CN104937412B - 用于鉴定患者特定驱动突变物的方法和系统 - Google Patents

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Abstract

提供了用于鉴定患者特定驱动突变物的方法。所提供的方法在癌症患者的生物样品中鉴定特定患者来源的与异常信号转导通路相关的标志物。

Description

用于鉴定患者特定驱动突变物的方法和系统
发明领域
提供了用于鉴定患者特定驱动突变物(driver mutation)的方法。所提供的方法在癌症患者的生物样品中鉴定特定患者来源的与异常信号转导通路相关的标志物。
发明背景
取决于根本的分子机制的准确诊断以及全部驱动突变物的鉴定和自分泌及旁分泌作用，被诊断为患各种疾病状况，诸如癌症的患者的临床治疗方案和预后可极为不同。此外，可能表型上(病理上)相似的许多疾病可具有非常不同的潜在病因。例如，癌症是极为多样性的；因此，准确诊断和分级治疗方法对于有效的治疗至关重要。在被诊断为患癌症的患者中，许多控制细胞生长和分化之间，特别是细胞增殖和细胞死亡之间的平衡的信号转导通路以异常的方式被调控。这些通路中的许多通路的激活是由称为“驱动突变物”的关键蛋白中的突变的积累引起的，驱动突变物或由肿瘤细胞或基质细胞分泌的生长因子和细胞因子及肿瘤质膜上激活这些信号转导通路的受体的再激活引起的。这些突变覆盖大量的程序，但全都具有赋予细胞癌变活性的能力。因此，用特异性的抑制性药物靶向此类驱动突变物(“靶向治疗”)是癌症治疗的主要目标。例如，肺癌可能具有各自需要不同的治疗方法的许多潜在的参与因子(例如EGFR突变和ALK-ELM4易位)。同样地，乳腺癌的治疗受潜在的分子特征谱(诸如ER/PR的表达或HER2的扩增)指令。不同通路之间的相互作用是非常复杂的并且是肿瘤特异性的，并且在大多数病例中是患者特异性的。需要对患者特异性的肿瘤潜在信号机制的充分理解以确定靶向治疗药物的最佳组合，所述靶向治疗药物可能通过中断异常信号转导通路来抑制细胞分裂并诱导细胞死亡而起效。肿瘤在个体间的异质性(基因多态性)对药物效力以及不希望的脱靶副作用的可能性和最终的存活率具有深远的影响。
在人类的约320个已知的信号转导通路中，约50个信号转导通路直接或间接地参与肿瘤生长和进展。对这样的平台的需要未被满足，所述平台使得通过在活的受试细胞中监测各种信号转导蛋白(诸如，例如，膜定位和/或细胞内受体及信号转导蛋白)的激活而确立患者肿瘤的激活的信号转导通路的特征成为可能。
癌症的复杂性和异质性要求更灵敏和识别能力更强的诊断方法，所述诊断方法以定性和定量的方式映射肿瘤信号转导通路并使得分级治疗的精准选择成为可能。目前的技术状态是，极少的单个标志物可用于预测药物的效力和毒性。此外，由于肿瘤内积累的大量突变和有限的已鉴定的驱动突变物的库(repertoire)，用于选择靶向治疗的全基因组测序(下一代测序)的适用性受到限制。此外，全基因组测序没有揭示出自分泌和旁分泌刺激，它们是肿瘤增殖的主要驱动因素。
因此，本领域存在对为患者提供特异性诊断平台的方法和系统的未被满足的需要，所述诊断平台是有成本和时间效益的，并且具有基于患者特定驱动突变物和自分泌-旁分泌突变的异常活性而专门识别这些驱动突变物突变的能力，并因此可预测特异性、个性化和优化的治疗。
发明概述
本发明提供了，通过鉴定受试细胞中信号转导通路活性的改变鉴定患者特定驱动突变物的方法和系统，所述信号转导通路活性的改变与驱动突变物的功能相关。根据一些实施方案，信号转导通路活性的改变通过鉴定与驱动突变物的功能相关的报告物基因的亚细胞定位的变化来确定。在一些实施方案中，从生物样品中获得特定患者来源的标志物(PDM)的基因，并在活的受试细胞中测试它们对相应荧光易位报告物(FTR)基因的亚细胞易位的影响以确定所测试的PDM是否突变。在一些实施方案中，获得特定患者来源的标志物并将其融合至荧光报告物以创建患者来源的报告物(PDR)，其中在活的受试细胞中测试PDR的亚细胞易位以确定所测试的PDR是否突变。
本文公开的方法和系统通常还允许确定与疾病相关的细胞内通路以及受到异常影响的信号转导通路的特定组分。本文公开的方法和系统提供的分析还允许确定和/或调整适应对由此鉴定的患者特定驱动突变物的最佳个性化治疗。
在一些实施方案中，本发明提供了用于确定参与癌症的患者特定驱动突变物的方法和系统。在一些实施方案中，驱动突变物是致癌性驱动突变物。在一些实施方案中，所述方法和系统提供了测试各种旁分泌和自分泌因子对特定癌症及其进展的影响的预测平台。在一些实施方案中，所述方法和系统提供了确定所测试的药物或药物组合对患者的特定细胞通路的影响的预测平台。在一些实施方案中，所述方法和系统提供了确定特别适合患者的优化治疗的预测平台。在一些实施方案中，本文所公开的方法能够确定自分泌和旁分泌对细胞和细胞间的信号转导通路的影响。在一些实施方案中，本文公开的方法能够检测和/或预测固有的耐药机制和获得性的耐药机制。
根据一些实施方案，提供了通过鉴定报告标志物基因的亚细胞定位的变化鉴定患者特定驱动突变物的方法，其中报告标志物基因的亚细胞定位的变化受到驱动突变物的影响。在一些实施方案中，患者来源的标志物(PDM)从该患者的生物样品中获得，并被操作(构建)以在报告物嵌合基因(荧光易位报告物(FTR)，包含报告物基因部分和靶基因部分的嵌合产物)的存在下在活的受试细胞中表达。然后确定FTR在受试细胞中的亚细胞定位。如果，与FTR在正常条件下(即，在相应的WT PDM的存在下)的亚细胞定位相比和/或与其他已知的参考相比，FTR在所测试的PDM的存在下的亚细胞定位不同，则指示所测试的PDM发生突变。因此，使用本文公开的方法，可将患者的特定PDM鉴定/表征为驱动突变物。可选择地或另外，在一些实施方案中，可通过创建PDR(即，连接/附接/融合至报告物基因的PDM)，并跟踪其亚细胞定位直接测试PDM，而无需使用FTR。此外，通过确定此类驱动突变物，可确定患者肿瘤内运行的已激活的信号转导通路。此外，这促进精确并针对性地选择根除肿瘤并避免特定患者的抗性机制所需要的必需的靶向疗法治疗。
根据一些实施方案，有利地提供了基于从肿瘤组织获得的生物样品的用于个性化癌症治疗的新型诊断平台。在一些实施方案中，所述方法是基于细胞的测定，所述基于细胞的测定能够通过此类监测激活型驱动突变物对固定在基底上的存活的(活的)细胞中FTR的影响，并且特别是监测此类激活型驱动突变物激活已知的参与肿瘤发展的信号转导通路的能力来感知此类激活型驱动突变物。在一些实施方案中，这可通过检测涉及荧光报告蛋白(FTR)的细胞内易位事件(即，易位到多个亚细胞位置，诸如质膜、细胞溶质、核内体、核仁等/在多个亚细胞位置，诸如质膜、细胞溶质、核内体、核仁等之间易位)和蛋白-蛋白的相互作用进行。因此，本文公开的方法和系统可允许在一线治疗之前鉴定此类细胞事件，从而启动有效的治疗方案。此外，可防止药物治疗刺激的肿瘤抗性细胞的过度生长。
因此，根据一些实施方案，提供了鉴定癌症患者的生物样品中的一种或更多种患者特定驱动突变物的方法，所述方法包括以下步骤：
a)从所述生物样品获得多种mRNA；
b)由所述多种mRNA产生cDNA文库；
c)使用与编码已知的信号转导蛋白的多核苷酸互补的一组引物扩增所述cDNA文库中的特定cDNA；
d)形成所扩增的cDNA的单独的表达构建体，其中所述cDNA被可操作地连接至启动子；
e)形成携带来自肿瘤的扩增的cDNA的第一组表达构建体及相应的野生型cDNA的第二组表达构建体的可寻址阵列；
从而提供在编码所述信号转导蛋白的多核苷酸中携带候选突变的表达构建体的可寻址阵列，所述可寻址阵列适于在所述癌症患者的生物样品中鉴定患者的特定驱动突变物。
在一些实施方案中，所述方法还包括步骤(f)：对于阵列中的每个位点，加入编码荧光易位报告物(FTR)基因的表达载体，所述荧光易位报告物(FTR)包含连接至特定报告物基因部分的靶基因部分。
在另外的实施方案中，所述方法还包括以下步骤：(g)在促使DNA构建体和载体转染进入受试细胞的条件下，将活的测定细胞加至每个位点；以及(h)比较表达来自肿瘤的cDNA与表达其相应的野生型表达的cDNA的测定细胞中表达的FTR的至少一个属性；其中，表达源自癌症患者的生物样品的cDNA与表达相应的野生型cDNA的测定细胞之间的不同的结果，用于鉴定该生物样品中作为候选的患者特定驱动突变物的cDNA。
在一些实施方案中，FTR的属性选自荧光蛋白的定位及荧光蛋白的易位。在一些实施方案中，定位包括选自以下的亚细胞定位：细胞溶质、细胞核、核仁、质膜、内质网(ER)、线粒体、高尔基体、溶酶体、过氧化物酶体、内体区室(endosomal compartment)和细胞骨架。
在一些实施方案中，FTR的靶基因部分编码选自以下的蛋白：肿瘤抑制因子、细胞骨架蛋白、生长因子受体、G-蛋白偶联受体、细胞粘附蛋白、蛋白激酶、转录因子、衔接蛋白和交换因子。在另外的实施方案中，FTR的报告物基因部分编码：绿色荧光蛋白(GFP)、mCherry、mApple、DsRed、红色荧光蛋白(RFP)、蓝色荧光蛋白(BFP)、EGFP、CFP、YFP、AmCyan1、ZsGreen1、ZsYellow1、DsRed2、AsRed2、和HcRed1。
在一些实施方案中，生物样品选自肿瘤细胞、肿瘤活检物、肿瘤组织和体液。
在一些实施方案中，第一和/或第二组表达构建体包含双链线性DNA。在其他实施方案中，第一和/或第二组表达构建体的启动子是诱导型启动子。在一些实施方案中，第一和/或第二组表达构建体的启动子是组成型启动子。
在一些实施方案中，所述方法还包括对于阵列中的每个位点，诱导表达构建体和/或表达载体在转染细胞中表达，以获得第一组来自肿瘤的cDNA和FTR的基因产物。
在另外的实施方案中，扩增的cDNA的表达构建体还包含IRES和第二报告物基因。
在一些实施方案中，所述方法还包括在转染试剂的存在下在固体支持体上干燥DNA构建体。
根据一些实施方案，提供了确定肿瘤细胞中异常信号转导通路的方法，包括以下步骤：
a)从所述肿瘤细胞获得多种mRNA；
b)由所述多种mRNA产生cDNA文库；
c)使用与编码已知的信号转导蛋白的多核苷酸互补的一组引物扩增所述cDNA文库中的特定cDNA；
d)形成步骤(c)的扩增的cDNA的单独的表达构建体，其中所述cDNA被可操作地连接至启动子；
e)形成携带来自肿瘤的扩增的cDNA的第一组表达构建体及相应的野生型cDNA的第二组表达构建体的可寻址阵列；
从而提供在编码所述信号转导蛋白的多核苷酸中携带候选突变的表达构建体的可寻址阵列，所述可寻址阵列适于确定所述肿瘤细胞中异常的信号转导通路。
在一些实施方案中，所述方法还包括步骤(f)：对于阵列中的每个位点，加入编码荧光易位报告物(FTR)基因的表达载体，所述荧光易位报告物(FTR)基因包含连接至报告物基因部分的靶基因部分。
在另外的实施方案中，所述方法还包括以下步骤：g)在促进DNA构建体被共转染到测定细胞中的条件下，将活的测定细胞加至每个位点；以及h)比较表达来自肿瘤的cDNA与表达其相应的野生型表达的cDNA的测定细胞中表达的FTR的至少一个属性；其中，表达源自肿瘤细胞的cDNA的测定细胞和表达相应的野生型cDNA的测定细胞之间的不同的结果，用于鉴定肿瘤细胞中作为候选的异常信号转导蛋白的cDNA。
在一些实施方案中，肿瘤细胞源自癌症患者的肿瘤样品，所述肿瘤样品选自：活检物、手术后的肿瘤切除物、血液样品、支气管肺泡灌洗液和骨髓。
在另外的实施方案中，通过该方法鉴定的候选的异常信号转导蛋白是患者的特定驱动突变物。
根据一些实施方案，提供了在癌症患者的生物样品中鉴定一种或更多种患者特定驱动突变物的方法，包括以下步骤：
a)从所述生物样品获得多种mRNA；
b)由所述多种mRNA产生cDNA文库；
c)使用与编码已知的信号转导蛋白的多核苷酸互补的一组引物扩增所述cDNA文库中的特定cDNA；
d)形成所扩增的cDNA的单独的表达构建体，其中所述cDNA被可操作地连接至启动子；
e)在可寻址阵列中，将活的测定细胞添加至基底；
f)向所述测定细胞加入携带来自肿瘤的扩增的cDNA的第一组表达构建体和相应的野生型cDNA的第二组表达构建体；其中在促使表达构建体转染进入所述测定细胞的条件下，将每种表达构建体加至位于不同的可寻址位点处的测定细胞；
从而产生包含在编码所述信号转导蛋白的多核苷酸中携带候选突变的表达构建体的测定细胞的阵列，所述阵列适于鉴定所述癌症患者的生物样品中的患者特定驱动突变物。
在一些实施方案中，所述方法还包括将荧光易位报告物(FTR)基因的表达载体加至测定细胞的步骤，所述FTR基因包含被连接至阵列中每个位点的特定报告物基因部分的靶基因部分。
在一些实施方案中，所述方法还包括，比较表达来自肿瘤的cDNA与表达其相应的野生型表达的cDNA的细胞中的FTR的至少一个属性；其中，表达生物样品来源的cDNA与表达相应的野生型cDNA的测定细胞之间的不同结果，用于鉴定生物样品中作为候选的患者特定驱动突变物的cDNA。
在一些实施方案中，生物样品选自肿瘤细胞、肿瘤活检物、肿瘤组织和体液。
根据一些实施方案，提供了确定肿瘤细胞中异常信号转导通路的方法，包括以下的一个或更多个步骤：
a)从所述肿瘤样品获得多种mRNA；
b)由所述多种mRNA产生cDNA文库；
c)使用与已知的信号转导蛋白的多核苷酸(基因或基因部分)互补的一组引物扩增所述cDNA文库中的特定cDNA；
d)形成(c)的扩增的cDNA的单独的表达构建体，其中所述cDNA被可操作地连接至启动子；
e)形成携带来自肿瘤的扩增的cDNA的第一组表达构建体及相应的野生型cDNA的第二组表达构建体的可寻址阵列；
f)对于阵列中的每个位点，加入用于共转染荧光易位报告物(FTR)嵌合基因的表达载体，所述FTR嵌合基因包含连接至报告物基因部分的靶基因部分；
g)在促进DNA构建体转染进入测定细胞的条件下，将活的测定细胞加至每个位点；
h)比较表达来自肿瘤的cDNA的细胞中与表达其相应的野生型表达的cDNA的细胞中表达的FTR的至少一个属性；
