CN110499297B

CN110499297B - 一种新型溶瘤病毒及其制备方法和应用

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Publication number: CN110499297B
Application number: CN201910807122.4A
Authority: CN
Inventors: 徐建青; 张晓燕; 丁相卿; 陈晔; 廖启彬
Original assignee: SHANGHAI PUBLIC HEALTH CLINICAL CENTER
Current assignee: SHANGHAI PUBLIC HEALTH CLINICAL CENTER
Priority date: 2019-08-29
Filing date: 2019-08-29
Publication date: 2021-07-09
Anticipated expiration: 2039-08-29
Also published as: CN110499297A

Abstract

本发明公开了一种基于痘苗病毒天坛株的新型溶瘤病毒及其制备方法和应用，所述病毒的胸腺嘧啶核苷激酶(TK)区包含SEQ ID NO.1所示AIF‑GM‑CSF的编码序列。本发明将基因治疗的抑瘤效果与病毒治疗的溶瘤效应有效结合起来，制备了一种可高效表达人源AIF‑GM‑CSF基因的溶瘤痘苗病毒。在痘苗病毒天坛株溶瘤病毒发挥溶瘤效应裂解肿瘤细胞的同时，大量表达人的AIF，可使感染的肿瘤细胞大量凋亡；并且大量表达人多GM‑CSF，可招募NK细胞或者DC细胞进入肿瘤内部，杀伤肿瘤或者将肿瘤抗原进行有效提呈，促进杀伤性T细胞的增值分化，发挥多重的抗肿瘤效果。相对于单纯的基因疗法或者病毒疗法，增强了其对恶性肿瘤的杀伤能力。

Description

一种新型溶瘤病毒及其制备方法和应用

技术领域

本发明属生物医学技术领域，具体涉及包含经修饰或经改造的人调亡诱导因子以及人中性粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（AIF-GM-CSF）基因的新型溶瘤病毒以及所述溶瘤病毒的制备方法和其在抗肿瘤方面的应用。

背景技术

由于经典的肿瘤治疗方案在晚期肿瘤治疗中治疗效果有限且副作用严重，领域一直在不断探索新型抗肿瘤治疗策略。溶瘤病毒选择性的在肿瘤局部感染，既可直接裂解肿瘤细胞，也可通过作用于多个细胞通路以诱导不同形式的细胞死亡，还可打破肿瘤微环境的免疫抑制而诱导长期的肿瘤特异性免疫应答，减少肿瘤的抗性。溶瘤病毒感染肿瘤细胞时可特异性的转运治疗性蛋白进入肿瘤细胞，随病毒复制而增加其所荷载治疗性蛋白的在恶性肿瘤细胞中表达水平。另外，溶瘤病毒生产成本较低因而患者负担的治疗费用少，与化疗与放疗联合使用时，还可以减少放化疗使用剂量进而降低其毒副作用。因此，溶瘤病毒抗肿瘤的治疗策略逐渐引起了广泛关注。

目前多种病毒如腺病毒(adenovirus)、单纯疱疹病毒-1 (herpes simplexvirus-1，HSV-1)、新城疫病毒等已经相继被改造成溶瘤病毒。2006年，来自于人5型腺病毒的溶瘤腺病毒产品(oncorine)，在中国已用于临床治疗鼻咽癌。该溶瘤病毒的E1B-55kD区被删除后，可在p53基因突变的癌细胞中繁殖并杀伤宿主细胞。但是，临床数据显示这种溶瘤腺病毒的治疗效果并不十分理想。美国生物治疗公司Jennerex研制的牛痘溶瘤病毒JX-594，2013年的二期临床试验结果表明，原发性肝癌患者生存时间中间值高剂量组可延长达14 .1个月，低剂量组的患者只有6 .7个月。BioVex生物技术公司研发的基因工程化的单纯疱疹病毒OncoVEX GM-CSF 在选择性地杀灭肿瘤细胞同时，可表达分泌中性粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(Granulocyte–Macrophage Colony-Stimulating Factor,GM-CSF)，诱导机体产生系统性免疫应答，杀伤剩余局部肿瘤细胞及其转移的肿瘤细胞。2009年BioVex公布的一项转移性黑色素瘤II期试验的结果显示，50名患者中有26％对治疗有反应，有8名患者完全缓解。2013年3月，安进(Amgen)公布了OncoVex的临床研究数据，证明它能缩减晚期患者的肿瘤负荷，在超过400名试验患者的III期研究中，比同类其他药物更加有效。OncoVex已于2015年10月通过了FDA的批准，成为世界首个上市的溶瘤病毒产品。

前期的研究也表明，目前研制的溶瘤病毒在机体免疫力下降的情况下可能发生变异、进化和重组、出现细胞毒性产物等，因而存在一定的安全隐患。机体内预存的抗溶瘤病毒的免疫反应也是影响安全性的一大难题。此外，溶瘤病毒的杀伤效果、靶向性、以及给药途径都方面依然需要进一步优化，以增强其抗肿瘤作用并减少潜在的毒副作用，使之真正成为治疗肿瘤的利器。

溶瘤病毒靶向肿瘤的选择性可来源于病毒本身对肿瘤细胞的趋向性，也可来源于基因修饰。为进一步增强溶瘤病毒的抗肿瘤效应，国际上采用的主要策略之一是“基因-病毒治疗”，即将外源性治疗基因导入溶瘤病毒，包括诱导细胞凋亡基因、靶向肿瘤微环境的基因和免疫调节基因等。这种策略不仅在病毒治疗研究领域开辟了新途径，也为癌症的基因治疗提供了新的载体，已经被广泛应用于肿瘤生物治疗研究。

