CN110088127A - Cd155变体免疫调节蛋白及其用途 - Google Patents
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Abstract
本文提供了包含变体CD155的免疫调节蛋白和编码此类蛋白的核酸。该免疫调节蛋白为多种免疫学和肿瘤学病症提供治疗效用。提供了组合物和用于制造和使用此类蛋白的方法。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2016年7月28日提交的美国临时申请号62/367,822、2016年9月14日提交的美国临时申请号62/394,696、2016年10月20日提交的美国临时申请号62/410,839、2017年3月16日提交的美国临时申请号62/472,558、以及2017年3月22日提交的美国临时申请62/475,196的优先权，将这些申请中的每一个的内容通过引用以其全文并入。
通过引用序列表并入
本申请与电子格式的序列表一起提交。序列表以2017年7月27日创建的名为76161200540SeqList.TXT的文件提供，其大小为3,409,818字节。将在电子格式的序列表中的信息通过引用以其全文并入。
技术领域
本公开文本涉及用于在癌症和免疫疾病的治疗中调节免疫应答的治疗组合物。在一些方面，本公开文本涉及CD155的特定变体，该CD155的特定变体对同源结合配偶体蛋白TIGIT、CD226或CD96显示出改善的结合，例如改善的结合亲和力或选择性。
背景技术
通过干预由抗原呈递细胞(APC)或靶细胞与淋巴细胞形成的免疫突触(IS)以及在抗原呈递细胞(APC)或靶细胞与淋巴细胞之间的免疫突触(IS)中发生的过程来调节免疫应答具有越来越大的医学意义。从机理而言，IS中的细胞表面蛋白可以涉及多个蛋白质靶标与它们所结合的单个蛋白质的协同且通常同时的相互作用。IS相互作用与两个细胞的接合密切相关，并且该结构中的单个蛋白质可以与相同细胞上的蛋白质(顺式)以及相关细胞上的蛋白质(反式)很可能在相同时间相互作用。虽然可以调节IS的治疗剂是已知的，但是需要改进的治疗剂。提供了满足此类需要的免疫调节蛋白，包括能够在细胞上表达的可溶性蛋白质或跨膜免疫调节蛋白。
发明内容
本文提供了变体CD155多肽。在一些实施方案中，变体CD155多肽包含IgV结构域或其特异性结合片段、IgC结构域或其特异性结合片段、或二者，其中该变体CD155多肽包含未修饰的CD155或其特异性结合片段中的一个或多个氨基酸修饰，该一个或多个氨基酸修饰对应于参照SEQ ID NO：47编号的位置7、8、9、10、11、12、13、15、16、18、19、20、21、22、23、24、25、26、29、30、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、64、65、67、68、69、70、72、73、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、87、88、89、90、91、92、94、95、96、97、98、99、100、102、104、106、107、108、110、111、112、113、114、115或116。在一些实施方案中，氨基酸修饰包括氨基酸取代、缺失或插入。在一些实施方案中，未修饰的CD155是哺乳动物CD155或其特异性结合片段。在一些实施方案中，未修饰的CD155是人CD155或其特异性结合片段。在一些实施方案中，未修饰的CD155包括(i)SEQ ID NO：47所示的氨基酸序列，(ii)与SEQ ID NO：47具有至少95％序列一致性的氨基酸序列；或(iii)(i)或(ii)的一部分，其包含IgV结构域或其特异性结合片段。
在任何一种变体CD155多肽的一些实施方案中，IgV结构域的特异性结合片段具有至少50、60、70、80、90、100、110或更多个氨基酸的长度；或IgV结构域的特异性结合片段包含SEQ ID NO：20的氨基酸24-139所示的IgV结构域长度的至少80％的长度。在一些实施方案中，变体CD155多肽包含多达1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸修饰，任选为氨基酸取代、插入和/或缺失。在一些实施方案中，变体CD155多肽包括显示出与SEQ ID NO：47或其特异性结合片段至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列。在一些实施方案中，与未修饰的CD155相比，变体CD155显示出与TIGIT、CD226或CD96的胞外域的改变的结合。在一些情况下，改变的结合是改变的结合亲和力和/或改变的结合选择性。
在任何一种变体CD155多肽的一些实施方案中，一个或多个氨基酸修饰选自G7E、D8G、V9A、V9D、V9I、V9L、V10F、V10G、V10I、V11A、V11E、V11M、Q12H、Q12K、Q12L、A13E、A13R、T15I、T15S、Q16H、P18C、P18F、P18H、P18L、P18S、P18T、P18Y、G19D、F20I、F20S、F20Y、L21S、L21M、G22S、D23A、D23G、D23N、D23Y、S24A、S24P、V25A、V25E、T26M、C29R、Y30C、Y30F、Y30H、Q32L、Q32R、V33M、P34S、N35D、N35F、N35S、M36I、M36R、M36T、E37G、E37P、E37S、E37V、V38A、V38G、T39A、T39S、H40Q、H40R、H40T、V41A、V41M、S42A、S42C、S42G、S42L、S42N、S42P、S42Q、S42T、S42V、S42W、L44P、L44V、T45A、T45G、T45I、T45S、T45Q、T45V、W46C、W46R、A47E、A47G、A47V、R48Q、H49L、H49Q、H49R、G50S、E51G、E51K、E51V、S52A、S52E、S52G、S52K、S52L、S52M、S52P、S52Q、S52R、S52T、S52W、G53R、S54C、S54G、S54H、S54N、S54R、M55I、M55L、M55V、A56V、V57A、V57L、V57T、F58L、F58Y、H59E、H59N、N59R、Q60H、Q60K、Q60P、Q60R、T61A、T61G、T61K、T61M、T61R、T61S、Q62F、Q62H、Q62K、Q62L、Q62M、Q62R、Q62Y、P64S、S65A、S65C、S65G、S65D、S65T、S65Y、S65H、S65N、S65T、S65W、S67A、S67E、S67G、S67H、S67L、S67T、S67V、S67W、E68D、E68G、S69L、S69P、K70E、K70R、K70Q、L72Q、E73D、E73G、E73R、V75A、V75L、A76E、A76G、A76T、A77T、A77V、R78G、R78K、R78S、L79P、L79Q、L79V、G80D、G80S、A81E、A81P、A81T、A81V、E82D、E82G、L83P、L83Q、R84W、N85D、N85Y、N87T、L88P、R89K、M90I、M90L、M90V、F91S、F91T、F91P、G92A、G92E、G92W、R94H、V95A、E96D、D97G、E98D、E98S、G99D、G99Y、N100Y、T102S、L104E、L104M、L104N、L104P、L104Q、L104T、L104Y、V106A、V106I、V106L、T107A、T107L、T107M、T107S、T107V、F108H、F108L、F108Y、Q110R、G111D、G111R、S112I、S112N、S112V、R113G、R113W、S114N、S114T、V115A、V115M、D116G或D116N或其保守氨基酸取代。在一些实施方案中，一个或多个氨基酸修饰选自P18S/P64S/F91S、P18S/F91S/L104P、P18L/L79V/F91S、P18S/F91S、P18T/F91S、P18T/S42P/F91S、G7E/P18T/Y30C/F91S、P18T/F91S/G111D、P18S/F91P、P18T/F91S/F108L、P18S/F91S、P18T/T45A/F91S、P18T/F91S/R94H、P18S/Y30C/F91S、A81V/L83P、A13E/P18S/A56V/F91S、P18T/F91S/V115A、P18T/Q60K、S52M、T45Q/S52L/L104E/G111R、S42G、Q62F、S52Q、S42A/L104Q/G111R、S42A/S52Q/L104Q/G111R、S52W/L104E、S42C、S52W、S52M/L104Q、S42L/S52L/Q62F/L104Q、S42W、S42Q、S52L、S52R、L104E、G111R、S52E、Q62Y、T45Q/S52M/L104E、S42N/L104Q/G111R、S52M/V57L、S42N/S52Q/Q62F、S42A/S52L/L104E/G111R、S42W/S52Q/V57L/Q62Y、L104Q、S42L/S52Q/L104E、S42C/S52L、S42W/S52R/Q62Y/L104Q、T45Q/S52R/L104E、S52R/Q62F/L104Q/G111R、T45Q/S52L/V57L/L104E、S52M/Q62Y、Q62F/L104E/G111R、T45Q/S52Q、S52L/L104E、S42V/S52E、T45Q/S52R/G111R、S42G/S52Q/L104E/G111R、S42N/S52E/V57L/L104E、S42C/S52M/Q62F、S42L、S42A、S42G/S52L/Q62F/L104Q、S42N、P18T/S65A/S67V/F91S、P18F/T39A/T45Q/T61R/S65N/S67L/E73G/R78G、P18T/T45Q/T61R/S65N/S67L、P18F/S65A/S67V/F91S、P18F/T45Q/T61R/S65N/S67L/F91S/L104P、P18S/L79P/L104M、P18S/L104M、L79P/L104M、P18T/T45Q/L79P、P18T/T45Q/T61R/S65H/S67H、P18T/A81E、P18S/D23Y/E37P/S52G/Q62M/G80S/A81P/G99Y/S112N、A13R/D23Y/E37P/S42P/Q62Y/A81E、A13R/D23Y/E37P/G99Y/S112N、A13R/D23Y/E37P/Q62M/A77V/G80S/A81P/G99Y、P18L/E37S/Q62M/G80S/A81P/G99Y/S112N、P18S/L104T、P18S/Q62H/L79Q/F91S、T45Q/S52K/Q62F/L104Q/G111R、T45Q/S52Q/Q62Y/L104Q/G111R、T45Q/S52Q/Q62Y/L104E/G111R、V57A/T61M/S65W/S67A/E96D/L104T、P18L/V57T/T61S/S65Y/S67A/L104T、P18T/T45Q、P18L/V57A/T61M/S65W/S67A/L104T、T61M/S65W/S67A/L104T、P18S/V41A/S42G/T45G/L104N、P18H/S42G/T45I/S52T/G53R/S54H/V57L/H59E/T61S/S65D/E68G/L104N、P18S/S42G/T45V/F58L/S67W/L104N、P18S/T45I/L104N、P18S/S42G/T45G/L104N/V106A、P18H/H40R/S42G/T45I/S52T/G53R/S54H/V57L/H59E/T61S/S65D/E68G/L104Y/V106L/F108H、E37V/S42G/T45G/L104N、P18S/T45Q/L79P/L104T、P18L/Q62R、A13R/D23Y/E37P/S42L/S52G/Q62Y/A81E、P18L/H49R/L104T/D116N、A13R/D23Y/E37P/Q62M/G80S/A81P/L104T、S65T/L104T、A13R/D23Y/E37P/S52G/V57A/Q62M/K70E/L104T、P18L/A47V/Q62Y/E73D/L104T、H40T/V41M/A47V/S52Q/Q62L/S65T/E73R/D97G/E98S/L104T/D116N、P18L/S42P/T45Q/T61G/S65H/S67E/L104T/D116N、P18S/H40T/V41M/A47V/S52Q/Q62L/S65T/E73R/L104M/V106A、H40T/V41M/A47V/S52Q/Q62L/S65T/E68G/E73R/D97G/E98S/L104T、T45Q/S52E/L104E、T45Q/S52E/Q62F/L104E、P18F/T26M/L44V/Q62K/L79P/F91S/L104M/G111D、P18S/T45S/T61K/S65W/S67A/F91S/G111R、P18S/L79P/L104M/T107M、P18S/S65W/S67A/M90V/V95A/L104Q/G111R、P18S/A47G/L79P/F91S/L104M/T107A/R113W、P18T/D23G/S24A/N35D/H49L/L79P/F91S/L104M/G111R、V9L/P18S/Q60R/V75L/L79P/R89K/F91S/L104E/G111R、P18S/H49R/E73D/L79P/N85D/F91S/V95A/L104M/G111R、V11A/P18S/L79P/F91S/L104M/G111R、V11A/P18S/S54R/Q60P/Q62K/L79P/N85D/F91S/T107M、P18T/S52P/S65A/S67V/L79P/F91S/L104M/G111R、P18T/M36T/L79P/F91S/G111R、D8G/P18S/M36I/V38A/H49Q/A76E/F91S/L104M/T107A/R113W、P18S/S52P/S65A/S67V/L79P/F91S/L104M/T107S/R113W、T15I/P18T/L79P/F91S/L104M/G111R、P18F/T26M/L44V/Q62K/L79P/E82D/F91S/L104M/G111D、P18T/E37G/G53R/Q62K/L79P/F91S/E98D/L104M/T107M、P18L/K70E/L79P/F91S/V95A/G111R、V9I/Q12K/P18F/S65A/S67V/L79P/L104T/G111R/S112I、P18F/S65A/S67V/F91S/L104M/G111R、V9I/V10I/P18S/F20S/T45A/L79P/F91S/L104M/F108Y/G111R/S112V、V9L/P18L/L79P/M90I/F91S/T102S/L104M/G111R、P18C/T26M/L44V/M55I/Q62K/L79P/F91S/L104M/T107M、V9I/P18T/D23G/L79P/F91S/G111R、P18F/L79P/M90L/F91S/V95A/L104M/G111R、P18T/M36T/S65A/S67E/L79Q/A81T/F91S/G111R、V9L/P18T/Q62R/L79P/F91S/L104M/G111R、P18S/S65W/S67A/L104Q/G111R、P18T/G19D/M36T/S54N/L79P/L83Q/F91S/T107M/F108Y、V9L/P18L/M55V/S69L/L79P/A81E/F91S/T107M、P18F/H40Q/T61K/Q62K/L79P/F91S/L104M/T107V、P18S/Q32R/Q62K/R78G/L79P/F91S/T107A/R113W、Q12H/P18T/L21S/G22S/V57A/Q62R/L79P/F91S/T107M、V9I/P18S/S24P/H49Q/F58Y/Q60R/Q62K/L79P/F91S/T107M、P18T/W46C/H49R/S65A/S67V/A76T/L79P/S87T/L104M、P18S/S42T/E51G/L79P/F91S/G92W/T107M、V10F/T15S/P18L/R48Q/L79P/F91S/T107M/V115M、P18S/L21M/Y30F/N35D/R84W/F91S/T107M/D116G、P18F/E51V/S54G/Q60R/L79Q/E82G/S87T/M90I/F91S/G92R/T107M、Q16H/P18F/F91S/T107M、P18T/D23G/Q60R/S67L/L79P/F91S/T107M/V115A、D8G/V9I/V11A/P18T/T26M/S52P/L79P/F91S/G92A/T107L/V115A、V9I/P18F/A47E/G50S/E68G/L79P/F91S/T107M、P18S/M55I/Q62K/S69P/L79P/F91S/T107M、P18T/T39S/S52P/S54R/L79P/F91S/T107M、P18S/D23N/L79P/F91S/T107M/S114N、P18S/P34S/E51V/L79P/F91S/G111R、P18S/H59N/V75A/L79P/A81T/F91S/L104M/T107M、P18S/W46R/E68D/L79P/F91S/T107M/R113G、V9L/P18F/T45A/S65A/S67V/R78K/L79V/F91S/T107M/S114T、P18T/M55L/T61R/L79P/F91S/V106I/T107M、T15I/P18S/V33M/N35F/T39S/M55L/R78S/L79P/F91S/T107M、P18S/Q62K/K70E/L79P/F91S/G92E/R113W、P18F/F20I/T26M/A47V/E51K/L79P/F91S、P18T/D23A/Q60H/L79P/M90V/F91S/T107M、P18S/D23G/C29R/N35D/E37G/M55I/Q62K/S65A/S67G/R78G/L79P/F91S/L104M/T107M/Q110R、A13E/P18S/M36R/Q62K/S67T/L79P/N85D/F91S/T107M、V9I/P18T/H49R/L79P/N85D/F91S/L104T/T107M、V9A/P18F/T61S/Q62L/L79P/F91S/G111R、D8E/P18T/T61A/L79P/F91S/T107M、P18S/V41A/H49R/S54C/L79S/N85Y/L88P/F91S/L104M/T107M、V11E/P18H/F20Y/V25E/N35S/H49R/L79P/F91S/T107M/G111R、V11A/P18F/D23A/L79P/G80D/V95A/T107M、P18S/K70R/L79P/F91S/G111R、V9L/V11M/P18S/N35S/S54G/Q62K/L79P/L104M/T107M/V115M、V9L/P18Y/V25A/V38G/M55V/A77T/L79P/M90I/F91S/L104M、V10G/P18T/L72Q/L79P/F91S/T107M、P18S/H59R/A76G/R78S/L79P、V9A/P18S/M36T/S65G/L79P/F91S/L104T/G111R/S112I、P18T/S52A/V57A/Q60R/Q62K/S65C/L79P/F91T/N100Y/T107M、V11A/P18F/N35D/A47E/Q62K/L79P/F91S/G99D/T107M/S114N、V11A/P18T/N35S/L79P/S87T/F91S、V9D/V11M/Q12L/P18S/E37V/M55I/Q60R/K70Q/L79P/F91S/L104M/T107M或T15S/P18S/Y30H/Q32L/Q62R/L79P/F91S/T107M。
在任何一种变体CD155多肽的一些实施方案中，变体CD155多肽包含1个IgC结构域或2个IgC结构域或其特异性片段。
在任何一种变体CD155多肽的一些实施方案中，由SEQ ID NO：59-80、178-274、1230-1252、1269和1610-1655中任一个所示的氨基酸序列或其特异性结合片段，或显示出与SEQ ID NO：59-80、178-274、1230-1252、1269和1610-1655中任一个或其特异性结合片段至少95％序列一致性并且含有所述一个或多个氨基酸取代的氨基酸序列。
在任何一种变体CD155多肽的一些实施方案中，变体CD155包含(i)SEQ ID NO：81-102、156-177、275-468、1184-1229、1270-1271、1656-1747中任一个所示的氨基酸序列或其特异性结合片段，(ii)显示出与SEQ ID NO：81-102、156-177、275-468、1184-1229、1270-1271、1656-1747中任一个或其特异性结合片段至少95％序列一致性并且含有所述一个或多个氨基酸取代的氨基酸序列。
在任何一种变体CD155多肽的一些实施方案中，与未修饰的CD155多肽相比，变体CD155多肽以增加的亲和力特异性地结合至TIGIT、CD226或CD96的胞外域。在一些实施方案中，与未修饰的CD155相比，变体CD155多肽以增加的亲和力特异性地结合至TIGIT或CD226的胞外域。在一些实施方案中，与未修饰的CD155相比，变体CD155多肽以增加的亲和力特异性地结合至TIGIT的胞外域和CD226的胞外域。在一些实施方案中，与未修饰的CD155相比，变体CD155多肽以增加的亲和力特异性地结合至TIGIT、CD226或CD96中的一个或多个的胞外域，并且以降低的亲和力特异性地结合至TIGIT、CD226或CD96中其余的一个或多个的胞外域。在一些实施方案中，与未修饰的CD155相比，变体CD155多肽以增加的亲和力特异性地结合至TIGIT的胞外域并且以降低的亲和力特异性地结合至CD226的胞外域。在一些实施方案中，与未修饰的CD155相比，变体多肽以增加的选择性特异性地结合至TIGIT的胞外域。在一些实施方案中，增加的选择性包括，变体多肽对于TIGIT相对于CD226的结合的比例大于未修饰的CD155多肽对于TIGIT相对于CD226的结合的比例。在一些实施方案中，该比例大至少或至少约1.5倍、2.0倍、3.0倍、4.0倍、5。0倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍或更多倍。在一些实施方案中，与未修饰的CD155相比，变体CD155多肽以增加的亲和力特异性地结合至CD226的胞外域并且以降低的亲和力特异性地结合至TIGIT的胞外域。
在任何一种变体CD155多肽的一些实施方案中，TIGIT是人TIGIT。在一些实施方案中，CD226是人CD226。在一些实施方案中，CD96是人CD96。
在任何一种变体CD155多肽的一些实施方案中，与未修饰的CD155相比，结合活性改变(增加或降低)多于1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍或50倍。
在任何一种变体CD155多肽的一些实施方案中，变体CD155多肽是可溶性蛋白。
在任何一种变体CD155多肽的一些实施方案中，变体CD155多肽与多聚化结构域连接。在一些实施方案中多聚化结构域是具有降低的效应子功能的Fc结构域或其变体。
在任何一种变体CD155多肽的一些实施方案中，变体CD155多肽与增加多肽的生物半衰期的部分连接。在一些实施方案中，变体CD80多肽与具有降低的效应子功能的Fc结构域或其变体连接。在一些实施方案中，Fc结构域是哺乳动物(任选地是人)的；或者，与哺乳动物(任选地是人)的未修饰的Fc结构域相比，变体Fc结构域包含一个或多个氨基酸修饰。在一些实施方案中，Fc结构域或其变体包含SEQ ID NO：56或SEQ ID NO：57所示的氨基酸序列或显示出与SEQ ID NO：56或SEQ ID NO：57至少85％序列一致性的氨基酸序列。在一些实施方案中，Fc结构域包含选自每个根据EU编号的E233P、L234A、L234V、L235A、L235E、G236del、G237A、S267K、N297G、V302C和K447del的一个或多个氨基酸修饰。在一些实施方案中，Fc结构域包含氨基酸修饰根据EU编号的C220S。在一些实施方案中，变体CD155多肽与多聚化结构域或Fc经由接头(任选地G4S接头)间接连接。
在任何一种变体CD155多肽的一些实施方案中，变体CD155多肽是跨膜免疫调节蛋白，其进一步含有与变体CD155多肽的其特异性结合片段的胞外结构域(ECD)连接的跨膜结构域。在一些实施方案中，跨膜结构域包含SEQ ID NO：20的残基344-367所示的氨基酸序列或其功能变体，该功能变体显示出与SEQ ID NO：20的残基344-367至少85％序列一致性。在一些实施方案中，变体CD155多肽还包含与跨膜结构域连接的细胞质信号传导结构域。在一些实施方案中，细胞质信号传导结构域包含SEQ ID NO：20的残基368-417所示的氨基酸序列或其功能变体，该功能变体显示出与SEQ ID NO：20的残基368-417至少85％序列一致性。
在任何一种变体CD155多肽的一些实施方案中，变体CD155多肽调节免疫细胞诸如T细胞的应答。在一些实施方案中，应答例如T细胞应答增加或降低。在任何一种变体CD155多肽的一些实施方案中，变体CD155在体外原代T细胞测定中相对于未修饰的CD155增加IFN-γ(干扰素-γ)表达。在本文所述的任何一种变体CD155多肽的一些实施方案中，变体CD155多肽相对于未修饰的CD155增加T细胞信号传导，例如使用报告测定所确定的，所述报告测定涉及被工程化改造有与IL-2启动子可操作地连接的报告基因(例如萤光素酶)的T细胞(例如Jurkat)。在本文所述的任何一种变体CD155多肽的一些实施方案中，变体CD155多肽相对于未修饰的CD155降低T细胞信号传导，例如使用报告基因测定所确定的，所述报告测定涉及被工程化改造有与IL-2启动子可操作地连接的报告基因(例如萤光素酶)的T细胞(例如Jurkat)。在任意这种实施方案中的一些中，变体CD155多肽以多种形式中的任一种被提供，诸如可溶性的或固定的(例如板结合的)。
在任何一种变体CD155多肽的一些实施方案中，变体CD155在体外原代T细胞测定中相对于未修饰的CD155降低IFN-γ(干扰素-γ)表达。在任何一种变体CD155多肽的一些实施方案中，变体CD155多肽是去糖基化的。在本文所述的任何一种变体CD155多肽的一些实施方案中，变体CD155多肽相对于未修饰的CD155增加T细胞信号传导，例如使用报告基因测定所确定的，所述报告测定涉及被工程化改造有与IL-2启动子可操作地连接的报告基因(例如萤光素酶)的T细胞(例如Jurkat)。在本文所述的任何一种变体CD155多肽的一些实施方案中，变体CD155多肽相对于未修饰的CD155降低T细胞信号传导，例如使用报告基因测定所确定的，所述报告测定涉及被工程化改造有与IL-2启动子可操作地连接的报告基因(例如萤光素酶)的T细胞(例如Jurkat)。在任意这种实施方案中的一些中，变体CD155多肽以多种形式中的任一种被提供，诸如可溶性的或固定的(例如板结合的)。
在一些实施方案中，本文提供了免疫调节多肽，其包含根据任何一个提供的实施方案的变体CD155以及包含IgSF家族成员的免疫球蛋白超家族(IgSF)结构域或其亲和力修饰的IgSF结构域的第二多肽，所述亲和力修饰的IgSF结构域包含与IgSF家族成员的未修饰的或野生型IgSF结构域相比一个或多个氨基酸修饰。在一些情况下，变体CD155多肽和第二多肽直接连接或经由接头间接连接。在一些实施方案中，IgSF结构域是亲和力修饰的，并且与IgSF家族成员的未修饰的或野生型IgSF结构域相比，显示出与一种或多种其同源结合配偶体的改变的结合。在一些实施方案中，IgSF结构域与未修饰的或野生型IgSF结构域相比，显示出与一种或多种其同源结合配偶体的增加的结合。在一些实施方案中，变体CD155多肽是第一变体CD155多肽，并且第二多肽的IgSF结构域是来自根据本文所述任一个实施方案的第二变体CD155多肽的IgSF结构域，其中该第一和第二变体CD155多肽是相同或不同的。在一些实施方案中，变体CD155多肽能够特异性地结合至TIGIT或CD226，并且IgSF结构域能够与同源结合配偶体结合，该同源结合配偶体并非由该变体CD155多肽特异性地结合的同源结合配偶体。在一些实施方案中，IgSF结构域来自B7家族的成员。
在一些实施方案中，IgSF结构域与肿瘤上表达的配体结合，或者是与在与炎性环境相关的细胞或组织上表达的配体结合的炎性定位部分。在一些实施方案中，配体是B7H6。在一些实施方案中，IgSF结构域来自NKp30。
在一些实施方案中，第二多肽的IgSF结构域是与抑制型受体结合的配体的IgSF结构域，或者是其亲和力修饰的IgSF结构域。在一些实施方案中，第二多肽的IgSF结构域是亲和力修饰的IgSF结构域，并且与未修饰的IgSF结构域与抑制型受体的结合相比，该亲和力修饰的IgSF结构域显示出对于抑制型受体的增加的结合亲和力和/或结合选择性。在一些实施方案中，抑制型受体是TIGIT、CD112R、CTLA-4或PD-1；或者抑制型受体的配体是CD112、CD80、PD-L1或PD-L2。
在一些实施方案中，第二多肽选自：(i)变体CD80多肽，其包含表3中所示的任一个SEQ ID NO的IgSF结构域，任选地SEQ ID NO：896-928、930-968、970-1002、1004-1042、1044-1116；(ii)变体PD-L1多肽，其包含表4中所示的任一个SEQ ID NO的IgSF结构域，任选地470-664、1753-1755、1757-2031；(iii)变体PD-L2多肽，其包含表5中所示的任一个SEQID NO的IgSF，任选地31、667-717、719-725、727-794、796-870、872-895；(iv)变体CD112多肽，其包含SEQ ID NO：1273-1366、1368-1609中的任一个所示的IgSF结构域；(v)氨基酸序列，其显示出与(i)-(iii)中任一个SEQ ID NO至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、95％、97％、98％、99％或更多序列一致性，并且包含氨基酸修饰，任选地是氨基酸取代、插入和/或缺失；或(vi)(i)-(v)中任一个的特异性结合片段。在一些实施方案中，免疫调节蛋白还含有第三多肽，其含有IgSF家族成员的IgSF结构域或其亲和力修饰的IgSF结构域，所述亲和力修饰的IgSF结构域与该IgSF家族成员的未修饰的或野生型IgSF结构域相比含有一个或多个氨基酸修饰。在一些方面，第三多肽与第一和/或第二多肽相同；或第三多肽与第一和/或第二多肽不同。在一些实施方案中，第三多肽选自：变体CD80多肽，其包含SEQ IDNO：896-928、930-968、970-1002、1004-1042、1044-1116中任一个所示的IgSF结构域；(ii)变体PD-L1多肽，其包含SEQ ID NO：470-664、1753-1755、1757-2031中任一个所示的IgSF结构域；(iii)变体PD-L2多肽，其包含SEQ ID NO：667-717、719-725、727-794、796-870、872-895中任一个所示的IgSF结构域；(iv)变体CD112多肽，其包含SEQ ID NO：1273-1366、1368-1609中任一个所示的IgSF结构域；(v)氨基酸序列，其显示出与(i)-(iv)中任一个SEQ IDNO至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、95％、97％、98％、99％或更多序列一致性并且包含氨基酸修饰，任选地是氨基酸取代、插入和/或缺失；或(vi)(i)-(v)中任一个的特异性结合片段。
在一些实施方案中，IgSF结构域或其亲和力修饰的IgSF结构域(任选地为第二或第三多肽的IgSF结构域或其亲和力修饰的IgSF结构域)，是或包含IgV结构域。在一些实施方案中，变体CD155多肽是或包含IgV结构域。
在任何这样的实施方案中的一些中，免疫调节蛋白进一步含有至少一个额外的多肽，所述多肽含有IgSF家族成员的IgSF结构域或其亲和力修饰的IgSF结构域，所述亲和力修饰的IgSF结构域与IgSF家族成员的未修饰的或野生型IgSF结构域相比含有一个或多个氨基酸修饰。
在根据任何一种免疫调节蛋白的一些实施方案中，免疫调节蛋白与多聚化结构域连接。在一些实施方案中，免疫调节蛋白还包含与至少一个变体CD155多肽或第二多肽连接的多聚化结构域。在一些实施方案中，免疫调节蛋白还含有与至少一个变体CD155多肽、第二多肽和/或第三多肽连接的多聚化结构域。在一些实施方案中，多聚化结构域是具有降低的效应子功能的Fc结构域或其变体。在一些实施方案中，Fc结构域或其变体包含SEQ IDNO：56或SEQ ID NO：57中所示的氨基酸序列或显示出与SEQ ID NO：56或SEQ ID NO：57至少85％序列一致性的氨基酸序列。在一些实施方案中，多聚化结构域促使异二聚体形成。
本文提供了一种免疫调节蛋白，其含有本文提供的第一变体CD155多肽，(其中多聚化结构域是第一多聚化结构域)和提供的第二变体CD155多肽(其中多聚化结构域是第二多聚化结构域)，其中第一和第二多聚化结构域相互作用以形成含有第一和第二变体CD155多肽的多聚体。在一些实施方案中，多聚化结构域是第一多聚化结构域，并且与第二多聚化结构域相互作用以形成含有免疫调节蛋白的多聚体。在一些实施方案中，免疫调节蛋白是第一免疫调节蛋白，并且第二免疫调节蛋白直接或经由接头间接与第二多聚化结构域连接，其中多聚体包含第一和第二免疫调节蛋白。在一些实施方案中，第二免疫调节蛋白是根据提供的任何一个实施方案的免疫调节蛋白。
在一些实施方案中，多聚体是二聚体。在一些情况下，免疫调节蛋白是同源二聚体。在一些方面，免疫调节蛋白是异二聚体。
在任何此类实施方案中的一些中，第一和/或第二多聚化结构域是具有降低的效应子功能的Fc结构域或其变体。在一些实施方案中，第一和第二多聚化结构域是相同的或不同的。
在一些实施方案中，本文提供了缀合物，其包含与一个部分连接的根据所提供的任一个实施方案的变体CD155或根据所提供的任一个实施方案的免疫调节蛋白。在一些实施方案中，该部分是特异性地结合至细胞表面上的分子的靶向部分。在一些实施方案中，靶向部分特异性地结合至免疫细胞表面上的分子。在一些实施方案中，免疫细胞是抗原呈递细胞或淋巴细胞。在一些实施方案中，靶向部分与肿瘤表面上的分子结合。在一些实施方案中，该部分是蛋白质、肽、核酸、小分子或纳米颗粒。在一些实施方案中，该部分是抗体或抗原结合片段。在一些实施方案中，缀合物是二价、四价、六价或八价的。
在一些实施方案中，本文提供了核酸分子，其编码根据所提供的任一个实施方案的变体CD155多肽或根据所提供的任一个实施方案的免疫调节蛋白。在一些实施方案中，核酸分子是合成核酸。在一些实施方案中，核酸是cDNA。
在一些实施方案中，本文提供了包含所提供的任一个实施方案的核酸的载体。在一些实施方案中，载体是表达载体。在一些实施方案中，载体是哺乳动物载体或病毒载体。
在一些实施方案中，本文提供了包含根据所提供的任一个实施方案的载体的细胞。在一些实施方案中，该细胞是哺乳动物细胞。在一些实施方案中，该细胞是人细胞。
在一些实施方案中，本文提供了产生变体CD155多肽或免疫调节蛋白的方法，包括在细胞中表达蛋白质的条件下将根据所提供的任一个实施方案的核酸分子或根据所提供的任一个实施方案的载体引入宿主细胞中。在一些实施方案中，该方法还包括从细胞中分离或纯化变体CD155多肽或免疫调节蛋白。
在一些实施方案中，本文提供了将表达变体CD155多肽的细胞工程化的方法，包括在宿主细胞中表达根据所提供的任一个实施方案的变体CD155多肽或免疫调节蛋白的条件下将编码所述根据所提供的任一个实施方案的变体CD155多肽或免疫调节蛋白的核酸分子引入该细胞中。
在一些实施方案中，本文提供了工程化细胞。在一些实施方案中，该工程化细胞包含本文所述的任一个变体CD155多肽、本文所述的任一个免疫调节蛋白、或本文所述的任一个核酸分子、或本文所述的任一个载体。在一些实施方案中，变体CD155多肽或免疫调节蛋白由本文所述的工程化细胞中的核酸编码，所述核酸含有编码信号肽的核酸序列。在一些实施方案中，本文所述的工程化细胞中的变体CD155多肽或免疫调节蛋白不包含跨膜结构域和/或不在细胞表面上表达。在一些实施方案中，本文所述的工程化细胞中的变体CD155多肽或免疫调节多肽由工程化细胞分泌。在一些实施方案中，工程化细胞包含包含跨膜结构域的变体CD155多肽，和/或包含本文所述的任一个跨膜免疫调节蛋白。在一些实施方案中，本文所述的工程化细胞中的变体CD155多肽在细胞表面上表达。
在一些实施方案中，本文提供了工程化细胞，其表达本文所述的所提供的任一个实施方案的变体CD155多肽或免疫调节蛋白。在一些实施方案中，工程化细胞是免疫细胞。在一些实施方案中，免疫细胞是抗原呈递细胞(APC)或淋巴细胞。在一些实施方案中，工程化细胞是原代细胞。在一些实施方案中，工程化细胞是哺乳动物细胞。在一些实施方案中，工程化细胞是人细胞。在一些实施方案中，淋巴细胞是T细胞。在一些实施方案中，APC是人工APC。在一些实施方案中，工程化细胞还包含嵌合抗原受体(CAR)或工程化T细胞受体(TCR)。
还提供了感染原。在一些实施方案中，所提供的感染原包含编码本文所述的任一个变体CD155多肽或本文所述的任一个免疫调节蛋白的核酸分子。在一些实施方案中，编码的变体CD155多肽或免疫调节蛋白不包含跨膜结构域和/或不在表达它的细胞表面上表达。在一些实施方案中，编码的变体CD155多肽或免疫调节多肽由表达它的细胞分泌。在一些实施方案中，编码的变体CD155多肽包含跨膜结构域。在一些实施方案中，编码的变体CD155多肽在表达它的细胞表面上表达。
在一些实施方案中，感染原是细菌或病毒。在一些实施方案中，病毒是慢病毒或逆转录病毒构建体或其杂种(hybrid)。在一些实施方案中，感染原是病毒并且该病毒是溶瘤病毒。在一些实施方案中，溶瘤病毒是腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、单纯疱疹病毒、水疱性口炎病毒、呼肠孤病毒、新城疫病毒、细小病毒、麻疹病毒、水疱性口炎病毒(VSV)、柯萨奇病毒或牛痘病毒。在一些实施方案中，病毒特异性地靶向树突细胞(DC)和/或是噬树突细胞的。在一些实施方案中，病毒是慢病毒载体，其用经修饰的辛德比斯病毒包膜产物假型化。
在一些实施方案中，感染原额外地包含编码另一基因产物的核酸分子，该另一基因产物导致靶细胞死亡或可增加或增强免疫应答。在一些实施方案中，该另一基因产物选自抗癌剂、抗转移剂、抗血管生成剂、免疫调节分子、免疫检查点抑制剂、抗体、细胞因子、生长因子、抗原、细胞毒性基因产物、促凋亡基因产物、抗凋亡基因产物、细胞基质降解基因、用于组织再生或将人类体细胞重编程为多能性的基因。
在一些实施方案中，本文提供了药物组合物，其包含根据本文所述的任一个实施方案的变体CD155多肽、根据本文所述的任一个实施方案的免疫调节蛋白、根据本文所述的任一个实施方案的缀合物、根据本文所述的任一个实施方案的工程化细胞或根据本文所述的任一个实施方案的感染原。在一些实施方案中，药物组合物还包含药学上可接受的赋形剂。在一些实施方案中，药物组合物是无菌的。
