JP6837428B2 - 患者特有の変異の発癌性指数を決定する方法およびシステム - Google Patents
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Description
患者特有の変異(複数可)の様々な発癌性関連指数を決定する方法およびシステムを提供する。該システムおよび方法は、様々な患者特有の変異の測定およびグレード分類、ならびに様々な関連の発癌性指数の定性的および定量的決定を可能にする。
癌(悪性腫瘍または悪性新生物)は、他の身体部分に侵入または拡大する能力を有する異常な細胞増殖を含む疾患群である。癌は、極めて多様であり、様々な根底的分子メカニズムがそれに関与する。したがって様々な癌と診断された患者の予後は、根底にある分子メカニズムの正確な診断に加え、発癌性変異ならびにオートクリンおよびパラクリンの影響の同定に応じて、大きく異なり得る。
本発明は、患者の変異および患者の特有の状態(予後)に関する洞察を得ることができ、最適な処置の決定をさらに補助することができる、患者特有の変異(複数可)の様々な発癌性指数を決定および/または計算および/または作成する方法およびシステムを提供する。該患者特有の変異は、テスト細胞において、ドライバー変異の機能に関連するシグナル伝達経路の活性の変化を同定することによって認識される。幾つかの実施形態によれば、シグナル伝達経路の活性の変化は、患者の変異の機能に関連するレポータ遺伝子の細胞内局在の変化を同定することによって測定される。幾つかの実施形態において、特異的な患者由来マーカ(PDM)遺伝子が、生体試料から得られ、またはそれに由来し(直接的または間接的に)、対応する蛍光トランスロケーション(translocation)レポータ(FTR)遺伝子の細胞内トランスロケーションに及ぼす影響を生存可能なテスト細胞でテストして、テストされたPDMが変異しているか否かを決定する。幾つかの実施形態において、該特異的な患者由来マーカを得て、蛍光レポータに融合し、患者由来レポータ(PDR)を生成して、そこでPDRの細胞内トランスロケーションを生存可能なテスト細胞でテストして、テストされたPDMが変異しているか否かを決定する。幾つかの実施形態において、ドライバー変異の同定は、様々な薬物および/または薬物の組み合わせへの、同定された特有の変異の薬物応答を測定することができ、さらに同定された変異のグレード分類(それらの腫瘍形成作用に関する)を提供するように、そして様々な患者特有の発癌性指数を決定するように構成される。
a)該生体試料から複数のmRNAを得るステップと;
b)該複数のmRNAからcDNAライブラリを作製するステップと;
c)既知のシグナル伝達タンパク質をコードするポリヌクレオチドに相補的なプライマーセットを用いて、該cDNAライブラリの特定のcDNAを増幅するステップと;
d)該増幅されたcDNAをプロモータに動作可能に連結させた該cDNAの個々の発現構築物を形成させるステップと;
e)該生体試料からの増幅cDNAを保有する発現構築物の第一のセットと、該対応する野生型cDNAの発現構築物の第二のセットと、のアドレス可能なアレー(addressable array)を形成させるステップと;
f)該アレーにおける各場所に特有のレポータ遺伝子部分に連結された標的遺伝子部分を含む蛍光トランスロケーションレポータ(FTR)遺伝子をコードする発現ベクターを添加するステップと;
g)該DNA構築物およびベクターを生存可能なアッセイ細胞にトランスフェクトすることが可能な条件下で、該アッセイ細胞を各場所に添加するステップと;
h)該生体試料からのcDNAを発現する該アッセイ細胞中の該発現されたFTRの少なくとも1つの属性を、対応する野生型発現cDNAと比較するステップであって、該生体試料からのcDNAを候補となる患者特有のドライバー変異として同定するために、該癌患者の生体試料に由来するcDNAを発現するアッセイ細胞と、対応する野生型cDNAを発現するアッセイ細胞との異なる結果を用いるステップと;
i)該候補となる患者特有のドライバー変異の異なる結果を定量し、それにより前記患者特有のドライバー変異の発癌性グレード分類指数を決定するステップと、
を含む、方法が提供される。
幾つかの実施形態によれば、ドライバー変異の機能に関連するシグナル伝達経路の活性の変化を同定および定量することによって、患者特有のドライバー変異の様々な発癌性関連指数を決定する方法およびシステムが提供される。幾つかの実施形態において、シグナル伝達経路活性の変化は、レポータ遺伝子の細胞内局在の変化を同定および定量することによって決定され、該レポータ遺伝子の細胞内局在の変化および前記変化の度合いは、ドライバー変異によって影響を受ける。幾つかの実施形態において、患者由来マーカ(PDM)が、患者の生体試料から得ることができ、レポータキメラ遺伝子(FTR)の存在下、テスト細胞内で発現されるように操作(設計)される。幾つかの実施形態において、患者由来マーカ(PDM)は、同定された配列に基づき対応する患者の遺伝子(複数可)を人工で作製し(合成し)、テスト細胞内で発現されるようにそれらをさらに操作することによって、得ることができる。幾つかの実施形態において、追加または代わりとして、該患者特有のマーカは、蛍光レポータに融合されて、患者由来レポータ(PDR)を作製する。その後、テスト細胞内でのFTR(適用可能ならば、および/またはPDR)の細胞内局在を測定する。テストPDM(適用可能ならば、および/またはPDR)の存在下でのFTRの細胞内局在が、正常条件下で(即ち、対応するWT PDMの存在下で)、または他の所定の参照と比較して、FTR(適用可能ならば、および/またはPDR)の細胞内局在と異なる場合、テストPDM(またはPDR)が変異していることを示している。さらに該方法は有利には、同定されたPDM(適用可能ならば、および/またはPDR)の応答の定量、および同定された変異(複数可)の重症度を示す発癌性グレード分類指数などの様々な発癌性関連指数の決定を可能にする。したがって、本明細書に開示された方法を用いれば、患者特有のPDMを、ドライバー変異であると同定/特徴づけすることができ、さらにそれらの相対的重要性(例えば、発癌活性に関して)を測定および定量することができる。その上、そのようなドライバー変異を測定することによって、患者の腫瘍内で動作する活性化されたシグナル伝達経路およびそれらの薬物応答を、同定、定量およびグレード分類して、特定の患者の様々な経路の相対的重要性を測定することができる。これによって、予後を精密かつ特異的に提供し、さらに最適で個人に合わせた標的治療処置を選択することができる。
a)該生体試料から複数のmRNAを得るステップと;
b)該複数のmRNAからcDNAライブラリを作製するステップと;
c)既知のシグナル伝達タンパク質をコードするポリヌクレオチドに相補的なプライマーセットを用いて、該cDNAライブラリの特定のcDNAを増幅するステップと;
d)該増幅されたcDNAをプロモータに動作可能に連結させた該cDNAの個々の発現構築物を形成させるステップと;
e)該試料からの増幅されたcDNAを保有する発現構築物の第一のセットと、対応する野生型cDNAの発現構築物の第二のセットと、のアドレス可能なアレーを形成させるステップと;
f)該アレーにおける各場所に特有のレポータ遺伝子部分に連結された標的遺伝子部分を含む蛍光トランスロケーションレポータ(FTR)遺伝子をコードする発現ベクターを添加するステップと;
g)該DNA構築物およびベクターを生存可能なアッセイ細胞にトランスフェクトすることが可能な条件下で、該アッセイ細胞を各場所に添加するステップと;
h)該試料からのcDNAを発現する該アッセイ細胞中の発現されたFTRの少なくとも1つの属性を、対応する野生型発現cDNAと比較するステップであって、癌患者の該生体試料からのcDNAを候補となる患者特有のドライバー変異として同定するために、癌患者の生体試料に由来するcDNAを発現するアッセイ細胞と、対応する野生型cDNAを発現するアッセイ細胞との異なる結果を用いるステップと;
i)該候補となる患者特有のドライバー変異の異なる結果を定量し、それにより前記患者特有のドライバー変異の発癌性関連指数を決定するステップと、
