JP2005537802A - ラブドウイルスの組み換え型変異体及びその使用方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、組み換え型ウイルス、単離した核酸、ベクター、細胞、及びそれらを含む組成物を提供する。前記組み換え型ウイルス、単離した核酸、ベクター、細胞、及びそれらを含む組成物は、少なくとも一つの外来核酸の発現に加えて、変異したマトリクス・タンパク質(M)及び/又は変異した糖タンパク質(G)を含んでいるラブドウイルス・タンパク質を発現する。また、本発明は、それらを、インビボや抗癌(神経膠腫の治療など)の用途に使用する方法に関する。また、本発明に係る組み換え型ラブドウイルスは、遺伝子治療及びワクチンの用途にも有用である。
Description
本発明は、ラブドウイルスに関し、特に、変異したマトリクス・タンパク質(M)及び/又は変異した糖タンパク質(G)などのラブドウイルス・タンパク質、さらにはそれらのゲノムに含まれる、少なくとも1つの外来の核酸の発現に関する。また、本発明は、それらを、インビボや抗癌(神経膠腫の治療など)の用途に使用する方法に関する。また、本発明に係る組み換え型ラブドウイルスは、遺伝子治療及びワクチンの用途にも有用である。
治療用途での遺伝子送達に適切なベクターの開発が著しく進歩したのにもかかわらず、特に、遺伝子治療やワクチン開発に効果的な送達システムの発達や、それらの抗癌治療への影響において、多くの障害が残っている。
遺伝子治療ウイルス・ベクターは、一般的に、標的とする細胞には溶解しない。遺伝子治療に用いられるウイルス・ベクターは、治療上有効な量のDNAを薬のように比較的安全に送達するために、人工的に作成される(例えば、D. T. Curielらによる米国特許第5,547,932号参照)。それらのベクターのいくつかは、標的細胞内でのみ、感染部で複製することができる(F. McConnickによる米国特許第5,677,178号)。他の、複製することができない遺伝子治療ベクターも人工的に作成される。複製しない遺伝子治療ベクターは、通常、ヘルパー・プラスミドを使用して(例えば、G. Natsoulisによる米国特許第5,622,856号、M. Mamounasによる米国特許第5,646,034号参照)、又は、ウイルスのゲノム内で欠いている遺伝因子を与える細胞をパッケージ化して生成される。
遺伝子治療ウイルス・ベクターの幅広い用途は、使用されるウイルス・ベクターに合っている野生型の宿主域は、多くの場合、容易に克服できないという事実によって妨げられている。近年、次のような、多数の遺伝子治療の特許が公開されている。アデノウイルス・ベクターを説明したもの(M. Cottenらによる米国特許第5,693,509号)、アデノ随伴ウイルス・ベクターについて(J. S. Lebkowskiらによる米国特許第5,589,377号)、レトロウイルス・ベクター(B. 0. Palssonらによる米国特許第5,616,487号)、キメラ融合糖タンパクを含むベクター(S. Kaymanらによる米国特許第5,643,756号)、ウイルスコート・タンパク質に対する抗体を含むベクター(Cottonら)、通常はHIV1に感染しない種類のサルに、ヒト免疫不全ウイルス1型(HIV1)を感染させることができるように人工的に作成された複合型ウイルス(J. Sodroskiらによる米国特許第5,654,195号)、及び水疱性口炎ウイルス(vesicular stomatitis virus:VSV)のGタンパク質を含むシュードタイプ・レトロウイルス・ベクター(J. C. Bumsらによる米国特許第5,512,421号及び米国特許第5,670,354号)。遺伝子治療に使用されるベクターの有効性を保ちつつ、個々のベクターに固有の宿主域を制限する問題を克服するために、遺伝子治療ベクターの多少の変更が試みられている。また、ウイルス送達媒体(細胞に送達された遺伝子の発現は永続的ではない)が、一時的な遺伝子治療のために作成される(I. H. Maxwellらによる米国特許第5,585,254号)。
ワクチン開発及び効果的な免疫反応の促進は、生物医学研究における新しい分野であり、特にウイルス送達媒体に関して、適切な遺伝子送達システムのより良い設計がもたらす利益を享受すると思われている。病原体又はワクチン製剤の侵入に対する免疫反応の初期段階に生成されたサイトカインは、抗原特異的Th細胞の発達において重要な役割を果たすことが立証されている。いくつかの一連の証拠は、防御と関係する表現型に分化するTヘルパー細胞の「決定」は、Tヘルパー細胞が発見されたサイトカイン環境によって強く影響されることを立証している(1)。さらに、様々なサイトカインが、治療用又は補助成分として投与された際に、細胞媒介性の抗原特異的免疫反応の発達を促進する免疫調節効果を有することが知られている。そのようなサイトカインの免疫調節性と補助特性を十分に活用するために、多くの研究者が、生体内に多量のそれらのサイトカインを送達するための、プラスミドDNA(2)、人工細胞(3、4)、又は組み換え型ウイルス(5)などのベクターの使用を評価しはじめている。
他の分野では、ウイルス・ベクターは、特に、腫瘍の治療(特に、脳腫瘍の治療)の用途に有望である。癌遺伝子治療の急速な進歩は、そのような技術が手術に対して優れた補助を提供するという望みを再びもたらす。これらの手段を用いた、癌を治療するための2つの治療方法が開発されている。一方の方法は、ウイルス療法(virotherapy, oncolytic therapy)と呼ばれ、瘍細胞を殺すために、細胞溶解性ウイルスに本来備わっている破壊的な能力を利用する。これらの、いわゆる腫瘍細胞破壊性ウイルスは、腫瘍細胞を特異的に標的とする、又は、正常な細胞での複製を制限するために遺伝子組み換えされており、それによって腫瘍を選択的に破壊する。複製が制限された腫瘍細胞破壊性ウイルスの一例は、ONYX−15である。ONYX−15は、EIB遺伝子が除去されたアデノウイルスであり、野生型のp53遺伝子を有する正常細胞内での複製を制限するが、p53の機能性を欠いている腫瘍細胞内では複製し、その細胞を殺す(6)。他方の方法は、治療性又は腫瘍細胞破壊性遺伝子を腫瘍細胞に送達することである。これらの遺伝子の産物は、腫瘍の成長を直接的又は間接的に抑制する。ヒト・サイトカイン遺伝子、腫瘍抑制遺伝子、遺伝子(自殺遺伝子)をエンコードする細菌性又はウイルス性のプロドラッグ活性化酵素、及び放射線及び化学療法するために腫瘤の感受性を高める遺伝子などの、多種多様な遺伝子が、臨床前及び臨床研究でテストされた。
ラブドウイルスは細胞膜で覆われたウイルスであり、自然界に広くに分布し、脊椎動物、無脊椎動物及び植物に影響を及ぼす。水疱性口炎ウイルス(Vesicular stomatitis virus: VSV)は、ラブドウイルス科のウイルスファミリ(6つの属に分類される)の一員である。ラブドウイルス科は、単一の、11,000〜12,000ヌクレオチドの負鎖RNAゲノムを有する(Rose and Whiff, 2001, Chapter 38, Rhabdoviridae: The viruses and their replication, in Fields Virology, 4tb edition, pp. 1221)。ウイルス粒子は、ゲノムRNA及びタンパク質から成る、らせん状のヌクレオカプシド・コアを含んでいる。一般に、N(ヌクレオカプシド、ゲノムを強固に覆う)、P(以前はNSと呼ばれた、本来は非構造性を示す)、及びL(大きい)と呼ばれる3つのタンパク質は、ヌクレオカプシドと関係があることが分っている。細胞膜外皮内には、恐らく細胞膜とヌクレオカプシ・コアとの両方に相互作用する、付加的なマトリクス(M)タンパク質が存在している。一種類の糖タンパク質(G)は、細胞膜を架橋し、ウイルス粒子の表面にスパイクを形成する。Gは、細胞と膜融合との結合に関与する。ゲノムは、マイナス・センスなので(即ち、mRNAとして機能するRNA配列(プラス・センス)を補完し、エンコードされたタンパク質を直接的に作成する)、ラブドウイルスは、P及びLタンパク質から成るビリオン(virion)内にRNA依存性RNAポリメラーゼをエンコードし、パッケージ化する必要がある(Balti-naore et al., 1970, Proc. Nad. Acad. Sci. USA 66: 572-576)。この酵素は、ゲノムRNAを転写し、5〜6つのウイルスタンパク質をエンコードするサブゲノムmRNAを作成する。また、完全長のマイナス及びプラス・センスRNAを複写する。遺伝子治療は、遺伝子の3´端から始めて、順次転写する。
VSVのマトリクス・タンパク質は、ウイルスのライフサイクルにおいて、2つの重要な機能を果たす。第1に、ウイルス集合、及び感染細胞からのウイルス粒子の放出にとって必須である。第2に、ホスト細胞の遺伝子発現の抑制に関与し、ウイルス・タンパク質を合成するための全てのホスト細胞翻訳機構にウイルスを利用することを可能にする。Mタンパク質によるホスト遺伝子発現の抑制は、VSVの感染と関係する、高度で急速な細胞変性効果に関与すると考えられている。Mタンパク質に誘発された細胞変性効果は、アポトーシスの惹起を引き起こし、一般的には、細胞は感染後12〜16時間後に死滅する。真核発現ベクターとは無関係な、Mタンパク質の一時的な発現は、ホスト細胞の細胞骨格の分解と細胞丸めなどの、典型的なVSV細胞変性効果を引き起こすのに十分であり、VSVに誘発された細胞変性効果には他のVSVタンパク質は不要であることを実証する。
VSV Gタンパク質は、ウイルスのホスト細胞への付着と、細胞の飲食作用後のウイルス外皮の細胞膜外部領域への融合を両方とも仲立ちする。Gタンパク質の118〜136残基の変異解析と、同様にVSVの疎水性光標識実験の結果により、この領域は融合ペプチドの内部であり、酸性のpH(9〜14)で標的細胞膜に挿入されるという証拠が得られる。残基395〜418の領域での挿入又は置換は、Gタンパク質の細胞膜の融合活性に影響を及ぼすことが分っている(15、16)。融合ペプチドと残基395〜418の両方で置換された二重変異体は、融合抑制への相加効果を有しており(17)、外部領域のC末端領域がGの融合活性において特に重要な役割を果たすことを示す。
以上述べたように、前述した遺伝子送達、ワクチン開発、及び抗癌治療の用途に使用されるウイルス・ベクターを開発する必要性が認識されている。特に、細胞変性効果を有しておらず、広範囲の細胞間拡散を行わず、細胞質内でのみ複製し、ウイルス・ベクター治療(標的細胞染色体内での挿入突然変異に関係するものを含む)に関係するものを排除するVSVベースのベクターの開発が求められている。
本発明のある実施形態は、マトリクス・タンパク質(M)、及び/又はラブドウイルス・タンパク質(G)の細胞膜に近接している外部領域が変異した又は部分的に除去された組み換え型ラブドウイルスを開示する。また、本発明の他の実施形態は、前記組み換え型ラブドウイルスを、ワクチンや抗癌治療のような遺伝子導入方法に使用する方法を提供する。
ある実施形態では、前記組み換え型ラブドウイルスは非細胞変性であり、第2のポリペプチドをエンコードする異種核酸配列の挿入をさらに含んでいる。前記第2のポリペプチドは、ある実施形態では治療用のポリペプチドであり、他の実施形態では免疫原性のポリペプチドである。
他の実施形態では、本発明は、マトリクス・タンパク質(M)内に欠損又は変異を有するラブドウイルス・タンパク質をエンコードする遺伝子組み換え核酸を含んでいる非細胞変異性の組み換え型ラブドウイルスを作成する方法を提供する。該方法は、(A)適切な細胞内に、マトリクス・タンパク質(M)内に欠損又は変異を有するラブドウイルス・タンパク質をエンコードするポリヌクレオチド配列、標識ポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチド配列、及びラブドウイルスを複製するためのシス作用シグナルを有する3´及び5´のラブドウイルス・リーダ及びトレーラ領域を少なくとも含んでいるポリシストロン性cDNAを挿入するステップと、(B)前記細胞を、前記細胞の非細胞変性表現型のために選択された条件下で培養するステップと、(C)前記細胞を、前記組み換え型ラブドウイルスを作成可能な条件下で培養するステップと、(D)前記非細胞変性組み換え型ラブドウイルスを単離するステップとを含んでいる。
他の実施形態では、本発明は、ラブドウイルス・ゲノムをエンコードするポリヌクレオチド配列を含んでおり、該ポリヌクレオチドはマトリクス・タンパク質をエンコードする遺伝子に変異又は欠失を有している単離した核酸分子を提供する。
他の実施形態では、本発明は、ラブドウイルス・糖タンパク質(G)の細胞膜に近接している外部領域をエンコードする領域内に欠損又は変異を有するラブドウイルス・ゲノムの核酸を含んでいる組み換え型ラブドウイルスを提供する。他の実施形態では、ラブドウイルスのゲノムは、さらに、マトリクス・タンパク質(M)内に欠損又は変異を有している。ある実施形態では、ラブドウイルスのゲノムは、さらに、2番目のポリペプチドをエンコードする異種核酸配列の挿入を含んでいる。ある実施形態では、前記2番目のポリペプチドは、治療用のポリペプチドである。他の実施形態では、前記2番目のポリペプチドは、免疫原性のポリペプチド、自殺遺伝子、又はマーカーポリペプチドである。
他の実施形態では、本発明は、ラブドウイルス・糖タンパク質(G)の細胞膜に近接している外部領域をエンコードする領域内に欠失又は変異を有するラブドウイルス・タンパク質をエンコードする遺伝子組み替え核酸を含んでいる組み換え型ラブドウイルスを作成する方法を提供する。該方法は、(A)適切な細胞内に、マトリクス・タンパク質(M)内に欠損又は変異を有するラブドウイルス・タンパク質をエンコードするポリヌクレオチド配列、標識ポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチド配列、及びラブドウイルスを複製するためのシス作用シグナルを有する3´及び5´のラブドウイルス・リーダ及びトレーラ領域を少なくとも含んでいるポリシストロン性cDNAを挿入するステップと、(B)前記細胞を、前記組み換え型ラブドウイルスの作成を作成可能な条件下で培養するステップと、(C)前記組み換え型ラブドウイルスを単離するステップとを含んでいる。
ある実施形態では、前記方法は、2番目のポリペプチドをエンコードする異種核酸配列を挿入するステップをさらに含んでいる。他の実施形態では、前記2番目のポリペプチドは、治療用のポリペプチド、又は免疫原性のポリペプチドである。
他の実施形態では、本発明は、ラブドウイルス・ゲノムをエンコードするポリヌクレオチド配列を含んでおり、該ポリヌクレオチド配列はラブドウイルス・糖タンパク質(G)の細胞膜に近接している外部領域をエンコードする遺伝子に欠失又は変異を有していることを特徴とする単離した核酸分子。
他の実施形態では、本発明は、欠陥遺伝子に関連する病気に罹っている患者を治療する方法を提供する。該方法は、前記患者の標的細胞に、治療上有効な量の組み換え型非細胞変性ラブドウイルスを投与するステップを含んでおり、前記ラブドウイルスのゲノムは、前記患者のマトリクス・タンパク質(M)をエンコードする領域及び/又は糖タンパク質(G)の細胞膜に近接している外部領域内における欠損又は変異と、標的細胞の内部で発現できる異種遺伝子とを有し、それによって病気を治療する。
他の実施形態では、本発明は、患者に病気に対する免疫性を与える方法を提供する。該方法は、前記患者の標的細胞に、治療上有効な量の組み換え型ウイルスを接触させるステップを含んでおり、前記ウイルスは、マトリクス・タンパク質(M)をエンコードする領域内及び/又は糖タンパク質(G)の細胞膜に近接している外部領域内に欠損又は変異を有するラブドウイルス・ゲノム又はその断片と、標的細胞の内部で発現できる免疫原性タンパク質又はペプチド断片をエンコードする異種遺伝子と有し、それによって病気に対する免疫性を与える。
他の実施形態では、本発明は、癌細胞を溶解させる方法を提供する。該方法は、癌細胞に、(a)マトリクス・タンパク質(M)をエンコードする領域内及び/又は糖タンパク質(G)の細胞膜に近接している外部領域内に欠損又は変異を有するラブドウイルス・ゲノム又はその断片を含む核酸と、(b)非ラブドウイルス核酸とを含んでいる組み換え型ラブドウイルスを接触させるステップを含んでいる。他の実施形態では、前記非ラブドウイルス核酸は、サイトカイン又は自殺遺伝子をエンコードする。
他の実施形態では、本発明は、ガンを治療する方法を提供する。該方法は、癌細胞に、(a)マトリクス・タンパク質(M)をエンコードする領域内及び/又は糖タンパク質(G)の細胞膜に近接している外部領域内に欠損又は変異を有するラブドウイルス・ゲノム又はその断片と、(b)非ラブドウイルス核酸とを含んでいる組み換え型ウイルスを接触させるステップを含む。他の実施形態では、前記非ラブドウイルス核酸は、サイトカイン又は自殺遺伝子をエンコードする。
他の実施形態では、本発明は、腫瘍細胞破壊作用を有する物質を同定する方法を提供する。該方法は、コロナ、黒質及び皮質組織のビブラトーム薄片を取得するステップと、生存力を維持しつつ細胞分裂を抑制した条件下で、前記薄片をカバースリップ上で培養するステップと、前記薄片培養物に標識された癌細胞を接種するステップと、前記接種された細胞を、対象物質と共に培養するステップと、癌細胞の生存度を測定するステップとを含む。癌細胞の生存度の減少は、前記対象物質が腫瘍細胞破壊性であることを示し、このことにより腫瘍細胞破壊作用を有する物質を同定する。他の実施形態では、前記癌細胞はニューロン由来である。他の実施形態では、前記癌細胞は、蛍光性、発光性、発色性及び電子密度レベルにより標識される。他の実施形態では、前記方法は、前記薄片培養物に標識された組み換え型ラブドウイルスを接種するステップ、及び/又は前記接種された薄片をサイトカインと共に培養するステップをさらに含む。
本発明は、組み換え型ウイルス、組み換え型ラブドウイルス、ベクター及びそれらを含む組成物を提供する。ある実施形態では、本発明に係るラブドウイルス核酸配列は、部分的な決失を有するマトリクス・タンパク質(M)及び/又は糖タンパク質(G)を含む。そのため、ラブドウイルス・ベースの遺伝子治療ベクター、ワクチンの作成及び/又は抗癌治療に使用できる。また、本発明の他の実施形態では、ここに開示される治療用途の組み換え型ラブドウイルス、ベクター及び組成物を作成する方法を提供する。
ある実施形態では、組み換え型ラブドウイルスは、外来遺伝子を送達する手段を提供する。前記遺伝子は、ヒトの体内で様々な細胞と感染するので、非常に用途が広い。他の実施形態では、それらの異種タンパク質を発現させる操作は、多様な細胞種類へ外来遺伝子を送達するシステムと、従来の多くの遺伝子送達に使用されるベクター(細胞親和性が低い)に欠けている用途を提供する。
従来の組み換え型ラブドウイルスの使用は、細胞タンパク質合成の減少により、外来タンパク質発現がわずかである細胞変性効果をもたらす。しかしながら、本発明のある実施形態では、Mタンパク質が変異又は削除された組み換え型ラブドウイルスは細胞と感染し、さらに非細胞変性である。異種タンパク質発現は、変異したウイルス内で機能強化されたタンパク質の発現により直ちに行われる。
Mタンパク質の変異は、宿主域を変えないので、複合型の細胞は感染し(実施例2)、すぐに元に戻せる(実施例3)。変異ウイルスに感染した島細胞は、細胞変性効果がわずかである高レベルの外来遺伝子発現をもたらす(実施例4)。さらに、M及びG糖タンパク質が削除されたステムによる感染は、8時間培養した後でも、高レベルの感染及び発現をもたらす。このように、Mタンパク質が変異又は削除された組み換え型ラブドウイルスは、Gタンパク質の変異又は欠失の同時発生の有無にかかわらず、非細胞変性の遺伝子送達/遺伝子治療ベクターを提供する。
ある実施形態では、マトリクス・タンパク質(M)をエンコードする領域内に欠失又は変異を有するラブドウイルス・ゲノムの核酸を含む組み換え型ラブドウイルスを提供する(ある実施形態では、前記組み換え型ラブドウイルスは非細胞変性である)。
ここで使われる「組み換え型ラブドウイルス」という用語は、ラブドウイルスでは本来発現しないタンパク質を発現させるために、遺伝子組み替えにより人工的に作成されたウイルスのことを意味する。このようなウイルスの作成は、その後単離することができる「シュードタイプ」又は「キメラ」ウイルスを生成する。
ここで使われる「非細胞変性ラブドウイルス」という用語は、ウイルス集合において依然として機能するが、感染した細胞に対しては細胞変性ではない、ラブドウイルスの非細胞変性の変異を意味する。
ここで使われる「マトリクス・タンパク質(M)」という用語は、ラブドウイルス・ゲノムにエンコードされているタンパク質を意味する。マトリクス・タンパク質は、細胞膜外皮内に存在し、恐らく細胞膜とヌクレオカプシ・コアとの両方に相互作用する。ラブドウイルスのマトリクス・タンパク質は、ウイルスのライフサイクルにおいて、2つの重要な機能を果たす。第1に、ウイルス集合、及び感染細胞からのウイルス粒子の放出にとって必須である。第2に、ホスト細胞の遺伝子発現の抑制に関与し、ウイルス・タンパク質を合成するための全てのホスト細胞翻訳機構にウイルスを利用することを可能にする。Mタンパク質によるホスト遺伝子発現の抑制は、VSVの感染と関係する、高度で急速な細胞変性効果に関与すると考えられている。
ある実施形態では、本発明に係る組み換え型非細胞変性ラブドウイルスは、マトリクス・タンパク質(M)内に欠損又は変異を有する。他の実施形態では、前記欠失又は変異は、核局在配列(nuclear localization signal :NLS)をエンコードする領域を有するマトリクス・タンパク質のN末端側半分をエンコードする領域内にある。
ここで使われる「核局在配列」又は「NLS」という用語は、NLSと関係する発現したペプチド、タンパク質、又は分子の、細胞の細胞質から核への細胞膜を経た輸送を指示するペプチド又はその派生物を意味する。
ある実施形態では、前記変異は、例えばマトリクス・タンパク質(M)の位置33又は51で、メチオニン残基の代わりにアラニン残基をエンコードする。他の実施形態では、前記変異は、例えば位置226での、グリシン残基によるセリン残基の置換をエンコードする。他の実施形態では、前記変異は、位置133での、アラニン酸残基によるトレオニン残基の置換をエンコードする。他の実施形態では、前記変異は、全てのMタンパク質をコードしている領域で欠失を有する。ラブドウイルスの細胞変性効果の減少をもたらすMタンパク質発現の任意の変更は、本発明の一部と見なされる。
他の実施形態では、Mタンパク質変異体は、SEQ ID NO:1、2、3、4又は5に対応するアミノ酸配列を有する。
本発明のある実施形態では、組み換え型非細胞変性ラブドウイルスは、糖タンパク質(G)をエンコードしている領域内に、さらに変異を有する。
ラブドウイルスにエンコードされた糖タンパク質(G)は、ウイルスの融合、感染力及びウイルスの出芽プロセスの全体的な効果に寄与する(Whitt M. A., (1998) The Journal of Microbiology 36: 1-8)。ラブドウイルスGタンパク質、Gステムポリペプチドの断片は、細胞膜融合に関与する。ここで使われる「Gステムポリペプチド」という用語は、42アミノ酸配列細胞膜に近接する外部領域、膜貫通型アンカー及び細胞質後部領域(成熟したGタンパク質の)を含む、ラブドウイルスGタンパク質のセグメントを意味する。
G糖タンパク質(G)は、細胞膜融合に関与するので、ラブドウイルス感染における細胞間核酸を促進する。ここでは、Gの細胞膜に近接する外部領域は、細胞膜融合に必須であると見なされている。Gの細胞膜近接外部領域をエンコードしている領域における置換、欠又は挿入の変異は、G発現の減少をもたらさない(実施例5)。安定性、細胞表面に対する完全長Gタンパク質のオリゴマー化又は輸送、領域の欠失に影響された細胞膜近接領域内の変異は、どれも大いに抑制された融合をもたらさない(細胞膜固定領域とGタンパク質との境界の間への9又は10のアミノ酸の挿入は影響されるが)。G細胞膜近接外部領域由来の特異的残余の置換は、融合を減少させない。融合活性が完全に止められた、保存FFGDTGモチーフを含むF440とN449との間の欠失だけが、このサブドメインがGno融合活性に重要であることを示す。融合の特徴、欠失変異が伴うウイルスの成長は、ウイルスを成長させるためのG機能の補完を必要とする(実施例8)。また、細胞膜近接外部領域のアミノ酸残基(例えばN449−K462)は、減少した伝染力をもたらす。
ある実施形態では、ラブドウイルス・糖タンパク質(G)の細胞膜近接外部領域をエンコードする領域内に欠失又は変異を有するラブドウイルス・ゲノムの核酸を含んでいる組み換え型ラブドウイルスを提供する。
ある実施形態では、ラブドウイルス・糖タンパク質(G)の細胞膜近接外部領域内の変異は、アラニン・アミノ酸残基によるトリプトファン・アミノ酸残基の置換をエンコードする(SEQ ID NO:8、10、11、12、13又は14)。他の実施形態では、前記変異は、アラニン・アミノ酸残基による、グルタミン酸(SEQ ID NO:6)、グリシン(SEQ ID NO:7)及び/又はフェニルアラニン・アミノ酸残基(SEQ ID NO:9)の置換をエンコードする。他の実施形態では、前記変異は、アスパラギン酸及びアラニン・アミノ酸残基による、グルタミン酸、グリシン、フェニルアラニン・アミノ酸残基、或いはそれらの組み合わせの置換をエンコードする。他の実施形態では、前記変異は、前記したアミノ酸残基の置換をエンコードする変異の任意の組み合わせである。
他の実施形態では、ラブドウイルス・糖タンパク質(G)の細胞膜近接外部領域をエンコードしている領域内の変異は、前記外部領域内のヌクレオチドの欠失をエンコードする。ある実施形態では、前記変異は、ラブドウイルス・糖タンパク質(G)のアミノ酸残基449〜461をエンコードするヌクレオチド(SEQ ID NO:20)、又はその断片の欠損である。他の実施形態では、前記変異は、アミノ酸残基440〜449をエンコードするヌクレオチド(SEQ ID NO:16)、又はそれらの断片の欠損である。
他の実施形態では、ラブドウイルス・糖タンパク質(G)の細胞膜近接外部領域をエンコードしている領域内の変異は、外部領域へのヌクレオチドの挿入をエンコードする。ある実施形態では、前記変異は、ラブドウイルス・糖タンパク質の細胞膜近接外部領域におけるセリンアミノ酸残基間への、崩壊促進因子(decay acceleration factor :DAT)のアミノ酸残基311〜319をエンコードするヌクレオチドの挿入である(SEQ ID NO:22)、
他の実施形態では、ラブドウイルス・糖タンパク質(G)の細胞膜近接外部領域をエンコードしている領域内の変異は、SEQ ID NO:15、19、20又は22に対応するアミノ酸配列を有する変異となる。
他の実施形態では、ラブドウイルス・糖タンパク質(G)の細胞膜近接外部領域をエンコードしている領域内の変異は、SEQ ID NO:15、19、20又は22に対応するアミノ酸配列を有する変異となる。
他の実施形態では、ラブドウイルス・ゲノムは、マトリクス・タンパク質(M)内に変異又は欠失をさらに含む。
ラブドウイルスMタンパク質のように、ラブドウイルスGタンパク質の細胞膜近接外部領域内での変異は、G細胞膜近接外部領域/Mタンパク質コード領域の部分的な決失又は完全な欠失をもたらし、本発明の一部と見なされることを理解されたい。同様に、G細胞膜近接外部領域内のMタンパク質コード領域の挿入変異は、本発明の一部と想定される。同様に、ここでは、機能の喪失、又はラブドウイルスのG細胞膜近接外部領域/Mタンパク質の発現の変化をもたらす変異が考えられ、更なる実施形態を含む。
ある実施形態では、本発明は、ベシクロ・ウイルス属及びリッサ・ウイルス属の任意のウイルスの利用のために提供されるが、本発明に使用される組み換え型ラブドウイルスは、水疱性口炎ウイルス(vesicular stomatitis virus :VSV)に由来する。前記ベシクロ・ウイルス属は、ニュージャージー抗原型の水疱性口炎ウイルス(VSVNJ)、インディアナ抗原型(VSVInd)、アラゴアスVSVストレーン、球菌ウイルス、Juronaウイルス、Carajasウイルス、Marabaウイルス、ピリウイルス、Calchaquiウイルス、Yug Bogdanovacウイルス、Isfahanウイルス、チャンディプラ・ウイルス、Perinetウイルス、及びPorton-Sウイルスである(Rose and Mitt. IN B. N. FIELDS' VIROLOGY 4th ED. VOL. 1 (2001))。前記リッサ・ウイルス属は、狂犬病ウイルス(Rabies virus :RV)、ラゴスコウモリ・ウイルス、Mokolaウイルス、Duvenhageウイルス、Obodhiangウイルス、及びKotonkanウイルスである。
他の実施形態では、本発明は、異種の融合促進ポリペプチドをエンコードする核酸配列をさらに含む組み換え型ラブドウイルスを提供する。他の実施形態では、融合促進ポリペプチドをエンコードする核酸配列は、分離転写ユニットから発現する。
ここで使用される「融合促進ポリペプチド」という用語は、標的水疱又は細胞を被覆している脂質二重層を有する水疱性細胞膜の水疱性細胞膜促進融合の表面で発現する任意のタンパク質(又はその融合促進ポリペプチド断片)を意味する。他の実施形態では、融合促進ポリペプチドは、(1)脂質エンベロープを有することを翌朝とするウイルスに由来する。(2)遺伝子改変ウイルス内で異種タンパク質として発現したとき、ウイルス・エンベロープの融合を促進し、関係する細胞膜間で、完全な二重層融合をもたらす。本発明に係る融合促進ポリペプチドは、非特異的に、野生型ウイルス接着タンパク質以外のウイルス・エンベロープへのタンパク質の接着を促進することができる。この融合促進ポリペプチドは、ある実施形態では、文献ではパラミクソウイルスのSV5株の「Fタンパク質」として知られている、ウイルス・エンベロープ融合タンパク質である。ここでは、特別に、より一般的な「融合タンパク質」よりも「Fタンパク質」としてよぶ。
Fタンパク質由来のシミアン・ウイルス5(SV5)に加えて、融合促進ポリペプチドは、HIVエンベロープ・タンパク質から選択することができる。同様に、VSV GNJ(ニュージャージー抗原型)又はVSV GInd(インディアナ抗原型)タンパク質から選択することができる。また、上記した融合ペプチドと相同である少なくとも70%アミノ酸配列を示すポリペプチドが含まれる。同様に、組み換え型ラブドウイルスと融合した標的細胞の刺激、及び本発明に係る核酸配列の発現に関して重要な機能相同を示すポリペプチドが含まれる。細胞膜形成を刺激する任意のタンパク質又はその断片の使用は、そのようなタンパク質(原核生物又は真核細胞に由来する)及びそれらの断片の相同物のように、本発明の範囲に含まれると見なされることを理解されたい。また、当該技術分野で公知のタンパク質創製法により生成されたタンパク質及びポリペプチドも想定され、本発明の更なる実施形態を示す。
ある実施形態では、組み換え型ラブドウイルスは、少なくとも1つの異種の(即ち、他の非ラブドウイルス)タンパク質において発現する。
他の実施形態では、本発明の組み換え型ラブドウイルスは、調節因子をさらに含む。
