CN111690744B - 一种用于评估乳腺肿瘤进展的生物标志物及其应用 - Google Patents

一种用于评估乳腺肿瘤进展的生物标志物及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供用于评估乳腺肿瘤进展的生物标志物及其应用，属于生物医学和检测分析技术领域。本发明经研究发现，乳腺细胞外泌体中的多种mRNA的相对表达水平与乳腺肿瘤发生显著相关，其中乳腺细胞外泌体源性R‑RAS基因、INSR基因和KDR基因的mRNA均可单独作为乳腺肿瘤的预后生物标志物，可用于对乳腺肿瘤进展进行有效评估，从而使乳腺癌的诊断和检测更加方便易行，具有良好的实际应用之价值。

Description

一种用于评估乳腺肿瘤进展的生物标志物及其应用
技术领域
本发明属于生物医学和检测分析技术领域，具体涉及一种用于评估乳腺肿瘤进展的生物标志物及其应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，严重威胁女性身心健康。尽管手术，放疗及化疗等治疗手段在近几年取得了显著进步，乳腺肿瘤患者的生存率仍有待提高。导致其高死亡率的主要原因是乳腺肿瘤易发生骨、肺、肝、脑等器官的远处转移。在肿瘤发展演进和转移的过程中，血管生成对于肿瘤细胞逃逸到血流中和建立远处转移是必不可少的。血管生成包括内皮细胞的活化、增殖、迁移和成管等几个连续步骤。这个复杂的过程需要内皮细胞与其周围环境之间紧密的相互作用。现有的研究证明，肿瘤细胞可通过分泌各种生物活性介质促进肿瘤血管的生成。
外泌体(exosomes)是近年来发现的具有双层磷脂分子膜的细胞外囊泡，能够由大多数细胞分泌并被受体细胞吞噬。外泌体内含有多种核酸，蛋白质和脂质等分子，广泛存在于体液中并在细胞间信息交流方面具有重要作用。肿瘤细胞分泌的外泌体在肿瘤的局部增殖、远处转移和肿瘤细胞耐药性的调节中发挥着重要作用。然而，发明人发现，针对外泌体与乳腺癌发生发展之间关系的研究鲜有报道。
发明内容
针对上述现有技术中存在的问题，本发明提供用于评估乳腺肿瘤进展的生物标志物及其应用。本发明经研究发现，乳腺肿瘤细胞源外泌体中的多种mRNA的相对表达水平与乳腺肿瘤发生发展显著相关，其中乳腺细胞外泌体源性R-RAS基因、INSR基因和KDR基因的mRNA均可单独作为乳腺肿瘤进展的生物标志物，为临床提供快速准确的诊断方式，使乳腺癌的预后评估更加方便易行。
为了实现上述技术目的，本发明的技术方案为：
本发明的第一个方面，提供一种用于评估乳腺肿瘤进展的生物标志物，所述生物标志物选自如下中的任意一个或多个：
外泌体源性R-RAS基因mRNA、外泌体源性INSR基因mRNA和外泌体源性KDR基因mRNA。
更具体的，上述mRNA为受试者乳腺肿瘤细胞外泌体mRNA。
更具体的，上述用于评估乳腺肿瘤进展的生物标志物为：外泌体源性R-RAS基因mRNA、外泌体源性INSR基因mRNA和外泌体源性KDR基因mRNA所组成的组。
所述乳腺肿瘤进展包括所述乳腺肿瘤的分期阶段和/或所述受试者的生存率。
其中，所述乳腺肿瘤的分期阶段具体采用TNM分期；包括1)乳腺肿瘤本身的生长情况，即肿瘤的大小和它生长浸润范围；2)区域淋巴结转移程度，包括第一站淋巴结转移情况以及有无第二站的转移和3)远位脏器有无血性转移。
本发明的第二个方面，提供检测上述生物标志物表达水平的物质在制备乳腺肿瘤进展评估产品中的应用。
其中，所述物质包括但不限于基于高通量测序方法和/或基于定量PCR方法和/或基于探针杂交方法检测上述生物标志物表达水平的物质。
所述产品包括但不限于装置(如寡核苷酸探针或其集成、芯片基片或检测基板上的高通量mRNA检测芯片、以及微流控检测芯片)、试剂盒和设备。
本发明的第三个方面，提供一种装置，所述装置包括：
检测上述生物标志物的一个或更多个装置。
本发明的第四个方面，提供一种试剂盒，所述试剂盒包含上述所述装置。