其中，表达肿瘤来源的cDNA的细胞与表达相应的野生型cDNA的细胞之间的不同的结果，用于鉴定所述肿瘤中作为候选的异常信号转导蛋白的cDNA。
在一些实施方案中，报告物基因的属性选自荧光蛋白的定位及荧光蛋白的易位。
在一些实施方案中，FTR的靶基因部分编码选自以下的蛋白：肿瘤抑制因子、细胞骨架蛋白、生长因子受体、G-蛋白偶联受体、细胞粘附蛋白、蛋白激酶、转录因子、衔接蛋白和交换因子。
在一些实施方案中，FTR的报告物基因部分编码或选自：绿色荧光蛋白(GFP)、mCherry、mApple、DsRed、红色荧光蛋白(RFP)、蓝色荧光蛋白(BFP)、增强型绿色荧光蛋白(EGFP)、青色荧光蛋白(CFP)、黄色荧光蛋白(YFP)、AmCyan1、ZsGreen1、ZsYellow1、DsRed2、AsRed2、和HcRed1。
根据另外的实施方案，定位包括选自以下的亚细胞定位：细胞溶质、细胞核、核仁、质膜、内质网(ER)、线粒体、高尔基体、溶酶体、过氧化物酶体、内体区室和细胞骨架。
在一些实施方案中，第一和/或第二表达构建体包含双链线性DNA。在另外的实施方案中，第一和/或第二表达构建体的启动子是诱导型启动子。在一些实施方案中，表达构建体的启动子是组成型启动子。
在一些实施方案中，所扩增的cDNA的表达构建体还包含IRES和第二报告物基因。
在一些实施方案中，FTR的表达载体是环状的表达载体。在另外的实施方案中，表达载体包含组成型或诱导型启动子。
在一些实施方案中，步骤g)在步骤e)和/或f)之前，在这些个例中，测定细胞在添加表达构建体和/或表达载体之前被添加至每个位点。
在一些实施方案中，所述方法还包括在转染试剂的存在下在固体支持体上干燥DNA构建体。
根据一些实施方案，测定细胞选自HeLa细胞、HEK293细胞、U2OS、PC12、A549、EKVX、T47D、HT29和患者的细胞。
根据另外的实施方案，通过该方法鉴定的候选的异常蛋白是患者的特定驱动突变物。
在另外的实施方案中，细胞从癌症患者的生物样品中获得。在一些实施方案中，肿瘤样品选自活检物、手术后的肿瘤切除物、血液样品、支气管肺泡灌洗液和骨髓。
在一些实施方案中，所述方法还包括，对于阵列中的每个位点，使构建体和/或表达载体在转染的细胞中表达，以获得第一组来自肿瘤的cDNA和FTR的基因产物。
根据一些实施方案，提供了在癌症患者的生物样品中鉴定患者特定驱动突变物的方法，包括以下步骤：
a.从所述生物样品获得多种mRNA的样品；
b.由所述多种mRNA产生cDNA文库；
c.使用与编码已知的信号转导蛋白的多核苷酸互补的一组引物扩增所述cDNA文库中的单独的cDNA样品；
d.形成所扩增的cDNA的单独的表达构建体，其中所述cDNA被可操作地连接至启动子；
e.形成携带来自肿瘤的扩增的cDNA的第一组表达构建体及平行的相应的野生型cDNA的第二组表达构建体的可寻址阵列；
f.针对阵列中的每个位点，加入用于共转染荧光易位报告物(FTR)基因的表达载体，所述FTR基因包含连接至特定报告物基因的靶基因；
g.在促进DNA构建体转染进入测定细胞的条件下，将活的测定细胞添加至每个位点；
h.比较表达来自肿瘤的cDNA与表达其相应野生型表达的cDNA的细胞中的报告物基因的至少一个属性；
其中，表达所述生物样品来源的cDNA的细胞与表达相应的野生型cDNA的细胞之间的不同的结果，用于鉴定所述生物样品中作为含候选的患者特定驱动突变物的cDNA。
在一些实施方案中，生物样品选自肿瘤细胞、组织、活检物和体液。
在一些实施方案中，细胞蛋白可以是可与癌症状况相关的任何类型的细胞蛋白。在一些实施方案中，细胞蛋白可参与各种细胞程序。在一些实施方案中，细胞蛋白可选自，但不限于：参与信号转导通路的蛋白、细胞骨架蛋白、酶、参与翻译的蛋白、参与细胞周期调控的蛋白、参与转录的蛋白、参与代谢的蛋白等，或其组合。
根据一些实施方案，还提供了用于在癌症患者的生物样品中鉴定患者的特定驱动突变物的试剂盒。在另外的实施方案中，提供了用于确定患者肿瘤细胞中的异常信号转导通路的试剂盒。
附图简述
图1是根据一些实施方案的用于获得患者来源的标志物并鉴定驱动突变物的方法的步骤的示意性框图；
图2是根据一些实施方案展示鉴定特定患者驱动突变物的示意图(未按比例)。
图3A-显示了基于细胞的测定的结果的条形图，其中编码野生型KRas(KRAS WT)或突变体形式的KRas(KRAS突变体(G13D))的基因已连同报告物蛋白(FTR)一起在受试细胞中表达，并基于细胞的荧光显微镜图像(转染后固定30小时)来定量FTR(ERK2-GFP)在细胞质和细胞核中的量。测量了细胞核(N)与细胞质(C)中的FTR(ERK2)强度之间的比(N:C比)。示出了针对每种条件测量的细胞数目(n)。
图3B-受PDM(KRAS)和相应的FTR(ERK2)影响的信号转导通路的示意图。
图4A-显示了基于细胞的测定的结果的条形图，其中编码野生型KRas(KRAS WT)或突变体形式的KRas(KRAS突变体(G13D))的基因已连同报告物蛋白(FTR)一起在受试细胞中表达，并基于细胞的荧光显微镜图像(转染后固定30小时)来定量FTR(ERF-GFP)在细胞质和细胞核中的量。测量了细胞核(N)与细胞质(C)中的FTR(ERF)强度之间的比(N:C比)。示出了针对每种条件测量的细胞数目(n)。
图4B-受PDM(KRAS)和相应的FTR(ERF)影响的信号转导通路的示意图。
图5A-显示了基于细胞的测定的结果的条形图，其中编码野生型KRas(KRAS WT)或突变体形式的KRas(KRAS突变体(G13D))的基因已连同报告物蛋白(FTR)一起在受试细胞中表达，并基于细胞的荧光镜显微图像(转染后固定30小时)来定量FTR(JNK1a1-GFP)在细胞质和细胞核中的量。测量了细胞核(N)与细胞质(C)中的FTR(JNK1a1)强度之间的比(N:C比)。示出了针对每种条件测量的细胞数目(n)。
图5B-A受PDM(KRAS)和相应的FTR(JNK1a1)影响的信号转导通路的示意图。
图6A-显示了基于细胞的测定的结果的条形图，其中编码野生型KRas(KRAS WT)或突变体形式的KRas(KRAS突变体(G13D))的基因已连同报告物蛋白(FTR)一起在受试细胞中表达，并基于细胞的荧光显微镜图像(转染后固定30小时)来定量FTR(AKT1-GFP)在细胞质和细胞核中的量。测量了细胞核(N)与细胞质(C)中的FTR(AKT1)强度之间的比(N:C比)。示出了针对每种条件测量的细胞数目(n)。
图6B-受PDM(KRAS)和相应的FTR(AKT1)影响的信号转导通路的示意图。
图7A-显示了基于细胞的测定的结果的条形图，其中编码野生型AKT2(AKT2 WT)或突变体形式的AKT2(AKT2突变体(R251W))的基因已连同报告物蛋白(FTR)一起在受试细胞中表达，并基于细胞的荧光显微镜图像(转染后固定30小时)来定量FTR(AKT1-GFP)在细胞质和细胞核中的量。测量了细胞核(N)与细胞质(C)中的FTR(AKT1)强度之间的比(N:C比)。示出了针对每种条件测量的细胞数目(n)。
图7B-受PDM(AKT2)和相应的FTR(AKT1)影响的信号转导通路的示意图。
图8A-显示了基于细胞的测定的结果的条形图，其中编码野生型AKT2(AKT2 WT)或突变体形式的AKT2(AKT2突变体(R251W))的基因已连同报告物蛋白(FTR)一起在测试细胞中表达，并基于细胞的荧光显微镜图像(转染后固定30小时)来定量FTR(RelA-GFP)在细胞质和细胞核中的量。测量了细胞核(N)与细胞质(C)中的FTR(RelA)强度之间的比(N:C比)。示出了针对每种条件测量的细胞数目(n)。
图8B-受PDM(AKT2)和相应的FTR(RelA)影响的信号转导通路的示意图。
图9A-显示了基于细胞的测定的结果的条形图，其中编码野生型AKT3(AKT3 WT)或突变体形式的AKT3(AKT3突变体(R465Q))的基因已连同报告物蛋白(FTR)一起在受试细胞中表达，并基于细胞的荧光显微镜图像(转染后固定30小时)来定量FTR(AKT1-GFP)在细胞质和细胞核中的量。测量了细胞核(N)与细胞质(C)中的FTR(AKT1)强度之间的比(N:C比)。示出了针对每种条件测量的细胞数目(n)。
图9B-受PDM(AKT3)和相应的FTR(AKT1)影响的信号转导通路的示意图。
图10A-显示了基于细胞的测定的结果的条形图，其中编码野生型AKT3(AKT3 WT)或突变体形式的AKT3(AKT3突变体(R465Q))的基因已连同报告物蛋白(FTR)一起在受试细胞中表达，并基于细胞的荧光显微镜图像(转染后固定30小时)来定量FTR(RelA-GFP)在细胞质和细胞核中的量。测量了细胞核(N)与细胞质(C)中的FTR(RelA)强度之间的比(N:C比)。示出了针对每种条件测量的细胞数目(n)。
图10B-受PDM(AKT3)和相应的FTR(RelA)影响的信号转导通路的示意图。
图11A-显示了基于细胞的测定的结果的条形图，其中编码野生型SMAD2(SMAD2WT)或突变体形式的SMAD2(SMAD2突变体(T67A))的基因已在受试细胞中表达，并基于细胞的荧光显微镜图像(转染后固定30小时)来定量细胞质和细胞核中用作患者来源的报告物(PDR)蛋白的SMAD2蛋白的量。测量了细胞核(N)与细胞质(C)中该蛋白的强度之间的比(N:C比)。示出了针对每种条件测量的细胞数目(n)。
图11B-受患者来源的报告物(PDR)，SMAD2影响的信号转导通路的示意图。
图12A-显示了基于细胞的测定的结果的条形图，其中编码野生型FGFR1(FGFR1WT)或突变体形式的FGFR1(FGFR1突变体(A343V))的基因已连同报告物蛋白(FTR)一起在受试细胞中表达，并基于细胞的荧光显微镜图像(转染后固定30小时)来定量FTR(ERK2-GFP)在细胞质和细胞核中的量。测量了细胞核(N)与细胞质(C)中的FTR(ERK2)强度之间的比(N:C比)。示出了针对每种条件测量的细胞数目(n)。
图12B-受PDM(FGFR1)和相应的FTR(ERK2)影响的信号转导通路的示意图。
图13A-显示了基于细胞的测定的结果的条形图，其中编码野生型FGFR1(FGFR1WT)或突变体形式的FGFR1(FGFR1突变体(A343V))的基因已连同报告物蛋白(FTR)一起在受试细胞中表达，并基于细胞的荧光显微镜图像(转染后固定30小时)来定量FTR(JNK1a1-GFP)在细胞质和细胞核中的量。测量了细胞核(N)与细胞质(C)中的FTR(JNK1a1)强度之间的比(N:C比)。示出了针对每种条件测量的细胞数目(n)。
图13B-受PDM(FGFR1)和相应的FTR(JNK1a1)影响的信号转导通路的示意图。
图14A-显示了基于细胞的测定的结果的条形图，其中编码野生型FGFR1(FGFR1WT)或突变体形式的FGFR1(FGFR1突变体(A343V))的基因已连同报告物蛋白(FTR)一起在受试细胞中表达，并基于细胞的荧光显微镜图像(转染后固定30小时)来定量FTR(P38b-GFP)在细胞质和细胞核中的量。测量了细胞核(N)与细胞质(C)中的FTR(P38b)强度之间的比(N:C比)。示出了针对每种条件测量的细胞数目(n)。
图14B-受PDM(FGFR1)和相应的FTR(P38b)影响的信号转导通路的示意图。
图15A-显示了基于细胞的测定的结果的条形图，其中编码野生型FGFR1(FGFR1WT)或突变体形式的FGFR1(FGFR1突变体(A343V))的基因已连同报告物蛋白(FTR)一起在受试细胞中表达，并基于细胞的荧光显微镜图像(转染后固定30小时)来定量FTR(STAT3-GFP)在细胞质和细胞核中的量。测量了细胞核(N)与细胞质(C)中的FTR(STAT3)强度之间的比(N:C比)。示出了针对每种条件测量的细胞数目(n)。
图15B-受PDM(FGFR1)和相应的FTR(STAT3)影响的信号转导通路的示意图。
图16A-显示了基于细胞的测定的结果的条形图，其中编码野生型FGFR1(FGFR1WT)或突变体形式的FGFR1(FGFR1突变体(A343V))的基因已连同报告物蛋白(FTR)一起在受试细胞中表达，并基于细胞的荧光显微镜图像(转染后固定30小时)来定量FTR(AKT1-GFP)在细胞质和细胞核中的量。测量了细胞核(N)与细胞质(C)中的FTR(AKT)强度之间的比(N:C比)。示出了针对每种条件测量的细胞数目(n)。
图16B-受PDM(FGFR1)和相应的FTR(AKT)影响的信号转导通路的示意图。
图17A-显示了基于细胞的测定的结果的条形图，其中编码野生型BRAF(BRAF WT)或突变体形式的BRAF(BRAF突变体G464V或V600E或I554T)的基因已连同报告物蛋白(FTR)一起在受试细胞中表达，并基于细胞的荧光显微镜图像(转染后固定30小时)来定量FTR(ERK2-GFP)在细胞质和细胞核中的量。测量了细胞核(N)与细胞质(C)中的FTR(ERK2)强度之间的比(N:C比)。示出了针对每种条件测量的细胞数目(n)。
图17B-受PDM(BRAF)和相应的FTR(ERK2)影响的信号转导通路的示意图。
图18A-显示了基于细胞的测定的结果的条形图，其中编码野生型BRAF(BRAF WT)或突变体形式的BRAF(BRAF突变体G464V或V600E或I554T)的基因已连同报告物蛋白(FTR)一起在受试细胞中表达，并基于细胞的荧光显微镜图像(转染后固定30小时)来定量FTR(ERF-GFP)在细胞质和细胞核中的量。测量了细胞核(N)与细胞质(C)中的FTR(ERF)强度之间的比(N:C比)。示出了针对每种条件测量的细胞数目(n)。
图18B-受PDM(BRAF)和相应的FTR(ERF)影响的信号转导通路的示意图。
