CN107076727B - 用于确定患者特定突变的致癌指数的方法和系统 - Google Patents

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Abstract

提供了用于确定患者特定突变的多种致癌相关的指数的方法。提供的方法允许确定多种患者特定突变和对多种患者特定突变分级以及定性地和定量地确定多种相关的致癌指数。

Description

用于确定患者特定突变的致癌指数的方法和系统
发明领域
提供了用于确定患者特定突变(patient specific mutation)的多种致癌相关的指数的方法和系统。所述系统和方法允许确定多种患者特定突变和对多种患者特定突变分级以及定性地和定量地确定多种相关致癌指数。
发明背景
癌症(恶性肿瘤或恶性赘生物)是一组涉及具有侵入或扩散到其他身体部分的潜能的异常细胞生长的疾病。癌症极其多样化，并且其涉及多种根本的分子机制。因此，取决于根本的分子机制的准确诊断以及致癌突变的鉴定和自分泌及旁分泌作用，被诊断为患有各种癌症的患者的预后可极为不同。
此外，癌症的复杂性和异质性要求更灵敏和识别能力更强的诊断方法，所述诊断方法以定性和定量的方式反映患者特定的肿瘤信号传送途径并能够对特定突变准确分级用于确定准确的预后和优化的疗法。例如，属于本申请的发明人中的一些的国际公布号WO2014/111936涉及用于鉴定患者特定驱动突变的方法和系统。目前，由于肿瘤内积累的大量突变、有限的已鉴定的驱动突变的库(repertoire)以及非常有限的关于多种突变的相互作用并且特别是其活性的深刻理解，全基因组测序(诸如下一代测序)用于提供准确的预后或优化的靶向疗法的选择的适用性受到限制。
因此，本领域中存在对以下方法和系统的未满足的需求：所述方法和系统提供对患者特定突变定性地和定量地分级并且能够允许确定多种相关指数，所述多种相关指数可以提供患者的特定突变的个性化指征(indication)并且还可以提供患者特定预后和/或优化的治疗的指征。
发明概述
本发明提供了用于确定和/或计算和/或产生患者特定突变的多种致癌指数的方法和系统，所述患者特定突变的多种致癌指数可以提供对于患者的突变以及对于患者的特定状况(预后)的深刻理解，并且还可以辅助确定优化的治疗。通过鉴定受试细胞中与驱动突变的功能相关的信号传送途径活性的改变来识别患者特定突变。根据一些实施方案，通过鉴定与患者突变的功能相关的报告物基因的亚细胞定位的变化来确定信号传送途径活性的改变。在一些实施方案中，从生物样品(直接或间接)获得或取得特定患者来源的标志物(patient derived marker)(PDM)基因，并在活的受试细胞中测试它们对相应荧光易位报告物(fluorescent translocation reporter)(FTR)基因的亚细胞易位的影响以确定所测试的PDM是否发生突变。在一些实施方案中，获得特定患者来源的标志物并将其融合至荧光报告物以创建患者来源的报告物(patient derived reporter)(PDR)，其中在活的受试细胞中测试PDR的亚细胞易位以确定所测试的PDR是否发生突变。在一些实施方案中，驱动突变的鉴定允许确定所鉴定的特定突变对多种药物和/或药物组合的药物反应，并且还被配置为提供对所鉴定的突变(关于其致瘤作用)分级以及确定多种患者特定致癌指数。
本文公开的方法和系统允许对多种所鉴定的患者突变定性地和定量地分级以及确定与所鉴定的突变的致瘤相关的多种指数和患者的总体状况和预后。
在一些实施方案中，本发明提供了用于鉴定参与癌症的患者特定驱动突变的方法和系统，并且还提供用于鉴定多种相关指数的方法和系统以及用于确定所述多种相关指数的方法。在一些实施方案中，驱动突变是致癌驱动突变。在一些实施方案中，本文公开的方法能够形成多种癌症相关的指数，诸如，例如，但不限于：无进展生存期(progression freesurvival)、总存活率(overall survival)、对药物反应的概率、致癌分级指数、治疗指数。在一些实施方案中，指数还可以与治疗相关，因为它们提供用于定量地确定药物相关指数诸如药物或药物组合的治疗指数的平台。
根据一些实施方案，所鉴定的突变连同所测量的关于突变的定量数据，连同获得的关于旁分泌/自分泌激活的途径的数据，可以一起用于产生“肿瘤致癌图谱”，其指示患者肿瘤中受影响的信号传送途径以及突变的基因和其致癌活性。
根据一些实施方案，提供了用于确定患者特定驱动突变的致癌分级的方法，所述方法包括鉴定报告物标志物基因的亚细胞定位/易位的改变，其中亚细胞定位的改变受驱动突变的影响，任选地，在受试药物或药物组合物的存在或不存在下鉴定报告物标志物基因的亚细胞定位/易位的改变。在一些实施方案中，从患者的生物样品(直接或间接，例如，基于测序数据)获得/取得患者来源的标志物(PDM)，并对其操作(工程化)以在活的受试细胞中在报告物嵌合基因(包括报告物基因部分和靶基因部分的嵌合产物的荧光易位报告物(FTR))的存在下表达。然后确定FTR在受试细胞中的亚细胞定位。如果，与FTR在正常条件下(即，在相应的WT PDM的存在下)的亚细胞定位相比和/或与其他已知的参考相比，FTR在所测试的PDM的存在下的亚细胞定位不同，则指示所测试的PDM发生突变。此外，可以在受试药物或受试药物组合的存在下测试所鉴定的突变，以鉴定所测试的PDM的特定药物反应，并且所鉴定的突变还可以用于确定多种治疗相关的指数。因此，使用本文公开的方法，可以将患者特定PDM鉴定/表征为是驱动突变，并且还可以在药物的存在下测定所述患者特定PDM，以测量所述药物影响所述患者特定PDM定位和致癌活性的能力，以最终允许产生多种相关的指数。可选择地或另外地，在一些实施方案中，可通过创建PDR(即，连接/附接/融合至报告物基因的PDM)，并追踪其亚细胞定位直接测试PDM，而无需使用FTR。通过确定这类驱动突变，可鉴定患者肿瘤内运行的已活化的信号传送途径。此外，这促进精确并针对性地选择根除肿瘤并避免特定患者的抗性机制所需要的必需的靶向疗法治疗。
根据一些实施方案，有利地提供了用于鉴定患者特定来源的突变和确定其多种致癌相关的指数的增强且改善的定量诊断平台，所述平台允许在相同基因中和/或在不同基因中和/或在相同受试细胞中不同PDM的组合中的不同突变或突变组合之间分级和比较。在一些实施方案中，公开的方法包括基于细胞的测定，所述基于细胞的测定能够通过在存活的(活的)细胞中监测驱动突变对FTR的影响来鉴定驱动突变，并且基于此，有效地确定/产生/计算/生成多种相关指数。本文公开的方法还能够有利地以高度显著性鉴定不同靶向疗法药物的抗性和敏感性，并且能够定量地鉴定和/或比较多种患者突变的药物反应，并且还提供在多种药物对相同靶标的情况下的药物选择。此外，如下文所示例的，由本文公开的方法确定的指数还与临床观察到的结果一致，这提供了体外测定和体内状况之间的相关性。因此，这些结果例示了所公开的方法和系统鉴定多种突变的多种致癌相关的指数和提供在不同突变之间分级和比较的定量平台的能力。
在一些实施方案中，本文公开的方法和系统提供了一种定量平台，所述平台能够通过在活的受试细胞中监测多种信号传送蛋白(诸如，例如，膜定位和/或细胞内受体及信号传送蛋白)的活化而鉴定患者特定肿瘤活化的信号传送途径的特征，并且基于该结果产生多种相关的指数。在一些实施方案中，驱动突变的鉴定可以通过检测涉及荧光报告物蛋白(FTR)的细胞内易位事件(即，易位到多个亚细胞位置，诸如质膜、胞质溶胶、核内体、核仁等/在多个亚细胞位置，诸如质膜、胞质溶胶、核内体、核仁等之间易位)和蛋白-蛋白的相互作用进行。根据一些实施方案，本文公开的方法和系统是有利的，因为除了仅鉴定同一患者的相同生物样品中的多个突变事件(包括尚未鉴定的突变、以及确定这类突变的致癌活性)以外，它们还提供了对这类突变的定量评价和分级，这能够最终允许患者的准确预后和/或确定用于特定患者的个性化的治疗方案。因此，本文公开的方法和系统除了允许鉴定导致癌症或参与癌症的细胞事件和患者特定突变以外，还可以允许指数化和分级这类事件，以及定量地鉴定/指示特别适合所述患者的有效药物治疗。
根据一些实施方案，鉴定患者特定突变和所涉及的信号传送途径之后，可以将已知抑制/影响/调节所鉴定的途径/突变(或未知)的靶向疗法药物/剂添加至受试细胞，并且可以再次测试致癌活性，以鉴定对肿瘤和患者表现出最佳效果的药物/剂，这是一种能够用作用于计算“治疗指数”的基础的测量方法。在一些实施方案中，多种药物/剂治疗和其各自的治疗指数可以被添加到肿瘤致癌图谱上，并且为医疗保健提供者提供患者特定的根本的分子肿瘤机制和治疗选择以及其各自期望的用于治疗特定患者的功效。
根据一些实施方案，鉴定患者特定的突变和所涉及的信号传送途径之后，可以确定/计算/产生致癌分级指数(致癌指数)，其中所鉴定的突变可以基于其致癌活性分级。所鉴定的突变的分级可以归因于本文公开的方法的定量性质。所鉴定的突变(如通过本文公开的方法所鉴定的，特别是如通过报告物基因的易位事件所确定的)的体外作用可以被定量，以提供致癌性分级，所述致癌性分级指示同一基因的不同突变之间和/或不同基因中的不同突变之间的致癌活性，并且将这些突变在体内的致癌活性相关。换言之，本文公开的定量方法能够在同一或不同基因中的不同突变之间进行定量比较，并且将这些突变在体内的作用相关，这对于预后和优选的治疗方法(preferred line of treatment)具有深远含义。
根据一些实施方案，鉴定患者特定突变和所涉及的信号传送途径(即，产生“肿瘤致癌图谱”)之后，可以将已知抑制/影响所鉴定的途径/突变的靶向疗法药物/剂与受试细胞孵育，并且可以再次测试抑制的/降低的致癌活性，以鉴定提供使肿瘤和患者的致癌指数(如下文所详述的)降低最多的药物/剂。在一些实施方案中，由药物/剂引起的致癌活性的抑制在本文中被称为“治疗指数”。在一些实施方案中，多种药物/剂治疗和其各自的治疗指数可以被添加到肿瘤致癌图谱上，并且为医疗保健提供者提供患者特定的根本的分子肿瘤机制和治疗选择以及其各自期望的用于治疗特定患者的功效。
根据一些实施方案，提供了用于确定致癌指数(分级指数)的方法和系统。在一些实施方案中，致癌指数指示给定的致癌突变/畸变驱动给定的患者肿瘤样品中恶性生长的能力。在一些实施方案中，致癌指数指示给定的致癌突变/畸变驱动患者中恶性生长的能力。在一些实施方案中，致癌指数基于给定的致癌突变/畸变驱动给定的患中恶性生长的能力，指示患者的预后。在一些实施方案中，所述方法和系统包括计算/估算(compute)/确定所测试的FTR/PDR的活化或抑制程度，例如，基于其核质比(nuclear to cytoplasm ratio)(NCR)。在一些实施方案中，然后可以以复杂的方式计算对于给定PDM的所有测试的FTR的总和，以推断所测试的PDM对恶性生长的影响。根据一些示例性实施方案，致癌指数具有数值，其中值越高，所测试的PDM的致癌指数越高。在一些实施方案中，致癌指数的值和其单位基于产生指数所利用的数据和/或另外的参数来确定。在一些实施方案中，定量步骤包括给测量结果分配数值。
根据一些实施方案，提供了提供/产生癌症患者的生物样品中的一种或更多种患者特定突变或肿瘤细胞中的一种或更多种异常信号转导蛋白的致癌分级指数的方法，所述方法包括以下步骤：
a)从生物样品获得多种mRNA；
b)由多种mRNA产生cDNA文库；
c)使用与编码已知的信号转导蛋白的多核苷酸互补的一组引物扩增cDNA文库中的特定cDNA；
d)形成扩增的cDNA的单独的表达构建体，其中所述cDNA被可操作地连接至启动子；
e)形成携带来自生物样品的扩增的cDNA的第一组表达构建体及相应的野生型cDNA的第二组表达构建体的可寻址阵列；
f)对于阵列中的每个位点，加入编码荧光易位报告物(FTR)基因的表达载体，所述荧光易位报告物(FTR)基因包含连接至特定报告物基因部分的靶基因部分；
g)将活的测定细胞在使得DNA构建体和载体转染进入测定细胞的条件下添加至每个位点；
h)比较表达来自生物样品的cDNA与表达其相应的野生型表达的cDNA的测定细胞中表达的FTR的至少一个属性；其中，表达源自癌症患者的生物样品的cDNA与表达相应的野生型cDNA的测定细胞之间的不同结果，用于鉴定来自生物样品中的cDNA作为候选的患者特定驱动突变；以及
i)对候选的患者特定驱动突变的不同结果进行定量，以从而确定所述患者特定驱动突变的致癌分级指数。
在一些实施方案中，定量步骤包括测量表达的FTR的至少一个属性。在一些实施方案中，定量步骤包括计算/估算/确定所测试的FTR/PDR的易位程度和/或其NCR。在一些实施方案中，所测试的FTR/PDR的易位程度被进一步校准/归一化/相关/映射至参考值。在一些实施方案中，所测试的FTR/PDR的易位程度被进一步校准/归一化为所测试的FTR/PDR参与的细胞信号传送途径对诸如，例如，细胞周期或细胞分裂的影响。在一些实施方案中，所述方法包括计算/估算/确定所测试的FTR/PDR的活化或抑制程度。然后可以以复杂的方式计算对于给定PDM的所有测试的FTR的总和，以推断所测试的PDM对恶性生长的影响。根据一些实施方案，致癌指数具有数值，其中值越高，所测试的FTR/PDM的致癌指数越高。在一些实施方案中，定量步骤包括给测量结果分配数值。在一些实施方案中，步骤g)在步骤e)和/或f)之前，在这些个例中，测定细胞在添加表达构建体和/或表达载体之前被添加至每个位点。
在一些实施方案中，FTR的属性选自荧光蛋白的定位及荧光蛋白的易位。在一些实施方案中，定位包括选自以下的亚细胞定位：胞质溶胶、细胞核、核仁、质膜、内质网(ER)、线粒体、高尔基体、溶酶体、过氧化物酶体、内体区室(endosomal compartment)和细胞骨架。
在一些实施方案中，FTR的靶基因部分编码选自以下的蛋白：肿瘤抑制因子(tumorsuppressor)、细胞骨架蛋白、生长因子受体、G-蛋白偶联受体、细胞粘附蛋白、蛋白激酶、转录因子、衔接体蛋白质(adaptor protein)和交换因子(exchange factor)。在另外的实施方案中，FTR的报告物基因部分编码荧光标志物，诸如，例如，绿色荧光蛋白(GFP)、mCherry、mApple、DsRed、红色荧光蛋白(RFP)、蓝色荧光蛋白(BFP)、EGFP、CFP、YFP、AmCyan1、ZsGreen1、ZsYellow1、DsRed2、AsRed2和/或HcRed1。
在一些实施方案中，生物样品选自肿瘤细胞、肿瘤活检物、肿瘤组织和体液。在一些实施方案中，通过该方法鉴定的候选的异常信号转导蛋白是患者特定突变。在一些实施方案中，突变是驱动突变。
在一些实施方案中，第一和/或第二组表达构建体包含双链线性DNA。在其他实施方案中，第一和/或第二组表达构建体的启动子是诱导型启动子。在一些实施方案中，第一和/或第二组表达构建体的启动子是组成型启动子。
在一些实施方案中，所述方法还包括对于阵列中的每个位点，诱导表达构建体和/或表达载体在转染细胞中表达，以获得第一组来自生物样品(例如，肿瘤)的cDNA和FTR的基因产物。
在另外的实施方案中，扩增的cDNA的表达构建体还包含IRES和第二报告物基因。
在一些实施方案中，所述方法还包括在转染试剂的存在下在固体支持体上干燥DNA构建体。在一些实施方案中，FTR的表达载体是环状的表达载体。在另外的实施方案中，表达载体包含组成型或诱导型启动子。
在一些实施方案中，所述方法还包括在转染试剂的存在下在固体支持体上干燥DNA构建体。在一些实施方案中，所述方法还包括将受试药物添加至受试细胞。在一些实施方案中，可以在药物的存在下重复步骤g)、h)和/或i)。在一些实施方案中，药物是抗癌药物。在一些实施方案中，药物是受试药物。在一些实施方案中，所述方法包括伴随地或顺序地添加多于一种药物。在一些实施方案中，所述方法包括添加药物组合。在一些实施方案中，所述方法包括添加不同浓度的药物以定量地确定药物反应。在一些实施方案中，在受试化合物的存在下获得的结果可以用于确定指示通过受试药物的所测试的基因的致癌活性的降低和/或指示突变的药物反应的治疗指数。
根据一些实施方案，提供了产生/确定/生成/估算一种或更多种患者特定突变的致癌指数的方法，所述方法包括以下步骤：a)形成携带包含患者的一种或更多种患者特定突变的基因的第一组表达构建体及相应的野生型基因的第二组表达构建体的可寻址阵列；b)对于可寻址阵列中的每个位点，添加编码荧光易位报告物(FTR)基因的表达载体，所述荧光易位报告物(FTR)基因包含连接至特定报告物基因部分的靶基因部分；c)将活的测定细胞在使得表达构建体和表达载体转染进入测定细胞的条件下添加至每个位点；d)比较表达包含所述一种或更多种患者特定突变的基因与表达其相应的野生型表达的基因的测定细胞中表达的FTR的亚细胞定位和/或易位，以鉴定不同的结果；e)对候选的患者特定突变的不同结果进行定量，通过：i)处理所述不同的结果以确定所测试的FTR在第一组表达构建体和第二组表达构建体的存在下的易位程度以确定患者特定突变的活化水平；ii)基于FTR在第二组表达构建体的存在下的易位程度，归一化FTR在第一组表达载体的存在下的易位程度，以确定患者特定突变的归一化的活化水平；以及iii)分析患者特定的突变的归一化的活化水平与临床结果(参考)之间的映射，以从而确定所述患者特定突变的致癌分级指数。在一些实施方案中，步骤c)可以在步骤a)和/或步骤b)之前。
根据一些实施方案，分析可以包括利用机器学习或任何其他计算技术。在一些实施方案中，分析可以包括诸如这类方法，但不限于：相关性单变量分析机、多变量分析机、支持向量机、广义线性模型机或其组合。
在一些实施方案中，易位程度基于核质比(NCR)来确定。
在一些实施方案中，指数具有指示候选的患者特定突变驱动恶性肿瘤的能力的数值。
在一些实施方案中，指数可以指示患者的无进展生存期、患者的总存活率、药物反应的概率、进展时间(TTP)、肿瘤反应率、复发、无病生存期(Disease-free survival)(DFS)。
在一些实施方案中，患者特定突变的易位程度可以被进一步归一化为对患者特定突变参与的细胞信号传送途径的影响。
在一些实施方案中，亚细胞定位可以选自：胞质溶胶、细胞核、核仁、质膜、内质网(ER)、线粒体、高尔基体、溶酶体、过氧化物酶体、内体区室和细胞骨架。
在一些实施方案中，FTR的靶基因部分可以编码选自以下的蛋白：肿瘤抑制因子、细胞骨架蛋白、生长因子受体、G-蛋白偶联受体、细胞粘附蛋白、蛋白激酶、转录因子、衔接体蛋白质和交换因子。在一些实施方案中，FTR的报告物基因部分可以编码荧光标志物。
在一些实施方案中，患者基因可以源自患者的生物样品。在一些实施方案中，突变中的至少一个是致癌突变。在一些实施方案中，突变是驱动突变。在一些实施方案中，基因(或其部分)可以基于其序列被人工合成。
在一些实施方案中，第一和/或第二组表达构建体包含双链线性DNA。在一些实施方案中，第一和/或第二组表达构建体的启动子是诱导型或组成型启动子。在一些实施方案中，第一和/或第二组表达构建体携带基因的一部分。在一些实施方案中，所述方法可以还包括在转染试剂的存在下在固体支持体上干燥构建体和/或载体的步骤。
在一些实施方案中，所述方法可以还包括将受试药物添加至细胞的步骤。在一些实施方案中，所述方法可以还包括计算治疗指数，所述治疗指数指示患者特定突变驱动恶性生长的能力响应于受试药物的降低。
根据一些实施方案，提供了用于产生致癌分级指数的系统，所述系统包括处理线路(processing circuitry)，所述被处理线路配置为：a)获得指示在第一组表达构建体的存在下和在第二组表达构建体的存在下受试细胞中荧光易位报告物(FTR)基因产物的亚细胞易位程度的不同结果；b)基于FTR的亚细胞易位或定位程度确定患者特定突变的活化水平；c)基于FTR在第二组表达构建体的存在下的易位程度，归一化FTR在第一组表达构建体的存在下的亚细胞易位，以确定患者特定突变的归一化的活化水平；以及d)分析患者特定突变的活化水平与临床结果(参考)之间的相关性，以从而确定致癌指数，其中所述不同结果通过以下步骤获得：i)形成携带包含一种或更多种患者特定突变的基因的第一组表达构建体及相应的野生型基因的第二组表达构建体的可寻址阵列；ii)对于可寻址阵列中的每个位点，添加编码荧光易位报告物(FTR)基因的表达载体，所述荧光易位报告物(FTR)基因包含连接至特定报告物基因部分的靶基因部分；以及iii)将活的测定细胞在使得表达构建体和表达载体转染进入测定细胞的条件下添加至每个位点。
在一些实施方案中，分析可以包括机器学习。在一些实施方案中，分析可以包括相关性单变量分析、多变量分析机、支持向量机分析、广义线性模型分析或其任何组合。
在一些实施方案中，步骤iii)可以在步骤i)和/或步骤ii)之前。