の1つまたは複数を含む(任意の選択された順序で)、方法が提供される。
a)該生体試料から複数のmRNAを得るステップと;
b)該複数のmRNAからcDNAライブラリを作製するステップと;
c)既知のシグナル伝達タンパク質をコードするポリヌクレオチドに相補的なプライマーセットを用いて、該cDNAライブラリの特定のcDNA試料を増幅するステップと;
d)該増幅されたcDNAをプロモータに動作可能に連結させた該cDNAの個々の発現構築物を形成させるステップと;
e)該生体試料からの増幅cDNAを保有する発現構築物の第一のセットと、対応する野生型cDNAの発現構築物の第二のセットと、のアドレス可能なアレーを形成させるステップと;
f)該アレーにおける各場所に特有のレポータ遺伝子部分に連結された標的遺伝子部分を含む蛍光トランスロケーションレポータ(FTR)遺伝子をコードする発現ベクターを添加するステップと;
g)該DNA構築物およびベクターを生存可能なアッセイ細胞にトランスフェクトすることが可能な条件下で、該アッセイ細胞を各場所に添加するステップと;
h)該生体試料からのcDNAを発現する該アッセイ細胞中の該発現されたFTRの少なくとも1つの属性を、対応する野生型発現cDNAと比較するステップであって、癌患者の生体試料からのcDNAを候補となる患者特有のドライバー変異として同定するために、癌患者の生体試料に由来するcDNAを発現するアッセイ細胞と、対応する野生型cDNAを発現するアッセイ細胞との異なる結果を用いるステップと;
i)該候補となる患者特有のドライバー変異の異なる結果を定量し、それにより前記患者特有のドライバー変異の発癌性グレード分類指数を決定するステップと、
の1つまたは複数を含む(任意の選択された順序で)、方法が提供される。
a)該生体試料から複数のmRNAを得るステップと;
b)該複数のmRNAからcDNAライブラリを作製するステップと;
c)既知のシグナル伝達タンパク質をコードするポリヌクレオチドに相補的なプライマーセットを用いて、該cDNAライブラリの特定のcDNA試料を増幅するステップと;
d)該増幅されたcDNAをプロモータに動作可能に連結させた該cDNAの個々の発現構築物を形成させるステップと;
e)アドレス可能なアレーにおいて、生存可能なアッセイ細胞を基板に添加するステップと;
f)該アッセイ細胞に、該生体試料からの増幅cDNAを保有する発現構築物の第一のセットと、対応する野生型cDNAの発現構築物の第二のセットと、を添加するステップであって、そこで、アッセイ細胞への発現構築物のトランスフェクションが可能な条件下で、該発現構築物のそれぞれが異なったアドレス可能な場所のアッセイ細胞に添加されるステップと、
g)該アレーにおける各場所に特有のレポータ遺伝子部分に連結された標的遺伝子部分を含む蛍光トランスロケーションレポータ(FTR)遺伝子をコードする発現ベクターを、アッセイ細胞に添加するステップと;
h)該試料からのcDNAを発現する該アッセイ細胞中の該発現されたFTRの少なくとも1つの属性を、対応する野生型発現cDNAと比較するステップであって、癌患者の生体試料からのcDNAを候補となる患者特有のドライバー変異として同定するために、癌患者の生体試料に由来するcDNAを発現するアッセイ細胞と、対応する野生型cDNAを発現するアッセイ細胞との異なる結果を用いるステップと;
i)該候補となる患者特有のドライバー変異の異なる結果を定量し、それにより前記患者特有のドライバー変異の発癌性グレード分類指数を決定するステップと、
の1つまたは複数を含む、方法が提供される。
a)腫瘍の生検からなど、癌患者の該生体試料から複数のmRNAの試料を得るステップと;
b)当該技術分野で公知の方法によって、該複数の腫瘍mRNAからcDNAライブラリを作製するステップと;
c)様々な細胞シグナル伝達経路に関与する既知のタンパク質をコードするポリヌクレオチドに相補的なプライマーセットを用いて、該cDNAライブラリの個々のcDNA試料を増幅するステップと;
d)増幅されたcDNAをプロモータおよびレポータ遺伝子に動作可能に連結させた該cDNAの個々の発現構築物を形成させて、キメラテスト患者由来レポータ(テストPDR)を生成させるステップと;
e)該腫瘍からの増幅されたcDNAを保有する発現構築物の第一のセット(テストPDR)と、並行して、該cDNAの発現構築物の第二のセット(wt PDR)と、のアドレス可能なアレーを形成させるステップと;
f)場合により、担体固体基板上で該cDNA構築物を乾燥させるステップと;
g)該DNA構築物を生存可能なアッセイ細胞にトランスフェクトすることが可能な条件下で、該アッセイ細胞を各場所に添加するステップと;
h)トランスフェクトされた細胞において該構築物および発現ベクターの発現を可能にして、腫瘍からのcDNAの第一のセットの遺伝子産物を得るステップと;
i)該腫瘍からのcDNAを発現する該細胞におけるキメラレポータ遺伝子の少なくとも1つの属性を、対応する野生型発現cDNAと比較するステップであって、癌患者の生体試料からのcDNAを候補となる患者特有のドライバー変異として同定するために、癌患者の生体試料に由来するcDNAを発現するアッセイ細胞と、対応する野生型cDNAを発現するアッセイ細胞との異なる結果を用いるステップと;
j)該候補となる患者特有のドライバー変異の異なる結果を定量し、それにより前記患者特有のドライバー変異の発癌性グレード分類指数を決定するステップと、
の1つまたは複数を含む(任意の適切な順序で)、方法が提供される。
a)アドレス可能なアレーにおいて、生存可能なアッセイ細胞を基板に添加するステップと;
b)該アレーにおける各場所に特有のレポータ遺伝子部分に連結された標的遺伝子部分を含む蛍光トランスロケーションレポータ(FTR)遺伝子の発現ベクターを該アッセイ細胞に添加するステップと;
c)該アレーの特定の場所で、該アッセイ細胞に患者の生体試料を添加するステップと;
d)該患者の生体試料が添加された細胞において発現されたFTRの少なくとも1つの属性を、該生体試料が添加されていない対応する細胞と比較するステップであって、腫瘍形成能に影響を及ぼすことが可能な因子を同定するために、該患者の生体試料が添加された細胞と、該生体試料が添加されていない対応する細胞と、の異なる結果が用いられるステップと;
e)腫瘍形成能に影響を及ぼすことが可能な因子の異なる結果を定量し、それにより腫瘍形成能に影響を及ぼすことが可能な前記因子の発癌性グレード分類指数を決定するステップと、
の1つまたは複数を含む(任意の適切な順序で)、方法が提供される。
a)患者特有の変異を含む遺伝子を保有する発現構築物の第一のセットと、対応する野生型遺伝子の発現構築物の第二のセットと、のアドレス可能なアレーを形成させるステップと;
b)該アドレス可能なアレーにおける各場所に特有のレポータ遺伝子部分に連結された標的遺伝子部分を含む蛍光トランスロケーションレポータ(FTR)遺伝子をコードする発現ベクターを添加するステップと;
c)該発現構築物および発現ベクターを生存可能なアッセイ細胞にトランスフェクトすることが可能な条件下で、該アッセイ細胞を各場所に添加するステップと;
d)変異を含む遺伝子を発現する該アッセイ細胞中の該発現されたFTRの細胞内局在および/またはトランスロケーションを、対応する野生型発現遺伝子と比較して、異なる結果を同定するステップと;
e)i)該異なる結果を処理して、発現構築物の第一のセットおよび発現構築物の第二のセットの存在下で該テストされたFTRのトランスロケーションの度合いを決定して、患者特有の変異の活性化レベルを測定すること;
ii)該発現構築物の第二のセットの存在下でのFTRのトランスロケーションの度合いに基づき、発現ベクターの第一のセットの存在下でのFTRのトランスロケーションの度合いを正規化して、患者特有の変異の正規化された活性化レベルを測定すること;ならびに
iii)患者特有の変異の正規化された活性化レベルと臨床転帰(参照)との写像/相関を解析すること、
によって候補となる患者特有の変異の異なる結果を定量し、それにより前記患者特有の変異の発癌性グレード分類指数を決定するステップと;
を含む、方法が提供される。
a)該発現構築物および発現ベクターを生存可能なアッセイ細胞にトランスフェクトすることが可能な条件下で、アドレス可能なアレーにおいて、生存可能なアッセイ細胞を基板に添加するステップと;