本发明的第五个方面，提供上述装置和/或试剂盒用于评估乳腺肿瘤进展；
所述乳腺肿瘤进展包括所述乳腺肿瘤的分期阶段和/或所述受试者的生存率。
其中，所述乳腺肿瘤的分期阶段具体采用TNM分期；包括1)乳腺肿瘤本身的生长情况，包括肿瘤的大小和生长浸润范围；2)区域淋巴结转移程度，和3)远位脏器有无血性转移。
本发明的第六个方面，提供一种用于评估乳腺肿瘤进展的设备，其包含：
i)分析单元，所述分析单元包含：用于确定受试者的样品中选自上述生物标志物表达水平的检测剂，以及；
ii)评估单元，所述评估单元包含根据i)中确定的所述生物标志物表达水平判断所述受试者中所述乳腺肿瘤的进展。
本发明的第七个方面，提供一种用于评估乳腺肿瘤进展的方法，所述方法包括：确定来自受试者的生物样品中上述生物标志物的表达水平，以及根据上述生物标志物表达水平判断所述受试者中所述乳腺肿瘤的进展。
其中，所述乳腺肿瘤的分期阶段具体采用TNM分期；包括1)乳腺肿瘤本身的生长情况，包括肿瘤的大小和生长浸润范围；2)区域淋巴结转移程度，和3)远位脏器有无血性转移。
以上一个或多个技术方案的有益技术效果：
上述技术方案首次发现了乳腺癌肿瘤细胞外泌体多种mRNA在乳腺癌发生发展过程中异常表达，具有较高诊断评估价值，为临床提供快速准确的诊断评估方式，使乳腺癌的预后评估更加方便易行。
说明书附图
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例中乳腺肿瘤细胞来源外泌体的鉴定；其中，A为乳腺肿瘤细胞系MCF-7和MDA-MB-231(231)来源外泌体的透射电镜照片；B为外泌体的纳米粒径分布；C为Western blotting检测外泌体的特征性蛋白CD9和TSG101的表达；
图2为本发明实施例中IL-35-Exo和con-Exo处理组之间差异基因(DEGs)的基因芯片分析；其中，A为MDA-MB-231(231)细胞IL-35-Exo和con-Exo处理组间DEGs的散点图；B为IL-35-Exo和con-Exo中DEGs的热图；C为与con-Exo相比，IL-35-Exo组内上调水平最高的前50位DEGs；D为与con-Exo相比，IL-35-Exo组内下调水平最大的前50位DEGs；
图3为本发明实施例中差异基因的功能富集与信号通路分析相关图；其中，A为GO生物功能富集图；B为富集于血管生成功能DEGs的PPI网络；C为KEGG信号通路分析图；D为富集于RAS和PPAR信号通路DEGs的PPI网络；气泡大小表示相应注释中富集的基因数，颜色表示FDR的-log值。
图4为本发明实施例中乳腺癌患者和正常对照者乳腺细胞来源外泌体中R-RASmRNA的表达情况，其中，BN为乳腺癌患者；NC为正常对照者；
图5为本发明实施例中乳腺癌患者和正常对照者乳腺细胞来源外泌体中INSRmRNA的表达情况，其中，BN为乳腺癌患者；NC为正常对照者；
图6为本发明实施例中乳腺癌患者和正常对照者乳腺细胞来源外泌体中KDR mRNA的表达情况，其中，BN为乳腺癌患者；NC为正常对照者；
图7为本发明实施例中R-RAS mRNA高表达组及低表达组乳腺癌患者总生存期图；
图8为本发明实施例中INSR mRNA高表达组及低表达组乳腺癌患者总生存期图；
图9为本发明实施例中KDR mRNA高表达组及低表达组乳腺癌患者总生存期图；
图10为本发明实施例中三种基因mRNA高表达组和低表达组乳腺癌患者发展为高级别乳腺癌的概率对比图。
图11为本发明实施例中三种基因mRNA高表达组和低表达组乳腺癌患者发生远处转移的概率对比图。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