在一些实施方案中，所述不同结果可以通过以下步骤获得：i)将活的测定细胞在使得表达构建体和表达载体转染进入测定细胞的条件下添加至可寻址阵列中的基底；ii)对于阵列中的每个位点，将荧光易位报告物(FTR)基因的表达载体添加至测定细胞，所述荧光易位报告物(FTR)基因包含连接至特定报告物基因部分的靶基因部分；iii)在可寻址阵列的特定位点将携带包含患者特定突变的基因第一组表达构建体添加至测定细胞，并且在特定位点将相应的野生型基因的第二组表达构建体添加至测定细胞，其中所述第一组表达构建体和所述第二组表达构建体未被添加至共同位点(common locus)。在一些实施方案中，步骤ii)和/或步骤iii)可以在步骤i)之前。
在一些实施方案中，还可以将处理线路配置为计算治疗指数，所述治疗指数指示患者特定突变驱动恶性生长的能力响应于受试药物的降低。
根据一些实施方案，提供了产生指示一种或更多种患者特定突变对药物治疗的敏感性的治疗指数的方法，所述方法包括以下步骤：a)形成携带包含一种或更多种患者特定突变的基因的第一组表达构建体及相应的野生型基因的第二组表达构建体的可寻址阵列；b)对于可寻址阵列中的每个位点，添加编码荧光易位报告物(FTR)基因的表达载体，所述荧光易位报告物(FTR)基因包含连接至特定报告物基因部分的靶基因部分；c)将活的测定细胞在使得表达构建体和表达载体转染进入测定细胞的条件下添加至每个位点；d)比较在药物的存在和/或不存在下表达包含突变的基因与表达其相应的野生型表达的基因的测定细胞中表达的FTR的亚细胞定位和/或易位，以鉴定不同的结果；e)通过以下步骤对候选的患者特定突变的不同结果进行定量：i)处理所述不同的结果以确定所测试的FTR在第一组表达构建体和第二组表达构建体的存在下的亚细胞易位程度以确定在药物的存在或不存在下患者特定突变的活化水平；ii)在药物的存在或不存在下，基于FTR在第二组表达构建体的存在下的亚细胞易位程度，归一化FTR在第一组表达载体的存在下的亚细胞易位程度，以确定患者特定突变的归一化的活化水平；以及iii)分析在药物的存在或不存在下患者特定突变的归一化的活化水平与临床结果(参考)之间的相关性，以从而确定药物对患者特定突变的治疗指数。
在一些实施方案中，药物是抗癌药物。在一些实施方案中，所述方法可以包括伴随地或顺序地添加多于一种药物。在一些实施方案中，所述方法可以包括添加药物组合。在一些实施方案中，所述方法可以包括添加不同浓度的药物。在一些实施方案中，步骤c)可以在步骤a)和/或步骤b)之前。
根据一些实施方案，表达构建体可以通过这样的方法获得，所述方法包括以下步骤的一个或更多个：i)由获自患者的生物样品的多种mRNA产生cDNA文库；ii)使用与编码疑似携带致癌突变的基因的多核苷酸互补的一组引物扩增cDNA文库的特定cDNA；以及iii)将扩增的cDNA可操作地连接至启动子。
在一些实施方案中，可以通过本领域已知的方法合成疑似携带一种或更多种突变的患者的基因或基因部分，并且任选地将其可操作地连接至启动子以获得表达构建体。在一些实施方案中，患者基因(或其部分)和/或相应的野生型基因可以基于其序列被人工合成并且被进一步处理以产生相应的PDM。
根据一些实施方案，还提供了用于鉴定癌症患者的生物样品中的患者特定驱动突变和用于确定/计算/估算患者特定驱动突变的多种致癌相关的指数的试剂盒。在另外的实施方案中，提供了用于鉴定患者的肿瘤细胞中的异常信号转导途径的试剂盒。
附图简述
图1是根据一些实施方案的用于鉴定患者驱动突变和检测其药物反应的方法的步骤的示意性框图；
图2A-显示了基于细胞的测定的结果的条形图，其中编码野生型BRAF(BRAF WT)或突变体形式的BRAF(BRAF突变体G464V或V600E或I554T)的基因已连同报告物蛋白(FTR)一起在受试细胞中表达，并基于细胞的荧光显微镜图像(转染后30小时固定)来对FTR(ERK2-GFP)在细胞质和细胞核中的量进行定量。测量细胞核(N)与细胞质(C)中FTR(ERK2)的强度之间的比率(N:C比率)。示出了针对每种条件测量的细胞数目(n)。
图2B-受PDM(BRAF)和相应的FTR(ERK2)影响的信号传送途径的示意图。
图3A-显示了基于细胞的测定的结果的条形图，其中编码野生型形式的EGFR(EGFRWT)，单突变体形式的EGFR(EGFR G719S)或三突变体形式的EGFR(EGFR三突变体，G719A、T790M和L861Q)的基因已连同报告物蛋白(FTR)一起在受试细胞中表达，并基于细胞的荧光显微镜图像(转染后30小时固定)来对FTR(AKT1-GFP)在细胞质和细胞核中的量进行定量。测量细胞核(N)与细胞质(C)中FTR(AKT1)强度之间的比率(N:C比率)。示出了针对每种条件测量的细胞数目(n)。
图3B-受PDM(EGFR)和相应的FTR(AKT1)影响的信号传送途径的示意图。
图4A-显示了基于细胞的测定的结果的条形图，其中编码野生型形式的EGFR(EGFRWT)，单突变体形式的EGFR(EGFR G719S)或三突变体形式的EGFR(EGFR三突变体，G719A、T790M和L861Q)的基因已连同报告物蛋白(FTR)一起在受试细胞中表达，并基于细胞的荧光显微镜图像(转染后30小时固定)来对FTR(JNK1A1-GFP)在细胞质和细胞核中的量进行定量。测量细胞核(N)与细胞质(C)中FTR(JNK1A1)的强度之间的比率(N:C比率)。示出了针对每种条件测量的细胞数目(n)。
图4B-受PDM(EGFR)和相应的FTR(JNK1A1)影响的信号传送途径的示意图。
图5A-受PDM(EGFR)和相应的FTR(JNK2、ERK2、STAT3)影响的信号传送途径的示意图。
图5B-显示了基于细胞的测定的结果的条形图，其中编码突变体形式的EGFR(EGFRL861Q、EGFR L858R、EGFR 746Del、G719A/T790M/L861Q(EGFRtripleM))的基因已连同不同的报告物蛋白(FTR)一起在受试细胞中表达，并基于细胞的荧光显微镜图像(转染后24小时固定)来对FTR(JNK2-GFP、ERK2-GFP、STAT3-GFP)在细胞质和细胞核中的量进行定量。测量细胞核(N)与细胞质(C)中FTR强度之间的比率的差异(ΔN:C比率)。
图6A-受PDM(ERBB2)和相应的FTR(JNK2、ERK2、STAT3、P38)影响的信号传送途径的示意图。
图6B-显示了基于细胞的测定的结果的条形图，其中编码突变体形式的ERBB2(ERBB2V842I、ERBB2V777L、ERBB2S310F、ERBB2L755S、ERBB2D769Y、ERBB2A1170P)的基因已连同不同的报告物蛋白(FTR)一起在受试细胞中表达，并基于细胞的荧光显微镜图像(转染后24小时固定)来对FTR(ERK2-GFP、JNK2-GFP、STAT3-GFP、P38-GFP)在细胞质和细胞核中的量进行定量。测量细胞核(N)与细胞质(C)中FTR强度之间的比率的差异(ΔN:C比率)。
图7A-受PDM(cKIT)和相应的FTR(JNK2、ERK2、STAT3、P38、REL-A)影响的信号传送途径的示意图。
图7B-显示了基于细胞的测定的结果的条形图，其中编码突变体形式的cKIT(cKITK642E、cKIT W557-K558Del)的基因已连同不同的报告物蛋白(FTR)一起在受试细胞中表达，并基于细胞的荧光显微镜图像(转染后24小时固定)来对FTR(ERK2-GFP、JNK2-GFP、STAT3-GFP、P38-GFP)在细胞质和细胞核中的量进行定量。测量细胞核(N)与细胞质(C)中FTR强度之间的比率的差异(ΔN:C比率)。
图8A-受PDM(KRAS)和相应的FTR(JNK2、ERK2、FOXO3a、REL-A)影响的信号传送途径的示意图。
图8B-显示了基于细胞的测定的结果的条形图，其中编码突变体形式的KRAS(KRASQ61H、KRAS G12V、KRAS G12R、KRAS G12A、KRAS G12D、KRAS G12C、KRAS G12S、KRAS A146V、KRAS A146T、KRAS G13D)的基因已连同不同的报告物蛋白(FTR)一起在受试细胞中表达，并基于细胞的荧光显微镜图像(转染后24小时固定)来对FTR(ERK2-GFP、JNK2-GFP、FOXO3a-GFP、REL-A-GFP)在细胞质和细胞核中的量进行定量。测量细胞核(N)与细胞质(C)中FTR强度之间的比率的差异(ΔN:C比率)。
图9A-受PDM(PIK3CA)和相应的FTR(KOG1、P38、STAT3、REL-A)影响的信号传送途径的示意图。
图9B-显示了基于细胞的测定的结果的条形图，其中编码突变体形式的PIK3CA(PIK3CA Y1021C、PIK3CA V344A、PIK3CA R38H、PIK3CA Q546L、PIK3CA N345K、PIK3CAH1047R、PIK3CA H1047L、PIK3CA E579K、PIK3CA E545K、PIK3CA E542K、PIK3CA C420R、PIK3CA R88Q/D350G)的基因已连同不同的报告物蛋白(FTR)一起在受试细胞中表达，并基于细胞的荧光显微镜图像(转染后24小时固定)来对FTR(KOG1-GFP、P38-GFP、STAT3-GFP、REL-A-GFP)在细胞质和细胞核中的量进行定量。测量细胞核(N)与细胞质(C)中FTR强度之间的比率的差异(ΔN:C比率)。
图10A-受PDM(BRAF)和相应的FTR (ERK2、JNK2、REL-A)影响的信号传送途径的示意图。
图10B-显示了基于细胞的测定的结果的条形图，其中编码突变体形式的BRAF(BRAF V600E、BRAF V600K、BRAF G469V、BRAF G469A、BRAF G466V、BRAF G466E)的基因已连同不同的报告物蛋白(FTR)一起在受试细胞中表达，并基于细胞的荧光显微镜图像(转染后24小时固定)来对FTR(ERK2-GFP、JNK2-GFP、REL-A-GFP)在细胞质和细胞核中的量进行定量。测量细胞核(N)与细胞质(C)中FTR强度之间的比率的差异(ΔN:C比率)。
图11A-受PDM(EGFR和KRAS)和相应的FTR(ERK2)影响的信号传送途径的示意图。
图11B-显示了基于细胞的测定的结果的条形图，其中编码WT形式的EGFR以及WT的KRAS或突变体形式的KRAS(KRAS G12V、KRAS G13D)的基因已连同不同的报告物蛋白(FTR)一起在受试细胞中表达，并基于细胞的荧光显微镜图像(转染后24小时固定)来定量FTR(ERK2-GFP)在细胞质和细胞核中的量。测量细胞核(N)与细胞质(C)中FTR强度之间的比率的差异(ΔN:C比率)。
图11C-显示了基于细胞的测定的结果的条形图，其中编码WT形式的EGFR或突变体形式的EGFR(EGFR L858R、EGFR T790M)以及呈WT的KRAS的基因已连同不同的报告物蛋白(FTR)一起在受试细胞中表达，并基于细胞的荧光显微镜图像(转染后24小时固定)来对FTR(ERK2-GFP)在细胞质和细胞核中的量进行定量。测量细胞核(N)与细胞质(C)中FTR强度之间的比率的差异(ΔN:C比率)。
图11D-显示了基于细胞的测定的结果的条形图，其中编码WT形式的EGFR或突变体形式的EGFR(EGFR L858R、EGFR T790M)以及WT形式的KRAS或突变形式的KRAS(KRAS G12V、KRAS G13D)的基因已连同不同的报告物蛋白(FTR)一起在受试细胞中表达，并基于细胞的荧光显微镜图像(转染后24小时固定)来对FTR(ERK2-GFP)在细胞质和细胞核中的量进行定量。测量细胞核(N)与细胞质(C)中FTR强度之间的比率的差异(ΔN:C比率)。
图12A-受PDM(EGFR和KRAS)和相应的FTR(REL-A)影响的信号传送途径的示意图。
图12B-显示了基于细胞的测定的结果的条形图，其中编码WT形式的EGFR以及WT形式的KRAS或突变体形式的KRAS(KRAS G12V、KRAS G13D)的基因已连同不同的报告物蛋白(FTR)一起在受试细胞中表达，并基于细胞的荧光显微镜图像(转染后24小时固定)来对FTR(REL-A-GFP)在细胞质和细胞核中的量进行定量。测量细胞核(N)与细胞质(C)中FTR强度之间的比率的差异(ΔN:C比率)。
图12C-显示了基于细胞的测定的结果的条形图，其中编码WT形式的EGFR或突变体形式的EGFR(EGFR L858R、EGFR T790M)以及呈WT的KRAS的基因已连同不同的报告物蛋白(FTR)一起在受试细胞中表达，并基于细胞的荧光显微镜图像(转染后24小时固定)来对FTR(REL-A-GFP)在细胞质和细胞核中的量进行定量。测量细胞核(N)与细胞质(C)中FTR强度之间的比率的差异(ΔN:C比率)。
图12D-显示了基于细胞的测定的结果的条形图，其中编码WT形式的EGFR或突变体形式的EGFR(EGFR L858R、EGFR T790M)以及WT形式的KRAS或突变体形式的KRAS(KRASG12V、KRAS G13D)的基因已连同不同的报告物蛋白(FTR)一起在受试细胞中表达，并基于细胞的荧光显微镜图像(转染后24小时固定)来对FTR(REL-A-GFP)在细胞质和细胞核中的量进行定量。测量细胞核(N)与细胞质(C)中FTR强度之间的比率的差异(ΔN:C比率)。
图13A-受PDM(EGFR和KRAS)和相应的FTR(ERK2)影响的信号传送途径的示意图。
图13B-显示了基于细胞的测定的结果的条形图，其中编码WT形式的EGFR以及WT形式的KRAS或突变体形式的KRAS(KRAS G12V、KRAS G13D)的基因已连同不同的报告物蛋白(FTR)一起在受试细胞中表达，并基于细胞的荧光显微镜图像(转染后24小时固定)来对FTR(JNK2-GFP)在细胞质和细胞核中的量进行定量。测量细胞核(N)与细胞质(C)中FTR强度之间的比率的差异(ΔN:C比率)。
图13C-显示了基于细胞的测定的结果的条形图，其中编码WT形式的EGFR或突变体形式的EGFR(EGFR L858R、EGFR T790M)以及WT形式的KRAS的基因已连同不同的报告物蛋白(FTR)一起在受试细胞中表达，并基于细胞的荧光显微镜图像(转染后24小时固定)来对FTR(JNK2-GFP)在细胞质和细胞核中的量进行定量。测量细胞核(N)与细胞质(C)中FTR强度之间的比率的差异(ΔN:C比率)。
图13D-显示了基于细胞的测定的结果的条形图，其中编码WT形式的EGFR或突变体形式的EGFR(EGFRL858R、EGFR T790M)以及WT的KRAS或突变体形式的KRAS(KRAS G12V、KRASG13D)的基因已连同不同的报告物蛋白(FTR)一起在受试细胞中表达，并基于细胞的荧光显微镜图像(转染后24小时固定)来对FTR(JNK2-GFP)在细胞质和细胞核中的量进行定量。测量细胞核(N)与细胞质(C)中FTR强度之间的比率的差异(ΔN:C比率)。
图14A-受PDM(EGFR和BRAF)和相应的FTR(ERK2)影响的信号传送途径的示意图。
图14B-显示了基于细胞的测定的结果的条形图，其中编码WT形式的EGFR以及WT形式的BRAF或突变体形式的BRAF(BRAF V600E、BRAF V600K)的基因已连同不同的报告物蛋白(FTR)一起在受试细胞中表达，并基于细胞的荧光显微镜图像(转染后24小时固定)来对FTR(ERK2-GFP)在细胞质和细胞核中的量进行定量。测量细胞核(N)与细胞质(C)中FTR强度之间的比率的差异(ΔN:C比率)。
图13C-显示了基于细胞的测定的结果的条形图，其中编码WT形式的EGFR或突变体形式的EGFR(EGFR L858R、EGFRT790M)以及呈WT的BRAF的基因已连同不同的报告物蛋白(FTR)一起在受试细胞中表达，并基于细胞的荧光显微镜图像(转染后24小时固定)来对FTR(ERK2-GFP)在细胞质和细胞核中的量进行定量。测量细胞核(N)与细胞质(C)中FTR强度之间的比率的差异(ΔN:C比率)。
图13D-显示了基于细胞的测定的结果的条形图，其中编码WT形式的EGFR或突变体形式的EGFR(EGFRL858R、EGFR T790M)以及WT形式的BRAF或突变体形式的BRAF(BRAFV600E、BRAF V600K)的基因已连同不同的报告物蛋白(FTR)一起在受试细胞中表达，并基于细胞的荧光显微镜图像(转染后24小时固定)来对FTR(ERK2-GFP)在细胞质和细胞核中的量进行定量。测量细胞核(N)与细胞质(C)中FTR强度之间的比率的差异(ΔN:C比率)。
发明详述
根据一些实施方案，提供了用于通过鉴定与驱动突变的功能相关的信号传送途径活性的改变和对与驱动突变的功能相关的信号传送途径活性的改变并对其进行定量，来确定患者特定驱动突变的多种致癌相关的指数的方法和系统。在一些实施方案中，信号传送途径活性的改变通过鉴定报告物基因的亚细胞定位的改变和对报告物基因的亚细胞定位的改变进行定量来确定，其中报告物基因的亚细胞定位的改变和所述改变的程度受驱动突变的影响。在一些实施方案中，患者来源的标志物(PDM)可以从患者的生物样品中获得，并被操作(工程化)以在报告物嵌合基因(FTR)的存在下在受试细胞中表达。在一些实施方案中，患者来源的标志物(PDM)可以通过基于其所鉴定的序列人工产生(合成)相应的患者基因而获得，并且进一步操作所述患者来源的标志物以在受试细胞中表达。在一些实施方案中，另外地或可选择地，将患者特定标志物融合至荧光报告物以创建患者来源的报告物(PDR)。然后确定FTR(和/或PDR，如果可适用)在受试细胞中的亚细胞定位。如果，与FTR(和/或PDR，如果可适用)在正常条件下(即，在相应的WT PDM的存在下)的亚细胞定位相比或与其他预定的参考相比，FTR在所测试的PDM(和/或PDR，如果可适用)的存在下的亚细胞定位不同，则指示所测试的PDM(或PDR)发生突变。此外，所述方法有利地允许对所鉴定的PDM(和/或PDR，如果可适用)的反应进行定量，以及确定多种致癌相关的指数，诸如致癌分级指数，所述致癌分级指数指示所鉴定的突变的严重程度。因此，使用本文公开的方法，患者特定PDM可以被鉴定/表征为是驱动突变，并且此外，它们的相对重要性(例如，在致癌活性方面)可以被确定和定量。此外，通过确定这类驱动突变，在患者肿瘤内运行的已活化的信号传送途径和其药物反应可以被鉴定、定量和分级，为特定患者确定多种途径的相对重要性。这使得精确并针对性地提供预后，并进一步选择优化且个性化的靶向疗法治疗。
在一些实施方案中，本文公开的方法和系统允许定量分析和比较所鉴定的突变以及异常的信号传送蛋白和信号传送途径的作用。根据一些实施方案，本文公开的方法和系统是有利的，因为它们除了允许鉴定尚未鉴定的突变以外，还允许鉴定同一患者的相同生物样品中的多个突变事件，并且还允许定量地确定这类突变的致癌活性以及对其分级和指数化，以及对多种药物对所鉴定的突变的治疗影响进行分级。例如，在目前使用的治疗方法中，用格列卫治疗携带cKit突变的胃肠道间质瘤患者。然而，常见的抗性机制通过cKit本身或下游途径中的继发突变(secondary mutation)发生，致使这类治疗无效。同样地，具有EGFR致癌突变的肺癌患者适合于靶向疗法治疗，但是存在若干可用的这类药物。因此，本文公开的方法和系统允许检测、鉴定、定量和分级/指数化所鉴定的突变，以最终提供准确的预后以及任选地进一步确定对特定患者的个性化且优化的药物治疗。
在一些实施方案中，本文公开的方法和系统能够效仿患者肿瘤以鉴定出已活化的信号传送途径和分级的致癌活性，并且此外确定肿瘤对多种药物的敏感性/抗性。在一些实施方案中，这通过将所转染的受试细胞与一种或更多种受试药物孵育来进行。在一些实施方案中，这可以通过将所转染的受试细胞与患者体液(诸如血浆、胸膜积液或组织间液(interstitial fluid))孵育来进行。
如本文提及的，术语“多核苷酸分子”、“寡核苷酸”、“多核苷酸”、“核酸”和“核苷酸”序列可以可互换使用。这些术语涉及脱氧核糖核苷酸(DNA)、核糖核苷酸(RNA)及其修饰的形式的聚合物，所述聚合物呈单独的片段，或作为更大的构建体的组分、线性或支链、单链、双链、三链或其杂合体的形式。该术语还包括RNA/DNA杂合体。多核苷酸可包括DNA或RNA的有义和反义寡核苷酸或多核苷酸序列。DNA或RNA分子可以是，例如，但不限于：互补的DNA(cDNA)、基因组DNA、合成的DNA、重组DNA、或其杂合体，或者RNA分子，诸如，例如，mRNA、shRNA、siRNA、miRNA及类似物。因此，如本文使用的，术语“多核苷酸分子”、“寡核苷酸”、“多核苷酸”、“核酸”和“核苷酸”序列意指DNA和RNA分子两者。该术语还包括由天然存在的碱基、糖和共价的核苷间键组成的寡核苷酸，以及具有非天然存在的部分的寡核苷酸，所述非天然存在的部分的功能类似于相应的天然存在的部分。
如本文使用的，术语“构建体”是指人工组装或分离的核酸分子，其可包括一个或更多个核酸序列，其中所述核酸序列可包括编码序列(即，编码终产物的序列)、调控序列、非编码序列或其任何组合。术语构建体包括，例如，载体，但不应被视为限于此。