在一些实施方案中，本文提供了在小瓶或容器中的制品，其包含根据本文所述的任一个实施方案的药物组合物。在一些实施方案中，小瓶或容器是密封的。
在一些实施方案中，本文提供了试剂盒，其包含根据本文所述的任一个实施方案的药物组合物和使用说明书。在一些实施方案中，本文提供了试剂盒，其包含根据本文所述的任一个实施方案的制品和使用说明书。
在一些实施方案中，本文提供了调节受试者中免疫应答(例如增加或降低免疫应答)的方法，包括向所述受试者给予根据本文所述的任一个实施方案的药物组合物。在一些实施方案中，该方法包括给予本文所述的任一个实施方案的工程化细胞。在一些实施方案中，工程化细胞对于受试者是自体同源的。在一些实施方案中，工程化细胞对于受试者是同种异体的。在一些实施方案中，该方法进一步包括向受试者施用根据本文所述的任一个实施方案的可溶性变体CD155多肽、根据本文所述的任一个实施方案的免疫调节蛋白、或根据本文所述的任一个实施方案的缀合物。在一些实施方案中，该方法包括向受试者施用根据本文所述的任一个实施方案的编码变体CD155多肽的感染原。
在一些实施方案中，调节免疫应答治疗受试者中的疾病或病况。
在一些实施方案中，免疫应答增加。考虑多种形式的变体CD155多肽用于施用至受试者以增加免疫应答，例如拮抗剂形式的变体CD155。在一些情况下，此类方法在该施用会阻断或减弱通过抑制型受体TIGIT的信号传导的条件下执行。在本文提供的方法的一些实施方案中，可溶的变体CD155多肽或免疫调节蛋白被施用至受试者。在本文提供的方法的一些实施方案中，可溶性免疫调节蛋白是免疫调节Fc融合蛋白。在本文提供的方法的一些实施方案中，本文所述的任何变体CD155多肽、或本文所述的任何免疫调节蛋白被施用至受试者。在本文提供的方法的一些实施方案中，包含可分泌性变体CD155多肽的工程化细胞被施用至受试者。在一些实施方案中，本文所述的任何工程化细胞被施用至受试者。在本文提供的方法的一些实施方案中，任选地是在感染原感染肿瘤细胞或免疫细胞并且可分泌性免疫调节蛋白从该被感染的细胞中分泌的条件下，编码为可分泌性免疫调节蛋白的变体CD155多肽的感染原被施用至受试者。
在一些实施方案中，疾病或病况是肿瘤或癌症。在一些实施方案中，疾病或病况选自黑色素瘤、肺癌、膀胱癌或血液恶性肿瘤。在任何此类实施方案中的一些中，变体CD155以增加受试者中的免疫应答的形式施用。
在一些实施方案中，免疫应答降低。考虑多种形式的变体CD155多肽用于施用至受试者以降低免疫应答，例如激动剂形式的变体CD155。在一些情况下，此类方法在该施用会激活或刺激或诱导通过抑制型受体TIGIT的信号传导的条件下被执行。在本文提供的方法的一些实施方案中，与定位到炎性环境的细胞或组织的部分连接的包含变体CD155多肽的免疫调节蛋白或缀合物被施用至受试者。在一些实施方案中，结合分子包含抗体或其抗原结合片段，或包含第二多肽，所述第二多肽包含野生型IgSF结构域或其变体。在本文提供的方法的一些实施方案中，本文所述的任何免疫调节蛋白或本文所述的任何缀合物被施用至受试者。在本文提供的方法的一些实施方案中，为跨膜免疫调节蛋白的变体CD155多肽被施用至受试者。在本文提供的方法的一些实施方案中，任何工程化细胞被施用至受试者，所述工程化细胞包含本文所述的为跨膜免疫蛋白的变体CD155多肽。在本文提供的方法的一些实施方案中，任选地在感染原感染受试者中的细胞并且跨膜免疫调节蛋白在该被感染的细胞的表面上表达的条件下，编码为跨膜免疫调节蛋白的变体CD155多肽的感染原被施用至受试者。
在一些实施方案中，疾病或病况是炎性或自身免疫性疾病或病况。在一些实施方案中，该疾病或病况是抗中性粒细胞胞浆抗体(ANCA)相关的血管炎、血管炎、自身免疫性皮肤病、移植、风湿性疾病、炎性胃肠疾病、炎性眼病、炎性神经疾病、炎性肺病、炎性内分泌疾病或自身免疫性血液病。在一些实施方案中，该疾病或病况选自间质性肠病、移植、克罗恩病、溃疡性结肠炎、多发性硬化、哮喘、类风湿性关节炎或银屑病。在任何此类实施方案中的一些中，变体CD155以降低免疫应答的形式在受试者中施用。
附图说明
图1A-图1C描绘了所提供的变体IgSF结构域分子的各种形式。图1A描绘了可溶性分子，其包括：(1)变体IgSF结构域(vIgD)，其与Fc链融合；(2)堆叠分子，其含有第一变体IgSF结构域(第一vIgD)和第二IgSF结构域如第二变体IgSF结构域(第二vIgD)；(3)肿瘤靶向IgSF分子，其含有第一变体IgSF结构域(vIgD)和靶向肿瘤抗原的IgSF结构域如Nkp30IgSF结构域；以及(4)变体IgSF结构域(vIgD)，其与抗体(V-mAb)连接。图1B描绘了跨膜免疫调节蛋白(TIP)，其含有在细胞表面上表达的变体IgSF结构域(vIgD)。在一个示例性实施方案中，跨膜结合的vIgD的同源结合配偶体是抑制型受体(例如TIGIT)，并且含有vIgD(例如，CD1556 vIgD)的TIP拮抗或阻断抑制型受体的负性(negative)信号传导，从而产生被活化的T细胞或效应T细胞。图1C描绘了分泌型免疫调节蛋白(SIP)，其中变体IgSF结构域(vIgD)由细胞分泌，如第一T细胞(例如CAR T细胞)。在一个示例性实施方案中，分泌的vIgD的同源结合配偶体是抑制型受体(例如TIGIT)，其可以由第一细胞(例如T细胞，例如CAR T细胞)和/或在第二细胞(例如T细胞；内源性的或工程化的，如CAR T细胞)上表达。在SIP与其同源结合配偶体结合后，SIP经由抑制型受体拮抗或阻断负性信号传导，从而产生被活化的T细胞或效应T细胞。在所有情况下，vIgD可以是单独的V结构域(IgV)、V结构域(IgV)和C结构域(IgC)的组合(包括整个细胞外结构域(ECD))、或IgSF超家族成员的Ig结构域的任何组合。
图2描绘了与Fc融合的变体IgSF结构域(vIgD)(vIgD-Fc)的活性的示例性示意图，其中vIgD是CD155的IgSF结构域的变体。如图所示，CD155的可溶性vIgD与其同源结合配偶体相互作用，以阻断CD155或CD112与TIGIT的相互作用，从而阻断TIGIT抑制型受体，并且，在一些情况下，允许T细胞分化为效应表型。
图3描绘了堆叠分子的示例性示意图，堆叠分子是一种多靶标检查点拮抗剂，其含有为PD-L1或PD-L2 vIgD的第一变体IgSF结构域(第一vIgD)以及与第二抑制型受体结合的第二IgSF结构域(例如第二vIgD)。在该示例性示意图中，第二IgSF结构域(例如第二vIgD)是CD155 vIgD。如图所示，第一vIgD和第二vIgD与它们的同源结合配偶体相互作用以分别阻断PD-L1或PD-L2与PD-1的相互作用和阻断CD155与TIGIT的相互作用，阻断多个抑制型受体。
图4描绘了用于将变体IgSF(vIgD)定位于肿瘤细胞的堆叠分子的示例性示意图。在这种形式中，堆叠分子含有第一变体IgSF结构域(第一vIgD)和第二IgSF结构域(例如第二vIgD)，其中该第二IgSF结构域(例如第二vIgD)是与肿瘤抗原结合的靶向肿瘤的IgSF结构域。示例性靶向肿瘤的IgSF结构域是与肿瘤抗原B7-H6结合的Nkp30的IgSF结构域。在该描述中，vIgD是CD155的IgSF结构域的变体。如图所示，靶向肿瘤的IgSF结构域与肿瘤细胞表面的结合将第一变体IgSF结构域定位于肿瘤细胞表面上，其中该第一变体IgSF结构域可以与相邻免疫细胞(例如T细胞)表面上表达的一种或多种其同源结合配偶体相互作用以拮抗TIGIT的抑制性信号。
图5A描绘了含有第一变体IgSF结构域(第一vIgD)和第二IgSF结构域如第二变体IgSF结构域(第二vIgD)的堆叠分子的各种示例性构型。如图所示，第一vIgD和第二IgSF结构域直接或间接地单独与Fc区的N-或C-末端连接。为了产生同型二聚体Fc分子，Fc区是能够通过细胞中各个Fc区的共表达而与匹配的Fc区形成同源二聚体的Fc亚基。为了产生异二聚体Fc分子，各个Fc区含有突变(例如CH3结构域中的“隆突到穴中(knob-into-hole)”突变)，使得当各个Fc区在细胞中共表达时，与同型二聚体相比，异二聚体的形成是有利的。
图5B描绘了含有第一变体IgSF结构域(第一vIgD)、第二IgSF结构域如第二变体IgSF结构域(第二vIgD)和第三IgSF结构域如第三变体IgSF结构域(第三vIgD)的堆叠分子的各种示例性构型。如图所示，第一vIgD、第二IgSF和第三IgSF结构域直接或间接地单独与Fc区的N-或C-末端连接。为了产生同型二聚体Fc分子，Fc区是能够通过细胞中各个Fc区的共表达而与匹配的Fc区形成同源二聚体的Fc区。
图6描绘了与抗体(V-Mab)缀合的变体IgSF结构域(vIgD)的活性的示例性示意图，其中抗体(例如抗HER2抗体)与肿瘤细胞表面上的抗原结合以将vIgD定位于该细胞。如图所示，抗体与肿瘤细胞表面的结合将vIgD定位于肿瘤细胞表面上，其中vIgD可以与在相邻免疫细胞(例如T细胞)表面上表达的一种或多种其同源结合配偶体相互作用以激动或拮抗受体信号传导。在所示的示例性实施方案中，变体IgSF结构域(vIgD)是结合抑制型受体TIGIT的(例如具有对于抑制型受体TIGIT具有增加的亲和力的)CD155的IgSF结构域的变体。CD155 vIgD与TIGIT抑制型受体的结合拮抗或阻断抑制型受体的负性信号传导，从而产生被活化的T细胞或效应T细胞。在一些情况下，如果抑制型受体(TIGIT)的成簇靠近活化型受体(例如CD226)，那么将会实现由TIP激动抑制型受体的活性。
图7A-图7C描绘了变体IgSF-抗体缀合物(V-Mab)的各种示例性构型。图7A示出了各种构型，其中变体IgSF结构域直接或间接地与抗体的轻链的N-和/或C-末端连接。图7B示出了各种构型，其中变体IgSF结构域直接或间接地与抗体的重链的N-和/或C-末端连接。图7C描绘了当图7A的轻链和图7B的重链在细胞中共表达时所得的V-Mab构型。
具体实施方式
本文提供了免疫调节蛋白，该免疫调节蛋白是CD155(也称为脊髓灰质炎病毒受体或PVR)的变体或突变体或其特异性结合片段或包含CD155的变体或突变体及其特异性结合片段，该CD155的变体或突变体及其特异性结合片段显示出活性以与对至少一种靶配体同源结合配偶体(也称为反结构蛋白)结合。在一些实施方案中，与未修饰的或野生型CD155多肽相比，变体CD155多肽含有一个或多个氨基酸修饰(例如，氨基酸取代、缺失或添加)。在一些实施方案中，一个或多个氨基酸修饰(例如取代)在未修饰的或野生型CD155多肽的IgSF结构域(例如IgV)中。在一些实施方案中，变体CD155多肽和免疫调节蛋白显示出对于至少一个同源结合配偶体(例如TIGIT、CD226或CD96中的至少一个)的改变的(例如增加的或降低的)结合活性或亲和力。在一些实施方案中，免疫调节蛋白是可溶性的。在一些实施方案中，免疫调节蛋白是能够在细胞表面上表达的跨膜免疫调节蛋白。在一些实施方案中，本文还提供了一种或多种其它免疫调节蛋白，其是含有本文提供的变体CD155多肽和一种或多种其它部分或多肽的缀合物或融合物。
在一些实施方案中，变体CD155多肽和免疫调节蛋白调节免疫学的免疫应答，如增加或降低免疫应答。在一些实施方案中，本文提供的变体CD155多肽和免疫调节蛋白可用于治疗与异常调节的免疫应答相关的疾病或病况。
在一些实施方案中，所提供的变体CD155多肽经由与共刺激和/或共抑制信号传导分子的相互作用调节T细胞活化。通常，抗原特异性T细胞活化通常需要两种不同的信号。第一信号由T细胞受体(TCR)与抗原呈递细胞(APC)上存在的主要组织相容性复合物(MHC)相关抗原的相互作用提供。第二信号是对TCR参与的共刺激并且是T细胞增殖、分化和/或存活(包括，在一些情况下，以避免T细胞凋亡或无反应性)所必需的。
在一些实施方案中，在正常身体条件下，T细胞介导的免疫应答由T细胞受体(TCR)识别抗原起始，并且受到共刺激和抑制信号(例如免疫检查点蛋白)的平衡的调节。免疫系统依赖于免疫检查点来防止自身免疫(即自身耐受)以及在免疫应答期间(例如在针对病原体感染的攻击期间)保护组织免于过度损伤。然而，在一些情况下，作为逃避免疫系统的一个机制，这些免疫调节蛋白能够在包括肿瘤在内的疾病和病况中被异常调节。
在一些实施方案中，已知的T细胞共刺激受体是CD226，其是对于配体CD155(也称为脊髓灰质炎病毒受体、PVR)和CD112(也称为Nectin-2)的T细胞共刺激受体。CD155和CD112通常在APC(例如树突细胞)的表面上表达，并且在一些情况下在肿瘤细胞中过表达。CD155或CD112配体被CD226结合以及CD226的参与能够促使Th1分化和/或NK细胞活化。但是，CD155和CD112配体也能与抑制性T细胞受体TIGIT(具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体)结合以抑制或下调免疫应答。TIGIT，也能在NK细胞和T细胞中表达，能够压抑或抑制NK细胞的细胞活性、T细胞增殖和/或促炎性细胞因子产生。在一些实施方案中，受体CD96，期结合配体CD155但是不结合CD112，也能够显示出对CD226的对抗作用以抑制NK细胞活性。因此，CD226和TIGIT或CD96可以在免疫应答中发挥对抗作用以调节在一些情况下与大量疾病和病况相关的促炎性或抗炎性应答。
在一些实施方案中，增强或抑制CD226、TIGIT和/或CD96受体的活性对于治疗炎性和自身免疫疾病、癌症和病毒感染具有临床意义。然而，在一些情况下，干预和改变此类受体的免疫调节作用的疗法受制于空间定向要求以及免疫突触界限所施加的大小限制。在一些方面，现有的治疗药物(包括抗体药物)可能不能与参与调节这些相互作用的多种靶蛋白同时相互作用。此外，在一些情况下，现有的治疗药物可能仅具有拮抗而非激动免疫应答的能力。另外，单独地靶向这些受体中的一种的药物之间的药代动力学差异可能在整个治疗过程中难以适当地维持这种药物组合的所需血液浓度。
在一些实施方案中，所提供的变体CD155多肽或免疫调节蛋白调节(例如增加或降低)共刺激受体TIGIT、CD226和CD96中的一种或多种诱导的或相关的免疫活性。因此，在一些实施方案中，所提供的多肽通过以下方式克服了这些限制：提供对TIGIT、CD226和/或CD96具有改变的(例如增加的或降低的)结合亲和力的变体CD155，从而激动或拮抗受体共刺激的互补作用。还提供了制备和使用这些变体CD155的方法。
本说明书中提及的所有出版物(包括专利、专利申请、科学文章和数据库)出于所有目的通过引用其全文并入本文，其程度如同具体地和单独地指出每个单独的出版物(包括专利、专利申请、科学文章或数据库)通过引用并入。如果本文所述的定义与通过引用并入本文的专利、申请、公开申请和其他出版物中阐述的定义相反或不一致，则本文所述的定义优先于通过引用并入本文的定义。
这里使用的章节标题仅用于组织目的，而不应解释为限制所描述的主题。
I定义
除非另外定义，否则本文使用的所有技术术语、符号和其他技术术语和科学术语或用词旨在具有与所要求保护的主题所属领域的普通技术人员通常所理解的相同意义。在一些情况下，为了清楚和/或为了便于引用而在本文中定义具有通常理解的含义的术语，并且本文中包含的这些定义不必被解释为代表与本领域通常所理解的意义有实质性差异。
除非在特定情况下另有限制，否则本说明书中使用的术语定义如下。如在本说明书和所附权利要求书中所用的，单数形式的“一个”、“一种”和“所述”包括复数指示物，除非上下文清楚地另外指明。除非另外定义，本文所用的全部技术术语和科学术语、缩略词和缩写具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同意义。除非另有说明，否则化学和生物化学名称的缩写和符号均为IUPAC-IUB命名法。除非另有说明，否则所有数值范围都包括定义该范围的值以及中间的所有整数值。
在免疫球蛋白超家族结构域的上下文中使用的术语“亲和力修饰的”意指具有改变的氨基酸序列(相对于相应的野生型亲本或未修饰的IgSF结构域)的哺乳动物免疫球蛋白超家族(IgSF)结构域，使得与亲本野生型或未修饰的(即，非亲和力修饰的)IgSF对照结构域相比，该哺乳动物免疫球蛋白超家族(IgSF)结构域具有对至少一个其同源结合配偶体(或者“反结构”)的增加或降低的结合亲和力或亲合力。在该上下文中包括亲和力修饰的CD155 IgSF结构域。在一些实施方案中，亲和力修饰的IgSF结构域可含有野生型或未修饰的IgSF结构域中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个或更多个氨基酸差异，如氨基酸取代。结合亲和力或亲合力的增加或降低可使用公知的结合测定法如流式细胞术来测定。Larsen等人，American Journalof Transplantation，第5卷：443-453(2005)。还参见，Linsley等人，Immunity，Vol.1：793-801(1994)。蛋白质与其一个或多个同源结合配偶体的结合亲和力或亲合力的增加是达到比野生型IgSF结构域对照的结合亲和力或亲合力高至少10％的值，并且在一些实施方案中，比野生型IgSF结构域对照值高至少20％、30％、40％、50％、100％、200％、300％、500％、1000％、5000％或10000％。蛋白质对其同源结合配偶体中的至少一个的结合亲和力或亲合力的降低是不大于对照的90％但不小于野生型IgSF结构域对照值的10％的值，并且在一些实施方案中，不大于野生型IgSF结构域对照值的80％、70％、60％、50％、40％、30％或20％但不小于野生型IgSF结构域对照值的10％。通过氨基酸残基的取代、添加或缺失，改变亲和力修饰的蛋白质的一级氨基酸序列。术语“亲和力修饰的IgSF结构域”不应解释为对产生亲和力修饰的IgSF结构域的任何特定起始组合物或方法施加任何条件。因此，本发明的亲和力修饰的IgSF结构域不限于野生型IgSF结构域，该野生型IgSF结构域随后通过任何特定的亲和力修饰过程转化为亲和力修饰的IgSF结构域。亲和力修饰的IgSF结构域多肽可以例如从野生型哺乳动物IgSF结构域序列信息开始产生，随后在计算机模拟中针对与其同源结合配偶体的结合进行建模，最后重组或化学合成以产生亲和力修饰的IgSF结构域组合物。但在一个替代例子中，亲和力修饰的IgSF结构域可以通过野生型IgSF结构域的定点诱变产生。因此，亲和力修饰的IgSF结构域表示产物，而不必是由任何给定方法产生的产物。可以使用多种技术，包括重组方法、化学合成或其组合。
本文所用的术语“同种异体的”意指从一种生物体中取出并随后输注或过继转移至相同物种的在遗传上不同的生物体中的细胞或组织。在本发明的一些实施方案中，该物种是鼠或人。
本文所用的术语“自体同源的”意指从后来输注或过继转移的相同生物体中取出的细胞或组织。可以通过例如重组DNA方法改变自体同源的细胞或组织，使得其与从生物体取出的天然细胞或天然组织不再在遗传上相同。例如，天然自体同源T细胞可以通过重组DNA技术进行遗传工程化，以成为表达跨膜免疫调节蛋白和/或嵌合抗原受体(CAR)的自体同源工程化细胞，该自体同源工程化细胞在一些情况下涉及将T细胞或TIL工程化(肿瘤浸润淋巴细胞)。然后将工程化细胞输注到患者中，该患者是从中分离天然T细胞的患者。在一些实施方案中，该生物体是人或鼠。
本文所用的术语“结合亲和力”和“结合亲合力”分别意指蛋白质在特定结合条件下对其反结构的特异性结合亲和力和特异性结合亲合力。在生物化学动力学中，亲合力是指单独非共价结合相互作用(如CD155与其反结构TIGIT、CD226和/或CD96)的多个亲和力的累积强度。因此，亲合力不同于亲和力，亲和力描述单个相互作用的强度。测定了含有亲和力修饰的CD155IgSF结构域的变体CD155与其反结构的结合亲和力相对于未修饰的CD155(如含有天然或野生型IgSF结构域如IgV结构域的未修饰的CD155)的结合亲和力的增加或降低。测定结合亲和力或亲合力的方法是本领域已知的。参见例如Larsen等人，AmericanJournal of Transplantation，第5卷：443-453(2005)。在一些实施方案中，本发明的变体CD155(即含有亲和力修饰的IgSF结构域CD155蛋白)以一定的结合亲和力特异性地结合至TIGIT、CD226和/或CD96(通过流式细胞术测量的)，该结合亲和力在结合测定中产生比野生型CD155对照至少大10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的平均荧光强度(MFI)值。
术语“生物半衰期”是指物质(如包含本发明的变体CD155的免疫调节多肽)丧失其药理学或生理学活性或浓度的一半所花费的时间。生物半衰期可受到物质的消除、排泄、降解(例如，酶促)或在身体的某些器官或组织中的吸收和浓缩的影响。在一些实施方案中，可以通过测定物质的血浆浓度达到其稳态水平的一半所花费的时间(“血浆半衰期”)来评估生物半衰期。可用于衍生化和增加本发明多肽的生物半衰期的缀合物是本领域已知的，并且该缀合物包括但不限于聚乙二醇(PEG)、羟乙基淀粉(HES)、XTEN(延伸的重组肽；参见，WO2013130683)、人血清白蛋白(HSA)、牛血清白蛋白(BSA)，脂质(酰化)和聚-Pro-Ala-Ser(PAS)、聚谷氨酸(谷氨酰胺化)。
本文所用的术语“嵌合抗原受体”或“CAR”是指在哺乳动物细胞上表达的人工(即人造)跨膜蛋白，其至少包含胞外域、跨膜和胞内域。任选地，CAR蛋白包括“间隔区”，其将胞外域与跨膜结构域共价连接。间隔区通常是经由肽键将胞外域与跨膜结构域连接的多肽。CAR通常在哺乳动物淋巴细胞上表达。在一些实施方案中，CAR在哺乳动物细胞上表达，如T细胞或肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)。在T细胞上表达的CAR在本文中称为“CAR T细胞”或“CAR-T”。在一些实施方案中，CAR-T是T辅助细胞、细胞毒性T细胞、天然杀伤T细胞、记忆T细胞、调节性T细胞或γδT细胞。当在临床上用于例如过继细胞转移时，具有对患者肿瘤的抗原结合特异性的CAR-T通常被工程化为在从患者获得的T细胞上表达。然后将表达CAR的工程化T细胞输注回患者体内。因此，CAR-T通常是自体同源CAR-T，但同种异体CAR-T也包括在本发明的范围内。CAR的胞外域包含抗原结合区，如抗体或其抗原结合片段(例如scFv)，其在生理条件下与靶抗原如肿瘤特异性抗原特异性结合。特异性结合后，生物化学系列事件(即，信号转导)导致CAR-T的免疫活性的调节。因此，例如，CAR-T的抗原结合区与其靶抗原的特异性结合可以导致T细胞活性的免疫活性的变化，如细胞毒性、增殖或细胞因子产生的变化所反映的。在一些实施方案中，通过参与天然哺乳动物T细胞中的信号转导的CD3-ζ链(“CD3-z”)实现CAR-T活化后的信号转导。CAR-T还可包含多个信号传导结构域，如CD28、41BB或OX40，以进一步调节T细胞的免疫调节应答。CD3-z包含称为基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)的保守基序，该保守基序参与T细胞受体信号转导。
当关于在体外测定中由本发明的两种或更多种变体CD155的存在诱导的细胞因子产生使用时，术语“共同地”或“共同的”意指总体细胞因子表达水平，而与由单个变体CD155诱导的细胞因子产生无关。在一些实施方案中，待测定的细胞因子是IFN-γ，例如在体外原代T细胞测定中的。
关于多肽，如关于变体CD155的IgSF结构域的术语“同源结合配偶体”(与“反结构”可互换使用)，是指引用的多肽在特异性结合条件下特异性结合的至少一种分子(通常是天然哺乳动物蛋白质)。在一些方面，含有亲和力修饰的IgSF结构域的变体CD155特异性地结合至相应的天然或野生型CD155的反结构，但以增加或减弱的亲和力特异性地结合。在特异性结合条件下识别并特异性地结合其同源受体的配体种类是该受体的反结构或同源结合配偶体的例子。“同源细胞表面结合配偶体”是在哺乳动物细胞表面上表达的同源结合配偶体。“细胞表面分子种类”是免疫突触(IS)的配体的同源结合配偶体，其在细胞(如哺乳动物细胞)上且由细胞表达，从而形成免疫突触。
如本文所用，“缀合物”、“缀合”或其语法变型是指通过本领域已知的任何接合或连接方法将两种或更多种化合物接合或连接在一起，从而导致另一种化合物的形成。它还可以指通过将两种或更多种化合物接合或连接在一起而产生的化合物。例如，直接或间接地与一个或多个化学部分或多肽连接的变体CD155多肽是示例性缀合物。这种缀合物包括融合蛋白、由化学缀合物产生的那些融合蛋白和通过任何其他方法产生的那些融合蛋白。
如本文所用的术语“竞争性结合”意指蛋白质能够特异性地结合至至少两个同源结合配偶体，但一个同源结合配偶体的该特异性结合抑制如阻止或妨碍同时结合第二同源结合配偶体。因此，在一些情况下，蛋白质不可能同时结合两个同源结合配偶体。通常，竞争性结合物含有用于特异性结合的相同或重叠的结合位点，但该结合位点不是所需的。在一些实施方案中，竞争性结合由于第二同源结合配偶体的特异性结合而引起蛋白质与其同源结合配偶体之一的特异性结合的可测量的抑制(部分或完全)。已知多种方法用于量化竞争性结合，如ELISA(酶联免疫吸附测定)测定。
本文所用的术语“保守氨基酸取代”意指氨基酸取代，其中氨基酸残基被具有相似化学性质(例如电荷或疏水性)的侧链R基团的另一氨基酸残基取代。具有相似化学性质的侧链的氨基酸基团的例子包括1)脂肪族侧链：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；2)脂肪族-羟基侧链：丝氨酸和苏氨酸；3)含酰胺的侧链：天冬酰胺和谷氨酰胺；4)芳香族侧链：苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；5)碱性侧链：赖氨酸、精氨酸和组氨酸；6)酸性侧链：天冬氨酸和谷氨酸；以及7)含硫侧链：半胱氨酸和甲硫氨酸。保守氨基酸取代基团是：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、谷氨酸-天冬氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。
关于蛋白质位置的术语“对应于”，如以下叙述：核苷酸或氨基酸位置“对应于”公开序列中的核苷酸或氨基酸位置，如序列表中所述，是指基于结构序列比对或使用标准比对算法(如GAP算法)在与公开序列比对时鉴定的核苷酸或氨基酸位置。例如，相应的残基可以通过如本文所述的结构比对方法将参照序列与SEQ ID NO：47(ECD结构域)所示或SEQ IDNO：58或155(IgV结构域)所示的野生型CD155的序列进行比对来确定。通过比对序列，本领域技术人员可以例如使用保守和相同的氨基酸残基作为指导来鉴定相应的残基。
本文所用的术语“降低”或“减弱”或“抑制”意指统计学上显著的量的降低。降低可以是至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。
术语“衍生物”或“衍生的”是指通过将蛋白质直接或间接地与组合物共价连接来修饰蛋白质，以在保持或增强其治疗益处的同时改变生物半衰期、生物利用度、免疫原性、溶解性、毒性、效力、功效等特征。本发明的免疫调节多肽的衍生物在本发明的范围内，并且可以通过例如糖基化、聚乙二醇化、脂化或Fc-融合来制备。
如本文所用，“结构域”(通常为三个或更多个，通常为5或7个或更多个氨基酸的序列，如10至200个氨基酸残基)是指分子如蛋白质或编码核酸的一部分，该部分在结构上和/或功能上与分子的其他部分不同并且是可识别的。例如，结构域包括多肽链的那些部分，该多肽链的那些部分可以在由一个或多个结构基序构成的蛋白质内形成独立折叠的结构和/或通过功能活性(如结合活性)识别。蛋白质可以具有一个或多于一个不同的结构域。例如，可以通过与相关家族成员的一级序列或结构的同源性(如与基序的同源性)来鉴定、定义或区分结构域。在另一个例子中，结构域可以通过其功能进行区分，如与生物分子(如同源结合配偶体)相互作用的能力。结构域可以独立地显示出生物学功能或活性，使得结构域可以独立地执行活性或与另一分子融合来执行活性，例如结合活性。结构域可以是氨基酸的线性序列或氨基酸的非线性序列。许多多肽含有多个结构域。这些结构域是已知的，并且可以由本领域技术人员鉴定。为了本文的示例，提供了定义，但应理解，通过名称识别特定结构域在本领域技术范围内。如果需要，可以使用适当的软件来鉴定结构域。
如本文所用的术语“胞外域”是指位于囊泡膜外的膜蛋白(如跨膜蛋白)的区域。胞外域通常包含特异性地结合至配体或细胞表面受体的结合结构域，如特异性地结合至配体或细胞表面受体的结合结构域。细胞跨膜蛋白的胞外域可替代地称为细胞外结构域。
术语“有效量”或“治疗有效量”是指本发明的治疗组合物(包括蛋白质组合物或细胞组合物)的量和/或浓度，当单独(即作为单一疗法)或与另外治疗剂组合离体(通过与来自患者的细胞接触)或在体内(通过向患者给药)给药时，该治疗组合物例如通过改善或消除该疾病的症状和/或病因产生统计学上疾病进展的显著降低。有效量可以是缓解、减轻或缓和与疾病或病症相关的至少一种症状或生物反应或效应，防止疾病或病症的进展，或改善患者的身体功能的量。在细胞疗法的情况下，有效量是通过过继细胞疗法向患者给予的有效剂量或细胞数。在一些实施方案中，患者是哺乳动物，例如非人灵长类动物或人类患者。
如本文所用的术语“胞内域”是指在延伸至由细胞表面膜限定的内部空间中的一些膜蛋白(如跨膜蛋白)中发现的区域。在哺乳动物细胞中，胞内域是膜蛋白的细胞质区域。在细胞中，胞内域与细胞内成分相互作用并且可以在信号转导中发挥作用，因此，在一些情况下，该胞内域可以是细胞内信号传导结构域。细胞跨膜蛋白的胞内域可替代地称为细胞质结构域，在一些情况下，其可以是细胞质信号传导结构域。
如本文中在增加哺乳动物淋巴细胞的免疫活性的上下文中使用的术语“增强的”或“增加的”意指增加淋巴细胞的一种或多种活性。增加的活性可以是增加细胞存活、细胞增殖、细胞因子产生或T细胞细胞毒性中的一种或多种，如增加统计学上显著的量。在一些实施方案中，提及增加的免疫活性意指增加干扰素γ(IFN-γ)产生，如增加统计学上显著的量。在一些实施方案中，可以在混合淋巴细胞反应(MLR)测定中评估免疫活性。进行MLR测定的方法是本领域已知的。Wang等人，Cancer Immunol Res.2014年9月：2(9)：846-56。评估淋巴细胞活性的其他方法是本领域已知的，包括本文所述的任何测定。在一些实施方案中，增强可以是与非零对照值相比至少10％、20％、30％、40％、50％、75％、100％、200％、300％、400％或500％的增加。
如本文所用的术语“工程化细胞”是指已通过人为干预(如通过重组DNA方法或病毒转导)进行遗传修饰的哺乳动物细胞。在一些实施方案中，细胞是免疫细胞，如淋巴细胞(例如T细胞、B细胞、NK细胞)或抗原呈递细胞(例如树突细胞)。该细胞可以是来自患者的原代细胞或可以是细胞系。在一些实施方案中，本发明的工程化细胞包含工程化为调节表达TIGIT、CD226和/或CD96的T细胞或表达PD-L1的APC的免疫活性的本发明的变体，TIGIT、CD226和/或CD96与变体CD155特异性地结合。在一些实施方案中，变体155是含有细胞外结构域或其部分的跨膜免疫调节蛋白(下文称为“TIP”)，该细胞外结构域或其部分含有与跨膜结构域(例如CD155跨膜结构域)以及任选细胞内信号传导结构域连接的IgV结构域。在一些情况下，TIP被格式化为含有异源细胞质信号传导结构域或胞内域的嵌合受体。在一些实施方案中，工程化细胞能够表达和分泌如本文所述的免疫调节蛋白。在提供的工程化细胞中，还有进一步含有工程化T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(CAR)的细胞。
如本文所用的术语“工程化T细胞”是指T细胞，如T辅助细胞、细胞毒性T细胞(或者，细胞毒性T淋巴细胞或CTL)、天然杀伤T细胞、调节性T细胞、记忆T细胞或γδT细胞，这些T细胞已经通过人为干预如通过重组DNA方法或病毒转导方法进行了遗传修饰。工程化T细胞包含本发明的变体CD80跨膜免疫调节蛋白(TIP)或分泌型免疫调节蛋白(SIP)，其在T细胞上表达并且被工程化为调节工程化T细胞自身或哺乳动物细胞的免疫活性，该哺乳动物细胞与在T细胞上表达的CD155特异性地结合。
术语“工程化T细胞受体”或“工程化TCR”是指被工程化为与主要组织相容性复合物(MHC)/肽靶抗原以所需的亲和力特异性地结合的T细胞受体(TCR)，其通常用于过继性免疫疗法，该主要组织相容性复合物(MHC)/肽靶抗原被选择、克隆和/或随后引入T细胞群中。与工程化TCR相反，CAR被工程化为以不依赖于MHC的方式结合靶抗原。
如本文所用的术语“在......上表达”用于指在细胞如哺乳动物细胞的表面上表达的蛋白质。因此，蛋白质被表达为膜蛋白。在一些实施方案中，表达的蛋白质是跨膜蛋白质。在一些实施方案中，蛋白质与小分子部分如药物或可检测标记缀合。在细胞表面上表达的蛋白质可包括细胞表面蛋白质，如在哺乳动物细胞上表达的细胞表面受体。
术语“半衰期延长部分”是指多肽融合物或化学缀合物的部分，与未与该部分缀合的蛋白质的半衰期相比，该部分延长了在哺乳动物血清中流通的蛋白质的半衰期。在一些实施方案中，半衰期延长大于或大于约1.2倍、1.5倍、2.0倍、3.0倍、4.0倍、5.0倍或6.0倍。在一些实施方案中，与不具有半衰期延长部分的蛋白质相比，在体内给药后半衰期延长超过6小时、超过12小时、超过24小时、超过48小时、超过72小时、超过96小时或超过1周。半衰期是指蛋白质丧失其浓度、量或活性的一半所需的时间。例如，可以通过使用ELISA测定或活性测定来确定半衰期。示例性的半衰期延长部分包括Fc结构域、多聚化结构域、聚乙二醇(PEG)、羟乙基淀粉(HES)、XTEN(延伸的重组肽；参见，WO2013130683)、人血清白蛋白(HSA)、牛血清白蛋白(BSA)、脂质(酰化)和聚-Pro-Ala-Ser(PAS)和聚谷氨酸(谷氨酰胺化)。
本文所用的术语“免疫突触”(“immunological synapse”或“immune synapse”)意指表达MHC I(主要组织相容性复合物)或MHC II的哺乳动物细胞(如抗原呈递细胞或肿瘤细胞)与哺乳动物淋巴细胞(如效应T细胞或自然杀伤(NK)细胞)之间的界面。
免疫球蛋白分子的Fc(可结晶片段)区域或结构域(也称为Fc多肽)主要对应于免疫球蛋白重链的恒定区，并且负责各种功能，包括一种或多种抗体的效应子功能。Fc结构域含有免疫球蛋白分子的铰链结构域的部分或全部以及CH2和CH3结构域。Fc结构域可以形成通过一个或多个二硫键接合的两条多肽链的二聚体。在一些实施方案中，Fc是变体Fc，其显示出降低(例如降低大于30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多)的活性以促进效应子功能。在一些实施方案中，除非参照特定的SEQ ID NO进行描述，否则提及Fc区域中的氨基酸取代是通过EU编号系统。EU编号是已知的，并且按照最新更新的IMGT ScientificChart(国际ImMunoGeneTics信息系统，http://www.imgt.org/IMGTScientificChart/Numbering/Hu_IGHGnber.html(创建：2001年5月17日，最后更新：2013年1月10日)和Kabat，E.A.等人Sequences of Proteins of Immunologicalinterest.第5版US Department of Health and Human Services，NIH公开号91-3242(1991))。
免疫球蛋白Fc融合物(“Fc-融合物”)，如免疫调节性Fc融合蛋白，是包含与免疫球蛋白的Fc区域可操作地连接的一种或多种多肽(或一种或多种小分子)的分子。Fc融合物可包含例如抗体的Fc区域(其促进效应子功能和药代动力学)和变体CD155多肽。免疫球蛋白Fc区域可以间接或直接地与一种或多种变体CD155多肽或小分子(融合配偶体)连接。各种接头是本领域已知的，并且可任选地用于将Fc与融合配偶体连接以产生Fc融合物。可以将相同种类的Fc融合物二聚化以形成Fc融合同型二聚体，或使用不同种类形成Fc融合异二聚体。在一些实施方案中，Fc是哺乳动物Fc，如鼠或人Fc。
术语“宿主细胞”是指可用于表达由重组表达载体编码的蛋白质的细胞。宿主细胞可以是原核生物，例如大肠杆菌，或者它可以是真核生物，例如，单细胞真核生物(例如，酵母或其他真菌)、植物细胞(例如，烟草或番茄植物细胞)、动物细胞(例如，人细胞、猴细胞、仓鼠细胞、大鼠细胞、小鼠细胞或昆虫细胞)或杂交瘤。宿主细胞的例子包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或其衍生物如在无血清培养基中生长的Veggie CHO和相关细胞系或缺乏DHFR的CHO菌株DX-B11。另一个实例是人内皮肾293细胞或其衍生物。在一些实施方案中，宿主细胞是哺乳动物细胞(例如，人细胞、猴细胞、仓鼠细胞、大鼠细胞、小鼠细胞或昆虫细胞)。
本文所用的术语“免疫球蛋白”(缩写为“Ig”)是指哺乳动物免疫球蛋白，包括五种人类抗体中的任何一种：IgA(其包括IgA1和IgA2子类)、IgD、IgE、IgG(其包括子类IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)和IgM。该术语还包括小于全长的免疫球蛋白，无论是完全或部分合成(例如，重组或化学合成)还是天然产生的，如抗原结合片段(Fab)、含有VH和VL的可变片段(Fv)、含有连接在一条链中的VH和VL的单链可变片段(scFv)，以及其他抗体V区域片段，如Fab′、F(ab)2、F(ab′)2、dsFv双抗体、Fc和Fd多肽片段。特异性抗体(同双特异性和异双特异性)包括在该术语的含义内。
本文所用的术语“免疫球蛋白超家族”或“IgSF”意指参与细胞的识别、结合或粘附过程的细胞表面和可溶性蛋白质的组。基于与免疫球蛋白(即抗体)共有的结构特征，分子被归类为该超家族的成员；它们都具有称为免疫球蛋白结构域或折叠的结构域。IgSF的成员包括免疫系统的细胞表面抗原受体、共受体和共刺激分子、参与将抗原呈递给淋巴细胞的分子、细胞粘附分子、某些细胞因子受体和细胞内肌肉蛋白。它们通常与免疫系统中的作用相关。免疫突触中的蛋白质通常是IgSF的成员。IgSF也可以基于共有特性如功能被分类为“亚家族”。这些亚家族通常由4至30个IgSF成员组成。
本文所用的术语“IgSF结构域”或“免疫球蛋白结构域”或“Ig结构域”是指IgSF蛋白的结构域。Ig结构域以免疫球蛋白分子命名。它们含有约70-110个氨基酸，并根据其大小和功能进行分类。Ig结构域具有特征性Ig-折叠，其具有由两条反平行β链形成的夹心样结构。夹心内侧的疏水性氨基酸与B链和F链中半胱氨酸残基之间形成的高度保守的二硫键之间的相互作用稳定了Ig-折叠。Ig结构域的一端具有称为互补决定区的区段，其对于抗体对其配体的特异性是重要的。Ig类结构域可以归类(分类)为：IgV、IgC(其可为IgC1或IgC2)或IgI。大多数Ig结构域是可变的(IgV)或恒定的(IgC)。具有9个β链的IgV结构域通常比具有7个β链的IgC结构域长。IgSF的一些成员的Ig结构域类似于氨基酸序列中的IgV结构域，但其大小与IgC结构域相似。这些称为IgC2结构域，而标准IgC结构域称为IgC1结构域。T细胞受体(TCR)链在细胞外部分含有两个Ig结构域；在N-末端的一个IgV结构域和与细胞膜临近的一个IgC1结构域。CD155含有三个Ig结构域：IgV和2个IgC结构域，所述2个IgC结构域是IgC2结构域。
