ES2260057T3 - Virus oncolitico. - Google Patents

Virus oncolitico.

Info

Publication number
ES2260057T3
ES2260057T3 ES00965106T ES00965106T ES2260057T3 ES 2260057 T3 ES2260057 T3 ES 2260057T3 ES 00965106 T ES00965106 T ES 00965106T ES 00965106 T ES00965106 T ES 00965106T ES 2260057 T3 ES2260057 T3 ES 2260057T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
virus
vev
cells
sequence
use according
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
ES00965106T
Other languages
English (en)
Inventor
John Cameron Bell
Nahum Sonenberg
David Francis Stojdl
Earl Garnet Brown
Harold Lawrence Atkins
Ricardo Marcellus Marius
Brian Dennis Lichty
Shane Brendan Knowles
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Wellstat Biologics Corp
Original Assignee
Wellstat Biologics Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Wellstat Biologics Corp filed Critical Wellstat Biologics Corp
Application granted granted Critical
Publication of ES2260057T3 publication Critical patent/ES2260057T3/es
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/76—Viruses; Subviral particles; Bacteriophages
    • A61K35/766—Rhabdovirus, e.g. vesicular stomatitis virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/21—Interferons [IFN]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A01K2267/0331—Animal model for proliferative diseases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
    • C07K2319/21—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand containing a His-tag
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/20011—Rhabdoviridae
    • C12N2760/20211—Vesiculovirus, e.g. vesicular stomatitis Indiana virus
    • C12N2760/20221—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/20011—Rhabdoviridae
    • C12N2760/20211—Vesiculovirus, e.g. vesicular stomatitis Indiana virus
    • C12N2760/20222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/20011—Rhabdoviridae
    • C12N2760/20211—Vesiculovirus, e.g. vesicular stomatitis Indiana virus
    • C12N2760/20232—Use of virus as therapeutic agent, other than vaccine, e.g. as cytolytic agent
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/20011—Rhabdoviridae
    • C12N2760/20211—Vesiculovirus, e.g. vesicular stomatitis Indiana virus
    • C12N2760/20251—Methods of production or purification of viral material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/20011—Rhabdoviridae
    • C12N2760/20211—Vesiculovirus, e.g. vesicular stomatitis Indiana virus
    • C12N2760/20261—Methods of inactivation or attenuation

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)

Abstract

Uso de un virus para la fabricación de un medicamento para reducir la viabilidad de una célula tumoral, en el que el virus es una cepa atenuada del virus de la estomatitis vesicular y en el que la célula tumoral es una célula de cáncer hematopoyético, un melanoma, un sarcoma, un tumor neuroendocrino, un carcinoma de pulmón o un carcinoma de colon.