b)該アレーにおける各場所に特有のレポータ遺伝子部分に連結された標的遺伝子部分を含む蛍光トランスロケーションレポータ(FTR)遺伝子の発現ベクターを該アッセイ細胞に添加するステップと;
c)該アドレス可能なアレーの特定の場所の該アッセイ細胞に、患者特有の変異を含む遺伝子を保有する発現構築物の第一のセットを添加し、そして特定の場所の該アッセイ細胞に、対応する野生型遺伝子の発現構築物の第二のセットを添加するステップであって、該発現構築物の第一のセットおよび該発現構築物の第二のセットが、共通の場所に添加されないステップと;
d)該変異(複数可)を含む遺伝子を発現する該アッセイ細胞中の該発現されたFTRの細胞内局在および/またはトランスロケーションを、対応する野生型発現遺伝子と比較して、異なる結果を同定するステップと;
e)i)該異なる結果を処理して、発現構築物の第一のセットおよび発現構築物の第二のセットの存在下で該テストされたFTRのトランスロケーションの度合いを決定して、患者特有の変異の活性化レベルを測定すること;
ii)該発現構築物の第二のセットの存在下でのFTRのトランスロケーションの度合いに基づき、発現ベクターの第一のセットの存在下でのFTRのトランスロケーションの度合いを正規化して、患者特有の変異の正規化された活性化レベルを測定すること;ならびに
iii)患者特有の変異の正規化された活性化レベルと臨床転帰(参照)との写像/相関を解析すること、
によって候補となる患者特有の変異の異なる結果を定量し、それにより前記患者特有の変異の発癌性グレード分類指数を決定するステップと;
を含む、方法が提供される。
a)テスト細胞において、発現構築物の第一のセットの存在下および発現構築物の第二のセットの存在下で、蛍光トランスロケーションレポータ(FTR)遺伝子産物の細胞内トランスロケーションの度合いを示す異なる結果を得るように;
b)FTRの細胞内トランスロケーションまたは局在の度合いに基づき、患者特有の変異の活性化レベルを測定するように;
c)発現構築物の第二のセットの存在下でのFTRのトランスロケーションの度合いに基づき、発現ベクターの第一のセットの存在下でのFTRの局在の細胞内トランスロケーションを正規化して、患者特有の変異の正規化された活性化レベルを測定するように;そして
d)患者特有の変異の活性化レベルと臨床転帰(参照)との相関/写像を解析し、それにより該発癌性指数を決定するように、
構成された処理回路を含み、
該異なる結果が、
i)患者特有の変異(複数可)を含む遺伝子を保有する発現構築物の第一のセットと、対応する野生型遺伝子の発現構築物の第二のセットと、のアドレス可能なアレーを形成させること;
ii)該アドレス可能なアレーにおける各場所に特有のレポータ遺伝子部分に連結された標的遺伝子部分を含む蛍光トランスロケーションレポータ(FTR)遺伝子をコードする発現ベクターを添加すること;ならびに
iii)該発現構築物および発現ベクターを生存可能なアッセイ細胞にトランスフェクトすることが可能な条件下で、該アッセイ細胞を各場所に添加すること、
によって得られる、システムが提供される。
a)テスト細胞において、発現構築物の第一のセットの存在下および発現構築物の第二のセットの存在下で、蛍光トランスロケーションレポータ(FTR)遺伝子産物の細胞内トランスロケーションの度合いを示す異なる結果を得るように;
b)FTRの細胞内トランスロケーションまたは局在の度合いに基づき、患者特有の変異の活性化レベルを測定するように;
c)発現構築物の第二のセットの存在下でのFTRのトランスロケーションの度合いに基づき、発現ベクターの第一のセットの存在下でのFTRの局在の細胞内トランスロケーションを正規化して、患者特有の変異の正規化された活性化レベルを測定するように;そして
d)患者特有の変異の活性化レベルと臨床転帰(参照)との相関を解析し、それにより該発癌性指数を決定するように、
構成された処理回路を含み、
該異なる結果が、
i)該発現構築物および発現ベクターを生存可能なアッセイ細胞にトランスフェクトすることが可能な条件下で、該アッセイ細胞を各場所に添加すること、
ii)患者特有の変異(複数可)を含む遺伝子を保有する発現構築物の第一のセットと、対応する野生型遺伝子の発現構築物の第二のセットと、のアドレス可能なアレーを形成させること;ならびに
iii)該アドレス可能なアレーにおける各場所に特有のレポータ遺伝子部分に連結された標的遺伝子部分を含む蛍光トランスロケーションレポータ(FTR)遺伝子をコードする発現ベクターを添加すること、
によって得られる、システムが提供される。
a)テスト細胞において、発現構築物の第一のセットの存在下および発現構築物の第二のセットの存在下で、蛍光トランスロケーションレポータ(FTR)遺伝子産物の細胞内トランスロケーションの度合いを示す異なる結果を得るように;
b)FTRの細胞内トランスロケーションまたは局在の度合いに基づき、患者特有の変異の活性化レベルを測定するように;
c)発現構築物の第二のセットの存在下でのFTRのトランスロケーションの度合いに基づき、発現ベクターの第一のセットの存在下でのFTRの局在の細胞内トランスロケーションを正規化して、患者特有の変異の正規化された活性化レベルを測定するように;そして
d)患者特有の変異の活性化レベルと臨床転帰(参照)との相関/写像を解析し、それにより該発癌性指数を決定するように、
構成された処理回路を含み、
該異なる結果が、以下のステップ:
i)腫瘍の生検からなど、癌患者の該生体試料から複数のmRNAの試料を得るステップと;
ii)当該技術分野で公知の方法によって、該複数の腫瘍mRNAからcDNAライブラリを作製するステップと;
iii)様々な細胞シグナル伝達経路に関与する既知のタンパク質をコードするポリヌクレオチドに相補的なプライマーセットを用いて、該cDNAライブラリの個々のcDNA試料を増幅するステップと;
iv)増幅されたcDNAをプロモータおよびレポータ遺伝子に動作可能に連結させた該cDNAの個々の発現構築物を形成させて、キメラテスト患者由来レポータ(テストPDR)を生成させるステップと;
v)該腫瘍からの増幅されたcDNAを保有する発現構築物の第一のセット(テストPDR)と、並行して、該cDNAの発現構築物の第二のセット(wt PDR)と、のアドレス可能なアレーを形成させるステップと;
vi)場合により、担体固体基板上で該cDNA構築物を乾燥させるステップと;
vii)該DNA構築物を生存可能なアッセイ細胞にトランスフェクトすることが可能な条件下で、該アッセイ細胞を各場所に添加するステップと;
viii)トランスフェクトされた細胞において該構築物および発現ベクターの発現を可能にして、腫瘍からのcDNAの第一のセットの遺伝子産物を得るステップと;
ix)該腫瘍からのcDNAを発現する該細胞におけるキメラレポータ遺伝子の少なくとも1つの属性を、対応する野生型発現cDNAと比較するステップであって、癌患者の生体試料からのcDNAを候補となる患者特有のドライバー変異として同定するために、癌患者の生体試料に由来するcDNAを発現するアッセイ細胞と、対応する野生型cDNAを発現するアッセイ細胞との異なる結果を用いるステップと;
x)該候補となる患者特有のドライバー変異の異なる結果を定量し、それにより前記患者特有のドライバー変異の発癌性グレード分類指数を決定するステップと、
の1つまたは複数を含む工程によって得られる、システムが提供される。
a)患者特有の変異を含む遺伝子を保有する発現構築物の第一のセットと、対応する野生型遺伝子の発現構築物の第二のセットと、のアドレス可能なアレーを形成させるステップと;
b)該アドレス可能なアレーにおける各場所に特有のレポータ遺伝子部分に連結された標的遺伝子部分を含む蛍光トランスロケーションレポータ(FTR)遺伝子をコードする発現ベクターを添加するステップと;
c)該発現構築物および発現ベクターを生存可能なアッセイ細胞にトランスフェクトすることが可能な条件下で、該アッセイ細胞を各場所に添加するステップと;
d)薬物の存在下と非存在下とで、該変異を含む遺伝子を発現する該アッセイ細胞中の該発現されたFTRの細胞内局在および/またはトランスロケーションを、対応する野生型発現遺伝子と比較して、異なる結果を同定するステップと;