图19A-显示了基于细胞的测定的结果的条形图，其中编码野生型形式的EGFR(EGFR WT)，单突变形式的EGFR(EGFR G719S)或三突变形式的EGFR(EGFR三突变体，G719A、T790M和L861Q)的基因已连同报告物蛋白(FTR)一起在受试细胞中表达，并基于细胞的荧光显微镜图像(转染后固定30小时)来定量FTR(RelA-GFP)在细胞质和细胞核中的量。测量了细胞核(N)与细胞质(C)中的FTR(RelA)强度之间的比(N:C比)。示出了针对每种条件测量的细胞数目(n)。
图19B-受PDM(EGFR)和相应的FTR(RelA)影响的信号转导通路的示意图。
图20A-显示了基于细胞的测定的结果的条形图，其中编码野生型形式的EGFR(EGFR WT)，单突变形式的EGFR(EGFR G719S)或三突变形式的EGFR(EGFR三突变体，G719A、T790M和L861Q)的基因已连同报告物蛋白(FTR)一起在受试细胞中表达，并基于细胞的荧光显微镜图像(转染后固定30小时)来定量FTR(AKT1-GFP)在细胞质和细胞核中的量。测量了细胞核(N)与细胞质(C)中的FTR(AKT1)强度之间的比(N:C比)。示出了针对每种条件测量的细胞数目(n)。
图20B-受PDM(EGFR)和相应的FTR(AKT1)影响的信号转导通路的示意图。
图21A-显示了基于细胞的测定的结果的条形图，其中编码野生型形式的EGFR(EGFR WT)，单突变形式的EGFR(EGFR G719S)或三突变形式的EGFR(EGFR三突变体，G719A、T790M和L861Q)的基因已连同报告物蛋白(FTR)一起在受试细胞中表达，并基于细胞的荧光显微镜图像(转染后固定30小时)来定量FTR(JNK1A1-GFP)在细胞质和细胞核中的量。测量了细胞核(N)与细胞质(C)中的FTR(JNK1A1)强度之间的比(N:C比)。示出了针对每种条件测量的细胞数目(n)。
图21B-受PDM(EGFR)和相应的FTR(JNK1A1)影响的信号转导通路的示意图。
图22A-显示了基于细胞的测定的结果的条形图，其中编码野生型形式的EGFR(EGFR WT)，单突变形式的EGFR(EGFR G719S)或三突变形式的EGFR(EGFR三突变体，G719A、T790M和L861Q)的基因已连同报告物蛋白(FTR)一起在受试细胞中表达，并基于细胞的荧光显微镜图像(转染后固定30小时)来定量FTR(P38b-GFP)在细胞质和细胞核中的量。测量了细胞核(N)与细胞质(C)中的FTR(P38b)强度之间的比(N:C比)。示出了针对每种条件测量的细胞数目(n)。
图22B-受PDM(EGFR)和相应的FTR(P38b)影响的信号转导通路的示意图。
图23A-显示了基于细胞的测定的结果的条形图，其中编码野生型形式的EGFR(EGFR WT)，单突变形式的EGFR(EGFR G719S)或三突变形式的EGFR(EGFR三突变体，G719A、T790M和L861Q)的基因已连同报告物蛋白(FTR)一起在受试细胞中表达，并基于细胞的荧光显微镜图像(转染后固定30小时)来定量FTR(ERK2-GFP)在细胞质和细胞核中的量。测量了细胞核(N)与细胞质(C)中的FTR(ERK2)强度之间的比(N:C比)。示出了针对每种条件测量的细胞数目(n)。
图23B-受PDM(EGFR)和相应的FTR(ERK2)影响的信号转导通路的示意图。
发明详述
根据一些实施方案，提供了用于通过确定信号转导通路活性的改变鉴定患者特定驱动突变物的方法，所述信号转导通路活性的改变与驱动突变物的功能相关。在一些实施方案中，信号转导通路转导活性的改变通过鉴定报告物基因的亚细胞定位的改变来确定，由此报告物基因的亚细胞定位的改变受驱动突变物的影响。在一些实施方案中，患者来源的标志物(PDM)从患者的生物样品中获得，并被操作(构建)以在报告物嵌合基因(FTR)的存在下在受试细胞中表达。在一些实施方案中，另外地或可选择地，将患者的特定标志物融合至荧光报告物以创建患者来源的报告物(PDR)。然后确定FTR(如果可适用，和/或PDR)在受试细胞中的亚细胞定位。如果，与FTR(和/或PDR如果适用的话)在正常条件下(即，在相应的WT PDM的存在下)的亚细胞定位相比或与其他预定的参考相比，FTR在所测试的PDM(和/或PDR，如果适用的话)的存在下的亚细胞定位不同，则指示所测试的PDM(或PDR)发生突变。因此，使用本文公开的方法，患者的特定PDM可被鉴定确认/表征为驱动突变物。此外，通过确定此类驱动突变物，可确定患者肿瘤内运行的已激活的信号转导通路。此外，这可促进精确并针对性地选择根除肿瘤并避免特定患者的抗性机制的所需要的必需的靶向疗法治疗。在一些实施方案中，本文提供的方法提供了所测试的信号转导系统在生物样品中的细粒度分辨率(fine-grained resolution)，并可准确地监控以参与其中的多条通路的活性水平。
在一些实施方案中，本发明基于这样的见解，参与癌症的信号转导通路的蛋白响应各种环境因素的而易位，从而，通过测试受此类信号转导通路影响的嵌合报告物基因的定位，可鉴定患者的特定驱动突变物。根据一些实施方案，本文公开的方法和系统是有利的，因为，虽然存在有关致癌突变的大量信息，但是之前并不存在用于鉴定同一患者的相同生物样品中的多个突变事件，以及如本文公开的尚未被鉴定确定的突变，并确定此类突变的致癌活性的稳健方法和系统。例如，在目前使用的治疗方法中，用格列卫治疗携带cKit突变的胃肠道间质瘤患者。然而，常见的抗性机制通过cKit本身或下游通路中的继发突变(secondary mutation)发生，致使该治疗无效。同样地，具有EGFR致癌基因过表达的结肠直肠癌患者适合于西妥昔单抗治疗，但仅在存在正常形式的KRAS癌蛋白时。
在一些实施方案中，本文公开的方法和系统能够效仿患者肿瘤，以鉴定出激活的信号转导通路并确定致癌活性。此外，该方法可用于预测肿瘤对抗癌治疗的敏感性/抗性。在一些实施方案中，这是通过用患者体液(诸如血浆、胸膜积液或组织间液(interstitialfluid))孵育转染的受试细胞来进行的。
如本文所提及的，术语“多核苷酸分子”、“寡核苷酸”、“多核苷酸”、“核酸”和“核苷酸”序列可互换使用。这些术语指脱氧核糖核苷酸(DNA)、核糖核苷酸(RNA)及其修饰的形式的聚合物，所述聚合物是单独的片段，或作为更大的构建体的组分、线性或支链、单链、双链、三链或其杂合体的形式。该术语还包括RNA/DNA杂合体。所述多核苷酸可包括DNA或RNA的有义和反义寡核苷酸或多核苷酸序列。DNA或RNA分子可以是，例如，但不限于：互补的DNA(cDNA)、基因组DNA、合成的DNA、重组DNA、或其杂合体，或RNA分子，诸如，例如，mRNA、shRNA、siRNA、miRNA及类似物。因此，如本文所用，术语“多核苷酸分子”、“寡核苷酸”、“多核苷酸”、“核酸”和“核苷酸”序列意指DNA和RNA分子两者。该术语还包括包含天然存在的碱基、糖和共价的核苷间键的寡核苷酸，以及具有非天然存在的部分的寡核苷酸，所述非天然存在的部分的功能类似于相应的天然存在的部分。
如本文所用，术语“构建体”是指人工组装或分离的核酸分子，其可包括一个或更多个核酸序列，其中所述核酸序列可包括编码序列(即，编码终产物的序列)、调控序列、非编码序列或其任何组合。术语构建体包括，例如，载体，但不应被视为限于此。
术语“表达载体”是指，具有将异源核酸片段(诸如DNA)整合到靶细胞中并使其在靶细胞中表达的能力的载体。换言之，表达载体包含能够被转录的核酸序列/片段。许多病毒、原核和真核表达载体是已知的和/或商购可得的。选择适当的表达载体在本领域技术人员的知识范围内。
如本文所用，术语“上游”和“下游”是指在核苷酸序列，诸如，例如，DNA序列或RNA序列中的相对位置。如众所周知的，核苷酸序列具有5'末端和3'末端，这样的命名是针对核苷酸骨架的糖(脱氧核糖或核糖)环上的碳的。因此，相对于核苷酸序列上的位置，术语下游涉及朝向序列的3'末端的区域。术语上游涉及朝向链的5'末端的区域。
如本文所用，术语“启动子元件”、“启动子”或“启动子序列”是指，通常位于编码序列的5'末端(即，在前面，位于上游)并用作开关激活编码序列的表达的核苷酸序列。如果编码序列被激活，其被表述为转录。转录通常涉及由编码序列合成RNA分子(诸如，例如，mRNA)。因此，启动子用作转录调控元件并且还提供将编码序列转录为mRNA的起始位点。启动子可完全源自天然来源，或包括源自自然界中发现的不同启动子的不同元件，或甚至包括合成的核苷酸区段。本领域技术人员应理解，不同的启动子可驱动基因在不同的组织或细胞类型中，或在发育的不同阶段或响应不同的环境条件，或以各种表达水平表达。引起基因在大多数细胞类型中在大多数时间表达的启动子通常被称为“组成型启动子”。引起特定组织中的基因表达的启动子被称为“组织特异性启动子”。
如本文所用，术语“引入”和“转染”可互换使用，并是指将分子，诸如，例如，核酸、多核苷酸分子、载体和类似物，转移或引入到靶细胞中，且更具体地进入靶细胞的膜包围的空间内部，诸如细胞的细胞溶质、细胞的细胞核、线粒体的内部空间、内质网(ER)等。可通过本领域技术人员已知的任何方法，例如按照其内容通过引用并入本文的Sambrook等人，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,NewYork(2001)教导的，将分子“引入”靶细胞。将分子“引入”细胞的方法包括，例如，但不限于：热激、磷酸钙转染、PEI转染、电穿孔、脂转染、转染试剂、病毒介导的转移等或其组合。在一些实施方案中，引入的核酸可以是，例如，可呈DNA、RNA形式的修饰的核酸。在一些实施方案中，核酸在被转染至细胞之前被脱水。在一些实施方案中，核酸被整合到载体，诸如，例如，表达载体中。每种可能性代表了本发明的独立的实施方案。
如本文所用，术语“表达”是指，期望的终产物分子在靶细胞中的产生。终产物分子可包括例如，RNA分子；肽或蛋白；及类似物；或其组合。
如本文提及，术语“患者”指具有或诊断为患有癌症的受试者。在一些实施方案中，患者符合肿瘤活检的条件。
如本文提及，术语“生物样品”指任何合适的身体来源的样品。样品可包括流体样品诸如全血、外周血单核细胞、白细胞、骨髓。样品可包括各种细胞和组织。样品可包括活检物。样品可包括固定的和/或包埋的组织切片。样品可以是新鲜提取的或冷冻的。在另一个实施方案中，样品是血液样品。在另一个实施方案中，样品是骨髓样品。在另一个实施方案中，用于分离和维持包含来自受试者的血细胞的样品的方法是本领域普通技术人员已知的。在一些实施方案中，包括多核苷酸、多肽、肽、抗体片段和其衍生物的样品可包括体液；细胞制剂的可溶性部分，或细胞生长于其中的培养基；从细胞中分离或提取的染色体、细胞器或膜；溶解的或与基底结合的基因组DNA、RNA或cDNA、多肽、或肽；细胞；组织；组织印记物；指纹、皮肤或毛发；其片段或衍生物。在一些实施方案中，生物样品从肿瘤中获得。
如本文提及，术语“患者来源的标志物”(“PDM”)和“受试者PDM”指从受试者的生物样品中分离的且在功能测定中确认其活性的基因或基因产物。在一些实施方案中，向从生物样品获得的PDM核酸序列添加5'和/或3'调控元件和/或另外的报告物基因。在一些实例中，如本文中所用的PDM包括嵌合核酸序列分子，所述嵌合核酸序列分子包含5'调控元件(启动子)-PDM序列-3'调控元件(IRES)-报告物基因。因此，当这样的核酸分子被引入并表达于靶细胞中时，PDM基因产物(蛋白)和报告物基因产物(蛋白)在该细胞中表达。另外或可选择地，IRES序列可省略，而包含PDM基因产物和报告物基因产物的嵌合蛋白在细胞中表达。由此形成的嵌合蛋白在本文中称为“患者来源的报告物”(“PDR”)或“受试者PDR”。如果通过功能测定发现所测试的PDM发生突变，则其可被认为是驱动突变物。在一些实施方案中，术语“对照PDM”、“野生型PDM”、“相应的PDM”和“相应的野生型PDM”指用作对照的相应于PDM基因的野生型基因(即非突变的、全活性的)。在一些实施方案中，野生型PDM不源自患者的生物样品。使用对照PDM比较受试者PDM与野生型(wt)PDM的活性。
如本文提及，术语“荧光易位报告物”(“FTR”)指嵌合报告物基因及相应的基因产物。嵌合FTR包含连接至预定靶(标志物)基因部分(诸如，例如，细胞信号转导蛋白、激酶、酶等)的报告物基因部分(诸如荧光蛋白)，据此靶(标志物)基因的至少一个属性可(直接或间接地)受所测试的PDM影响。
如本文提及，术语“受试细胞”、“靶细胞”和“测定细胞”可互换使用。这些术语指，被转染了多核酸(poly nucleic acid)分子诸如本文所描述的PDM和/或PDR和/或FTR和/或任何对照基因的测定细胞。在一些实施方案中，受试细胞是真核细胞。在一些实施方案中，受试细胞可以是原代细胞或细胞系。在另一个实施方案中，测定细胞是非癌性细胞。在另一个实施方案中，测定细胞源自细胞系。在另一个实施方案中，测定细胞响应于至少一种癌症分泌的生长因子。在另一个实施方案中，测定细胞经得住转染。在另一个实施方案中，测定细胞经得住瞬时转染。在另一个实施方案中，测定细胞是一个或更多个内源基因的表达已通过任何分子方法被减少或消除的细胞。在另一个实施方案中，测定细胞是Hela细胞。在另一个实施方案中，测定细胞是HEK 293细胞。在另一个实施方案中，测定细胞是PC12细胞。在另一个实施方案中，测定细胞是U2OS细胞。在另一个实施方案中，测定细胞是NCI60细胞系，诸如，A549、EKVX、T47D、HT29。在一些实施方案中，测定细胞是源自患者的细胞。在一些实施方案中，测定细胞是源自癌症患者的细胞。
如本文所用，术语“亚细胞定位”、“亚细胞区域”和“亚细胞区室”是指，细胞的可通过各种方法(诸如，例如，通过可视化方法)与细胞的其他区域区分开的任何限定部分。在一些实例中，亚细胞区域可以是细胞内受限制的区域。在一些实施方案中，亚细胞区域可包括细胞器。亚细胞定位的非限制性实例包括，例如，但不限于：细胞核、核仁、细胞溶质、线粒体、内质网(ER)、叶绿体、膜、树突棘、高尔基体、溶酶体、过氧化物酶体，内体区室、细胞骨架等。在一些实施方案中，术语“亚细胞易位”是指，在各种条件下检测到的报告物基因(诸如，FTR或PDR)的亚细胞定位的改变。