本文所用的术语“IgSF种类”意指具有相同或基本相同的一级氨基酸序列的IgSF成员蛋白质的集合。每个哺乳动物免疫球蛋白超家族(IgSF)成员定义了属于该IgSF成员的所有IgSF种类的独特身份。因此，每个IgSF家族成员独特于其他IgSF家族成员，因此，特定IgSF家族成员的每个种类独特于另一个IgSF家族成员的种类。然而，由于翻译后修饰(如糖基化、磷酸化、泛素化、亚硝基化、甲基化、乙酰化和脂化)的差异，可能发生具有相同IgSF种类的分子之间的变异。另外，由于基因多态性导致的单个IgSF种类内的微小序列差异构成单个IgSF种类内的另一种变异形式，如由于例如蛋白水解裂解导致的野生型截短形式的IgSF种类。“细胞表面IgSF种类”是在细胞(通常是哺乳动物细胞)的表面上表达的IgSF种类。
本文在哺乳动物淋巴细胞如T细胞的上下文中使用的术语“免疫活性”是指一种或多种细胞存活、细胞增殖、细胞因子产生(例如干扰素-γ)或T细胞细胞毒性活性。在一些情况下，免疫活性可意指细胞因子如趋化因子或白细胞介素的细胞表达。用于确定增强或抑制免疫活性的测定包括测量培养上清液中干扰素-γ细胞因子水平的MLR(混合淋巴细胞反应)测定(Wang等人，Cancer Immunol Res.2014年9月：2(9)：846-56)、SEB(葡萄球菌肠毒素B)T细胞刺激测定(Wang等人，Cancer Immunol Res.2014年9月：2(9)：846-56)和抗CD3T细胞刺激测定(Li和Kurlander，J Transl Med.2010：8：104)。由于T细胞活化与IFN-γ细胞因子的分泌有关，因此可以使用商业ELISA试剂盒通过这些体外人T细胞测定来检测培养上清液中的IFN-γ水平(Wu等人，Immunol Lett 2008年4月15日；117(1)：57-62)。免疫应答的诱导导致免疫活性相对于静止淋巴细胞增加。如本文提供的免发疫调节蛋白，如含有亲和力修饰的IgSF结构域的变体CD155多肽在一些实施方案中可以在原代T细胞测定中相对于野生型IgSF成员或IgSF结构域对照增加，或者在替代实施方案中减少IFN-γ(干扰素-γ)表达。本领域技术人员将认识到，用于确定IFN-γ表达增加的原代T细胞测定的形式可以不同于用于测定IFN-γ表达减少的形式。在测定本发明的免疫调节蛋白或亲和力修饰的IgSF结构域在原代T细胞测定中改变IFN-γ表达的能力时，可以使用混合淋巴细胞反应(MLR)测定。方便地，在一些情况下，本发明的可溶形式的亲和力修饰的IgSF结构域可用于测定其增加或减少MLR中IFN-γ表达的能力。或者，可以使用共固定化测定。在共固定化测定中，在一些实施方案中通过抗CD3抗体提供的T细胞受体信号与共固定化亲和力修饰的IgSF结构域(如变体CD155)联合使用，以测定相对于野生型IgSF结构域对照增加或减少IFN-γ表达的能力。测定工程化细胞的免疫活性的方法，包括评估变体CD155跨膜免疫调节蛋白的活性的方法，是本领域已知的，并且该活性包括但不限于在抗原刺激后扩增T细胞的能力，在没有再刺激的情况下维持T细胞扩增的能力，以及在适当的动物模型中维持抗癌活性的能力。测定还包括评估细胞毒性的测定，包括标准51Cr释放测定(参见例如Milone等人，(2009)Molecular Therapy 17：1453-1464)，或基于流动的细胞毒性测定，或基于阻抗的细胞毒性测定(Peper等人(2014)Journal of Immunological Methods，405：192-198)。
“免疫调节多肽”或“免疫调节蛋白”是调节免疫活性的多肽或蛋白分子。“调节”(“modulation”或“modulating”)免疫应答是指增加或降低免疫活性。免疫调节蛋白可以是单个多肽链或具有通过例如链间二硫键彼此共价键合的至少两个多肽链的多聚体(二聚体或更高级多聚体)。因此，单体、二聚体和更高级多聚体多肽在所定义的术语范围内。多聚体多肽可以是同型多聚体(相同多肽链)或异多聚体(非相同多肽链)。本发明的免疫调节蛋白包含变体CD155。
本文所用的术语“增加”意指增加统计学上显著的量。增加可以是比非零对照值大至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、75％、100％或更大。
CD155的“同种型”是氨基酸序列不同的多种天然存在的CD155多肽之一。同种型可以是由单个基因表达的RNA转录物的剪接变体的产物，或高度相似但不同的基因的表达产物，从而产生功能相似的蛋白质，如可以从基因复制中产生。如本文所用，术语CD155的“同种型”也指CD155基因的不同等位基因的产物。
本文所用的术语“淋巴细胞”意指哺乳动物免疫系统中白细胞的三种亚型中的任何一种。它们包括天然杀伤细胞(NK细胞)(其在细胞介导的细胞毒性先天免疫中起作用)、T细胞(用于细胞介导的细胞毒性适应性免疫)和B细胞(用于体液、抗体驱动的适应性免疫)。T细胞包括：T辅助细胞、细胞毒性T细胞、自然杀伤T细胞、记忆T细胞、调节性T细胞或γδT细胞。先天淋巴细胞(ILC)也包括在淋巴细胞的定义中。
术语“哺乳动物”或“患者”具体包括提及以下内容中的至少一种：人、黑猩猩、恒河猴、食蟹猴、狗、猫、小鼠或大鼠。
如本文所用的术语“膜蛋白”意指在生理条件下直接或间接地附接于脂质双层的蛋白质。形成膜的脂质双层可以是生物膜，如真核(例如哺乳动物)细胞膜或人工(即人造)膜，如在脂质体上发现的膜。膜蛋白附接于脂质双层可以通过共价附接，或通过非共价相互作用，如疏水或静电相互作用。膜蛋白可以是完整的膜蛋白或外周膜蛋白。膜蛋白(外周膜蛋白)非共价附接于脂质双层或非共价附接于整合膜蛋白。外周膜蛋白形成与脂质双层的临时附接，使得在哺乳动物生理条件的范围内，外周膜蛋白可以与脂质双层缔合和/或解离。与外周膜蛋白相反，整合膜蛋白形成与膜脂质双层基本永久性附接，使得在哺乳动物生理条件的范围内，整合膜蛋白不从它们与脂质双层的附接中解离。膜蛋白可通过脂质双层的一层形成与膜的附接(单面)，或通过膜的两层附接(多面)。与仅一个脂质双层相互作用的完整膜蛋白是“整合的单面蛋白”。与脂质双层的两层相互作用的完整膜蛋白是“整合的多面蛋白”，其在本文中可替代地称为“跨膜蛋白”。
本文在免疫应答(如哺乳动物免疫应答)的上下文中使用的术语“调节”(“modulating”或“modulate”)是指由于给予包含本发明的变体CD155的免疫调节多肽或由于给予表达免疫调节蛋白(如本发明的变体CD155跨膜免疫调节蛋白)的工程化细胞而发生的现有或潜在的免疫应答的任何改变，如增加或减少。因此，它指的是与在不给予包含变体CD155的免疫调节蛋白或表达此类免疫调节多肽的细胞的情况下发生或存在的免疫应答相比，免疫应答的改变，如增加或减少。这种调节包括免疫细胞免疫活性的程度或范围的任何诱导、激活、抑制或改变。免疫细胞包括B细胞、T细胞、NK(自然杀伤)细胞、NK T细胞、专业抗原呈递细胞(APC)和非专业抗原呈递细胞，以及炎性细胞(中性粒细胞、巨噬细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞)。调节包括对现有免疫应答、发展中的免疫应答、潜在免疫施加的任何改变，或对诱导、调节、影响或响应免疫应答的能力施加的任何改变。调节包括作为免疫应答的一部分的免疫细胞中基因、蛋白质和/或其他分子的表达和/或功能的任何改变。免疫应答的调节或免疫活性的调节包括例如以下内容：免疫细胞的消除、缺失或隔离；可调节其他细胞如自身反应性淋巴细胞、抗原呈递细胞或炎性细胞的功能能力的免疫细胞的诱导或生成；在免疫细胞中诱导无反应状态(即无反应性)；增强或抑制免疫细胞的活性或功能，包括但不限于改变由这些细胞表达的蛋白质的模式。例子包括某些类别的分子如细胞因子、趋化因子、生长因子、转录因子、激酶、共刺激分子或其他细胞表面受体的改变的产生和/或分泌，或这些调节事件的任何组合。可以例如通过相对于原代T细胞测定中的野生型CD155对照的IFN-γ(干扰素γ)表达的改变来评估调节(参见，Zhao和Ji，ExpCell Res.2016 Jan1；340(1)132-138)。例如，可以通过工程化细胞的免疫活性的改变来评估调节，如相对于用野生型CD155跨膜蛋白工程化的细胞，工程化细胞的细胞毒性活性的改变或工程化细胞的细胞因子分泌的改变。
本文所用的术语“分子种类”意指具有相同或基本相同的一级氨基酸序列的蛋白质的集合。每个哺乳动物免疫球蛋白超家族(IgSF)成员定义了相同或基本相同的分子种类的集合。因此，例如，人CD155是IgSF成员，并且每个人CD155分子是分子种类CD155。由于翻译后修饰(如糖基化、磷酸化、泛素化、亚硝基化、甲基化、乙酰化和脂化)的差异，可能发生具有相同分子种类的分子之间的变异。另外，由于基因多态性导致的单个分子种类内的微小序列差异构成单个分子种类内的另一种变异形式，如由于例如蛋白水解裂解导致的野生型截短形式的单个分子种类。“细胞表面分子种类”是在哺乳动物细胞表面上表达的分子种类。两种或更多种不同种类的蛋白质据称彼此呈“顺式”或“顺式构型”，其中每种蛋白质仅存在于形成IS的两种哺乳动物细胞的一种或仅另一种(但不是两种)。两种不同种类的蛋白质据称彼此呈“反式”或“反式构型”，其中第一种仅存在于形成IS的两种哺乳动物细胞之一，第二种仅存在于形成IS的两种哺乳动物细胞中的第二种。在形成IS的两种哺乳动物细胞上存在的两种不同种类的蛋白质在这些细胞上呈顺式和反式构型。
术语“多聚化结构域”是指促进多肽分子与一种或多种另外的多肽分子的稳定相互作用的氨基酸序列，每个多肽分子含有互补的多聚化结构域(例如第一多聚化结构域和第二多聚化结构域)，这些多聚化结构域可以是相同或不同的多聚化结构域。互补的多聚化结构域之间的相互作用，例如第一多聚化结构域和第二多聚化结构域之间的相互作用，形成稳定的蛋白-蛋白相互作用，以产生具有额外的多肽分子的多肽分子多聚体。在一些情况下，多聚化结构域是相同的，并且与其本身相互作用，以在两条多肽链之间形成稳定的蛋白-蛋白相互作用。通常，多肽直接或间接地与多聚化结构域接合。示例性的多聚化结构域包括免疫球蛋白序列或其部分、亮氨酸拉链、疏水区、亲水区和相容的蛋白质间相互作用结构域。例如，多聚化结构域可以是免疫球蛋白恒定区或结构域，例如来自IgG的Fc结构域或其部分，包括IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚型、IgA、IgE、IgD和IgM及其修饰的形式。
术语“核酸”和“多核苷酸”可互换使用，是指单链或双链形式的核酸残基(例如，脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)的聚合物。除非特别限定，否则该术语包括含有天然核苷酸的已知类似物且具有与其相似的结合特性，并且以类似于天然存在的核苷酸的方式代谢的核酸。除非另有说明，否则特定核酸序列还隐含地包括其保守修饰的变体(例如简并密码子取代)和互补核苷酸序列以及明确指出的序列(“参照序列”)。具体地，简并密码子取代可以通过生成序列来实现，其中一个或多个选择(或所有)的密码子的第三位置被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代。术语核酸或多核苷酸包括由基因编码的cDNA或mRNA。
本文所用的术语“非竞争性结合”是指一个蛋白质与至少两个同源结合配偶体同时特异性地结合的能力。因此，该蛋白质能够同时与至少两个不同的同源结合配偶体结合，但结合相互作用不需要相同的持续时间，使得在一些情况下，蛋白质仅与同源结合配偶体中的一个特异性地结合。在一些实施方案中，结合在特定结合条件下发生。在一些实施方案中，同时结合使得一个同源结合配偶体的结合基本上不抑制与第二同源结合配偶体的同时结合。在一些实施方案中，非竞争性结合意指将第二同源结合配偶体与其在蛋白质上的结合位点结合不会取代第一同源结合配偶体与其在蛋白质上的结合位点的结合。评估非竞争性结合的方法是本领域公知的，如Perez de La Lastra等人，Immunology，1999年4月：96(4)：663-670中描述的方法。在一些情况下，在非竞争性相互作用中，第一同源结合配偶体在不与第二同源结合配偶体的相互作用位点重叠的相互作用位点处特异性地结合，使得第二同源结合配偶体的结合不直接干扰第一同源结合配偶体的结合。因此，第二同源结合配偶体的结合对同源结合配偶体的结合的任何影响是通过直接干扰第一同源结合配偶体的结合以外的机制。例如，在酶-底物相互作用的情况下，非竞争性抑制剂与酶的活性位点以外的位点结合。非竞争性结合包括非竞争性结合相互作用，其中第二同源结合配偶体在相互作用位点特异性结合，该相互作用位点不与第一同源结合配偶体的结合重叠，但仅在第一相互作用位点被第一同源结合配偶体占据时与第二相互作用位点结合。
术语“药物组合物”是指适用于哺乳动物受试者(通常是人)的药物用途的组合物。药物组合物通常包含有效量的活性剂(例如，包含变体CD155的免疫调节多肽或表达变体CD155跨膜免疫调节蛋白的工程化细胞)和载体、赋形剂或稀释剂。载体、赋形剂或稀释剂通常分别是药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。
术语“多肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，并且是指通过肽键连接的两个或更多个氨基酸的分子链。这些术语不是指产品的特定长度。因此，“肽”和“寡肽”包括在多肽的定义内。该术语包括多肽的翻译后修饰，例如糖基化、乙酰化、磷酸化等。该术语还包括分子，其中可以包含一种或多种氨基酸类似物或非经典或非天然氨基酸，其可以合成或使用已知蛋白质工程化技术重组表达。此外，蛋白质可以衍生化。
本文所用的术语“原代T细胞测定”是指用于测量干扰素-γ(“IFN-γ”)表达的体外测定。各种这样的原代T细胞测定是本领域已知的。在优选的实施方案中，使用的测定是抗CD3共同固定化测定。在该测定中，通过采用或不采用另外的重组蛋白固定的抗CD3刺激原代T细胞。在通常24-72小时的时间点处收获培养上清液。在另一个实施方案中，使用的测定是MLR。在该测定中，用同种异体APC刺激原代T细胞。在通常24-72小时的时间点处收获培养上清液。通过标准ELISA技术测量培养上清液中的人IFN-γ水平。商业试剂盒可从供应商处获得，并且根据制造商的推荐进行测定。
应用于核酸(如编码本发明的免疫调节蛋白的核酸)的术语“纯化的”通常表示基本上不含通过本领域公知的分析技术测定的其他组分的核酸或多肽(例如，纯化的多肽或多核苷酸在电泳凝胶、色谱洗脱液和/或经过密度梯度离心的介质中形成离散的条带)。例如，在电泳凝胶中基本上产生一个条带的核酸或多肽是“纯化的”。本发明的纯化的核酸或蛋白质纯度为至少约50％纯，通常至少约75％、80％、85％、90％、95％、96％、99％或更高的纯度(例如，重量或摩尔百分比)。
术语“重组”表示已通过人为干预进行人工(即非天然)改变的材料(例如，核酸或多肽)。可以对在其自然环境或状态内的材料进行改变或从其自然环境或状态取出的材料进行改变。例如，“重组核酸”通过例如在克隆、亲和力修饰、DNA改组或其他公知的分子生物学过程中重组核酸来制备。“重组DNA分子”由通过这种分子生物学技术接合在一起的DNA区段组成。如本文所用的术语“重组蛋白”或“重组多肽”是指使用重组DNA分子表达的蛋白质分子。“重组宿主细胞”是含有和/或表达重组核酸或通过基因工程化改变的细胞，如通过向细胞中引入编码重组蛋白(如本文提供的跨膜免疫调节蛋白)的核酸分子。真核生物中的转录控制信号包含“启动子”和“增强子”元件。启动子和增强子由DNA序列的短阵列组成，这些DNA序列与参与转录的细胞蛋白特异性相互作用。已经从多种真核来源分离了启动子和增强子元件，该真核来源包括酵母、昆虫和哺乳动物细胞和病毒中的基因(类似的控制元件，即启动子，也见于原核生物中)。特定启动子和增强子的选择取决于用于表达感兴趣的蛋白质的细胞类型。本文所用的术语“可操作组合”、“可操作顺序”和“可操作地连接”是指核酸序列以产生能够指导给定基因的转录和/或所需蛋白质分子的合成的核酸分子的方式或方向连接核酸序列。
如本文所用的术语“重组表达载体”是指DNA分子，其含有所需编码序列和在特定宿主细胞中表达可操作地连接的编码序列所必需的合适核酸序列。在原核生物中表达所必需的核酸序列包括启动子、任选操纵子序列、核糖体结合位点和可能的其他序列。已知真核细胞利用启动子、增强子以及终止和多腺苷酸化信号。分泌信号肽序列还可以任选地由重组表达载体编码，该重组表达载体与重组蛋白如重组融合蛋白的编码序列可操作地连接，使得表达的融合蛋白可以由重组宿主细胞分泌，以更容易地从细胞中分离融合蛋白(如果需要的话)。该术语包括作为自我复制核酸结构的载体以及掺入已引入了其的宿主细胞的基因组中的载体。在该载体中有病毒载体，如慢病毒载体。
术语“选择性”是指与另一种底物如主题蛋白质的不同的同源结合配偶体的特异性结合相比，主题蛋白质或多肽对于一种底物如一种同源结合配偶体的特异性结合的倾向。选择性可以反映为主题蛋白质和第一底物如第一同源结合配偶体(例如Kd1)的结合活性(例如结合亲和力)与相同主题蛋白质和第二同源结合配偶体(例如，Kd2)的结合活性(例如结合亲和力)的比。
如本文所用的术语“序列一致性”分别指核苷酸或氨基酸水平上的基因或蛋白质之间的序列一致性。“序列一致性”是氨基酸水平上的蛋白质之间的一致性的量度和核苷酸水平上的核酸之间的一致性的量度。当序列比对时，可以通过比较每个序列中给定位置的氨基酸序列来确定蛋白质序列一致性。类似地，当序列比对时，可以通过比较每个序列中给定位置的核苷酸序列来确定核酸序列一致性。用于比较的序列比对的方法是本领域公知的，这样的方法包括GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA。BLAST算法计算序列一致性百分比并对两个序列之间的相似性进行统计分析。用于进行BLAST分析的软件可通过国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)网站公开获得。
本文所用的关于蛋白质的术语“可溶的”意指蛋白质不是膜蛋白。通常，可溶性蛋白质仅含有IgSF家族成员受体的细胞外结构域或其一部分，但不含有跨膜结构域，该部分含有一个或多个IgSF结构域或其特异性结合片段。在一些情况下，蛋白质的溶解性可以通过直接或间接地经由接头与Fc结构域连接或附接来改善，在一些情况下，Fc结构域也可以改善蛋白质的稳定性和/或半衰期。在一些方面，可溶性蛋白质是Fc融合蛋白。
本文所用的关于多肽或核酸的术语“种类”意指具有相同或基本相同的序列的分子的集合。由于翻译后修饰(如糖基化、磷酸化、泛素化、亚硝基化、甲基化、乙酰化和脂化)的差异，可能发生具有相同种类的多肽之间的变异。在氨基末端或羧基末端与全长种类相差(或编码相差)不超过1、2或3个氨基酸残基的略微截短的多肽序列被认为是单一种类。这种微观异质性是制造蛋白质的共同特征。
本文所用的关于全长野生型哺乳动物CD155多肽或其IgV或IgC(例如IgC2)结构域的术语“特异性结合片段”意指具有全长多肽或IgV和/或IgC结构域的子序列，并且在体外和/或体内与哺乳动物TIGIT、哺乳动物CD226和/或哺乳动物CD96(如人或鼠TIGIT、CD226或CD96)特异性结合的多肽。在一些实施方案中，特异性结合片段包含CD155 IgV、CD155 IgC2子序列，其为全长野生型序列或其IgV或IgC(例如IgC2)序列的序列长度的至少60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。可以依次改变特异性结合片段以形成本发明的变体CD155。
本文所用的术语“特异性结合”意指蛋白质在特定结合条件下与靶蛋白结合的能力，使得其亲和力或亲合力是相同蛋白质对于足够统计尺寸的一系列随机肽或多肽的平均亲和力或亲合力的5倍，但任选至少10、20、30、40、50、100、250或500倍或甚至至少1000倍。特异性结合蛋白不需要专一地与单个靶分子结合，但由于靶标与非靶标(例如，旁系同源物或直系同源物)之间的结构构象的相似性，可以特异性结合非靶分子。本领域技术人员将认识到，与在不同动物物种中具有相同功能的分子(即直系同源物)特异性结合或与具有与靶分子基本相似的表位的非靶分子(例如，旁系同源物)的特异性结合是可能的，并且不会降低相对于统计学上有效的一系列独特非靶标(例如随机多肽)确定的结合特异性。由于交叉反应性，因此本发明的多肽可以与多于一种的不同种类的靶分子特异性结合。固相ELISA免疫测定、ForteBio Octet或Biacore测量可用于确定两种蛋白质之间的特异性结合。通常，两种结合蛋白之间的相互作用具有小于1×10-5M的解离常数(Kd)，并且通常低至1×10-12M。在本公开的某些实施方案中，两种结合蛋白之间的相互作用具有小于或小于约1x10-6M、1x10-7M、1x10-8M、1x10-9M、1x10-10M或1x10-11M或更小的解离常数。
关于表达多肽的哺乳动物细胞的术语“表面表达”(“surface expresses”或“surface expression”)意指多肽表达为膜蛋白。在一些实施方案中，膜蛋白是跨膜蛋白。
如本文所用，关于合成核酸分子或合成基因或合成肽的“合成的”是指通过重组方法和/或通过化学合成方法产生的核酸分子或多肽分子。
如本文所用的术语“靶向部分”是指共价或非共价附接于本发明的包含变体CD155的多肽的组合物，或物理上包封包含本发明的变体CD155的多肽组合物。靶向部分对所需的反结构(如细胞表面受体(例如B7家族成员PD-L1)或肿瘤抗原如肿瘤特异性抗原(TSA)或肿瘤相关抗原(TAA)如B7-H6)具有特异性结合亲和力。通常，所需的反结构位于特定组织或细胞类型上。靶向部分包括：抗体、抗原结合片段(Fab)、含有VH和VL的可变片段(Fv)、含有连接在一条链中的VH和VL的单链可变片段(scFv)，以及其他抗体V区域片段，如Fab′、F(ab)2、F(ab′)2、dsFv双抗体、纳米抗体、可溶性受体、受体配体、亲和力成熟受体或配体以及小分子(＜500道尔顿)组合物(例如，特异性结合受体组合物)。靶向部分也可以共价或非共价附接于包封本发明多肽的脂质体的脂质膜。
本文所用的术语“跨膜蛋白”是指基本上或完全跨越脂质双层的膜蛋白，如在生物膜如哺乳动物细胞中或在人工构建体如脂质体中发现的那些脂质双层。跨膜蛋白包含跨膜结构域(“跨膜结构域”)，该跨膜蛋白通过跨膜结构域整合至脂质双层中，并且通过该跨膜结构域的整合在生理条件下是热力学稳定的。跨膜结构域通常可以通过其氨基酸序列经由任何数量的可商购生物信息学软件应用基于其相对于与水性环境(例如胞质溶胶、细胞外液)相互作用的蛋白质区域提高的疏水性来预测。跨膜结构域通常是跨越膜的疏水性α螺旋。跨膜蛋白可以一次或多次穿过脂质双层的两层。跨膜蛋白包括本文所述的所提供的跨膜免疫调节蛋白。除跨膜结构域外，本发明的跨膜免疫调节蛋白还包含胞外域，并且在一些实施方案中，还包含胞内域。
本文所用的术语“治疗”(“treating”、“treatment”或“therapy”)意指通过单独给予本发明的治疗组合物(例如含有免疫调节蛋白或工程化细胞)或与本文所述的另一种化合物组合给予来减缓、停止或逆转疾病或病症进展，如通过临床或诊断症状的减少、中止或消除所证明的。“治疗”(“treating”、“treatment”或“therapy”)还意指急性或慢性疾病或病症中症状的严重性降低，或例如在复发或缓解自身免疫疾病病程的情况下复发率的降低，或在自身免疫疾病的炎性方面的情况下炎症的减少。如本文在癌症的上下文中所使用的，术语“治疗”或“抑制”(“inhibit”、“inhibiting”或“inhibition”)癌症是指以下内容中的至少一种：肿瘤生长速率的统计上显著的降低、肿瘤停止生长或肿瘤的大小、质量、代谢活动或体积的减少，如通过标准(例如但不限于实体肿瘤的反应评估标准(RECIST)，无进展生存期的统计上显著的增加(PFS)或总生存期(OS))测量。在本发明的上下文中使用的疾病或病症的“预防”(“Preventing”、“prophylaxis”或“prevention”)是指单独给予本发明的免疫调节多肽或工程化细胞或与另一种化合物组合给予，以预防疾病或病症或者疾病或病症的部分或全部症状的发生或发作，或者降低疾病或病症发作的可能性。
如本文所用的术语“肿瘤特异性抗原”或“TSA”是指主要存在于哺乳动物受试者的肿瘤细胞上但通常在哺乳动物受试者的正常细胞上未发现的反结构。肿瘤特异性抗原不必是肿瘤细胞所独有的，但具有肿瘤特异性抗原的特定哺乳动物细胞的百分比足够高或肿瘤表面上肿瘤特异性抗原的水平足够高，以使其可以被抗肿瘤治疗剂如本发明的免疫调节多肽靶向，并且可以预防或治疗哺乳动物免受肿瘤的影响。在一些实施方案中，在来自具有肿瘤的哺乳动物的细胞的随机统计样品中，显示TSA的至少50％的细胞是癌性的。在其他实施方案中，显示TSA的至少60％、70％、80％、85％、90％、95％或99％的细胞是癌性的。
关于变体CD155所用的术语“变体”(也称为“修饰的”或“突变的”)意指CD155，如通过人为干预产生的哺乳动物(例如人或鼠)CD155。变体CD155是相对于未修饰或野生型CD155具有改变的氨基酸序列的多肽。变体CD155是通过一个或多个氨基酸取代、缺失、添加或其组合而不同于野生型CD155同种型序列的多肽。为了本文的目的，变体CD155含有至少一个亲和力修饰的结构域，其中一个或多个氨基酸差异发生在IgSF结构域(例如IgV结构域)中。变体CD155可含有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个或更多个氨基酸差异，如氨基酸取代。变体CD155多肽通常显示出与相应的野生型或未修饰的CD155(如与SEQ ID NO：20的序列、其成熟序列(缺少信号序列)或其部分，该部分含有其细胞外结构域或IgSF结构域)至少50％、60％、70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列一致性。在一些实施方案中，变体CD155多肽显示出与包含SEQ ID NO：47或SEQID NO：58或155所示的序列的相应的野生型或未修饰的CD155至少50％、60％、70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列一致性。非天然存在的氨基酸以及天然存在的氨基酸包括在允许的取代或添加的范围内。变体CD155不限于任何特定的制备方法，并且包括例如从头化学合成、从头重组DNA技术或其组合。本发明的变体CD155特异性地结合至哺乳动物物种的TIGIT、CD226或CD96中的至少一种或多种。在一些实施方案中，与野生型或未修饰的CD155蛋白相比，改变的氨基酸序列导致对TIGIT、CD226和/或CD96A-4的结合亲和力或亲合力改变(即，增加或降低)。结合亲和力或亲合力的增加或降低可使用公知的结合测定法如流式细胞术来测定。Larsen等人，American Journal of Transplantation，第5卷：443-453(2005)。还参见，Linsley等人，Immunity，Vol.1(9)：793-801(1994)。变体CD155对TIGIT、CD226和/或CD96的结合亲和力或亲合力的增加是比野生型的未修饰或CD155的结合亲和力或亲合力大至少5％的值，并且在一些实施方案中，比野生型或未修饰的CD155对照值的结合亲和力或亲合力大至少10％、15％、20％、30％、40％、50％、100％。CD155对TIGIT、CD226和/或CD96的结合亲和力或亲合力的降低是不大于野生型或未修饰的对照值的95％的值，并且在一些实施方案中，不大于野生型或未修饰的对照值的80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％、5％或不可检测的结合亲和力或亲合力。通过氨基酸残基的取代、添加或缺失，改变变体CD155的一级氨基酸序列。在变体CD155的上下文中的术语“变体”不应解释为对产生变体CD155的任何特定起始组合物或方法施加任何条件。例如，变体CD155可以从野生型哺乳动物CD155序列信息开始产生，随后在计算机模拟中针对与TIGIT、CD226和/或CD96的结合进行建模，最后重组或化学合成以产生本发明的变体CD155。但在一个替代例子中，变体CD155可以通过野生型CD155的定点诱变产生。因此，变体CD155表示组合物，并且不必是由任何给定方法产生的产物。可以使用多种技术，包括重组方法、化学合成或其组合。
本文所用的关于生物材料(如核酸分子、蛋白质(例如，CD155)、IgSF成员、宿主细胞等)使用的术语“野生型”或“天然的”(“natural”或“native”)是指那些生物材料。
II变体CD155多肽
本文提供了对一种或多种CD155同源结合配偶体显示出改变的(增加或降低的)结合活性或亲和力的变体CD155多肽。在一些实施方案中，CD155同源结合配偶体是TIGIT、CD226或CD96。在一些实施方案中，CD155同源结合配偶体是TIGIT或CD226。在一些实施方案中，相对于野生型或未修饰的CD155多肽或含有IgD或其特异性结合片段的野生型或未修饰的CD155的一部分，变体CD155多肽包含一个或多个氨基酸修饰，如免疫球蛋白超家族(IgSF)结构域(IgD)中的一个或多个取代(或者，“突变”或“置换”)、缺失或添加。
因此，提供的变体CD155多肽是变体IgD(下文称为“vIgD”)或包含变体IgD，其中该一个或多个氨基酸修饰(例如取代)位于IgD中。
在一些实施方案中，IgD包含IgV结构域或IgC(例如IgC2)结构域或IgV结构域或IgC(例如IgC2)结构域的特异性结合片段，或其组合。在一些实施方案中，IgD可以是单独的IgV，IgV和IgC的组合，包括整个细胞外结构域(ECD)或CD155的Ig结构域的任何组合。表2提供了对应于CD155的IgV或IgC区域的示例性残基。在一些实施方案中，变体CD155多肽包含IgV结构域或IgC结构域或其特异性结合片段，其中该至少一个氨基酸修饰(例如，取代)位于IgV结构域或IgC结构域或其特异性结合片段中。在一些实施方案中，变体CD155多肽包含IgV结构域或其特异性结合片段，其中该至少一个氨基酸修饰(例如，取代)位于IgV结构域或其特异性结合片段中。在一些实施方案中，由于改变的结合活性或亲和力，改变的IgV结构域或IgC(例如IgC2)结构域是亲和力修饰的IgSF结构域。
在一些实施方案中，相对于未修饰的CD155序列的序列，在又一个IgSF结构域中修饰变体。在一些实施方案中，未修饰的CD155序列是野生型CD155。在一些实施方案中，未修饰的或野生型CD155具有天然CD155或其直系同源物的序列。在一些实施方案中，未修饰的CD155是CD155的细胞外结构域(ECD)或其部分或包含CD155的细胞外结构域(ECD)或其部分，该部分含有一个或多个IgSF结构域(参见表2)。在一些实施方案中，未修饰的或野生型CD155多肽的细胞外结构域包含IgV结构域和一个或多个IgC(例如IgC2)结构域。然而，变体CD155多肽不需要包含IgV结构域和一个或多个IgC(例如IgC2)结构域二者。在一些实施方案中，变体CD155多肽包含IgV结构域或其特异性结合片段，或基本上由IgV结构域或其特异性结合片段组成。在一些实施方案中，变体CD155多肽包含一个或两个IgC(例如IgC2)结构域或其特异性结合片段或基本上由一个或两个IgC结构域(例如IgC2)或其特异性结合片段组成。在一些实施方案中，变体CD155多肽包含仅一个IgC(例如IgC2)结构域或其特异性结合片段或基本上由仅一个IgC结构域(例如IgC2)或其特异性结合片段组成。在一些实施方案中，变体CD155多肽包含IgV结构域或其特异性结合片段以及第一和第二IgC(例如IgC2)结构域或其特异性结合片段。在一些实施方案中，变体CD155是可溶的并且缺乏跨膜结构域。在一些实施方案中，变体CD155还包含跨膜结构域，并且在一些情况下，还包含细胞质结构域。
在一些实施方案中，野生型或未修饰的CD155序列是哺乳动物CD155序列。在一些实施方案中，野生型或未修饰的CD155序列可以是哺乳动物CD155，其包括但不限于人、小鼠、食蟹猴或大鼠的。在一些实施方案中，野生型或未修饰的CD155序列是人的。
在一些实施方案中，野生型或未修饰的CD155序列具有(i)SEQ ID NO：20所示的氨基酸序列或其缺乏信号序列的成熟形式，(ii)显示出与SEQ ID NO：20或其成熟形式至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大的序列一致性的氨基酸序列，或(iii)是(i)或(ii)的一部分，其含有IgV结构域或IgC(例如IgC2)结构域或其特异性结合片段。
在一些实施方案中，野生型或未修饰的CD155多肽是CD155的细胞外结构域或其部分或包含CD155的细胞外结构域或其部分。在一些实施方案中，未修饰的或野生型CD155多肽包含SEQ ID NO：47所示的氨基酸序列或其直系同源物。在一些情况下，未修饰的或野生型CD155多肽可包含(i)SEQ ID NO：47所示的氨基酸序列，(ii)与SEQ ID NO：47具有至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列一致性的氨基酸序列，或(iii)是(i)或(ii)的序列的特异性结合片段，其包含IgV结构域或IgC(例如IgC2)结构域。
在一些实施方案中，野生型或未修饰的CD155多肽包含IgV结构域或一个或多个IgC(例如IgC2)结构域或其特异性结合片段。在一些实施方案中，野生型或未修饰的CD155多肽的IgV结构域包含SEQ ID NO：58或155所示的氨基酸序列(分别对应于SEQ ID NO：20的氨基酸残基24-139或21-142)或其直系同源物。例如，未修饰的或野生型CD155多肽的IgV结构域可含有(i)SEQ ID NO：58或155所示的氨基酸序列；(ii)与SEQ ID NO：58或155具有至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列一致性的氨基酸序列，或(iii)(i)或(ii)的序列的特异性结合片段。在一些实施方案中，野生型或未修饰的IgV结构域能够结合一种或多种CD155同源结合蛋白，例如TIGIT、CD226或CD96中的一个或多个。
在一些实施方案中，野生型或未修饰的CD155多肽的第一IgC2结构域包含SEQ IDNO：20的残基145-237所示的氨基酸序列或其直系同源物。例如，未修饰的或野生型CD155多肽的IgC2结构域可含有(i)SEQ ID NO：20的残基145-237所示的氨基酸序列；(ii)与SEQ IDNO：20的残基145-237具有至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列一致性的氨基酸序列，或(iii)(i)或(ii)的特异性结合片段。在一些实施方案中，野生型或未修饰的CD155多肽的第二IgC2结构域包含SEQ IDNO：20的残基244-328所示的氨基酸序列或其直系同源物。例如，未修饰的或野生型CD155多肽的IgC2结构域可含有(i)SEQ ID NO：20的残基244-328所示的氨基酸序列；(ii)与SEQ IDNO：20的残基244-328具有至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列一致性的氨基酸序列，或(iii)(i)或(ii)的特异性结合片段。在一些实施方案中，野生型或未修饰的IgC结构域中的一个或两个能够结合一种或多种CD155同源结合蛋白。
在一些实施方案中，野生型或未修饰的CD155多肽含有CD155的特异性结合片段，如IgV结构域或IgC(例如IgC2)结构域的特异性结合片段。在一些实施方案中，特异性结合片段可以结合TIGIT、CD226和/或CD96。特异性结合片段可具有至少50个氨基酸的氨基酸长度，如至少60、70、80、90、100或110个氨基酸。在一些实施方案中，IgV结构域的特异性结合片段含有氨基酸序列，其为SEQ ID NO：20的氨基酸24-139所示的IgV结构域长度的至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％。在一些实施方案中，IgC(例如IgC2)结构域的特异性结合片段包含氨基酸序列，其为SEQ IDNO：20的氨基酸145-237所示的IgC结构域长度的至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％。在一些实施方案中，IgC(例如IgC2)结构域的特异性结合片段包含氨基酸序列，其为SEQ ID NO：20的氨基酸244-328所示的IgC结构域长度的至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％。
在一些实施方案中，变体CD155多肽包含ECD结构域或其部分，该部分包含一个或多个亲和力修饰的IgSF结构域。在一些实施方案中，变体CD155多肽可包含IgV结构域或一个或多个IgC(例如IgC2)结构域，或IgV结构域的特异性结合片段或一个或多个IgC(例如IgC2)结构域的特异性结合片段，其中IgSF结构(IgV或IgC)中的一个或多个含有一个或多个氨基酸修饰(例如，取代)。在一些实施方案中，变体CD155多肽可包含IgV结构域和一个或多个IgC(例如IgC2)结构域，或IgV结构域的特异性结合片段和一个或多个IgC(例如IgC2)结构域的特异性结合片段，其中IgV或IgC结构域中的至少一个含有一个或多个氨基酸修饰(例如，取代)。在一些实施方案中，变体CD155多肽包含全长IgV结构域。在一些实施方案中，变体CD155多肽包含一个或多个全长IgC(例如IgC2)结构域。在一些实施方案中，变体CD155多肽包含IgV结构域的特异性结合片段。在一些实施方案中，变体CD155多肽包含一个或多个IgC(例如IgC2)结构域的特异性结合片段。在一些实施方案中，变体CD155多肽包含全长IgV结构域和一个或多个全长IgC(例如IgC2)结构域。在一些实施方案中，变体CD155多肽包含全长IgV结构域和一个或多个IgC(例如IgC2)结构域的特异性结合片段。在一些实施方案中，变体CD155多肽包含IgV结构域的特异性结合片段和一个或多个全长IgC结构域。在一些实施方案中，变体CD155多肽包含IgV结构域的特异性结合片段和一个或多个IgC(例如IgC2)结构域的特异性结合片段。
在任何这样的实施方案中，变体CD155多肽的一个或多个氨基酸修饰(例如，取代)可位于任何一个或多个CD155多肽IgSF结构域中。例如，在一些实施方案中，一个或多个氨基酸修饰(例如，取代)位于变体CD155多肽的细胞外结构域中。在一些实施方案中，一个或多个氨基酸修饰(例如，取代)位于IgV结构域或IgV结构域的特异性结合片段中。在一些实施方案中，一个或多个氨基酸修饰(例如，取代)位于IgC(例如IgC2)结构域或IgC(例如IgC2)结构域的特异性结合片段中。