e)i)該異なる結果を処理して、発現構築物の第一のセットおよび発現構築物の第二のセットの存在下で該テストされたFTRの細胞内トランスロケーションの度合いを決定して、患者特有の変異の活性化レベルを測定すること;
ii)該薬物の存在下または非存在下で、該発現構築物の第二のセットの存在下でのFTRの細胞内トランスロケーションの度合いに基づき、発現ベクターの第一のセットの存在下でのFTRの細胞内トランスロケーションの度合いを正規化して、患者特有の変異の正規化された活性化レベルを測定すること;ならびに
iii)薬物の存在下または非存在下での患者特有の変異の正規化された活性化レベルと、臨床転帰(参照)との相関を解析すること、
によって候補となる患者特有の変異の異なる結果を定量し、それにより患者特有の変異に関する薬物の治癒指数を決定するステップと;
を含む、方法が提供される。
a)該発現構築物および発現ベクターを生存可能なアッセイ細胞にトランスフェクトすることが可能な条件下で、該アッセイ細胞を各場所に添加するステップと;
b)患者特有の変異を含む遺伝子を保有する発現構築物の第一のセットと、対応する野生型遺伝子の発現構築物の第二のセットと、のアドレス可能なアレーを形成させるステップと;
c)該アドレス可能なアレーにおける各場所に特有のレポータ遺伝子部分に連結された標的遺伝子部分を含む蛍光トランスロケーションレポータ(FTR)遺伝子をコードする発現ベクターを添加するステップと;
d)薬物の存在下および非存在下で、変異(複数可)を含む遺伝子を発現する該アッセイ細胞中の該発現されたFTRの細胞内局在および/またはトランスロケーションを、対応する野生型発現遺伝子と比較して、異なる結果を同定するステップと;
e)i)該異なる結果を処理して、発現構築物の第一のセットおよび発現構築物の第二のセットの存在下で該テストされたFTRの細胞内トランスロケーションの度合いを決定して、薬物の存在下または非存在下での患者特有の変異の活性化レベルを測定すること;
ii)薬物の存在下または非存在下で、該発現構築物の第二のセットの存在下でのFTRの細胞内トランスロケーションの度合いに基づき、発現ベクターの第一のセットの存在下でのFTRの細胞内トランスロケーションの度合いを正規化して、患者特有の変異の正規化された活性化レベルを測定すること;ならびに
iii)薬物の存在下または非存在下での患者特有の変異の正規化された活性化レベルと、臨床転帰(参照)との相関を解析すること、
によって候補となる患者特有の変異の異なる結果を定量し、それにより前記患者特有の変異についての薬物の治癒指数を決定するステップと;
を含む、方法が提供される。
a)薬物または薬物の組み合わせの存在下および非存在下で、テスト細胞において、発現構築物の第一のセットの存在下および発現構築物の第二のセットの存在下で、蛍光トランスロケーションレポータ(FTR)遺伝子産物の細胞内トランスロケーションの度合いを示す異なる結果を得るように;
b)FTRの細胞内トランスロケーションまたは局在の度合いに基づき、患者特有の変異の活性化レベルを測定するように;
c)薬物または薬物の組み合わせの存在下または非存在下で、発現構築物の第二のセットの存在下でのFTRのトランスロケーションの度合いに基づき、発現構築物の第一のセットの存在下でのFTRの局在の細胞内トランスロケーションを正規化して、患者特有の変異の正規化された活性化レベルを測定するように;そして
d)患者特有の変異の活性化レベルと臨床転帰(参照)との相関/写像を解析し、それにより該発癌性指数を決定するように、
構成された処理回路を含み、
該異なる結果が、
i)患者特有の変異(複数可)を含む遺伝子を保有する発現構築物の第一のセットと、対応する野生型遺伝子の発現構築物の第二のセットと、のアドレス可能なアレーを形成させること;
ii)該アドレス可能なアレーにおける各場所に特有のレポータ遺伝子部分に連結された標的遺伝子部分を含む蛍光トランスロケーションレポータ(FTR)遺伝子をコードする発現ベクターを添加すること;ならびに
iii)該発現構築物および発現ベクターを生存可能なアッセイ細胞にトランスフェクトすることが可能な条件下で、該アッセイ細胞を各場所に添加すること、
によって得られる、システムが提供される。
a)薬物または薬物の組み合わせの存在下および非存在下で、テスト細胞において、発現構築物の第一のセットの存在下および発現構築物の第二のセットの存在下で、蛍光トランスロケーションレポータ(FTR)遺伝子産物の細胞内トランスロケーションの度合いを示す異なる結果を得るように;
b)FTRの細胞内トランスロケーションまたは局在の度合いに基づき、患者特有の変異の活性化レベルを測定するように;
c)薬物または薬物の組み合わせの存在下または非存在下で、発現構築物の第二のセットの存在下でのFTRのトランスロケーションの度合いに基づき、発現構築物の第一のセットの存在下でのFTRの局在の細胞内トランスロケーションを正規化して、患者特有の変異の正規化された活性化レベルを測定するように;そして
d)患者特有の変異の活性化レベルと臨床転帰(参照)との相関/写像を解析し、それにより該発癌性指数を決定するように、
構成された処理回路を含み、
該異なる結果が、
i)該発現構築物および発現ベクターを生存可能なアッセイ細胞にトランスフェクトすることが可能な条件下で、該アッセイ細胞を各場所に添加すること、
ii)患者特有の変異(複数可)を含む遺伝子を保有する発現構築物の第一のセットと、対応する野生型遺伝子の発現構築物の第二のセットと、のアドレス可能なアレーを形成させること;ならびに
iii)該アドレス可能なアレーにおける各場所に特有のレポータ遺伝子部分に連結された標的遺伝子部分を含む蛍光トランスロケーションレポータ(FTR)遺伝子をコードする発現ベクターを添加すること;
によって得られる、システムが提供される。
a)薬物または薬物の組み合わせの存在下および非存在下で、テスト細胞において、発現構築物の第一のセットの存在下および発現構築物の第二のセットの存在下で、蛍光トランスロケーションレポータ(FTR)遺伝子産物の細胞内トランスロケーションの度合いを示す異なる結果を得るように;
b)該細胞内トランスロケーションまたはその局在の度合いに基づき、患者特有の変異の活性化レベルを測定するように;
c)薬物または薬物の組み合わせの存在下または非存在下で、発現構築物の第二のセットの存在下でのFTRのトランスロケーションの度合いに基づき、発現構築物の第一のセットの存在下でのFTRの局在の細胞内トランスロケーションを正規化して、患者特有の変異の正規化された活性化レベルを測定するように;そして
d)患者特有の変異の活性化レベルと臨床転帰(参照)との相関/写像を解析し、それにより該発癌性指数を決定するように、
構成された処理回路を含み、
該異なる結果が、以下のステップ:
i)腫瘍の生検からなど、癌患者の該生体試料から複数のmRNAの試料を得るステップと;
ii)当該技術分野で公知の方法によって、該複数の腫瘍mRNAからcDNAライブラリを作製するステップと;
iii)様々な細胞シグナル伝達経路に関与する既知のタンパク質をコードするポリヌクレオチドに相補的なプライマーセットを用いて、該cDNAライブラリの個々のcDNA試料を増幅するステップと;
iv)増幅されたcDNAをプロモータおよびレポータ遺伝子に動作可能に連結させた該cDNAの個々の発現構築物を形成させて、キメラテスト患者由来レポータ(テストPDR)を生成させるステップと;
v)該腫瘍からの増幅されたcDNAを保有する発現構築物の第一のセット(テストPDR)と、並行して、該cDNAの発現構築物の第二のセット(wt PDR)と、のアドレス可能なアレーを形成させるステップと;
vi)場合により、担体固体基板上で該cDNA構築物を乾燥させるステップと;
vii)該DNA構築物を生存可能なアッセイ細胞にトランスフェクトすることが可能な条件下で、該アッセイ細胞を各場所に添加するステップと;
viii)トランスフェクトされた細胞において該構築物および発現ベクターの発現を可能にして、腫瘍からのcDNAの第一のセットの遺伝子産物を得るステップと;