本领域中已知的有数种mRNA的序列，应理解，以下所示的各个mRNA的数据库登录号是人来源的mRNA。然而，这些数据库条目还提供了例如以下不同来源的各自mRNA的数据库登录号：例如任何哺乳动物、爬行动物、或鸟类来源的mRNA，例如选自实验室动物(例如，小鼠或大鼠)、家养动物(包括例如豚鼠、兔、马、驴、牛、绵羊、山羊、猪、鸡、骆驼、猫、狗、海龟、陆龟、蛇或蜥蜴)或灵长类(包括黑猩猩、倭黑猩猩和大猩猩)的mRNA的那些。
术语“mRNA组合”涉及本发明的mRNA的组合。mRNA的量可以通过本领域公知的技术在对象的样品中确定。根据样品的性质，所述量可以通过用于量化多核苷酸量的基于PCR的技术或者通过其他方法(如质谱或(下一代)测序等)来确定。如本发明所使用的术语“确定mRNA组合中至少所述mRNA的量”优选地涉及单独确定组合中每种mRNA的量以能够将组合中每种mRNA的量与所述mRNA特异性的参考进行比较。
如本发明所使用的术语“探针”是指通常用于检测与探针的序列互补的靶RNA和/或RNA序列的单链寡核苷酸。探针与核苷酸序列由于探针与靶序列之间的互补性而允许核苷酸配对的单链核酸(DNA或RNA)杂交。探针的长度取决于预期用途以及所需的探针特异性。通常，探针的长度为20至500个(即50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、300、400、500个)核苷酸，优选20至100个，更优选20至50个核苷酸。对于微RNA的检测，探针为12至30个核苷酸。探针用于多种实验设置，例如但不限于Southern和Northern印迹、实时PCR和原位杂交(In Situ Hybridization，ISH)以及微阵列实验。探针可以是未经标记的、经直接标记的或经间接标记的，例如用链霉抗生物素蛋白复合物随后可结合的生物素标记的。所述标记可以是可通过光谱、光化学、生物化学、免疫化学、化学或其他物理手段检测的分子。例如，合适的标记包括32P、荧光染料、电子致密试剂、酶(例如，通常用于ELISA)、生物素、地高辛配基(digoxigenin)、或半抗原以及其他可检测或可以变成可检测的实体。标记可以引入核酸中的任何位置，例如3’端、5’端或内部。术语“探针”还涵盖其骨架组成不同的核酸，例如但不限于肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA)、二醇核酸(GNA)和苏糖核酸(TNA)。
术语“表达水平”是指在特定的时间点体内或样品中存在的基因产物的量。表达水平可以例如通过由基因表达的蛋白质或mRNA来测量/量化/检测。可以例如如下量化表达水平：用相同样品或参考样品(例如，在相同时间从同一个体得到的样品或相同样品的相同尺寸(重量、体积)的部分)中相同类型基因产物的总量(总蛋白质或mRNA)归一化样品中存在的目的基因产物的量，或者确定目的基因产物的量/限定的样品尺寸(重量、体积等)。可以通过本领域已知的任何方法来测量或检测表达水平，所述方法例如用于目的基因产物的直接检测和量化的方法(例如质谱)，或者通常通过目的基因产物与对目的基因产物具有特异性的一种或更多种不同分子或检测装置(例如，引物、探针、抗体、蛋白质支架)结合而工作的用于间接检测和测量目的基因产物的方法。技术人员还已知的是确定基因拷贝的水平，其还包括确定一个或更多个片段的不存在或存在(例如，通过核酸探针或引物，例如定量PCR、多重连接依赖性探针扩增(Multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA)PCR)。
术语“指标”和“标志”在本发明中可互换使用，并且是指病症的体征或信号或者用于监测病症。这样的“病症”是指细胞、组织或器官的生物状态，或者是指个体的健康和/或疾病状态。指标可以是包括但不限于肽、蛋白质和核酸的分子的存在或不存在，或者可以是细胞、或组织、器官或个体中这样的分子的表达水平或模式变化。指标可以是个体中疾病的发生、发展或存在或者这样的疾病的进一步进展的体征。指标也可以是在个体中发生疾病的风险的体征。