术语“表达载体”是指，具有将异源核酸片段(诸如DNA)整合到靶细胞中并使其在靶细胞中表达的能力的载体。换言之，表达载体包含能够被转录的核酸序列/片段。许多病毒、原核和真核表达载体是已知的和/或商购可得的。选择适当的表达载体在本领域技术人员的知识范围内。
如本文使用的，术语“上游”和“下游”是指在核苷酸序列，诸如，例如，DNA序列或RNA序列中的相对位置。如众所周知的，核苷酸序列具有5'末端和3'末端，这样的命名是针对核苷酸骨架的糖(脱氧核糖或核糖)环上的碳的。因此，相对于核苷酸序列上的位置，术语下游涉及朝向序列的3'末端的区域。术语上游涉及朝向链的5'末端的区域。
如本文使用的，术语“启动子元件”、“启动子”或“启动子序列”是指，通常位于编码序列的5'末端(即，在前面，位于上游)并用作开关活化编码序列的表达的核苷酸序列。如果编码序列被活化，其被表述为被转录。转录通常涉及由编码序列合成RNA分子(诸如，例如，mRNA)。因此，启动子用作转录调控元件并且还提供将编码序列转录为mRNA的起始位点。启动子可完全源自天然来源，或包括源自自然界中发现的不同启动子的不同元件，或甚至包括合成的核苷酸区段。本领域技术人员应理解，不同的启动子可驱动基因在不同的组织或细胞类型中，或在发育的不同阶段或响应不同的环境条件，或以各种表达水平表达。引起基因在大多数细胞类型中在大多数时间表达的启动子通常被称为“组成型启动子”。引起特定组织中的基因表达的启动子被称为“组织特异性启动子”。
如本文使用的，术语“引入”和“转染”可互换使用，并是指将分子，诸如，例如，核酸、多核苷酸分子、载体和类似物，转移或引入到靶细胞中，且更具体地进入靶细胞的膜包围的空间内部，诸如细胞的胞质溶胶、细胞的细胞核、线粒体的内部空间、内质网(ER)和类似物。分子可以通过本领域技术人员已知的任何方式被“引入”靶细胞中，所述方式例如Sambrook等Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor LaboratoryPress,New York(2001)所教导的，其内容通过引用并入本文。将分子“引入”细胞的方法包括，例如，但不限于：热激、磷酸钙转染、PEI转染、电穿孔、脂质体转染、转染试剂、病毒介导的转移等或其组合。在一些实施方案中，引入的核酸可以是，例如，可呈DNA、RNA形式的修饰的核酸。在一些实施方案中，核酸在被转染至细胞之前被脱水。在一些实施方案中，核酸被整合到载体，诸如，例如，表达载体中。每种可能性代表了本发明的独立的实施方案。
如本文使用的，术语“表达”是指，期望的终产物分子在靶细胞中的产生。终产物分子可包括例如，RNA分子；肽或蛋白；及类似物；或其组合。
如本文提及的，术语“患者”指疑似具有或诊断为患有疾病的受试者。在一些实施方案中，术语患者指具有或诊断为患有癌症的受试者。在一些实施方案中，患者符合肿瘤活检的条件。
如本文提及，术语“生物样品”指任何合适的身体来源的样品。样品可包括流体样品诸如全血、外周血单核细胞、白细胞、骨髓。样品可包括各种细胞和组织。样品可包括活检物。样品可包括固定的和/或包埋的组织切片。样品可以是新鲜提取的或冷冻的。在另一个实施方案中，样品是血液样品。在另一个实施方案中，样品是骨髓样品。在另一个实施方案中，用于分离和维持包含来自受试者的血细胞的样品的方法是本领域普通技术人员已知的。在一些实施方案中，包括多核苷酸、多肽、肽、抗体片段和其衍生物的样品可包括体液；细胞制剂的可溶性部分，或细胞生长于其中的培养基；从细胞中分离或提取的染色体、细胞器或膜；溶解的或与基底结合的基因组DNA、RNA或cDNA、多肽、或肽；细胞；组织；组织印记物(tissue print)；指纹、皮肤或毛发；其片段或衍生物。在一些实施方案中，生物样品从肿瘤中获得。
如本文提及，术语“患者来源的标志物”(“PDM”)和“受试者PDM”指从受试者的生物样品中(直接或间接)分离或获得(obtained)或得到(derived)的基因或基因产物(或其部分)，并且在功能测定中确定其活性。在一些实施方案中，向PDM核酸序列(其从生物样品直接获得(例如，通过生成cDNA)或被人工合成(即，间接获得))中添加5'和/或3'调控元件和/或另外的报告物基因。在一些实例中，如本文中所用的PDM包括嵌合核酸序列分子，所述嵌合核酸序列分子包含调控元件(启动子)-PDM序列-调控元件(IRES)-报告物基因，不必须以该顺序。因此，当这样的核酸分子被引入并表达于靶细胞中时，PDM基因产物(蛋白)和报告物基因产物(蛋白)在该细胞中表达。另外或可选择地，IRES序列可省略，而包含PDM基因产物和报告物基因产物的嵌合蛋白在细胞中表达。由此形成的嵌合蛋白在本文中称为“患者来源的报告物”(“PDR”)或“受试者PDR”。在一些实施方案中，术语“对照PDM”、“野生型PDM”、“相应的PDM”和“相应的野生型PDM”指用作对照的相应于PDM基因的野生型基因(即非突变的、全活性的)。在一些实施方案中，野生型PDM不源自患者的生物样品。使用对照PDM比较受试者PDM与野生型(wt)PDM的活性。
如本文提及的，术语“荧光易位报告物”(“FTR”)指嵌合报告物基因及相应的基因产物。嵌合FTR包含连接至预定靶(标志物)基因部分(诸如，例如，细胞信号传送蛋白、激酶、酶等)的报告物基因部分(诸如荧光标志物(蛋白))，据此靶(标志物)基因的至少一个属性可(直接或间接地)受所测试的PDM影响。
如本文提及的，术语“受试细胞”、“靶细胞”和“测定细胞”可互换使用。这些术语指，被转染了多核酸(poly nucleic acid)分子诸如本文所描述的PDM和/或PDR和/或FTR和/或任何对照基因的测定细胞。在一些实施方案中，受试细胞是真核细胞。在一些实施方案中，受试细胞可以是原代细胞或细胞系。在另一个实施方案中，测定细胞是非癌性细胞。在另一个实施方案中，测定细胞源自细胞系。在另一个实施方案中，测定细胞响应于至少一种癌症分泌的生长因子。在另一个实施方案中，测定细胞适合用转染。在另一个实施方案中，测定细胞适合用瞬时转染。在另一个实施方案中，测定细胞是一个或更多个内源基因的表达已通过任何分子方法被减少或消除的细胞。在另一个实施方案中，测定细胞是Hela细胞。在另一个实施方案中，测定细胞是HEK 293细胞。在另一个实施方案中，测定细胞是PC12细胞。在另一个实施方案中，测定细胞是U2OS细胞。在另一个实施方案中，测定细胞是NCI60细胞系，诸如，A549、EKVX、T47D、HT29。在一些实施方案中，测定细胞是源自患者的细胞。在一些实施方案中，测定细胞是源自癌症患者的细胞。
如本文使用的，术语“亚细胞定位”、“亚细胞区域”和“亚细胞区室”是指，细胞的可通过各种方法(诸如，例如，通过可视化方法)与细胞的其他区域区分开的任何限定部分。在一些实例中，亚细胞区域可以是细胞内受限制的区域。在一些实施方案中，亚细胞区域可包括细胞器。亚细胞定位的非限制性实例包括，例如，但不限于：细胞核、核仁、胞质溶胶、线粒体、内质网(ER)、叶绿体、膜、树突棘、高尔基体、溶酶体、过氧化物酶体，内体区室、细胞骨架等。每种可能性是独立的实施方案。在一些实施方案中，术语“亚细胞易位”是指，在各种条件下检测到的报告物基因(诸如，FTR或PDR)的亚细胞定位的改变。例如，易位可以是从胞质溶胶至细胞核/从细胞核至胞质溶胶。
如本文所提及的，术语“药物”、“受试化合物”和“受试药物”可以可互换使用。术语药物是指在治疗状况中有效果的任何化合物、物质(substance)、分子、剂和/或试剂。在一些实施方案中，药物是抗癌药物。在一些实施方案中，术语药物可以包括多于一种药物。在一些实施方案中，术语方法包括药物组合。在一些实施方案中，药物是细胞蛋白的表达和/或活性的抑制剂。
如本文提及的，术语“药物反应”和“对药物的敏感性”可互换使用。该术语是指由受试药物引起的反应或效果。在一些实施方案中，该术语涉及药物抑制突变诸如致癌突变的作用的能力。
在一些实施方案中，术语“治疗疾病”或“治疗状况”指，施用一种或更多种有效改善与疾病相关的症状、有效减轻严重程度或治愈该疾病，或有效预防疾病发生的化合物。
术语“检测”、“诊断”是指检测疾病、症状、紊乱、病理学或正常状况的方法；疾病、症状、紊乱、病理学状况的分类方法；确定疾病、症状、紊乱、病理学状况的严重程度的方法；监测疾病、症状、紊乱、病理学状况进展的方法；预测其恢复的结果和/或前景的方法。术语“诊断”意指鉴定病理学状况的存在或性质。
术语“基底”指，在其上放置核酸分子、构建体、载体和/或测定细胞的固体支持体。基底可包括任何类型的合适的基底，诸如，但不限于：芯片、载玻片、孔、容器、管、小瓶等。在一些实施方案中，基底是芯片。在一些实施方案中，基底是显微镜载玻片。在一些实施方案中，基底是多孔板，诸如6孔板、12孔板、24孔板、48孔板、96孔板、384孔板等。在一些实施方案中，基底被构造成使得其包括矩阵阵列(位点)，由此每个位点(或阵列中的点)被指定并且是可识别的。在一些实施方案中，核酸分子在基底上被脱水。在一些实施方案中，核酸分子在转染试剂的存在或不存在下在基底上被脱水。
术语“驱动突变”和“致癌突变”可互换使用。该术语涉及与疾病直接或间接相关的突变的基因或基因产物。在一些实施方案中，该术语涉及与疾病相关和/或参与疾病和/或能够导致和/或引起疾病的突变的基因或基因产物，所述疾病诸如癌症。
术语“可寻址阵列”是指包括空间上分开的位点的矩阵，所述位点的位置是可鉴定的和可辨识的。在一些示例性实施方案中，可寻址阵列可包括多孔板，其中每个孔(位点)是空间上可鉴定的。在其他示例性实施方案中，可寻址阵列可包括具有可分开的处于/位于指定阵列中的位点的任何基底。
术语“编码蛋白的多核苷酸”是指编码相应蛋白或其部分的多核苷酸序列或分子。在一些实施方案中，编码蛋白的多核苷酸包含编码相应蛋白的基因或其部分的核苷酸序列。
术语“致癌相关的指数”指包括可以通过关于其致癌活性或能力对所鉴定的突变(一种或更多种，或其组合)计算或分级而产生的任何类型的指数。在一些实施方案中，致癌相关的指数是数值。在一些实施方案中，致癌相关的指数反映体内突变的活性。在一些实施方案中，致癌相关的指数可以用于在相同基因中的不同突变之间和/或不同基因中的不同突变之间进行比较。
现参考图1，其图示地展示了根据一些实施方案的用于在患者的生物样品中鉴定患者特定驱动突变和用于鉴定其药物反应的方法中的示例性步骤的框图。如图1中所示，在步骤100处，获得患者的生物样品。所述生物样品可选自，但不限于：血液、血清、活检物、穿刺活检物、支气管肺泡灌洗液、胸膜积液、肿瘤组织、尿液、唾液和肿瘤组织。在一些实施方案中，所述生物样品可以是新鲜的(新鲜的或新鲜冷冻的)，即，未被固定的样品(步骤102)。在一些实施方案中，所述生物样品可通过本领域已知的用于固定生物样品的方法来固定(步骤104)。
如图1中所示，可从新鲜的生物样品(步骤102)提取多种组分，各自通过本领域熟知的适当方法提取。例如，如步骤106所示，可提取组织间液(IF)(细胞外液)并保存以备将来使用。此外，可从新鲜的生物样品提取mRNA(步骤108)。然后通过本领域熟知的方法(诸如，通过使用polydT引物)使用所提取/分离的mRNA产生cDNA文库(步骤110)。特定的PDMcDNA从cDNA文库扩增并通过使用对应预定的PDM的期望基因区域(多核苷酸)的适当引物对来创建。所选择的PDM可以是基于相应的WT PDM或不同疾病状态中的突变PDM(例如，致癌基因)的已知功能/活性/作用选择的。然后，在步骤112处，通过将调控型启动子元件添加至PDM cDNA的5'末端，并任选地添加3'IRES和标签，诸如报告物基因、荧光标签等来创建测定PDM。在一些实施方案中，启动子元件可以是组成型启动子或诱导型启动子。在一些实施方案中，PDM cDNA还可包括包含FTR编码部分的另外的表达盒。在一些实施方案中，特定的PDM通过人工合成/产生特定的PDM(基于其鉴定的序列)产生，而无需产生cDNA文库的步骤。
还如图1中所示，在步骤114处，可从固定的生物样品(诸如，福尔马林固定的样品(步骤104)中提取基因组DNA。在步骤116处，提取的DNA可经历特殊的、预定的外显子(已知其在癌症病例中发生突变)的扩增，和随后的连接/融合至包含缺少已被扩增的特定外显子的相应的全长基因的表达构建体以产生被测PDM。
然后，在步骤118中，步骤112和/或步骤116中产生(经由产生cDNA，或人工合成)的每种PDM的核酸分子可被放置/点样在支撑性基底(诸如，载玻片、孔(例如，微孔板的孔)、芯片等)上的指定位点(位置)。将PDM放置在具有编码嵌合报告物(FTR)的核酸分子的混合物中，其中选择FTR以对应于PDM(即，选择的FTR在功能上可(直接或间接地)受到PDM影响)。编码PDM和FTR的核酸分子的混合物还可包含适当的转染试剂以允许这些分子被转染到受试细胞。任选地，PDM+FTR混合物被脱水到基底上。在另一种选择中，PDM和FTR被构建为位于单个核酸分子上，以允许两种蛋白在细胞中独立表达。平行地，准备包括WT PDM和相应的FTR的对照测定。此外，在步骤118中，将足量的所选择的受试细胞连同合适的生长培养基一起添加至基底。可在添加核酸分子之前或之后添加细胞。在一些实施方案中，受试细胞的足够量包括约1-10000个细胞/孔(96多孔板的孔)。在一些实施方案中，受试细胞的足够量包括约1-50000个细胞/孔(24多孔板的孔)。在一些实施方案中，受试细胞的足够量包括约1-100000个细胞/孔(12多孔板的孔)。在一些实施方案中，受试细胞的足够量包括约1-1000个细胞/孔(96多孔板的孔)。在一些实施方案中，受试细胞的足够量包括约1-1000个细胞/孔(384多孔板的孔)。在一些实施方案中，受试细胞选自，但不限于：HeLa细胞、HEK 293细胞、U2OS、PC12、NCI60、A549、EKVX、T47D、HT29等。然后将细胞孵育指定的时间段(例如，在约6-60小时的范围内)，以允许FTR的表达和任选地PDM的表达。任选地，在一些实施方案中，在步骤118中，将细胞添加至固体基底(具有合适的生长培养基)持续一段时间(诸如0.5-48小时)，然后在允许分子转染进入细胞的条件下将编码PDM和/或FTR的核酸分子加入细胞。
然后，在步骤120处，在预定的时间段(诸如，4-60小时)之后，细胞生长培养基可更换为新鲜培养基。在一些实施方案中，更换的培养基是低血清培养基。然后，在另一孵育期(诸如，在4-16小时的范围内)之后，受控于诱导型启动子的PDM的表达的诱导被启动。诱导型启动子的诱导可被启动，例如，当使用四环素诱导型启动子时，可通过添加四环素来启动，或当使用蜕皮激素诱导型启动子时，可通过添加蜕皮激素来启动，或通过本领域已知的任何其他方法来启动。
任选地，在步骤122处，对于从固定的样品中产生的PDM(步骤116)，在预定的时间段(诸如，4-60小时)之后，细胞生长培养基更换为新鲜培养基。在一些实施方案中，更换的培养基是低血清培养基。然后，在另一温育期(诸如，在4-24小时的范围内)之后，PDM在组成型启动子的控制下表达。
然后，在步骤124处，在允许PDM在受试细胞中表达的另一时间段(诸如，例如，在约4-48小时的范围内)之后，确定FTR的亚细胞定位。确定FTR的亚细胞定位可通过各种方法进行，诸如，使用荧光显微镜成像，使用生物化学方法区分亚细胞区室。在一些示例性实施方案中，细胞被固定，并通过荧光成像确定荧光FTR的定位。对FTR在不同实验条件下的亚细胞定位的分析和比较允许确定关于所测试的PDM是否是有缺陷的(即，发生突变)。例如，在共表达FTR与所测试的PDM的细胞中确定FTR的亚细胞定位(测试测定)。此外，在共表达相同的FTR与WT PDM的细胞中确定该FTR的亚细胞定位(对照测定)。测试测定和对照测定的FTR的亚细胞定位之间的差异指示关于所测试的PDM的功能活性。因此，例如，在步骤126中，如果FTR在测试测定中被鉴定为处于与对照测定中相同的亚细胞定位，则所测试的PDM未发生突变。例如，在步骤128中，如果FTR在测试测定中被鉴定为处于与对照测定中不同的亚细胞定位，则所测试的PDM发生突变，这指示该PDM为驱动突变。然后，在步骤130处，对结果(即FTR的亚细胞定位的改变，诸如，例如，细胞核与细胞质(N:C)的比率)进行定量，以(例如，通过处理线路)确定/计算/产生致癌分级指数，所述致癌分级指数可以原样用于，或与另外的操作一起用于，在不同的突变、不同的基因等之间进行比较，并且提供进一步的患者特定的相关信息(诸如，预后)，如下文进一步详述的。
根据一些实施方案，提供了确定癌症患者的生物样品中的一种或更多种患者特定驱动突变的致癌相关的指数的方法，所述方法包括以下步骤的一个或更多个(以任何所选的顺序)：
a)从生物样品获得多种mRNA；
b)由多种mRNA产生cDNA文库；
c)使用与编码已知的信号转导蛋白的多核苷酸互补的一组引物扩增cDNA文库中的特定cDNA；
d)形成扩增的cDNA的单独的表达构建体，其中所述cDNA被可操作地连接至启动子；
e)形成携带来自样品的扩增的cDNA的第一组表达构建体及相应的野生型cDNA的第二组表达构建体的可寻址阵列；
f)对于阵列中的每个位点，加入编码荧光易位报告物(FTR)基因的表达载体，所述荧光易位报告物(FTR)基因包含连接至特定报告物基因部分的靶基因部分；
g)将活的测定细胞在使得DNA构建体和载体转染进入测定细胞的条件下添加至每个位点；
h)比较表达来自样品的cDNA与表达其相应的野生型表达的cDNA的测定细胞中表达的FTR的至少一个属性；其中，表达源自癌症患者的生物样品的cDNA与表达相应的野生型cDNA的测定细胞之间的不同结果，用于鉴定来自生物样品中的cDNA作为候选的患者特定驱动突变；以及
i)对候选的患者特定驱动突变的不同结果进行定量，以从而确定所述患者特定驱动突变的致癌相关的指数。
在一些实施方案中，定量步骤包括测量表达的FTR的至少一个属性。在一些实施方案中，定量步骤包括计算/估算/确定所测试的FTR/PDR的易位程度。在一些实施方案中，所测试的FTR/PDR的易位程度被进一步校准/归一化以推断所测试的PDM对恶性生长的影响。根据一些实施方案，致癌指数具有数值，其中值越高，所测试的FTR/PDM的致癌指数越高。在一些实施方案中，定量步骤包括给测量结果分配数值。
在一些实施方案中，PDM的表达盒和FTR的表达盒位于一个表达构建体上(即，在一个分子上)。在这类实施方案中，PDM表达盒和FTR表达盒可具有相同、相似或不同的启动子(即，PDM和FTR的表达可由相同或不同的启动子来控制)。在这类实施方案中，上文的步骤d)和f)被组合成一个步骤：(替代性的步骤d)：形成扩增的cDNA的单独的表达构建体，其中cDNA被可操作地连接至启动子，以产生受试患者来源的标志物(受试PDM)；其中所述表达构建体还包括特定报告物基因(FTR)。在一些实施方案中，FTR被连接至启动子(其可与PDM的启动子相同或不同)。在另外的实施方案中，FTR包含与报告物基因部分连接的靶基因部分。
在一些实施方案中，步骤g)在步骤e)和/或f)之前，在这些个例中，测定细胞在添加表达盒之前被添加至每个位点。
在一些实施方案中，所述方法在步骤e)中包括相应的PDM蛋白的第三组表达构建体，所述相应的PDM蛋白包含所述基因中的一种或更多种已知的驱动突变(本文中的“人工PDM”)，其可以被用作实验对照。将第三组表达构建体添加到可寻址阵列。
在一些实施方案中，致癌相关的指数可以选自致癌分级指数、治疗指数、总致癌指数、总治疗指数、转移指数、血管生成指数、基因组不稳定性指数、微管动态不稳定性指数、细胞周期进程指数、凋亡指数、分化指数等或其组合。每种可能性是独立的实施方案。
根据一些实施方案，提供了确定癌症患者的生物样品中的一种或更多种患者特定驱动突变的致癌分级指数的方法，所述方法包括以下步骤的一个或更多个(以任何所选的顺序)：
a)从生物样品获得多种mRNA；
b)由多种mRNA产生cDNA文库；
c)使用与编码已知的信号转导蛋白的多核苷酸互补的一组引物扩增cDNA文库中的特定cDNA；
d)形成扩增的cDNA的单独的表达构建体，其中所述cDNA被可操作地连接至启动子；
e)形成携带来自生物样品的扩增的cDNA的第一组表达构建体及相应的野生型cDNA的第二组表达构建体的可寻址阵列；
f)对于阵列中的每个位点，加入编码荧光易位报告物(FTR)基因的表达载体，所述荧光易位报告物(FTR)基因包含连接至特定报告物基因部分的靶基因部分；
g)将活的测定细胞在使得DNA构建体和载体转染进入测定细胞的条件下添加至每个位点；
h)比较表达来自生物样品的cDNA与表达其相应的野生型表达的cDNA的测定细胞中表达的FTR的至少一个属性；其中，表达源自癌症患者的生物样品的cDNA与表达相应的野生型cDNA的测定细胞之间的不同结果，用于鉴定来自生物样品中的cDNA作为候选的患者特定驱动突变；以及