通常，多肽的各种属性中的每一种在下面单独公开(例如，可溶的和膜结合的多肽，CD155对TIGIT、CD226和CD96的亲和力，每条多肽链的变异数，连接的多肽链的数量，每种变体CD155的氨基酸改变的数量和性质等)。然而，如本领域技术人员所清楚的，任何特定多肽可包含这些独立属性的组合。应当理解，提及氨基酸，包括提及以SEQ ID NO形式阐述用于描述IgSF结构域的结构域组织的特定序列，这是出于说明的目的，并不意味着限制所提供的实施方案的范围。应当理解，多肽及其结构域的描述是在理论上基于同源性分析和与相似分子的比对而得到的。因此，确切的基因座可以变化，并且对于每种蛋白质不一定相同。因此，特异性IgSF结构域，如特异性IgV结构域或IgC结构域，可以是更长或更短的几个氨基酸(如一个、两个、三个或四个)。
此外，如下所述的本发明的各种实施方案经常在如上所公开的定义术语的含义内提供。因此，当使用所定义的术语讨论本文所述的各个方面和属性时，以特定定义描述的实施方案将被解释为通过引用并入。因此，标题、描述各个方面和实施方案的顺序以及每个独立属性的单独公开不意味着限制本公开的范围。
示例性修饰
本文提供了相对于野生型或未修饰的CD155多肽中包含的IgSF结构域而言含有至少一个亲和力修饰的IgSF结构域(例如IgV或IgC)或其特异性结合片段的变体CD155多肽，使得变体CD155多肽显示出与野生型或未修饰的CD155多肽相比，对一种或多种配体TIGIT、CD226或CD96的改变(增加或降低)的结合活性或亲和力。在一些实施方案中，变体CD155多肽对TIGIT、CD226和/或CD96的结合亲和力不同于野生型或未修饰的CD155多肽对照序列的结合亲和力，如通过例如固相ELISA免疫测定、流式细胞术、ForteBio Octet或Biacore测定所测定的。在一些实施方案中，变体CD155多肽对TIGIT、CD226和/或CD96结合亲和力增加。在一些实施方案中，相对于野生型或未修饰的CD155多肽，变体CD155多肽对TIGIT、CD226和/或CD96的结合亲和力降低。TIGIT、CD226和/或CD96可以是哺乳动物蛋白质，如人蛋白质或鼠蛋白质。
每个同源结合配偶体的结合亲和力是独立的；也就是说，在一些实施方案中，相对于野生型或未修饰的CD155多肽，变体CD155多肽对TIGIT、CD226和/或CD96中的一种、两种或三种的结合亲和力增加，和/或对TIGIT、CD226和/或CD96中的一种、两种或三种的结合亲和力降低。
在一些实施方案中，相对于野生型或未修饰的CD155多肽，变体CD155多肽对TIGIT的结合亲和力增加。在一些实施方案中，相对于野生型或未修饰的CD155多肽，变体CD155多肽对CD226的结合亲和力增加。在一些实施方案中，相对于野生型或未修饰的CD155多肽，变体CD155多肽对CD96的结合亲和力增加。在一些实施方案中，相对于野生型或未修饰的CD155多肽，变体CD155多肽对TIGIT的结合亲和力降低。在一些实施方案中，相对于野生型或未修饰的CD155多肽，变体CD155多肽对CD226的结合亲和力降低。在一些实施方案中，相对于野生型或未修饰的CD155多肽，变体CD155多肽对CD96的结合亲和力降低。
在一些实施方案中，相对于野生型或未修饰的CD155多肽，变体CD155多肽对TIGIT和CD226的结合亲和力增加。在一些实施方案中，相对于野生型或未修饰的CD155多肽，变体CD155多肽对TIGIT的结合亲和力增加，且对CD226的结合亲和力降低。在一些实施方案中，相对于野生型或未修饰的CD155多肽，变体CD155多肽对TIGIT和CD226的结合亲和力降低。在一些实施方案中，相对于野生型或未修饰的CD155多肽，变体CD155多肽对TIGIT的结合亲和力降低，且对CD226的结合亲和力增加。
在一些实施方案中，相对于野生型或未修饰的CD155多肽，变体CD155多肽对TIGIT和CD96的结合亲和力增加。在一些实施方案中，相对于野生型或未修饰的CD155多肽，变体CD155多肽对TIGIT的结合亲和力增加，且对CD96的结合亲和力降低。在一些实施方案中，相对于野生型或未修饰的CD155多肽，变体CD155多肽对TIGIT和CD96的结合亲和力降低。在一些实施方案中，相对于野生型或未修饰的CD155多肽，变体CD155多肽对TIGIT的结合亲和力降低，且对CD96的结合亲和力增加。
在一些实施方案中，相对于野生型或未修饰的CD155多肽，变体CD155多肽对CD226和CD96的结合亲和力增加。在一些实施方案中，相对于野生型或未修饰的CD155多肽，变体CD155多肽对CD226的结合亲和力增加，且对CD96的结合亲和力降低。在一些实施方案中，相对于野生型或未修饰的CD155多肽，变体CD155多肽对CD226和CD96的结合亲和力降低。在一些实施方案中，相对于野生型或未修饰的CD155多肽，变体CD155多肽对CD226的结合亲和力降低，且对CD96的结合亲和力增加。
在一些实施方案中，相对于野生型或未修饰的CD155多肽，变体CD155多肽对TIGIT、CD226和CD96的结合亲和力增加。在一些实施方案中，相对于野生型或未修饰的CD155多肽，变体CD155多肽对TIGIT和CD226的结合亲和力增加，且对CD96的结合亲和力降低。在一些实施方案中，相对于野生型或未修饰的CD155多肽，变体CD155多肽对TIGIT和CD96的结合亲和力增加，且对CD226的结合亲和力降低。在一些实施方案中，相对于野生型或未修饰的CD155多肽，变体CD155多肽对TIGIT和CD226的结合亲和力降低，且对CD96的结合亲和力增加。在一些实施方案中，相对于野生型或未修饰的CD155多肽，变体CD155多肽对TIGIT的结合亲和力降低，且对CD226和CD96的结合亲和力增加。在一些实施方案中，相对于野生型或未修饰的CD155多肽，变体CD155多肽对TIGIT的结合亲和力增加，且对CD226和CD96的结合亲和力降低。在一些实施方案中，相对于野生型或未修饰的CD155多肽，变体CD155多肽对TIGIT、CD96和CD226的结合亲和力降低。在一些实施方案中，相对于野生型或未修饰的CD155多肽，变体CD155多肽对TIGIT的结合亲和力降低，且对CD226和CD96的结合亲和力增加。
在一些实施方案中，相对于野生型或未修饰的CD155多肽对照，对TIGIT、CD226和/或CD96具有增加的或更高的结合亲和力的变体CD155多肽增加至少约5％的对TIGIT、CD226和/或CD96的结合亲和力的，如至少约10％、15％、20％、25％、35％或50％。在一些实施方案中，相对于野生型或未修饰的CD155多肽的结合亲和力的增加超过1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍或50倍。在这样的例子中，野生型或未修饰的CD155多肽具有与变体CD155多肽相同的序列，不同的是它不含有一个或多个氨基酸修饰(例如，取代)。
在一些实施方案中，相对于野生型或未修饰的CD155多肽对照，对TIGIT、CD226和/或CD96具有降低或减小的结合亲和力的变体CD155多肽降低至少5％的对TIGIT、CD226和/或CD96的结合亲和力，如至少约10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多。在一些实施方案中，相对于野生型或未修饰的CD155多肽的结合亲和力的降低超过1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍或50倍。在这样的例子中，野生型或未修饰的CD155多肽具有与变体CD155多肽相同的序列，不同的是它不含有一个或多个氨基酸修饰(例如，取代)。
在一些实施方案中，任何前述实施方案的对TIGIT、CD226和/或CD96的平衡解离常数(Kd)可小于1×10-5M、1×10-6M、1×10-7M、1×10-8M、1×10-9M、1×10-10M或1×10-11M或1x10-12M或更小。
野生型或未修饰的CD155序列不一定必须用作起始组合物以产生本文所述的变体CD155多肽。因此，术语“修饰”例如“取代”的使用并不意味着本发明的实施方案限于制备变体CD155多肽的特定方法。变体CD155多肽可以例如通过从头肽合成来制备，因此在改变密码子的意义上不一定需要修饰，例如“取代”，来编码以进行修饰例如取代。该原理还延伸至氨基酸残基的术语“添加”和“缺失”，其同样不暗示特定的制备方法。设计或产生变体CD155多肽的方法不限于任何特定方法。然而，在一些实施方案中，由野生型或未修饰的CD155遗传物质诱变野生型或未修饰的CD155编码核酸，并针对特异性结合亲和力和/或IFN-γ表达的诱导或其他功能活性进行筛选。在一些实施方案中，使用可在任何数量的公共可获得的数据库中获得的蛋白质或核酸序列从头合成变体CD155多肽，然后进行筛选。国家生物技术信息中心提供此类信息，并且其网站可通过互联网公开访问，如前所述，UniProtKB数据库也是如此。
除非另有说明，否则如本公开全文所示，一个或多个氨基酸修饰由对应于SEQ ID NO：47所示的未修饰的ECD序列的位置编号的氨基酸位置编号指定，或者在适用的情况下由SEQ IDNO：58或SEQ ID NO：155所示的未修饰的IgV序列的位置编号的氨基酸位置编号指定，如下：
如通过参照序列与SEQ ID NO：47或SEQ ID NO：58或SEQ ID NO：155的比对来确定CD155多肽(包括其含有IgSF结构域(例如IgV)的部分)中修饰的相应位置，例如，氨基酸取代，这在技术人员的水平内。在整个本公开的修饰列表中，氨基酸位置在中间表示，在编号之前列出相应的未修饰的(例如野生型)氨基酸，并且在编号后列出所鉴定的变体氨基酸取代。如果修饰是位置的缺失，则显示“del”，并且如果修饰是在该位置的插入，则显示“ins”。在一些情况下，插入用在中间表示的氨基酸位置列出，在编号之前和之后列出相应的未修饰的(例如野生型)氨基酸，并且在未修饰的(例如野生型)氨基酸之后列出所鉴定的变体氨基酸插入。
在一些实施方案中，变体CD155多肽在野生型或未修饰的CD155序列中具有一个或多个氨基酸修饰例如取代。一个或多个氨基酸修饰例如取代可以在野生型或未修饰的CD155序列的胞外域(细胞外结构域)中。在一些实施方案中，一个或多个氨基酸修饰例如取代位于IgV结构域或其特异性结合片段中。在一些实施方案中，一个或多个氨基酸修饰例如取代位于IgC(例如IgC2)结构域或其特异性结合片段中。在变体CD155多肽的一些实施方案中，一个或多个氨基酸修饰例如取代中的一些位于IgV结构域或其特异性结合片段中，并且一个或多个氨基酸修饰例如取代中的一些位于一个或多个IgC结构域(例如IgC2)或其特异性结合片段中。
在一些实施方案中，变体CD155多肽具有多达1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸修饰例如取代。取代可以位于IgV结构域或一个或多个IgC(例如IgC2)结构域中。在一些实施方案中，变体CD155多肽在IgV结构域或其特异性结合片段中具有多达1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸修饰例如取代。在一些实施方案中，变体CD155多肽在一个或多个IgC(例如IgC2)结构域或其特异性结合片段中具有多达1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸修饰例如取代。在一些实施方案中，变体CD155多肽与野生型或未修饰的CD155多肽或其特异性结合片段(如SEQ ID NO：47、58或155的氨基酸序列)具有至少约85％、86％、86％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性。
在一些实施方案中，变体CD155多肽在未修饰的CD155或其特异性结合片段中具有对应于参照SEQ ID NO：47中所示的位置位置7、8、9、10、11、12、13、15、16、18、19、20、21、22、23、24、25、26、29、30、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、64、65、67、68、69、70、72、73、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、87、88、89、90、91、92、94、95、96、97、98、99、100、102、104、106、107、108、110、111、112、113、114、115或116的一个或多个氨基酸修饰例如取代。在一些实施方案中，与野生型或未修饰的CD155多肽相比，此类变体CD155多肽显示出对CD28、PD-L1或CTLA-4中的一种或多种改变的结合亲和力。例如，在一些实施方案中，与野生型或未修饰的CD155多肽相比，变体CD155多肽显示出对TIGIT、CD226和/或CD96中的一个或多个改变的结合亲和力。例如，在一些实施方案中，与野生型或未修饰的CD155多肽相比，变体CD155多肽显示出对TIGIT、CD226和/或CD96增加的结合亲和力。在一些实施方案中，与野生型或未修饰的CD155多肽相比，变体CD155多肽显示出对TIGIT、CD226或CD96降低的结合亲和力。
在一些实施方案中，变体CD155多肽具有选自以下各项的一个或多个氨基酸修饰：G7E、D8G、V9A、V9D、V9I、V9L、V10F、V10G、V10I、V11A、V11E、V11M、Q12H、Q12K、Q12L、A13E、A13R、T15I、T15S、Q16H、P18C、P18F、P18H、P18L、P18S、P18T、P18Y、G19D、F20I、F20S、F20Y、L21S、L21M、G22S、D23A、D23G、D23N、D23Y、S24A、S24P、V25A、V25E、T26M、C29R、Y30C、Y30F、Y30H、Q32L、Q32R、V33M、P34S、N35D、N35F、N35S、M36I、M36R、M36T、E37G、E37P、E37S、E37V、V38A、V38G、T39A、T39S、H40Q、H40R、H40T、V41A、V41M、S42A、S42C、S42G、S42L、S42N、S42P、S42Q、S42T、S42V、S42W、L44P、L44V、T45A、T45G、T45I、T45S、T45Q、T45V、W46C、W46R、A47E、A47G、A47V、R48Q、H49L、H49Q、H49R、G50S、E51G、E51K、E51V、S52A、S52E、S52G、S52K、S52L、S52M、S52P、S52Q、S52R、S52T、S52W、G53R、S54C、S54G、S54H、S54N、S54R、M55I、M55L、M55V、A56V、V57A、V57L、V57T、F58L、F58Y、H59E、H59N、N59R、Q60H、Q60K、Q60P、Q60R、T61A、T61G、T61K、T61M、T61R、T61S、Q62F、Q62H、Q62K、Q62L、Q62M、Q62R、Q62Y、P64S、S65A、S65C、S65G、S65D、S65T、S65Y、S65H、S65N、S65T、S65W、S67A、S67E、S67G、S67H、S67L、S67T、S67V、S67W、E68G、S69L、S69P、K70E、K70R、K70Q、L72Q、E73D、E73G、E73R、V75A、V75L、A76E、A76G、A76T、A77T、A77V、R78G、R78K、R78S、L79P、L79Q、L79V、G80D、G80S、A81E、A81P、A81T、A81V、E82D、E82G、L83P、L83Q、R84W、N85D、N85Y、N87T、L88P、R89K、M90I、M90L、M90V、F91S、F91P、F91T、G92A、G92E、G92W、R94H、V95A、E96D、D97G、E98D、E98S、G99D、G99Y、N100Y、T102S、L104E、L104M、L104N、L104P、L104Q、L104T、L104Y、V106A、V106I、V106L、T107A、T107L、T107M、T107S、T107V、F108H、F108L、F108Y、Q110R、G111D、G111R、S112I、S112N、S112V、R113G、R113W、S114N、S114T、V115A、V115M、D116G或D116N，或其保守性氨基酸取代。保守性氨基酸取代是落入与被取代的氨基酸相同类型的氨基酸中并且不同于野生型或未修饰的氨基酸的任何氨基酸。氨基酸的类型是脂肪族的(甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸)、含羟基或硫的(丝氨酸、半胱氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸)、环状的(脯氨酸)、芳香族的(苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸)、碱性的(组氨酸、赖氨酸和精氨酸)和酸性的/酰胺(天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺)。
在一些实施方案中，变体CD155多肽具有选自以下各项的两个或更多个氨基酸稀释：G7E、D8G、V9A、V9D、V9I、V9L、V10F、V10G、V10I、V11A、V11E、V11M、Q12H、Q12K、Q12L、A13E、A13R、T15I、T15S、Q16H、P18C、P18F、P18H、P18L、P18S、P18T、P18Y、G19D、F20I、F20S、F20Y、L21S、L21M、G22S、D23A、D23G、D23N、D23Y、S24A、S24P、V25A、V25E、T26M、C29R、Y30C、Y30F、Y30H、Q32L、Q32R、V33M、P34S、N35D、N35F、N35S、M36I、M36R、M36T、E37G、E37P、E37S、E37V、V38A、V38G、T39A、T39S、H40Q、H40R、H40T、V41A、V41M、S42A、S42C、S42G、S42L、S42N、S42P、S42Q、S42T、S42V、S42W、L44P、L44V、T45A、T45G、T45I、T45S、T45Q、T45V、W46C、W46R、A47E、A47G、A47V、R48Q、H49L、H49Q、H49R、G50S、E51G、E51K、E51V、S52A、S52E、S52G、S52K、S52L、S52M、S52P、S52Q、S52R、S52T、S52W、G53R、S54C、S54G、S54H、S54N、S54R、M55I、M55L、M55V、A56V、V57A、V57L、V57T、F58L、F58Y、H59E、H59N、N59R、Q60H、Q60K、Q60P、Q60R、T61A、T61G、T61K、T61M、T61R、T61S、Q62F、Q62H、Q62K、Q62L、Q62M、Q62R、Q62Y、P64S、S65A、S65C、S65G、S65D、S65T、S65Y、S65H、S65N、S65T、S65W、S67A、S67E、S67G、S67H、S67L、S67T、S67V、S67W、E68D、E68G、S69L、S69P、K70E、K70R、K70Q、L72Q、E73D、E73G、E73R、V75A、V75L、A76E、A76G、A76T、A77T、A77V、R78G、R78K、R78S、L79P、L79Q、L79V、G80D、G80S、A81E、A81P、A81T、A81V、E82D、E82G、L83P、L83Q、R84W、N85D、N85Y、N87T、L88P、R89K、M90I、M90L、M90V、F91S、F91T、F91P、G92A、G92E、G92W、R94H、V95A、E96D、D97G、E98D、E98S、G99D、G99Y、N100Y、T102S、L104E、L104M、L104N、L104P、L104Q、L104T、L104Y、V106A、V106I、V106L、T107A、T107L、T107M、T107S、T107V、F108H、F108L、F108Y、Q110R、G111D、G111R、S112I、S112N、S112V、R113G、R113W、S114N、S114T、V115A、V115M、D116G或D116N。在一些实施方案中，两个或更多个氨基酸修饰是P18S/P64S/F91S、P18S/F91S/L104P、P18L/L79V/F91S、P18S/F91S、P18T/F91S、P18T/S42P/F91S、G7E/P18T/Y30C/F91S、P18T/F91S/G111D、P18S/F91P、P18T/F91S/F108L、P18S/F91S、P18T/T45A/F91S、P18T/F91S/R94H、P18S/Y30C/F91S、A81V/L83P、A13E/P18S/A56V/F91S、P18T/F91S/V115A、P18T/Q60K、S52M、T45Q/S52L/L104E/G111R、S42G、Q62F、S52Q、S42A/L104Q/G111R、S42A/S52Q/L104Q/G111R、S52W/L104E、S42C、S52W、S52M/L104Q、S42L/S52L/Q62F/L104Q、S42W、S42Q、S52L、S52R、L104E、G111R、S52E、Q62Y、T45Q/S52M/L104E、S42N/L104Q/G111R、S52M/V57L、S42N/S52Q/Q62F、S42A/S52L/L104E/G111R、S42W/S52Q/V57L/Q62Y、L104Q、S42L/S52Q/L104E、S42C/S52L、S42W/S52R/Q62Y/L104Q、T45Q/S52R/L104E、S52R/Q62F/L104Q/G111R、T45Q/S52L/V57L/L104E、S52M/Q62Y、Q62F/L104E/G111R、T45Q/S52Q、S52L/L104E、S42V/S52E、T45Q/S52R/G111R、S42G/S52Q/L104E/G111R、S42N/S52E/V57L/L104E、S42C/S52M/Q62F、S42L、S42A、S42G/S52L/Q62F/L104Q、S42N、P18T/S65A/S67V/F91S、P18F/T39A/T45Q/T61R/S65N/S67L/E73G/R78G、P18T/T45Q/T61R/S65N/S67L、P18F/S65A/S67V/F91S、P18F/T45Q/T61R/S65N/S67L/F91S/L104P、P18S/L79P/L104M、P18S/L104M、L79P/L104M、P18T/T45Q/L79P、P18T/T45Q/T61R/S65H/S67H、P18T/A81E、P18S/D23Y/E37P/S52G/Q62M/G80S/A81P/G99Y/S112N、A13R/D23Y/E37P/S42P/Q62Y/A81E、A13R/D23Y/E37P/G99Y/S112N、A13R/D23Y/E37P/Q62M/A77V/G80S/A81P/G99Y、P18L/E37S/Q62M/G80S/A81P/G99Y/S112N、P18S/L104T、P18S/Q62H/L79Q/F91S、T45Q/S52K/Q62F/L104Q/G111R、T45Q/S52Q/Q62Y/L104Q/G111R、T45Q/S52Q/Q62Y/L104E/G111R、V57A/T61M/S65W/S67A/E96D/L104T、P18L/V57T/T61S/S65Y/S67A/L104T、P18T/T45Q、P18L/V57A/T61M/S65W/S67A/L104T、T61M/S65W/S67A/L104T、P18S/V41A/S42G/T45G/L104N、P18H/S42G/T45I/S52T/G53R/S54H/V57L/H59E/T61S/S65D/E68G/L104N、P18S/S42G/T45V/F58L/S67W/L104N、P18S/T45I/L104N、P18S/S42G/T45G/L104N/V106A、P18H/H40R/S42G/T45I/S52T/G53R/S54H/V57L/H59E/T61S/S65D/E68G/L104Y/V106L/F108H、E37V/S42G/T45G/L104N、P18S/T45Q/L79P/L104T、P18L/Q62R、A13R/D23Y/E37P/S42L/S52G/Q62Y/A81E、P18L/H49R/L104T/D116N、A13R/D23Y/E37P/Q62M/G80S/A81P/L104T、S65T/L104T、A13R/D23Y/E37P/S52G/V57A/Q62M/K70E/L104T、P18L/A47V/Q62Y/E73D/L104T、H40T/V41M/A47V/S52Q/Q62L/S65T/E73R/D97G/E98S/L104T/D116N、P18L/S42P/T45Q/T61G/S65H/S67E/L104T/D116N、P18S/H40T/V41M/A47V/S52Q/Q62L/S65T/E73R/L104M/V106A、H40T/V41M/A47V/S52Q/Q62L/S65T/E68G/E73R/D97G/E98S/L104T、T45Q/S52E/L104E、T45Q/S52E/Q62F/L104E、P18F/T26M/L44V/Q62K/L79P/F91S/L104M/G111D、P18S/T45S/T61K/S65W/S67A/F91S/G111R、P18S/L79P/L104M/T107M、P18S/S65W/S67A/M90V/V95A/L104Q/G111R、P18S/A47G/L79P/F91S/L104M/T107A/R113W、P18T/D23G/S24A/N35D/H49L/L79P/F91S/L104M/G111R、V9L/P18S/Q60R/V75L/L79P/R89K/F91S/L104E/G111R、P18S/H49R/E73D/L79P/N85D/F91S/V95A/L104M/G111R、V11A/P18S/L79P/F91S/L104M/G111R、V11A/P18S/S54R/Q60P/Q62K/L79P/N85D/F91S/T107M、P18T/S52P/S65A/S67V/L79P/F91S/L104M/G111R、P18T/M36T/L79P/F91S/G111R、D8G/P18S/M36I/V38A/H49Q/A76E/F91S/L104M/T107A/R113W、P18S/S52P/S65A/S67V/L79P/F91S/L104M/T107S/R113W、T15I/P18T/L79P/F91S/L104M/G111R、P18F/T26M/L44V/Q62K/L79P/E82D/F91S/L104M/G111D、P18T/E37G/G53R/Q62K/L79P/F91S/E98D/L104M/T107M、P18L/K70E/L79P/F91S/V95A/G111R、V9I/Q12K/P18F/S65A/S67V/L79P/L104T/G111R/S112I、P18F/S65A/S67V/F91S/L104M/G111R、V9I/V10I/P18S/F20S/T45A/L79P/F91S/L104M/F108Y/G111R/S112V、V9L/P18L/L79P/M90I/F91S/T102S/L104M/G111R、P18C/T26M/L44V/M55I/Q62K/L79P/F91S/L104M/T107M、V9I/P18T/D23G/L79P/F91S/G111R、P18F/L79P/M90L/F91S/V95A/L104M/G111R、P18T/M36T/S65A/S67E/L79Q/A81T/F91S/G111R、V9L/P18T/Q62R/L79P/F91S/L104M/G111R、P18S/S65W/S67A/L104Q/G111R、P18T/G19D/M36T/S54N/L79P/L83Q/F91S/T107M/F108Y、V9L/P18L/M55V/S69L/L79P/A81E/F91S/T107M、P18F/H40Q/T61K/Q62K/L79P/F91S/L104M/T107V、P18S/Q32R/Q62K/R78G/L79P/F91S/T107A/R113W、Q12H/P18T/L21S/G22S/V57A/Q62R/L79P/F91S/T107M、V9I/P18S/S24P/H49Q/F58Y/Q60R/Q62K/L79P/F91S/T107M、P18T/W46C/H49R/S65A/S67V/A76T/L79P/S87T/L104M、P18S/S42T/E51G/L79P/F91S/G92W/T107M、V10F/T15S/P18L/R48Q/L79P/F91S/T107M/V115M、P18S/L21M/Y30F/N35D/R84W/F91S/T107M/D116G、P18F/E51V/S54G/Q60R/L79Q/E82G/S87T/M90I/F91S/G92R/T107M、Q16H/P18F/F91S/T107M、P18T/D23G/Q60R/S67L/L79P/F91S/T107M/V115A、D8G/V9I/V11A/P18T/T26M/S52P/L79P/F91S/G92A/T107L/V115A、V9I/P18F/A47E/G50S/E68G/L79P/F91S/T107M、P18S/M55I/Q62K/S69P/L79P/F91S/T107M、P18T/T39S/S52P/S54R/L79P/F91S/T107M、P18S/D23N/L79P/F91S/T107M/S114N、P18S/P34S/E51V/L79P/F91S/G111R、P18S/H59N/V75A/L79P/A81T/F91S/L104M/T107M、P18S/W46R/E68D/L79P/F91S/T107M/R113G、V9L/P18F/T45A/S65A/S67V/R78K/L79V/F91S/T107M/S114T、P18T/M55L/T61R/L79P/F91S/V106I/T107M、T15I/P18S/V33M/N35F/T39S/M55L/R78S/L79P/F91S/T107M、P18S/Q62K/K70E/L79P/F91S/G92E/R113W、P18F/F20I/T26M/A47V/E51K/L79P/F91S、P18T/D23A/Q60H/L79P/M90V/F91S/T107M、P18S/D23G/C29R/N35D/E37G/M55I/Q62K/S65A/S67G/R78G/L79P/F91S/L104M/T107M/Q110R、A13E/P18S/M36R/Q62K/S67T/L79P/N85D/F91S/T107M、V9I/P18T/H49R/L79P/N85D/F91S/L104T/T107M、V9A/P18F/T61S/Q62L/L79P/F91S/G111R、D8E/P18T/T61A/L79P/F91S/T107M、P18S/V41A/H49R/S54C/L79S/N85Y/L88P/F91S/L104M/T107M、V11E/P18H/F20Y/V25E/N35S/H49R/L79P/F91S/T107M/G111R、V11A/P18F/D23A/L79P/G80D/V95A/T107M、P18S/K70R/L79P/F91S/G111R、V9L/V11M/P18S/N35S/S54G/Q62K/L79P/L104M/T107M/V115M、V9L/P18Y/V25A/V38G/M55V/A77T/L79P/M90I/F91S/L104M、V10G/P18T/L72Q/L79P/F91S/T107M、P18S/H59R/A76G/R78S/L79P、V9A/P18S/M36T/S65G/L79P/F91S/L104T/G111R/S112I、P18T/S52A/V57A/Q60R/Q62K/S65C/L79P/F91T/N100Y/T107M、V11A/P18F/N35D/A47E/Q62K/L79P/F91S/G99D/T107M/S114N、V11A/P18T/N35S/L79P/S87T/F91S、V9D/V11M/Q12L/P18S/E37V/M55I/Q60R/K70Q/L79P/F91S/L104M/T107M或T15S/P18S/Y30H/Q32L/Q62R/L79P/F91S/T107M。
在一些实施方案中，变体CD155多肽包含表1中列出的任何取代(突变)。表1还提供了参照SEQ ID NO的野生型CD155或示例性变体CD155多肽的细胞外结构域(ECD)或IgV结构域的示例性序列。如所指出的，对应于给定结构域的确切基因座或残基可以变化，如根据用于鉴定或分类结构域的方法变化。同样，在一些情况下，给定结构域(例如IgV)的相邻N-和/或C-末端氨基酸也可以包括在变体IgSF多肽的序列中，如以确保表达时结构域的适当折叠。因此，应当理解，表1中SEQ ID NO的示例不应解释为限制。例如，变体CD155多肽的特定结构域如IgV结构域可以比相应的SEQ ID NO所示的氨基酸序列长或短若干个氨基酸，如长或短1-10个氨基酸，如1、2、3、4、5、6或7个氨基酸。
在一些实施方案中，变体CD155多肽包含表1中列出的任何突变。在一些实施方案中，变体CD155多肽包含表1中列出的任何细胞外结构域(ECD)序列(即，SEQ ID NO：59-80、178-274、1230-1252、1269和1610-1655中的任何一个)。在一些实施方案中，变体CD155多肽包含这样的多肽序列，该多肽序列显示出与表1中列出的任何细胞外结构域(ECD)序列(即，SEQ ID NO：59-80、178-274、1230-1252、1269和1610-1655中的任何一个)至少90％一致性、至少91％一致性、至少92％一致性、至少93％一致性、至少94％一致性、至少95％一致性，如至少96％一致性、97％一致性、98％一致性或99％一致性，且含有野生型或未修饰的CD155中不存在的一个或多个氨基酸修饰，例如一个或多个取代。在一些实施方案中，变体CD155多肽包含表1中列出的任何细胞外结构域(ECD)序列(即，SEQ ID NO：59-80、178-274、1230-1252、1269和1610-1655中的任何一个)的特异性结合片段，且含有野生型或未修饰的CD155中不存在的一个或多个氨基酸修饰，例如，一个或多个取代。在一些实施方案中，变体CD155多肽包含表1中列出的任何IgV序列(即，SEQ ID NO：81-102、156-177、275-468、1184-1229、1270-1271、1656-1747中的任何一个)。在一些实施方案中，变体CD155多肽包含这样的多肽序列，该多肽序列显示出与表1中列出的任何IgV序列(即，SEQ ID NO：81-102、156-177、275-468、1184-1229、1270-1271、1656-1747中的任何一个)至少90％一致性、至少91％一致性、至少92％一致性、至少93％一致性、至少94％一致性、至少95％一致性，如至少96％一致性、97％一致性、98％一致性或99％一致性，且含有野生型或未修饰的CD155中不存在的一个或多个氨基酸修饰，例如一个或多个取代。在一些实施方案中，变体CD155多肽包含表1中列出的任何IgV序列(即，SEQ ID NO：81-102、156-177、275-468、1184-1229、1270-1271、1656-1747中的任何一个)的特异性结合片段，且含有野生型或未修饰的CD155中不存在的一个或多个氨基酸修饰，例如一个或多个取代。
在一些实施方案中，变体CD155多肽表现出与野生型或未修饰的CD155多肽(例如包含SEQ ID NO：47、58或155所示的序列的野生型或未修饰的CD155多肽)相比对TIGIT的细胞内结构域增加的亲和力。在一些实施方案中，变体CD155多肽表现出与野生型或未修饰的CD155多肽(例如包含SEQ ID NO：47、58或155所示的序列的野生型或未修饰的CD155多肽)相比对CD226的细胞内结构域增加的亲和力。在一些实施方案中，变体CD155多肽表现出与野生型或未修饰的CD155多肽(例如包含SEQ ID NO：47、58或155所示的序列的野生型或未修饰的CD155多肽)相比对CD96的细胞内结构域增加的亲和力。在一些实施方案中，变体CD155多肽表现出与野生型或未修饰的CD155多肽(例如包含SEQ ID NO：47、58或155所示的序列的野生型或未修饰的CD155多肽)相比对TIGIT的细胞内结构域、CD226的细胞内结构域和CD96的细胞内结构域增加的亲和力。在一些实施方案中，变体CD155多肽表现出与野生型或未修饰的CD155多肽(例如包含SEQ ID NO：47、58或155所示的序列的野生型或未修饰的CD155多肽)相比对TIGIT的细胞内结构域和CD226的细胞内结构域增加的亲和力。在一些实施方案中，变体CD155多肽表现出与野生型或未修饰的CD155多肽(例如包含SEQ ID NO：47、58或155所示的序列的野生型或未修饰的CD155多肽)相比对TIGIT的细胞内结构域和CD96的细胞内结构域增加的亲和力。在一些实施方案中，变体CD155多肽表现出与野生型或未修饰的CD155多肽(例如包含SEQ ID NO：47、58或155所示的序列的野生型或未修饰的CD155多肽)相比对CD226的细胞内结构域和CD96的细胞内结构域增加的亲和力。
在一些实施方案中，与野生型或未修饰的CD155多肽(例如包含SEQ ID NO：47、58或155所示的序列的野生型或未修饰的CD155多肽)相比，变体CD155多肽表现出对于结合TIGIT、CD226或CD96的细胞内结构域中的一个增加的结合亲和力，并且表现出对于结合TIGIT、CD226或CD96的细胞内结构域中的其它降低的结合亲和力。在一些实施方案中，与野生型或未修饰的CD155多肽(例如包含SEQ ID NO：47、58或155所示的序列的野生型或未修饰的CD155多肽)相比，变体CD155多肽表现出对于TIGIT的细胞内结构域或CD226的细胞内结构域增加的亲和力，以及对于CD96的细胞内结构域降低的亲和力。在一些实施方案中，与野生型或未修饰的CD155多肽(例如包含SEQ ID NO：47、58或155所示的序列的野生型或未修饰的CD155多肽)相比，变体CD155多肽表现出对于TIGIT的细胞内结构域或CD96的细胞内结构域增加的亲和力，以及对于CD226的细胞内结构域降低的亲和力。在一些实施方案中，与野生型或未修饰的CD155多肽(例如包含SEQ ID NO：47、58或155所示的序列的野生型或未修饰的CD155多肽)相比，变体CD155多肽表现出对于CD226的细胞内结构域或CD96的细胞内结构域增加的亲和力，以及对于TIGIT的细胞内结构域降低的亲和力。
在一些实施方案中，与野生型或未修饰的CD155多肽(例如包含SEQ ID NO：47、58或155所示的序列的野生型或未修饰的CD155多肽)相比，变体CD155多肽表现出对于TIGIT的细胞内结构域和CD226的细胞内结构域增加的亲和力，以及对于CD96的细胞内结构域降低的亲和力。在一些实施方案中，与野生型或未修饰的CD155多肽(例如包含SEQ ID NO：47、58或155所示的序列的野生型或未修饰的CD155多肽)相比，变体CD155多肽表现出对于TIGIT的细胞内结构域和CD96的细胞内结构域增加的亲和力，以及对于CD226的细胞内结构域降低的亲和力。在一些实施方案中，与野生型或未修饰的CD155多肽(例如包含SEQ IDNO：47、58或155所示的序列的野生型或未修饰的CD155多肽)相比，变体CD155多肽表现出对于CD226的细胞内结构域和CD96的细胞内结构域增加的亲和力，以及对于TIGIT的细胞内结构域降低的亲和力。
