器。
Figure BPA0000184824780002952
ClassificationControl Microspheres L100-CON1(Luminex)作为设备控制试剂用于Luminex LX200仪器。
Figure BPA0000184824780002953
Reporter Control MicrospheresL100-CON2(Luminex)作为报告控制试剂用于Luminex LX200仪器。
捕获抗体
在本实施例中，将下列抗体用于涂覆Luminex微球以通过结合囊泡上的其对应蛋白质靶标而捕获特定的囊泡群体：a.小鼠抗人CD9单克隆抗体是IgG2b，其用于涂覆微球L100-C105以制备*EPCLMACD9-C105；b.小鼠抗人PSMA单克隆抗体是IgGl，其用于涂覆微球L100-C115以制备EPCLMAPSMA-C115；c.小鼠抗人PCSA单克隆抗体是IgGl，其用于涂覆微球L100-C119以制备EPCLMAPCSA-C119；d.小鼠抗人CD63单克隆抗体是IgGl，其用于涂覆微球L100-C120以制备EPCLMACD63-C120；e.小鼠抗人CD81单克隆抗体是IgGl，其用于涂覆微球L100-C124以制备EPCLMACD81-C124；f.山羊抗人B7-H3单克隆抗体是IgG纯化抗体，其用于涂覆微球L100-C125以制备EPCLGAB7-H3-C125；以及g.小鼠抗人EpCAM单克隆抗体是IgG2b纯化抗体，其用于涂覆微球L100-C175以制备EPCLMAEpCAM-C175。
检测抗体
下列藻红蛋白(PE)标记抗体在本分析中用作检测探针：a.EPCLMACD81PE：小鼠抗人CD81PE标记抗体是IgGl抗体，其用于检测捕获囊泡上的CD81；b.EPCLMACD9PE：小鼠抗人CD9PE标记抗体是IgGl抗体，其用于检测捕获囊泡上的CD9；c.EPCLMACD63PE：小鼠抗人CD63PE标记抗体是IgGl抗体，其用于检测捕获囊泡上的CD63；d.EPCLMAEpCAMPE：小鼠抗人EpCAMPE标记抗体是IgGl抗体，其用于检测捕获囊泡上的EpCAM；e.EPCLMAPSMAPE：小鼠抗人PSMA PE标记抗体是IgGl抗体，其用于检测捕获囊泡上的PSMA；f.EPCLMACD59PE：小鼠抗人CD59PE标记抗体是IgGl抗体，其用于检测捕获囊泡上的CD59；以及g.EPCLMAB7-H3PE：小鼠抗人B7-H3PE标记抗体是IgGl抗体，其用于检测捕获囊泡上的B7-H3。
试剂制备
抗体纯化：表12中的下列抗体来自销售商并且根据下列方案进行纯化和调节至所需工作浓度。
表12：用于PCa分析的抗体
Figure BPA0000184824780002961
抗体纯化方案：使用来自Pierce的蛋白质G树脂(Protein G spin kit，产品号89979)纯化抗体。将由过滤的P-200吸头所制备的微型色谱柱用于纯化。
使用来自所述Pierce试剂盒的100μl缓冲液将100μl的蛋白质G树脂加载至各微型柱内。在等候数分钟以使所述树脂沉降后，在需要时使用P-200移液器(Pipettman)施加气压以排干缓冲液，而确保该柱不会被干燥。使用0.6ml的结合缓冲液(pH7.4，100mM磷酸盐缓冲液，150mM NaCl；(Pierce，产品号89979))平衡该柱。将抗体施用于该柱(＜1mg的抗体加载至该柱)。使用1.5ml结合缓冲液洗涤该柱。准备了5个管(1.5ml微离心管)并将10μl中和溶液(Pierce，产品号89979)应用于各管。使用来自所述试剂盒的洗脱缓冲液将抗体洗脱至所述5个管的各管内，每管100ul(总计500μl)。使用Nanodrop(Thermo scientific，Nanodrop1000分光光度计)在280nm下测量各级分的相对吸光度。选择具有最高OD读数的级分用于下游使用。使用Pierce Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette(Pierce，产品号66333，3KDa截止值)以0.25升PBS缓冲液透析所述样品。在4℃下连续的搅拌情况下，每2小时更换缓冲液，最少进行三次更换。随后将所透析样品转移至1.5ml微离心管内，并且可进行标识并存储于4℃(短期)或-20℃(长期)下。
微球工作混合物组装：微球工作混合物MWM101包括表13中的前四排的抗体、微球和涂覆微球。
表13：抗体-微球组合
Figure BPA0000184824780002971
根据下列方案使用上文所列的其各自对应抗体涂覆微球。
用于蛋白质与羧化微球的两步碳二亚胺偶联的方案：在本过程中所述微球应受到保护以免于长时间暴露于光线下。根据随所述微球(xMAPtechnologies，MicroPlex TM Microspheres)提供的产品信息页中所述的指示重悬浮未偶联原料微球。将5×106个原料微球转移至USA Scientific1.5ml微离心管中。通过在室温下以≥8000×g进行1-2分钟的微离心而沉淀原料微球。除去上清液并通过涡旋和超声处理约20秒钟将沉淀的微球重悬浮于100μl的dH2O中。通过在室温下以≥8000×g进行1-2分钟的微离心而沉淀微球。除去上清液并通过涡旋和超声处理(Branson1510，Branson ULTrasonics Corp.)约20秒钟将经清洗的微球重悬浮于80μl的100mM磷酸二氢钠，pH6.2中。将10μl的50mg/ml Sulfo-NHS(Thermo Scientific，编号24500)(稀释于dH2O中)加至所述微球并通过涡旋轻柔地混合。将10μl的50mg/ml EDC(Thermo Scientific，编号25952-53-8)(稀释于dH2O中)加至所述微球并通过涡旋轻柔地混合。在室温下孵育所述微球20分钟并以10分钟的间隔通过涡旋轻柔地混合。通过在室温下以≥8000×g进行1-2分钟的微离心而沉淀激活的微球。除去上清液并通过涡旋和超声处理约20秒钟将所述微球重悬浮于250μl的50mM MES，pH5.0(MES，Sigma，编号M2933)中。(仅PBS-1％BSA+叠氮化物(PBS-BN)((Sigma(P3688-10PAK+0.05％叠氮化钠(S8032)))应作为分析缓冲液以及洗涤缓冲液使用。)随后通过在室温下以≥8000×g进行1-2分钟的微离心而沉淀所述微球。
除去上清液并通过涡旋和超声处理约20秒钟将所述微球重悬浮于250μl的50mM MES，pH5.0(MES，Sigma，编号M2933)中。(仅PBS-1％BSA+叠氮化物(PBS-BN)((Sigma(P3688-10PAK+0.05％叠氮化钠(S8032)))应作为分析缓冲液以及洗涤缓冲液使用。)随后通过在室温下以≥8000×g进行1-2分钟的微离心而沉淀所述微球，由此而完成50mM MES，pH5.0进行的两次洗涤。
除去上清液并通过涡旋和超声处理约20秒钟将激活和洗涤的微球重悬浮于100μl的50mM MES，pH5.0中。将125、25、5或1μg量的蛋白质加至重悬浮的微球。(注：可在1至125μg范围内进行滴定以测定各具体偶联反应的最佳蛋白质量。)使用50mM MES，pH5.0将总体积调至500μl。通过涡旋混合偶联反应物并将其在室温下混合(通过在Labquake rotator，Barnstead上进行旋转)下孵育2小时。通过在室温下以≥8000×g进行1-2分钟的微离心而沉淀偶联的微球。除去上清液并通过涡旋混合和超声处理约20秒钟将所述沉淀的微球重悬浮于500μl的PBS-TBN中。(可针对使用的具体试剂、分析条件、复用水平等等而优化浓度。)
所述微球在室温下伴随混合(通过在Labquake rotator，Bamstead上进行旋转)孵育30分钟。通过在室温下以≥8000×g进行1-2分钟的微离心而沉淀偶联的微球。除去上清液并通过涡旋和超声处理约20秒钟将所述微球重悬浮于1ml的PBS-TBN中。(每次进行样品、检测抗体或SA-PE添加时，使用密封物和遮光物(诸如铝箔)覆盖所述平板，将其置于回旋振动器上，并设定在900下持续15-30秒以重悬浮所述珠。之后，应将速度设定在550下持续孵育的时间)。
通过以≥8000×g进行1-2分钟的微离心而沉淀所述微球。除去所述上清液并通过涡旋和超声处理约20秒钟将所述微球重悬浮于1ml的PBS-TBN中。通过以≥8000×g进行1-2分钟的微离心而沉淀所述微球(得到使用1ml PBS-TBN进行的总计两次洗涤)。
微球分析方案：根据实施例4中描述的使用多种藻红蛋白检测抗体的制剂。在Luminex分析仪(Luminex200，xMAP technologies)上根据系统手册(高PMT设置)分析100μl。
决策树：图10中的决策树用于评估来自所述微球分析的结果以确定受试者是否患有癌症。建立MFI的阈限并根据所述抗体的MFI得分的结果对样品分类，从而确定样品是否具有足够的信号用于实施分析(如，对于分析是有效样品或者对于进一步分析是无效样品，在该情况下可获取第二受试者样品)以及所述样品是否是PCa阳性的。图10示出了使用以PCSA、PSMA、B7-H3、CD9、CD81和CD63获得的MFI的决策树。如果所述MFI处于预设阈值(TH)的标准差之内，则将样品归类为不确定。在该情况下，可获取第二受试者样品。为进行验证，当使用单个四跨膜蛋白捕获囊泡并且使用全部四跨膜蛋白进行标记时，所述样品必须具有足够的信号。如果所述前列腺特异性标志物(PSMA或PCSA)中任一被视作阳性并且所述癌症标志物(B7-H3)也被视作阳性的情况下，通过了验证的样品称为阳性。
结果：参见实施例23。
实施例23：微球囊泡PCa分析性能
在本实施例中，所述囊泡PCa测试是用于检测一组蛋白质生物标志物的基于微球的免疫分析，所述蛋白质生物标志物存在于来自患有前列腺癌的受试者的血浆的囊泡上。测试类似于实施例22的测试进行，其具有下文所示的改动。
所述测试使用设计用于检测循环微囊泡的多重免疫分析。所述测试使用PCSA、PSMA和B7H3以捕获存在于受试者样品(诸如血浆)中的微囊泡并且使用CD9、CD81和CD63以检测所捕获的微囊泡。这一分析的结果是由对微囊泡(所述微囊泡包含该微囊泡上的单个捕获蛋白质和检测蛋白质)的抗体捕获和荧光标记的抗体检测所产生的中位荧光强度(MFI)。如果含PSMA或PCSA及B7H3蛋白的微囊泡的MFI水平超过经验确定的阈值，则根据这一测试样品为“阳性”。用于确定阈值的方法呈现于2011年4月6日提交的并且发明名称为“Circulating Biomarkersfor Disease”的国际专利申请系列No.PCT/US201I/031479的实施例33中，该申请通过引用全部并入本文。如果这两种微囊泡捕获类别中的任意一种表现出低于经验确定阈值的MFI水平，则将样品确定为“阴性”。或者，如果由于MFI值不符合特定的阈值或者平行测定的数据表现出过大的统计差异而使样品MFI不能明确地产生阳性或阴性结果，则报告“不明确”的结果。对这一测试的“不可评估”的说明表示该受试者样品包含对于分析而言不充分的微囊泡量。用于测定经验获得的阈值的方法参见国际专利申请系列No.PCT/US201I/031479的实施例33。
所述测试使用针对下列蛋白质生物标志物的特异性抗体：如实施例22中的CD9、CD59、CD63、CD81、PSMA、PCSA和B7H3。根据表14所概述的，设定决策规则以用于确定样品是否称为阳性、阴性或不明确。还参见实施例22。对于被称为阳性的样品，重复进行的测试必须超过针对四跨膜蛋白标志物(CD9、CD63、CD81)、前列腺标志物(PSMA或PCSA)和B7H3确定的全部四个MFI截止值。如果来自PSMA和PCSA的三个重复测试中的两种或来自B7H3抗体的三个重复测试中的任意一个跨越了MFI截止值，则样品被称为不明确的。如果四跨膜蛋白标志物(CD9、CD63和CD81)、前列腺标志物(PSMA或PCSA)、B7H3中的至少一种低于MFI截止值，则样品被称为阴性的。
表14：各捕获抗体的MFI参数
Figure BPA0000184824780003011
将所述囊泡PCa测试与通过活组织切片检查而确认患有或未患Pca的296位受试者的同龄组的提高的PSA进行比较。图11中示出了所述结果的ROC曲线。根据显示，囊泡PCa测试的曲线下面积(AUC)为0.94，而相同样品上提高的PSA的AUC仅为0.68。PCa样品很可能由于高PSA值而被发现。因此这一群体受到倾向于PSA的曲解，这导致了比真实临床情况更高的AUC。
进一步在933位受试者血浆样品的群体组上进行了囊泡PCa测试。结果总结于表15中。
表15：囊泡PCa测试在933位受试者同龄组上的性能
真阳性 409
真阴性 307
假阳性 50
假阴性 72
不可评估 63
不明确 32
总计 933
灵敏度 85％
特异性 86％
精确性 85％
不可评估率 8％
不明确率 5％
如表15中示出的，囊泡PCa测试以86％的特异性水平实现了85％的灵敏度水平，达到了85％的精确性。与之对比，PSA在85％的灵敏度下具有约55％的特异性，并且PSA在86％的特异性下具有约5％的灵敏度。参见图11。933例样品中约12％为不可评估的或不明确的。可重收集并且重新评估来自所述受试者的样品。囊泡PCa测试对于所述933例样品具有0.92的AUC。
实施例24：用于检测前列腺癌的囊泡蛋白阵列
在本实施例中，通过使用蛋白质阵列(更具体而言，抗体阵列)检测存在于来自患前列腺癌受试者的血浆的囊泡上蛋白质生物标志物集而实施囊泡PCa测试。所述阵列包含对下列蛋白质生物标志物特异性的捕获抗体：CD9、CD59、CD63、CD81。根据上文所述分离囊泡，如，实施例6中。在对来自存在PCa风险的男性(诸如超过50岁的男性)的血浆的囊泡进行过滤和分离之后，血浆样品与携带各种捕获抗体的阵列一起孵育。根据针对PSMA、PCSA、B7H3和EpCAM的荧光标记检测抗体的结合水平进行前列腺癌存在与否的确定，所述抗体与来自受试者血浆的杂交于所述阵列的囊泡相结合。
在第二种阵列形式中，囊泡从血浆中分离并与包含CD9、CD59、CD63、CD81、PSMA、PCSA、B7H3和EpCAM的阵列杂交。使用以Cy3和/或Cy5标记的非特异性囊泡抗体对捕获的囊泡加标签。检测荧光。取决于结合的模式，进行前列腺癌存在与否的确定。
实施例25：使用miR区分BPH和PCa
在Exiqon mIRCURY LNA microRNA PCR系统组上分析来自9位正常男性个体和9位患有3期前列腺癌的个体的血浆源囊泡的RNA。Exiqon384孔板组测量750种miR。将样品相对于用于Universal cDNA合成试剂盒的合成RNA掺入物(spike-in)的对照引物进行归一化。将各个探针在各适应症(indication)(BPH或PCa)的三个数据集上的归一化值加以平均。具有高于20％的平均CV％的探针不用于分析。
对所述结果的分析揭示了与3期前列腺癌样品相比在BPH样品中2倍或更高地过表达的多种微RNA。这些miR包括：hsa-miR-329、hsa-miR-30a、hsa-miR-335、hsa-miR-152、hsa-miR-151-5p、hsa-miR-200a和hsa-miR-145，如表16中所示出的：
表16：在BPH中相对于PCa过表达的miR
BPH中相对于PCa过表达 倍数变化
hsa-miR-329 12.32
hsa-miR-30a 6.16
hsa-miR-335 6
hsa-miR-152 4.73
hsa-miR-151-5p 3.16
hsa-miR-200a 3.16
hsa-miR-145 2.35
实施例26：对照和PCa样品中的miR-145
图12示出了在对照和前列腺癌样品中miR-145的比较。如实施例12中所述收集RNA。对照包括PSA＜4ng/ml和良性直肠指检的＞75岁的高加索人以及＞65岁的非裔美国人。如图中所见，miR-145在PCa样品中表达不足。miR-145可用于相对于具有良性前列腺变化(如BPH)的个体鉴定患有早期/潜伏性(indolent)Pca的个体。
实施例27：用于增强囊泡诊断分析性能的miR
根据本文所述，囊泡在受试者血浆样品中浓缩并且进行评估以提供诊断、预后或治疗诊断的结果输出。根据本文所述，受试者样品的囊泡分析包括对囊泡表面生物标志物(如表面抗原)和/或囊泡有效负载(如mRNA和微RNA)的检测。可评估囊泡中的有效负载以增强分析性能。例如，图13A示出了使用囊泡内的miR分析以将假阴性转换成为真阳性的方案的示意图，由此改善了灵敏度。在这一方案中，根据囊泡表面抗原分析而被称为阴性的样品通过评估囊泡内的有效负载而被进一步证实为真阴性或真阳性。类似地，图13B示出了使用囊泡内的miR分析以将假阳性转换成为真阴性的方案的示意图，由此改善了特异性。在这一方案中，根据囊泡表面抗原分析而被称为阳性的样品通过评估囊泡内的有效负载而被进一步证实为真阴性或真阳性。
用于前列腺癌的诊断测试包括从来自受试者的血液样品中分离囊泡以检测指示前列腺癌存在与否的囊泡。例如，参见实施例20-23。所述血液可以是血清或血浆。通过用识别特定囊泡表面抗原的“捕获抗体”进行捕获而分离囊泡。用于前列腺癌诊断分析的表面抗原包括四跨膜蛋白CD9、CD63和CD81(其通常存在于血液中的囊泡上并且因此而作为一般囊泡生物标志物发挥作用)、前列腺特异性生物标志物PSMA和PCSA以及癌症特异性生物标志物B7H3。所述捕获抗体系留于荧光标记的珠上，其中所述珠针对各捕获抗体进行差异性标记。使用针对四跨膜蛋白CD9、CD63和CD81的荧光标记的“检测抗体”对捕获的囊泡进行进一步突出显示。来自所述珠和所述检测抗体的荧光用于测定血浆样品中表达所述表面抗原的囊泡量以用于所述前列腺癌诊断分析。将样品中的荧光水平与参照水平(其可区别于具有前列腺癌的样品)进行比较。在本实施例中，微RNA分析用于增强基于囊泡的前列腺癌诊断分析的性能。
图13C示出了通过基于囊泡的前列腺癌诊断分析评估的样品中miR-107的检测结果。图13D示出了通过基于囊泡的前列腺癌诊断分析评估的样品中miR-141的检测结果。在该图中，所标示的miR的归一化水平在Y轴上示出，其为囊泡诊断分析所称的真阳性(TP)、囊泡诊断分析所称的真阴性(TN)、囊泡诊断分析所称的假阳性(FP)和囊泡诊断分析所称的假阴性(FN)。根据图13C所示，miR-107的使用通过将假阴性与真阴性加以区分(p＝0.0008)而增强了囊泡分析的灵敏度。类似地，图13D也显示，miR-141的使用通过将假阴性与真阴性加以区分(p＝0.0001)而增强了囊泡分析的灵敏度。表17中示出了添加miR-141的结果。miR-574-3p的表现类似。
表17：向基于囊泡的PCa测试中添加miR-141
无miR-141 具有miR-141
灵敏度 85％ 98％
特异性 86％ 86％
在本实施例中，通过指示前列腺癌的表面抗原检测囊泡，并且通过检测囊泡中的miR而进一步支持所述印记的性能，即，在不对特异性造成不利影响的情况下提高灵敏度。可对这一基本方法进行扩展以用于其中针对表面抗原或其它信息性特征对囊泡进行分型，随后将一种或多种另外的生物标志物用于增强表征分析的任何情况中。在此处，所述一种或多种另外的生物标志物是miR。其还可包括mRNA、可溶性蛋白、脂质、碳水化合物类以及可用于表征目标表型的任何其它囊泡相关生物实体。
实施例28：囊泡分离和检测方法
除上文所述的方法外，本领域的技术人员所知的大量方法可用于囊泡的分离和检测从而实施本发明的方法。以下是几种这类方法的说明性描述。
玻璃微珠.可自Illumina，Inc.San Diego，CA，USA获得的VeraCode/BeadXpress。步骤如下：
1.通过将抗体与可得的羧基基团直接偶联而制备所述珠。
2.封闭在所述珠的表面上的非特异性结合位点。
3.将所述珠添加于囊泡浓缩物样品中。
4.洗涤所述样品以除去未结合的囊泡。
5.将荧光标记抗体作为检测抗体使用，其应与囊泡特异性地结合。
6.洗涤板以除去未结合的检测抗体。
7.测量板孔的荧光以确定囊泡的存在。
酶联免疫吸附分析(ELISA).进行ELISA的方法对于本领域的技术人员是公知的。步骤通常如下：
1.制备表面，已知量的捕获抗体结合于其上。
2.封闭在所述表面上的非特异性结合位点。
3.将囊泡样品应用于该板。
4.洗涤所述板以除去未结合的囊泡。
5.应用作为检测抗体的酶连接的一级抗体，其也与所述囊泡特异性地结合。
6.洗涤所述板以除去未结合的抗体-酶偶联物。
7.应用化学制剂，其被所述酶转化成为颜色、荧光或电化学信号。
8.测量所述板孔的吸光度、荧光或电化学信号(如电流)以确定囊泡的存在和量。
电化学发光检测分析.可获自Meso Scale Discovery，Gaithersburg，MD，USA：
1.通过将5mL所选择的缓冲液(如PBS、TBS、HEPES)与75μl的1％Triton X-100(终浓度0.015％)结合以制备板涂覆缓冲液。
2.稀释待涂覆的捕获抗体。
3.使用板涂覆缓冲液(含Triton)制备每孔5μl的稀释捕获抗体。
4.将5μl稀释的捕获抗体直接应用于工作电极表面的中心，注意不要破坏电介质。小液滴应随时间扩散至电介质屏障的边缘但不越过所述边缘。
5.使板不覆盖和非干扰地静置过夜。
将包含囊泡的样品和包含标记检测抗体的溶液加至所述板孔。所述检测抗体是以电化学发光化合物MSD SULFO-TAG标记物标记的抗靶标抗体。存在于样品中的囊泡与固定于电极上的捕获抗体结合并且所述标记检测抗体与所述囊泡上的靶标结合，从而完成了夹心形式(sandwich)。加入MSD读出缓冲液以提供电化学发光检测所必需的环境。将板插入读板仪中，其中将电压施加于板电极上，这导致结合于电极表面的标记物发光。读板仪检测所发射光的强度以提供对所述样品中囊泡量的定量测量。