如本文提及，术语“药物”指在治疗状况方面有作用的化合物。术语“治疗疾病”或“治疗状况”指，施用一种或更多种有效改善与疾病相关的症状、有效减轻严重程度或治愈该疾病，或有效预防疾病发生的化合物。
术语“检测”、“诊断”是指检测疾病、症状、紊乱、病理学或正常状况的方法；疾病、症状、紊乱、病理学状况的分类方法；确定疾病、症状、紊乱、病理学状况的严重程度的方法；监测疾病、症状、紊乱、病理学状况进展的方法；预测其恢复的结果和/或前景的方法。术语“诊断”意指鉴定病理学状况的存在或性质。
术语“基底”指，在其上放置核酸分子、构建体、载体和/或测定细胞的固体支持体。基底可包括任何类型的合适的基底，诸如，但不限于：芯片、载玻片、孔、容器、管、小瓶等。在一些实施方案中，基底是芯片。在一些实施方案中，基底是显微镜载玻片。在一些实施方案中，基底是多孔板，诸如6孔板、12孔板、24孔板、48孔板、96孔板、384孔板等。在一些实施方案中，基底被构造成使得其包括矩阵阵列(位点)，由此每个位点(或阵列中的点)被指定并且可识别的。在一些实施方案中，核酸分子在基底上被脱水。在一些实施方案中，核酸分子在存在或不存在转染试剂时在基底上被脱水。
术语“驱动突变物”指可导致或引起疾病，诸如癌症的突变的基因或基因产物。
术语“编码蛋白的多核苷酸”是指编码相应蛋白或其部分的多核苷酸序列或分子。在一些实施方案中，编码蛋白的多核苷酸包含编码相应蛋白的基因或其部分的核苷酸序列。
现参考图1，其图示地展示了根据一些实施方案的用于在患者的生物样品中鉴定患者特定驱动突变物的方法的示例性步骤的框图。如图1中所示，在步骤100处，获得患者的生物样品。所述生物样品可选自，但不限于：血液、血清、活检物、穿刺活检物、支气管肺泡灌洗液、胸膜积液、肿瘤组织、尿液、唾液和肿瘤组织。在一些实施方案中，所述生物样品可以是新鲜的(新鲜的或新鲜冷冻的)，即，未被固定的样品(步骤102)。在一些实施方案中，所述生物样品可通过本领域已知的用于固定生物样品的方法来固定(步骤104)。
如图1中所示，可从新鲜的生物样品(步骤102)提取多种组分，各自通过本领域熟知的适当方法提取。例如，如步骤106所示，可提取组织间液(IF)(细胞外液)并保存以备将来使用。此外，可从新鲜的生物样品提取mRNA(步骤108)。然后通过本领域熟知的方法(诸如，通过使用polydT引物)使用所提取/分离的mRNA产生cDNA文库(步骤110)。特定的PDMcDNA从cDNA文库扩增并通过使用对应预定的PDM的期望基因区域(多核苷酸)的适当引物对来创建。所选择的PDM可以是基于相应的WT PDM或不同疾病状态中的突变PDM(例如，致癌基因)的已知功能/活性/作用选择的。然后，在步骤112处，通过将调控型启动子元件添加至PDM cDNA的5'末端，并任选地添加3'IRES和标签，诸如报告物基因、荧光标签等来创建测定PDM。在一些实施方案中，启动子元件可以是组成型启动子或诱导型启动子。在一些实施方案中，PDM cDNA还可包括包含FTR编码部分的另外的表达盒。
还如图1中所示，在步骤114处，可从固定的生物样品(诸如，福尔马林固定的样品(步骤104)中提取基因组DNA。在步骤116处，提取的DNA可经历特殊的、预定的外显子(已知其在癌症病例中发生突变)的扩增，和随后的连接/融合至包含相应的缺少已被扩增以产生被测PDM的特定外显子的全长基因的表达构建体。
然后，在步骤118中，步骤112和/或步骤116中产生的各种PDM的核酸分子可被放置/点在支撑性基底(诸如，载玻片、孔(例如，微孔板的孔)、芯片等)上的指定位点(位置)。将PDM放置在具有编码嵌合报告物(FTR)的核酸分子的混合物中，其中选择FTR以对应PDM(即，选择的FTR在功能上可(直接或间接地)受到PDM影响)。编码PDM和FTR的核酸分子的混合物还可包含适当的转染试剂以允许这些分子被转导到受试细胞。任选地，PDM+FTR混合物被脱水到基底上。在另一种选择中，PDM和FTR被构建为位于单个核酸分子上，以允许两种蛋白在细胞中独立表达。并行地，准备包括WT PDM和相应的FTR的对照测定。此外，在步骤118中，将足量的所选择的受试细胞连同合适的生长培养基一起添加至基底。可在添加核酸分子之前或之后添加细胞。在一些实施方案中，受试细胞的足够量包括约1-10000个细胞/孔(96多孔板的孔)。在一些实施方案中，受试细胞的足够量包括约1-50000个细胞/孔(24多孔板的孔)。在一些实施方案中，受试细胞的足够量包括约1-100000个细胞/孔(12多孔板的孔)。在一些实施方案中，受试细胞的足够量包括约1-1000个细胞/孔(96多孔板的孔)。在一些实施方案中，受试细胞的足够量包括约1-1000个细胞/孔(384多孔板的孔)。在一些实施方案中，受试细胞选自，但不限于：HeLa细胞、HEK293细胞、U2OS、PC12、NCI60、A549、EKVX、T47D、HT29等。然后将细胞孵育指定的时间段(例如，在约6-60小时的范围内)，以允许FTR的表达和任选地PDM的表达。任选地，在一些实施方案中，在步骤118中，将细胞添加至固体基底(具有合适的生长培养基)持续一段时间(诸如0.5-48小时)，然后在允许分子转染进入细胞的条件下将编码PDM和/或FTR的核酸分子加入细胞。
然后，在步骤120处，在预定的时间段(诸如，4-60小时)之后，细胞生长培养基可更换为新鲜培养基。在一些实施例中，更换的培养基是低血清培养基。然后，在另一孵育期(诸如，在4-16小时的范围内)之后，受控于诱导型启动子的PDM的表达的诱导被启动。诱导型启动子的诱导可被启动，例如，当使用四环素诱导型启动子时，可通过添加四环素来启动，或当使用蜕皮激素诱导型启动子时，可通过添加蜕皮激素来启动，或通过本领域已知的任何其他方法来启动。
任选地，在步骤122处，对于从固定的样品中产生的PDM(步骤116)，在预定的时间段(诸如，4-60小时)之后，细胞生长培养基更换为新鲜培养基。在一些实施方案中，更换的培养基是低血清培养基。然后，在另一温育期(诸如，在4-24小时的范围内)之后，PDM在组成型启动子的控制下表达。
然后，在步骤124处，在允许PDM在受试细胞中表达的另一时间段(诸如，例如，在约4-48小时的范围内)之后，确定FTR的亚细胞定位。确定FTR的亚细胞定位可通过各种方法进行，诸如，使用荧光显微镜成像，使用生物化学方法区分亚细胞区室。在一些示例性实施方案中，细胞被固定，并通过荧光成像确定荧光FTR的定位。对FTR在不同实验条件下的亚细胞定位的分析和比较允许确定关于所测试的PDM是否是有缺陷的(即，发生突变)。例如，在共表达FTR与所测试的PDM的细胞中确定FTR的亚细胞定位(测试测定)。此外，在共表达相同的FTR与WT PDM的细胞中确定该FTR的亚细胞定位(对照测定)。测试测定和对照测定的FTR的亚细胞定位之间的差异指示关于所测试的PDM的功能活性。因此，例如，在步骤126中，如果FTR在测试测定中被确定为处于与对照测定中相同的亚细胞定位，则所测试的PDM未发生突变。例如，在步骤128中，如果FTR在测试测定中被确定为处于与对照测定中不同的亚细胞定位，则所测试的PDM发生突变，这指示该PDM为驱动突变物。
现参考图2，其是根据一些实施方案应用本发明的方法鉴定示例性细胞信号转导通路中的驱动突变物的示意图(未按比例)。如图2中所示，为MAP激酶信号转导通路的成员(EGFR、HER2、RAS、RAF、和MEK)的各种PDM按上文描述的，由患者的生物样品制备。该示例性测定中的FTR是包含融合至GFP报告基因(作为报告物基因部分)的MAPK蛋白(ERK1或ERK2)作为靶(标志物)基因部分的嵌合报告物。PDM和FTR各自如本文以上描述的处理，并在不同实验条件下确定FTR的定位。如左图(200)所示，所测试的PDM无一发生突变，因为检测到的FTR的定位与WT条件中的一样(即，FTR位于细胞质)-因此，所测试的PDM无一发生突变。如右图(202)所示，所测试的PDM中的至少一个发生突变，因为FTR的亚细胞定位与WT条件中不同(即，在该实例中，其在细胞核中)。由于所测试的PDM各自与FTR在不同的受试细胞中被单独地测试，鉴定特定的突变的PDM是可实现的。
因此，根据一些实施方案，提供了用于鉴定癌症患者的生物样品中异常的信号转导通路的方法，和/或用于鉴定一种或更多种患者特定驱动突变物的方法，所述方法包括以下步骤中的一个或更多个(以任何所选的顺序)：
a)从所述癌症患者的生物样品，诸如从肿瘤的活检物获得多种mRNA的样品；
b)通过本领域已知的方法，由多种肿瘤mRNA产生cDNA文库；
c)使用与编码已知蛋白的多核苷酸(基因或基因部分)互补的一组引物扩增所述cDNA文库中的单独的cDNA样品，其中这些蛋白参与多种细胞信号转导通路；
d)形成扩增的cDNA的单独的表达构建体，其中所述cDNA被可操作地连接至启动子以产生受试的患者来源的标志物(受试PDM)；
e)形成携带来自肿瘤的扩增的cDNA(受试PDM)的第一组表达构建体及平行的相应(相匹配)的野生型蛋白(WT PDM)的第二组表达构建体的可寻址阵列；
f)针对阵列中的每个位点，加入用于共转染与特定报告物基因(FTR)连接的标志物基因的表达载体，其中所述标志物基因受相应的PDM直接或间接地影响；
g)任选地在支撑性固体基底上干燥cDNA构建体；
h)在促使DNA构建体转染进入测定细胞的条件下，将活的测定细胞添加至每个位点；
i)针对阵列中的每个位点，允许构建体和表达载体在转染的细胞中表达，以获得第一组来自肿瘤的cDNA和特定报告物基因的基因产物；
j)比较表达来自肿瘤的cDNA与表达其相应的野生型表达的cDNA的细胞中的报告物基因的至少一个属性；
其中，表达肿瘤来源的cDNA与表达相应的野生型cDNA的细胞之间的不同结果，用于鉴定所述肿瘤样品中作为候选的异常信号转导蛋白的cDNA。
在一些实施方案中，PDM的表达盒和FTR的表达盒位于一个表达构建体上(即，在一个分子上)。在此类实施方案中，PDM表达盒和FTR表达盒可具有相同、相似或不同的启动子(即，PDM和FTR的表达可由相同或不同的启动子来控制)。在此类实施方案中，上文的步骤d)和f)被组合成一个步骤(替代性步骤d)：形成扩增的cDNA的单独的表达构建体，其中cDNA被可操作地连接至启动子，以产生受试的患者来源的标志物(受试PDM)；其中所述表达构建体还包括特定报告物基因(FTR)。在一些实施方案中，FTR被连接至启动子(其可与PDM的启动子相同或不同)。在另外的实施方案中，FTR包含与报告物基因部分连接的靶基因部分。
在一些实施方案中，步骤g)在步骤e)和/或f)之前，在这些个例中，测定细胞在加入表达盒之前被加至每个位点。
因此，根据一些实施方案，提供了在癌症患者的生物样品中确定一种或更多种患者特定驱动突变物的方法，包括以下步骤：
a)从所述生物样品获得多种mRNA；
b)由所述多种mRNA产生cDNA文库；
c)使用与编码已知的信号转导蛋白的多核苷酸互补的一组引物扩增所述cDNA文库中的特定cDNA；
d)形成扩增的cDNA的单独的表达构建体，其中所述cDNA被可操作地连接至启动子；
e)形成携带来自肿瘤的扩增的cDNA的第一组表达构建体及相应的野生型cDNA的第二组表达构建体的可寻址阵列；
从而提供了在编码信号转导蛋白的多核苷酸中携带候选突变的表达构建体的可寻址阵列，所述阵列适合于在所述癌症患者的生物样品中鉴定患者特定驱动突变物。
在一些实施方案中，所述方法还包括步骤(f)：对于阵列中的每个位点，加入编码荧光易位报告物(FTR)基因的表达载体，所述FTR基因包含连接至特定报告物基因部分的靶基因部分。
在另外的实施方案中，所述方法还包括以下步骤：(g)在促使DNA构建体和载体转染进入测定细胞的条件下，将活的测定细胞加至每个位点；以及(h)比较表达来自肿瘤的cDNA与表达其相应的野生型表达的cDNA的细胞中表达的FTR的至少一个属性；其中，表达源自癌症患者的生物样品的cDNA与表达相应的野生型cDNA的测定细胞之间的不同结果，用于鉴定所述生物样品中作为候选的患者特定驱动突变物的cDNA。
根据一些实施方案，提供了在癌症患者的生物样品中鉴定一种或更多种患者特定驱动突变物的方法，包括以下步骤：
a)从所述生物样品获得多种mRNA；
b)由所述多种mRNA产生cDNA文库；
c)使用与编码已知的信号转导蛋白的多核苷酸互补的一组引物扩增cDNA文库中的特定cDNA；
d)形成扩增的cDNA的单独的表达构建体，其中cDNA被可操作地连接至启动子；
e)在可寻址阵列中，将活的测定细胞加至基底上；
f)将携带来自肿瘤的扩增的cDNA的第一组表达构建体和携带相应的野生型cDNA的第二组表达构建体加至测定细胞；其中在促使表达构建体转染进入测定细胞的条件下，将每种表达构建体加至位于不同的可寻址位点处的测定细胞；
从而产生包含在编码信号转导蛋白的多核苷酸中携带候选突变的表达构建体的测定细胞的阵列，所述阵列用于在所述癌症患者的生物样品中鉴定患者特定驱动突变物。
在一些实施方案中，所述方法还包括针对阵列中的每个位点，将荧光易位报告物(FTR)基因的表达载体加至测定细胞的步骤，所述FTR基因包括连接至特定报告物基因部分的靶基因部分。
在一些实施方案中，所述方法还包括，比较表达来自肿瘤的cDNA与表达相应的野生型表达的cDNA的细胞中的FTR的至少一个属性；其中，表达生物样品来源的cDNA与表达相应的野生型cDNA的测定细胞之间的不同的结果，用于鉴定所述生物样品中作为候选的患者特定驱动突变物的cDNA。
在一些实施方案中，生物样品选自肿瘤细胞、肿瘤活检物、肿瘤组织和体液。
根据一些实施方案，提供了用于在癌症患者的生物样品中鉴定异常信号转导通路的方法，和/或用于鉴定患者特定驱动突变物的方法，所述方法包括以下步骤中的一个或更多个(以任何适当的顺序)：
a)从所述癌症患者的生物样品，诸如从肿瘤的活检物获得多种mRNA样品；
