CN112501304A - miRNA-424作为脑垂体瘤诊断标志物的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了miRNA‑424作为脑垂体瘤诊断标志物以及制备或筛选治疗脑垂体瘤药物的应用。本发明首次发现了miRNA‑424表达水平与脑垂体瘤的发生有关,通过检测患者miRNA‑424的表达水平,可以判断受试者是否患有脑垂体瘤的风险,从而指导临床医师给受试者提供预防方案或者治疗方案。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域,尤其涉及脑垂体瘤的miRNA诊断标志物,具体涉及miRNA-424作为脑垂体瘤诊断标志物的应用。
背景技术
MicroRNAs(miRNAs)是一种相对近期发现的在真核生物中具有调控功能的非编码RNA。成熟的miRNA是一种单链的RNA分子,包含大约19-23个核苷酸,由较长的初级转录物经过一系列酶的剪切加工过程产生。
miRNA主要在转录后水平参与基因表达调控。miRNA通过序列互补的方式与靶基因3’非翻译区的miRNA识别原件结合,通过阻断蛋白质翻译机器或通过使mRNA转录物与核糖体分离从而阻止靶基因的翻译。miRNA也可以通过类似RNA干扰的方式诱导靶mRNA的降解。与小干扰RNA(siRNA)不同的是,每个miRNA可以有多个靶基因,而几个miRNA也可以有同一个靶基因。这种复杂的调节网络使得生物体内一个miRNA可能调控多个基因的表达,而通过多个miRNA的组合可以精细调控某个基因的表达。生物信息学的分析表明可能有大约30%编码蛋白质的基因可以被miRNA调控。
近些年来,脑垂体瘤的病理机制研究取得了很大进展,一些原癌基因和抑癌基因相继被发现。也有一些研究表明与其它肿瘤类似,脑垂体瘤中也有异常的miRNA表达。目前为止脑垂体瘤中只有个别的miRNA及其靶基因的关系被鉴定出来。例如:miR-15a和miR-16-1在分泌生长素、催乳素或促肾上腺皮质激素的脑垂体瘤中表达较低;let-7很可能部分通过调控HMGA2的表达在脑垂体瘤中发挥作用。也有个别文献报道脑垂体瘤某亚型中miRNA的基因芯片分析结果,并发现某些miRNA可能与脑垂体瘤的生长、凋亡或某个信号通路有关。
虽然近年来的研究发现脑垂体瘤中存在miRNA的异常表达,并且miRNA很可能在脑垂体瘤进展中发挥重要功能,但整体而言对于miRNA及其靶基因在脑垂体瘤中病理机制的研究还很少,特别是包含脑垂体瘤各种亚型的比较全面的miRNA分析还没有展开。对于大规模的研究应用miRNA表达特征区分脑垂体瘤的研究还很欠缺。目前为止,只有少数miRNA及其靶基因在脑垂体瘤中的功能被鉴定出来,更多的miRNA及其靶基因在调控脑垂体瘤进展中的作用需要被发现。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种可用于诊断脑垂体瘤的miRNA标记物,即:miRNA-424;该miRNA-424具有作为脑垂体瘤诊断标志物的用途以及制备或筛选治疗脑垂体瘤药物的用途。
具体技术方案如下:
本发明提供了miRNA-424在作为脑垂体瘤诊断标志物中的应用。所述miRNA-424选自以下组中的至少一种:miRNA-424初始miRNA、miRNA-424前体miRNA、成熟miRNA424;所述miRNA-424初始miRNA能在人细胞内被剪切并表达为成熟miRNA-424;所述miRNA-424前体miRNA能在人细胞内被剪切并表达为成熟miRNA-424。
本发明的miRNA-424包括组成型核酸分子的功能等同物,即突变体,其显示完整miRNA-424核酸分子相同的功能,尽管它们通过核苷酸残基的缺失、置换或者插入而突变。
为了保证miRNA的稳定性,可以在miRNA的一端或者两端增加保护碱基,如TT,也可对miRNA碱基进行修饰,但是不影响miRNA的功能。因此,在不影响miRNA-424功能的前提下,对miRNA-424进行碱基修饰或者增加碱基获得的序列同样包含在本发明的保护范围之内。
本发明具体实施方式中,采用的是成熟miRNA-424,序列如图2所示。虽然在具体实施方式中所使用的是成熟miRNA-424,但是初始miRNA(pi-miRNA-424)、前体miRNA(pre-miRNA-424)将可以获得与成熟miRNA-424同样的技术效果,因为细胞有进一步将初始miRNA(pi-miRNA-424)、前体miRNA(pre-miRNA-424)加工为成熟miRNA-424的能力。