ix)該腫瘍からのcDNAを発現する該細胞におけるキメラレポータ遺伝子の少なくとも1つの属性を、対応する野生型発現cDNAと比較するステップであって、癌患者の生体試料からのcDNAを候補となる患者特有のドライバー変異として同定するために、癌患者の生体試料に由来するcDNAを発現するアッセイ細胞と、対応する野生型cDNAを発現するアッセイ細胞との異なる結果を用いるステップと;
x)該候補となる患者特有のドライバー変異の異なる結果を定量し、それにより前記患者特有のドライバー変異の発癌性グレード分類指数を決定するステップと、
の1つまたは複数を含む(任意の順序で)工程によって得られる、システムが提供される。
i)患者の生体試料から得られた複数のmRNAからcDNAライブラリを作製するステップ;
ii)発癌性変異を保有することが疑われる遺伝子をコードするポリヌクレオチドに相補的なプライマーセットを用いて、該cDNAライブラリの特定のcDNAを増幅するステップ;および
iii)該増幅されたcDNAをプロモータに動作可能に連結させるステップ。
一般に、本明細書で用いられる命名法および本発明で利用される実験手順は、分子、生化学、微生物学および組換えDNAの技術を含む。そのような技術は、文献に詳細に説明されている。例えば、”Molecular Cloning: A laboratory Manual” Sambrook et al., (1989); ”Current Protocols in Molecular Biology” Volumes I−III Ausubel, R. M., ed. (1994); Ausubel et al., ”Current Protocols in Molecular Biology”, John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, ”A Practical Guide to Molecular Cloning”, John Wiley & Sons, New York (1988); Watson et al., ”Recombinant DNA”, Scientific American Books, New York; Birren et al. (eds) ”Genome Analysis: A Laboratory Manual Series”, Vols. 1−4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998);米国特許第4,666,828号、同第4,683,202号、同第4,801,531号、同第5,192,659号および同第5,272,057号に示された方法論; ”Cell Biology: A Laboratory Handbook”, Volumes I−III Cellis, J. E., ed. (1994); ”Culture of Animal Cells − A Manual of Basic Technique” by Freshney, Wiley−Liss, N. Y. (1994), Third Edition; ”Current Protocols in Immunology” Volumes I−III Coligan J. E., ed. (1994); Stites et al. (eds), ”Basic and Clinical Immunology” (8th Edition), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell and Shiigi (eds), ”Selected Methods in Cellular Immunology”, W. H. Freeman and Co., New York (1980)を参照されたい;利用可能な免疫アッセイは、特許および科学文献に詳細に記載されており、例えば米国特許第3,791,932号、同第3,839,153号、同第3,850,752号、同第3,850,578号、同第3,853,987号、同第3,867,517号、同第3,879,262号、同第3,901,654号、同第3,935,074号、同第3,984,533号、同第3,996,345号、同第4,034,074号、同第4,098,876号、同第4,879,219号、同第5,011,771号および同第5,281,521号; ”Oligonucleotide Synthesis” Gait, M. J., ed. (1984); “Nucleic Acid Hybridization” Hames, B. D., and Higgins S. J., eds. (1985); ”Transcription and Translation” Hames, B. D., and Higgins S. J., eds. (1984); ”Animal Cell Culture” Freshney, R. I., ed. (1986); ”Immobilized Cells and Enzymes” IRL Press, (1986); ”A Practical Guide to Molecular Cloning” Perbal, B., (1984) and ”Methods in Enzymology” Vol. 1−317, Academic Press; ”PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications”, Academic Press, San Diego, CA (1990); Marshak et al., ”Strategies for Protein Purification and Characterization − A Laboratory Course Manual” CSHL Press (1996)を参照されたい(それらの全てが、参照により本明細書に組み入れられる)。他の一般的参考資料は、この文書全体に提供されている。
ホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)腫瘍生検と凍結した新鮮な腫瘍部分または生検の両方を採取する。FFPE試料を用いて、癌の進行に関与することが知られている特異的ゲノムエクソン(cKitのエクソン11など)を抽出する。新鮮な(新鮮な、または新鮮な状態で凍結された)生検を、mRNAの抽出と間質液抽出の両方に使用する。
針生検 − 組織を15コニカルチューブに入れ、−80℃の冷凍庫で凍結させる。
気管支鏡検査による生検 − 組織を15コニカルチューブに入れ、−80℃の冷凍庫で凍結させる。
気管支肺胞洗浄液 − 抽出液を2本の50mlファルコンチューブに分配し、遠心分離する(3000RPM、15分)。液体を新しいチューブに移し、液体と細胞(元のチューブの)の両方を−80℃で凍結させる。
胸水 − 胸水を遠心分離し(3000RPM、15分)、液体を新しいチューブに移し、液体と細胞(元のチューブの)の両方を−80℃で凍結させる。
凍結切片 − 可能であれば、腫瘍をミクロトームで凍結し、切り出す。
エクソン11のcKit変異、EGFRエクソン19、20、HER2エクソン20など、特定のエクソンにおいて既知の変異が存在する遺伝子を同定するために、FFPE組織から抽出されたDNAを用いる。この目的のために、標準的なDNA抽出キットおよびプロトコルを用いる(例えば、Qiagen社のQIAamp DNA FFPE組織、カタログ番号56404)。
所望のエクソンを発現させるために、ゲノムDNAの増幅を実施し、このエクソンを欠く全長遺伝子にこのエクソンを挿入する。この目的のために、即発現可能なベクターにおいてこのエクソンを欠く全長遺伝子を作製し、その後、このエクソンを従来の分子生物学の技術を用いて該構築物中に組み込む。
生検の画分を、RNA精製および間質液抽出に使用する。生物材料の残りを、将来の参照分析または追加の分析(免疫組織化学検査(IHC)、FISHなど)のために貯蔵する。
腫瘍細胞によって分泌され、抗癌薬への耐性を付与し得る物質の存在を検出するために、テスト細胞に対するアゴニストとしての後の使用のために、以下に詳述される通り抽出された間質液(IF)を貯蔵する。
