CN111662982A - 用于脑胶质瘤早期诊断和/或复发监测的生物标志物及其应用 - Google Patents

用于脑胶质瘤早期诊断和/或复发监测的生物标志物及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供用于脑胶质瘤早期诊断和/或复发监测的生物标志物及其应用，属于分子诊断和分子生物学技术领域。本发明研究发现，脑脊液外泌体中的多种miRNA的相对表达水平与胶质瘤发生显著相关，其中胶质瘤患者脑脊液外泌体中显著上调的miRNA共102个，显著下调的miRNA共167个，由这些miRNA及其组成的包含269个miRNA的标记物谱均具有较高的诊断价值。上述269个miRNA每个均可单独作为胶质瘤的生物标志物，而其标记谱集合具有更高诊断价值，联合应用后将为临床提供快速准确的诊断方式，使胶质瘤的诊断和复发检测更加方便易行。

Description

用于脑胶质瘤早期诊断和/或复发监测的生物标志物及其 应用
技术领域
本发明属于分子诊断和分子生物学技术领域，具体涉及用于脑胶质瘤早期诊断和/或复发监测的生物标志物及其应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
人脑胶质瘤是中枢神经系统最常见的恶性肿瘤，虽然其预后取决于多种因素及诊治措施，但是一般而言，III级者生存期2-3年，IV级者生存期仅为一年左右。恶性胶质瘤的临床表现缺乏特异性，后期以神经系统功能缺失伴颅内压增高症状为主，目前，初步诊断主要依靠CT及MRI检查等影像学检查方法，最终诊断还需要通过肿瘤切除术或活检术获取标本进行病理学诊断加以明确。由于缺乏有效的胶质瘤早期筛查及术前诊断方法，多数患者发现时已错过最佳手术时机，预后不佳。
外泌体是指包含了多种RNA和蛋白质、直径在50-150nm的细胞外囊泡。作为人体内一类重要的外分泌微小囊泡，多种细胞在正常及病理状态下均可选择性地包裹多种调控分子，以外泌体的形式转运至特定的靶细胞中，发挥相应调控作用。因此，外泌体天然存在于体液中，包括血液、唾液、尿液、脑脊液和乳汁等。胶质瘤作为中枢神经系统中侵袭性生长的恶性肿瘤，生长初期即可分泌大量外泌体至脑脊液中。
随着液体活检领域的发展，外泌体来源的生物标志物越来越被大家所重视。外泌体具有内部环境稳定、各种分子标记物含量丰富、半衰期长以及组织穿透力强等特点，且胶质瘤外泌体在脑脊液循环中具有很强的稳定性及易得性。因此，胶质瘤外泌体是一类灵敏度高、特异性好的高效肿瘤标志物载体。
发明人发现，miRNA(microRNA)是广泛存在于生物体内的19-25nt的非编码单链小分子RNA，其通过与靶基因mRNA的互补配对降解靶mRNA或抑制其翻译。研究表明miRNA在肿瘤发生过程中起重要作用，miRNA业已成为癌症治疗与诊断的新途径。外泌体中的非编码RNA以miRNA为主，且种类丰富，其可以影响干细胞分化、器官形成、造血作用、肿瘤发生以及新陈代谢等诸多生理活动。然而，迄今对脑脊液外泌体的诊断和液体活检鲜有报道。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供用于脑胶质瘤早期诊断和/或复发监测的生物标志物及其应用。本发明经研究发现，脑脊液外泌体中的多种miRNA的相对表达水平与胶质瘤发生显著相关，其中胶质瘤患者脑脊液外泌体中显著上调的miRNA共102个，显著下调的miRNA共167个，由这些miRNA及其组成的包含269个miRNA的标记物谱均具有较高的诊断价值。上述269个miRNA每个均可单独作为胶质瘤的生物标志物，而其标记谱集合具有更高诊断价值，联合应用后将为临床提供快速准确的诊断方式，使胶质瘤的诊断和复发检测更加方便易行。
为了实现上述目的，本发明涉及以下技术方案：
本发明的第一个方面，提供一种用于脑胶质瘤检测的生物标志物，所述生物标志物选自如下miRNA中的任意一个或多个：
miR-204-5p、miR-615-3p、miR-6716-3p、miR-1323、miR-504-5p、miR-125a-5p、miR-195-3p、miR-337-3p、miR-543、miR-92b-3p、miR-885-5p、miR-1911-3p、miR-10a-5p、miR-125b-5p、miR-105-5p、miR-329-3p、miR-92b-5p、miR-99a-5p、miR-130b-5p、miR-885-3p、miR-483-3p、miR-1468-5p、miR-409-3p、miR-483-5p、miR-204-3p、miR-10b-5p、hsa-let-7e-3p、miR-99b-5p、miR-485-5p、miR-335-3p、miR-323a-3p、miR-1180-3p、miR-200b-5p、miR-23b-5p、miR-522-3p、miR-449c-5p、miR-432-5p、miR-216b-5p、miR-328-3p、hsa-let-7c-3p、miR-34b-3p、miR-139-3p、miR-196a-5p、miR-3605-3p、miR-30a-3p、miR-3074-3p、miR-433-3p、hsa-let-7c-5p、miR-145-3p、miR-4488、miR-365b-5p、miR-30c-5p、miR-224-5p、miR-128-3p、miR-654-3p、miR-24-1-5p、miR-340-3p、hsa-let-7e-5p、miR-100-5p、miR-516b-5p、miR-149-5p、miR-411-3p、miR-379-3p、miR-1226-5p、miR-1911-5p、miR-222-3p、miR-3690、miR-124-3p、miR-628-3p、miR-200c-3p、miR-125b-1-3p、miR-139-5p、miR-369-5p、miR-365a-3p、miR-375-3p、miR-193b-5p、miR-3120-5p、miR-429、miR-34c-3p、miR-183-5p、miR-1298-3p、miR-424-3p、miR-493-5p、miR-767-5p、miR-99b-3p、hsa-let-7d-3p、miR-1912-3p、miR-494-3p、miR-448、miR-27b-5p、miR-1298-5p、miR-505-5p、miR-455-5p、miR-196b-5p、miR-382-5p、hsa-let-7b-5p、miR-151a-3p、miR-331-5p、hsa-let-7b-3p、miR-654-5p、miR-549a-3p、miR-181a-2-3p、miR-148b-5p、miR-25-5p、miR-342-3p、miR-769-5p、miR-23a-5p、miR-514a-3p、miR-203a-3p、miR-203b-5p、miR-15b-5p、miR-625-3p、miR-3913-5p、miR-589-5p、miR-27a-3p、miR-1268a、miR-542-3p、miR-22-5p、miR-3913-3p、miR-210-3p、miR-16-2-3p、miR-330-5p、miR-3529-3p、miR-7-5p、miR-10527-5p、miR-140-5p、miR-103a-3p、miR-144-5p、miR-103b、miR-29a-3p、miR-181c-5p、miR-148b-3p、miR-30e-5p、miR-326、miR-155-5p、miR-26b-5p、miR-30d-3p、miR-181a-3p、miR-324-5p、miR-106b-3p、miR-374a-5p、miR-873-5p、miR-374a-3p、miR-642a-3p、miR-642b-5p、miR-29b-3p、miR-20b-5p、miR-660-5p、miR-130b-3p、miR-550b-3p、miR-766-5p、miR-93-5p、miR-20a-5p、miR-550a-3-5p、miR-550a-5p、hsa-let-7i-5p、miR-500a-3p、miR-1273h-3p、miR-3614-5p、miR-17-5p、miR-1246、miR-23a-3p、miR-625-5p、miR-451a、miR-106a-5p、miR-17-3p、miR-454-3p、miR-26b-3p、miR-374b-3p、miR-15a-5p、miR-378a-3p、miR-150-3p、miR-107、hsa-let-7f-2-3p、miR-10399-3p、miR-942-5p、miR-4286、miR-140-3p、miR-7-1-3p、miR-101-3p、miR-548o-3p、miR-6503-3p、miR-1307-5p、miR-106b-5p、miR-1291、miR-340-5p、miR-502-3p、miR-378f、miR-19a-3p、miR-548j-5p、miR-3202、miR-548k、miR-186-5p、miR-185-3p、miR-8485、miR-15b-3p、miR-16-5p、miR-32-5p、miR-10395-3p、miR-324-3p、miR-424-5p、miR-146b-5p、miR-4485-3p、miR-627-3p、miR-548t-3p、miR-147b-3p、miR-29c-3p、miR-150-5p、miR-5009-5p、miR-6515-5p、miR-144-3p、miR-374b-5p、miR-374c-3p、miR-425-3p、