纳米颗粒.多组金纳米颗粒使用与各颗粒结合的独立抗体进行制备。在玻片上将浓缩的微囊泡与单一珠类型在37C下孵育4小时。如果存在足量的靶标，则出现从红色向紫色的色度偏移。对各靶标独立地进行所述分析。金纳米颗粒可获自Nanosphere，Inc.，Northbrook，Illinois，USA。
Nanosight.可使用光学的粒子检测测定一种或多种囊泡的直径。参见2010年7月6日授权的题为“Optical Detection and Analysis ofParticles”的美国专利7，751,053；以及2010年7月15日授权的题为“Optical Detection and Analysis of Particles”的美国专利7，399，600。还可标记所述颗粒并对其进行计数，从而可评估样品中不同囊泡或囊泡群体的量。
实施例29：CRC细胞系和患者样品中的KRAS测序
KRAS RNA从来自CRC细胞系的囊泡中进行分离并测序。在测序前将RNA转化成为cDNA。在列于表18中的细胞系上进行测序：
表18：CRC细胞系和KRAS序列
表18和图14显示了来自细胞系的基因组DNA中检测到的突变也在源自该细胞系的囊泡所含的RNA中检测到。图14显示了HCT116细胞中源自囊泡mRNA的cDNA序列(图14A)和基因组DNA的序列(图14B)。
将十二个CRC患者样品针对KRAS进行测序。如表19中所示，全部都是野生型(WT)。所有患者样品在RNA提取过程中接受了DNase处理。从分离的囊泡提取RNA。针对GAPDH扩增的12个患者样品全部显示RNA存在于它们的囊泡中。
表19：CRC患者样品和KRAS序列
Figure BPA0000184824780003091
在其中发现患者是KRAS13G＞A突变阳性的患者样品中，来自CRC患者肿瘤样品的KRAS突变也可在源自同一患者血浆源囊泡中被鉴定出。图14显示了这名患者中源自血浆中囊泡mRNA的cDNA的序列(图14C)以及源自新鲜冷冻的石蜡包埋(FFPE)肿瘤样品的基因组DNA(图14D)。
实施例30：蛋白质-核酸复合物的免疫沉淀
该实施例检验了包含在与Ago2、阿朴脂蛋白AI和GW182的复合物中的血浆中miRNA的水平。特别地，用Ago2、阿朴脂蛋白AI和GW182的抗体共同免疫沉淀后评价miRNA水平。
为了进行免疫沉淀，用结合蛋白G珠的抗Ago2、阿朴脂蛋白AI、GW182和IgG对照的抗体孵育人血浆。为了制备所述珠，将10μg抗-AGO2(ab57113，lot GR29117-1，Abcam，Cambridge，MA)、抗-ApoAI(PAI-22558，Thermo Scientific，Walmam，MA)、抗-GW182(A302-330A，Bethyl Labs，Montgomery，TX)或抗-IgG(sc-205，Santa Cruz，Santa Cruz，CA)与Magnabind蛋白G珠(Cat.#21349，Thermo Scientific)或Dynabead蛋白G(Cat.#100.04D，Invitrogen，Carlsbad，CA)偶联。将200μl珠放入1.5ml eppendorf管中并且置于磁力分离器(Cat.#S1509S，NewEngland Biolabs，Ipswich，WA)上一分钟。除去存储缓冲液并丢弃。用200ml磷酸盐缓冲盐水(PBS)将珠洗涤一次。使抗体在室温(RT)下在200μl PBS中结合珠20分钟，然后在4℃下再90分钟。将抗体结合的珠置于磁力分离器上一分钟。除去并丢弃未结合的抗体。用冰冷PBS将珠洗涤三次。
将抗体偶联的珠重悬浮于200μl PBS中，并且与200μl来自正常受试者(即，不带癌)的人血浆混合。使混合物在4℃下在Thermo ScientificLabquake Shaker/Rotisserie上滚动过夜。孵育过夜后，将珠置于磁力分离器上1分钟或直至溶液变得澄清。用200μl冷PBS将珠洗涤三次，并用200μl NP-40洗涤缓冲液(1％NP-40，50mM Tris-HCl，pH7.4，150mM NaCl和2mM EDTA)洗涤一次。NP-40缓冲液洗涤后，用200μl冷PBS将样品再冲洗一次。将珠置于磁力分离器上一分钟。珠在200μl PBS中变回原来的初始体积。将四分之三的样品按照之前所述的(Arroyo等，2011)用于RNA分离。将剩余的存储在-20℃用于Western分析。
分别使用ABI Taqman检测试剂盒ABI_391和ABI_431(AppliedBiosystems，Carlasbad，CA)针对miR-16和miR-92a来筛选分离的RNA。相对于合成标准品来定量RNA。收集上清液，并分析选定的miRNA(miR-16和miR-92a)。检测的miR-16和miR-92a的水平显示于图15。分别如图15A和图15B中所示以比IgG对照高得多的水平，使用Magnabeads(比较条表示为“珠(Beads)”)用Ago2和GW182共同免疫沉淀。出于技术原因，使用Dynabeads的共同免疫沉淀未成功，没有对其进行进一步的研究。
来自人血浆的miRNA的潜在来源包括囊泡和/或循环Ago2-结合的核蛋白复合物(RNP)。可以使用GW182的捕获从与AGO1-4的复合物和囊泡同时分离miR。该实施例显示了在人血浆中miR-16和miR-92a用AGO2和GW182共同免疫沉淀。
实施例31：微RNA复合物的流式分选
可以使用组织特异性生物标志物来分离源自特定组织的循环微RNA以分离微囊泡和其他微RNA复合物。该实施例显示了人血浆中PCSA/Ago2双阳性亚群体中的微RNA可以区分前列腺癌与非癌。
如实施例17中，对来自三名罹患前列腺癌的受试者和三名未患前列腺癌的男性受试者的血浆样品进行处理以浓缩囊泡。使用优化浓度的抗PCSA(前列腺特异性生物标志物)和Ago2的抗体(ab57113，lotGR29117-1，Abcam，Cambridge，MA)将浓缩的囊泡染色。所用的抗体为用PE标记的抗-PCSA和用FITC标记的抗-Ago2。使用匹配的同种型对照抗体设定阳性门控以限定阳性和阴性区域。基于图16中所示的区域来选择分选的群体。将Beckman Coulter MoFlo-XDP细胞分选器和流式细胞仪用于分离的阳性事件，使用高纯度分选模式(即，“纯度1(Purify1)/滴(Drop)”)来确保分选事件的纯度＞90％。MoFlo-XDP能够以高达每秒50,000个事件的速率来分选两个群体。为了确保颗粒分选的纯度和效率，速率平均在每秒200-300个事件。将阳性事件分选至三个2ml试管中，并且保存用于随后的miR分析。
一旦分选，评价来自每个前列腺特异性亚群体的微RNA含量。进行总的浓缩的血浆源微囊泡比较时，在前列腺癌(PrC)和非癌样品(即，正常)之间几乎没有观察到miR-22的差异表达(图17A)。利用分离自每个PCSA/Ago2双群体的总RNA的miR-22平均拷贝数水平观察到了相似的结果(图17B)。在不考虑微RNA水平的情况下，来自每个血浆样品的PCSA/Ago2双阳性事件的数量没有显著地区分癌症和非癌(图17C)。然而，将从每个分选观察到的miR-22拷贝的数目除以来自每个分选的特定事件数目时，在前列腺癌和非癌之间观察到了明显的分离(图17D)。在后一种情况中，与正常相比，在所有PCa血浆样品中观察到了每PCSA/Ago2双阳性复合物更高水平的miR-22。
实施例32：用于循环微囊泡的免疫沉淀纯化的方案
该实施例提供了从使用针对两种标志物的抗体免疫沉淀循环微囊泡(cMV)的实验方案。可以使用任何合适的抗体，其捕获所需的目标囊泡标志物。该实验方案可以进一步应用于不同样品来源，如来自各种体液的囊泡的分析。在该实施例中，使用针对PCSA和CD9的抗体从血浆中双重免疫沉淀前列腺特异性囊泡。
1)解冻1ml来自目标受试者的血浆。例如，罹患前列腺癌的受试者或对照如未患前列腺癌的正常男性。
2)用针对血浆的40μl抗-PCSA-PE偶联的抗体和45μl抗-CD9-FITC对未浓缩的血浆染色。
3)混合并在黑暗中室温下孵育30分钟。
4)使用300kD柱将血浆从1ml浓缩至300μl以除去未结合的抗体。
5)取出并留出50μl浓缩血浆以测定起始含量。留待流式分析，存储在4℃。
6)将20μl抗-FITC微珠加入剩余的250μl染色的浓缩物中。
7)在黑暗中孵育，在摇床上冷藏30min。
8)用3×100μl洗涤液洗涤柱来制备MultiSort柱(Miltenyi BiotecInc.，Auburn，CA)，用分离缓冲液(Miltenyi)洗掉磁体。
9)用抗-FITC微珠(Miltenyi)孵育30分钟后，通过添加200μl缓冲液稀释染色且标记的血浆以降低粘度。如果还太稠，进一步稀释。
10)将～470μl血浆溶液加入第一洗涤的柱(柱1)的顶部，在磁体上静置。
11)使血浆溶液流过。
12)将2×100μl洗涤液加入上部存储库中以除去未磁化的颗粒。
13)柱1的总通流为～670μl。留待表型分型。
14)将柱1从磁体移除。
15)加入300μl缓冲液，并且牢固插塞以从柱1除去磁化的cMV。
16)将10μl Multisort释放试剂(Miltenyi)加入保留的体积(300μl)中。
17)混合并在黑暗中4℃下孵育10min。
18)按照需要，可以进行任选的洗涤步骤以除去释放的微珠。
19)将20μl MultiSort终止试剂(Miltenyi)加入cMV溶液中。
20)加入20μl抗-PE MultiSort珠(Miltenyi)。
21)混合并在黑暗中4℃下孵育30min。
22)将溶液加入第二柱(柱2)的顶部，同时放在磁体上。
23)使其流过，并且作为通流液收集。
24)加入另外100μl以从柱2洗去任何未磁化的颗粒(～450μl)。
25)收集通流液并保存用于流式评价。
26)将柱2移离磁体，并且加入300μl缓冲液。
27)牢固插塞以逐出保留的细胞，保存用于流式评价。
28)加入10μl释放试剂以切割珠。
29)在黑暗中4℃下孵育10min。
30)加入20μl终止试剂。
31)转向流式评价。
也可以按照需要，使用单抗体和柱步骤在样品中免疫沉淀囊泡。例如，用抗-PSCA抗体进行单一免疫沉淀，可以捕获前列腺特异性囊泡。
流式分析。通过流式细胞术分析以上收集的五个群体：1)初始未分离的血浆；2)通过柱1的流；3)保留的柱1；4)通过柱2的流；5)保留的柱2。所有群体具有以上添加的CD9-FITC和抗-PCSA-PE。移除珠，但PE-偶联的抗体保留在cMV上并且可以在流式细胞仪中进行评价。
1)将cMV溶液转移至TmCount管用于cMV/事件的量化。
2)使用Beckman Coulter MoFlo-XDP细胞分选器，通过流式细胞术评价。基于TruCount管(Beckman Coulter)计算事件的数量。
实施例33：将血浆cMV中的miRNA表达相对于cMV水平标准化
该实施例通过结合细胞类型特异性cMV表面蛋白标志物的荧光强度、免疫沉淀和核酸检测，说明了标准化体液中的miRNA表达的方法。该过程允许放大目标组之间的生物标志物信号。该实施例说明了该方法使用miR-22来区分来自前列腺癌受试者和正常(即，非前列腺癌)的血浆样品，miR-22是显示为在前列腺癌中上调的微RNA。参见，Zhang等，microRNA-22，downregulated in hepatocellular carcinoma andcorrelated with prognosis，suppresses cell proliferation and tumourigenicity.Br J Cancer103：1215-20(2010)。
使用实施例32中概述的方法，用抗-CD9抗体(CD9-FITC BDBiosciences目录#555371，BD Pharmingen，San Diego，CA)和抗-PCSA抗体(内部制得)，将来自前列腺癌和正常供体的血浆微囊泡双重免疫沉淀。图18A显示了用于示例性样品的输入血浆，其使用BeckmanCoulter MoFlo-XDP细胞分选器和流式细胞仪来鉴定阳性事件。在图18A中，可以看到全血浆主要具有双阴性事件(即，CD9-/PCSA-)。在标识为R7的右上象限中存在一些双阳性(即，CD9+/PCSA+)。包括在第一CD9柱上捕获接着释放和在第二PCSA柱上第二次捕获的双重免疫沉淀后，观察到的cMV群体中明显富集CD9+/PCSA+双阳性事件。参见图18B，其显示了双重免疫沉淀后的群体。
将以上所述的群体裂解，并评价miRNA/mRNA含量。未处理血浆中的miR-22水平在正常中高于癌症样品。参见图19A。利用从浓缩血浆中的总cMV分离的总RNA的miR-22水平观察到了相似趋势。参见图19B。然而，分离的CD9+/PCSA+cMV中的原始miR-22拷贝数与非癌相比在癌症样品中较高。参见图19C。将观察到的来自每个双阳性cMV群体的miR-22拷贝数与实施例20中使用抗-PCSA作为捕获剂获得的匹配PCSA MFI相比时，这种分离得到增强。参见图19D。
在第二个实验中，使用以上的方法进行使用抗-PCSA抗体的单免疫沉淀，并且通过流式细胞术评价所得到的cMV群体。输入材料的示例性样品的流式分析的结果显示于图18C中。最初存在很少PCSA+事件。用抗-PCSA抗体免疫沉淀后，群体强烈富集PCSA+cMV。参见图18D。然后将该群体裂解，并且评价来自前列腺癌供体血浆和正常供体血浆的miRNA/mRNA含量。参见图19E-19G。与使用双重免疫沉淀一样，当将观察到的来自各个PCSA阳性cMV群体的miR-22拷贝数与匹配的PCSA MFI相比较时，癌症和正常之间的分离增强。
实施例34：用于将抗体捕获的miR表达相对于抗体水平标准化的评分
该实施例说明了通过检测循环微囊泡(cMV)内的miRNA水平产生用于区分来自癌症患者与非癌患者的血浆的评分的方法。
用1.2uM滤器过滤来自前列腺癌患者和正常个体(即，未患前列腺癌)的血浆，然后用150kDa柱浓缩以浓缩cMV。参见实施例17。为了测量前列腺特异性cMV，用200μl浓缩物孵育PE偶联的抗-PCSA抗体。通过使用Miltenyi磁柱，针对表达PCSA的cMV纯化PCSA标记的浓缩物。参见实施例32。使用Qiagen miRNeasy(Qiagen Inc.，Valencia，CA)，从含表达PCSA的cMV的保留的珠分离RNA。将60μlPCSA标记的浓缩物在微球试验上运行，所述试验由针对PCSA、PSMA、B7H3、CD81、CD63和CD9的HPLC纯化抗体组成。将针对PCSA、PSMA和B7H3的抗体用作捕获剂，并且将荧光标记的针对CD81、CD63和CD9的抗体用作检测剂。参见实施例22-23。记录中值荧光水平(MFI)。
从每个样品浓缩物分离RNA。使用Taqman试验在ABl7900(AppliedBiosystems，life Technologies，Carlsbad，CA)上使用pre-amp步骤测定miR-22和let-7a的拷贝数。为了计算诊断评分，将每个样品中的miR-22和let-7a的拷贝数乘以10，然后除以该样品中PCSA的MFI(如使用微球试验测定的)。将这些值的和加上来自微球试验的PSMA的MFI值。所有三个值的平均产生了诊断评分，将其用于区分癌症和正常。换句话说，诊断评分等于10*miR22/PCSA MFI，10*let-7a/PCSA MFI和PSMAMFI的平均。
使用40个随机选择的样品来确定评分的阈值。使用531或以上的阈值评分来区分癌症，获得了83％灵敏度和63％特异性的性能。参见图20A和20B，其中通过虚的水平线来表示阈值。图20C显示用该数据产生的ROC曲线。AUC是0.77。将该阈值用于分类20个样品的独立群组，导致82％灵敏度和67％特异性的性能。
实施例35：PCa的miRNA印记
该实施例说明了可以用于区分前列腺癌的循环微囊泡(cMV)miRNA印记。
实施例34中所述的针对表达PCSA的cMV纯化的二十一个样品用来鉴定区分各种样品群体的微RNA。所述样品群组包括八个前列腺癌、三个高级PIN、两个炎性疾病和六个正常(即，无前列腺病症)。按照实施例25中所述的，使用Exiqon卡分析了来自表达PCSA的cMV的分离RNA的miR含量。进行统计学分析以鉴定显著区分癌症样品的miR。前17个miR包括miR-182、miR-663、miR-155、mirR-125a-5p、miR-548a-5p、miR-628-5p、miR-517*、miR-450a、miR-920、hsa-miR-619、miR-1913、miR-224*、miR-502-5p、miR-888、miR-376a、miR-542-5p、miR-30b*和miR-1179。图21显示了miR-920(图21A)和miR-450a(图21B)的说明性曲线。如图中所示，miR-920在混杂疾病中是过表达的，而miR-450a在癌症中是下调的。
实施例36：循环微囊泡(cMV)中蛋白质、mRNA和微RNA生物标 志物的分析
使用基于微球的系统分析囊泡蛋白质生物标志物。将针对目标靶标蛋白质的选定的抗体与差异编址的微球偶联。参见，例如，实施例22中的方法。偶联后，将抗体涂覆的微球体进行洗涤，通过在PBS中的Starting Block封闭缓冲液(目录#37538，Thermo Scientific，Thermo FisherScientific的分部，Waltham，MA)封闭，在PBS中洗涤，并用来自血浆的浓缩cMV孵育，如下所述。cMV捕获后，将微球-cMV复合物洗涤，并用针对四跨膜蛋白CD9、CD63和CD81的藻红蛋白(PE)标记的检测剂抗体(即，PE标记的抗-CD9、PE标记的抗-CD63和PE标记的抗-CD81)孵育，并洗涤，接着在微球阅读器上检测。测量来自100个微球的荧光信号，并且计算针对各差异编址的微球-各对应于不同的捕获抗体-的中值荧光强度(MFI)。除了如上所述的四跨膜蛋白检测剂外，检验了检测剂和捕获抗体的各种不同组合。
使用流式细胞术来测定患者样品中的cMV总数。将患者血浆样品在PBS中稀释100倍，然后在BD Trucount管(BD BiosCiences，San Jose，CA)中在室温下孵育15min用于每个样品的事件的定量。Trucount管含有已知数量的荧光珠，其可以用于通过流式细胞术标准化各个样品的事件。通过FACS Canto II细胞计数器(BD Biosciences)的样品获取和通过FlowJo软件(Tree Star，Inc.，Ashland，OR)的分析用于确定每管的样品事件数和Trucount珠数。按照制造商的说明(BD Biosciences)获得每个样品的绝对数的计算，并且按照需要通过稀释倍数来调节。
用来自血浆样品的cMV检验来自有效负载的miRNA。使用改进的Trizol方法浓缩cMV并提取miRNA。简而言之，用RnaseA(20μg/ml，37℃，20min；
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，company，Madison，WI)处理cMV，接着Trizol处理(每100μ，750μl的Trizol LS)，并且在室温下在1400rpm下涡旋30min。离心后，收集上清液，并且用miRNeasy96纯化试剂盒(Qiagen，Inc.，Valencia，CA)进一步纯化RNA，并且存储在-80℃下。将四十ng RNA逆转录，并且在ABI7900(AppliedBiosystems，life Technologies，Carlsbad，CA)上，在Exiqon qRT-PCR人类组I和II上运行。参见，例如，实施例13-14，25。使用SDS2.4软件(Applied Biosystems计算cT值。将所有样品相对于平板间校准器和RT-PCR对照标准化。
还在来自血浆样品的cMV有效负载中检验了信使RNA(mRNA)。如上所述分离cMV并用RNase处理。使用如上所述的改进Trizol方法提取mRNA，并用以70％乙醇沉淀的Qiagen RNeasy微型试剂盒(Qiagen，Inc.)纯化。将收集的RNA逆转录，并根据制造商说明(AgilentTechnologies，Santa Clara，CA)使用Agilent的用于一色基因表达分析的“Low Input Quick Amp Lableling”试剂盒标记Cy-3。根据制造商的说明(Alilent Techonologies)，将标记的样品与Agilent’s Whole Genome44K v2阵列杂交并洗涤。将阵列在Agilent B扫描仪(AgilentTechnologies)上扫描，并用Feature Extractor(Agilent Technologies)软件提取数据。用通用标准化方法将提取的数据标准化，并且用GeneSpring GX软件(Agilent Technologies)进行分析。
可以从来自血浆的特定cMV亚群体检验miRNA和信使RNA。例如，将cMV浓缩，然后使用免疫沉淀分离对PCSA阳性的群体。参见实施例32-33。分离PCSA+cMV，并且如上所述分离miRNA和mRNA并分析。使用相同方法来检验使用针对不同目标囊泡表面抗原的不同捕获剂分离的囊泡miRNA和mRNA含量。此外，可以分离对超过一种表面抗原阳性的囊泡。参见实施例32-33。
将标准化的分析物值输入R(可从www.r-project.org的The R Projectfor Statistical Computing获得)或SAS软件(SAS Institute Inc.，Cary，NC)。使用合适的质量控制方法来过滤数据，并且在分析前进行转换。如下进行分析：
印记性能评价(用于预先指定的或新的印记)