ある実施形態では、遺伝子生成物(ここでは、調節因子と呼ぶ。例えば、プロモーター遺伝子又はエンハンサー配列)の発現を規制するヌクレオチド配列は、前記遺伝子生成物が発現する細胞の種類に基づいて選択される。他の実施形態では、本発明に係る組み換え型ラブドウイルスに感染する細胞内での、前記遺伝子生成物の望ましいレベルでの発現に基づいて選択される。本発明のこの見地によれば、ここで説明したように、遺伝子生成物は異種タンパク質に相当する。したがって、ある実施形態では、そのような異種タンパク質の調整された発現が実現される。
例えば、プロモーター遺伝子と結合した遺伝子の細胞型特異的発現を与えることで知られているプロモーター遺伝子を使用することができる。筋芽細胞遺伝子の発現に特異的なプロモーター遺伝子は、遺伝子生成物の筋肉特異性発現を与えることに関与する遺伝子に結合することができる。従来知られている筋肉特異性調整因子は、ジストロフィン遺伝子の上流領域を含む(Klatnut et al., (1989) Mol. Cell Biol.9: 2396)、クレアチン・キナーゼ(Buskin and Hauschka, (1989) Mol. Cell Biol. 9: 2627)、及びトロポニン遺伝子(Mar and Ordahl, (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85:6404)。
従来、他の細胞型に対して特異的な調整因子(例えば、肝臓特異的発現のためのアルブミン・エンハンサー、膵島細胞特異的発現のためのインスリン調整因子、神経細胞特異的調整因子(神経ジストロフィン、神経エノラーゼ、及びA4アミロイド、プロモーター遺伝子を含む))が知られている。他の実施形態では、様々な細胞型で遺伝子の発現を直接的に構成する調整因子(例えば、ウイルス調整因子)を使用することができる。遺伝子発現を促進するのに一般に使用されるウイルス・プロモーター遺伝子は、ポリオーマ・ウイルス、アデノウイルス2、サイトメガロ・ウイルス及びシミアン・ウイルス40、及びレトロウイルスLTRである。
他の実施形態では、それに結合した遺伝子の誘導発現をもたらす調整因子を使用することもできる。誘導調整因子(例えば、誘導プロモーター)の使用は、細胞内での遺伝子生成物の生成の変調をもたらす。真核細胞に用いる潜在的に使用可能な誘導調整システムの例としては、ホルモン制御因子(例えば、Mader, S. and White, J.H. (1993) Proc. NatI. Acad. Sci. USA 90:5603-5607参照)、合成リガンド調整因子(例えば、Spencer, D.M. et al (1993) Science 262:1019-1024参照)、及び電離放射線調整因子(例えば、Manome, Y. Et al. (1993) Biochemistry 32:10607-10613; Datta, R. et, al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:1014-10153参照)がある。本発明に使用するために、更なる組織特異性又は誘導調整因子が開発されるであろう。
ある実施形態では、異種タンパク質は治療に使用することができる。「治療用」という用語は、必要としている患者における異種タンパク質の発現が有益な効果を提供することを意味する。ある場合には、タンパク質は、患者内で、発現の欠損又はそのようなタンパク質の適切な欠損を元に戻す点において治療的である。いくつかの実施形態は、内生のヌル変異(null mutant)が外来タンパク質の発現により補償される場合などの、タンパク質の発現が欠けている場合を含んでいる。他の実施形態では、内生タンパク質は変異し、異種の機能的なタンパク質の発現により補償を行う、非機能的なタンパク質を生成する。他の実施形態では、異種タンパク質の発現は低内生レベルに添加され、所定のタンパク質の累積的に発現を促進する。
ある実施形態では、発現した治療用タンパク質は、インターフェロン又はインターロイキン、或いはそれらのレセプターなどのサイトカインを含む。サイトカインの発現の欠失は病気に対する感受性に関係し、多くの感染に対する抵抗をもたらすために、発現を促進する。サイトカインの発現パターンは、有益な効果(例えば、感染又は自己免疫疾患におけるTh1型の発現パターン又はTh2型パターンに対する免疫反応のバイアス)を得るために変更される。変更された発現パターンは、ホストに対する有益性を示す。
サイトカインの大きい定量化をもたらす単鎖IL−12Fを発現及び分泌させるために、糖タンパク質(G)が削除された組み換え型VSVが遺伝子組み替えされた(実施例9)。VSVΔG−IL−12Fとリステリア抗原の同時投与は、強力なリステリア特異的T細胞介在性反応をもたらす。それは、LMAg+rIL−12の免疫を持つマウスに見られるのと同様の、超寿命の保護用のリステリア免疫を与える(実施例10及び11)。
ある実施形態は、サイトカインを発現させるために遺伝子組み替えされた、糖タンパク質(G)が削除された組み換え型ラブドウイルスを提供する。前記サイトカインは、インターロイキン又はインターフェロン又は化学誘引物質である。ある実施形態では、インターロイキン2、インターロイキン4、インターロイキン12、又はインターフェロン−γである。
他の実施形態では、サイトカインを発現させるために遺伝子組み替えされた組み換え型ラブドウイルスは、マトリクス・タンパク質が変異又は削除されている。他の実施形態では、サイトカインを発現させるための組み換え型ラブドウイルスは、糖タンパク質(G)の細胞膜近接外部領域が変異又は削除されている。本発明の組み換え型ラブドウイルスはどれも、サイトカインを発現させるためにさらに遺伝子組み替えすることができ、それは本発明の一部とみなされることを理解されたい。
他の実施形態では、発現した治療用タンパク質は、グリコーゲン貯蔵又は破壊に関与する酵素を含む。他の実施形態では、治療用タンパク質は、輸送体を含む。輸送体としては、イオン輸送体(例えば、CFTR)、ブドウ糖輸送担体、又は欠乏や不適切な発現が様々な病気をもたらす他の輸送体などの輸送体が挙げられる。
他の実施形態では、発現した治療用タンパク質は、細胞内のシグナツ伝達に関与するレセプターを含む。ある実施例は、上記したように、サイトカイン・レセプター、レプチン・レセプター、転移レセプター、又はその発現が欠失した任意のレセプターを含む。或いは、変化した発現は、不適切な又は不十分な細胞内のシグナツ伝達をもたらす。
他の実施形態では、発現した治療用タンパク質は、その発現が細胞内の癌の進行に関係する諸現象を変える、癌抑制遺伝子又はプロアポトーシス遺伝子を含む。例えば、初期腫瘍の諸現象を実証するp53が細胞内で発現し、それによって癌の進行を抑制する。
他の実施形態では、発現した治療用タンパク質は、自然又は非自然のインスリン、アミラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、グリコシル、トランスフェラーゼ、トリプシノゲン、キモトリプシノゲン、カルボキシペプチダーゼ、ホルモン、リボヌクレアーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、トリアシルグリセロール・リパーゼ、ホスホリパーゼA2、エラスターゼ、アミラーゼ、血液凝固因子、UDPグルクロニル・トランスフェラーゼ、オルニチン・トランスカルバモイラーゼ、シトクロムp450酵素、アデノシン・デアミナーゼ、セラム胸腺因子、胸腺液性因子、サイモポイエチン、成長ホルモン、ソマトメジン、共刺激因子、抗体、コロニー刺激因子、エリスロポエチン、上皮細胞増殖因子、肝臓赤血球生成因子(hepatopoietin)、肝細胞成長因子、インターロイキン、インターフェロン、ネガティブ成長因子、線維芽細胞、βファミリーの形質転換成長因子、ガストリン、セクレチン、コレシストキニン、ソマトスタチン、セロトニン、P物質、及び転写因子から成る群より選択される。
他の実施形態では、本発明に係る組み換え型ラブドウイルスは、標識ポリペプチドをエンコードする異種核酸の挿入をさらに含む。標識ポリペプチドは、例えば、緑色発光タンパク質(green fluorescent protein: GFP)、分泌されたアルカリ・ホスフォターゼ(secreted alkaline phosphatase: SEAP)、DsRed発光タンパク質(赤色発光タンパク質)、βガラクトシダーゼ、発光酵素、又当業者に周知の他のレポーター・タンパク質である。
特定の細胞に対して特異的に標的にすることが望ましい。他の実施形態では、治療用タンパク質の発現に加えて、本発明の組み換え型ラブドウイルスが特定部位(標的タンパク質の発現が発生する部位)を直接的に標的とするように、標的タンパク質が発現する。
ある実施形態では、ここで説明した腫瘍細胞を標的とする。組み換え型ラブドウイルスは、例えば、表面マーカーerbB+を発現する。そのようなerbB+細胞は、組み換え型ラブドウイルスが最終的に融合する集団であるので、ここでは、「標的細胞」と呼ばれる。標的細胞は、多くの場合、隣接する細胞(腫瘍細胞由来せず、erbBを発現しない)とは対照的に、組み換え型ラブドウイルスを細胞に導くのに使用される表面マーカー(ここでは、「標的抗原」と呼ぶ)を発現する。
標的抗原はレセプターであってもよい。そのため、「抗原レセプター」は、前述したようにラブドウイルス・エンベロープ又は細胞表面上に表示されるタンパク質を意味する「接着タンパク質」とも呼ばれ、標的細胞の細胞膜上で、ウイルス粒子/改質された細胞の対応するレセプターへの接着に関与する。例えば、パラミクソウイルスSV5の野生型抗原レセプターは、ホスト細胞の細胞膜上でシアル酸と結合する、ウイルス性のHNタンパク質である。
ここで使われる「接着」という用語は、抗原レセプター(ウイルス粒子の脂質エンベロープ上又は遺伝子組み替え細胞の表面で発現する)の作用を意味し、感染中は標的細胞表面の「レセプター」を認識し結合する。当業者は、接着させる細胞膜と標的細胞のプラズマ細胞膜との融合前に、接着が生じることを知っている。
他の実施形態では、本発明の組み換え型ラブドウイルスは、細胞表面で発現したウイルスタンパク質と結合するアンチレセプターを介して、組み換え型ラブドウイルスをウイルス感染細胞に導くアンチレセプターを発現する。この場合、組み換え型ラブドウイルスのウイルス感染細胞との融合を促進するアンチレセプターは、ウイルス発現表面タンパク質を認識し結合する。例えば、HIV−1感染細胞はgp120のようなHIV付随タンパク質を発現する。そのため、組み換え型ラブドウイルスによるCD4の発現は、CD4−gp120相互作用を介して、HIV感染細胞のターゲティングを促進する。
アンチレセプター・タンパク質又はそのポリペプチド断片は、次のウイルス・ファミリーと感染した細胞との融合を増進することを目的とする。アレナウイルス科、ブニヤウイルス科、コロナウイルス科、フィロウイルス科、フラビウイルス科、ヘルペスウイルス科、ヘパドナウイルス科、オルトミクソウイルス科、パラミクソウイルス科、ポックスウイルス科、レトロウイルス科、及びラブドウイルス科。さらなるウイルス標的因子は次のグループから発生することができる。アフリカ豚コレラウイルス、ボーマ病ウイルス、肝炎ウイルス、HIV−1、ヒトTリンパ球ウイルス1型(HTLV−1)、HTLV−2、15レンチウイルス、エプスタイン−バー・ウイルス、パピローマ・ウイルス、単純ヘルペスウイルス、肝炎B、肝炎C。
他の実施形態では、ウイルス感染細胞のターゲティングは、感染細胞との融合促進を強めるために、組み換え型ラブドウイルス/組み換え型ラブドウイルス・エンベロープさらなるウイルス・コレセプターの発現により実現される。ある実施形態では、例えばCXCR4又はCXCR5などのHIVコレセプターをさらに発現させるために、組み換え型ラブドウイルス/組み換え型ウイルスは遺伝子組み替えされる。
細胞内感染中に発現する細菌タンパク質は、本発明の組み換え型ラブドウイルス/組み換え型ウイルスによる治療行為の目的とすることができる。細胞内細菌は、数ある中でも、赤痢菌、サルモネラ菌、レジオネラ菌、連鎖球菌、マイコバクテリウム、フランシセラ、クラミジアがある(G. L. Mandell, "Introduction to Bacterial Disease" IN CECIL TEXT1300K OF MEDICINE, (W.B. Saunders Co., 1996) 1556-7を参照)。これらのバクテリアは、組み換え型ラブドウイルス/組み換え型ウイルスが付着する感染細胞の表面で、バクテリア・タンパク質を発現すると期待されている。
他の実施形態では、他の実施形態では、ターゲティング部分は、強力な抗原提示細胞などの、感染細胞上で上方に調節するインテグリン又はMHCのクラスII分子を含む。細胞内に存在する寄生性因子のタンパク質は、組み換え型ラブドウイルス/組み換え型ウイルスによる感染を意図するターゲットである。細胞内の寄生性因子は、例えば、原生動物を含む。細胞に感染させる原生動物は、プラスモディウム属の規制因子(例えば、熱帯熱マラリア原虫、三日熱マラリア原虫、卵形マラリア原虫、及び四日熱マラリア原虫など)、トキソプラズマ、リーシュマニア、及びクリプトスポリジウムを含む。
病気及び/又は異常細胞は、前述した方法により、本発明の組み換え型ラブドウイルスを使用してターゲティングされる。病気及び/又は異常細胞は、感染細胞、腫瘍細胞、前癌細胞、炎症性病巣、良性腫瘍又はポリープ、カフェオレ斑症、白板斑症、及び他の皮膚の斑を含む。
本発明の組み換え型ラブドウイルスは、その同属のレセプターを認識し結合するアンチレセプター、又は病気及び/又は異常細胞上で発現するリガンドを使用してターゲティングする。
他の実施形態では、病気及び/又は異常細胞は、組み換え型ラブドウイルスの影響を非常に受けやすく、侵入及び細胞溶解をもたらす。ある実施形態では、非細胞変性組み換え型ラブドウイルスは、病気及び/又は異常細胞だけに細胞変性である。ある実施形態では、非細胞変性組み換え型ラブドウイルスは、異種タンパク質を発現するために、さらに遺伝子組み替えされる。他の実施形態では、異種タンパク質は、上記に記載した実施形態を全て含む。他の実施形態では、非細胞変性組み換え型ラブドウイルスは、ラブドウイルス糖タンパク質又はその断片(Gの細胞膜近接外部領域など)の発現において、同時に起こる欠失の合併などのさらなる減衰を含む、上記に記載した実施形態を全て含む。
同様に、ラブドウイルス・ゲノムを発現させるために、細胞は周知の手法により遺伝子組み替えされる。ある実施形態では、欠失又は変異したマトリクス・タンパク質(M)を有する核酸ベクターは、Gの細胞膜近接外部領域にさらに欠失を有する。また、他の実施形態では、Gが削除されている。
他の実施形態では、本発明の組み換え型ラブドウイルスは、それらの接着タンパク質として、抗体又はそのポリペプチド断片、二元機能抗体、Fab、Fe、Fv、又は単鎖Fv(scFv)を発現させるために、遺伝子操作される。そのような抗体断片は、同定するために作成され、特異的レセプターと結合する。これらの抗体は、ヒト化、ヒト、又はキメラ抗体である(詳細については、S. L. Morrison "Antibody Molecules, Genetic Engineering of," in MOLECULAR BIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY: A COMPREHENSIVE DESK REFERENCE 1995、S. D. Gillies et aL, (1990) Hum. Antibod. Hybridomas 1(1). 47-54、E. HARLOW AND D. LANE, ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL (1988) Cold Spring Harbor Press, NYを参照されたい)。ワクシニア・ウイルスを使用した、ウイルス表面の機能的単鎖抗体の発現が報告されている(M.C. Gah-niche et al., (1997) J. Gen. Virol. 78: 3019-3027)。融合促進タンパク質、抗体及び抗体断片を発現する組み換え型ラブドウイルスを作成するのに、同様の方法を使用することができる。細胞表面で発現する腫瘍関連抗原(tumor-associated antigen: TAA)をターゲティングするモノクローナル抗体をエンコードしている遺伝子は単離される。そして、望ましい組み換え型ラブドウイルスを作成するのに、又は適切な発現ベクターにサブクローニングするのに使用される。そして、当業者に周知の方法により、細胞表面で発現する。
抗体の例としては、悪性の前立腺被覆組織と反応し、良性の前立腺組織とは反応しない抗体(例えば、ATCC No. HB-9119; ATCC HB-9120; 及びATCC No. HB-1 1430)や、悪性の乳癌細胞と反応し、正常の乳房組織とは反応しない抗体(例えば、TCC No. HB-8691; ATCC No. HB-10807; 及び21BB-108011)が挙げられる。病気の組織と反応し、正常な組織とは反応しない他の抗体又はその断片は、当業者には明らかである。
他の実施形態では、本発明の組み換え型ラブドウイルスは、少なくとも一つの免疫原性タンパク質を発現する。
ここで使用される「免疫原性」という単語は、免疫反応を誘導する能力を意味する。細胞媒介性の免疫反応、又は古典的には「体液性(体液性)」と呼ばれた免疫反応は、抗体を介した反応に属する。又は、両方は、本発明の組み換え型ラブドウイルスにより誘導される。
ある実施形態では、免疫原性タンパク質又はペプチドをさらにエンコードしている本発明の組み換え型ラブドウイルスは、本発明の方法として、ワクチンの目的で使用される。
一例では、VSVの組み換え型ラブドウイルスは、ワクチン・ベクターの有望な候補である。VSVは、5つの遺伝子だけを含んでいる単純なゲノムを有する。免疫調節タンパク質と同様に、異種抗原性タンパク質をエンコードする逆遺伝学の出現で、組み換え型ラブドウイルスの作成が可能になった。VSVゲノムは、ウイルスの複製又は集合する能力に影響を与えることなく、比較的多量の挿入に適合する。VSVの棒状形態に起因して、リボースヌクレオカプシド・コア、及びウイルス粒子自身は拡張可能である。例えば、ゲノムにさらなる遺伝子が追加されたように、前記粒子は単純に長くなる(18)。第3に、多数のウイルス通過後、外来遺伝子を長期に発現させるために、VSVに挿入される外来遺伝子内での変異の蓄積は十分に小さい(19)。第4に、VSVはセグメント化されていない負鎖RNAゲノムと、細胞質内でのみ生じRNA中間物を含むウイルス複製とを有していても、ウイルスゲノムがホスト細胞DNAと結合できる可能性はない。そのため、他のDNAベース・ベクターと考えられる、挿入突然変異の恐れは取り除かれる。加えて、VSVは様々な種類の細胞型と増殖的に感染する。また、通常の複製サイクル中に、ホスト細胞タンパク質合成を効率的に停止する能力を有する(18−20)。動物では、VSV感染は、ラブドウイルスによってエンコードされたタンパク質に対して特異的な強い免疫応答を誘導する。また、ヒトのVSV感染は、ほぼ世界中でまれである(22)。そのため、既存の免疫性によるVSVベース・ワクチンへの干渉はめったに起こらない。
非細胞変性ラブドウイルス、及び細胞間拡散能力が減少したラブドウイルスは、ワクチン送達ベクターして使用する魅力的な候補である。後者のラブドウイルスは、例えば、隣接細胞に感染しない、感染細胞から放出される後代ビリオンを作成する。
本発明のラブドウイルスMタンパク質及びGタンパク質又はその断片、及び/又はGの細胞膜近接外部領域に変異又は欠失を有する組み換え型ラブドウイルスは、ウイルスを弱める働きをする。変異又は欠失を有するラブドウイルスの結合は、そのため、例えば、安全因子が増したウイルス・ベクターを作成する。また、ある実施形態では、遺伝子伝達担体又はワクチンとしてベクターを利用する用途で、免疫無防備状態の単体に使用される。
他の実施形態では、本発明の免疫原性タンパク質又はペプチドをさらにエンコードする組み換え型ラブドウイルスは、病気の進行を中断させる手段として、病気の重症度を減少させる治療用に使用される。
本発明の構造体に、さらなる減弱分子を組み入れることが望ましい。他の実施形態では、本発明が意図する組み換え型ラブドウイルスは、ここに記載した生成物を含む細胞内で、細胞を死に至らしめる自殺遺伝子を発現する。
ここで使用される「自殺遺伝子」という用語は、それ自身により又は他の化合物の存在下で細胞を死に至らしめる生成物をコードする核酸を意味する。自殺遺伝子の代表例は、単純ヘルペスウイルスのチミジン・キナーゼをコードするものである。さらなる例は、水痘ヘルペスウイルスのチミジン・キナーゼ、及び5−フルオロウラシルを高細胞傷害性化合物に変化させることができるバクテリア遺伝子シトシン・デアミナーゼである。
自殺遺伝子は、プロドラッグを細胞傷害性の生成物に変化させることにより、細胞毒性を作り出す。ここで使用される「プロドラッグ」という用語は、細胞にとって毒性の生産物に変化させることができる任意の化合物を意味する。そのようなプロドラッグの代表的なものは、HSV−チミジン・キナーゼにより、インビボで毒性化合物に変化するガンシクロビルである。その後、ガンシクロビル派生物は、細胞にとって毒性を持つ。プロドラッグの他の代表例としては、アシクロビル、FIAU[1-(2-Deoxy-2-fluoro-β-D-arabinofuranosyl)-5-iodouracil]、VZV−TK用の6−メトキシプリン・アラビノシド、及びシトシン・デアミナーゼ用のフルオロシトシンがある。
ある実施形態では、追加された安全因子は、本発明の構成物内への自殺遺伝子の組み込みにより提供される。他の実施形態では、細胞内への自殺遺伝子の組み込みは、標的細胞の溶解が望ましい場合に、治療方法を提供する目標とされた細胞毒性をもたらす。そのような結合は、他の実施形態では、抗癌用途に望ましい。その場合、癌細胞が本発明の組み換え型ラブドウイルスによって特異的にターゲティングされ、特異的に溶解する癌細胞は、自殺遺伝子の組み込みにより影響を受ける。
他の実施形態では、「TH2」反応が進んだ病気において、組み換え体が「Th1」反応を誘発する免疫原性タンパク質又はポリペプチドをさらに発現する、本発明の組み換え型ラブドウイルスは、「Th1」反応と呼ばれる発達が患者に有用であるとき使用される。免疫原性タンパク質、又はポリペプチドの導入は、Th1型反応への転換をもたらす。
ここで使用される「Th2型反応」という用語は、頑強な細胞性免疫の発達を支持する適応的免疫反応の一部としてヘルパーT細胞によって誘発されるサイトカイン発現のパターンを意味する。一般的なTh1反応は、例えば、患者の蠕虫感染において有益である。一般的なTh2反応は、例えば、インターロイキン4又はインターロイキン10の生成により認識される。
ここで使用される「Th1型反応」という用語は、頑強な細胞性免疫の発達を支持する適応的免疫反応の一部としてヘルパーT細胞によって誘発されるサイトカイン発現のパターンを意味する。一般的なTh1反応は、例えば、患者の細胞間感染において有益である。一般的なTh1反応は、例えば、インターロイキン2又はインターフェロン・ガンマの生成により認識される。
他の実施形態では、組み換え型ウイルス/ラブドウイルス、核酸、ベクター、又は本発明の組成物を介する免疫原性タンパク質又はポリペプチドの導入が、より有益なサイトカイン特性への転換を提供するという、患者により役立つ結果をTh2型反応が提供したとき、Th1型反応が発達するという反対のことが生じる。ある例では、Mハンセン菌からTh1サイトカイン転換を刺激する抗原を発現する組み換え型ウイルス/ラブドウイルス、核酸、ベクター、又は本発明の組成物が、らい腫らいとは対称的に、より重症型のTh2型反応と関係する病気である結核様らいをもたらすハンセン病で生じる。
本発明の、病気予防、及び/又は病気改善、及び/又は病気の進行を変更するために、患者に免疫性を与える目的の免疫原性タンパク質を発現する組み換え型ラブドウイルスの任意の使用は、本発明の一部と見なされることを理解されたい。
防御免疫反応を刺激する感染性ウイルスの好ましい例としては、次のものがある。レトロウイルス科(例えばHIV−1(HTLV−III、LAV或いはHTLV−IR/LAV、又はHIV−III、及び他の単離体(例えばHIV−LP)などのヒト免疫不全ウイルス)、ピコルナ・ウイルス科(例えば、ポリオウイルス、A型肝炎ウイルス、エンテロ・ウイルス、ヒト・コクサッキー・ウイルス、ライノウイルス、エコーウイルス)、カルシウイルス科(例えば、胃腸炎を引き起こす菌株)、トガウイルス科(例えば、ウマ脳炎ウイルス、風疹ウイルス)、フラビウイルス科(例えば、デングウイルス、脳炎ウイルス、黄熱病ウイルス)、コロナウイルス科(例えば、コロナウイルス)、ラブドウイルス科(例えば、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス)、フィロウイルス科(例えば、エボラウイルス)、パラミクソウイルス科(例えば、パラインフルエンザ・ウイルス、ムンプス・ウイルス、麻疹ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス)、オルトミクソウイルス科(例えば、インフルエンザ・ウイルス)、ブンガウイルス科(ハンターンウイルス、ブンガウイルス、フレボ・ウイルス、及びナイロウイルス)、アレナウイルス科(出血熱ウイルス)、レオウイルス科(レオウイルス、オルビウイルス、ロタウイルス)、ビルナ・ウイルス科、ヘパドナ・ウイルス科(B型肝炎ウイルス)、パルボウイルス科(パルボウイルス)、パポバウイルス科(パピローマ・ウイルス、ポリオーマ・ウイルス)、アデノウイルス科(アデノウイルス)、ヘルペス・ウイルス科(単純ヘルペス・ウイルス(HSV)1及び2、水疱瘡ウイルス、サイトメガロ・ウイルス(CMV)、ヘルペス・ウイルス)、ポックスウイルス科(痘瘡ウイルス、痘疹ウイルス、水痘ウイルス)、イリドウイルス科(アフリカ豚コレラウイルス)、及び分類されていないウイルス(例えば、海綿状脳症の原因菌、デルタ肝炎の原因菌(B型肝炎ウイルスの欠陥付随体と考えられている)、非A、非B型肝炎ウイルスの原因菌(クラス1=内面的に伝染、クラス2=非経口的に伝染(すなわちC型肝炎))、ノーウォーク及び関連ウイルス、及びアストロウイルス。
防御免疫反応を刺激する感染性細菌の好ましい例としては、次のものがある。ヘリコバクター・ピロリ、ライム病ボレリア、レジオネラ・ニューモフィラ、マイコバクテリア属sp(例えば、M.結核、M.結核菌、M.細胞内、M. kansaii、M. gordonae)、黄色ブドウ球菌、淋菌、髄膜炎菌、リステリア菌、化膿連鎖球菌(A群ストレプトコッカス)、ストレプトコッカス・アガラクティエ(B群ストレプトコッカス)、ストレプトコッカス(ビリダンス群)、大便連鎖球菌、ストレプトコッカス・ボビス、ストレプトコッカス(嫌気性sp)、肺炎連鎖球菌、病原カンピロバクターsp、エンテロコッカス属sp、クラミジアsp、インフルエンザ菌、炭疽菌、ジフテリア菌、コリネバクテリウム属sp、ブタ丹毒菌、ウェルシュ菌、破傷風菌、アイロゲネス腸内菌、肺炎桿菌、Pasturella multocida、バクテロイデス属sp、フゾバクテリウム属菌、モニリフォルミス連鎖杆菌、梅毒トレポネーマ、トレポネーマ‐ペルテニュ、レプトスピラ属、イスラエル放線菌、及び野兎病菌。
防御免疫反応を刺激する菌類の好ましい例としては、次のものがある。クリプトコックス・ネオフォルマンス、ヒストプラスマ・カプスラーツム、コクシジオイデス・イミティス、ブラストミセス・デルマチチジス、クラミジア・トラコマチス、カンジダ・アルビカンス。他の感染性微生物(すなわち原生生物)としては、プラスモジウム属sp、リーシュマニア属sp、住血吸虫属sp、及びトキソプラズマ属spがある。
他の実施形態では、本発明の免疫原性タンパク質を発現する組み換え型ラブドウイルスは、さらなる免疫調節性タンパク質を発現する。
有用な免疫調節性タンパク質の例としては、サイトカイン、ケモカイン、補体成分、免疫系アクセサリー、接着分子、及びそれらのヒト又はヒト以外の動物に特異的なレセプターがある。また、有用な例としては、GM−CSF、IL−2、IL−12、OX40、OX40L(gp34)、lymphotactin、CD40、及びCD40Lがある。さらに、有用な例としては、インターロイキン1〜15、インターフェロン・アルファ、ベータ又はガンマ、腫瘍壊死因子、顆粒球マクロファージ・コロニー刺激因子(GM−CSF)、マクロファージ・コロニー刺激因子(M−CSF)、顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF)、好中球活性化タンパク(NAP)のようなケモカイン、マクロファージ遊走因子及び活性因子(MCAF)、RANTES、マクロファージ炎症性ペプチドMIP−la及びMIP−lb、補体成分及びそれらのレセプター、又はアクセサリー分子(B7.1、B7.2、TRAP、ICAM−1・2・3、及びサイトカイン・レセプター。OX40、及びOX40リガンド(gp34)は、免疫調節タンパク質の例にとって、さらに有用である。
他の実施形態では、免疫調節タンパク質は、ヒト又はヒト以外の動物に特異的であり、天然タンパク質と同程度の結合活性を有する細胞外ドメイン及び/又は他の断片を含んでいる。免疫調節タンパク質は、他の実施形態では記載した実施形態の突然変異型を含む、又は免疫グロブリン重鎖遺伝子定常領域などのポリペプチド配列を有する融合タンパク質を含む。複合的な免疫調節タンパク質は、単体の構成物、及び本発明のさらなる実施形態に表すものに組み込まれる。
本発明の組み換え型ラブドウイルスは複合的な免疫調節タンパク質を発現することを理解されたい。ある実施形態では、該免疫調節タンパク質は、同一又は近縁種に由来する。
多重抗原のワクチン結合は、免疫原性を強めることが知られている。
多重抗原のワクチン結合は、免疫原性を強めることが知られている。
本発明の免疫原性タンパク質又はペプチド断片を発現する組み換え型ラブドウイルスは、構成物により刺激される様々な種類の免疫応答を引き起こす。前記免疫応答としては、非相同的に発現したタンパク質又はペプチド、バイスタンダー効果によって免疫原性を得る他の抗原、ホスト抗原などに対する応答がある。本発明の方法は、患者の細菌性、ウイルス性、寄生性、又は他の病態(腫瘍を含む)を予防又は治療するのに使用できることが想定される。
ワクチンの組み合わせは、免疫原性の促進及び保護を提供することが知られている。そして、他の実施形態では、免疫原性タンパク質又はペプチドは、異なった種類から由来する。
他の実施形態では、本発明は、マトリクス・タンパク質(M)内に欠損又は変異を有するラブドウイルス・ゲノム又はその断片の核酸を含んでいる組み換え型ウイルスを提供する。組み換え型ウイルス内のラブドウイルス・ゲノム又はその断片、及び欠損又は変異したマトリクス・タンパク質は、ここで記載したすべての実施形態を含む。