b)通过本领域已知的方法，由多种肿瘤mRNA产生cDNA文库；
c)使用与编码已知蛋白的多核苷酸互补的一组引物扩增所述cDNA文库的单独的cDNA样品，其中所述蛋白参与多种细胞信号转导通路；
d)形成扩增的cDNA的单独的表达构建体，其中所述cDNA被可操作地连接至启动子和报告物基因，以产生嵌合的受试患者来源的报告物(受试PDR)；
e)形成携带来自肿瘤的扩增的cDNA(受试PDR)的第一组表达构建体及平行的cDNA(wt PDR)的第二组表达构建体的可寻址阵列；
f)任选地在支撑性固体基底上干燥cDNA构建体；
g)在促使DNA构建体转染进入测定细胞的条件下，将活的测定细胞加至每个位点；
h)允许构建体和表达载体在转染的细胞中表达，以获得第一组来自肿瘤的cDNA的基因产物；
i)比较表达来自肿瘤的cDNA与表达其相应的野生型表达的cDNA的细胞中的嵌合报告物基因的至少一个属性；
其中，表达肿瘤来源的cDNA与表达相应的野生型cDNA的细胞之间的不同结果，用于鉴定所述肿瘤中作为候选的异常信号转导蛋白的cDNA。
根据一些实施方案，提供了确定肿瘤细胞中的异常信号转导通路的方法，包括以下的一个或更多个步骤(以任何适当的顺序)：
a)从可在体外或体内获得，例如，从肿瘤活检物获得的肿瘤细胞获得mRNA样品；
b)由获得的多种mRNA产生cDNA文库；
c)使用与已知的信号转导蛋白互补的一组引物扩增cDNA文库中的单独的cDNA样品；
d)形成扩增的cDNA的单独的表达构建体，其中所述cDNA被可操作地连接至启动子；
e)形成携带来自肿瘤的扩增的cDNA的第一组表达构建体及平行的相应的野生型cDNA的第二组表达构建体的可寻址阵列；
f)对于阵列中的每个位点，加入用于共转染包含连接至报告物基因部分的靶基因部分的荧光易位报告物(FTR)嵌合基因的表达载体；
g)在促进DNA构建体转染进入测定细胞的条件下，将活的测定细胞加至每个位点；
h)比较表达来自肿瘤的cDNA与表达其相应的野生型表达的cDNA的细胞中表达的FTR的至少一个属性；
其中，表达肿瘤来源的cDNA与表达相应的野生型cDNA的细胞之间的不同结果，用于鉴定所述肿瘤中作为作为候选的异常信号转导蛋白的cDNA。
在一些实施方案中，PDM的表达盒和FTR的表达盒位于一个表达构建体上(即，在一个分子上)。在此类实施方案中，PDM表达盒和FTR表达盒可具有相同、相似或不同的启动子(即，PDM和FTR的表达可由相同或不同的启动子来控制)。在一些实施方案中，步骤g)可在步骤e)和/或f)之前，在这些个例中，测定细胞在加入表达构建体和/或表达载体之前被加至每个位点。
因此，根据一些实施方案，提供了鉴定肿瘤细胞中的异常信号转导通路的方法，包括以下的一个或更多个步骤(以任何适当的顺序)：
a)从可在体外或体内获得，例如，从肿瘤活检物获得的肿瘤细胞获得mRNA样品；
b)由获得的多种mRNA产生cDNA文库；
c)使用与编码已知的信号转导蛋白的多核苷酸互补的一组引物扩增所述cDNA文库中的单独的cDNA样品；
d)形成扩增的cDNA的单独的表达构建体，其中所述cDNA可操作地连接至第一启动子；所述表达构建体还包含含有第二启动子并编码荧光易位报告物(FTR)嵌合基因的表达盒，所述FTR包含连接至报告物基因部分的靶基因部分；
e)形成携带来自肿瘤的扩增的cDNA和FTR盒的第一组表达构建体及平行的相应的野生型cDNA和FTR盒的第二组表达构建体的可寻址阵列；
f)在促使DNA构建体转染进入测定细胞的条件下，将活的测定细胞加至每个位点；以及
g)比较表达来自肿瘤的cDNA与表达其相应的野生型表达cDNA的细胞中表达的FTR的至少一个属性；
其中，表达肿瘤来源的cDNA与表达相应的野生型cDNA的细胞之间的不同结果，用于确定所述肿瘤细胞中作为候选的异常信号转导蛋白的cDNA。
在一些实施方案中，第一和第二启动子是相同或不同的。
根据一些实施方案，提供了鉴定肿瘤细胞中的异常信号转导通路的方法，包括以下步骤：
a)从肿瘤细胞获得多种mRNA；
b)由多种mRNA产生cDNA文库；
c)使用与编码已知的信号转导蛋白的多核苷酸互补的一组引物扩增所述cDNA文库中的特定cDNA；
d)形成步骤(c)中扩增的cDNA的单独的表达构建体，其中所述cDNA被可操作地连接至启动子；
e)形成携带来自肿瘤的扩增的cDNA的第一组表达构建体及相应的野生型cDNA的第二组表达构建体的可寻址阵列；
从而提供编码信号转导蛋白的多核苷酸中携带候选突变的表达构建体的可寻址阵列，所述可寻址阵列适合于鉴定所述肿瘤细胞中异常的信号转导通路。
在一些实施方案中，所述方法还包括步骤(f)：针对阵列中的每个位点，加入编码荧光易位报告物(FTR)基因的表达载体，所述荧光易位报告物(FTR)基因包含连接至报告物基因部分的靶基因部分。
在另外的实施方案中，所述方法还包括以下步骤：g)在促使多种DNA构建体共转染进入测定细胞的条件下，将活的测定细胞加至每个位点；以及h)比较表达来自肿瘤的cDNA与表达其相应的野生型表达的cDNA的测定细胞中表达的FTR的至少一个属性；其中，表达源自肿瘤细胞的cDNA与表达相应的野生型cDNA的测定细胞之间的不同结果，用于鉴定所述肿瘤细胞中作为候选的异常信号转导蛋白的cDNA。
根据一些实施方案，患者是患有癌症的患者。在一些实施方案中，癌症包括如下这些癌症：癌、肉瘤、骨髓瘤、白血病、淋巴瘤及混合型肿瘤。特定类别的肿瘤包括淋巴组织增生性紊乱、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、宫颈癌、子宫内膜癌、骨癌、肝癌、胃癌、结肠癌、肺癌、胰腺癌、甲状腺癌、头颈癌、中枢神经系统癌、周围神经系统癌、皮肤癌、肾癌，以及上述所有的转移病灶。适合治疗的特定类型的肿瘤包括：肝细胞癌、肝细胞瘤(hepatoma)、肝母细胞瘤、横纹肌肉瘤、食管癌、甲状腺癌、成神经节细胞瘤(ganglioblastoma)、纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨原性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、尤因氏瘤、平滑肌肉瘤、rhabdotheliosarcoma、浸润性导管癌、乳头状腺癌、黑色素瘤、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌(高度分化、中度分化、低度分化或未分化)、肾细胞癌、肾上腺样瘤、肾上腺样腺癌(hypernephroid adenocarcinoma)、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎癌、肾母细胞瘤(Wilms’tumor)、睾丸肿瘤、包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌和大细胞肺癌的肺癌、膀胱癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、视网膜母细胞瘤、神经母细胞瘤、结肠癌、直肠癌、包括所有类型的白血病和淋巴瘤的造血系统恶性肿瘤，包括：急性骨髓性白血病、急性髓细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、慢性骨髓性白血病、慢性淋巴细胞白血病、肥大细胞白血病、多发性骨髓瘤、髓性淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤。
根据某些实施方案，癌症选自前列腺癌、乳腺癌、皮肤癌、结肠癌、肺癌、胰腺癌、淋巴瘤、骨髓瘤、白血病、头颈癌、肾癌、卵巢癌、骨癌、肝癌或甲状腺癌。
在一些实施方案中，患者已被诊断为癌症阳性。在一些实施方案中，患者被施以具有已知或未知的治疗效果的靶向疗法的治疗方案。在一些实施方案中，患者有可利用的患者肿瘤分子学特征谱(IHC、FISH、PCR及测序)。在一些实施方案中，患者有可利用的病历(patient history)以及治疗结果(患者反应、耐受性、复发率和存活率)。
在一些实施方案中，生物样品选自：血液、血清、活检物、组织、穿刺活检物、支气管肺泡灌洗液、胸膜积液、尿液、唾液和肿瘤。在一些实施方案中，生物样品可以是新鲜分离的。在一些实施方案中，生物样品可以是冷冻的。在一些实施方案中，生物样品可被固定。
在一些实施方案中，在测定细胞中表达的每种蛋白(诸如，所测试的PDM、FTR、WTPDM、PDR)是可区别性地鉴定的。在另一个实施方案中，每种蛋白可直接或间接地通过不同的标志物或不同的报告物或不同的荧光蛋白鉴定。在另一个实施方案中，每种嵌合蛋白(诸如，FTR或PDR)包含不同的报告物部分。在另一个实施方案中，不同的蛋白质可都有荧光蛋白或报告物。在另一个实施方案中，本发明的每种嵌合蛋白包括不同的报告物部分。
在另一个实施方案中，PDM与癌症的生长相关。在另一个实施方案中，PDM是致癌基因或肿瘤抑制因子。在另一个实施方案中，PDM是细胞骨架调节因子。在另一个实施方案中，PDM在肿瘤生长和转移方面起作用。在另一个实施方案中，PDM是囊泡运输蛋白。在另一个实施方案中，PDM是囊泡拴系蛋白(vesicle tethering protein)。在另一个实施方案中，PDM是细胞粘附蛋白。在另一个实施方案中，PDM是核完整性蛋白(nuclear integrityprotein)。在另一个实施方案中，PDM是生长因子受体。在另一个实施方案中，PDM是细胞因子受体。在另一个实施方案中，PDM是细胞附着蛋白。在另一个实施方案中，PDM参与肿瘤炎症。在另一个实施方案中，PDM是细胞极性蛋白。在另一个实施方案中，PDM是信号转导蛋白。在另一个实施方案中，PDM是衔接蛋白。在另一个实施方案中，PDM是蛋白激酶。在另一个实施方案中，PDM是交换因子。在另一个实施方案中，PDM是细胞骨架蛋白。在一些示例性实施方案中，PDM选自包括以下的组或由以下组成的组：AKT1、AKT2、AKT3、ALK、BRAF、BRCA1、BRCA2、CBL、CTNNB1、EGFR、ERBB2、ERBB3、FGFR1、FGFR2、GNA11、GNAQ、HRAS、JAK2、KIT、KRAS、MET、NRAS、PDGFRA、PIK3CA、PTEN、RAF1、RET、ROS1、SMO、TP53、SMAD2、SMAD3、SMAD4、STAT1、STAT3、STAT5B、TGFBR2、FBXW7、MYC、LKB1、SMARCA4、TCF7L2、MAP3K1、ESR1、AR、PR、DDR2、MEK1或其任何组合。每种可能性是独立的实施方案。
在另一个实施方案中，PDM与标志物(标签)诸如荧光蛋白(诸如mCherry、mApple、GFP、Cherry、DsRed、RFP、EGFP、BFP、YFP、AmCyan1、ZsGreen1、ZsYellow1、DsRed2、AsRed2、和HcRed1)连接地表达。在一些实施方案中，标志物包括具有Cys-Cys-Pro-Gly-Cys-Cys基序的标志物(SEQ ID NO:47)，并在成像之前，可向测试性测定添加FlAsH-EDT2或ReAsH-EDT2，以在结合包含Cys-Cys-Pro-Gly-Cys-Cys基序的重组蛋白后发出荧光。在一些实施方案中，包含Cys-Cys-Pro-Gly-Cys-Cys的蛋白可以是PDM、单独的荧光蛋白、或与可进一步用于标记亚细胞性细胞器，诸如，例如，质膜或细胞核的亚细胞标志物融合的荧光蛋白。在一些实施方案中，与PDM连接地表达的标志物(标签)用作验证测定细胞中PDM的转染和表达的标志物。
在另一个实施方案中，PDR是与标志物(标签)诸如荧光蛋白(诸如mCherry、mApple、GFP、Cherry、DsRed、RFP、EGFP、BFP、YFP、AmCyan1、ZsGreen1、ZsYellow1、DsRed2、AsRed2、和HcRed1)融合的PDM。在一些实施方案中，PDR是与包含Cys-Cys-Pro-Gly-Cys-Cys(SEQ ID NO:47)基序的标志物(标签)融合的PDM。
在一些实施方案中，FTR是融合(嵌合)蛋白，其包含报告物部分，诸如荧光蛋白(诸如mCherry、MAPPLE、GFP、樱桃红、DsRed、RFP、EGFP、BFP、YFP、AmCyan1、ZsGreen1、ZsYellow1、DsRed2、AsRed2、和HcRed1)或Cys-Cys-Pro-Gly-Cys-Cys基序，和选自但不限于以下的靶蛋白部分：与癌症生长相关的蛋白、致癌基因产物、细胞骨架调节因子、囊泡运输蛋白、囊泡拴系蛋白、细胞粘附蛋白、核完整性蛋白、生长因子受体、细胞附着蛋白、细胞信号转导蛋白、参与肿瘤炎症蛋白、细胞极性蛋白、生长因子信号转导蛋白、衔接蛋白(adaptor)、细胞骨架蛋白等。每种可能性是独立的实施方案。
在一些示例性实施方案中，FTR是融合蛋白，其包含报诸如荧光蛋白的告物部分和选自但不限于包含以下的组或由以下组成的组的靶(标志物)蛋白部分：AKT1、AKT2、mTOR、RelA、NFKB1、NFKB2、ERK1、ERK2、ERF、STAT1、STAT3、STAT5、CTNNB1、JNK1α、JNK1β、JNK2α、JNK2β、ERK5、P38α、P38β、AMPK、STK11、SMARCA4、TP53、ESR1、GATA3、CDK2、SMAD1、NOTCH1、MYB、MYC、SMAD2、SMAD3、SMAD4、PRKACA、NLK或其任何组合。每种可能性是独立的实施方案。
在一些示例性实施方案中，PDM可以是KRaS且FTR的靶部分可选自：ERK2、ERF、JNK和AKT1。每种可能性独立的实施方案。
在一些示例性实施方案中，PDM可以是AKT2或AKT3且FTR的靶部分可选自：AKT1和RelA。每种可能性是独立的实施方案。
在一些示例性实施方案中，PDM可以是FGFR1且FTR的靶部分可选自：ERK2、JNK(诸如JNK1α1)、p38b、AKT1和STAT3。每种可能性是独立的实施方案。