Description

Virus oncolítico.
La presente invención se refiere a un agente terapéutico novedoso contra el cáncer. Más específicamente, esta invención se refiere a virus que infectan selectivamente e inhiben el crecimiento de las células tumorales.
Antecedentes de la invención
Se conoce el uso de bacterias oncolíticas, o composiciones de bacterias oncolíticas, para combatir neoplasmas en seres humanos y animales. Por ejemplo, los documentos EP 564 121, GB 1.587.244 y U.S. 3.192.116 describen el uso de bacterias no patógenas que dan como resultado la liquificación y la lisis de tumores en vertebrados. Sin embargo, en muchos casos, por ejemplo con el uso de Clostridium, los tumores sólo se destruyen parcialmente y todavía puede producirse el crecimiento del nuevo del tumor. Para garantizar el control del crecimiento del tumor, se ha sugerido la administración de bacterias, seguido por fármacos quimioterápicos, por ejemplo 5-fluorodesoxiuridina o agentes alquilantes (por ejemplo, el documento GB 1.069.144).
También se ha demostrado que varios virus muestran propiedades tumoricidas, por ejemplo el parvovirus H-1 (Dupressoir et al., 1996. Cáncer Res, 49: 3203-3208), el virus de la enfermedad de Newcastle (Reichand et al., 1992. J. Surg. Res, 52: 448-453) o vectores retrovirales que contienen genes de susceptibilidad a fármacos (Takamiya et al., 1993. J. Neurosurg, 79: 104-110). Los documentos W097/26904 y W096/03997 describen un virus herpes simple mutante (VHS-1761) que inhibe el crecimiento de células tumorales. La administración de VHS-1716 que comprende una deleción de 759 pares de bases en cada copia de \gamma34.5 de la región de repetición larga (R_{L}) a células tumorales elimina estas células. Sin embargo, este virus es específico para células neuronales, ya que se sabe que el VHS habita selectivamente en el sistema neuronal. Además, el uso de patógenos humanos comunes, tal como un virus oncolítico está limitado, ya que es probable que la población general se haya infectado y haya adquirido una respuesta inmunitaria a estos virus. Una respuesta inmunitaria preexistente a una cepa viral similar a la utilizada como agente terapéutico en el tratamiento de un cáncer puede atenuar la eficacia del virus como agente terapéutico.
Se ha notificado que otras cepas de virus tienen actividad oncolítica. Se cree que el adenovirus humano ONYX-015 (producido por ONYX pharmaceuticals) se replica preferentemente en células tumorales negativas para p53. Este virus es prometedor en ensayos clínicos con pacientes con cáncer en cabeza y cuello (Kirn, D., T. et al., Nat Med, 1998.4: 1341-1342). Oncolytic Biotech está desarrollando el reovirus tipo 3 como agente terapéutico contra el cáncer, que crece preferentemente en células PKR-/- (proteína cinasa dependiente de ARN) (Yin, H. S.,. J Virol Methods, 1997. 67:93-101; Strong, J. E. y P. W. Lee,. J Virol, 1996.70: 612-616; Strong, J. E., et al., Virology, 1993. 197:405-411; Minuk, G. Y., et al., J Hepatol, 1987. 5:8-13; Rozee, K. R., et al., Appl Environ Microbiol, 1978. 35:297-300). Los reovirus de tipo III mostraron propiedades de replicación aumentadas en células que expresaban el oncogén ras mutante (Coffey, M. C., et al., Science, 1998. 282:1332-1334; Strong, J. E., et al., Embo J, 1998. 17:3351-1362). Mundschau y Faller (Mundschau, L. J. y D. V. Faller, J Biol Chem, 1992. 267:23092-23098) han demostrado que el producto del oncogén ras activaba un inhibidor de la PKR, y esto se asoció a la observación de que el inhibidor químico de la PKR, 2-aminopurina, aumentaba el crecimiento de Reo de tipo III en células normales, lo que implica que PKR es un regulador crítico del crecimiento de los reovirus.
El documento WO 99/04026 enseña el uso de VEV (virus de la estomatitis vesicular) como un vector en la terapia génica para la expresión de una amplia variedad de productos, incluyendo anticuerpos, inmunógenos, toxinas, etc. para el tratamiento de una variedad de trastornos de enfermedad.
El documento WO 99/45783 describe células productoras de virus selectivos de la replicación en el tratamiento del cáncer.
El documento WO 96/34625 describe vesiculovirus y sus usos.
Los interferones son factores circulantes que se unen a receptores de la superficie celular, que activan una cascada de señalización que conduce finalmente a varias respuestas biológicas.
Dos de los resultados de la señalización del interferón están estrechamente asociados: (1) una respuesta antiviral y (2) la inducción de las señales inhibidoras del crecimiento y/o apoptóticas.
El documento U.S. 4.806.347 describe el uso del interferón \gamma y de un fragmento del INF-\gamma (conocido como \Delta4\alpha2) frente a células tumorales humanas.
El documento WO 99/18799 informa acerca de la actividad citotóxica del virus de la enfermedad de Newcastle (NDV) y del virus Sindbis hacia varias células cancerígenas humanas. Sin embargo, ambos virus demostraron selectividad en su actividad citotóxica hacia las células tumorales.
El documento WO 99/18799 describe que la adición del interferón a células normales hace que estas células sean resistentes al NDV, aunque este efecto no se observó con células tumorales tratadas con interferón que continuaban mostrando sensibilidad inducida por NDV. El documento WO 99/18799 también describe la actividad citotóxica de las células VEV frente a las células KB (carcinoma de cabeza y cuello) y HT 1080 (fibrosarcoma), y el alivio de la citotoxicidad en células normales y tumorales, mediante VEV, en presencia del interferón. No se probaron otros tipos celulares frente a la actividad citotóxica de VEV.
Se ha informado acerca de ciertas cepas mutantes de VEV. Stanners, et al., Virology (1987) 160(1): 255-8. Francoeur, et al., Virology (1987) 160(1): 236-45. Stanners, et al., J. Gen. Virol. (1975) 29 (3): 281-96. Stanners, et al., Cell (1977) 11 (2): 273-81.
La presente invención se refiere a formulaciones virales que son útiles en el tratamiento de enfermedades y cánceres, preferiblemente leucemia. Tales formulaciones también pueden comprender una cepa oncolítica de VEV y un agente químico, por ejemplo una citocina que confiere a las células normales resistencia frente a la infección viral, pero que deja células enfermas o cancerígenas susceptibles de infección viral y lisis.
Es un objeto de la invención superar las desventajas de la técnica anterior.
El objeto anterior se cumple mediante las combinaciones de las características de las reivindicaciones principales, describiendo las reivindicaciones dependientes realizaciones ventajosas de la invención adicionales.
Sumario de la invención
La presente invención se refiere a un agente terapéutico novedoso contra el cáncer. Más específicamente, esta invención se refiere a virus que infectan selectivamente e inhiben el crecimiento de las células tumorales.
Según la presente invención se proporciona el uso de un virus en la fabricación de un medicamento para reducir la viabilidad de una célula tumoral, en el que el virus es una cepa atenuada del virus de la estomatitis vesicular y en el que la célula tumoral es un melanoma vesicular hematopoyético, un sarcoma, un tumor neuroendocrino, un carcinoma de pulmón o un carcinoma de colon.
Esta invención también se refiere a la reducción de la viabilidad de una célula tumoral mediante la administración del VEV a la célula tumoral, en la que el VEV no puede inactivar la actividad de PKR dentro de una célula huésped.
La presente invención también está relacionada con la reducción de la viabilidad de una célula tumoral dentro de una población de células mediante la administración del VEV a la población de células, en la que el VEV puede infectar y eliminar selectivamente a la célula tumoral. Preferiblemente, el VEV no puede inactivar la actividad de PKR en una célula huésped.
Esta invención también se refiere a la reducción de la viabilidad de una célula tumoral dentro de una población de células, en la que la población de células se trata con interferón antes de la administración del VEV.
La presente invención se refiere a un VEV mutante, caracterizado porque el VEV mutante crece escasamente en células que responden al interferón. Tales cepas también se denominan en el presente documento cepas atenuadas de VEV, o cepas de VEV que crecen escasamente en células que responden al interferón. Pueden identificarse por su producción de placas más pequeñas en las monocapas de células que responden al interferón que en las células que no responden al interferón, tal como se describe más adelante. Las cepas de VEV atenuadas también pueden identificarse porque tienen una DL50 (dosis letal media) mayor cuando se administra por vía intranasal a ratones PKR+/- en comparación con WT Indiana, en el ensayo descrito más adelante.
La presente invención también se refiere a moléculas aisladas de ácido nucleico (ADN o ARN) que tienen una secuencia que codifica para proteínas del VEV mutante y secuencias complementarias a la misma. Tales moléculas de ácido nucleico pueden utilizarse en la preparación de un VEV recombinante o como vacuna de ADN.
Hay varias ventajas para el uso de un virus tal como se describe en el presente documento como virus terapéutico en relación con otros virus:
\bullet
Los rabdovirus no son patógenos humanos comunes. Por ejemplo, el VEV se encuentra principalmente en insectos, roedores y animales de granja domésticos y, por tanto, una gran proporción de individuos no se habrán infectado o inmunizado frente a la infección por VEV. Por otra parte, los adenovirus o los reovirus son patógenos humanos y la mayor parte de la población general se ha infectado y ha adquirido una respuesta inmunitaria frente a ambos virus. Una respuesta inmunitaria preexistente a una cepa viral similar a la utilizada como agente terapéutico en el tratamiento de un cáncer puede atenuar la eficacia del virus como agente terapéutico;
\bullet
El VEV se replica mucho más rápidamente que los adenovirus o los reovirus, y puede concentrarse fácilmente hasta títulos altos. La producción de preparaciones de virus de título alto es una limitación significativa de otras posibles cepas virales terapéuticas;
\bullet
El VEV es un virus simple que comprende sólo cinco genes, fácilmente tratable mediante manipulación genética. Tal sistema no está actualmente disponible para reovirus;
\bullet
La infección celular mediante VEV responde enormemente a los agentes químicos adicionales tales como el interferón, una característica que potencia su valor terapéutico;
\bullet
El VEV tiene un amplio intervalo de huéspedes y puede infectar a la mayoría de los tipos de células humanas, mientras que otros virus son más limitados en cuanto a los tipos de células que puede infectar;
\bullet
El VEV es un virus ARN y la totalidad de su ciclo de vida transcurre en el citoplasma. Por tanto, supone menos peligro de integración no deseada en el genoma de un paciente.
Colectivamente, estos atributos del VEV proporcionan ventajas significativas sobre el uso de los otros virus que se sabe que muestran actividad oncolítica.
Breve descripción de los dibujos
Éstas y otras características de la invención se harán más evidentes a partir de la siguiente descripción en la que se hace referencia a los dibujos adjuntos, en los que:
La Figura 1 muestra una representación esquemática general de la cascada del interferón.
La Figura 2 muestra el efecto del VEV sobre fibroblastos humanos normales, la línea celular de melanoma humano SK-MEL3, LNCaP, una línea celular de cáncer de próstata y la célula de carcinoma de ovario A2780, en presencia y ausencia de interferón tal como se determina mediante un ensayo de cpe (efecto citopático) modificado. Se infectaron monocapas de células en una MOI (multiplicidad de infección) de 0,1 ufp (unidades formadoras de placa) en una placa de 12 pocillos. A tiempo 0 y cada 12 horas posteriormente hasta las 48 horas, un pocillo de células infectadas se fijó con 0,5 ml de fijación Leukostat durante 2 minutos. Al final del experimento, las monocapas se tiñeron con tinciones de Leukostat.
La Figura 3 muestra el efecto citopático del VEV en células de fibroblastos normales (figura 3 (a)), y líneas celulares de tumor, incluyendo células tumorales de ovario (figura 3 (b)) y células tumorales KB (figura 3 (c)).
La Figura 4 muestra el efecto del VEV sobre fibroblastos humanos normales co-cultivados con células tumorales 293T durante un periodo de 24 horas. Los co-cultivos se infectaron a una MOI de 0,1 ufp/célula y se permitió que la infección continuara en presencia (IFN+) o ausencia (IFN-) de interferón. Los cultivos se tiñeron con anticuerpos frente al antígeno T grande (núcleos rojos) para detectar las células 293T y con DAPI (4''-6-diamidino-2-fenilindol) (núcleos azules) que tiñen todos los tipos de células.
La Figura 5 muestra el efecto del VEV in vivo sobre tumores implantados dentro de ratones desnudos. Se implantaron células de melanoma humano dentro de ratones desnudos y, o bien se les inyectó una simulación (VEV (-)), se les inyectó el VEV de tipo natural (datos no presentados), o se les inyectaron células de melanoma adicionales infectadas in vitro con VEV durante una hora antes de la inyección en el sitio del tumor de VEV (+)). El tamaño de los tumores se determinó durante un periodo de 7 días.
La Figura 6 muestra las úlceras formadas sobre un tumor producidas dentro de un ratón desnudo, tal como se describe en la figura 5.
Figura 7: VEV y células infectadas con VEV inhiben el crecimiento de xenoinjertos de melanoma humano en ratones desnudos.
Figuras 8A y 8B: Los ratones PKR-/- son extremadamente sensibles a la infección intranasal por VEV y demuestran una deficiencia en la resistencia mediada por el IFN.
Figura 9: El interferón puede proteger a ratones desnudos que llevan un xenoinjerto durante el tratamiento con VEV.
Figuras 10A y 10B: Producción de virus a partir de células tumorales y células normales infectadas con la cepas de VEV natural de tipo Indiana y varias cepas de VEV mutantes.
Figura 11: Las células malignas se eliminan rápidamente tras la infección por VEV (WT Indiana (tipo natural Indiana)) y no están protegidas mediante el IFN-\alpha.
Figura 12: VEV indujo un efecto citopático visible en células de melanoma humano pero no en células humanas primarias o sin IFN-\alpha.
Figura 13: Eficacia de una dosis intravenosa única del VEV mutante en el tratamiento de xenoinjertos de melanoma humano en ratones desnudos.
Figura 14: Secuencia de ADNc de la proteína N de los VEV de tipo natural y mutante.
Figura 15: Secuencia de aminoácidos de la proteína N de los VEV de tipo natural y mutante.
Figura 16: Secuencia de ADNc de la proteína P de los VEV de tipo natural y mutante.
Figura 17: Secuencia de aminoácidos de la proteína P de los VEV de tipo natural y mutante.
Figura 18: Secuencia de ADNc de la proteína M de los VEV de tipo natural y mutante.
Figura 19: Secuencia de aminoácidos de la proteína M de los VEV de tipo natural y mutante.
Figura 20: Secuencia de ADNc de la proteína G de los VEV de tipo natural y mutante.
Figura 21: Secuencia de aminoácidos de la proteína G de los VEV de tipo natural y mutante.
Figura 22: Secuencia de ADNc de la proteína L de los VEV de tipo natural y mutante.
Figura 23: Secuencia de aminoácidos de la proteína L de los VEV de tipo natural y mutante.
Descripción de las realizaciones preferidas
La presente invención se refiere a un agente terapéutico novedoso contra el cáncer. Más específicamente, esta invención se refiere a virus que infectan selectivamente e inhiben el crecimiento de las células tumorales.
La siguiente descripción es de una realización preferida, únicamente a modo de ejemplo y sin limitación para la combinación de características necesaria para llevar a cabo la invención.
Las células cancerígenas obtienen una ventaja de supervivencia con respecto a sus homólogas normales al adquirir mutaciones en las rutas apoptóticas o de inhibición del crecimiento y, en el caso de los interferones, lo harían así a expensas de mecanismos de defensa antivirales críticos. A medida que las células tumorales obtienen una ventaja de crecimiento significativa mediante la mutación de los genes de respuesta al interferón, serán más susceptibles a la infección viral.
Por "reducción de la viabilidad" de una célula tumoral se quiere decir o bien la muerte de la célula tumoral o bien la limitación de su crecimiento durante un periodo de tiempo.
Por "no es un patógeno humano común" se quiere decir un virus que se encuentra principalmente en huéspedes no humanos, por ejemplo, pero sin limitarse a insectos, roedores y animales de granja. Tales virus no se encuentran normalmente dentro de la población humana general.
Tal como se usa en el presente documento Mutante I, Mutante 1, Mut 1 y MI se refieren a la cepa T1026 mutante atenuada. Mutantes II, III, IV y V (y la nomenclatura variante análoga a Mutante I) se refieren a los mutantes T1026R, TP3, TP6 y G31 atenuados, respectivamente.
El agente terapéutico novedoso contra el cáncer de la presente invención incorpora el uso de al menos un virus oncolítico que selecciona selectivamente como diana las células tumorales y conduce a su destrucción. Preferiblemente el virus oncolítico es un virus de la estomatitis vesicular (VEV), por ejemplo la cepa Indiana, u otras cepas, o un derivado del mismo. Por un derivado del VEV, se quiere decir un virus VEV obtenido o bien seleccionando el virus bajo diferentes condiciones de crecimiento, o bien uno que se ha sometido a una diversidad de presiones de selección, o bien uno que se ha modificado genéticamente utilizando técnicas recombinantes conocidas en la técnica. Por ejemplo, lo que no debe considerarse como limitante en modo alguno, un derivado de VEV puede incluir un VEV mutante seleccionado tras la infección en una célula humana que se ha tratado con interferón tal como se describe en el presente documento, o un VEV que muestra una etiqueta de afinidad útil para la purificación por
afinidad.
La eficacia de la inhibición por parte del virus oncolítico del crecimiento de la célula tumoral reside en parte en la sensibilidad diferencial de las células tumorales, en comparación con las células normales, a la infección viral. Sin desear adherirse a ninguna teoría, la sensibilidad diferencial puede deberse en parte a la regulación por disminución o a la inactivación de factores dentro de una célula que en caso contrario funcionan para proteger a la célula del crecimiento de tumores y de la infección por virus. Ejemplos de factores que cuando se inactivan dan como resultado el crecimiento de células tumorales, y que también están implicados en mediar la infección por virus, incluyen pero sin limitarse a PKR (cinasa dependiente de ARN de doble cadena) y PML (gen de la leucemia promielocítica), sin embargo, debe entenderse que otros factores también pueden desempeñar un papel.
Se sabe que la regulación por disminución o la inactivación de la PKR, mediante una variedad de mecanismos que incluyen, pero sin limitarse a, los mediadores relacionados con la PKR, están asociadas con el crecimiento de la célula tumoral, mientras que las células normales muestran una PKR activa. Además, las células de tipo natural expuestas a la infección viral muestran una expresión elevada de PKR que da como resultado la supresión de la replicación viral, mientras que las células que muestran actividad de PKR reducida o ausencia de la misma, son sensibles al ataque viral y muestran crecimiento canceroso. De manera similar, el producto génico de PML funciona como un inhibidor tumoral y también se sabe que inhibe la replicación viral.
Por "sensibilidad diferencial" se quiere decir una propiedad asociada con una célula que da como resultado tanto el crecimiento de la célula tumoral como la incapacidad de la célula para inhibir la replicación viral. Las células que muestran sensibilidad diferencial son las candidatas preferidas para el tratamiento del crecimiento de células tumorales utilizando el agente terapéutico contra el cáncer de la presente invención. Esta sensibilidad diferencial puede acentuarse mediante la adición de uno o más agentes químicos antes de o durante el tratamiento de la célula tumoral. Preferiblemente, este agente químico aumenta la resistencia de una célula de tipo natural a la infección viral, pero tiene poco o ningún efecto sobre la respuesta de una célula tumoral a la infección viral. Un ejemplo, que no debe considerarse limitante en modo alguno, de un agente químico de este tipo es el interferón.
Por "PKR" se quiere decir una serina / treonina cinasa que muestra múltiples funciones, incluyendo papeles en el control de la traducción del ARNm y la transcripción génica (1,2). La cinasa alberga dos motivos de unión al ARN de doble cadena, ARNdc, en su mitad reguladora amino terminal y un dominio cinasa catalítico en su cola carboxílica. La unión del ARNdc al extremo amino induce un cambio conformacional en la enzima que revela y activa el dominio de cinasa catalítico. La expresión de PKR está inducida por varios mediadores de la PKR, incluyendo, pero sin limitarse al interferón.