本发明所述的miRNA-424核酸分子能够以单链或双链的形式存在。成熟的miRNA-424主要呈单链形式,但是miRNA-424前体的自身部分能够互补形成双链结构。本发明的核酸分子可以是RNA、DNA、PNA、LNA的形式。
本发明提供了所述miRNA-196b的检测试剂用于制备脑垂体瘤早期诊断和预后诊断的体外诊断产品。
进一步地,所述体外诊断产品通过使用qRT-PCR技术、印记杂交技术、原位杂交技术、阵列杂交技术、基因芯片技术或新一代测序技术来检测miRNA-424的表达水平以诊断脑垂体瘤。
进一步地,所述体外诊断产品包括但不限于芯片和试剂盒。
本发明通过实时荧光定量PCR能获知待检测样本中实时荧光定量PCR的表达水平,将待测样本的结果同正常的脑垂体组织相比,能够判断待测样本是否存在罹患脑垂体瘤的风险。因此,通过实时荧光定量PCR技术获得miRNA-424表达水平与脑垂体瘤相关性的应用同样包含在本发明的保护范围之内。
本发明还提供了一种用于诊断脑垂体瘤的芯片,所述芯片包括固相载体及固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针,所述寡核苷酸探针包括特异性地对应于miRNA-424的部分或全部序列。所述寡核苷酸探针还可包括针对现有技术中已经报道的可用于判断脑垂体瘤是否发生的miRNA的寡核苷酸探针。将多种miRNA的检测探针放置在同一芯片上通过检测多种miRNA指标联合诊断脑垂体瘤的情况也包含在本发明的保护范围之内。
进一步,所述固相载体包括固相载体可采用的基因芯片领域的各种常用材料,例如但不限于尼龙膜,经活性基团(如醛基、氨基等)修饰的玻片或硅片、未修饰的玻片、塑料片等。
所述的miRNA芯片的制备可采用本领域已知的生物芯片的常规制造方法。
本发明还提供了一种用于预判脑垂体瘤是否发生的诊断试剂盒。进一步地,所述试剂盒为针对miRNA-424的引物和/或探针。将多种miRNA的检测引物和/或探针放置在同一试剂盒中通过检测多种miRNA指标联合诊断脑垂体瘤的情况也包含在本发明的保护范围之内。
在本发明中,术语“样本”不仅包括生物体试样,例如细胞、组织、脏器、体液(血液、淋巴液等)、消化液、咳痰、肺胞气管支清洗液、尿、便,也包括由这些生物体试样得到的核酸提取物(基因组DNA提取物、mRNA提取物、由mRNA提取物制备的cDNA制备物或cRNA制备物等)或蛋白质提取物。另外,也可以对上述试样实施福尔马林固定处理、醇固定处理、冻结处理或石蜡包埋处理。优选的所述样本为组织。
本发明还提供了miRNA-424或其同源模拟物在制备或筛选治疗脑垂体瘤药物中的应用。
进一步地,所述miRNA-424或其同源模拟物用于抑制脑垂体瘤细胞的增殖。
进一步地,所述miRNA-424或其同源模拟物通过在mRNA和蛋白质水平上抑制HMGA1的表达来抑制脑垂体瘤细胞的增殖。
进一步地,所述同源模拟物为外源miRNA-424或miRNA-424同源物的正义寡核苷酸。试验证明,根据miRNA-424序列设计出它的特异性正义寡核苷酸,将正义寡核苷酸转移到人体内后,能够明显上调miRNA-424的表达。
根据miRNA-424序列设计出它的同源物,是经过特殊标记与化学修饰的单链RNA,将同源物转移到人体后,能够高效上调miRNA-424的表达,下调HMGA1的表达水平。
本发明还提供了一种治疗脑垂体瘤的药物,所述药物包含miRNA-424或其同源物。所述的miRNA-424同源物能够上调miRNA-424的表达或者能够激活miRNA-424的功能。所述miRNA-424同源模拟物的激活靶标不限于miRNA-424本身,还包括miRNA-424的上下游,例如:编码miRNA-424的基因组序列,miRNA-424靶基因、调控miRNA-424表达的蛋白或者基因。
本发明的miRNA-424可以是天然的或是人工合成的,或者使用可以表达miRNA-424的DNA片段的载体转染细胞获得。所述载体包括病毒载体、真核载体。
病毒载体可以是任何适当的载体,包括但不限于逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺病毒相关病毒载体、疱疹病毒(例如单纯疱疹病毒、痘苗病毒及EB病毒)载体、甲病毒载体。
