JP6411372B2 - 患者特有のドライバー変異を特定するための方法およびシステム - Google Patents
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Description
a)生体試料から複数のmRNAを取得する工程;
b)複数のmRNAからcDNAライブラリーを作製する工程;
c)既知のシグナル伝達タンパク質をコードするポリヌクレオチドに相補的なプライマーのセットを使用して、cDNAライブラリーの特定のcDNAを増幅する工程;
d)cDNAが作動可能にプロモーターへ連結される、増幅cDNAの個々の発現構築物を形成する工程;
e)腫瘍からの増幅cDNAを保有する発現構築物の第1のセット、および対応する野生型cDNAの発現構築物の第2のセットのアドレス可能なアレイを形成する工程であって;
それによりシグナル伝達タンパク質をコードするポリヌクレオチド中の候補変異を保有する発現構築物のアドレス可能なアレイを提供し、アレイが癌患者の生体試料中の患者特有のドライバー変異を特定するのに適する工程。
a)腫瘍細胞から複数のmRNAを取得する工程;
b)複数のmRNAからcDNAライブラリーを作製する工程;
c)既知のシグナル伝達タンパク質をコードするポリヌクレオチドに相補的なプライマーのセットを使用して、cDNAライブラリーの特定のcDNAを増幅する工程;
d)cDNAが作動可能にプロモーターへ連結される、工程(c)の増幅cDNAの個々の発現構築物を形成する工程;
e)腫瘍からの増幅cDNAを保有する発現構築物の第1のセット、および対応する野生型cDNAの発現構築物の第2のセットのアドレス可能なアレイを形成する工程であって;
それにより腫瘍細胞における異常なシグナル伝達経路を特定するのに適する、シグナル伝達タンパク質をコードするポリヌクレオチド中の候補変異を保有する発現構築物のアドレス可能なアレイを提供する工程。
a)生体試料から複数のmRNAを取得する工程;
b)複数のmRNAからcDNAライブラリーを作製する工程;
c)既知のシグナル伝達タンパク質をコードするポリヌクレオチドに相補的なプライマーのセットを使用して、cDNAライブラリーの特定のcDNAを増幅する工程;
d)cDNAが作動可能にプロモーターへ連結される、増幅cDNAの個々の発現構築物を形成する工程;
e)アドレス可能なアレイにおいて、担体に生存能力のあるアッセイ細胞を添加する工程;
f)腫瘍からの増幅cDNAを保有する発現構築物の第1のセット、および対応する野生型cDNAの発現構築物の第2のセットをアッセイ細胞に添加する工程であって;発現構築物の各々がアッセイ細胞への発現構築物のトランスフェクションを可能にする条件下で、アドレス可能な異なる遺伝子座にあるアッセイ細胞へ添加され;
それにより癌患者の生体試料中の患者特有のドライバー変異を特定するのに適する、シグナル伝達タンパク質をコードするポリヌクレオチド中に候補変異を保有する発現構築物を含むアッセイ細胞のアレイを作製する工程。
a)腫瘍細胞から複数のmRNAを取得する工程;
b)複数のmRNAからcDNAライブラリーを作製する工程;
c)既知のシグナル伝達タンパク質のポリヌクレオチド(遺伝子または遺伝子部分)に相補的なプライマーのセットを使用して、cDNAライブラリーの特定のcDNAを増幅する工程;
d)cDNAが作動可能にプロモーターへ連結される、(c)の増幅cDNAの個々の発現構築物を形成する工程;
e)腫瘍からの増幅cDNAを保有する発現構築物の第1のセット、および対応する野生型cDNAの発現構築物の第2のセットのアドレス可能なアレイを形成する工程;
f)アレイ中の各遺伝子座用のレポーター遺伝子部分に連結された標的遺伝子部分を含む、蛍光トランスロケーションレポーター(FTR)キメラ遺伝子のコトランスフェクション用の発現ベクターを添加する工程;
g)アッセイ細胞へのDNA構築物のトランスフェクションを可能にする条件下で、各遺伝子座に生存能力のあるアッセイ細胞を添加する工程;
h)腫瘍からのcDNAを発現する細胞内で発現するFTRの少なくとも1つの属性を、その対応する野生型発現cDNAの場合と比較する工程であって;
腫瘍由来のcDNAを発現する細胞と対応する野生型cDNAを発現する細胞との間の異なる結果が異常なシグナル伝達経路タンパク質の候補として腫瘍からのcDNAを特定するために使用される工程。
a)生体試料から複数のmRNAの試料を取得する工程;
b)複数のmRNAからcDNAライブラリーを作製する工程;
c)既知のシグナル伝達タンパク質をコードするポリヌクレオチドに相補的なプライマーのセットを使用して、cDNAライブラリーの個々のcDNA試料を増幅する工程;