i)对候选的患者特定驱动突变的不同结果进行定量，以从而确定所述患者特定驱动突变的致癌分级指数。
在一些实施方案中，PDM的表达盒和FTR的表达盒位于一个表达构建体上(即，在一个分子上)。在这类实施方案中，PDM表达盒和FTR表达盒可具有相同、相似或不同的启动子(即，PDM和FTR的表达可由相同或不同的启动子来控制)。在这类实施方案中，上文的步骤d)和f)被组合成一个步骤：(替代性的步骤d)：形成扩增的cDNA的单独的表达构建体，其中cDNA被可操作地连接至启动子，以产生受试患者来源的标志物(受试PDM)；其中所述表达构建体还包括特定报告物基因(FTR)。在一些实施方案中，FTR被连接至启动子(其可与PDM的启动子相同或不同)。在另外的实施方案中，FTR包含与报告物基因部分连接的靶基因部分。
在一些实施方案中，步骤g)在步骤e)和/或f)之前，在这些个例中，测定细胞在添加表达盒之前被添加至每个位点。
在一些实施方案中，所述方法在步骤e)中包括相应的PDM蛋白的第三组表达构建体，所述相应的PDM蛋白包含所述基因中的一个或更多个已知的驱动突变(本文中的“人工PDM”)，其可以被用作实验对照。将第三组表达构建体添加到可寻址阵列。
在另外的实施方案中，所述方法还包括步骤j)，所述步骤j)包括在药物的存在下重复步骤g)至i)中的任一个，并且比较在药物的存在和/或不存在下表达来自样品的cDNA和/或表达相应的野生型表达的cDNA的测定细胞中表达的FTR的至少一个属性；其中表达源自癌症患者的生物样品的cDNA与表达相应的野生型cDNA的测定细胞之间的不同结果用于鉴定来自生物样品中的cDNA作为候选的患者特定驱动突变；并且其中在药物的不存在或存在下表达源自癌症患者的生物样品的cDNA的测定细胞之间的不同结果指示候选的患者特定驱动突变的药物反应。
在一些实施方案中，定量步骤包括测量表达的FTR的至少一个属性。在一些实施方案中，定量步骤包括计算/估算/确定所测试的FTR/PDR的易位程度。在一些实施方案中，所测试的FTR/PDR的易位程度被进一步校准/归一化以推断所测试的PDM对恶性生长的影响。根据一些实施方案，致癌指数具有数值，其中值越高，所测试的FTR/PDM的致癌指数越高。在一些实施方案中，定量步骤包括给测量结果分配数值。
在一些实施方案中，生物样品选自肿瘤细胞、肿瘤活检物、肿瘤组织和体液。
根据一些实施方案，可以在测定细胞中使用给定的FTR测试两种或更多种PDM的组合，以测量/确定/鉴定PDM的累积效应(cumulative effect)。
根据一些实施方案，所述方法可以包括将多于一种PDM的离散的表达构建体引入测定细胞中。在一些实施方案中，离散的表达构建体可以伴随地或顺序地被引入。在一些实施方案中，所述方法可以包括将编码多于一种PDM的(例如，编码两种离散的PDM，三种离散的PDM等)的表达盒引入细胞。
根据一些实施方案，提供了确定癌症患者的生物样品中的一种或更多种患者特定驱动突变的致癌分级指数的方法，所述方法包括以下步骤的一个或更多个：
a)从生物样品获得多种mRNA；
b)由多种mRNA产生cDNA文库；
c)使用与编码已知的信号转导蛋白的多核苷酸互补的一组引物扩增cDNA文库中的特定cDNA；
d)形成扩增的cDNA的单独的表达构建体，其中所述cDNA被可操作地连接至启动子；
e)在可寻址阵列中，将活的测定细胞添加至基底；
f)将携带来自生物样品的扩增的cDNA的第一组表达构建体和携带相应的野生型cDNA的第二组表达构建体添加至测定细胞；其中将每种表达构建体在使得表达构建体转染进入测定细胞的条件下添加至位于不同的可寻址位点处的测定细胞；
g)对于阵列中的每个位点，将编码荧光易位报告物(FTR)基因的表达载体添加至测定细胞，所述荧光易位报告物(FTR)基因包含连接至特定报告物基因部分的靶基因部分；
h)比较表达来自样品的cDNA与表达其相应的野生型表达的cDNA的测定细胞中表达的FTR的至少一个属性；其中，表达源自癌症患者的生物样品的cDNA与表达相应的野生型cDNA的测定细胞之间的不同结果，用于鉴定来自生物样品中的cDNA作为候选的患者特定驱动突变；以及
i)对候选的患者特定驱动突变的不同结果进行定量，以从而确定所述患者特定驱动突变的致癌分级指数。
在一些实施方案中，用指定的FTR稳定地转染测定细胞，并且可以将这类表达相应的FTR的测定细胞用于本文公开的方法中。
在一些实施方案中，所述方法在步骤f)中包括在使得转染的条件下向位于不同的可寻址位点处的测定细胞添加相应的PDM蛋白的第三组表达构建体，所述相应的PDM蛋白包含所述基因中的一种或更多种已知的驱动突变(相应的人工PDM)。
在一些实施方案中，所述方法还包括，比较表达来自样品的cDNA与表达相应的野生型表达的cDNA的细胞中的FTR的至少一个属性；其中，表达生物样品来源的cDNA与表达相应的野生型cDNA的测定细胞之间的不同的结果，用于鉴定来自所述生物样品中的cDNA作为候选的患者特定致癌突变。
在一些实施方案中，所述方法还包括重复以下步骤：将药物添加至测定细胞并且比较在药物的存在和不存在下在表达来自样品的cDNA和/或表达相应的野生型表达的cDNA的测定细胞中表达的FTR的至少一个属性；其中在药物的不存在或存在下表达源自癌症患者的生物样品的cDNA的测定细胞之间的不同结果指示候选的患者特定致癌突变的药物反应。
根据一些实施方案，提供了用于确定癌症患者的生物样品中的异常信号转导蛋白和/或患者特定致癌突变的致癌相关的指数的方法，所述方法包括以下步骤的一个或更多个(以任何适当的顺序)：
a)从癌症患者的生物样品，诸如从肿瘤的活检物获得多种mRNA样品；
b)通过本领域已知的方法，由多种肿瘤mRNA产生cDNA文库；
c)使用与编码已知蛋白的多核苷酸互补的一组引物扩增cDNA文库的单独的cDNA样品，其中所述蛋白参与多种细胞信号传送途径；
d)形成扩增的cDNA的单独表达构建体，其中所述cDNA被可操作地连接至启动子和报告物基因，以产生嵌合的受试患者来源的报告物(受试PDR)；
e)形成携带来自肿瘤的扩增的cDNA(受试PDR)的第一组表达构建体及平行的cDNA(wt PDR)的第二组表达构建体的可寻址阵列；
f)任选地在支撑性固体基底上干燥cDNA构建体；
g)将活的测定细胞在使得DNA构建体转染进入测定细胞的条件下添加至每个位点；
h)允许构建体和表达载体在转染的细胞中表达，以获得第一组来自肿瘤的cDNA的基因产物；
i)比较表达来自肿瘤的cDNA与表达其相应的野生型表达的cDNA的细胞中的嵌合报告物基因的至少一个属性，其中，表达源自癌症患者的生物样品的cDNA与表达相应的野生型cDNA的测定细胞之间的不同结果，用于鉴定来自生物样品中的cDNA作为候选的患者特定驱动突变；以及
j)对候选的患者特定驱动突变的不同结果进行定量，以从而确定所述患者特定驱动突变的致癌分级指数。
在一些实施方案中，所述方法还包括将所述细胞与受试药物孵育的步骤。在一些实施方案中，药物是抗癌药物/剂。在一些实施方案中，将多于一种药物添加至细胞。在一些实施方案中，可以将药物组合(混合物)添加至细胞。在一些实施方案中，当将多于一种药物添加至细胞时，可以以任何时间间隔伴随地或顺序地添加药物并且持续任何孵育时间段。
在一些实施方案中，PDM的表达盒和FTR的表达盒位于一个表达构建体上(即，在一个分子上)。在这类实施方案中，PDM表达盒和FTR表达盒可具有相同、相似或不同的启动子(即，PDM和FTR的表达可由相同或不同的启动子来控制)。在一些实施方案中，步骤g)可在步骤e)和/或f)之前，在这些个例中，测定细胞在添加表达构建体和/或表达载体之前被添加至每个位点。
在一些实施方案中，在受试化合物的存在下获得的结果可以用于确定治疗指数，所述治疗指数指示致癌指数的降低。
根据一些实施方案，提供了用于确定来自癌症患者的生物样品的能够影响致瘤性(tumoriogenity)的细胞外和/或细胞内因子的致癌相关的指数的方法，所述方法包括以下步骤的一个或更多个(以任何适当的顺序)：
a)在可寻址阵列中，将活的测定细胞添加至基底；
b)对于阵列中的每个位点，将荧光易位报告物(FTR)基因的表达载体添加至测定细胞，所述荧光易位报告物(FTR)基因包含连接至特定报告物基因部分的靶基因部分；
c)在阵列的特定位点将患者的生物样品添加至测定细胞；
d)比较其中添加了患者的生物样品的细胞与其中未添加生物样品的相应细胞中表达的FTR的至少一个属性，其中，其中添加了患者的生物样品的细胞与其中未添加生物样品的相应细胞之间的不同结果用于鉴定能够影响致瘤性的因子；以及
e)对能够影响致瘤性的因子的不同结果进行定量以从而确定所述能够影响致瘤性的因子的致癌分级指数。
在一些实施方案中，生物样品选自患者肿瘤微环境、细胞外液、来自肿瘤的分泌液、血浆、支气管肺泡灌洗液及类似物或其组合。
在一些实施方案中，能够影响致瘤性的因子选自自分泌因子、旁分泌因子或两者。在一些实施方案中，所述因子是细胞外因子、细胞内因子或两者。在一些实施方案中，所述因子可以选自任何类型的分子，诸如，但不限于：蛋白(例如，生长因子)、核酸等。
在一些实施方案中，测定细胞稳定表达FTR。在一些实施方案中，步骤b)可以在步骤a)之前，在这些个例中，将测定细胞添加至已添加在可寻址阵列中的FTR的表达载体。
根据一些实施方案，提供了产生和/或确定和/或生成和/或估算一种或更多种患者特定突变的致癌指数的方法，所述方法包括以下步骤：
a)形成携带包含患者特定突变的基因的第一组表达构建体及相应的野生型基因的第二组表达构建体的可寻址阵列；
b)对于可寻址阵列中的每个位点，添加编码荧光易位报告物(FTR)基因的表达载体，所述荧光易位报告物(FTR)基因包含连接至特定报告物基因部分的靶基因部分；
c)将活的测定细胞在使得表达构建体和表达载体转染进入测定细胞的条件下添加至每个位点；
d)比较表达包含突变的基因与表达其相应的野生型表达的基因的测定细胞中表达的FTR的亚细胞定位和/或易位，以鉴定不同结果；
e)通过以下步骤对候选的患者特定突变的不同结果进行定量：
i)处理所述不同结果以确定所测试的FTR在第一组表达构建体和第二组表达构建体的存在下的易位程度，以确定患者特定突变的活化水平；
ii)基于FTR在第二组表达构建体的存在下的易位程度，归一化FTR在第一组表达载体的存在下的易位程度，以确定患者特定突变的归一化的活化水平；以及
iii)分析患者特定突变的归一化的活化水平与临床结果(参考)之间的映射/相关性；
以从而确定所述患者特定突变的致癌分级指数。
根据一些实施方案，分析可以包括利用机器学习。在一些实施方案中，分析可以包括诸如这类方法，但不限于：相关性单变量分析机、多变量分析机、支持向量机、广义线性模型机或其组合。
在一些实施方案中，易位程度基于核质比(NCR)来确定。在一些实施方案中，临床结果参考/结果可以包括诸如这类参考，但不限于：临床试验、测试实验室的临床结果、由医疗保健提供者得到的治疗临床结果、本领域的参考文献等，或其组合。
在一些实施方案中，指数具有指示候选的患者特定突变驱动恶性肿瘤的能力的数值。
在一些实施方案中，指数可以指示患者的无进展生存期、患者的总存活率、药物反应的概率、进展时间(TTP)、肿瘤反应率、复发、无病生存期(DFS)。
在一些实施方案中，患者特定突变的易位程度可以被进一步归一化为对患者特定突变参与的细胞信号传送途径的影响。
在一些实施方案中，患者基因可以(直接或间接)源自患者的生物样品。在一些实施方案中，突变中的至少一个是致癌突变。在一些实施方案中，突变是驱动突变。在一些实施方案中，患者特定基因可以基于基因序列被人工合成(例如，通过合成寡核苷酸)。
在一些实施方案中，第一和/或第二组表达构建体包含双链线性DNA。在一些实施方案中，第一和/或第二组表达构建体的启动子是诱导型或组成型启动子。在一些实施方案中，第一和/或第二组表达构建体携带基因的一部分。在一些实施方案中，所述方法可以还包括在转染试剂的存在下在固体支持体上干燥构建体和/或载体的步骤。
在一些实施方案中，步骤c)可以在步骤a)和/或b)之前，在这些个例中，测定细胞在添加表达盒之前被添加至每个位点。
在一些实施方案中，所述方法可以还包括可以被用作实验对照的相应的PDM蛋白的第三组表达构建体，所述相应的PDM蛋白包含所述基因中的一个或更多个已知的突变(人工PDM)。将第三组表达构建体添加到可寻址阵列。
在一些实施方案中，所述方法可以还包括将受试药物添加至细胞的步骤。在一些实施方案中，所述方法可以还包括计算治疗指数，所述治疗指数指示患者特定突变驱动恶性生长的能力响应于受试药物的降低。
根据一些实施方案，提供了产生和/或确定和/或生成和/或估算一种或更多种患者特定突变的致癌指数的方法，所述方法包括以下步骤：
a)将活的测定细胞在使得表达构建体和表达载体转染进入测定细胞的条件下添加至可寻址阵列中的基底；
b)对于阵列中的每个位点，将荧光易位报告物(FTR)基因的表达载体添加至测定细胞，所述荧光易位报告物(FTR)基因包含连接至特定报告物基因部分的靶基因部分；
c)在可寻址阵列的特定位点，将携带包含患者特定突变的基因的第一组表达构建体添加至测定细胞，并且在特定位点，将相应的野生型基因的第二组表达构建体添加至测定细胞，其中第一组表达构建体和第二组表达构建体未被加入至共同位点；
d)比较表达包含突变的基因与表达其相应的野生型表达的基因的测定细胞中表达的FTR的亚细胞定位和/或易位，以鉴定不同结果；
e)通过以下步骤对候选的患者特定突变的不同结果进行定量：
i)处理所述不同结果以确定所测试的FTR在第一组表达构建体和第二组表达构建体的存在下的易位程度，以确定患者特定突变的活化水平；
ii)基于FTR在第二组表达构建体的存在下的易位程度，归一化FTR在第一组表达构建体的存在下的易位程度，以确定患者特定突变的归一化的活化水平；以及
iii)分析患者特定突变的归一化的活化水平与临床结果(参考)之间的映射/相关性；
以从而确定所述患者特定突变的致癌分级指数。
根据一些实施方案，提供了用于产生致癌分级指数的系统，所述系统包括处理线路，所述处理线路被配置为：
a)获得指示受试细胞中荧光易位报告物(FTR)基因产物在第一组表达构建体的存在下和在第二组表达构建体的存在下的亚细胞易位程度的不同结果；
b)基于FTR的亚细胞易位或定位的程度确定患者特定突变的活化水平；
c)基于FTR在第二组表达构建体的存在下的易位程度，归一化FTR在第一组表达构建体的存在下的亚细胞易位或定位，以确定患者特定突变的归一化的活化水平；以及
d)分析患者特定突变的活化水平与临床结果(参考)之间的相关性/映射，以从而确定致癌指数；
其中所述不同结果通过以下步骤获得：
i)形成携带包含患者特定突变的基因的第一组表达构建体及相应的野生型基因的第二组表达构建体的可寻址阵列；
ii)对于可寻址阵列中的每个位点，添加编码荧光易位报告物(FTR)基因的表达载体，所述荧光易位报告物(FTR)基因包含连接至特定报告物基因部分的靶基因部分；以及
iii)将活的测定细胞在使得表达构建体和表达载体转染进入测定细胞的条件下添加至每个位点。
在一些实施方案中，分析可以包括机器学习或任何其他合适的计算方法。在一些实施方案中，分析可以包括相关性单变量分析、相关性多变量分析、支持向量机、广义线性模型分析或其任何组合。
在一些实施方案中，步骤iii)在步骤i)和/或ii)之前，在这些个例中，测定细胞在添加表达构建体和/或表达载体之前被添加至每个位点。
在一些实施方案中，所述系统可以还包括可以被用作实验对照的相应的PDM蛋白的第三组表达构建体，所述相应的PDM蛋白包含所述基因中的一个或更多个已知的突变(人工PDM)。将第三组表达构建体添加到可寻址阵列。
在一些实施方案中，还可以将处理线路配置为计算治疗指数，所述治疗指数指示患者特定突变驱动恶性生长的能力响应于受试药物的降低。
根据一些实施方案，提供了用于产生致癌分级指数的系统，所述包括处理线路，所述处理线路被配置为：
a)获得指示受试细胞中荧光易位报告物(FTR)基因产物在第一组表达构建体的存在下和在第二组表达构建体的存在下的亚细胞易位程度的不同结果；
b)基于FTR的亚细胞易位或定位的程度确定患者特定突变的活化水平；
c)基于FTR在第二组表达构建体的存在下的易位程度，归一化FTR在第一组表达构建体的存在下的亚细胞易位和/或定位，以确定患者特定突变的归一化的活化水平；以及
d)分析患者特定突变的活化水平与临床结果(参考)之间的相关性，以从而确定致癌指数；
其中所述不同结果通过以下步骤获得：
i)将活的测定细胞在使得表达构建体和表达载体转染进入测定细胞的条件下添加至每个位点；
ii)形成携带包含患者特定突变的基因的第一组表达构建体及相应的野生型基因的第二组表达构建体的可寻址阵列；
iii)对于可寻址阵列中的每个位点，添加编码荧光易位报告物(FTR)基因的表达载体，所述荧光易位报告物(FTR)基因包含连接至特定报告物基因部分的靶基因部分；
根据一些实施方案，提供了用于产生致癌分级指数的系统，所述系统包括处理线路，所述处理线路被配置为：
a)获得指示受试细胞中荧光易位报告物(FTR)基因产物在第一组表达构建体的存在下和在第二组表达构建体的存在下的亚细胞易位程度的不同结果；
b)基于FTR的亚细胞易位或定位的程度确定患者特定突变的活化水平；
c)基于FTR在第二组表达构建体的存在下的易位程度，归一化FTR在第一组表达构建体的存在下的亚细胞易位和/或定位，以确定患者特定突变的归一化的活化水平；以及
d)分析患者特定突变的活化水平与临床结果(参考)之间的相关性/映射，以从而确定致癌指数；
其中所述不同结果通过这样的方法获得，所述方法包括以下步骤的一个或更多个：
i.从癌症患者的生物样品，诸如从肿瘤的活检物获得多种mRNA样品；
ii.通过本领域已知的方法，由多种肿瘤mRNA产生cDNA文库；
iii.使用与编码已知蛋白的多核苷酸互补的一组引物扩增cDNA文库的单独的cDNA样品，其中所述蛋白参与多种细胞信号传送途径；
iv.形成扩增的cDNA的单独表达构建体，其中所述cDNA被可操作地连接至启动子和报告物基因，以产生嵌合的受试患者来源的报告物(受试PDR)；
v.形成携带来自肿瘤的扩增的cDNA(受试PDR)的第一组表达构建体及平行的cDNA(wt PDR)的第二组表达构建体的可寻址阵列；
vi.任选地在支撑性固体基底上干燥cDNA构建体；
vii.将活的测定细胞在使得DNA构建体转染进入测定细胞的条件下添加至每个位点；viii.允许构建体和表达载体在转染的细胞中表达，以获得第一组来自肿瘤的cDNA的基因产物；
ix.比较表达来自肿瘤的cDNA与表达其相应的野生型表达的cDNA的细胞中的嵌合报告物基因的至少一个属性；其中，表达源自癌症患者的生物样品的cDNA与表达相应的野生型cDNA的测定细胞之间的不同结果，用于鉴定来自生物样品中的cDNA作为候选的患者特定驱动突变；以及
x.对候选的患者特定驱动突变的不同结果进行定量，以从而确定所述患者特定驱动突变的致癌分级指数。
根据一些实施方案，提供了产生指示一种或更多种患者特定突变对药物治疗的敏感性的治疗指数的方法，所述方法包括以下步骤：
a)形成携带包含患者特定突变的基因的第一组表达构建体及相应的野生型基因的第二组表达构建体的可寻址阵列；
b)对于可寻址阵列中的每个位点，添加编码荧光易位报告物(FTR)基因的表达载体，所述荧光易位报告物(FTR)基因包含连接至特定报告物基因部分的靶基因部分；
c)将活的测定细胞在使得表达构建体和表达载体转染进入测定细胞的条件下添加至每个位点；
d)比较在药物的存在或不存在下表达包含突变的基因与表达其相应的野生型表达的基因的测定细胞中表达的FTR的亚细胞定位和/或易位，以鉴定不同结果；
e)通过以下步骤对候选的患者特定突变的不同结果进行定量：
i)处理所述不同结果以确定所测试的FTR在第一组表达构建体和第二组表达构建体的存在下的亚细胞易位程度，以确定在药物的存在或不存在下患者特定突变的活化水平；
ii)在药物的存在或不存在下，基于FTR在第二组表达构建体的存在下的亚细胞易位程度，归一化FTR在第一组表达载体的存在下的亚细胞易位程度，以确定患者特定突变的归一化的活化水平；以及
iii)分析在药物的存在或不存在下的患者特定突变的归一化的活化水平与临床结果(参考)之间的相关性；
以从而确定药物对患者特定突变的治疗指数。
在一些实施方案中，药物是抗癌药物。在一些实施方案中，所述方法可以包括伴随地或顺序地添加多于一种药物。在一些实施方案中，所述方法可以包括添加药物组合。在一些实施方案中，所述方法可以包括添加不同浓度的药物。
在一些实施方案中，步骤c)可以在步骤a)和/或步骤b)之前。
根据一些实施方案，提供了产生指示一种或更多种患者特定突变对药物治疗的敏感性的治疗指数的方法，所述方法包括以下步骤：
a)将活的测定细胞在使得表达构建体和表达载体转染进入测定细胞的条件下添加至每个位点；