中性粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）作为一种有效的免疫应答募集蛋白，已经在临床中得到了广泛的应用，且其对于免疫系统有多种效应作用。GM-CSF对于DC细胞的发育和成熟，T细胞的活化与增值过程中起到了重要作用。GM-CSF可被多种细胞诱导产生，包括成纤维细胞，上皮细胞，巨噬细胞，T细胞和肿瘤细胞。GM-CSF还是T细胞与抗原提呈细胞（Antigen-Presenting Cell, APC）相互作用过程中非常重要调节剂。因此，GM-CSF对抗肿瘤抗原的免疫应答至关重要。早期研究已经证明GM-CSF可作为佐剂诱导体液和细胞抗肿瘤免疫应答。GM-CSF作为免疫细胞化学引诱物，招募DC细胞，NK细胞，诱导肿瘤特异性的细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)应答。JX-594和OncoVex都是将GM-CSF基因导入溶瘤病毒中，其作用机制主要通过直接杀死细胞快速去除大体积肿瘤，诱导抗肿瘤免疫反应，选择性靶向血管肿瘤，从而快速减少肿瘤的血流量。

但是单一基因GM-CSF修饰溶瘤病毒的临床效果仍然欠佳，例如针对Pexa-vec（JX-594）的临床试验中，肝癌的Phase-IIb-Traverse顶线结果显示该研究未达到其总体生存的主要终点，此前，Biomedtracker将其获批率为8%低于平均；并且针对晚期肝癌Phase III临床试验未达到临床预期而终止试验。因此，有必要对单一基因GM-CSF的设计进行进一步的优化，以提升其治疗效果。

抗肿瘤治疗的另外一个策略为诱导癌细胞的死亡。细胞的死亡可以分为凋亡、焦亡和细胞坏死。细胞凋亡是半胱天冬酶依赖的，主要通过死亡受体介导和线粒体介导两条经典通路，就是所谓的细胞程序性死亡。有多个利用诱导肿瘤细胞凋亡抗肿瘤的临床试验正在进行，主要的作用靶点有BCL-2蛋白家族，P53蛋白，凋亡抑制因子（inhibitor ofapoptosis protein，IAP)，胱门蛋白酶等。凋亡也可以通过非半胱天冬酶的通路，其中关键的方式就是调亡诱导因子(Apoptosis inducing factor ,AIF)转导，调亡诱导因子是线粒体的黄素蛋白，能够参与不依赖于半胱天冬酶的细胞凋亡，当凋亡过程发生时，AIF从线粒体转移到细胞质内，然后进入细胞核中，促使染色质凝集，引起核内DNA断裂片段化，细胞核收缩，最终实现程序性细胞死亡。目前，国内外鲜有利用AIF蛋白诱导肿瘤细胞凋亡的应用研究报道。

本发明利用天坛株痘苗病毒强大的抗肿瘤作用，搭载细胞凋亡诱导因子和免疫调节基因，显著增强了抗肿瘤效果。本发明将着重阐述搭载细胞凋亡基因和免疫调节基因的天坛株溶瘤病毒功能。

发明内容

本发明所解决的技术问题是：本发明提出一种溶瘤病毒，该溶瘤病毒能够在肿瘤细胞内大量复制并最终摧毁肿瘤细胞，同时搭载细胞凋亡基因AIF，促进肿瘤肿瘤细胞的凋亡，以及免疫调节基因GM-CSF，可通过招募其他免疫细胞如DC细胞或者NK细胞杀伤肿瘤，来增强抗肿瘤效果。

为了解决上述技术问题，本发明提出了一种新型溶瘤病毒构建体，所述溶瘤病毒基因组中包含AIF和GM-CSF的基因编码序列，并能表达AIF和GM-CSF蛋白分子。

优选的，所述AIF和GM-CSF为人源基因；所述溶瘤病毒基因组中包含的人AIF基因和人GM-CSF基因的片段为AIF-GM-CSF，其核苷酸编码序列如SEQ ID NO：1所示，表达的AIF-GM-CSF蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的。

优选的，所述溶瘤病毒为包含SEQ ID NO:1所示AIF-GM-CSF目的基因的重组痘苗病毒天坛株，命名为rTV-AIF-GM-CSF，其保藏编号为：CCTCC NO:V201959，保藏日期为2019年8月22日，保藏地址为中国典型培养物保藏中心。

优选的，所述AIF和GM-SCF的核苷酸序列之间采用T2A剪切肽、P2A或者IRES相连接，两段核酸序列可在一个载体同时表达，且两段核酸序列中AIF可位于序列的5’端或者3’端；或AIF与GM-CSF两段核酸序列表达在不同的载体上但联合使用。

优选的，所述溶瘤病毒经过修饰以编码和表达AIF-GM-CSF基因，其功能片段或变体，所述基因或其功能片段或变体与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2具有至少90％序列同一性。

优选的，所述新型溶瘤病毒的病毒骨架来源于经修饰或经改造的痘苗病毒天坛株、纽约株、哥本哈根株、金丝雀株、安卡拉株，腺病毒载体、腺相关病毒载体、单纯疱疹病毒载体、水痘－带状疱疹病毒载体、呼吸道合胞病毒、生里基森林病毒， EB病毒、巨细胞病毒、人疱疹病毒6型、天花病毒、痘苗病毒、传染性软疣病毒、羊口疮病毒、呼肠孤病毒、轮状病毒、肠道病毒、塞内卡病毒、脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒、鼻病毒、甲型肝炎病毒、口蹄疫病毒、披膜病毒、甲病毒、塞姆利基森林病毒、东部马脑炎病毒、辛德毕斯病毒、风疹病毒、冠状病毒、黄病毒、丙型肝炎病毒、日本脑炎病毒、圣路易斯脑炎病毒、墨累谷热病毒、黄热病毒、西尼罗河病毒、寨卡病毒、登革病毒、埃博拉病毒、马尔堡病毒、沙粒病毒、拉沙热病毒、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒、皮钦德病毒、胡宁病毒、马丘波病毒、汉坦病毒、裂谷热病毒、副粘病毒、人副流感病毒、腮腺炎病毒、猴病毒5、麻疹病毒、水疱性口炎病毒、狂犬病病毒、呼吸道合胞病毒、正粘病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、丙型流感病毒、丁型肝炎病毒、猴免疫缺陷病毒、人免疫缺陷病毒1型和人免疫缺陷病毒2型、劳氏肉瘤病毒、嗜人T细胞白血病病毒1型、猴泡沫病毒、乙型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、人乳头瘤病毒或多瘤病毒。