Por "mediador de la PKR" se quiere decir proteínas o compuestos que afectan directa o indirectamente a la actividad de la PKR a nivel génico o proteico e incluye tanto activadores de la PKR como inhibidores de la PKR. Ejemplos de los activadores de la PKR incluyen, pero no se limitan a, STAT1 (véase la figura 1), el factor regulador del interferón (IRF-1), y el interferón. Ejemplos de inhibidores de la PKR incluyen, pero sin limitarse a, VA RNA, p58 (IPK), factores asociados con la ruta Ras, la proteína ribosómica L18, o proteasas que degradan la proteína PKR. La actividad de la PKR también puede mediarse a través de mutaciones en el gen que codifica para la PKR, o en la región reguladora que conduce a la expresión de PKR. Estas mutaciones pueden aumentar o disminuir la actividad de PKR. Las mutaciones en la PKR que reducen la actividad de PKR incluyen, pero sin limitarse a, la pérdida de la capacidad de unión al ARNdc de la PKR, o mutaciones que dan como resultado mutantes catalíticos negativos. Las mutaciones que aumentan la actividad de PKR incluyen, pero no se limitan a, la sobreexpresión de PKR, o mutaciones que dan como resultado una proteína PKR más activa.
PKR regula la traducción mediante la fosforilación de eIF-2\alpha, un factor que participa en el inicio de la traducción de proteínas. Una vez fosforilado, eIF-2\alpha-GDP, forma un complejo inactivo con eIF-2B lo que da como resultado una rápida inhibición de la síntesis de proteínas. PKR incide sobre la transcripción génica indirectamente mediante la activación de NF\kappaB. Esta activación parece llevarse a cabo mediante la fosforilación por la PKR de una I\kappaB cinasa (3) que, a su vez, fosforila a I\kappaB, lo que conduce a su destrucción dirigida.
Actividad antiviral de PKR
La infección de una célula por muchos tipos de virus distintos conduce a la formación de ARNdc (por ejemplo, como productos intermedios de la replicación) lo que da como resultado la activación de PKR y de sus efectores posteriores en el sentido de 3' (véase la figura 1). En particular, la síntesis de proteínas se termina rápidamente y se inicia una cascada apoptótica (4,5). Como resultado de la activación de PKR, se reduce la producción de nuevos viriones y se limita la diseminación del virus por el organismo. Der et al (12) informan de una necesidad de PKR en la inducción de la apoptosis celular en respuesta a una variedad de agentes inductores del estrés.
Sin adherirse a ninguna teoría, es posible que los cánceres surjan como resultado de múltiples mutaciones en los genes que controlan la proliferación celular y la apoptosis. El papel de la PKR en la regulación de la síntesis de proteínas asociada a sus propiedades antiproliferativas y pro-apoptóticas la convierten en una diana para las mutaciones oncogénicas, lo que afecta directa o indirectamente a su actividad.
Tal como se describe en más detalle en los ejemplos, una selección inicial de varios virus utilizando animales
PKR-/- indicó que los animales sin PKR son susceptibles de infección por el virus de la estomatitis vesicular (VEV). Se obtuvieron resultados similares in vitro, donde la infección por VEV avanzó más rápidamente en fibroblastos PKR-/-,
cuando se comparaba con la infección en fibroblastos PKR +/+. Estos resultados demuestran que las células de mamíferos requieren la PKR para resistir a las infecciones por VEV. Además, ciertas líneas celulares, por ejemplo, pero sin limitarse a la médula ósea humana primaria, eran resistentes a la infección por VEV, mientras que las líneas celulares de leucemia eran sensibles a la infección por VEV.
Se considera que los virus relacionados con VEV, u otros virus que muestran mecanismos similares de infección viral pueden identificarse como que muestran la propiedad de infectar selectivamente células con actividad PKR reducida o ausencia de la misma. Un experto en la técnica puede seleccionar fácilmente otros virus utilizando los métodos tal como se describen en el presente documento, por su capacidad para reducir la viabilidad de las células, o eliminar las células que carecen de actividad PKR, o células PKR-/-, animales PKR -/-, o tanto células como animales PKR-/-.
Tal como se indica en los ejemplos más adelante, el pretratamiento de las células con interferón reduce la capacidad de infección de los virus en varios órdenes de magnitud. Sin desear adherirse a ninguna teoría, la adición del interferón puede regular por incremento la expresión de PKR dando como resultado este aumento de la resistencia a la infección viral.
Debido a su potente actividad antiviral, los virus han desarrollado estrategias para sortear a la PKR. Por ejemplo, el VIH y el virus de la hepatitis C codifican para proteínas cuya función es unirse y activar la PKR (6,7). Los adenovirus codifican para pequeñas moléculas de ARN (VA RNA) que se unen a, pero que no activan la PKR (8). El virus de la gripe usurpa una proteína celular p58 (IPK) para inhibir la PKR, mientras que el virus de la polio inicia la degradación proteolítica de la PKR (9,10). El antígeno T grande de SV-40 parece funcionar en el sentido de 3' de eIF-2\alpha para potenciar la traducción de proteínas, incluso en presencia de la PKR activada (10).
PKR e inhibición tumoral
La expresión de mutantes catalíticos de PKR dominantes negativos en células NIH 3T3 conduce a su transformación en células cancerígenas y facilita su crecimiento como tumores en modelos de ratón desnudo (13,14). Se ha observado un fenómeno similar utilizando mutantes de PKR que han perdido la actividad de unión a ARNdc. La expresión inducida de PKR en S. cerevisiae conduce a la detención del crecimiento en la levadura (un fenómeno que puede revertirse mediante la coexpresión de una versión no fosforilable de eIF-2\alpha). Por tanto, PKR tiene actividad anti-proliferativa y funciona como un inhibidor tumoral.
Hay varias líneas de evidencia de que PKR está inactivada, ausente o reducida en su expresión en un amplio espectro de cánceres humanos:
\bullet
Las mutaciones de Ras oncogénicas se producen en aproximadamente el 30% de todos los tumores humanos, mientras que las mutaciones en los activadores de Ras en la dirección de 5'' (es decir, receptor de EGF, receptor de Neu, receptor de PDGF) son incluso más comunes. Mundschau y Faller (15,16) han descrito un inhibidor de PKR inducido por Ras oncogénico. Además, Strong et al (17) demostraron que la activación de la ruta de Ras da como resultado la regulación por disminución de la actividad de PKR.
\bullet
La proteína ribosómica L18 está sobreexpresada en tejidos de cáncer colorrectal primario y recientemente se ha demostrado que se une a e inactiva la PKR (18).
\bullet
Los pacientes con translocaciones de 5q muestran una expresión disminuida de PKR (19-21). El factor 1 regulador del interferón (IRF-1) es un factor de la transcripción con actividad de supresión de tumores, que se mapea en la región cromosómica humana 5q. La transcripción del gen de PKR está regulada en parte por IRF-1.
\bullet
La PKR humana mapea en 2p21-22 y recientemente se ha identificado como el sitio de translocación en un caso de leucemia mielógena aguda.
\bullet
En biopsias de tumores escasamente diferenciados y altamente malignos, la proteína PKR estaba presente a niveles muy bajos o fue indetectable (23-25).
STAT1
STAT1 es un mediador esencial de la ruta del interferón y su activación da como resultado una regulación por incremento del ARMm de PKR y de la proteína (véase la figura 1).
Hay una marcada deficiencia en el nivel / actividad de la proteína STAT1 en las líneas celulares de melanoma resistentes al interferón y en el material de biopsia de melanoma primario (26), en una variedad de líneas de células tumorales humanas incluyendo la leucemia mieloide, los carcinomas cervicales, el cáncer de ovario y un carcinoma de pulmón (27), y en un adenocarcinoma gástrico (28,29). Además, el linfoma cutáneo de células T (LCCT) es un cáncer que, en general, responde al interferón (sin embargo, con frecuencia se produce resistencia clínica en una parte sustancial de los casos). Sun et al (30) han informado de que la proteína STAT1 está ausente en una línea celular de LCCT, lo que sugiere que el desarrollo de resistencia clínica al interferón puede surgir debido a mutaciones de
STAT1.
PML: Gen de la leucemia promielocítica
PML es un gen inducido por el interferón que normalmente funciona como un inhibidor tumoral y un regulador clave de la apoptosis inducida por Fas, TNF\alpha e interferón. Recientemente, Chelbi-Alix et al han demostrado que otra función normal del producto génico de PML es inhibir la replicación de los virus. La proteína de fusión PML-RAR funciona como un inhibidor negativo dominante de la apoptosis inducida por el interferón y podría predecirse que también hará que las células APL sean preferentemente sensibles a la infección por virus.
La regulación por disminución de la actividad o la proteína PKR se produce en un amplio espectro de cánceres humanos. Aunque las células cancerígenas logran una ventaja de crecimiento y capacidad de traducción de la proteína sin control mediante la eliminación de la PKR o los mediadores de la PKR, estas células han eliminado simultáneamente uno de los mecanismos de defensa antivirales potentes y primarios de las células. Por tanto, las células tumorales con actividad PKR reducida serán más sensibles a la infección que sus homólogas normales. Tal como se indicó anteriormente, otros componentes (por ejemplo, STAT1 y PML) de la ruta del interferón están mutados frecuentemente en los cánceres humanos, y la pérdida de su actividad dará lugar a células tumorales sensibles a la infección por virus. Esta sensibilidad diferencial constituye la base del uso de agentes terapéuticos contra el cáncer basados en virus de la presente invención para el tratamiento del crecimiento de las células tumorales.
La selección de cepas de ratón sin PKR con varios virus diferentes indicó que los animales sin PKR pueden inhibir varias infecciones virales incluyendo la del virus vaccinia, el virus de la gripe y EMCV (virus de la encefalomiocarditis). Sin embargo, el virus de la estomatitis vesicular (VEV) mostró capacidad para infectar animales PKR -/-. Se observó que el VEV, un miembro de la familia de los rabdovirus, mataba el 100% de los animales sin PKR tras la infección intranasal por tan solo 50 partículas virales infecciosas (o unidades formadoras de placas, ufp). Por el contrario, se requirió un número más de 20.000 veces mayor de partículas de VEV para matar a la mitad de las camadas infectadas por el tipo natural.
El VEV es un virus ARN de sentido negativo, con envuelta, con un genoma simple de cinco genes. Ésta es una familia de virus muy bien caracterizada con varias cepas de laboratorio serológicamente distintas y una multitud de mutantes caracterizados. Los huéspedes naturales del VEV incluyen insectos, roedores y animales de granja domésticos. En general, muy pocos norteamericanos han entrado en contacto con el virus (la mayoría de las infecciones en seres humanos se producen en personal de laboratorio y granjeros). En los seres humanos, las infecciones o bien son asintomáticas o bien se manifiestan como "gripe" leve. No se han notificado casos de enfermedad grave ni muerte entre los seres humanos infectados.
También se observó la capacidad del VEV para infectar selectivamente células tumorales con respecto a las células de tipo natural. Las líneas de células tumorales, tras una infección durante la noche, mostraron una tasa de infección de 100 a 1.000 veces superior que la detectada en fibroblastos primarios normales. Además, se aceleró el efecto citopático (cpe) en los cultivos de células tumorales.
Dado que la PKR es un producto génico inducible por el interferón, se probó el pretratamiento de las células con interferón antes de la exposición a VEV para determinar el efecto de la infección viral. Los cultivos celulares de tipo natural, que estaban pretratados con interferón, fueron resistentes a la infección por VEV, mientras que las líneas celulares tumorales, por ejemplo, pero sin limitarse a, fibrosarcoma, melanoma, carcinoma de próstata, leucemia y sarcoma de ovario, fueron sensibles a la infección viral (véase la tabla 1, ejemplo 2; figura 2). Las células de carcinoma de pulmón (LC80) también fueron susceptibles a la infección por VEV en presencia o ausencia de interferón (datos no presentados). Sin embargo, varias líneas celulares tumorales fueron resistentes a la infección por VEV en presencia de interferón.
Las células de carcinoma de ovario, fibrosacroma, carcinoma de pulmón, melanoma, carcinoma de próstata, carcinoma de pulmón, y leucemia son sensibles al VEV, y esta sensibilidad se mantuvo en presencia del interferón, por lo que tales células tumorales y cánceres derivados de las mismas pueden ser particularmente fáciles de tratar mediante el tratamiento con VEV. Sin embargo, otros cánceres también pueden ser fáciles de tratar con el tratamiento viral tal como se describe en el presente documento. Estudios con respecto a la sensibilidad frente a VEV utilizando material tumoral primario están fácilmente disponibles en fluido de ascitis. Además, dado que el tumor está contenido dentro de la cavidad peritoneal, puede demostrar ser particularmente adecuado para la administración localizada de un agente terapéutico basado en un virus. A este respecto, puede probarse tejido vivo a partir del fluido ascítico del paciente para determinar la capacidad de las células tumorales para soportar la infección por VEV en presencia y ausencia de interferón.
Se espera que el VEV tendrá actividad terapéutica in vivo, y tendrá la capacidad de eliminar crecimientos tumorales distantes (metastáticos). Hasta la fecha no se ha observado ninguna patología orgánica significativa en ratones tratados, sin embargo, es necesario estudiar adicionalmente la cinética de la viremia del VEV. Se implantaron células de melanoma humano que recibieron VEV, o células de melanoma adicionales infectadas in vitro con VEV, en ratones desnudos (véase el ejemplo 5), para garantizar la producción continua de partículas infectivas en el tumor durante un periodo de varias horas, mediante inyección (figura 5). En animales a los que se inyectó una simulación (VEV(-); inyección con vehículo solo), los tumores crecieron continuamente durante el transcurso del experimento. Los animales que recibieron sólo el virus puro mostraron inicialmente un crecimiento continuo de los tumores durante el primer periodo de cuatro días, tras este tiempo los tumores comenzaron a reducirse en tamaño y continuaron así durante el transcurso de este experimento. Los tumores que se inyectaron con células infectadas dejaron de crecer y experimentaron una regresión hasta pequeños nódulos duros que parecían tejido cicatrizal. En algunos de los tumores inyectados más grandes, se formaron úlceras en el tumor en el plazo de 1 - 2 días (véase la figura 6). Mientras que tanto la inyección de virus purificado como de células de melanoma infectadas produjeron regresiones significativas, las células productoras infectadas fueron más eficaces.
Los estudios con un modelo tumoral de ratón inmunocompetente (es decir, tal como se describe por Strong et al; 17) examinarán los efectos de la respuesta de anticuerpos a la infección terapéutica por VEV y determinarán si la infección por VEV de las células tumorales aumenta su inmunogenicidad y potencia el reconocimiento de antígenos tumorales por el organismo huésped.
También se encontró que la médula ósea humana primaria era resistente a la infección por VEV en ausencia de pretratamiento con interferón (véase la tabla 1, ejemplo 2), lo que indica que estas células tienen una resistencia innata a la infección por VEV. Por el contrario, también se probaron dos líneas celulares de leucemia (M07E y L1210) y se encontró que eran sensibles a infección por VEV tal como se puso de evidencia por el efecto citopático, el crecimiento del virus y la pérdida de viabilidad celular.
Aunque los resultados descritos en el presente documento se refieren a VEV, debe entenderse que un experto en la técnica, siguiendo los métodos explicados en este documento, podrá seleccionar fácilmente otras cepas de VEV, derivados de VEV que incluyen mutantes de VEV, o virus relacionados por su capacidad para eliminar selectivamente células tumorales. Hay otras diversas cepas de VEV serológica y biológicamente distintas, que pueden probarse para determinar esta propiedad. Tales cepas de VEV incluyen, pero no se limitan a New Jersey, Piry, Coccal, y Chandipura. La identificación de otras cepas adecuadas no relacionadas serológicamente puede ser útil si se requieren inyecciones secuenciales de VEV para erradicar completamente los tumores. Además, pueden utilizarse combinaciones de virus para potenciar el efecto citopático observado con VEV.
Con el fin de determinar si la presencia de una célula normal o tumoral podría afectar al otro tipo celular (célula normal y tumoral) y modificar la resistencia o susceptibilidad de cualquiera de estas células a la infección por VEV, se co-cultivaron células normales y fibroblastos en presencia de VEV. El cultivo se infectó a una MOI de 0,1 ufp/célula y se dejó que la infección avanzara en presencia y ausencia de interferón. A las 0, 12 y 24 horas (figura 4), los cultivos se fijaron y se tiñeron con anticuerpos frente al antígeno T grande (núcleos rojos) para detectar las células 293T y con DAPI (núcleos azules) que tiñen todos los tipos de células (figura 4). El número de células 293T (núcleos rojos) disminuyó a ritmo constante durante el transcurso de tiempo y mostró núcleos gravemente condensados o fragmentos característicos de una célula que muere a partir de apoptosis inducida viralmente. Esta destrucción selectiva de las células transformadas se observó tanto en presencia como en ausencia de interferón. Los fibroblastos normales no desarrollaron cambios nucleares ni sus números se redujeron en respuesta a la infección por VEV, aun cuando las células 293T estaban produciendo cantidades abundantes de virus dentro del co-cultivo. Esto indica que las mezclas de poblaciones celulares pueden tratarse con VEV mientras que todavía mantienen la sensibilidad de la célula tumoral y la resistencia de la célula normal al VEV.
Además, hay varios mutantes del VEV, por ejemplo, pero sin limitarse a mutantes que afectan a la paralización de la síntesis de proteínas del huésped o son más o menos sensibles al interferón, que pueden mostrar infección diferencial entre las células normales y tumorales. Por ejemplo, lo que no pretende ser limitante en modo alguno, se han descrito otros mutantes virales que se sabe que muestran tropismo para células negativas para STAT1 o PKR que incluyen una cepa del virus de la gripe que no puede inactivar PKR (36). Se sabe que los mutantes de adenovirus que carecen de PKR que inactiva al gen Va crecen mejor en ausencia de PKR.
Tal como se describe en el presente documento, se aislaron mutantes de VEV que crecían escasamente en células que responden al interferón. Estos mutantes se seleccionaron basándose en su capacidad para formar pequeñas placas en monocapas de células que responden al interferón. En células que no responden al interferón (es decir, células tumorales), estos mutantes forman grandes placas. La selección de mutantes por el tamaño de la placa en células que responden al interferón permite el aislamiento de virus que crecen escasamente en células normales. Sin embargo, pueden obtenerse otros mutantes de VEV según diferentes criterios de selección. Los mutantes aislados utilizando células que responden al interferón se amplificaron y se probó su capacidad para eliminar células tumorales y normales. El motivo aquí es que los mutantes de VEV, que pueden inducir interferón en células diana, limitarían su propia replicación en una población de células que responden al interferón. Sin embargo, estos mismos virus tendrían un crecimiento ilimitado en células tumorales que carecen de capacidad de respuesta al interferón. Estos mutantes son valiosos, ya que tienen incluso menos efecto citopático en tejidos normales, mientras mantienen la actividad oncolítica, que el VEV de tipo natural.
Se obtuvieron cuatro mutantes (Mut 1-4) basándose en su capacidad para formar placas en monocapas de células que responden al interferón. Estos mutantes y el virus de tipo natural (MOI de 1,0 ufp/célula) se utilizaron para infectar células de melanoma y fibroblastos de prepucio humano normal. Todos los mutantes pudieron eliminar células tumorales de manera eficaz, pero las células normales infectadas con los mutantes incluso después de largos periodos de infección, aparecieron carentes completamente de infección. A esta misma MOI, el VEV de tipo natural demostró un efecto citopático sobre las células normales. Estos resultados indican que los virus mutantes tienen un mayor efecto terapéutico porque eliminan las células tumorales de manera eficaz mientras que evitan a las células normales, y también tienen la capacidad de producir más partículas virales y aumentar la diseminación de los virus por todo el tumor (véase el ejemplo 4). Sorprendentemente, estos mutantes crecen más rápidamente que el VEV de tipo natural (Indiana) en células de carcinoma de colon HCT 116, pero no en las células OSF7 (véase el ejemplo 21 y las figuras 10A y 10B). Se prefieren los mutantes de VEV que muestran un rápido crecimiento en la célula tumoral de interés, pero no en las células normales.