miR-766-3p、miR-185-5p、miR-1278、miR-378e、miR-2355-3p、miR-548d-5p、miR-548e-3p、miR-451b、miR-21-5p、miR-223-5p、hsa-let-7g-5p、miR-378g、miR-26a-2-3p、miR-652-3p、hsa-let-7i-3p、miR-4772-5p、miR-27a-5p、miR-548bc、miR-548f-5p、miR-629-5p、miR-1250-5p、miR-6503-5p、miR-576-3p、miR-3177-3p、miR-18a-5p、miR-548ad-5p、miR-3150b-3p、miR-142-5p、miR-548aq-3p、miR-548g-5p、miR-4772-3p、miR-548ap-3p、miR-1273h-5p、miR-6501-5p、miR-651-5p、miR-1973、miR-378c、miR-548u、miR-378d、miR-1304-5p、miR-1285-3p、miR-2115-3p、miR-671-5p、miR-142-3p、miR-146b-3p、miR-362-3p、miR-19b-3p、miR-21-3p、miR-146a-5p、miR-10399-5p、hsa-let-7g-3p、miR-548f-3p、miR-223-3p、miR-582-5p、miR-12136。
上述miRNA为前体miRNA或成熟miRNA，优选为人源miRNA。
更具体的，上述miRNA为受试者脑脊液外泌体miRNA。
更具体的，上述用于脑胶质瘤检测的生物标志物包括如下任意一种或多种组成的组：
hsa-miR-99a-5p+hsa-let-7i-5p+hsa-let-7c-5p；
hsa-miR-99a-5p+hsa-miR-21-5p+hsa-let-7i-5p+hsa-let-7c-5p；
hsa-miR-99a-5p+hsa-miR-10a-5p+hsa-miR-99b-5p+hsa-miR-let-7i-5p+hsa-miR-378a-3p；
hsa-miR-99a-5p+hsa-miR-21-5p+hsa-miR-451a+hsa-let-7i-5p+hsa-let-7c-5p；
hsa-miR-99a-5p+hsa-miR-21-5p+hsa-miR-451a+hsa-let-7i-5p+hsa-miR-204-5p+hsa-let-7a-5p+hsa-let-7c-5p；
hsa-miR-99a-5p+hsa-miR-21-5p+hsa-miR-451a+hsa-let-7i-5p+hsa-miR-204-5p+hsa-let-7a-5p+hsa-miR-122-5p+hsa-miR-122b-3p+hsa-let-7c-5p；
hsa-miR-99a-5p+hsa-miR-21-5p+hsa-miR-451a+hsa-let-7i-5p+hsa-miR-204-5p+hsa-miR-1298-5p+hsa-let-7a-5p+hsa-miR-122-5p+hsa-miR-122b-3p+hsa-miR-143-3p+hsa-let-7c-5p；
hsa-miR-99a-5p+hsa-miR-21-5p+hsa-miR-451a+hsa-miR-204-5p+hsa-miR-1298-5p+hsa-let-7b-5p+hsa-let-7a-5p+hsa-miR-122-5p+hsa-miR-122b-3p+hsa-miR-143-3p+hsa-let-7c-5p；
hsa-miR-99a-5p+hsa-miR-21-5p+hsa-miR-451a+hsa-miR-204-5p+hsa-miR-1298-5p+hsa-let-7b-5p+hsa-let-7a-5p+hsa-miR-122-5p+hsa-miR-122b-3p+hsa-let-7c-5p；
hsa-miR-99a-5p+hsa-miR-21-5p+hsa-miR-451a+hsa-miR-204-5p+hsa-miR-1298-5p+hsa-let-7b-5p+hsa-let-7a-5p+hsa-miR-122-5p+hsa-miR-122b-3p；
hsa-miR-99a-5p+hsa-miR-21-5p+hsa-miR-451a+hsa-miR-1298-5p+hsa-let-7b-5p+hsa-let-7a-5p+hsa-miR-122-5p+hsa-miR-122b-3p。
具体的，上述用于脑胶质瘤检测的生物标志物具体为用于脑胶质瘤早期诊断和/或复发监测的生物标志物。
更具体的，所述生物标志物具有如下a)-c)中任意一种或多种功能：
a)鉴定或辅助鉴定胶质瘤细胞；
b)诊断或辅助诊断初发胶质瘤；
c)诊断或辅助诊断复发胶质瘤。
本发明的第二个方面，提供检测上述生物标志物表达水平的物质在制备脑胶质瘤检测产品中的应用。
其中，所述物质包括但不限于基于高通量测序方法和/或基于定量PCR方法和/或基于探针杂交方法检测上述生物标志物表达水平的物质。
所述产品包括但不限于装置(如寡核苷酸探针或其集成、芯片基片或检测基板上的高通量miRNA检测芯片、以及微流控检测芯片)、试剂盒和设备。
本发明的第三个方面，提供一种装置，所述装置包括：
检测上述生物标志物的一个或更多个装置。
本发明的第四个方面，提供一种试剂盒，所述试剂盒包含上述所述装置。
本发明的第五个方面，提供上述装置和/或试剂盒用于检测脑胶质瘤的用途；具体为用于脑胶质瘤早期诊断和/或复发监测；
更具体的，具有如下a)-c)中任意一种或多种功能：
a)鉴定或辅助鉴定胶质瘤细胞；
b)诊断或辅助诊断初发胶质瘤；
c)诊断或辅助诊断复发胶质瘤。
本发明的第六个方面，提供一种用于检测脑胶质瘤的设备，其包含：
i)分析单元，所述分析单元包含：用于确定对象的样品中选自上述生物标志物表达水平的检测剂，以及；
ii)包含有数据处理器的评估单元，所述数据处理器有形地嵌入有用于将通过所述分析单元确定的量与参考进行比较的算法，并且能够生成包含基于所述比较建立的诊断结果的输出文件。
本发明的第七个方面，提供一种用于脑胶质瘤早期诊断和/或复发监测的方法，所述方法包括：确定来自受试者的生物样品中上述生物标志物的存在或表达水平，以及将所述生物标志物的表达水平与参照进行比较。
其中，所述生物样品为脑脊液外泌体。
更具体的，所述方法具体为：
a)鉴定或辅助鉴定胶质瘤细胞；
b)诊断或辅助诊断初发胶质瘤；
c)诊断或辅助诊断复发胶质瘤。
以上一个或多个技术方案的有益技术效果：
上述技术方案首次发现了脑脊液外泌体中共计269种miRNA可作为胶质瘤的生物标志物，包括在胶质瘤患者脑脊液外泌体中上调的102个miRNA和下调的167个miRNA，因此具有较高诊断价值，为临床提供快速准确的诊断方式，使胶质瘤的诊断更加方便易行。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为实施例中脑脊液外泌体电镜鉴定示例性结果图。
图2为实施例中胶质瘤患者及正常对照的脑脊液外泌体中主要RNA指标表达量分布图；其中，a为miRNA，b为mRNA，c为lncRNA，d为circRNA。
图3为实施例中脑脊液外泌体中的miRNA能够诊断胶质瘤，mRNA、lncRNA和circRNA均无法实现；其中，a为脑脊液外泌体miRNA诊断胶质瘤的聚类分析；b为脑脊液外泌体miRNA诊断胶质瘤的所有差异表达miRNA的热图聚类分析；c为脑脊液外泌体mRNA、lncRNA和circRNA诊断胶质瘤的聚类分析。
图4为实施例中脑脊液外泌体miRNA的胶质瘤复发监测作用图。a，脑脊液外泌体miRNA诊断胶质瘤和复发监测的聚类分析；b，脑脊液外泌体miRNA诊断胶质瘤复发与否的热图聚类分析；b，脑脊液外泌体miRNA诊断胶质瘤复发与否的热图聚类分析(269个miRNA指标)；c，优化的脑脊液外泌体miRNA诊断胶质瘤复发与否的热图聚类分析(90个miRNA指标)；
图5为实施例中脑脊液外泌体miRNA诊断作用相关图，其中，a为机器学习算法的训练集和验证集，所发明的评分均具有较好的诊断效果；b和c分别为机器学习算法运算和收敛过程；d和e分别为模型在训练集和验证集中的ROC曲线，5个最佳指标及其组合均能够达到较好的诊断效能；f为所有受试患者的最佳液体活检指标热图分析，表明其具有同前述269个以及90个miRNA指标谱同样的诊断能力；g为所发明的外泌体miRNA液体活检评分(CSF-exo-miRNA-Score)临床用诊断标尺；i为在受试者中的临床诊断效能，准确率超过90％，仅在交界区有极少误判。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本发明使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。
技术人员理解本发明中使用的术语例如“miRNA”和“miR”的变化形式，并且其涉及见于真核生物细胞和后生动物生物体的体液中的短核糖核酸(RNA)分子。miRNA包括人miRNA、成熟单链miRNA、前体miRNA(pre-miR)、及其变体，其可以是天然存在的。在一些情况下，术语“miRNA”还包括初级miRNA转录物(pri-miRNA)和双链体miRNA。除非另外指出，否则当在本发明中使用时，特定miRNA的名称是指成熟miRNA。miRNA前体可以由25至数千个核苷酸，通常40至130、50至120、或60至110个核苷酸组成。通常，成熟miRNA由5至100个核苷酸，通常10至50、12至40、或18至26个核苷酸组成。术语miRNA还包括最终进入RNA诱导沉默复合体(RNA-induced silencing complex，RISC)的“引导”链以及与其互补的“过客”链。