优选的，所述溶瘤病毒骨架为细胞内成熟病毒、细胞内包装病毒、细胞相关包装病毒或细胞外包装病毒。

所述的AIF-GM-CSF重组痘苗病毒天坛株的制备方法，包括以下步骤：

(1)合成人AIF-GM-CSF，其基因序列如SEQ ID NO：1所示；

(2)将AIF-GM-CSF亚克隆至痘苗病毒穿梭质粒(pSC65)的TK区中，构建出重组质粒pSC65-AIF-GM-CSF；

(3)采用基因同源重组的方式，将pSC65-AIF-GM-CSF质粒转染到已经被感染了野生型痘苗病毒的TK143-细胞中，使两者同源重组，产生重组痘苗病毒rTV-AIF-GM-CSF；经筛选后，获得所述TK区包含SEQ ID NO：1所示的pSC65-AIF-GM-CSF的编码序列的重组溶瘤痘苗病毒；其中，AIF-GM-CSF基因由痘苗病毒的早/晚期启动子p7.5 控制。

上述的AIF-GM-CSF重组痘苗病毒天坛株的扩增方法具体步骤包括：细胞生长密度达接近100％时滴入AIF-GM-CSF重组痘苗病毒天坛株，更换低浓度胎牛血清的维持培养基，每10 cm 培养板接种量约为0.02 MOI溶瘤痘苗病毒，放入孵箱培养,重组痘病毒扩增完毕后，收集病毒液再反复冻融后，用蔗糖溶液进行密度梯度离心纯化。

上述溶瘤病毒在制备抗肿瘤药物方面可以广泛应用。例如制备以下抗肿瘤药物方面的应用：肿瘤选自B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、黑色素瘤、前列腺癌、肾细胞癌、肉瘤、胶质瘤、高级别胶质瘤、母细胞瘤神经母细胞瘤、骨肉瘤、浆细胞瘤、组织细胞瘤、胰腺癌、乳腺癌、肺癌诸如小细胞肺癌和非小细胞肺癌、胃癌、肝癌、结肠癌、直肠癌、食管癌、大肠癌、造血系统癌、睾丸癌、宫颈癌、卵巢癌、膀胱癌、鳞状细胞癌、腺癌、AIDS相关淋巴瘤、膀胱癌、脑癌、神经系统癌、头颈癌、头颈部鳞状细胞癌、霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤或血液致瘤疾病。

本发明的有益效果是：

1、本发明所述新型溶瘤病毒在溶瘤病毒原有的溶瘤效应基础上，进一步赋能免疫调节效应与基因治疗抑制肿瘤效应，制备了一种可高效表达人源AIF-GM-CSF基因的痘苗病毒天坛株的溶瘤病毒。在溶瘤病毒发挥溶瘤效应裂解肿瘤细胞的同时，高效表达人的AIF基因诱导肿瘤细胞大量凋亡；并且通过表达人的GM-CSF进而招募NK细胞或DC细胞进入肿瘤内部，杀伤肿瘤或者将肿瘤抗原进行有效提呈以促进杀伤性T细胞的增值分化，发挥多重的抗肿瘤效果。相对于单纯的基因疗法或者溶瘤病毒疗法，新型溶瘤病毒显著增强了针对恶性肿瘤的杀伤能力。

2、本发明完成对痘苗病毒天坛株溶瘤病毒体内前列腺癌以及恶性肺癌等治疗评价，实现了对肿瘤的良好靶向性及抗肿瘤效果，并且有较为完备的病毒扩增方法，为进一步的产业化奠定基础，本发明具有良好的应用前景。

附图说明

图1显示了人源基因AIF-GM-CSF穿梭质粒载体的构建及AIF-GM-CSF蛋白的表达。图1a为整合有AIF-GM-CSF基因的穿梭质粒pSC65表达图谱；图1b为重组痘苗病毒rTV-AIF-GM-CSF感染VERO细胞后AIF成功表达；图1c为重组痘苗病毒rTV-AIF-GM-CSF感染VERO细胞后细胞上清中GM-CSF的成功表达。从图中可知，重组痘苗病毒rTV-AIF-GM-CSF所搭载的AIF以及GM-CSF分子均成功表达。

图2显示了结果显示，重组痘苗病毒rTV-AIF-GM-CSF促使人肺癌肺癌细胞的凋亡作用。将Annexin V阳性与PI阴性的细胞群为A549细胞早期凋亡的标志。图2中为重组痘苗病毒rTV-AIF-GM-CSF感染人肺癌细胞A549细胞后，能够促使A549细胞有15%的凋亡，感染天坛痘苗病毒野生株仅诱导2%细胞凋亡。从图中可知，相比于野生型痘苗病毒，重组痘苗病毒rTV-AIF-GM-CSF诱导人肺癌肺癌细胞的凋亡具有显著差异性。