他の実施形態では、本発明は、ラブドウイルスMタンパク質の変異に加えて、糖タンパク質(G)内に欠損又は変異を有するラブドウイルス・ゲノム又はその断片の核酸を含んでいる組み換え型ウイルスを提供する。他の実施形態では、本発明は、糖タンパク質(G)の細胞膜近接外部領域をエンコードする領域内に欠損又は変異を有するラブドウイルス・ゲノムの核酸を含んでいる組み換え型ウイルスを提供する。他の実施形態では、前記組み換え型ウイルスは、ラブドウイルスMタンパク質の変異に加えて、糖タンパク質(G)の細胞膜近接外部領域をエンコードする領域内に欠損又は変異を有する。ここで説明した組み換え型ウイルスは、本発明の組み換え型ラブドウイルスに関して記載した全ての実施形態を含む。
他の実施形態では、本発明は、マトリクス・タンパク質(M)をエンコードする遺伝子に欠失又は変異を有する非細胞変性ラブドウイルス・ゲノムをエンコードするポリヌクレオチド配列を含んでいる単離した核酸分子を提供する。単離した核酸分子は、異種タンパク質の発現、Gステムポリペプチド及び融合促進ポリペプチドの発現、欠失を有する糖タンパク質(G)の発現及び細胞膜近接外部領域に欠失を有する糖タンパク質の発現をエンコードする配列を含んでいる(それらは、それぞれ本発明のさらなる実施形態に相当する)、ここで記載した全ての実施形態を含むことを理解されたい。他の実施形態では、本発明は、ここで説明した、単離した核酸分子を含んでいるベクターを提供する。
他の実施形態では、本発明は、糖タンパク質(G)の細胞膜近接外部領域をエンコードする遺伝子に欠失又は変異を有するラブドウイルス・ゲノムをエンコードするポリヌクレオチド配列を含んでいる単離した核酸分子を提供する。本発明のこの態様は、単離した核酸分子は、異種タンパク質の発現、融合促進ポリペプチドの発現、及び欠失を有するマトリクス・タンパク質の発現をエンコードする配列を含んでいる(それらは、それぞれ本発明のさらなる実施形態に相当する)、ここで記載した全ての実施形態を含む。他の実施形態では、本発明は、そのような単離した核酸分子を含んでいるベクターを提供する。
本明細書において、「核酸」分子という用語は、限定するものではないが、原核生物の配列、真核生物のmRNA、原核生物のmRNAからのcDNA、真核生物(例えば哺乳類)DNAからのゲノムDNA配列、及び合成DNA配列を含み得る。またこの用語は、DNA及びRNAの公知の塩基類似体(base analogs)の任意のものを含む配列も指す。
本明細書で開示される核酸配列は、配列を細胞内に導入する所望の方法に応じて、特定のベクター内にサブクローニングすることができる。核酸断片が特定のベクター内にサブクローニングされると、それは組み替え型ベクターとなる。本発明における核酸構成物を生成するため、関心のある配列をエンコードするポリヌクレオチド断片を、哺乳類細胞の形質導入/形質転換及び形質導入された細胞内における組み替え生成物の発現を導くのに適した商業的に入手可能な発現ベクター系中に結合することができる。そのような商業的に入手可能なベクター系は、既存のプロモーター又はエンハンサー配列の置換、複製又は変異及び/又は、例えば付加的な選択マーカーをエンコードする配列やレポーターポリペプチドをエンコードする配列のような付加的なポリヌクレオチド配列の導入のために、広く用いられている組み替え技法を介して容易に改変できることを理解されたい。
本発明の細胞に上述の組み替え型ベクターを導入するための本分野で公知の方法は数多くあり、限定するものではないが、例えば、直接DNA取り込み法、及びウイルス、プラスミド、直鎖状DNA又はリポソーム媒介形質導入、レセプター媒介取り込み及びリン酸カルシウム媒介及びDEAEデキストラン媒介導入法を採用した磁気穿孔法(magnetoporation methods)、電気穿孔法(electroporation)、リポソーム媒介トランスフェクション、直接注入、及びレセプター媒介取り込みがある(より詳しくは、例えば、「Methods in Enzymology」 Vol. 1-317, Academic Press, Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel F.M. et al. (eds.) Greene Publishing Associates, (1989)、及び、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Sambrook et al. Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989)又は他の標準的な実験室マニュアルを参照されたい)。
細胞に核酸を導入する特定の発現ベクター系及び方法の効力は本分野で日常的に行われている標準的な方法で評価することができる。例えば、細胞に導入されたDNAをフィルターハイブリダイゼーション法(例えばサザンブロッティング)で検出することができ、導入されたDNAの転写によって生成されるRNAを、例えば、ノザンブロッティング、RNaseプロテクション法又は逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR)によって検出することができる。遺伝子生成物は適切なアッセイ、例えば、特定の抗体を用いるような産生タンパク質の免疫学的検出或いは酵素法のような遺伝子生成物の機能活性を検出する機能アッセイによって検出することができる。細胞によって発現されるべき関心のある遺伝子生成物が容易にアッセイできない場合、まず、使用されるベクター及び調節要素に関連したレポーター遺伝子を用いて発現系の最適化を行うことができる。レポーター遺伝子は、容易に検出可能であり従って系の効力の評価に用いることが可能な遺伝子生成物をエンコードする。本分野で用いられている標準的なレポーター遺伝子には、β−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコール・アセチル・転移酵素、発光酵素及びヒト成長ホルモン、又は本明細書に列挙されるマーカータンパク質の任意のものをエンコードする遺伝子が含まれる。
別の実施形態では、更なる減弱(attenuation)手段として働き得る、ラブドウイルスMタンパク質において変異又は欠失を含むcDNAを含む、パッケージングシステムが構成される。
パッケージングシステムは、核酸をキャプシッドに包み、それをビリオン生成細胞から移送し、標的細胞へ送り、標的細胞内で導入遺伝子発現を促進することができるビリオンを生成するのに必要な遺伝情報のすべてを発現可能な形態で集合的に提供する複数のベクター、又は、単一のベクターからなる。しかしながら、パッケージングシステムはそれ自身をパッケージ化する、即ち、減弱する手段を提供する能力が実質的にあってはならない。なぜなら、標的細胞内に導入された後、ビリオンの生成が妨げられるからである。
別の実施形態では、本発明は、本明細書で開示される組み替え型ラブドウイルス、ウイルス、ベクター又は核酸を含む細胞を提供する。一実施形態では、細胞は原核細胞であり、別の実施形態では真核細胞である。組み替え型ラブドウイルス、ウイルス、ベクター及び/又は核酸に対し本明細書において挙げた各実施態様は、細胞中に組み込むことが可能であり、本発明の考えられる形態の一部を表し得ることを理解されたい。組み替え型ラブドウイルス粒子又はウイルス粒子も同様に本発明の追加的な実施態様であり、本明細書中に列挙した任意の置換(permutation)を含み得る。
このように、組み替え型ラブドウイルス及び/又は粒子を用意し、組み立て、単離することができる。一実施形態では、こうして用意された組み替え型ラブドウイルス及び/又は粒子は細胞変異性(cytopathic)でない。
別の実施形態では、ラブドウイルスMタンパク質における変異又は欠失は、高度に悪性の細胞においてのみ細胞変性効果を有するウイルスを生成する。そのようなラブドウイルス株の使用により、隣接する細胞に影響を与えることなく、特定の悪性細胞を選択的に溶解する手段を提供することができる。別の実施形態では、ラブドウイルスMタンパク質中への変異又は欠失の組み込みは、細胞障害性効果を高度に悪性の細胞のみに制限するため、ラブドウイルス・ゲノムを組み込んだ構成物を更に減弱する手段となる。
組み替え型ラブドウイルスの生成方法は、cDNA及びミニウイルス(Minivirus)又はヘルパー細胞株(Helper Cell Line)の使用を伴い得る。この場合、「ミニウイルス」と「ヘルパー細胞」(「ヘルパー細胞株」としても知られている)の両方とも、ラブドウイルス・タンパク質の遺伝子をエンコードするトランスフェクションされたDNAから産生されない、ラブドウイルスビリオンの組み上げのためのラブドウイルス・タンパク質のソースを提供する。
組み替え型ラブドウイルスの生成は、(1)cDNA単独、(2)様々な組み合わせでヘルパー細胞へトランスフェクションされたcDNA、或いは、(3)cDNAの細胞へのトランスフェクションを、さらに、感染性又は非感染性の組み替え型ラブドウイルスを生成するのに必要とされる残りの要素又は活性を途中で(in trans)提供するミニウイルスに感染させたもの、を用いることによって達成することができる。これらの方法(例えば、ミニウイルス、ヘルパー細胞株、又はcDNAトランスフェクションのみ)のいずれかを用いる場合、必要な最小限の要素は、(1)ゲノム(又はアンチゲノム)RNAをラブドウイルスNタンパク質によりキャプシッドに包む、及び(2)ゲノム又はアンチゲノム(複製中間体)RNA等価物を複製するためのシス作用性シグナルを含むRNA分子である。組み替え型ラブドウイルスの生成に必要なDNA:感染性のラブドウイルスの生成に「必要なcDNA」との用語は、変異したマトリックスタンパク質(M)を発現する感染性組み替え型ラブドウイルス粒子を生成するのに必要な核酸分子を意味する。
「ミニウイルス」なる用語は、N−P−M−L、N−P−L、N−P−G−L、M−G、Gのみ、Mのみ、或いは4以下のラブドウイルス遺伝子の任意の組み合わせをエンコードするポリシストロン性核酸分子を含む不完全なウイルス粒子を含むものである。この不完全なウイルス粒子は、ウイルス複製、即ち、ゲノムの完全なコピー作製を含むラブドウイルスのライフサイクルプロセスを行う能力がない。
ラブドウイルス・ゲノムのコピー作製(「ラブドウイルス複製」と呼ばれる)には、複製要素又はレプリコンの存在が必要である。レプリコンは、ここでは、最低限5′及び3′末端にラブドウイルスのリーダ配列及びトレーラ配列を含むRNAのストランドを意味する。ゲノム的意味では、リーダは3′末端にあり、トレーラは5′末端にある。これら2つの複製シグナルの間に位置するRNAは全て複製される。リーダ及びトレーラ領域は更に、ラブドウイルス転写及び複製の開始に必要なポリメラーゼ結合及びNタンパク質によるキャプシッド被覆のための最小限のシス作用性要素を含まなければならない。
いくつかの異なるVSV由来レプリコンが生成され、培養細胞中で長期間、異種の(非VSV)タンパク質を複製及び発現することが示されている。そのようなレプリコンは遺伝子治療ベクターの理想的な候補である。なぜなら、それらは細胞質においてのみ複製し、他の遺伝子治療ベクターのように標的細胞の染色体中に挿入突然変異生成を起こす心配がないからである。更に、感染した細胞において何らかの再結合を記録しようとする試みが広範囲になされているにも関わらず、VSVに基づくレプリコンが同種(又は異種)の再結合をし得るとの証拠はこれまでにない。再結合能力がないことは、レプリコンを含む細胞が他の負鎖RNAウイルスに感染され複製及び感染能力が再生される懸念をなくす。
本発明の組み替え型ラブドウイルスを生成するためには、上記した改変されたラブドウイルス・ゲノムをエンコードするcDNAを、採用されたベクターの発現を促進する条件下で細胞に接触させ、組み替え型ラブドウイルスの生成を可能にしなければならない。尚、上記した3つの方法の任意の一つで組み替え型ラブドウイルスの組み立てを可能とする細胞は、本発明の一部として含まれると理解されるべきである。
ウイルス生成のための細胞の培養:トランスフェクションされた細胞は通常少なくとも24時間、所望の温度(通常約37℃)でインキュベートされる。感染性ウイルス粒子の生成では、組み替え型ウイルスを含む上清が採取され、新しい細胞に移される。Gタンパク質を過渡的又は定常的なトランスフェクションを介して発現するこれらの新しい細胞は約48時間インキュベートされ、上清が集められる。
組み替え型ラブドウイルスの精製:「単離」又はラブドウイルスを「単離する」との用語は、非常に僅かの細胞の破片しか残らないようにウイルス粒子を培養及び精製するプロセスを意味する。一例は、ビリオンを含む上清を集め、それを濾過して(0.2μ小孔サイズ)(例えば、Millex-GS、Millipore)、ワクシニアウイルス及び細胞破片を除去することである。或いは、例えばショ糖勾配法のような勾配法を用いてビリオンを浄化することができる。その後組み替え型ラブドウイルスはペレット化され、所望の賦形剤又はキャリア中に再懸濁される。ウイルス力価は細胞への感染に用いられる上清の連続的な希釈によって特定することができ、ウイルス・タンパク質の発現後、感染された細胞は例えば抗M(23H12)又は抗N(10G4)タンパク質特異的抗体(L. Lefrancois et al., (1982) Virology 121: 157-67)を用いて間接的な免疫蛍光法により計量される。従って、組み替え型ラブドウイルス粒子もまた本発明の一部と考えられることを理解されたい。
別の実施形態では、本発明は、マトリクス・タンパク質(M)内に欠損又は変異を有するラブドウイルス・タンパク質をエンコードする遺伝子組み換え核酸を含む非細胞変異性の組み換え型ラブドウイルスを作成する方法であって、(A)適切な細胞内に、マトリクス・タンパク質(M)内に欠損又は変異を有するラブドウイルス・タンパク質をエンコードするポリヌクレオチド配列、標識ポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチド配列、及びラブドウイルスを複製するためのシス作用シグナルを有する3´及び5´のラブドウイルス・リーダ及びトレーラ領域を少なくとも含んでいるポリシストロン性cDNAを挿入するステップと、(B)前記細胞を、前記細胞の非細胞変性表現型のために選択された条件下で培養するステップと、(C)前記細胞を、前記組み換え型ラブドウイルスを作成可能な条件下で培養するステップと、(D)前記非細胞変性組み換え型ラブドウイルスを単離するステップとを含むことを特徴とする方法を提供する。
一実施形態では、この方法は、本発明の単離した組み換え型ラブドウイルスから、ゲノムRNAを単離するステップを有する。別の実施形態では、ゲノムRNAを単離するステップは、RT−PCRを介して行われる。別の実施形態では、本方法で用いられる細胞は、齧歯類、霊長類及びヒト細胞から成る群より選択される。
別の実施形態では、G糖タンパク質に変異又は欠損を有する非細胞変異性の組み替え型ラブドウイルスが、本明細書で開示される方法によって生成される。本発明のこの側面に基づくと、糖タンパク質(G)内に変異又は欠損を有するラブドウイルス・タンパク質をエンコードするポリヌクレオチド配列が細胞中に挿入される。一実施形態では、糖タンパク質中の変異又は欠損は糖タンパク質の細胞膜近接外部領域にある。
別の実施形態では、2番目のポリペプチドをエンコードする異種核酸配列を更に発現する非細胞変異性の組み替え型ラブドウイルスが、本明細書中に開示される方法によって生成される。本発明のこの側面に基づくと、少なくとも一つの異種ポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチド配列が細胞中に挿入される。一実施形態では、2番目のポリペプチドは治療用のポリペプチドである。別の実施形態では、2番目のポリペプチドは、免疫原性である。
別の実施形態では、本発明は、糖タンパク質(G)の細胞膜近接外部領域内に欠失又は変異を有するラブドウイルス・タンパク質をエンコードする遺伝子組み替え核酸を含む組み換え型ラブドウイルスを作成する方法であって、(A)適切な細胞内に、糖タンパク質(G)の細胞膜近接外部領域内に欠損又は変異を有するラブドウイルス・タンパク質をエンコードするポリヌクレオチド配列、標識ポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチド配列、及びラブドウイルスを複製するためのシス作用シグナルを有する3´及び5´のラブドウイルス・リーダ及びトレーラ領域を少なくとも含んでいるポリシストロン性cDNAを挿入するステップと、(B)前記細胞を、前記組み換え型ラブドウイルスの作成が可能な条件下で培養するステップと、(C)前記組み換え型ラブドウイルスを単離するステップとを含むことを特徴とする方法を提供する。
細胞(例えば、組織培養細胞又はバイオプシーのような組織サンプルからの細胞など)に感染させるため、単離された組み替え型ラブドウイルスは本分野で公知の技法を用いて細胞とともにインキュベートされる。組み替え型ラブドウイルスによる感染の検出は、緑色蛍光タンパク質(GFP)のような、レポーター遺伝子の存在を特定することで、又は、上記したように、間接的な免疫蛍光法によって特定されるウイルス・タンパク質の発現の評価を通じて行われ得る。
感染性のウイルス粒子を用意するため、まず、適切な細胞株(例えば、BHK細胞)にワクシニアウイルスvTF7−3(T.R. Fuerst et al., (1986) Proc.Natl Acad. Sci. USA 3. 8122-26)、又は、T7RNAポリメラーゼ又は他の適切なバクテリオファージ・ポリメラーゼ(例えばT3又はSP6ポリメラーゼ)をエンコードする等価物を感染させる(Usdin et al., (1993) BioTechniques14:222-224又はRodriguez et al. (1990) J. Virol. 64:4851-4857参照)。或いは、RNAポリメラーゼを提供する、ワクシニアを含まない系を用いることもできる。続いて、N、P、G及びLラブドウイルス・タンパク質をエンコードする遺伝子を含む個々のcDNAで細胞をトランスフェクションする。これらのcDNAは組み替え型ラブドウイルス粒子を組み立てるためのタンパク質を提供する。細胞は本分野で知られている任意の方法でトランスフェクションすることができる(例えば、リポソーム法、電気穿孔法など)。
本発明は更に、上記した本発明のベクター、ウイルス又は組成物からなる要素の1又は複数が充填された1又は複数のコンテナを含む診断用及び製薬用パック及びキットに関する。
別の実施形態では、本発明は、細胞又は多細胞生物への投与のため、本明細書に開示された組み換え型ウイルス、ラブドウイルス、核酸、又はベクターを含む組成物を提供する。本発明のベクターは、別の実施形態では、個体への投与に適した製剤用キャリアのような、細胞、組織、生物への投与のための非滅菌又は滅菌済みの1乃至複数のキャリアとともに用いることができる。このような組成物は、例えば、媒質添加剤(media additive)又は治療上有効な量の本発明の組み替え型ウイルス及び薬剤的に許容可能なキャリア又は賦形剤を含む。そのようなキャリアは、限定するものではないが、塩水、緩衝食塩水、デキストロース、水、グリセロール、及びそれらの組み合わせを含み得る。
本発明の組み替え型ウイルス、ベクター又は組成物は単独で用いることも、あるいは、付加的な治療化合物のような他の化合物とともに用いることもできる。
医薬化合物は任意の効果的な従来方法で投与することができ、それには、血管内投与(i.v.)、筋肉内投与(i.m.)、鼻腔内投与(i.n.)、皮下投与(s.c.)、口腔、直腸、膣内送達を通じた投与、或いは、組み替え型ウイルス/組成物を組織へ送達可能な任意の手段(例えば、針やカテーテル)による投与が含まれる。或いは、上皮細胞への挿入に対しては局所的投与が望まれ得る。他の投与方法に、吸引又はエアゾール形成を介したものがある。
哺乳類、特にヒトへの投与では、特定の個人の年齢、体重及び反応によって変化し得る個人に最適な実際の適用量及び治療期間を医者が決定することが期待される。
組み替え型ラブドウイルスに対して用いられる投与経路は、ウイルスの周期、吸着及び感染を促進し、それによってエンコードされるタンパク質のウイルス発現を可能とする。発現したタンパク質は組み替え型ラブドウイルス内にレポーター・タンパク質を組み込むことでアッセイすることができる。ラブドウイルス投与後、(例えば、レポーター・タンパク質の検出によって特定される)ウイルス・タンパク質の発現が24時間以内に、確実には36時間以内に発生することが期待される。
別の実施形態では、本発明は、患者に病気に対する免疫性を与える方法であって、前記患者の標的細胞に、治療上有効な量の組み換え型ウイルスを接触させるステップを含んでおり、前記ウイルスは、マトリクス・タンパク質(M)をエンコードする領域内に欠損又は変異を有するラブドウイルス・ゲノム又はその断片と、標的細胞の内部で発現できる免疫原性タンパク質又はペプチド断片をエンコードする異種遺伝子とを有し、それによって病気に対する免疫性を与えることを特徴とする方法を提供する。
ここで、「標的細胞への接触」という用語は、本発明のウイルス、核酸、ベクター又は組成物に対する標的細胞の直接的な暴露と間接的な暴露の両方を指す。一実施形態では、細胞への接触は、例えばマイクロインジェクションのような本分野で公知の任意の手段による細胞の直接注射を含むことができる。また、別の実施形態では、細胞への供給を、細胞を周囲する培養基への供給を介するような、間接的なものとすることも考えられる。
標的細胞への本発明のウイルス、核酸又はベクターの導入のためのプロトコルには、例えば、直接DNA取り込み法、ウイルス、プラスミド、直鎖状DNA又はリポソーム媒介形質導入、又はトランスフェクション、リン酸カルシウム媒介及びDEAEデキストラン媒介導入法を採用した磁気穿孔法(magnetoporation methods)、電気穿孔法、直接注入、及びレセプター媒介取り込みがある(より詳しくは、例えば、「Methods in Enzymology」 Vol. 1-317, Academic Press, Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel F.M. et al. (eds.) Greene Publishing Associates, (1989)及びMolecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Sambrook et al. Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989)又は他の標準的な実験室マニュアルを参照されたい)。尚、本発明のウイルス、核酸又はベクターの細胞内アクセスのどのような直接的又は間接的な手段も本明細書中で考慮されており、本発明の実施形態を表すことを理解されたい。
別の実施形態では、本発明は、病気に罹っている患者を治療する方法であって、前記患者の標的細胞に、治療上有効な量の組み換え型ウイルスを接触させるステップを含んでおり、前記ウイルスは、マトリクス・タンパク質(M)をエンコードする領域内に欠損又は変異を有するラブドウイルス・ゲノム又はその断片と、標的細胞の内部で発現できる免疫原性タンパク質又はペプチド断片をエンコードする異種遺伝子とを有し、それによって病気を治療することを特徴とする方法を提供する。
本発明のこの側面に基づくと、更なる実施形態において、標的細胞は、上皮細胞、肺細胞、腎細胞、肝細胞、星状細胞、グリア細胞、前立腺細胞、強力な抗原提示細胞、リンパ球、又はM細胞である。
別の実施形態において、本発明は、欠陥遺伝子に関連する病気に罹っている患者を治療する方法であって、前記患者の標的細胞に、治療上有効な量の組み換え型の非細胞変異性ラブドウイルス、或いは、ラブドウイルス・ゲノム又はラブドウイルス・ゲノムをエンコードする核酸配列を含む本発明の組み替え型ウイルス、ベクター又は細胞を接触させるステップを含んでおり、前記ラブドウイルスのゲノムは、マトリクス・タンパク質(M)をエンコードする領域内に欠損又は変異を有するとともに、標的細胞の内部で発現できる異種遺伝子を有し、それによって病気を治療することを特徴とする方法を提供する。
別の実施形態では、本発明のこの側面に基づくと、組み替え型の非細胞変異性ラブドウイルスは更にラブドウイルス・糖タンパク質の細胞膜に近接している外部領域内に変異又は欠損を有することができる。
このように用いられる組み替え型ラブドウイルス、ウイルス、ベクター又は細胞は、本明細書中に列挙した任意の実施形態又はそれらの組み合わせを含み得ることを理解されたい。
本発明のこの側面に基づくと、限定するものではないが、患者が治療される病気には、筋ジストロフィー、癌、心血管疾患、高血圧、感染症、腎疾患、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン舞踏病、クロイツフェルト−ヤコブ病のような神経変性、狼瘡、リウマチ様関節炎のような自己免疫疾患、心内膜炎、グレーヴズ病又はALD、喘息のような呼吸疾患又は嚢胞性繊維症、骨粗鬆症のような骨疾患、関節疾患、肝疾患、乾癬や湿疹のような皮膚病、眼病、耳鼻咽喉疾患、タレット症候群(Turret syndrome)、精神分裂病、鬱病、自閉症又はストーク(stoke)のような他の神経疾患、糖原貯蔵症や糖尿病のような代謝疾患が含まれ得る。本発明の組み替え型ラブドウイルス、ウイルス、ベクター又は細胞或いは組成物の使用によって実現し得る特定のタンパク質の発現が求められるどのような病気も本発明の一部と考えられることを理解されたい。
一実施形態では、本発明のこの側面に基づく標的細胞は、上皮細胞、肺細胞、腎細胞、肝細胞、星状細胞、グリア細胞、前立腺細胞である。本発明のこの側面に基づく方法は、各々本発明の追加的な実施態様を表す更に開示される治療への応用のいずれを提供することもできる。開示される組み替え型ウイルス、細胞、ベクター、核酸又は組成物のどのような治療への応用のための使用も本発明の一部であり実施態様として考慮されていることを理解されたい。
別の実施形態では、本発明は、患者に病気に対する免疫性を与える方法であって、患者の標的細胞に、治療上有効な量の組み換え型ウイルスを接触させるステップを含んでおり、前記ウイルスは、マトリクス・タンパク質(M)をエンコードする領域内及び/又は糖タンパク質(G)の細胞膜に近接している外部領域内に欠損又は変異を有するラブドウイルス・ゲノム又はその断片と、標的細胞の内部で発現できる免疫原性タンパク質又はペプチド断片をエンコードする異種遺伝子とを有し、それによって病気に対する免疫性を与えることを特徴とする方法を提供する。
本発明の組み替え型ラブドウイルス及び本明細書に開示するウイルス、ベクター、細胞及び組成物は、別の実施形態において、効果的な抗癌治療として働き得る。様々な量のrVSVに感染されたC6グリオーム細胞のような癌細胞は、72時間以内に約90%が細胞死する結果となった(例12)。しかしながら、VSV感染の結果、培養物内の健康な細胞の損傷が明らかだった。これに関し、Gに対して欠損を有する組み替え型VSVはグリオーム細胞に対して特異的にウイルス溶解効果を有し、隣接する健康な細胞には影響を与えなかった。
本発明の別の側面に基づくと、別の実施形態では、癌細胞を溶解させる方法であって、癌細胞に、(a)マトリクス・タンパク質(M)をエンコードする領域内及び/又は糖タンパク質(G)の細胞膜に近接している外部領域内に欠損又は変異を有するラブドウイルス・ゲノムを含む核酸と、(b)非ラブドウイルス核酸とを含んでいる組み換え型ラブドウイルスを接触させるステップを含むことを特徴とする方法が提供される。
インターフェロン−βで前処理することで特定のグリオーム細胞の溶解を生じる結果となったが(図36)、VSVによる感染後、薄片内の正常な神経細胞は非常に僅かしか感染されなかった。
他の実施形態では、非ラブドウイルス核酸は、サイトカイン又は自殺遺伝子をエンコードする。別の実施形態では、本発明の組み替え型ラブドウイルスによる感染前、感染中、又は感染後に、細胞に付加的な治療化合物を接触させる。一実施形態では、治療化合物はヌクレオシドアナログ(nucleoside analog)である。別の実施形態では、治療化合物は例えば微小管阻害剤のような細胞骨格阻害剤である。
一実施形態では、癌細胞はびまん(diffuse)型であり、或いは、別の実施形態では、塊状(solid)癌組織細胞型である。別の実施形態では、癌細胞は腫瘍形成のどの段階にあってもよく、また、どのような起源でもよい。
更に、G発現(ΔG)が欠損したVSV株は、ウイルスの感染後、インビボにおいて腫瘍の大幅な減量を示したが、薄片培養物内の正常細胞の感染は発生したとしてもほとんどなかった(例13、図39D)。
本発明は、別の実施形態では、癌を治療する方法であって、癌細胞に、(a)マトリクス・タンパク質(M)をエンコードする領域内及び/又は糖タンパク質(G)の細胞膜に近接している外部領域をエンコードする領域内に欠損又は変異を有するラブドウイルス・ゲノム又はその断片と、(b)非ラブドウイルス核酸とを含んでいる組み換え型ウイルスを接触させるステップを含むことを特徴とする方法を提供する。他の実施形態では、非ラブドウイルス核酸はサイトカイン又は自殺遺伝子をエンコードする。
別の実施形態では、本発明は、神経組織における腫瘍形成を研究するためのモデルであって、コロナ、黒質及び皮質組織のビブラトーム薄片を取得するステップと、生存力を維持しつつ細胞分裂を抑制した条件下で、前記薄片をカバースリップ上で培養するステップと、前記薄片培養物に標識された癌細胞を接種するステップと、前記標識された癌細胞の最終結果(fate)を測定するステップとを含むことを特徴とするモデルを提供する。
一実施形態では、前記モデルは薄片培養物に組み換え型ラブドウイルスを接種するステップを更に有する。別の実施形態では、組み換え型ラブドウイルスはラブドウイルスMタンパク質に対し変異又は欠損が発生している。別の実施形態では、ラブドウイルスMタンパク質をエンコードする核酸配列に対し変異又は欠損を有する組み替え型ラブドウイルスは、ラブドウイルスGタンパク質をエンコードする核酸配列に対し更に変異又は欠損が発生している。別の実施形態では、組み替え型ラブドウイルスは、ラブドウイルスGタンパク質の細胞膜に近接している外部領域に対し変異が生じている。
別の実施形態では、前記モデルは、蛍光性、発光性、発色性、及び高電子密度材料により標識された癌細胞を用いる。別の実施形態では、前記モデルは標識された組み替え型ラブドウイルスを用いる。別の実施形態では、腫瘍形成を促進する又は阻害すると考えられる作用因子(agent)が培養物に供給され、標識された癌細胞への影響が特定される。
一実施形態では、作用因子はサイトカイン、ケモカイン、炎症誘発性分子、血管形成因子、血管形成阻害剤、イオノフォア(ionophore)、微小管阻害剤、又は細胞周期阻害剤である。
別の実施形態では、本明細書中で開示されるモデルに基づいて、腫瘍形成に変化を生じさせる又は腫瘍形成に変化を生じさせると思われる作用因子の評価がなされる。本発明のこの側面によると、作用因子は、癌細胞の付加の後又は同時に薄片培養物中に供給される。一実施形態では、癌細胞の生存能力(viability)への影響が特定される。別の実施形態では、癌細胞の増殖に与える影響が特定される。別の実施形態では、癌細胞の表面マーカー発現又は細胞周期ステージに与える影響が特定される。そのような影響は、本分野において当業者に公知の方法によって容易に測定することができ、限定するものではないが、そのような方法には、例えばトリパンブルー排除法のような生存能力測定としての色素取り込みの測定がある。細胞増殖の測定は、例えば3H−チミジンの取り込みを測定することにより行うことができ、細胞表面マーカー発現及び細胞周期ステージは、FACS又は本分野で当業者に公知のプロトコルに基づく他の方法によって特定することができる。