本领域中已知的有数种miRNA的序列，应理解，以下所示的各个miRNA的数据库登录号是人来源的miRNA。然而，这些数据库条目还提供了例如以下不同来源的各自miRNA的数据库登录号：例如任何哺乳动物、爬行动物、或鸟类来源的miRNA，例如如选自实验室动物(例如，小鼠或大鼠)、家养动物(包括例如豚鼠、兔、马、驴、牛、绵羊、山羊、猪、鸡、骆驼、猫、狗、海龟、陆龟、蛇或蜥蜴)或灵长类(包括黑猩猩、倭黑猩猩和大猩猩)的miRNA的那些。
术语“miRNA组合”涉及本发明的miRNA的组合。miRNA的量可以通过本领域公知的技术在对象的样品中确定。根据样品的性质，所述量可以通过用于量化多核苷酸量的基于PCR的技术或者通过其他方法(如质谱或(下一代)测序等)来确定。如本发明所使用的术语“确定miRNA组合中至少所述miRNA的量”优选地涉及单独确定组合中每种miRNA的量以能够将组合中每种miRNA的量与所述miRNA特异性的参考进行比较。
如本发明所使用的术语“探针”是指通常用于检测与探针的序列互补的靶RNA和/或RNA序列的单链寡核苷酸。探针与核苷酸序列由于探针与靶序列之间的互补性而允许核苷酸配对的单链核酸(DNA或RNA)杂交。探针的长度取决于预期用途以及所需的探针特异性。通常，探针的长度为20至500个(即50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、300、400、500个)核苷酸，优选20至100个，更优选20至50个核苷酸。对于微RNA的检测，探针为12至30个核苷酸。探针用于多种实验设置，例如但不限于Southern和Northern印迹、实时PCR和原位杂交(In Situ Hybridization，ISH)以及微阵列实验。探针可以是未经标记的、经直接标记的或经间接标记的，例如用链霉抗生物素蛋白复合物随后可结合的生物素标记的。所述标记可以是可通过光谱、光化学、生物化学、免疫化学、化学或其他物理手段检测的分子。例如，合适的标记包括32P、荧光染料、电子致密试剂、酶(例如，通常用于ELISA)、生物素、地高辛配基(digoxigenin)、或半抗原以及其他可检测或可以变成可检测的实体。标记可以引入核酸中的任何位置，例如3’端、5’端或内部。术语“探针”还涵盖其骨架组成不同的核酸，例如但不限于肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA)、二醇核酸(GNA)和苏糖核酸(TNA)。
术语“表达水平”是指在特定的时间点体内或样品中存在的基因产物的量。表达水平可以例如通过由基因表达的蛋白质或mRNA来测量/量化/检测。可以例如如下量化表达水平：用相同样品或参考样品(例如，在相同时间从同一个体得到的样品或相同样品的相同尺寸(重量、体积)的部分)中相同类型基因产物的总量(总蛋白质或mRNA)归一化样品中存在的目的基因产物的量，或者确定目的基因产物的量/限定的样品尺寸(重量、体积等)。可以通过本领域已知的任何方法来测量或检测表达水平，所述方法例如用于目的基因产物的直接检测和量化的方法(例如质谱)，或者通常通过目的基因产物与对目的基因产物具有特异性的一种或更多种不同分子或检测装置(例如，引物、探针、抗体、蛋白质支架)结合而工作的用于间接检测和测量目的基因产物的方法。技术人员还已知的是确定基因拷贝的水平，其还包括确定一个或更多个片段的不存在或存在(例如，通过核酸探针或引物，例如定量PCR、多重连接依赖性探针扩增(Multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA)PCR)。
术语“指标”和“标志”在本发明中可互换使用，并且是指病症的体征或信号或者用于监测病症。这样的“病症”是指细胞、组织或器官的生物状态，或者是指个体的健康和/或疾病状态。指标可以是包括但不限于肽、蛋白质和核酸的分子的存在或不存在，或者可以是细胞、或组织、器官或个体中这样的分子的表达水平或模式变化。指标可以是个体中疾病的发生、发展或存在或者这样的疾病的进一步进展的体征。指标也可以是在个体中发生疾病的风险的体征。
术语指标的水平“下调”、“降低”或“下降”是指与参考或参考样品相比，样品中这样的指标的水平降低。术语指标的水平“上调”、“升高”或“提高”是指与参考或参考样品相比，样品中这样的指标的水平更高。
在原理上，可以通过应用标准统计学方法基于给定miRNA的平均值或中值来对本发明所指定的对象组或群组计算参考量。特别地，例如旨在或不旨在判断事件的方法的测试的精确度最好由其接受者操作特征(receiver-operating characteristic，ROC)来描述(尤其参见Zweig 1993，Clin.Chem.39：561-577)。ROC图是由在所观察到的整个数据范围上不断改变判定阈值获得的所有灵敏度相对于特异性对的图。诊断方法的临床表现取决于其精确度，即其将对象正确地分配到某种预后或诊断的能力。ROC图通过在适于区分的完整阈值范围将灵敏度相对于1-特异性绘图来表示两个分布之间的重叠。在y轴上是灵敏度或真阳性分数，其被定义为真阳性测试结果数与真阳性数和假阴性测试结果数之和的比率。这在疾病或病症的存在下也被称为阳性。其单独地由受影响的亚组计算。在x轴上是假阳性分数或1-特异性，其被定义为假阳性结果数与真阴性数和假阳性结果数之和的比率。其是特异性的指数，并且完全由未受影响的亚组计算。由于真和假阳性分数是完全单独地进行计算，因此通过使用来自两个不同亚组的测试结果，ROC图独立于群组中事件的普遍性。ROC图上的每个点表示对应于特定判定阈值的灵敏度/-特异性对。具有完美辨别(在两个结果分布中没有重叠)的测试具有经过左上角的ROC图，其中真阳性分数为1.0或100％(完美灵敏度)，假阳性分数为0(完美特异性)。没有辨别(两组结果的分布相同)的测试的理论图为从左下角到右上角的45°对角线。大多数图落在这两个极端之间。如果ROC图完全落在45°对角线之下，则这容易地通过将“阳性”标准从“大于”反转为“小于”来矫正，反之亦然。定性地，图越靠近左上角，测试的整体精确度就越高。根据期望的置信区间，可以从ROC曲线推导出阈值，允许分别用灵敏度和特异性的适当平衡诊断或预测给定事件。因此，可以优选地通过如上所述建立用于所述群组的ROC并从其推导出阈值量来生成用于本发明方法的参考。根据诊断方法的期望灵敏度和特异性，ROC图允许推导出合适的阈值。优选地，参考量位于这样的值范围内，其表示至少75％的灵敏度和至少45％的特异性、或者至少80％的灵敏度和至少40％的特异性、或者至少85％的灵敏度和至少33％的特异性、或者至少90％的灵敏度和至少25％的特异性。
如果不知道供体是否患有脑胶质瘤，优选地，如本发明所使用的参考量由在治疗前获得的对象样品获得。该参考量水平可以是离散数字，或者可以是数字的范围。显然，参考水平或量可以在miRNA的个体物种之间变化。因此，优选地，用包含已知量的每种特定miRNA的样品或一系列样品校准测量系统。技术人员理解，在这种情况下，miRNA的量可优选表示为任意单位(AU)。因此，优选地，通过将从样品获得的信号与包括在校准曲线中的信号进行比较来确定miRNA的量。适用于个体对象的参考量可以根据多种生理参数(例如年龄或亚群)而变化。因此，合适的参考量可以通过本发明的方法由待分析的参考样品与测试样品一起(即同时或先后)确定。此外，可以优选地使用阈值量作为参考量。参考量可以优选地由已知患有脑胶质瘤的对象或对象组的样品获得。参考量还可以优选地由已知未患有脑胶质瘤的对象或对象组的样品获得。应理解，上述量可能由于统计学和测量误差而变化。偏差，即本发明提及的miRNA量的降低或升高优选地是统计学上显著的偏差，即统计学上显著的降低或统计学上显著的升高。
如本发明所使用的术语“试剂盒”是指优选地单独提供或提供在单个容器内的上述组分的集合。容器还优选地包含有用于实施本发明方法的说明。在本说明书中已经给出了试剂盒的这些组分的实例及其使用方法。优选地，试剂盒包含在即用型制剂中的上述组分。优选地，试剂盒可另外地包括说明书，例如用于调节组分(例如，检测剂的浓度)以及用于解释关于通过本发明方法所提供诊断的任何测定的结果的用户手册。特别地，这样的手册可以包括用于将确定基因产物的量分配至诊断类型的信息。细节见于本说明书的别处。此外，这样的用户手册可以提供关于正确地使用试剂盒组分用于确定相应生物标志物的量的说明。用户手册可以以纸质或电子形式提供(例如，存储在CD或CD ROM上)。本发明还涉及所述试剂盒在根据本发明的任何方法中的用途。
如本发明所使用的术语“设备”涉及至少包含有效地互相联系以允许进行诊断的上述装置的装置系统。在上文结合本发明的方法公开了优选的用于确定基因产物之甲基化状态或量的装置和用于进行比较的装置。如何以操作方式联系装置将取决于设备中包括的装置的类型。例如，在应用用于自动化确定基因产物的甲基化状态或量的装置的情况下，可以通过例如计算机程序来处理由所述自动化操作装置获得的数据以建立诊断。优选地，在这种情况下，装置包含在单设备中。因此，所述设备可以包括用于确定样品中基因产物的甲基化状态或量的分析单元以及用于处理所得数据用于诊断的评估单元。在上文结合涉及本发明方法的实施方案公开了优选的检测装置。在这种情况下，使装置有效地连接，使得系统的使用者由于手册中给出的说明和解释将量的确定结果及其诊断值结合在一起。在这样的实施方案中装置可以呈现为单独的设备并且优选地作为试剂盒包装在一起。本领域技术人员将了解如何联系装置而无需进一步的创造性技能。优选的设备是可以在没有专业临床医师的特定知识的情况下应用的那些，例如仅需要加载样品的测试条或电子设备。结果可以作为参数诊断原始数据的输出，优选地作为绝对或相对量给出。应理解，这些数据将需要由临床医师解释。然而，还设想了专家系统设备，其中输出包含经处理的诊断原始数据，其解释不需要专业的临床医师。另一些优选设备包含分析单元/设备(例如，生物传感器、阵列、与特异性识别多肽的配体偶联的固体支持物、等离子体表面共振设备、NMR光谱仪、质谱仪等)或上文根据本发明方法提及的评估单元/设备。