使用以上方法(即，分离囊泡群体的有效负载分析)产生的样品集可以用于评价临床结果未揭盲(unblinding)或样品的临床实验室测试未揭盲之前完全指定的生物印记的性能。在这样的情况中，印记被认为是预先指定的，并且必须在未改变的情况下应用于该样品集的新分析物数据以对所有样品获得预测的结果。通过比较预测和真实结果评价预先指定的印记的性能(例如，就诊断灵敏度、特异性和准确性而言)。统计分析包括性能估计和置信区间。
对于没有预先指定(即，使用样品的临床结果和实验室测试结果的先知而得到的)的印记，这些样品仍可用于评价印记的性能。然而，为了降低潜在偏差的性能估计，在包括标志物选择和类别预测步骤的k-折叠交叉证实环内进行巢式统计学分析，如下所述。
用于新印记的标志物选择
如果使用本领域技术人员已知的常用技术子集通过测试标志物与疾病结果的相关性，它们是具有统计学信息的，则在新印记中包括该标志物。这些包括：1)Welch检验-当方差不同时，用于组平均之间差异的强力参数统计学检验；2)Wilcoxon符号-秩检验-可以解释为显示ROCAUC提高(高于0.50)的强力非参数统计学检验；3)Youden’s J-计算为标志物的最大组合灵敏度和特异性，在所有可能的诊断阈值上。通过置换检验评价统计学显著性。
如果检验在进行的数量统计学检验的情况中是显著的，则标志物判断是在统计学上具有信息的。更具体地，对于多个检验，调节逐次比较的p-值-例如，使用假发现率阈值或通过控制逐族误差率。
新印记的形成
一旦在上述的标志物选择阶段鉴定具有信息的标志物子集，使用公认的建模技术形成多标志物模型。通过在整个训练数据集上训练模型来估计用于印记的参数，并且使用“用于非预先指定的印记”的方法，根据“印记生能评价”所述的来评价对于印记的性能。将简单且公认的建模技术用于这些步骤中，包括：判别分析、支持向量机、logistic回归和决策树。记录所有模型的结果并且因此鉴定最佳标志物小组。
针对可用的目标临床变量，对数据集进行另外的经验分析。这样的变量包括年龄、种族、PSA水平、直肠指检(DRE)结果、之前活检次数、活检指征和活检结果(例如，HGPIN、ATYPIA、BPH、前列腺炎或前列腺癌)等。通过将共变量或分层变量引入之前限定的模型中来进行这样的分析。对于多重检验，对p-值进行校正。
实施例37：循环微囊泡(cMV)中的生物途径表达
在该实施例中，进行了cMV中mRNA有效负载的表达分型。进行cMV中表达的mRNA的途径分析以鉴定最显著的生物途径。
为了在整个囊泡群体中对mRNA分型，按照实施例6中所述的，使用过滤和浓缩从1ml来自三个前列腺癌和三个非癌对照样品的血浆分离cMV。从100μl血浆浓缩物提取RNA，然后将其细分成25μl等份试样用于在RNASE A处理后用Trizol LS(Invitrogen，life technologies，Carlsbad，CA)裂解。用70％乙醇沉淀来自四个等份试样中每一个的水相，在单一Qiagen微型RNA提取柱(Qiagen，Inc.，Valencia，CA)上合并，并在30μl体积中洗脱。洗脱的RNA可能难以通过标准方式来可靠地定量。因此，将10μl体积用于随后的标记反应。根据制造商的说明(Agilent Technologies，Santa Clara，CA)，用来自Agilent的用于一色基因表达分析的“Low Input Quick Amp Labeling”试剂盒进行cy-3标记，具有以下改进：1)改变用于Cy3标记的掺入(spike-in)混合物，以使得第三稀释为1：5，并且将1μl加入每个样品中；2)使用vacufuge，将10μl样品的体积减少至2.5μl，对于每个样品一式两份；3)在整个方案中，将每个样品一式两份进行处理，直至扩增样品的纯化步骤。在纯化方案开始时，将一式两份的样品合并，并且随后通过柱；4)在纯化后没有将样品定量，而是将全部体积的纯化样品与阵列杂交。然后根据制造商的说明(Agilent Technologies)，将标记的样品与Agilent WholeGenome44K微阵列杂交。用Feature Extractor软件(Aglient Technologies)提取数据，并用GeneSpring GX(Agilent Technologies)分析。发现浓缩物中存在4291种mRNA，包括表20中发现的那些。使用GeneSpring软件来鉴定与表达模式相关的途径。以上分析后，雄激素受体(AR)和EGFR1途径是囊泡群体中最显著表达的途径。AR和EGFR1途径的成员如表21中所示。
表20：总cMV中的mRNA表达
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表21：总cMV中的途径表达
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在相关的一组实验中，在PCSA+cMV中进行表达分型。使用实施例32中的免疫沉淀来分离PCSA+cMV。使用Agilent Whole Genome44K微阵列如上进行表达。在PCSA捕获样品中发现了2402种mRNA，包括表22中所示的那些。TNF-α途径是最显著过表达的途径。TNF-a途径的成员显示于表23中。
表22：PCSA+cMV中的mRNA表达
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表23：PcSA+cMV中的途径表达
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与总cMV群体相比，表24中的基因在PCSA+cMV中全部显著下调。使用t-检验用Benjamini和Hochberg假-发现率校正来比较表达。显著不同表达的mRNA显示于表中(校正的p-值≤0.05)。
表24：与总cMV相比PcSA+cMV中下调的mRNA
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实施例38：来自循环微囊泡(cMV)的mRNA的微阵列分型
对高密度阵列或cMV内的mRNA水平的大规模筛选可能受到样品量和质量的阻碍。研发了实验方案来允许区分前列腺癌和正常的cMV有效负载mRNA的强力分析。
按照实施例6中所述的，使用过滤和浓缩从四个前列腺癌和四个非癌对照样品的1ml血浆分离cMV。从100μl血浆浓缩物中提取RNA，然后将其细分成25μl等份试样，用于在RNASE A处理后用Trizol LS(Invitrogen，life technologies，Carlsbad，CA)裂解。用70％乙醇沉淀四个等份试样每一个的水相，在单Qiagen微型RNA提取柱(Qiagen，Inc.，Valencia，CA)上合并，并在30μl体积中洗脱。洗脱的RNA可能难以通过标准方法来可靠地定量。因此，将l0μl体积用于随后的标记反应。根据制造商的说明(Agilent Technologies，Santa Clara，CA)，样品用来自Agilent的用于一色基因表达分析的“Low Input Quick AmpLabeling”试剂盒进行cy-3标记，具有以下改进：1)改变用于Cy3标记的掺入混合物，使得第三稀释为1：5，并且将1μl加入每个样品中；2)使用vacufuge，将10μl样品的体积减少至2.5μl，对于每个样品一式两份；3)在整个实验方案中，将每个样品一式两份进行处理，直至扩增样品的纯化步骤。在纯化实验方案开始时，将一式两份的样品合并，并且随后通过柱；4)在纯化后没有将样品定量，而是将全部体积的纯化样品与阵列杂交。然后根据制造商的说明(Agilent Technologies)，将标记的样品与Agilent Whole Genome44K微阵列杂交。用Feature Extractor软件(Aglient Technologies)提取数据，并用GeneSpring GX(AgilentTechnologies)分析。在最终分析中包括至少50％样品中具有表达的基因。检测了符合这些标准的2155个探针。在这2155个探针中，发现了24个在前列腺癌组和对照组之间具有显著不同的表达(p值＜0.05)。参见表25和图22。表25显示了在来自四个前列腺癌患者样品和四个健康对照样品的cMV的mRNA有效负载之间显著差异表达的24个基因。图22显示了微阵列的选定基因的荧光值减去原始背景的点图。
表25：来自PCa和健康样品的cMV中差异表达的mRNA
基因代码 p-值 正常中的变化 FC绝对值
A2ML1 0.001 下调 1.88
GABARAPL2 0.002 上调 1.36
PTMA 0.002 上调 1.76
ETFB 0.003 上调 1.16
RPL22 0.008 下调 1.36
GUK1 0.009 上调 1.28
PRDX5 0.011 上调 1.48
HIST1H3B 0.014 上调 1.29
RABAC1 0.022 上调 1.33
PTMA 0.024 上调 1.65
Clorf162 0.026 下调 1.35
HLA-A 0.031 上调 1.23
SEPW1 0.033 上调 1.31
SOX1 0.034 下调 1.38
EIF3C 0.034 下调 1.30
GZMH 0.037 上调 1.81
CSDA 0.040 上调 1.79
SAP18 0.040 下调 1.36
BAX 0.043 上调 1.20
RABGAP1L 0.045 上调 2.19
C10orf47 0.047 下调 1.58
HSP90AA1 0.047 上调 1.46
PTMA 0.048 上调 1.52
NRGN 0.049 上调 2.57
表25中的缩写，“基因代码”指的是可用于阵列上各个基因特征的命名。对于每个基因的详细内容，可以从Agilent(www.chem.agilent.com)或HUGO数据库(www.genemanes.org)获得。“FC绝对值”显示了组之间检测的mRNA水平的绝对倍数变化。
实施例39：用于卵巢癌的循环微囊泡分析
在该实施例中，囊泡卵巢癌测试是用于检测来自患卵巢癌病人的血浆的囊泡上存在的一组蛋白质生物标志物的基于微球的免疫分析。该测试使用对以下蛋白生物标志物具有结合特异性的抗体或其他配体或结合剂(例如，适体、肽、肽-核酸)：CD95、CD9、CD59、CD63、CD81和EpCAM。在通过针对CD95和EpCAM的抗体(或其他结合剂)涂覆的微球捕获囊泡后，将藻红蛋白-标记的抗体用于检测一般囊泡生物标志物(在此为CD9、CD59、CD63和/或CD81)。根据这些抗体与来自病人血浆的囊泡的结合水平，确定了卵巢癌的存在或不存在。
按照以上所述的，例如，实施例22和23中所述的，分离囊泡。通过将测试样品的特征与参照样品的相比较，用于这些蛋白生物标志物的分型自身可以表示诊断、预后或治疗诊断结果。参照样品可以是不带癌的正常样品中的微囊泡水平，其中包含CD95、CD9、CD59、CD63、CD81和EpCAM的囊泡的升高水平表示卵巢癌的存在。
此外，将生物标志物用于分型、鉴定或分离特定的测试样品，其进一步可以探查存在于微囊泡群体中或与微囊泡群体相关的另外的生物标志物。例如，利用生物标志物特异性的结合剂(在此，底物结合的抗体结合CD95和/或EpCam)，将微囊泡的输入样品进行亲和性或免疫沉淀步骤，并且进一步利用本文中公开的或本领域已知的方法处理分离的生物标志物阳性(BM+)亚群体，以表征和确定微囊泡亚群体中存在的另外的生物标志物(例如，蛋白质、肽、RNA、DNA)的存在。
测试可以进一步包括使用本文中呈现的方法，例如，实施例14-16中的方法，来评价捕获的囊泡内的微RNA的水平。所述微RNA包括miR200家族的成员，包括miR-200c。与非癌参照相比降低的miR200微RNA的水平表示卵巢癌的存在。miR200的较低水平进一步表示侵袭性更高的癌症。
实施例40：PCa中差异表达的miR
已经挑战了发现用于前列腺癌(PCa)检测的基于血液的生物标志物的尝试。血液中微RNA(miR)的量化用于鉴定潜在的遗传生物标志物。使用血浆源的循环微囊泡(cMV)作为来自细胞的miR的富集源，该实施例说明了可以区分PCa样品和健康对照的miR生物印记以及用于转移性PCa的miR生物印记。
按照本文中所述的，使用Exiqon RT-PCR小组分析了一组来自罹患前列腺癌男性和对照(活检证实未患前列腺癌的男性)的血浆样品。使用TNM量表，前列腺癌包括MX样品(没有评价远转移)、M0样品(没有远转移)和M1样品(证实远转移)。
在从患者样品分离的囊泡中检测miR。使用改进的Qiagen miRneasy实验方案(Qiagen GmbH，德国)，从150μl来自每个样品的冷冻血浆浓缩物分离RNA。改进的实验方案包括用Rnase处理浓缩样品，接着分离以使得只分析每个样品中囊泡内保护的RNA。用已知量的秀丽隐杆线虫(C.elegans)微RNA掺入样品以在随后的步骤中标准化。将40ng从样品中的囊泡分离的RNA用于各个Exiqon小组。
Exiqon RT-PCR小组由覆盖750个miR的双384卡和对照分析组成。使用在ABI7900(Life Technologies Corporation，Carlsbad，加利福尼亚)上运行的Sybr绿分析进行qRT-PCR试验。将用于每个miR分析的Ct值相对于平板间校准器(IPC)探针和RT-PCR对照的Ct值标准化。进行几次质量校验。当IPC Ct值＞25，RT-PCR Ct值＞35时，并且样品没有扩增对照miR(即，miR-16和miR-21)时，样品从分析中去除。使用GeneSpring软件(Agilent Technologies，Inc.，Santa Clara，CA)进行样品数据的主要成分分析以鉴定离群值。由于不能使用这些定性测量达到合格，从分析中去除了三个样品。
按以下所述的，使数据经受样品组之间的配对t-检验，并且用Benjamini和Hochberg假-发现率检验校正p-值。使用Taqman探针方法验证了显示出最显著p-值的miR。
发现非转移性PCa(n＝64)和正常对照(n＝28)样品中比较的750种miR中有十种具有＞2.0的倍数变化，p值＜0.01。参见表26。在验证集(N＝168)中，检验了hsa-miR-107(P＝0.03)和hsa-miR-574-3p(P＝0.02)的表达。两者在非转移性PCa(n＝133)和对照(n＝35)样品之间显著不同。
表26：非转移性前列腺癌vs对照
miR p-值 前列腺癌中的倍数变化
hsa-miR-574-3p 0.003 3.32
hsa-miR-141 0.008 3.22
hsa-miR-432 0.002 4.15
hsa-miR-326 0.001 6.36
hsa-miR-2110 0.005 5.98
hsa-miR-181a-2* 0.004 -2.75
hsa-miR-107 0.000 13.16
hsa-miR-301a 0.006 5.41
hsa-miR-484 0.009 2.92
hsa-miR-625* 0.003 4.00
转移性(n＝15)和非转移性(n＝55)样品的比较发现750种miR中有16种具有＞2.0的倍数变化，P值＜0.01。参见表27。在随后验证集(39个转移性的和73个非转移性的)中这些miR的定量发现通过qRT-PCR测试的几种miR能够区分转移性和非转移性PCa(hsa-miR-200b、hsa-miR-375、hsa-miR-141、hsa-mir-331-3p、hsa-miR-181a和hsa-miR-574-3p)。在单独同龄组中，在来自转移性PCa患者的cMV(n＝47)中的hsa-miR-141和hsa-miR-375水平显著高于非复发性PCa患者的cMV中的水平(n＝72；P＝0.0001)。参见图23。
表27：转移性vs非转移性前列腺癌
miR p-值 转移性前列腺癌中的倍数变化
hsa-miR-582-3p 0.001 2.51
hsa-miR-20a* 0.002 3.62
hsa-miR-375 0.003 10.71
hsa-miR-200b 0.003 3.90
hsa-miR-379 0.005 2.10
hsa-miR-572 0.005 -7.39
hsa-miR-513a-5p 0.005 2.23
hsa-miR-577 0.005 5.90
hsa-miR-23a* 0.005 2.30
hsa-miR-1236 0.005 2.63
hsa-miR-609 0.006 2.31
hsa-miR-17* 0.006 4.80
hsa-miR-130b 0.007 6.12
hsa-miR-619 0.008 3.37
hsa-miR-624* 0.009 6.09
hsa-miR-198 0.009 2.12
血液来源的cMV是用于表征表型的miR生物标志物的来源。miR生物印记能够区分非转移性PCa血样与对照。在转移性血浆源的cMV样品中，存在7个miR的较高表达，且进一步证实了其中的两个(hsa-miR-141和hsa-miR-375)在转移性血清源的cMV中升高。该实施例提供了用于检测前列腺癌和鉴定转移性病例的cMV的基于血液的miR生物印记。
实施例41：分离外来体亚群和随后的miR谱
在这个实施例中，在基于表面蛋白组成限定的循环微囊泡亚群体中检验微RNA(miR)表达模式。使用本文中所述的方法，基于其表面蛋白质组成对从前列腺癌细胞系(VCaP)分离的囊泡进行流式分选。针对miR的差异表达来评价囊泡。将靶向EpCam、CD63或B7-H3的藻红蛋白标记的抗体用于通过荧光激活的细胞分选来分选囊泡的亚群体。囊泡在Beckman-Coulter MoFlo XDP(Beckman Coulter，Inc.，Brea，CA)上分选，以使得各囊泡可以作为单个颗粒来分析。由于囊泡表面上的抗原的丰度，存在超过同种型对照的FL2通道强度的显著偏移。随后通过miR表达将分选的囊泡亚群体进行分型。将EpCam、CD63和B7-H3阳性亚群体的miR谱与总VCaP囊泡群体的谱相比较。在亚群体间观察到不同的miR表达模式，并且所有表达模式不同于总群体中观察到的。miR的过表达和表达不足的模式都在组之间观察到。这些数据表明基于表面蛋白质标志物及其遗传含量(在这个情况中，为miR)可以区分和分离囊泡的亚群体。基于表面蛋白质组成从患者血浆分离组织特异性囊泡群体并且随后基于表面蛋白质组成和遗传含量进行分析的能力可以用于如本文中所述的诊断、预后和治疗诊断应用中。
实施例42：用于检测肺癌的微RNA miR-497
目前不存在用于肺癌早期诊断的血液测试。在从血浆样品分离的循环微囊泡(cMV)中检验微RNA。按照实施例6中所述的分离囊泡。使用Trizol方法，从1ml血浆中所含的囊泡提取RNA。使用定量
Figure BPA0000184824780003471
RT-PCR方法检测微RNA有效负载。在来自16个肺癌患者和15个对照正常成人(即，无肺癌)的血浆中检验了miR-497的表达。在两个组之间观察到了miR-497拷贝数的显著差异(p＝0.0001)。参见图24A。使用1154个miR-497拷贝(在0.1ml血浆中)的阈值来区分肺癌与正常样品(通过图24A中的垂直线来表示)，以88％灵敏度和80％特异性检测肺癌。
在追踪研究中，从1ml冷冻血浆中分离来自24名主要早期疾病的非小细胞肺癌(NSCLC)患者(IA期＝9，IIA期＝1，IIB期＝2，III期＝1，IV期＝2)和26名健康个体的循环微囊泡(cMV)。在来自肺癌患者和26名对照健康成人(即，无肺癌)的血浆样品的cMV中检验了miR-497的表达。患者特征显示于表28中。
表28：患者特征
期 男性 女性
IA期 5 4
IB期 4 5
IIA期 1 0
IIB期 1 1
III期 1 0
IV期 0 2
正常 14 12
，中值标准化的拷贝数对于正常个体为9000±307拷贝/ml(±95％CIM)，而对于NSCLC患者为27,500+1298拷贝/ml(+95％CIM)。对于癌症，设定0.1ml样品中1570个拷贝的阈值(即，15,700个拷贝/ml)，试验具有79％的灵敏度和81％的特异性，以及0.89的AUC。参见图24B-24C以及表29中的结果。表29显示了使用13，560和15,700拷贝/ml的截止阈值的测试性能。可以调节阈值来提高灵敏度或特异性。
表29：检测肺癌的miR-497
真阳性 21 19
真阴性 18 21
假阳性 8 5
假阴性 3 5
灵敏度 88％ 79％
特异性 69％ 81％
准确性 78％ 80％
AUC 0.89 0.89
截止(拷贝/ml) 13,560 15,700
实施例43：循环生物标志物诊断分析的预后分析
介绍：除了非黑素瘤皮肤癌，前列腺癌是影响美国男性的最常见的癌症。在美国，2010年，新增217,730个前列腺癌病例，并且32,050人死亡(来源是国家癌症研究院(National Caner Institute))。前列腺癌的临床行为从显微充分分化的肿瘤到侵袭性的癌症，具有侵袭和转移的高可能性。
尽管前列腺特异性抗原(PSA)测试有效管控前列腺癌的显著效益，但广泛认为来自前列腺组织特异性而不是前列腺癌特异性抗原的结果具有明显的缺陷。目前认为正常的PSA值低于4.0ng/ml，但是该截止值仍存在争论。如果血清PSA在4.0至10ng/ml的范围中，对前列腺活检存在大约30％发现前列腺癌的机会，即使通过使用重复的活检(例如，10-12个核)。在National Comprehensive Cancer Network(NCCN)指南中推荐了针对前列腺活检的PSA截止值为2.5ng/ml。美国癌症协会指南推荐如果PSA高于2.5ng/ml则考虑活检。
因为测试对PSA抗原是高度特异性的，在前列腺癌和非恶性病症(如，良性前列腺增生(BPH)和前列腺炎)中都会升高。此外，不是所有前列腺癌释放过量水平的PSA至血清中，并且PSA水平可能受到各种其他因素的影响，如伴随的药物治疗、年龄和种族(例如，非裔美国人常常具有相对较高的PSA水平；亚洲男性常常具有较低的PSA水平)。因此，作为可能的前列腺癌的情况中的风险评价辅助，升高的PSA与次最佳的临床灵敏度、特异性和阳性预测值相关。存在着对于给目前的诊断算法增加特异性的有助于前列腺癌诊断的测试的需求。