d)cDNAが作動可能にプロモーターへ連結される、増幅cDNAの個々の発現構築物を形成する工程;
e)腫瘍からの増幅cDNAを保有する発現構築物の第1のセット、および並行して対応する野生型cDNAの発現構築物の第2のセットのアドレス可能なアレイを形成する工程;
f)アレイ中の各遺伝子座用の特定のレポーター遺伝子に連結された標的遺伝子を含む、蛍光トランスロケーションレポーター(FTR)遺伝子のコトランスフェクション用の発現ベクターを添加する工程;
g)アッセイ細胞へのDNA構築物のトランスフェクションを可能にする条件下で、各遺伝子座に生存能力のあるアッセイ細胞を添加する工程;
h)腫瘍からのcDNAを発現する細胞内のレポーター遺伝子の少なくとも1つの属性を、その対応する野生型発現cDNAの場合と比較する工程であって;
生体試料由来のcDNAを発現する細胞と対応する野生型cDNAを発現する細胞間との間の異なる結果が患者特有のドライバー変異の候補として生体試料からのcDNAを特定するために使用される工程。
a)腫瘍の生検などの癌患者の生体試料から複数のmRNAの試料を取得する工程;
b)当技術分野で公知の方法によって、複数の腫瘍mRNAからcDNAライブラリーを作製する工程;
c)様々な細胞シグナル伝達経路に関与する既知のタンパク質をコードするポリヌクレオチド(遺伝子または遺伝子部分)に相補的なプライマーのセットを使用して、cDNAライブラリーの個々のcDNA試料を増幅する工程;
d)cDNAが作動可能にプロモーターへ連結される、増幅cDNAの個々の発現構築物を形成して、試験患者由来のマーカー(試験PDM)を生成する工程;
e)腫瘍からの増幅cDNAを保有する発現構築物の第1のセットの、および並行して対応する(マッチする)野生型タンパク質(WT PDM)の発現構築物の第2のセットのアドレス可能なアレイを形成する工程;
f)マーカー遺伝子が対応するPDMにより直接的または間接的に影響を受ける、アレイ中の各遺伝子座用の特定のレポーター遺伝子(FTR)に連結されたマーカー遺伝子のコトランスフェクション用の発現ベクターを添加する工程;
g)必要に応じて支持固体担体上でcDNA構築物を乾燥させる工程;
h)アッセイ細胞へのDNA構築物のトランスフェクションを可能にする条件下で、各遺伝子座に生存能力のあるアッセイ細胞を添加する工程;
i)トランスフェクト細胞での構築物および発現ベクターの発現を可能にして、腫瘍からのcDNAの第1のセットおよびアレイ中の各遺伝子座用の特定のレポーター遺伝子の遺伝子産物を取得する工程;
j)腫瘍からのcDNAを発現する細胞内のレポーター遺伝子の少なくとも1つの属性を、その対応する野生型発現cDNAの場合と比較する工程であって;
腫瘍由来のcDNAを発現する細胞と対応する野生型cDNAを発現する細胞との間の異なる結果が異常なシグナル伝達経路タンパク質の候補として腫瘍試料からのcDNAを特定するために使用される工程。
a)生体試料から複数のmRNAを取得する工程;
b)複数のmRNAからcDNAライブラリーを作製する工程;
c)既知のシグナル伝達タンパク質をコードするポリヌクレオチドに相補的なプライマーのセットを使用して、cDNAライブラリーの特定のcDNAを増幅する工程;
d)cDNAが作動可能にプロモーターへ連結される、増幅cDNAの個々の発現構築物を形成する工程;
e)腫瘍からの増幅cDNAを保有する発現構築物の第1のセット、および対応する野生型cDNAの発現構築物の第2のセットのアドレス可能なアレイを形成する工程であって;
それによって、シグナル伝達タンパク質をコードするポリヌクレオチド中の候補変異を保有する発現構築物のアドレス可能なアレイを提供し、アレイが癌患者の生体試料中の患者特有のドライバー変異を特定するのに適している、工程。
a)生体試料から複数のmRNAを取得する工程;
b)複数のmRNAからcDNAライブラリーを作製する工程;
c)既知のシグナル伝達タンパク質をコードするポリヌクレオチドに相補的なプライマーのセットを使用して、cDNAライブラリーの特定のcDNAを増幅する工程;
d)cDNAが作動可能にプロモーターへ連結される、増幅cDNAの個々の発現構築物を形成する工程;
e)アドレス可能なアレイにおいて、担体に生存能力のあるアッセイ細胞を添加する工程;
f)腫瘍からの増幅cDNAを保有する発現構築物の第1のセット、および対応する野生型cDNAの発現構築物の第2のセットをアッセイ細胞に添加する工程であって;発現構築物の各々がアッセイ細胞への発現構築物のトランスフェクションを可能にする条件下で、アドレス可能な異なる遺伝子座にてアッセイ細胞へ添加される工程であって;