图3显示了重组痘苗病毒rTV-AIF-GM-CSF的小鼠体内抗人肺癌的作用。实验动物分为三组，包括对照组、NKT细胞治疗组、以及NKT细胞联合重组痘苗病毒rTV-AIF-GM-CSF治疗组。小鼠B-NDG®（B-NSGTM）接种了NCI-H292恶性肺癌细胞后形成肺癌的荷瘤模型。从图中可知，NKT细胞联合重组痘苗病毒rTV-AIF-GM-CSF在体内能够明显提升对NCI-H292恶性肺癌的杀伤效果。

图4显示了重组痘苗病毒rTV-AIF-GM-CSF的小鼠体内抗人前列腺癌的作用。图4a为B-NDG小鼠接种了LNCaP前列腺癌细胞后的无瘤生存期。实验动物分为三组，包括对照组、NKT细胞治疗组、以及NKT细胞联合重组痘苗病毒rTV-AIF-GM-CSF治疗组；图4b为B-NDG小鼠接种LNCaP前列腺癌细胞后的荷载肿瘤比率。实验动物分为三组同图4a；从图中可知，NKT细胞联合重组痘苗病毒rTV-AIF-GM-CSF在体内同样能够明显提升对LNCaP前列腺癌的杀伤效果，减少LNCaP前列腺癌小鼠的荷载率。

保藏信息：重组痘病毒rTV-AIF-GM-CSF，拉丁文学名为Orthopoxvirus genus，于2019年8月22日保藏在中国典型培养物保藏中心，地址位于中国武汉，武汉大学，邮编430072，其保藏编号为：CCTCC NO:V201959。

具体实施方式

实施例一：重组痘苗病毒rTV-AIF-GM-CSF的构建以及表达验证

1.1带有人源AIF-GM-CSF目的基因的pSC65载体构建

人工合成AIF-GM-CSF的DNA序列，两个基因之间用T2A序列连接，合成的序列如SEQID NO:1所示，以合成的DNA序列为模版采用如下引物进行PCR扩增。扩增的引物为：

AIF-GM-CSF-F：GTACCAGGCCTAGTACTATGTTCCGGTGTGGAGGCCT

AIF-GM-CSF-R:AATAAGCTCGAAGTCGACTCACTCCTGGACTGGCTCCCAGCAG

PCR反应程序：94℃预变性5 分钟；98℃变性10 秒, 58℃退火30 秒，72 ℃延伸2分钟，反应30个循环；72℃环再充分延伸10 分钟，终止于25℃。

PCR产物的回收与克隆构建：扩增结束后，在2%的琼脂糖凝胶中分离目的基因，同时将pSC65载体用Sal I酶切（Thermo Scientific公司，货号ER0642）切胶回收，采用Sanprep柱式DNA 胶回收试剂盒（Promega公司，货号A9282）回收PCR片断段与载体酶切片段，基因回收产物与酶切线性化载体用同源重组的方法连接（诺唯赞公司，货号c112-02），将连接产物转化至大肠杆菌E.coli TOP10，在含氨苄霉素的培养板上过夜生长。第2天，随机挑取单菌落进行双酶切鉴定，再经过测序，突变位点校正，验证全部序列正确后，成功克隆出AIF-GM-CSF基因的pSC65载体（pSC65-AIF-GM-CSF），质粒构建图谱如图1a。

1.2：构建重组痘苗病毒rTV-AIF-GM-CSF

1．细胞准备：将143TK^-细胞铺在6孔板中，每孔1×10⁶个。培养24小时后细胞贴壁并且铺满整个底面时，进行下一步操作。

2．痘苗病毒孵育：用野生型痘苗病毒天坛株感染细胞（0.0125 PFU /3个细胞），37℃孵箱孵育1 小时后弃上清，并用1 mL PBS冲洗一遍再加入1 mL完全培养基。

3．质粒转染：将上述穿梭质粒pSC65-AIF-GM-CSF转染143TK^-细胞。37℃孵箱培养48 小时左右,具体时间根据细胞病变情况而定。

4．准备病毒铺斑用的2×DMEM维持培养基（含2%PS和4%FBS），加入2%预热的低熔点琼脂糖再加X-gal（终浓度为200 μg/mL）。

5．弃掉6孔板中的上清，将铺斑用的混合物加入6孔板中（300μL/孔），然后小心放入4℃冰箱，促进凝固，待低熔点琼脂糖凝固后再转入37℃孵箱中倒置培养直至出现清晰的蓝斑。

6．挑取蓝斑（含有目的重组痘苗病毒rTV-AIF-GM-CSF），加入500 μL的完全培养基。在-80℃反复冻融三次以上，使病毒尽量多的释放。

7．将143TK^-细胞铺在6孔板中（1×10⁶个/孔），培养24 小时左右，至细胞贴壁并且铺满整个底面。

8．反复吹打EP管中的蓝斑，使其完全散开。

9．将完全培养基换成维持培养基然后将含有蓝斑的病毒液加入，37℃孵箱孵育3-4 小时。

10.加入筛选压力：BrdU工作浓度为50 μg/mL，放入37℃孵箱中孵育48 小时，根据病毒斑形成情况进行铺斑。该纯化过程至少需要进行5次。

11．然后进行重组痘苗病毒的小样扩增，铺143TK^-细胞于六孔板，每孔1×10⁶个细胞，使用时细胞约为孔板底面积的100%。

12．种毒前将孔中的培养基换成2 mL维持培养基。将纯化得到的含有蓝斑的病毒液反复吹打至蓝斑散开。每孔加入100 μL左右病毒液。37℃孵箱孵育48 小时左右，根据病毒斑形成情况收样。