試料から抽出されたmRNAは、患者由来のマーカ(PDM)、即ち、既知の発癌遺伝子であり、細胞に発癌遺伝子特性をもたらす変異を潜在的に保有する遺伝子(ドライバー変異を保有する可能性のある遺伝子)の増幅のために必要である。テストされる例示的遺伝子としては、AKT1、AKT2、AKT3、ALK、BRAF、BRCA1、BRCA2、CBL、CTNNB1、EGFR、ERBB2、ERBB3、FGFR1、FGFR2、GNA11、GNAQ、HRAS、JAK2、KIT、KRAS、MET、NRAS、PDGFRA、PIK3CA、PTEN、RAF1、RET、ROS1、SMO、TP53、SMAD2、SMAD3、SMAD4、STAT1、STAT3、STAT5B、TGFBR2、FBXW7、MYC、LKB1、SMARCA4、TCF7L2、MAP3K1、AR、PR、ESR1、DDR2、MEK1、およびMEK2が挙げられる。
PDMの増幅を可能にするために、組織から抽出されたmRNAに基づいてcDNAを合成する。cDNAを、テンプレートmRNAに基づき、RNA依存性DNAポリメラーゼ逆転写酵素およびオリゴdTプライマー、ランダムヘキサマープライマー、または特異的プライマーを用いて合成する。例示的なプロトコルとしては、SuperScript(商標)III First−Standard Synthesis SuperMixプロトコル(Life technologies、カタログ番号18080−051)の使用が挙げられる。
テストPDMの作製は、選択されたPDMの増幅、およびアッセイ細胞での適正な発現を可能にするための追加的エレメントの付着、の2つのステップで実施される。
予め設計されたマトリックスに従って、分析に用いられる各レポータ遺伝子(FTR)を、先に記載された通り調製された対照の野生型PDM遺伝子またテストPDM遺伝子のいずれかと混合し、適切なトランスフェクション試薬と混合する。
レポータFTRの十分な発現後、増殖培地を低血清培地と交換して(培地中に存在する任意の増殖因子/リガンドを除去するため)、刺激されるシグナル伝達を最小のバックグラウンドまで低減する。
細胞におけるFTRおよびPDMの十分な発現後(両方とも構成型プロモータの制御下で)、増殖培地を低血清培地と交換して(培地中に存在する任意の増殖因子/リガンドを除去するため)、刺激されるシグナル伝達を最小のバックグラウンドまで低減する。
PDMの発現後(トランスフェクション後30時間)に、細胞をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で3回洗浄し、4%パラホルムアルデヒド(PFA)中で5分間インキュベートし、PBSで3回連続して洗浄することにより固定する。その後、スライドをカバースリップで覆い、対応する各FTRの局在を画像化する。
0日目:スライドを0.01%のポリ−L−リシンで、室温(RT)にて5分間プレコーティングした後、滅菌水(DDW)で洗浄する。水を吸引し、スライドを2時間乾燥させる。HeLa細胞(15000細胞)を、各ウェルにつき200μ1の完全培地(完全培地:DMEM、10%FBS、1%ペニシリン/ストレプトマイシン(P/S))中で播種する。
Helaアッセイ細胞を、対応するFTR(ERK2)共にWT PDM(BRAF−WT)または指示された変異PDM(以下の変異の1つを保有する変異BRAF:既知のドライバー変異G464Vまたは(orv)V600E、BRAFのキナーゼドメイン内に存在する機能的に未知の変異I554T)でトランスフェクトした。トランスフェクションの30時間後に、細胞を固定して、蛍光顕微鏡を利用して画像化した。細胞質および核の中のFTRの量を定量した。核(N)中と細胞質(C)中でのFTR強度の比を測定した(N:C比)。総括すると、結果から、2種の機能が既知の変異(G464VおよびV600E)が、ERK1/2シグナル伝達経路を活性化することが示される(図2A)。結果はさらに、機能的に未知の変異(I544T)もまたテストシグナル伝達経路を活性化することを示しており、これが発癌性変異であることが示される。その上、ERK2をFTRとして用いた場合に、機能的に未知のI544T変異を保有する変異BRAFによる活性化レベルが、G464V変異よりも活性があると過去に報告された既知のV600E変異を保有するBRAFで観察されたものと同程度に高い。
Helaアッセイ細胞を、対応するFTRと共に、WT PDM(EGFR−WT)または示された変異PDM(以下の変異の1つを保有する変異EGFR:既知のドライバー変異G719、L861Q、L858R、E746Delまたは3つの既知ドライバー変異G719A、T790M(小分子EGFR阻害剤への耐性を付与することで知られる)およびL861Qを含む変異体)でトランスフェクトした。トランスフェクションの30時間後に、細胞を固定して、蛍光顕微鏡を利用して画像化した。細胞質および核の中のFTRの量を定量した。核(N)中と細胞質(C)中でのFTR強度の比を測定した(N:C比)。結果を図3A、4Aおよび5Bに示す。図3Aでは、FTRはAKT1であり、F4Aでは、FTRはJNK1である。図5Bは、WTと比較してN:C比の差(デルタN:C比)として表した、3つの異なる経路に沿った4つの変異の比較を強調したものである。総括すると結果から、AKT1をFTRとして用いた場合(図3A)、JNK1をFTRとして用いた場合(図4A)、またはJNK2、ERK2およびSTAT3の場合(図5B)、活性化レベルが、異なる変異体によって変動することが示される。したがって本明細書に開示された方法を利用することにより、FTRの細胞内トランスロケーションのグレードの上昇が、EGFR発癌性変異の重度に相関する。
Helaアッセイ細胞を、対応するFTR、JNK2、ERK2、STAT3またはP38と共に、WT PDMまたは示された変異PDM(ERBB2 V842I、V777L、S310F、L755S、D769Y、A1170P)でトランスフェクトした。トランスフェクションの24時間後に、細胞を固定して、蛍光顕微鏡を利用して画像化した。細胞質および核の中のFTRの量を定量した。核(N)中と細胞質(C)中でのFTR強度の比を測定し(N:C比)、WTと比較してN:C比の差(デルタN:C比)として表している。図6Bに表された結果は、4つの異なる経路に沿った6つの変異の比較を強調したものである。
Helaアッセイ細胞を、対応するFTR、ERK2、STAT3、JNK2、REL−AまたはP38と共に、WT PDMまたは示された変異PDM(cKIT K642E、W557−K558del)でトランスフェクトした。トランスフェクションの24時間後に、細胞を固定して、蛍光顕微鏡を利用して画像化した。細胞質および核の中のFTRの量を定量した。核(N)中と細胞質(C)中でのFTR強度の比を測定し(N:C比)、WTと比較してN:C比の差(デルタN:C比)として表している。図7Bに表された結果は、5つの異なる経路に沿った2つの変異の比較を強調したものである。
Helaアッセイ細胞を、対応するFTR、FOXO3a、JNK2、ERK2またはREL−Aと共に、WT PDMまたは示された変異PDM(KRAS Q61H、G12V、G12R、G12A、G12D、G12C、G12S、A146V、A146T、G13D)でトランスフェクトした。トランスフェクションの24時間後に、細胞を固定して、蛍光顕微鏡を利用して画像化した。細胞質および核の中のFTRの量を定量した。核(N)中と細胞質(C)中でのFTR強度の比を測定し(N:C比)、WTと比較してN:C比の差(デルタN:C比)として表した。図8Bに表された結果は、4つの異なる経路に沿った10の変異の比較を強調したものである。総括すると結果から、活性化レベルが、異なる変異体によって変動することが示される。したがって本明細書に開示された方法を利用することにより、FTRの細胞内トランスロケーションのグレード上昇が、KRAS発癌性変異の重度に相関する。