それにより、癌患者の生体試料での患者特有のドライバー変異を特定するためのシグナル伝達タンパク質をコードするポリヌクレオチド中に候補変異を保有する発現構築物を含むアッセイ細胞のアレイを作製する工程。
a)腫瘍の生検などの癌患者の生体試料から複数のmRNAの試料を取得する工程;
b)当技術分野で公知の方法によって、複数の腫瘍mRNAからcDNAライブラリーを作製する工程;
c)様々な細胞シグナル伝達経路に関与する既知のタンパク質をコードするポリヌクレオチドに相補的なプライマーのセットを使用して、cDNAライブラリーの個々のcDNA試料を増幅する工程;
d)cDNAが作動可能にプロモーターへ連結される、増幅cDNAの個々の発現構築物を形成し、試験患者由来のキメラレポーター(試験PDR)を生成する工程;
e)腫瘍からの増幅cDNAを保有する発現構築物の第1のセット(試験PDR)、および並行してcDNA(wt PDR)の発現構築物の第2のセットのアドレス可能なアレイを形成する工程;
f)必要に応じて支持固体担体上でcDNA構築物を乾燥させる工程;
g)アッセイ細胞へのDNA構築物のトランスフェクションを可能にする条件下で、各遺伝子座に生存能力のあるアッセイ細胞を添加する工程;
h)腫瘍からのcDNAの第1のセットの遺伝子産物を取得するために、トランスフェクト細胞での構築物および発現ベクターの発現を可能にして、腫瘍からのcDNAの第1のセットの遺伝子産物を取得する工程;
i)腫瘍からのcDNAを発現する細胞でのキメラレポーター遺伝子の少なくとも1つの属性を、その対応する野生型発現cDNAの場合と比較する工程であって;
腫瘍由来のcDNAを発現する細胞と対応する野生型cDNAを発現する細胞との間の異なる結果が異常なシグナル伝達経路タンパク質の候補として腫瘍からのcDNAを特定するために使用される工程。
a)インビトロまたはインビボで、例えば腫瘍生検から、取得される、腫瘍細胞からmRNAの試料を取得する工程;
b)取得した複数のmRNAからcDNAライブラリーを作製する工程;
c)既知のシグナル伝達タンパク質に相補的なプライマーのセットを使用して、cDNAライブラリーの個々のcDNA試料を増幅する工程;
d)cDNAが作動可能にプロモーターへ連結される、増幅cDNAの個々の発現構築物を形成する工程;
e)腫瘍からの増幅cDNAを保有する発現構築物の第1のセット、および並行して対応する野生型cDNAの発現構築物の第2のセットのアドレス可能なアレイを形成する工程;
f)アレイ中の各遺伝子座用のレポーター遺伝子部分に連結された標的遺伝子部分を含む、蛍光トランスロケーションレポーター(FTR)キメラ遺伝子のコトランスフェクション用の発現ベクターを添加する工程;
g)アッセイ細胞へのDNA構築物のトランスフェクションを可能にする条件下で、各遺伝子座に生存能力のあるアッセイ細胞を添加する工程;
h)腫瘍からのcDNAを発現する細胞で発現するFTRの少なくとも1つの属性を、その対応する野生型発現cDNAの場合と比較する工程であって;
腫瘍由来のcDNAを発現する細胞と対応する野生型cDNAを発現する細胞との間の異なる結果が異常なシグナル伝達経路タンパク質の候補として腫瘍細胞からのcDNAを特定するために使用される工程。
a)インビトロまたはインビボで、例えば腫瘍生検から、取得される、mRNAの試料を腫瘍細胞から取得する工程;
b)取得した複数のmRNAからcDNAライブラリーを作製する工程;
c)既知のシグナル伝達タンパク質をコードするポリヌクレオチドに相補的なプライマーのセットを使用して、cDNAライブラリーの個々のcDNA試料を増幅する工程;
d)されている増幅cDNAの個々の発現構築物を形成する工程であって、cDNAが作動可能に第1のプロモーターへ連結され;前記発現構築物が第2のプロモーターを含み蛍光トランスロケーションレポーター(FTR)キメラ遺伝子をコードする発現カセットをさらに含み、前記FTRがレポーター遺伝子部分に連結される標的遺伝子部分を含む、工程;
e)腫瘍からの増幅cDNAおよびFTRカセットを保有する発現構築物の第1のセット、ならびに並行して対応する野生型cDNAおよびFTRカセットの発現構築物の第2のセットのアドレス可能なアレイを形成する工程;
f)アッセイ細胞へのDNA構築物のトランスフェクションを可能にする条件下で、各遺伝子座に生存能力のあるアッセイ細胞を添加する工程;および
g)腫瘍からのcDNAを発現する細胞で発現するFTRの少なくとも1つの属性を、その対応する野生型発現cDNAの場合と比較する工程であって;