术语指标的水平“下调”、“降低”或“下降”是指与参考或参考样品相比，样品中这样的指标的水平降低。术语指标的水平“上调”、“升高”或“提高”是指与参考或参考样品相比，样品中这样的指标的水平更高。
术语“肿瘤分期”通常是指通过患者体内肿瘤的数量和位置，评价所述肿瘤的进展的组织病理学分类方法。所述肿瘤分期可以根据个体内原发肿瘤以及播散程度(例如，按照WHO提出的TNM分类方法)来描述恶性肿瘤的严重程度和受累范围。所述肿瘤分期可以帮助医生制定相应的治疗计划并且了解疾病的预后，同时避免过度治疗或治疗不足的情况。一般按照世界卫生组织(WHO)提出的TNM分类方法对肿瘤进行分期。TNM分类方法中各个英文数字代号的含义如下，T：原发肿瘤的范围和大小、浸润范围、有无转移、浸润深达程度，分为由0(T0至T4，5个等级)，数字越大表示癌症进展得越明显，根据癌症发生的不同脏器制定的分类方法也不尽相同；N：淋巴结播散情况，分为由0(N0至N3，4个等级)，数字越大表示癌症进展得越明显；M：是否存在转移，其中M0表示没有转移，M1表示有远处转移。临床上将上述的T、N、M的结果综合在一起来决定肿瘤的分期。例如，所述肿瘤分期可以包括肿瘤I期、肿瘤II期、肿瘤III期和肿瘤IV期。
术语所述“生存时间”是指经过治疗后的肿瘤患者的总存活时间。所述生存时间可以与所述肿瘤分期相关。
在原理上，可以通过应用标准统计学方法基于给定mRNA的平均值或中值来对本发明所指定的对象组或群组计算参考量。特别地，例如旨在或不旨在判断事件的方法的测试的精确度最好由其接受者操作特征(receiver-operating characteristic，ROC)来描述(尤其参见Zweig 1993，Clin.Chem.39：561-577)。ROC图是由在所观察到的整个数据范围上不断改变判定阈值获得的所有灵敏度相对于特异性对的图。诊断方法的临床表现取决于其精确度，即其将对象正确地分配到某种预后或诊断的能力。ROC图通过在适于区分的完整阈值范围将灵敏度相对于1-特异性绘图来表示两个分布之间的重叠。在y轴上是灵敏度或真阳性分数，其被定义为真阳性测试结果数与真阳性数和假阴性测试结果数之和的比率。这在疾病或病症的存在下也被称为阳性。其单独地由受影响的亚组计算。在x轴上是假阳性分数或1-特异性，其被定义为假阳性结果数与真阴性数和假阳性结果数之和的比率。其是特异性的指数，并且完全由未受影响的亚组计算。由于真和假阳性分数是完全单独地进行计算，因此通过使用来自两个不同亚组的测试结果，ROC图独立于群组中事件的普遍性。ROC图上的每个点表示对应于特定判定阈值的灵敏度/-特异性对。具有完美辨别(在两个结果分布中没有重叠)的测试具有经过左上角的ROC图，其中真阳性分数为1.0或100％(完美灵敏度)，假阳性分数为0(完美特异性)。没有辨别(两组结果的分布相同)的测试的理论图为从左下角到右上角的45°对角线。大多数图落在这两个极端之间。如果ROC图完全落在45°对角线之下，则这容易地通过将“阳性”标准从“大于”反转为“小于”来矫正，反之亦然。定性地，图越靠近左上角，测试的整体精确度就越高。根据期望的置信区间，可以从ROC曲线推导出阈值，允许分别用灵敏度和特异性的适当平衡诊断或预测给定事件。因此，可以优选地通过如上所述建立用于所述群组的ROC并从其推导出阈值量来生成用于本发明方法的参考。根据诊断方法的期望灵敏度和特异性，ROC图允许推导出合适的阈值。优选地，参考量位于这样的值范围内，其表示至少75％的灵敏度和至少45％的特异性、或者至少80％的灵敏度和至少40％的特异性、或者至少85％的灵敏度和至少33％的特异性、或者至少90％的灵敏度和至少25％的特异性。