13．收样：将孔里的细胞充分吹下并收于EP管中，用于后续基因组的提取以及作为毒种进行扩增。

1.3：重组痘苗病毒rTV-AIF-GM-CSF的表达验证

1．取10 cm 细胞培养皿，接种5×10⁶个VERO细胞/皿，保证第二天接种痘苗病毒时使细胞密度达100%为宜；

2．病毒接种前，将完全培养基换成8 mL维持培养基（DMEM培养基+2%FBS +1%PS），并接种病毒到该细胞中，接种量约为0.02 MOI。

3．在37℃ 5% CO2的孵箱中培养48小时左右，取一个皿的感染后的VERO细胞，收集病毒培养液，然后将细胞用PBS洗2遍，800 g，离心3 分钟。收取感染后的VERO细胞，通过蛋白质免疫印迹法分析AIF的表达。所用的抗体一抗为Anti-AIF (Abcam 公司，货号ab2086)，二抗为HRP标记山羊抗兔（中杉金桥公司，货号zb-2301）。结果显示，重组有AIF的痘苗病毒感染VERO细胞后，利用蛋白质免疫印迹方法能检测到AIF蛋白的高表达，感染天坛痘苗病毒野生株仅有微量表达（图1b）。

4．用酶联免疫吸附实验检测感染VERO细胞上清中GM-CSF的表达（BD公司，货号555126），结果显示，重组痘苗病毒rTV-AIF-GM-CSF感染VERO细胞后，利用酶联免疫吸附实验能检测到GM-CSF蛋白的高表达，感染天坛痘苗病毒野生株几乎检测不到（图1c）。

实施例二重组痘苗病毒rTV-AIF-GM-CSF的扩增

1．143TK-细胞的准备：将细胞铺在24孔板中（2×10⁵个细胞/孔），使用时细胞密度要达到24孔板底面积的100%；

2．稀释病毒：用维持培养基稀释痘苗病毒病毒液，从1:100开始，做10倍比稀释，终体积为1100 μL；

3．弃掉24孔板中的完全培养基，加入病毒稀释液（500 μL/孔），做两个复孔。37℃5% CO2的条件下孵育48 小时左右，根据病毒嗜斑形成情况决定铺斑时间；

3．收痘苗病毒：弃掉皿内8 mL培养基，取用2 mL维持培养基将剩余的细胞吹下，收于15 mL离心管中；

4．冻存24 小时后，将收得的病毒液再反复冻融2次，用36%的蔗糖溶液进行密度梯度离心，16000 g 4℃离心90 分钟，小心倒掉上清，用PBS缓冲液溶解离心管内的病毒沉淀，分装保存于-80℃，待测定病毒滴度。

实施例三重组痘苗病毒rTV-AIF-GM-CSF的滴度测定

1．143TK^-细胞的准备：将细胞铺在24孔板中（2×10⁵个细胞/孔），使用时细胞密度要达到24孔板底面积的100%；

2．稀释病毒，用维持培养基稀释痘苗病毒病毒液，从1:100开始，做10倍比稀释，终体积为1100 μL；

3．弃掉24孔板中的培养基，加入病毒稀释液（500 μL/孔），做两个复孔。37℃ 5%CO₂的条件下孵育48小时左右，根据病毒嗜斑形成情况决定铺斑时间；

4．铺斑方法：准备8 mL含有 2×DMEM培养基+4%FBS+2%PS的铺斑培养基以及8 mL沸水浴融化后并置于37℃水浴锅中的低熔点琼脂糖，将二者混合，再将X-gal加入混合物中，终浓度为200 μg/mL，待用；

5．吸掉24孔板中的上清。步骤4中的铺斑混合物立刻加入24孔板中，每孔500 μL。然后小心放入4℃冰箱，促进凝固，待低熔点琼脂糖凝固后再转入37℃孵箱中倒置培养直至出现清晰的蓝斑；

6．病毒斑计数：首先观察病毒嗜斑的数目是否呈十倍比的趋势递减，随后统计种毒的两个复孔中仅有个位数蓝斑的数量，得到的两个孔中蓝斑数值之和，乘以该孔所对应稀释度的倒数值即为1 mL中病毒的滴度。

实施例四重组痘苗病毒rTV-AIF-GM-CSF促使人肺癌细胞凋亡

1．A549细胞的准备：将A549细胞铺在24孔板中（4×10⁵个细胞/孔），使用时细胞密度要达到24孔板底面积的90%；

2．弃掉24孔板中的完全培养基，加入重组痘苗病毒稀释液（1×10⁶PFU/孔）；

3. 37℃ 5% CO2条件下孵育12小时后弃掉孔中培养基，用PBS清涤后加入200µl的胰酶（无EDTA）室温消化至细胞收缩呈单个状态，用1mL的培养基终止消化，分别收集每孔到1.5mL的EP管中，100g离心3分钟，弃上清。

4. 用1mL的预冷PBS洗涤2遍，100g离心3分钟，弃上清。

FITC-及PI的一管作为阴性对照，所用试剂盒为BD 5. 用100 µl 1×结合缓冲液重悬细胞，然后将细胞悬液转移到反应管中，加入2µl FITC Annexin V FITC标记的Annexin-V和2µl PI，室温孵育15分钟。同时以不加AnnexinV Apoptosis Detection Kit I（BD公司，货号556547）。

6. 加入200 µl 1×结合缓冲液终止反应，采用流式细胞术检测凋亡情况。Annexin V阳性与PI阴性的细胞群为A549细胞早期凋亡的亚群。

结果显示，重组有AIF-GM-CSF的痘苗病毒感染A549细胞12小时后，能够促使A549细胞有15%的凋亡，感染天坛痘苗病毒野生株仅导致少量凋亡（2%）（图2）。

实施例五重组痘苗病毒rTV-AIF-GM-CSF的小鼠体内抗人肺癌效果

1. 实验小鼠模型：采用免疫缺陷小鼠B-NDG®小鼠（NOD-Prkdcscid Il2rgtm1/Bcgen，购置百奥赛图公司），该品系小鼠是NOD遗传背景下，双基因敲除了Prkdc和IL2rg，适合人源细胞或组织移植。