真核表达载体可以是任何适当的表达载体,包括但不限于pCMV-Myc表达载体、pcDNA3.0表达载体、pcDNA3.1表达载体、pEGFP表达载体、pEFBos表达载体、pTet表达载体、pTRE表达载体、或者在公知表达载体的基础上经改造的载体,比如pBin438、pCAMBIA1301等。
可以表达miRNA-424的DNA片段可以通过如下方式获取:从NCBI数据库中(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore)寻找miRNA-424在基因组上的位置及具体序列信息,根据基因组序列确定miRNA-424初始miRNA的位置,在miRNA-424初始miRNA位置设计特异性引物,扩增即可获得表达miRNA-424的DNA片段。
与现有技术相比,本发明具有以下有益效果:
本发明首次发现了miRNA-424表达水平与脑垂体瘤的发生有关,通过检测患者miRNA-424的表达水平,可以判断受试者是否患有脑垂体瘤的风险,从而指导临床医师给受试者提供预防方案或者治疗方案。
附图说明
图1为实施例2中脑垂体瘤组织中验证miR-424表达的结果图;
其中,Normal为正常垂体细胞;ACTH为促肾上腺皮质激素型;PRL为催乳素型;GH为分泌生长素型;GTH为促甲状腺激素型;NULL为非功能型。
图2为实施例3中HMGA1的3’非编码区与miR-424识别的序列示意图。
图3为实施例4中miR-424的模拟物或抑制剂对miR-424表达水平的影响结果图;
其中,A为miR-424模拟物对miR-424表达的影响;B为miR-424抑制剂对miR-424表达的影响;Negative Control表示阴性对照组;miR-424mimic表示miR-424过表达组;miR-424inhibitor表示miR-424抑制剂组。
图4为实施例4中miR-424抑制HMGA1表达的影响图;
其中,A miR-424对HMGA1表达的影响;B为miR-424模拟物对HMGA1表达的影响;Negative Control表示阴性对照组;miR-424mimic表示miR-424过表达组;Controlinhibitor表示阴性对照组;miR-424inhibitor表示miR-424抑制剂组。
图5为不同处理对脑垂体瘤细胞增殖的影响;
其中,Negative Control表示阴性对照组;miR-424mimic表示miR-424过表达组;Control inhibitor表示阴性对照组;miR-424inhibitor表示miR-424抑制剂组。
具体实施方式
下面结合具体的实施例进一步说明本发明,本发明的实施例仅用于解释本发明,并不意味着限制本发明的保护范围。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
实施例1 qPCR验证差异表达的miRNA-424
1、样本获取
各收集5例正常脑垂体组织和包含全部5种亚型的53例脑垂体瘤组织。上述所有标本的取得均通过组织伦理委员会的同意。
2、样本总RNA的提取
使用QIAGEN公司的组织RNA提取试剂盒提前总RNA。
具体步骤如下:
1)在较少RNase干扰的清洁区,使用含适量液氮的研钵称取组织样本约20mg,用杵棒研磨至粉末状;
2)将样本转移到一个不含RNA酶的2mL的离心管中;
3)加入300μL Lysis solution,置于匀浆器内,充分研磨1-5min;
4)12000g,4℃,离心10min,转移上清至新的1.5mL的离心管中;
5)加入600μL RNase-Free Water,用漩涡器混匀;
6)加入20μL蛋白酶K,在55℃水浴锅中孵育15min,不断涡旋混匀;
7)14000g,室温,离心1min,使细胞碎片沉淀于离心管底部,取上清液转移到另外一个不含RNA酶1.5mL的离心管中;
8)加入450μL的95%乙醇,涡旋混匀;
9)取650μL含乙醇的裂解液加到离心柱中,14000g离心1min;弃下层,将柱子重新置于收集管中;
10)依照裂解液的容量,重复步骤9);
11)加入400μL Wash solution,14000g离心2min;弃下层,将离心柱置于新的收集管中;
12)加入100μL Enzyme Incubation Buffer和15μL DNase I,14000g离心1min,将收集管中的溶液重新移入柱中,室温放置15min;
13)加入400μL Wash solution,14000g离心1min,弃下层,将柱子重新置于收集管中;
14)加入400μL Wash solution,14000g离心2min,弃收集管,把柱子放入1.7mLElution管中;