如本发明所使用的术语“试剂盒”是指优选地单独提供或提供在单个容器内的上述组分的集合。容器还优选地包含有用于实施本发明方法的说明。在本说明书中已经给出了试剂盒的这些组分的实例及其使用方法。优选地，试剂盒包含在即用型制剂中的上述组分。优选地，试剂盒可另外地包括说明书，例如用于调节组分(例如，检测剂的浓度)以及用于解释关于通过本发明方法所提供诊断的任何测定的结果的用户手册。特别地，这样的手册可以包括用于将确定基因产物的量分配至诊断类型的信息。细节见于本说明书的别处。此外，这样的用户手册可以提供关于正确地使用试剂盒组分用于确定相应生物标志物的量的说明。用户手册可以以纸质或电子形式提供(例如，存储在CD或CD ROM上)。本发明还涉及所述试剂盒在根据本发明的任何方法中的用途。
如本发明所使用的术语“设备”涉及至少包含有效地互相联系以允许进行诊断的上述装置的装置系统。在上文结合本发明的方法公开了优选的用于确定基因产物之甲基化状态或量的装置和用于进行比较的装置。如何以操作方式联系装置将取决于设备中包括的装置的类型。例如，在应用用于自动化确定基因产物的甲基化状态或量的装置的情况下，可以通过例如计算机程序来处理由所述自动化操作装置获得的数据以建立诊断。优选地，在这种情况下，装置包含在单设备中。因此，所述设备可以包括用于确定样品中基因产物的甲基化状态或量的分析单元以及用于处理所得数据用于诊断的评估单元。在上文结合涉及本发明方法的实施方案公开了优选的检测装置。在这种情况下，使装置有效地连接，使得系统的使用者由于手册中给出的说明和解释将量的确定结果及其诊断值结合在一起。在这样的实施方案中装置可以呈现为单独的设备并且优选地作为试剂盒包装在一起。本领域技术人员将了解如何联系装置而无需进一步的创造性技能。优选的设备是可以在没有专业临床医师的特定知识的情况下应用的那些，例如仅需要加载样品的测试条或电子设备。结果可以作为参数诊断原始数据的输出，优选地作为绝对或相对量给出。应理解，这些数据将需要由临床医师解释。然而，还设想了专家系统设备，其中输出包含经处理的诊断原始数据，其解释不需要专业的临床医师。另一些优选设备包含分析单元/设备(例如，生物传感器、阵列、与特异性识别多肽的配体偶联的固体支持物、等离子体表面共振设备、NMR光谱仪、质谱仪等)或上文根据本发明方法提及的评估单元/设备。
本发明的一个具体实施方式中，提供一种用于评估乳腺肿瘤进展的生物标志物，所述生物标志物选自如下中的任意一个或多个：
外泌体源性R-RAS基因mRNA、外泌体源性INSR基因mRNA和外泌体源性KDR基因mRNA。
更具体的，上述mRNA为受试者乳腺肿瘤细胞外泌体mRNA。
更具体的，上述用于评估乳腺肿瘤进展的生物标志物为：外泌体源性R-RAS基因mRNA、外泌体源性INSR基因mRNA和外泌体源性KDR基因mRNA所组成的组。
所述乳腺肿瘤进展包括所述乳腺肿瘤的分期阶段和/或所述受试者的生存率。
其中，所述乳腺肿瘤的分期阶段具体采用TNM分期；包括1)乳腺肿瘤本身的生长情况，即肿瘤的大小和它生长浸润范围；2)区域淋巴结转移程度，包括第一站淋巴结转移情况以及有无第二站的转移和3)远位脏器有无血性转移。
本发明的第二个方面，提供检测上述生物标志物表达水平的物质在制备乳腺肿瘤进展评估产品中的应用。
其中，所述物质包括但不限于基于高通量测序方法和/或基于定量PCR方法和/或基于探针杂交方法检测上述生物标志物表达水平的物质。
所述产品包括但不限于装置(如寡核苷酸探针或其集成、芯片基片或检测基板上的高通量mRNA检测芯片、以及微流控检测芯片)、试剂盒和设备。
本发明的第三个方面，提供一种装置，所述装置包括：
检测上述生物标志物的一个或更多个装置。
本发明的第四个方面，提供一种试剂盒，所述试剂盒包含上述所述装置。
本发明的第五个方面，提供上述装置和/或试剂盒用于评估乳腺肿瘤进展；
所述乳腺肿瘤进展包括所述乳腺肿瘤的分期阶段和/或所述受试者的生存率。
其中，所述乳腺肿瘤的分期阶段具体采用TNM分期；包括1)乳腺肿瘤本身的生长情况，包括肿瘤的大小和生长浸润范围；2)区域淋巴结转移程度，和3)远位脏器有无血性转移。