在一个或多个具体实施方式中，提供一种用于脑胶质瘤检测的生物标志物，所述生物标志物选自如下miRNA中的任意一个或多个：
miR-204-5p、miR-615-3p、miR-6716-3p、miR-1323、miR-504-5p、miR-125a-5p、miR-195-3p、miR-337-3p、miR-543、miR-92b-3p、miR-885-5p、miR-1911-3p、miR-10a-5p、miR-125b-5p、miR-105-5p、miR-329-3p、miR-92b-5p、miR-99a-5p、miR-130b-5p、miR-885-3p、miR-483-3p、miR-1468-5p、miR-409-3p、miR-483-5p、miR-204-3p、miR-10b-5p、hsa-let-7e-3p、miR-99b-5p、miR-485-5p、miR-335-3p、miR-323a-3p、miR-1180-3p、miR-200b-5p、miR-23b-5p、miR-522-3p、miR-449c-5p、miR-432-5p、miR-216b-5p、miR-328-3p、hsa-let-7c-3p、miR-34b-3p、miR-139-3p、miR-196a-5p、miR-3605-3p、miR-30a-3p、miR-3074-3p、miR-433-3p、hsa-let-7c-5p、miR-145-3p、miR-4488、miR-365b-5p、miR-30c-5p、miR-224-5p、miR-128-3p、miR-654-3p、miR-24-1-5p、miR-340-3p、hsa-let-7e-5p、miR-100-5p、miR-516b-5p、miR-149-5p、miR-411-3p、miR-379-3p、miR-1226-5p、miR-1911-5p、miR-222-3p、miR-3690、miR-124-3p、miR-628-3p、miR-200c-3p、miR-125b-1-3p、miR-139-5p、miR-369-5p、miR-365a-3p、miR-375-3p、miR-193b-5p、miR-3120-5p、miR-429、miR-34c-3p、miR-183-5p、miR-1298-3p、miR-424-3p、miR-493-5p、miR-767-5p、miR-99b-3p、hsa-let-7d-3p、miR-1912-3p、miR-494-3p、miR-448、miR-27b-5p、miR-1298-5p、miR-505-5p、miR-455-5p、miR-196b-5p、miR-382-5p、hsa-let-7b-5p、miR-151a-3p、miR-331-5p、hsa-let-7b-3p、miR-654-5p、miR-549a-3p、miR-181a-2-3p、miR-148b-5p、miR-25-5p、miR-342-3p、miR-769-5p、miR-23a-5p、miR-514a-3p、miR-203a-3p、miR-203b-5p、miR-15b-5p、miR-625-3p、miR-3913-5p、miR-589-5p、miR-27a-3p、miR-1268a、miR-542-3p、miR-22-5p、miR-3913-3p、miR-210-3p、miR-16-2-3p、miR-330-5p、miR-3529-3p、miR-7-5p、miR-10527-5p、miR-140-5p、miR-103a-3p、miR-144-5p、miR-103b、miR-29a-3p、miR-181c-5p、miR-148b-3p、miR-30e-5p、miR-326、miR-155-5p、miR-26b-5p、miR-30d-3p、miR-181a-3p、miR-324-5p、miR-106b-3p、miR-374a-5p、miR-873-5p、miR-374a-3p、miR-642a-3p、miR-642b-5p、miR-29b-3p、miR-20b-5p、miR-660-5p、miR-130b-3p、miR-550b-3p、miR-766-5p、miR-93-5p、miR-20a-5p、miR-550a-3-5p、miR-550a-5p、hsa-let-7i-5p、miR-500a-3p、miR-1273h-3p、miR-3614-5p、miR-17-5p、miR-1246、miR-23a-3p、miR-625-5p、miR-451a、miR-106a-5p、miR-17-3p、miR-454-3p、miR-26b-3p、miR-374b-3p、miR-15a-5p、miR-378a-3p、miR-150-3p、miR-107、hsa-let-7f-2-3p、miR-10399-3p、miR-942-5p、miR-4286、miR-140-3p、miR-7-1-3p、miR-101-3p、miR-548o-3p、miR-6503-3p、miR-1307-5p、miR-106b-5p、miR-1291、miR-340-5p、miR-502-3p、miR-378f、miR-19a-3p、miR-548j-5p、miR-3202、miR-548k、miR-186-5p、miR-185-3p、miR-8485、miR-15b-3p、miR-16-5p、miR-32-5p、miR-10395-3p、miR-324-3p、miR-424-5p、miR-146b-5p、miR-4485-3p、miR-627-3p、miR-548t-3p、miR-147b-3p、miR-29c-3p、miR-150-5p、miR-5009-5p、miR-6515-5p、miR-144-3p、miR-374b-5p、miR-374c-3p、miR-425-3p、miR-766-3p、miR-185-5p、miR-1278、miR-378e、miR-2355-3p、miR-548d-5p、miR-548e-3p、miR-451b、miR-21-5p、miR-223-5p、hsa-let-7g-5p、miR-378g、miR-26a-2-3p、miR-652-3p、hsa-let-7i-3p、miR-4772-5p、miR-27a-5p、miR-548bc、miR-548f-5p、miR-629-5p、miR-1250-5p、miR-6503-5p、miR-576-3p、miR-3177-3p、miR-18a-5p、miR-548ad-5p、miR-3150b-3p、miR-142-5p、miR-548aq-3p、miR-548g-5p、miR-4772-3p、miR-548ap-3p、miR-1273h-5p、miR-6501-5p、miR-651-5p、miR-1973、miR-378c、miR-548u、miR-378d、miR-1304-5p、miR-1285-3p、miR-2115-3p、miR-671-5p、miR-142-3p、miR-146b-3p、miR-362-3p、miR-19b-3p、miR-21-3p、miR-146a-5p、miR-10399-5p、hsa-let-7g-3p、miR-548f-3p、miR-223-3p、miR-582-5p、miR-12136。
在一些具体实施方案中，上述miRNA为前体miRNA或成熟miRNA，优选为人源miRNA。
在一些具体实施方案中，上述miRNA为受试者脑脊液外泌体miRNA。
在一些具体实施方案中，上述生物标志物表达水平的改变指示组织状态或疾病的变化，例如组织状态或疾病(特别是脑胶质瘤)的恶化或好转。