2. 对B-NDG 小鼠通过皮下种植5×10⁶的人肺癌细胞（NCI-H292，125μL），每天记录小鼠的肿瘤长、短径，采用以下公式计算肿瘤的体积。

肿瘤体积计算公式：肿瘤体积（mm³）=（长径×宽径²）/2。

根据动物实验伦理的规定，当某只小鼠肿瘤直径在任意方向有超过2 cm，便进行小鼠的安乐死，该实验小鼠记为死亡（预计10天左右成瘤）。

3. 小鼠接种肿瘤NCI-H292细胞后30天，将成瘤的小鼠随机分为四组（每组5只小鼠），分别为未处理对照组、NKT细胞治疗组、NKT细胞联合重组痘苗病毒rTV-AIF-GM-CSF治疗组。给药方式为瘤内注射回输，单次给药。

A：对照组：同体积的生理盐水；

B：NKT组：5×10⁶个NKT细胞；

C：NKT + rTV组：5×10⁶个NKT细胞联合1×10⁶PFU 的重组痘苗病毒rTV-AIF-GM-CSF。

4. 肿瘤生长曲线监测：回输细胞后，使用游标卡尺每天监测肿瘤大小，监测时长15天。采用游标卡尺测量瘤体的长径和宽径直径，计算肿瘤体积。

结果如图3显示，相比于未处理的对照组，NKT细胞治疗组能一定程度的控制B-NDG小鼠NCI-H292瘤的生长，但观察到接种肿瘤细胞后的第15天，NKT细胞治疗组小鼠的肿瘤体积均超过600 mm³；而NKT细胞联合重组痘苗病毒rTV-AIF-GM-CSF治疗组，均能够显著控制B-NDG小鼠NCI-H292肺癌的生长，能将全部5只小鼠的肿瘤体积控制在100 mm³以下，甚至全部清除（图3）。

实施例四：重组痘苗病毒rTV-AIF-GM-CSF的抗人前列腺癌效果

1. 对B-NDG小鼠通过皮下种植5×10⁶的LNCaP前列腺癌细胞（LNCaP，125μL），

每天记录小鼠的肿瘤长、短径，采用以下公式计算肿瘤的体积。

肿瘤体积计算公式：肿瘤体积（mm³）=（长径×宽径²）/2。

3. 小鼠接种肿瘤LNCaP细胞后20天，将成瘤的小鼠随机分为三组（每组5只小鼠），分别为一个未处理的对照组、二个治疗组包括NKT细胞治疗组（NKT组）、NKT细胞联合重组痘苗病毒rTV-AIF-GM-CSF治疗组（NKT+rTV组）。给药方式为瘤内注射回输，单次给药一次。

A：对照组：同体积的生理盐水；

B：NKT组：5×10⁶个NKT细胞；

C：NKT + rTVF治疗组： 5×10⁶个NKT细胞联合1×10⁶PFU 的重组痘苗病毒rTV-AIF-GM-CSF；

4. 肿瘤生长曲线监测：回输细胞后，使用游标卡尺每天监测肿瘤大小，监测时长30天。采用游标卡尺测量瘤体的长径和宽径直径，计算肿瘤体积。

结果如图4显示，相比于未处理的对照组，NKT细胞治疗组能一定程度的控制B-NDG小鼠LNCaP瘤的生长，但观察到接种肿瘤细胞后的第30天，NKT细胞治疗组小鼠的肿瘤体积均超过1000 mm³；而NKT细胞联合重组痘苗病毒rTV-AIF-GM-CSF治疗组，均能够显著控制B-NDG小鼠LNCaP瘤的生长，能将全部5只小鼠的肿瘤体积控制在100 mm³以下，甚至全部清除（图4a）；同时，NKT细胞联合重组痘苗病毒rTV-AIF-GM-CSF治疗组可极大的减少肿瘤的荷载，观察到第30天，所有5只小鼠均无肿瘤荷载（图4b）。

综上所述，重组痘苗病毒rTV-AIF-GM-CSF作为溶瘤病毒，能够显著控制人肺癌以及前列腺癌等多种实体肿瘤的生长，对于肿瘤的治疗有非常高的应用价值；且重组痘苗病毒制备简单，便于大量制备以及推广使用。上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

序列表

<110> 上海市公共卫生临床中心

<120> 一种新型溶瘤病毒及其制备方法和应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2328

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgttccggt gtggaggcct ggcggcgggt gctttgaagc agaagctggt gcccttggtg 60