15)加入30μL Elution Buffer,200g离心2min,使溶液充分与柱结合;
16)14000g离心1min,将RNA使用无RNA去离子水溶解,待用。
RNA样品的质量分析(NanoDrop1000分光光度计)
Nanodrop2000紫外分光光度计检测RNA样品,RNA-seq测序的样品要求:OD260/OD280为1.8-2.2。
将上述提取的RNA进行琼脂糖凝胶电泳,Agilent Technologies2100Bioanalyzer检测RNA样品质量,在凝胶成像仪上观测、拍照,保存图像,一般认为28S:18S≥2可以初步判定总RNA质量较好。
3、逆转录
1)将10pg-1μg的总RNA模板与2μL 10×缓冲液、2μL dATP(10mM)、0.5μL polyA多聚酶、0.5μL核糖核酸酶(RNase)抑制剂和无核糖核酸酶水(RNase free water)混合,体积最后为20μL,37℃孵育1h。
2)反应管中加入1μL 0.5μg/μL Oligo(dT)特异性RT引物,70℃孵育5min。
3)立即冰上孵育至少2min,打断RNA和引物的二级结构。
4)将上述20μL反应混合物与4μL 5×缓冲液、1μL dNTP(10mM),0.5μL M-MLV逆转录酶,0.5μL核糖核酸酶(RNase)抑制剂,10μL polyA反应混合液和4μL无核糖核酸酶水(RNase free water)混合,42℃孵育1h。
4、qPCR反应:
1)引物设计
扩增miRNA-424及U6snRNA的引物购于QIAGEN。
2)按照表1配制PCR反应体系:
其中,SYBR Green聚合酶链式反应体系购自Invitrogen公司。
表1 PCR反应体系
3)PCR反应条件:95℃10min,(95℃15s,60℃60s)×45个循环。
以SYBR Green作为荧光标记物,在ABI荧光定量PCR仪上进行PCR反应,以U6snRNA作为参照基因,通过融解曲线分析和电泳确定目的条带,ΔΔCT法进行相对定量。
5、结果
通过miRNA荧光定量PCR的方法,验证了与正常脑垂体组织相比,在脑垂体瘤组织中miR-424存在低表达。如图1所示。
实施例2脑垂体瘤中特异性表达的miRNA及其关键靶基因的鉴定
1、生物信息学方法预测miRNA-424潜在的关键靶基因
结合多种方法提高分析的准确性,使用TargetScan,miRecords和PicTar等软件进行预测,取几种预测软件结果的交集进行分析。由于这种生物信息学的分析可能得到很大数量的可能靶基因,需要在已有的脑垂体瘤研究的基础上,重点选择在脑垂体瘤发生发展中可能发挥功能的潜在靶基因进行分析。对于一个miRNA,可以同时分析、验证多个可能的靶基因,提高成功率。
2、结果
通过生物信息学分析预测miR-424可能的关键靶基因。结果表明,一种在脑垂体瘤发生发展中发挥重要作用的基因HMGA1的3’非编码区有miR-424的识别序列。如图2所示。
实施例3 qPCR检测脑垂体瘤细胞中miRNA-424、HMGA1的表达及western blotting检测HMGA1蛋白的表达
1、细胞培养
将GT1-1细胞常规培养于含5%胎牛血清和5%马血清的F-12培养基中,于37℃、5%CO2及饱和湿度条件下培养。
2、细胞转染
将GT1-1细胞分为四组,实验组即转染miRNA-424模拟物和miRNA-424抑制剂,阴性对照组即转染随机对照序列组,脂质体对照组即转染LipofectamineTM 3000脂质体转染试剂组,空白对照组即不转染组。运用转染试剂LipofectamineTM 3000进行转染,转染方法参照说明书。对照组和实验组的工作浓度均为100nM。转染后48h收集各组细胞用于后续实验。
3、qPCR实验
1)细胞总RNA提取:利用QIAGEN公司的RNA提取试剂盒进行细胞总RNA的提取,按照说明书指示进行。
2)qPCR:步骤同实施例1。
4、Western blotting实验
细胞总蛋白的提取:细胞培养和转染方法参考例3,将细胞用细胞刮子刮下来加入蛋白裂解液,裂解30min。13000rpm离心30min,取上清。蛋白定量方法参考BioRad蛋白定量试剂盒说明书。将细胞的裂解液加入loading buffer制成上样缓冲溶液,取30μg总蛋白跑SDS-PAGE电泳。100V 75min湿法转PVDF膜,5%脱脂牛奶室温封闭1h,加入一抗孵育过夜,PBST洗3次,每次10min;加二抗,室温孵育1h,PBST洗3次,每次10min;显色用ECL化学发光法,检测信号强弱表明样品蛋白水平的高低。