微囊泡的生物学：当细胞膜片段自发套叠、发生胞吐作用并且释放至胞外环境中时，可以由多种细胞类型在细胞内形成微囊泡。多种细胞类型可以产生微囊泡，包括树突细胞、肿瘤细胞、淋巴样细胞、间皮细胞、上皮细胞和来自不同组织或器官的细胞。微囊泡可以包括源自质膜或内膜并且随后释放至胞外环境中的任何膜结合颗粒。微囊泡是脂质双层膜结合的细胞衍生的结构，其产生自突出外翻(起泡)、质膜部分的分离和密封，或产生自任何含有各种细胞来源的膜相关蛋白的细胞内膜结合囊泡结构。这些可以包括选择性结合肿瘤衍生蛋白质的源自宿主循环的表面结合分子以及微囊泡或外来体内腔中所含的分子，如肿瘤衍生的miRNA、mRNA和细胞内蛋白质。微囊泡还可以包括膜片段。Valadi等(2007)剖析了源自肥大细胞的微囊泡的组成和含量，并且发现它们基本上富含微RNA(miRNA、miR)和信使RNA(mRNA)。此外，微囊泡中发现的RNA的谱不同于细胞溶质中发现的RNA的谱。例如，微囊泡不含核糖体RNA，但它们含有大量19-22核苷酸的miRNA。图25A-C显示了通过超离心从培养中生长的前列腺癌细胞系分离的微囊泡的透射电子显微照片。图25A是结合载玻片的Vcap-衍生的微囊泡的电子显微照片。图25B是Vcap-衍生的微囊泡的扫描电子显微照片，而图25C是结合聚-L-赖氨酸涂覆的聚苯乙烯珠的Vcap微囊泡的扫描电子显微照片。
肿瘤细胞的微囊泡分泌及其涉及蛋白质和核酸(例如，miRNA)的转运证明了微囊泡在病理学过程中的作用。已经在多种体液中发现了微囊泡，所述体液包括，但不限于，血浆、支气管肺泡灌洗流体和尿液。在其他生物功能中，特别地微囊泡参与细胞间通讯以及作为蛋白质、RNA、DNA、病毒和朊病毒的转运载体。
微囊泡和生物标志物：蛋白质生物标志物或肿瘤标志物包括在与癌症相关的血液或组织中存在的蛋白质分子，并且其测量或鉴定在疾病诊断或临床管控中是有用的。
肿瘤标志物可以用于多种临床目的，包括但不限于以下：(1)筛选针对癌症存在的健康群体或高风险群体，(2)作为进行癌症或特定类型癌症诊断的辅助手段，(3)作为确定预后的辅助手段，和4)支持治疗监测。
对支持临床决策的生物标志物的研究正快速增加，并且在最近几年，已经发现并证实了多种遗传生物标志物用于指导癌症病人的治疗决策(例如，罹患结肠直肠癌的患者中的KRAS，罹患乳腺癌的患者中Her2-neu的过表达，以及罹患非小细胞肺癌患者中的EGFR)。然而，目前可得的许多蛋白质生物标志物不能显示出临床医生需要的灵敏度、特异性和预测值来支持进行决策。例如，癌胚抗原(CEA)是首先在结肠直肠癌患者中鉴定的，但已经发现在各种恶性肿瘤中升高，包括胰腺、胃、肺和乳腺以及各种良性病症，如肝硬化、炎性肠病、慢性肺病和胰腺炎。另一个实例是CA-125，它是存在于80％非粘液性卵巢癌上的抗原，但在如子宫内膜内膜、胰腺、肺、乳腺和结肠的其他恶性肿瘤以及各种良性病症，如月经、妊娠和子宫内膜异位中也可能是升高的。
通过肿瘤细胞产生的微囊泡含有肿瘤细胞来源的分子，如miRNA、mRNA和蛋白质。因此，循环微囊泡(cMV)的分离和浓缩可以提供肿瘤相关生物标志物的高度浓缩的来源。
该实施例说明了用于开发基于微囊泡的诊断测试的方案，其特征在于生物标志物印记(生物印记)以提供40至75岁年龄男性中前列腺癌的存在和/或风险的更好评估。这种基于微囊泡的方法可以进一步用于肿瘤疾病的分期/监测，从而支持作出治疗决策和确定预后。
如本文中所述，本发明部分地提供了基于捕获的循环微囊泡的多重夹心免疫分析(以下描述)，所述循环微囊泡能够区分来自罹患器官限制的前列腺癌的男性和未患前列腺癌的男性的血浆。该分析包括基于微球的免疫分析以用于检测存在于来自罹患前列腺癌的患者的血浆中的微囊泡上的一组蛋白质生物标志物。在分析方法开发过程中检测了多种微囊泡表面抗原，并且选择最佳的生物印记组或标志物。这个初步方法使用了以下蛋白质生物标志物的特异性抗体：CD9、CD63、CD81、PCSA、B7H3和PSMA。
PSMA和PCSA两者都是用于分离从前列腺上皮细胞分泌的微囊泡的前列腺特异性标志物。B7-H3是转化细胞中发现的蛋白质生物标志物，并且用于鉴定来自癌细胞的微囊泡。CD9、CD63和CD81是在大部分表皮细胞上和从表皮细胞分泌的微囊泡上发现的四跨膜蛋白或跨膜蛋白。这些四跨膜蛋白作为一般囊泡标志物发挥作用(参见表3)。藻红蛋白(PE)标记的抗四跨膜蛋白抗体用于在分析中各种结合微囊泡的检测。根据这些抗体与来自病人血浆的微囊泡的结合水平，进行了与前列腺癌的存在或风险的相关性的确定。
在比较前列腺癌患者与不具有前列腺癌男性的回顾性研究中，该分析形式显示出83％灵敏度和86％特异性。使用一组预期收集的样品测试该生物印记，所述样品来自由于升高的前列腺癌风险而安排进行前列腺活检的所有男性。
除了使用蛋白质生物标志物，将miRNA分子添加至该分析中以提高检测和区分前列腺癌的灵敏度和特异性。这将通过收集和浓缩来自血浆的cMV并提取和测量特定miRNA物质以及确定它们与前列腺癌的相关性来实现。例如，以上实施例中呈现了与前列腺癌或转移性前列腺癌的存在具有高度相关性的miRNA。
目标：该前瞻性研究的目标在于鉴定和/或证实在从血液样品检测前列腺癌中提供高度准确性的基于微囊泡的前列腺癌特异性生物印记。更具体的，目标是开发一种有助于需求泌尿科医师评估可能的前列腺癌的男性群体中前列腺癌的检测的分析方法。分析性能目标包括基于≥10核超声指导活检的不完全黄金标准的≥80％特异性和≥80％特异性，ROC分析具有≥0.80的AUC。
预期的用途：该实施例中所述的循环微囊泡(cMV)分析意图用于测量人血浆中微囊泡的指定生物标志物。该分析意图用作检测具有升高的PSA和/或异常直肠指检的认为处于升高的前列腺癌风险中并且可以是前列腺活检的候选者的40-90岁男性中前列腺癌的辅助手段。
研究设计：从所有安排前列腺活检的满足所述入组标准的男性收集血样。将样品以合适的形式登记入册和存储。将病例报告表上收集的相关数据以电子形式存储，并且因此存档纸印本。按照样品收集方案中详细说明的(参见图25D)将血液处理成血浆，冷冻并从收集地点(例如，医院或护理所)运送至分析地点，在此处进行处理并检验蛋白质和核酸生物标志物。通过差分过滤程序从血浆分离和浓缩循环微囊泡。对来自活检证实了前列腺癌的男性的至少50个前列腺癌样品以及来自相同地点的具有阴性活检的男性的至少50个样品的训练集检验浓缩微囊泡的蛋白质和miRNA生物标志物。使用来自跨美国的3个不同收集地点的样品。
方法：在Luminex200仪系统上进行蛋白质生物标志物选择。根据制造商推荐的实验方案，将选定的抗体与来自Luminex Corp.的差异编址微球偶联。偶联后，洗涤涂覆的微球，通过在PBS中的Starting Block封闭缓冲液(Thermo Scientific，目录#37538)中孵育进行封闭，在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中洗涤，并用来自血浆的浓缩cMV孵育，如下所述。使用珠结合的抗-CD9、抗-B7H3、抗-PCSA和抗-PSMA捕获cMV后，洗涤微球-cMV复合物，然后用藻红蛋白标记的检测剂抗体(PE-CD9、PE-CD63和PE-CD81)孵育，并洗涤，然后在Luminex200上阅读。标准方案包括从100个微球测量荧光信号，并且针对各对应于不同捕获抗体的各个编址的微球测量中值荧光强度(MFI)。除了以上所述的四跨膜蛋白检测剂外，将检验检测剂和捕获抗体的各种不同组合。例如，按照需要，将评价表5中的前列腺或其他标志物生物标志物。
使用流式细胞术来分析所评价的各种群体中的cMV的总数。将合适量的血浆样品在PBS中稀释100倍，然后在室温下在BD Trucount管(BD Biosciences，San Jose，CA)中孵育15min用于定量每个样品的事件。Trucount管含有精确数目的荧光珠，其可以通过流式细胞术比较各个样品的事件。通过FACS Canto II细胞计数器(BD Biosciences)的样品获取和通过FloWJo软件(Tree Star，Inc.，Ashland，OR)的分析揭示每管的样品事件的数量和Trucount珠的数量。最后，按照BD的指示获得每个样品的绝对数量的计算，并且通过稀释倍数来调整。
从来自血浆样品的cMV检验微RNA。将cMV浓缩并且使用Trizol方法从cMV提取miRNA。简而言之，用Rnase A(EpicentreBiotechnolgies，Madison，WI)处理cMV(20μg/ml，37℃，20min)，接着Trizol处理(每100μl，750μl Trizol LS)，并且在室温和1400rpm下涡旋30min。离心后，收集上清液，并且用miRNeasy96(Qiagen Inc.，Valencia，CA)纯化试剂盒进一步纯化RNA，并存储于-80℃下。将40ngRNA逆转录，然后在ABI7900(Applied Biosystems，Life Technologies，Carlsbad，CA)上，在Exiqon qRT-PCR人类组I和II上运行。使用SDS2.4软件(Applied Biosystems)计算CT值。将所有样品相对于板间校准器和RT-PCR对照标准化。
还从来自血浆样品的cMV检验信使RNA。检验来自血浆样品的cMV的信使RNA。首先，分离cMV，并用229μg/ml的RNase A在37℃下处理20分钟。然后使用Trizol方法提取信使RNA，并用Qiagen RNeasy微型试剂盒纯化，用70％乙醇沉淀。将样品RNA逆转录，并且根据制造商说明(Agilent Technologies，Santa Clara，CA)使用Agilent的用于一色基因表达分析的“Low Input Quick Amp Lableling”试剂盒进行Cy-3标记。根据制造商的说明(Agilent Technologies，Inc.，Santa Clara，CA)将标记的样品与Agilent’s Whole Genome44K v2阵列杂交并洗涤。在Agilent B扫描仪上扫描阵列，并且用Feature Extractor(AgilentTechnologies)软件提取数据。提取的数据用通用标准化方法标准化，并且用GeneSpring GX(Agilent Technologies)软件进行分析。
从来自血浆的特定cMV亚群体检验miRNA和信使RNA。例如，将cMV浓缩，然后使用磁性免疫沉淀分离PCSA阳性的群体。分离后，使用改进的Trizol方法提取miRNA。简而言之，用Rnase A(Epicentre)(20μg/ml，37℃，20min)处理cMV，接着Trizol处理(每100μl，750μlTrizol LS)，并且在室温和1400rpm下涡旋30min。离心后，收集上清液，并且用miRNeasy96(Qiagen)纯化试剂盒进一步纯化RNA，并存储于-80℃下。将40ng RNA逆转录，然后在ABI7900上在ExiqonqRT-PCR人类组I和II上运行。使用SDS2.4软件(Applied Biosystems)计算CT值。将所有样品相对于板间校准器和RT-PCR对照和/或cMV的数量标准化。还检验来自血浆样品的cMV的信使RNA。首先，分离cMV，并用229μg/ml的RNase A(Epicentre)在37℃下处理20分钟。然后使用改进的Trizol方法提取信使RNA，并用Qiagen RNeasy微型试剂盒纯化，用70％乙醇沉淀。将样品RNA逆转录，并且根据制造商说明使用Agilent的用于一色基因表达分析的“Low Input Quick AmpLableling”试剂盒进行cy-3标记。根据制造商的说明，将标记的样品与Agilent’s Whole Genome44K v2阵列杂交并洗涤。将在Agilent B扫描仪上扫描阵列，并且用Feature Extractor(Agilent Technologies)软件提取数据。用通用标准化方法将提取的数据标准化，并且用GeneSpring GX(Agilent Technologies)软件分析。
标准化的分析物值输入R(cran.org)和SAS软件(SAS Institute Inc.，Cary NC)中进行质量控制分析并在分析前进行转换。如下进行分析：
1)印记性能评价(用于预先指定的或新的印记)
a.该样品集可以用于评价临床结果揭盲或样品的临床实验室测试揭盲之前完全指定的印记的性能。在这样的情况中，印记被认为是预先指定的，并且必须在未改变的情况下应用于该样品集的新分析物数据以获得所有样品的预测结果。通过比较预测和真实结果评价预先指定的印记的性能(例如，就诊断灵敏度、特异性和准确性而言)。统计分析包括性能估计和置信区间。
b.对于没有预先指定的印记(即，从样品的临床结果和实验室测试结果的先知得到的)，这些样品仍可用于评价印记的性能。为了确保相对无偏差的性能估计，在包括所有标志物选择和类别预测步骤的k-折交叉证实环内进行巢式统计学分析，如下所述。
2)用于新印记的标志物选择
a.只有当使用常用技术的子集对它们与疾病结果的相关性通过测试显示出是提供统计学信息时，才将标志物包括在新印记中，例如
i.Welch检验-当方差不同时，用于组平均值之间差异的强力参数统计学检验；
ii.Wilcoxon符号-秩检验-可以解释为显示ROC AUC的提高(高于0.50)的强力非参数统计学检验；
iii.Youden’s J-计算为在所有可能的诊断阈值上标志物的最大组合灵敏度和特异性。通过置换检验评价统计学显著性。
b.仅在检验在进行的数量统计学检验的情况中是显著的时，标志物判断为提供统计学上的信息。更具体地，对于多重检验，调节逐次比较的p-值-例如，使用假发现率阈值或通过控制逐家族的误差率。
3)新印记的形成：假定在之前(标志物选择)阶段鉴定出提供信息的标志物子集，使用公认的建模技术形成新的多标志物模型。通过在整个训练数据集上训练模型来估计用于印记的参数，并且使用“用于非预先指定的印记”的方法，根据“印记性能评价”所述的来评价对于印记的性能。我们将集中于简单且公认的建模技术，包括：判别分析、支持向量机、logistic回归和决策树。报告所有模型的结果。
针对目标临床变量，可以对数据集进行另外的经验分析-例如，之前的活检次数、活检指征和活检结果(例如，高级前列腺上皮内瘤样病变(HGPIN)、非典型小腺泡增殖(ASAP)、ATYPIA、良性前列腺增生(BPH)和前列腺炎)。通过将共变量或分层变量引入之前限定的模型中来进行这样的分析。只在评价数据充分性后进行经验检验，记录所有测试和结果，并且对于多重检验对p-值进行校正。
患者适格性：
入组标准：
1.性别：男性
2.年龄范围40至79岁
3.任何种族或人种
4.作为常规护理的部分安排前列腺活检并且同意在安排的活检前7天内抽取血液的男性
5.前列腺活检病理报告可用于提交给Caris，以及所有研究表格和患者样品。
6.理解研究的理解水平和签署同意书的适格性。
排除标准：
1.任何之前或正在进行的前列腺癌治疗，包括前列腺切除术或激素治疗。
2.之前除了前列腺癌或非黑素瘤皮肤癌以外的癌症诊断。
3.在血液采集30天内前列腺活检。
4.在进行抽血之前在采血当天进行DRE。
5.拒绝放血。
6.拒绝签署同意书表格。
适合参与前列腺血液采集项目的个体的种族、性别(研究限于男性)和人种特征应当反映出接受或寻求泌尿科医疗的受试者的人口统计学状况。根据这些人口统计学来包括受试者。没有个体基于种族、国家来源、人种、残疾或HIV状态排除在前列腺血液采集项目外。
患者或数据选择要求：数据选择将基于患者合格标准并且限于对应于该研究中包括的受试者的数据记录的子集(即，在实验室分析物数据可用的情况下)。数据字段包括用于(非-PHI)供体识别、QC和临床解释的那些，如表30中所示：
表30：患者数据
Figure BPA0000184824780003571
Figure BPA0000184824780003581
患者或数据采集要求：在抽血的机构在临床数据表格上获取数据字段。现场职员使用医疗记录和患者得到的信息来获取所有数据要素。将针对各种情况收集的数据在接收的48小时内输入数据库中。需要完成所有数据字段；如果任何一个没有完成，将查询发送到现场，并且要示在10个工作日内答复。预先选定的数据字段必须完成或将患者排除在分析外。
本领域技术人员将认识到可以按照相似的方案来开发和证实其他情况中包括循环生物生物标志物的生物印记，例如，针对其他疾病和前列腺癌以外的癌症的诊断、预后和/或治疗诊断评价。例如，表5中的生物标志物可以用作针对其他情况的生物印记的部分
实施例44：数据挖掘以鉴定生物标志物
已知微RNA调节mRNA的表达。已经形成了含有关于许多肿瘤类型的mRNA表达的信息的表达数据库。所述数据库含有针对好几千患者使用Illumina DASL微阵列(Illumina，Inc.，San Diego，CA)获得的数据。循环微囊泡(cMV)含有微RNA作为主要RNA物质，并且还含有mRNA。在该实施例中，在来自表达数据库的癌症肿瘤中差异表达的mRNA和cMV中表达的那些mRNA之间进行关联。发现在肿瘤组织中差异表达的mRNA也用于发现cMV中的微RNA靶标。
评价来自表达数据库的基因表达数据以发现前列腺癌(PCa+)、乳腺癌(BrCa)、肺癌(LCa)和结肠直肠癌(CRC)与匹配的正常组织(PCa-)之间以及癌症类型之间，统计学上最显著差异表达的基因(表31)。分析癌症样品(前列腺、结肠直肠、乳腺和肺)的表达数据(形式HT-12和REF-8)以检测癌症类型之间差异表达的基因。相似地，针对前列腺正常样品比较前列腺癌(PCa)样品以检测前列腺癌特异性探针。为了进行该分析，在分析之前通过采用20个任意选定阵列(6个乳腺癌、5个结肠直肠癌、5个肺癌和4个前列腺癌)的子集将表达数据标准化以产生分位数参照分布。然后将该数据集中的所有阵列相对参照分布标准化以确保每个阵列共有相同的分位数分布。接着，对于数据集中的各个探针分析标准化的表达数据。使用F-评分(也称为Fisher’s评分)统计，通过比较每个类别对(例如，前列腺癌vs.乳腺癌，以及前列腺癌vs.前列腺正常)检测差异表达的探针(及其相应的基因)。通过计算组标准偏差总和平方上的平均组差异的平方来获得该统计量，其在类别变异之间vs.类别变异内测量。在PCa+样品的平均是两组中的较低者的情况中，将F-评分设定为阴性。最后，使用F-评分的绝对值将F-评分分成降序序列，并且从列表中选择最高上/下调节的标志物。
表31：PCa+样品和所示样品之间统计学最显著差异表达的基因
Figure BPA0000184824780003591
对于前列腺癌，产生了最显著的过表达和表达不足的基因的列表。将这些基因与已经通过微阵列在来自前列腺癌患者的cMV中检测的mRNA的列表相比较。还发现了来自组织列表的一个基因AQP2在cMV中表达。然后使用针对可以影响这些mRNA表达的微RNA的TargetScan公共数据库将来自前列腺肿瘤组织的上调和下调基因的列表进行挖掘。检验的20个mRNA中有11个发现存在匹配的微RNA(表32)。然后将这个微RNA列表与我们发现在cMV中可靠检测的微RNA列表相比较。该比较揭示了在cMV中也发现了调节前列腺肿瘤组织中目标mRNA的10个微RNA(表32)。
表32：与差异表达的mRNA相关的微RNA
Figure BPA0000184824780003602
Figure BPA0000184824780003611
此外，发现为差异表达的mRNA常常指示蛋白质水平的差异。这种挖掘活动的结果鉴定了与可以用于区分前列腺癌与其他癌症的cMV相关的蛋白质(例如，KLK2)，所述其他癌症包括乳腺癌、肺癌和结肠癌。已知KLK2与前列腺组织相关。
实施例45：微RNA功能分析
可以发现微RNA在微囊泡包封的血液、HDL和LDL颗粒中以及核蛋白复合物(RNP)的成分中循环。可以使用可利用的技术来检测微RNA，所述技术如RT-qPCR或下一代测序。然而，处于生物活性状态的微RNA被Argonaute蛋白(Ago1-4)之一结合并激活。该实施例呈现了可以在单一反应中检测来自不同来源(包括但不限于细胞裂解物、体液、血浆、血清、分离的微囊泡等)的样品内给定微RNA的功能活性的分析。
该分析包括微珠、生物素偶联的合成RNA分子、抗生蛋白链菌素-PE、重组Argonaute2和RISC(RNA诱导的沉默复合物)反应缓冲成分。该分析的成分显示于图26中。如图26A中所示，生物素偶联的合成RNA分子含有3’接头/延伸区域262、中心miRNA靶向区域263和第二5’接头/延伸区域264。将RNA在3’端连接微珠261，且将5’端与生物素266偶联。将中心miRNA靶向区域263设计成与目标miRNA序列互补。任何目标微RNA可以用于该分析中；为了举例，在此仅使用了let-7a。使用抗生蛋白链菌素-PE(藻红蛋白)265来标记RNA的生物素末端。如果靶标let-7a存在于样品中，并且与Ago蛋白267(例如，重组Ago2(rAgo2))结合/关联，则let-7a将结合互补微RNA靶向区域263，并且随后通过Argonaute2的内切核苷酸切割活性在区域263切割合成的RNA。参见图26中的步骤268。一旦切割，合成RNA分子的5’端被释放，由此生物素/抗生蛋白链菌素-PE复合物与微珠261分离。参见图26B。接着，分离和洗涤微珠以除去切割的RNA，由此只留下剩余的未切割材料以及任何切割的RNA。该洗涤步骤后，将PE信号的差异与原始分析中存在的Ago-结合的靶微RNA267的浓度和活性相关联。在该实施例中，输入样品中Ago结合的let-7a的量决定了切割的RNA的水平。例如，如果不存在let-7a，则合成的RNA靶标区域263将保持不切割，并且信号强度将保持不改变。