cggaccgtgt gcgtccgaag cccgaggcag aggaaccggc tcccaggcaa cttgttccag 120

cgatggcatg ttcctctaga actccagatg acaagacaaa tggctagctc tggtgcatca 180

gggggcaaaa tcgataattc tgtgttagtc cttattgtgg gcttatcaac agtaggagct 240

ggtgcctatg cctacaagac tatgaaagag gacgaaaaaa gatacaatga aagaatttca 300

gggttagggc tgacaccaga acagaaacag aaaaaggccg cgttatctgc ttcagaagga 360

gaggaagttc ctcaagacaa ggcgccaagt catgttcctt tcctgctaat tggtggaggc 420

acagctgctt ttgctgcagc cagatccatc cgggctcggg atcctggggc cagggtactg 480

attgtatctg aagatcctga gctgccgtac atgcgacctc ctctttcaaa agaactgtgg 540

ttttcagatg acccaaatgt cacaaagaca ctgcgattca aacagtggaa tggaaaagag 600

agaagcatat atttccagcc accttctttc tatgtctctg ctcaggacct gcctcatatt 660

gagaatggtg gtgtggctgt cctcactggg aagaaggtag tacagctgga tgtgagagac 720

aacatggtga aacttaatga tggctctcaa ataacctatg aaaagtgctt gattgcaaca 780

ggaggtactc caagaagtct gtctgccatt gatagggctg gagcagaggt gaagagtaga 840

acaacgcttt tcagaaagat tggagacttt agaagcttgg agaagatttc acgggaagtc 900

aaatcaatta cgattatcgg tgggggcttc cttggtagcg aactggcctg tgctcttggc 960

agaaaggctc gagccttggg cacagaagtg attcaactct tccccgagaa aggaaatatg 1020

ggaaagatcc tccccgaata cctcagcaac tggaccatgg aaaaagtcag acgagagggg 1080

gttaaggtga tgcccaatgc tattgtgcaa tccgttggag tcagcagtgg caagttactt 1140

atcaagctga aagacggcag gaaggtagaa actgaccaca tagtggcagc tgtgggcctg 1200

gagcccaatg ttgagttggc caagactggt ggcctggaaa tagactcaga ttttggtggc 1260

ttccgggtaa atgcagagct acaagcacgc tctaacatct gggtggcagg agatgctgca 1320

tgcttctacg atataaagtt gggaaggagg cgggtagagc accatgatca cgctgttgtg 1380

agtggaagat tggctggaga aaatatgact ggagctgcta agccgtactg gcatcagtca 1440

atgttctgga gtgatttggg ccccgatgtt ggctatgaag ctattggtct tgtggacagt 1500

agtttgccca cagttggtgt ttttgcaaaa gcaactgcac aagacaaccc caaatctgcc 1560

acagagcagt caggaactgg tatccgatca gagagtgaga cagagtccga ggcctcagaa 1620

attactattc ctcccagcac cccggcagtt ccacaggctc ccgtccaggg ggaggactac 1680

ggcaaaggtg tcatcttcta cctcagggac aaagtggtcg tggggattgt gctatggaac 1740

atctttaacc gaatgccaat agcaaggaag atcattaagg acggtgagca gcatgaagat 1800

ctcaatgaag tagccaaact attcaacatt catgaagacg agggcagagg aagtctgcta 1860

acatgcggtg acgtcgagga gaatcctggc ccaatgtggc tgcagagcct gctgctcttg 1920

ggcactgtgg cctgcagcat ctctgcaccc gcccgctcgc ccagccccag cacgcagccc 1980

tgggagcatg tgaatgccat ccaggaggcc cggcgtctcc tgaacctgag tagagacact 2040

gctgctgaga tgaatgaaac agtagaagtc atctcagaaa tgtttgacct ccaggagccg 2100

acctgcctac agacccgcct ggagctgtac aagcagggcc tgcggggcag cctcaccaag 2160

ctcaagggcc ccttgaccat gatggccagc cactacaagc agcactgccc tccaaccccg 2220

gaaacttcct gtgcaaccca gattatcacc tttgaaagtt tcaaagagaa cctgaaggac 2280

tttctgcttg tcatcccctt tgactgctgg gagccagtcc aggagtga 2328

<210> 2

<211> 775

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Phe Arg Cys Gly Gly Leu Ala Ala Gly Ala Leu Lys Gln Lys Leu