腫瘍由来のcDNAを発現する細胞と対応する野生型cDNAを発現する細胞との間の異なる結果が異常なシグナル伝達経路タンパク質の候補として腫瘍細胞からのcDNAを特定するために使用される工程。
a)腫瘍細胞から複数のmRNAを取得する工程;
b)複数のmRNAからcDNAライブラリーを作製する工程;
c)既知のシグナル伝達タンパク質をコードするポリヌクレオチドに相補的なプライマーのセットを使用して、cDNAライブラリーの特定のcDNAを増幅する工程;
d)cDNAが作動可能にプロモーターへ連結される、工程(c)の増幅cDNAの個々の発現構築物を形成する工程;
e)腫瘍からの増幅cDNAを保有する発現構築物の第1のセット、および対応する野生型cDNAの発現構築物の第2のセットのアドレス可能なアレイを形成する工程であって;
それにより腫瘍細胞における異常なシグナル伝達経路を特定するのに適する、シグナル伝達タンパク質をコードするポリヌクレオチド中の候補変異を保有する発現構築物のアドレス可能なアレイを提供する工程。
一般に、本明細書で使用する用語および本発明で利用する実験手順には、分子、生化学、微生物学および組換えDNAの技術が含まれる。このような技術は、文献に詳細に説明されている。例えば、「分子クローニング:実験室マニュアル」Sambrookら、(1989);「分子生物学の最新プロトコル」I〜III巻、Ausubel、R.M.(編)(1994);Ausubelら、「分子生物学の最新プロトコル」、John Wiley and Sons社、メリーランド州ボルチモア(1989);Perbal、「分子クローニングの実用ガイド」、John Wiley&Sons社、ニューヨーク(1988);Watsonら、「組換えDNA」、Scientific American Books社、ニューヨーク;Birrenら(編)「ゲノム解析:実験室マニュアルシリーズ」、1〜4巻、Cold Spring Harbor Laboratory Press社、ニューヨーク(1998);米国特許第4,666,828号、同第4,683,202号、同第4,801,531号、同第5,192,659号、および同第5,272,057号に記載の方法;「細胞生物学:実験ハンドブック」、I〜III巻、Cellis、J.E.(編)(1994);「動物細胞の培養−基本技術のマニュアル」Freshney、Wiley−Liss、ニューヨーク(1994)、第3版;「免疫学における最近プロトコル」I〜III巻、Coligan J.E.(編)(1994);Stitesら(編)、「基礎および臨床免疫学」(第8版)、Appleton & Lange社、コネティカット州ノーウォーク、(1994);MishellおよびShiigi(編)、「細胞免疫学の厳選された方法(Selected Methods in Cellular Immunology)」、W.H.Freeman and Co.、ニューヨーク(1980)を参照されたい。利用可能な免疫測定法は特許および科学文献に広く記載されている。例えば、米国特許第3,791,932号、同第3,839,153号、同第3,850,752号、同第3,850,578号、同第3,853,987号、同第3,867,517号、同第3,879,262号、同第3,901,654号、同第3,935,074号、同第3,984,533号、同第3,996,345号、同第4,034,074号、同第4,098,876号、同第4,879,219号、同第5,011,771号、および同第5,281,521号;「オリゴヌクレオチド合成」Gait,M.J.編(1984);「核酸ハイブリダイゼーション」Hames、B.D.およびHiggins S.J.(編)(1985);「転写および翻訳」Hames、B.D.およびHiggins S.J.(編)(1984);「動物細胞培養」Freshney,R.I.(編)(1986);「固定化細胞と酵素」IRL Press社(1986);「分子クローニングの実用ガイド」、Perbal、B.(1984)および「酵素学における方法」1〜317巻、Academic Press社;「PCRプロトコル:方法と応用へのガイド」、Academic Press社、カリフォルニア州サンディエゴ(1990);Marshakら、「タンパク質の精製と特徴付けのための戦略−研究室コースマニュアル」CSHL Press社(1996)を参照されたく、これらの全ては参照により組み込まれる。他の一般的な文献は、本明細書を通じて提供される。
ホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)腫瘍生検と凍結した新鮮な腫瘍部分または生検の両方を採取する。FFPE試料を用いて、癌の進行に関与することが知られている特定のゲノムエクソン(cKitのエクソン11など)を抽出する。新鮮な(新鮮であるまたは新鮮に凍結された)生検を、mRNAの抽出および間質液抽出の両方に使用する。
針生検−組織を15円錐管に入れ、−80℃の冷凍庫で凍結させる。
気管支鏡検査による生検−組織を15円錐管に入れ、−80℃の冷凍庫で凍結させる。
気管支肺胞洗浄液−抽出液を2〜50mlのファルコンチューブに分け、遠沈させる(3000 RPM、15分)。液体を新しいチューブに移し、液体と細胞(元のチューブで)の両方を−80℃で凍結させる。
胸水−胸水を遠沈させ(3000 RPM、15分)、液体を新しいチューブに移し、液体と細胞(元のチューブで)の両方を−80℃で凍結させる。
凍結切片−可能であれば、腫瘍をミクロトームで凍結し、薄片を作る。
エクソン11のcKit変異、エクソン19、20のEGFR変異、エクソン20のHER2変異などの、特定のエクソン中での既知の変異が存在する遺伝子を特定するために、FFPE組織から抽出したDNAを用いる。この目的のために、標準的なDNA抽出キットおよびプロトコルを用いる(例えば、Qiagen社のQIAamp DNA FFPE組織、カタログ番号56404)。
所望のエクソンを発現させるために、ゲノムDNAの増幅を行い、このエクソンを欠く全長遺伝子にこのエクソンを挿入する。この目的のために、発現準備ベクター(expression ready vector)中のこのエクソンを欠く全長遺伝子を作製し、その後、このエクソンを従来の分子生物学技術を用いて構築物中に組み込む。
生検のフラクションを、RNA精製および間質液抽出のために使用する。生物材料の残りを、将来の参考または追加の分析(免疫組織化学(IHC)およびFISHなど)のために保存する。
腫瘍細胞が分泌し、抗がん剤に対する耐性を付与できる物質の存在を検出するために、試験細胞に対するアゴニストとして後で使用するために、以下に詳述するように抽出した間質液(IF)を保存する。
試料から抽出したmRNAは、患者由来のマーカー(PDM)、すなわち、既知の癌遺伝子であり、細胞に癌特性をもたらす変異を潜在的に保有する遺伝子(ドライバー変異を保有する可能性を有する遺伝子)の増幅のために必要である。試験される代表的な遺伝子には、AKT1、AKT2、AKT3、ALK、BRAF、BRCA1、BRCA2、CBL、CTNNB1、EGFR、ERBB2、ERBB3、FGFR1、FGFR2、GNA11、GNAQ、HRAS、JAK2、KIT、KRAS、MET、NRAS、PDGFRA、PIK3CA、PTEN、RAF1、RET、ROS1、SMO、TP53、SMAD2、SMAD3、SMAD4、STAT1、STAT3、STAT5B、TGFBR2、FBXW7、MYC、LKB1、SMARCA4、TCF7L2、MAP3K1、AR、PR、ESR1、DDR2、MEK1、およびMEK2が含まれる。
PDMの増幅を可能にするために、組織から抽出したmRNAに基づいてcDNAを合成する。cDNAを、鋳型mRNAに基づき、RNA依存性DNAポリメラーゼ逆転写酵素およびオリゴdTプライマー、ランダムヘキサマープライマー、または特異的プライマーを用いて合成する。代表的なプロトコルには、SuperScript(商標)IIIファーストストランド合成SuperMixプロトコル(Life technologies社、カタログ番号18080−051)を使用するプロトコルが含まれる。
試験PDMの作製を以下の2段階で行う:選択したPDMの増幅、およびアッセイ細胞での適切な発現を可能にするための追加要素の取り付け。
以下のプライマーセットを、以下のFTRの標的部分のPCR増幅に使用した(表2):
あらかじめデザインしたマトリックスに従って、分析に使用する各レポーター遺伝子(FTR)を、上述のように調製した、対照の野生型PDM遺伝子また試験PDM遺伝子のいずれかと混合し、適切なトランスフェクション試薬と混合する。
レポーターFTRの十分な発現後、増殖培地を低血清培地と交換して(培地中に存在するいかなる増殖因子/リガンドも除去するため)、刺激されるシグナル伝達を最小のバックグラウンドまで低減する。
細胞におけるFTRおよびPDMの十分な発現後(両方とも構成的プロモーターの制御下で)、増殖培地を低血清培地と交換して(培地中に存在するいかなる増殖因子/リガンドも除去するため)、刺激されるシグナル伝達を最小のバックグラウンドまで低減する。