Los experimentos iniciales indicaron que los ratones PKR -/- morían con el VEV a través de varias vías de infección, sin embargo, estos ratones no resultaban afectados por las inyecciones intravenosas del virus. Con el fin de determinar si los componentes plasmáticos estaban inactivando el virus con el contacto, se incubó VEV producido a partir de varias fuentes, incluyendo dentro de las células L de ratón, con suero humano (procedente de un donante no infectado normal) y se determinó el título del virus tras la incubación (ejemplo 6). El título viral de VEV producido en células L disminuyó cuatrocientas veces, mientras que el VEV producido en células de melanoma humano no resultó afectado por la incubación en plasma. Estos resultados indican que la elección de la línea celular para la producción del VEV es crítica. Basándose en esta observación es posible seleccionar líneas celulares humanas para aquellas que producen cantidades óptimas de virus que no son sensibles al suero humano.
Sin desear adherirse a ninguna teoría, puede ser que la diferencia en estas dos preparaciones de virus refleje la naturaleza de la cohorte de proteínas encontrada en la superficie de las células que producen virus. Como parte de su ciclo de replicación, el VEV se "injerta" a través de la membrana plasmática y adquiere proteínas celulares en su envuelta. Ciertas proteínas encontradas en las células L cuando se expresan en el contexto de la partícula viral podrían activarse completamente. De hecho, se ha demostrado inicialmente que las partículas de retrovirus producidas en ciertas células de ratón se inactivan por el suero, mientras que el mismo virus producido en un subconjunto de líneas celulares humanas no resultó afectado por el plasma. (Pensiero, M. N., et al. Hum Gene Ther, 1996. 7: 1095-1101).
El VEV puede modificarse genéticamente con el fin de modificar sus propiedades para su uso in vivo. Los métodos para la modificación genética de VEV están bien establecidos dentro de la técnica. Por ejemplo, se ha establecido un sistema genético inverso para VEV (Roberts A. y J. K. Rose, Virology, 1998. 247:1-6) que posibilita modificar las propiedades genéticas del virus. Además, pueden utilizarse las técnicas habituales bien conocidas por un experto en la técnica para modificar genéticamente el VEV e introducir los genes deseados dentro del genoma de VEV para producir VEV recombinantes (por ejemplo, Sambrook et al., 1989, A Laboratory Manual. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press).
VEV puede dirigirse a un sitio deseado in vivo para aumentar la eficacia viral. Por ejemplo, puede utilizarse la modificación de la proteína G del VEV para producir fusiones que se dirijan a sitios específicos para potenciar la eficacia del VEV in vivo. Sin embargo, debe entenderse que también pueden modificarse otras dianas de proteína además de la proteína G de VEV para producir tales proteínas de fusión. Tales proteínas de fusión pueden comprender, por ejemplo, pero sin limitarse a, fragmentos Fv de cadena sencilla (Lorimer, I. A., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 1996. 93:14815-20) que tienen especificidad para antígenos tumorales. Un ejemplo de un fragmento Fv de cadena sencilla de este tipo que puede usarse para preparar una proteína G de fusión de VEV, es un fragmento Fv que tiene como diana un receptor de EGF mutante encontrado en aproximadamente el 80% de las células tumorales de cáncer de mama humano.
VEV también puede modificarse para que exprese uno más genes suicidas capaces de metabolizar un profármaco en un metabolito tóxico permitiendo así que las células infectadas por VEV se eliminen mediante la administración de un profármaco. Por ejemplo, el VEV que comprende el gen de citosina desaminasa o el gen de la timidina cinasa del virus herpes, codifica para una enzima que puede convertir ganciclovir o 5-FC, respectivamente, en un compuesto tóxico. Sin embargo, debe entenderse que también pueden emplearse otros genes suicidas. Dado que está bien establecido que los metabolitos de ganciclovir eliminan no sólo las células que expresan TK de VHS, sino también las células de las proximidades inmediatas, el VEVr que comprende estos genes suicidas muestra varias ventajas. Por ejemplo, se aumenta la eliminación eficaz por parte del virus, puesto que una célula infectada elimina a diez o más células tumorales circundantes, además el VEVr que comprende un gen suicida permite la eliminación del virus si se desea de un individuo infectado con el virus. Esto puede ser importante en situaciones en las que no está claro cómo el VEV puede afectar a un individuo. Por ejemplo, un individuo inmunocomprometido puede ser inesperadamente sensible al VEV. Por tanto, la adición de un gen suicida sería una mejora importante para la seguridad del agente terapéutico viral.
El VEV también puede modificarse mediante la introducción de un producto génico de mamífero. Tal producto génico de mamífero limitaría el crecimiento de VEV en las células normales, pero no el crecimiento de VEV en las células tumorales o enfermas. Por ejemplo, el VEVr que puede expresar uno o más transactivadores de p53, activa rutas apoptóticas en las células normales, pero no en las células tumorales. Por tanto, tales VEVr limitan selectivamente la diseminación del virus en los tejidos normales. Sin embargo, debe entenderse que también pueden expresarse otros productos génicos de mamífero dentro de VEV para este fin. Otro ejemplo, que no debe considerarse como limitante en modo alguno, es el gen de PKR. Un VEVr que expresa el gen de PKR limita la replicación del virus en todas las células normales; sin embargo, en las células que expresan inhibidores de PKR, se inactiva la PKR codificada viralmente. Un ejemplo de una célula que expresa uno o más inhibidores de la PKR es una célula infectada de manera crónica por la hepatitis C. Dado que la hepatitis C codifica para y expresa dos inhibidores conocidos de la PKR (es decir, NS5A y E2), un producto génico de PKR codificado por VEV se neutraliza y se permite que VEV se replique libremente.
La descripción anterior no pretende limitar la invención reivindicada en modo alguno; además, la combinación tratada de características podría no ser absolutamente necesaria para la solución inventiva.
La presente invención se ilustrará adicionalmente en los ejemplos siguientes. Sin embargo, debe entenderse que estos ejemplos son únicamente para fines ilustrativos y no deben utilizarse para limitar el alcance de la presente invención en modo alguno.
\newpage
Ejemplo 1
Las células negativas para PKR son sensibles a la infección por VEV Experimentos in vivo
Los estudios iniciales se refieren a la identificación de virus que pueden infectar animales y células PKR-/-. Utilizando estrategias de recombinación homólogas, se generaron cepas de ratón sin PKR (35) y se probaron para determinar su capacidad para luchar contra infecciones virales. Dado que estos ratones son PKR-/-, deben ser sensibles a la infección por virus. Se administraron varias especies de virus a animales sin PKR en un intervalo de concentraciones.
Infección de ratones sin PKR
Se generó una línea de ratón sin PKR utilizando la tecnología de deficiencia convencional (Abraham, N., et al., J Biol Chem, 1999. 274:5953-5962). Se infectaron grupos de cinco ratones hembra, de 3 meses de edad o mayores, por vía intranasal con diversas cantidades de virus de la estomatitis vesicular (cepa Indiana). Se infectaron en paralelo animales de tipo natural de edad correspondiente y ambos conjuntos de animales se monitorizaron diariamente para determinar signos de infección. Estos incluyen hidratación, piloerección, nivel de actividad, apetito, parálisis de las patas traseras, frecuencia respiratoria, peso corporal y cualquier otro síntoma que indicara que el animal tenía molestias.
Los animales de tipo natural mostraron menos síntomas, y sólo transitorios, en multiplicidades de infección de hasta 10^{5} ufp con VEV. Por el contrario, los animales sin PKR desarrollaron muy rápidamente deshidratación, piloerección, pérdida de apetito, frecuencia respiratoria rápida, disminución de la actividad y ojos estrábicos irritados. A dosis altas de infección por VEV (10^{5} ufp), los animales mostraron síntomas en menos de 24 horas y normalmente sucumbieron a la infección en el plazo de 48 horas. A dosis de infección de tan solo 25 ufp, el 100 por cien de los animales sin PKR murieron por la infección de VEV en el plazo de 5 días. En experimentos separados, se sacrificaron grupos de cinco animales de tipo natural y sin PKR a las 48 horas tras la infección con VEV y se extirparon los órganos para evaluar los títulos virales. En los animales con PKR, se encontraron títulos de más de un millón de UFP/ml de homogeneizado de pulmón en este tiempo, mientras que en los animales de tipo natural, los títulos virales oscilaron desde 0 hasta 100 ufp por ml de homogeneizado de pulmón. En los animales de tipo natural y sin PKR, se encontraron cantidades similares de virus en el cerebro. El resto de los tejidos de ambas cepas de ratón tenían virus indetectables en este tiempo tras la infección.
El virus de la estomatitis vesicular, un miembro de la familia de rabdovirus, pudo matar al 100% de los animales sin PKR tras la infección intranasal mediante tan solo 50 partículas virales infecciosas (o unidades formadoras de placa, ufp). Por el contrario, se requirió un número más de 20.000 veces mayor de partículas de VEV para matar a la mitad de las camadas normales infectadas. Estos resultados indican que los animales sin PKR pueden inhibir varias infecciones por virus, incluyendo la del virus vaccinia, de la gripe y EMCV. Sin embargo, el VEV mostró capacidad para infectar animales PKR-/-. Estos resultados también indican que las células de mamífero requieren la PKR para resistir las infecciones por el VEV (cepa de laboratorio Indiana).
Ejemplo 2
Eliminación selectiva de células tumorales con VEV Experimentos in vitro
Se escogieron aleatoriamente varias líneas de células tumorales del Ottawa Regional Cáncer Center (Centro de Cáncer Regional de Ottawa) y se probaron para determinar su susceptibilidad a la infección por VEV. Como células control se utilizaron cultivos de fibroblastos primarios procedentes de voluntarios adultos sanos o muestras de médula ósea primarias de donantes sanos.
Infección de células tumorales por VEV
Como primera prueba de las propiedades oncolíticas del VEV, se evaluó la producción de virus y el efecto citopático tras una incubación durante la noche con VEV. Se incubaron monocapas de células con la cepa Indiana de VEV a una multiplicidad de infección (MOI) de 0,1 unidades formadoras de placa (ufp). Tras permitir que el virus se adsorbiera durante 30 minutos a 37ºC, se enjuagaron los cultivos meticulosamente con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y después se cultivaron durante 18 horas adicionales a 37ºC. En ese momento, se examinaron los cultivos microscópicamente para determinar el efecto citopático (cpe) y se fotografiaron. Se eliminó el sobrenadante tras las 18 horas y se determinaron los títulos de virus por ml de medio. En algunos experimentos, los cultivos se preicunbaron durante 12 horas con interferón alfa humano (100 unidades/ml) antes de la infección.
Para examinar la cinética de la infección de los tipos celulares variados, se utilizó un ensayo modificado de cpe (Heise, C., et al., Nat Med, 1997. 3:639-645). Esencialmente, las monocapas de células se infectaron a una MOI de 0,1 ufp en una placa de 12 pocillos. A tiempo 0 y cada 12 horas posteriormente hasta las 48 horas, se fijó un pocillo de células infectadas con 0,5 ml de fijación Leukostat (Fisher Diagnostics) durante 2 minutos. Al final del experimento, se tiñeron las monocapas con tinciones de Leukostat 1 y 2 siguiendo las instrucciones del fabricante. Dado que PKR es un producto génico inducible por el interferón, se probó el pretratamiento con interferón, 100 unidades/ml de interferón alfa humano 12 horas antes de la infección, para determinar si el interferón podría potenciar la protección dentro de cultivos celulares variados. Los datos se presentan en la tabla 1 y en las figuras 2 - 3.
TABLA 1 Líneas celulares probadas para determinar la sensibilidad a VEV
Línea Tipo celular Referencia Rendimiento con Rendimiento con
celular virus no tratado virus tratado
durante la noche durante la noche
con interferón
OSF 16 fibroblastoma humano normal ORCC^{1} 1 X 10^{5} ufp 0 ufp
AG1522 fibroblastoma de prepucio humano [20] 0 ufp
OSF 7 fibroblastoma humano normal ORCC 1 X 10^{6} 0 ufp
OSF12 fibroblastoma humano normal ORCC 2 X 10^{5} ufp 0 ufp
MN11 fibrosarcoma de ratón [21] 1 X 10^{8} 1 X 10^{4}
A2780 carcinoma de ovario humano [22] 2 X 10^{8} 1 X 10^{7}
H-1078 médula ósea humana normal ORCC 0 ufp (MOI 10 ufp) No determinado
M07E línea celular leucémica humana [23] 2 X 10^{6} (MOI 1,0 ufp) No determinado
L1210 línea celular leucémica de ratón [24] 4 X 10^{6} 2 X 10^{4}
SK-MEL3 melanoma humano [25] No determinado: No determinado:
ensayo cpe positivo ensayo cpe positivo
LNCAP carcinoma de próstata humano [26] No determinado: No determinado:
ensayo cpe positivo ensayo cpe positivo
293T fibrosarcoma transformado [27] 1 X 10^{8} 8 X 10^{7}
con T grande de SV-40 y
E1A de adenovirus.
OVCA 432 [28] 1 X 10^{7} 0 ufp
C13 carcinoma de ovario [29] 1 X 10^{8} 1 X 10^{5}
OVCA 3 [30] 5 X 10^{7} No determinado
COS línea celular de riñón de [31] 2 X 10^{8} No determinado
simio transformada con T grande
HCT 116 carcinoma de colon [32] No determinado: No determinado:
ensayo cpe positivo ensayo cpe positivo
OVCA 420 [28] 1 X 10^{8} 3 X 10^{6}
1 establecido en el ORCC (Ottawa Regional Cáncer Center) a partir de biopsia de antebrazo.
A partir de los datos de la tabla 1 puede observarse que, aunque los fibroblastos humanos normales pueden soportar la replicación viral, la cantidad de virus producidos y la progresión a la lisis celular se retrasó sustancialmente cuando se comparaba con las células tumorales. Se observó una diferencia incluso más sustancial en la producción de virus tras el pretratamiento con interferón. Aunque las monocapas de fibroblastos humanos normales se protegieron completamente del efecto citolítico del VEV mediante el interferón, las células tumorales permanecieron sensibles, produciendo abundantes cantidades de partículas virales y experimentando rápidamente citolisis.
También se encontró que otras líneas celulares, incluyendo una línea celular de carcinoma de pulmón (LC80) y una línea celular de leucemia, las células de AML5 (leucemia mielógena aguda 5), se eliminaban eficazmente mediante el VEV. En el caso de AML5, a una MOI de 1,0 ufp/ml, las células se eliminaron completamente en el plazo de 24 horas, mientras que a 0,0001 ufp/ml, las células se eliminaron en el plazo de 72 horas, indicando adicionalmente la sensibilidad de las células de leucemia al VEV.
Tal como se observa en la figura 2, las monocapas de células tumorales se destruyeron mucho más rápidamente mediante la infección por VEV en comparación con los fibroblastos humanos normales. La línea celular de melanoma humano SK-MEL3, la línea celular de cáncer de próstata LNCaP y las células de carcinoma de ovario A2780, mostraron todas cep sustancial tan solo a las 12 horas tras la infección. Aunque los cultivos de fibroblastos humanos normales se infectaron y pudieron producir virus (véase la tabla 1), la cinética de la infección fue sustancialmente más lenta que en las tres líneas celulares tumorales probadas en este experimento. Además, al igual que con el ensayo de crecimiento del virus durante la noche (tabla 1, figura 2), el tratamiento con interferón alfa protegió completamente a los fibroblastos humanos normales, pero fue ineficaz en la protección de tres líneas celulares tumorales del efecto citopático del VEV.
Los resultados obtenidos para la tabla 1 demuestran que puede emplearse una estrategia de selección para determinar los tipos de tumores que son susceptibles de eliminarse por el VEV utilizando, por ejemplo, pero sin limitarse a, el panel convencional de NIH (National Institutes of Health, Instituto Nacional de Salud) / NCI (National Cáncer Institute, Instituto Nacional contra el Cáncer) de líneas celulares de tumor disponibles de la ATCC (American Type Culture Collection, Colección Americana de Cultivos Tipo). Estas líneas celulares se seleccionan con el fin de determinar el tiempo para completar el cpe y/o el crecimiento del virus utilizando varias multiplicidades iniciales de infección. Estos experimentos se realizan en presencia y ausencia de interferón, de modo que se determine el número de y los tipos de tumores que son sensibles a VEV y son resistentes a la actividad antiviral del interferón.
Tratamiento de la leucemia con VEV
El VEV no infecta productivamente a las células madre de la médula ósea, incluso con una alta MOI de 10 ufp/célula (H-1078, tabla 1). Los cultivos tratados mantenían todas las características de sus células madre. Se eliminaron dos líneas celulares de leucemia (MO7E y L1210; tabla 1) tras una infección durante la noche y se produjeron grandes cantidades del virus.
Para determinar si el VEV podría eliminar células de leucemia primaria de un paciente con cáncer, se obtuvo una muestra de sangre periférica de un paciente con LMA (leucemia mielocítica aguda) y se recogieron los glóbulos blancos y se sembraron en placa en medio RMPI más 10% de FBS (suero bovino fetal) (10^{7}/pocillo en placas de 6 pocillos, cada infección por duplicado). Las células se infectaron con simulación o se infectaron a una MOI de 10,0/célula. El VEV eliminó selectivamente las células leucémicas mieloides, tal como se indica por la disminución en el porcentaje de blastocitos (blastocitos leucémicos), mientras que el número global de células resultó mínimamente afectado (es decir, neutrófilos desarrollados). La muestra leucémica produjo títulos de VEV que superaban 10^{7} ufp/ml a las 16 horas tras la infección. El número de blastocitos en la muestra se redujo espectacularmente a las 21 horas tras la infección, mientras que aumentó la proporción de neutrófilos normales. Las células infectadas con simulación (-VEV) contenían casi un 70% de blastocitos en una monocapa, mientras que en las células infectadas con VEV (+VEV), predominaban las células normales. Estos resultados demuestran que VEV puede eliminar preferentemente blastocitos leucémicos primarios, mientras que evita a las células sanguíneas normales.
Ejemplo 3
Eliminación de células tumorales en cultivos mixtos
Se co-cultivaron fibroblastos humanos normales y células tumorales 293T en una mezcla 50:50. Dado que las células 293T expresan el antígeno T grande que no se encuentra en las células normales, los dos tipos de células pueden diferenciarse por inmunofluorescencia.
En este experimento, se infectaron cultivos a una MOI de 0,1 ufp/célula y se permitió que la infección continuara en presencia o ausencia de interferón. A las 0, 18 y 24 horas (figura 4), se fijaron los cultivos y se tiñeron con anticuerpos frente al antígeno T grande (núcleos rojos) para detectar las células 293T y con DAPI (núcleos azules) que tiñe todos los tipos de células (figura 4). Inicialmente, ambos tipos de células mostraron una morfología similar a un huso con grandes núcleos ovales. Tras 18 horas, el número de células 293T (núcleos rojos) se redujo y muchas de las células 293T restantes mostraron una morfología nuclear alterada. Hacia las 24 horas tras la infección, se detectaron muy pocas células 293T y las pocas que quedaban mostraron núcleos gravemente condensados o fragmentados característicos de una célula que está muriendo por apoptosis inducida viralmente.
Esta destrucción selectiva de las células transformadas se ha observado tanto en presencia como en ausencia de interferón. Los fibroblastos normales no desarrollaron cambios nucleares ni su número se redujo en respuesta a la infección por VEV, aun cuando las células 293T estaban produciendo abundantes cantidades de virus dentro del co-cultivo.
\newpage
Ejemplo 4
Mutantes de VEV como agentes oncolíticos