在一些具体实施方案中，miR-204-5p、miR-615-3p、miR-6716-3p、miR-1323、miR-504-5p、miR-125a-5p、miR-195-3p、miR-337-3p、miR-543、miR-92b-3p、miR-885-5p、miR-1911-3p、miR-10a-5p、miR-125b-5p、miR-105-5p、miR-329-3p、miR-92b-5p、miR-99a-5p、miR-130b-5p、miR-885-3p、miR-483-3p、miR-1468-5p、miR-409-3p、miR-483-5p、miR-204-3p、miR-10b-5p、hsa-let-7e-3p、miR-99b-5p、miR-485-5p、miR-335-3p、miR-323a-3p、miR-1180-3p、miR-200b-5p、miR-23b-5p、miR-522-3p、miR-449c-5p、miR-432-5p、miR-216b-5p、miR-328-3p、hsa-let-7c-3p、miR-34b-3p、miR-139-3p、miR-196a-5p、miR-3605-3p、miR-30a-3p、miR-3074-3p、miR-433-3p、hsa-let-7c-5p、miR-145-3p、miR-4488、miR-365b-5p、miR-30c-5p、miR-224-5p、miR-128-3p、miR-654-3p、miR-24-1-5p、miR-340-3p、hsa-let-7e-5p、miR-100-5p、miR-516b-5p、miR-149-5p、miR-411-3p、miR-379-3p、miR-1226-5p、miR-1911-5p、miR-222-3p、miR-3690、miR-124-3p、miR-628-3p、miR-200c-3p、miR-125b-1-3p、miR-139-5p、miR-369-5p、miR-365a-3p、miR-375-3p、miR-193b-5p、miR-3120-5p、miR-429、miR-34c-3p、miR-183-5p、miR-1298-3p、miR-424-3p、miR-493-5p、miR-767-5p、miR-99b-3p、hsa-let-7d-3p、miR-1912-3p、miR-494-3p、miR-448、miR-27b-5p、miR-1298-5p、miR-505-5p、miR-455-5p、miR-196b-5p、miR-382-5p、hsa-let-7b-5p、miR-151a-3p、miR-331-5p、hsa-let-7b-3p、miR-654-5p和/或miR-549a-3p的表达水平的升高指示发生变性组织状态或疾病(特别是脑胶质瘤)的风险；还指示个体遭受经改变的组织状态或疾病(特别是脑胶质瘤)。此外，上述miRNA表达水平升高指示对象中组织状态或疾病(如脑胶质瘤)的进展或阶段。特别地，上述miRNA表达水平升高指示组织状态或疾病(特别是脑胶质瘤)恶化。
在一些具体实施方案中，miR-181a-2-3p、miR-148b-5p、miR-25-5p、miR-342-3p、miR-769-5p、miR-23a-5p、miR-514a-3p、miR-203a-3p、miR-203b-5p、miR-15b-5p、miR-625-3p、miR-3913-5p、miR-589-5p、miR-27a-3p、miR-1268a、miR-542-3p、miR-22-5p、miR-3913-3p、miR-210-3p、miR-16-2-3p、miR-330-5p、miR-3529-3p、miR-7-5p、miR-10527-5p、miR-140-5p、miR-103a-3p、miR-144-5p、miR-103b、miR-29a-3p、miR-181c-5p、miR-148b-3p、miR-30e-5p、miR-326、miR-155-5p、miR-26b-5p、miR-30d-3p、miR-181a-3p、miR-324-5p、miR-106b-3p、miR-374a-5p、miR-873-5p、miR-374a-3p、miR-642a-3p、miR-642b-5p、miR-29b-3p、miR-20b-5p、miR-660-5p、miR-130b-3p、miR-550b-3p、miR-766-5p、miR-93-5p、miR-20a-5p、miR-550a-3-5p、miR-550a-5p、hsa-let-7i-5p、miR-500a-3p、miR-1273h-3p、miR-3614-5p、miR-17-5p、miR-1246、miR-23a-3p、miR-625-5p、miR-451a、miR-106a-5p、miR-17-3p、miR-454-3p、miR-26b-3p、miR-374b-3p、miR-15a-5p、miR-378a-3p、miR-150-3p、miR-107、hsa-let-7f-2-3p、miR-10399-3p、miR-942-5p、miR-4286、miR-140-3p、miR-7-1-3p、miR-101-3p、miR-548o-3p、miR-6503-3p、miR-1307-5p、miR-106b-5p、miR-1291、miR-340-5p、miR-502-3p、miR-378f、miR-19a-3p、miR-548j-5p、miR-3202、miR-548k、miR-186-5p、miR-185-3p、miR-8485、miR-15b-3p、miR-16-5p、miR-32-5p、miR-10395-3p、miR-324-3p、miR-424-5p、miR-146b-5p、miR-4485-3p、miR-627-3p、miR-548t-3p、miR-147b-3p、miR-29c-3p、miR-150-5p、miR-5009-5p、miR-6515-5p、miR-144-3p、miR-374b-5p、miR-374c-3p、miR-425-3p、miR-766-3p、miR-185-5p、miR-1278、miR-378e、miR-2355-3p、miR-548d-5p、miR-548e-3p、miR-451b、miR-21-5p、miR-223-5p、hsa-let-7g-5p、miR-378g、miR-26a-2-3p、miR-652-3p、hsa-let-7i-3p、miR-4772-5p、miR-27a-5p、miR-548bc、miR-548f-5p、miR-629-5p、miR-1250-5p、miR-6503-5p、miR-576-3p、miR-3177-3p、miR-18a-5p、miR-548ad-5p、miR-3150b-3p、miR-142-5p、miR-548aq-3p、miR-548g-5p、miR-4772-3p、miR-548ap-3p、miR-1273h-5p、miR-6501-5p、miR-651-5p、miR-1973、miR-378c、miR-548u、miR-378d、miR-1304-5p、miR-1285-3p、miR-2115-3p、miR-671-5p、miR-142-3p、miR-146b-3p、miR-362-3p、miR-19b-3p、miR-21-3p、miR-146a-5p、miR-10399-5p、hsa-let-7g-3p、miR-548f-3p、miR-223-3p、miR-582-5p和/或miR-12136表达水平的降低指示发生变性组织状态或疾病(特别是脑胶质瘤)的风险；还指示个体遭受经改变的组织状态或疾病(特别是脑胶质瘤)。此外，上述miRNA表达水平降低指示对象中组织状态或疾病(如脑胶质瘤)的进展或阶段。特别地，上述miRNA表达水平降低指示组织状态或疾病(特别是脑胶质瘤)恶化。
在一些具体实施方案中，上述用于脑胶质瘤检测的生物标志物包括如下任意一种或多种组成的组：
hsa-miR-99a-5p+hsa-let-7i-5p+hsa-let-7c-5p；
hsa-miR-99a-5p+hsa-miR-21-5p+hsa-let-7i-5p+hsa-let-7c-5p；
hsa-miR-99a-5p+hsa-miR-10a-5p+hsa-miR-99b-5p+hsa-miR-let-7i-5p+hsa-miR-378a-3p；
hsa-miR-99a-5p+hsa-miR-21-5p+hsa-miR-451a+hsa-let-7i-5p+hsa-let-7c-5p；
hsa-miR-99a-5p+hsa-miR-21-5p+hsa-miR-451a+hsa-let-7i-5p+hsa-miR-204-5p+hsa-let-7a-5p+hsa-let-7c-5p；
hsa-miR-99a-5p+hsa-miR-21-5p+hsa-miR-451a+hsa-let-7i-5p+hsa-miR-204-5p+hsa-let-7a-5p+hsa-miR-122-5p+hsa-miR-122b-3p+hsa-let-7c-5p；
hsa-miR-99a-5p+hsa-miR-21-5p+hsa-miR-451a+hsa-let-7i-5p+hsa-miR-204-5p+hsa-miR-1298-5p+hsa-let-7a-5p+hsa-miR-122-5p+hsa-miR-122b-3p+hsa-miR-143-3p+hsa-let-7c-5p；
hsa-miR-99a-5p+hsa-miR-21-5p+hsa-miR-451a+hsa-miR-204-5p+hsa-miR-1298-5p+hsa-let-7b-5p+hsa-let-7a-5p+hsa-miR-122-5p+hsa-miR-122b-3p+hsa-miR-143-3p+hsa-let-7c-5p；
hsa-miR-99a-5p+hsa-miR-21-5p+hsa-miR-451a+hsa-miR-204-5p+hsa-miR-1298-5p+hsa-let-7b-5p+hsa-let-7a-5p+hsa-miR-122-5p+hsa-miR-122b-3p+hsa-let-7c-5p；
hsa-miR-99a-5p+hsa-miR-21-5p+hsa-miR-451a+hsa-miR-204-5p+hsa-miR-1298-5p+hsa-let-7b-5p+hsa-let-7a-5p+hsa-miR-122-5p+hsa-miR-122b-3p；
hsa-miR-99a-5p+hsa-miR-21-5p+hsa-miR-451a+hsa-miR-1298-5p+hsa-let-7b-5p+hsa-let-7a-5p+hsa-miR-122-5p+hsa-miR-122b-3p。
在一些具体实施方案中，上述用于脑胶质瘤检测的生物标志物具体为用于脑胶质瘤早期诊断和/或复发监测的生物标志物。