PDM発現後(トランスフェクション後30時間)に、細胞を、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で3回洗浄し、4%パラホルムアルデヒド(PFA)中で5分間インキュベートし、その後PBSで3回洗浄することにより固定する。その後、スライドをカバースリップでカバーし、対応する各FTRの局在を画像化する。
0日目:スライドを0.01%のポリ−L−リジンで、室温(RT)にて5分間プレコーティングした後、滅菌水(DDW)で洗浄する。水を吸引し、2時間スライドを乾燥させる。
HeLa細胞(15000細胞)を、各ウェルにつき200μ1の完全培地(完全培地:DMEM、10%FBS、1%ペニシリン/ストレプトマイシン(P/S))中で播種する。
HeLaアッセイ細胞を、対応するFTRとともに、示したWTおよび変異体PDM(KRAS−WTおよび既知のドライバー変異(G13D)を保有する変異KRAS)でトランスフェクトした(上記のように)。トランスフェクション後30時間の時点で、細胞を固定し、蛍光顕微鏡を用いて画像化した。細胞質内および核内のFTRの量を定量した。核(N)および細胞質(C)内のFTRの強度比を測定した(N:C比)。結果を図3A〜図6Aに示す。図3Aでは、FTRはERK2であり、図4Aでは、FTRはERFあり、図5Aでは、FTRはJNK1α1であり、図6Aでは、FTRはAKT1である。図3B〜図6Bは、それぞれのFTRの局在化によって決定されるとおり、PDM(KRAS)によって影響を受けるシグナル伝達経路の発癌マップを模式的に示す。要するに、結果は、G13D変異を保有する試験KRASが、3つの異なるシグナル伝達経路:ERK1/2、JNKおよびAKTを活性化することを示す。
HeLaアッセイ細胞を、対応するFTRとともに、示したWTおよび変異体PDM(AKT2−WTおよび阻害因子結合部位近傍のAKT2キナーゼドメインに存在する機能未知の変異(R251W)を保有する変異AKT2)でトランスフェクトした(上記のように)。トランスフェクション後30時間の時点で、細胞を固定し、蛍光顕微鏡を用いて画像化した。細胞質内および核内のFTRの量を定量した。核(N)および細胞質(C)内のFTRの強度比を測定した(N:C比)。結果を図7Aおよび図8Aに示す。図7Aでは、FTRはAKT1であり、図8Aでは、FTRはRelAである。図7B〜図8Bは、それぞれのFTRの局在化によって決定されるとおり、PDM(AKT2)によって影響を受けるシグナル伝達経路の発癌マップを模式的に示す。要するに、結果は、R251W変異を保有する試験AKT2が、試験FTRの核トランスロケーションの減少により、試験した2つの異なるシグナル伝達経路(AKTおよびNFκB)に影響を与えることを示す。
HeLaアッセイ細胞を、対応するFTRとともに、示したWTおよび変異体PDM(AKT3−WTおよび著しく拡大した脳のサイズに関連する散発的な異常増殖障害の症候群に関与すると報告されている活性化変異(R465Q)を保有する変異AKT3)でトランスフェクトした(上記のように)。上記のように、試験PDMの誘導性プロモーターを誘導した。トランスフェクション後30時間の時点で、細胞を固定し、蛍光顕微鏡を用いて画像化した。細胞質内および核内のFTRの量を定量した。核(N)および細胞質(C)内のFTRの強度比を測定した(N:C比)。結果を図9Aおよび図10Aに示す。図9Aでは、FTRはAKT1であり、図10Aでは、FTRはRelAである。図9B〜図10Bは、それぞれのFTRの局在化によって決定されるとおり、PDM(AKT3)によって影響を受けるシグナル伝達経路の発癌マップを模式的に示す。要するに、結果は、R564Q変異を保有する試験AKT3が、試験FTRの核トランスロケーションの増加により、試験した2つの異なるシグナル伝達経路(AKTおよびNFκB)に影響を与えることを示す。
HeLaアッセイ細胞を、示したWTおよび変異体PDR(SMAD3−WTおよび他の転写因子と相互作用するMH1ドメインに存在する未知の変異(T67A)を保有する変異SMAD3)でトランスフェクトした(上記のように)。SMAD2は、TGFβのシグナルを媒介し、したがって、細胞の増殖、アポトーシス、および分化などの複数の細胞プロセスを調節する。トランスフェクション後30時間の時点で、細胞を固定し、蛍光顕微鏡を用いて画像化した。細胞質内および核内のPDR(SMAD2)の量を定量した。核(N)および細胞質(C)内のWT SMAD2ならびに変異SMAD2の強度比を測定した(N:C比)。結果を図11A〜図11Bに示す。図に示すように、SMAD2内のT67A変異は、細胞の他のいかなる刺激も誘導することなく、SMAD2を核内に移行させる。