別の実施形態では、本発明のこの側面に基づき、薄片は、Geyのデキストロース溶液、プラズマ、トロンビン、Eagleの基礎培地、Hanksの平衡塩類溶液、L−グルタミン、又はそれらの任意の組み合わせを含む培地において、生存力を維持した条件下で、カバースリップ上で培養される。別の実施形態では、本発明のこの側面に基づき、薄片は、シトシン−α−D−アラビノフラノシド、ウリジン、5−フルロ−2′−デオキシウリジン、Geyのデキストロース溶液、プラズマ、トロンビン、Eagleの基礎培地、Hanksの平衡塩類溶液、L−グルタミン、又はそれらの任意の組み合わせを含む培地において、細胞分裂を抑制した条件下で、カバースリップ上で培養される。
このモデルは、一実施形態では、正常細胞に対する毒性及び潜在的な腫瘍治療の有効性の分析を可能とする。これらは同時に行うことができ、また別の実施形態では、リアルタイムに調べることができる。この器官薄片培養は、一実施形態では、本モデルを用いた任意の調査の間、通常インビボで存在する解剖学的な接続に関し適切なニューロン構造の保存を可能とし、従って、インビボの脳の生理的、構造的及び細胞に関する側面を現実的に近似する(23−32)。本モデルは、別の実施形態では、脳組織の薬理学的、生理学的及び構造的調査が求められる研究に用いることができ、別の実施形態では、インビボで行われる類似の研究との比較のよりどころとして用いることができる。
別の実施形態では、このモデルの培養系は短期間の研究に用いることができる。或いは別の実施形態では、細胞の健常性又は電気生理学的反応性を損なうことなく、長期の研究に用いることもできる。
別の実施形態において、本発明は、腫瘍細胞破壊作用を有する物質を同定する方法であって、コロナ、黒質及び皮質組織のビブラトーム薄片を取得するステップと、生存力を維持しつつ細胞分裂を抑制した条件下で、前記薄片をカバースリップ上で培養するステップと、前記薄片培養物に標識された癌細胞を接種するステップと、前記接種された細胞を、候補物質と共に培養するステップと、癌細胞の生存度を測定するステップとを含み、癌細胞の生存度の減少は前記候補物質が腫瘍細胞破壊性であることを示し、このことにより腫瘍細胞破壊作用を有する物質を同定することを特徴とする方法を提供する。
一実施形態では、癌細胞はニューロン由来であり、例えばグリオーマ細胞由来である。別の実施形態では、本発明のこの側面に基づくと、癌細胞は、蛍光性、発光性、発色性、又は高電子密度ラベルにより標識される。別の実施形態では、上記方法は薄片培養物に標識された組み換え型ラブドウイルスを接種するステップをさらに含む。
別の実施形態では、本発明のこの側面に基づく方法は、接種された薄片をサイトカインと共に培養するステップをさらに含む。一実施形態では、サイトカインはインターフェロン、インターロイキン、マクロファージ炎症性タンパク質又は遊走阻止因子又は腫瘍壊死因子のような化学誘引物質(chemoattractant)である。
組み替え型ラブドウイルス及び薄片モデルに対して本明細書中に列挙したどの実施形態も、腫瘍破壊作用を有する物質の同定方法の更なる実施形態を表すことを理解されたい。
別の実施形態では、異種タンパク質を発現する本発明の組み替え型ウイルス、核酸又はベクターをタンパク質発現系として用いることができる。細胞内にこれらの構成物(constructs)を安定的に導入することで、発現されるタンパク質を高効率に生産する手段を与えることができる。
以下の例は、本発明の実施形態のいくつかについてより良い理解が得られるように提供されるものである。これらの例は、本発明の範囲を制限するものと考えられるべきではない。
《実施例1》
VSVのMタンパク質中の変異は、感染性であるが非細胞変性ウイルスを作製する
〈材料及び方法〉
GFP遺伝子を発現するVSVの部位定方向突然変異誘発が行われた。その後、BHK−21細胞は変異したVSVに感染した。ウイルス粒子は、超遠心分離によって細胞培養上清から濃縮され、ウイルス性RNAは単離された。逆転写PCRは、NCP−12変異体の完全長cDNAを得るために使用された。M遺伝子及びcDNAは、自動配列分析された。
VSVのMタンパク質中の変異は、感染性であるが非細胞変性ウイルスを作製する
〈材料及び方法〉
GFP遺伝子を発現するVSVの部位定方向突然変異誘発が行われた。その後、BHK−21細胞は変異したVSVに感染した。ウイルス粒子は、超遠心分離によって細胞培養上清から濃縮され、ウイルス性RNAは単離された。逆転写PCRは、NCP−12変異体の完全長cDNAを得るために使用された。M遺伝子及びcDNAは、自動配列分析された。
感染した、培養されたBHK−21(MOI=10)細胞の感染力及び形態は、蛍光顕微鏡検査法により、表示された回数で測定された。円形細胞は、培養液から吸引され、培養液は丁寧なピペット操作により数回洗浄される。その後、培養され、周期的に検査された。7日後、培養液は、感染を示すGFP陽性細胞の存在を検査され、培養上清は、未感染の細胞を感染させるのに用いるべく、アリコートでハーベストされた。細胞は、培養上清と感染した24時間後、GFPの発現について検査された。また、細胞は、感染を示す証拠のために、3%のパラホルムアルデヒドにより固定され、1%のトリトンX100により透過された。そして、感染を証明するため、Alexa569染料(プローブ分子)と結合したNタンパク質特異的モノクローナル抗体(10G4、Lefrancois and Lyles (1982) Virology 121:157〜167)でNタンパク質をプローブした。
BHK−21細胞はまた、カバーグラス上で成長させられ、Optimem(Gibco BRL製)に溶かした10μlのリポフェクタミン(Gibco BRL製)を用いて、2μgのpCAGGS-M wt、pCAGGS-NCP-12.1、またはpCAGGS−MCSプラスミドを一時的に形質移入された。形質移入後24時間で、3%のパラホルムアルデヒドで細胞を固定し、1%のトリトンX−100で透過して、ローダミン抱合ヤギ抗マウス二次抗体で標識されるM特異モノクローナル抗体(23H12)を有するMタンパク質の発現を調査した。
MNCP12.1、cDNAは4つの同定変異体を含むM遺伝子のために複製され、回収されたウイルスの表現型を顕微鏡的に検するような標準的な手順によって組換え型ウイルスのリカバリーを判定するために、突然変異体遺伝子は野生型M遺伝子に置き替えられた。
〈結果〉
前記証拠は、N末端に欠失を有する2つのMタンパク質(M2及びM3と呼ばれる)がVSV感染細胞中に見られる細胞変性効果(CPE)に寄与することを示唆している。VSV Mタンパク質突然変異体の単離は、図1のスキームに従って行われた。
前記証拠は、N末端に欠失を有する2つのMタンパク質(M2及びM3と呼ばれる)がVSV感染細胞中に見られる細胞変性効果(CPE)に寄与することを示唆している。VSV Mタンパク質突然変異体の単離は、図1のスキームに従って行われた。
2つの翻訳開始コドンを除去することにより、M2及びM3タンパク質は生成されず、変異ウイルスに感染した細胞は、VSV・CPEの顕著な特徴である細胞円形化に遅れを示した(図2)。単離された組換え型ウイルスは緑色蛍光タンパク質(GFP)のためにさらにエンコードされ、これによってどの細胞が複製ウイルスに感染したかが示された。24時間後、30%以下の細胞は、VSV・CPEの明らかな徴候を示さなかった。しかし、残りの70%以下の細胞は、円形化され、さらに培養され、コンフルエントになった時にはGFP陽性であり、これは細胞が複製したウイルスを含むことを示すものであり、さらに、感染によって死滅することなく成長を続けた。細胞が感染性ウイルスを作製するかどうかを判定するために、培養上清はハーベストされ、アリコートを用いて未感染の細胞を感染した。24時間経過後、新たに感染した細胞はCPEの徴候を示さなかったが、発現した全てのGFPは、感染性ウイルスが作製されかつ未処置の細胞に移入されうることを示した。さらに、これらの細胞もまた感染性ウイルスを作製し、非細胞変性(NCP)表現型は維持された。
どのドメインがMタンパク質に誘発された細胞変性効果に関与しているかを特定するために、いくつかの異なるMタンパク質突然変異体が生成された。得られた個々の分離株6つのうち、全てに同じ変異があった。変異は、結果的に、位置33(SEQ・ID・NO:1)でメチオニン残基をアラニン残基に置換し、位置51(SEQ・ID・NO:2)でメチオニンをアラニン残基に置換した。さらには、位置133(SEQ・ID・NO:3)ではアラニン残基はトレオニン残基に置換され、位置226(SEQ・ID・NO:4)ではグリシン残基がセリン残基に置換された(図3)。
NCP表現型が排他的にMタンパク質中の変異に起因していること(及びNCPウイルスゲノムにおける他の変異に応じたものではないこと)を判定するために、MNCP12.1に指定された突然変異遺伝子で野生型M遺伝子を置換することにより、cDNAは、4つの同定変異体(SEQ・ID・NO:5)を含むM遺伝子のために複製された。組換え型ウイルスは、標準的な手順を用いて回収され、回収されたウイルスの表現型が検査された(図4)。組換え型ウイルスは感染性であるが、感染したBHK−21細胞中において細胞の細胞変性効果を媒介しなかった(図5B及び5D)。細胞は、複製突然変異ウイルスを感染させたにもかかわらず、典型的な細胞形態を維持した(図5C)。対照的に、wt−VSVを感染させた細胞は、致命的なVSV感染に関連する典型的な細胞円形化を示した(図5A)。
BHK−21細胞はまた、野生型Mタンパク質またはwt,NCP−12.1突然変異体を有するVSVを一時的に形質移入した。突然変異Mタンパク質の発現は、Mタンパク質とRNAポリメラーゼII依存性発現との干渉による野生型Mタンパク質合成阻害機能として、野生型M(図6E)に比べて著しく向上した(図6F及び6G)。野生型Mタンパク質により媒介される細胞の細胞変性効果は、細胞の円形化において明らかであったが(図6A)、NCP突然変異体を発現する細胞は、外観的に平らかつ正常なままであった(図6B及び6C)。
《実施例2》
VSVのMタンパク質における変異は細胞親和性に影響しない
〈材料及び方法〉
以下の細胞型即ちBHK細胞、CV−1細胞、ベロ細胞またはヒーラ細胞は、多重度10でrVSV/MNCPl2.1に感染した。細胞は、37℃で12時間若しくは24時間培養され、3%のパラホルムアルデヒドに固定され、50mMのグリシンを含むリン酸塩緩衝生理食塩水(PBS)で2回洗浄された。そして、細胞は、蛍光顕微鏡(西ドイツのZeiss Axiophot製)によってGFP発現を検査され、細胞形態は位相差顕微鏡によって評価された。
VSVのMタンパク質における変異は細胞親和性に影響しない
〈材料及び方法〉
以下の細胞型即ちBHK細胞、CV−1細胞、ベロ細胞またはヒーラ細胞は、多重度10でrVSV/MNCPl2.1に感染した。細胞は、37℃で12時間若しくは24時間培養され、3%のパラホルムアルデヒドに固定され、50mMのグリシンを含むリン酸塩緩衝生理食塩水(PBS)で2回洗浄された。そして、細胞は、蛍光顕微鏡(西ドイツのZeiss Axiophot製)によってGFP発現を検査され、細胞形態は位相差顕微鏡によって評価された。
〈結果〉
非細胞変性のrVSV/MNCPl2.1が細胞親和性を変更したかどうかを判定するために、BHK細胞、CV−1細胞、ベロ細胞及びヒーラ細胞が多重度10で感染し(図7)、感染は、GFP発現の関数として判定された。細胞型にかかわらず、rVSV/MNCP12.1は、細胞変性効果を示す証拠なしに、細胞内での感染及び複製が可能であった。
非細胞変性のrVSV/MNCPl2.1が細胞親和性を変更したかどうかを判定するために、BHK細胞、CV−1細胞、ベロ細胞及びヒーラ細胞が多重度10で感染し(図7)、感染は、GFP発現の関数として判定された。細胞型にかかわらず、rVSV/MNCP12.1は、細胞変性効果を示す証拠なしに、細胞内での感染及び複製が可能であった。
《実施例3》
遺伝子治療に適用するための優れたベクターの開発
〈材料及び方法〉
組換え型VSVのM突然変異体は、上述したように生成された。突然変異ウイルスは、BHK−21細胞の感染中に、N、P、及びLタンパク質を発現するプラスミドとの共発現によって成長及び回収した。突然変異ウイルスは、MNCPl2.1を発現する細胞中で増殖された。rVSV−ΔM(VSVレプリコン)に感染した細胞から得られた上清は、5μgのpc−MNCPl2.1プラスミドを24時間前に形質移入された細胞に投与された。細胞は形質移入から24時間後に固定され、ローダミン抱合ヤギ抗マウス二次抗体(Jackson Immuno Research Laboratories製)で標識されたN特異モノクローナル抗体でプローブされた。
遺伝子治療に適用するための優れたベクターの開発
〈材料及び方法〉
組換え型VSVのM突然変異体は、上述したように生成された。突然変異ウイルスは、BHK−21細胞の感染中に、N、P、及びLタンパク質を発現するプラスミドとの共発現によって成長及び回収した。突然変異ウイルスは、MNCPl2.1を発現する細胞中で増殖された。rVSV−ΔM(VSVレプリコン)に感染した細胞から得られた上清は、5μgのpc−MNCPl2.1プラスミドを24時間前に形質移入された細胞に投与された。細胞は形質移入から24時間後に固定され、ローダミン抱合ヤギ抗マウス二次抗体(Jackson Immuno Research Laboratories製)で標識されたN特異モノクローナル抗体でプローブされた。
〈結果〉
これまで、Mタンパク質が変異または欠失したVSV(ΔM−VSV)を回収しようと試みられてきたが成功しなかった。それはおそらく、Mタンパク質の毒作用が細胞を死滅させ、そのために、発現されたMタンパク質の量に限界があったためである。容易に回収可能なベクターを上述の方法及び菌株が提供するかどうかを判定するために、回収スキーム(図8)が利用された。このスキームは、MNCP12.1が最初のウイルス回収中にN、P、及びL支持プラスミドと共発現され、続いてMNCP12.1を発現する細胞(または細胞株)から得られたウイルスが増殖される点を除いて、組換え型VSVを回収するために用いられる標準的な方法に類似している。
これまで、Mタンパク質が変異または欠失したVSV(ΔM−VSV)を回収しようと試みられてきたが成功しなかった。それはおそらく、Mタンパク質の毒作用が細胞を死滅させ、そのために、発現されたMタンパク質の量に限界があったためである。容易に回収可能なベクターを上述の方法及び菌株が提供するかどうかを判定するために、回収スキーム(図8)が利用された。このスキームは、MNCP12.1が最初のウイルス回収中にN、P、及びL支持プラスミドと共発現され、続いてMNCP12.1を発現する細胞(または細胞株)から得られたウイルスが増殖される点を除いて、組換え型VSVを回収するために用いられる標準的な方法に類似している。
ΔM−VSVは、これらの条件下で容易に回収可能であった(図9)ので、優れた遺伝子送達/遺伝子治療ベクターの候補である。ΔM−VSVは、細胞質中で排他的に複製され、レトロウイルス遺伝子治療ベクターなどの他の典型的な遺伝子送達ベクターを使用する際の副産物である挿入性突然変異生成及び導入遺伝子サイレンシングの潜在的な問題を排除する。
《実施例4》
M及びGタンパク質のために除去された組換え型VSVは島細胞に感染し細胞変性ではない
〈材料及び方法〉
テネシー大学の膵島ラボで、参加する患者からインフォームド・コンセントが得られた。島細胞の標本が準備され、Mタンパク質(NCP12)の欠失した複製適格性VSV、またはM及びGタンパク質(ΔG−NCP12)の欠失した複製制限的VSVのいずれかに感染した。細胞は、12ウェルプレートに750ulの培地中に維持された。感染に続いて、ウイルス接種材料は取り除かれず、小島は、感染後3日目及び8日目にイメージング及びフローサイトメトリー分析のためにハーベストされた。少量の島細胞がプレートから取り除かれ、1500rpmで5分間回転された。ペレットは、100ulのPBS中で再懸濁され、グラス・プレート上に懸濁液として加えられ、カバーグラスが被せられ、40Xの対物レンズ下で観察された。アポトーシスの島細胞の割合を決定するために、残りはアネキシンVで染色された。
M及びGタンパク質のために除去された組換え型VSVは島細胞に感染し細胞変性ではない
〈材料及び方法〉
テネシー大学の膵島ラボで、参加する患者からインフォームド・コンセントが得られた。島細胞の標本が準備され、Mタンパク質(NCP12)の欠失した複製適格性VSV、またはM及びGタンパク質(ΔG−NCP12)の欠失した複製制限的VSVのいずれかに感染した。細胞は、12ウェルプレートに750ulの培地中に維持された。感染に続いて、ウイルス接種材料は取り除かれず、小島は、感染後3日目及び8日目にイメージング及びフローサイトメトリー分析のためにハーベストされた。少量の島細胞がプレートから取り除かれ、1500rpmで5分間回転された。ペレットは、100ulのPBS中で再懸濁され、グラス・プレート上に懸濁液として加えられ、カバーグラスが被せられ、40Xの対物レンズ下で観察された。アポトーシスの島細胞の割合を決定するために、残りはアネキシンVで染色された。
〈結果〉
サンプル番号176及び163の2つのサンプルが試験された。両サンプルにおいて、Mタンパク質のために除去された組換え型VSVをMOI=5で感染させると、感染細胞における高水準の発現(それぞれ図10、11)が最小の細胞変性効果で得られた。G糖タンパク質の欠失は、感染レベルへの明らかな効果を有さないが、一般的なサンプル176では、より効率的に感染した。MOI=25での感染は、感染後3日目に、感染率または細胞変性効果のいずれにも認識可能な増加を生じさせなかった(それぞれ図12及び13)。
サンプル番号176及び163の2つのサンプルが試験された。両サンプルにおいて、Mタンパク質のために除去された組換え型VSVをMOI=5で感染させると、感染細胞における高水準の発現(それぞれ図10、11)が最小の細胞変性効果で得られた。G糖タンパク質の欠失は、感染レベルへの明らかな効果を有さないが、一般的なサンプル176では、より効率的に感染した。MOI=25での感染は、感染後3日目に、感染率または細胞変性効果のいずれにも認識可能な増加を生じさせなかった(それぞれ図12及び13)。
感染は、MOIとは関係なく、発現が認識可能に減少することなく培養液中で8日残存した(図14〜17)。MOIとは関係なく、感染後3日目及び8日目に高水準の発現が検出された。したがって、島細胞はVSV構成物に効率的に感染し、感染は認識できる細胞変性効果にもたらさず、遺伝子伝達手段としてのそのような構成物の有用性をさらに強調する。
《実施例5》
VSV・G外部ドメインの膜近位領域における変異はGタンパク質の発現または安定性に影響しない
〈材料及び方法〉
プラスミド及びオレゴヌクレオチド定方向突然変異誘発
VSVのGタンパク質をエンコードする遺伝子、血清型インディアナ、菌株サンジュアン(SanJuan)は、前述(14)のようなプラスミドpXM−Gを生成するために真核性発現ベクターpXMに複製された。突然変異体E452A(SBQ・ID・NO:6)、G456D(SEQ・ID・NO:7)、W457A(SEQ・ID・NO:8)、F458A(SEQ・ID・NO:9)、及びW461A(SEQ・ID・NO:10)は、オレゴヌクレオチド定方向突然変異誘発により構成され(14)、変異領域はpXM G(AXB)(32)に複製された。二重変異体及び三重変異体即ちG456DW457A(DA)(SEQ・ID・NO:11)、W457AW461A(WW−AA)(SEQ・ID・NO:12)、W457AF458AW461A(AAA)(SEQ・ID・NO:13)、及びG456DW457DW461A(DAA)(SEQ・ID・NO:14)は、高速交換部位定方向突然変異誘発キット(Quick Change Site-Directed Mutagenesis Kit)を製造業者(カナダのStratagene社)のインストラクションに従って使用することにより産出された。テンプレートとしてpXN4−G(AXB)プラスミドが使用された。所望の変異を含む2つの相補合成オリゴヌクレオチドプライマー(マクマスター大学中心施設(McMaster University Central Facilities)から入手)は、ターボPfu・DNAポリメラーゼを使用する突然変異誘発に用いられた。欠失および突然変異体は、前述(32)のように構成された。構成物GD9及びDF440〜N449は、VSV・G外部ドメインのアミノ酸453〜461(SEQ・ID・NO:15)及び440〜449(SEQ・ID・NO:16)を欠失させることにより作られた。構成物G10DAF及びGD9〜10DAFは、崩壊促進因子(DAF)(7)の膜近傍領域からの9つのアミノ酸(残基311〜319)をそれぞれVSV・G(AXB)(SEQ・ID・NO:17)とGD9(SEQ・ID・NO:18)のアミノ酸464と465との間に挿入することにより作られた。これらの構成物を「10−DAF」と呼ぶ理由は、ベクターG(AXB)が、制限酵素認識部位の挿入によりTM接合部で追加のセリンを含むからである。キメラG(+9)gBGは、単純ヘルペスウイルス1型(HSV1)糖タンパク質gBのアミノ酸721〜726及び773〜795をVSV・Gの外部ドメインのアミノ酸464と細胞質尾部のアミノ酸の483との間に挿入することにより構成され、それによって、VSV・Gの膜固着(TM)ドメイン(残基465〜482)はHSV1・gBタンパク質(38)の第3TM領域によって置換された。このキメラは、VSV・Gタンパク質の読み枠を維持するために、ecto−TMドメイン接合部で余分なセリン残基を含む。
VSV・G外部ドメインの膜近位領域における変異はGタンパク質の発現または安定性に影響しない
〈材料及び方法〉
プラスミド及びオレゴヌクレオチド定方向突然変異誘発
VSVのGタンパク質をエンコードする遺伝子、血清型インディアナ、菌株サンジュアン(SanJuan)は、前述(14)のようなプラスミドpXM−Gを生成するために真核性発現ベクターpXMに複製された。突然変異体E452A(SBQ・ID・NO:6)、G456D(SEQ・ID・NO:7)、W457A(SEQ・ID・NO:8)、F458A(SEQ・ID・NO:9)、及びW461A(SEQ・ID・NO:10)は、オレゴヌクレオチド定方向突然変異誘発により構成され(14)、変異領域はpXM G(AXB)(32)に複製された。二重変異体及び三重変異体即ちG456DW457A(DA)(SEQ・ID・NO:11)、W457AW461A(WW−AA)(SEQ・ID・NO:12)、W457AF458AW461A(AAA)(SEQ・ID・NO:13)、及びG456DW457DW461A(DAA)(SEQ・ID・NO:14)は、高速交換部位定方向突然変異誘発キット(Quick Change Site-Directed Mutagenesis Kit)を製造業者(カナダのStratagene社)のインストラクションに従って使用することにより産出された。テンプレートとしてpXN4−G(AXB)プラスミドが使用された。所望の変異を含む2つの相補合成オリゴヌクレオチドプライマー(マクマスター大学中心施設(McMaster University Central Facilities)から入手)は、ターボPfu・DNAポリメラーゼを使用する突然変異誘発に用いられた。欠失および突然変異体は、前述(32)のように構成された。構成物GD9及びDF440〜N449は、VSV・G外部ドメインのアミノ酸453〜461(SEQ・ID・NO:15)及び440〜449(SEQ・ID・NO:16)を欠失させることにより作られた。構成物G10DAF及びGD9〜10DAFは、崩壊促進因子(DAF)(7)の膜近傍領域からの9つのアミノ酸(残基311〜319)をそれぞれVSV・G(AXB)(SEQ・ID・NO:17)とGD9(SEQ・ID・NO:18)のアミノ酸464と465との間に挿入することにより作られた。これらの構成物を「10−DAF」と呼ぶ理由は、ベクターG(AXB)が、制限酵素認識部位の挿入によりTM接合部で追加のセリンを含むからである。キメラG(+9)gBGは、単純ヘルペスウイルス1型(HSV1)糖タンパク質gBのアミノ酸721〜726及び773〜795をVSV・Gの外部ドメインのアミノ酸464と細胞質尾部のアミノ酸の483との間に挿入することにより構成され、それによって、VSV・Gの膜固着(TM)ドメイン(残基465〜482)はHSV1・gBタンパク質(38)の第3TM領域によって置換された。このキメラは、VSV・Gタンパク質の読み枠を維持するために、ecto−TMドメイン接合部で余分なセリン残基を含む。
構成物W457−A(W1A)、W461−A(W2A)、W457W461−AA(WW−AA)、GΔ13、GSrev11、GSrev11−AAは、テンプレートとしてプラスミドpVSV9.1(+)(34)を用いてオーバーラップPCR法を使って作られた。プライマーの配列は、要求に応じて利用可能である。オーバーラップPCR生成物は、次に、6%のポリアクリルアミドゲルで浄化され、電解溶出され、固有の制限酵素KpnI及びNheIで消化され、予め同じ酵素で消化されたpVSV−FL(+)2(34)にサブクローニングするために使用された。配列は、その後、ジデオキシヌクレオチド塩基配列決定法によって確認された。所望の変異を有するG遺伝子もまた、MluI及びNheI断片として改良型の真核性発現ベクターpCAGGS−MCSにサブクローニングされた。構成物pVSV−DAA、−AAA、−G10DAF、−G(+9)gBG、−GΔ9、−GΔ9−10DAF、及び−DF440−N449は、テンプレートとして突然変異G遺伝子含む対応するpXMプラスミドを用いてKpnI部位と3’末端との間のG遺伝子の領域を増幅し、この領域をpVSV−FL(+)2にサブクローニングすることにより生成された。
ウイルスの回収は、若干改良して既述(33〜35)のように行われた。簡潔に言えば、35mmプレート中のBHK−21細胞のコンフルエント単分子層は、31℃で1時間、多重度5で、T7 RNAポリメラーゼ(vTF7−3)(36)をエンコードする組換え型牛痘ウイルスに感染した。細胞は、その後、5mgのpVSV(+)−G*(*は変異体を有するG遺伝子を示す)と、VSVINDから得られるN、P、L、G遺伝子を含むそれぞれ3mg、5mg、1mg、8mgのプラスミドと、90mlのトランスフェクトACE(Transfect ACE)(36、37)とからなるDNA:リポソーム懸濁液を形質移入された。3時間後、トランスフェクション混合体は、DNMM+10%FBSと取り替えられ、細胞は37℃で培養された。上清は、48時間の培養後に収集され、牛痘ウイルスを取り除くために0.2mフィルタ(ミリポア社のマイレクス−GS)でろ過された。濾液は、24時間前に2mgのpCAGGS−GINDを形質移入されたBHK−21細胞に与えられた。ウイルスの回収は、24〜36時間後にVSV感染の典型である細胞変性効果を検査することにより評価された。回収したウイルスはその後プラーク精製され、継代され、そのRNAは単離された。G遺伝子における変異は、RT−PCR塩基配列決定法によって確認された。
〈結果〉
VSV Gの膜近位領域においていずれの残基が膜融合活性に重要となり得るかを判定するために、異なる小胞ウイルスからの膜近位ドメインの配列アラインメントが行われた(図20)。アラインメントは、この領域が、密接に関連する小胞ウイルス全体でよく保存され、これらのサブドメインにおいて保存された残基の数に基づいてA及びBとして標識される2つの別のドメインが画定されたことを示している。最大の保存(90%以上)は、残基E437とW461との間の領域(ドメインB)にあった。残基E437とF421との間(ドメインA)のアミノ酸配列は、VSVインディアナ血清型の2つの菌株(サンジュアン(San Juan)及びオルセー(Orsay))に一致した。一方、球菌ウイルスでは、保存は80%以上であった。球菌ウイルスは、インディアナ−2血清型及び他の2つのインディアナ−2血清型ウイルスとして分類される、より関係の薄いウイルスである。しかし、ドメインAは、試験した他のウイルスの中ではよく保存されなかった。位置457及び461のトリプトファン(W)残基は、試験した全ての小胞ウイルス全体で保存された。トリプトファン残基以外では、いくつかの他のアミノ酸(H423、P424、T444、G445、N449、及びP450)も、試験した小胞ウイルスの配列全体で保存された。ドメインBの始まりに近くかつ残基440〜445から延在するFFGDTG(SEQ・ID・NO:19)モチーフは、試験した全ての小胞ウイルス全体で不変異体であるTG残基を有する、密接に関連するメンバーのほとんどで保存された。
VSV Gの膜近位領域においていずれの残基が膜融合活性に重要となり得るかを判定するために、異なる小胞ウイルスからの膜近位ドメインの配列アラインメントが行われた(図20)。アラインメントは、この領域が、密接に関連する小胞ウイルス全体でよく保存され、これらのサブドメインにおいて保存された残基の数に基づいてA及びBとして標識される2つの別のドメインが画定されたことを示している。最大の保存(90%以上)は、残基E437とW461との間の領域(ドメインB)にあった。残基E437とF421との間(ドメインA)のアミノ酸配列は、VSVインディアナ血清型の2つの菌株(サンジュアン(San Juan)及びオルセー(Orsay))に一致した。一方、球菌ウイルスでは、保存は80%以上であった。球菌ウイルスは、インディアナ−2血清型及び他の2つのインディアナ−2血清型ウイルスとして分類される、より関係の薄いウイルスである。しかし、ドメインAは、試験した他のウイルスの中ではよく保存されなかった。位置457及び461のトリプトファン(W)残基は、試験した全ての小胞ウイルス全体で保存された。トリプトファン残基以外では、いくつかの他のアミノ酸(H423、P424、T444、G445、N449、及びP450)も、試験した小胞ウイルスの配列全体で保存された。ドメインBの始まりに近くかつ残基440〜445から延在するFFGDTG(SEQ・ID・NO:19)モチーフは、試験した全ての小胞ウイルス全体で不変異体であるTG残基を有する、密接に関連するメンバーのほとんどで保存された。