图26C-E示意性地说明了可以用作该分析的输入的各种RNA来源。图26C说明了结合Ago蛋白269以形成核糖核酸复合物267的微RNA268。图26D说明了使用Ago的结合剂2610的Argonaute-微RNA复合物267的免疫沉淀。图26E说明例如来自细胞裂解物、体液或裂解的微囊泡Argonaute-微RNA复合物267的直接分析。
尽管本发明的优选实施方案已在本文中进行演示和描述，对于本领域的技术人员而言很明显这些实施方案仅以示例性的方式提供。本领域的技术人员在不脱离本发明的情况下可想到大量的改造、变动和替换。应当了解本文所述的本发明实施方案的多种不同的替代方案可被用于实施本发明。下列权利要求意图定义本发明的范围并且这些权利要求范围中的方法和结构及它们的等同物因此被涵盖在内。

Claims (104)

1.一种方法，其包括：
(a)测定生物样品中一种或多种生物标志物的存在或水平，其中所述一种或多种生物标志物包括一种或多种选自表5的生物标志物；和
(b)鉴定包括所述一种或多种生物标志物的存在或水平的生物印记。
2.权利要求1的方法，其中所述一种或多种生物标志物选自miR-22、let7a、miR-141、miR-182、miR-663、miR-155、mirR-125a-5p、miR-548a-5p、miR-628-5p、miR-517*、miR-450a、miR-920、hsa-miR-619、miR-1913、miR-224*、miR-502-5p、miR-888、miR-376a、miR-542-5p、miR-30b*、miR-1179及其组合。
3.权利要求1的方法，其中所述一种或多种生物标志物选自miR-22、let7a、miR-141、miR-920、miR-450a及其组合。
4.权利要求1的方法，其中所述一种或多种生物标志物包括选自表20-24任一个中的基因组成的组的信使RNA(mRNA)及其组合。
5.权利要求1的方法，其中所述一种或多种生物标志物包括选自A2ML1、BAX、C10orf47、Clorf162、CSDA、EIFC3、ETFB、GABARAPL2、GUK1、GZMH、HIST1H3B、HLA-A、HSP90AA1、NRGN、PRDX5、PTMA、RABAC1、RABAGAP1L、RPL22、SAP18、SEPW1、SOX1及其组合的信使RNA(mRNA)。
6.权利要求1的方法，其中所述一种或多种生物标志物包括选自A2ML1、GABARAPL2、PTMA、RABAC1、SOX1、EFTB及其组合的信使RNA(mRNA)。
7.权利要求1的方法，其中所述一种或多种生物标志物选自CA-125、CA19-9、c-反应蛋白、CD95、FAP-1、EGFR、EGFRvIII、阿朴脂蛋白AI、阿朴脂蛋白CIII、肌红蛋白、腱生蛋白C、MSH6、封闭蛋白-3、封闭蛋白-4、小窝蛋白-1、凝血因子III、CD9、CD36、CD37、CD53、CD63、CD81、CD136、CD147、Hsp70、Hsp90、Rab13、桥粒芯胶蛋白-1、EMP-2、CK7、CK20、GCDF15、CD82、Rab-5b、膜联蛋白V、MFG-E8、HLA-DR、miR200微RNA、miR-200c及其组合。
8.权利要求1的方法，其中所述一种或多种生物标志物选自CA-125、CA19-9、c-反应蛋白、CD95、FAP-1及其组合。
9.权利要求1的方法，其中所述一种或多种生物标志物选自hsa-miR-574-3p、hsa-miR-141、hsa-miR-432、hsa-miR-326、hsa-miR-2110、hsa-miR-181a-2*、hsa-miR-107、hsa-miR-301a、hsa-miR-484、hsa-miR-625*及其组合。
10.权利要求1的方法，其中所述一种或多种生物标志物选自hsa-miR-582-3p、hsa-miR-20a*、hsa-miR-375、hsa-miR-200b、hsa-miR-379、hsa-miR-572、hsa-miR-513a-5p、hsa-miR-577、hsa-miR-23a*、hsa-miR-1236、hsa-miR-609、hsa-miR-17*、hsa-miR-130b、hsa-miR-619、hsa-miR-624*、hsa-miR-198及其组合。
11.权利要求1的方法，其中所述一种或多种生物标志物包括miR-497。
12.权利要求1的方法，其中所述一种或多种生物标志物包括选自AQP2、BMP5、C16orf86、CXCL13、DST、ERCC1、GNAO1、KLHL5、MAP4K1、NELL2、PENK、PGF、POU3F1、PRSS21、SCML1、SEMG1、SMARCD3、SNAI2、TAF1C、TNNT3及其组合的信使RNA(mRNA)。
13.权利要求1的方法，其中所述一种或多种生物标志物包括选自ADRB2、ARG2、C22orf32、CYorf14、EIF1AY、FEV、KLK2、KLK4、LRRC26、MAOA、NLGN4Y、PNPLA7、PVRL3、SIM2、SLC30A4、SLC45A3、STX19、TRIM36、TRPM8及其组合的信使RNA(mRNA)。
14.权利要求1的方法，其中所述一种或多种生物标志物包括选自ADRB2、BAIAP2L2、C19orf33、CDX1、CEACAM6、EEF1A2、ERN2、FAM110B、FOXA2、KLK2、KLK4、LOC389816、LRRC26、MIPOL1、SLC45A3、SPDEF、TRIM31、TRIM36、ZNF613及其组合的信使RNA(mRNA)。
15.权利要求1的方法，其中所述一种或多种生物标志物包括选自ASTN2、CAB39L、CRIP1、FAM110B、FEV、GSTP1、KLK2、KLK4、LOC389816、LRRC26、MUC1、PNPLA7、SIM2、SLC45A3、SPDEF、TRIM36、TRPV6、ZNF613及其组合的信使RNA(mRNA)。
16.权利要求1的方法，其中所述一种或多种生物标志物包括选自miRs-26a+b、miR-15、miR-16、miR-195、miR-497、miR-424、miR-206、miR-342-5p、miR-186、miR-1271、miR-600、miR-216b、miR-519家族、miR-203及其组合的微RNA。
17.一种方法，其包括：
(a)从生物样品分离一种或多种核酸-蛋白质复合物；
(b)用所述一种或多种核酸-蛋白质复合物确定一种或多种核酸生物标志物的存在或水平；和
(c)鉴定包括所述一种或多种核酸生物标志物的存在或水平的生物印记。
18.权利要求17的方法，其中所述核酸-蛋白质复合物包含括选自一种或多种Argonaute家族成员、Ago1、Ago2、Ago3、Ago4、GW182(TNRC6A)、TNRC6B、TNRC6C、HNRNPA2B1、HNRPAB、ILF2、NCL(核仁素)、NPM1(核磷蛋白)、RPL10A、RPL5、RPLP1、RPS12、RPS19、SNRPG、TROVE2、阿朴脂蛋白、阿朴脂蛋白A、apo A-I、apo A-II、apo A-IV、apo A-V、阿朴脂蛋白B、apo B48、apo B100、阿朴脂蛋白C、apo C-I、apo C-II、apo C-III、apo C-IV、阿朴脂蛋白D(ApoD)、阿朴脂蛋白E(ApoE)、阿朴脂蛋白H(ApoH)、阿朴脂蛋白L、APOL1、APOL2、APOL3、APOL4、APOL5、APOL6、APOLD1及其组合的一种或多种蛋白质。
19.权利要求17的方法，其中所述核酸-蛋白质复合物包含选自一种或多种Argonaute家族成员、Ago1、Ago2、Ago3、Ago4、GW182(TNRC6A)及其组合的一种或多种蛋白质。
20.权利要求17的方法，其中所述核酸-蛋白质复合物包含一种或多种选自Ago2、阿朴脂蛋白I、GW182(TNRC6A)及其组合的蛋白质。
21.权利要求17的方法，其中所述一种或多种核酸包括一种或多种微RNA。
22.权利要求21的方法，其中所述一种或多种微RNA包括表5中的微RNA。
23.权利要求21的方法，其中所述一种或多种微RNA包括一种或多种选自miR-22、miR-16、miR-148a、miR-92a、miR-451、let7a及其组合的微RNA。
24.权利要求21的方法，其中所述核酸-蛋白质复合物包含一种或多种选自Ago2、阿朴脂蛋白I、GW182(TNRC6A)及其组合的蛋白质；并且所述一种或多种微RNA包括一种或多种选自miR-16和miR-92a及其组合的微RNA。
25.一种方法，其包括：
(a)检测来自生物样品的微囊泡群体中的一种或多种蛋白质生物标志物；
(b)确定与所检测的微囊泡群体相关的一种或多种核酸生物标志物的存在或水平；和
(c)鉴定包括所述一种或多种核酸的存在或水平的生物印记。
26.权利要求25的方法，其中将所述一种或多种核酸生物标志物的水平相对于所述一种或多种蛋白质生物标志物的水平标准化。
27.权利要求25的方法，其中所述一种或多种生物标志物包括一种或多种选自PCSA、Ago2、CD9及其组合的蛋白质。
28.权利要求25的方法，其中所述一种或多种核酸生物标志物包括一种或多种选自miR-22、miR-16、miR-148a、miR-92a、miR-451、let7a及其组合的微RNA。
29.权利要求25的方法，其中所述一种或多种蛋白质生物标志物包括PCSA和Ago2；并且所述一种或多种核酸生物标志物包括miR-22。
30.权利要求25的方法，其中所述一种或多种蛋白质生物标志物包括PCSA和/或CD9；并且所述一种或多种核酸生物标志物包括miR-22。
31.权利要求25的方法，其中所述一种或多种蛋白质生物标志物包括PCSA；并且所述一种或多种核酸生物标志物包括选自表22-24任一个中的信使RNA(mRNA)。
32.权利要求25的方法，其中所述生物印记包括从所述一种或多种蛋白质生物标志物和一种或多种核酸生物标志物的水平的比率计算的评分。
33.权利要求32的方法，其中所述一种或多种蛋白质生物标志物包括PCSA和PSMA，并且所述一种或多种核酸生物标志物包括miR-22和let7a。
34.权利要求32的方法，其中计算评分包括取以下的总和：
(a)微囊泡亚群体中miR-22有效负载的水平除以与微囊泡亚群体相关的PCSA蛋白质的水平的第一倍数；
(b)微囊泡亚群体中let7a有效负载的水平除以与微囊泡亚群体相关的PCSA蛋白质的水平的第二倍数；和
(c)与微囊泡亚群体相关的PSMA蛋白的水平的第三倍数。
35.权利要求34的方法，其中计算评分包括所述总和的单调变换。
36.权利要求34的方法，其中第一倍数是10。
37.权利要求34的方法，其中第二倍数是10。
38.权利要求34的方法，其中第三倍数是1。
39.前述任一项权利要求的方法，进一步包括将所述生物印记与参照生物印记进行比较，其中所述比较用于表征癌症。
40.权利要求39的方法，其中所述参照生物印记来自未患癌症的受试者。
41.权利要求39的方法，其中所述表征包括鉴定受试者中癌症的存在或风险，或鉴定受试者中癌症是转移性的或侵袭性的。
42.权利要求39的方法，其中所述比较步骤包括确定生物印记是否相对于参照生物印记有改变，由此提供癌症的预后、诊断或治疗诊断确定。
43.前述任一项权利要求的方法，其中所述生物样品包括体液。
44.权利要求43的方法，其中体液包括外周血、血清、血浆、腹水、尿液、脑脊液(CSF)、痰、唾液、骨髓、滑液、房水、羊水、耳垢、乳汁、支气管肺泡灌洗液、精液、前列腺液、考珀液或预射精液、女性射出液、汗液、排泄物、毛发、泪液、囊液、胸腔积液和腹水液、心包液、淋巴、食物糜、乳糜、胆汁、间质液、经血、脓、皮脂、呕吐物、阴道分泌物、粘膜分泌物、稀便、胰液、鼻腔灌洗液、支气管抽吸液、囊胚腔液或脐带血。
45.前述任一项权利要求的方法，其中所述生物样品包括尿液、血液或血液衍生物。
46.权利要求1-43任一项的方法，其中所述生物样品包括细胞培养物。
47.权利要求1-43任一项的方法，其中所述生物样品包括组织样品。
48.前述任一项权利要求的方法，其中所述生物样品含有一种或多种微囊泡。
49.权利要求48的方法，其中所述一种或多种生物标志物与所述一种或多种微囊泡相关。
50.权利要求48的方法，其中所述一种或多种微囊泡具有20nm至2000nm的直径。
51.权利要求48的方法，其中所述一种或多种微囊泡具有20nm至200nm的直径。
52.权利要求48的方法，其中所述一种或多种微囊泡经受尺寸排阻色谱、密度梯度离心、差速离心、纳米膜超滤、免疫吸附捕获、亲和纯化、亲和捕获、免疫分析、微流体分离、流式细胞分析或其组合。
53.权利要求48的方法，其中将所述一种或多种微囊泡接触一种或多种结合剂。
54.权利要求53的方法，其中所述一种或多种结合剂包括核酸、DNA分子、RNA分子、抗体、抗体片段、适体、类肽、zDNA、肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA)、凝集素、肽、枝状物、膜蛋白标记剂、化学化合物或其组合。
55.权利要求53的方法，其中所述一种或多种结合剂用于捕获和/或检测一种或多种微囊泡。
56.权利要求53的方法，其中所述一种或多种结合剂结合一种或多种微囊泡上的一种或多种表面抗原。
57.权利要求56的方法，其中所述一种或多种表面抗原包括一种或多种蛋白质。
58.权利要求57的方法，其中所述一种或多种蛋白质包括CD9、CD63、CD81、PSMA、PCSA、B7H3和EpCam中的一种或多种。
59.权利要求57的方法，其中所述一种或多种蛋白质包括四跨膜蛋白、CD9、CD63、CD81、CD63、CD9、CD81、CD82、CD37、CD52、Rab-5b、膜联蛋白V、MFG-E8或表3中的蛋白质中的一种或多种。
60.权利要求57的方法，其中所述一种或多种蛋白质包括表3-5任一个中的一种或多种蛋白质。
61.权利要求53的方法，其中所述一种或多种结合剂用于捕获所述一种或多种微囊泡。
62.权利要求61的方法，其中所述一种或多种生物标志物包括所述一种或多种捕获的微囊泡内的有效负载。
63.权利要求62的方法，其中所述有效负载包含一种或多种核酸、肽、蛋白质、脂质、抗原、碳水化合物和/或蛋白聚糖。
64.权利要求63的方法，其中所述核酸包括一种或多种DNA、mRNA、微RNA、snoRNA、snRNA、rRNA、tRNA、siRNA、hnRNA或shRNA。
65.权利要求62的方法，其中所述一种或多种生物标志物包括mRNA。
66.权利要求39的方法，其中所述癌症包括急性成淋巴细胞性白血病；急性骨髓性白血病；肾上腺皮质癌；AIDS相关癌症；AIDS相关淋巴瘤；肛门癌；阑尾癌；星形细胞瘤；非典型畸胎样瘤/横纹肌样瘤；基底细胞癌；膀胱癌；脑干胶质瘤；脑肿瘤(包括脑干胶质瘤、中枢神经系统非典型畸胎样瘤/横纹肌样瘤、中枢神经系统胚胎性瘤、星形细胞瘤、颅咽管瘤、成室管膜母细胞瘤、室管膜瘤、髓母细胞瘤、髓上皮瘤、中度分化的松果体实质肿瘤、幕上原始神经外胚层肿瘤和成松果体细胞瘤)；乳腺癌；支气管肿瘤；伯基特氏淋巴瘤；原发部位不明的癌症；类癌瘤；原发部位不明的癌瘤；中枢神经系统非典型畸胎样瘤/横纹肌样瘤；中枢神经系统胚胎性肿瘤；宫颈癌；儿童期癌症；脊索瘤；慢性淋巴细胞性白血病；慢性骨髓性白血病；慢性骨髓增殖紊乱；结肠癌；结肠直肠癌；颅咽管瘤；皮肤T细胞淋巴瘤；内分泌胰岛细胞瘤；子宫内膜癌；成室管膜母细胞瘤；室管膜瘤；食管癌；成感觉神经细胞瘤；尤文氏肉瘤；颅外生殖细胞瘤；性腺外生殖细胞肿瘤；肝外胆管癌；胆囊癌；胃的(胃)癌；胃肠道类癌肿瘤；胃肠道间质细胞瘤；胃肠道间质瘤(GIST)；妊娠滋养细胞肿瘤；神经胶质瘤；毛细胞白血病；头颈癌；心脏癌；霍奇金淋巴瘤；喉咽癌；眼内黑色素瘤；胰岛细胞瘤；卡波济氏肉瘤；肾癌；朗格汉斯细胞组织细胞增生症；喉癌；唇癌；肝癌；恶性纤维组织细胞瘤骨癌；髓母细胞瘤；髓上皮瘤；黑色素瘤；Merkel细胞癌；Merkel细胞皮肤癌；间皮瘤；隐匿原发性的转移性鳞状颈癌；口腔癌；多发性内分泌肿瘤综合征；多发性骨髓瘤；多发性骨髓瘤/浆细胞肿瘤；蕈样肉芽肿；骨髓发育异常综合征；骨髓增生性肿瘤；鼻腔癌；鼻咽癌；神经母细胞瘤；非霍奇金淋巴瘤；非黑色素瘤皮肤癌；非小细胞肺癌；口癌；口腔癌；口咽癌；骨肉瘤；其它脑和脊髓肿瘤；卵巢癌；卵巢上皮癌；卵巢生殖细胞肿瘤；卵巢低恶性潜在肿瘤；胰腺癌；乳头状瘤病；副鼻窦癌；甲状旁腺癌；盆腔癌；阴茎癌；咽癌；中度分化的松果体实质肿瘤；成松果体细胞瘤；垂体瘤；浆细胞肿瘤/多发性骨髓瘤；胸膜肺母细胞瘤；原发性中枢神经系统(CNS)淋巴瘤；原发性肝细胞肝癌；前列腺癌；直肠癌；肾癌；肾细胞(肾)癌；肾细胞癌；呼吸道癌；视网膜母细胞瘤；横纹肌肉瘤；唾液腺癌症；Sézary综合征；小细胞肺癌；小肠癌；软组织肉瘤；鳞状细胞癌；鳞状颈癌；胃(胃的)癌；幕上原始神经外胚层肿瘤；T细胞淋巴瘤；睾丸癌；咽喉癌；胸腺癌；胸腺瘤；甲状腺癌；移行细胞癌；肾盂和输尿管的移行细胞癌；滋养细胞肿瘤；输尿管癌；尿道癌；子宫癌；子宫肉瘤；阴道癌；外阴癌；
Figure FPA0000184824770000111
巨球蛋白血症；或Wilm’s肿瘤。
67.从属于权利要求1-6、9-10或12-38任一项的权利要求39的方法，其中所述癌症包括前列腺癌。
68.从属于权利要求1、11、15、17-22、25或26任一项的权利要求39的方法，其中所述癌症包括肺癌。
69.从属于权利要求1、13、17-22、25或26任一项的权利要求39的方法，其中所述癌症包括乳腺癌。
70.从属于权利要求1、14、17-22、25或26任一项的权利要求39的方法，其中所述癌症包括结肠直肠癌。
71.从属于权利要求1、7-8、17-22、25或26任一项的权利要求39的方法，其中所述癌症包括卵巢癌。
72.前述任一项权利要求的方法，其中所述方法在体外进行。
73.用于实施前述任一项权利要求的方法的试剂的用途。
74.一种包含配置为实施权利要求1-72任一项的方法的试剂的试剂盒。
75.权利要求74的试剂盒，其中所述试剂是能够结合表3-5、9-11、16-27、29或31-32任一个中的至少一种生物标志物的结合剂。
76.分离的PCSA+囊泡。
77.权利要求76的囊泡，包含一种或多种选自miR-22、let7a、miR-141、miR-182、miR-663、miR-155、mirR-125a-5p、miR-548a-5p、miR-628-5p、miR-517*、miR-450a、miR-920、hsa-miR-619、miR-1913、miR-224*、miR-502-5p、miR-888、miR-376a、miR-542-5p、miR-30b*、miR-1179及其组合的微RNA。
78.权利要求76的囊泡，包含一种或多种选自表20-24任一个中的信使RNA(mRNA)。
79.一种组合物，其包含：
(a)寡核苷酸，其包含栓系于基底的第一部分，与目标微RNA序列至少75％互补的第二部分，和包含标记的第三部分，其中第二部分位于第一和第三部分之间；和
(b)微RNA。
80.权利要求79的方法，其中所述基底包括平面基底、柱或珠。
81.权利要求79的方法，其中所述寡核苷酸的第二部分与(b)中的微RNA至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％互补。
82.权利要求79的方法，其中所述寡核苷酸的第二部分与目标微RNA序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％互补。
83.权利要求79的方法，其中所述寡核苷酸的第三部分是间接标记的。
84.权利要求79的方法，其中所述寡核苷酸的第三部分是生物素化的。
85.权利要求83的方法，其中所述标记包括抗生蛋白链菌素。
86.权利要求79的方法，其中所述寡核苷酸的第三部分的标记包括荧光标记、放射性标记或酶标记。
87.权利要求79的方法，其中所述标记包括藻红蛋白(PE)。
88.权利要求79的方法，其中所述寡核苷酸的第三部分是间接标记的。
89.权利要求79的方法，其中(b)中的所述微RNA处于与蛋白质的复合物中。
90.权利要求89的方法，其中所述蛋白质选自Argonaute家族成员、Ago1、Ago2、Ago3、Ago4、GW182(TNRC6A)、TNRC6B、TNRC6C、HNRNPA2B1、HNRPAB、ILF2、NCL(核仁素)、NPM1(核磷蛋白)、RPL10A、RPL5、RPLP1、RPS12、RPS19、SNRPG、TROVE2、阿朴脂蛋白、阿朴脂蛋白A、apo A-I、apo A-II、apo A-IV、apo A-V、阿朴脂蛋白B、apo B48、apo B100、阿朴脂蛋白C、apo C-I、apo C-II、apoC-III、apo C-IV、阿朴脂蛋白D(ApoD)、阿朴脂蛋白E(ApoE)、阿朴脂蛋白H(ApoH)、阿朴脂蛋白L、APOL1、APOL2、APOL3、APOL4、APOL5、APOL6和APOLD1。
91.权利要求89的方法，其中所述蛋白质选自Ago1、Ago2、Ago3和Ago4。
92.权利要求89的方法，其中所述蛋白质包括重组蛋白质。
93.权利要求92的方法，其中所述蛋白质包括Ago2。
94.权利要求79的方法，其中所述组合物包括生物样品。
95.权利要求79的方法，其中所述微RNA从生物样品分离。
96.权利要求94或95的方法，其中所述生物样品包括体液。
97.权利要求96的方法，其中所述体液包括外周血、血清、血浆、腹水、尿液、脑脊液(CSF)、痰、唾液、骨髓、滑液、房水、羊水、耳垢、乳汁、支气管肺泡灌洗液、精液、前列腺液、考珀液或预射精液、女性射出液、汗液、排泄物、毛发、泪液、囊液、胸腔积液和腹水液、心包液、淋巴、食物糜、乳糜、胆汁、间质液、经血、脓、皮脂、呕吐物、阴道分泌物、粘膜分泌物、稀便、胰液、鼻腔灌洗液、支气管抽吸液、囊胚腔液或脐带血。