Helaアッセイ細胞を、対応するFTR、KOG1、P38、STAT3またはREL−Aと共に、WT PDMまたは示された変異PDM(PIK3CA Y1021C、V344A、R38H、Q546L、N345K、H1047R、H1047L、E579K、E545K、E542K、C420R、R88Q/D350G)でトランスフェクトした。トランスフェクションの24時間後に、細胞を固定して、蛍光顕微鏡を利用して画像化した。細胞質および核の中のFTRの量を定量した。核(N)中と細胞質(C)中でのFTR強度の比を測定し(N:C比)、WTと比較してN:C比の差(デルタN:C比)として表している。図9Bに表された結果は、4つの異なる経路に沿った12の変異の比較を強調したものである。総括すると結果から、活性化レベルが、異なる変異体によって変動することが示される。したがって本明細書に開示された方法を利用することにより、FTRの細胞内トランスロケーションのグレード上昇が、PIK3CA発癌性変異の重度に相関する。
Helaアッセイ細胞を、対応するFTR、ERK2、JNK2またはREL−Aと共に、WT PDMまたは示された変異PDM(BRAF V600E、V600K、G468V、G469A、G466V、G466E)でトランスフェクトした。トランスフェクションの24時間後に、細胞を固定して、蛍光顕微鏡を利用して画像化した。細胞質および核の中のFTRの量を定量した。核(N)中と細胞質(C)中でのFTR強度の比を測定し(N:C比)、WTと比較してN:C比の差(デルタN:C比)として表した。図10Bに表された結果は、3つの異なる経路に沿った6つの変異の比較を強調したものである。総括すると結果から、活性化レベルが、異なる変異体によって変動することが示される。したがって本明細書に開示された方法を利用することにより、FTRの細胞内トランスロケーションのグレード上昇が、BRAF発癌性変異の重度に相関する。
Helaアッセイ細胞を、対応するFTR:ERK2、JNK2またはREL−Aと共に、WT EGFR PDMもしくはKRAS PDMまたは示された変異PDM(EGFR L858R、T790M、L861Q、KRAS G12V、G13D)でトランスフェクトした。トランスフェクションの24時間後に、細胞を固定して、蛍光顕微鏡を利用して画像化した。細胞質および核の中のFTRの量を定量した。核(N)中と細胞質(C)中でのFTR強度の比(N:C比)を測定した。図11B、図11Cおよび図11Dに示された結果から、各変異が、ERK1/2経路に別々に影響を及ぼし、EGFRとKRASの両変異を合わせると、EGFR L858R変異がKRAS変異に対して優性であるが(G12Vはわずかに付加的作用を有する)、KRAS変異がEGFR T790M変異よりも優性であることが明らかである。第二の経路NFkBを測定すると(図12B、図12Cおよび図12D)、EGFR L858R変異は優性であるが、L861Qから、この経路の場合に、KRAS変異がEGFR変異の次であることが示唆される。最後にJNK経路を測定すると、図13B、図13Cおよび図13Dに示された結果から、EGFR L858R変異がKRAS変異よりも優性であるがKRAS変異体がEGFR L861Q変異よりも優性であることが示される。まとめると、KRASに直接つながる経路は、EGFR変異体と比較して優性の差を示すが、EGFR特異的経路は、KRAS変異の精密さによる影響を受けないことが示される。この結果は、本明細書に開示された方法を用いると、テストした遺伝子の組み合わせによって、それらの活性と、優性、重要性、または他の変異との相互作用に関してさらなる洞察が得られることを実証している。
Helaアッセイ細胞を、対応するFTR:ERK2と共に、WT ERBB2 PDMもしくはBRAF PDMまたは示された変異PDM(ERBB2 L755S、V777L、BRAF V600E、V600K)でトランスフェクトした。トランスフェクションの24時間後に、細胞を固定して、蛍光顕微鏡を利用して画像化した。細胞質および核の中のFTRの量を定量した。核(N)中と細胞質(C)中でのFTR強度の比(N:C比)を測定した。図14Bおよび図14Cに示された結果から、BRAF変異体がERK1/2経路に影響を及ぼすが、ERBB2変異体が有意に活性でないことが示される。ERBB2とBRAFの両変異を合わせると、図14Dに示された結果から、ERBB2 V777L/BRAF V600K変異の組み合わせを除き、ERBB2の存在がBRAF変異体の影響をある程度まで低減することが明らかである。それゆえERK1/2経路は、ERBB2およびBRAF変異の組み合わせによって異なる程度に影響を受ける。これらの結果は、本明細書に開示された方法を用いると、テストした遺伝子の組み合わせによって、それらの活性およびそれらの間の相互作用に関してさらなる洞察が得られることを実証している。
以下の例示的発癌性指数を作成するために用いられる方法は、中でもマシンラーニング技術を用いている。計算の第一のステップは、正規化ステップ(前処理)である。正規化ステップに続いて、様々な生物学的アッセイのアウトプット(即ち、本明細書に開示された方法およびシステムによる患者の遺伝子のテストおよびその活性化レベルの測定)から得られた実際の結果を臨床関連指数に写像する関数を学習する適切なマシンラーニング法を行うことができる。
この例示的指数を作成するために、以下の計算およびアルゴリズムを用いる:
A − 各PDMと各FTRの間の正規化された活性化マトリックス
W − 各PDMとFTRの間の重みマトリックス。マシンラーニングされている(得られた生物学的結果と入手できた臨床データのフィッティング)。
Claims (15)
- 1つまたは複数の患者特有の変異の発癌性指数を作成する方法であって、
a)患者特有の変異を含む遺伝子を保有するテスト発現構築物の第一のセットと、対応する野生型遺伝子の対照発現構築物の第二のセットと、のアドレス可能なアレーを形成させるステップと;
b)前記アドレス可能なアレーにおける各場所に特有のレポータ遺伝子部分に連結された標的遺伝子部分を含むキメラ蛍光トランスロケーションレポータ(FTR)遺伝子を含む発現ベクターを添加するステップと;
c)生存可能なアッセイ細胞を、(i)テスト発現構築物またはその対応する対照構築物および(ii)前記FTRを含む発現ベクターでの各アッセイ細胞のコトランスフェクションが可能な条件下で各場所に添加するステップと;
d)前記アッセイ細胞における核と細胞質との間での前記FTRの強度の比率を測定することによって、前記患者特有の変異を含む遺伝子を発現するアッセイ細胞中の発現されたFTRの細胞内局在および/またはトランスロケーションを、対応する野生型発現遺伝子を発現するアッセイ細胞と比較して、異なる結果を同定するステップと;
e)i)前記異なる結果を処理して、発現構築物の前記第一のセットおよび発現構築物の前記第二のセットの存在下で前記テストされたFTRのトランスロケーションの度合いを決定して、前記患者特有の変異の活性化レベルを決定すること;
ii)前記発現構築物の前記第二のセットの存在下での前記FTRのトランスロケーションの度合いに基づき、発現ベクターの前記第一のセットの存在下での前記FTRのトランスロケーションの度合いを正規化して、前記患者特有の変異の正規化された活性化レベルを決定すること;ならびに
iii)前記患者特有の変異の前記正規化された活性化レベルと臨床転帰との間の相関を解析すること、
によって候補となる患者特有の変異の前記異なる結果を定量し、それにより前記1つまたは複数の患者特有の変異の前記発癌性指数を決定するステップと、
を含む、方法。 - 解析が、
マシンラーニングを利用すること、あるいは
相関単変量解析、多変量解析、サポートベクターマシン、一般化線形モデルまたはそれらの組み合わせ、
を含む、請求項1に記載の方法。 - 前記トランスロケーションの度合いが、核/細胞質比に基づいて決定される、または
前記患者特有の変異のトランスロケーションの度合いが、前記患者特有の変異が関与する細胞シグナル伝達経路の影響に対してさらに正規化される、
請求項1に記載の方法。 - 前記指数が、悪性腫瘍に至らせる前記候補となる患者特有の変異の能力を示す数値を有する、あるいは
前記指数が、前記患者の無増悪生存、前記患者の全生存、薬物応答の確率、無増悪期間(TTP)、腫瘍応答率、再発率、無病生存(DFS)、またはそれらの組み合わせを示す、
請求項1に記載の方法。 - 前記FTRの標的遺伝子部分が、腫瘍抑制因子、細胞骨格タンパク質、増殖因子受容体、Gタンパク質共役受容体、細胞接着タンパク質、プロテインキナーゼ、転写因子、アダプタータンパク質および交換因子から選択されるタンパク質をコードする、あるいは