本发明的第六个方面，提供一种用于评估乳腺肿瘤进展的设备，其包含：
i)分析单元，所述分析单元包含：用于确定受试者的样品中选自上述生物标志物表达水平的检测剂，以及；
ii)评估单元，所述评估单元包含根据i)中确定的所述生物标志物表达水平判断所述受试者中所述乳腺肿瘤的进展。
本发明的第七个方面，提供一种用于评估乳腺肿瘤进展的方法，所述方法包括：确定来自受试者的生物样品中上述生物标志物的表达水平，以及根据上述生物标志物表达水平判断所述受试者中所述乳腺肿瘤的进展。
其中，所述乳腺肿瘤的分期阶段具体采用TNM分期；包括1)乳腺肿瘤本身的生长情况，包括肿瘤的大小和生长浸润范围；2)区域淋巴结转移程度，和3)远位脏器有无血性转移。
更具体的，上述生物标志物表达水平出现上升，则为高表达组，预示乳腺肿瘤恶化、侵袭性较高，生存预后水平较差，较容易出现肿瘤细胞增殖、浸润、远处转移或疾病进展甚至死亡；否则为低表达组。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本公开的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。
实施例
1、材料与方法
1.1实验材料
1.1.1主要设备
OPTIMAL-L100 XP超速离心机 Beckman公司
台式低温高速离心机 日立公司
LSM800激光扫描共聚焦荧光显微镜 ZEISS公司
台式高速离心机 北京医用离心机厂
HS-840U超净工作台 苏州安泰公司
BB5060UVC02培养箱 Hemeus公司
Nanosight纳米颗粒跟踪分析仪 Malvern公司
荧光倒置显微镜 ZEISS公司
体视显微镜 JNOEC公司
电热恒温水浴槽 GFL公司
液氮罐 Thermo Fisher公司
FACSCalibur流式细胞仪 BD公司
酶标仪 BIO-RAD公司
超纯水仪 Millipore公司
电子天平ABT100-5M 科恩公司
垂直电泳槽 BIO-RAD公司
凝胶成像分析仪 BIO-RAD公司
SIM-F124落地式碎化冰块制冰机 三洋公司
手动移液器 艾本德公司
0.22μm滤器 Millipore公司
T25细胞培养瓶/培养皿 康宁公司
15ml/50ml离心管 康宁公司
96孔板 康宁公司
1.1.2主要试剂
Figure BDA0002547555240000111
1.1.3试剂配置
(1)磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline，PBS)：
NaCI 8.00g
KCI 0.20g
Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub> 1.44g
KH<sub>2</sub>PO4 0.24g
溶于1L双蒸水后，调节pH值至7.4，高压灭菌后置于4℃冰箱备用。
(2)Western blottingting电泳液：
Tris 3g
Glycine 14.4g
SDS 1g
溶于1L双蒸水后，置于4℃冰箱备用。
(3)Western blottingting转膜液：
Tris 3g
Glycine 14.4g
甲醇 200ml
溶于800ml双蒸水后，置于4℃冰箱备用。
(4)RPMI 1640完全培养基：RPMI 1640中加入10％胎牛血清及1％的青霉素链霉素，置于4℃冰箱备用。
(5)细胞冻存液：胎牛血清和二甲基亚砜按照9：1的比例进行配置。
1.2试验方法
1.2.1外泌体提取
(1)收集细胞培养基，在4℃环境中300g离心10分钟，以分离死细胞及细胞碎片。
(2)取上清转移至新的离心管中，在4℃环境中16500g离心30分钟，以进一步去除细胞和细胞碎片。
(3)0.22μm滤器过滤上清，去除大于0.22μm的微粒。
(4)过滤后的上清转移到新的超速离心管中，在4℃环境中，经100，000g超速离心1.5小时后，弃上清。