Se aislaron mutantes de VEV basándose en su capacidad para formar placas pequeñas en monocapas de células que responden a interferón, en comparación con el tamaño de las placas en monocapas de células que no responden al interferón. Se recogieron aislados virales, que forman placas pequeñas en las células que responden al interferón, se amplificaron y se volvieron a clonar. Los mutantes aislados de esta forma se amplificaron y se probaron para determinar su capacidad para eliminar células tumorales y normales. El fundamento aquí es que los mutantes de VEV, que pueden inducir interferón en las células diana, limitarían su propia replicación en una población de células que responden al interferón. Sin embargo, estos mismos virus tendrían un crecimiento ilimitado en las células tumorales que carecen de capacidad de respuesta al interferón. Estos mutantes serían valiosos, ya que deben tener incluso menos efecto citopático sobre tejidos normales mientras que mantienen su actividad oncolítica.
Se obtuvieron cuatro mutantes (Mut 1-4) basándose en su capacidad para formar placas pequeñas en monocapas de células que responden al interferón. Dr. Lauren Poliquin (Universidad de Quebec en Montreal) identificó inicialmente estos mutantes y los facilitó. Tras cinco rondas de purificación de las placas, estos mutantes y el virus de tipo natural (MOI de 1,0 ufp/célula) se utilizaron para infectar células de melanoma y fibroblastos de prepucio humano normales y se determinaron los títulos de los virus liberados 12 y 24 horas tras la infección.
Todos los mutantes pudieron eliminar células tumorales eficazmente, pero las células normales infectadas con los mutantes incluso tras largos puntos de tiempo aparecieron completamente sin infectar. A esta misma MOI, el VEV de tipo natural demostró un efecto citopático sobre las células normales. También se observó que todos los mutantes de VEV producían aproximadamente diez veces más virus que el VEV de tipo natural tras una infección durante la noche de células de melanoma. En las células normales, aunque los Mutantes 1-4 tenían significativamente menos efecto citopático que el VEV de tipo natural, se produjeron cantidades similares de virus procedentes de los cultivos infectados. Estos resultados indican que los virus mutantes tienen un mayor efecto terapéutico ya que eliminan las células tumorales eficazmente mientras que evitan a las células normales, y que también tienen la capacidad para producir más partículas de virus y de aumentar la diseminación del virus por todo el tumor.
Ejemplo 5
Infección de ratones desnudos que llevan xenoinjertos de tumores humanos
Se implantaron células de melanoma humano en ratones desnudos y se dividieron en grupos. Un grupo recibió una inyección de simulación (VEV(-)), y al otro se inyectó VEV de tipo natural o se inyectaron células de melanoma adicionales infectadas in vitro con VEV durante una hora antes de la inyección en el sitio del tumor con el fin de administrar células que producirían continuamente partículas infectivas al tumor durante un periodo de varias horas (VEV(+)). Los resultados de estos experimentos se observan en la figura 5 que muestra el promedio del área del tumor con el tiempo en los animales tratados y en los inyectados con simulación.
En el caso de los animales inyectados con simulación (VEV(-); inyección con vehículo solo), los tumores crecieron continuamente durante el transcurso del experimento. Los animales que sólo recibieron virus puros mostraron inicialmente un crecimiento continuo de los tumores, aunque en el día 4 tras la infección los tumores comenzaron a reducirse y continuaron haciéndolo durante el transcurso de este experimento. Los tumores que se inyectaron con células infectadas demostraron las regresiones más espectaculares. Esencialmente la mayor parte de los tumores detuvieron su crecimiento y experimentaron un retroceso a pequeños nódulos duros que parecían tejido cicatrizal.
En algunos de los tumores inyectados más grandes se formaron úlceras en el tumor en el plazo de 1 - 2 días (véase la figura 6), seguido por la reducción continua del cáncer que crece rápidamente una vez. Aunque tanto la inyección del virus purificado como de las células de melanoma infectadas produjo regresiones significativas, las células productoras infectadas fueron más eficaces.
Ejemplo 6
La elección de la línea celular para producir VEV afecta a la sensibilidad del virus con respecto al plasma
Los experimentos anteriores indicaron que los ratones PKR -/- morían con VEV a través de varias vías de infección; sin embargo, estos ratones no resultaban afectados por inyecciones intravenosas del virus. Sin desear adherirse a ninguna teoría, esto podría deberse a que las células endoteliales vasculares PKR -/- proporcionan una barrera a la infección tisular o a que los componentes del plasma estaban inactivando el virus con el contacto. Para probar esta última idea, se incubó VEV producido a partir de varias fuentes, incluyendo dentro de las células L de ratón, con suero humano (procedente de donantes no infectados humanos) y se determinó el título del virus tras la incubación.
Tras la incubación de VEV en suero humano, el título viral de VEV producido en células L disminuyó cuatrocientas veces. Por otra parte, el VEV producido en las células de melanoma humano no resultó afectado por la incubación en plasma.
Estos resultados indican que la elección de la línea celular para la producción de VEV es crítica. Basándose en esta observación es posible seleccionar líneas celulares humanas para encontrar las que producen cantidades óptimas de virus que no es sensible al suero humano.
Ejemplo 7
Uso de VEV para tratar infecciones crónicas
Algunos trastornos en seres humanos surgen como resultado de infecciones virales crónicas, incluyendo la infección por herpes latente, hepatitis, SIDA y cáncer cervical. En cada uno de estos casos, el agente viral causante ha desarrollado mecanismos para inactivar los componentes de la ruta de respuesta del interferón incluyendo la PKR (por ejemplo, Chelbi-Alix, M. K. y H. de The, Oncogene, 1999. 18:935-941; Gale, M. J., Jr., et al., Virology, 1997. 230:217-227; Gale, M. J., et al., Clin Diagn Virol, 1998. 10:157-162; Gale, M., Jr. y M. G. Katze, Methods, 1997. 11:383-401; Barnard, P. y N. A. McMillan, Virology, 1999. 259: 305-313). Por tanto, la administración de VEV, o de mutantes de VEV que inducen el interferón, o una combinación de los mismos, a individuos que padecen estos trastornos, elimina selectivamente las células infectadas de manera crónica. Podría encontrarse eficacia terapéutica adicional mediante la selección como diana a través de receptores de células o virus únicamente de las células infectadas de manera crónica.
Ejemplo 8
Modificación genética de VEV
Se ha establecido un sistema genético inverso para VEV (Roberts A. y J. K. Rose, Virology, 1998. 247:1-6) lo que hace posible modificar las propiedades genéticas de los virus.
Selección como diana de VEV hacia sitios deseados in vivo
En la actualidad, el VEV puede unirse a la mayor parte de los tipos celulares de mamífero aunque puede limitarse su replicación una vez dentro de la célula (es decir, mediante productos génicos que responden al interferón, incluyendo la PKR). Por tanto, la dosis eficaz del virus que puede unirse realmente a las células diana (es decir, a las células tumorales) para la infección productiva puede limitarse enormemente sólo mediante la "reducción" que proporcionan otros tejidos normales. Por tanto, VEV puede modificarse genéticamente con el fin de unirse e infectar sólo células tumorales.
Se utilizan técnicas de ADN recombinante bien conocidas en la técnica (por ejemplo, Sambrook et al., 1989, A Laboratory Manual. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press) para modificar la proteína G de VEV. Los fragmentos Fv de cadena sencilla (Lorimer, I. A., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 1996. 93:14815-20) que tienen especificidad por los antígenos tumorales se fusionan con la proteína G de VEV. Un ejemplo de tal fragmento Fv de cadena sencilla es uno que selecciona como diana al receptor de EGF mutante que se encuentra en aproximadamente el 80% de las células de cáncer de mama humano.
Expresión de genes suicidas dentro de VEV
El genoma de VEV se modifica de modo que comprende el gen de la citosina desaminasa o el gen de la timidina cinasa del virus herpes. Ambos genes codifican para enzimas que pueden convertir profármacos en compuestos tóxicos (por ejemplo, ganciclovir o 5-FC). Los virus modificadas de este modo expresan estos genes suicidas, permitiendo así que se eliminen células infectadas por VEV mediante la administración del profármaco. Esto proporciona dos ventajas puesto que (1) está bien establecido que los metabolitos del ganciclovir eliminan no sólo las células que expresan TK de VHS, sino también las células de las proximidades inmediatas. Este "efecto espectador" ("by-stander effect") puede aumentar la eliminación eficaz por parte del virus (es decir, una célula infectada podría dar como resultado la muerte de diez o más células tumorales circundantes); y (2) tener un VEV con un gen suicida podría permitir la eliminación del virus si se desea de un individuo infectado con el virus.
Control del crecimiento de VEV in vivo
Se introduce un producto génico de mamífero dentro de VEV para limitar el crecimiento de VEV en las células normales pero este producto génico no afecta al crecimiento de VEV en las células tumorales o enfermas.
Los VEV recombinantes (VEVr) que comprenden uno o más transactivadores de p53, activan las rutas apoptóticas en células normales pero no en células tumorales. Tales VEVr limitan la diseminación del virus en tejidos normales pero permiten el crecimiento de los virus en las células tumorales.
El VEVr que comprende el gen de PKR limita la replicación del virus en todas las células normales; sin embargo, en las células que expresan inhibidores de la PKR, la PKR codificada viralmente está inactivada. Un ejemplo de una célula que expresa uno o más inhibidores de la PKR es una célula infectada por hepatitis C de manera crónica. Dado que la hepatitis C codifica y expresa dos inhibidores conocidos de PKR (es decir, NS5A y E2), un producto génico de PKR codificado por VEV se neutraliza y se permite que VEV se replique libremente.
Ejemplo 9
Pérdida progresiva de capacidad de respuesta al interferón con la transformación oncogénica
Se infectaron fibroblastos murinos en varias fases de la transformación, o bien pretratados con 100 unidades de interferón alfa o sin tratar, con VEV WT Indiana a una MOI de 0,1 ufp/célula. La producción viral se midió 18 horas p.i. (tras la infección) mediante un ensayo en placa habitual. MEF: cultivos primarios de fibroblasto de ratón aislados de embriones de ratón Balb/C. Células NIH 3T3: fibroblastos embrionarios de ratón inmortalizados. PVSrc: Células NIH 3T3 transformadas con el gen src viral. MOP 8: Células NIH 3T3 transformadas con el antígeno T grande del virus del polioma. Los resultados se muestran en la tabla 2.
En este ejemplo, la pérdida de la capacidad de respuesta al interferón guarda relación con la sensibilidad a la infección por VEV y a la progresión del fenotipo maligno. Las células MEF son mortales (es decir, tienen una vida limitada en cultivo) y pueden responder completamente al interferón. Las células NIH 3T3, aunque no son tumorigénicas, están inmortalizadas y tienen aproximadamente diez mil veces más capacidad de respuesta al interferón que MEF. Las células PVSrc y MOP 8 son completamente tumorigénicas, soportan la replicación vigorosa de VEV y están mínimamente protegidas por el tratamiento con interferón.
TABLA 2
Línea celular Título viral (ufp/ml)
No tratadas IFN-\alpha
MEF (fibroblasto embrionario de ratón) 4 x 10^{6} < 10
NIH3T3 8 x 10^{7} 1 x 10^{4}
PVSrc 3 x 10^{9} 2 x 10^{7}
MOP 8 1 x 10^{8} 5 x 10^{6}
Ejemplo 10
Rendimiento del virus tras infección durante la noche de varias líneas celulares tratadas o no tratadas con IFN
Una variedad de líneas celulares normales y transformadas se dejaron sin tratar o se pretrataron con 100 unidades de IFN-\alpha, se infectaron a una MOI de 0,1 ufp/ml con VEV WT Indiana y se incubaron durante 18 horas a 37ºC. Los medios de cultivo procedentes de cada muestra se titularon para determinar la producción de VEV. Los resultados se muestran en la tabla 3.
Este ejemplo demuestra que la producción viral es de diez a diez mil veces más eficaz en una variedad de tipos de células tumorales, en comparación con los tejidos primarios normales. En presencia del interferón alfa, la producción de virus en las células primarias normales está casi completamente bloqueada, mientras que en las células tumorales, el interferón tiene poco o ningún efecto sobre la replicación de VEV.
TABLA 3
Línea celular Título viral (ufp/ml)
No tratadas IFN-\alpha
OSF7 (fibroblasto humano normal primario) 1 x 10^{6} < 10
OSF12 (fibroblasto humano normal primario) 2 x 10^{5} < 10
OSF16 (fibroblasto humano normal primario) 1 x 10^{5} < 10
PrEC (epitelio de próstata humano normal primario) 8 x 10^{6} < 10
HOSE (epitelio de la superficie del ovario humano normal primario) 1 x 10^{7} < 1000
A2780 (carcinoma de ovario humano) 2 x 10^{8} 1 x 10^{7}
OVCA 420 (carcinoma de ovario humano) 1 x 10^{8} 3 x 10^{6}
C13 (carcinoma de ovario humano) 1 x 10^{8} 1 x 10^{5}
LC80 (carcinoma de pulmón humano) 2 x 10^{9} 6 x 10^{7}
SK-MEL3 (melanoma humano) 1 x 10^{9} 1 x 10^{9}
LNCAP (carcinoma de próstata humano) 4 x 10^{9} 5 x 10^{9}
HCT116 (carcinoma de colon humano) 1 x 10^{9} 2 x 10^{9}
293T (células HEK transformadas con antígeno T y E1A de adenovirus 1 x 10^{8} 8 x 10^{7} 
\newpage
Ejemplo 11
DL_{50} para VEV WT y mutante administrados por vía intranasal a ratones PKR^{+/-} (129 x Balb/c).
Se anestesiaron ratones hembra de 8 - 10 semanas de edad y se infectaron por vía intranasal con el virus diluido en 50 \mul de solución salina tamponada con fosfato (PBS) en las fosas nasales de cada animal (PKR^{+/-}; 129 x variedad Balb/c). Se calcularon los valores de la dosis letal 50 utilizando el método de Korler-Spearman. Los resultados se muestran en la tabla 4.
Este ejemplo demuestra que los mutantes I, II y III en particular, están atenuados en comparación con la cepa Indiana de tipo natural del virus cuando se prueban para determinar su toxicidad en 120 X ratones Balb/c.
TABLA 4 
\dotable{\tabskip\tabcolsep\hfil#\hfil\+\hfil#\hfil\+\hfil#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 Virus \+  \hskip4cm  \+ DL _{50}  intranasal (ufp)\cr
\+\+\cr  WT Indiana \+ \+ 1 x 10 ^{4} \cr  Mutante I \+ \+ 1 x
10 ^{10} \cr  Mutante II \+ \+ >1 x 10 ^{10} \cr  Mutante III \+
\+ 3 x 10 ^{8} \cr  Mutante IV \+ \+ <1 x
10 ^{5} \cr}
Ejemplo 12
Los ratones PKR^{-/-} son sumamente sensibles a VEV, en comparación con varias cepas de ratón PKR^{+/+}
Se infectaron por vía intranasal ratones PKR^{-/-} y PKR^{+/+} en varias dosis y se monitorizó su supervivencia a lo largo del tiempo. Todos los ratones PKR^{-/-} sucumbieron a la infección entre los días 2 y 5, dependiendo de la dosis, mientras que los ratones control permanecieron vivos más allá de este punto. Los resultados se muestran en la tabla 5.
Este ejemplo demuestra la importancia del producto génico de PKR en la resistencia de los ratones a la infección por VEV.
TABLA 5
Antecedentes genéticos Dosis i.n. Supervivencia en el día 5
PKR^{+/+} Balb/c 5 x 10^{4} 5/5
CD-1 5 x 10^{4} 5/5
Balb/c x 129 5 x 10^{4} 5/5
PKR^{-/-} Balb/c x 129 5 x 10^{4} 0/5
5 x 10^{3} 0/4
5 x 10^{2} 0/3
5 x 10^{1} 0/3
Ejemplo 13
Las células AML3 mueren por apoptosis tras la infección por VEV
Se infectaron células OCI/AML3 (leucemia mielógena aguda) con VEV a una MOI de 3,0 ufp/célula. Se analizaron las muestras sin fijar catorce y veinte horas tras la infección. Las células apoptóticas con translocación de fosfatidilserina a través de la membrana se detectaron mediante citometría de flujo utilizando la proteína fluorescente roja anexina - V- biotina - X/NeutrAvidina - PE (Molecular Probes). Se analizó la despolarización de la membrana mitocondrial en las células apoptóticas tempranas mediante citometría de flujo utilizando el colorante sensible al potencial, JC-1 (Molecular Probes). JC-1 se acumula por la mitocondria polarizada que cambia la emisión de fluorescencia del espectro verde al rojo. Las células AML3 no viables se identificaron utilizando colorante vital fluorescente rojo de homodímero de etidio-1 (EthD-1) (Molecular Probes). Los análisis se llevaron a cabo siguiendo las especificaciones de los fabricantes. Los resultados se muestran en la tabla 6.
Este ejemplo demuestra que VEV elimina a las células de AML, al menos en parte, a través de una ruta apoptótica inducida viralmente.
TABLA 6
Pruebas MOI 0,0 MOI 3,0 Positivos netos
(muertos)
Porcentaje de Porcentaje de
positivos positivos
14 horas p.i. EthD-l 6,6 32,3 25,7
Anexina V 14,3 52,7 38,4
JC-1 7,5 21,4 13,4
20 horas p.i. Positiva para EthD-1 6,4 58,5 52,1
Positiva para anexina V 10,8 79,6 68,8
JC-1 3,9 43,2 39,3
Ejemplo 14
Las cepas de VEV mutantes infectan y eliminan células de AML
Se infectaron células OCI/AML3 (leucemia mielógena aguda) a una MOI de 1,0 y se incubaron durante 23 horas. Las células no fijadas se tiñeron con Eth-D1 (dímero de etidio, Molecular Probes) para detectar las células no viables siguiendo las especificaciones de los fabricantes. El número de células teñidas por 10.000 contadas se utilizó para calcular el porcentaje de muertes. Los resultados se muestran en la tabla 7.
Este ejemplo demuestra que las cepas VEV mutantes utilizadas son tan eficaces como la cepa Indiana de tipo natural en la eliminación de las células de AML.
TABLA 7
Simulación WT IND Mut I Mut II Mut III Mut IV Mut V
Porcentaje de muertes 30,0 64,7 60,7 86,7 72,1 74,4 82,8
Ejemplo 15
VEV y las células infectadas por VEV muestran actividad antitumoral frente a xenoinjertos de melanoma en humanos en ratones desnudos
Se desarrollaron tumores derivados de SK-MEL 3 (melanoma) en ratones atímicos Balb/c hembras de 8 - 10 semanas de edad. En el día 0, los tumores o bien se dejaron sin tratar o se infectaron con 10^{8} ufp de VEV WT Indiana en medio de cultivo o 2,5 x 10^{6} células SK-MEL 3 infectadas por VEV WT Indiana (células que producen VEV). Se calcularon las diferencias estadísticas entre los grupos tratados y los no tratados en cada punto de datos con los siguientes valores de confianza (b: p < 0,01; c: p < 0,001; d: p= 0,007). Los resultados se muestran en la figura 7. En el día 3, sólo los tumores tratados con células que producen VEV fueron significativamente más pequeños que los tumores no tratados (a: p < 0,001). No fueron evidentes diferencias estadísticamente significativas en los volúmenes tumorales entre los grupos desde el día 0 hasta el día 2. Los puntos de datos representan las medias +/- EEM de múltiples tumores (no tratados n = 8; células que producen VEV n = 8; VEV solo n = 4).
Este ejemplo demuestra que una única inyección de VEV, directamente en tumores sólidos afecta profundamente al crecimiento del tumor, dando como resultado la regresión de parcial a completa. El uso de células tumorales infectadas como vehículo para administrar el virus también es eficaz.
\newpage
Ejemplo 16
Los ratones PKR^{-/-} son extremadamente sensibles a la infección por VEV intranasal y demuestran una deficiencia en la resistencia mediada por IFN
Ratones PKR^{-/-} (A y B) y ratones control (Balb/c x 129) se infectaron por vía intranasal con 5 x 10^{4} ufp de VEV y se monitorizaron para determinar la morbididad y la supervivencia durante el transcurso de 14 días, tras los cuales se consideró que los animales que quedaban habían sobrevivido a la infección.
Los resultados se muestran en las figuras 8A y 8B. Los ratones PKR^{-/-} mostraron una grave disminución de la supervivencia en comparación con los ratones control (WT), que sucumbieron hacia el día 3 ó 4, mientras que todos los ratones control sobrevivieron a la infección. El pretratamiento con IFN-\alpha/\beta (18 h antes de la infección) con 2 x 10^{4} U.I. (figura 8A) o bien con 2 x 10^{5} UI no produjo efecto protector en los animales PKR^{-/-}.
Este ejemplo demuestra que un único defecto en la ruta del interferón (ausencia del producto génico de PKR) es suficiente para hacer que los ratones no puedan resistir a las infecciones por VEV. Este defecto no puede salvarse por el interferón.
Ejemplo 17
El interferón puede proteger a ratones desnudos que llevan xenoinjerto durante el tratamiento con VEV
Se inyectaron por vía intradérmica células de melanoma SK-MEL 3 en ratones desnudos atímicos CD-1. En el día 0, se inyectó a los tumores o bien VEV WT Indiana vivo (1 x 10^{9} ufp) o bien una cantidad equivalente de VEV inactivado por UV, y se midió diariamente. Los resultados se muestran en la figura 9. Se administró interferón a un subconjunto de animales (VEV IFN) en los momentos indicados (flechas negras). (UV-VEV n = 4; VEV IFN n = 6; VEV n = 6). En estos experimentos, una única inyección intratumoral de VEV inhibe el tumor en todos los casos. Todos los tumores tenían al menos una regresión parcial y en tres de doce ratones tratados hubo una regresión tumoral completa. Los tumores que recibieron virus inactivado por UV continuaron creciendo sin mitigarse hasta que estos animales se sacrificaron en el día 11. Los ratones desnudos que no recibieron interferón y a los que se inyectó el virus vivo comenzaron a morir en el día 10 y sólo dos de seis permanecieron viables en el día 15. Por el contrario, todos los ratones desnudos, infectados, tratados con interferón, estuvieron protegidos de la toxicidad de VEV y permanecieron libres de síntomas durante más de 45 días.