5、结果
为了研究miRNA对靶基因的调控以及miRNA在细胞中的功能,在细胞中加入miR-424的模拟物或抑制剂提高或降低miR-424的表达。如图3所示。在细胞中加入miR-424的模拟物可以在mRNA和蛋白质水平上抑制HMGA1的表达,但在细胞中加入miR-424的抑制剂对HMGA1的表达影响不显著。如图4所示。这可能是因为miRNA与靶基因存在多靶标效应。
实施例4 CTA法检测miRNA-424对细胞增殖的影响
1、细胞培养
将GT1-1细胞常规培养于含5%胎牛血清和5%马血清的F-12培养基中,于37℃、5%CO2及饱和湿度条件下培养。
2、细胞转染
将GT1-1细胞分为四组,实验组即转染miRNA-424模拟物和miRNA-424抑制剂,阴性对照组即转染随机对照序列组,脂质体对照组即转染LipofectamineTM 3000脂质体转染试剂组,空白对照组即不转染组。运用转染试剂LipofectamineTM 3000进行转染,转染方法参照说明书。对照组和实验组的工作浓度均为100nM。转染后48h收集各组细胞用于后续实验。
3、转染48h后,收集GT1-1细胞:细胞计数后,每组细胞配成浓度为5×104个/mL细胞悬液;
4、96孔板每孔0.1mL,每组细胞设4个复孔,重复铺2块96孔板;
5、细胞贴壁48h后,检测肿瘤细胞活力水平:加CTA溶液,每孔120μL,37℃孵育2h,490nm波长测OD值,记录各组OD平均值,根据平均值作图。
6、结果
在细胞中加入miR-424的模拟物可以抑制脑垂体瘤细胞的增殖,初步验证了miR-424在脑垂体瘤细胞中的抑制作用。如图5所示。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以对本发明进行若干改进和修饰,这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
Claims (10)
1.miRNA-424在作为脑垂体瘤诊断标志物中的应用。
2.如权利要求1所述的应用,其特征在于,所述miRNA-196b的检测试剂用于制备脑垂体瘤早期诊断和预后诊断的体外诊断产品。
3.如权利要求2所述的应用,其特征在于,所述体外诊断产品通过使用qRT-PCR技术、印记杂交技术、原位杂交技术、阵列杂交技术、基因芯片技术或新一代测序技术来检测miRNA-424的表达水平以诊断脑垂体瘤。
4.如权利要求2所述的应用,其特征在于,所述体外诊断产品包括芯片和试剂盒。
5.如权利要求4所述的应用,其特征在于,所述试剂盒为针对miRNA-424的引物和/或探针。
6.miRNA-424或其同源模拟物在制备或筛选治疗脑垂体瘤药物中的应用。
7.如权利要求6所述的应用,其特征在于,所述miRNA-424或其同源模拟物用于抑制脑垂体瘤细胞的增殖。
8.如权利要求6所述的应用,其特征在于,所述miRNA-424或其同源模拟物通过在mRNA和蛋白质水平上抑制HMGA1的表达来抑制脑垂体瘤细胞的增殖。
9.如权利要求6~8任一项所述的应用,其特征在于,所述同源模拟物为外源miRNA-424或miRNA-424同源物的正义寡核苷酸。
10.一种用于治疗脑垂体瘤的药物,其特征在于,所述药物包含miRNA-424或其同源模拟物。
Priority Applications (1)
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CN202011490895.3A CN112501304A (zh) | 2020-12-17 | 2020-12-17 | miRNA-424作为脑垂体瘤诊断标志物的应用 |
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CN113604578A (zh) * | 2021-07-20 | 2021-11-05 | 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 | 一种与绵羊脂肪相关的miRNA及其应用 |
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2020
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