b)形成携带包含患者特定突变的基因的第一组表达构建体及相应的野生型基因的第二组表达构建体的可寻址阵列；
c)对于可寻址阵列中的每个位点，添加编码荧光易位报告物(FTR)基因的表达载体，所述荧光易位报告物(FTR)基因包含连接至特定报告物基因部分的靶基因部分；
d)比较表达包含突变的基因与表达其相应的野生型表达的基因的测定细胞中表达的FTR的亚细胞定位和/或易位，以鉴定不同结果；
e)通过以下步骤对候选的患者特定突变的不同结果进行定量：
i)处理所述不同结果以确定所测试的FTR在第一组表达构建体和第二组表达构建体的存在下的亚细胞易位程度，以确定在药物的存在或不存在下患者特定突变的活化水平；
ii)基于FTR在第二组表达构建体的存在下的亚细胞易位程度，归一化FTR在第一组表达载体的存在下的亚细胞易位程度，以确定患者特定突变的归一化的活化水平；以及
iii)分析在药物的存在或不存在下的患者特定突变的归一化的活化水平与临床结果(参考)之间的相关性；
以从而确定药物对患者特定突变的治疗指数。
根据一些实施方案，提供了用于产生指示一种或更多种患者特定突变对药物治疗的敏感性的治疗指数的系统，所述系统包括处理线路，所述处理线路被配置为：
a)获得指示在药物或药物组合的存在和不存在下受试细胞中荧光易位报告物(FTR)基因产物在第一组表达构建体的存在下和在第二组表达构建体的存在下的亚细胞易位程度的不同结果；
b)基于FTR的亚细胞易位或定位的程度确定患者特定突变的活化水平；
c)在药物或药物组合的存在或不存在下，基于FTR在第二组表达构建体的存在下的易位程度，归一化FTR在第一组表达构建体的存在下的亚细胞易位和/或定位，以确定患者特定突变的归一化的活化水平；以及
d)分析患者特定突变的活化水平与临床结果(参考)之间的相关性/映射，以从而确定致癌指数；
其中所述不同结果通过以下步骤获得：
i)形成携带包含患者特定突变的基因的第一组表达构建体及相应的野生型基因的第二组表达构建体的可寻址阵列；
ii)对于可寻址阵列中的每个位点，添加编码荧光易位报告物(FTR)基因的表达载体，所述荧光易位报告物(FTR)基因包含连接至特定报告物基因部分的靶基因部分；以及
iii)将活的测定细胞在使得表达构建体和表达载体转染进入测定细胞的条件下添加至每个位点。
根据一些实施方案，提供了用于产生指示一种或更多种患者特定突变对药物治疗的敏感性的治疗指数的系统，所述系统包括处理线路，所述处理线路被配置为：
a)获得指示在药物或药物组合的存在和不存在下受试细胞中荧光易位报告物(FTR)基因产物在第一组表达构建体的存在下和在第二组表达构建体的存在下的亚细胞易位程度的不同结果；
b)基于FTR的亚细胞易位或定位的程度确定患者特定突变的活化水平；
c)在药物或药物组合的存在或不存在下，基于FTR在第二组表达构建体的存在下的易位程度，归一化FTR在第一组表达构建体的存在下的亚细胞易位和/或定位，以确定患者特定突变的归一化的活化水平；以及
d)分析患者特定突变的活化水平与临床结果(参考)之间的相关性/映射，以从而确定致癌指数；
其中所述不同结果通过以下步骤获得：
i)将活的测定细胞在使得表达构建体和表达载体转染进入测定细胞的条件下添加至每个位点；
ii)形成携带包含患者特定突变的基因的第一组表达构建体及相应的野生型基因的第二组表达构建体的可寻址阵列；以及
iii)对于可寻址阵列中的每个位点，添加编码荧光易位报告物(FTR)基因的表达载体，所述荧光易位报告物(FTR)基因包含连接至特定报告物基因部分的靶基因部分。
根据一些实施方案，提供了用于产生指示一种或更多种患者特定突变对药物治疗的敏感性的治疗指数的系统，所述系统包括处理线路，所述处理线路被配置为：
a)获得指示在药物或药物组合的存在和不存在下受试细胞中荧光易位报告物(FTR)基因产物在第一组表达构建体的存在下和在第二组表达构建体的存在下的亚细胞易位程度的不同结果；
b)基于其亚细胞易位或定位的程度确定患者特定突变的活化水平；
c)在药物或药物组合的存在或不存在下，基于FTR在第二组表达构建体的存在下的易位程度，归一化FTR在第一组表达构建体的存在下的亚细胞易位和/或定位，以确定患者特定突变的归一化的活化水平；以及
d)分析患者特定突变的活化水平与临床结果(参考)之间的相关性/映射，以从而确定致癌指数；
其中所述不同结果通过方法获得，所述方法包括以下步骤的一个或更多个：
i.从癌症患者的生物样品，诸如从肿瘤的活检物获得多种mRNA样品；
ii.通过本领域已知的方法，由多种肿瘤mRNA产生cDNA文库；
iii.使用与编码已知蛋白的多核苷酸互补的一组引物扩增cDNA文库的单独的cDNA样品，其中所述蛋白参与多种细胞信号传送途径；
iv.形成扩增的cDNA的单独表达构建体，其中所述cDNA被可操作地连接至启动子和报告物基因，以产生嵌合的受试患者来源的报告物(受试PDR)；
v.形成携带来自肿瘤的扩增的cDNA(受试PDR)的第一组表达构建体及平行的cDNA(wt PDR)的第二组表达构建体的可寻址阵列；
vi.任选地在支撑性固体基底上干燥cDNA构建体；
vii.将活的测定细胞在使得DNA构建体转染进入测定细胞的条件下添加至每个位点；
viii.允许构建体和表达载体在转染的细胞中表达，以获得第一组来自肿瘤的cDNA的基因产物；
ix.比较表达来自肿瘤的cDNA与表达其相应的野生型表达的cDNA的细胞中的嵌合报告物基因的至少一个属性；其中，表达源自癌症患者的生物样品的cDNA与表达相应的野生型cDNA的测定细胞之间的不同结果，用于鉴定来自生物样品中的cDNA作为候选的患者特定驱动突变；以及
x.对候选的患者特定驱动突变的不同结果进行定量，以从而确定所述患者特定驱动突变的致癌分级指数。
根据一些实施方案，本文公开的方法和系统中使用的表达构建体可以通过方法获得，所述方法包括以下步骤的一个或更多个：
i)由获得自患者的生物样品的多种mRNA产生cDNA文库；
ii)使用与编码疑似携带致癌突变的基因的多核苷酸互补的一组引物扩增cDNA文库的特定cDNA；以及
iii)将扩增的cDNA可操作地连接至启动子。
在一些实施方案中，可以通过本领域已知的方法合成疑似携带一种或更多种突变的患者的基因或基因部分，并且任选地将其可操作地连接至启动子以获得表达构建体。在一些实施方案中，如本文详述的，患者基因(或其部分)和/或相应的野生型(WT)基因可以基于其序列被人工合成并且被进一步处理以产生相应的PDM。
根据一些实施方案，所鉴定的突变连同关于突变的数据，连同获得的关于旁分泌/自分泌活化的途径的数据，可以一起用于产生“肿瘤致癌基因图谱”，其指示患者肿瘤中受影响的信号传送途径以及突变的基因和其致癌活性。在一些实施方案中，肿瘤致癌基因图谱包括所测试的基因的单独的致癌指数的总结。在一些实施方案中，突变是致癌突变。在一些实施方案中，突变是驱动突变。
根据一些实施方案，鉴定患者特定突变和其参与的信号传送途径(即产生肿瘤致癌基因图谱)之后，可以进行第二次测试，其中所述第二次测试测定在处理的存在下进行，所述处理诸如已知抑制/影响所鉴定的途径/突变的靶向疗法药物/剂/组合物。因此可以确定对患者肿瘤的致癌指数有影响的药物/剂/组合物。在一些实施方案中，由所测试的药物/剂/组合物引起的致癌活性的改变在本文中被称为“治疗指数”。
在一些实施方案中，多种药物/剂治疗和其各自的治疗指数可以被添加到“肿瘤致癌基因图谱”上，并且为医疗保健提供者提供患者特定的根本的分子肿瘤机制和治疗选择以及其各自期望的用于治疗特定患者的功效。
根据一些实施方案，因此提供了用于鉴定能够影响患者特定肿瘤的致癌指数的候选治疗的方法，所述方法包括(通过本文公开的任何方法)鉴定患者特定驱动突变并且(通过本文公开的任何方法)测试候选药物对患者的生物样品中的患者特定驱动突变的影响。在一些实施方案中，候选治疗是药物、剂、组合物或任何类型的治疗。
根据一些实施方案，提供了用于确定致癌指数的方法，所述致癌指数指示给定的所鉴定的致癌突变/畸变(PDR/PDM)驱动给定的患者肿瘤样品中恶性生长的能力，所述方法包括计算/估算/确定所测试的FTR/PDR的易位程度，所述所测试的FTR/PDR的易位程度被校准/归一化以推断所测试的PDM对恶性生长的影响。根据一些实施方案，致癌指数具有数值，其中值越高，所测试的FTR/PDM的致癌指数越高。在一些实施方案中，致癌指数在1-100的范围内。在一些实施方案中，致癌指数在1-50的范围内。在一些实施方案中，致癌指数在1-10的范围内。在一些实施方案中，致癌指数在0-10的范围内。在一些实施方案中，致癌指数在0-5的范围内。在一些实施方案中，致癌指数在0-1的范围内。
根据一些实施方案，术语“致癌指数”和“致癌分级指数”可以可互换使用。该术语是指指示给定的致癌突变/畸变驱动给定的患者肿瘤样品中恶性生长的能力的值。
根据一些实施方案，被鉴定为携带致癌突变的每个基因被分配致癌指数，所述致癌指数能够使不同的所鉴定的肿瘤的驱动突变之间的严重性比较成为可能。
根据一些实施方案，术语“总致癌指数”是指指示所有信号传送途径中的所有所鉴定的突变驱动给定的患者肿瘤样品中恶性生长的总能力的值。在一些实施方案中，总致癌指数可以通过将所鉴定的突变的基因的所有致癌指数加在一起来计算，并且指示疾病的总体严重性。
根据一些实施方案，术语“治疗指数”是指反映由患者肿瘤的一种或更多种抗癌治疗(诸如药物治疗)产生的致癌指数的改变的值(诸如数值)。
根据一些实施方案，术语“总治疗指数”是指将由患者肿瘤的完全组合药物治疗产生的总致癌指数的总体改变加在一起的值(诸如数值)。
在一些实施方案中，治疗指数可以基于特定的所测试的基因、基因的组或基因的组合的致癌指数、以及该指数由使用受试化合物(诸如小分子、治疗抗体等)处理所测试的细胞的改变(取决于影响的性质，降低/未改变/增强)来计算。如果受试化合物可以引起所测试的细胞的致癌指数降低(即存在通过该基因测量的致癌信号传送的降低)，则这导致高治疗指数。
根据一些实施方案，术语“转移指数”是指指示给定的突变/畸变驱动细胞从原发性肿瘤部位解离在远端位置中形成肿瘤或者细胞渗透/粘附的能力的值(诸如数值)。在一些实施方案中，术语“总转移指数”是指将所鉴定的突变的基因的总体转移指数加在一起的值(诸如数值)，并且指示疾病的全部转移潜力。
根据一些实施方案，术语“血管生成指数”是指指示给定的突变/畸变驱动肿瘤中的血管形成/发展/分支/侵入以支持肿瘤载量(burden)/肿瘤生长的能力的值(诸如数值)。根据一些实施方案，术语“总血管生成指数”是指将所鉴定的突变的基因的全部血管生成指数加在一起的值(诸如数值)。
根据一些实施方案，术语“基因组不稳定性指数”是指指示给定的突变/畸变在肿瘤中抑制DNA修复或刺激DNA突变以及DNA突变的建立或者作为驱动肿瘤生长或者刺激与原发肿瘤类似或不同的另外的肿瘤的体细胞突变的能力的值(诸如数值)。在一些实施方案中，术语“总基因组不稳定性指数”是指将所鉴定的突变的基因的全部基因组不稳定性指数加在一起的值(诸如数值)。
根据一些实施方案，术语“微管动态不稳定性指数”是指指示给定的突变/畸变影响微管系统或其他细胞骨架系统的活性或稳定以驱动肿瘤生长的能力的值(诸如数值)。在一些实施方案中，突变/畸变可以选自：微管蛋白/微管结合蛋白的蛋白构象状态、动态不稳定性、或者能够刺激细胞分裂或者对有丝分裂抑制剂或稳定化微管系统或其他细胞骨架系统的其他微管或细胞骨架药物有抗性并且能够驱动肿瘤生长的其他细胞骨架蛋白。在一些实施方案中，术语“总微管动态不稳定性指数”是指将所鉴定的突变的基因的全部微管动态不稳定性指数加在一起的值(诸如数值)。
根据一些实施方案，术语“细胞周期进程指数”是指指示给定的突变/畸变影响细胞周期进程的能力的值(诸如数值)。
根据一些实施方案，术语“凋亡指数”是指指示给定的突变/畸变影响细胞凋亡的能力的值(诸如数值)。
根据一些实施方案，术语“分化指数”是指指示给定的突变/畸变影响细胞分化的能力的值(诸如数值)。
根据一些实施方案，基于本文公开的方法和系统确定/计算/估算的本文公开的致癌相关的指数中的一个或更多个，可以用于鉴定、确定和/或推荐能够为患者提供最好的治疗效果的患者特定治疗。
根据一些实施方案，用于产生多种指数的方法和系统可以利用多种计算技术，诸如，例如，机器学习技术。在一些实施方案中，机器学习技术可以包括诸如这类的技术，但不限于：相关性分析、支持向量机、广义线性模型等，或其组合。
根据一些实施方案，用于产生指数的计算的第一步是归一化步骤(预处理)。在一些实施方案中，归一化步骤包括提供参考值。在一些示例性实施方案中，可以以核质比(NCR)为单位表示(通过本文描述的系统和方法)确定的患者特定突变和突变的信号传送途径的活化水平。因此，归一化步骤可以包括确定野生型(WT)样品/参考(例如WT-PDM)的原始NCR，该原始NCR被任意地设置为参考值(例如，零)，并且所测试的PDM的每个所测量的NCR(“受试NCR”)被给定与该WT参考相关的值。另外或者可选择地，每个所测量的受试NCR可以与相关的固定参考相关，并且被归一化为其单位(例如，使得参考一直是100)。
在一些实施方案中，归一化步骤之后可以是合适的机器学习方法(或者任何其他合适的计算系统)，以获知(learn)将从多种生物测定输出获得的实际结果(即通过本文公开的方法和系统测试患者基因，并且确定其活化水平)与临床参考/结果映射/相关的函数，以提供临床相关的指数。在一些实施方案中，临床结果参考/结果可以包括诸如这类参考，但不限于：临床试验、测试实验室的临床结果、由医疗保健提供者得到的治疗临床结果、本领域的参考文献等，或其组合。
根据一些实施方案，得到的指数取决于被提供用于产生该指数的输入(数据)，并且因此，指数的临床显著性依赖于该输入。在一些实施方案中，当使用生物测定输出连同观察到的无进展生存期一起用于确定患者特定基因的活化水平时，所得到的致癌指数是无进展生存期指数(即，所产生的指数基于患者特定突变指示/预测患者的无进展生存期)。在一些实施方案中，如果输入(数据)是在药物的存在和不存在下连同临床中测量的对药物的反应一起用于患者特定基因的生物测定输出，则所得到的指数是药物反应的指示物(indicator)/预测物(predictor)。在一些实施方案中，所计算的指数是定量的。
根据一些实施方案，指数可以基于从生物测定获得的数据(即，确定的多种患者特定PDM的活化水平)产生，而无需另外的临床参考/结果的输入。
根据一些实施方案，本文公开的系统可以包括任何合适的硬件、固件或软件诸如处理线路(processing circuitry)(包括处理逻辑、处理单元、处理器等)、非瞬时性存储器等，或其组合，所述非瞬时性存储器已在其上储存有由所述处理线路可执行的计算机可读指令以进行用于产生指数的任何所需步骤。
根据一些实施方案，患者是罹患癌症的患者。在一些实施方案中，癌症包括如下这些癌症：癌(carcinomas)、肉瘤、骨髓瘤、白血病、淋巴瘤及混合型肿瘤。特定类别的肿瘤包括淋巴组织增生性紊乱、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、宫颈癌、子宫内膜癌、骨癌、肝癌、胃癌、结肠癌、肺癌、胰腺癌、甲状腺癌、头颈癌、中枢神经系统癌、周围神经系统癌、皮肤癌、肾癌，以及上述所有的转移病灶。适合治疗的特定类型的肿瘤包括：肝细胞癌、肝细胞瘤(hepatoma)、肝母细胞瘤、横纹肌肉瘤、食管癌、甲状腺癌、成神经节细胞瘤(ganglioblastoma)、纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨原性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、尤因氏瘤、平滑肌肉瘤、rhabdotheliosarcoma、浸润性导管癌、乳头状腺癌、黑色素瘤、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌(高度分化、中度分化、低度分化或未分化)、肾细胞癌、肾上腺样瘤、肾上腺样腺癌(hypernephroid adenocarcinoma)、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎癌、肾母细胞瘤(Wilms’tumor)、睾丸肿瘤、包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌和大细胞肺癌的肺癌、膀胱癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、视网膜母细胞瘤、神经母细胞瘤、结肠癌、直肠癌、包括所有类型的白血病和淋巴瘤的造血系统恶性肿瘤，包括：急性骨髓性白血病、急性髓细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、慢性骨髓性白血病、慢性淋巴细胞白血病、肥大细胞白血病、多发性骨髓瘤、髓性淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤。
根据某些实施方案，癌症选自前列腺癌、乳腺癌、皮肤癌、结肠癌、肺癌、胰腺癌、淋巴瘤、骨髓瘤、白血病、头颈癌、肾癌、卵巢癌、骨癌、肝癌或甲状腺癌。
在一些实施方案中，患者已被诊断为癌症阳性。在一些实施方案中，患者被施以具有已知或未知的治疗效果的靶向疗法的治疗方案。在一些实施方案中，患者有可利用的患者肿瘤分子学特征谱(IHC、FISH、PCR及测序)。在一些实施方案中，患者有可利用的病历(patient history)以及治疗结果(患者反应、耐受性、复发率和存活率)。
在一些实施方案中，生物样品选自：血液、血清、活检物、组织、穿刺活检物、支气管肺泡灌洗液、胸膜积液、尿液、唾液和肿瘤。在一些实施方案中，生物样品可以是新鲜分离的。在一些实施方案中，生物样品可以是冷冻的。在一些实施方案中，生物样品可被固定。
在一些实施方案中，在测定细胞中表达的每种蛋白(诸如，所测试的PDM、FTR、WTPDM、PDR)是可区别性地鉴定的。在另一个实施方案中，每种蛋白可直接或间接地通过不同的标志物或不同的报告物或不同的荧光蛋白鉴定。在另一个实施方案中，每种嵌合蛋白(诸如，FTR或PDR)包含不同的报告物部分。在另一个实施方案中，不同的蛋白可都有荧光蛋白或报告物。在另一个实施方案中，本发明的每种嵌合蛋白包括不同的报告物部分。
在另一个实施方案中，PDM与癌症的生长相关。在另一个实施方案中，PDM是致癌基因或肿瘤抑制因子。在另一个实施方案中，PDM是细胞骨架调控因子。在另一个实施方案中，PDM在肿瘤生长和转移方面起作用。在另一个实施方案中，PDM是囊泡运输蛋白。在另一个实施方案中，PDM是囊泡拴系蛋白(vesicle tethering protein)。在另一个实施方案中，PDM是细胞粘附蛋白。在另一个实施方案中，PDM是核完整性蛋白(nuclear integrityprotein)。在另一个实施方案中，PDM是生长因子受体。在另一个实施方案中，PDM是细胞因子受体。在另一个实施方案中，PDM是细胞附着蛋白。在另一个实施方案中，PDM参与肿瘤炎症。在另一个实施方案中，PDM是细胞极性蛋白。在另一个实施方案中，PDM是信号传送蛋白。在另一个实施方案中，PDM是衔接体蛋白质。在另一个实施方案中，PDM是蛋白激酶。在另一个实施方案中，PDM是交换因子。在另一个实施方案中，PDM是细胞骨架蛋白。在一些示例性实施方案中，PDM选自包括以下的组或由以下组成的组：AKT1、AKT2、AKT3、ALK、BRAF、BRCA1、BRCA2、CBL、CTNNB1、EGFR、ERBB2、ERBB3、FGFR1、FGFR2、GNA11、GNAQ、HRAS、JAK2、KIT、KRAS、MET、NRAS、PDGFRA、PIK3CA、PTEN、RAF1、RET、ROS1、SMO、TP53、SMAD2、SMAD3、SMAD4、STAT1、STAT3、STAT5B、TGFBR2、FBXW7、MYC、LKB1、SMARCA4、TCF7L2、MAP3K1、ESR1、AR、PR、DDR2、MEK1或其任何组合。每种可能性是独立的实施方案。
在另一个实施方案中，PDM可以与标志物(标签)诸如荧光蛋白(诸如mCherry、mApple、GFP、Cherry、DsRed、RFP、EGFP、BFP、YFP、AmCyan1、ZsGreen1、ZsYellow1、DsRed2、AsRed2、和HcRed1)联合表达。在一些实施方案中，标志物包含Cys-Cys-Pro-Gly-Cys-Cys(SEQ ID NO:47)的标志物基序，并在成像之前，可向测试性测定添加FlAsH-EDT2或ReAsH-EDT2，以在结合包含Cys-Cys-Pro-Gly-Cys-Cys基序的重组蛋白后发出荧光。在一些实施方案中，包含Cys-Cys-Pro-Gly-Cys-Cys的蛋白可以是PDM、单独的荧光蛋白、或与可进一步用于标记亚细胞性细胞器，诸如，例如，质膜或细胞核的亚细胞标志物融合的荧光蛋白。在一些实施方案中，与PDM联合表达的标志物(标签)用作验证测定细胞中PDM的转染和表达的标志物。