在一些具体实施方案中，所述生物标志物具有如下a)-c)中任意一种或多种功能：
a)鉴定或辅助鉴定胶质瘤细胞；
b)诊断或辅助诊断初发胶质瘤；
c)诊断或辅助诊断复发胶质瘤。
在一些具体实施方案中，提供检测上述生物标志物表达水平的物质在制备脑胶质瘤检测产品中的应用。
在一些具体实施方案中，所述物质包括但不限于基于高通量测序方法和/或基于定量PCR方法和/或基于探针杂交方法检测上述生物标志物表达水平的物质。
在一些具体实施方案中，所述产品包括但不限于装置(如寡核苷酸探针或其集成、芯片基片或检测基板上的高通量miRNA检测芯片)、试剂盒和设备。
在一些具体实施方案中，提供一种装置，所述装置包括：
检测上述生物标志物的一个或更多个装置。
在一些具体实施方案中，提供一种试剂盒，所述试剂盒包含上述所述装置。
在一些具体实施方案中，提供上述装置和/或试剂盒用于检测脑胶质瘤的用途；具体为用于脑胶质瘤早期诊断和/或复发监测；
在一些具体实施方案中，具有如下a)-c)中任意一种或多种功能：
a)鉴定或辅助鉴定胶质瘤细胞；
b)诊断或辅助诊断初发胶质瘤；
c)诊断或辅助诊断复发胶质瘤。
在一些具体实施方案中，提供一种用于检测脑胶质瘤的设备，其包含：
i)分析单元，所述分析单元包含：用于确定对象的样品中选自上述生物标志物表达水平的检测剂，以及
ii)包含有数据处理器的评估单元，所述数据处理器有形地嵌入有用于将通过所述分析单元确定的量与参考进行比较的算法，并且能够生成包含基于所述比较建立的诊断结果的输出文件。
在一些具体实施方案中，提供一种用于脑胶质瘤早期诊断和/或复发监测的方法，所述方法包括：确定来自受试者的生物样品中上述生物标志物的存在或表达水平，以及将所述生物标志物的表达水平与参照进行比较。
在一些具体实施方案中，所述生物样品为脑脊液外泌体。
在一些具体实施方案中，所述方法具体为：
a)鉴定或辅助鉴定胶质瘤细胞；
b)诊断或辅助诊断初发胶质瘤；
c)诊断或辅助诊断复发胶质瘤。
在一些具体实施方案中，将受试者中至少一种miRNA标志物的存在(特别是量)与一个或更多个参照中至少一种miRNA标志物的存在(特别是量)进行比较。特别地，所述参照为阈值、参考值或参考样品。
在其中参考为阈值的实施方案中，选自miR-204-5p、miR-615-3p、miR-6716-3p、miR-1323、miR-504-5p、miR-125a-5p、miR-195-3p、miR-337-3p、miR-543、miR-92b-3p、miR-885-5p、miR-1911-3p、miR-10a-5p、miR-125b-5p、miR-105-5p、miR-329-3p、miR-92b-5p、miR-99a-5p、miR-130b-5p、miR-885-3p、miR-483-3p、miR-1468-5p、miR-409-3p、miR-483-5p、miR-204-3p、miR-10b-5p、hsa-let-7e-3p、miR-99b-5p、miR-485-5p、miR-335-3p、miR-323a-3p、miR-1180-3p、miR-200b-5p、miR-23b-5p、miR-522-3p、miR-449c-5p、miR-432-5p、miR-216b-5p、miR-328-3p、hsa-let-7c-3p、miR-34b-3p、miR-139-3p、miR-196a-5p、miR-3605-3p、miR-30a-3p、miR-3074-3p、miR-433-3p、hsa-let-7c-5p、miR-145-3p、miR-4488、miR-365b-5p、miR-30c-5p、miR-224-5p、miR-128-3p、miR-654-3p、miR-24-1-5p、miR-340-3p、hsa-let-7e-5p、miR-100-5p、miR-516b-5p、miR-149-5p、miR-411-3p、miR-379-3p、miR-1226-5p、miR-1911-5p、miR-222-3p、miR-3690、miR-124-3p、miR-628-3p、miR-200c-3p、miR-125b-1-3p、miR-139-5p、miR-369-5p、miR-365a-3p、miR-375-3p、miR-193b-5p、miR-3120-5p、miR-429、miR-34c-3p、miR-183-5p、miR-1298-3p、miR-424-3p、miR-493-5p、miR-767-5p、miR-99b-3p、hsa-let-7d-3p、miR-1912-3p、miR-494-3p、miR-448、miR-27b-5p、miR-1298-5p、miR-505-5p、miR-455-5p、miR-196b-5p、miR-382-5p、hsa-let-7b-5p、miR-151a-3p、miR-331-5p、hsa-let-7b-3p、miR-654-5p和/或miR-549a-3p的至少一种miRNA标志物的量等于或大于阈值指示对象患有脑胶质瘤、发生脑胶质瘤的风险升高或脑胶质瘤疾病恶化；然而，低于阈值的量指示对象未患脑胶质瘤、发生脑胶质瘤的风险降低或脑胶质瘤疾病好转。应理解，上述表达水平可以由于统计学和测量误差而不同。
在其中参照为阈值的实施方案中，选自miR-181a-2-3p、miR-148b-5p、miR-25-5p、miR-342-3p、miR-769-5p、miR-23a-5p、miR-514a-3p、miR-203a-3p、miR-203b-5p、miR-15b-5p、miR-625-3p、miR-3913-5p、miR-589-5p、miR-27a-3p、miR-1268a、miR-542-3p、miR-22-5p、miR-3913-3p、miR-210-3p、miR-16-2-3p、miR-330-5p、miR-3529-3p、miR-7-5p、miR-10527-5p、miR-140-5p、miR-103a-3p、miR-144-5p、miR-103b、miR-29a-3p、miR-181c-5p、miR-148b-3p、miR-30e-5p、miR-326、miR-155-5p、miR-26b-5p、miR-30d-3p、miR-181a-3p、miR-324-5p、miR-106b-3p、miR-374a-5p、miR-873-5p、miR-374a-3p、miR-642a-3p、miR-642b-5p、miR-29b-3p、miR-20b-5p、miR-660-5p、miR-130b-3p、miR-550b-3p、miR-766-5p、miR-93-5p、miR-20a-5p、miR-550a-3-5p、miR-550a-5p、hsa-let-7i-5p、miR-500a-3p、miR-1273h-3p、miR-3614-5p、miR-17-5p、miR-1246、miR-23a-3p、miR-625-5p、miR-451a、miR-106a-5p、miR-17-3p、miR-454-3p、miR-26b-3p、miR-374b-3p、miR-15a-5p、miR-378a-3p、miR-150-3p、miR-107、hsa-let-7f-2-3p、miR-10399-3p、miR-942-5p、miR-4286、miR-140-3p、miR-7-1-3p、miR-101-3p、miR-548o-3p、miR-6503-3p、miR-1307-5p、miR-106b-5p、miR-1291、miR-340-5p、miR-502-3p、miR-378f、miR-19a-3p、miR-548j-5p、miR-3202、miR-548k、miR-186-5p、miR-185-3p、miR-8485、miR-15b-3p、miR-16-5p、miR-32-5p、miR-10395-3p、miR-324-3p、miR-424-5p、miR-146b-5p、miR-4485-3p、miR-627-3p、miR-548t-3p、miR-147b-3p、miR-29c-3p、miR-150-5p、miR-5009-5p、miR-6515-5p、miR-144-3p、miR-374b-5p、miR-374c-3p、miR-425-3p、miR-766-3p、miR-185-5p、miR-1278、miR-378e、miR-2355-3p、miR-548d-5p、miR-548e-3p、miR-451b、miR-21-5p、miR-223-5p、hsa-let-7g-5p、miR-378g、miR-26a-2-3p、miR-652-3p、hsa-let-7i-3p、miR-4772-5p、miR-27a-5p、miR-548bc、miR-548f-5p、miR-629-5p、miR-1250-5p、miR-6503-5p、miR-576-3p、miR-3177-3p、miR-18a-5p、miR-548ad-5p、miR-3150b-3p、miR-142-5p、miR-548aq-3p、miR-548g-5p、miR-4772-3p、miR-548ap-3p、miR-1273h-5p、miR-6501-5p、miR-651-5p、miR-1973、miR-378c、miR-548u、miR-378d、miR-1304-5p、miR-1285-3p、miR-2115-3p、miR-671-5p、miR-142-3p、miR-146b-3p、miR-362-3p、miR-19b-3p、miR-21-3p、miR-146a-5p、miR-10399-5p、hsa-let-7g-3p、miR-548f-3p、miR-223-3p、miR-582-5p、miR-12136的至少一种miRNA标志物的量小于或等于阈值指示对象患有脑胶质瘤、发生脑胶质瘤的风险升高或脑胶质瘤疾病恶化；然而，高于阈值的量指示对象未患脑胶质瘤、发生脑胶质瘤的风险降低或脑胶质瘤疾病好转。应理解，上述表达水平可以由于统计学和测量误差而不同。