在一些示例性实施方案中，PDM可以是BRaf且FTR的靶部分可选自：ERK2和ERF。每种可能性是独立的实施方案。
在一些示例性实施方案中，PDM可以是EGFR且FTR的靶部分可选自：ERK2、RelA、AKT1、p38b、JNK1a1。每种可能性是独立的实施方案。
在另一个实施方案中，本发明包括这样的测定细胞，其中，每种测定细胞都表达PDM和/或FTR。在另一个实施方案中，本发明包括这样的测定细胞，其中，每种测定细胞表达不同的PDM和/或FTR和/或PDR。在另一个实施方案中，本发明包括这样的测定细胞，其中，每种测定细胞转染了不同的DNA片段，其中各DNA片段编码不同的PDM和/或FTR。在一些实施方案中，测定细胞被置于/平铺/种植在具有指定位点(位置)的固体基底上。在一些实施方案中，针对每个位点的测定细胞是相同的。在一些实施方案中，针对每个位点的测定细胞是不相同的。在一些实施方案中，测定细胞被添加至每个位点的培养基中。在一些实施方案中，细胞被加至已具有在其上脱水的DNA构建体的固体基底。在一些实施方案中，先将细胞平铺在固体基底上并在预定的时间段之后转染。
在另一个实施方案中，本发明包括这样的测定细胞，其中，每种测定细胞转染了不同的DNA片段，其中各DNA片段编码不同的PDM和/或FTR和/或PDR。
在一些实施方案中，使用蛋白测定、结合测定、免疫测定、显微镜成像或本领域技术人员已知的任何其他合适的测定进行FTR定位的确定。
在一些实施方案中，本发明还包括检测测定细胞的形态变化的步骤。在一些实施方案中，本发明的方法不要求对任何患者的DNA测序。
根据一些实施方案，提供了用于诊断患者的癌症的试剂盒。在一些实施方案中，提供了用于鉴定肿瘤细胞中异常的细胞信号转导通路的试剂盒。在一些实施方案中，提供了用于确定患者特定驱动突变物的试剂盒。
在一些实施方案中，本发明提供了通过鉴定患者特定驱动突变物诊断受试者的癌症或癌症分子谱(molecular cancer profile)的试剂盒。根据一些实施方案，试剂盒可用于预测治疗成功率或鉴定参与癌症的旁分泌或自分泌因子。在另一个实施方案中，试剂盒包括至少一个检测报告物基因的装置。在另一个实施方案中，试剂盒包括用于检测标志物的装置。在一些实施方案中，试剂盒包含以下的一个或更多个：用于容纳核酸分子和/或受试细胞的基底或容器、用于进行检测/易位测定的说明书、受试细胞、转染试剂或其任何组合。
如果期望的话，本发明的诊断组合物可以成品(article of manufacture)存在，例如，可包含诊断试剂和使用说明书的试剂盒，诸如FDA批准的试剂盒。所述试剂盒还适于在容器上以规范药物生产、应用或销售的政府机构规定的形式附上公告，所述公告反映了组合物的形式或人或兽医用途被该机构批准。
在另一个实施方案中，本发明的方法和试剂盒增加癌症患者的存活率。本发明的测定非常适于试剂盒的制备。此类试剂盒可包含承载装置，所述承载装置被分区以在紧密布置的限定空间容纳一个或更多个容器装置，诸如小瓶、管、板、载玻片等，每个容器装置包含细胞测定的单独元件。
在一个实施方案中，提供了用于诊断受试者中的癌症的包括一组测定细胞的试剂盒，每种测定细胞包括本发明的不同蛋白，该试剂盒包括具有编码PDM(源自患者的生物样品)和/或FTR和/或FTR的核酸分子的基底以及用于反应测量和/或检测易位事件的打印的说明书，其中该基底还能够容纳测定细胞和从疑似患有癌症的人受试者分离的生物样品。
在一些实施方案中，转染的测定细胞在允许重组蛋白或标记的蛋白的表达的有效条件下培养。在一个实施方案中，本发明的标记的蛋白或标志物蛋白(例如PDM、FTR)是重组蛋白或嵌合体。在一些实施方案中，有效的培养条件包括，但不限于，允许蛋白表达的有效的培养基、生物反应器、温度、CO2、pH和氧气条件。在一个实施方案中，有效的培养基是指，细胞在其中被培养以产生本发明的重组多肽的任何培养基。在一些实施方案中，培养基通常包括具有可吸收的碳、氮和磷酸盐来源，以及适当的盐、矿物质、金属和其他营养物，诸如维生素的水溶液。在一些实施方案中，本发明的细胞可在常规发酵生物反应器、摇瓶、试管、微量滴定皿和培养皿中培养。在一些实施方案中，在重组细胞适合的温度、pH和氧含量下进行培养。在一些实施方案中，培养条件在本领域的普通技术人员的专业知识内。
在一些实施方案中，本发明利用再分配技术来监测并记录蛋白易位事件。在另一个实施方案中，蛋白靶标被标记了绿色荧光蛋白或其他荧光蛋白，并产生被稳定转染或瞬时转染的细胞系。在另一个实施方案中，本发明的测定使用高通量、基于光学显微镜的仪器读取。
在另一个实施方案中，本发明的蛋白易位测定是高含量、高通量测定，主要用于铅系的性能分析、源自作为细胞培养基成分的生物样品的PDM的初步筛选。在另一个实施方案中，本发明的蛋白易位测定包括使用Spinning Disc technology或任何其他基于显微术的技术的活细胞成像。
在一些实施方案中，位置定位技术(toponomic localization technique)用于跟踪并记录蛋白易位事件。在一些实施方案中，对本发明的蛋白利用了免疫荧光手段。在一些实施方案中，本发明的蛋白标有荧光标志物。在一些实施方案中，对共聚焦显微镜图像进行评估和处理。在另一个实施方案中，标准数据集包括每种生物条件每种细胞的2-40个图像。在另一个实施方案中，进行自动图像分析。在另一个实施方案中，自动化图像分析包括细胞区室或结构识别。
在另一个实施方案中，以不同的维度捕捉空间关系。在另一个实施方案中，进行蛋白标志物在有界区域中的浓度的定量评估。在另一个实施方案中，基于测量和评价像素点之间的距离的各向同性分布，本发明还提供了蛋白共定位研究。在另一个实施方案中，本发明提供了二维分析(区域)。在另一个实施方案中，本发明还提供了0维分析(点)。在另一个实施方案中，本发明提供了1维建模。
术语“包含(comprises)”、“包含(comprising)”、“包括(includes)”、“包括(including)”、“具有(having)”和其同源词是指“包括但不限于”。术语“包含(comprises)”和“包含(comprising)”在一些实施方案中分别局限于“由…组成(consists)”和“由…组成(consisting)”。术语“由...组成(consisting of)意指“包括并局限于”。术语“基本上由......组成”意指组合物、方法或结构可包括另外的成分、步骤和/或部分，但是只在这些另外的成分、步骤和/或部分实质上不改变所要求保护的组合物、方法或结构的基本特征和新特征的情况下。
如本文使用的，除非上下文另有明确指示，单数形式“一个(a)”，“一个(an)”和“该(the)”包括复数指代。例如，术语“一种化合物(a compound)”或“至少一种化合物”可包括多种化合物，包括其混合物。
如本文所用，述及本文提到的数值的术语“约”应理解为所提到的数值+/-10％。
如本文使用的术语“方法”是指，用于完成给定任务的方式、手段、技术和程序，包括，但不限于，已知的方式、手段、技术和程序，或化学、药理学、生物学、生物化学和医学领域的从业者易于从已知的方式、手段、技术和程序开发的那些方式、手段、技术和程序。
在研究并非意在限制的以下实施例之后，本发明的另外的目的、优势、及新特征对本领域普通技术人员将变得明显。此外，如上文描写的以及以下权利要求部分要求保护的本发明的多个实施方案和多个方面中的每一个在以下实施例中均找到实验性支持。
以下实施例是为了更充分地说明本发明的一些实施方案而呈现。然而，其不应以任何方式被解释为限制本发明的宽范围。
实施例
总体上，本文使用的命名法和本发明中利用的实验室程序包括分子学、生物化学、微生物学和重组DNA技术。这些技术已在文献中被充分描述。参见，例如，"MolecularCloning:A laboratory Manual"Sambrook等人，(1989)；"Current Protocols inMolecular Biology"Volumes I-III Ausubel,R.M.,编著(1994)；Ausubel等人，"CurrentProtocols in Molecular Biology",John Wiley和Sons,Baltimore,Maryland(1989)；Perbal,"A Practical Guide to Molecular Cloning",John Wiley&Sons,New York(1988)；Watson等人，"Recombinant DNA",Scientific American Books,New York；Birren等人(编著)，"Genome Analysis:A Laboratory Manual Series",第1-4卷,Cold SpringHarbor Laboratory Press,New York(1998)；如美国专利第4,666,828；4,683,202；4,801,531；5,192,659和5,272,057号中所列的方法学；"Cell Biology:A LaboratoryHandbook",第I-III卷Cellis,J.E.,编著(1994)；"Culture of Animal Cells-A Manualof Basic Technique"by Freshney,Wiley-Liss,N.Y.(1994),第三版；"CurrentProtocols in Immunology"第I-III卷Coligan J.E.,编著(1994)；Stites等人(编著),"Basic and Clinical Immunology"(第8版),Appleton&Lange,Norwalk,CT(1994)；Mishell和Shiigi(编著),"Selected Methods in Cellular Immunology",W.H.Freeman和Co.,NewYork(1980)；可用的免疫测定被广泛描述于专利和科学文献中，参见，例如，美国专利第3,791,932；3,839,153；3,850,752；3,850,578；3,853,987；3,867,517；3,879,262；3,901,654；3,935,074；3,984,533；3,996,345；4,034,074；4,098,876；4,879,219；5,011,771和5,281,521号；"Oligonucleotide Synthesis"Gait,M.J.,编著(1984)；“Nucleic AcidHybridization"Hames,B.D.,和Higgins S.J.,编著(1985)；"Transcription andTranslation"Hames,B.D.,和Higgins S.J.,编著(1984)；"Animal Cell Culture"Freshney,R.I.,编著(1986)；"Immobilized Cells and Enzymes"IRL Press,(1986)；"APractical Guide to Molecular Cloning"Perbal,B.,(1984)以及"Methods inEnzymology"第1-317卷,Academic Press；"PCR Protocols：A Guide To Methods AndApplications",Academic Press,San Diego,CA (1990)；Marshak等人，"Strategies forProtein Purification and Characterization-A Laboratory Course Manual"CSHLPress(1996)；其全部通过引用并入本文。本文件遍布全文提供了其他常规的参考文献。
生物样品收集
收集福尔马林固定的石蜡包埋(FFPE)的肿瘤活检物以及冷冻的新鲜肿瘤部分或活检物。FFPE样品用于提取已知参与癌症进展的特定的基因组外显子(诸如cKit外显子11)。新鲜的(新鲜的或新鲜冷冻的)活检物用于mRNA提取和组织间液提取。
因此，回顾性和前瞻性样品均被采集。回顾性研究基于来自已知治疗功效的病例的冰冻肿瘤切片。
前瞻性研究基于在手术/活检/支气管镜检后立即收集的新鲜或速冻的样品/活检组织/肿瘤切片。这使得扩增所有相关的测试蛋白(诸如癌基因或指示物)成为可能。其他体液诸如血浆样品(使用Heparane硫酸盐凝胶管)、血液样品、腹膜积液、胸膜积液和通过支气管镜检获得的肺液是非常重要的，因为他们积累了许多肿瘤分泌物并且也被收集。
在肿瘤切除术(手术、活检、支气管镜检)后，将肿瘤组织放置于冰上的无菌袋或管中(未用福尔马林处理)。病理学从业者将肿瘤分割(考虑活的肿瘤部分的尺寸和位置)成需要固定的部分和最能代表肿瘤的部分，这些部分在冰上被新鲜递送以便进一步分析。病理学从业者找出富含恶性细胞且具有减少的量的基质或其他非恶性组织的组织部分或区域，并将其切下。如果组织的净重超过1克，则将组织进一步切成若干片，并放置在纤维素柱上并以100g离心10min(预期从每克组织得到100±50微升IF)。然后将组织转移至另一个15/50ml管并冷冻于-80℃冰柜。称为间质液(IF)的离出液被冷冻在原管中。
穿刺活检-将组织放置于15圆锥管中并冷冻于-80冰柜。
经由支气管镜检的活检–将组织放置于15圆锥管中并冷冻于-80冰柜。
支气管肺泡灌洗–将提取液分在2个50ml falcon管中并离心(3000RPM，15min)。将液体转移进新管中，并将液体和细胞(原管中)均冷冻在80℃下。
胸膜积液-离心胸膜积液(3000RPM,15min.)，将液体转移进新管，并将液体和细胞(原管中)均冷冻于-80℃下。
冰冻切片-如果可能的话，将肿瘤冻结在切片机(microtome)中并切片。
从福尔马林固定包埋的肿瘤活检物提取基因组DNA