1 5 10 15

Val Pro Leu Val Arg Thr Val Cys Val Arg Ser Pro Arg Gln Arg Asn

20 25 30

Arg Leu Pro Gly Asn Leu Phe Gln Arg Trp His Val Pro Leu Glu Leu

35 40 45

Gln Met Thr Arg Gln Met Ala Ser Ser Gly Ala Ser Gly Gly Lys Ile

50 55 60

Asp Asn Ser Val Leu Val Leu Ile Val Gly Leu Ser Thr Val Gly Ala

65 70 75 80

Gly Ala Tyr Ala Tyr Lys Thr Met Lys Glu Asp Glu Lys Arg Tyr Asn

85 90 95

Glu Arg Ile Ser Gly Leu Gly Leu Thr Pro Glu Gln Lys Gln Lys Lys

100 105 110

Ala Ala Leu Ser Ala Ser Glu Gly Glu Glu Val Pro Gln Asp Lys Ala

115 120 125

Pro Ser His Val Pro Phe Leu Leu Ile Gly Gly Gly Thr Ala Ala Phe

130 135 140

Ala Ala Ala Arg Ser Ile Arg Ala Arg Asp Pro Gly Ala Arg Val Leu

145 150 155 160

Ile Val Ser Glu Asp Pro Glu Leu Pro Tyr Met Arg Pro Pro Leu Ser

165 170 175

Lys Glu Leu Trp Phe Ser Asp Asp Pro Asn Val Thr Lys Thr Leu Arg

180 185 190

Phe Lys Gln Trp Asn Gly Lys Glu Arg Ser Ile Tyr Phe Gln Pro Pro

195 200 205

Ser Phe Tyr Val Ser Ala Gln Asp Leu Pro His Ile Glu Asn Gly Gly

210 215 220

Val Ala Val Leu Thr Gly Lys Lys Val Val Gln Leu Asp Val Arg Asp

225 230 235 240

Asn Met Val Lys Leu Asn Asp Gly Ser Gln Ile Thr Tyr Glu Lys Cys

245 250 255

Leu Ile Ala Thr Gly Gly Thr Pro Arg Ser Leu Ser Ala Ile Asp Arg

260 265 270

Ala Gly Ala Glu Val Lys Ser Arg Thr Thr Leu Phe Arg Lys Ile Gly

275 280 285

Asp Phe Arg Ser Leu Glu Lys Ile Ser Arg Glu Val Lys Ser Ile Thr

290 295 300

Ile Ile Gly Gly Gly Phe Leu Gly Ser Glu Leu Ala Cys Ala Leu Gly

305 310 315 320

Arg Lys Ala Arg Ala Leu Gly Thr Glu Val Ile Gln Leu Phe Pro Glu

325 330 335

Lys Gly Asn Met Gly Lys Ile Leu Pro Glu Tyr Leu Ser Asn Trp Thr

340 345 350

Met Glu Lys Val Arg Arg Glu Gly Val Lys Val Met Pro Asn Ala Ile

355 360 365

Val Gln Ser Val Gly Val Ser Ser Gly Lys Leu Leu Ile Lys Leu Lys

370 375 380

Asp Gly Arg Lys Val Glu Thr Asp His Ile Val Ala Ala Val Gly Leu

385 390 395 400

Glu Pro Asn Val Glu Leu Ala Lys Thr Gly Gly Leu Glu Ile Asp Ser

405 410 415

Asp Phe Gly Gly Phe Arg Val Asn Ala Glu Leu Gln Ala Arg Ser Asn

420 425 430

Ile Trp Val Ala Gly Asp Ala Ala Cys Phe Tyr Asp Ile Lys Leu Gly

435 440 445

Arg Arg Arg Val Glu His His Asp His Ala Val Val Ser Gly Arg Leu

450 455 460

Ala Gly Glu Asn Met Thr Gly Ala Ala Lys Pro Tyr Trp His Gln Ser

465 470 475 480

Met Phe Trp Ser Asp Leu Gly Pro Asp Val Gly Tyr Glu Ala Ile Gly

485 490 495

Leu Val Asp Ser Ser Leu Pro Thr Val Gly Val Phe Ala Lys Ala Thr

500 505 510

Ala Gln Asp Asn Pro Lys Ser Ala Thr Glu Gln Ser Gly Thr Gly Ile

515 520 525

Arg Ser Glu Ser Glu Thr Glu Ser Glu Ala Ser Glu Ile Thr Ile Pro

530 535 540

Pro Ser Thr Pro Ala Val Pro Gln Ala Pro Val Gln Gly Glu Asp Tyr

545 550 555 560

Gly Lys Gly Val Ile Phe Tyr Leu Arg Asp Lys Val Val Val Gly Ile

565 570 575

Val Leu Trp Asn Ile Phe Asn Arg Met Pro Ile Ala Arg Lys Ile Ile

580 585 590

Lys Asp Gly Glu Gln His Glu Asp Leu Asn Glu Val Ala Lys Leu Phe

595 600 605

Asn Ile His Glu Asp Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp

610 615 620

Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Trp Leu Gln Ser Leu Leu Leu Leu

625 630 635 640

Gly Thr Val Ala Cys Ser Ile Ser Ala Pro Ala Arg Ser Pro Ser Pro

645 650 655

Ser Thr Gln Pro Trp Glu His Val Asn Ala Ile Gln Glu Ala Arg Arg

660 665 670

Leu Leu Asn Leu Ser Arg Asp Thr Ala Ala Glu Met Asn Glu Thr Val

675 680 685

Glu Val Ile Ser Glu Met Phe Asp Leu Gln Glu Pro Thr Cys Leu Gln

690 695 700

Thr Arg Leu Glu Leu Tyr Lys Gln Gly Leu Arg Gly Ser Leu Thr Lys

705 710 715 720

Leu Lys Gly Pro Leu Thr Met Met Ala Ser His Tyr Lys Gln His Cys

725 730 735

Pro Pro Thr Pro Glu Thr Ser Cys Ala Thr Gln Ile Ile Thr Phe Glu

740 745 750

Ser Phe Lys Glu Asn Leu Lys Asp Phe Leu Leu Val Ile Pro Phe Asp

755 760 765

Cys Trp Glu Pro Val Gln Glu

770 775

Claims

1.一种溶瘤病毒，其特征在于，所述溶瘤病毒为包含SEQ ID NO:1所示AIF-GM-CSF目的基因的重组痘苗病毒天坛株，命名为rTV-AIF-GM-CSF，其保藏编号为：CCTCC NO:V201959，保藏日期为2019年8月22日，保藏地址为中国典型培养物保藏中心。

2.权利要求1所述溶瘤病毒在制备抗肿瘤药物方面的应用，其中所述肿瘤选自前列腺癌以及肺癌。

3.一种溶瘤病毒的制备方法，包括以下步骤：

(1)合成人AIF-GM-CSF，其基因序列如SEQ ID NO：1所示；

(2)将AIF-GM-CSF亚克隆至痘苗病毒穿梭质粒pSC65的TK区中，构建出重组质粒pSC65-AIF-GM-CSF；

(3)采用基因同源重组的方式，将pSC65-AIF-GM-CSF质粒转染到已经感染了野生型痘苗病毒的TK143细胞中，使两者同源重组，产生重组痘苗病毒rTV-AIF-GM-CSF；经筛选后，获得所述TK区包含SEQ ID NO：1所示的AIF-GM-CSF的编码序列的重组溶瘤痘苗病毒；其中，AIF-GM-CSF基因由痘苗病毒的早/晚期启动子p7.5 控制；

（4）对获得的重组溶瘤痘苗病毒进行扩增。

4.根据权利要求3所述溶瘤病毒的制备方法，其特征在于，重组溶瘤痘苗病毒进行扩增具体步骤包括：Vero细胞生长密度达接近100％时滴入AIF-GM-CSF重组痘苗病毒天坛株，更换低浓度胎牛血清的维持培养基，每10 cm 培养板接种量为0.02 MOI溶瘤痘苗病毒，放入孵箱培养,重组痘病毒扩增完毕后，收集病毒液再反复冻融后，用蔗糖溶液进行密度梯度离心纯化。