在另一个实施方案中，PDR是与标志物(标签)诸如荧光蛋白(诸如mCherry、mApple、GFP、Cherry、DsRed、RFP、EGFP、BFP、YFP、AmCyan1、ZsGreen1、ZsYellow1、DsRed2、AsRed2、和HcRed1)融合的PDM。在一些实施方案中，PDR是与包含Cys-Cys-Pro-Gly-Cys-Cys(SEQ ID NO:47)基序的标志物(标签)融合的PDM。
在一些实施方案中，FTR是融合(嵌合)蛋白，其包含报告物部分，诸如荧光标志物(荧光蛋白，诸如mCherry、mApple、GFP、樱桃红、DsRed、RFP、EGFP、BFP、YFP、AmCyan1、ZsGreen1、ZsYellow1、DsRed2、AsRed2、和HcRed1)或Cys-Cys-Pro-Gly-Cys-Cys(SEQ IDNO:47)基序，和选自但不限于以下的靶蛋白部分：与癌症生长相关的蛋白、致癌基因产物、细胞骨架调控因子、囊泡运输蛋白、囊泡拴系蛋白、细胞粘附蛋白、核完整性蛋白、生长因子受体、细胞附着蛋白、细胞信号传送蛋白、参与肿瘤炎症蛋白、细胞极性蛋白、生长因子信号传送蛋白、衔接体蛋白质(adaptor)、细胞骨架蛋白等。每种可能性是独立的实施方案。
在一些示例性实施方案中，FTR是包含报告物部分诸如荧光蛋白和靶(标志物)蛋白部分的融合蛋白，所述靶(标志物)蛋白部分选自但不限于包括以下的组或者由以下组成的组：AKT1、AKT2、mTOR、RelA、NFKB1、NFKB2、ERK1、ERK2、ERF、STAT1、STAT3、STAT5、CTNNB1、JNK1α、JNK1β、JNK2α、JNK2β、ERK5、P38α、P38β、AMPK、STK11、SMARCA4、TP53、ESR1、GATA3、CDK2、SMAD1、NOTCH1、MYB、MYC、SMAD2、SMAD3、SMAD4、PRKACA、NLK或其任何组合。每种可能性是独立的实施方案。
在一些示例性实施方案中，PDM可以是KRas且FTR的靶部分可选自：ERK2、ERF、JNK和AKT1。每种可能性是独立的实施方案。
在一些示例性实施方案中，PDM可以是AKT2或AKT3且FTR的靶部分可选自：AKT1和RelA。每种可能性是独立的实施方案。
在一些示例性实施方案中，PDM可以是FGFR1且FTR的靶部分可选自：ERK2、JNK(诸如JNK1α1)、p38b、AKT1和STAT3。每种可能性是独立的实施方案。
在一些示例性实施方案中，PDM可以是BRaf且FTR的靶部分可选自：ERK2和ERF。每种可能性是独立的实施方案。
在一些示例性实施方案中，PDM可以是EGFR且FTR的靶部分可选自：ERK2、RelA、AKT1、p38b、JNK1a1。每种可能性是独立的实施方案。
在另一个实施方案中，本发明包括其中每种测定细胞都表达PDM和/或FTR的测定细胞。在另一个实施方案中，本发明包括其中每种测定细胞表达不同的PDM和/或FTR和/或PDR的测定细胞。在另一个实施方案中，本发明包括其中每种测定细胞转染了不同的DNA片段，其中各DNA片段编码不同的PDM和/或FTR的测定细胞。在一些实施方案中，测定细胞被置于/平铺/种植在具有指定位点(位置)的固体基底上。在一些实施方案中，针对每个位点的测定细胞是相同的。在一些实施方案中，针对每个位点的测定细胞是不相同的。在一些实施方案中，测定细胞被添加至每个位点的培养基中。在一些实施方案中，细胞被加至已具有在其上脱水的DNA构建体的固体基底。在一些实施方案中，先将细胞平铺在固体基底上并在预定的时间段之后转染。
在另一个实施方案中，本发明包括其中每种测定细胞转染了不同的DNA片段，其中各DNA片段编码不同的PDM和/或FTR和/或PDR的测定细胞。
在一些实施方案中，使用蛋白测定、结合测定、免疫测定、显微镜成像或本领域技术人员已知的任何其他合适的测定进行FTR定位的鉴定。在一些实施方案中，受试PDM的活化水平可以基于FTR的核质比(NCR)来确定。
在一些实施方案中，本发明还包括检测测定细胞的形态变化的步骤。在一些实施方案中，本发明的方法不要求对任何患者的DNA测序。
根据一些实施方案，所述方法可以还包括将受试药物添加至细胞，并且鉴定在不同实验条件下药物对FTR的易位的影响。
根据一些实施方案，药物是抗癌药物。在一些实施方案中，药物可以选自，但不限于：Brentuximab vedotin、卡博替尼(cabozantinib)、卡非佐米(carfilzomib)、西妥昔单抗(cetuximab)、克唑替尼(crizotinib)、达拉非尼(dabrafenib)、达沙替尼(dasatinib)、狄迪诺塞麦(denosumab)、厄洛替尼(Erlotinib)、依维莫司(Everolimus)、吉非替尼(gefitinib)、替伊莫单抗(ibritumomab tiuxetan)、依鲁替尼(Ibrutinib)、甲磺酸伊马替尼(imatinib mesylate)、易普利姆玛(ipilimumab)、拉帕替尼(lapatinib)、盐酸尼洛替尼一水合物(nilotinib hydrochloride monohydrate)、obinutuzumab、奥法木单抗(ofatumumab)、帕尼单抗(panitumumab)、帕唑帕尼(pazopanib)、帕妥株单抗(pertuzumab)、帕纳替尼(ponatinib)、瑞戈非尼(Regorafenib)、Rituxan、索拉非尼(sorafenib)、司美替尼(lapatinib)、舒尼替尼(sunitinib)、替西罗莫司(temsirolimus)、曲美替尼(trametinib)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、凡德他尼(vandetanib)、维罗非尼(vemurafenib)、维莫德吉(vismodegib)、阿柏西普(ziv-aflibercept)。
根据一些实施方案，可以以任何期望的量/浓度将药物添加至受试细胞。例如，可以以以下浓度添加药物：1nM至1mM。
根据一些实施方案，可以添加药物并且将药物与受试细胞孵育持续任何期望的时间段，诸如例如，在以下范围内的时间段：10分钟至24小时。
根据一些实施方案，提供了用于诊断患者的癌症的试剂盒。在一些实施方案中，提供了用于鉴定肿瘤细胞中异常的细胞信号传送途径的试剂盒。在一些实施方案中，提供了用于鉴定患者特定驱动突变的试剂盒。在一些实施方案中，提供了用于确定/检测/鉴定患者特定驱动突变的药物反应的试剂盒。在一些实施方案中，提供了用于测量患者突变基因对药物疗法的反应/抗性。根据一些实施方案，提供了用于产生/确定患者特定致癌突变的多种致癌相关的指数的试剂盒。
在一些实施方案中，本发明提供了通过鉴定患者特定驱动突变诊断受试者的癌症或癌症分子谱(molecular cancer profile)的试剂盒。根据一些实施方案，试剂盒可用于预测治疗成功率或鉴定参与癌症的旁分泌或自分泌因子。在另一个实施方案中，试剂盒包括至少一个检测报告物基因的工具(means)。在另一个实施方案中，试剂盒包括用于检测标志物的工具。在一些实施方案中，试剂盒包含以下的一个或更多个：用于容纳核酸分子和/或受试细胞的基底或容器、用于进行检测/易位测定的说明书、受试细胞、转染试剂或其任何组合。
如果期望的话，本发明的诊断组合物可以成品(article of manufacture)存在，例如，可包含诊断试剂和使用说明书的试剂盒，诸如FDA批准的试剂盒。所述试剂盒还可适于在容器上以规范药物生产、应用或销售的政府机构规定的形式附上公告，所述公告反映了组合物的形式或人或兽医用途被该机构批准。
在另一个实施方案中，本发明的方法和试剂盒增加癌症患者的存活率。本发明的测定非常适于试剂盒的制备。这类试剂盒可包含承载装置，所述承载装置被分区以在紧密布置的限定空间容纳一个或更多个容器装置，诸如小瓶、管、板、载玻片等，每个容器装置包含细胞测定的单独元件。
在一个实施方案中，提供了用于诊断受试者中的癌症的包括一组测定细胞的试剂盒，每种测定细胞包括本发明的不同蛋白，该试剂盒包括具有编码PDM(源自患者的生物样品)和/或FTR和/或FTR的核酸分子的基底以及用于反应测量和/或检测易位事件的打印的说明书，其中该基底还能够容纳测定细胞和从疑似患有癌症的人受试者分离的生物样品。
在一些实施方案中，转染的测定细胞在允许重组蛋白或标记的蛋白的表达的有效条件下培养。在一个实施方案中，本发明的标记的蛋白或标志物蛋白(例如PDM、FTR)是重组蛋白或嵌合体。在一些实施方案中，有效的培养条件包括，但不限于，允许蛋白表达的有效的培养基、生物反应器、温度、CO2、pH和氧气条件。在一个实施方案中，有效的培养基是指，细胞在其中被培养以产生本发明的重组多肽的任何培养基。在一些实施方案中，培养基通常包括具有可吸收的碳、氮和磷酸盐来源，以及适当的盐、矿物质、金属和其他营养物，诸如维生素的水溶液。在一些实施方案中，本发明的细胞可在常规发酵生物反应器、摇瓶、试管、微量滴定皿和培养皿中培养。在一些实施方案中，在重组细胞适合的温度、pH和氧含量下进行培养。在一些实施方案中，培养条件在本领域的普通技术人员的专业知识内。
在一些实施方案中，本发明利用再分配技术来监测并记录蛋白易位事件。在另一个实施方案中，用绿色荧光蛋白或其他荧光蛋白标记蛋白靶标，并产生被稳定转染或瞬时转染的细胞系。在另一个实施方案中，本发明的测定使用高通量、基于光学显微镜的仪器读取。
在另一个实施方案中，本发明的蛋白易位测定是高含量、高通量测定，主要用于先导系列的剖析(profiling of lead series)、作为细胞培养基成分的源自生物样品的PDM的初步筛选。在另一个实施方案中，本发明的蛋白易位测定包括使用Spinning Disctechnology或任何其他基于显微术的技术的活细胞成像。
在一些实施方案中，拓扑定位技术(toponomic localization technique)用于跟踪并记录蛋白易位事件。在一些实施方案中，对本发明的蛋白利用了免疫荧光手段。在一些实施方案中，本发明的蛋白用荧光标志物标记。在一些实施方案中，对共聚焦显微镜图像进行评估和处理。在另一个实施方案中，标准数据集包括每种生物条件每种细胞的2-40个图像。在另一个实施方案中，进行自动化图像分析。在另一个实施方案中，自动化图像分析包括细胞区室或结构识别。
在另一个实施方案中，以不同的维度捕捉空间关系。在另一个实施方案中，进行蛋白标志物在有界区域中的浓度的定量评估。在另一个实施方案中，基于测量和评价像素点之间的距离的各向同性分布，本发明还提供了蛋白共定位研究。在另一个实施方案中，本发明提供了二维分析(区域)。在另一个实施方案中，本发明还提供了0维分析(点)。在另一个实施方案中，本发明提供了1维建模。
术语“包含(comprises)”、“包含(comprising)”、“包括(includes)”、“包括(including)”、“具有(having)”和其同源词意指“包括但不限于”。术语“包含(comprises)”和“包含(comprising)”在一些实施方案中分别限于“由...组成(consists)”和“由…组成(consisting)”。术语“由...组成(consisting of)意指“包括并局限于”。术语“基本上由...组成”意指，组合物、方法或结构可包括另外的成分、步骤和/或部分，但仅当该另外的成分、步骤和/或部分不实质上改变请求保护的组合物、方法或结构的基本特征和新颖特征的情况下。
如本文使用的，除非上下文另外清楚指明，否则单数形式“一(a)”、“一(an)”和“该(the)”包括复数指代物。例如，术语“一个化合物(a compound)”或“至少一个化合物”可包括多个化合物，包括其混合物。
如本文使用的，述及本文提到的数值的术语“约”应理解为所提到的数值+/-10％。
如本文使用的术语“方法”是指，用于完成给定任务的方式、手段、技术和程序，包括，但不限于，已知的方式、手段、技术和程序，或化学、药理学、生物学、生物化学和医学领域的从业者易于从已知的方式、手段、技术和程序开发的那些方式、手段、技术和程序。
在研究并非意在限制的以下实施例之后，本发明的另外的目的、优势、及新特征对本领域普通技术人员将变得明显。另外，如上文描写的以及以下权利要求部分要求保护的本发明的多个实施方案和多个方面中的每一个在以下实施例中均找到实验性支持。
以下实施例是为了更充分地说明本发明的一些实施方案而呈现。然而，其不应以任何方式被解释为限制本发明的宽泛的范围。
实施例
总体上，本文使用的命名法和本发明中利用的实验室程序包括分子学、生物化学、微生物学和重组DNA技术。这些技术已在文献中被充分描述。参见，例如，"MolecularCloning:A laboratory Manual"Sambrook等,(1989)；“Current Protocols in MolecularBiology”第I-III卷Ausubel,R.M.,编著(1994)；Ausubel等,"Current Protocols inMolecular Biology”,John Wiley和Sons,Baltimore,Maryland(1989)；Perbal,“APractical Guide to Molecular Cloning",John Wiley&Sons,New York(1988)；Watson等,"Recombinant DNA",Scientific American Books,New York；Birren等(编著)"GenomeAnalysis:A Laboratory Manual Series",第1-4卷,Cold Spring Harbor LaboratoryPress,New York(1998)；方法如以下中列出的：美国专利第4,666,828；4,683,202；4,801,531；5,192,659和5,272,057号；“Cell Biology:A Laboratory Handbook”,第I-III卷Cellis,J.E.,编著(1994)；由Freshney,Wiley-Liss,N.Y.的"Culture of Animal Cells-AManual of Basic Technique"，(1994),第三版；"Current Protocols in Immunology"第I-III卷Coligan J.E.,编著(1994)；Stites等(编著),"Basic and Clinical Immunology"(第8版),Appleton&Lange,Norwalk,CT(1994)；Mishell和Shiigi(编著),“SelectedMethods in Cellular Immunology”,W.H.Freeman和Co.,New York(1980)；可用的免疫测定被广泛描述于专利和科学文献中，参见，例如，美国专利第3,791,932；3,839,153；3,850,752；3,850,578；3,853,987；3,867,517；3,879,262；3,901,654；3,935,074；3,984,533；3,996,345；4,034,074；4,098,876；4,879,219；5,011,771和5,281,521号；"OligonucleotideSynthesis"Gait,M.J.,编著(1984)；"Nucleic Acid Hybridization"Hames,B.D.,和Higgins S.J.,编著(1985)；"Transcription and Translation"Hames,B.D.,和HigginsS.J.,编著(1984)；"Animal Cell Culture"Freshney,R.I.,编著(1986)；"ImmobilizedCells and Enzymes"IRL Press,(1986)；"A Practical Guide to Molecular Cloning"Perbal,B.,(1984)以及"Methods in Enzymology"第1-317卷,Academic Press；"PCRProtocols：A Guide To Methods And Applications",Academic Press,San Diego,CA(1990)；Marshak等，"Strategies for Protein Purification and Characterization-ALaboratory Course Manual"CSHL Press(1996)；其全部通过引用并入本文。本文件贯穿全文提供了其他常规的参考文献。
生物样品收集
收集福尔马林固定的石蜡包埋(FFPE)的肿瘤活检物以及冷冻的新鲜肿瘤部分或活检物。FFPE样品用于提取已知参与癌症进展的特定的基因组外显子(诸如cKit外显子11)。新鲜的(新鲜的或新鲜冷冻的)活检物用于mRNA提取和组织间液提取。
因此，回顾性和前瞻性样品均被采集。回顾性研究基于来自已知治疗功效的病例的冷冻肿瘤切片。
前瞻性研究基于在手术/活检/支气管镜检后立即收集的新鲜或速冻的样品/活检组织/肿瘤切片。这使得扩增所有相关的测试蛋白(诸如癌基因或指示物)成为可能。其他体液诸如血浆样品(使用硫酸肝素凝胶管)、血液样品、腹膜积液、胸膜积液和通过支气管镜检获得的肺液是非常重要的，因为他们积累了许多肿瘤分泌物并且也被收集。
在肿瘤切除术(手术、活检、支气管镜检)后，将肿瘤组织放置于冰上的无菌袋或管中(未用福尔马林处理)。病理学从业者将肿瘤分割(考虑活的肿瘤部分的尺寸和位置)成需要固定的部分和最能代表肿瘤的部分，这些部分在冰上被新鲜递送以便进一步分析。病理学从业者找出富含恶性细胞且具有减少的量的基质或其他非恶性组织的组织部分或区域，并将其切下。如果组织的净重超过1克，则将组织进一步切成若干片，并放置在纤维素柱上并以100g离心10min(预期从每克组织得到100±50微升IF)。然后将组织转移至另一个15/50ml管并冷冻于-80℃冰柜中。称为组织间液(IF)的离出液被冷冻在原管中。
穿刺活检-将组织放置于15圆锥管中并冷冻于-80冰柜。
经由支气管镜检的活检–将组织放置于15圆锥管中并冷冻于-80冰柜。
支气管肺泡灌洗-将提取液分在2个50ml falcon管中并离心(3000RPM，15min)。将液体转移进新管中，并将液体和细胞(原管中)均冷冻在80℃下。
胸膜积液-离心胸膜积液(3000RPM,15min.)，将液体转移进新管，并将液体和细胞(原管中)均冷冻于-80℃下。
冷冻切片-如果可能的话，将肿瘤冻结在切片机(microtome)中并切片。
从福尔马林固定包埋的肿瘤活检物提取基因组DNA
为确定在特定外显子中存在已知突变的基因，诸如cKit在外显子11中的突变，EGFR外显子19、20，HER2外显子20，使用从FFPE组织提取的DNA。为此目的，使用标准的DNA提取试剂盒和操作说明(例如，Qiagen QIAamp DNAFFPE Tissue，目录号56404)。
扩增外显子并插入全长基因
为表达期望的外显子，从基因组DNA进行扩增并将外显子插入缺乏该外显子的全长基因中。为此目的，制备在表达备用载体(expression ready vector)中缺乏该外显子的全长基因，然后使用常规分子生物学技术将该外显子整合到构建体中。
新鲜的活检物：从冷冻的活检物提取所需量的组织
一部分活检物用于RNA纯化和组织间液提取。将剩余的生物材料储存起来以备将来参考或其他分析(免疫组织化学(IHC)、FISH等)。
组织间液(IF)的提取
将按照下文详述地提取的组织间液(IF)储存起来供稍后用作被测试的细胞的激动剂以检测肿瘤细胞分泌并可赋予抗癌药物抗性的物质的存在。
IF提取通过在4℃下，在具有玻璃纤维过滤器的柱中以1500g离心组织样品7分钟进行。然后将来自柱底部的液体收集到新管中。
mRNA的提取
从样品提取的mRNA是扩增患者来源的标志物(PDM)，即，已知为致癌基因并可能携带为细胞提供致癌性质的突变的基因(具有携带驱动突变的可能性的基因)所需要的。被测试的示例性基因包括：AKT1、AKT2、AKT3、ALK、BRAF、BRCA1、BRCA2、CBL、CTNNB1、EGFR、ERBB2、ERBB3、FGFR1、FGFR2、GNA11、GNAQ、HRAS、JAK2、KIT、KRAS、MET、NRAS、PDGFRA、PIK3CA、PTEN、RAF1、RET、ROS1、SMO、TP53、SMAD2、SMAD3、SMAD4、STAT1、STAT3、STAT5B、TGFBR2、FBXW7、MYC、LKB1、SMARCA4、TCF7L2、MAP3K1、AR、PR、ESR1、DDR2、MEK1和MEK2。