为确定在特定外显子中存在已知突变的基因，诸如外显子11，EGFR外显子19、20，HER2外显子20中的cKit突变，使用从FFPE组织提取的DNA。为此目的，使用标准的DNA提取试剂盒和操作说明(例如，Qiagen QIAamp DNA FFPE Tissue，目录号56404)。
扩增外显子并插入全长基因
为表达期望的外显子，从基因组DNA进行扩增并将外显子插入缺乏该外显子的全长基因中。为此目的，在表达备用载体中制备缺乏该外显子的全长基因，然后使用常规分子生物学技术将该外显子整合到构建体中。
新鲜的活检物：从冷冻的活检物提取所需量的组织
一部分活检物用于RNA纯化和间质液提取。将剩余的生物材料储存起来以备将来参考或其他分析(免疫组织化学(IHC)、FISH等)。
组织间液(IF)的提取
将按照下文详述地提取的组织液(IF)储存起来供稍后用作被测试的细胞的激动剂以检测肿瘤细胞分泌并可赋予抗癌药物抗性的物质的存在。
IF提取通过在4℃下，在具有玻璃纤维过滤器的柱中以1500g离心组织样品7min进行。然后将来自柱底部的液体收集到新管中。
mRNA的提取
从样品提取的mRNA是扩增患者来源的标志物(PDM)，即，已知为致癌基因并可能携带为细胞提致癌性质的突变的基因(具有携带驱动突变物的可能性的基因)所需要的。被测试的示例性基因包括：AKT1、AKT2、AKT3、ALK、BRAF、BRCA1、BRCA2、CBL、CTNNB1、EGFR、ERBB2、ERBB3、FGFR1、FGFR2、GNA11、GNAQ、HRAS、JAK2、KIT、KRAS、MET、NRAS、PDGFRA、PIK3CA、PTEN、RAF1、RET、ROS1、SMO、TP53、SMAD2、SMAD3、SMAD4、STAT1、STAT3、STAT5B、TGFBR2、FBXW7、MYC、LKB1、SMARCA4、TCF7L2、MAP3K1、AR、PR、ESR1、DDR2、MEK1、和MEK2。
RNA提取通过包括胍盐-氯化铯法(Guanidium-Cesium Chlroride Method)、胍酸-酚法(Guanidium Acid-Phenol Method)的本领域已知的方法，和在离液盐(chaotropicsalt)的存在下结合核酸的玻璃纤维过滤器进行，和/或通过使用商购可得的试剂盒(诸如Qiagen RNeasy试剂盒，目录号74106)根据制造商的说明书进行。
cDNA的产生
为促进PDM的扩增，基于从组织提取的mRNA合成cDNA。基于模板mRNA，使用RNA-依赖性的DNA聚合酶逆转录酶，并使用寡-dT引物、随机六聚体引物(random hexamericprimer)或特异性引物来合成cDNA。示例性方案包括使用SuperScriptTM III First-StrandSynthesis SuperMix protocol(Life technologies,目录号18080-051)。
受试PDM的生成
受试PDM的产生以两个步骤进行：扩增所选择的PDM并附接其他元件以允许其在测定细胞中的适当表达。
进行包含与被扩增的受试PDM相关的寡核苷酸的初步PCR反应以允许这些所选择的基因过多出现在cDNA样品内。
在一些实例中，针对每个待扩增的基因，cDNA样本被分到单独的孔/管中。
使用为各个PDM设计的引物进行PCR反应以从cDNA文库扩增所选择的PDM基因。
以下组的引物用于以下被测试的PDM的PCR扩增(表1)：
表1：
在扩增PDM基因区域后，进行第二PCR反应以向各个PDM基因序列的5`末端添加启动子(或组成型启动子诸如CMV或诱导型启动子诸如四环素启动子)及向3`末端添加IRES接着是荧光报告物基因(诸如GFP、RFP、BFP或任何其他报告物基因，如指定的)。
在一些实例中，启动子和IRES+荧光报告物元件的添加通过分子生物学克隆工具，通过借助PCR方法、连接酶或重组方法(诸如分别为T4DNA连接酶或InFusion酶(Clontech))将PCR产物融合至期望的元件进行。
当全长核酸分子(即5'启动子-PDM-3'IRES+报告物(或这些元件的任何其他顺序))形成时，进行使用PCR反应的扩增，以获得足量的用于转染细胞的核酸分子。
在一些个例中，核酸分子的扩增通过将全长核酸分子连接到适当的表达载体上并转化到细菌中来实现。使用标准质粒提取试剂盒，诸如Qiagen QIAprep Miniprep试剂盒提取由此形成的质粒。在一些个例中，各种PDM的线性PCR片段用于转染受试细胞。
FTR的生成：
以下组的引物用于PCR扩增以下FTR的靶部分(表2)：
表2
表达构建体(FTR和PDM的混合物)的转染
根据预先设计的矩阵，将用于分析的按上文描述的制备的每个报告物基因(FTR)与对照野生型PDM基因或受试PDM基因混合，并与适当的转染试剂混合。
在一种可选方案中，将转染混合物放置在适当的固体支持基底上并任选地在该适当的固体支持基底上脱水。在各种设置中，基底包括多种固体基底，诸如：显微镜载玻片、芯片、细胞培养板、多孔板、96孔板、384孔板等。将各种混合物放置在指定的、可追踪的位点/点(即，指定的孔或载玻片或芯片上的指定位置)中。对基底的转染混合物，将处于正常的全生长培养基中的固定数目的细胞(在约100至100,000的范围内，取决于以上所述的基底类型)分配至各个点上。基于所测试的PDM和测定方法，细胞选自HeLa细胞、HEK 293细胞、NCI60细胞系诸如A549、EKVX、T47D、HT29或任何其他合适的细胞系。将受试细胞放置在固体基底上，并根据细胞的类型、生长培养基和转染条件孵育12-48小时。孵育时间允许细胞粘附至基底，并允许细胞导入和表达FTR和PDM。
在另一种可选方案中，根据预先设计的矩阵将细胞平铺在固体基底上(在指定的、可追踪位点/点(即，指定的孔或载玻片或芯片上的指定位置))。在预定的时间段之后，在适当的转染条件用FTR和适当的PDM(WT PDM或受试PDM)转染细胞。FTR和合适的PDM可位于两个不同的分子上，或位于编码这两个基因的一个分子上。
测定的实施：诱导型启动子
在报告物FTR充分表达之后，将生长培养基替换为低血清培养基(以除去培养基中存在的任何生长因子/配体)以减至最少的背景刺激的信号转导。
当信号转导水平显著减少(4至16小时内)时，启动PDM的诱导表达。这是通过添加四环素(当使用四环素诱导型启动子时)和蜕皮激素(当使用蜕皮激素诱导型启动子时)通过添加实现的。
在一些实例中，添加组织间液(IF)和/或抗癌药物以诱导PDM的表达，从而测试IF或药物对PDM的影响。
测定实施-组成型启动子
在细胞充分表达FTR和PDM(均在组成型启动子的控制下)后，将生长培养基替换为低血清培养基(以除去培养基中存在的任何生长因子/配体)，以减至最少的背景刺激的信号转导。
在一些实例中，添加组织间液和/或抗癌药物以诱导PDM的表达，并从而测试IF或药物对PDM的影响。
图像采集和分析
在PDM表达(转染30小时后)后，通过磷酸盐缓冲的盐水(PBS)洗涤3次，在4％多聚甲醛(PFA)中孵育5分钟，并随后用PBS洗涤3次固定细胞。然后用盖玻片覆盖载玻片，并对每个相应的FTR的定位成像。
对对照野生型细胞以及PDM转染的细胞中的每种FTR进行图像分析并做比较。将FTR在对照细胞与PDM转染的细胞中的定位之间的差异定量，并使用所述差异确定所测试的PDM的致癌形式或野生型形式是否存在于被测试的样品中。定量使用标准图像分析软件，诸如ImageJ进行。
使用HeLa细胞作为测定细胞的示例性测定：
第0天：在室温(RT)下用0.01％的聚-l-赖氨酸预包被载玻片5分钟，然后用无菌水(DDW)洗涤。将水吸掉并将载玻片干燥2小时。将HeLa细胞(15000个细胞)平铺在每个孔的200μl完全培养基(完全培养基：DMEM、10％FBS、1％青霉素/链霉素(P/S))中。
第1天：将转染试剂(FugeneHD试剂(Promege，目录号E2311)加热至RT并涡旋。对于每个孔，在管中制备转染混合物，所述转染混合物包括：管中的50/100/200ng PDM表达构建体；50/100ng合适的FTR的表达构建体；Optimem缓冲液(至总计10μl)和FugeneHD(对于每3μg DNA为1μl)。在RT下孵育转染混合物15分钟。
从孔中吸出细胞培养基，并对每个孔补充100μl转染培养基(DMEM、10％FCS、无抗生素)。将10μl转染混合物添加至每个孔中。然后将细胞孵育在37℃的湿润培养箱(5％CO2)中。
6-8小时后，培养基被更换为饥饿培养基1(具有0.1％FCS、1％青霉素/链霉素的DMEM)，并将细胞孵育在37℃、5％CO2的湿润培养箱中。
第2天：26小时后(即，固定细胞之前4小时)，将培养基换成饥饿培养基2(具有0.1％FCS、1％P/S的DMEM)。然后将细胞孵育在37℃的湿润培养箱(5％CO2)中。
对于需要诱导信号转导的测定：将培养基替换为补充有20ng/ml EGF的饥饿培养基2代替培养基，5min。然后将细胞孵育在37℃的湿润培养箱(5％CO2)中。实施例1(图6)和实施例2(图9-10)中是这样做的。
转染30小时后，通过以下方法(所有步骤都在室温下)固定细胞：将细胞用PBS洗涤3次，用固定溶液(溶于PBS的5％葡萄糖/4％多聚甲醛(PFA))固定10分钟，用PBS洗涤3次。将细胞任选地用DAPI溶液染色，之后用PBS洗涤细胞三次。
实施例1：ERK1/2、JNK和AKT通路的亚细胞易位测定，可区分WT KRas与突变体KRas 并鉴定KRas驱动突变物。
HeLa测定细胞用指定的WT PDM和突变的PDM(KRAS-WT和携带已知驱动突变(G13D)的突变的KRAS)，连同相应的FTR一起转染(如上文详细描述的)。转染30小时后，固定细胞并利用荧光显微镜成像。对细胞质和细胞核中FTR的量进行定量。测量细胞核(N)与细胞质(C)中的FTR强度之间的比(N:C比)。结果示于图3A-图6A中。在图3A中，FTR是ERK2，在图4A中，FTR是ERF，在图5A中，FTR是JNK1α1，且在图6A中，FTR是AKT1。图3B-6B示意性地示出了，通过相应FTR的定位确定的受PDM(KRAS)影响的信号转导通路的致癌基因图谱。总之，结果表明，携带G13D突变的被测KRAS激活3种不同的信号转导通路：ERK1/2、JNK和AKT。
实施例2：AKT和NFkB通路的亚细胞易位测定可区分WT AKT2和突变体AKT2并鉴定 AKT2驱动突变物。
HeLa测定细胞用指定的WT PDM和突变的PDM(AKT2-WT和携带功能未知突变(R251W)的突变的AKT2，所述未知突变(R251W)存在于AKT2的激酶结构域，紧挨着抑制剂结合位点)，连同相应的FTR一起转染(如上文详细描述的)。转染30小时后，固定细胞并利用荧光显微镜成像。对细胞质和细胞核中FTR的量进行定量。测量细胞核(N)与细胞质(C)中的FTR强度之间的比(N:C比)。结果示于图7A和8A中。在图7A中，FTR是AKT1，在图8A中，FTR是RelA。图7B-8B示意性地示出了，通过相应FTR的定位确定的受PDM(AKT2)影响的信号转导通路的致癌基因图谱。总之，结果表明，携带R251W突变的被测AKT2通过减少被测FTR的核易位影响被测的两种不同的信号转导通路(AKT和NFkB)。
实施例3：AKT和NFkB通路的亚细胞易位测定可区分WT AKT3和突变体AKT3并确定 AKT3驱动突变物。
HeLa测定细胞用指定的WT PDM和突变的PDM(AKT3-WT和携带激活突变(R465Q)的突变的AKT3，据报道所述激活突变(R465Q)参与与显着增大的脑尺寸相关的偶发性过度生长失调综合征(synthrome of sporadic overgrowth disorder))，连同相应的FTR一起转染(如上文详细描述的)。按照上文描述的诱导所测试的PDM的诱导型启动子。转染30小时后，固定细胞并利用荧光显微镜成像。对细胞质和细胞核中FTR的量进行定量。测量细胞核(N)与细胞质(C)中的FTR强度在之间的率(N:C比)。结果示于图9A和10A中。在图9A中，FTR是AKT1，在图10A中，FTR是RelA。图9B-10B示意性地示出了，通过相应的FTR的定位确定的受PDM(AKT3)影响的信号转导通路的致癌基因图谱。总之，结果表明，携带R564Q突变的被测AKT3通过增加被测FTR的核易位影响被测的两种不同的信号转导通路(AKT和NFkB)。
实施例4：SMAD2通路的亚细胞易位测定可区分WT SMAD2和突变体SMAD2并确定 SMAD2驱动突变物。
HeLa测定细胞用指定的WT PDR和突变的PDR(SMAD2-WT和携带未知突变(T67A)的突变的SMAD2，所述未知突变(T67A)位于与其他转录因子相互作用的MH1结构域中)转染(如上文详细描述的)。SMAD2调节TGFβ的信号，并因此调控多种细胞进程，诸如细胞增殖、凋亡和分化。转染30小时后，固定细胞并利用荧光显微镜成像。对细胞质和细胞核中PDR(SMAD2)的量进行定量。测量了细胞核(N)与细胞质(C)中的WT SMAD2和突变的SMAD2之间的比(N:C比)。结果示于图11A-B中。如所示的，SMAD2中的T67A突变致使SMAD2易位到细胞核中，而没有诱导对细胞的任何其他刺激。
实施例5：ERK1/2、JNK和P38通路的亚细胞易位测定可区分WT FGFR1和突变体 FGFR1并确定FGFR1驱动突变物。
HeLa测定细胞用指定的WT PDM和突变的PDM(FGFR1-WT和携带功能未知突变(A343V)的突变的FGFR1，所述未知突变(A343V)位于胞外区的Ig-样3型C2结构域(Ig-likeC2-type 3domain)中)，连同相应的FTR一起转染(如上文详细描述的)。转染30小时后，固定细胞并利用荧光显微镜成像。对FTR在细胞质和细胞核中的量进行定量。测量了细胞核(N)与细胞质(C)中FTR强度之间的比(N:C比)。结果示于图12A-16A中。在图12A中，FTR是ERK2，在图13A中，FTR是JNK1α1，在图14A中，FTR是P38b，在图15A中，FTR是STAT3而在图16A中，FTR是AKT1。图12B-16B示意性地示出了，通过相应的FTR的定位确定的受PDM(FGFR1)影响的信号转导通路的致癌基因图谱。总之，结果表明，携带A343V突变的被测FGFR1影响ERK1/2、JNK和p38信号转导通路，但对STAT通路(图15A-B)或AKT(图16A-B)没有影响。