前記FTRのレポータ遺伝子部分が、蛍光マーカをコードする、
請求項1に記載の方法。 - 前記遺伝子が、前記患者の生体試料に由来する、あるいは
前記変異の少なくとも1つが、発癌性変異である、あるいは
発現構築物の前記第一および/または第二のセットが、二本鎖直鎖状DNAを含む、あるいは
発現構築物の前記第一および/または第二のセットのプロモータが、誘導型または構成型プロモータである、あるいは
発現構築物の前記第一および/または第二のセットが、遺伝子の一部を保有する、
請求項1に記載の方法。 - トランスフェクション試薬の存在下、固体担体上で前記構築物および/またはベクターを乾燥させることをさらに含む、あるいは
ステップc)が、ステップa)および/またはステップb)に先行する、
請求項1に記載の方法。 - テスト薬物を前記細胞に添加するステップをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記テスト薬物への応答による、悪性腫瘍の成長に至らせる前記患者特有の変異の能力の低下を示す治癒指数を計算することをさらに含む、請求項8に記載の方法。
- 発癌性グレード分類指数を作成するためのシステムであって、
a)テスト細胞において、発現構築物の第一のセットの存在下および発現構築物の第二のセットの存在下で、蛍光トランスロケーションレポータ(FTR)遺伝子産物の細胞内トランスロケーションの度合いを示す異なる結果を得るように;
b)前記FTRの前記細胞内トランスロケーションまたは局在の度合いに基づき、1つまたは複数の患者特有の変異の活性化レベルを測定するように;
c)発現構築物の前記第二のセットの存在下での前記FTRのトランスロケーションの度合いに基づき、発現構築物の前記第一のセットの存在下での前記FTRの局在の細胞内トランスロケーションを正規化して、前記患者特有の変異の正規化された活性化レベルを測定するように;そして
d)前記患者特有の変異の活性化レベルと臨床転帰との相関を解析し、それにより前記発癌性指数を決定するように、
構成された処理回路を含み、
細胞内トランスロケーションの度合いが、前記テスト細胞における核と細胞質との間での前記FTRの強度の比率を測定することによって決定され、
前記異なる結果が、
i)1つまたは複数の患者特有の変異を含む遺伝子を保有するテスト発現構築物の第一のセットと、対応する野生型遺伝子の対照発現構築物の第二のセットと、のアドレス可能なアレーを形成させること;
ii)前記アドレス可能なアレーにおける各場所に特有のレポータ遺伝子部分に連結された標的遺伝子部分を含むキメラ蛍光トランスロケーションレポータ(FTR)遺伝子を含む発現ベクターを添加すること;ならびに
iii)生存可能なアッセイ細胞を、(i)テスト発現構築物またはその対応する対照構築物および(ii)前記FTRを含む発現ベクターでの各アッセイ細胞のコトランスフェクションが可能な条件下で各場所に添加すること、
によって得られる、
システム。 - 解析が、マシンラーニングを含む、あるいは
解析が、相関単変量解析、多変量解析、サポートベクターマシン解析、一般化線形モデル解析またはそれらの任意の組み合わせを含む、あるいは
前記指数が、悪性腫瘍に至らせる前記候補となる患者特有の変異の能力を示す数値を有する、あるいは
前記指数が、前記患者の無増悪生存、前記患者の全生存、薬物応答の確率、無増悪期間(TTP)、腫瘍応答率、再発率、無病生存(DFS)、またはそれらの組み合わせを示す、あるいは
前記患者特有の変異の前記トランスロケーションの度合いがさらに、前記患者特有の変異が関与する細胞シグナル伝達経路の影響に対して正規化される、あるいは
前記FTRの標的遺伝子部分が、腫瘍抑制因子、細胞骨格タンパク質、増殖因子受容体、Gタンパク質共役受容体、細胞接着タンパク質、プロテインキナーゼ、転写因子、アダプタータンパク質および交換因子から選択されるタンパク質をコードする、あるいは
前記FTRのレポータ遺伝子部分が、蛍光マーカをコードする、あるいは
前記遺伝子が、前記患者の生体試料に由来する、あるいは
前記変異の少なくとも1つが、発癌性変異である、あるいは
発現構築物の前記第一および/または第二のセットが、二本鎖直鎖状DNAを含む、あるいは
発現構築物の前記第一および/または第二のセットのプロモータが、誘導型または構成型プロモータである、あるいは
発現構築物の前記第一および/または第二のセットが、遺伝子の一部を保有する、または
トランスフェクション試薬の存在下、固体担体上で前記構築物および/またはベクターを乾燥させることをさらに含む、あるいは
ステップiii)が、ステップi)および/またはステップii)に先行する、
請求項10に記載のシステム。 - テスト薬物を前記細胞に添加するステップをさらに含む、請求項10に記載のシステム。
- 前記処理回路がさらに、前記テスト薬物への応答による、悪性腫瘍の成長に至らせる前記患者特有の変異の能力の低下を示す治癒指数を決定するように構成されている、請求項12に記載のシステム。
- 1つまたは複数の患者特有の変異の薬物処置への感受性を示す治癒指数を作成する方法であって、
a)1つまたは複数の患者特有の変異を含む遺伝子を保有するテスト発現構築物の第一のセットと、対応する野生型遺伝子の対照発現構築物の第二のセットと、のアドレス可能なアレーを形成させるステップと;
b)前記アドレス可能なアレーにおける各場所に特有のレポータ遺伝子部分に連結された標的遺伝子部分を含むキメラ蛍光トランスロケーションレポータ(FTR)遺伝子を含む発現ベクターを添加するステップと;
c)生存可能なアッセイ細胞を、(i)テスト発現構築物またはその対応する対照構築物および(ii)前記FTRを含む発現ベクターでの各アッセイ細胞のコトランスフェクションが可能な条件下で各場所に添加するステップと;
d)前記アッセイ細胞における核と細胞質との間での前記FTRの強度の比率を測定することによって、薬物の存在下および非存在下で、前記1つまたは複数の患者特有の変異を含む遺伝子を発現する前記アッセイ細胞中の発現されたFTRの細胞内局在および/またはトランスロケーションを、対応する野生型発現遺伝子を発現するアッセイ細胞と比較して、異なる結果を同定するステップと;
e)i)前記異なる結果を処理して、発現構築物の前記第一のセットおよび発現構築物の前記第二のセットの存在下で前記テストされたFTRの細胞内トランスロケーションの度合いを決定して、前記薬物の存在下または非存在下での前記患者特有の変異の活性化レベルを決定すること;
ii)前記薬物の存在下または非存在下で、発現構築物の前記第二のセットの存在下での前記FTRの細胞内トランスロケーションの度合いに基づき、発現ベクターの前記第一のセットの存在下での前記FTRの細胞内トランスロケーションの度合いを正規化して、前記患者特有の変異の正規化された活性化レベルを決定すること;ならびに
iii)前記薬物の存在下または非存在下での前記患者特有の変異の前記正規化された活性化レベルと、臨床転帰との相関を解析すること、
によって候補となる患者特有の変異の前記異なる結果を定量し、それにより前記患者特有の変異についての前記薬物の治癒指数を決定するステップと;
を含む、方法。 - 前記薬物が、抗癌薬である、あるいは
1種より多くの薬物を同時に、または連続で添加することを含む、あるいは
様々な濃度の薬物(複数可)を添加することを含む、あるいは
解析が、マシンラーニングを利用することを含む、あるいは
前記遺伝子が、前記患者の生体試料に由来する、あるいは
前記変異の少なくとも1つが、発癌性変異である、あるいは
発現構築物の前記第一および/または第二のセットが、二本鎖直鎖状DNAを含む、あるいは
発現構築物の前記第一および/または第二のセットのプロモータが、誘導型または構成型プロモータである、あるいは
発現構築物の前記第一および/または第二のセットが、遺伝子の一部を保有する、あるいは
トランスフェクション試薬の存在下、固体担体上で前記構築物および/またはベクターを乾燥させることをさらに含む、あるいは
ステップc)が、ステップa)および/またはステップb)に先行する、
請求項14に記載の方法。
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