98.权利要求96的方法，其中所述体液包括尿液、血液或血液衍生物。
99.权利要求95的方法，其中所述微RNA在与蛋白质的复合物中分离。
100.一种方法，其包括：
(i)提供权利要求79-99任一项的组合物；
(ii)在允许所述微RNA结合所述寡核苷酸的条件下孵育所述组合物；和
(iii)检测标记从基底切割的量。
101.权利要求100的方法，其中检测标记从基底切割的量包括检测在步骤(ii)之前和之后接触基底的标记的量。
102.权利要求100的方法，其中标记从基底切割指示与微RNA复合的蛋白质的存在。
103.权利要求102的方法，其中所述蛋白质选自Ago1、Ago2、Ago3和Ago4。
104.权利要求100的方法，其中实时观察标记从基底切割的量。
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Cited By (47)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104887694A (zh) * 2015-05-27 2015-09-09 中国科学院微生物研究所 一种靶向非编码rna的反义寡核苷酸及其在制备抗流感病毒药物中的应用
CN105713985A (zh) * 2016-04-22 2016-06-29 湖北工业大学 一种用于叉头转录因子o1基因突变检测的试剂及应用
WO2016127277A1 (zh) * 2015-02-10 2016-08-18 张曼 尿液载脂蛋白c-ii的应用
CN106405096A (zh) * 2015-07-31 2017-02-15 复旦大学附属华山医院 核仁素在制备胃癌诊断试剂和治疗药物中的应用
CN106636308A (zh) * 2015-10-30 2017-05-10 益善生物技术股份有限公司 一种检测皮肤癌相关标志物的探针组合及其试剂盒
CN107075568A (zh) * 2014-05-01 2017-08-18 阿姆斯特丹自由大学医学中心基金会 作为生物标记物的小ncRNA
CN107400728A (zh) * 2017-09-21 2017-11-28 西安医学院 miR‑155作为分子标记物在诊断子痫前期中的应用
CN107582525A (zh) * 2017-08-31 2018-01-16 孙诚谊 Trim31抑制剂磁性靶向载药微球在制备抑制pdac增殖能力药物中的应用
CN108026584A (zh) * 2015-09-11 2018-05-11 适体科学株式会社 非小细胞肺癌诊断用蛋白质生物标志物组及利用其的非小细胞肺癌诊断方法
CN108070645A (zh) * 2016-11-11 2018-05-25 中国科学院上海生命科学研究院 Stx-t在预防和/或治疗贫血或其相关疾病的应用
CN108410987A (zh) * 2018-03-12 2018-08-17 常州市第人民医院 一种肿瘤的生物标志物及其检测方法
CN108431605A (zh) * 2015-12-11 2018-08-21 善福德健康 用于监测乳腺癌治疗的试剂和方法
CN108559778A (zh) * 2018-04-28 2018-09-21 北京师范大学 多发性骨髓瘤分子分型及其在用药指导上的应用
CN108885220A (zh) * 2016-03-10 2018-11-23 新加坡科技研究局 用于诊断癌症的脂质生物标志物
CN109022586A (zh) * 2018-09-11 2018-12-18 朱伟 一种与宫颈癌辅助诊断相关的血浆miRNA标志物及其应用
CN109100496A (zh) * 2018-08-28 2018-12-28 东华大学 一种织物对皮肤湿敏感性影响的评价方法
CN109507425A (zh) * 2018-11-07 2019-03-22 国家纳米科学中心 基于热泳细胞外囊泡的前列腺癌症复发监控系统及方法
CN109642259A (zh) * 2017-02-17 2019-04-16 阿姆斯特丹自由大学医学中心基金会 使用肿瘤教育的血小板的针对癌症的群智能增强的诊断和治疗选择
CN109715802A (zh) * 2016-03-18 2019-05-03 卡里斯科学公司 寡核苷酸探针及其用途
CN109998481A (zh) * 2019-02-01 2019-07-12 中国科学院苏州生物医学工程技术研究所 基于光电倍增管的微弱光检测装置
WO2019201277A1 (en) * 2018-04-17 2019-10-24 Wang Mong Lien Method for blocking stress-induced tumor progression
CN110384796A (zh) * 2019-07-11 2019-10-29 南京医科大学 马铃薯样磷脂酶7的应用
CN110408694A (zh) * 2018-04-26 2019-11-05 胤安国际（辽宁）基因科技股份有限公司 评估替莫唑胺在治疗脑胶质瘤患者的敏感性的新方法
CN110499251A (zh) * 2018-05-17 2019-11-26 中国科学院大连化学物理研究所 高通量多参数的单细胞源性细胞外囊泡分析芯片及应用
CN110568449A (zh) * 2019-10-14 2019-12-13 自然资源部第二海洋研究所 一种风生粗糙海面激光反射、透射矩阵计算方法
CN110749734A (zh) * 2019-12-06 2020-02-04 四川大学华西医院 Gtf2i自身抗体检测试剂在制备肺癌筛查试剂盒中的用途
CN110872628A (zh) * 2018-08-30 2020-03-10 杨昆德 胞外囊泡作为生物标记以制备试剂盒的用途
CN111742371A (zh) * 2018-01-05 2020-10-02 维森盖特有限公司 使用光学断层扫描对细胞进行形态计量学基因分型以检测肿瘤突变负荷
CN111788487A (zh) * 2017-12-22 2020-10-16 坦佩雷大学注册基金会 用于治疗眼病的预测性生物标记物
CN111909999A (zh) * 2019-05-07 2020-11-10 上海交通大学医学院附属瑞金医院 miRNA组合及其在制备DLBCL预后的标记物中的应用
CN112063725A (zh) * 2020-09-14 2020-12-11 华南农业大学 鸡胫长和胫直径相关的ago3基因分子标记及应用
CN112501304A (zh) * 2020-12-17 2021-03-16 浙江清华长三角研究院 miRNA-424作为脑垂体瘤诊断标志物的应用
CN112578125A (zh) * 2019-09-27 2021-03-30 成都中医药大学 检测粪钙卫蛋白含量的试剂在制备卵巢病变筛查试剂盒中的用途
CN112666047A (zh) * 2021-01-14 2021-04-16 新疆大学 一种液体粘度检测方法
WO2021043340A3 (zh) * 2019-09-05 2021-04-22 南京安吉生物科技有限公司 一种肿瘤标志物aquaporin 2蛋白及其应用
CN113265463A (zh) * 2021-04-15 2021-08-17 山西医科大学 Fam84b在制备食管鳞癌预后评估试剂以及在靶向治疗食管鳞癌药物的筛选中的应用
CN113462782A (zh) * 2021-07-30 2021-10-01 中山大学肿瘤防治中心（中山大学附属肿瘤医院、中山大学肿瘤研究所） 鼻咽癌标志物及其应用
CN113646431A (zh) * 2018-12-20 2021-11-12 Abivax公司 生物标志物及在治疗病毒感染、炎症、或癌症中的用途
CN113721030A (zh) * 2021-08-30 2021-11-30 河南中医药大学 用于桥本甲状腺炎不同证候特征性自身抗体检测的生物标志物及其应用
CN113817672A (zh) * 2014-05-18 2021-12-21 儿童医学中心公司 涉及外排体的方法和组合物
CN113940999A (zh) * 2020-07-15 2022-01-18 中国农业大学 一种治疗非酒精性脂肪肝性肝病治疗靶点的应用
CN114196763A (zh) * 2021-12-14 2022-03-18 安徽农业大学 一种鸭剩余采食量相关的microRNA分子标记及其应用
CN114341364A (zh) * 2019-07-08 2022-04-12 阿尔兹卡生物科学公司 Tau病理靶向配体
CN114672572A (zh) * 2022-03-14 2022-06-28 上海市农业科学院 一种与肉鹅10周龄体重相关的分子标记及其应用
TWI805777B (zh) * 2018-06-08 2023-06-21 中央研究院 預測前列腺癌惡化之生物標記
CN117462521A (zh) * 2023-12-28 2024-01-30 成都金瑞基业生物科技有限公司 和厚朴酚在制备治疗脊索瘤药物中的用途
CN117778574A (zh) * 2023-12-25 2024-03-29 山东中医药大学 Mir937基因组拷贝数扩增在卵巢癌诊断和/或治疗中的应用

Families Citing this family (131)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102089444A (zh) 2008-05-14 2011-06-08 德玛泰克国际公司 利用核酸分析方法来诊断黑素瘤和太阳能雀斑
EP2295543A1 (en) * 2009-09-11 2011-03-16 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Method for the preparation of an influenza virus
NZ617003A (en) 2010-01-11 2015-04-24 Genomic Health Inc Method to use gene expression to determine likelihood of clinical outcome of renal cancer
KR20130056855A (ko) 2010-03-01 2013-05-30 카리스 라이프 사이언스 룩셈부르크 홀딩스 치료진단용 생물학적 지표들
AU2011237669B2 (en) 2010-04-06 2016-09-08 Caris Life Sciences Switzerland Holdings Gmbh Circulating biomarkers for disease
US9611511B2 (en) * 2010-04-20 2017-04-04 Comprehensive Biomarker Center Gmbh Complex miRNA sets as novel biomarkers for an acute coronary syndrome
US9417249B2 (en) * 2011-09-16 2016-08-16 University Of Louisville Research Foundation, Inc. Methods of predicting and decreasing the risk of pre-term birth
WO2013049680A1 (en) * 2011-09-28 2013-04-04 The General Hospital Corporation Cadherins as cancer biomarkers
US9447471B2 (en) * 2011-12-29 2016-09-20 Quest Diagnostics Investments Incorporated Microrna profiling for diagnosis of dysplastic nevi and melanoma
US9275334B2 (en) * 2012-04-06 2016-03-01 Applied Materials, Inc. Increasing signal to noise ratio for creation of generalized and robust prediction models
WO2013177699A1 (en) * 2012-05-28 2013-12-05 The Royal Institution For The Advancement Of Learning/Mcgill University Inflammation-enabling polypeptides and uses thereof
ES2800026T3 (es) * 2012-08-09 2020-12-23 Celgene Corp Tratamiento de enfermedades inmunitarias e inflamatorias
US10433740B2 (en) * 2012-09-12 2019-10-08 Heartflow, Inc. Systems and methods for estimating ischemia and blood flow characteristics from vessel geometry and physiology
CA2928520C (en) 2012-10-23 2023-03-14 Caris Life Sciences Switzerland Holdings, S.A.R.L. Aptamers and uses thereof
US10942184B2 (en) 2012-10-23 2021-03-09 Caris Science, Inc. Aptamers and uses thereof
EP2935628B1 (en) 2012-12-19 2018-03-21 Caris Life Sciences Switzerland Holdings GmbH Compositions and methods for aptamer screening
US20160230227A1 (en) * 2012-12-21 2016-08-11 The New York Stem Cell Foundation Methods of treating alzheimer's disease
US20140186332A1 (en) * 2012-12-28 2014-07-03 NX Pharmagen Biomarkers of preterm birth
US10928402B2 (en) 2012-12-28 2021-02-23 Nx Prenatal Inc. Treatment of spontaneous preterm birth
CN110106229B (zh) * 2013-01-03 2023-03-28 外来体诊断公司 用于分离微囊泡的方法
US10280463B2 (en) 2013-02-06 2019-05-07 Wake Forest University Health Sciences Identification of unique gene expression profiles in children with regressive autism spectrum disorder (ASD) and ileocolitis
ES2828510T3 (es) 2013-02-15 2021-05-26 Univ Nat Corp Tokyo Medical & Dental Agente terapéutico para tratar un cáncer en el que NRF2 está estabilizado
US20160007900A1 (en) * 2013-03-01 2016-01-14 The Regents Of The University Of California Point-of-Care Device for Monitoring Renal Function
WO2014150751A2 (en) 2013-03-15 2014-09-25 Novartis Ag Biomarkers associated with brm inhibition
CN103243161B (zh) * 2013-05-07 2015-02-25 中国医学科学院肿瘤医院 一种辅助预测食管鳞癌患者术后生存时间长短的产品
WO2014193999A2 (en) * 2013-05-28 2014-12-04 Caris Science, Inc. Biomarker methods and compositions
EP3004392B1 (en) 2013-05-30 2020-09-30 Genomic Health, Inc. Gene expression profile algorithm for calculating a recurrence score for a patient with kidney cancer
JP6443889B2 (ja) * 2013-08-08 2018-12-26 国立大学法人大阪大学 尿路上皮癌の診断または治療剤
JP2016533752A (ja) 2013-08-28 2016-11-04 カリス ライフ サイエンシズ スウィッツァーランド ホー オリゴヌクレオチドプローブおよびその使用
EP2843415B1 (en) * 2013-08-30 2020-04-01 LURIC Datenbank GbR Methods for cardiovascular risk assessment in diabetes patients
FR3010188B1 (fr) * 2013-09-05 2017-11-24 Univ Joseph Fourier - Grenoble 1 Procede theragnostique pour le traitement des rhumatismes inflammatoires chroniques
US20160237505A1 (en) * 2013-10-15 2016-08-18 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Serum mirnas for the prognosis of prostate cancer
WO2015068772A1 (ja) 2013-11-06 2015-05-14 Jsr株式会社 分離方法、検出方法、シグナル測定方法、疾患の判定方法、疾患治療薬の薬効評価方法、キット及び液状組成物
ES2824108T3 (es) 2014-03-12 2021-05-11 Icahn School Med Mount Sinai Método para identificar receptores de aloinjertos de riñón en riesgo de lesión crónica
WO2015164448A1 (en) 2014-04-22 2015-10-29 The Johns Hopkins University THE TGF(Beta)-MIR200-MIG6 PATHWAY AND ITS USE IN THE TREATMENT OF CANCER AS AN INDICATOR OF RESISTANCE TO EGFR INHIBITORS
US11268085B2 (en) 2014-05-27 2022-03-08 Exosome Diagnostics, Inc. Methods for isolating microvesicles and extracting nucleic acids from biological samples
JP6837838B2 (ja) 2014-06-18 2021-03-03 東レ株式会社 肝臓がんの検出キット又はデバイス及び検出方法
EP3161165B1 (en) 2014-06-26 2020-11-18 Icahn School of Medicine at Mount Sinai Method for diagnosing subclinical and clinical acute rejection by analysis of predictive gene sets, therapeutic agent for use in the treatment and kits for determining the expression
CA3084920C (en) * 2014-07-09 2023-02-28 Exosome Diagnostics, Inc. Methods for isolating microvesicles and extracting nucleic acids from biological samples
WO2016021673A1 (ja) * 2014-08-06 2016-02-11 協和発酵キリン株式会社 ｓｍａｌｌ ＲＮＡ含有医薬組成物の薬効を予測する方法
WO2016028843A2 (en) 2014-08-19 2016-02-25 President And Fellows Of Harvard College Rna-guided systems for probing and mapping of nucleic acids