(5)用PBS重悬沉淀并重复(4)以纯化外泌体。
(6)BCA法检测外泌体浓度，分装后于-80℃冰箱保存。
1.2.2外泌体鉴定
(1)提取的外泌体经染色固定后于透射电镜下观察其形态。
(2)外泌体悬液使用NanoSight纳米颗粒跟踪分析仪进行检测。
(3)Western-blotting方法检测外泌体标志蛋白CD9及TSG101的表达。
1.2.3基因表达谱芯片分析
(1)收集各组细胞的外泌体，包括IL-35刺激组的乳腺肿瘤细胞分泌的外泌体(IL-35-Exo)或PBS刺激组的(Con-35-Exo)。加入Trizol试剂，，震荡混匀，使细胞充分裂解。室温静置5分钟。
(2)加氯仿，剧烈震荡30秒，冰上静置10分钟。在4℃环境下12000rpm,离心20分钟后，小心吸取最上层透明水相液体。
(3)加入等体积的异丙醇混匀，室温静置10分钟以沉淀RNA。在4℃环境下12000rpm,离心20分钟。
(4)弃上清，沉淀中加入1mL无水乙醇，震荡10秒后，在4℃环境下12000rpm继续离心20分钟。
(5)弃上清，待沉淀晾至半干，加入适量DEPC水溶解RNA。
(7)使用NanoDrop ND-1000和标准变性凝胶电泳对RNA进行质检。
(8)样品标记和芯片杂交根据Agilent One-Color Microarray-Based GeneExpression Analysis实验方案应用Agilent Human lncRNA+mRNA Array V4.0芯片执行，由上海康成生物技术有限公司进行。
1.2.4差异基因分析及数据挖掘
(1)根据mRNA基因表达谱筛选差异基因，标准包括：与Con-35-Exo相比，IL-35-ExomRNA的|Fold change|≥2且探针强度≥200。
(2)对差异基因进行GO功能注释和KEGG信号通路富集分析。计算每个GO或KEGG项目中包含的差异基因数及EASE得分。根据EASE评分、FDR和富集度评分评价差异基因的生物学意义。
(3)使用STRING网站进一步评估项目内蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)关系。
所有的实验均重复三次以上用，GraphPad-Prism 6软件进行统计分析。用Student's t-test检验评估两组数据的差异性，P＜0.05被认为具有统计学差异。数据以平均数±标准差(Mean±SD)表示。
2、试验结果
2.1乳腺肿瘤细胞来源外泌体的分离与鉴定
应用透射电镜观察MDA-MB-231和MCF-7乳腺肿瘤细胞分离得到的外泌体，结果显示其为典型双层磷脂膜的囊泡结构(图1A)。纳米颗粒分析发现纯化的两种乳腺肿瘤细胞外泌体直径均为100nm左右(图1B)。同时，Western blottingting结果显示，MDA-MB-231和MCF-7乳腺肿瘤细胞分离得到的囊泡表达外泌体的特异性标志蛋白CD9和TSG101(图1C)。
2.2IL-35对乳腺肿瘤细胞外泌体中mRNA表达谱的影响分析
既往的研究证实，外泌体内的mRNA是功能性的，可以在受体细胞中被翻译为蛋白质。本研究分析比较了IL-35处理前、后MDA-MB-231细胞分泌的外泌体中mRNA表达谱的变化，确定了一系列由IL-35作用导致的差异基因(DEGs)。如图2A所示，与con-Exo组相比，IL-35-Exo组共有1841个基因发生上调，1667个基因下调，10488个基因无明显变化。DEGs的表达水平以热图形式在图2B中显示。图2C热图显示了上调程度最高的50个DEGs的表达水平。图2D热图显示了下调程度最大的50个DEGs的表达水平。
2.3差异基因功能富集与信号通路分析