Gタンパク質の膜融合活性におけるこれら保存された領域の役割を判定するため、この領域で、置換、欠失、及び挿入を行った(図21)。位置457及び461の2つの不変異体トリプトファン(W)残基は、アラニンと置換された。同様に、保存されたグルタミン酸(E452)、グリシン(G456)、及びフェニルアラニン(F458)は、個別にアラニンと、若しくはアスパラギン酸及びアラニンと置換された。W457及びW461をアラニンで、G456及びW457をアスパラギン酸及びアラニンでそれぞれ置換することにより、2つの二重変異体も構成された。さらに、W457A、F458A、W461Aをアラニンで置換し、G455、W457、W461をアスパラギン酸及びアラニンでそれぞれ置換することにより、2つの三重変異体も産出された。変異体E452A、G456D、W457A、F458A、W461A、W457W−461−AA、変異体G456D−W457A、変異体G456D−W457A−W461A、及び変異体W457A−F456A−W461Aは、それぞれE−A、G−D、W1A、F−A、W2A、WW−AA、DA、DAA、及びAAAとも呼ばれる。
上記の点変異に加えて、欠失変異体(アミノ酸453〜461(SEQ・ID・NO:15)の欠失であるGΔ9、残基449〜461(SEQ・ID・NO:20)の欠失であるGΔ13、及びアミノ酸440〜449(SEQ・ID・NO:16)の欠失であるΔF440〜N449)と、いくつかの挿入変異体が調製された。構成物G(AXB)は、K462とS463との間に2つの付加的なセリンを導入する((38)に記載されている)。一方、D10DAF及びGΔ9〜10DAFは、G(AXB)のaa S464とS465、及びGΔ9の間にそれぞれ挿入された崩壊促進因子(DAF)から9つのaa(残基311〜319)を含む。変異体G(+9)gBGは、G(AXB)の外部ドメインとGgB3G(39)(SEQ・ID・NO:21)の膜貫通ドメインとの間に9つの残基が挿入されている。試験された残りの変異体は、反転した膜貫通ドメインに隣接する11 aaの配列(Gsrev11)(SEQ・ID・NO:22)を有する。変異体GSrev11−AAは、同一の反転した11 aaを有し、アラニンに変化した2つのW残基(SEQ・ID・NO:23)も有する。
突然変異体遺伝子は、pXMベクターを用いてCOS−1細胞において発現され(11)、タンパク質は、[35S]−メチオニンで標識され、その後、ポリクローナル抗G抗体での免疫沈降とそれに続くSDS−PAGEによって分析された(図23)。全ての置換変異体は野生型Gタンパク質と共に移動し、野生型及び変異体に対応したバンドの強度は類似していた。これは、Gタンパク質との関連で、保存された残基の置換及び余分な残基の欠失または挿入は、タンパク質の発現または安定性に影響しなかったことを示唆している。
変異体Gタンパク質をエンコードする組換え型ウイルスの回収は、初期の回収及び後続の増幅ステップ中にWT・Gタンパク質共発現によって達成された。これは、Gタンパク質突然変異体が膜融合的に欠陥があったか否かに関係なく、すべてのウイルスが回収され得ることを確実にした。
《実施例6》
変異Gタンパク質の移送及び細胞表面発現
〈材料及び方法〉
間接的な免疫蛍光検分析は、様々なGタンパク質の表面発現を検査するために使用される。細胞は形質移入され、3%のパラホルムアルデヒドにより固定された後、G特異的モノクローナル抗体(mAb I1)(40)、続いてローダミン結合ヤギ抗マウス(又は抗ラビット)の2次抗体(Jackson Immunoresearch Laboratories, Inc.)により調べられた。Gタンパク質の表面発現を定量化するため、ウイルス感染した細胞のフローサイトメトリー分析、又は形質移入されたCOS−1細胞のラクトペルオキシダーゼ触媒ヨウ素化が行われた(15)。フローサイトメトリーには、35mmプレート内のBHK−21細胞(5x105)は、野生型VSV、又は適切な多重度10のG補完された変異ウイルスのいずれかに感染した。細胞は、感染後6時間で、50mMのEDTAが含まれるPBSを使用してプレートから取り出され、1250xgで5分間、遠心分離によりペレット化された。細胞は、その後、3%のパラホルムアルデヒドを使用して、懸濁液中に室温で20分間固定された。細胞は、固定液を除去するために、PBS−グリシンにより2回洗浄された。そして細胞は、PBSグリシン+0.5%のウシ血清アルブミン(BSA)(Sigma-Aldrich)中で、室温で30分間培養された。BSAでブロックした後、細胞は、主要な抗体及びローダミン結合ヤギ抗マウス抗体としてのI1mAbにより調べられた。その後、様々な突然変異体Gタンパク質の表面発現レベルを計るために、細胞はフローサイトメトリーにより分析された。
変異Gタンパク質の移送及び細胞表面発現
〈材料及び方法〉
間接的な免疫蛍光検分析は、様々なGタンパク質の表面発現を検査するために使用される。細胞は形質移入され、3%のパラホルムアルデヒドにより固定された後、G特異的モノクローナル抗体(mAb I1)(40)、続いてローダミン結合ヤギ抗マウス(又は抗ラビット)の2次抗体(Jackson Immunoresearch Laboratories, Inc.)により調べられた。Gタンパク質の表面発現を定量化するため、ウイルス感染した細胞のフローサイトメトリー分析、又は形質移入されたCOS−1細胞のラクトペルオキシダーゼ触媒ヨウ素化が行われた(15)。フローサイトメトリーには、35mmプレート内のBHK−21細胞(5x105)は、野生型VSV、又は適切な多重度10のG補完された変異ウイルスのいずれかに感染した。細胞は、感染後6時間で、50mMのEDTAが含まれるPBSを使用してプレートから取り出され、1250xgで5分間、遠心分離によりペレット化された。細胞は、その後、3%のパラホルムアルデヒドを使用して、懸濁液中に室温で20分間固定された。細胞は、固定液を除去するために、PBS−グリシンにより2回洗浄された。そして細胞は、PBSグリシン+0.5%のウシ血清アルブミン(BSA)(Sigma-Aldrich)中で、室温で30分間培養された。BSAでブロックした後、細胞は、主要な抗体及びローダミン結合ヤギ抗マウス抗体としてのI1mAbにより調べられた。その後、様々な突然変異体Gタンパク質の表面発現レベルを計るために、細胞はフローサイトメトリーにより分析された。
〈結果〉
細胞間融合とウイルス出芽は両方とも、原形質膜に対するウイルス・タンパク質の局在を必要とする。ウイルス・タンパク質が細胞表面へ移送されたかどうか判定するために、フローサイメトリーとラクトペルオキシダーゼ触媒ヨウ素化の両方が行われた。変異Gタンパク質は、野生型Gタンパク質の80〜100%の間のレベルで、細胞表面上に発現した(表1)。
細胞間融合とウイルス出芽は両方とも、原形質膜に対するウイルス・タンパク質の局在を必要とする。ウイルス・タンパク質が細胞表面へ移送されたかどうか判定するために、フローサイメトリーとラクトペルオキシダーゼ触媒ヨウ素化の両方が行われた。変異Gタンパク質は、野生型Gタンパク質の80〜100%の間のレベルで、細胞表面上に発現した(表1)。
a:COS細胞は、指標Gタンパク質をエンコードするpXMベクターにより形質移入された。前記細胞は、表面がヨウ素化され、表面発現の相対量は前述したようにして計算された(15)。b:BHK−21細胞はG補完ウイルス(G-complemented viruses)に感染し、感染後6時間固定された。そして、前記細胞は、G特異的モノクローナル抗体I1とローダミン標識第2抗体により染色された後、フローサイメトリーによって分析された。相対的な表面発現は、次の式を使用して計算した。(変異の蛍光強度である、変異個体群x中の陽性細胞:%)/(蛍光強度である、WT陽性細胞x:%)。c:形質移入されたCOS細胞は、pH5.6に緩衝された融合培地に入れられ、細胞間融合は〈材料及び方法〉の欄で説明したようにして測定された。d:HK−21細胞は、各ウイルス変異体に感染し、前述したようにしてpH5.9に緩衝された融合培地で培養された。数値は100%に設定されたWT融合活性の百分率として表される。N.D.(not done)は不実施である。
細胞膜近傍領域内の変異が細胞内移送又はGタンパク質の細胞表面局在化に影響されるかどうかを判断するために、COS−1とBHK−21細胞の両方で、野生型及び変異体Gタンパク質を発現させた。小胞体(ER)からゴルジ複合体までの移送は、エンドH耐性獲得を試験することにより評価された。15分のパルスの後、すべての変異はエンドHに感受性があったので、前記変異はN結合したオリゴ糖によりグリコシル化されたことが実証された。1時間の追跡後、前記変異はエンドH消化に対して耐性を示したので、すべての変異Gタンパク質は、同様の動態で、ERからゴルジまで移送されたことが分った。BHK−21細胞内で発現した変異の代表例を図24に示す。
《実施例7》
Gタンパク質欠失変異体は、膜融合を促進する能力が低い。
Gタンパク質欠失変異体は、膜融合を促進する能力が低い。
〈材料及び方法〉
ウイルス感染したBHK−21細胞及びプラスミドが形質移入されたCOS−1細胞は、合胞体形成を測定する分析に利用される。ウイルスに感染した細胞では、培地は感染した6時間後に除去される。その後、前記細胞は、融合培地([10mM Na2HPO4、10mM N−2−ヒドロキシエチルピペラジン−N’−2−エタンスルホン酸(HEPES)、10mMの2−(N−モルホリノ)エタンスルホン酸(MES)]、HClにより指標pH(5.9、5.5、又は5.2)に滴定されている)により1回洗浄され、室温で1分間、未使用の融合培地に浸けられた。1分後、融合培地は、5%のウシ胎仔血清(FBS)を含んでいる未使用のダルベッコ改変イーグル培地(Dulbecco's modified Eagle's medium: DMEM)と交換され、細胞は37℃で30分培養された。細胞は、その後、3%のパラホルムアルデヒドにより固定され、前述したようにして、免疫蛍光のために処理された。形質移入されたCOS−1細胞は、前述したようにして処理された(11)。
ウイルス感染したBHK−21細胞及びプラスミドが形質移入されたCOS−1細胞は、合胞体形成を測定する分析に利用される。ウイルスに感染した細胞では、培地は感染した6時間後に除去される。その後、前記細胞は、融合培地([10mM Na2HPO4、10mM N−2−ヒドロキシエチルピペラジン−N’−2−エタンスルホン酸(HEPES)、10mMの2−(N−モルホリノ)エタンスルホン酸(MES)]、HClにより指標pH(5.9、5.5、又は5.2)に滴定されている)により1回洗浄され、室温で1分間、未使用の融合培地に浸けられた。1分後、融合培地は、5%のウシ胎仔血清(FBS)を含んでいる未使用のダルベッコ改変イーグル培地(Dulbecco's modified Eagle's medium: DMEM)と交換され、細胞は37℃で30分培養された。細胞は、その後、3%のパラホルムアルデヒドにより固定され、前述したようにして、免疫蛍光のために処理された。形質移入されたCOS−1細胞は、前述したようにして処理された(11)。
〈結果〉
膜融合活性における変異体の影響を検査するため、細胞間融合分析が行われた。WT或いは各G変異を発現する細胞は、pH5.9〜4.8に緩衝された融合培地で処理された。一時的に形質移入されたCOS−1細胞を分析した場合、全ての置換変異体は、膜融合活性が、野生型の活性の70%から5%の範囲で、減少することを示した(表1)。
膜融合活性における変異体の影響を検査するため、細胞間融合分析が行われた。WT或いは各G変異を発現する細胞は、pH5.9〜4.8に緩衝された融合培地で処理された。一時的に形質移入されたCOS−1細胞を分析した場合、全ての置換変異体は、膜融合活性が、野生型の活性の70%から5%の範囲で、減少することを示した(表1)。
一方、ウイルス感染したBHK細胞を分析した場合、これら突然変異体の多く(W1A、W2A、WW−AA、DAA、及びAAA)が、大きさと範囲が野生型VSVに感染した細胞と類似する、広範囲に及ぶ合胞体を生成した。この違いの根拠は、完全には理解されていない。しかし、それは単に、一時的に形質移入された細胞に感染したウイルス中のGタンパク質発現レベルのためだと思われる。
置換変異体とは対照的に、欠失及び挿入変異体の膜融合活性は、COSとウイルス感染BHK細胞の両方において、検知できないほど非常に低い。変異体GΔ9、GΔ13、及びGΔ9−10DAFは、細胞がpH5.9に暴露されたとき、3つ又は4つの核だけを有する合胞体を極僅かながら生成した(図25A、矢印で示す)。これらのタンパク質を発現する細胞がpH5.5、5.2、または4.8に緩衝された培地に入れられたとき、合胞体の大きさも数も増大しない(データは示さず)。このことは、合胞体形成の欠損は、pH閾値の変動が原因でないことを示す。さらに、低pHトリガへの暴露後の、長時間の培養は、見られた合胞体の数又は大きさを増大させなかった(データは示さず)。9つ又は10のアミノ酸が、膜固着領域と外部領域{変異体G(+9)gB及びG10DAF}との境界の間に挿入されたとき、及び残基F440〜N449が欠失したときに、膜融合活性は完全に喪失する(図25B)。これらのデータは、膜近傍領域における配列の前後関係は、融合活性に重要であることを意味している。これら全てのケースでは、酸性pHに暴露する時間の増加、又は融合培地のpHの減少、膜融合活性を促進しない。
保存されている細胞膜近傍の芳香族残基(トリプトファン及びフェニルアラニン)及びグリシン残基は、そのため、ウイルス感染細胞では、VSVGが誘発した膜融合に重要ではない。しかし、COS−1細胞で一時的に発現した場合、いくらかの活性の低下が見られた。11細胞膜近傍の残基配列の反転は、同様に、融合活性に重要な影響を与えない。9細胞膜近傍のアミノ酸の線形順序は膜融合活性に影響を与えるようには見えないが、これらの残基の欠失は融合活性を減少させるので(by>99%)、これら残基は重要である。さらに、13アミノ酸の欠失は、Gタンパク質に仲介された細胞間融合について、同様の効果があった。しかしながら、保存されているFFGDTG(SEQ・ED・NO: )モチーフ(融合活性を完全に停止している)を含んでいるF440とN449との間の領域における欠失は、このサブドメインがGの融合活性に重要であることを示している。挿入変異体G10DAF及びG(+9)gBGについての結果は、これらの挿入は表面発現に影響を与えないことを示すが、それらが融合活性を完全に停止させることは、膜貫通領域から細胞膜近傍領域の間隔が、膜融合活性にとって非常に重要であることを示す。この考えに従って、G10DAF内の膜近傍領域の長さが、9細胞膜近傍残基(GD9−10DAF)の欠失により減少したとき、膜融合活性は部分的に回収された。これらの結果を総合すれば、膜固着領域に直接に隣接する領域は、例えばHIV−1 gp41(41)では、VSV G内の保存されている細胞膜近傍W残基は、ウイルス中へのGタンパク質の取り込み又は膜融合活性にとって重要ではないのとは違って、VSV Gタンパク質の膜融合活性にとって不可欠であることを示す。
《実施例8》
変異Gタンパク質の安定性
〈材料及び方法〉
オリゴマー状態の発現Gタンパク質は、(15、17)で説明したような、ショ糖密度勾配遠心分離法によって測定された。エンドグリコシダーゼH分析は、(15)に記載したように形質移入された細胞の溶解液で、(10)に記載したようにウイルス感染した細胞の溶解液で、若干の変更を伴って行われた。35mmプレートで成長したBHK−21細胞は、多重度10で、適切なG補完変異ウイルスに感染した。感染してから6時間、細胞はメチオニンフリーのDMEM(MetフリーDMEM)によって一度洗浄され、その後2mlのMetフリーDMEM内で20分間培養された。その培地は、指示された回数だけ、55mCiの[35S]メチオニン(Translabel protein labeling mix, New England Nuclear)を含んでいる2mlのMetフリーDMEMと交換された。パルス周期後、細胞は、1mlの洗浄溶解緩衝液[10mMトリス(pH7.4、66mMのEDTA、1%TX−100、0.4%デオキシコール酸、0.02%アジ化ナトリウム)にすぐに溶解される、又は2mMの過剰の非放射性メチオニンを含んでいるDMEM+10%FBS培地で追跡された。核と細胞残屑は、卓上マイクロ遠心分離機(IEC Centra)上で、14,000rpm、1分間の遠心分離によって除去された。免疫沈降は、post-nuclear上澄みが0.3%ナトリウム・ドデシル硫酸塩(SDS)のために作成し、原抗体複合体を37℃で1時間形成するとき以外は、基本的に前述した(42)のようにして抗Gテール・ラビット・ポリクローナル抗体(ペプチドAb#3226)によって行われる。免疫沈降の2分の1は、製造業者の指示に従って、エンドH(New England Biolabs)によって消化された。
変異Gタンパク質の安定性
〈材料及び方法〉
オリゴマー状態の発現Gタンパク質は、(15、17)で説明したような、ショ糖密度勾配遠心分離法によって測定された。エンドグリコシダーゼH分析は、(15)に記載したように形質移入された細胞の溶解液で、(10)に記載したようにウイルス感染した細胞の溶解液で、若干の変更を伴って行われた。35mmプレートで成長したBHK−21細胞は、多重度10で、適切なG補完変異ウイルスに感染した。感染してから6時間、細胞はメチオニンフリーのDMEM(MetフリーDMEM)によって一度洗浄され、その後2mlのMetフリーDMEM内で20分間培養された。その培地は、指示された回数だけ、55mCiの[35S]メチオニン(Translabel protein labeling mix, New England Nuclear)を含んでいる2mlのMetフリーDMEMと交換された。パルス周期後、細胞は、1mlの洗浄溶解緩衝液[10mMトリス(pH7.4、66mMのEDTA、1%TX−100、0.4%デオキシコール酸、0.02%アジ化ナトリウム)にすぐに溶解される、又は2mMの過剰の非放射性メチオニンを含んでいるDMEM+10%FBS培地で追跡された。核と細胞残屑は、卓上マイクロ遠心分離機(IEC Centra)上で、14,000rpm、1分間の遠心分離によって除去された。免疫沈降は、post-nuclear上澄みが0.3%ナトリウム・ドデシル硫酸塩(SDS)のために作成し、原抗体複合体を37℃で1時間形成するとき以外は、基本的に前述した(42)のようにして抗Gテール・ラビット・ポリクローナル抗体(ペプチドAb#3226)によって行われる。免疫沈降の2分の1は、製造業者の指示に従って、エンドH(New England Biolabs)によって消化された。
野生型及び変異タンパク質のトリプシン感受性は、(38、43)で説明したようにして測定された。簡単に言えば、形質移入された細胞は[35S]メチオニンによって標識され、2X MNT[40mM 2−(N−モルフォリン)エタンスルホン酸、60mM Tris、200mM NaCl、2.5mM EDTA]中で、指示されたpHで、1%TritonX100によって溶解された。溶解液は、14,000gで5分間遠心分離され、同等量の上澄みは、10mgのTPCK−トリプシンが存在しない又は存在する状態で、37℃で30分間培養された。消化は、アプロチニン(100ユニット)を添加することによって止められた。そして、混合物は、どの不溶性物質も取り除くため、14,000rpmで25分間、再び遠心分離された。上澄みはアンチG(Indiana)抗体によって免疫沈降され、SDS−PAGEにより分析された。
感染したウイルスの滴定量はプラーク測定法により測定された。6枚のウェルプレート内のBHK−21細胞(5x105)は、10フォルドの連続希釈法でウイルスと感染した。感染1時間後、接種材料は除去され、細胞は、0.9%の寒天及び5%のFBSを含んでいるDNMMによってオーバーレイされ、37℃で36時間培養された。培養期間後、プラークの数はカウントされ、少なくとも2回の希釈を平均した。ウイルス滴定量はプラーク形成単位(PFU)/mlとして表される。プラークは、75−200Nikonレンズを用いたNikonデジタル・カメラで撮影された。デジタル映像は、その後、拡大され、4x8インチのKodak写真用紙にプリントされた。ウイルス当たり、少なくとも15のプラークの大きさが測定され、平均化された。
〈結果〉
細胞表面上に発現する全ての変異タンパク質は、原型質膜に移送されるべく、ER内で十分に折りたたまれ、オリゴマー形成することを示している。しかし、いくつかの変異体は、移送に影響を及ぼすことなく、ショ糖密度勾配のトリマー安定性に影響を与えることが知られている(43、44)。膜融合活性が減少された細胞膜近傍領域の変異が、トリマー安定性に影響を与えるかどうか判定するために、酸性及び中性のpHでショ糖密度勾配遠心分離を行った。試験された変異体は、すべて、野生型G(pH5.6に緩衝された勾配中で遠心分離するには若干安定性が足りないG(+9)gBGを除く)に類似する沈降パターンを示した(表2)。
細胞表面上に発現する全ての変異タンパク質は、原型質膜に移送されるべく、ER内で十分に折りたたまれ、オリゴマー形成することを示している。しかし、いくつかの変異体は、移送に影響を及ぼすことなく、ショ糖密度勾配のトリマー安定性に影響を与えることが知られている(43、44)。膜融合活性が減少された細胞膜近傍領域の変異が、トリマー安定性に影響を与えるかどうか判定するために、酸性及び中性のpHでショ糖密度勾配遠心分離を行った。試験された変異体は、すべて、野生型G(pH5.6に緩衝された勾配中で遠心分離するには若干安定性が足りないG(+9)gBGを除く)に類似する沈降パターンを示した(表2)。
BHK−21細胞のコンフルエント単分子層は、多重度10で、WT又は変異ウイルスのいずれかに感染した。感染した6時間後、細胞を放射活性物質で標識し、〈材料と方法〉の欄で説明したようにして追跡した。トリマーを分析するために、細胞は、pH5.6まで緩衝された2xMNT中に溶解された。その後、溶解物は、同じpHに緩衝された5〜20%のショ糖密度勾配によって遠心分離された。破片は底部から採取され、Gタンパク質はポリクローナル・アンチVSV抗血清と共に免疫沈降した。トリプシン感受性を分析するために、細胞は、表示されたpHに緩衝された1xMNT中に溶解された。細胞残屑と核を除去すべく、溶解物は遠心分離によって清澄された。上清は、その後、TPCKトリプシンを用いて又は用いないで処理され、Gタンパク質はポリクローナル・アンチVSV抗体と共に免疫沈殿した。免疫沈殿したタンパク質は、SDS−PAGEによって分離され、蛍光写真撮影法によって視覚化され、デンシトメトリー走査法により定量化された。(+++)=95%〜100%抵抗性、(++)=50%〜95%抵抗性、(+)=10%〜50%抵抗性、(−)=<10%抵抗性。
おそらくは酸性pHによって誘発された構造変化によって、低いpHではGタンパク質はトリプシン消化に対する抵抗力を持つようになるため(42)、細胞膜近傍の変異体の融合誘導活性は、低いpHに誘発される構造変化に起因するかどうかを判定することが重要である。変異体及び野生型Gタンパク質のトリプシン消化に対するpHに依存する抵抗性を試験した(表2)。ほとんどの変異体は、野生型Gタンパク質に観察されたのと類似するトリプシン抵抗特性を示した。例えば、pH6.5では、約75〜80%の変異体及び野生型Gタンパク質がトリプシン消化に対する抵抗性を有する。変異体G(+9)gBGは、劇的な抵抗性パターンの変化を示し、pH6.5では消化に対して全面的に感受性で、pH5.6では部分的にのみ抵抗性を示す。しかし、2つの変異体、GD9及びG10DAFは、pH6.5では、トリプシン消化に対する抵抗性は少々低かった(それぞれ48%と40%)。
細胞間融合分析結果に基づいて、野生型G融合活性を示す変異体をエンコードする組み換え型ウイルスは、野生型VSVと同じように成長し、検知不能な膜融合活性を有するものは、野生型Gを使用した補完なしに成長できないであろうと予測される。予測されたように、点変異、挿入変異(G(AXB))、及び逆転配列変異(GSrev11、GSrev11−AA)はすべて、BEK−21細胞に成長したとき、野生型のVSVに類似する力価を示す。しかし驚くことに、細胞間融合活性において>99%の減少を示すウイルスのいくつかは(例えばGΔ9、GΔ13及びGΔ9−10DAF)、低い力価にもかかわらず、補完のためのGタンパク質の発現を必要することなく、BHK−21細胞上で成長し、拡散することができた(図26)。欠質変異体GΔ9は、常に、野生型ウイルスよりも100フォルド低い力価を与える。一方、欠質変異体GΔ13は、約100フォルド低い力価を有する。GΔ9−10DAFの力価は、野生型VSVの力価より約10,000フォルド低かった。野生型のVSV及び他の変異体は感染後24〜30時間でプラークが生じるのにもかかわらず、ウイルス力価が減少するのに一致して、これらの変異体によるプラーク形成は49〜60時間かかった(表3)。
回収又はその後の若しくは後に続く増殖中に(検知可能な膜融合活性が見かけ上存在しない状態で成長する能力を示す)、GΔ9、GΔ13又はGΔ9−10DAFのG遺伝子内に、補償する変異が生じたかどうか判定するために、これらのウイルスのG遺伝子全体で配列決定するRT−PCRを行なった。特異的に導入されたもの以外の他の変異は検知されなかった。このことは、ウイルスの表現型は、意図された変異が原因であることを示す。
G10DAF、G(+9)gBG、及びAF440−N449などの残りの変異体は、非感染性であり、それらの細胞間融合活性の欠如と一致する野生体Gタンパク質の共発現なしでは、BHK−21細胞中で成長することができなかった。すべての変異Gタンパク質はWTタンパク質のレベルと同様のレベルで組込まれたので、感染力の欠如はウイルス粒子に組み込まれたGタンパク質の量の差が原因ではない(図27)。
《実施例8−2》
細胞へのウイルス結合
〈材料及び方法〉
出芽性分析は、基本的には(46)で説明したようにして行われた。35mmプレート中のコンフルエントBHK−21細胞は、多重度10で、各変異体ウイルスに感染した。そして、吸着した後、残留した接種材料は、それぞれ37度で5分間攪拌しながら、無血清DMEM(SF−DMEM)でプレートを2回洗浄し、振動を備えたSF−DMEM中で2回洗浄することにより除去された。その後、細胞は、37度で、2mlのSF−DMEM中で培養された。培養した16時間後、上清は採取され、1,250Xgで10分間遠心分離することにより清澄された。プラーク測定法によってウイルス力価を測定するために、上清のアリコートを使用した。ウイルス粒子は、残った1.5mlの上清から、20%のショ糖クッション遠心分離(245,000rpm、35分間)によってペレット化された。ウイルスのペレットは、50mlの減少するサンプル緩衝液中で再懸濁された。各サンプルの5分の1(10ml)は、10%のポリアクリルアミドゲルにおける電気泳動によって分離された。ゲルは、製造業者の指定通りに、クーマシー(GELCODE-blue, PIERCE Co.)により染色された。ゲルは脱染され、35−80mmのニコン・レンズを使用したNikonデジタル・カメラを使用して撮影された。ウイルス・タンパク質の数量化は、Image Quant分析ソフトウェア(Molecular Dynamics)を使用して行われた。ウイルス生成は、Nタンパク質バンドの強度を測定することにより測定された。
細胞へのウイルス結合
〈材料及び方法〉
出芽性分析は、基本的には(46)で説明したようにして行われた。35mmプレート中のコンフルエントBHK−21細胞は、多重度10で、各変異体ウイルスに感染した。そして、吸着した後、残留した接種材料は、それぞれ37度で5分間攪拌しながら、無血清DMEM(SF−DMEM)でプレートを2回洗浄し、振動を備えたSF−DMEM中で2回洗浄することにより除去された。その後、細胞は、37度で、2mlのSF−DMEM中で培養された。培養した16時間後、上清は採取され、1,250Xgで10分間遠心分離することにより清澄された。プラーク測定法によってウイルス力価を測定するために、上清のアリコートを使用した。ウイルス粒子は、残った1.5mlの上清から、20%のショ糖クッション遠心分離(245,000rpm、35分間)によってペレット化された。ウイルスのペレットは、50mlの減少するサンプル緩衝液中で再懸濁された。各サンプルの5分の1(10ml)は、10%のポリアクリルアミドゲルにおける電気泳動によって分離された。ゲルは、製造業者の指定通りに、クーマシー(GELCODE-blue, PIERCE Co.)により染色された。ゲルは脱染され、35−80mmのニコン・レンズを使用したNikonデジタル・カメラを使用して撮影された。ウイルス・タンパク質の数量化は、Image Quant分析ソフトウェア(Molecular Dynamics)を使用して行われた。ウイルス生成は、Nタンパク質バンドの強度を測定することにより測定された。
〈結果〉
膜融合活性の減少または欠如、同様に、ある変異体中のウイルス感染力の欠乏の説明の1つとして、変異はGタンパク質の細胞へ結合する能力に影響を与えたかもしれない。変異がウイルスの結合に影響したかどうか判定するために、放射性標識ウイルス粒子が培養され、pH7.0又はpH5に緩衝された結合用培地中で、BHK−21細胞と共に培養された。ウイルス粒子のエンドサイトーシスを防止するために、同様に、低いpHへの暴露後に細胞膜を備えたウイルス・エンベロープの融合を防ぐために、結合は氷上で行われた。VSV結合は、酸性pHで促進される(8、47)。GΔ13及びAF440−N449以外は、試験した全ての変異体は、pH7.0及びpH5.9の両方で野生型VSVと類似する細胞へ結合した(図29)。GΔ13及びAF440−N449は両方とも、pH7.0では、一貫して、WTと比較して2フォルド良い結合を与えた。しかし、pH5.9では、GΔ13結合は野生型VSVより約10%少なかった。一方、ΔF440−N449結合は、野生型ウイルスと比較して50%減少した(図28)。これらのデータは、F440とV454との間の領域の残基がウイルス結合に寄与し、減少した結合量がこれらの変異体で見られた膜融合活性における欠如に部分的には原因となりうることを示す。DAF(G10DAF、GΔ9−10DAF)からの10aa、又はHSVgBからの9aaの挿入は、結合に影響を与えない。このことは、TMと外部ドメインとの間の残基の間隔は、結合にとって重要ではないことを示す。これらの結果に基づいて、G10DAF、G(+9)gBG、及びGΔ9−10DAFへの、融合活性及びウイルス感染力の欠如は、結合後の段階にある可能性が高いことは明らかである。
膜融合活性の減少または欠如、同様に、ある変異体中のウイルス感染力の欠乏の説明の1つとして、変異はGタンパク質の細胞へ結合する能力に影響を与えたかもしれない。変異がウイルスの結合に影響したかどうか判定するために、放射性標識ウイルス粒子が培養され、pH7.0又はpH5に緩衝された結合用培地中で、BHK−21細胞と共に培養された。ウイルス粒子のエンドサイトーシスを防止するために、同様に、低いpHへの暴露後に細胞膜を備えたウイルス・エンベロープの融合を防ぐために、結合は氷上で行われた。VSV結合は、酸性pHで促進される(8、47)。GΔ13及びAF440−N449以外は、試験した全ての変異体は、pH7.0及びpH5.9の両方で野生型VSVと類似する細胞へ結合した(図29)。GΔ13及びAF440−N449は両方とも、pH7.0では、一貫して、WTと比較して2フォルド良い結合を与えた。しかし、pH5.9では、GΔ13結合は野生型VSVより約10%少なかった。一方、ΔF440−N449結合は、野生型ウイルスと比較して50%減少した(図28)。これらのデータは、F440とV454との間の領域の残基がウイルス結合に寄与し、減少した結合量がこれらの変異体で見られた膜融合活性における欠如に部分的には原因となりうることを示す。DAF(G10DAF、GΔ9−10DAF)からの10aa、又はHSVgBからの9aaの挿入は、結合に影響を与えない。このことは、TMと外部ドメインとの間の残基の間隔は、結合にとって重要ではないことを示す。これらの結果に基づいて、G10DAF、G(+9)gBG、及びGΔ9−10DAFへの、融合活性及びウイルス感染力の欠如は、結合後の段階にある可能性が高いことは明らかである。