在一些实施方案中，与野生型或未修饰的CD155多肽(例如包含SEQ ID NO：47、58或155所示的序列的野生型或未修饰的CD155多肽)相比，变体CD155多肽表现出对于TIGIT的细胞内结构域增加的亲和力，以及对于CD226的细胞内结构域和CD96的细胞内结构域降低的亲和力。在一些实施方案中，与野生型或未修饰的CD155多肽(例如包含SEQ ID NO：47、58或155所示的序列的野生型或未修饰的CD155多肽)相比，变体CD155多肽表现出对于CD96的细胞内结构域增加的亲和力，以及对于TIGIT的细胞内结构域和CD226的细胞内结构域降低的亲和力。在一些实施方案中，与野生型或未修饰的CD155多肽(例如包含SEQ ID NO：47、58或155所示的序列的野生型或未修饰的CD155多肽)相比，变体CD155多肽表现出对于CD226的细胞内结构域增加的亲和力，以及对于TIGIT的细胞内结构域和CD96的细胞内结构域降低的亲和力。
在一些实施方案中，与未修饰的CD155多肽(例如SEQ ID NO：47、58或155所示出的)对于TIGIT相对于CD226的结合的比率(例如由大于1的TIGIT结合与CD226结合的比率(TIGIT：CD226结合比率)所示出的)相比，变体CD155多肽表现出对于TIGIT相对于CD226的增加的选择性。在一些实施方案中，变体CD155多肽表现出大于或大于约或为1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70或更大的结合TIGIT相对于CD226的比率。
III变体多肽的形式
包含本文提供的变体CD155(其中包含vIgD)的免疫调节多肽可以以多种方式形成，包括以可溶性蛋白质、膜结合蛋白或分泌蛋白。在一些实施方案中，可以选择特定形式用于所需的治疗应用。在一些情况下，包含变体CD155多肽的免疫调节多肽以某一种形式提供，以拮抗或阻断其同源结合配偶体例如TIGIT的活性。在一些实施方案中，TIGIT的拮抗作用可用于促进肿瘤中的免疫。在一些情况下，包含变体CD155多肽的免疫调节多肽以某一种形式提供，以激动或刺激其同源结合配偶体例如TIGIT的活性。在一些实施方案中，TIGIT的激动可用于治疗炎症或自身免疫。技术人员可以容易地确定特定形式的活性，例如用于拮抗或激动一种或多种特异性同源结合配偶体的活性。本文(包括在实施例中)提供了用于评估此类活性的示例性方法。
在一些方面，提供了包含CD155的vIgD的免疫调节蛋白，其中这些蛋白质是可溶的，例如与Fc链融合。在一些方面，一个或多个另外的IgSF结构域，如一个或多个另外的vIgD，可以与本文提供的CD155的vIgD连接(下文称为“堆叠”或“堆叠的”免疫调节蛋白)。在一些实施方案中，所提供的免疫调节蛋白的模块形式提供了工程化或产生免疫调节蛋白的灵活性，以用于调节多个反结构(多个同源结合配偶体)的活性。在一些实施方案中，此类“堆叠”分子可以以可溶形式提供，或者在一些情况下，可以以膜结合或分泌蛋白的形式提供。在一些实施方案中，变体CD155免疫调节蛋白以缀合物的形式提供，其中含有直接或间接地与靶向剂或部分连接(例如，特异性地结合至配体(例如抗原)的抗体或其他结合分子连接)的CD155的vIgD，例如，以用于如当向受试者给药时将vIgD靶向或定位于特定环境或细胞。在一些实施方案中，靶向剂例如抗体或其他结合分子与肿瘤抗原结合，从而将含有vIgD的变体CD155定位于肿瘤微环境，例如，以调节对肿瘤微环境特异的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的活性。
在一些实施方案中，提供的免疫调节蛋白在细胞中表达并作为工程化细胞疗法(ECT)的一部分提供。在一些实施方案中，变体CD155多肽以膜结合形式在细胞(如免疫细胞(例如T细胞或抗原呈递细胞))中表达，从而提供跨膜免疫调节蛋白(下文中也称为“TIP”)。在一些实施方案中，根据TIP识别的同源结合配偶体，表达TIP的工程化细胞可通过向其他工程化细胞和/或内源性T细胞提供阳性至阴性的共刺激信号来激动同源结合配偶体。在一些方面，变体CD155多肽以可分泌形式在细胞(如免疫细胞(例如T细胞或抗原呈递细胞))中表达，从而如当将细胞给予受试者时产生分泌的或可溶形式的变体CD155多肽(下文中也称为“SIP”)。在一些方面，SIP可以拮抗分泌它的环境(例如肿瘤微环境)中的同源结合配偶体。在一些实施方案中，变体CD155多肽在感染原(例如病毒或细菌剂)中表达，该感染原在给予受试者后能够感染体内细胞，如免疫细胞(例如T细胞或抗原呈递细胞)，以用于在细胞中以TIP或SIP的形式递送或表达变体多肽。
在一些实施方案中，可溶性免疫调节多肽，如含有vIgD的变体CD155，可以包封在脂质体内，该脂质体本身可以与所提供的缀合物(例如，靶向部分)中的任何一种或任何组合缀合。在一些实施方案中，本发明的可溶性或膜结合免疫调节多肽是去糖基化的。在更具体的实施方案中，变体CD155序列是去糖基化的。在甚至更具体的实施方案中，变体CD155的IgV和/或IgC(例如IgC2)结构域是去糖基化的。
所提供形式的非限制性例子在图1A-图1C中描述并进一步描述如下。
A.可溶性蛋白质
在一些实施方案中，含有变体CD155多肽的免疫调节蛋白是可溶性蛋白质。本领域技术人员将理解，细胞表面蛋白通常具有细胞内、跨膜和细胞外结构域(ECD)，并且可以使用细胞外结构域或其免疫活性子序列制备可溶形式的此类蛋白质。因此，在一些实施方案中，含有变体CD155多肽的免疫调节蛋白缺乏跨膜结构域或跨膜结构域的一部分。在一些实施方案中，含有变体CD155的免疫调节蛋白缺乏细胞内(细胞质)结构域或细胞内结构域的一部分。在一些实施方案中，含有变体CD155多肽的免疫调节蛋白仅含有vIgD部分，该vIgD部分含有ECD结构域或其部分，该部分含有一个或多个IgV结构域和/或IgC(例如IgC2)结构域或其特异性结合片段，该特异性结合片段含有一个或多个氨基酸修饰。
在一些实施方案中，包含变体CD155的免疫调节多肽可包括一种或多种本发明的变体CD155多肽。在一些实施方案中，本发明的多肽将恰好包含1、2、3、4、5个变体CD155序列。在一些实施方案中，变体CD155序列中的至少两个是相同的变体CD155序列。
在一些实施方案中，所提供的免疫调节多肽包含两个或更多个CD155的vIgD序列。多肽链内的多个变体CD155多肽可以是彼此相同(即，相同的种类)，或者彼此不同(即，不同的种类)的变体CD155序列。除了单一多肽链实施方案之外，在一些实施方案中，本发明的两个、三个、四个或更多个多肽可以彼此共价或非共价连接。因此，本文提供了单体、二聚体和更高级(例如，3、4、5个或更多个)多聚体蛋白质。例如，在一些实施方案中，本发明的两个多肽恰好可以彼此共价或非共价附接以形成二聚体。在一些实施方案中，经由链间半胱氨酸二硫键进行附接。包含两个或更多个本发明多肽的组合物可以具有相同种类或基本上相同种类的多肽(例如同型二聚体)或具有不同种类的多肽(例如异二聚体)。如上所述，具有多个本发明的连接多肽的组合物在每条多肽链中具有本发明的一个或多个相同或不同的变体CD155多肽。
在一些实施方案中，免疫调节蛋白包含附接于免疫球蛋白Fc的变体CD155多肽(得到“免疫调节Fc融合物”，如“变体CD155-Fc变体融合物”，也称为CD155 vIgD-Fc融合物)。在一些实施方案中，变体CD155多肽的附接位于Fc的N-末端。在一些实施方案中，变体CD155多肽的附接位于Fc的C-末端。在一些实施方案中，两个或更多个CD155变体多肽(相同或不同)独立地附接在N-末端和C-末端。
在一些实施方案中，Fc是鼠或人Fc。在一些实施方案中，Fc是哺乳动物或人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc区域。在一些实施方案中，Fc来源于IgG1，如人IgG1。在一些实施方案中，Fc包含SEQ ID NO：56所示的氨基酸序列或显示出与SEQ ID NO：56至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列一致性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，Fc区域含有一个或多个修饰以改变(例如减少)其正常功能中的一种或多种。通常，除了作为免疫球蛋白的主要功能的抗原结合能力之外，Fc区域还负责效应子功能，如补体依赖性细胞毒性(CDC)和抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。此外，Fc区域中存在的FcRn序列通过与体内FcRn受体缀合增加体内半衰期而起到调节血清中IgG水平的作用。在一些实施方案中，可以在Fc中减少或改变这样的功能以与提供的Fc融合蛋白一起使用。
在一些实施方案中，可以将一个或多个氨基酸修饰引入本文提供的CD155-Fc变体融合物的Fc区域，从而产生Fc区域变体。在一些实施方案中，Fc区域变体具有降低的效应子功能。有许多可改变效应子功能的Fc序列的变化或突变的例子。例如，WO 00/42072、WO2006019447、WO2012125850、WO2015/107026、US2016/0017041和Shields等人JBiol.Chem.9(2)：6591-6604(2001)描述了改善或减弱与FcR结合的Fc变体。这些出版物的内容通过引用特别地并入本文。
在一些实施方案中，所提供的变体CD155-Fc融合物包含显示出降低的效应子功能的Fc区域，这使其成为一些应用的理想候选物，在该应用中体内CD155-Fc变体融合物的半衰期是重要的但某些效应子功能(如CDC和ADCC)是不必要或有害的。可以进行体外和/或体内细胞毒性测定以确认CDC和/或ADCC活性的降低/消耗。例如，可以进行Fc受体(FcR)结合测定以确保CD155-Fc变体融合物缺乏FcγR结合(因此可能缺乏ADCC活性)，但保留FcRn结合能力。介导ADCC的原代细胞NK细胞仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol.9：457-492(1991)的第464页表3总结了造血细胞上的FcR表达。用于评估感兴趣分子的ADCC活性的体外测定的非限制性例子描述于美国专利号5,500,362(参见，例如Hellstrom，I.等人Proc.Nat′l Acad.Sci.USA 83：7059-7063(1986))和Hellstrom，I等人，Proc.Nat′l Acad.Sci.USA 82：1499-1502(1985)；美国专利号5,821,337(参见Bruggemann，M.等人，J.Exp.Med.166：1351-1361(1987))。或者，可以使用非放射性测定方法(参见例如用于流式细胞术的ACTITM非放射性细胞毒性测定(CellTechnology公司，山景城，加利福尼亚州)；和CytoTox 96TM非放射性细胞毒性测定(Promega，麦迪逊，威斯康辛州)。用于此类测定的有用效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。可选地或另外地，可以在体内(例如在动物模型中，如Clynes等人Proc.Nat′l Acad.Sci.USA 95：652-656(1998)中公开的动物模型)评估感兴趣分子的ADCC活性。还可以进行C1q结合测定以证实CD155-Fc变体融合物不能结合C1q并因此缺乏CDC活性。参见例如WO 2006/029879和WO 2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA。为了评估补体活化，可以进行CDC测定(参见例如Gazzano-Santoro等人，J.Immunol.Methods202：163(1996)；Cragg，M.S.等人，Blood 101：1045-1052(2003)；以及Cragg，M.S.和M.J.Glennie，Blood 103：2738-2743(2004))。还可以使用本领域已知的方法进行FcRn结合和体内清除/半衰期测定(参见例如Petkova，S.B.等人，Int′l.Immunol.18(12)：1759-1769(2006))。
具有降低的效应子功能的CD155-Fc变体融合物包括具有根据EU编号的Fc区域残基238、265、269、270、297、327和329的一个或多个取代的那些CD80-Fc变体融合物(美国专利号6,737,056)此类Fc突变体包括根据EU编号的氨基酸位置265、269、270、297和327中的两个或更多个位置处具有取代的Fc突变体，包括残基265和297取代为丙氨酸的所谓的“DANA”Fc突变体(美国专利号7,332,581)。
在一些实施方案中，CD155-Fv变体融合物的Fc区域具有Fc区域，其中位置234、235、236、237、238、239、270、297、298、325和329处(根据EU编号表示)的任何一个或多个氨基酸被不同于天然Fc区域的氨基酸取代。Fc区域的这种改变不限于上述改变，并且包括例如，诸如Biotechnology(2009)20(6)，685-691中的Current Opinion中描述的去糖基化链(N297A和N297Q)、IgG1-N297G、IgG1-L234A/L235A、IgG1-L234A/L235E/G237A、IgG1-A325A/A330S/P331S、IgG1-C226S/C229S、IgG1-C226S/C229S/E233P/L234V/L235A、IgG1-E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、IgG1-L234F/L235E/P331S、IgG1-S267E/L328F、IgG2-V234A/G237A、IgG2-H268Q/V309L/A330S/A331S、IgG4-L235A/G237A/E318A和IgG4-L236E的改变；诸如WO 2008/092117中描述的G236R/L328R、L235G/G236R、N325A/L328R和N325LL328R的改变；位置233、234、235和237处(根据EU编号表示)的氨基酸插入；以及WO 2000/042072中描述的位置处的改变。
描述了具有改善或减弱的与FcR结合的某些Fc变体。(参见例如美国专利号6,737,056；WO 2004/056312、WO2006019447和Shields等人，J.Biol.Chem.9(2)：6591-6604(2001))。
在一些实施方案中，提供了包含变体Fc区域的CD155-Fc变体融合物，该变体Fc区域包含增加半衰期和/或改善与新生Fc受体(FcRn)的结合的一个或多个氨基酸取代。具有增加的半衰期和改善的与FcRn的结合的抗体描述于US 2005/0014934 A1(Hinton等人)或WO 2015107026中。那些抗体包含其中具有一个或多个取代的Fc区域，该一个或多个取代改善Fc区域与FcRn的结合。此类Fc变体包括在根据EU编号的Fc区域残基：238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434中的一个或多个残基处具有取代的那些Fc变体，例如，Fc区域残基434的取代(美国专利号7,371,826)。
在一些实施方案中，CD155-Fc变体融合物的Fc区域包含一个或多个氨基酸取代根据EU编号的E356D和M358L。在一些实施方案中，CD155-Fc变体融合物的Fc区域包含一个或多个氨基酸取代根据EU编号的C220S、C226S和/或C229S。在一些实施方案中，CD155变体融合物的Fc区域包含一个或多个氨基酸取代R292C和V302C。关于Fc区域变体的其他例子还参见Duncan&Winter，Nature 322：738-40(1988)；美国专利号5,648,260；美国专利号5,624,821；和WO 94/29351。
在一些实施方案中，在Fc区域中进行改变，这导致C1q结合和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)减弱，例如，如美国专利号6,194,551、WO 99/51642和Idusogie等人，J.Immunol.164：4178-4184(2000)中描述的。
在一些实施方案中，提供了CD155-Fc变体融合物，其包含含有一个或多个氨基酸修饰的变体Fc区域，其中该变体Fc区域来源于IgG1，如人IgG1。在一些实施方案中，变体Fc区域来源于SEQ ID NO：56所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，Fc含有根据SEQ ID NO：56编号的至少一个氨基酸取代，即N82G(对应于根据EU编号的N297G)。在一些实施方案中，Fc还含有根据SEQ ID NO：56编号的至少一个氨基酸取代，即R77C或V87C(对应于根据EU编号的R292C或V302C)。在一些实施方案中，变体Fc区域还包含根据SEQ ID NO：56编号的C5S氨基酸修饰(对应于根据EU编号的C220S)。例如，在一些实施方案中，变体Fc区域包含以下氨基酸修饰：V297G和以下氨基酸修饰的一个或多个：根据EU编号的C220S、R292C或V302C(对应于N82G和以下氨基酸修饰的一个或多个：参照SEQ ID NO：56的C5S、R77C或V87C)，例如Fc区域包含SEQ ID NO：1135所示的序列。在一些实施方案中，变体Fc区域包含氨基酸修饰C220S、L234A、L235E或G237A中的一个或多个，例如，Fc区域包含SEQ ID NO：1136所示的序列。在一些实施方案中，变体Fc区域包含氨基酸修饰C220S、L235P、L234V、L235A、G236del或S267K中的一个或多个，例如Fc区域包含SEQ ID NO：1137所示的序列。在一些实施方案中，变体Fc区域包含氨基酸修饰C220S、L234A、L235E、G237A、E356D或M358L中的一个或多个，例如Fc区域包含SEQ ID NO：1119所示的序列。
在一些实施方案中，Fc区域缺乏对应于SEQ ID NO：56所示的野生型或未修饰的Fc的位置232C的末端赖氨酸(对应于根据EU编号的K447del)。在一些方面，此类Fc区域可以额外地包括一个或多个另外的修饰，例如氨基酸取代，例如所述的任一个。此类Fc区域的实例示于SEQ ID NO：1253、1748、1749或1750。
在一些实施方案中，提供了包含变体Fc区域的CD155-Fc变体融合物，其中该变体Fc包含SEQ ID NO：1119、1135、1136、1137、1253、1748、1749或1750中任一个所示的氨基酸序列，或者显示出与SEQ ID NO：1119、1135、1136、1137、1253、1748、1749或1750至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列一致性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，Fc来源于IgG2，如人IgG2。在一些实施方案中，Fc包含SEQ IDNO：57所示的氨基酸序列或显示出与SEQ ID NO：57至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列一致性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，Fc包含SEQ ID NO：1178所示的人IgG4的氨基酸序列或显示出与SEQ ID NO：1178至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列一致性的氨基酸序列。在一些实施方案中，IgG4Fc是稳定的Fc，其中人IgG4的CH3结构域被人IgG1的CH3结构域取代并且显示出抑制的聚集体形成；抗体，其中人IgG4的CH3和CH2结构域分别被人IgG1的CH3和CH2结构域取代；或抗体，其中由Kabat等人提出的EU指数表示的人IgG4的位置409处的精氨酸被赖氨酸取代并且显示出抑制的聚集体形成(参见例如美国专利号8,911,726)。在一些实施方案中，Fc是含有S228P突变的IgG4，其已经显示通过Fab-臂交换防止治疗性抗体与内源性IgG4之间的重组(参见，例如Labrijin等人(2009)Nat.Biotechnol.，27(8)767-71)。在一些实施方案中，Fc包含SEQID NO：1179所示的具有S228P的人IgG4所示的氨基酸序列或显示出与SEQ ID NO：1179至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列一致性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，变体CD155多肽与Fc序列直接连接。在一些实施方案中，变体CD155多肽与Fc序列间接连接，如经由接头。在一些实施方案中，一个或多个“肽接头”连接变体CD155多肽和Fc结构域。在一些实施方案中，肽接头长度可以是单个氨基酸残基或更长。在一些实施方案中，肽接头的长度为至少一个氨基酸残基但不超过20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸残基。在一些实施方案中，接头是三个丙氨酸(AAA)。在一些实施方案中，接头是(以单字母氨基酸代码的形式)：GGGGS(“4GS”；SEQID NO：1752)或4GS接头的多聚体，如2、3、4或5个4GS接头的重复序列，例如SEQ ID NO：1182(2xGGGGS)或SEQ ID NO：1181(3xGGGGS)所示的。在一些实施方案中，接头(以单字母氨基酸代码的形式)是GSGGGGS(SEQ ID NO：1751)。
在一些实施方案中，变体CD155-Fc融合蛋白是由两个连接至Fc结构域的变体CD155 Fc多肽形成的二聚体。在一些实施方案中，二聚体是同源二聚体，其中两个变体CD155 Fc多肽是相同的。在一些实施方案中，二聚体是异二聚体，其中两个变体CD155 Fc多肽是不同的。
还提供了编码变体CD155-Fc融合蛋白的核酸分子。在一些实施方案中，为了产生Fc融合蛋白，将编码变体CD155-Fc融合蛋白的核酸分子插入合适的表达载体中。得到的变体CD155-Fc融合蛋白可以在用表达转化的宿主细胞中表达，其中通过Fc部分之间形成的链间二硫键发生Fc结构域之间的组装，以产生二聚(如二价)变体CD155-Fc融合蛋白。
得到的Fc融合蛋白可以通过蛋白质A或蛋白质G柱上的亲和色谱容易地纯化。为了产生异二聚体，可能需要另外的纯化步骤。例如，当编码不同变体CD155多肽的两个核酸转化至细胞中时，必须生物化学地实现异二聚体的形成，因为携带Fc结构域的变体CD155分子也将表达为二硫键连接的同型二聚体。因此，同型二聚体可以在有利于破坏链间二硫键但不影响链内二硫键的条件下还原。在一些情况下，将不同的变体CD155 Fc单体以等摩尔量混合并氧化以形成同型二聚体和异二聚体的混合物。通过色谱技术分离该混合物的组分。或者，这种类型的异二聚体的形成可以使用下述隆突到穴中(knob-into-hole)方法通过遗传工程化和表达含有变体CD155多肽的Fc融合分子来产生偏差。
B.具有另外的IgSF结构域的堆叠分子
在一些实施方案中，免疫调节蛋白可含有直接或间接与一个或多个其他免疫球蛋白超家族(IgSF)结构域(“堆叠的”免疫调节蛋白构建体，也称为“II型”免疫调节蛋白)连接的本文提供的任何变体CD155多肽。在一些方面，这可以产生独特的多结构域免疫调节蛋白，其结合两种或更多种，如三种或更多种同源结合配偶体，从而提供免疫突触的多靶向调节。
在一些实施方案中，免疫调节蛋白包含变体CD155结构域与野生型IgSF家族成员中未发现的另一个IgSF家族成员(例如哺乳动物IgSF家族成员)的一个或多个其他亲和力修饰和/或非亲和力修饰的IgSF结构域序列的组合(“非野生型组合”)和/或排列(“非野生型排列”或“非野生型置换”)。在一些实施方案中，免疫调节蛋白含有2、3、4、5或6个免疫球蛋白超家族(IgSF)结构域，其中根据提供的描述，IgSF结构域中的至少一个是变体CD155IgSF结构域(CD155的vIgD)。
在一些实施方案中，另外的IgSF结构域的序列可以是修饰的IgSF结构域，其含有与野生型或未修饰的IgSF结构域相比的一个或多个氨基酸修饰，例如，取代。在一些实施方案中，IgSF结构域可以是非亲和力修饰的(例如野生型)或经亲和力修饰的。在一些实施方案中，未修饰的或野生型IgSF结构域可以来自小鼠、大鼠、食蟹猴或人来源，或其组合。在一些实施方案中，另外的IgSF结构域可以是表2所示的IgSF家族成员的IgSF结构域。在一些实施方案中，另外的IgSF结构域可以是含有与表2所示的IgSF家族成员中包含的IgSF结构域相比的一个或多个氨基酸修饰(例如，取代)的亲和力修饰的IgSF结构域。
在一些实施方案中，另外的IgSF结构域是包含在以下家族的IgSF家族成员中的亲和力或非亲和力修饰的IgSF结构域：信号调节蛋白(SIRP)家族、在骨髓细胞样(TREML)家族上表达的触发受体、癌胚抗原相关细胞粘附分子(CEACAM)家族、唾液酸结合Ig样凝集素(SIGLEC)家族、嗜乳脂蛋白家族、B7家族、CD28家族、含V-set和免疫球蛋白结构域(VSIG)的家族、V-set跨膜结构域(VSTM)家族、主要组织相容性复合物(MHC)家族、信号淋巴细胞活化分子(SLAM)家族、白细胞免疫球蛋白样受体(LIR)、Nectin(Nec)家族、Nectin样(NECL)家族、脊髓灰质炎病毒受体相关(PVR)家族、天然细胞毒性触发受体(NCR)家族、T细胞免疫球蛋白和粘蛋白(TIM)家族或杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)家族。在一些实施方案中，另外的IgSF结构域独立地来源于选自下组的IgSF蛋白，该组由以下各项组成：CD80(B7-1)、CD86(B7-2)、CD274(CD155、B7-H1)、PDCD1LG2(CD155、CD273)、ICOSLG(B7RP1、CD275、ICOSL、B7-H2)、CD276(B7-H3)、VTCN1(B7-H4)、CD28、CTLA4、PDCD1(TIGIT)、ICOS、BTLA(CD272)、CD4、CD8A(CD8-α)、CD8B(CD8-β)、LAG3、HAVCR2(TIM-3)、CEACAM1、TIGIT、PVR(CD155)、PVRL2(CD112)、CD226、CD2、CD160、CD200、CD200R1(CD200R)和NCR3(NKp30)。
表2的第一列提供了该特定IgSF成员的名称，以及任选一些可能同义词的名称。第二列提供了UniProtKB数据库的蛋白质标识符，UniProtKB数据库是经由互联网在uniprot.org，或者在一些情况下经由GenBank登录号可访问的公共可获得的数据库。Universal Protein Resource(UniProt)是蛋白质序列和注释数据的综合资源。UniProt数据库包括UniProt知识库(UniProtKB)。UniProt是欧洲生物信息研究所(EMBL-EBI)、SIB瑞士生物信息研究所和蛋白质信息资源(PIR)之间的合作，并且主要由美国国立卫生研究院(NIH)的资助支持。GenBank是NIH基因序列数据库，是所有公共可获得的DNA序列的注释集合(Nucleic Acids Research，2013Jan；41(D1)：D36-42)。第三列提供了所示IgSF结构域所在的区域。该区域被规定为一个范围，其中结构域包含定义该范围的残基。第3列还表明规定的IgSF区域的IgSF结构域类别。第4列提供了所示另外的结构域所在的区域(信号肽，S；细胞外结构域，E；跨膜结构域，T；细胞质结构域，C)。应当理解，结构域的描述可以根据用于鉴定或分类结构域的方法而变化，并且可以根据不同来源而差异地鉴定。对应于表2中的结构域的残基的描述仅用于举例说明，并且可以是长或短若干个氨基酸(如一个、两个、三个或四个)。第5列表示一些列出的IgSF成员，IgSF成员的一些同源细胞表面结合配偶体。
存在于“堆叠的”免疫调节蛋白构建体中的这种非亲和力修饰或亲和力修饰的IgSF结构域的数目(无论是非野生型组合还是非野生型排列)为至少2、3、4或5，并且在一些实施方案中恰好为2、3、4或5个IgSF结构域(由此确定的亲和力修饰的IgSF结构域的数目忽略其任何非特异性结合部分的序列和/或其基本上免疫失活部分的序列)。
在本文提供的堆叠的免疫调节蛋白的一些实施方案中，IgSF结构域的数目为至少2，其中亲和力修饰的IgSF结构域的数目和非亲和力修饰的IgSF结构域的数目各自独立地为至少：0、1、2、3、4、5或6。因此，亲和力修饰的IgSF结构域的数目和非亲和力修饰的IgSF结构域的数目(亲和力修饰的IgSF结构域：非亲和力修饰的IgSF结构域)可以恰好为或为至少：2：0(亲和力修饰的：野生型)、0：2、2：1、1：2、2：2、2：3、3：2、2：4、4：2、1：1、1：3、3：1、1：4、4：1、1：5或5：1。
在堆叠的免疫调节蛋白的一些实施方案中，非亲和力修饰和/或亲和力修饰的IgSF结构域中的至少两个是相同的IgSF结构域。
在一些实施方案中，本文提供的堆叠的免疫调节蛋白包含来自单个IgSF成员但为非野生型排列(或者“置换”)的至少两个亲和力修饰和/或非亲和力修饰的IgSF结构域。非野生型排列或置换的一个说明性例子是免疫调节蛋白，其包含相对于在野生型CD155中发现的那些IgSF结构域序列的非野生型顺序的亲和力修饰和/或非亲和力修饰的IgSF结构域序列，该野生型CD155的IgSF结构域序列用作本文提供的变体IgSF结构域的来源。因此，在一个例子中，免疫调节蛋白可以包含在跨膜结构域近端的IgV和远端的IgC，虽然是非亲和力修饰和/或亲和力修饰的形式。在本文提供的免疫调节蛋白中，非亲和力修饰和/或亲和力修饰的IgSF结构域的非野生型组合和非野生型排列的存在也在所提供的主题范围内。
在堆叠的免疫调节蛋白的一些实施方案中，非亲和力修饰和/或亲和力修饰的IgSF结构域是不相同的(即，不同的)IgSF结构域。在特异性结合条件下不相同的亲和力修饰的IgSF结构域特异性结合不同的同源结合配偶体，并且无论它们工程化来源的野生型或未修饰的IgSF结构域是否相同，该不相同的亲和力修饰的IgSF结构域是“不相同的”。因此，例如，免疫调节蛋白中的至少两个不相同的IgSF结构域的非野生型组合可以包含至少一个IgSF结构域序列(其来源于且仅来源于一个CD155)和至少一个第二IgSF结构域序列(其来源于且仅来源于非CD155的另一种IgSF家族成员)，其中该免疫调节蛋白的IgSF结构域是非亲和力修饰和/或亲和力修饰的形式。然而，在替代实施方案中，两个不相同的IgSF结构域来源于相同的IgSF结构域序列，但至少一个是亲和力修饰的，使得它们与不同的同源结合配偶体特异性结合。
在一些实施方案中，除了含有变体CD155多肽之外，所提供的免疫调节蛋白还含有至少1、2、3、4、5或6个另外的免疫球蛋白超家族(IgSF)结构域，如表2所示的IgSF家族成员的IgD结构域。在一些实施方案中，所提供的免疫调节蛋白含有至少一个另外的IgSF结构域(例如第二IgSF结构域)。在一些实施方案中，所提供的免疫调节蛋白含有至少两个另外的IgSF结构域(例如第二和第三IgSF结构域)。在一些实施方案中，所提供的免疫调节蛋白含有至少三个另外的IgSF结构域(例如第二、第三和第四)。在一些实施方案中，所提供的免疫调节蛋白含有至少四个另外的IgSF结构域(例如第二、第三、第四和第五)。在一些实施方案中，所提供的免疫调节蛋白含有至少五个另外的IgSF结构域(例如第二、第三、第四、第五和第六)。在一些实施方案中，所提供的免疫调节蛋白含有至少六个另外的IgSF结构域(例如第二、第三、第四、第五、第六和第七)。在一些实施方案中，免疫调节蛋白中的每个IgSF结构域都不同。在一些实施方案中，在免疫调节蛋白中，另外的IgSF结构域中的至少一个与至少一个其它IgSF结构域相同。在一些实施方案中，每个IgSF结构域来自或衍生自不同的IgSF家族成员。在一些实施方案中，IgSF结构域中的至少两个来自或衍生自相同的IgSF家族成员。
在一些实施方案中，另外的IgSF结构域包含IgV结构域或一个或多个IgC(例如IgC2)结构域或IgV结构域的特异性结合片段或一个或多个IgC(例如IgC2)结构域的特异性结合片段。在一些实施方案中，另外的IgSF结构域是或包含全长IgV结构域。在一些实施方案中，另外的IgSF结构域是或包含一个或多个全长IgC(例如IgC2)结构域。在一些实施方案中，另外的IgSF结构域是或包含IgV结构域的特异性结合片段。在一些实施方案中，另外的IgSF结构域是或包含一个或多个IgC(IgC2)结构域的特异性结合片段。在一些实施方案中，免疫调节蛋白含有来自单个(相同)IgSF成员的至少两个另外的IgSF结构域。例如，在一些方面，免疫调节蛋白含有IgSF成员的ECD或其部分，其含有全长IgV结构域和一个或多个全长IgC(例如IgC2)结构域或其特异性结合片段。
在一些实施方案中，所提供的免疫调节蛋白含有至少一个另外的IgSF结构域(例如第二IgSF结构域，或者在一些情况下还含有第三IgSF结构域)，其中至少一个另外的(例如第二或第三IgSF结构域)是野生型或未修饰的IgSF结构域中所示的IgSF结构域或其特异性结合片段(包含在SEQ ID NO：1-27和132所示的氨基酸序列中)。在一些实施方案中，野生型或未修饰的IgSF结构域是IgV结构域或IgC结构域，如IgC1或IgC2结构域。
在一些实施方案中，除了含有变体CD155多肽之外，所提供的免疫调节蛋白还含有至少一个另外的亲和力修饰的IgSF结构域(例如第二亲和力修饰的IgSF结构域，或者在一些情况下还含有第三亲和力修饰的IgSF结构域等等)，其中至少一个另外的IgSF结构域是与野生型或未修饰的IgSF结构域中的IgSF结构域(如表2所示的IgSF家族成员中的IgSF结构域)相比是含有一个或多个氨基酸修饰(例如取代、缺失或突变)的vIgD。在一些实施方案中，另外的(例如第二或第三)亲和力修饰的IgSF结构域包含与野生型或未修饰的IgSF结构域或其特异性结合片段(包含在SEQ ID NO：1-27和132中任一个所示的氨基酸序列中)至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列一致性。在一些实施方案中，野生型或未修饰的IgSF结构域是IgV结构域或IgC结构域，如IgC1或IgC2结构域。。在一些实施方案中，另外的(例如第二或第三)IgSF结构域是亲和力修饰的IgV结构域和/或IgC结构域。在一些实施方案中，一个或多个另外的IgSF结构域是亲和力修饰的IgSF结构域，其含有IgV结构域和/或一个或多个IgC(例如IgC2)结构域，或IgV结构域的特异性结合片段和/或一个或多个IgC(例如IgC2)结构域的特异性结合片段，其中IgV和/或IgC结构域含有一个或多个氨基酸修饰(例如一个或多个取代)。在一些实施方案中，一个或多个另外的亲和力修饰的IgSF结构域含有IgV结构域，该IgV结构域含有一个或多个氨基酸修饰(例如一个或多个取代)。在一些实施方案中，一个或多个另外的亲和力修饰的IgSF结构域包括存在于对应的未修饰的IgSF家族成员的ECD或ECD的一部分中的IgSF结构域，例如全长IgV结构域和一个或多个全长IgC(例如IgC2)或其特异性结合片段，其中IgV和IgC之一或二者含有一个或多个氨基酸修饰(例如一个或多个取代)。
在一些实施方案中，所提供的免疫调节蛋白含有至少一个另外的(例如第二IgSF结构域，或在一些情况下还含有第三IgSF结构域，等等)IgSF结构域，该另外的IgSF结构域是与野生型或未修饰的IgSF结构域的IgSF结构域(例如IgV)相比含有一个或多个氨基酸取代的vIgD并且不是CD155。
在一些实施方案中，一个或多个另外的IgSF结构域(例如第二或第三IgSF结构域)是本身也与抑制型受体结合的另一个IgSF家族成员的IgSF结构域(例如IgV)。在一些方面，一个或多个另外的IgSF结构域(例如第二或第三IgSF结构域)是亲和力修饰的IgSF结构域，其是与抑制型受体结合的IgSF家族成员的变体IgSF结构域(vIgD)，其在此类IgSF结构域(例如IgV)中含有一个或多个氨基酸取代，其中，在一些情况下，一个或多个氨基酸修饰导致与该抑制型受体的结合增加。在一些实施方案中，vIgD在与抑制型受体结合的IgSF家族成员的野生型或未修饰的IgSF结构域(例如IgV)中含有一个或多个氨基酸修饰(例如取代、缺失或插入)。除了TIGIT之外，这类抑制型受体的实例为CD112R CTLA-4、LAG3、PD-1、TIM-3或BTLA。在一些实施方案中，一个或多个另外的IgSF结构域来自选自CD112、PD-L1、PD-L2、CD80或CEACAM1的IgSF家族成员。因此，在一些方面，提供了多靶标检查点拮抗剂，其靶向或阻断多于一种抑制型受体的活性。
在一些实施方案中，提供了免疫调节蛋白，其含有任何一种变体CD155多肽和抑制型受体(例如野生型或未修饰的抑制型受体)的一个或多个IgSF结构域。在一些实施方案中，提供了免疫调节蛋白，其含有任何一种变体CD155多肽和CD80(例如野生型或未修饰的CD80)的一个或多个IgSF结构域(例如SEQ ID NO：969或1043所示的IgV结构域或SEQ IDNO：28或其部分所示的ECD或其部分(含有IgV和IgC结构域或其特异性结合片段))。在一些实施方案中，提供了免疫调节蛋白，其含有任何一种变体CD155多肽和PD-L1(例如野生型或未修饰的PD-L1)的一个或多个IgSF结构域(例如SEQ ID NO：469或665所示的IgV结构域或SEQ ID NO：30或1756或其部分所示的ECD或其部分(含有IgV和IgC结构域或其特异性结合片段))。在一些实施方案中，提供了免疫调节蛋白，其含有任何一种变体CD155多肽和PD-L2(例如野生型或未修饰的PD-L1)的一个或多个IgSF结构域(例如SEQ ID NO：666或726所示的IgV结构域或SEQ ID NO：31或其部分所示的ECD或其部分(含有IgV和IgC结构域或其特异性结合片段))。在一些实施方案中，提供了免疫调节蛋白，其含有任何一种变体CD155多肽和CD112(例如野生型或未修饰的PD-L1)的一个或多个IgSF结构域(例如SEQ ID NO：1272或1367所示的IgV结构域或SEQ ID NO：48或其部分所示的ECD或其部分(含有IgV和IgC结构域或其特异性结合片段))。