RNA提取通过包括胍盐-氯化铯法(Guanidium-Cesium Chlroride Method)、胍酸-酚法(Guanidium Acid-Phenol Method)的本领域已知的方法，和在离液盐(chaotropicsalt)的存在下结合核酸的玻璃纤维过滤器进行，和/或通过使用商购可得的试剂盒(诸如Qiagen RNeasy试剂盒，目录号74106)根据制造商的说明书进行。
cDNA的产生
为允许PDM的扩增，基于从组织提取的mRNA合成cDNA。基于模板mRNA，使用RNA-依赖性的DNA聚合酶逆转录酶，并使用寡-dT引物、随机六聚体引物(random hexamericprimer)或特异性引物来合成cDNA。示例性方案包括使用SuperScriptTMIII First-StrandSynthesis SuperMix protocol(Life technologies,目录号18080-051)。
产生受试PDM
受试PDM的产生以两个步骤进行：扩增所选择的PDM并附接其他元件以允许其在测定细胞中适当表达。
在一个直接的方法中，进行包含与被扩增的受试PDM相关的寡核苷酸的初步PCR反应以允许这些所选择的基因过多出现在cDNA样品内。在一个间接的方法中，基于特定的受试PDM的序列人工合成受试PDM，并且该人工PDM可以用作用于使用恰当的引物的PCR反应的模板。
在一些实例中，针对每个待扩增的基因，cDNA样本被分到单独的孔/管中。
使用为各个PDM设计的引物进行PCR反应以从cDNA文库扩增所选择的PDM基因，或基于人工生成产生的模板PDM使用为各个PDM设计的引物进行PCR反应。
以下组的引物用于以下被测试的PDM的PCR扩增(表1)：
表1
在扩增PDM基因区域后，进行第二PCR反应以向各个PDM基因序列的5`末端添加启动子(或组成型启动子诸如CMV或诱导型启动子诸如四环素启动子)及向3`末端添加IRES接着是荧光报告物基因(诸如GFP、RFP、BFP或任何其他报告物基因，如指定的)。
在一些实例中，启动子和IRES+荧光报告物元件的添加通过分子生物学克隆工具，通过借助PCR方法、连接酶或重组方法(诸如分别为T4DNA连接酶或InFusion酶(Clontech))将PCR产物融合至期望的元件进行。
当全长核酸分子(即5'启动子-PDM-3'IRES+报告物(或这些元件的任何其他顺序))形成时，进行使用PCR反应的扩增，以获得足量的用于转染细胞的核酸分子。
在一些个例中，核酸分子的扩增通过将全长核酸分子连接到适当的表达载体上并转化到细菌中来实现。使用标准质粒提取试剂盒，诸如Qiagen QIAprep Miniprep试剂盒提取由此形成的质粒。在一些个例中，各种PDM的线性PCR片段用于转染受试细胞。
FTR的生成：
以下组的引物用于PCR扩增以下FTR的靶部分(表2)：
表2
表达构建体(FTR和PDM的混合物)的转染
根据预先设计的矩阵，将用于分析的按上文描述的制备的每个报告物基因(FTR)与对照野生型PDM基因或受试PDM基因混合，并与适当的转染试剂混合。
在一种可选方案中，将转染混合物放置在适当的固体支持基底上并任选地在该适当的固体支持基底上脱水。在各种设置中，基底包括多种固体基底，诸如：显微镜载玻片、芯片、细胞培养板、多孔板、96孔板、384孔板等。将各种混合物放置在指定的、可追踪的位点/点(即，指定的孔或载玻片或芯片上的指定位置)中。对基底的转染混合物，将处于正常的全生长培养基中的固定数目的细胞(在约100至100,000的范围内，取决于以上所述的基底类型)分配至各个点上。基于所测试的PDM和测定方法，细胞选自HeLa细胞、HEK 293细胞、NCI60细胞系诸如A549、EKVX、T47D、HT29或任何其他合适的细胞系。将受试细胞放置在固体基底上，并根据细胞的类型、生长培养基和转染条件孵育12-48小时。孵育时间允许细胞粘附至基底，并允许细胞导入和表达FTR和PDM。
在另一种可选方案中，根据预先设计的矩阵将细胞平铺在固体基底上(在指定的、可追踪位点/点(即，指定的孔或载玻片或芯片上的指定位置))。在预定的时间段之后，在适当的转染条件用FTR和适当的PDM(WT PDM或受试PDM)转染细胞。FTR和合适的PDM可位于两个不同的分子上，或位于编码这两个基因的一个分子上。
测定实施：诱导型启动子
在报告物FTR充分表达之后，将生长培养基替换为低血清培养基(以除去培养基中存在的任何生长因子/配体)以减至最少的背景刺激的信号传送。
当信号传送水平显著减少(4至16小时内)时，启动PDM的诱导表达。这是通过添加四环素(当使用四环素诱导型启动子时)和蜕皮激素(当使用蜕皮激素诱导型启动子时)实现的。
在一些实例中，添加组织间液(IF)和/或抗癌药物以诱导PDM的表达，从而测试IF或药物对PDM的影响。
测定实施-组成型启动子
在细胞充分表达FTR和PDM(均在组成型启动子的控制下)后，将生长培养基替换为低血清培养基(以除去培养基中存在的任何生长因子/配体)，以减至最少的背景刺激的信号传送。
在一些实例中，添加组织间液和/或抗癌药物以诱导PDM的表达，并从而测试IF或药物对PDM的影响。
图像采集和分析
在PDM表达(转染后30小时)后，通过磷酸盐缓冲的盐水(PBS)洗涤3次，在4％多聚甲醛(PFA)中孵育5分钟，并随后用PBS洗涤3次固定细胞。然后用盖玻片覆盖载玻片，并对每个相应的FTR的定位成像。
对对照野生型细胞以及PDM转染的细胞中的每种FTR进行图像分析并做比较。将FTR在对照细胞与PDM转染的细胞中的定位之间的差异定量，并使用所述差异确定所测试的PDM的致癌形式或野生型形式是否存在于被测试的样品中。定量使用标准图像分析软件，诸如ImageJ进行。
使用HeLa细胞作为测定细胞的示例性测定：
第0天：在室温(RT)下用0.01％的聚-l-赖氨酸预包被载玻片5分钟，然后用无菌水(DDW)洗涤。将水吸掉并将载玻片干燥2小时。将HeLa细胞(15000个细胞)平铺在每个孔的200μl完全培养基(完全培养基：DMEM、10％FBS、1％青霉素/链霉素(P/S))中。
第1天：将转染试剂(FugeneHD试剂(Promege，目录号E2311)加热至RT并涡旋。对于每个孔，在管中制备转染混合物，所述转染混合物包括：管中的50/100/200ng PDM表达构建体；50/100ng合适的FTR的表达构建体；Optimem缓冲液(至总计10μl)和FugeneHD(对于每3μg DNA为1μl)。在RT下孵育转染混合物15分钟。从孔中吸出细胞培养基，并对每个孔补充100μl转染培养基(DMEM、10％FCS、无抗生素)。将10μl转染混合物添加至每个孔中。然后将细胞孵育在37℃的湿润培养箱(5％CO2)中。6-8小时后，培养基被更换为饥饿培养基1(具有0.1％FCS、1％青霉素/链霉素的DMEM)，并将细胞孵育在37℃、5％CO2的湿润培养箱中。对于需要药物/化学抑制剂的24小时孵育的测定，所述药物/化学抑制剂以所需浓度添加。
对于需要与药物孵育的测定：用补充有所需药物的饥饿培养基2替换培养基。然后将细胞孵育在37℃的湿润培养箱(5％CO2)中。另外，如果需要更短的药物孵育时间，其可以被进行。
第2天：26小时后(即，固定细胞之前4小时)，将培养基换成饥饿培养基2(具有1％P/S的DMEM)。然后将细胞孵育在37℃的湿润培养箱(5％CO2)中。
对于需要诱导信号传送的测定：根据需要用补充有诱导物的饥饿培养基2替换培养基。然后将细胞孵育在37℃的湿润培养箱(5％CO2)中。另外，如果需要更短的药物/化学抑制剂孵育时间，其可以被进行。
转染后30小时，通过以下方法固定细胞(所有步骤在室温下)：将细胞用PBS洗涤3次。用固定溶液(PBS中的5％葡萄糖/4％多聚甲醛(PFA))固定持续10分钟，用PBS洗涤3次。将细胞任选地用DAPI溶液染色，之后用PBS洗涤细胞三次。
实施例1：ERK1/2途径的亚细胞易位测定可以区分WT与突变体BRAF并以定量的方式鉴定BRAF驱动突变。
用WT PDM(BRAF-WT)或指定的突变的PDM(携带以下突变中的一个的突变的BRAF：已知的驱动突变G464V或V600E、位于BRAF的激酶结构域中的功能未知的突变I554T)连同相应的FTR(ERK-2)一起转染HeLa测定细胞。转染之后30小时，将细胞固定并且利用荧光显微镜成像。对FTR在细胞质和细胞核中的量进行定量。测量细胞核(N)与细胞质(C)中FTR强度之间的比率(N:C比率)。总之，结果显示，两种功能已知的突变(G464V和V600E)活化ERK1/2信号传送途径(图2A)。结果还显示，功能未知的突变(I544T)也活化所测试的信号传送途径，表明这是致癌突变。此外，当使用ERK2作为FTR时，由携带功能未知的I544T突变的突变的BRAF的活化水平高达对于携带已知的V600E突变的BRAF观察到的活化水平，该V600E突变先前已被报道比G464V突变活性更高。
因此，通过使用本文公开的方法，BRAF突变体(I544T)被鉴定为能够诱发异常信号转导途径的功能活性突变体，其中FTR的亚细胞易位的分级增加与BRAF致癌突变的严重性(gravity)相关。
实施例2：亚细胞易位测定可区分WT和突变体EGFR并对EGFR突变的严重性分级
用WT PDM(EGFR-WT)或指定的突变的PDM(携带以下突变中的一个的突变的EGFR：已知的驱动突变G719S、L861Q、L858R、E746Del或者包括三种已知的驱动突变G719A、T790M(已知赋予对小分子EGFR抑制剂的抗性)和L861Q的突变体(三重突变))连同相应的FTR一起转染HeLa测定细胞。转染之后30小时，将细胞固定并且利用荧光显微镜成像。对FTR在细胞质和细胞核中的量进行定量。测量细胞核(N)与细胞质(C)中FTR强度之间的比率(N:C比率)。结果示于图3A、4A和5B中。在图3A中，FTR是AKT1，并且在图4A中，FTR是JNK1。图5B是沿着3种不同的途径的4种突变的增强比较，表示为与WT相比的N:C比率的差异(ΔN:C比率)。总之，结果表明，当使用AKT1作为FTR(图3A)，JNK1作为FTR(图4A)或JNK2、ERK2和STAT3作为FTR(图5B)时，活化水平在不同突变体中不同。因此，通过使用本文公开的方法，FTR的亚细胞易位的该分级增加与EGFR致癌突变的严重性相关。
实施例3：亚胞易位测定可以允许对ERBB2突变的严重性分级
用WT PDM或指定的突变的PDM(ERBB2V842I、V777L、S310F、L755S、D769Y、A1170P)连同相应的FTR：JNK2、ERK2、STAT3或P38一起转染Hela测定细胞。转染之后24小时，将细胞固定并且利用荧光显微镜成像。对FTR在细胞质和细胞核中的量进行定量。测量细胞核(N)与细胞质(C)中FTR强度之间的比率(N:C比率)，并且将其表示为与WT相比的N:C比率的差异(ΔN:C比率)。图6B中所示的结果是沿着4个不同途径的6种突变的增强比较。
总之，结果表明活化水平在不同突变体中不同。因此，通过使用本文公开的方法，FTR的亚细胞易位的该分级增加与ERBB2致癌突变的严重性相关。
实施例4：亚细胞易位测定可以允许对cKIT突变的严重性分级
用WT PDM或指定的突变的PDM(cKIT K642E、W557-K558del)连同相应的FTR：ERK2、STAT3、JNK2、REL-A或P38一起转染Hela测定细胞。转染之后24小时，将细胞固定并且利用荧光显微镜成像。对FTR在细胞质和细胞核中的量进行定量。测量细胞核(N)与细胞质(C)中FTR强度之间的比率(N:C比率)，并且将其表示为与WT相比的N:C比率的差异(ΔN:C比率)。图7B中所示的结果是沿着5个不同途径的2种突变的增强比较。
总之，结果表明活化水平在不同突变体中不同。因此，通过使用本文公开的方法，FTR的亚细胞易位的该分级增加与cKIT致癌突变的严重性相关。
实施例5：亚细胞易位测定可以允许对KRAS突变的严重性分级
用WT PDM或指定的突变的PDM(KRAS Q61H、G12V、G12R、G12A、G12D、G12C、G12S、A146V、A146T、G13D)连同相应的FTR：FOXO3a、JNK2、ERK2或REL-A一起转染Hela测定细胞。转染之后24小时，将细胞固定并且利用荧光显微镜成像。对FTR在细胞质和细胞核中的量进行定量。测量细胞核(N)与细胞质(C)中FTR强度之间的比率(N:C比率)，并且将其表示为与WT相比的N:C比率的差异(ΔN:C比率)。图8B中所示的结果是沿着4个不同途径的10种突变的增强比较。总之，结果表明活化水平在不同突变体中不同。因此，通过使用本文公开的方法，FTR的亚细胞易位的该分级增加与KRAS致癌突变的严重性相关。
实施例6：亚细胞易位测定可以允许对PIK3CA突变的严重性分级
用WT PDM或指定的突变的PDM(PIK3CA Y1021C、V344A、R38H、Q546L、N345K、H1047R、H1047L、E579K、E545K、E542K、C420R、R88Q/D350G)连同相应的FTR：KOG1、P38、STAT3或REL-A一起转染Hela测定细胞。转染之后24小时，将细胞固定并且利用荧光显微镜成像。对FTR在细胞质和细胞核中的量进行定量。测量细胞核(N)与细胞质(C)中FTR强度之间的比率(N:C比率)，并且将其表示为与WT相比的N:C比率的差异(ΔN:C比率)。图9B中所示的结果是沿着4个不同途径的12种突变的增强比较。总之，结果表明活化水平在不同突变体中不同。因此，通过使用本文公开的方法，FTR的亚细胞易位的该分级增加与PIK3CA致癌突变的严重性相关。
实施例7：亚细胞易位测定可以允许对BRAF突变的严重性分级
用WT PDM或指定的突变的PDM(BRAF V600E、V600K、G468V、G469A、G466V、G466E)连同相应的FTR：ERK2、JNK2或REL-A一起转染Hela测定细胞。转染之后24小时，将细胞固定并且利用荧光显微镜成像。对FTR在细胞质和细胞核中的量进行定量。测量细胞核(N)与细胞质(C)中FTR强度之间的比率(N:C比率)，将其表示为与WT相比的N:C比率的差异(ΔN:C比率)。图10B中所示的结果是沿着3个不同途径的6种突变的增强比较。总之，结果表明活化水平在不同突变体中不同。因此，通过使用本文公开的方法，FTR的亚细胞易位的该分级增加与BRAF致癌突变的严重性相关。
实施例8：亚细胞易位测定可以允许确定不同途径中EGFR和KRAS之间的显性突变(dominant mutation)
用WT的EGFR PDM或KRAS PDM或者指定的突变的PDM(EGFR L858R、EGFR T790M、EGFR L861Q、KRAS G12V、KRAS G13D)连同相应的FTR：ERK2、JNK2或REL-A一起转染Hela测定细胞。转染之后24小时，将细胞固定并且利用荧光显微镜成像。对FTR在细胞质和细胞核中的量进行定量。测量细胞核(N)与细胞质(C)中FTR强度之间的比率(N:C比率)。图11B、图11C和图11D所示的结果表明，虽然每种突变单独地影响ERK1/2途径，但是组合EGFR和KRAS突变两者显示EGFR L858R突变相对于KRAS突变是显性的(其中G12V具有轻微增加的效应)，而KRAS突变相比于EGFR T790M突变是显性的。当测量第二个途径NFkB时(图12B、图12C和图12D)，EGFR L858R和L861Q突变是显性的，意味着对于该途径来说，KRAS突变相对于EGFR突变是继发的(secondary)。最后，当测量JNK途径时，图13B、图13C和图13D中所示的结果表明，EGFR L858R突变相比于KRAS突变是显性的，并且KRAS突变相比于EGFR L861Q突变是显性的。总之，当直接与途径相连时，KRAS显示出与EGFR突变体相比的差异显性，而EGFR特异性途径不受精确的KRAS突变的影响。该结果证明，使用本文公开的方法测试基因的组合，能够提供另外的关于其活性以及其与其他突变相比的显性、重要性或与其他突变的相互作用的深刻理解。
实施例9：亚细胞易位测定可以允许确定不同途径中ERBB2和BRAF之间的显性突变
用WT ERBB2PDM或BRAF PDM或者指定的突变的PDM(ERBB2L755S、ERBB2V777L、BRAFV600E、BRAF V600K)连同相应的FTR：ERK2一起转染Hela测定细胞。转染之后24小时，将细胞固定并且利用荧光显微镜成像。对FTR在细胞质和细胞核中的量进行定量。测量细胞核(N)与细胞质(C)中FTR强度之间的比率(N:C比率)。图14B和图4C中所示的结果表明，尽管BRAF突变体影响ERK1/2途径，但是ERBB2突变体没有显著的活性。当组合ERBB2和BRAF突变两者时，图14D中所示的结果揭示除了ERBB2V777L/BRAF V600K组合以外，ERBB2的存在在一定程度上降低BRAF突变体的作用。因此，ERK1/2途径不同程度上受ERBB2和BRAF组合的突变影响。该结果证明，使用本文公开的方法测试基因的组合，能够提供另外的关于其活性以及其之间的相互作用的深刻理解。
实施例10：示例性的致癌指数(无进展生存期指数、总存活率指数、对药物反应的可能性)的计算
用于产生以下示例性致癌指数的方法利用机器学习技术以及其他。计算的第一个步骤是归一化步骤(预处理)。归一化步骤之后可以是合适的机器学习方法，以获知将从多种生物测定输出(即通过本文公开的方法和系统测试患者基因，并且确定其活化水平)获得的实际结果映射到临床相关的指数的函数。
在以下实例中，多种计算的输出是致癌指数。指数的类型取决于被提供用于产生指数的输入(数据)。例如，当对于患者特定基因的生物测定输出连同观察到的无进展生存期一起使用时，所得到的指数是无进展生存期指数(即，所产生的指数基于患者特定突变指示/预测患者的无进展生存期)。类似地，如果输入(数据)是在药物的存在和不存在下对于患者特定基因的生物测定输出连同临床中测量的药物反应一起，则所得到的指数是药物反应的指示物/预测物。
归一化：如本文中上文详述的，所利用的方法和系统允许确定患者的特定突变和突变的信号传送途径活化水平。活化水平可以以通过本文公开的方法测量和确定的核质比(NCR)为单位来表示。
在该实施例中，野生型(WT)参考的原始NCR被任意地设置为参考值(例如，零)，并且所测试的PDM的每个所测量的NCR(“受试NCR”)被给定与该WT参考相关的值。例如，对于特定的患者肿瘤样本，如果参考WT基因X的NCR被发现是1.4，并且受试基因X的NCR被发现是2.1，则对于基因X的报告值是0.7(即2.1-1.4)。类似地，每个所测量的受试NCR可以与相关的固定的参考相关，并且被归一化为其单位(即，使得参考一直是100)。例如，对于示例性的PDM-FTR对KRAS-ERK：如果KRAS-WT-ERK的值是1.4，并且患者-KRAS–ERK的值是1.7，则KRAS_WT-ERK可以被归一化为100，并且患者-KRAS–ERK对将因此被给定值121(121＝1.7/1.4*100)。
因此，生物测定的归一化的输出可以用作用于多种合适的机器学习技术的输入。示例性技术在下文中描述：
相关性单/多变量分析：可以将归一化的数据用于分析特定的信号传送途径的活化水平与例如患者反应之间的相关性。标准统计学方法用于鉴定那些途径，对于所述途径，在单变量分析中，活化与有利的患者反应之间的相关性是统计学显著的。这些途径是考虑到现存临床状态的结果的标志物。多变量分析可以用于鉴定基因和/或途径的组，当所述基因和/或途径的组被组合使用时，与构成该组的单独的基因/途径相比，其活化水平是结果(患者反应)的更好标志物。此外，定义已知或疑似与癌症的分子病理学的特定方面相关的基因/途径的组是可能的。基因/途径可以基于其在癌症的分子生物学的特定方面的已知或疑似作用，或者基于其与已经被分配到特定的组的另一个基因/途径的共活化，而被分配到特定的组。
支持向量机(SVM)：归一化步骤之后，将数据提供给SVM，SVM可以将活化模式分类为临床相关性的组和亚组。SVM使用核函数(Kernel)将活化水平映射到高维空间，并且可以鉴定将不同组的活化水平分开的超平面。核函数(在以下等式中为K)的实例可以包括诸如但不限于以下的核函数：线性函数、多项式函数、高斯径向基函数、双曲正切函数或任何其他非线性函数。
给定一些训练数据D，则一组n形成：
其中y是点x所属的临床结果的反应变量(诸如反应者对比未反应者)，点x属于所述临床结果。X是(如本文所描述的)归一化的生物测定输出的向量，并且是对于特定患者所观察到的所有活性水平的高维描述。SVM简化为以下优化问题：
其中特别地，量关于α主项被最大化为一些约束：αi≥0，
和
优化问题的最终结果是由α限定的超平面：