实施例6：ERK1/2通路的亚细胞易位测定，可在WT和突变体BRAF之间进行区分并确 定BRAF驱动突变物。
HeLa测定细胞用WT PDM(BRAF-WT)或指定的突变的PDM(突变的BRaf，携带以下突变中的一个突变：已知的驱动突变物(G464V)、已知的驱动突变(V600E)或位于BRAF的激酶结构域中的功能未知的突变(I554T))连同相应的FTR一起转染(如以上详述)。转染30小时后，固定细胞并利用荧光显微镜成像。对FTR在细胞质和细胞核中的量进行定量。测量细胞核(N)与细胞质(C)中的FTR强度之间的比(N:C比)。结果示于图17A-18A中。在图17A中，FTR是ERK2，在图18A中，FTR是ERF。图17B-18B示意性地示出了，通过相应的FTR的定位确定的受PDM(BRAF)影响的信号转导通路的致癌基因图谱。总之，结果表明，两种功能已知的突变(G464V和V600E)的确激活信号转导通路(如通过所测试的两种FTR确定的)。结果还表明，功能未知的突变(I544T)也激活所测试的信号转导通路，指示这是驱动突变物。此外，当使用ERK2作为FTR时(图17A)，由携带功能未知的I544T突变的突变的BRAF的激活水平高达对于携带已知V600E突变的BRAF观察到的激活水平，V600E突变先前已被报道比G464V突变活性更高。
因此，通过使用本文公开的方法，先前不知道是有活性的BRAF突变(I544T)被鉴定为有功能活性的、能够引起异常信号转导通路的突变体。
实施例7：NFkB、AKT和NFkB通路的亚细胞易位测定可区分WT EGFR和突变体之间进 行区分并分级EGFR突变严重性。
HeLa测定细胞用WT PDM(EGFR-WT)或指定的突变的PDM(突变的EGFR，携带以下突变中的一个突变：已知的驱动突变(G719S)，或包括以下三种已知驱动突变G719A、T790M(已知赋予对小分子EGFR抑制剂的抗性)和L861Q(三重突变)的突变体)连同相应的FTR一起转染(如上文详细描述的)。转染30小时后，固定细胞并利用荧光显微镜成像。对FTR在细胞质和细胞核中的量进行定量。测量细胞核(N)与细胞质(C)中的FTR强度之间的比(N:C比)。结果示于图19A-23A中。在图19A中，FTR是RelA，在图20A中，FTR是AKT1，在图21A中，FTR是Jnk1α1，在图22A中，FTR是P38β而在图23A中，FTR是ERK2。图19B-23B示意性地示出了，通过相应的FTR的定位确定的受PDM(EGFR)影响的信号转导通路的致癌基因图谱。总之，结果表明，测试的EGFR突变体(G719S和三重突变)影响NFkB信号转导通路(图19A-B)，但对P38通路(图22A-B)没有影响。此外，当使用AKT1作为FTR(图20A)或使用ERK2作为FTR(图23A)时，这两种突变体激活该通路，但三重突变以大于G179S突变的方式(以统计学上显著的方式)激活该通路。同样地，当使用JNK1α1作为FTR时(图21A)，G719S突变体的激活水平与WT相似，而三重突变引起该通路的激活。
因此，通过使用本文公开的方法，表明了，与单个驱动突变(G719S)相比，具有对小分子抑制剂的固有抗性的EGFR三重突变(G719A、T790M和L861Q)诱导增强的信号转导通路激活模式。
前面对特定实施方案的描述将如此充分地揭示本发明的总体性质，以致于其他人通过应用现有知识便可容易地进行调整以用于多种应用，而无需过多的实验且不偏离常规概念，并且，因此，此类调整和修改应该被理解为并且期望被理解为在所公开的实施方案的等同方式的含义和范围内。虽然已结合本发明的具体实施方案描述了本发明，但是显然地，对于本领域技术人员，许多替换、修改和变化将是明显的。因此，涵盖落入所附权利要求书的精神和宽范围内的所有这些替换、修改和变化是期望的。

Claims (29)

1.编码荧光易位报告物(FTR)基因的表达载体在制备用于鉴定癌症患者的生物样品中的一种或更多种患者特定驱动突变物的试剂盒中的用途，当所述试剂盒被使用时，包括以下步骤：
a)从所述生物样品获得多种mRNA；
b)由所述多种mRNA产生cDNA文库；
c)使用与编码已知的信号转导蛋白的多核苷酸互补的一组引物扩增所述cDNA文库中的特定cDNA；
d)形成所扩增的cDNA的单独的表达构建体，其中所述cDNA被可操作地连接至启动子；
e)形成携带来自肿瘤的所扩增的cDNA的第一组表达构建体及相应的野生型cDNA的第二组表达构建体的可寻址阵列；
从而提供在编码所述信号转导蛋白的多核苷酸中携带候选突变的表达构建体的可寻址阵列，所述可寻址阵列适合鉴定所述癌症患者的生物样品中的患者特定驱动突变物；
(f)对于所述可寻址阵列中的每个位点，加入所述编码荧光易位报告物(FTR)基因的表达载体，所述荧光易位报告物(FTR)基因包含连接至特定报告物基因部分的靶基因部分；
g)在促使所述第一组表达构建体和所述第二组表达构建体以及所述表达载体转染进入活的测定细胞的条件下，将所述活的测定细胞添加至每个位点；以及
h)比较表达来自所述肿瘤的cDNA与表达其相应的野生型表达的cDNA的活的测定细胞中表达的FTR的至少一个属性；
其中，表达源自所述癌症患者的生物样品的cDNA与表达相应的野生型cDNA的活的测定细胞之间的不同结果，用于鉴定所述生物样品中作为候选的患者特定驱动突变物的cDNA。
2.如权利要求1所述的用途，其中所述荧光易位报告物(FTR)的属性选自荧光蛋白的定位和荧光蛋白的易位。
3.如权利要求2所述的用途，其中所述定位包括选自以下的亚细胞定位：细胞溶质、细胞核、核仁、质膜、内质网(ER)、线粒体、高尔基体、溶酶体、过氧化物酶体、内体区室和细胞骨架。
4.如权利要求1所述的用途，其中所述荧光易位报告物(FTR)的靶基因部分编码选自以下的蛋白：肿瘤抑制因子、细胞骨架蛋白、生长因子受体、G-蛋白偶联受体、细胞粘附蛋白、蛋白激酶、转录因子、衔接蛋白和交换因子。
5.如权利要求1所述的用途，其中所述荧光易位报告物(FTR)的报告物基因部分编码：绿色荧光蛋白(GFP)、mCherry、mApple、DsRed、红色荧光蛋白(RFP)、蓝色荧光蛋白(BFP)、EGFP、CFP、YFP、AmCyan1、ZsGreen1、ZsYellow1、DsRed2、AsRed2和HcRed1。
6.如权利要求1所述的用途，其中所述生物样品选自肿瘤细胞、肿瘤活检物、肿瘤组织和体液。
7.如权利要求1所述的用途，其中所述第一和/或第二组表达构建体包含双链线性DNA。
8.如权利要求1所述的用途，其中所述第一和/或第二组表达构建体的启动子是诱导型启动子。
9.如权利要求8所述的用途，所述步骤还包括对于所述可寻址阵列中的每个位点，诱导所述表达构建体和/或表达载体在被转染的细胞中的表达，以获得第一组来自所述肿瘤的cDNA和荧光易位报告物(FTR)的基因产物。
10.如权利要求1所述的用途，其中所述第一和/或第二组表达构建体的启动子是组成型启动子。
11.如权利要求1所述的用途，其中所扩增的cDNA的表达构建体还包含IRES和第二报告物基因。
12.如权利要求1所述的用途，所述步骤还包括在转染试剂的存在下，在固体支持体上干燥所述第一组表达构建体和所述第二组表达构建体。
13.编码荧光易位报告物(FTR)基因的表达载体在制备鉴定肿瘤细胞中的异常信号转导通路的试剂盒中的用途，当所述试剂盒被使用时，包括以下步骤：
a)从所述肿瘤细胞获得多种mRNA；
b)由所述多种mRNA生成cDNA文库；
c)使用与编码已知的信号转导蛋白的多核苷酸互补的一组引物扩增所述cDNA文库中的特定cDNA；
d)形成步骤(c)所扩增的cDNA的单独的表达构建体，其中所述cDNA被可操作地连接至启动子；
e)形成携带来自肿瘤的所扩增的cDNA的第一组表达构建体，及相应的野生型cDNA的第二组表达构建体的可寻址阵列；
从而提供在编码所述信号转导蛋白的多核苷酸中携带候选突变的表达构建体的可寻址阵列，所述可寻址阵列适合于鉴定所述肿瘤细胞中的异常信号转导通路；
(f)对于所述可寻址阵列中的每个位点，加入编码所述荧光易位报告物(FTR)基因的表达载体，所述荧光易位报告物(FTR)基因包含连接至报告物基因部分的靶基因部分；
g)在促使所述第一组表达构建体和所述第二组表达构建体共转染进入活的测定细胞的条件下，将所述活的测定细胞添加至每个位点；以及
h)比较表达来自肿瘤的cDNA与表达其相应的野生型表达的cDNA的活的测定细胞中表达的荧光易位报告物(FTR)的至少一个属性；
其中，表达源自肿瘤细胞的cDNA与表达相应的野生型cDNA的活的测定细胞之间的不同结果，用于鉴定所述肿瘤细胞中作为候选的异常信号转导蛋白的cDNA。
14.如权利要求13所述的用途，其中所述荧光易位报告物(FTR)的属性选自荧光蛋白的定位和荧光蛋白的易位。
15.如权利要求13所述的用途，其中所述荧光易位报告物(FTR)的靶基因部分编码选自以下的蛋白：肿瘤抑制因子、细胞骨架蛋白、生长因子受体、G-蛋白偶联受体、细胞粘附蛋白、蛋白激酶、转录因子、衔接蛋白和交换因子。
16.如权利要求13所述的用途，其中所述荧光易位报告物(FTR)的报告物基因部分编码选自以下的蛋白：绿色荧光蛋白(GFP)、mCherry、mApple、DsRed、红色荧光蛋白(RFP)、蓝色荧光蛋白(BFP)、EGFP、CFP、YFP、AmCyan1、ZsGreen1、ZsYellow1、DsRed2、AsRed2和HcRed1。
17.如权利要求13所述的用途，其中所述活的测定细胞选自HeLa细胞、HEK293细胞、U2OS、PC12、NCI60、A549、EKVX、T47D、HT29和癌症患者的细胞。
18.如权利要求13所述的用途，其中所述肿瘤细胞源自癌症患者的肿瘤样品，所述肿瘤样品选自：活检物、手术后的肿瘤切除物、血液样品、支气管肺泡灌洗液和骨髓。
19.如权利要求18所述的用途，其中通过所述步骤鉴定的候选的异常信号转导蛋白为患者特定驱动突变物。
20.编码荧光易位报告物(FTR)基因的表达载体在制备用于在癌症患者的生物样品中鉴定一种或更多种患者特定驱动突变物的试剂盒中的用途，当所述试剂盒被使用时，包括以下步骤：
a)从所述生物样品获得多种mRNA；
b)由所述多种mRNA产生cDNA文库；
c)使用与编码已知的信号转导蛋白的多核苷酸互补的一组引物扩增所述cDNA文库中的特定cDNA；
d)形成所扩增的cDNA的单独的表达构建体，其中所述cDNA被可操作地连接至启动子；
e)在可寻址阵列中，将活的测定细胞加至基底；
f)向所述活的测定细胞加入携带来自肿瘤的扩增的cDNA的第一组表达构建体和相应的野生型cDNA的第二组表达构建体；其中在促使表达构建体转染进入所述活的测定细胞的条件下，将每种表达构建体加至位于不同的可寻址位点处的活的测定细胞；
从而产生包含在编码信号转导蛋白的多核苷酸中携带候选突变的表达构建体的测定细胞的阵列，所述阵列适合于鉴定所述癌症患者的生物样品中的患者特定驱动突变物；
(g)对于所述可寻址阵列中的每个位点，将所述荧光易位报告物(FTR)基因的表达载体加至所述活的测定细胞，所述荧光易位报告物(FTR)基因基因包含连接至特定报告物基因部分的靶基因部分；
(h)比较表达来自肿瘤的cDNA与表达其相应的野生型表达的cDNA的细胞中的荧光易位报告物(FTR)的至少一个属性；
其中，表达所述生物样品来源的cDNA与表达相应的野生型cDNA的测定细胞之间的不同结果，用于鉴定所述生物样品中作为候选的患者特定驱动突变物的cDNA。
21.如权利要求20所述的用途，其中所述荧光易位报告物(FTR)的属性选自荧光蛋白的定位和荧光蛋白的易位。
22.如权利要求21所述的用途，其中所述定位包括选自以下的亚细胞定位：细胞溶质、细胞核、核仁、质膜、内质网(ER)、线粒体、高尔基体、溶酶体、过氧化物酶体、内体区室和细胞骨架。
23.如权利要求20所述的用途，其中所述荧光易位报告物(FTR)的靶基因部分编码选自以下的蛋白：肿瘤抑制因子、细胞骨架蛋白、生长因子受体、G-蛋白偶联受体、细胞粘附蛋白、蛋白激酶、转录因子、衔接蛋白和交换因子。
24.如权利要求20所述的用途，其中所述荧光易位报告物(FTR)的报告物基因部分编码选自以下的蛋白：绿色荧光蛋白(GFP)、mCherry、mApple、DsRed、红色荧光蛋白(RFP)、蓝色荧光蛋白(BFP)、EGFP、CFP、YFP、AmCyan1、ZsGreen1、ZsYellow1、DsRed2、AsRed2和HcRed1。
25.如权利要求20所述的用途，其中所述生物样品选自肿瘤细胞、肿瘤活检物、肿瘤组织和体液。
26.一种用于诊断受试者中的癌症的试剂盒，所述试剂盒包括：
一组活的测定细胞；
基底，所述基底具有编码源自疑似患有癌症的人受试者的患者来源的标志物和荧光易位报告物(FTR)和/或患者来源的报告物(PDR)的核酸分子，其中所述基底还能够容纳所述一组测定细胞；和
用于反应、测量和/或检测所述荧光易位报告物(FTR)和/或所述患者来源的报告物(PDR)的易位事件的打印的说明书。
27.如权利要求26所述的试剂盒，其中所述一组活的测定细胞选自HeLa细胞、HEK293细胞、U2OS、PC12、NCI60、A549、EKVX、T47D、HT29和癌症患者的细胞。
28.如权利要求26所述的试剂盒，所述试剂盒还包括转染试剂。
29.如权利要求26所述的试剂盒，所述试剂盒还包括一个或更多个用于检测荧光易位报告物(FTR)和/或所述患者来源的报告物(PDR)的装置。
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