在一些实施方案中，提供了免疫球蛋白，其含有一个或多个另外的IgSF结构域(例如第二或第三IgSF)，该另外的IgSF结构域是与抑制型受体结合的IgSF家族成员的vIgD，其中IgSF结构域(例如IgV)中的一个或多个氨基酸修饰导致与未修饰的IgSF结构域相比vIgD或含有该vIgD的融合物或免疫调节蛋白对于其抑制型受体同源结合配偶体的增加的结合亲和力，例如结合亲和力增加大于1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍或50倍。在一些实施方案中，IgSF结构域(例如IgV)中的一个或多个氨基酸修饰导致与未修饰的IgSF结构域相比vIgD或含有该vIgD的融合物或免疫调节蛋白对于其抑制型受体的增加的选择性。在一些实施方案中，增加的选择性为，相对于未修饰的IgSF对于该抑制型受体相对于另一同源结合配偶体(例如不是抑制型受体的同源结合配偶体)的结合比率，vIgD对于该抑制型受体相对于该另一同源结合配偶体的结合的更高比率。在一些实施方案中，该比率大了至少或至少约1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍或50倍。
在一些实施方案中，至少一种另外的(例如第二或第三)vIgD是变体CD80多肽的IgSF结构域(例如IgV)，该变体CD80多肽与未修饰的或野生型CD80相比在IgSF结构域(例如IgV)中含有一个或多个氨基酸修饰(例如取代、缺失或插入)，在一些方面这导致与抑制型受体CTLA-4的结合增加。表3中示出了变体CD80多肽的IgSF结构域(例如IgV或含有IgV和IgC的ECD)中的示例性的氨基酸修饰(例如取代、缺失或插入)。在一些实施方案中，提供了免疫修饰蛋白，其含有任何一种所提供的变体CD155多肽和含有IgV结构域的变体CD80多肽，该IgV结构域包含表3中所示的任何氨基酸修饰，例如SEQ ID NO：969-1002、1004-1042、1044-1076、1078-1116中的任一个所示的IgV结构域或与SEQ ID NO：969-1002、1004-1042、1044-1076、1078-1116中的任一个具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％一致性并且含有一个或多个氨基酸修饰的IgV结构域。在一些实施方案中，提供了免疫调节蛋白，其含有任何一种所提供的变体CD155多肽和含有含有IgV和/或IgC结构域的ECD或其部分的变体CD80多肽，该ECD或其部分中含有表3中所示的任何氨基酸修饰，例如SEQ ID NO：897-928、930-968中的任一个所示的ECD或与SEQID NO：897-928、930-968中的任一个具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％一致性并且含有一个或多个氨基酸修饰的ECD。
在一些实施方案中，至少一个另外的(例如第二或第三)vIgD是变体PD-L1多肽的IgSF结构域(例如IgV)，该变体PD-L1多肽在PD-L1或PD-L2的IgSF结构域(例如IgV)中含有一个或多个氨基酸修饰(例如取代、缺失或插入)，PD-L1和PD-L2是与抑制型受体PD-1结合的IgSF家族成员。在一些实施方案中，至少一个另外的(例如第二或第三)vIgD在CD112的IgSF结构域(例如IgV)中含有一个或多个氨基酸修饰(例如取代、缺失或插入)，CD112是与抑制型受体CD112R结合的IgSF家族成员。在一些实施方案中，至少一个另外的(例如第二或第三)vIgD与未修饰的或野生型的PD-L1相比，在IgSF结构域(例如IgV或ECD)中含有一个或多个氨基酸修饰(例如取代、缺失或插入)，这在一些方面中导致与抑制型受体PD-1的结合增加。表4中示出了变体PD-L1多肽的IgSF结构域(例如IgV或含有IgV和IgC的ECD)中的示例性的氨基酸修饰(例如取代、缺失或插入)。在一些实施方案中，提供了免疫调节蛋白，其含有任何一种所提供的变体CD155多肽和含有IgV结构域的变体PD-L1多肽，该IgV结构域包括表4中所示的任何氨基酸修饰，例如SEQ ID NO：535-664、1754、1755、1936-1965中的任一个所示的IgV结构域或与SEQ ID NO：535-664、1754、1755、1936-1965中的任一个具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％一致性并且含有一个或多个氨基酸修饰的IgV结构域。在一些实施方案中，提供了免疫调节蛋白，其含有任何一种所提供的变体CD155多肽和含有含有IgV和/或IgC结构域的ECD或其部分的变体PD-L1多肽，该ECD或其部分中含有表4中所示的任何氨基酸修饰，例如SEQ ID NO：470-534、1753、1757-1935、1966-2031中的任一个所示的ECD或与SEQ ID NO：470-534、1753、1757-1935、1966-2031中的任一个具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％一致性并且含有一个或多个氨基酸修饰的ECD。
在一些实施方案中，至少一种另外的(例如第二或第三)vIgD是变体PD-L2多肽的IgSF结构域(例如IgV)，该变体PD-L2多肽与未修饰的或野生型PD-L2相比在IgSF结构域(例如IgV)中含有一个或多个氨基酸修饰(例如取代、缺失或插入)，这在一些方面中导致与抑制型受体PD-1的结合增加。表5中示出了变体PD-L2多肽的IgSF结构域(例如IgV或含有IgV和IgC的ECD)中的示例性的氨基酸修饰(例如取代、缺失或插入)。在一些实施方案中，提供了免疫调节蛋白，其含有任何一种所提供的变体CD155多肽和含有IgV结构域的变体PD-L2多肽，该IgV结构域包括表5中所示的任何氨基酸修饰，例如SEQ ID NO：744-794、796-870、872-895中的任一个所示的IgV结构域或与SEQ ID NO：744-794、796-870、872-895中的任一个具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％一致性并且含有一个或多个氨基酸修饰的IgV结构域。在一些实施方案中，提供了免疫调节蛋白，其含有任何一种所提供的变体CD155多肽和含有含有IgV和/或IgC结构域的ECD或其部分的变体PD-L2多肽，该ECD或其部分中含有表5中所示的任何氨基酸修饰，例如SEQ ID NO：667-717、719-743中的任一个所示的ECD或与SEQ ID NO：667-717、719-743中的任一个具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％一致性并且含有一个或多个氨基酸修饰的ECD。
在一些实施方案中，至少一种另外的(例如第二或第三)vIgD是变体CD112多肽的IgSF结构域(例如IgV)，该变体CD112多肽与未修饰的或野生型CD112相比在IgSF结构域(例如IgV)中含有一个或多个氨基酸修饰(例如取代、缺失或插入)，这在一些方面中导致与抑制型受体TIGIT的结合增加。表8中示出了变体CD112多肽的IgSF结构域(例如IgV或含有IgV和IgC的ECD)中的示例性的氨基酸修饰(例如取代、缺失或插入)。在一些实施方案中，提供了免疫调节蛋白，其含有任何一种所提供的变体CD155多肽和含有IgV结构域的变体CD112多肽，该IgV结构域包括表8中所示的任何氨基酸修饰，例如SEQ ID NO：1320-1366、1368-1414、1497-1537、1586-1609中的任一个所示的IgV结构域或与SEQ ID NO：1320-1366、1368-1414、1497-1537、1586-1609中的任一个具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％一致性并且含有一个或多个氨基酸修饰的IgV结构域。在一些实施方案中，提供了免疫调节蛋白，其含有任何一种所提供的变体CD155多肽和含有含有IgV和/或IgC结构域的ECD或其部分的变体CD112多肽，该ECD或其部分中含有表8中所示的任何氨基酸修饰，例如SEQ ID NO：1273-1319、1415-1455、1538-1561中的任一个所示的ECD或与SEQ ID NO：1273-1319、1415-1455、1538-1561中的任一个具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％一致性并且含有一个或多个氨基酸修饰的ECD。
在一些实施方案中，一个或多个另外的IgSF结构域(例如第二或第三IgSF结构域)是结合或识别肿瘤抗原的另一IgSF家族成员的IgSF结构域(例如IgV)。在这类实施方案中，IgSF家族成员充当肿瘤定位部分，从而使CD155的vIgD靠近肿瘤微环境中的肿瘤细胞。在一些实施方案中，另外的IgSF结构域(例如第二或第三IgSF结构域)是NKp30的IgSF结构域，NKp30结合或识别肿瘤细胞上表达的B7-H6。在一些实施方案中，至少一个另外的(例如第三或第三)IgSF结构域(例如NKp30)是含有一个或多个氨基酸修饰(例如取代、缺失或插入)的亲和力修饰的IgSF结构域或vIgD。在一些实施方案中，与未修饰的IgSF结构域(例如NPp30)相比，一个或多个氨基酸修饰增加与B7-H6的结合亲和力和/或选择性，例如增加至少或至少约1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍或50倍。表6中示出了变体NKp30多肽的IgSF结构域(例如IgC样ECD或全ECD)中的示例性的氨基酸修饰(例如取代、缺失或插入)。其中示例性多肽是NKp30变体，其含有参照NKp30细胞外结构域中的位置对应于SEQ ID NO：54所示的位置的突变L30V/A60V/S64P/S86G。在一些实施方案中，提供了免疫调节蛋白，其含有任何一种所提供的变体CD155多肽和含有IgC样结构域的变体NKp30多肽，该IgC样结构域含有表6中所示的任何氨基酸修饰，例如SEQ ID NO：1162-1166中的任一个所示的IgC样结构域或与SEQ ID NO：1162-1166中的任一个具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％一致性并且含有一个或多个氨基酸修饰的IgC样结构域。在一些实施方案中，提供了免疫调节蛋白，其含有任何一种所提供的变体CD155多肽和含有含有一个或多个IgSF结构域的ECD或其部分的变体NKp30多肽，该ECD或其部分含有表6中所示的任何氨基酸修饰，例如SEQ ID NO：1156-1160中的任一个所示的ECD或与SEQ ID NO：1156-1160中的任一个具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％一致性并且含有一个或多个氨基酸修饰的ECD。
在一些实施方案中，至少一种另外的(例如第二或第三)vIgD是变体CD86多肽的IgSF结构域(例如IgV)，该变体CD86多肽与未修饰的或野生型CD86相比在IgSF结构域(例如IgV)中含有一个或多个氨基酸修饰(例如取代、缺失或插入)，这在一些方面中导致与其同源结合配偶体的结合增加。表7中示出了变体CD86多肽的IgSF结构域(例如IgV或含有IgV和IgC的ECD)中的示例性的氨基酸修饰(例如取代、缺失或插入)。其中示例性多肽包括CD86变体，其含有参照CD86细胞外结构域中的位置对应于SEQ ID NO：54所示的位置的突变Q35H/H90L/Q102H。在一些实施方案中，提供了免疫调节蛋白，其含有任何一种所提供的变体CD155多肽和含有IgV结构域的变体CD86多肽，该IgV结构域含有表7中所示的任何氨基酸修饰，例如SEQ ID NO：1174-1177中的任一个所示的IgV结构域或与SEQ ID NO：1174-1177中的任一个具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％一致性并且含有一个或多个氨基酸修饰的IgV结构域。在一些实施方案中，提供了免疫调节蛋白，其含有任何一种所提供的变体CD155多肽和含有含有IgV和/或IgC结构域的ECD或其部分的变体CD86多肽，该ECD或其部分含有表7中所示的任何氨基酸修饰，例如SEQ ID NO：1169-1172中的任一个所示的ECD或与SEQ ID NO：1169-1172中的任一个具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％一致性并且含有一个或多个氨基酸修饰的ECD。
表3-8提供了可用于本文提供的堆叠构建体中的含有一个或多个亲和力修饰的IgSF结构域的示例性多肽。
在一些实施方案中，该两个或更多个IgSF结构域是共价或非共价连接的，其包括CD155的vIgD和来自另一个IgSF家族成员的一个或多个另外的IgSF结构域(例如第二或第三变体IgSF结构域)。堆叠的免疫调节蛋白多肽链中的多个非亲和力修饰和/或亲和力修饰的IgSF结构域不需要彼此直接共价连接。在一些实施方案中，该两个或更多个IgSF结构域直接或间接地如经由接头连接。在一些实施方案中，一个或多个氨基酸残基的间隔跨度间接地将IgSF结构域彼此共价键合。连接可以是经由N-末端到C-末端残基。在一些实施方案中，可以经由不位于一个或多个IgSF结构域的N-末端或C-末端的氨基酸残基的侧链进行连接。因此，可以经由末端或内部氨基酸残基或其组合进行连接。
在一些实施方案中，免疫调节蛋白含有至少两个IgSF结构域，各自直接连接或经由接头连接。在一些实施方案中，免疫调节蛋白含有至少三个免疫调节蛋白，各自直接连接或经由接头连接。图5A和5B示出了多种构型。
在一些实施方案中，一个或多个“肽接头”连接CD155的vIgD和一个或多个另外的IgSF结构域(例如第二或第三变体IgSF结构域)。在一些实施方案中，肽接头长度可以是单个氨基酸残基或更长。在一些实施方案中，肽接头的长度为至少一个氨基酸残基但不超过20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸残基。在一些实施方案中，接头是(以单字母氨基酸代码的形式)：GGGGS(“4GS”；SEQ ID NO：1752)或4GS接头的多聚体，如2、3、4或5个4GS接头的重复序列。在一些实施方案中，肽接头是(GGGGS)2SEQ IDNO：1182或(GGGGS)3SEQ ID NO：1181。在一些实施方案中，接头还可以单独包含一系列丙氨酸残基或者还包含另一个肽接头(如4GS接头或其多聚体)。在一些实施方案中，每个系列中丙氨酸残基的数目是2、3、4、5或6个丙氨酸。
在一些实施方案中，非亲和力修饰和/或亲和力修饰的IgSF结构域是通过在第二非亲和力修饰和/或亲和力修饰的IgSF结构域的N-末端和/或C-末端插入的“野生型肽接头”连接。这些接头也称为前导序列(非亲和力修饰或亲和力修饰的IgSF结构域的N-末端)或尾随序列(非亲和力修饰或亲和力修饰的IgSF结构域的C-末端)，以及存在于野生型蛋白质中的这样的序列-其紧接着跨于IgSF的Ig折叠的结构预测的外侧。在一些实施方案中，“野生型接头”是在野生型蛋白质的氨基酸序列中存在于信号序列之后但在IgSF结构域(如定义的IgV结构域)之前的氨基酸序列。在一些实施方案中，“野生型”接头是在野生型蛋白质的氨基酸序列中紧接在IgSF结构域之后(如紧接在定义的IgV结构域之后)但在IgC结构域之前存在的氨基酸序列。这些接头序列可有助于一个或多个邻近IgSF结构域的适当折叠和功能。在一些实施方案中，存在在第一IgSF结构域的N-末端插入的前导肽接头和/或在第一非亲和力修饰和/或亲和力修饰的IgSF结构域的C-末端插入的尾随序列。在一些实施方案中，存在在第二IgSF结构域的N-末端插入的第二前导肽接头和/或在第二非亲和力修饰和/或亲和力修饰的IgSF结构域的C-末端插入的第二尾随序列。当第一和第二非亲和力修饰和/或亲和力修饰的IgSF结构域来源于相同的亲本蛋白质并以相同方向连接时，第一与第二非亲和力修饰和/或亲和力修饰的IgSF结构域之间的野生型肽接头不重复。例如，当第一尾随野生型肽接头和第二前导野生型肽接头相同时，II型免疫调节蛋白不包含第一尾随野生型肽接头或第二前导野生型肽接头。
在一些实施方案中，II型免疫调节蛋白包含在第一非亲和力修饰和/或亲和力修饰的IgSF结构域的N-末端插入的第一前导野生型肽接头，其中该第一前导野生型肽接头包含来自野生型蛋白质中的间插序列的至少5个(如至少约6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个中的任何一个)连续氨基酸，在该野生型蛋白质中第一非亲和力修饰和/或亲和力修饰的IgSF结构域来源于亲本IgSF结构域与紧接在前的结构域(如信号肽或IgSF结构域)之间。在一些实施方案中，第一前导野生型肽接头包含野生型蛋白质中的完整间插序列，在该野生型蛋白质中第一非亲和力修饰和/或亲和力修饰的IgSF结构域来源于亲本IgSF结构域与紧接在前的结构域(如信号肽或IgSF结构域)之间。
在一些实施方案中，II型免疫调节蛋白还包含在第一非亲和力修饰和/或亲和力修饰的IgSF结构域的C-末端插入的第一尾随野生型肽接头，其中该第一尾随野生型肽接头包含来自野生型蛋白质中的间插序列的至少5个(如至少约6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个中的任何一个)连续氨基酸，在该野生型蛋白质中第一非亲和力修饰和/或亲和力修饰的IgSF结构域来源于亲本IgSF结构域与紧随其后的结构域(如IgSF结构域或跨膜结构域)之间。在一些实施方案中，第一尾随野生型肽接头包含野生型蛋白质中的完整间插序列，在该野生型蛋白质中第一非亲和力修饰和/或亲和力修饰的IgSF结构域来源于亲本IgSF结构域与紧随其后的结构域(如IgSF结构域或跨膜结构域)之间。
在一些实施方案中，II型免疫调节蛋白还包含在第二非亲和力修饰和/或亲和力修饰的IgSF结构域的N-末端插入的第二前导野生型肽接头，其中该第二前导野生型肽接头包含来自野生型蛋白质中的间插序列的至少5个(如至少约6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多中的任何一个)连续氨基酸，在该野生型蛋白质中第二非亲和力修饰和/或亲和力修饰的IgSF结构域来源于亲本IgSF结构域与紧接在前的结构域(如信号肽或IgSF结构域)之间。在一些实施方案中，第二前导野生型肽接头包含野生型蛋白质中的完整间插序列，在该野生型蛋白质中第二非亲和力修饰和/或亲和力修饰的IgSF结构域来源于亲本IgSF结构域与紧接在前的结构域(如信号肽或IgSF结构域)之间。
在一些实施方案中，II型免疫调节蛋白还包含在第二非亲和力修饰和/或亲和力修饰的IgSF结构域的C-末端插入的第二尾随野生型肽接头，其中该第二尾随野生型肽接头包含来自野生型蛋白质中的间插序列的至少5个(如至少约6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个中的任何一个)连续氨基酸，在该野生型蛋白质中第二非亲和力修饰和/或亲和力修饰的IgSF结构域来源于亲本IgSF结构域与紧随其后的结构域(如IgSF结构域或跨膜结构域)之间。在一些实施方案中，第二尾随野生型肽接头包含野生型蛋白质中的完整间插序列，在该野生型蛋白质中第二非亲和力修饰和/或亲和力修饰的IgSF结构域来源于亲本IgSF结构域与紧随其后的结构域(如IgSF结构域或跨膜结构域)之间。
在一些实施方案中，该两个或更多个IgSF结构域与Fc连接或附接以形成Fc融合物，该两个或更多个IgSF结构域包括CD155的vIgD和来自另一个IgSF家族成员的一个或多个另外的IgSF结构域(例如第二和/或第三变体IgSF结构域)，在一些方面，在细胞中表达后，Fc融合物可以产生二聚体多结构域堆叠免疫调节蛋白。因此，还提供了二聚体多结构域堆叠免疫调节蛋白。
在一些实施方案中，变体CD155多肽和一个或多个另外的IgSF结构域直接或间接地单独与Fc区域的N-或C-末端连接。在一些实施方案中，变体CD155多肽和该一个或多个另外的IgSF结构域之一直接或间接地连接，并且变体CD155之一和该一个或多个另外的IgSF结构域之一也直接或间接地与Fc区域的N-或C-末端连接。在一些实施方案中，Fc区域的N-或C-末端与变体CD155多肽或该一个或多个另外的IgSF结构域连接，并且Fc区域的其它N-或C-末端与其它CD155变体或该一个或多个另外的IgSF结构域的另一个连接。在一些实施方案中，与Fc的连接是经由肽接头，例如如上所述的肽接头。在一些实施方案中，变体CD155与第二IgSF结构域之间的连接是经由肽接头，例如如上所述的肽接头。在一些实施方案中，变体CD155与该一个或多个另外的IgSF结构域之间的连接是经由肽接头，例如如上所述的肽接头。在一些实施方案中，CD155的vIgD、一个或多个另外的IgSF结构域和Fc结构域可以以如图5A和5B所示的多种构型中的任何一种连接在一起。在实施例中描述了示例性构型。
在一些实施方案中，堆叠的免疫调节蛋白是由两个免疫调节Fc融合多肽形成的二聚体。还提供了编码任何堆叠的免疫调节蛋白的核酸分子。在一些实施方案中，二聚体多结构域堆叠免疫调节蛋白可以通过堆叠免疫调节性Fc区域多肽的表达或在一些情况下共表达在细胞中产生，如上文根据产生二聚体Fc融合蛋白所述。
在一些实施方案中，二聚体多结构域堆叠免疫调节蛋白对于每个Fc亚基是二价的，对于每个亚基是单价的，或对于一个亚基是二价的而对于另一个亚基是四价的。
在一些实施方案中，二聚体多结构域堆叠免疫调节蛋白是同型二聚体多结构域堆叠Fc蛋白。在一些实施方案中，二聚体多结构域堆叠免疫调节蛋白包含第一堆叠免疫调节性Fc融合多肽和第二堆叠免疫调节性Fc融合多肽，其中该第一多肽和第二多肽相同。在一些实施方案中，多结构域堆叠分子含有第一Fc融合多肽和第二Fc融合多肽，该第一Fc融合多肽含有变体CD155和第二IgSF结构域，该第二Fc融合多肽含有变体CD155和第二IgSF结构域。在一些实施方案中，多结构域堆叠分子含有第一Fc融合多肽和第二Fc融合多肽，该第一Fc融合多肽含有变体CD155、第二IgSF结构域和第三IgSF结构域，该第二Fc融合多肽含有变体CD155、第二IgSF结构域和第三IgSF结构域。在一些实施方案中，第一和/或第二融合多肽的Fc部分可以是如上所述的任何Fc。在一些实施方案中，第一和/或第二融合多肽的Fc部分或区域是相同的。
在一些实施方案中，多结构域堆叠分子是异二聚体，其包含两种不同的Fc融合多肽(例如第一和第二Fc多肽)，其中至少一种是含有至少一种变体CD155多肽的Fc融合多肽，和/或至少一种是含有第二IgSF结构域(例如第二变体IgSF结构域)的Fc多肽。在一些实施方案中，第一或第二Fc融合多肽还含有第三IgSF结构域(例如第三变体IgSF结构域)。在一些实施方案中，多结构域堆叠分子含有含有变体CD155的第一Fc融合多肽和含有第二IgSF结构域的第二Fc融合多肽，其中，在一些情况下，第一或第二Fc融合多肽还含有第三IgSF结构域。在一些实施方案中，多结构域堆叠分子含有第一Fc融合多肽和第二Fc融合多肽，该第一Fc融合多肽含有变体CD155、第二IgSF结构域和在一些情况下第三IgSF结构域，该第二Fc融合多肽不与变体CD155多肽或另外的IgSF结构域连接。在一些实施方案中，第一和第二融合多肽的Fc部分或区域是相同的。在一些实施方案中，第一和第二融合多肽的Fc部分或区域是不同的。
在一些实施方案中，多结构域堆叠分子包含含有1、2、3、4或更多个变体CD155多肽和1、2、3、4或更多个另外的IgSF结构域的第一融合Fc多肽，其中第一堆叠Fc融合多肽中IgSF结构域的总数大于2、3、4、5、6或更多个。在这样的实施方案的一个例子中，第二堆叠Fc融合多肽含有1、2、3、4或更多个变体CD155多肽和1、2、3、4或更多个另外的IgSF结构域，其中第二堆叠Fc融合多肽中IgSF结构域的总数大于2、3、4、5、6或更多个。在这样的实施方案的另一个例子中，第二Fc多肽不与变体CD155多肽或另外的IgSF结构域连接。
在一些实施方案中，异二聚体堆叠分子含有第一堆叠免疫调节性Fc融合多肽和第二堆叠免疫调节性Fc融合多肽，其中该第一多肽和第二多肽不同。在一些实施方案中，异二聚体堆叠分子包含含有Fc区域和第一变体CD155多肽和/或第二IgSF结构域(例如第二变体IgSF结构域)的第一Fc多肽融合物，以及含有Fc区域和其他第一变体CD155多肽或第二IgSF结构域的第二Fc多肽融合物。在一些实施方案中，异二聚体堆叠分子包含含有Fc区域和第一变体CD155多肽和/或第二IgSF结构域(例如第二变体IgSF结构域)的第一Fc多肽融合物和含有Fc区域和第一变体CD155多肽和第二IgSF结构域(例如第二变体IgSF结构域)二者但是与第一Fc区域的方向或构型不同的第二Fc多肽融合物。在一些实施方案中，第一和/或第二Fc融合多肽还含有第三IgSF结构域(例如第三变体IgSF结构域)。
在一些实施方案中，第一和第二堆叠的免疫调节性Fc融合多肽中的一种或两种的Fc结构域包含修饰(例如取代)，使得Fc分子的界面被修饰为帮助和/或促进异二聚化。在一些实施方案中，修饰包括将突起(隆突)引入第一Fc多肽中并将腔(穴)引入第二Fc多肽中，使得突起可定位在腔中以促进第一和第二含Fc多肽的复合。靶向用于替代和/或修饰以在多肽中产生突起或腔的氨基酸通常是与第二多肽的界面中的一个或多个氨基酸相互作用或接触的界面氨基酸。
在一些实施方案中，对于其中Fc序列是该序列的N-末端部分的构建体，在Fc序列之前加入一个氨基酸序列。在一些情况下，对于其中Fc序列是该序列的N-末端部分的构建体，在Fc序列之前加入氨基酸序列HMSSVSAQ(SEQ ID NO：1027)。在一些实施方案中，异二聚体堆叠分子包含含有Fc区域(隆突)和第一变体CD155多肽和/或第二IgSF结构域(例如第二变体IgSF结构域)的第一Fc多肽融合物以及含有Fc区域(穴)的第二Fc多肽融合物以及在第一和第二多肽融合物的两个Fc区域之前紧接加入的填充序列HMSSVSAQ(SEQ ID NO：1027)。
在一些实施方案中，经修饰以含有突起(穴)氨基酸的第一多肽包括用具有至少一个侧链的氨基酸替代天然或原始氨基酸，该至少一个侧链从第一多肽的界面突出，因此可位于第二多肽的相邻界面中的补偿腔(穴)中。最常见的是，替代氨基酸是具有比原始氨基酸残基更大的侧链体积的氨基酸。本领域技术人员了解如何测定和/或评估氨基酸残基的性质以鉴定产生突起的理想的替代氨基酸。在一些实施方案中，用于形成突起的替代残基是天然存在的氨基酸残基，并且包括例如精氨酸(R)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)或色氨酸(W)。在一些例子中，经鉴定用于替代的原始残基是具有小侧链的氨基酸残基，例如丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸或缬氨酸。
在一些实施方案中，经修饰以含有腔(穴)的第二多肽是包括用具有至少一个侧链的氨基酸替代天然或原始氨基酸的多肽，该至少一个侧链从第二多肽的界面凹进，因此能够从第一多肽的界面容纳相应的突起。最常见的是，替代氨基酸是具有比原始氨基酸残基更小的侧链体积的氨基酸。本领域技术人员了解如何测定和/或评估氨基酸残基的性质以鉴定对于形成腔而言理想的替代残基。通常，用于形成腔的替代残基是天然存在的氨基酸，并且包括例如丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)和缬氨酸(V)。在一些例子中，经鉴定用于替代的原始氨基酸是具有大侧链的氨基酸，例如酪氨酸、精氨酸、苯丙氨酸或色氨酸。
例如，人IgG1的CH3界面包括位于四个反平行β链上的每个结构域上的十六个残基，该每个结构域从每个表面掩埋(参见例如，Deisenhofer等人(1981)Biochemistry，20：2361-2370；Miller等人，(1990)J Mol.Biol.，216，965-973；Ridgway等人，(1996)Prot.Engin.，9：617-621；美国专利号5,731,168)。例如，用于产生突起或腔而对CH3结构域的修饰描述于例如美国专利号5,731,168；国际专利申请WO 98/50431和WO2005/063816；和Ridgway等人，(1996)Prot.Engin.，9：617-621中。在一些例子中，用于产生突起或腔而对CH3结构域的修饰通常靶向位于两个中心反平行β链上的残基。目的是最小化以下风险，即产生的突起可通过突出到周围溶剂中而被容纳而不是由配偶体CH3结构域中的补偿腔容纳。
在一些实施方案中，异二聚体分子含有“隆突链”的CH3结构域中的T366W突变，以及“穴链”的CH3结构域中的T366S、L368A、Y407V突变。在一些情况下，例如通过将Y349C突变引入“隆突”或“穴”链的CH3结构域中，以及将E356C突变或S354C突变引入另一条链的CH3结构域中，还可以使用CH3结构域之间的另外的链间二硫桥(Merchant，A.M.，等人，NatureBiotech.16(1998)677-681)。在一些实施方案中，异二聚体分子含有两个CH3结构域之一中的S354C、T366W突变，以及两个CH3结构域中的另一个中的Y349C、T366S、L368A、Y407V突变。在一些实施方案中，异二聚体分子包含两个CH3结构域之一中的E356C、T366W突变，以及两个CH3结构域中的另一个中的Y349C、T366S、L368A、Y407V突变。在一些实施方案中，异二聚体分子包含两个CH3结构域之一中的Y349C、T366W突变以及两个CH3结构域中的另一个中的E356C、T366S、L368A、Y407V突变。在一些实施方案中，异二聚体分子包含两个CH3结构域之一中的Y349C、T366W突变，以及两个CH3结构域中的另一个中的S354C、T366S、L368A、Y407V突变。其他隆突入穴技术的例子是本领域已知的，例如，如EP 1 870 459 A1所述。
在一些实施方案中，异二聚体分子的Fc区域另外可含有一种或多种其他Fc突变，如上文所述的任何Fc突变。在一些实施方案中，异二聚体分子含有Fc区域，其具有降低效应子功能的突变。
在一些实施方案中，含有CH3突起(隆突)/腔(穴)修饰的Fc变体可以在任何地方与堆叠的免疫调节多肽接合，但通常经由其N-或C-末端与第一和/或第二堆叠的免疫调节多肽的N-或C-末端接合，例如以形成融合多肽。连接可以是直接的或间接经由接头。通常，通过含有一个或多个CH3突起修饰的Fc变体连接的第一堆叠的免疫调节多肽与含有一个或多个CH3腔修饰的Fc变体连接的第二堆叠的免疫调节多肽的共表达来产生隆突和穴分子。
本文提供了从堆叠免疫调节Fc融合多肽产生的异二聚体多结构域堆叠分子，该堆叠免疫调节Fc融合多肽含有变体CD155多肽的IgSF结构域(例如IgV结构域)和变体CD112多肽的第二IgSF结构域(例如IgV)。在一些实施方案中，该多结构域堆叠分子的第一和第二免疫调节Fc融合多肽具有SEQ ID NO：1260、1261、1262、1263、1264或1265中的任一个所示的序列或与SEQ ID NO：1260、1261、1262、1263、1264或1265中的任一个具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列一致性的氨基酸序列，并且在变体CD112和/或CD155 IgSF结构域中含有一个或多个氨基酸修饰。在一些实施方案中，得到的多结构域堆叠分子与TIGIT和CD112R二者结合。在一些方面，与相应的未修饰的或野生型CD112或CD155的IgSF结构域与TIGIT的结合相比，与TIGIT的结合具有相同或相似的程度，或者在一些情况下有所增加。在一些方面，与相应的未修饰的或野生型CD112的IgSF结构域与CD112R的结合相比，与CD112R的结合具有相同或相似的程度，或者在一些情况下有所增加。在一些实施方案中，与TIGIT或CD112R的结合是非堆叠形式的变体CD112 IgSF-Fc与TIGIT或CD112R的结合的至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大。在一些实施方案中，与TIGIT的结合是非堆叠形式的变体CD155 IgSF-Fc与TIGIT的结合的至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大。在一些实施方案中，得到的多结构域堆叠分子与非堆叠变体CD112IgSF-Fc和/或变体CD155-IgSF-Fc相比增加了T细胞免疫应答，例如在报告基因测定中所确定的。在一些实施方案中，该增加大于1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、2.0倍、3.0倍、4.0倍、5.0倍或更多。
本文提供了从堆叠免疫调节Fc融合多肽产生的异二聚体多结构域堆叠分子，该堆叠免疫调节Fc融合多肽含有变体CD155多肽的IgSF结构域(例如IgV结构域)和变体PD-L1多肽的第二IgSF结构域(例如IgV)。在一些实施方案中，该多结构域堆叠分子的第一和第二免疫调节Fc融合多肽具有SEQ ID NO：1254、1255、1256、1257、1258或1259中的任一个所示的序列或与SEQ ID NO：1254、1255、1256、1257、1258或1259中的任一个具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列一致性的氨基酸序列，并且在变体PD-L1和/或CD155 IgSF结构域中含有一个或多个氨基酸修饰。在一些实施方案中，得到的多结构域堆叠分子与TIGIT和PD-1二者结合。在一些方面，与相应的未修饰的或野生型CD155的IgSF结构域与TIGIT的结合相比，与TIGIT的结合具有相同或相似的程度，或者在一些情况下有所增加。在一些方面，与相应的未修饰的或野生型PD-L1的IgSF结构域与PD-1的结合相比，与PD-1的结合具有相同或相似的程度，或者在一些情况下有所增加。在一些实施方案中，与TIGIT或PD-1的结合是非堆叠形式的变体CD155IgSF-Fc与TIGIT或PD-1的结合的至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大。在一些实施方案中，与TIGIT的结合是非堆叠形式的变体CD155 IgSF-Fc与TIGIT的结合的至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大。在一些实施方案中，得到的多结构域堆叠分子与非堆叠变体PD-L1 IgSF-Fc和/或变体CD155-IgSF-Fc相比增加了T细胞免疫应答，例如在报告基因测定中所确定的。在一些实施方案中，该增加大于1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、2.0倍、3.0倍、4.0倍、5.0倍或更多。
本文提供了从堆叠免疫调节Fc融合多肽产生的异二聚体多结构域堆叠分子，该堆叠免疫调节Fc融合多肽含有变体CD155多肽的IgSF结构域(例如IgV结构域)和变体PD-L2多肽的第二IgSF结构域(例如IgV)。在一些实施方案中，该多结构域堆叠分子的第一和第二免疫调节Fc融合多肽具有SEQ ID NO：1121、1122、1123、1124、1125或1126中的任一个所示的序列或与SEQ ID NO：1121、1122、1123、1124、1125或1126中的任一个具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列一致性的氨基酸序列，并且在变体PD-L2和/或CD155 IgSF结构域中含有一个或多个氨基酸修饰。在一些实施方案中，得到的多结构域堆叠分子与TIGIT和PD-1二者结合。在一些方面，与相应的未修饰的或野生型CD155的IgSF结构域与TIGIT的结合相比，与TIGIT的结合具有相同或相似的程度，或者在一些情况下有所增加。在一些方面，与相应的未修饰的或野生型PD-L1的IgSF结构域与PD-1的结合相比，与PD-1的结合具有相同或相似的程度，或者在一些情况下有所增加。在一些实施方案中，与TIGIT或PD-1的结合是非堆叠形式的变体CD155IgSF-Fc与TIGIT或PD-1的结合的至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大。在一些实施方案中，与TIGIT的结合是非堆叠形式的变体CD155 IgSF-Fc与TIGIT的结合的至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大。在一些实施方案中，得到的多结构域堆叠分子与非堆叠变体PD-L2 IgSF-Fc和/或变体CD155-IgSF-Fc相比增加了T细胞免疫应答，例如在报告基因测定中所确定的。在一些实施方案中，该增加大于1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、2.0倍、3.0倍、4.0倍、5.0倍或更多。
本文提供了从堆叠免疫调节Fc融合多肽产生的异二聚体多结构域堆叠分子，该堆叠免疫调节Fc融合多肽含有变体CD155多肽的IgSF结构域(例如IgV结构域)和变体PD-L2多肽的第二IgSF结构域(例如IgV)。在一些实施方案中，该多结构域堆叠分子的第一和第二免疫调节Fc融合多肽包含隆突分子，并且在变体PD-L2和/或CD155 IgSF结构域中含有一个或多个氨基酸修饰，该隆突分子具有SEQ ID NO：1127、1128、1129、1130、1131或1133中的任一个所示的序列或与SEQ ID NO：1127、1128、1129、1130、1131或1133中的任一个具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列一致性的氨基酸序列。在一些实施方案中，该多结构域堆叠分子的第一和第二免疫调节Fc融合多肽包含穴分子并且在变体PD-L2和/或CD155 IgSF结构域中含有一个或多个氨基酸修饰，该穴分子具有SEQ ID NO：1118、1132或1134中的任一个所示的序列或与SEQID NO：1118、1132或1134中的任一个具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列一致性的氨基酸序列。在一些实施方案中，得到的多结构域堆叠分子与TIGIT和PD-1二者结合。在一些实施方案中，隆突和穴分子以不同的组合表达，并且通过连接至含有一个或多个CD3突起修饰的Fc变体的第一堆叠免疫调节多肽与连接至含有一个或多个CD3腔修饰的Fc变体的第二堆叠免疫调节多肽的共表达而产生。例如，多结构域堆叠分子的第一和第二免疫调节Fc融合多肽包含隆突和穴分子并且在变体PD-L2和/或CD155 IgSF结构域中含有一个或多个氨基酸修饰，该隆突和穴分子具有SEQ ID NO：1127+1118，1128+1118，1129+1118，1130+1118，1133+1134，1131+1132，1129+1132，1129+1134，1130+1132，1130+1134中的任一个所示的序列对，或者与SEQID NO：1127+1118，1128+1118，1129+1118，1130+1118，1133+1134，1131+1132，1129+1132，1129+1134，1130+1132，1130+1134对中的任一个具有至少85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或更高序列一致性的氨基酸序列。在一些情况下，隆突或穴分子包括SEQ ID NO：1120所示的N-末端HMSSVSAQ。在一些方面，与相应的未修饰的或野生型CD155的IgSF结构域与TIGIT的结合相比，与TIGIT的结合具有相同或相似的程度，或者在一些情况下有所增加。在一些方面，与相应的未修饰的或野生型PD-L2的IgSF结构域与PD-1的结合相比，与PD-1的结合具有相同或相似的程度，或者在一些情况下有所增加。在一些实施方案中，与TIGIT或PD-1的结合是非堆叠形式的变体CD155IgSF-Fc与TIGIT或PD-1的结合的至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大。在一些实施方案中，与TIGIT的结合是非堆叠形式的变体CD155 IgSF-Fc与TIGIT的结合的至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大。在一些实施方案中，得到的多结构域堆叠分子与非堆叠变体PD-L2 IgSF-Fc和/或变体CD155-IgSF-Fc相比增加了T细胞免疫应答，例如在报告基因测定中所确定的。在一些实施方案中，该增加大于1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、2.0倍、3.0倍、4.0倍、5.0倍或更多。