US10444247B2 (en) * 2014-09-17 2019-10-15 Wallac Oy Method for determining the risk of preterm birth
CN116731958A (zh) * 2014-10-09 2023-09-12 细胞结构公司 胎盘来源的贴壁细胞外泌体及其用途
WO2016065204A1 (en) * 2014-10-22 2016-04-28 The George Washington University, A Congressionally Chartered Not-For-Profit Corporation Blood biomarkers for appendicitis and diagnostics methods using biomarkers
US20170319649A1 (en) * 2014-11-19 2017-11-09 The Board of Regents of the University of Texsas System Novel peptide activator of cyclin c-dependent kinase 8 (cdk8)
EP3230743A1 (en) 2014-12-11 2017-10-18 Wisconsin Alumni Research Foundation Methods for detection and treatment of colorectal cancer
US11497767B2 (en) 2015-02-18 2022-11-15 Enlivex Therapeutics R&D Ltd Combination immune therapy and cytokine control therapy for cancer treatment
US11596652B2 (en) 2015-02-18 2023-03-07 Enlivex Therapeutics R&D Ltd Early apoptotic cells for use in treating sepsis
US11304976B2 (en) 2015-02-18 2022-04-19 Enlivex Therapeutics Ltd Combination immune therapy and cytokine control therapy for cancer treatment
US11318163B2 (en) 2015-02-18 2022-05-03 Enlivex Therapeutics Ltd Combination immune therapy and cytokine control therapy for cancer treatment
US11000548B2 (en) 2015-02-18 2021-05-11 Enlivex Therapeutics Ltd Combination immune therapy and cytokine control therapy for cancer treatment
EP3865139B1 (en) 2015-02-18 2023-05-03 Enlivex Therapeutics Rdo Ltd Combination immune therapy and cytokine control therapy for cancer treatment
UA124612C2 (uk) * 2015-02-24 2021-10-20 Рупрехт-Карлс-Універсітет Гейдельберг Панель біомаркерів для виявлення раку
CA2979361A1 (en) 2015-03-09 2016-09-15 Caris Science, Inc. Method of preparing oligonucleotide libraries
US10571400B2 (en) * 2015-03-11 2020-02-25 The General Hospital Corporation Plasmonic nanoparticle immunoassay method
WO2016149358A1 (en) * 2015-03-16 2016-09-22 Duncan Ross Method of treatment comprising membrane-enclosed vesicle
EP3839510A3 (en) 2015-04-17 2021-08-25 Merck Sharp & Dohme Corp. Blood-based biomarkers of tumor sensitivity to pd-1 antagonists
AU2016250570B2 (en) 2015-04-21 2021-07-01 Enlivex Therapeutics Rdo Ltd Therapeutic pooled blood apoptotic cell preparations and uses thereof
WO2016182855A1 (en) * 2015-05-11 2016-11-17 The Regents Of The University Of California Methods of distinguishing ischemic stroke from intracerebral hemorrhage
WO2016198749A1 (en) * 2015-06-12 2016-12-15 Turun Yliopisto Diagnostic biomarkers, clinical variables, and techniques for selecting and using them
EP3314027A4 (en) 2015-06-29 2019-07-03 Caris Science, Inc. THERAPEUTIC OLIGONUCLEOTIDES
CA2993652A1 (en) 2015-07-28 2017-02-02 Caris Science, Inc. Targeted oligonucleotides
KR20170013621A (ko) * 2015-07-28 2017-02-07 (주) 넥셀 Ｍｉｌｋ ｆａｔ ｇｌｏｂｕｌｅ－ＥＧＦ ｆａｃｔｏｒ（ＭＦＧ－Ｅ８）을 이용한 조직섬유화 예방 또는 치료용 조성물
KR101819795B1 (ko) 2015-07-31 2018-01-18 가톨릭대학교 산학협력단 대장암 발병 진단 및 예측용 유전 마커
AU2016326742B2 (en) * 2015-09-24 2022-04-28 Caris Science, Inc. Method, apparatus, and computer program product for analyzing biological data
WO2017054058A1 (en) 2015-09-30 2017-04-06 Immunexpress Pty Ltd Pathogen biomarkers and uses therefor
EP3371324B1 (en) * 2015-11-06 2021-08-18 ImmuneXpress Pty Ltd Viral biomarkers and uses therefor
CN105288660B (zh) * 2015-11-19 2018-08-14 中国人民解放军第三军医大学 MiRNA-22在制备MMP14和Snail表达抑制剂中的应用
CN109072479A (zh) 2015-12-04 2018-12-21 Nx产前公司 使用循环微粒对自发性早产风险进行分层
WO2017100789A1 (en) * 2015-12-11 2017-06-15 Expression Pathology, Inc. Srm/mrm assays
CN105483246B (zh) * 2015-12-29 2019-01-22 北京泱深生物信息技术有限公司 基因的差异表达在口腔癌诊断中的应用
CA3014885A1 (en) 2016-02-18 2017-08-24 Enlivex Therapeutics Ltd. Combination immune therapy and cytokine control therapy for cancer treatment
TWI794171B (zh) 2016-05-11 2023-03-01 美商滬亞生物國際有限公司 Ｈｄａｃ抑制劑與ｐｄ-ｌ１抑制劑之組合治療
TWI808055B (zh) 2016-05-11 2023-07-11 美商滬亞生物國際有限公司 Hdac 抑制劑與 pd-1 抑制劑之組合治療
CN105925686B (zh) * 2016-05-12 2019-08-09 首都医科大学附属北京胸科医院 用于辅助检测非小细胞肺癌的标记物、引物以及检测方法
US11293017B2 (en) 2016-05-25 2022-04-05 Caris Science, Inc. Oligonucleotide probes and uses thereof
WO2017210662A1 (en) * 2016-06-03 2017-12-07 Castle Biosciences, Inc. Methods for predicting risk of recurrence and/or metastasis in soft tissue sarcoma
GB201615330D0 (en) * 2016-09-09 2016-10-26 Univ Of Birmingham The Method of diagnosis
WO2018053228A1 (en) * 2016-09-15 2018-03-22 The Regents Of The University Of California Biomarkers for bipolar disorder and schizophrenia
US20190310258A1 (en) * 2016-10-28 2019-10-10 Japanese Foundation For Cancer Research Biomarker, method for searching disease-related gene, and renal cancer marker
CN106706925B (zh) * 2016-12-12 2018-08-10 北京大学人民医院 一种筛查或辅助诊断炎症性肠病的方法及适用于该方法的试剂盒
CN106755406A (zh) * 2016-12-22 2017-05-31 亚能生物技术（深圳）有限公司 一种卵巢癌检测产品及试剂盒
WO2018119411A1 (en) * 2016-12-23 2018-06-28 Trustees Of Boston University Classification of diffuse large b-cell lymphoma
CN107099584A (zh) * 2017-04-06 2017-08-29 哈尔滨医科大学 一种与结直肠癌转移及预后相关的分子标记物及其应用
EP3631462A1 (en) * 2017-05-24 2020-04-08 Koninklijke Philips N.V. Diagnostics of gingivitis based on salivary il-1beta and hgf
US20180357361A1 (en) * 2017-06-13 2018-12-13 Feliks Frenkel Systems and methods for identifying responders and non-responders to immune checkpoint blockade therapy
KR102120659B1 (ko) * 2017-07-06 2020-06-11 중앙대학교 산학협력단 난소과립막세포암 또는 자궁내막암의 진단 및 치료를 위한 마이크로rna-1236의 용도
CN107658029A (zh) * 2017-09-29 2018-02-02 杭州电子科技大学 一种全新的分布式和私有化miRNA‑疾病联系预测方法
CN108085316B (zh) * 2017-12-25 2021-02-09 中国人民解放军第四军医大学 一种通过抑制微小核糖核酸来促进小鼠视网膜前体细胞体外扩增的方法
CN107937621A (zh) * 2018-01-12 2018-04-20 南方医科大学皮肤病医院（广东省皮肤病医院、广东省皮肤性病防治中心、中国麻风防治研究中心） miRNA的应用、应用其的产品及检测方法
US11976332B2 (en) 2018-02-14 2024-05-07 Dermtech, Inc. Gene classifiers and uses thereof in non-melanoma skin cancers
JP7464279B2 (ja) 2018-04-16 2024-04-09 アイカーン スクール オブ メディスン アット マウント シナイ レシピエント血液における移植前トランスクリプトームシグネチャーを使用した急性拒絶反応および腎臓同種異系移植喪失の予測のための方法およびキット
US20210238690A1 (en) * 2018-04-26 2021-08-05 Intellexon Gmbh Hla-j and medical/diagnostic uses thereof
CN108796084A (zh) * 2018-06-27 2018-11-13 深圳天烁生物科技有限公司 一种卵巢癌检测试剂盒及检测方法
CN109055556A (zh) * 2018-08-27 2018-12-21 中山大学 一种用于诊断肺癌转移的lncRNA检测试剂盒及其应用
CA3111802A1 (en) * 2018-09-06 2020-03-12 The Council Of The Queensland Institute Of Medical Research Biomarkers for cancer therapy
CN109486817A (zh) * 2018-11-13 2019-03-19 南京医科大学第二附属医院 一种长链非编码rna及其组合物在诊断治疗胆管癌中的应用
US20200174016A1 (en) * 2018-11-30 2020-06-04 Universitätsmedizin Der Johannes Gutenberg-Universität Mainz Myb-related transcription factor (mypop) as diagnostic marker and therapeutic target for tumor therapy
TWI758670B (zh) * 2018-12-24 2022-03-21 奎克生技光電股份有限公司 健康風險評估方法
EP3709023B1 (en) * 2019-03-15 2022-03-16 Kuen-Der Yang Devices and methods for isolating matters of interest
JP7343868B2 (ja) * 2019-03-19 2023-09-13 国立大学法人愛媛大学 癌の予防及び／又は治療薬、癌マーカー、癌診断キット、又は生体試料の測定方法
AU2020247911A1 (en) 2019-03-26 2021-11-11 Dermtech, Inc. Novel gene classifiers and uses thereof in skin cancers
KR102203850B1 (ko) * 2019-04-09 2021-01-18 사회복지법인 삼성생명공익재단 신경교종의 진단 또는 예후 예측용 조성물 및 이에 관한 정보를 제공하는 방법
WO2020234617A1 (en) * 2019-05-22 2020-11-26 Biomerieux Methods and systems for manufacturing a production assay reactor
US20220326241A1 (en) * 2019-08-12 2022-10-13 Baylor College Of Medicine Proteogenomic methods for diagnosing cancer
CN110609078B (zh) * 2019-09-20 2022-03-11 南京谱利健生物技术有限公司 一种检测蛋白磷酸化和乙酰氨基葡萄糖化关联作用的方法
US20230005576A1 (en) * 2019-12-05 2023-01-05 Multiplai Health Ltd. Analysis of selectively normalized spatial representations of data
BR112022011328A2 (pt) * 2019-12-09 2022-08-23 Beth Israel Deaconess Medical Ct Inc Método para determinar o risco de um evento trombótico em um paciente com câncer, método para diagnosticar e tratar uma condição trombótica em um paciente com câncer, método para monitorar o risco de uma condição trombótica em um paciente com câncer em tratamento, kit, método para examinar ppia, pdia3 e pelo menos um dentre eif5a, eif4h, eif4a3, ube2n, ube2l3, ube2i e hsp70 em uma amostra de soro ou plasma e método para examinar uma combinação de marcadores em uma amostra de fluido biológico obtida de um indivíduo humano
EP4083624A4 (en) * 2019-12-27 2023-06-21 FUJIFILM Corporation METHODS TO ASSIST IN THE DIAGNOSIS OF METASTATIC CASTRATION-RESISTANT PROSTATE CANCER
JP7471898B2 (ja) 2020-04-17 2024-04-22 合同会社Ｈ．Ｕ．グループ中央研究所 胆管がんのバイオマーカー
CN115702351A (zh) * 2020-04-17 2023-02-14 国立医药品食品卫生研究所长 重症药疹的蛋白质诊断生物标记物
WO2022010919A2 (en) * 2020-07-06 2022-01-13 Cornell University Exosomal tumor biomarkers and collections thereof
US20230255948A1 (en) * 2020-07-31 2023-08-17 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Combination Therapy for Cancer
CN111763716B (zh) * 2020-08-11 2022-08-23 河南省畜牧总站 黄牛mogat1基因snp标记辅助选择生长性状的方法及应用
GB202014819D0 (en) * 2020-08-24 2020-11-04 Imperial College Innovations Ltd A method for determining a diagnostic outcome
WO2022054976A1 (ko) * 2020-09-08 2022-03-17 (주)유로테크 전립선암 진단 점수 계산 방법 및 그 용도
EP4226159A4 (en) * 2020-10-05 2024-07-03 Gina Life Diagnostics Ltd IDENTIFICATION AND CHARACTERIZATION OF SPECIFIC BIOMARKERS OF OVARIAN CANCER IN VAGINAL SECRETIONS
EP4269613A1 (en) 2020-12-24 2023-11-01 Pontificia Universidad Católica De Chile In-vitro method for diagnosing and predicting the aggressiveness of thyroid cancer, and the precision surgery options and type to be used to remove a tumour from a patient; kit; reagents forming the kit; and use of the reagents and use of molecular markers as part of the method