HeLaアッセイ細胞を、対応するFTRと共に、示したWTおよび変異体PDR(FGFR1−WTおよび細胞外領域のIg様C2型3ドメインに存在する機能未知の変異(A343V)を保有する変異FGFR1)でトランスフェクトした(上記のように)。トランスフェクション後30時間の時点で、細胞を固定し、蛍光顕微鏡を用いて画像化した。細胞質内および核内のFTRの量を定量した。核(N)および細胞質(C)内のFTRの強度比を測定した(N:C比)。結果を図12A〜図16Aに示す。図12Aでは、FTRはERK2であり、図13Aでは、FTRはJNK1α1であり、図14Aでは、FTRはP38であり、図15Aでは、FTRはSTAT3であり、図16Aでは、FTRはAKT1である。図12B〜16Bは、それぞれのFTRの局在化によって決定されるとおり、PDM(FGFR1)によって影響を受けるシグナル伝達経路の発癌マップを模式的に示す。要するに、結果は、A343V変異を保有する試験FGFR1はERK1/2、JNKおよびp38シグナル伝達経路に影響を与えるが、STAT経路(図15A〜15B)またはAKT経路(図16A〜16B)には影響を与えないことを示す。
HeLaアッセイ細胞を、対応するFTRと共に、WT PDM(BRAF−WT)または示した変異体PDM(以下の変異:BRAFのキナーゼドメインに存在する既知のドライバー変異(G464V)、既知のドライバー変異(V600E)または機能未知の変異(I554T)の1つを保有する、変異BRaf)でトランスフェクトした(上記のように)。トランスフェクション後30時間の時点で、細胞を固定し、蛍光顕微鏡を用いて画像化した。細胞質内および核内のFTRの量を定量した。核(N)および細胞質(C)内のFTRの強度比を測定した(N:C比)。結果を図17A〜図18Aに示す。図17Aでは、FTRはERK2であり、図18Aでは、FTRはERFである。図17B〜18Bは、それぞれのFTRの局在化によって決定されるとおり、PDM(BRAF)によって影響を受けるシグナル伝達経路の発癌マップを模式的に示す。要するに、結果は、2つの機能既知の変異(G464VおよびV600E)が、実際にシグナル伝達経路を活性化する(試験した両方のFTRによって決定されるとおり)ことを示している。結果は、さらに、機能未知の変異(I544T)も試験したシグナル伝達経路を活性化することを示し、これがドライバー変異であることを示す。さらに、FTRとしてERK2を使用した場合(図17A)、機能未知のI544T変異を保有する変異BRAFによる活性化レベルは、G464V変異よりも活性があると以前に報告されている、既知のV600E変異を保有するBRAFについて観察されるものと同じくらい高い。
HeLaアッセイ細胞を、対応するFTRと共に、WT PDM(EGFR−WT)または示した変異体PDM(以下の変異:既知のドライバー変異(G719S)または3つの既知のドライバー変異G719A、T790M(小分子EGFR阻害剤に対する耐性を付与することが知られている)およびL861Qを含む変異体(3重変異)の1つを保有する、変異EGFR)でトランスフェクトした(上記のように)。トランスフェクション後30時間の時点で、細胞を固定し、蛍光顕微鏡を用いて画像化した。細胞質内および核内のFTRの量を定量した。核(N)および細胞質(C)内のFTRの強度比を測定した(N:C比)。結果を図19A〜図23Aに示す。図19Aでは、FTRはRelAであり、図20Aでは、FTRはAKT1であり、図21Aでは、FTRはJNK1α1であり、図22Aでは、FTRはP38βであり、図23Aでは、FTRはERK2である。図19B〜23Bは、それぞれのFTRの局在化によって決定されるとおり、PDM(FGFR)によって影響を受けるシグナル伝達経路の発癌マップを模式的に示す。要するに、結果は、試験FGFR変異体(G719Sおよび三重変異)はNFκBのシグナル伝達経路に影響を与えるが(図19A〜19B)、P38経路には影響を与えない(図22A〜22B)ことを示す。さらに、FTRとしてAKT1(図20A)またはFTRとしてERK2(図23A)を用いた場合は、いずれの変異体もこの経路を活性化するが、3重変異が(統計的に有意に)G179S変異よりも大きな程度まで活性化した。同様に、FTRとしてJNK1α1を用いた場合は、G719S変異体による活性化レベルはWTと類似していたが、3重変異はこの経路の活性化を引き起こした。
Claims (8)
- 癌患者由来の試料中の1つまたは複数の患者特有の異常なシグナル伝達経路をもたらすドライバー変異を特定する方法であって、以下の工程を含む方法:
a)患者の生体試料または患者の腫瘍分子プロファイリングのデータを取得する工程;
b)前記患者の試験遺伝子を含む個々の発現構築物を作製する工程、