膜融合活性への影響に加えて、変異は、細胞から放出されたウイルス量を減少させることができる。GΔ9、GΔ13又はGΔ9−10DAFで観測されたウイルス力価の減少が、減少したウイルス出芽が原因であるかどうかを判定するために、各ウイルスの特異的感染力を測定した。前記測定は、ウイルス力価の、放出されたウイルスの相対量に対する比率として計算される(WTウイルスと比べて)。WTから作られるウイルス量の60%から90%で生産され、低下したウイルス力価を与える3つ変異体は全て、細胞を感染させた。したがって、これらの変異体が培養液中で拡散する能力の欠如は、ウイルスの出芽が原因ではなく、主として膜融合活性の欠如によるものである。
《実施例9》
IL−12Fを発現する組み換え型VSV−ΔG
〈材料及び方法〉
逆遺伝学によって組み換え型VSV−ΔGを作成するために、次のプラスミドを使用した。pBS−N、pBS−P、pBS−L、及びpBS−G(表示されたVSVタンパク質をエンコードする、pBluescriptベースのプラスミド(48))。プラスミドpVSVΔG−PLは、Gタンパク質のコーディング領域がポリリンカーと置換されたVSV−ΔGのアンチ・ゲノムRNAを発現するBluescriptBベースのプラスミドである(49)。プラスミドpCAGGS−GINDは、VSV Gタンパク質(GIND)のインディアナ血清型をエンコードする、pCAGGSベースのくプラスミドである。IL−12F構成物は、pSFG-m1Ll2.p4O.L.Δ.p35の構成物としてDr. Richard Mulligan(ハーバード大学)から得られた(50)。IL−12F構成物は、親プラスミドから取り出され、SmaI/SmaI断片としてBluescript SK(Strategene、 La Jolla、 CA)にクローン化した。そして、その後、pVSVΔG-IL12Fを作成するために、XhoI/EagI断片としてpVSVΔG-PLにクローン化した。
IL−12Fを発現する組み換え型VSV−ΔG
〈材料及び方法〉
逆遺伝学によって組み換え型VSV−ΔGを作成するために、次のプラスミドを使用した。pBS−N、pBS−P、pBS−L、及びpBS−G(表示されたVSVタンパク質をエンコードする、pBluescriptベースのプラスミド(48))。プラスミドpVSVΔG−PLは、Gタンパク質のコーディング領域がポリリンカーと置換されたVSV−ΔGのアンチ・ゲノムRNAを発現するBluescriptBベースのプラスミドである(49)。プラスミドpCAGGS−GINDは、VSV Gタンパク質(GIND)のインディアナ血清型をエンコードする、pCAGGSベースのくプラスミドである。IL−12F構成物は、pSFG-m1Ll2.p4O.L.Δ.p35の構成物としてDr. Richard Mulligan(ハーバード大学)から得られた(50)。IL−12F構成物は、親プラスミドから取り出され、SmaI/SmaI断片としてBluescript SK(Strategene、 La Jolla、 CA)にクローン化した。そして、その後、pVSVΔG-IL12Fを作成するために、XhoI/EagI断片としてpVSVΔG-PLにクローン化した。
IL−12Fタンパク質を発現する組み換え型VSV−ΔGの回収は、前述した逆転遺伝学的方法[Takada,1997年#1055、Robison,2000年#1057]を使用して行なわれた。この回収システムは、適切な宿主細胞内でのVSVを構成するタンパク質の発現と関連する組み換え型アンチ・ゲノムRNAの合成に基づく。VSV(N、P、L、及びG)の各必須構成タンパク質と、組み換え型アンチ・ゲノムの配列とをエンコードする遺伝子は、T7プロモーターの管理下で、個々のBluescriptベースのプラスミド上でエンコード化され、組み換え型アンチ・ゲノム・プラスミドはpVSVΔG−IL12Fにデザインされる。簡単に言えば、BHK−21細胞(T7ポリメラーゼ(vTF7−3)を発現する組み換え型vaccimiaウイルスに既に感染している)は、VSVのN、P、L、及びGタンパク質をエンコードするBluescriptベースのプラスミドを同時形質移入された。3:5:1:8:5の比率で、アンチ・ゲノム(pVSVΔG-IL12F)をエンコードするプラスミドも同様である。形質移入された細胞は、無血清DMEM(DNMM−0)中で5時間培養され、その後10%のFCS(DNEM−10)が補充されたDNMM中で48時間培養された。培養上清は、牛痘ウイルス粒子を取り出すために収集され、ろ過された(0.2μm)。そして、その後、pCAGGS−GINDを既に形質移入された未感染のBHK−21細胞上にオーバーレイされた。組み換え型ウイルスはGタンパク質を作成しないので、新しく出芽するウイルス粒子が感染性であるように、途中で供給されなければならない。そして、組み換え型ウイルスはプラーク精製され、増殖され、G補完BEK−21細胞上に滴定された。
BHK−21細胞はG補完VSVΔG−IL12F(MOI=5)に感染し、37℃で17時間、DMEM−0中で培養された。ΔGウイルス粒子を取り出すために、M−12Fタンパク質を含んでいる培養上清が収集され、20%を超えるショ糖、100,000Xgで遠心分離された。清澄された上清は、無菌のPBS(滅菌されたフィルタ)の3つの変更に対して透析され、−85℃で保管された。
精製したウイルス・プレパラートと同様に、VSVΔG−IL−12Fに感染したBHK細胞培養上清のタンパク質成分は、前述の手順を修正したものを用いて、SDS−PAGE(10%)によって単離された(51)。単離されたタンパク質は、クーマシー・ブリリアント・ブルー(Sigma Chemical Co、 St Louis、 MO)で染色することにより視覚化された。
ウエスタン分析は(52)に前述した手順を修正したものを用いて行なわれた。簡潔に言えば、10%のSDS−PAGEによって単離されたタンパク質は、ニトロセルロース膜に電気泳動的に移送され、その後ILの特定のmAb(CI7.8.20.15)でプローブされた。TBSTで数回洗浄した後、膜はアンチ・マウスIgペルオキシダーゼ(Sigma Chemical Co)でプローブされた。非結合性の第2AbはTBSTで洗浄することにより取り出され、膜へ結合する第2抗体は、ルネッサンス・ウエスタンブロット・ケミルミネサンス試薬システム(Renaissance Western Blot Chemiluminescence)(NEN Life Science Products Co、 Boston、MA)を使用して検出された。
〈結果〉
逆遺伝学アプローチを使用して、その複製サイクル中に大量のvIL−12Fを発現する複製が制限された水疱性口内炎ウイルス(VSV−ΔG)を構成した。IL−12FをエンコードするcDNAは、図28Aに図示するようにDr. Richard Mulligan及び同僚(50)によって最初に構成された。組み換え型VSVΔG−IL12Fの作成は、組み換え型VSVのアンチ・ゲノムをエンコードするプラスミドと同様に、VSV N、P、G、及びLタンパク質(全てT7プロモーター管理下)をエンコードするプラスミドを有するBHK細胞と共に、組み換え型牛痘ウイルス(T7を発現する)に感染したBHK細胞の同時形質移入によって行われた。図28Bは、アンチ・ゲノム・プラスミドのGコード領域がIL−12Fコード領域と置換された、組み換え型VSVΔG−IL12Fの構成を示す。同時形質移入されたBHK細胞から回収された組み換え型VSVΔG−IL12Fは、プラーク精製され、増殖され、Gタンパク質を発現するBHK細胞上に滴定された。結果として生じたG補完ウイルスは、細胞を感染させて複製することができるが、Gタンパク質が途中で供給されない場合、非感染性の「むき出しの(bald)」ウイルス粒子を生成する。
逆遺伝学アプローチを使用して、その複製サイクル中に大量のvIL−12Fを発現する複製が制限された水疱性口内炎ウイルス(VSV−ΔG)を構成した。IL−12FをエンコードするcDNAは、図28Aに図示するようにDr. Richard Mulligan及び同僚(50)によって最初に構成された。組み換え型VSVΔG−IL12Fの作成は、組み換え型VSVのアンチ・ゲノムをエンコードするプラスミドと同様に、VSV N、P、G、及びLタンパク質(全てT7プロモーター管理下)をエンコードするプラスミドを有するBHK細胞と共に、組み換え型牛痘ウイルス(T7を発現する)に感染したBHK細胞の同時形質移入によって行われた。図28Bは、アンチ・ゲノム・プラスミドのGコード領域がIL−12Fコード領域と置換された、組み換え型VSVΔG−IL12Fの構成を示す。同時形質移入されたBHK細胞から回収された組み換え型VSVΔG−IL12Fは、プラーク精製され、増殖され、Gタンパク質を発現するBHK細胞上に滴定された。結果として生じたG補完ウイルスは、細胞を感染させて複製することができるが、Gタンパク質が途中で供給されない場合、非感染性の「むき出しの(bald)」ウイルス粒子を生成する。
vIL−12Fを作成するために、BHK細胞をVSVΔG−IL12F(MOI=5)に感染させ、タンパク質フリーの培地で17時間培養した。その後、培養上清は収集され、遠心分離(ウイルス粒子は20%のショ糖クッション遠心分離によりペレット化された)によって清澄された。感染したBHK細胞からのvIL−12F分泌を評価するために、清澄前及び清澄後の上清及びウイルス・ペレットのサンプルは、SDS−PAGEによって分析され、続いてクーマシー・ブルーで染色され(図29A)、IL−12p40固有のmAbでウエスタンブロット分析が行われた(図29B)。VSVΔG−IL−12Fに感染した細胞からの事前に清澄化された上清(図29A、レーン1)は、vIL−12Fの予想されたサイズ(およそ70kDa)に相当する追加のバンド(ダブレット)と同様に、Gタンパク質以外の全てのVSVタンパク質の存在を明らかにする。ウエスタン分析は、この顕著な70kDaのバンドが確かにvIL−12F(図29B、レーン1)であることを確認した。上清からウイルス(図29A,レーン2及び3、図29B,レーン2)を取り除かれると、清澄された上清に残る唯一の検知可能なタンパク質はIL−12Fであった。ウイルス・ペレットの分析は、組み換え型VSVΔG−IL12Fゲノム(L、N及びP、及びM)によってエンコードされたウイルスタンパク質のそれぞれが容易に検知できることを明らかにしたが(図2A、レーン4)、vIL−12F(図29A、レーン4、及び図29B、レーン3)の検知できる量はない。予想通りに、VSV Gタンパク質(ウイルスの感染力に必要となる表面の糖タンパク質)に対応するバンドが検知できなかったことはさらに指摘されるべきである。これらの結果は、大量のvIL−12FがVSVΔG−IL12Fに感染したBHK細胞から生産、分泌され、清澄された培養上清のタンパク質含有量の>95%が、vIL−12Fであったことを明白に示す。
《実施例10》
IL−12Fを発現する組み換え型VSV−ΔGは、リステリア感染に対する抗原特異反応を促進する。
IL−12Fを発現する組み換え型VSV−ΔGは、リステリア感染に対する抗原特異反応を促進する。
〈材料及び方法〉
雌のC3HeB/FeJマウスは、ジャクソン研究所(Bar Harbour, ME)から得られた。各実験では、マウスの年齢を一致させ、8〜16週齢のマウスを使用した。マウスは、食事と水を備えた、任意の市販されている実験用のマイクロ・アイソレーター・ケージに収容した。
雌のC3HeB/FeJマウスは、ジャクソン研究所(Bar Harbour, ME)から得られた。各実験では、マウスの年齢を一致させ、8〜16週齢のマウスを使用した。マウスは、食事と水を備えた、任意の市販されている実験用のマイクロ・アイソレーター・ケージに収容した。
抗体に対する特異性およびソースは次の通りである。PEと複合したアンチ・CD5(クローン53.7.3、ref(53)参照)及びアンチ・CD3(クローン145−2C11、ref(54)参照)、FITCを複合したアンチ・CD45R/B220(クローンRA3−6B2、(55)参照)、アンチ・TCRβ鎖(クローンH57−597、ref(56)参照)、アンチ・γδ TCR(クローンGL3、ref(57、58)参照)、アンチ・CD4(クローンRM4−5、ref(59)参照)、及びアンチ・CD8(クローン53−6.7、60参照)抗体。全てのアイソタイプの対照抗体は、商業的に得られた(Pharmingen、 San Diego、 CA)。また、アンチ−IFN−γ ハイブリドーマ R4−6A2(American Type Culture Collection又はATCC、Rockville、MD、ATCC #HB170)、Rockville、MD(61)及びXMG1.2(62)は、DNAX社(Palo Alto、 CA)によって提供された。また、アンチ・マウスIL−12ハイブリドーマC17.8.20.15は、Dr. G. Trinchieri(Wistar Institute、 Philadelphia、 PA)によって提供された。研究所のセル・ラインで作成されたmAbは、タンパク質A又はタンパク質Gアフィニティー・クロマトグラフィー(63)によって、培養上清から精製された。精製された抗体は、ELISA分析に使用するために、標準的な技術を用いて、ビオチンと直接的に結合された(63)。
個々の抗原/サイトカイン混合物の成分、及び使用された免疫付与スケジュールは、結果の欄に記載する。全ての注入量は、エンドトキシンフリーのPBSを使用して、総体積が1mlとなるように準備され、腹腔内に投与された。これらの研究で使用されるラットのrIL−12はGenetics Institute(Andover, MA)から受け取ったものであった。
実験用のリステリア・モノサイトゲネスを感染させるのは、亜致死量(目標投与量:6×103)の生存Lモノサイトゲネス菌株43251(ATCC)を、複腔内注入することによって行った。マウスは、生菌のLモノサイトゲネス(C3HeB/FeJラットに対して、目標投与量:4〜6x105、約10xLD50)を複腔内注入により大量投与することによって感染する。注入に使用されるリステリア菌は、通気を備えた37℃の脳心臓注入(brain heart infusion: BHI)培養液(Difco Laboratories、 Detroit、 MI)中で一晩培養された。バクテリアは、PBS中で3回洗浄され、濃度はBF11寒天プレート上のコロニー数をカウントする光学濃度法によって測定された。加熱死菌されたリステリア菌(Heat-killed Listeria monocytogenes: HKLM)は、バクテリアを80℃で1時間培養することにより作成された。加熱死菌された試料は、BHI寒天プレート上で、生存していないことが検査された。バクテリアは、死滅させる前に3回洗われ、LPSフリーのPBS中で再懸濁された。
溶解性リステリア・タンパク質(Soluble listerial protein: SLP)は、前述した(64)のようにして作成された。簡単に言えば、Lモノサイトゲネスは、BHI培養液中で、37℃で一晩培養された。そして、バクテリアは遠心分離によってペレット化され、PBS中で洗浄され、少量のPBS中で再懸濁された。その後、懸濁液は超音波処理され、微粒子は遠心分離によってペレット化された後廃棄され、上澄みは、PBSに対して透析された。その後、上澄みは、等密度勾配遠心分離によって塩化セシウム上に結合され、破片を含むタンパク質は同定され、収集され、PBSに対して透析された。
腹腔滲出細胞(PEC)は、0.06%BSA、10mMのHepes緩衝溶液(Irvine Scientific, Santa Anna, CA)、50U/mlのペニシリン、50μg/mlのストレプトマイシン、10U/mlのヘパリンを追加したBBSSでの腹腔洗浄によりマウスから得られた。免疫化群の全てのマウスからの細胞は、プールされた。マクロファージは、37℃で2時間、100mmの組織培養処置されたプレート(Coming Inc., Corning, NY)内でPBC(4x106/ml/ウェル)を培養することによって単離された。非接着細胞は、除去及びプールされ、形成性非接着腹腔滲出細胞(PNA)と呼ばれる細胞集団になった。腹腔洗浄に続いて、無菌解剖によって脾臓が除去された。
PNAは、培養培地(10%FCS、5x10−5Mの2−ME、0.5mMのピルビン酸ナトリウム、10mMのHepes緩衝溶液、50U/mlのペニシリン、50μg/mlのストレプトマイシン、及び2mMのLグルタミンを補充したRPMI1640)中に懸濁され(1.5x106/ml)、種々のインビトロ刺激薬が24ウェルプレート(Corning Inc., Corning, NY)に所定の最適用量(図の説明に示されている)で加えられた。刺激薬インビトロとして用いられる試薬には、シグマケミカル社(Sigma Chemical Co.(St. Louis, MO))から購入できるCon A(2μg/ml)と、BKLM(107/ml)と、SLP(8μg/ml)とがある。細胞培養物は、37℃で24時間培養され、その後、IL−2及びIFN−γ定量分析で使用するために上清が冷凍され(−20℃)、保存された。
IL−2は、上述のバイオアッセイ(65,66)を用いてPNA培養上清で定量された。簡単に言えば、PNA培養物からの上清は、全量200μlの培養培地において1x104HT−2細胞(IL依存T細胞株)と共に96ウェル組織培養プレートに移され、37℃で培養された。培養の24時間後に[3H]チミジン(1μgCi/ウェル)が加えられ、細胞は、Filtermateセルハーベスター(Packard Instrument Co., Inc., Downers Grove., IL)を使用してガラス繊維フィルタに6〜18時間後に採取され、マトリックス9600直読型ベータカウンタ(Matrix 9600 Direct Beta counter)(Packard Instrument Co.)を使用してカウントされた。上清のIL−2濃度は、種々の濃度のIL−2を含むウェルから作成される標準曲線に関連がある。IL−2標準物質の源はP815−IL−2(67)培養物から得られる上清であり、この上清のIL−2濃度は、ヒトのrIL−2の既知の濃度(ワシントン州シアトルのイミュネクス社(Immunex. Corp)提供)と比較して前述の分析を用いて測定された。通常、この分析は約500U/mlに対して線形であり、検出下限界は約5U/mlであった。全ての分析は3回実施され、結果は三重反復サンプルの平均(+/−SD)として報告された。
Cherwinskiらの文献(62)に記載されているように、IFN−γはサンドイッチELISA分析を用いてPNA培養上清で測定された。R4−6A2は捕獲抗体として働き、ビオチン化XMG1.2は検出抗体として働く。ビオチンシグナルを増幅するためにストレップアビジン−ペルオキシダーゼ(StrepAvidin-peroxidase)(Sigma Chemical Co.)が用いられ、分析を現像するために現像緩衝溶液(600μgのABTS及び0.02%の過酸化水素を含む50mMクエン酸緩衝溶液)が用いられた。405mnでの吸光度は、SpectraMax340自動プレート読取器(Molecular Devices, Sunnyvale, CA)を用いて読み取られた。上清中のIFN−γ濃度は、種々の濃度のマウスrIFN−γ(Genzyme Corp., Cambridge, MA)が捕獲されるウェルから作成される標準曲線に関連がある。通常、分析は約120U/mlに対して線形であり、検出下限界は約8U/mlであった。全ての分析は3回実施され、結果は三重反復サンプルの平均(+/−SD)として報告された。
フローサイトメトリーは、前述のように実施された(68,69)。簡単に言えば、PNA(1〜5x105)は、25μlの所定最適濃度の蛍光色素抱合mAbを用いて氷上で30分間培養され、3%FCS及び0.1%アジ化ナトリウムを含むPBSで2回洗浄され、PBS中で1%パラホルムアルデヒドを用いて固定された。サンプルは、分析のためにリンパ球集団を選択するべくゲーティングする前方散乱/側方散乱を用いてFACScan(登録商標)(Becton Dickinson & Co., Mountain View, CA)で分析された。各テスト抗体に対する背景免疫蛍光レベルを決定するために、アイソタイプ対応対照Igが用いられた。
〈結果〉
リステリア症のマウスモデルは、十分に確立されており、細胞仲介性の免疫反応のメカニズムを研究するために利用可能な最もよく知られているシステムである。致死量以下の生存可能なリステリアに感染したマウスが迅速に感染をクリアし、長寿命の防御リステリア免疫が残されることは文献にも示されている(70−72)。対照的に、マウスに高投与量の生存可能なリステリアを接種すると、結果的に、2〜4日間で脾臓及び肝臓における細菌の無制御複製によって特徴付けられるような全身感染が生じ、感染後4〜10日の間に死に至る(71,73)。脾臓及び肝臓における細菌の数はマウスの免疫状態と、反比例しているので、感染から2〜4日後にこれらの器官でリステリアを数え上げることは、リステリア感染に対するマウスの感受性を決定する一般的に認められた方法である(74)。リステリアに対する特異的後天免疫は、感受性が高いマウスにおいて観察される細菌負荷と比較して、脾臓又は肝臓における細菌負荷における2〜4log10減少によって特徴付けられる。HKLM(及び他のリステリアサブユニット製剤)は単独で投与されたときに免疫抗原性が十分でないことが知られているが(75,76)、そのような抗原を有効なアジュバントと同時投与すれば防御免疫反応を生じさせ得ること(68,69,77)に留意することも重要である。従って、細胞性免疫の研究のためのモデルとしての有用性に加えて、リステリア症のマウスモデルは、ワクチン製剤又は免疫療法の有効性を評価するための優れたモデルでもある。
リステリア症のマウスモデルは、十分に確立されており、細胞仲介性の免疫反応のメカニズムを研究するために利用可能な最もよく知られているシステムである。致死量以下の生存可能なリステリアに感染したマウスが迅速に感染をクリアし、長寿命の防御リステリア免疫が残されることは文献にも示されている(70−72)。対照的に、マウスに高投与量の生存可能なリステリアを接種すると、結果的に、2〜4日間で脾臓及び肝臓における細菌の無制御複製によって特徴付けられるような全身感染が生じ、感染後4〜10日の間に死に至る(71,73)。脾臓及び肝臓における細菌の数はマウスの免疫状態と、反比例しているので、感染から2〜4日後にこれらの器官でリステリアを数え上げることは、リステリア感染に対するマウスの感受性を決定する一般的に認められた方法である(74)。リステリアに対する特異的後天免疫は、感受性が高いマウスにおいて観察される細菌負荷と比較して、脾臓又は肝臓における細菌負荷における2〜4log10減少によって特徴付けられる。HKLM(及び他のリステリアサブユニット製剤)は単独で投与されたときに免疫抗原性が十分でないことが知られているが(75,76)、そのような抗原を有効なアジュバントと同時投与すれば防御免疫反応を生じさせ得ること(68,69,77)に留意することも重要である。従って、細胞性免疫の研究のためのモデルとしての有用性に加えて、リステリア症のマウスモデルは、ワクチン製剤又は免疫療法の有効性を評価するための優れたモデルでもある。
vIL−12Fのアジュバント活性を高めるために、PBS、109 HKLM/10μg SLP (LMAg) + PBS、LMAg + 0.5μg rIL12、LMAg + 0.5μg vIL-12F、又はLMAg + 5.0μg vIL-12Fのいずれかで、0、5、及び15日目にC3HeB/FeJマウス(5/群)を免疫化した。20日目に、マウスは屠殺処分され、分析のために組織が収集された。PECが洗浄によって収集され、プールされ、PNA集団が調製され、PNAが所定の最適用量で37℃、24時間、一連の刺激(培養培地:それ以上の刺激なし、Con A:多クローン性T細胞刺激装置、BKLM又はSLP:リステリア抗原調製)によってインビトロ再刺激された。免疫反応性の1つの指標として、これらの培養物から得られた細胞不含上清が分析され、示されたインビトロ刺激に反応してT細胞によって産出されるIL−2(図30A)及びIUN−γ(図30B)が定量された。
以前の研究(68,69,77)において観察されたように、LMAg + rIL-12(陽性対照)で免疫されたマウスは、致死「免疫」量以下の生存可能なリステリアに感染したマウスによって産出されるものに類似したリステリア抗原特異的T細胞を産出した。また予想通りに、PIBS単独又はLMAg + PBS(陰性対照)で免疫されたマウスは検出可能なリステリア特異T細胞反応を開始できなかった。LMAg + 0.5μg vIL-12F又はLMAg + 5.0μg vIL-12Fのいずれかのワクチン製剤を受容したマウスからのT細胞の反応性のパターンは、LMAg + rIL-12(陽性対照)群からのT細胞によって産出されるパターンに酷似していた。それに加えて、これら2つのテスト群によって引き起こされる反応は、いくらかvIL−12F投与量に依存しているように見えた。高投与量のvIL−12Fと共にLMAgを受容したマウスから得られるT細胞は、リステリア抗原による刺激インビトロに続いて大量のIL−2及びIFN−γを産出した。これらの発見は、各免疫化群からのマウスの相対的な脾臓サイズによって示唆される免疫刺激の一般状態と関連していた。2つの陰性対照処置群(PBS、LMAg + PBS)と比較して、LMAg及びvIL−12Fで免疫された各マウスのみならず、陽性対照マウス(LMAg + rIL-12)の各々に脾臓サイズの劇的な増加が観察された(データ表示せず)。さらに、LMAg + 5.0μg vIL-12Fを受容したマウスにおいて観察された脾腫が低用量のvIL−12F(LMAg + 0.5μg vIL-12F)を受容したマウスよりさらにはっきりしていたので、vIL−12F投与量依存反応は明白であった。これらの結果は、非免疫抗原性抗原鉱物油への免疫反応性を促進する能力の点でvIL−12Fが天然のrIL−12と類似していることを示す。
LMAg及びvIL−12Fで免疫されたマウスの免疫状態の更なる尺度として、フローサイトメトリー分析が実施され、各免疫された動物の腹腔キャビティ(PNA)における細胞集団レジデントを特徴付けた。抗CD5及び抗CD45R/B220で二重染色されたPNAの分析は、LMAg、及びrIL−12又はvIL−12Fのいずれかで免疫されたマウスにおいてCD45R/B220+(B細胞)及びCD5lo/B220lo(B1 B細胞)の減少と同時に起きるCD5+細胞(T細胞)の細胞周期の著しい増加(3〜4倍)を明らかにした(陰性対照免疫化群から得られるマウスにおいて観察される細胞周期と比較して;図31A及び31C)。これらの動物のCD3+腹腔細胞集団をさらに特徴付けるため、PNAは、抗CD3と、抗αβTCR、抗γδTCR、抗CD4又は抗CD8のいずれかで二重染色され、フローサイトメトリー分析が行われた(図31B)。CD5染色パターンに観察されたのと同様に、LMAg、及びrIL−12又はvIL−12Fのいずれかを受容した動物においては、陰性対照製剤(図31B及び31D)を受容したマウスにおけるものと比べて、腹腔リンパ球集団内のCD3+細胞周期が劇的に高かった(3〜4倍)ことをCD3染色パターンは明らかにした。それに加えて、LMAg、及びrIL−12又はvIL−12Fのいずれかを受容したマウスは、αβTCR+/CD4+細胞の腹腔細胞周期の選択的増加を経験した(それぞれ図31E、31F)。ここで報告された結果は、LMAとvIL−12Fの同時投与によって誘発される腹腔細胞周期の変化がLMAg + rIL-12処置によって誘発される変化をそっくりに真似ることを明らかにした。さらに、最近のレポートにおいて、LMAg + rIL-12(陽性対照)を受容したマウスが直面する腹腔細胞周期の変化は、以前観察及び報告されたもの(68,69,77)と一致する。
《実施例11》
LMAg + vIL-12Fと比較した長寿命の防御リステリア免疫の投与。
LMAg + vIL-12Fと比較した長寿命の防御リステリア免疫の投与。
〈材料及び方法〉
免疫化/感染宿受容者からの無菌除去の後、各脾臓/肝臓は、すりガラスホモジナイザーを用いてホモジナイズされた。細胞は、細胞内細菌を放出するために、0.5%のトリトンX−100(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)を含む全量10mlのPBSで処置することによって分裂された。各サンプルの連続10倍希釈溶液が作られ、各希釈溶液の100μlがBHIプレート上に均一に拡散され、これらの器官における生リステリアを定量した。
免疫化/感染宿受容者からの無菌除去の後、各脾臓/肝臓は、すりガラスホモジナイザーを用いてホモジナイズされた。細胞は、細胞内細菌を放出するために、0.5%のトリトンX−100(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)を含む全量10mlのPBSで処置することによって分裂された。各サンプルの連続10倍希釈溶液が作られ、各希釈溶液の100μlがBHIプレート上に均一に拡散され、これらの器官における生リステリアを定量した。
〈結果〉
AL−12Fを典型的な非免疫抗原性抗原と同時投与することで防御免疫反応をconferすることが可能かを決定するために、0、5、15日目に、C3Heb/FeJマウス(5/群)が、PBS単独、LMAg + PBS、5.0μg VIL-12F + PBS、LMAg + 0.5μg vIL-12F、又はLMAg + 5.0μg vIL-12Fのいずれかで免疫された。追加された群のマウスは、単回投与の致死量以下(6x103/マウス、又は0.12xLD50)の生存可能なリステリア(リステリア感染した;陽性対照)を0日目に受容した。この群のマウスは、その後のリステリア症から回収する典型的な後天免疫に対するベンチマークに用いられた。45日目に、マウスは致死量の生存可能なリステリア(6.4x105又は12.9xLD50)で(腹腔内の)感染した。マウスは49日目に殺処分され、各マウスの脾臓(図32A)及び肝臓(図32B)での細菌負荷が決定された。LMAg + 5.0μg vIL12Fを受容したマウスの器官に観察された細菌負荷は、PBS対照群と比較して劇的に減少した(脾臓及び肝臓でそれぞれ2.72、4.12 log10減少)。実際、これらの結果は、動物の脾臓及び肝臓における細菌負荷がそれぞれ3.98、2.93 log10減少を経験したような免疫量の生存可能なリステリア(陽性対照群)を受容した動物において観察されるものと類似していた。これらの結果は、LMAg + 5.0μg VIL-12Fで免疫化されたマウスが防御リステリア特異免疫反応を引き起こすことを示す。LMAg + 0.5μg vEL-12Fでの免疫化は、各動物の脾臓及び肝臓における細菌負荷の中程度の減少(それぞれ1.41、2.90 log10減少)によって証明されるように、部分的に防御免疫反応を促進するようにみえる。予想通り、LMAg + PBS(それぞれ0.37、0.45 log減少)又はvIL-12F + PBS(それぞれ0.08、0.56 log10減少)で免疫化されたマウスの脾臓及び肝臓では、細菌負荷の減少は殆ど又は全く見られなかった。この実験において観察される防御免疫(及びvIL−12F投与量依存反応)は、LMAg + vIL-12Fで免疫されたマウスにおけるリステリア特異T細胞の存在(再刺激された腹腔リンパ球インビトロによるIL−2及びIFN−γ産出によって示される;図31)とよく関連していた。