CN112904028B (zh) * 2021-01-21 2023-11-24 宁波职业技术学院 一种血清淀粉样蛋白a质控品及其制备方法
CN112646895A (zh) * 2021-01-22 2021-04-13 深圳科诺医学检验实验室 检测基因表达量的引物、探针、试剂盒、检测方法及应用
KR102632724B1 (ko) * 2021-03-02 2024-02-05 인하대학교 산학협력단 췌장암의 전이 예측 또는 치료용 조성물
WO2022251655A1 (en) * 2021-05-28 2022-12-01 Guardant Health, Inc. Compositions and methods for assaying circulating molecules
EP4124661A1 (en) * 2021-07-26 2023-02-01 Koninklijke Philips N.V. Personalization in prostate cancer by use of the prostate cancer pde4d7 knock-down score
RU2766774C1 (ru) * 2021-07-28 2022-03-15 федеральное государственное бюджетное учреждение «Национальный медицинский исследовательский центр онкологии» Министерства здравоохранения Российской Федерации Малоинвазивный способ диагностики метастатического поражения регионарных лимфатических узлов у больных раком шейки матки на основании показателя копийности генов CCND1 и PPARGC1A
WO2023152133A1 (en) * 2022-02-08 2023-08-17 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Method for diagnosing colorectal cancer
CN114381529B (zh) * 2022-03-16 2022-06-10 上海晟燃生物科技有限公司 Actr10与ca125联合在卵巢癌检测中的应用和试剂盒
WO2024192004A1 (en) * 2023-03-12 2024-09-19 Novelna Inc. Ovarian cancer detection proteins and methods of use thereof
WO2024192009A1 (en) * 2023-03-12 2024-09-19 Novelna Inc. Cervical cancer detection proteins and methods of use thereof
WO2024192027A1 (en) * 2023-03-12 2024-09-19 Novelna Inc. Kidney cancer detection proteins and methods of use thereof
WO2024192031A1 (en) * 2023-03-12 2024-09-19 Novelna Inc. Melanoma detection proteins and methods of use thereof
CN116555432B (zh) * 2023-07-05 2023-09-05 广州凯普医药科技有限公司 一种膀胱癌快速检测试剂盒

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010056337A2 (en) * 2008-11-12 2010-05-20 Caris Mpi, Inc. Methods and systems of using exosomes for determining phenotypes
US20100267574A1 (en) * 2006-10-20 2010-10-21 The Washington University Predicting lung cancer survival using gene expression
US20100304989A1 (en) * 2009-02-11 2010-12-02 Von Hoff Daniel D Molecular profiling of tumors
US20110104717A1 (en) * 2008-07-10 2011-05-05 Nodality, Inc. Methods for diagnosis, prognosis and methods of treatment

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2008231393A1 (en) * 2007-03-27 2008-10-02 Rosetta Genomics Ltd. Gene expression signature for classification of cancers
JP5349838B2 (ja) * 2007-11-30 2013-11-20 和光純薬工業株式会社 ｓｍａｌｌＲＮＡの取得用担体、取得方法及び取得用試薬
JP2011517283A (ja) * 2008-02-28 2011-06-02 ジ・オハイオ・ステイト・ユニバーシティ・リサーチ・ファウンデイション 前立腺関連障害の予後診断及び治療のためのマイクロｒｎａに基づく方法及び組成物
EP2358912B1 (en) * 2008-10-30 2016-10-12 Caris Life Sciences Switzerland Holdings GmbH Methods for assessing rna patterns
EP2421972A2 (en) * 2009-04-24 2012-02-29 The Board of Regents of The University of Texas System Modulation of gene expression using oligomers that target gene regions downstream of 3' untranslated regions

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100267574A1 (en) * 2006-10-20 2010-10-21 The Washington University Predicting lung cancer survival using gene expression
US20110104717A1 (en) * 2008-07-10 2011-05-05 Nodality, Inc. Methods for diagnosis, prognosis and methods of treatment
WO2010056337A2 (en) * 2008-11-12 2010-05-20 Caris Mpi, Inc. Methods and systems of using exosomes for determining phenotypes
US20100304989A1 (en) * 2009-02-11 2010-12-02 Von Hoff Daniel D Molecular profiling of tumors

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JASON D. ARROYO等: "Argonaute2 complexes carry a population of circulating microRNAs independent of vesicles in human plasma", 《PNAS》, vol. 108, no. 12, 22 March 2011 (2011-03-22), pages 5003 - 5008 *
TURCHINOVICH ET AL.: "Characterization of extracellular circulating microRNA", 《NUCLEIC ACIDS RESEARCH》, vol. 39, no. 16, 24 May 2011 (2011-05-24) *
周嘉敏等: "Argonaute家族与肿瘤的研究进展", 《实用医学杂志》, vol. 27, no. 8, 30 April 2011 (2011-04-30) *

Cited By (63)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107075568A (zh) * 2014-05-01 2017-08-18 阿姆斯特丹自由大学医学中心基金会 作为生物标记物的小ncRNA
CN113817672A (zh) * 2014-05-18 2021-12-21 儿童医学中心公司 涉及外排体的方法和组合物
WO2016127277A1 (zh) * 2015-02-10 2016-08-18 张曼 尿液载脂蛋白c-ii的应用
CN104887694A (zh) * 2015-05-27 2015-09-09 中国科学院微生物研究所 一种靶向非编码rna的反义寡核苷酸及其在制备抗流感病毒药物中的应用
CN104887694B (zh) * 2015-05-27 2018-08-24 中国科学院微生物研究所 一种靶向非编码rna的反义寡核苷酸及其在制备抗流感病毒药物中的应用
CN106405096A (zh) * 2015-07-31 2017-02-15 复旦大学附属华山医院 核仁素在制备胃癌诊断试剂和治疗药物中的应用
CN108026584B (zh) * 2015-09-11 2021-12-10 适体科学株式会社 非小细胞肺癌诊断用蛋白质生物标志物组及利用其的非小细胞肺癌诊断方法
CN108026584A (zh) * 2015-09-11 2018-05-11 适体科学株式会社 非小细胞肺癌诊断用蛋白质生物标志物组及利用其的非小细胞肺癌诊断方法
CN106636308A (zh) * 2015-10-30 2017-05-10 益善生物技术股份有限公司 一种检测皮肤癌相关标志物的探针组合及其试剂盒
CN106636308B (zh) * 2015-10-30 2021-03-02 益善生物技术股份有限公司 一种检测皮肤癌相关标志物的探针组合及其试剂盒
CN108431605A (zh) * 2015-12-11 2018-08-21 善福德健康 用于监测乳腺癌治疗的试剂和方法
CN108885220A (zh) * 2016-03-10 2018-11-23 新加坡科技研究局 用于诊断癌症的脂质生物标志物
CN109715802A (zh) * 2016-03-18 2019-05-03 卡里斯科学公司 寡核苷酸探针及其用途
CN105713985A (zh) * 2016-04-22 2016-06-29 湖北工业大学 一种用于叉头转录因子o1基因突变检测的试剂及应用
CN105713985B (zh) * 2016-04-22 2019-08-02 湖北工业大学 一种用于叉头转录因子o1基因突变检测的试剂及应用
CN108070645A (zh) * 2016-11-11 2018-05-25 中国科学院上海生命科学研究院 Stx-t在预防和/或治疗贫血或其相关疾病的应用
CN109642259A (zh) * 2017-02-17 2019-04-16 阿姆斯特丹自由大学医学中心基金会 使用肿瘤教育的血小板的针对癌症的群智能增强的诊断和治疗选择
CN107582525A (zh) * 2017-08-31 2018-01-16 孙诚谊 Trim31抑制剂磁性靶向载药微球在制备抑制pdac增殖能力药物中的应用
CN107400728A (zh) * 2017-09-21 2017-11-28 西安医学院 miR‑155作为分子标记物在诊断子痫前期中的应用
CN111788487A (zh) * 2017-12-22 2020-10-16 坦佩雷大学注册基金会 用于治疗眼病的预测性生物标记物
CN111742371A (zh) * 2018-01-05 2020-10-02 维森盖特有限公司 使用光学断层扫描对细胞进行形态计量学基因分型以检测肿瘤突变负荷
CN108410987B (zh) * 2018-03-12 2023-05-02 常州市第一人民医院 一种肿瘤的生物标志物及其检测方法
CN108410987A (zh) * 2018-03-12 2018-08-17 常州市第人民医院 一种肿瘤的生物标志物及其检测方法
WO2019201277A1 (en) * 2018-04-17 2019-10-24 Wang Mong Lien Method for blocking stress-induced tumor progression
CN110408694A (zh) * 2018-04-26 2019-11-05 胤安国际（辽宁）基因科技股份有限公司 评估替莫唑胺在治疗脑胶质瘤患者的敏感性的新方法
CN108559778A (zh) * 2018-04-28 2018-09-21 北京师范大学 多发性骨髓瘤分子分型及其在用药指导上的应用
CN110499251A (zh) * 2018-05-17 2019-11-26 中国科学院大连化学物理研究所 高通量多参数的单细胞源性细胞外囊泡分析芯片及应用
TWI805777B (zh) * 2018-06-08 2023-06-21 中央研究院 預測前列腺癌惡化之生物標記
CN109100496A (zh) * 2018-08-28 2018-12-28 东华大学 一种织物对皮肤湿敏感性影响的评价方法
CN109100496B (zh) * 2018-08-28 2021-07-20 东华大学 一种织物对皮肤湿敏感性影响的评价方法
CN110872628A (zh) * 2018-08-30 2020-03-10 杨昆德 胞外囊泡作为生物标记以制备试剂盒的用途
CN109022586B (zh) * 2018-09-11 2022-11-29 朱伟 一种与宫颈癌辅助诊断相关的血浆miRNA标志物及其应用
CN109022586A (zh) * 2018-09-11 2018-12-18 朱伟 一种与宫颈癌辅助诊断相关的血浆miRNA标志物及其应用
CN109507425A (zh) * 2018-11-07 2019-03-22 国家纳米科学中心 基于热泳细胞外囊泡的前列腺癌症复发监控系统及方法
CN113646431A (zh) * 2018-12-20 2021-11-12 Abivax公司 生物标志物及在治疗病毒感染、炎症、或癌症中的用途
CN109998481A (zh) * 2019-02-01 2019-07-12 中国科学院苏州生物医学工程技术研究所 基于光电倍增管的微弱光检测装置
CN109998481B (zh) * 2019-02-01 2024-01-30 中国科学院苏州生物医学工程技术研究所 基于光电倍增管的微弱光检测装置
CN111909999B (zh) * 2019-05-07 2023-03-07 上海交通大学医学院附属瑞金医院 miRNA组合及其在制备DLBCL预后的标记物中的应用
CN111909999A (zh) * 2019-05-07 2020-11-10 上海交通大学医学院附属瑞金医院 miRNA组合及其在制备DLBCL预后的标记物中的应用
CN114341364A (zh) * 2019-07-08 2022-04-12 阿尔兹卡生物科学公司 Tau病理靶向配体
CN110384796A (zh) * 2019-07-11 2019-10-29 南京医科大学 马铃薯样磷脂酶7的应用
WO2021043340A3 (zh) * 2019-09-05 2021-04-22 南京安吉生物科技有限公司 一种肿瘤标志物aquaporin 2蛋白及其应用
CN112578125B (zh) * 2019-09-27 2022-10-25 成都中医药大学 检测粪钙卫蛋白含量的试剂在制备卵巢病变筛查试剂盒中的用途
CN112578125A (zh) * 2019-09-27 2021-03-30 成都中医药大学 检测粪钙卫蛋白含量的试剂在制备卵巢病变筛查试剂盒中的用途
CN110568449B (zh) * 2019-10-14 2021-04-16 自然资源部第二海洋研究所 一种风生粗糙海面激光反射、透射矩阵计算方法
CN110568449A (zh) * 2019-10-14 2019-12-13 自然资源部第二海洋研究所 一种风生粗糙海面激光反射、透射矩阵计算方法
CN110749734A (zh) * 2019-12-06 2020-02-04 四川大学华西医院 Gtf2i自身抗体检测试剂在制备肺癌筛查试剂盒中的用途
CN113940999B (zh) * 2020-07-15 2022-11-29 中国农业大学 一种治疗非酒精性脂肪肝性肝病治疗靶点的应用
CN113940999A (zh) * 2020-07-15 2022-01-18 中国农业大学 一种治疗非酒精性脂肪肝性肝病治疗靶点的应用
CN112063725A (zh) * 2020-09-14 2020-12-11 华南农业大学 鸡胫长和胫直径相关的ago3基因分子标记及应用
CN112501304A (zh) * 2020-12-17 2021-03-16 浙江清华长三角研究院 miRNA-424作为脑垂体瘤诊断标志物的应用
CN112666047B (zh) * 2021-01-14 2022-04-29 新疆大学 一种液体粘度检测方法
CN112666047A (zh) * 2021-01-14 2021-04-16 新疆大学 一种液体粘度检测方法
CN113265463A (zh) * 2021-04-15 2021-08-17 山西医科大学 Fam84b在制备食管鳞癌预后评估试剂以及在靶向治疗食管鳞癌药物的筛选中的应用
CN113462782A (zh) * 2021-07-30 2021-10-01 中山大学肿瘤防治中心（中山大学附属肿瘤医院、中山大学肿瘤研究所） 鼻咽癌标志物及其应用
CN113721030A (zh) * 2021-08-30 2021-11-30 河南中医药大学 用于桥本甲状腺炎不同证候特征性自身抗体检测的生物标志物及其应用
CN113721030B (zh) * 2021-08-30 2024-02-13 河南中医药大学 用于桥本甲状腺炎不同证候特征性自身抗体检测的生物标志物及其应用
CN114196763A (zh) * 2021-12-14 2022-03-18 安徽农业大学 一种鸭剩余采食量相关的microRNA分子标记及其应用
CN114196763B (zh) * 2021-12-14 2023-05-12 安徽农业大学 一种鸭剩余采食量相关的microRNA分子标记及其应用
CN114672572A (zh) * 2022-03-14 2022-06-28 上海市农业科学院 一种与肉鹅10周龄体重相关的分子标记及其应用
CN117778574A (zh) * 2023-12-25 2024-03-29 山东中医药大学 Mir937基因组拷贝数扩增在卵巢癌诊断和/或治疗中的应用
CN117462521A (zh) * 2023-12-28 2024-01-30 成都金瑞基业生物科技有限公司 和厚朴酚在制备治疗脊索瘤药物中的用途
CN117462521B (zh) * 2023-12-28 2024-04-05 成都金瑞基业生物科技有限公司 和厚朴酚在制备治疗脊索瘤药物中的用途

Also Published As

Publication number Publication date
WO2012174282A2 (en) 2012-12-20
BR112013032232A2 (pt) 2016-09-20
JP2014519340A (ja) 2014-08-14
WO2012174282A3 (en) 2013-02-07
CA2839530A1 (en) 2012-12-20
KR20140072014A (ko) 2014-06-12
US20140220580A1 (en) 2014-08-07
EP2721179A2 (en) 2014-04-23
AU2012271516A1 (en) 2014-01-23
EP2721179A4 (en) 2014-10-01

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US20140148348A1 (en) Dectection of gastrointestinal disorders
US20160041153A1 (en) Biomarker compositions and markers
US20150024961A1 (en) Methods and systems of using biomarkers for determining phenotypes
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