Este ejemplo demuestra que una única inyección intratumoral de VEV vivo es eficaz contra los tumores. Además, los ratones desnudos, infectados, que llevan tumores, pueden salvarse de la toxicidad de VEV mediante la inyección de interferón.
Ejemplo 18
VEV infecta y elimina células de leucemia y de mieloma
Las líneas celulares indicadas se infectaron con la cepa de VEV Indiana HR a una multiplicidad de infección de una unidad formadora de placa por célula. A las 24, 48 y 72 horas tras la infección (p.i.) se tomaron muestras de los cultivos infectados y se tiñeron directamente con yoduro de propidio siguiendo las instrucciones de los fabricantes (Molecular Probes). Las muestras se analizaron entonces mediante citometría de flujo utilizando el programa FACSsort WinMDI Versión 2.7. En la tabla 8 se muestra el porcentaje de células muertas por cada tipo de célula leucémica para los tiempos indicados tras la infección.
Este ejemplo muestra que VEV es viable para infectar y eliminar un conjunto diverso de tipos de leucemia. La célula K-562 se aísla de un paciente con leucemia mielógena crónica (CML) mientras que MOLT-4 es una leucemia de células T y SR y H929 son mielomas.
TABLA 8
Línea celular 24 h p.i. 48 h p.i. 72 h p.i.
K-562 (CML) 15,38% 52,36% N/D
MOLT-4 (leucemia de células T) 53,94% 48,80% N/D
SR (mieloma) 32,10% 46,38% N/D
H929 (mieloma) 10,73% 17,35% 64,41% 
\newpage
Ejemplo 19
Las cepas del virus de la estomatitis vesicular (VEV) incluyendo el tipo natural Indiana y cinco mutantes de VEV atenuados demuestran citotoxicidad selectiva hacia células de carcinoma de próstata humano, en comparación con los fibroblastos humanos normales
Las cepas del virus de la estomatitis vesicular, incluyendo el tipo natural Indiana y las cepas mutantes atenuadas I (TR1026), II (TR1026R), III (TP3), IV (TP6) y V (G31) se obtuvieron del Dr. Lauren Poliquin, Universidad de Quebec en Montreal. Cada una de estas cepas de virus se purificó en placa cinco veces antes de su uso en este experimento.
Se hicieron crecer células de carcinoma de próstata humano (LNCAP) y células humanas normales (fibroblasto de antebrazo OSF 7) en placas de cultivo tisular de 96 pocillos hasta una densidad de aproximadamente 5 x 10^{4} células por pocillo. Se añadieron virus en diluciones de 10 veces que oscilaban desde 5 x 10^{5} ufp hasta 5 ufp. En cada placa se incluyeron pocillos control sin virus. Las placas se incubaron durante 48 horas a 37ºC en el 5% de CO_{2}. Se cuantificó la citotoxicidad utilizando un ensayo colorimétrico MTS ((3-[4, 5-dimetiltiazol-2-il]-5-[3- carboximetoxifenil]-2- [4-sulfofenil]-2H-tetrazolio, sal interna) (CellTiter 96 Aqueous, número de catálogo G l 1 12, Promega Corporation, Madison WI 53711-5399), monitorizado a 490 nm, que detecta actividad de enzimas mitocondriales. La cantidad de muerte celular en los pocillos tratados con virus se determinó mediante la pérdida en la viabilidad en los pocillos tratados con virus con respecto a los pocillos no tratados. Los datos se representaron gráficamente como ufp/célula frente a porcentaje de muerte celular con respecto al control. Se calculó la CT50 (concentración tóxica al 50%) como la cantidad de virus en ufp/célula que produce una reducción del 50% en la cantidad de células viables. Los valores menores de CT50 reflejan el aumento de la sensibilidad de las células a los efectos líticos del virus. Se calculó el índice terapéutico in vitro para cada cepa de VEV como la razón de CT50 para las células OSF7, en comparación con la CT50 para las células LNCAP.
Los resultados se muestran en la tabla 9. El VEV Indiana de tipo natural y cada uno de los cinco mutantes demostraron un alto grado de citotoxicidad hacia las células de carcinoma de próstata humano, tal como se refleja en los bajos valores de CT50, todos inferiores a 0,01 ufp/célula. Las células de fibroblastos humanos normales fueron de uno a más de 3 órdenes de magnitud más resistentes a los efectos citotóxicos de todas las seis cepas de VEV. Los cinco mutantes tuvieron menos toxicidad sobre las células de fibroblastos OSF7 normales y tuvieron un mayor índice terapéutico in vitro que el VEV Indiana de tipo natural.
TABLA 9 Resultados del ensayo de citotoxicidad para las cepas de VEV (Indiana de tipo natural y Mutantes del I al V) contra células de carcinoma de próstata y fibroblastos normales
Mutante I Mutante II Mutante III Mutante IV Mutante V WI Indiana
Carcinoma de próstata 0,0064 0,0048 0,0014 0,0006 0,0012 0,0017
LNCAP CT50 (ufp/célula)
Fibroblastos normales > 42 22 4,3 0,031 9,8 0,022
OSF7 CT50 (ufp/célula)
Índice terapéutico > 6562 4583 3071 52 8167 13
(CT50 OSF7 / CT50 LNCAPP)
Ejemplo 20
Producción de virus a partir de células tumorales y células normales infectadas con el tipo natural Indiana y varias cepas mutantes de VEV
Se hicieron crecer células de carcinoma de colon HCT 116 y fibroblastos de antebrazo OSF 7 hasta la confluencia en placas de cultivo tisular de 35 mm. Se extrajo el medio y se añadieron los virus en un volumen de 30 \mul con una multiplicidad de infección de 0,1 ufp/célula para las células HCT 116 y de 1,5 ufp/célula para las células OSF 7. Tras un periodo de incubación de 1 hora a 37ºC, 5% de CO_{2}, se añadió 1 ml de medio de cultivo tisular a las placas. Los resultados se muestran en las figuras 10A y B. En los puntos de tiempo indicados, se extrajeron muestras de 10 \mul de las placas. Se determinó el título de virus de estas muestras mediante un ensayo en placa.
Este ejemplo demuestra la rápida cinética de replicación de las cepas de VEV de tipo natural y mutante en las células de carcinoma de colon HCT 116. Las cuatro cepas mutantes de VEV tuvieron un crecimiento más rápido en las células tumorales HCT 116 que el VEV de tipo natural. Obsérvese que en los cultivos de células OSF-7 normales, se requiere una entrada diez veces mayor de virus para lograr similares cinéticas de replicación.
Ejemplo 21
Las células cancerígenas se eliminan rápidamente tras la infección por VEV (WT Indiana) y no están protegidas por el IFN-\alpha
Monocapas de fibroblastos humanos primarios normales (AG 1522) y varias líneas de células tumorales se dejaron sin tratar o se pretrataron con IFN-\alpha (100 unidades) y después se infectaron con VEV a una MOI de 0,1 ufp/ml. A incrementos de 12 horas se terminaron las infecciones mediante fijación celular y tinción para determinar la cinética de la muerte celular. Se dejaron crecer monocapas control (CNTL), no infectadas, durante el transcurso del experimento y, por tanto, se tiñeron más intensamente. Los resultados se muestran en la figura 11. LNCAP es un carcinoma de próstata humano; A2780 es un carcinoma epitelial de ovario humano, y Sk MEL3 es un melanoma humano.
Este ejemplo demuestra la rápida cinética de la muerte de la célula tumoral por el VEV Indiana incluso en presencia de interferón alfa. Aunque las células normales también mueren por el VEV, la cinética es más lenta y las células normales pueden protegerse completamente por el interferón alfa.
Ejemplo 22
El efecto citopático inducido por VEV es visible en células de melanoma humano pero no en células humanas primarias con y sin IFN-\alpha
Cubreobjetos cubiertos con gelatina con células humanas normales y células SK-MEL3 no tratadas o pretratadas con IFN-\alpha (100 U/ml) se infectaron con VEV WT Indiana a una MOI de 0,1 ufp/ml. Los resultados se muestran en la figura 12. Las células de melanoma humano (SK-MEL3) mostraron cpe a las 12 horas tras la infección incluso en presencia de interferón. A las 24 horas tras la infección, estas células cancerígenas habían muerto y se sacaron del cubreobjetos. Las células primarias humanas, incluyendo fibroblastos de prepucio (AG1522), células epiteliales de la superficie del ovario (HOSE) y células epiteliales de la próstata (PrEC) no mostraron CPE (efecto citopático) hasta las 36 horas en ausencia de interferón y estuvieron completamente protegidas en presencia de interferón más allá de las 72 horas tras la infección.
Este ejemplo demuestra que VEV Indiana puede destruir rápidamente células de melanoma incluso en presencia de interferón alfa, mientras que los fibroblastos normales y las células epiteliales son más lentos en morir y pueden resultar completamente protegidas por el interferón alfa.
Ejemplo 23
VEV elimina selectivamente células transformadas co-cultivadas con fibroblastos normales
Se sembraron en placa números iguales de células 293T (células de riñón embrionarias humanas transformadas con el antígeno T grande y E1A de adenovirus) y fibroblastos de prepucio humanos normales sobre cubreobjetos recubiertos con gelatina y se infectaron (VEV WT Indiana) a una MOI de 0,1 tanto en presencia como en ausencia de interferón. Las células se fijaron a las 12 (no mostrado), 24 y 36 horas tras la infección. Las células fijadas se tiñeron con un anticuerpo anti-Tag y DAPI. Las células 293T teñidas de rojo murieron rápidamente tan sólo 12 horas tras la infección, independientemente del tratamiento con interferón, con aquellas pocas células restantes que mostraban núcleos condensados o fragmentados. Los fibroblastos normales mostraron núcleos alterados hacia las 36 horas tras la infección en ausencia de interferón, pero estuvieron protegidas del virus en presencia de interferón más allá de este punto de tiempo.
Este ejemplo demuestra que en un cultivo mixto de células normales y tumorales, VEV Indiana se replica preferentemente y elimina células tumorales. Las células normales en los co-cultivos infectados son más lentas en morir y pueden salvarse completamente mediante el tratamiento con interferón.
Ejemplo 24
Eficacia de una dosis intravenosa única de VEV mutante en el tratamiento de xenoinjertos de melanoma humano en ratones desnudos
Se establecieron xenoinjertos de melanoma humano SK-Mel3 en ratones atímicos CD-1 de 5 - 6 semanas. En el día 0, los tumores o bien se dejaron sin tratar o se trataron por vía intravenosa con 5 x 10^{9} ufp de VEV mutante, tal como se indica. Los resultados se muestran en la figura 13.
Este ejemplo demuestra que los mutantes II y III pueden inhibir el crecimiento tumoral tras una única inyección intravenosa. Por tanto, no es necesario administrar el virus en el sitio del tumor para que sea eficaz en la inhibición del crecimiento del tumor. Además, los mutantes, aunque se están atenuando para su crecimiento en tejidos de ratón normales, todavía pueden seleccionar como diana células tumorales in vivo.
\newpage
Ejemplo 25
Muerte selectiva de células AML co-cultivadas con médula ósea normal
La línea celular OCI/AML3 independiente de factor de crecimiento se mezcló 1:9 con médula ósea normal y se infectó durante 24 horas con VEV WT Indiana. Después se sembraron en placa varias diluciones de células en metilcelulosa más y menos factores de crecimiento y se realizaron recuentos de colonias 14 días después. La tabla 10 muestra los datos para las placas que recibieron 10^{4} células. El asterisco (*) significa que no se detectaron colonias leucémicas en las placas sin factor de crecimiento incluso cuando se sembraron 10^{5} células por placa.
Este ejemplo demuestra la muerte rápida y selectiva de células de leucemia en presencia de células madre óseas normales. Además, demuestra que la médula ósea no es un objetivo limitante de la dosis del tratamiento oncolítico con VEV, como ocurre con la mayor parte de otros tratamientos contra el cáncer convencionales.
TABLA 10
Multiplicidad de infección
Tipo de colonia 0,0 1,0 5,0
Leucémica 172 0* 0*
Neutrófilos 12 7 5
Mixta 6 3 4
Monocitos 10 7 5
Ejemplo 26
Secuencias de VEV
El genoma de VEV contiene genes que codifican para las proteínas virales N, P, M, G y L. Se determinaron las secuencias de ADNc de los marcos de lectura abiertos (ORF) para estas proteínas del VEV resistente al calor (HR) de tipo natural y tres VEV mutantes (basándose en la secuenciación cinco veces para cada uno) y se compararon con las secuencias de GenBank con número de registro NC 001560 (derivado de las cepas de VEV de Colorado y San Juan). Los mutantes son M2 (TR 1026R), M3 (TP3) y M4 (TP6). Las secuencias de ácidos nucleicos se muestran en las figuras 14, 16, 18, 20 y 22. Las secuencias de aminoácidos deducidas correspondientes se muestran en las figuras 15, 17, 19, 21 y 23, respectivamente. Las diferencias se indican mediante letras destacadas. Las líneas de puntos representan secuenciación incompleta.
Algunas de las diferencias entre las secuencias de aminoácidos se muestran en la tabla 11 que utiliza la notación basada en el encabezamiento de la columna (es decir, para el encabezamiento de la columna "Diferencias entre GenBank y HR" la notación K155R significa que el aminoácido en la posición 155 es K en GenBank y R en HR). En los casos en que la secuencia HR todavía no está disponible, sólo pueden hacerse comparaciones entre GenBank y un mutante particular. M3* indica una diferencia entre el mutante 3 y HR, pero en este caso, el aminoácido se corresponde con el depósito de GenBank en esa posición (es decir, el mutante 3 y la secuencia de GenBank coinciden en esta posición, mientras que HR es diferente).
Estos datos demuestran las múltiples diferencias en la secuencia entre la cepa HR y el depósito de GenBank (que se deriva principalmente de la cepa San Juan). También demuestra algunas de las diferencias entre los mutantes y la cepa HR de la que se derivan. Estas diferencias genéticas se corresponden con diferencias fenotípicas.
TABLA 11
Gen Diferencias entre Diferencias entre HR y Diferencias entre Diferencias entre
GenBank y HR los mutantes GenBank y GenBank y
el mutante 2 el mutante 4
N D10A, K155R, N353S A10D (M3*) Ninguna (M4)
P K50R, A76V, Q77P Ninguna (M2, M3 y M4)
E99D, P110Q, S126L,
S140L, Y151H, M168I
E170K, D237N
TABLA 11 (continuación)
Gen Diferencias entre Diferencias entre HR y Diferencias entre Diferencias entre
GenBank y HR los mutantes GenBank y GenBank y
el mutante 2 el mutante 4
M S32N, Y54H, N57H, M51R (M3)
T133A, I171V, I226V Ninguna (M4)
G H24Y, 157L, Q96H, Q26R, R242H, S431A A331V
V141A, Y172D, G132D (todos M3)
H242R, S438T, L453F E254G (M4)
H487Y
L T367A, T689S, T2026I Ninguna (M4) I202L, K296R
R2075K
Bibliografía
1. Stark, G. R., et al., How cells respond to interferons. Annu Rev Biochem, 1998. 67: pág. 227-64.
2. Jaramillo, M. L., N. Abraham, y J. C. Bell, The interferon system: a review with emphasis on the role of PKR in growth control. Cáncer Invest, 1995. 13 (3): pág. 327-38.
3. Cuddihy, A. R., et al., Double-stranded-RNA-activated protein kinase PKR enhances transcriptional activation by tumor suppressor p53. Mol Cell Biol, 1999. 19 (4): pág. 2475-84.
4. Lee, S. B., et al., The apoptosis pathway triggered by the interferon-induced protein kinase PKR requires the third basic domain, initiates upstream of Bcl-2, and involves ICE-like proteases. Virology, 1997. 231 (1): pág.81-8.
5. Lee, S. B. y M. Esteban, The interferon-induced double-stranded RNA activated protein kinase induces apoptosis. Virology, 1994. 199 (2): pág. 491-6.
6. Gale, M. J., Jr., et al., Evidence that hepatitis C virus resistance to interferon is mediated through repression of the PKR protein kinase by the nonstructural 5A protein. Virology, 1997. 230 (2): pág. 217-27.
7. McMillan, N. A., et al., HIV-1 Tat directly interacts with the interferon-induced, double-stranded RNA-dependent kinase, PKR. Virology, 1995. 213 (2): pág. 413-24.
8. Kitajewski, J., et al., Adenovirus VAI RNA antagonizes the antiviral action of interferon by preventing activation of the interferon-induced eIF-2 alpha kinase. Cell, 1986. 45 (2): pág. 195-200.
9. Black, T. L., G. N. Barber, y M. G. Katze, Degradation of the interferon induced 68,000-M (r) protein kinase by polio virus requires RNA. J Virol, 1993. 67 (2): pág. 791-800.
10. Melville, M. W., et al., The molecular chaperone hsp40 regulates the activity of P58IPK, the cellular inhibitor of PKR. Proc Natl Acad Sci U S A, 1997. 94(1): pág. 97-102.
11. Swaminathan, S., et al., Simian Virus 40 Large-T Bypasses the Translational Block Imposed by the Phosphorylation of eIF-2alpha. Virology, 1996. 219(1): pág. 321-3.
12. Der, S. D., et al., A double-stranded RNA-activated protein kinase-dependent pathway mediating stress-induced apoptosis. Proc Natl Acad Sci U S A, 1997. 94 (7): pág. 3279-83.
13. Meurs, E. F., et al., Tumor suppressor function of the interferon-induced double-stranded RNA-activated protein kinase. Proc Natl Acad Sci U S A, 1993. 90(1): pág. 232-6.
14. Koromilas, A. E., et al., Malignant transformation by a mutant of the IFN-inducible dsRNA-dependent protein kinase. Science, 1992. 257 (5077): pág. 1685-9.
15. Mundschau, L. J. y D. V. Faller, Oncogenic ras induces an inhibitor of double-stranded RNA-dependent eukaryotic initiation factor 2 alpha-kinase activation. J Biol Chem, 1992. 267 (32): pág. 23092-8.
\newpage
16. Mundschau, L. J. y D. V. Faller, Endogenous inhibitors of the dsRNA dependent eIF-2 alpha protein kinase PKR in normal and ras-transformed cells. Biochimie, 1994. 76 (8): pág. 792-800.
17. Strong, J. E., et al., The molecular basis of viral oncolysis: usurpation of the Ras signalling pathway by reovirus. Embo J, 1998. 17(12): pág. 3351-62.
18. Kumar, K. U., S. P. Srivastava, y R. J. Kaufman, Double-stranded RNA activated protein kinase (PKR) is negatively regulated by 60S ribosomal subunit protein Ll8. Mol Cell Biol, 1999. 19 (2): pág. 1116-25.
19. Peralta, R. C., et al., Distinct regions of frequent loss of heterozygosity of chromosome 5p and 5q in human esophageal cáncer. Int J Cáncer, 1998. 78 (5): pág. 600-5.
20. Kirchhoff, S., et al., IRF-1 induced cell growth inhibition and interferon induction requires the activity of the protein kinase PKR. Oncogene, 1995. 11 (3): pág. 439-45.
21. Beretta, L., et al., Expression of the protein kinase PKR in modulated by IRF-1 and is reduced in 5q-associated leukemias. Oncogene, 1996. 12 (7): pág. 1593-6.
22. Lossos, I. S., et al., A novel translocation (1;2) (p34; p21-22) in acute myelomonoblastic leukemia. Cancer Genet Cytogenet, 1998. 106 (1): pág. 78-9.
23. Haines, G. K. d., et al., Expression of the double-stranded RNA-dependent protein kinase (p68) in squamous cell carcinoma of the head and neck region. Arch Otolaryngol Head Neck Surg, 1993. 119 (10): pág. 1142-7.
24. Haines, G. K., et al., Correlation of the expression of double-stranded RNA-dependent protein kinase (p68) with differentiation in head and neck squamous cell carcinoma. Virchows Arch B Cell Pathol Incl Mol Pathol, 1993. 63 (5): pág. 289-95.
25. Shimada, A., et al., Aberrant expression of double-stranded RNA-dependent protein kinase in hepatocytes of chronic hepatitis and differentiated hepatocellular carcinoma. Cancer Res, 1998. 58 (19): pág. 4434-8.
26. Wong, L. H., et al., Interferon-resistant human melanoma cells are deficient in ISGF3 components, STAT1, STAT2, and p48-ISGF3gamma. J Biol Chem, 1997. 272 (45): pág. 28779-85.
27. Petricoin, E., 3rd, et al., Human cáncer cell lines express a negative transcriptional regulator of the interferon regulatory factor family of DNA binding proteins. Mol Cell Biol, 1994. 14 (2): pág. 1477-86.
28. Abril, E., et al., Characterization of a gastric tumor cell line defective in MHC class I inducibility by both alpha-and gamma-interferon. Tissue Antigens, 1996. 47 (5): pág.391-8.
29. Abril, E., et al., Unresponsiveness to interferon associated with STATI protein deficiency in a gastric adenocarcinoma cell line. Cancer Immunol Immunother, 1998. 47 (2): pág. 113-20.
30. Sun, W. H., et al., Interferon-alpha resistance in a cutaneous T-cell lymphoma cell line is associated with lack of STATI expression. Blood, 1998. 91 (2): pág. 570-6.
31. Chelbi-Alix, M. K., et al., Resistance to virus infection conferred by the interferon-induced promyelocytic leukemia protein. J Virol, 1998. 72 (2): pág. 1043-51.
32. Chelbi-Alix, M. K., et al., Induction of the PML protein by interferons in normal and APL cells. Leukemia, 1995. 9 (12): pág. 2027-33.
33. Stadler, M., et al., Transcriptional induction of the PML growth suppressor gene by interferons is mediated through an ISRE and a GAS element. Oncogene, 1995. 11 (12): pág. 2565-73.
34. Koken, M. H., et al., Leukemia-associated retinoic acid receptor alpha fusion partners, PML and PLZF, heterodimerize and colocalize to nuclear bodies. Proc Natl Acad Sci U S A, 1997. 94 (19): pág. 10255-60.
35. Abraham, N., et al., Characterization of transgenic mice with targeted disruption of the catalytic domain of the double-stranded RNA-dependent protein kinase, PKR. J Biol Chem, 1999. 274 (9): pág. 5953-62.
36. Garcia-Sastre, A., et al., Influenza A virus lacking the NS 1 gene replicates in interferon-deficient systems. Virology, 1998. 252 (2): pág. 324-30.