c)前記患者からの前記試験遺伝子を保有する発現構築物の第1のセット、および対応する野生型遺伝子の発現構築物の第2のセットのアドレス可能なアレイを形成する工程;
d)アレイ中の各遺伝子座用の特定のレポーター遺伝子部分に連結された標的遺伝子部分を含む蛍光トランスロケーションレポーター(FTR)遺伝子をコードする発現ベクターを添加する工程;
e)前記アッセイ細胞中への前記構築物およびベクターのトランスフェクションを可能にする条件下で生存能力のあるアッセイ細胞を各遺伝子座に添加する工程;
これによって、前記癌患者の試料中の患者特有のドライバー変異を特定するのに適する、前記患者の前記試験遺伝子をコードするポリヌクレオチド中の候補変異を保有する発現構築物のアドレス可能なアレイを提供する工程
f)前記患者からの前記試験遺伝子を発現する前記アッセイ細胞で発現したFTRの少なくとも1つの属性を対応する野生型発現遺伝子と比較する工程
ここで前記FTRの属性が蛍光タンパク質の局在および蛍光タンパク質のトランスロケーションから選択され、
その際、前記癌患者の試料由来の前記試験遺伝子を発現する前記アッセイ細胞と、前記対応する野生型遺伝子を発現する前記アッセイ細胞との間の異なる結果が、患者特有の異常なシグナル伝達経路をもたらすドライバー変異の候補として前記試料からの試験遺伝子を特定するために使用される。 - 前記局在が細胞質、核、核小体、細胞膜、小胞体(ER)、ミトコンドリア、ゴルジ装置、リソソーム、ペルオキシソーム、エンドソーム区画、および細胞骨格から選択される細胞内局在を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記FTRの標的遺伝子部分が腫瘍サプレッサー、細胞骨格タンパク質、成長因子受容体、Gタンパク質共役受容体、細胞接着タンパク質、タンパク質キナーゼ、転写因子、アダプタータンパク質および交換因子から選択されるタンパク質をコードするか、または、
前記FTRの前記レポーター遺伝子部分が緑色蛍光タンパク質(GFP)、mCherry、mApple、DsRed、赤色蛍光タンパク質(RFP)、青色蛍光タンパク質(BFP)、EGFP、CFP、YFP、AmCyan1、ZsGreen1、ZsYellow1、DsRed2、AsRed2、およびHcRed1をコードする、
請求項1に記載の方法。 - 前記生体試料が腫瘍細胞、腫瘍生検、腫瘍組織および体液から選択されるか、または、
前記発現構築物の第1および/または第2のセットが2本鎖直鎖状DNAを含むか、または、
前記発現構築物の第1および/または第2のセットの前記プロモーターが構成的プロモーターであるか、または、
前記試験遺伝子の前記発現構築物がIRESおよび第2のレポーター遺伝子をさらに含むか、または、
トランスフェクション試薬の存在下で固体支持体上の前記DNA構築物を乾燥させることをさらに含むか、または、
前記発現構築物の第1および/または第2のセットの前記プロモーターが誘導性プロモーターであるか、または、
トランスフェクト細胞内での前記発現構築物および/または発現ベクターの発現を誘導して前記腫瘍からの前記試験遺伝子の前記第1のセットと前記アレイ中の各遺伝子座用の前記FTRの遺伝子産物を取得することをさらに含む、
請求項1に記載の方法。 - 前記患者の前記試験遺伝子の前記発現構築物が、プロモーターへ作動可能に連結された特定の増幅されたcDNAを含み、前記増幅されたcDNAが以下の工程によって取得される請求項1に記載の方法:
癌患者の生体試料中の1つまたは複数の患者特有のドライバー変異を特定する方法であって、以下の工程を含む方法:
a)生体試料から取得された複数のmRNAからcDNAライブラリーを作製する工程;
b)既知のシグナル伝達タンパク質をコードするポリヌクレオチドに相補的なプライマーのセットを使用してcDNAライブラリーの特定のcDNAを増幅する工程。 - 前記患者の前記試験遺伝子がシグナル伝達タンパク質である、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 前記アッセイ細胞が、HeLa細胞、HEK293細胞、U2OS、PC12、NCI60、A549、EKVX、T47D、HT29および癌患者の細胞から選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記細胞が癌患者の腫瘍試料由来であり、前記腫瘍試料が、生検、術後の腫瘍切片、血液試料、気管支肺胞洗浄、および骨髄から選択される、請求項7に記載の方法。
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