本文提供了从堆叠免疫调节Fc融合多肽产生的异二聚体多结构域堆叠分子，该堆叠免疫调节Fc融合多肽含有变体CD112多肽的IgSF结构域(例如IgV结构域)、变体CD155多肽的第二IgSF结构域(例如IgV)和变体PD-L1多肽的第三IgSF结构域(例如IgV)。在一些实施方案中，该多结构域堆叠分子的第一和第二免疫调节Fc融合多肽具有SEQ ID NO：1266、1267和1268中的任一个所示的序列或与SEQ ID NO：1266、1267和1268中的任一个具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列一致性的氨基酸序列，并且在变体CD112、CD155和/或PD-L1 IgSF结构域中含有一个或多个氨基酸修饰。在一些实施方案中，得到的多结构域堆叠分子与TIGIT、CD112R和PD-1结合。在一些方面，与相应的未修饰的或野生型CD112或CD155的IgSF结构域与TIGIT的结合相比，与TIGIT的结合具有相同或相似的程度，或者在一些情况下有所增加。在一些方面，与相应的未修饰的或野生型CD112的IgSF结构域与CD112R的结合相比，与CD112R的结合具有相同或相似的程度，或者在一些情况下有所增加。在一些方面，与相应的未修饰的或野生型PD-L1的IgSF结构域与PD-1的结合相比，与PD-1的结合具有相同或相似的程度，或者在一些情况下有所增加。在一些实施方案中，与TIGIT或CD112R的结合是非堆叠形式的变体CD112IgSF-Fc与TIGIT或CD112R的结合的至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大。在一些实施方案中，与TIGIT的结合是非堆叠形式的变体CD155IgSF-Fc与TIGIT的结合的至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大。在一些实施方案中，与PD-1的结合是非堆叠形式的变体PD-L1 IgSF-Fc与PD-1的结合的至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大。在一些实施方案中，得到的多结构域堆叠分子与非堆叠变体CD112IgSF-Fc、变体CD155-IgSF-Fc和/或变体PD-L1-IgSF-Fc相比增加了T细胞免疫应答，例如在报告基因测定中所确定的。在一些实施方案中，该增加大于1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、2.0倍、3.0倍、4.0倍、5.0倍或更多。
C变体多肽和免疫调节蛋白的缀合物和融合物
在一些实施方案中，本文提供的变体多肽是包含IgSF家族(vIgD)的Ig结构域的变体的免疫调节蛋白，该变体多肽可以与部分(如效应子部分，如另一种蛋白质)直接或间接地缀合或融合以形成缀合物(“IgSF缀合物”)。在一些实施方案中，附接可以是共价的或非共价的，例如，经由生物素-链霉亲和素非共价相互作用。在CD155-Fc变体融合物的一些实施方案中，任何两种或更多种前述缀合物中的任何一种或组合可以附接至Fc或变体CD155多肽或附接至两者。
在一些实施方案中，该部分可以是靶向部分、小分子药物(小于500道尔顿摩尔质量的非多肽药物)、毒素、细胞抑制剂、细胞毒剂、免疫抑制剂、适用于诊断目的的放射性试剂、用于治疗目的的放射性金属离子、前药活化酶、增加生物半衰期的试剂、或诊断或可检测的试剂。
在一些实施方案中，效应子部分是治疗剂，如癌症治疗剂，其具有细胞毒性、细胞抑制性或以其他方式提供一些治疗益处。在一些实施方案中，效应子部分是靶向部分或试剂，如靶向细胞表面抗原(例如肿瘤细胞表面上的抗原)的试剂。在一些实施方案中，效应子部分是标记，其可以直接或间接地产生可检测信号。在一些实施方案中，效应子部分是毒素。在一些实施方案中，效应子部分是蛋白质、肽、核酸、小分子或纳米颗粒。
在一些实施方案中，1、2、3、4、5或更多个可以相同或不同的效应子部分与变体多肽或蛋白质缀合、连接或融合以形成IgSF缀合物。在一些实施方案中，可以使用本领域已知的和下文描述的各种分子生物学或化学缀合和连接方法将此类效应子部分附接于变体多肽或免疫调节蛋白。在一些实施方案中，接头，如肽接头、可裂解接头、不可裂解接头或有助于缀合反应的接头可用于将效应子部分与变体多肽或免疫调节蛋白连接或缀合。
在一些实施方案中，IgSF缀合物包含以下组分：(蛋白质或多肽)、(L)q和(效应子部分)m，其中该蛋白质或多肽是能够结合所述的一种或多种同源反结构配体的变体多肽或免疫调节蛋白中的任何一种；L是用于将蛋白质或多肽与该部分连接的接头；m为至少1；q为0或更大；并且所得的IgSF缀合物与一种或多种反结构配体结合。在具体实施方案中，m为1至4且q为0至8。
在一些实施方案中，提供了IgSF缀合物，其包含与靶向剂缀合的本文提供的变体多肽或免疫调节蛋白，该靶向剂与细胞表面分子缀合，例如，以用于将变体多肽或免疫调节蛋白靶向递送至特定细胞。在一些实施方案中，靶向剂是一种或多种分子，其具有定位并结合受试者中正常细胞/组织和/或肿瘤细胞/肿瘤上存在的分子的能力。换言之，包含靶向剂的IgSF缀合物可以与存在于细胞(如肿瘤细胞)上的配体(直接或间接地)结合。预期使用的本发明的靶向剂包括可以结合靶细胞或分子的组分的抗体、多肽、肽、适体、其他配体或其任何组合。
在一些实施方案中，靶向剂在给予受试者后结合一个或多个肿瘤细胞或可在肿瘤细胞附近(例如肿瘤血管或肿瘤微环境)结合。靶向剂可以与癌细胞表面上的受体或配体结合。在本发明的另一方面，选择对非癌细胞或组织特异的靶向剂。例如，靶向剂可以对于通常存在于特定细胞或组织上的分子具有特异性。此外，在一些实施方案中，相同的分子可以存在于正常细胞和癌细胞上。各种细胞组分和分子是已知的。例如，如果靶向剂对EGFR具有特异性，则所得的IgSF缀合物可以靶向表达EGFR的癌细胞以及表达EGFR的正常皮肤表皮细胞。因此，在一些实施方案中，本发明的IgSF缀合物可通过两种不同的机制(靶向癌细胞和非癌细胞)起作用。
在本文公开的本发明的各个方面，本发明的IgSF缀合物包含靶向剂，其可以结合/靶向细胞组分，如肿瘤抗原、细菌抗原、病毒抗原、支原体抗原、真菌抗原、朊病毒抗原、来自寄生虫的抗原。在一些方面，细胞组分、抗原或分子可各自用于表示靶向剂的所需靶标。例如，在各种实施方案中，靶向剂对组分具有特异性或与组分结合，该组分包括但不限于表皮生长因子受体(EGFR、ErbB-1、HER1)、ErbB-2(HER2/neu)、ErbB-3/HER3、ErbB-4/HER4、EGFR配体家族；胰岛素样生长因子受体(IGFR)家族、IGF结合蛋白(IGFBP)、IGFR配体家族；血小板衍生生长因子受体(PDGFR)家族、PDGFR配体家族；成纤维细胞生长因子受体(FGFR)家族、FGFR配体家族、血管内皮生长因子受体(VEGFR)家族、VEGF家族；HGF受体家族；TRK受体家族；ephrin(EPH)受体家族；AXL受体家族；白细胞酪氨酸激酶(LTK)受体家族；TIE受体家族、血管生成素1，2；受体酪氨酸激酶样孤儿受体(ROR)受体家族，例如ROR1；CD171(L1CAM)；B7-H6(NCR3LG1)；CD155、肿瘤糖基化抗原，例如sTn或Tn(如MUC1的sTn Ag)；LHR(LHCGR)；磷脂酰丝氨酸、盘状结构域受体(DDR)家族；RET受体家族；KLG受体家族；RYK受体家族；MuSK受体家族；转化生长因子-α(TGF-α)受体、TGF-β；细胞因子受体、I类(血细胞生成素家族)和II类(干扰素/IL-10家族)受体、肿瘤坏死因子(TNF)受体超家族(TNFRSF)、死亡受体家族；癌-睾丸(CT)抗原、谱系特异性抗原、分化抗原、α-辅肌动蛋白-4、ARTCl、断点簇区域-Abelson(Bcr-abl)融合产物、B-RAF、半胱天冬酶-5(CASP-5)、半胱天冬酶-8(CASP-8)、β-连环蛋白(CTNNB1)、细胞分裂周期27(CDC27)、细胞周期蛋白依赖性激酶4(CDK4)、CDKN2A、COA-I、dek-can融合蛋白、EFTUD-2、延伸因子2(ELF2)、Ets变异基因6/急性髓细胞白血病1基因ETS(ETC6-AML1)融合蛋白、纤连蛋白(FN)(例如纤连蛋白的额外结构域A(EDA))、GPNMB、低密度脂质受体/GDP-L岩藻糖：β-D-半乳糖2-α-L-岩藻糖基转移酶(LDLR/FUT)融合蛋白、HLA-A2、在HLA-A2基因(HLA-A*201-R170I)中α2-结构域的α-螺旋的残基170处精氨酸与异亮氨酸交换、HLA-A1、热休克蛋白70-2突变(HSP70-2M)、K1AA0205，MART2、黑色素瘤普遍突变1，2，3(MUM-1，2，3)、前列腺酸性磷酸酶(PAP)、新-PAP、肌球蛋白I类、NFYC、OGT、OS-9、pml-RARα融合蛋白、PRDX5、PTPRK、K-ras(KRAS2)、N-ras(NRAS)、HRAS、RBAF600、SIRT2、SNRPD1、SYT-SSX1或-SSX2融合蛋白、磷酸丙糖异构酶、BAGE、BAGK-1、BAGE-2，3，4，5、GAGE-1，2，3，4，5，6，7，8、GnT-V(异常N-乙酰葡糖胺基转移酶V、MGAT5)、HERV-K-MEL、KK-LC、KM-HN-I、LAGE、LAGE-I、CTL识别的黑色素瘤抗原(CAMEL)、MAGE-A1(MAGE-I)、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A5、MAGE-A6、MAGE-A8、MAGE-A9、MAGE-AlO、MAGE-AIl、MAGE-A12、MAGE-3、MAGE-Bl、MAGE-B2、MAGE-B5、MAGE-B6、MAGE-Cl、MAGE-C2、粘蛋白1(MUC1)、MART-1/Melan-A(MLANA)、gp1OO、gp1OO/Pmell7(SILV)、酪氨酸酶(TYR)、TRP-I、HAGE、NA-88、NY-ESO-I、NY-ESO-l/LAGE-2、SAGE、Spl7、SSX-1，2，3，4、TRP2-INT2、癌胚抗原(CEA)、激肽释放酶4、乳房珠蛋白-A、OAl、前列腺特异性抗原(PSA)、TRP-1/gp75、TRP-2、脂肪分化相关蛋白(adipophilin)、黑色素瘤2(AIM-2)中不存在的诱导蛋白、BING-4、CPSF、细胞周期蛋白D1、上皮细胞粘附分子(Ep-CAM)、EphA3、成纤维细胞生长因子-5(FGF-5)、糖蛋白250(gp250)、EGFR(ERBB1)、HER-2/neu(ERBB2)、白细胞介素13受体α2链(IL13Rα2)、IL-6受体、肠道羧基酯酶(iCE)、甲胎蛋白(AFP)、M-CSF、mdm-2、MUC1、p53(TP53)、PBF、PRAME、PSMA、RAGE-I、RNF43、RU2AS、SOXlO、STEAP1、存活蛋白(BIRC5)、人端粒酶逆转录酶(hTERT)、端粒酶、Wilms肿瘤基因(WT1)、SYCPl、BRDT、SPANX、XAGE、ADAM2、PAGE-5、LIPl、CTAGE-I、CSAGE、MMAl、CAGE、BORIS、HOM-TES-85、AF15ql4、HCA661、LDHC、MORC、SGY-I、SPOl1、TPXl、NY-SAR-35、FTHL17、NXF2、TDRDl、TEX15、FATE、TPTE、免疫球蛋白独特型、Bence-Jones蛋白、雌激素受体(ER)、雄激素受体(AR)、CD40，CD30、CD20、CD19、CD33、癌抗原72-4(CA 72-4)、癌抗原15-3(CA 15-3)、癌抗原27-29(CA 27-29)、癌抗原125(CA 125)、癌抗原19-9(CA 19-9)、β-人绒毛膜促性腺激素、β-2微球蛋白、鳞状细胞癌抗原、神经元特异性烯醇化酶、热休克蛋白gp96、GM2、沙格司亭、CTLA-4、707丙氨酸脯氨酸(707-AP)、T细胞识别的腺癌抗原4(ART-4)、致癌胚抗原肽-1(CAP-I)、钙激活氯通道-2(CLCA2)、亲环蛋白B(Cyp-B)、人印戒肿瘤-2(HST-2)、人乳头瘤病毒(HPV)蛋白(HPV-E6、HPV-E7、主要或次要衣壳抗原及其他)、Epstein-Barr病毒(EBV)蛋白(EBV潜伏膜蛋白质-LMP1、LMP2；其他)、乙型肝炎或丙型肝炎病毒蛋白以及HIV蛋白。
在一些实施方案中，IgSF缀合物通过其靶向剂将结合肿瘤细胞、肿瘤血管或肿瘤微环境的细胞组分，从而经由调节免疫应答(例如，通过激活共刺激分子或抑制免疫细胞激活的负调节分子)、抑制存活信号(例如，生长因子或细胞因子或激素受体拮抗剂)、激活死亡信号和/或免疫介导的细胞毒性(如通过抗体依赖性细胞毒性)促进靶细胞的杀伤。此类IgSF缀合物可通过几种机制起作用以预防、减少或消除肿瘤细胞，如促进缀合的效应子部分向肿瘤靶标的递送，如通过受体介导的IgSF缀合物的内吞作用进行递送；或这种缀合物可以募集、结合和/或激活免疫细胞(例如NK细胞、单核细胞/巨噬细胞、树突细胞、T细胞、B细胞)。此外，在一些情况下，一种或多种前述途径可以在给予一种或多种本发明的IgSF缀合物时起作用。
在一些实施方案中，IgSF缀合物通过其靶向剂将定位于(如结合)肿瘤细胞、肿瘤血管或肿瘤微环境的细胞组分，从而调节肿瘤附近的免疫应答的细胞。在一些实施方案中，靶向剂促进缀合的IgSF(例如vIgD)递送至肿瘤靶标，如以与其同源结合配偶体相互作用以改变携带同源结合配偶体的免疫细胞(例如NK细胞、单核细胞/巨噬细胞、树突细胞、T细胞、B细胞)的信号传导。在一些实施方案中，局部递送介导TIGIT抑制型受体的拮抗或阻断活性。在一些实施方案中，局部递送激动TIGIT抑制型受体，这在一些情况下当存在活化型受体成簇靠近时可以发生。
在一些实施方案中，靶向剂是免疫球蛋白。如本文所用，术语“免疫球蛋白”包括天然或人工单价或多价抗体，其包括但不限于多克隆、单克隆、多特异性、人抗体、人源化抗体或嵌合抗体、单链抗体、Fab片段、F(ab′)片段，由Fab表达文库产生的片段、单链Fv(scFv)、抗独特型(抗Id)抗体(包括针对例如本发明抗体的抗Id抗体)以及任何上述的表位结合片段。如本文所用，术语“抗体”是指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，例如含有免疫特异性结合抗原的抗原结合位点的分子。本发明的免疫球蛋白分子可以具有任何类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类别(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或免疫球蛋白分子的子类。
在一些实施方案中，IgSF缀合物通过其抗体靶向部分将结合肿瘤细胞、肿瘤血管或肿瘤微环境的细胞组分，从而经由调节免疫应答(例如，通过激活共刺激分子或抑制免疫细胞激活的负调节分子)、抑制存活信号(例如，生长因子或细胞因子或激素受体拮抗剂)、激活死亡信号和/或免疫介导的细胞毒性(如通过抗体依赖性细胞毒性)促进靶细胞的凋亡。此类IgSF缀合物可通过几种机制起作用以预防、减少或消除肿瘤细胞，如促进缀合的效应子部分向肿瘤靶标的递送，如通过受体介导的IgSF缀合物的内吞作用进行递送；或这种缀合物可以募集、结合和/或激活免疫细胞(例如NK细胞、单核细胞/巨噬细胞、树突细胞、T细胞、B细胞)。
在一些实施方案中，IgSF缀合物通过其抗体靶向部分将结合肿瘤细胞、肿瘤血管或肿瘤微环境的细胞组分，从而调节免疫应答(例如，通过激活共刺激分子或抑制免疫细胞激活的负调节)。在一些实施方案中，此类缀合物可识别、结合和/或调节(例如抑制或激活)免疫细胞(例如NK细胞、单核细胞/巨噬细胞、树突细胞、T细胞、B细胞)。
本发明的抗体靶向部分包括抗体片段，其包括但不限于Fab、Fab’和F(ab′)2、Fd、单链Fv(scFv)、单链抗体、二硫键连接的Fv(sdFv)和包含VL或VH结构域的片段。结合抗原的抗体片段(包括单链抗体)可以单独包含一个或多个可变区或者一个或多个可变区与以下的全部或部分的组合：铰链区、CH1、CH2和CH3结构域。本发明还包括抗原结合片段，该抗原结合片段还包含一个或多个可变区与铰链区、CH1、CH2和CH3结构域的任何组合。本发明还包括Fc片段、抗原-Fc融合蛋白和Fc靶向部分缀合物或融合产物(Fc-肽、Fc-适体)。本发明的抗体靶向部分可以来自任何动物来源，包括鸟类和哺乳动物。在一个方面，抗体靶向部分是人、鼠(例如小鼠和大鼠)、驴、绵羊、兔、山羊、豚鼠、骆驼、马或鸡。此外，此类抗体可以是动物抗体的人源化形式。本发明的抗体靶向部分可以是单特异性的、双特异性的、三特异性的或具有更高的多特异性。
在各种实施方案中，抗体/靶向部分经由Fc(抗体中)与Fc受体(免疫细胞上)之间的相互作用以及经由本文提供的缀合的变体多肽或免疫调节蛋白来募集、结合和/或激活免疫细胞(例如NK细胞、单核细胞/巨噬细胞、树突细胞)。在一些实施方案中，抗体/靶向部分识别或结合肿瘤剂，并经由本文提供的缀合变体多肽或免疫调节蛋白定位于肿瘤细胞，以促进肿瘤附近免疫细胞的调节。
可以掺入IgSF缀合物中的抗体的例子包括但不限于以下抗体，如西妥昔单抗(IMC-C225；)、曲妥珠单抗利妥昔单抗(Rituxanb；)、贝伐单抗阿伦单抗(Campath- )、帕尼单抗(ABX-EGF；)、兰尼单抗替伊莫单抗、替伊莫单抗(Ibritumomabtiuxetan)托西莫单抗、碘I 131托西莫单抗卡妥索单抗吉妥珠单抗、吉妥珠单抗奥唑米星阿巴西普(CTLA4-Ig；)、贝拉西普(L104EA29YIg；LEA29Y；LEA)、伊匹单抗(MDX-010；MDX-101)、曲美目单抗(替西木单抗；CP-675,206)、PRS-010、PRS-050、阿柏西普(VEGF Trap、AVE005)、伏洛昔单抗(M200)、F200、MORAb-009、SS1P(CAT-5001)、西妥木单抗(IMC-A12)、马妥珠单抗(EMD72000)、尼妥珠单抗(h-R3)、扎鲁木单抗(HuMax-EGFR)、耐昔妥珠单抗IMC-11F8、mAb806/ch806、Sym004、mAb-425、Panorex@(17-1A)(鼠单克隆抗体)；Panorex@(17-1A)(嵌合鼠单克隆抗体)；IDEC-Y2B8(鼠，抗CD20MAb)；BEC2(抗独特型MAb，模拟GD表位)(具有BCG)；Oncolym(Lym-1单克隆抗体)；SMART MI95Ab、人源化13′I LYM-I(Oncolym)、Ovarex(B43.13、抗独特型小鼠MAb)；MDX-210(人源化抗HER-2双特异性抗体)；与腺癌上的EGP40(17-1A)泛癌抗原结合的3622W94MAb；抗VEGF、赛尼哌(Zenapax)(SMART抗Tac(IL-2受体)；SMART MI95Ab、人源化Ab，人源化)；MDX-210(人源化抗HER-2双特异性抗体)；MDX-447(人源化抗EGF受体双特异性抗体)；NovoMAb-G2(泛癌特异性Ab)；TNT(嵌合MAb至组蛋白抗原)；TNT(嵌合MAb至组蛋白抗原)；Gliomab-H(Monoclon s-人源化Ab)；GNI-250Mab；EMD-72000(嵌合-EGF拮抗剂)；LymphoCide(人源化LL2抗体)；以及MDX-260双特异性靶标GD-2、ANAAb、SMART ID10Ab、SMART ABL 364Ab或ImmuRAIT-CEA。如前述列表所示，通常制备针对特定靶表位的抗体。
在一些实施方案中，抗体靶向部分是全长抗体或其含有Fc结构域的抗原结合片段。在一些实施方案中，变体多肽或免疫调节蛋白与抗体靶向部分的Fc部分缀合，如通过与抗体的Fc部分的N-末端缀合。
在一些实施方案中，vIgD直接或间接地与抗体的轻链和/或重链的N-或C-末端连接。在一些实施方案中，连接可以经由肽接头，如以上描述的任何一种肽接头。可以构建各种构型。图7A至图7C描绘了示例性构型。在一些实施方案中，可以通过在细胞中共表达抗体的重链和轻链来产生抗体缀合物。
在本发明的一个方面，靶向剂是适体分子。例如，在一些实施方案中，适体由充当靶向剂的核酸组成。在各种实施方案中，本发明的IgSF缀合物包含对肿瘤细胞、肿瘤血管和/或肿瘤微环境上的分子具有特异性的适体。在一些实施方案中，适体本身可以包含生物活性序列以及靶向模块(序列)，其中该生物活性序列可以诱导针对靶细胞的免疫应答。换言之，这种适体分子是两用试剂。在一些实施方案中，本发明的IgSF缀合物包括适体与抗体的缀合，其中该适体和该抗体特异性结合肿瘤细胞、肿瘤血管、肿瘤微环境和/或免疫细胞上的单独分子。
术语“适体”包括基于对特定分子的特异性结合特性选择的DNA、RNA或肽。例如，可以选择一种或多种适体用于结合如本文所公开的肿瘤细胞、肿瘤血管、肿瘤微环境和/或免疫细胞中的特定基因或基因产物，其中通过本领域已知且本领域技术人员熟悉的方法进行选择。
在本发明的一些方面，靶向剂是肽。例如，本文提供的变体多肽或免疫调节蛋白可以与可与癌症或肿瘤细胞的组分结合的肽缀合。因此，本发明的这种IgSF缀合物包含肽靶向剂，其与肿瘤细胞的细胞组分、肿瘤血管和/或肿瘤微环境的组分结合。在一些实施方案中，靶向剂肽可以是整合素的拮抗剂或激动剂。包含α和β亚基的整合素包括本领域技术人员公知的许多类型。
在一个实施方案中，靶向剂是Vvβ3。整合素Vvβ3在多种细胞上表达，并且已显示介导几种生物相关过程，包括破骨细胞粘附于骨基质、血管平滑肌细胞的迁移和血管生成。用于整合素的合适靶向分子包括RGD肽或肽模拟物以及用于其他整合素如V4.βi(VLA-4)、V4-P7(参见例如美国专利号6,365,619；Chang等人，Bioorganic&Medicinal Chem Lett，12：159-163(2002)；Lin等人，Bioorganic&Medicinal Chem Lett，12：133-136(2002))等的非RGD肽或肽模拟物(参见例如美国专利号5,767,071和5,780,426)。
在一些实施方案中，提供了IgSF缀合物，其包含与治疗剂缀合的本文提供的变体多肽或免疫调节蛋白。在一些实施方案中，治疗剂包括例如道诺霉素、多柔比星、甲氨蝶呤和长春地辛(Rowland等人，Cancer Immunol.Immunother.21：183-187，1986)。在一些实施方案中，治疗剂具有细胞内活性。在一些实施方案中，IgSF缀合物被内化，并且治疗剂是阻断细胞的蛋白质合成从而导致细胞死亡的细胞毒素。在一些实施方案中，治疗剂是包含具有核糖体失活活性的多肽的细胞毒素，包括例如白树毒素、bouganin、皂草素、蓖麻毒蛋白、蓖麻毒蛋白A链、异株泻根毒蛋白、白喉毒素、局限曲菌素、假单胞菌外毒素A及其变体。在一些实施方案中，当治疗剂是包含具有核糖体失活活性的多肽的细胞毒素时，IgSF缀合物必须在与靶细胞结合后内化，以使蛋白质对细胞具有细胞毒性。
在一些实施方案中，提供了IgSF缀合物，其包含与毒素缀合的本文提供的变体多肽或免疫调节蛋白。在一些实施方案中，毒素包括，例如，细菌毒素(如白喉毒素)、植物毒素(如蓖麻毒素)、小分子毒素(如格尔德霉素(Mandler等人，J.Nat.Cancer Inst.92(19)：1573-1581(2000)；Mandler等人，Bioorganic&Med.Chem.Letters 10：1025-1028(2000)；Mandler等人，Bioconjugate Chem.13：786-791(2002))、美登木素生物碱(EP 1391213；Liu等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：8618-8623(1996))和卡里奇霉素(Lode等人，CancerRes.58：2928(1998)；Hinman等人，Cancer Res.53：3336-3342(1993))。毒素可通过包括微管蛋白结合、DNA结合或拓扑异构酶抑制的机制发挥其细胞毒性和细胞抑制作用。
在一些实施方案中，提供了IgSF缀合物，其包含与标记缀合的本文提供的变体多肽或免疫调节蛋白，该标记可间接或直接地产生可检测信号。这些IgSF缀合物可用于研究或诊断应用，如用于体内癌症检测。标记优选能够直接或间接地产生可检测信号。例如，标记可以是不透射线的或放射性同位素，如3H、14C、32P、35S、123I、125I、131I；荧光(荧光团)或化学发光(发色团)化合物如异硫氰酸荧光素、罗丹明或荧光素；酶，如碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或辣根过氧化物酶；成像剂；或金属离子。在一些实施方案中，标记是用于闪烁照相研究的放射性原子(例如99Tc或123I)或用于核磁共振(NMR)成像的自旋标记(也称为磁共振成像，MRI)，如锆-89、碘-123、碘-131、铟-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、钆、锰或铁。锆-89可以与各种金属螯合剂复合并与抗体缀合，例如用于PET成像(WO 2011/056983)。在一些实施方案中，IgSF缀合物可间接地检测。例如，对IgSF缀合物具有特异性并含有可检测标记的二级抗体可用于检测IgSF缀合物。
可以使用本领域已知的任何方法制备IgSF缀合物。参见例如WO 2009/067800、WO2011/133886和美国专利申请公开号2014322129，其通过引用其全文并入本文。
IgSF缀合物的变体多肽或免疫调节蛋白可以通过任何方法“附接于”效应子部分，变体多肽或免疫调节蛋白可以通过该任何方法与效应子部分缀合或连接。例如，IgSF缀合物的变体多肽或免疫调节蛋白可以通过化学或重组方法附接于效应子部分。用于制备融合物或缀合物的化学方法是本领域已知的，并且可用于制备IgSF缀合物。用于缀合变体多肽或免疫调节蛋白和效应子部分的方法必须能够使变体多肽或免疫调节蛋白与效应子部分连接，而不会干扰变体多肽或免疫调节蛋白与其一个或多个反结构配体结合的能力。
IgSF缀合物的变体多肽或免疫调节蛋白可以间接地与效应子部分连接。例如，IgSF缀合物的变体多肽或免疫调节蛋白可以直接地与含有几种类型之一的效应子部分的脂质体连接。一个或多个效应子部分和/或变体多肽或免疫调节蛋白也可以结合至固体表面。
在一些实施方案中，IgSF缀合物的变体多肽或免疫调节蛋白以及效应子部分均为蛋白质并且可以使用本领域公知的技术缀合。几百种可以缀合两种蛋白质的交联剂是可用的。(参见例如“Chemistry of Protein Conjugation and Crosslinking，”1991，ShansWong，CRC Press，Ann Arbor)。通常基于可用的或在变体多肽或免疫调节蛋白和/或效应子部分插入的反应性官能团来选择交联剂。另外，如果没有反应性基团，可以使用可光活化的交联剂。在某些情况下，可能需要在变体多肽或免疫调节蛋白与效应子部分之间包括间隔区。本领域已知的交联剂包括同双功能试剂：戊二醛、二甲基己二亚酰胺化物(dimethyladipimidate)和双(重氮基联苯胺)以及异双功能试剂：m马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺和磺基-m马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺。
在一些实施方案中，IgSF缀合物的变体多肽或免疫调节蛋白可以用特定残基工程化，以用于效应子部分的化学附接。用于本领域已知的分子的化学附接的特定残基包括赖氨酸和半胱氨酸。基于在变体多肽或免疫调节蛋白和/或效应子部分插入的反应性官能团来选择交联剂，并且该交联剂可用于效应子部分。
还可以使用重组DNA技术制备IgSF缀合物。在这种情况下，编码变体多肽或免疫调节蛋白的DNA序列与编码效应子部分的DNA序列融合，从而产生嵌合DNA分子。将嵌合DNA序列转染至表达融合蛋白的宿主细胞中。可以从细胞培养物中回收融合蛋白，并使用本领域已知的技术纯化。
将作为标记的效应子部分附接至变体多肽或免疫调节蛋白的例子包括以下文献中所述的方法：Hunter，等人，Nature 144：945(1962)；David，等人，Biochemistry 13：1014(1974)；Pain，等人，J.Immunol.Meth.40：219(1981)；Nygren，J.Histochem.和Cytochem.30：407(1982)；Wensel和Meares，Radioimmunoimaging AndRadioimmunotherapy，Elsevier，N.Y.(1983)；以及Colcher等人，“Use Of MonoclonalAntibodies As Radiopharmaceuticals For The Localization Of Human CarcinomaXenografts In Athymic Mice”，Meth.Enzymol.，121：802-16(1986)。
放射性标记或其他标记可以以已知方式掺入缀合物中。例如，肽可以是生物合成的，或者可以通过化学氨基酸合成使用合适的氨基酸前体合成，该氨基酸前体包含例如替代氢的氟-19。标记如99Tc或123I、186Re、188Re和111In可以经由肽中的半胱氨酸残基附接。钇-90可以经由赖氨酸残基附接。可使用IODOGEN方法(Fraker等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.80：49-57(1978))掺入碘-123。“Monoclonal Antibodiesin Immunoscintigraphy”(Chatal，CRC Press 1989)详细描述了其他方法。
可以使用多种双功能蛋白偶联剂如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸盐(SMCC)、亚氨基硫杂环戊烷(IT)、亚氨酸酯的双功能衍生物(如二甲基二亚胺代己二酸酯HCI)、活性酯(如双琥珀酰亚胺辛二酸酯)、醛(如戊二醛)、双叠氮化合物(如双(对-叠氮基苯甲酰基)己二胺)、双重氮基衍生物(如双-(对-重氮基苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(如甲苯2，6-二异氰酸酯)和双活性氟化合物(如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)制备变体多肽或免疫调节蛋白和细胞毒性剂的缀合物。例如，可以如Vitetta等人，Science 238：1098(1987)中所述制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14-标记的1-对-异硫氰酸基苄基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于将放射性核苷酸与抗体缀合的示例性螯合剂。参见例如WO 94/11026。接头可以是“可裂解接头”，其促进细胞中细胞毒性药物的释放。例如，可以使用酸不稳定的接头、肽酶敏感接头、光不稳定的接头、二甲基接头或含二硫键的接头(Chari等人，Cancer Research 52：127-131(1992)；美国专利号5,208,020)。
本发明的IgSF缀合物明确地考虑但不限于用交联试剂制备的药物缀合物：BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、磺基-EMCS、磺基-GMBS、磺基-KMUS、磺基-MBS、磺基-SIAB、磺基-SMCC和磺基-SMPB以及SVSB(琥珀酰亚胺基-(4-乙烯砜)苯甲酸酯)，它们可商购获得(例如，来自Pierce Biotechnology公司，罗克福德，伊利诺伊州，美国)。参见2003-2004应用手册和目录第467-498页。
D跨膜和可分泌性免疫调节蛋白和工程化细胞
本文提供了表达免疫调节变体CD155多肽的工程化细胞(可替代地，“工程化细胞”)。在一些实施方案中，表达的免疫调节变体CD155多肽是跨膜蛋白并且是表面表达的。在一些实施方案中，表达的免疫调节变体CD155多肽由细胞表达和分泌。
1.跨膜免疫调节蛋白
在一些实施方案中，包含变体CD155的免疫调节多肽可以是膜结合蛋白。如下文更详细描述的，免疫调节多肽可以是包含变体CD155的跨膜免疫调节多肽，在该变体CD80中包含：含有至少一个亲和力修饰的IgSF结构域(IgV或IgC)的胞外域、跨膜结构域和任选细胞质结构域。在一些实施方案中，跨膜免疫调节蛋白可以在免疫细胞(如哺乳动物细胞)的表面上表达，包括在淋巴细胞(例如T细胞或NK细胞)或抗原呈递细胞的表面上表达。在一些实施方案中，跨膜免疫调节蛋白在哺乳动物T细胞的表面上表达，包括如下T细胞：T辅助细胞、细胞毒性T细胞(或者，细胞毒性T淋巴细胞或CTL)、自然杀伤T细胞、调节性T细胞、记忆T细胞或γδT细胞。在一些实施方案中，哺乳动物细胞是抗原呈递细胞(APC)。通常但非唯一地，胞外域(或者，“细胞外结构域”)包含本发明的变体CD155的一个或多个氨基酸变异(例如氨基酸取代)。因此，例如，在一些实施方案中，跨膜蛋白将包含胞外域，该胞外域包含本发明的变体CD155的一个或多个氨基酸取代。
在一些实施方案中，工程化细胞表达的变体CD155多肽是跨膜免疫调节多肽(TIP)，该跨膜免疫调节多肽可以是膜蛋白，如跨膜蛋白。在典型的实施方案中，膜蛋白的胞外域包含本文提供的变体CD155的细胞外结构域或其IgSF结构域，其中在该至少一个IgSF结构域中含有一个或多个氨基酸取代。本文提供的跨膜免疫调节蛋白还含有与胞外域连接的跨膜结构域。在一些实施方案中，跨膜结构域产生用于在细胞上进行细胞表面表达的编码蛋白质。在一些实施方案中，跨膜结构域直接与胞外域连接。在一些实施方案中，跨膜结构域经由一个或多个接头或间隔区间接地与胞外域连接。在一些实施方案中，跨膜结构域主要含有疏水性氨基酸残基，如亮氨酸和缬氨酸。
在一些实施方案中，全长跨膜锚定结构域可用于确保TIP将在工程化细胞(如工程化T细胞)的表面上表达。方便地，这可以来自亲和力修饰的特定天然蛋白质(例如CD155或其他天然IgSF蛋白质)，并且以与天然IgSF蛋白质(例如CD155)类似的方式与第一膜近端结构域的序列简单融合。在一些实施方案中，跨膜免疫调节蛋白包含相应的野生型或未修饰的IgSF成员的跨膜结构域，如包含在SEQ ID NO：20所示的氨基酸序列中的跨膜结构域(表2)。在一些实施方案中，膜结合形式包含相应的野生型或未修饰的多肽的跨膜结构域，如对应于SEQ ID NO：20的残基221-241。
在一些实施方案中，跨膜结构域是非天然跨膜结构域，该非天然跨膜结构域不是天然CD155的跨膜结构域。在一些实施方案中，跨膜结构域来源于来自另一种非CD155家族成员多肽的跨膜结构域，该跨膜结构域是膜结合的或是跨膜蛋白。在一些实施方案中，可以使用来自T细胞上的另一种蛋白质的跨膜锚定结构域。在一些实施方案中，跨膜结构域来源于CD8。在一些实施方案中，跨膜结构域可还含有CD8的细胞外部分，其用作间隔结构域。示例性CD8衍生的跨膜结构域为SEQ ID NO：130或1142所示或其含有CD8跨膜结构域的部分。在一些实施方案中，跨膜结构域是合成的跨膜结构域。
在一些实施方案中，跨膜免疫调节蛋白还含有与跨膜结构域连接的胞内域，如细胞质信号传导结构域。在一些实施方案中，细胞质信号传导结构域诱导细胞信号传导。在一些实施方案中，跨膜免疫调节蛋白的胞内域包含相应的野生型或未修饰的多肽的细胞质结构域，如SEQ ID NO：20所示的氨基酸序列中包含的细胞质结构域(参见表2)。
在一些实施方案中，提供的跨膜免疫调节蛋白(其是变体CD155或包含变体CD155)包含显示出与SEQ ID NO：122至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列，并且包含含有至少一个如上所述的亲和力修饰的CD155 IgSF结构域的胞外域和跨膜结构域。在一些实施方案中，跨膜免疫调节蛋白在IgSF结构域(例如IgV结构域)(包括表1所示的任何一个IgSF结构域)中含有任何一个或多个氨基酸取代。在一些实施方案中，跨膜免疫调节蛋白可还包含所述的细胞质结构域。在一些实施方案中，跨膜免疫调节蛋白可还含有信号肽。在一些实施方案中，信号肽是野生型IgSF成员的天然信号肽，如包含在SEQ ID NO：20所示的氨基酸序列中的野生型IgSF成员(参见例如表2)。
还提供了编码这种跨膜免疫调节蛋白的核酸分子。在一些实施方案中，编码跨膜免疫调节蛋白的核酸分子包含核苷酸序列，其编码如下氨基酸序列，该氨基酸序列显示出与SEQ ID NO：122至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性并且包含含有至少一个所述的亲和力修饰的IgSF结构域的胞外域、跨膜结构域和任选细胞质结构域。在一些实施方案中，核酸分子可还包含编码信号肽的核苷酸序列。在一些实施方案中，信号肽是相应的野生型IgSF成员(参见例如表2)的天然信号肽。
在一些实施方案中，提供了CAR相关的跨膜免疫调节蛋白，其中跨膜免疫调节蛋白的胞内域包含细胞质信号传导结构域，该细胞质信号传导结构域包含至少一个含ITAM(基于免疫受体酪氨酸的激活基序)的信号传导结构域。ITAM是在许多参与免疫细胞信号转导的蛋白质信号传导结构域中发现的保守基序，包括在参与T细胞受体信号转导的CD3-ζ链(“CD3-z”)中发现的保守基序。在一些实施方案中，胞内域包含CD3-ζ信号传导结构域。在一些实施方案中，CD3-ζ信号传导结构域包含SEQ ID NO：131所示的氨基酸序列或显示出与SEQ ID NO：131至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％并且保留T细胞信号传导活性的氨基酸序列。在一些实施方案中，CAR相关的跨膜免疫调节蛋白的胞内域可还包含共刺激信号传导结构域，以进一步调节T细胞的免疫调节应答。在一些实施方案中，共刺激信号传导结构域是CD28、ICOS、41BB或OX40。在一些实施方案中，共刺激信号传导结构域来源于CD28或4-1BB，并且包含SEQ ID NO：1143-1146中任一个所示的氨基酸序列或显示出与SEQ ID NO：1143-1146至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％并且保留T细胞共刺激信号传导活性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所提供的CAR相关的跨膜免疫调节蛋白具有CAR的特征，以在亲和力修饰的IgSF结构域与同源结合配偶体或反结构结合后刺激T细胞信号传导。在一些实施方案中，通过亲和力修饰的IgSF结构域与其反结构的特异性结合可以导致如细胞毒性、增殖或细胞因子产生的变化所反映的T细胞活性的免疫活性的变化。