在其中参照为参考值的一些实施方案中，所述参考值为脑胶质瘤不存在、脑胶质瘤存在或者发生脑胶质瘤的风险升高或降低的代表值。
在另一些实施方案中，参考样品选自从健康个体获得的参考样品、从患病个体获得的参考样品、在较早或较晚时间点取得的与目的样品从同一个体获得的参考样品、以及代表健康个体或者代表脑胶质瘤存在或不存在或者代表发生脑胶质瘤的风险升高或降低的参考样品。
在一些具体实施方案中，对象为哺乳动物、爬行动物或鸟类。特别地，对象选自实验室动物(例如小鼠或大鼠)、家养动物(包括例如豚鼠、兔、马、驴、牛、绵羊、山羊、猪、鸡、骆驼、猫、狗、海龟、陆龟、蛇或蜥蜴)或灵长类(包括黑猩猩、倭黑猩猩、大猩猩和人)。人是特别优选的。
以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人《分子克隆：实验手册》或《分子克隆实验指南》中所述的技术和条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例
选取的脑脊液外泌体样本为91份，其中88份来自在齐鲁医院确诊并收治的44例胶质瘤患者的术前荷瘤状态和术后非荷瘤状态对照脑脊液(均签署知情同意书，经病理组织学确诊为I-IV级胶质瘤患者，影像资料及病历资料完善)，3例来自于正常对照患者脑脊液(脑积水脑室腹腔分流术中获取)。各脑脊液样本分别进行如下检测：
一、脑脊液外泌体的提取及鉴定
1、所取脑脊液样本，均采用金标准的密度梯度超速离心法提取外泌体。
2、取步骤1得到的外泌体，均采用外泌体鉴定金标准投射电子显微镜进行观察。各个脑脊液样本均得到了外泌体，示例性结果见图1。
二、外泌体总RNA的抽提
取步骤一的1得到的脑脊液外泌体，提取总RNA，其中每份脑脊液取一半样品使用microRNA专用提取试剂盒进行miRNA抽提。
三、全部样品均由二代测序进行全转录组测序(测序内容包含miRNA、mRNA、lncRNA、circRNA、TUCP RNA、snoRNA等全部常见RNA类型)。
1、取步骤二得到的总RNA，进行逆转录，得到cDNA。
2、以步骤三得到的cDNA为模板，进行has二代测序，测序由北京诺禾致源负责。
3、测序结果由发明人团队负责后序计算分析和解读。
实验结果：
1、脑脊液外泌体中分子标记物的鉴定筛选：
通过上述全转录组检测，发现脑脊液外泌体中仅miRNA的表达量稳定可靠，且不受术前术后状态、肿瘤和非肿瘤、以及个体间差异影响，是最佳的脑脊液液体活检标记物(图2)。miRNA表达水平最高，且个体间差异最小，总体提表达水平最为稳定
2、脑脊液外泌体中仅miRNA能够作为液体活检分子标志物早期诊断胶质瘤
通过将miRNA、mRNA、lncRNA和circRNA等各种脑脊液外泌体指标进行对比，发现只有miRNA能够准确区分肿瘤患者脑脊液和正常对照脑脊液，其余RNA指标均无法完成液体活检诊断，且术后切除肿瘤之后脑脊液迅速恢复正常，与正常脑脊液表达谱高度一致(图3)。表明脑脊液外泌体中的miRNA能够诊断胶质瘤，mRNA、lncRNA和circRNA均无法实现。
3、脑脊液外泌体miRNA除了能够早期诊断胶质瘤，还能够早期发现复发患者，进行复发监测
进一步随访液体活检患者，继续纳入术后复查的患者脑脊液样本之后，发现脑脊液外泌体miRNA指标还能够实现复发灶的指示作用，较常规影像学手段至少可提前6-9个月(图4)。
4、可用于临床早期诊断胶质瘤和预后复发检测的脑脊液液体活检指标最佳组合
进一步利用LASSO算法和人工神经网络模型，将90个miRNA指标进一步优化，形成了10余种最优组合，其中例如miR-99a-5p、miR-10a-5p、miR-99b-5p、miR-let-7i-5p和miR-378a-3p的组合为最佳组合之一，且具有较少的指标数，模型运算得出的外泌体miRNA液体活检评分(CSF-exo-miRNA-Score)非常利于临床推广应用(图5)。
5、所有代表性的miRNA标志物AUC值见下表：
Figure BDA0002530991000000121
Figure BDA0002530991000000131
Figure BDA0002530991000000141
6、10种miRNA组合ROC分析见下表：
Figure BDA0002530991000000142
Figure BDA0002530991000000151
Figure BDA0002530991000000161
Figure BDA0002530991000000171
Figure BDA0002530991000000181
Figure BDA0002530991000000191
Figure BDA0002530991000000201
Figure BDA0002530991000000211
Figure BDA0002530991000000221
Figure BDA0002530991000000231
Figure BDA0002530991000000241
Figure BDA0002530991000000251
Figure BDA0002530991000000261
Figure BDA0002530991000000271
Figure BDA0002530991000000281
Figure BDA0002530991000000291
Figure BDA0002530991000000301
Figure BDA0002530991000000311
Figure BDA0002530991000000321
Figure BDA0002530991000000331
Figure BDA0002530991000000341
Figure BDA0002530991000000351
Figure BDA0002530991000000361
应注意的是，以上实例仅用于说明本发明的技术方案而非对其进行限制。尽管参照所给出的实例对本发明进行了详细说明，但是本领域的普通技术人员可根据需要对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。

Claims (10)

1.一种用于脑胶质瘤检测的生物标志物，其特征在于，所述生物标志物选自如下miRNA中的任意一个或多个：
miR-204-5p、miR-615-3p、miR-6716-3p、miR-1323、miR-504-5p、miR-125a-5p、miR-195-3p、miR-337-3p、miR-543、miR-92b-3p、miR-885-5p、miR-1911-3p、miR-10a-5p、miR-125b-5p、miR-105-5p、miR-329-3p、miR-92b-5p、miR-99a-5p、miR-130b-5p、miR-885-3p、miR-483-3p、miR-1468-5p、miR-409-3p、miR-483-5p、miR-204-3p、miR-10b-5p、hsa-let-7e-3p、miR-99b-5p、miR-485-5p、miR-335-3p、miR-323a-3p、miR-1180-3p、miR-200b-5p、miR-23b-5p、miR-522-3p、miR-449c-5p、miR-432-5p、miR-216b-5p、miR-328-3p、hsa-let-7c-3p、miR-34b-3p、miR-139-3p、miR-196a-5p、miR-3605-3p、miR-30a-3p、miR-3074-3p、miR-433-3p、hsa-let-7c-5p、miR-145-3p、miR-4488、miR-365b-5p、miR-30c-5p、miR-224-5p、miR-128-3p、miR-654-3p、miR-24-1-5p、miR-340-3p、hsa-let-7e-5p、miR-100-5p、miR-516b-5p、miR-149-5p、miR-411-3p、miR-379-3p、miR-1226-5p、miR-1911-5p、miR-222-3p、miR-3690、miR-124-3p、miR-628-3p、miR-200c-3p、miR-125b-1-3p、miR-139-5p、miR-369-5p、miR-365a-3p、miR-375-3p、miR-193b-5p、miR-3120-5p、miR-429、miR-34c-3p、miR-183-5p、miR-1298-3p、miR-424-3p、miR-493-5p、miR-767-5p、miR-99b-3p、hsa-let-7d-3p、miR-1912-3p、miR-494-3p、miR-448、miR-27b-5p、miR-1298-5p、miR-505-5p、miR-455-5p、miR-196b-5p、miR-382-5p、hsa-let-7b-5p、miR-151a-3p、miR-331-5p、hsa-let-7b-3p、miR-654-5p、miR-549a-3p、miR-181a-2-3p、miR-148b-5p、miR-25-5p、miR-342-3p、miR-769-5p、miR-23