为了阐明差异基因的潜在功能，通过GO功能富集和KEGG信号通路分析分别对DEGs进行数据挖掘。结果提示，DEGs主要参与血管生成和细胞增殖等GO项目(图3A)。为进一步揭示蛋白之间相互作用的关系，绘制了血管生成相关的DEGs的PPI网络图。根据DEGs在网络中的位置，确定了关键中枢基因(MMP14，THBS1，AGT，KDR)。这些基因在拓扑结构上被认为处于重要地位，在调节血管生成中起着关键作用(图3B)。KEGG信号通路分析结果显示，DEGs在RAS和PPAR信号通路中发挥作用(图3C)。PPI网络显示R-RAS,INSR和KDR是调节RAS和PPAR信号通路的关键中枢基因(图3D)。
2.4乳腺癌细胞外泌体中mRNA高表达及预后评估价值
乳腺癌细胞外泌体样本88份，来自在山大二院收治的乳腺癌患者，4例来自正常非乳腺癌患者乳腺细胞，提取总RNA，通过将miRNA、mRNA、lncRNA和circRNA等各种外泌体指标进行对比，mRNA特别是乳腺细胞外泌体中R-RAS mRNA、INSR mRNA和KDR mRNA在肿瘤患者乳腺细胞外泌体中异常高表达，与正常组呈显著性差异(p＜0.05，见图4-6)。
进一步的，用每个mRNA的表达水平中位数作为阈值，将乳腺癌患者分成基因mRNA-高表达组及基因mRNA-低表达组，比较两组间的预后差异。Kaplan-Meier生存分析的结果显示，三种基因mRNA高表达组病人的总生存期(OS))均显著较差。即上述三种基因mRNA表达增加与预后较差相关(图7-9)。同时，试验结果显示，三种基因mRNA高表达组乳腺癌患者发展为高级别(低分化)乳腺癌和发生远处转移的概率均显著高于三种基因mRNA低表达组(p＜0.05，见图10-11)，以上研究表明高表达上述三种基因mRNA的乳腺癌肿瘤进展更快且更倾向于发生淋巴结或远处器管转移，以及其总体生存率均呈明显下降趋势，表明其可用于对乳腺癌的预后评估。
应注意的是，以上实施例仅用于说明本发明的技术方案而非对其进行限制。尽管参照所给出的实施例对本发明进行了详细说明，但是本领域的普通技术人员可根据需要对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。

Claims (1)

1.生物标志物在制备乳腺肿瘤进展评估产品中的应用，所述生物标志物选自：外泌体源性R-RAS基因mRNA、外泌体源性INSR基因mRNA和外泌体源性KDR基因mRNA所组成的组，mRNA为受试者乳腺肿瘤细胞外泌体mRNA；
所述产品为用于外泌体提取、外泌体鉴定和基因表达谱芯片分析的产品；
乳腺肿瘤进展评估为：外泌体中高表达上述三种基因mRNA的乳腺癌肿瘤进展更快且更倾向于发生淋巴结或远处器管转移，以及其总体生存率均呈明显下降趋势。
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ANLN and KDR Are Jointly Prognostic of Breast Cancer Survival and Can Be Modulated for Triple Negative Breast Cancer Control;Xiaofeng Dai等;《Front Genet.》;20191004;第10卷;摘要部分 *
Colorectal cancer cell-derived microvesicles are enriched in cell cycle-related mRNAs that promote proliferation of endothelial cells;Bok Sil Hong等;《BMC Genomics.》;20091130;第10卷;第4页左侧第1段，图3和附加文件3 *
R-ras基因在乳腺癌组织中的表达及其临床意义;宋洁 等;《临床肿瘤学杂志》;20100831;第15卷(第8期);摘要部分 *

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