Claims (36)

1. Uso de un virus para la fabricación de un medicamento para reducir la viabilidad de una célula tumoral, en el que el virus es una cepa atenuada del virus de la estomatitis vesicular y en el que la célula tumoral es una célula de cáncer hematopoyético, un melanoma, un sarcoma, un tumor neuroendocrino, un carcinoma de pulmón o un carcinoma de colon.
2. Uso según la reivindicación 1, en el que la célula tumoral es un carcinoma de pulmón.
3. Uso según la reivindicación 1, en el que la célula tumoral es una célula de cáncer hematopoyético.
4. Uso según la reivindicación 3, en el que la célula de cáncer hematopoyético es una leucemia, un linfoma, o un mieloma.
5. Uso según la reivindicación 4, en el que la célula de cáncer hematopoyético es una leucemia.
6. Uso según la reivindicación 5, en el que la leucemia es leucemia mielógena aguda.
7. Uso según la reivindicación 5, en el que la leucemia es leucemia mielógena crónica.
8. Uso según la reivindicación 5, en el que la leucemia es leucemia promielocítica.
9. Uso según la reivindicación 5, en el que la leucemia es leucemia de células T.
10. Uso según la reivindicación 4, en el que la célula de cáncer hematopoyético es un linfoma.
11. Uso según la reivindicación 4, en el que la célula de cáncer hematopoyético es un mieloma.
12. Uso según la reivindicación 1, en el que la célula tumoral es un sarcoma.
13. Uso según la reivindicación 12, en el que el sarcoma es un osteosarcoma.
14. Uso según la reivindicación 12, en el que el sarcoma es un fibrosarcoma.
15. Uso según la reivindicación 1, en el que la célula tumoral es tumor neuroendocrino.
16. Uso según la reivindicación 1, en el que la célula tumoral carece sustancialmente de actividad PKR.
17. Uso según la reivindicación 1, en el que la célula tumoral es PKR-/-, STAT1-/-; o tanto PKR-/- como STAT1-/-.
18. Uso según la reivindicación 5, que comprende además administrar interferón a la célula tumoral antes de administrar VEV.
19. Uso según la reivindicación 1, en el que el virus es la cepa M1 del virus de la estomatitis vesicular.
20. Uso según la reivindicación 1, en el que el virus es la cepa M2 del virus de la estomatitis vesicular.
21. Uso según la reivindicación 1, en el que el virus es la cepa M3 del virus de la estomatitis vesicular.
22. Uso según la reivindicación 1, en el que el virus es la cepa M4 del virus de la estomatitis vesicular.
23. Uso según la reivindicación 1, en el que el virus es la cepa M5 del virus de la estomatitis vesicular.
24. Uso según la reivindicación 1, en el que la célula tumoral está en un sujeto mamífero y el virus es para la administración a la célula tumoral mediante administración intravenosa, intranasal, intraperitoneal o intratumoral al sujeto.
25. Uso según la reivindicación 24, en el que el sujeto mamífero es un mamífero humano o no humano.
26. Uso según la reivindicación 24, en el que el virus está contenido en una línea celular infectada con el virus y la administración comprende administrar la línea celular infectada por el virus al sujeto mediante una ruta seleccionada de vía intratumoral, intravenosa o intraperitoneal.
27. Uso según la reivindicación 1, en el que el virus tiene una secuencia de ácido nucleico del gen N que codifica para la misma secuencia de aminoácidos de la proteína N que la secuencia de ADNc del gen N para la cepa M2, M3 o M4 del virus de la estomatitis vesicular, tal como se muestra en la figura 14.
28. Uso según la reivindicación 1, en el que el virus tiene una secuencia de ácido nucleico del gen P que codifica para la misma secuencia de aminoácidos de la proteína P que la secuencia de ADNc del gen P para la cepa M2, M3 o M4 del virus de la estomatitis vesicular, tal como se muestra en la figura 16.
29. Uso según la reivindicación 1, en el que el virus tiene una secuencia de ácido nucleico del gen M que codifica para la misma secuencia de aminoácidos de la proteína M que la secuencia de ADNc del gen M para la cepa M3 o M4 del virus de la estomatitis vesicular, tal como se muestra en la figura 18.
30. Uso según la reivindicación 1, en el que el virus tiene una secuencia de ácido nucleico del gen G que codifica para la misma secuencia de aminoácidos de la proteína G que la secuencia de ADNc del gen G para la cepa M2, M3 o M4 del virus de la estomatitis vesicular, tal como se muestra en la figura 20.
31. Uso según la reivindicación 1, en el que el virus tiene una secuencia de ácido nucleico del gen L que codifica para la misma secuencia de aminoácidos de la proteína L que la secuencia de ADNc del gen L para la cepa M2 o M4 del virus de la estomatitis vesicular, tal como se muestra en la figura 22.
32. Molécula de ácido nucleico aislada que tiene una secuencia que comprende:
(a)
una secuencia que codifica para una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de la proteína N de la cepa HR de VEV mostrada en la figura 15; o
(b)
la secuencia de ADNc del gen N de una cepa de VEV seleccionada del grupo que consiste en HR, M2 y M3, mostrada en la figura 14; o
(c)
la secuencia de ARN que corresponde a (b); o
(d)
una secuencia complementaria a (a), (b) o (c).
33. Molécula de ácido nucleico aislada que tiene una secuencia que comprende:
(a)
una secuencia que codifica para una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de la proteína P de la cepa HR de VEV mostrada en la figura 17; o
(b)
la secuencia de ADNc del gen P de una cepa de VEV seleccionada del grupo que consiste en HR y M3, mostrada en la figura 16; o
(c)
la secuencia de ARN que corresponde a (b); o
(d)
una secuencia complementaria a (a), (b) o (c).
34. Molécula de ácido nucleico aislada que tiene una secuencia que comprende:
(a)
una secuencia que codifica para una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de la proteína M de una cepa de VEV seleccionada del grupo que consiste en HR, M3 y M4, mostrada en la figura 19; o
(b)
la secuencia de ADNc del gen M de una cepa de VEV seleccionada del grupo que consiste en HR, M3 y M4, mostrada en la figura 18; o
(c)
la secuencia de ARN que corresponde a (b); o
(d)
una secuencia complementaria a (a), (b) o (c).
35. Molécula de ácido nucleico aislada que tiene una secuencia que comprende:
(a)
una secuencia que codifica para una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de la proteína G de la cepa M3 de VEV mostrada en la figura 21; o
(b)
la secuencia de ADNc del gen G de la cepa M3 de VEV, mostrada en la figura 20; o
(c)
la secuencia de ARN que corresponde a (b); o
(d)
una secuencia complementaria a (a), (b) o (c).
36. Molécula de ácido nucleico aislada que tiene una secuencia que comprende:
(a)
una secuencia que codifica para una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de la proteína L de la cepa M4 de VEV mostrada en la figura 23; o
(b)
la secuencia de ADNc del gen L de la cepa M4 de VEV, mostrada en la figura 22; o
(c)
la secuencia de ARN que corresponde a (b); o
(d)
una secuencia complementaria a (a), (b) o (c).
ES00965106T 1999-09-17 2000-09-18 Virus oncolitico. Expired - Lifetime ES2260057T3 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US39787399A 1999-09-17 1999-09-17
US397873 1999-09-17