a-5p、miR-514a-3p、miR-203a-3p、miR-203b-5p、miR-15b-5p、miR-625-3p、miR-3913-5p、miR-589-5p、miR-27a-3p、miR-1268a、miR-542-3p、miR-22-5p、miR-3913-3p、miR-210-3p、miR-16-2-3p、miR-330-5p、miR-3529-3p、miR-7-5p、miR-10527-5p、miR-140-5p、miR-103a-3p、miR-144-5p、miR-103b、miR-29a-3p、miR-181c-5p、miR-148b-3p、miR-30e-5p、miR-326、miR-155-5p、miR-26b-5p、miR-30d-3p、miR-181a-3p、miR-324-5p、miR-106b-3p、miR-374a-5p、miR-873-5p、miR-374a-3p、miR-642a-3p、miR-642b-5p、miR-29b-3p、miR-20b-5p、miR-660-5p、miR-130b-3p、miR-550b-3p、miR-766-5p、miR-93-5p、miR-20a-5p、miR-550a-3-5p、miR-550a-5p、hsa-let-7i-5p、miR-500a-3p、miR-1273h-3p、miR-3614-5p、miR-17-5p、miR-1246、miR-23a-3p、miR-625-5p、miR-451a、miR-106a-5p、miR-17-3p、miR-454-3p、miR-26b-3p、miR-374b-3p、miR-15a-5p、miR-378a-3p、miR-150-3p、miR-107、hsa-let-7f-2-3p、miR-10399-3p、miR-942-5p、miR-4286、miR-140-3p、miR-7-1-3p、miR-101-3p、miR-548o-3p、miR-6503-3p、miR-1307-5p、miR-106b-5p、miR-1291、miR-340-5p、miR-502-3p、miR-378f、miR-19a-3p、miR-548j-5p、miR-3202、miR-548k、miR-186-5p、miR-185-3p、miR-8485、miR-15b-3p、miR-16-5p、miR-32-5p、miR-10395-3p、miR-324-3p、miR-424-5p、miR-146b-5p、miR-4485-3p、miR-627-3p、miR-548t-3p、miR-147b-3p、miR-29c-3p、miR-150-5p、miR-5009-5p、miR-6515-5p、miR-144-3p、miR-374b-5p、miR-374c-3p、miR-425-3p、miR-766-3p、miR-185-5p、miR-1278、miR-378e、miR-2355-3p、miR-548d-5p、miR-548e-3p、miR-451b、miR-21-5p、miR-223-5p、hsa-let-7g-5p、miR-378g、miR-26a-2-3p、miR-652-3p、hsa-let-7i-3p、miR-4772-5p、miR-27a-5p、miR-548bc、miR-548f-5p、miR-629-5p、miR-1250-5p、miR-6503-5p、miR-576-3p、miR-3177-3p、miR-18a-5p、miR-548ad-5p、miR-3150b-3p、miR-142-5p、miR-548aq-3p、miR-548g-5p、miR-4772-3p、miR-548ap-3p、miR-1273h-5p、miR-6501-5p、miR-651-5p、miR-1973、miR-378c、miR-548u、miR-378d、miR-1304-5p、miR-1285-3p、miR-2115-3p、miR-671-5p、miR-142-3p、miR-146b-3p、miR-362-3p、miR-19b-3p、miR-21-3p、miR-146a-5p、miR-10399-5p、hsa-let-7g-3p、miR-548f-3p、miR-223-3p、miR-582-5p和miR-12136。
2.如权利要求1所述的用于脑胶质瘤检测的生物标志物，其特征在于，所述miRNA为前体miRNA或成熟miRNA，优选为人源miRNA；
或，上述miRNA为受试者脑脊液外泌体miRNA。
3.如权利要求1所述的用于脑胶质瘤检测的生物标志物，其特征在于，所述生物标志物包括如下任意一种或多种组成的组：
hsa-miR-99a-5p+hsa-let-7i-5p+hsa-let-7c-5p；
hsa-miR-99a-5p+hsa-miR-21-5p+hsa-let-7i-5p+hsa-let-7c-5p；
hsa-miR-99a-5p+hsa-miR-10a-5p+hsa-miR-99b-5p+hsa-miR-let-7i-5p+hsa-miR-378a-3p；
hsa-miR-99a-5p+hsa-miR-21-5p+hsa-miR-451a+hsa-let-7i-5p+hsa-let-7c-5p；
hsa-miR-99a-5p+hsa-miR-21-5p+hsa-miR-451a+hsa-let-7i-5p+hsa-miR-204-5p+hsa-let-7a-5p+hsa-let-7c-5p；
hsa-miR-99a-5p+hsa-miR-21-5p+hsa-miR-451a+hsa-let-7i-5p+hsa-miR-204-5p+hsa-let-7a-5p+hsa-miR-122-5p+hsa-miR-122b-3p+hsa-let-7c-5p；
hsa-miR-99a-5p+hsa-miR-21-5p+hsa-miR-451a+hsa-let-7i-5p+hsa-miR-204-5p+hsa-miR-1298-5p+hsa-let-7a-5p+hsa-miR-122-5p+hsa-miR-122b-3p+hsa-miR-143-3p+hsa-let-7c-5p；
hsa-miR-99a-5p+hsa-miR-21-5p+hsa-miR-451a+hsa-miR-204-5p+hsa-miR-1298-5p+hsa-let-7b-5p+hsa-let-7a-5p+hsa-miR-122-5p+hsa-miR-122b-3p+hsa-miR-143-3p+hsa-let-7c-5p；
hsa-miR-99a-5p+hsa-miR-21-5p+hsa-miR-451a+hsa-miR-204-5p+hsa-miR-1298-5p+hsa-let-7b-5p+hsa-let-7a-5p+hsa-miR-122-5p+hsa-miR-122b-3p+hsa-let-7c-5p；
hsa-miR-99a-5p+hsa-miR-21-5p+hsa-miR-451a+hsa-miR-204-5p+hsa-miR-1298-5p+hsa-let-7b-5p+hsa-let-7a-5p+hsa-miR-122-5p+hsa-miR-122b-3p；
hsa-miR-99a-5p+hsa-miR-21-5p+hsa-miR-451a+hsa-miR-1298-5p+hsa-let-7b-5p+hsa-let-7a-5p+hsa-miR-122-5p+hsa-miR-122b-3p。
4.如权利要求1-3任一项所述用于脑胶质瘤检测的生物标志物，其特征在于，所述生物标志物具体为用于脑胶质瘤早期诊断和/或复发监测；
更具体的，所述生物标志物具有如下a)-c)中任意一种或多种功能：
a)鉴定或辅助鉴定胶质瘤细胞；
b)诊断或辅助诊断初发胶质瘤；
c)诊断或辅助诊断复发胶质瘤。
5.检测权利要求1-4任一项所述生物标志物表达水平的物质在制备脑胶质瘤检测产品中的应用；
优选的，所述物质包括基于高通量测序方法和/或基于定量PCR方法和/或基于探针杂交方法检测上述生物标志物表达水平的物质；
优选的，所述产品包括装置、试剂盒和设备。
6.一种装置，其特征在于，所述装置包括：
检测权利要求1-4任一项所述生物标志物的一个或更多个装置。
7.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求6所述装置。
8.权利要求6或7所述装置和/或试剂盒用于检测脑胶质瘤的应用；优选的，所述应用为用于脑胶质瘤早期诊断和/或复发监测；
更优选的，所述应用中，具有如下a)-c)中任意一种或多种功能：
a)鉴定或辅助鉴定胶质瘤细胞；
b)诊断或辅助诊断初发胶质瘤；
c)诊断或辅助诊断复发胶质瘤。
9.一种用于检测脑胶质瘤的设备，其特征在于，包含：
i)分析单元，所述分析单元包含：用于确定对象的样品中选自上述生物标志物表达水平的检测剂，以及
ii)包含有数据处理器的评估单元，所述数据处理器有形地嵌入有用于将通过所述分析单元确定的量与参考进行比较的算法，并且能够生成包含基于所述比较建立的诊断结果的输出文件。
10.一种用于脑胶质瘤早期诊断和/或复发监测的方法，其特征在于，所述方法包括：确定来自受试者的生物样品中上述生物标志物的存在或表达水平，以及将所述生物标志物的表达水平与参照进行比较；
优选的，所述生物样品为脑脊液外泌体；
优选的，所述方法具体为：
a)鉴定或辅助鉴定胶质瘤细胞；
b)诊断或辅助诊断初发胶质瘤；
c)诊断或辅助诊断复发胶质瘤。
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