AL−12Fを典型的な非免疫抗原性抗原と同時投与することで防御免疫反応をconferすることが可能かを決定するために、0、5、15日目に、C3Heb/FeJマウス(5/群)が、PBS単独、LMAg + PBS、5.0μg VIL-12F + PBS、LMAg + 0.5μg vIL-12F、又はLMAg + 5.0μg vIL-12Fのいずれかで免疫された。追加された群のマウスは、単回投与の致死量以下(6x103/マウス、又は0.12xLD50)の生存可能なリステリア(リステリア感染した;陽性対照)を0日目に受容した。この群のマウスは、その後のリステリア症から回収する典型的な後天免疫に対するベンチマークに用いられた。45日目に、マウスは致死量の生存可能なリステリア(6.4x105又は12.9xLD50)で(腹腔内の)感染した。マウスは49日目に殺処分され、各マウスの脾臓(図32A)及び肝臓(図32B)での細菌負荷が決定された。LMAg + 5.0μg vIL12Fを受容したマウスの器官に観察された細菌負荷は、PBS対照群と比較して劇的に減少した(脾臓及び肝臓でそれぞれ2.72、4.12 log10減少)。実際、これらの結果は、動物の脾臓及び肝臓における細菌負荷がそれぞれ3.98、2.93 log10減少を経験したような免疫量の生存可能なリステリア(陽性対照群)を受容した動物において観察されるものと類似していた。これらの結果は、LMAg + 5.0μg VIL-12Fで免疫化されたマウスが防御リステリア特異免疫反応を引き起こすことを示す。LMAg + 0.5μg vEL-12Fでの免疫化は、各動物の脾臓及び肝臓における細菌負荷の中程度の減少(それぞれ1.41、2.90 log10減少)によって証明されるように、部分的に防御免疫反応を促進するようにみえる。予想通り、LMAg + PBS(それぞれ0.37、0.45 log減少)又はvIL-12F + PBS(それぞれ0.08、0.56 log10減少)で免疫化されたマウスの脾臓及び肝臓では、細菌負荷の減少は殆ど又は全く見られなかった。この実験において観察される防御免疫(及びvIL−12F投与量依存反応)は、LMAg + vIL-12Fで免疫されたマウスにおけるリステリア特異T細胞の存在(再刺激された腹腔リンパ球インビトロによるIL−2及びIFN−γ産出によって示される;図31)とよく関連していた。
LMAg + vIL-12Fでの免疫化によって与えられた防御免疫が長寿命であったかを決定するために、0、5、15日目に、C3Heb/FeJマウス(5/群)がLMAg + 5.0μg v1L-12F又は適切な対照製剤で免疫された。追加群のマウスは、単回投与の免疫量(6x103/マウス又は0.12xLD50)の生存可能なリステリア菌(リステリア感染した;陽性対照)を0日目に受容した。最後の追加免疫が投与されてから3カ月又はそれ以上後で(120日目)、各マウスは(腹腔内の)、大量感染(3.8x105/マウス又は7.6xLD50)の生存可能なリステリアを受容した。その4日後(124日目)、マウスは処分され、リステリア菌に対する感受性の1つの指標として各マウスの脾臓及び肝臓における細菌負荷が定量された。上述の短期的防御免疫試験(図33)で観察された結果と同様に、LMAg + vIL-12F(それぞれ1.84、2.23 log10減少)又は免疫量の生存可能なリステリア(それぞれ2.55、1.61 log10減少)のいずれかで免疫されたマウスの脾臓及び肝臓で細菌負荷の劇的な減少(PBS処置群と比較して)が観察されたが、LMAg又はvIL−12Fのいずれか単独で免疫されたマウスの場合には観察されなかった(図33)。これらの結果は、致死量以下のリステリアでの感染により誘発されたものと同様に、LMAg + vIL-12Fでの免疫化が長寿命の防御免疫を与えることを実証する。
《実施例11》
rVSV−DsRedは、インビトロでC6グリオーマに対して強い細胞毒性活性を示す。
rVSV−DsRedは、インビトロでC6グリオーマに対して強い細胞毒性活性を示す。
〈材料及び方法〉
C6グリオーマ細胞株(American Type Culture Collection, Manassas, VA)は、15%の熱失活したウマ血清と、2.5%の熱失活したウシ胎児血清と、100i.u./mlのペニシリンと、100μg/mlのストレプトマイシンとを補充したHams/F12において37℃、5%のCO2で単層培養として維持された。C6グリオーマ細胞株は、増強された視覚分析を可能にするべく緑色蛍光タンパク質(GFP)を発現するpFBレトロウイルス(Stratagene, La Jolla, CA)で安定に形質導入された。GFPで安定に形質導入された細胞は、高レベルのGFPを均一に発現する細胞集団を作成すべくフローサイトメトリーを用いて選別された。スライス培養物への接種のための細胞を作成するために、指数関数的に成長する細胞は、EDTA/トリプシンによって37℃で5分間採取された。トリプシン処理は上述の完全培地で終了され、細胞は1,000RPMで5分間遠心された。ペレットは、無菌リン酸緩衝生理食塩溶液(PBS)中に再懸濁され、トリパンブルー染色法を用いて計数された。ペレットはその後3x104細胞/μlの濃度でPBS中に再懸濁され、スライス培養物に接種するで氷上に置かれた。
C6グリオーマ細胞株(American Type Culture Collection, Manassas, VA)は、15%の熱失活したウマ血清と、2.5%の熱失活したウシ胎児血清と、100i.u./mlのペニシリンと、100μg/mlのストレプトマイシンとを補充したHams/F12において37℃、5%のCO2で単層培養として維持された。C6グリオーマ細胞株は、増強された視覚分析を可能にするべく緑色蛍光タンパク質(GFP)を発現するpFBレトロウイルス(Stratagene, La Jolla, CA)で安定に形質導入された。GFPで安定に形質導入された細胞は、高レベルのGFPを均一に発現する細胞集団を作成すべくフローサイトメトリーを用いて選別された。スライス培養物への接種のための細胞を作成するために、指数関数的に成長する細胞は、EDTA/トリプシンによって37℃で5分間採取された。トリプシン処理は上述の完全培地で終了され、細胞は1,000RPMで5分間遠心された。ペレットは、無菌リン酸緩衝生理食塩溶液(PBS)中に再懸濁され、トリパンブルー染色法を用いて計数された。ペレットはその後3x104細胞/μlの濃度でPBS中に再懸濁され、スライス培養物に接種するで氷上に置かれた。
ウイルス感染をリアルタイムで追跡するため、有色イソギンチャク(sea anemone-Discosoma sp.(BD Biosciences-Clontech))由来の市販されている色素タンパク質である赤色蛍光タンパク質DsRedに対してcDNAを発現するようなrVSVを作成した。DsRedタンパク質のためのcDNAは、親プラスミドから切除され、前述(3)のpVSV-ΔG-GSHA/GFPへの親ベクターである、pVSV-MCS 2.6の複数のクローニング部位にサブクローニングされた。結果として得られる組換えウイルスrVSV−DsRedは、我々の実験室で予め確立され他に記載された標準手順(78)を用いて回収され、特徴付けられた。rVSV−ΔG−DsRedを構成するために、L遺伝子の上流に位置するpVSV-ΔG-PL 31の複数のクローニング部位にDsRedに対するcDNAをサブクローニングした。組換えウイルスrVSV-ΔG-DsRedは、先に述べた方法論(3)を用いて回収された。ΔG−DsRedはウイルス性糖タンパク質をエンコードしないので、ウイルスは、VSV−Gタンパク質を過渡的に発現する細胞内で増殖される。従って、細胞の感染は、VSV−Gタンパク質補充ウイルスを利用する。
C6グリオーマ細胞は、100U/mlのペニシリンと100μgのストレプトマイシン、15%のウマ血清と、2.5%のウシ胎児血清とを補充した全量100μlのHams/F12培地において、30%、60%、90%の密集度で96ウェル平底プレートに3通りにプレーティングされた。細胞は、付着を可能にするために37℃で一晩培養された。培養物は、種々の量(101〜105pfu)のrVSV−DsRedを接種された。ウイルス接種材料の追加に続いて、感染から4、8、24、36、48、72、96時間後に細胞価96R非放射性細胞増殖分析(CellTiter 96R Non-Radioactive Cell Proliferation assay(G5421, Prornega, Madison, WI))を用いて細胞死が分析された。この分析では、化合物MTS[(4,5−ジメチルチアゾ−ル−2−yl) (3−カルボキシメトキシフェニル) (4−スルホンフェニル) 2H Tetrozolium]は20:1の比で電子結合試薬フェナジンメトサルフェートと混合され、96ウェルプレート培養物に加えられる。MTS試薬は、代謝的に活性な細胞においてデヒドロゲナーゼ酵素によって生細胞によって水溶性ホルマザンに変えられる。従って、生細胞の数は、490nmで読み取られるホルマザン生成量に正比例する。各時点で培養物に存在する生細胞の割合は、Lab Systems Multiskan Biochromatic Elisaプレートリーダー(Vienna, Virginia)を用いて、各条件に対するMTS分析からの490nmでの絶対値を未処置の対照細胞と比較することによって計算された。記載されている全ての値は、3つのデータポイントの平均を表す。
〈結果〉
C6−GFPグリオーマ細胞が、DsRedをエンコードするrVSV−wtによる感染に感受性が高いことを確認するために、6ウェルディッシュで成長させた細胞を101〜105pfuの量のウイルスに感染させた。図33は、105pfuでのC6グリオーマの感染の経時変化を示す。殆どの細胞は、VSV感染の特徴的な細胞変性効果、即ち感染後24時間以内の細胞ラウンディング(cell rounding)及び細胞死を示した。95%以上の細胞は48時間以内にディッシュを外した。より低いウイルス性の接種材料に感染しても類似の細胞変性効果が生じるが、速度は遅い(データ表示せず)。これらの結果は、C6グリオーマ細胞がrVSV−DsRedによる感染に感受性があることを示している。
C6−GFPグリオーマ細胞が、DsRedをエンコードするrVSV−wtによる感染に感受性が高いことを確認するために、6ウェルディッシュで成長させた細胞を101〜105pfuの量のウイルスに感染させた。図33は、105pfuでのC6グリオーマの感染の経時変化を示す。殆どの細胞は、VSV感染の特徴的な細胞変性効果、即ち感染後24時間以内の細胞ラウンディング(cell rounding)及び細胞死を示した。95%以上の細胞は48時間以内にディッシュを外した。より低いウイルス性の接種材料に感染しても類似の細胞変性効果が生じるが、速度は遅い(データ表示せず)。これらの結果は、C6グリオーマ細胞がrVSV−DsRedによる感染に感受性があることを示している。
C6グリオーマに対するVSVの細胞毒性の程度をよりよく定量化し、経時変化をより特異的に画定するために、インビトロ細胞毒性分析を用いた。C6−GFPグリオーマ細胞は、30%、60%、90%の密集度で96ウェル平底プレートにプレーティングされ、101〜105pfuの種々の量(101〜105pfu)のrVSV−DsRedに感染させられた。接種から4、8、24、36、48、72、96時間後に細胞価非放射性細胞増殖分析を用いて細胞死が分析された。図33に示されるように、rVSV−DsRedは、ウイルス価とは関係なく72時間以内におよそ90%の細胞死となった。結果は、細胞が30%及び60%の密集度でプレーティングされたときと同様であった(データ表示せず)。要約すれば、rVSV−DsRedは、細胞密度及びウイルス接種材料の量とは関係なく、ラットC6−GFPグリオーマに対して良好なインビトロ細胞溶解活性を示した。
《実施例13》
VSVベースの抗グリオーマ治療の有効性及び毒性を研究するための器官型スライスC6−GFP共培養系
〈材料及び方法〉
器官型脳スライス培養法は、Plenz and Kitai(79)によって紹介された方法を改変したものである。1〜2日齢のSDラットの幼体が断頭され、脳が迅速に除去され、0.5%デキストロースを含むゲイ緩衝塩類溶液(G9779, Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO)中に4℃で維持された。ゲイ/デキストロース溶液内で、線条体及び黒質では500μm、皮質では400μmの冠状薄片がビブラトーム上で作製された。関心のある領域を有する薄片は、解剖顕微鏡下で切断された。皮質、線条体及び黒質緻密部の領域は、0.5〜1mmのサイズに解剖され、ミリセル培養インサート(PICM03050, Millipore Corp., Billerica, MA)上に引き続いて載置され、カバーグラス上で10μlのニワトリ血漿(P3266, Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO)に浸された。インサート上に注意深く組織を並べた後、10μlのゲイ/デキストロース溶液に溶解した0.5ユニットのウシトロンビン(T6634, Sigraa-Aldrich Corp St. Louis, MO)を加えてカバーグラス上でニワトリ血漿と混合した。組織を載置したカバーグラスは、次に培養チューブ(156758, Nalge Nunc International, Rochester, NY)内に入れられ、各チューブに750μlの培養用培地が加えられた。この培養用培地の成分は(全てInvitrogen Corp., Carlsbad, CAから得られる)、50%のイーグルの基礎培地(BME)(21010−046)、25%のハンクス液(HBSS)(24020−125)、25%のウマ血清(26050−070)、1mMのLグルタミン(25030−081)、及び0.5%のデキストロース(15023−021)である。チューブは次に、0.5RPMの速度で回転させられる回転ラック上で35℃で培養された。培養物から72時間後、培養培地に、各々4.4μMのシトシン−α−D−アラビノフラノシド(arabinofaranoside)と、ウリジンと、5−フルロ−2’−デオキシウリジンとからなる細胞分裂阻害混合物が加えられた。これは24時間後に取り除かれ、750μlの新鮮な培地と交換された。培養培地は、その後、週に2回、完全に交換された。薄片は、3週間後に、培養液中で実験に用いられた。スライスC6−GFPグリオーマ共培養を作成するために、150,000GFP陽性C6ラットグリオーマ細胞が5μl、無菌条件下で薄片に接種された。培養チューブは、培地なしでインキュベータ内に水平に30分間置かれた。培養培地は次に交換され、チューブはさらに2時間水平位置に残され、その後、回転ラック上での回転が再開された。培養物中のGFP陽性C6グリオーマ細胞の成長はオリンパス蛍光顕微鏡を用いて可視化され、画像はデジタル・カメラを用いて収集された。
VSVベースの抗グリオーマ治療の有効性及び毒性を研究するための器官型スライスC6−GFP共培養系
〈材料及び方法〉
器官型脳スライス培養法は、Plenz and Kitai(79)によって紹介された方法を改変したものである。1〜2日齢のSDラットの幼体が断頭され、脳が迅速に除去され、0.5%デキストロースを含むゲイ緩衝塩類溶液(G9779, Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO)中に4℃で維持された。ゲイ/デキストロース溶液内で、線条体及び黒質では500μm、皮質では400μmの冠状薄片がビブラトーム上で作製された。関心のある領域を有する薄片は、解剖顕微鏡下で切断された。皮質、線条体及び黒質緻密部の領域は、0.5〜1mmのサイズに解剖され、ミリセル培養インサート(PICM03050, Millipore Corp., Billerica, MA)上に引き続いて載置され、カバーグラス上で10μlのニワトリ血漿(P3266, Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO)に浸された。インサート上に注意深く組織を並べた後、10μlのゲイ/デキストロース溶液に溶解した0.5ユニットのウシトロンビン(T6634, Sigraa-Aldrich Corp St. Louis, MO)を加えてカバーグラス上でニワトリ血漿と混合した。組織を載置したカバーグラスは、次に培養チューブ(156758, Nalge Nunc International, Rochester, NY)内に入れられ、各チューブに750μlの培養用培地が加えられた。この培養用培地の成分は(全てInvitrogen Corp., Carlsbad, CAから得られる)、50%のイーグルの基礎培地(BME)(21010−046)、25%のハンクス液(HBSS)(24020−125)、25%のウマ血清(26050−070)、1mMのLグルタミン(25030−081)、及び0.5%のデキストロース(15023−021)である。チューブは次に、0.5RPMの速度で回転させられる回転ラック上で35℃で培養された。培養物から72時間後、培養培地に、各々4.4μMのシトシン−α−D−アラビノフラノシド(arabinofaranoside)と、ウリジンと、5−フルロ−2’−デオキシウリジンとからなる細胞分裂阻害混合物が加えられた。これは24時間後に取り除かれ、750μlの新鮮な培地と交換された。培養培地は、その後、週に2回、完全に交換された。薄片は、3週間後に、培養液中で実験に用いられた。スライスC6−GFPグリオーマ共培養を作成するために、150,000GFP陽性C6ラットグリオーマ細胞が5μl、無菌条件下で薄片に接種された。培養チューブは、培地なしでインキュベータ内に水平に30分間置かれた。培養培地は次に交換され、チューブはさらに2時間水平位置に残され、その後、回転ラック上での回転が再開された。培養物中のGFP陽性C6グリオーマ細胞の成長はオリンパス蛍光顕微鏡を用いて可視化され、画像はデジタル・カメラを用いて収集された。
少なくとも3週間培養物中で成長した、C6−GFPグリオーマ細胞を有するか或いは有しない脳スライス培養物は、104プラーク形成単位(pfa)のrVSV−DsRed又は106感染単位(IU)の感染性AG−DsRedウイルスに感染した。ウイルスは、回転ラック上で37℃、5時間、薄片に吸着された。接種材料はthen取り除かれ、薄片は培地内で洗浄され、新鮮な培地が薄片に加えられた。薄片は、その後さらに3日間培養された。IFN−βを受容する薄片の場合、薄片は、ウイルス感染の18〜20時間前に1,000UのラットIFN−βで前処置された。ウイルスはその後、上述したようにIFN−βの存在下で吸着された。接種材料は、5時間後に、1,000UのIFN−βを含む新鮮な培地と交換された。
薄片は、2時間、リン酸緩衝溶液中で4%パラホルムアルデヒドを用いて固定され、組織がスライドグラスに載せられる前にリン酸緩衝生理食塩溶液(PBS)で3回洗浄された。培養された組織は、高温のプレート上で短時間に乾かされ、後で使用するために4℃で保存した。免疫組織化学は、以下の手順で実施された。スライドグラスは、PBS中で短時間に洗浄され、3%水素ペルオキシダーゼ及び10%メタノールで20分間処置された後、PBSで3回洗浄され、PBS中で2%脱脂乳及び0.3%トリトン−X中で1時間培養され、室温で一晩、3%のロバ血清及び0.1%のトリトン−Xを用いてマウス抗微小管関連タンパク質2(MAP-2, 1:500, M-4403, Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO)又はマウス抗チロシンヒドロキシラーゼ(TH, 1:1,000, NLkB318, Chernicon International, Temecula, CA)中で培養され、PBSで3回洗浄され、暗所にて室温で4時間、2%ロバ血清及び0.1%のトリトン−Xを用いてCyTM2又はCyTM3抱合AffiniPureロバ抗マウスIgG(1:250, Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., West Grove, PA)中で培養され、PBSで3回洗浄され、エタノールを用いて脱水され、キシレンで除去され、DPXマウンティング培地(445 8 1, Fluka Biochemika)内でカバーグラスに載置された。MAP−2及びTH免疫活性はBio−Rad共焦点顕微鏡を用いて可視化され、デジタル画像は関連する共焦点ソフトウェアを用いて収集された。薄片におけるウイルス感染の範囲は、蛍光顕微鏡を用いて以下のDsRed発現により可視化された。
〈結果〉
器官型脳スライスグリオーマ共培養(図34)は、3週間定着させたものであるが、薄片(図34B)における成熟した黒質神経細胞を示す実証可能なTH免疫染色によってプレーティングしてから6〜8週間後まで生存可能である。図35Cは、この器官型スライス培養モデルにおけるベースラインMAP−2免疫活性を実証し、神経細胞の完全性の高感度指標である非特異神経細胞マーカとして働く(80)。GFPを安定に発現しているグリオーマ細胞は、薄片組織において自然に成長し、3〜4日間経過後、C6グリオーマ接種材料サイズ及び腫瘍細胞成長速度に依って、腫瘍退行に対する治療薬の効果及び薄片の完全性を含む薄片グリオーマ細胞生物学の種々の面が研究され得るような蛍光顕微鏡検査(図34D及びE)がリアルタイムで行われた。
器官型脳スライスグリオーマ共培養(図34)は、3週間定着させたものであるが、薄片(図34B)における成熟した黒質神経細胞を示す実証可能なTH免疫染色によってプレーティングしてから6〜8週間後まで生存可能である。図35Cは、この器官型スライス培養モデルにおけるベースラインMAP−2免疫活性を実証し、神経細胞の完全性の高感度指標である非特異神経細胞マーカとして働く(80)。GFPを安定に発現しているグリオーマ細胞は、薄片組織において自然に成長し、3〜4日間経過後、C6グリオーマ接種材料サイズ及び腫瘍細胞成長速度に依って、腫瘍退行に対する治療薬の効果及び薄片の完全性を含む薄片グリオーマ細胞生物学の種々の面が研究され得るような蛍光顕微鏡検査(図34D及びE)がリアルタイムで行われた。
野生型VSVは、スライス培養系における正常な組織への毒性がある。rVSV−DsRedは、赤色蛍光タンパク質を発現し、従って、C6グリオーマ細胞と識別できるGFP(緑色)蛍光からのシグナルを作成する。これは、リアルタイムでスライス培養物のウイルス感染中に続けて起こった。DsRedに対する遺伝子は、VSVゲノムにおいてG遺伝子とL遺伝子の間に導入された。G遺伝子とL遺伝子の間に追加の異種遺伝子を挿入しても、ウイルスの細胞溶解性、特性又は複製効率に何ら影響を与えなかった(81)。感染に続き、MAP−2発現に対する免疫組織化学的染色によってスライス培養物が検査された。rVSV−DsRedは薄片を容易に感染し、3日目までに薄片の殆どの細胞は、組織に見られる赤色蛍光によって示されるように感染した(図35A)。驚くことではないが、感染した薄片に対するMAP−2免疫染色は不良であって、これは神経細胞組織の完全性が失われたことを示している(図36A)。従って、複製コンピテント野生型VSVは神経細胞組織にかなり細胞変性であり、それゆえ、腫瘍細胞破壊性因子として適用する際にはその毒性から正常な組織を保護するために抗ウイルス性因子の使用を必要とすることになる。
VSVは、IFN−βの抗ウイルス性効果に高い感受性があることが知られている。種々の系列の悪性細胞は、IFNシグナル伝達経路に1若しくは複数の欠損を有する(82,83)。これは最近、VSV仲介性の細胞溶解活性によって特異腫瘍細胞ターゲティングのために活用されてきており、一方で正常な組織は影響されない(84,85)。器官型スライス共培養系は、従って、IFN−βによりVSV感染から保護された正常な神経細胞組織が、培養物においてグリオーマ細胞への毒性を有するかを決定するのに利用された。スライス培養物は、VSV感染前に、2つの異なる濃度のIFN−β(100U又は1,000U)で24時間前処置された。1,000UのIFN−βで前処置された培養物は、rVSV−DsRedへの感染が防止された(図36)。MAP−2染色パターンもまた、感染前にIFN−β処置に続いて劇的に向上したが、これは正常な組織へのVSV仲介性の細胞毒性の著しい減少を示し(図37B)、IFN−βの抗アポトーシス機能と一致する(86)。100UのIFN−βでの前処置は、高投与量がより保護的ではあるが(データ表示せず)、有益であった。IFN−β単独では薄片に対する毒性はなく、複製コンピテント野生型VSV(図37D)と併せて魅力的な前処置方法を提供する。
成熟したスライス培養物上で成長したグリオーマ細胞は、かなり大きな腫瘤に成長した。1,000UのIUN−βで24時間前処置し、続けてrVSV−DsRed感染すると、結果的に、rVSV−DsRed(図36)による正常な組織の感染なしにC6−GPPグリオーマ腫瘍負荷が減少した。従って、rVSV−DsRedは、C6−GFP腫瘍を選択的に破壊するようにみえた。興味深いことに、IFN−β前処置された共培養においてVSVへの薄片の明らかな感染が殆どないにもかかわらず、異常なMAP−2染色パターン(図37C)によって示されるように薄片は尚も著しくダメージを受けた。このことは、rVSV−DsRedは腫瘍細胞を除去するのに効果的であるが、一般的にウイルス性感染に関連するもの以外のメカニズムによって仲介される薄片組織への十分なダメージが尚もあることを示している。
複製制限的VSV−ΔGは、腫瘍細胞溶解活性における野生型VSVに類似しているが、器官型スライスグリオーマ共培養系における毒性に関して優れている。rVSV−ΔGは、第2世代の複製制限的VSVである。rVSV−ΔGには、ウイルスのエンベロープタンパク質のためにエンコードする糖タンパク質(G)遺伝子が欠乏している。VSVの糖タンパク質(Gタンパク質)は、ウイルスのエンドサイトーシスに続くウイルスの細胞への付着及びウイルス性エンベロープのエンドソーム膜との融合を仲介し、そのようなものとしてVSV感染力が必要とされる。従って、rVSV−ΔGベクターを増殖するため、ウイルスは、野生型Gタンパク質を過渡的に発現する細胞内で成長しなければならない。産出される子孫ウイルスは、ウイルス性エンベロープ(感染性ΔGウイルス)中に過渡的に発現されたGタンパク質を含み、正常に細胞に感染することができる。しかし、これらのウイルスのゲノムにはGタンパク質コード領域が欠乏しているので、Gタンパク質を発現しない細胞から放出される子孫ビリオンは非感染性であり、隣接する細胞を再感染できない。従って、rVSV−ΔGベクターは、単回複製される(即ち複製制限的である)。rVSV−ΔGを用いる利点は、rVSV−DsRedなどの複製コンピテントウイルスによって時間と共に生成されるウイルス粒子の指数関数的増加が回避できることである。スライス培養系における複製制限的VSV−ΔGの毒性をテストするために、DsRedをエンコードする改良ΔGウイルス(ΔG−DsRed)を培養物に接種し、3日後にスライス培養物を検査した。培養物は、感染後の神経細胞の完全性を決定するべくMAP−2に固定及び染色された。感染性ΔG−DsRedが、rVSV−DsRedで見られたのと同様の方法で、2日目までに薄片を容易に感染したことがわかった(図39A)。興味深いことに、ΔG−DsRedに起因する著しい感染にもかかわらず、MAP−2免疫活性は比較的損なわれていなかった(図40A)。予測したように、薄片がIFN−βで前処置されたとき(図39B)にΔG−DsRedによる感染は殆ど又は全く見られず、MAP−2染色は感染していない培養物に見られるものと類似していた(図40B)。
成熟した薄片上で4日間C6−GFPグリオーマ細胞を成長させると、大きな腫瘤を産出した。しかし、1,000Uの濃度で24時間、IFN−βで前処置し、その後106IUの感染性ΔG−DsRedウイルスを接種すると、ΔG−DsRedウイルスでのi培養から3日後に腫瘍負荷が著しく減少することが実証された(図39)。腫瘍に対する優れた細胞溶解活性にもかかわらず、スライス培養物自体において正常な細胞の感染はあるとしてもほんの僅かであった(図39D)。従って、IFN−β前処置とその後の感染性ΔG−DsRedへの感染は、正常な組織に感染することなくC6−GFPグリオーマを選択的に破壊した。このことは、MAP−2免疫活性の結果(図39C)によってさらに実証された。従って、複製制限的ΔG−VSVとIFN−β前処置を併用することは、グリオーマの処置のための魅力的な併用療法である。
《実施例14》
VSVベースの抗グリオーマ治療の有効性
〈材料及び方法〉
細胞及びウイルスは、刺入可能なガイドスクリューシステム(87)を用いて適切な解剖学的頭蓋内領域に注入される。5〜7週齢、体重250〜350グラム、成体、メスのSDラットが用いられる。動物は、体重10g当たり0.15mgの用量でケタミン/キシラジン溶液(17mlの生理食塩溶液中にケタミン200mg、キシラジン20mg)を用いて腹腔内に麻酔される。各ラットの頭部areaは、剃毛し、ポビジンヨード(povidine-iodine)で清潔にした。動物は、定位フレームに固定化される。球欠縫合及びブレグマ縫合を位置決めするために動かされた頭蓋外組織によって、長さ約5mmの正中線切開が行われた。ブレグマ縫合に沿って正中線から横向きに3mmの小さな骨孔がドリルで作製される。骨孔に小型カニューレ(Plastics One)が挿入される。リン酸緩衝生理食塩溶液(PBS)単独、又は体積10μlのPBS中に再懸濁された1x105GFP陽性C6グリオーマ細胞は、ハミルトンシリンジを用いて5mmの深さに5分間以上注入される。適当な位置に、穴を塞ぐためにカニューレストッパが挿入される。動物は、感染の徴候又は腫瘍成長の結果としての神経欠損がないか毎日観察される。
VSVベースの抗グリオーマ治療の有効性
〈材料及び方法〉