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2260057T3 true ES2260057T3 (es) 2006-11-01

Family

ID=23573018

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES00965106T Expired - Lifetime ES2260057T3 (es) 1999-09-17 2000-09-18 Virus oncolitico.
ES05025974T Expired - Lifetime ES2320239T3 (es) 1999-09-17 2000-09-18 Virus oncolitico.

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES05025974T Expired - Lifetime ES2320239T3 (es) 1999-09-17 2000-09-18 Virus oncolitico.

Country Status (13)

Country Link
EP (2) EP1716858B9 (es)
JP (1) JP5060694B2 (es)
CN (1) CN1289098C (es)
AT (2) ATE319460T1 (es)
AU (1) AU782402B2 (es)
CA (1) CA2386920C (es)
DE (2) DE60041210D1 (es)
ES (2) ES2260057T3 (es)
HK (2) HK1044708B (es)
IL (2) IL148621A0 (es)
MX (1) MXPA02002772A (es)
NZ (4) NZ517573A (es)
WO (1) WO2001019380A2 (es)

Families Citing this family (38)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AUPQ425699A0 (en) 1999-11-25 1999-12-23 University Of Newcastle Research Associates Limited, The A method of treating a malignancy in a subject and a pharmaceutical composition for use in same
US7306902B2 (en) 2002-06-28 2007-12-11 Oncolyties Biotech Inc. Oncolytic viruses as phenotyping agents for neoplasms
US8491884B2 (en) 2000-05-03 2013-07-23 Oncolytics Biotech Inc. Virus clearance of neoplastic cells from mixed cellular compositions
CN1250711C (zh) 2000-06-26 2006-04-12 威尔斯达特生物制剂公司 用病毒清除细胞
JP4916641B2 (ja) 2001-05-11 2012-04-18 ウェルスタット バイオロジクス コーポレイション 腫瘍崩壊性ウイルス治療
CA2452517A1 (en) * 2001-07-11 2003-01-23 University Of Miami Recombinant vsv for the treatment of tumor cells
AU2008201293B2 (en) * 2001-07-11 2011-08-18 University Of Miami Recombinant VSV for the treatment of tumor cells
JP2004099584A (ja) 2002-05-02 2004-04-02 Keio Gijuku Ｈｓｖを用いた抗腫瘍剤
AU2002953436A0 (en) 2002-12-18 2003-01-09 The University Of Newcastle Research Associates Limited A method of treating a malignancy in a subject via direct picornaviral-mediated oncolysis
US7731974B2 (en) * 2003-03-27 2010-06-08 Ottawa Hospital Research Institute Mutant vesicular stomatitis viruses and uses thereof
WO2004085658A1 (en) 2003-03-27 2004-10-07 Ottawa Health Research Institute Mutant vesicular stomatitis viruses and use thereof
US8012747B2 (en) 2004-06-01 2011-09-06 San Diego State University Foundation Expression system
ZA200702269B (en) * 2004-08-20 2008-09-25 Viralytics Ltd Methods and compositions for treatment of hematologic cancers
CA2577692C (en) 2004-08-20 2014-05-06 Viralytics Limited Methods and compositions for treatment of hematologic cancers
EP1917351A4 (en) 2005-08-01 2009-12-16 Univ Technologies Int ATTENUATED REOVIRUS
US10668119B2 (en) 2005-08-01 2020-06-02 Virocure, Inc. Attenuated reovirus
CN105769931B (zh) * 2006-09-15 2021-04-27 渥太华医院研究机构 溶瘤弹状病毒
US10369171B2 (en) 2007-03-13 2019-08-06 Virocure, Inc. Attenuated reoviruses for selection of cell populations
KR20110004354A (ko) * 2007-12-21 2011-01-13 와이어쓰 엘엘씨 유전자 변형된 약독화 수포성 구내염 바이러스, 이의 조성물 및 사용 방법
US10603351B2 (en) 2008-08-21 2020-03-31 Turnstone Limited Partnership Engineered synergistic oncolytic viral symbiosis
DE102008050860A1 (de) * 2008-10-08 2010-04-15 Dorothee Von Laer LCMV-GP-VSV-Pseudotypvektoren und tumorinfiltrierende Virenproduzentenzellen zur Therapie von Tumoren
CN102448487B (zh) 2009-03-16 2016-03-16 麦克马斯特大学 疫苗接种方法
MX337062B (es) * 2009-12-10 2016-02-11 Ottawa Hospital Res Inst Rabdovirus oncolítico.
EP2611920B1 (en) 2010-09-02 2015-05-13 Mayo Foundation For Medical Education And Research Vesicular stomatitis viruses
US9951117B2 (en) 2010-09-02 2018-04-24 Mayo Foundation For Medical Education And Research Vesicular stomatitis viruses
US9364532B2 (en) 2011-06-08 2016-06-14 Children's Hospital Of Eastern Ontario Research Institute Inc. Compositions and methods for glioblastoma treatment
US20140335117A1 (en) 2011-10-07 2014-11-13 Skau Aps Identification and Attenuation of the Immunosuppressive Domains in Fusion Proteins of Enveloped RNA Viruses
AU2014221143B2 (en) 2013-02-21 2019-02-07 Turnstone Limited Partnership Vaccine composition
US11484567B2 (en) 2013-04-10 2022-11-01 Aarhus Universitet Use of immune suppressive domains as medicaments
WO2014198003A1 (en) 2013-06-14 2014-12-18 Ottawa Hospital Research Institute Compositions and methods for enhancing virus replication
PL2826856T3 (pl) * 2013-07-16 2016-06-30 Sia Latima Genetycznie stabilny onkolityczny wirus RNA, sposób jego wytwarzania i zastosowanie
WO2016013008A1 (en) 2014-07-21 2016-01-28 Novellusdx Ltd. Methods and systems for determining oncogenic index of patient specific mutations
CN105233285B (zh) * 2015-09-06 2018-10-12 广州威溶特医药科技有限公司 Epac直接或间接激动剂与溶瘤病毒的联合应用
US10610583B2 (en) 2017-08-31 2020-04-07 Regents Of The University Of Minnesota Methods and compositions for treating glioma and medulloblastoma brain tumors using the zika virus
EP3684786A1 (en) * 2017-09-22 2020-07-29 Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS) Mutated glycoprotein of vesicular stomatitis virus
CN110499297B (zh) * 2019-08-29 2021-07-09 上海市公共卫生临床中心 一种新型溶瘤病毒及其制备方法和应用
WO2022033469A1 (zh) * 2020-08-14 2022-02-17 上海行深生物科技有限公司 重组溶瘤病毒及其构建方法和用途
EP4288140A1 (en) 2021-02-05 2023-12-13 Iovance Biotherapeutics, Inc. Adjuvant therapy for cancer

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE1118403B (de) 1960-01-27 1961-11-30 Hoechst Ag Verfahren zur Gewinnung von antitumorwirksamen Sporen
GB1069144A (en) 1963-07-10 1967-05-17 Merck & Co Inc Method for the treatment of malignant tumors
US4806347A (en) 1985-12-11 1989-02-21 Schering Corporation Interferon combinations
DK0713397T3 (da) * 1992-03-24 2003-03-31 United Cancer Res Inst Vaccine indeholdende levende virus
GB9415320D0 (en) 1994-07-29 1994-09-21 Medical Res Council Cancer treatment
US7153510B1 (en) * 1995-05-04 2006-12-26 Yale University Recombinant vesiculoviruses and their uses
EP1314430A1 (en) 1996-01-25 2003-05-28 The University Court Of The University Of Glasgow Treatment of non-neuronal cancer using HSV mutant
CA2295858C (en) * 1997-07-11 2011-05-10 Yale University Rhabdoviruses with reengineered coats
CA2305269C (en) * 1997-10-09 2012-07-03 Pro-Virus, Inc. Treatment of neoplasms with viruses
BR9814370A (pt) * 1997-12-22 2000-10-10 Univ Tennessee Research Corp A Rhabdovirus recombinante contendo uma proteìna de fusão heteróloga.
EP1061806A4 (en) * 1998-03-12 2001-09-12 Univ Pennsylvania PRODUCTIVE CELLS FOR REPLICATION-SELECTIVE VIRUSES FOR TREATING Vicious DISEASES
DK1086207T3 (da) * 1998-06-12 2007-05-29 Sinai School Medicine Hidtil ukendte fremgangsmåder og inteferon-deficiente substrater til opformering af vira
EP1390046A4 (en) * 1999-04-15 2005-04-20 Wellstat Biologics Corp TREATMENT OF NEOPLASMS WITH VIRUSES

Also Published As

Publication number Publication date
AU7588200A (en) 2001-04-17
EP1716858B1 (en) 2008-12-24
EP1716858A2 (en) 2006-11-02
EP1218019A2 (en) 2002-07-03
WO2001019380A2 (en) 2001-03-22
CA2386920A1 (en) 2001-03-22
ES2320239T3 (es) 2009-05-20
NZ523805A (en) 2004-09-24
ATE418341T1 (de) 2009-01-15
IL148621A (en) 2010-02-17
JP5060694B2 (ja) 2012-10-31
NZ534307A (en) 2005-07-29
HK1092713A1 (en) 2007-02-16
CN1289098C (zh) 2006-12-13
EP1716858B9 (en) 2009-08-12
CA2386920C (en) 2012-01-24
DE60041210D1 (de) 2009-02-05
WO2001019380A3 (en) 2001-11-22
EP1218019B1 (en) 2006-03-08
DE60026554D1 (de) 2006-05-04
HK1044708B (zh) 2006-10-27
MXPA02002772A (es) 2004-04-02
DE60026554T2 (de) 2006-09-28
IL148621A0 (en) 2002-09-12
CN1496268A (zh) 2004-05-12
ATE319460T1 (de) 2006-03-15
NZ517573A (en) 2004-02-27
JP2004525855A (ja) 2004-08-26
EP1716858A3 (en) 2007-08-15
HK1044708A1 (en) 2002-11-01
AU782402B2 (en) 2005-07-28
NZ534306A (en) 2005-12-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2260057T3 (es) Virus oncolitico.
US20070166287A1 (en) Oncolytic virus
ES2292207T3 (es) Tratamiento de neoplasmas con virus clonales, sensibles al interferon.
Balachandran et al. Vesicular stomatitis virus (VSV) therapy of tumors
ES2315595T3 (es) Composiciones para tratar cancer con uso de virus.
JP2005537802A (ja) ラブドウイルスの組み換え型変異体及びその使用方法
US20210169956A1 (en) Increased activity of oncolytic newcastle disease virus
US20200206286A1 (en) Replication-competent vesicular stomatitis viruses
US20100303839A1 (en) Methods and compositions for treatment of cancer using oncolytic rsv activity
Gainey et al. A hyperfusogenic F protein enhances the oncolytic potency of a paramyxovirus simian virus 5 P/V mutant without compromising sensitivity to type I interferon
US20220273740A1 (en) Chimeric vesiculoviruses and methods of use
Nakhaei et al. Oncolytic virotherapy of cancer with vesicular stomatitis virus
CA3125370A1 (en) Recombinant oncolytic newcastle disease viruses with increased activity
Cary Assessing an M mutant vesicular stomatitis virus for the treatment of glioblastoma multiforme by determining apoptotic mechanisms and antiviral response
Power Cell carriers for systemic delivery of oncolytic viruses
Berens The Bcl-2 family proteins BAX and BAK play important but separate roles in the pathogenesis of reovirus encephalitis