该超平面将患者活化的空间分成两个反应类别(诸如有反应患者(respondingpatients)和无反应患者(non-responding patients))。尽管SVM的自然应用是二元分类，但是可以使用多类SVM添加更高分辨率的类别和更多反应特征。例如，可以使用归一化的数据基于基因/途径的组的活化水平分类为患者预后的组(即无进展生存期：类别A1-3个月、类别B 4-6个月、类别C 7-9个月等)。结合训练集D中的每个患者中所观察到的类别，对归一化的活化数据进行SVM训练。SVM可以被保留并且调整SVM以适应其他数据。
广义线性模型(GLM)——归一化步骤(如上)之后，将数据供给到能够预测临床相关性的GLM。GLM使用核函数将多种其他统计学模型统一，并且将活化水平映射到临床相关性变量的结果，所述其他统计学模型包括线性回归、逻辑回归和泊松回归。
因变量(即指数)的期望值被表示为相对于如以下等式中的线性预测物Xβ的连接函数g()：
E(Y)＝μ＝g-1(Xβ)
其中X是所有协变量的向量，并且β是未知参数的向量，所述未知参数需要从实例中获知以将‘显著性’分配至每个协变量变量。连接函数可以采取多种形式，诸如，例如，但不限于：常见形式、指数形式、γ形式、逆高斯形式、泊松形式等。连接函数的选择由所观察到的数据以及考虑所得到的指数来确定。
在一些实例中，可以通过许多技术诸如例如使用牛顿-拉弗森方法(Newton–Raphson method)，使用最大似然性优化来得到具有未知权重的向量β。
得到向量β后，可以将新的归一化的生物测定输出添加到等式中，并且所得到的数字是临床指数。
作为实例，活化水平的向量通过以下的生物测定来确定：KRAS-ERK、KRAS-FOXO3、KRAS-RelA、PI3K-FOXO3、PI3K-RelA、EGFR-STAT3、EGFR-ERK、EGFR-FOXO3、EGFR-RelA。该观察结果的向量的归一化结果可以是[110、160、100、80、80、160、100、100、100]，并且未知权重的向量可以被获知为β＝[0.0017、0.0033、0.0053、0.0002、0.0002、0.0033、0.0067、0.00670]。使用指数连接函数产生为23.1810的期望指数。
如果所获知的β参数已经使用无进展生存期(例如以周计)的反应变量来获知，则指数23.18将指示对于所测试的患者估计的～23周的无进展生存期。
实施例11：示例性的致癌指数的产生(中值无进展生存期预测物)
为了产生该示例性的指数，使用以下运算和算法：
OI-致癌指数(中值无进展生存期预测物)。
A-每个PDM和每个FTR之间的归一化的活化矩阵。
W-每个PDM和FTR之间的权重矩阵。机器获知(拟合所获得的生物结果与可用的临床数据)。
作为实例，这是上文所描述的广义线性模型(GLM)的一种实现。在该实施例中，使用的连接函数是恒等函数(用于简单的情况)，并且所测量的活化水平的归一化包括绝对值运算。
对于该实施例，确定了以下PDM和FTR的组的活化。
所测试的PDM是EGFR L861Q和L858R。所测试的FTR是：JNK1、JNK2、ERK2、STAT3、P38b。
所得到的归一化的活化水平是：
结果表明，携带L861Q突变的EGFR基因引起FTR：JNK2、JNK1、ERK2、STAT3、P38b中分别为：0.06、0.11、0.14、0.16、0.07的归一化活化。结果表明，携带L858R突变的EGFR基因引起各自FTR中为：0.13、0、0.21、0.4、0.25的归一化活化，如本文公开的方法所确定的。
活化水平已经结合对于具有这些特定突变的患者所观察到的中值无进展生存期的反应变量一起用来训练系统。所得到的获知的参数W的向量是：
因此得到的指数(即对于患者所期望的中值无进展生存期的指数)表明：
对于携带EGFR基因中的L861Q突变的患者所预期的中值无进展生存期的估量是8.03个月。该值与本领域观察到的8.1个月的值(Chiu,Chao-Hua,等(2015),Journal ofThoracic Oncology 10 793-799)相当。
对于携带EGFR基因中的L858R突变的患者所预期的中值无进展生存期的估量是10.4个月。该值与本领域观察到的10.8个月(Rosell,Rafael,等(2012),The lancetoncology 13.3(2012):239-246)相当。
因此，本文所示的结果表明，通过本文公开的方法和系统产生的致癌指数是灵敏且准确的，并且实际上可以用于提供关于所测试的突变的致癌性程度以及一般患者的状况以及其预后的程度的可靠评估。
具体实施方案的以上描述将如此充分地揭示本发明的总体性质，使得其他人可以通过应用现有的知识，可容易地进行调整和/或修改这类具体实施方案以用于多种应用，而无需过多的实验且不背离一般概念，并且因此，这类调整和修改应该被理解为并且预期被包含在公开的实施方案的等价方式的含义和范围内。虽然已结合本发明的具体实施方案描述了本发明，但是显然地，对于本领域技术人员，许多替换、修改和变化将是明显的。因此，涵盖落入所附权利要求书的精神和宽范围内的所有这些替换、修改和变化是期望的。
序列表
<110> 诺威尔卢斯德克有限公司
<120> 用于确定患者特定驱动突变的致癌指数的方法
<130> NNDX 005 PCT
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<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 23
atgaatgagg tgtctgtcat caaag 25
<210> 24
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 24
tcactcgcgg atgctgg 17
<210> 25
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 25
atgagcgatg ttaccattgt g 21
<210> 26
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 26
ttattctcgt ccacttgcag ag 22
<210> 27
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 27
atgtggagct ggaagtgc 18
<210> 28
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 28
tcagcggcgt ttgagtc 17
<210> 29
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 29
atggtcagct ggggtcg 17
<210> 30
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 30
tcatgtttta acactgccgt ttatg 25
<210> 31
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 31
gcctgctgaa aatgactgaa tataaac 27
<210> 32
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 32
ttacataatt acacactttg tctttgactt c 31
<210> 33
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 33
atgtcgtcca tcttgccatt c 21
<210> 34
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 34
ttatgacatg cttgagcaac g 21
<210> 35
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 35
atggcggcgg cggcgg 16
<210> 36
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 36
ttaagatctg tatcctgg 18
<210> 37
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 37
atgaagaccc cggcggacac 20
<210> 38
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 38
tcaggagtct cggtgctcc 19
<210> 39
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 39
atgagcagaa gcaagcg 17
<210> 40
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 40
tcactgctgc acctgtgc 18
<210> 41
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 41
atggacgaac tgttccccct 20
<210> 42
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 42
taggagctga tctgactcag c 21
<210> 43
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 43
atgtcgggcc ctcg 14
<210> 44
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 44
tcactgctca atctccaggc 20
<210> 45
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 45
atggcccaat ggaatcag 18
<210> 46
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 46
tcacatgggg gaggtagc 18
<210> 47
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 47
Cys Cys Pro Gly Cys Cys
1 5

Claims (50)

1.携带包含患者特定突变的基因的第一组表达构建体及相应的野生型基因的第二组表达构建体在制备用于产生一种或更多种所述患者特定突变的致癌指数的试剂盒中的用途，当所述试剂盒被使用时，包括以下步骤：
a.形成携带包含患者特定突变的基因的所述第一组表达构建体及相应的野生型基因的所述第二组表达构建体的可寻址阵列；
b.对于所述可寻址阵列中的每个位点，添加编码荧光易位报告物(FTR)基因的表达载体，所述荧光易位报告物(FTR)基因包含连接至特定报告物基因部分的靶基因部分；
c.将活的测定细胞在使得所述表达构建体和所述表达载体转染进入所述测定细胞的条件下添加至每个位点；
d.比较表达包含所述突变的基因与表达其相应的野生型表达的基因的所述测定细胞中表达的FTR的亚细胞定位和/或易位，以鉴定不同结果；
e.通过以下对候选的患者特定突变的所述不同结果进行定量：
i)处理所述不同结果以确定所测试的FTR在所述第一组表达构建体和所述第二组表达构建体的存在下的易位程度，以确定所述患者特定突变的活化水平；
ii)基于所述FTR在所述第二组表达构建体的存在下的易位程度归一化所述FTR在所述第一组表达载体的存在下的易位程度，以确定所述患者特定突变的归一化的活化水平；以及
iii)分析所述患者特定突变的归一化的活化水平与临床结果(参考)之间的映射；
以从而确定所述一种或更多种患者特定突变的所述致癌分级指数。
2.根据权利要求1所述的用途，其中分析包括利用机器学习。
3.根据权利要求1所述的用途，其中分析包括相关性单变量分析、多变量分析、支持向量机、广义线性模型或其组合。
4.根据权利要求1所述的用途，其中所述易位程度基于核质比来确定。
5.根据权利要求1所述的用途，其中所述指数具有指示所述候选的患者特定突变驱动恶性肿瘤的能力的数值。
6.根据权利要求1所述的用途，其中所述指数指示患者的无进展生存期、患者的总存活率、药物反应的概率、进展时间(TTP)、肿瘤反应率、复发、无病生存期(DFS)或其组合。
7.根据权利要求1所述的用途，其中所述患者特定突变的易位程度被进一步归一化为对所述患者特定突变参与的细胞信号传送途径的影响。
8.根据权利要求1所述的用途，其中所述亚细胞定位选自：胞质溶胶、细胞核、核仁、质膜、内质网(ER)、线粒体、高尔基体、溶酶体、过氧化物酶体、内体区室和细胞骨架。
9.根据权利要求1所述的用途，其中所述FTR的所述靶基因部分编码选自以下的蛋白：肿瘤抑制因子、细胞骨架蛋白、生长因子受体、G-蛋白偶联受体、细胞粘附蛋白、蛋白激酶、转录因子、衔接体蛋白质和交换因子。
10.根据权利要求1所述的用途，其中所述FTR的所述报告物基因部分编码荧光标志物。
11.根据权利要求1所述的用途，其中所述基因源自所述患者的生物样品。
12.根据权利要求1所述的用途，其中所述突变的至少一种是致癌突变。
13.根据权利要求1所述的用途，其中所述第一和/或第二组表达构建体包含双链线性DNA。
14.根据权利要求1所述的用途，其中所述第一和/或第二组表达构建体的启动子是诱导型启动子或组成型启动子。
15.根据权利要求1所述的用途，其中所述第一和/或第二组表达构建体携带基因的一部分。
16.根据权利要求1所述的用途，其中当所述试剂盒被使用时，所述构建体和/或载体在转染试剂的存在下在固体支持体上被进一步干燥。
17.根据权利要求1所述的用途，其中步骤c)在步骤a)和/或步骤b)之前。
18.根据权利要求1所述的用途，其中当所述试剂盒被使用时，还包括将受试药物添加至所述细胞的步骤。
19.根据权利要求18所述的用途，其中当所述试剂盒被使用时，治疗指数被计算，所述治疗指数指示所述患者特定突变驱动恶性生长的能力响应于所述受试药物的降低。
20.一种用于产生致癌分级指数的系统，所述系统包括处理线路，所述处理线路被配置为：
a)获得指示受试细胞中荧光易位报告物(FTR)基因产物在第一组表达构建体的存在下和在第二组表达构建体的存在下的亚细胞易位程度的不同结果；
b)基于所述FTR的亚细胞易位或定位的程度确定一种或更多种患者特定突变的活化水平；
c)基于所述FTR在所述第二组表达构建体的存在下的易位程度，归一化所述FTR在所述第一组表达构建体的存在下的亚细胞易位，以确定所述患者特定突变的归一化的活化水平；以及
d)分析所述患者特定突变的活化水平与临床结果(参考)之间的相关性，以从而确定所述致癌指数；
其中所述不同结果通过以下获得：
i)形成携带包含一种或更多种患者特定突变的基因的第一组表达构建体及相应的野生型基因的第二组表达构建体的可寻址阵列；
ii)对于所述可寻址阵列中的每个位点，添加编码荧光易位报告物(FTR)基因的表达载体，所述荧光易位报告物(FTR)基因包含连接至特定报告物基因部分的靶基因部分；以及
iii)将活的测定细胞在使得所述表达构建体和表达载体转染进入所述测定细胞的条件下添加至每个位点。
21.根据权利要求20所述的系统，其中分析包括机器学习。
22.根据权利要求20所述的系统，其中分析包括相关性单变量分析、多变量分析、支持向量机分析、广义线性模型分析或其任何组合。
23.根据权利要求20所述的系统，其中所述指数具有指示候选的患者特定突变驱动恶性肿瘤的能力的数值。
24.根据权利要求20所述的系统，其中所述指数指示患者的无进展生存期、患者的总存活率、药物反应的概率、进展时间(TTP)、肿瘤反应率、复发、无病生存期(DFS)或其组合。
25.根据权利要求20所述的系统，其中所述患者特定突变的易位程度被进一步归一化为对所述患者特定突变参与的细胞信号传送途径的影响。
26.根据权利要求20所述的系统，其中所述亚细胞定位选自：胞质溶胶、细胞核、核仁、质膜、内质网(ER)、线粒体、高尔基体、溶酶体、过氧化物酶体、内体区室和细胞骨架。
27.根据权利要求20所述的系统，其中所述FTR的所述靶基因部分编码选自以下的蛋白：肿瘤抑制因子、细胞骨架蛋白、生长因子受体、G-蛋白偶联受体、细胞粘附蛋白、蛋白激酶、转录因子、衔接体蛋白质和交换因子。
28.根据权利要求20所述的系统，其中所述FTR的所述报告物基因部分编码荧光标志物。
29.根据权利要求20所述的系统，其中所述基因源自所述患者的生物样品。
30.根据权利要求20所述的系统，其中所述突变的至少一种是致癌突变。
31.根据权利要求20所述的系统，其中所述第一和/或第二组表达构建体包含双链线性DNA。
32.根据权利要求20所述的系统，其中所述第一和/或第二组表达构建体的启动子是诱导型启动子或组成型启动子。
33.根据权利要求20所述的系统，其中所述第一和/或第二组表达构建体携带基因的一部分。
34.根据权利要求20所述的系统，所述系统还包括在转染试剂的存在下在固体支持体上干燥所述构建体和/或载体。
35.根据权利要求20所述的系统，其中步骤iii)在步骤i)和/或步骤ii)之前。
36.根据权利要求20所述的系统，所述系统还包括将受试药物添加至所述细胞的步骤。
37.根据权利要求36所述的系统，其中所述处理线路被进一步配置为确定治疗指数，所述治疗指数指示所述患者特定突变驱动恶性生长的能力响应于所述受试药物的降低。
38.携带包含一种或更多种患者特定突变的基因的第一组表达构建体及相应的野生型基因的第二组表达构建体在制备产生指示所述一种或更多种患者特定突变对药物治疗的敏感性的治疗指数的试剂盒中的用途，当所述试剂盒被使用时，包括以下步骤：
a)形成携带包含一种或更多种患者特定突变的基因的所述第一组表达构建体及相应的野生型基因的所述第二组表达构建体的可寻址阵列；
b)对于可寻址阵列中的每个位点，添加编码荧光易位报告物(FTR)基因的表达载体，所述荧光易位报告物(FTR)基因包含连接至特定报告物基因部分的靶基因部分；
c)将活的测定细胞在使得所述表达构建体和所述表达载体转染进入所述测定细胞的条件下添加至每个位点；
d)比较在药物的存在或不存在下表达包含所述一种或更多种突变的基因与表达其相应的野生型表达的基因的测定细胞中表达的FTR的亚细胞定位和/或易位，以鉴定不同结果；
e)通过以下对候选的患者特定突变的所述不同结果进行定量：
i)处理所述不同结果以确定所测试的FTR在所述第一组表达构建体和所述第二组表达构建体的存在下的亚细胞易位程度，以确定在所述药物的存在或不存在下所述患者特定突变的活化水平；
ii)在所述药物的存在或不存在下，基于所述FTR在所述第二组表达构建体的存在下的亚细胞易位程度，归一化所述FTR在所述第一组表达载体的存在下的亚细胞易位程度，以确定所述患者特定突变的归一化的活化水平；以及
iii)分析在所述药物的存在或不存在下所述患者特定突变的归一化的活化水平与临床结果(参考)之间的相关性；
以从而确定所述药物对所述患者特定突变的治疗指数。
39.根据权利要求38所述的用途，其中所述药物是抗癌药物。
40.根据权利要求38所述的用途，其中当所述试剂盒被使用时，多于一种药物被伴随地或顺序地添加。
41.根据权利要求38所述的用途，其中当所述试剂盒被使用时，不同浓度的药物被添加。
42.根据权利要求38所述的用途，其中所述亚细胞定位包括：胞质溶胶、细胞核、核仁、质膜、内质网(ER)、线粒体、高尔基体、溶酶体、过氧化物酶体、内体区室和细胞骨架。
43.根据权利要求38所述的用途，其中分析包括利用机器学习。
44.根据权利要求38所述的用途，其中所述基因源自所述患者的生物样品。
45.根据权利要求38所述的用途，其中所述突变的至少一种是致癌突变。
46.根据权利要求38所述的用途，其中所述第一和/或第二组表达构建体包含双链线性DNA。
47.根据权利要求38所述的用途，其中所述第一和/或第二组表达构建体的启动子是诱导型启动子或组成型启动子。
48.根据权利要求38所述的用途，其中所述第一和/或第二组表达构建体携带基因的一部分。
49.根据权利要求38所述的用途，其中当所述试剂盒被使用时，所述构建体和/或载体在转染试剂的存在下在固体支持体上被进一步干燥。
50.根据权利要求38所述的用途，其中步骤c)在步骤a)和/或步骤b)之前。
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