細胞及びウイルスは、刺入可能なガイドスクリューシステム(87)を用いて適切な解剖学的頭蓋内領域に注入される。5〜7週齢、体重250〜350グラム、成体、メスのSDラットが用いられる。動物は、体重10g当たり0.15mgの用量でケタミン/キシラジン溶液(17mlの生理食塩溶液中にケタミン200mg、キシラジン20mg)を用いて腹腔内に麻酔される。各ラットの頭部areaは、剃毛し、ポビジンヨード(povidine-iodine)で清潔にした。動物は、定位フレームに固定化される。球欠縫合及びブレグマ縫合を位置決めするために動かされた頭蓋外組織によって、長さ約5mmの正中線切開が行われた。ブレグマ縫合に沿って正中線から横向きに3mmの小さな骨孔がドリルで作製される。骨孔に小型カニューレ(Plastics One)が挿入される。リン酸緩衝生理食塩溶液(PBS)単独、又は体積10μlのPBS中に再懸濁された1x105GFP陽性C6グリオーマ細胞は、ハミルトンシリンジを用いて5mmの深さに5分間以上注入される。適当な位置に、穴を塞ぐためにカニューレストッパが挿入される。動物は、感染の徴候又は腫瘍成長の結果としての神経欠損がないか毎日観察される。
10日間間隔を空けた後、ラットは、無菌PBS又はrVSV−RFPを1回して処置される。rVSV−RFPを投与する時点は、頭蓋内腫瘍の予測サイズを基に選択される。これは、神経画像処理によって腫瘍が検出可能な時であるが重大な神経欠損が生じる前の時点を表すべきである。ラットは、頭蓋内ウイルス投与の前に麻酔される。カニューレを配置するために、以前の切開は再度開かれ、頭蓋外組織は動態化される。ストッパが取り除かれ、10μlの量のPBS又はVSVが投与される。これは、ウイルスを直接腫瘍のベッドに配置する。インビボのIFN−βは、また、内因性毒性及びVSV毒性の鈍化の両方に関連して評価される。
〈結果〉
GFP陽性C6グリオーマ細胞は、予め埋め込まれたカニューレを介してラットの前頭葉へ送られる。所定の培養期間後、腫瘍ベッドにウイルスを送るためにカニューレが用いられる。動物は、分析のための処置後、選択された時点で屠殺される。組織病理学研究は、ウイルスによって引き起こされるCNS毒性及び腫瘍細胞減量(cytoreduction)の度合いを決定する。さらに、神経欠損や生存などのパラメータは結果を画定するための基準として用いられる。従って、正常な組織に大きなダメージを与えることなく、生きているCNSバックグラウンドにおいて癌細胞を破壊するVSVの能力が実証される。
GFP陽性C6グリオーマ細胞は、予め埋め込まれたカニューレを介してラットの前頭葉へ送られる。所定の培養期間後、腫瘍ベッドにウイルスを送るためにカニューレが用いられる。動物は、分析のための処置後、選択された時点で屠殺される。組織病理学研究は、ウイルスによって引き起こされるCNS毒性及び腫瘍細胞減量(cytoreduction)の度合いを決定する。さらに、神経欠損や生存などのパラメータは結果を画定するための基準として用いられる。従って、正常な組織に大きなダメージを与えることなく、生きているCNSバックグラウンドにおいて癌細胞を破壊するVSVの能力が実証される。
腫瘍細胞が感染しかつ子孫ウイルスを放出する際にウイルス負荷の指数関数的増加を引き起こし得るような複製コンピテントウイルスのおかげで、腫瘍を処置するのに1回の投与で十分であることもあり得る。このサイクルは、殆どの腫瘍が破壊されるまで、即ち免疫系が残りのウイルスを無くなる時点まで続き得る。カニューレシステムは、ある期間に複数の投与を可能にするが、それゆえ再投与は腫瘍の根絶のための実行可能な別の行動計画である。
異なる群間で60〜100%の範囲を以って80%の成功率が報告されているので、ラット頭蓋内グリオーマモデルは一定でない結果を与える可能性がある。免疫不全動物(即ちヌードラット)の使用することで「腫瘍摘出」の成功率を100%近くまで上げることができ、またその使用を試みることもできるが、一方で、免疫系がこれらの研究に重要な構成要素であり、従って単独では適切な研究モデルにはならないことに留意されたい。免疫担当SDラットを用いた頭蓋内グリオーマモデルの大きなサンプルサイズを用いれば、結果の正確な解釈が可能になるはずである。
動物は、表4に示すグループに従って割り当てられた。
*用量又は時点が決定されることになる。=は腫瘍細胞の初回接種からの時間を示す。∋は分析が行われる時点を示す。H腫瘍細胞、コントロール Rx、及びVSV Rxは10μLの量を脳内に投与されることになる。φ IFN α/β前処置を用いたVSV防御(即ち投与の用量及び時点)が評価され、結果の関数として用量及び時点が得られる。Xは、対照群の処置の日数を示し、動物によって示めされる病気の症状に依ることになる。
脳への直接注入に続くVSV効果は、PBSのみの対照と比較される。動物は、脳炎のサイン(嗜眠、栄養不足、体重減、等)をモニターされ、試験的研究の結果から決定された特定の時間の後で屠殺される。組織は、標準手順に従って作成されることになる。ラットは、ヘパリン化生理食塩溶液、続いて4%パラホルムアルデヒドによって、深い麻酔下で経心腔的に灌流される。脳は除去され、4%パラホルムアルデヒドに4℃で2時間 固定された。脳は、クリオスタット上で20μm区域に区切られる。VSV感染には直接蛍光顕微鏡検査(Nタンパク質特異抗体を用いたRFP蛍光又は免疫組織化学染色のモニタリング)、基礎神経病理学にはヘマトキシリン&エオシン染色、腫瘍及び周囲の実質における細胞死にはアポトーシス研究など、脳部分に毒性の徴候がないかを検査するために異なる技術が用いられることになる。著しい腫瘍量を含む対照ラットから得られたデータの例を図41に示す。
最初の腫瘍接種から17日間の培養に続き(ウイルスの投与から7日後)、各研究群内の動物が屠殺され、腫瘍及び周囲の組織の組織病理学的特性が分析される。腫瘍の大きさ、正中線偏位の存在又は不存在、腫瘍ベッドにおける壊死の存在又は不存在などの重要なパラメータが分析される。さらに、周囲の正常な組織は、ウイルスに関連する毒性の徴候がないか詳しく調べられる。腫瘍成長の証拠がないか脳部分の検査が行われるが、これにはGFPのための直接蛍光マイクロコピー、基礎神経病理学のためのヘマトキシリン&エオシン染色、特異腫瘍抗原に対する免疫細胞化学、及び腫瘍及び周囲の実質における細胞死に対するアポトーシスの研究が含まれ得る。C6グリオーマ細胞におけるGFP標識化は、腫瘤の非常に高感度検出及び分析と、接種の原発部位から取り除いた細胞の微生物集団とを可能にする(図42)。
本研究の重要な側面は、腫瘍の原発部位を回避した細胞の微生物集団に接近し標的にするVSVの能力である(図42)。本研究に用いられるC6グリオーマ細胞によって行われるGFP標識は、レーザ走査共焦点顕微鏡を用いて組織部分全体で非常に小さい集団の細胞でさえも検出できるようにし、ラットグリオーマモデルにおけるrVSVの投与の効果の包括的な実態を示す。
rVSV投与後のラット生存もまた決定される。ラットは、表5に従ってPBS又はVSVのいずれかで処置される。
*用量又は時点は決定されることになる、パイロット実験の,結果。=は腫瘍細胞の初回接種からの時間を示す。∋は分析が行われる時点を示す。H腫瘍細胞、コントロール Rx、及びVSV Rxは10μLの量を脳内に投与されることになる、φ IFN α/β前処置を用いたVSV防御のための手順はパイロットの結果に基づき進展されることになる。
動物は、腫瘍が動物を制覇するとき又は動物が生存することが明らかにになるときまでずっと生き残る。そのとき、上述のように全ての動物は屠殺されかつ腫瘍の残遺物が存在するか分析される。VSVで処置された動物の全体的な生存は、対照と比較して、著しく増加している。
Claims (112)
- マトリクス・タンパク質(M)をエンコードする領域内に欠失又は変異を有するラブドウイルス・ゲノムの核酸を含むことを特徴とする組み換え型非細胞変性ラブドウイルス。
- 糖タンパク質(G)をエンコードする領域内に欠失又は変異をさらに有することを特徴とする請求項1に記載の組み換え型非細胞変性ラブドウイルス。
- 調節因子をさらに含むことを特徴とする請求項1に記載の組み換え型非細胞変性ラブドウイルス。
- 前記欠失又は変異は、前記マトリクス・タンパク質のN末端側半分をエンコードする領域内にあることを特徴とする請求項1に記載の組み換え型非細胞変性ラブドウイルス。
- 前記欠失又は変異は、核局在配列をエンコードする前記マトリクス・タンパク質におけるN末端部分をエンコードする領域内にあることを特徴とする請求項4に記載の組み換え型非細胞変性ラブドウイルス。
- 前記変異は、
(a)位置33又は51での、アラニン・アミノ酸残基によるメチオニン・アミノ酸残基の置換、又は
(b)位置226での、グリシン・アミノ酸残基によるセリン・アミノ酸残基の置換をエンコードすることを特徴とする請求項5に記載の組み換え型非細胞変性ラブドウイルス。 - 2番目のポリペプチドをエンコードする異種核酸の挿入をさらに含むことを特徴とする請求項1に記載の組み換え型非細胞変性ラブドウイルス。
- 前記2番目のポリペプチドは、治療用のポリペプチドであることを特徴とする請求項7に記載の組み換え型非細胞変性ラブドウイルス。
- 前記2番目のポリペプチドは、免疫原性のポリペプチドであることを特徴とする請求項7に記載の組み換え型非細胞変性ラブドウイルス。
- 標識ポリペプチドをエンコードする異種核酸の挿入をさらに含むことを特徴とする請求項1に記載の組み換え型非細胞変性ラブドウイルス。
- 前記標識ポリペプチドは、緑色発光タンパク質、分泌されたアルカリ・ホスフォターゼ、DsRed発光タンパク質、βガラクトシダーゼ、又は発光酵素であることを特徴とする請求項10に記載の組み換え型非細胞変性ラブドウイルス。
- 自殺遺伝子をエンコードする異種核酸の挿入をさらに含むことを特徴とする請求項1に記載の組み換え型非細胞変性ラブドウイルス。
- サイトカイン遺伝子をエンコードする異種核酸の挿入をさらに含むことを特徴とする請求項1に記載の組み換え型非細胞変性ラブドウイルス。
- 前記サイトカインは、インターロイキン2、インターロイキン4、インターロイキン12、又はインターフェロン−γであることを特徴とする請求項13に記載の組み換え型非細胞変性ラブドウイルス。
- ラブドウイルス・Gステム・ポリペプチドをさらに含むことを特徴とする請求項1に記載の組み換え型非細胞変性ラブドウイルス。
- 遺伝子送達ベクター又はワクチンとして使用されることを特徴とする請求項1に記載の組み換え型非細胞変性ラブドウイルス。
- 前記ラブドウイルスは、腫瘍細胞に対して選択的に細胞変性することを特徴とする請求項1に記載の組み換え型非細胞変性ラブドウイルス。
- 前記ラブドウイルス・ゲノムは、水疱性口炎ウイルス・ゲノムであることを特徴とする請求項1に記載の組み換え型非細胞変性ラブドウイルス。
- マトリクス・タンパク質(M)内に欠損又は変異を有するラブドウイルス・タンパク質をエンコードする遺伝子組み換え核酸を含む非細胞変異性の組み換え型ラブドウイルスを作成する方法であって、
(A)適切な細胞内に、マトリクス・タンパク質(M)内に欠損又は変異を有するラブドウイルス・タンパク質をエンコードするポリヌクレオチド配列、標識ポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチド配列、及びラブドウイルスを複製するためのシス作用シグナルを有する3´及び5´のラブドウイルス・リーダ及びトレーラ領域を少なくとも含んでいるポリシストロン性cDNAを挿入するステップと、
(B)前記細胞を、前記細胞の非細胞変性表現型のために選択された条件下で培養するステップと、
(C)前記細胞を、前記組み換え型ラブドウイルスを作成可能な条件下で培養するステップと、
(D)前記非細胞変性組み換え型ラブドウイルスを単離するステップとを含むことを特徴とする方法。 - 前記非細胞変性組み換え型ラブドウイルスは、2番目のポリペプチドをエンコードする異種核酸配列をさらに含むことを特徴とする請求項19に記載の方法。
- 前記2番目のポリペプチドは、治療用のポリペプチドであることを特徴とする請求項20に記載の方法。
- 前記2番目のポリペプチドは、免疫原性のポリペプチドであることを特徴とする請求項20に記載の方法。
- 前記単離した非細胞変性組み換え型ラブドウイルスから、ゲノムRNAを単離するステップをさらに含むことを特徴とする請求項19に記載の方法。
- 前記ゲノムRNAを単離するステップは、RT−PCRを使用して行われることを特徴とする請求項23に記載の方法。
- 前記適切な細胞は、齧歯類、霊長類及びヒト細胞から成る群より選択されることを特徴とする請求項19に記載の方法。
- 前記欠損又は変異は、前記マトリクス・タンパク質のN末端領域に存在することを特徴とする請求項19に記載の方法。
- 前記マトリクス・タンパク質の前記N末端領域に存在している前記欠損又は変異は、核局在配列の一部であることを特徴とする請求項26に記載の方法。
- 前記変異は、
(a)位置33又は51での、アラニン・アミノ酸残基によるメチオニン・アミノ酸残基のアミノ酸置換、又は
(b)位置226での、グリシン・アミノ酸残基によるセリン・アミノ酸残基のアミノ酸置換であることを特徴とする請求項19に記載の方法。 - 前記非細胞変性組み換え型ラブドウイルスは、水疱性口炎ウイルスであることを特徴とする請求項19に記載の方法。
- マトリクス・タンパク質をエンコードする遺伝子に欠失又は変異を有する非細胞変性ラブドウイルス・ゲノムをエンコードするポリヌクレオチド配列を含むことを特徴とする単離した核酸分子。
- 前記非細胞変性ラブドウイルス・ゲノムは、遺伝子組み換えされた糖タンパク質(G)をさらに含むことを特徴とする請求項30に記載の単離した核酸分子。
- 調節因子をさらに含むことを特徴とする請求項30に記載の単離した核酸分子。
- 前記欠損又は変異は、前記マトリクス・タンパク質のN末端領域をエンコードする領域に存在することを特徴とする請求項30に記載の単離した核酸分子。
- 前記マトリクス・タンパク質のN末端領域をエンコードする領域に存在する前記欠損又は変異は、核局在配列をエンコードすることを特徴とする請求項33に記載の単離した核酸分子。
- 前記変異は、
(a)位置33又は51での、アラニン・アミノ酸残基によるメチオニン・アミノ酸残基の置換、又は
(b)位置226での、グリシン・アミノ酸残基によるセリン・アミノ酸残基の置換をエンコードすることを特徴とする請求項30に記載の単離した核酸分子。 - 2番目のポリペプチドをエンコードする異種核酸配列の挿入をさらに含むことを特徴とする請求項30に記載の単離した核酸分子。
- 前記2番目のポリペプチドは、治療用のポリペプチドであることを特徴とする請求項36に記載の単離した核酸分子。
- 前記2番目のポリペプチドは、免疫原性のポリペプチドであることを特徴とする請求項36に記載の単離した核酸分子。
- 標識ポリペプチドをエンコードする異種核酸の挿入をさらに含むことを特徴とする請求項36に記載の単離した核酸分子。
- 前記標識ポリペプチドは、緑色発光タンパク質、分泌されたアルカリ・ホスフォターゼ、DsRed発光タンパク質、βガラクトシダーゼ、又は発光酵素であることを特徴とする請求項39に記載の単離した核酸分子。
- 自殺遺伝子をエンコードする異種核酸の挿入をさらに含むことを特徴とする請求項30に記載の単離した核酸分子。
- ラブドウイルス・Gステム・ポリペプチドをさらに含むことを特徴とする請求項30に記載の単離した核酸分子。
- 前記ゲノムは、水疱性口炎ウイルス・ゲノムであることを特徴とする請求項30に記載の単離した核酸分子。
- 請求項30に記載の単離した核酸分子を含むことを特徴とするベクター。
- ラブドウイルス・糖タンパク質(G)の細胞膜に近接している外部領域をエンコードする領域内に欠失又は変異を有するラブドウイルス・ゲノムの核酸を含むことを特徴とする組み換え型ラブドウイルス。
- 前記変異は、
(a)アラニン・アミノ酸残基によるトリプトファン・アミノ酸残基の置換、
(b)アラニン・アミノ酸残基による、グルタミン酸、グリシン及び/又はフェニルアラニン・アミノ酸残基の置換、
(c)アスパラギン酸及びアラニン・アミノ酸残基による、グルタミン酸、グリシン、フェニルアラニン・アミノ酸残基、或いはそれらの組み合わせの置換、又は
(d)前記(a)〜(c)の任意の組み合わせの置換をエンコードすることを特徴とする請求項45に記載の組み換え型ラブドウイルス。 - 前記変異は、
(a)アミノ酸残基449〜461をエンコードするヌクレオチド或いはそれらの断片の欠損、又は
(b)アミノ酸残基440〜449をエンコードするヌクレオチド或いはそれらの断片の欠損をエンコードすることを特徴とする請求項45に記載の組み換え型ラブドウイルス。 - 前記変異は、ラブドウイルス・糖タンパク質の細胞膜に近接している外部領域におけるセリンアミノ酸残基間への、崩壊促進因子のアミノ酸残基311〜319をエンコードするヌクレオチドの挿入であることを特徴とする請求項45に記載の組み換え型ラブドウイルス。
- 2番目のポリペプチドをエンコードする異種核酸配列の挿入をさらに含むことを特徴とする請求項45に記載の組み換え型ラブドウイルス。
- 前記2番目のポリペプチドは、治療用のポリペプチドであることを特徴とする請求項49に記載の組み換え型ラブドウイルス。
- 前記2番目のポリペプチドは、免疫原性のポリペプチドであることを特徴とする請求項49に記載の組み換え型ラブドウイルス。
- 標識ポリペプチドをエンコードする異種核酸配列の挿入をさらに含むことを特徴とする請求項45に記載の組み換え型ラブドウイルス。
- 前記標識ポリペプチドは、緑色発光タンパク質、分泌されたアルカリ・ホスフォターゼ、DsRed発光タンパク質、βガラクトシダーゼ、又は発光酵素であることを特徴とする請求項52に記載の組み換え型ラブドウイルス。
- 自殺遺伝子をエンコードする異種核酸の挿入をさらに含むことを特徴とする請求項45に記載の組み換え型ラブドウイルス。
- サイトカイン遺伝子をエンコードする異種核酸の挿入をさらに含むことを特徴とする請求項45に記載の組み換え型ラブドウイルス。
- 前記サイトカインは、インターロイキン2、インターロイキン4、インターロイキン12、又はインターフェロン−γであることを特徴とする請求項55に記載の組み換え型ラブドウイルス。
- マトリクス・タンパク質(M)をエンコードする領域内に欠失又は変異を有することを特徴とする請求項45に記載の組み換え型ラブドウイルス。
- 前記遺伝子組み換えマトリクス・タンパク質は、該マトリクス・タンパク質のN末端領域に欠損を有することを特徴とする請求項57に記載の組み換え型ラブドウイルス。
- 前記マトリクス・タンパク質の前記N末端領域に存在する前記欠損又は変異は、核局在配列の一部であることを特徴とする請求項73に記載の組み換え型ラブドウイルス。
- 調節因子をさらに含むことを特徴とする請求項45に記載の組み換え型ラブドウイルス。
- 遺伝子送達ベクターとして使用されることを特徴とする請求項45に記載の組み換え型ラブドウイルス。
- ワクチンとして使用されることを特徴とする請求項45に記載の組み換え型ラブドウイルス。
- 前記ラブドウイルス・ゲノムは、水疱性口炎ウイルス・ゲノムであることを特徴とする請求項56に記載の組み換え型ラブドウイルス。
- ラブドウイルス・糖タンパク質(G)の細胞膜に近接している外部領域をエンコードする領域内に欠失又は変異を有するラブドウイルス・タンパク質をエンコードする遺伝子組み替え核酸を含む組み換え型ラブドウイルスを作成する方法であって、
(A)適切な細胞内に、マトリクス・タンパク質(M)内に欠損又は変異を有するラブドウイルス・タンパク質をエンコードするポリヌクレオチド配列、標識ポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチド配列、及びラブドウイルスを複製するためのシス作用シグナルを有する3´及び5´のラブドウイルス・リーダ及びトレーラ領域を少なくとも含んでいるポリシストロン性cDNAを挿入するステップと、
(B)前記細胞を、前記組み換え型ラブドウイルスの作成を作成可能な条件下で培養するステップと、
(C)前記組み換え型ラブドウイルスを単離するステップとを含むことを特徴とする方法。 - 前記細胞内に、2番目のポリペプチドをエンコードする異種核酸配列を挿入するステップをさらに含むことを特徴とする請求項64に記載の方法。
- 前記2番目のポリペプチドは、治療用のポリペプチドであることを特徴とする請求項64に記載の方法。
- 前記2番目のポリペプチドは、免疫原性のポリペプチドであることを特徴とする請求項64に記載の組み換え型ラブドウイルス。
- 前記単離した非細胞変性組み換え型ラブドウイルスから、ゲノムRNAを単離するステップをさらに含むことを特徴とする請求項64に記載の方法。
- 前記ゲノムRNAを単離するステップは、RT−PCRを使用して行われることを特徴とする請求項68に記載の方法。
- 前記適切な細胞は、齧歯類、霊長類及びヒト細胞から成る群より選択されることを特徴とする請求項64に記載の方法。
- ラブドウイルス・糖タンパク質(G)の細胞膜に近接している外部領域をエンコードする領域内の変異は、
(a)アラニン・アミノ酸残基によるトリプトファン・アミノ酸残基の置換、
(b)アラニン・アミノ酸残基による、グルタミン酸、グリシン及び/又はフェニルアラニン・アミノ酸残基の置換、
(c)アスパラギン酸及びアラニン・アミノ酸残基による、グルタミン酸、グリシン、フェニルアラニン・アミノ酸残基、或いはそれらの組み合わせの置換、又は
(d)前記(a)〜(c)の任意の組み合わせの置換をエンコードすることを特徴とする請求項64に記載の方法。 - 前記変異は、
(a)アミノ酸残基449〜461をエンコードするヌクレオチド或いはそれらの断片の欠損、又は
(b)アミノ酸残基440〜449をエンコードするヌクレオチド或いはそれらの断片の欠損であることを特徴とする請求項64に記載の方法。 - 前記変異は、ラブドウイルス・糖タンパク質の細胞膜に近接している外部領域におけるセリンアミノ酸残基間への、崩壊促進因子のアミノ酸残基311〜319をエンコードするヌクレオチドの挿入であることを特徴とする請求項64に記載の方法。
- 前記非細胞変性組み換え型ラブドウイルスは、水疱性口炎ウイルスであることを特徴とする請求項64に記載の方法。
- ラブドウイルス・ゲノムをエンコードするポリヌクレオチド配列を含んでおり、該ポリヌクレオチド配列はラブドウイルス・糖タンパク質(G)の細胞膜に近接している外部領域をエンコードする遺伝子に欠失又は変異を有していることを特徴とする単離した核酸分子。
- 前記糖タンパク質(G)の細胞膜に近接している外部領域の変異は、
(a)アラニン・アミノ酸残基によるトリプトファン・アミノ酸残基の置換、
(b)アラニン・アミノ酸残基による、グルタミン酸、グリシン及び/又はフェニルアラニン・アミノ酸残基の置換、
(c)アスパラギン酸及びアラニン・アミノ酸残基による、グルタミン酸、グリシン、フェニルアラニン・アミノ酸残基、或いはそれらの組み合わせの置換、又は
(d)前記(a)〜(c)の置換の任意の組み合わせの置換であることを特徴とする請求項75に記載の単離した核酸分子。 - 前記変異は、
(a)アミノ酸残基449〜461をエンコードするヌクレオチド或いはそれらの断片の欠損、又は
(b)アミノ酸残基440〜449をエンコードするヌクレオチド或いはそれらの断片の欠損であることを特徴とする請求項75に記載の単離した核酸分子。 - 前記変異は、ラブドウイルス・糖タンパク質の細胞膜に近接している外部領域におけるセリンアミノ酸残基間への、崩壊促進因子のアミノ酸残基311〜319をエンコードするヌクレオチドの挿入であることを特徴とする請求項75に記載の単離した核酸分子。
- 非細胞変性ラブドウイルス・ゲノムは、遺伝子組み替えマトリクス・タンパク質をさらに含んでいることを特徴とする請求項75に記載の単離した核酸分子。
- 前記欠損又は変異は、前記マトリクス・タンパク質のN末端をエンコードする領域内にあることを特徴とする請求項75に記載の単離した核酸分子。
- 前記欠損又は変異は、核局在配列をエンコードする領域内にあることを特徴とする請求項75に記載の単離した核酸分子。
- 前記変異は、
(a)位置33又は51での、アラニン・アミノ酸残基によるメチオニン・アミノ酸残基の置換、又は
(b)位置226での、グリシン・アミノ酸残基によるセリン・アミノ酸残基の置換をエンコードすることを特徴とする請求項75に記載の単離した核酸分子。 - 調節因子をさらに含むことを特徴とする請求項75に記載の単離した核酸分子。
- 2番目のポリペプチドをエンコードする異種核酸配列の挿入をさらに含むことを特徴とする請求項75に記載の単離した核酸分子。
- 前記2番目のポリペプチドは、治療用のポリペプチド又は免疫原性のポリペプチドであることを特徴とする請求項75に記載の単離した核酸分子。
- 標識ポリペプチドをエンコードする異種核酸の挿入をさらに含むことを特徴とする請求項75に記載の単離した核酸分子。
- 前記標識ポリペプチドは、緑色発光タンパク質、分泌されたアルカリ・ホスフォターゼ、DsRed発光タンパク質、βガラクトシダーゼ、又は発光酵素であることを特徴とする請求項86に記載の単離した核酸分子。
- 自殺遺伝子をエンコードする核酸配列の挿入をさらに含むことを特徴とする請求項75に記載の単離した核酸分子。
- 融合促進ポリペプチド又は抗受容体をさらに含むことを特徴とする請求項75に記載の単離した核酸分子。
- 前記ゲノムは、水疱性口炎ウイルス・ゲノムであることを特徴とする請求項75に記載の単離した核酸分子。
- 請求項75に記載の単離した核酸分子を含むベクター。
- 欠陥遺伝子に関連する病気に罹っている患者を治療する方法であって、
前記患者の標的細胞に、治療上有効な量の組み換え型非細胞変性ラブドウイルスを投与するステップを含んでおり、
前記ラブドウイルスのゲノムは、前記患者のマトリクス・タンパク質(M)をエンコードする領域及び/又は糖タンパク質(G)の細胞膜に近接している外部領域内における欠損又は変異と、標的細胞の内部で発現できる異種遺伝子とを有し、それによって病気を治療することを特徴とする方法。 - 前記標的細胞は、上皮細胞、肺細胞、腎細胞、肝細胞、星状細胞、免疫細胞、グリア細胞、前立腺細胞、膵島のα・β・γ細胞、又は腺房細胞であることを特徴とする請求項92に記載の方法。
- 患者に病気に対する免疫性を与える方法であって、
前記患者の標的細胞に、治療上有効な量の組み換え型ウイルスを接触させるステップを含んでおり、
前記ウイルスは、マトリクス・タンパク質(M)をエンコードする領域内及び/又は糖タンパク質(G)の細胞膜に近接している外部領域内に欠損又は変異を有するラブドウイルス・ゲノム又はその断片と、標的細胞の内部で発現できる免疫原性タンパク質又はペプチド断片をエンコードする異種遺伝子と有し、それによって病気に対する免疫性を与えることを特徴とする方法。 - 前記標的細胞は、上皮細胞、肺細胞、腎細胞、肝細胞、星状細胞、グリア細胞、前立腺細胞、強力な抗原提示細胞、リンパ球、又はM細胞であることを特徴とする請求項94に記載の方法。
- 病気に罹っている患者を治療する方法であって、
前記患者の標的細胞に、治療上有効な量の組み換え型ウイルスを接触させるステップを含んでおり、
前記ウイルスは、マトリクス・タンパク質(M)をエンコードする領域内及び/又は糖タンパク質(G)の細胞膜に近接している外部領域内に欠損又は変異を有するラブドウイルス・ゲノム又はその断片と、標的細胞の内部で発現できる免疫原性タンパク質又はペプチド断片をエンコードする異種遺伝子を有し、それによって病気を治療することを特徴とする方法。 - 前記標的細胞は、上皮細胞、肺細胞、腎細胞、肝細胞、星状細胞、グリア細胞、前立腺細胞、強力な抗原提示細胞、リンパ球、又はM細胞であることを特徴とする請求項96に記載の方法。
- 欠陥遺伝子に関連する病気に罹っている患者を治療する方法であって、
前記患者の標的細胞に、治療上有効な量の組み換え型ウイルスを接触させるステップを含んでおり、
前記ウイルスは、前記患者のマトリクス・タンパク質(M)をエンコードする領域内及び/又は糖タンパク質(G)の細胞膜に近接している外部領域内欠損又は変異を有するラブドウイルス・ゲノム又はその断片と、標的細胞の内部で発現できる異種遺伝子とを有し、それによって病気を治療することを特徴とする方法。 - 前記標的細胞は、上皮細胞、肺細胞、腎細胞、肝細胞、星状細胞、グリア細胞、又は前立腺細胞であることを特徴とする請求項98に記載の方法。
- 癌細胞を溶解させる方法であって、
癌細胞に、(a)マトリクス・タンパク質(M)をエンコードする領域内及び/又は糖タンパク質(G)の細胞膜に近接している外部領域内に欠損又は変異を有するラブドウイルス・ゲノム又はその断片を含む核酸と、(b)非ラブドウイルス核酸とを含んでいる組み換え型ラブドウイルスを接触させるステップを含むことを特徴とする方法。 - 前記非ラブドウイルス核酸は、サイトカイン又は自殺遺伝子をエンコードすることを特徴とする請求項100に記載の方法。
- 癌を治療する方法であって、
癌細胞に、(a)マトリクス・タンパク質(M)をエンコードする領域内及び/又は糖タンパク質(G)の細胞膜に近接している外部領域内に欠損又は変異を有するラブドウイルス・ゲノム又はその断片と、(b)非ラブドウイルス核酸とを含んでいる組み換え型ウイルスを接触させるステップを含むことを特徴とする方法。 - 前記非ラブドウイルス核酸は、サイトカイン又は自殺遺伝子をエンコードすることを特徴とする請求項102に記載の方法。
- 腫瘍細胞破壊作用を有する物質を同定する方法であって、
コロナ、黒質及び皮質組織のビブラトーム薄片を取得するステップと、
生存力を維持しつつ細胞分裂を抑制した条件下で、前記薄片をカバースリップ上で培養するステップと、
前記薄片培養物に標識された癌細胞を接種するステップと、
前記接種された細胞を、対象物質と共に培養するステップと、
癌細胞の生存度を測定するステップとを含み、
癌細胞の生存度の減少は前記対象物質が腫瘍細胞破壊性であることを示し、このことにより腫瘍細胞破壊作用を有する物質を同定することを特徴とする方法。 - 前記癌細胞は、ニューロン由来であることを特徴とする請求項104に記載の方法。
- 前記ニューロン由来の癌細胞は、グリオーマ細胞であることを特徴とする請求項105に記載の方法。
- 前記ニューロン由来の癌細胞は、蛍光性、発光性、発色性、及び電子密度ラベルにより標識されることを特徴とする請求項104に記載の方法。
- 前記薄片培養物に標識された組み換え型ラブドウイルスを接種するステップをさらに含むことを特徴とする請求項104に記載の方法。
- 前記接種された薄片をサイトカインと共に培養するステップをさらに含むことを特徴とする請求項104に記載の方法。
- 前記サイトカインはインターフェロンであることを特徴とする請求項109に記載の方法。
- 生存力を維持した条件下における、前記薄片のカバースリップ上での培養は、
Geyのデキストロース溶液,プラズマ,トロンビン、Eagleの基礎培地、Hanksの平衡塩類溶液,L−グルタミン酸、又はそれらの任意の組み合わせを含む培地で行うことを特徴とする請求項104に記載の方法。 - 細胞分裂を抑制した条件下における、前記薄片のカバースリップ上での培養は、
シトシン−α−D−アラビノフラノシド、ウリジン、Geyのデキストロース溶液,プラズマ,トロンビン、Eagleの基礎培地、Hanksの平衡塩類溶液,L−グルタミン酸、又はそれらの任意の組み合わせを含む培地で行うことを特徴とする請求項104に記載の方法。
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