在一些实施方案中，跨膜免疫调节蛋白不含能够介导细胞质信号传导的胞内域。在一些实施方案中，跨膜免疫调节蛋白缺乏野生型或未修饰多肽的信号转导机制，因此本身不诱导细胞信号传导。在一些实施方案中，跨膜免疫调节蛋白缺乏相应的野生型或未修饰的多肽的细胞内(细胞质)结构域或细胞内结构域的一部分，如SEQ ID NO：20所示的氨基酸序列中包含的细胞质信号传导结构域(参见表2)。在一些实施方案中，跨膜免疫调节蛋白不含有ITIM(基于免疫受体酪氨酸的抑制基序)，如在某些抑制性受体(包括IgSF家族的抑制性受体(例如TIGIT或TIGIT))中包含的ITIM。因此，在一些实施方案中，跨膜免疫调节蛋白仅含有胞外域和跨膜结构域，如所述的任何结构域。
2.分泌的免疫调节蛋白和工程化细胞
在一些实施方案中，含有如本文所述的任何一种或多种氨基酸突变的CD155变体免疫调节多肽是可分泌的，如当由细胞表达时。这种变体CD155免疫调节蛋白不包含跨膜结构域。在一些实施方案中，变体CD155免疫调节蛋白不与半衰期延长部分(如Fc结构域或多聚化结构域)缀合。在一些实施方案中，变体CD155免疫调节蛋白包含信号肽，例如抗体信号肽或其他有效的信号序列，以获得细胞外的结构域。当免疫调节蛋白包含信号肽并由工程化细胞表达时，信号肽导致工程化细胞分泌免疫调节蛋白。通常，信号肽或信号肽的一部分在分泌时由免疫调节蛋白裂解而来。免疫调节蛋白可以由核酸(其可以是表达载体的一部分)编码。在一些实施方案中，免疫调节蛋白由细胞(如免疫细胞，例如原代免疫细胞)表达和分泌。
因此，在一些实施方案中，提供了还包含信号肽的变体CD155免疫调节蛋白。在一些实施方案中，本文提供了编码变体CD155免疫调节蛋白的核酸分子，该核酸分子与编码信号肽的分泌序列可操作连接的。
信号肽是免疫调节蛋白N-末端的序列，该序列发出由细胞分泌免疫调节蛋白的信号。在一些实施方案中，信号肽的长度为约5至约40个氨基酸(如约5至约7、约7至约10、约10至约15、约15至约20、约20至约25或约25至约30、约30至约35或约35至约40个氨基酸)。
在一些实施方案中，信号肽是来自相应野生型CD155的天然信号肽(参见表2)。在一些实施方案中，信号肽是非天然信号肽。例如，在一些实施方案中，非天然信号肽是来自相应野生型CD155的突变天然信号肽，并且可包括一个或多个(如2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个)取代、插入或缺失。在一些实施方案中，非天然信号肽是来自与野生型IgSF家族成员相同的IgSF家族的家族成员的信号肽或其突变体。在一些实施方案中，非天然信号肽是来自与野生型IgSF家族成员不同的IgSF家族的IgSF家族成员的信号肽或其突变体。在一些实施方案中，信号肽是来自非IgSF蛋白家族的信号肽或其突变体，如来自免疫球蛋白的信号肽(如IgG重链或IgG-κ轻链)、细胞因子(如白细胞介素-2(IL-2)或CD33)、血清白蛋白蛋白质(例如HSA或白蛋白)、人天青杀素前蛋白(human azurocidin preprotein)信号序列、荧光素酶、胰蛋白酶原(例如胰凝乳蛋白酶原或胰蛋白酶原)或能够使细胞有效分泌蛋白质的其他信号肽。示例性信号肽包括表9中描述的任何信号肽。
在可分泌性变体CD155免疫调节蛋白的一些实施方案中，免疫调节蛋白在表达时包含信号肽，并且信号肽(或其部分)在分泌时由免疫调节蛋白裂解而来。
在一些实施方案中，工程化细胞表达由细胞分泌的变体CD155多肽。在一些实施方案中，这种变体CD155多肽由编码免疫调节蛋白的核酸分子在信号序列对于分泌的可操作控制下编码。在一些实施方案中，编码的免疫调节蛋白在由细胞表达时分泌。在一些实施方案中，由核酸分子编码的免疫调节蛋白不包含跨膜结构域。在一些实施方案中，由核酸分子编码的免疫调节蛋白不包含半衰期延长部分(如Fc结构域或多聚化结构域)。在一些实施方案中，由核酸分子编码的免疫调节蛋白包含信号肽。在一些实施方案中，本发明的核酸还包含编码与编码免疫调节蛋白的核酸可操作地连接的分泌或信号肽的核苷酸序列，从而允许免疫调节蛋白的分泌。
3.细胞和工程化细胞
本文提供了表达任何所提供的免疫调节多肽的工程化细胞。在一些实施方案中，工程化细胞在其表面上表达任何所提供的跨膜免疫调节多肽。在一些实施方案中，工程化细胞在适合于分泌蛋白质的条件下表达免疫调节蛋白并且可以或能够由该细胞分泌免疫调节蛋白。在一些实施方案中，免疫调节蛋白在淋巴细胞上或淋巴细胞中表达，如肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、T细胞或NK细胞或在骨髓细胞上表达。在一些实施方案中，工程化细胞是抗原呈递细胞(APC)。在一些实施方案中，工程化细胞是工程化哺乳动物T细胞或工程化哺乳动物抗原呈递细胞(APC)。在一些实施方案中，工程化T细胞或APC是人或鼠细胞。
在一些实施方案中，工程化T细胞包括但不限于T辅助细胞、细胞毒性T细胞(或者，细胞毒性T淋巴细胞或CTL)、天然杀伤T细胞、调节性T细胞、记忆T细胞或γδT细胞。在一些实施方案中，工程化T细胞是CD4+或CD8+。
在一些实施方案中，工程化APC包括，例如，表达MHC II的APC，如巨噬细胞、B细胞和树突细胞以及包括细胞和非细胞(例如可生物降解的聚合物微粒)aAPC的人工APC(aAPC)。人工APC(aAPC)是APC的合成形式，其可以与APC类似的方式起作用，因为它们将抗原呈递给T细胞并激活它们。抗原呈递由MHC(I类或II类)进行。在一些实施方案中，在工程化APC如aAPC中，加载至MHC上的抗原在一些实施方案中是肿瘤特异性抗原或肿瘤相关抗原。加载至MHC上的抗原被T细胞的T细胞受体(TCR)识别，在某些情况下，T细胞可以表达TIGIT或由本文提供的变体CD155多肽识别的其他分子。可用于工程化aAPC的材料包括：聚(乙醇酸)、聚(乳酸-乙醇酸共聚物)、氧化铁、脂质体、脂质双层、琼脂糖和聚苯乙烯。
在一些实施方案中，细胞aAPC可以被工程化为含有TIP和TCR激动剂，其用于采用的细胞疗法。在一些实施方案中，细胞aAPC可以被工程化为含有TIP和TCR激动剂，其例如在施用之前用于离体扩增人T细胞例如用于再次引入患者体内。在一些方面，aAPC可以包括至少一种抗-CD3抗体克隆(例如ODT3和/或UCHT1)的表达。在一些方面，aAPC可以被灭活(例如被辐射)。在一些实施方案中，TIP可以包括表现出对T细胞上的同源结合配偶体的结合亲和力的任何变体IgSF结构域。
在一些实施方案中，本文提供的免疫调节蛋白，如跨膜免疫调节蛋白或可分泌性免疫调节蛋白，在表达抗原结合受体的细胞中共表达或工程化至该细胞中，该抗原结合受体例如重组受体，如嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)。在一些实施方案中，工程化细胞如工程化T细胞识别与癌症、炎症和自身免疫病症或病毒感染相关的所需抗原。在具体的实施方案中，抗原结合受体含有特异性结合肿瘤特异性抗原或肿瘤相关抗原的抗原结合部分。在一些实施方案中，工程化T细胞是CAR(嵌合抗原受体)T细胞，其含有特异性地结合至抗原(如肿瘤特异性抗原或肿瘤相关抗原)的抗原结合结构域(例如scFv)。在一些实施方案中，TIP蛋白在工程化T细胞受体细胞或工程化嵌合抗原受体细胞中表达。在此类实施方案中，工程化细胞共表达TIP和CAR或TCR。在一些实施方案中，SIP蛋白在工程化T细胞受体细胞或工程化嵌合抗原受体细胞中表达。在此类实施方案中，工程化细胞共表达SIP和CAR或TCR。
嵌合抗原受体(CAR)是重组受体，其包括抗原结合结构域(胞外域)、跨膜结构域和细胞内信号传导区域(胞外域)，胞外域能够在抗原被结合后诱导或介导到T细胞的活化信号。在一些实例中，CAR表达细胞被工程化为表达对特定的肿瘤抗原具有特异性的细胞外单链可变片段(scFv)，该scFv与包含活化结构域(并且在一些情况下为共刺激结构域)的细胞内信号传导部分连接。共刺激结构域可以衍生自例如CD28、OX-40、4-1BB/CD137或可诱导T细胞共刺激分子(ICOS)。活化结构域可以衍生自例如CD3(如CD3ζ、ε、δ、γ等)。在某些实施方案中，CAR被设计成具有2个、3个、4个或更多个共刺激结构域。CAR scFv可以被设计成靶向与疾病或病况相关的细胞上表达的抗原，例如肿瘤抗原，例如CD19，其是由B细胞系中的细胞(包括所有正常B细胞和B细胞恶性肿瘤，包括但不限于NHL、CLL和非T细胞ALL)表达的跨膜蛋白。示例性的CAR+ T细胞疗法和构建体记载于美国专利公开号2013/0287748、2014/0227237、2014/0099309和2014/0050708，这些参考文件通过引用的方式整体并入。
在一些方面，抗原结合结构域是抗体或其抗原结合片段，例如单链片段(scFv)。在一些实施方案中，抗原是在肿瘤或癌细胞上表达的。抗原的实例是CD19。CAR的实例是抗-CD19 CAR，例如含有SEQ ID NO：1152所示的抗-CD19 scFv的CAR。在一些实施方案中，CAR还含有间隔区、跨膜结构域和包含ITAM信号传导结构域的细胞内信号传导结构域或区域，例如CD3ζ信号传导结构域。在一些实施方案中，CAR还包括共刺激信号传导结构域。
在一些实施方案中，间隔区和跨膜结构域是来源于CD8的铰链和跨膜结构域，例如具有SEQ ID NO：130、1142、2032所示的示例性序列或显示出与SEQ ID NO：130、1142、2032至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列一致性的氨基酸序列。在一些实施方案中，胞内域包含CD3-ζ信号传导结构域。在一些实施方案中，CD3-ζ信号传导结构域包含SEQ ID NO：131所示的氨基酸序列或显示出与SEQ ID NO：131至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高序列一致性并且保留T细胞信号传导活性的氨基酸序列。在一些实施方案中，CAR的胞内域可还包含共刺激信号传导结构域或区域，以进一步调节T细胞的免疫调节应答。在一些实施方案中，共刺激信号传导结构域是或包含CD28、ICOS、41BB或OX40的共刺激区域，或来源于CD28、ICOS、41BB或OX40的共刺激区域。在一些实施方案中，共刺激信号传导结构域来源于CD28或4-1BB，并且包含SEQ ID NO：1143-1146中任一个所示的氨基酸序列或显示出与SEQ ID NO：1143-1146至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高序列一致性并且保留T细胞共刺激信号传导活性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，编码CAR的构建体还编码第二蛋白例如标记物诸如可检测蛋白，该第二蛋白通过自切割肽序列与CAR分开。在一些实施方案中，自切割肽序列是F2A、T2A、E2A或P2A自切割肽。T2A自切割肽的示例性序列示于SEQ ID NO：1147、1155或2039中任一个，或显示出与SEQ ID NO：1147、1155或2039中的任一个至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高序列一致性的氨基酸序列。在一些实施方案中，T2A由SEQ ID NO：1155所示的核苷酸序列或显示出与SEQ IDNO：1155中的任一个至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高序列一致性的序列编码。在一些实施方案中，标记物是可检测蛋白，诸如荧光蛋白，例如绿色荧光蛋白(GFP)或蓝色荧光蛋白(BFP)。荧光蛋白标记物的示例性序列示于SEQ ID NO：1148或2038或显示出与SEQ ID NO：1148或2038至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高序列一致性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，CAR是抗-CD19 CAR，其具有SEQ ID NO：1138、1149、1150、1151、2033、2034、2036或2037中的任一个所示的氨基酸序列或显示出与SEQ ID NO：1138、1149、1150、1151、2033、2034、2036或2037中的任一个至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高序列一致性的氨基酸序列。在一些实施方案中，CAR由SEQ ID NO：1153或2035所示的核苷酸序列或显示出与SEQ IDNO：1153或2035中的任一个至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高序列一致性的核苷酸序列编码。
在另一个实施方案中，工程化T细胞具有TCR，包括重组或工程化TCR。在一些实施方案中，TCR可以是天然TCR。本领域技术人员将认识到，通常天然哺乳动物T细胞受体包含参与抗原特异性识别和结合的α链和β链(或γ链和δ链)。在一些实施方案中，TCR是经修饰的工程化TCR。在一些实施方案中，工程化T细胞的TCR特异性地结合至由APC呈递的肿瘤相关或肿瘤特异性抗原。
在一些实施方案中，免疫调节多肽，如跨膜免疫调节多肽或可分泌性免疫调节多肽，可通过多种策略(如用于重组宿主细胞的那些策略)掺入工程化细胞中，如工程化T细胞或工程化APC。将DNA构建体引入原代T细胞中的多种方法是本领域已知的。在一些实施方案中，使用病毒转导或质粒电穿孔。在典型的实施方案中，编码免疫调节蛋白或表达载体的核酸分子包含信号肽，该信号肽将表达的跨膜免疫调节蛋白定位于细胞膜或用于分泌。在一些实施方案中，将编码本发明的跨膜免疫调节蛋白的核酸亚克隆至允许在宿主哺乳动物细胞中表达的病毒载体中，如逆转录病毒载体。可以将表达载体引入哺乳动物宿主细胞中，并且在宿主细胞培养条件下，免疫调节蛋白在表面上表达或分泌。
在一个示例性例子中，可以离体纯化原代T细胞(CD4细胞或CD8细胞或两者)，并用由各种TCR/CD28激动剂组成的激活方案(如抗CD3/抗CD28包被的珠粒)刺激原代T细胞。在激活过程后2或3天，可以通过本领域标准慢病毒或逆转录病毒转导方案或质粒电穿孔策略将含有免疫调节多肽的重组表达载体稳定地引入原代T细胞中。可以通过例如流式细胞术使用与天然亲本分子交叉反应的抗表位标签或抗体以及含有变体CD155的多肽监测细胞的免疫调节多肽表达。表达免疫调节多肽的T细胞可以通过用抗表位标签抗体分选来富集，或者根据应用针对高表达或低表达来富集。
在免疫调节多肽表达后，可以通过多种方法测定工程化T细胞的适当功能。可以验证工程化CAR或TCR共表达以表明该部分工程化T细胞不受免疫调节蛋白表达的显著影响。一旦验证，标准的体外细胞毒性、增殖或细胞因子测定(例如，IFN-γ表达)可用于评估工程化T细胞的功能。示例性标准终点是培养上清液中肿瘤细胞系的裂解、工程化T细胞的增殖或IFN-γ蛋白表达的百分比。可以选择导致与对照构建体相比统计学上显著增加的肿瘤细胞系裂解、增加的工程化T细胞增殖或增加的IFN-γ表达的工程化构建体。此外，非工程化T细胞，如天然的原代或内源性T细胞也可以掺入相同的体外测定中，以测量在工程化细胞(如工程化T细胞)上表达的免疫调节多肽构建体调节活性的能力，在一些情况下，包括在旁观者天然T-细胞中激活和产生效应子功能的能力。可以监测在内源性T细胞上的激活标志物如CD69、CD44或CD62L的增加的表达，并且增加的增殖和/或细胞因子产生可以表明在工程化T细胞上表达的免疫调节蛋白的所需活性。
在一些实施方案中，类似的测定可用于比较仅含有CAR或TCR的工程化T细胞与含有CAR或TCR和TIP构建体的T细胞的功能。通常，这些体外测定通过将各种比例的工程化T细胞和含有同源CAR或TCR抗原的“肿瘤”细胞系共同接种在培养物中来进行。标准终点是培养上清液中肿瘤细胞系的裂解、工程化T细胞的增殖或IFN-γ产生的百分比。可以选择导致与单独的相同TCR或CAR构建体相比统计学上显著增加的肿瘤细胞系裂解、增加的工程化T细胞增殖或增加的IFN-γ产生的工程化免疫调节蛋白。可以在免疫功能不全的小鼠(如缺乏小鼠T、NK和B细胞的NSG品种)中分析工程化人T细胞。工程化人T细胞(其中CAR或TCR结合异种移植物上的靶反结构并与TIP亲和力修饰的IgSF结构域共表达)可以以与异种移植物不同的细胞数量和比例过继转移至体内。例如，可以通过生物发光或通过流式细胞术离体监测含有荧光素酶/GFP载体的CD19+白血病肿瘤细胞系的移植。在一个常见的实施方案中，将异种移植物引入鼠模型中，然后在几天后将工程化T细胞引入。可以测定含有免疫调节蛋白的工程化T细胞相对于仅含有CAR或TCR的工程化T细胞增加的存活率、肿瘤清除或扩增的工程化T细胞数目。如在体外测定中，内源性、天然(即，非工程化)人T细胞可以共同过继转移以寻求在该群体中成功的表位扩散，从而导致更好的存活率或肿瘤清除。
E.表达变体多肽和免疫调节蛋白的感染原
还提供了含有编码任何变体多肽(如CD155 vIgD多肽，包括本文所述的可分泌性或跨膜免疫调节蛋白)的核酸的感染原。在一些实施方案中，此类感染原可将编码本文所述的变体免疫调节多肽的核酸(如CD155 vIgD多肽)递送至受试者的靶细胞，如受试者中的免疫细胞和/或抗原呈递细胞(APC)或肿瘤细胞。还提供了包含在这些感染原中的核酸，和/或用于产生或修饰这些感染原的核酸(如载体和/或质粒)以及含有这种感染原的组合物。
在一些实施方案中，感染原是微生物(microorganism或microbe)。在一些实施方案中，感染原是病毒或细菌。在一些实施方案中，感染原是病毒。在一些实施方案中，感染原是细菌。在一些实施方案中，这种感染原可递送编码任何变体多肽(如CD155 vIgD多肽，包括本文所述的可分泌性或跨膜免疫调节蛋白)的核酸序列。因此，在一些实施方案中，受试者中被感染原感染或接触的细胞可以在细胞表面上表达或分泌变体免疫调节多肽。在一些实施方案中，感染原还可以将一种或多种其他治疗剂或编码其他治疗剂的核酸递送至细胞和/或受试者体内的环境。在一些实施方案中，可以通过感染原递送的其他治疗剂包括细胞因子或其他免疫调节分子。
在一些实施方案中，感染原例如病毒或细菌含有编码任何变体多肽(如CD155vIgD多肽，包括本文所述的可分泌性或跨膜免疫调节蛋白)的核酸序列，并且通过接触和/或感染受试者中的细胞，该细胞表达由感染原中包含的核酸序列编码的变体多肽(如CD155vIgD多肽，包括可分泌性或跨膜免疫调节蛋白)。在一些实施方案中，可以将感染原给予受试者。在一些实施方案中，可以将感染原与来自受试者的细胞离体接触。
在一些实施方案中，由感染原感染的细胞表达的变体多肽(如CD155 vIgD多肽，包括跨膜免疫调节蛋白)是跨膜蛋白并且是表面表达的。在一些实施方案中，由感染原感染的细胞表达的变体多肽(如CD155 vIgD多肽，包括可分泌性免疫调节蛋白)由细胞表达并分泌。跨膜免疫调节蛋白或分泌的免疫调节蛋白可以是本文所述的任何蛋白质。
在一些实施方案中，受试者中被感染原靶向的细胞包括肿瘤细胞、免疫细胞和/或抗原呈递细胞(APC)。在一些实施方案中，感染原靶向肿瘤微环境(TME)中的细胞。在一些实施方案中，感染原将编码变体多肽的核酸(如CD155 vIgD多肽，包括可分泌性或跨膜免疫调节蛋白)递送至合适的细胞(例如，APC，如在其细胞表面展示肽/MHC复合物的细胞，如树突细胞)或组织(例如，淋巴组织)，所述合适的细胞或组织将诱导和/或增强所需效果，例如免疫调节和/或特定细胞介导的免疫应答，例如CD4和/或CD8 T细胞应答，该CD8 T细胞应答可包括细胞毒性T细胞(CTL)应答。在一些实施方案中，感染原靶向APC，如树突细胞(DC)。在一些实施方案中，通过本文所述的感染原递送的核酸分子包括在特定靶细胞中对于编码变体免疫调节多肽的可操作连接的编码序列的表达而言所必需的适当核酸序列，例如调节元件如启动子。
在一些实施方案中，含有编码免疫调节多肽的核酸序列的感染原也可含有编码一种或多种另外的基因产物(例如细胞因子、前药转化酶、细胞毒素和/或可检测的基因产物)的核酸序列。例如，在一些实施方案中，感染原是溶瘤病毒，并且该病毒可以包括编码另外的治疗性基因产物的核酸序列(参见例如Kirn等人，(2009)Nat Rev Cancer 9：64-71；Garcia-Aragoncillo等人，(2010)Curr Opin Mol Ther 12：403-411；参见美国专利号7,588,767、7,588,771、7,662,398和7,754,221，以及美国专利公开号2007/0202572、2007/0212727、2010/0062016、2009/0098529、2009/0053244、2009/0155287、2009/0117034、2010/0233078、2009/0162288、2010/0196325、2009/0136917和2011/0064650)。在一些实施方案中，另外的基因产物可以是可导致靶细胞(例如，肿瘤细胞)死亡的治疗性基因产物，或是可增强或加强或调节免疫应答的基因产物(例如，细胞因子)。示例性基因产物还包括抗癌剂、抗转移剂、抗血管生成剂、免疫调节分子、免疫检查点抑制剂、抗体、细胞因子、生长因子、抗原、细胞毒性基因产物、促凋亡基因产物、抗凋亡基因产物、细胞基质降解基因、用于组织再生和将人类体细胞重编程为多能性的基因、以及本文描述的或本领域技术人员已知的其他基因。在一些实施方案中，另外的基因产物是粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。
1.病毒
在一些实施方案中，感染原是病毒。在一些实施方案中，感染原是溶瘤病毒，或靶向特定细胞例如免疫细胞的病毒。在一些实施方案中，感染原靶向受试者中的肿瘤细胞和/或癌细胞。在一些实施方案中，感染原靶向免疫细胞或抗原呈递细胞(APC)。
在一些实施方案中，感染原是溶瘤病毒。溶瘤病毒是在肿瘤细胞中积累并在肿瘤细胞中复制的病毒。通过在细胞中复制，以及任选递送编码本文所述的变体CD155多肽或免疫调节多肽的核酸，肿瘤细胞被溶解，肿瘤收缩并且可以被消除。溶瘤病毒还可具有广泛的宿主和细胞类型范围。例如，溶瘤病毒可以在免疫特权细胞或免疫特权组织(包括肿瘤和/或转移，并且还包括受伤组织和细胞)中积累，从而允许在广泛的细胞类型范围内递送和表达编码本文所述变体免疫调节多肽的核酸。溶瘤病毒也可以以肿瘤细胞特异性方式复制，导致肿瘤细胞溶解和有效的肿瘤消退。
示例性溶瘤病毒包括腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、单纯疱疹病毒、水疱性口炎病毒、呼肠孤病毒、新城疫病毒、细小病毒、麻疹病毒、水疱性口炎病毒(VSV)、柯萨奇病毒和牛痘病毒。在一些实施方案中，溶瘤病毒可以特异性定殖于实体瘤，而不感染其他器官，并且可以用作感染原以将编码本文所述变体免疫调节多肽的核酸递送至此类实体瘤。
用于递送编码本文所述的变体CD155多肽或免疫调节多肽的核酸的溶瘤病毒可以是本领域技术人员已知的任何一种溶瘤病毒，并且包括例如水疱性口炎病毒，参见例如美国专利号7,731,974、7,153,510、6,653,103，美国专利公开号2010/0178684、2010/0172877、2010/0113567、2007/0098743、20050260601、20050220818以及欧洲专利号1385466、1606411和1520175；单纯疱疹病毒，参见例如，美国专利号7,897,146、7,731,952、7,550,296、7,537,924、6,723,316、6,428,968，美国专利公开号2014/0154216、2011/0177032、2011/0158948、2010/0092515、2009/0274728、2009/0285860、2009/0215147、2009/0010889、2007/0110720、2006/0039894、2004/0009604、2004/0063094，以及国际专利公开号WO 2007/052029、WO 1999/038955；逆转录病毒，参见例如美国专利公开号6,689,871、6,635,472、5,851,529、5,716,826、5,716,613和美国专利公开号20110212530；牛痘病毒，参见例如2016/0339066，以及腺相关病毒，参见例如美国专利号8,007,780、7,968,340、7,943,374、7,906,111、7,927,585、7,811,814、7,662,627、7,241,447、7,238,526、7,172,893、7,033,826、7,001,765、6,897,045和6,632,670。
溶瘤病毒还包括经遗传改变以减弱其毒性、改善其安全性、增强其肿瘤特异性的病毒，并且它们还配备有另外的基因，例如细胞毒素、细胞因子、前药转化酶以改善病毒的整体功效(参见例如Kirn等人，(2009)Nat Rev Cancer 9：64-71；Garcia-Aragoncillo等人，(2010)Curr Opin Mol Ther 12：403-411；参见美国专利号7,588,767、7,588,771、7,662,398和7,754,221，以及美国专利公开号2007/0202572、2007/0212727、2010/0062016、2009/0098529、2009/0053244、2009/0155287、2009/0117034、2010/0233078、2009/0162288、2010/0196325、2009/0136917和2011/0064650)。在一些实施方案中，溶瘤病毒可以是已经被修饰以使得它们在癌细胞中选择性地复制的那些溶瘤病毒，因此它们是溶瘤的。例如，溶瘤病毒是腺病毒，其被工程化为具有针对肿瘤治疗的改变的趋性并且也作为基因治疗载体。这样的示例是ONYX-015、H101和Ad5ΔCR(Hallden和Portella(2012)ExpertOpin Ther Targets，16：945-58)和TNFerade(McLoughlin等人(2005)Ann.Surg.Oncol.，12：825-30)，或条件复制型腺病毒
在一些实施方案中，感染原是经修饰的单纯疱疹病毒。在一些实施方案中，感染原是Talimogene laherparepvec(也称为T-Vec、Imlygic或OncoVex GM-CSF)的修饰形式，其被修饰为含有编码任何本文所述的变体免疫调节多肽的核酸，如本文所述的变体CD155多肽。在一些实施方案中，感染原是描述在例如WO 2007/052029、WO 1999/038955、US 2004/0063094、US 2014/0154216中的经修饰的单纯疱疹病毒，或其变体。
在一些实施方案中，感染原是靶向被给予病毒的受试者中的特定细胞类型的病毒，例如靶向免疫细胞或抗原呈递细胞(APC)的病毒。树突细胞(DC)是用于启动和控制免疫应答的必需APC。DC可以捕获和加工抗原，从外周迁移到淋巴器官，并以主要组织相容性复合物(MHC)限制的方式将抗原呈递给静息T细胞。在一些实施方案中，感染原是可特异性地靶向DC以递送编码变体CD155多肽或免疫调节多肽的核酸以在DC中表达的病毒。在一些实施方案中，病毒是慢病毒或其变体或衍生物，例如整合缺陷型慢病毒载体。在一些实施方案中，该病毒是慢病毒，其被假型化以有效结合并有效地感染能表达细胞表面标志物树突细胞特异性细胞间粘附分子-3-捕获非整合素(DC-SIGN)的细胞，如DC。在一些实施方案中，该病毒是用辛德比斯病毒E2糖蛋白或其修饰形式假型化的慢病毒，如WO 2013/149167中描述的那些慢病毒。在一些实施方案中，病毒允许将感兴趣的序列(例如，编码任何本文所述的变体CD155多肽或免疫调节多肽的核酸)递送至DC并表达该感兴趣的序列。在一些实施方案中，病毒包括WO 2008/011636或US 2011/0064763、Tareen et al.(2014)Mol.Ther.，22：575-587中描述的那些病毒，或其变体。树突细胞向性载体平台的实例是ZVexTM。
2.细菌
在一些实施方案中，感染原是细菌。例如，在一些实施方案中，细菌可以将编码任何本文所述的变体CD155多肽或免疫调节多肽的核酸递送至受试者中的靶细胞，如肿瘤细胞、免疫细胞、抗原呈递细胞和/或吞噬细胞。在一些实施方案中，细菌可以优先靶向受试者体内的特定环境，如肿瘤微环境(TME)，以用于表达和/或分泌变体免疫调节多肽，和/或靶向环境中的靶特异性细胞以用于表达变体免疫调节多肽。
在一些实施方案中，经由细菌介导的质粒DNA转移至哺乳动物细胞将核酸递送至细胞(也称为“细胞转染”)。例如，在一些实施方案中，通过整个细菌进入靶细胞来实现遗传物质的递送。在一些实施方案中，自发或诱导的细菌溶解可导致质粒的释放，以用于随后的真核细胞表达。在一些实施方案中，细菌可以将核酸递送至非吞噬哺乳动物细胞(例如，肿瘤细胞)和/或递送至吞噬细胞，例如某些免疫细胞和/或APC。在一些实施方案中，通过细菌递送的核酸可以转移至受试者中的细胞的细胞核中以用于表达。在一些实施方案中，核酸还包括在特定宿主细胞中表达编码变体免疫调节多肽的可操作连接的序列所必需的合适的核酸序列，例如调节元件如启动子或增强子。在一些实施方案中，感染原(其为细菌)可以以RNA的形式递送编码免疫调节蛋白的核酸，如预先制备的能翻译的RNA，其递送至靶细胞的细胞质以供靶细胞机制进行翻译。
在一些实施方案中，细菌可以复制并溶解靶细胞，例如，肿瘤细胞。在一些实施方案中，细菌可以在靶细胞的细胞质中含有和/或释放核酸序列和/或基因产物，从而杀死靶细胞，例如肿瘤细胞。在一些实施方案中，感染原是可以在受试者的特定环境(例如肿瘤微环境(TME))中特异性复制的细菌。例如，在一些实施方案中，细菌可以在厌氧或缺氧微环境中特异性地复制。在一些实施方案中，存在于特定环境中的条件或因子，例如在TME中由细胞产生的天冬氨酸、丝氨酸、柠檬酸、核糖或半乳糖，可充当化学引诱物以将细菌吸引到环境中。在一些实施方案中，细菌可以在环境中表达和/或分泌本文所述的免疫调节蛋白，例如TME。
在一些实施方案中，感染原是细菌，其为利斯特氏菌属物种、双歧杆菌属物种、埃希氏菌属物种、梭菌属物种、沙门氏菌属物种、志贺氏菌属物种、弧菌属物种或耶尔森氏菌属物种。在一些实施方案中，细菌选自单核细胞增生利斯特氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌、大肠杆菌、霍乱弧菌、产气荚膜梭菌、丁酸梭菌、诺氏梭菌、丙酮丁醇梭菌、婴儿双歧杆菌、长双歧杆菌和青春双歧杆菌中的一种或多种。在一些实施方案中，细菌是工程化细菌。在一些实施方案中，细菌是工程化细菌，如以下文献中描述的那些细菌，例如Seow和Wood(2009)Molecular Therapy 17(5)：767-777；Baban等人(2010)Bioengineered Bugs1：6，385-394；Patyar等人(2010)J Biomed Sci 17：21；Tangney等人(2010)BioengineeredBugs 1：4，284-287；van Pijkeren等人(2010)Hum Gene Ther.21(4)：405-416；WO 2012/149364；WO 2014/198002；US 9103831；US 9453227；US 2014/0186401；US 2004/0146488；US 2011/0293705；US 2015/0359909和EP 3020816。可以修饰细菌以递送编码任何本文提供的变体免疫调节多肽、缀合物和/或融合物的核酸序列，和/或以在受试者中表达此类变体免疫调节多肽。
F.用于产生该多肽或细胞的核酸、载体和方法
本文提供了分离的或重组的核酸(统称为“核酸”)，其编码本文提供的变体CD155多肽或免疫调节多肽的各种提供的实施方案中的任一种。在一些实施方案中，本文提供的核酸(包括下文所述的全部核酸)可用于重组生产(例如表达)本文提供的变体CD155多肽或免疫调节多肽。在一些实施方案中，本文提供的核酸(包括下文所述的全部核酸)可用于在细胞(如在工程化细胞中，例如，免疫细胞或感染原细胞)中表达本文提供的变体CD155多肽或免疫调节多肽。本文提供的核酸可以是RNA形式或DNA形式，并且包括mRNA、cRNA、重组或合成RNA和DNA，以及cDNA。本文提供的核酸通常是DNA分子，并且通常是双链DNA分子。然而，还提供了包含本发明的任何核苷酸序列的单链DNA、单链RNA、双链RNA和杂合DNA/RNA核酸或其组合。
本文还提供了重组表达载体和重组宿主细胞，其可用于产生本文提供的变体CD155多肽或免疫调节多肽。
本文还提供了工程化细胞，如工程化免疫细胞，其含有任何提供的核酸或编码的变体CD155多肽或免疫调节多肽，如任何跨膜免疫调节多肽或可分泌性免疫调节多肽。
本文还提供了感染原，如细菌或病毒细胞，其含有任何提供的核酸或编码的变体CD155多肽或免疫调节多肽，如任何跨膜免疫调节多肽或可分泌性免疫调节多肽。
在任何上述提供的实施方案中，可以使用重组DNA和克隆技术将编码本文提供的免疫调节多肽的核酸引入细胞中。为此，制备编码免疫调节多肽的重组DNA分子。制备这种DNA分子的方法是本领域公知的。例如，可以使用合适的限制酶从DNA切除编码肽的序列。或者，可以使用化学合成技术合成DNA分子，如亚磷酰胺法。此外，可以使用这些技术的组合。在一些情况下，可以通过聚合酶链反应(PCR)产生重组或合成核酸。在一些实施方案中，可以产生编码一种或多种变体CD155多肽的DNA插入片段，该一种或多种变体CD155多肽含有至少一个亲和力修饰的IgSF结构域，并且在一些实施方案中，根据提供的描述含有信号肽、跨膜结构域和/或胞内域。如本领域技术人员已知的，可以将该DNA插入片段克隆至合适的转导/转染载体中。还提供了含有核酸分子的表达载体。
在一些实施方案中，表达载体能够在适合于蛋白质表达的条件下在合适的细胞中表达免疫调节蛋白。在一些方面，核酸分子或表达载体包含编码与合适的表达控制序列可操作地连接的免疫调节蛋白的DNA分子。在DNA分子插入载体之前或之后实现这种有效连接的方法是公知的。表达控制序列包括启动子、激活子、增强子、操纵子、核糖体结合位点、起始信号、终止信号、加帽信号、多腺苷酸化信号和涉及转录或翻译控制的其他信号。
在一些实施方案中，免疫调节蛋白的表达受启动子或增强子控制以控制或调节表达。启动子与编码变体多肽或免疫调节蛋白的核酸分子部分可操作地连接。在一些实施方案中，启动子是组成型活性启动子(如组织特异性组成型活性启动子或其他组成型启动子)。在一些实施方案中，启动子是诱导型启动子，其可以对诱导剂(如T细胞激活信号)有响应。
在一些实施方案中，组成型启动子与编码变体多肽或免疫调节蛋白的核酸分子可操作地连接。示例性的组成型启动子包括猴空泡病毒40(SV40)启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子、泛素C(UbC)启动子和EF-1α(EF1a)启动子。在一些实施方案中，组成型启动子是组织特异性的。例如，在一些实施方案中，启动子允许免疫调节蛋白在特定组织(如免疫细胞、淋巴细胞或T细胞)中组成型表达。示例性组织特异性启动子描述在美国专利号5,998,205中，包括例如胎蛋白、DF3、酪氨酸酶、CEA、表面活性蛋白和ErbB2启动子。
在一些实施方案中，诱导型启动子与编码变体多肽或免疫调节蛋白的核酸分子可操作地连接，使得通过控制合适的转录诱导物的存在或不存在来控制核酸的表达。例如，启动子可以是调节的启动子和转录因子表达系统，如公开的四环素调节的系统或其他可调节的系统(参见例如公开的国际PCT申请号WO 01/30843)，以允许编码的多肽的调节的表达。示例性可调节启动子系统是例如可从Clontech(帕洛阿尔托，加利福尼亚州)获得的Tet-On(和Tet-Off)系统。该启动子系统允许通过四环素或四环素衍生物(如多西环素)控制的转基因的调节的表达。其他可调节的启动子系统是已知的(参见例如公开的美国申请号2002-0168714，标题为“Regulation of Gene Expression Using Single-Chain，Monomeric，Ligand Dependent Polypeptide Switches”，其描述了含有配体结合结构域和转录调节结构域(如来自激素受体的那些结构域)的基因开关)。
在一些实施方案中，启动子响应于对T细胞激活信号传导有响应的元件。仅举例来说，在一些实施方案中，工程化T细胞包含编码免疫调节蛋白的表达载体和可操作地连接的启动子以控制免疫调节蛋白的表达。工程化的T细胞可以被激活，例如通过工程化T细胞受体(TCR)或嵌合抗原反应器(CAR)的信号传导来激活，从而通过响应性启动子引发免疫调节蛋白的表达和分泌。
在一些实施方案中，诱导型启动子与编码免疫调节蛋白的核酸分子可操作地连接，使得免疫调节蛋白响应于活化T细胞的核因子(NFAT)或活化B细胞的核因子κ-轻链增强子(NF-κB)而表达。例如，在一些实施方案中，诱导型启动子包含NFAT或NF-κB的结合位点。例如，在一些实施方案中，启动子是NFAT或NF-κB启动子或其功能变体。因此，在一些实施方案中，核酸使得可以控制免疫调节蛋白的表达，同时还降低或消除免疫调节蛋白的毒性。特别地，包含本发明核酸的工程化免疫细胞仅在该细胞(例如，由该细胞表达的T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(CAR))被抗原特异性刺激和/或该细胞(例如，该细胞的钙信号传导途径)被例如佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯(PMA)/离子霉素非特异性刺激时才表达和分泌免疫调节蛋白。因此，免疫调节蛋白的表达和在一些情况下免疫调节蛋白的分泌可以控制仅在需要的时间和地点(例如，在存在感染性致病剂、癌症的存在下或在肿瘤部位)发生，这可以减少或避免不希望的免疫调节蛋白相互作用。
在一些实施方案中，编码本文所述免疫调节蛋白的核酸包含编码NFAT启动子、NF-κB启动子或其功能变体的合适核苷酸序列。如本文所用的“NFAT启动子”意指与最小启动子连接的一种或多种NFAT响应元件。“NF-κB启动子”是指与最小启动子连接的一种或多种NF-κB响应元件。在一些实施方案中，基因的最小启动子是最小的人IL-2启动子或CMV启动子。NFAT响应元件可包括例如NFAT1、NFAT2、NFAT3和/或NFAT4响应元件。NFAT启动子、NF-κB启动子或其功能变体可包含任何数量的结合基序，例如，至少两个、至少三个、至少四个、至少五个或至少六个、至少七个、至少八个、至少九个、至少十个、至少十一个或多达十二个结合基序。
其上具有DNA分子的所得重组表达载体用于转化合适的宿主。可以使用本领域公知的方法进行该转化。在一些实施方案中，本文提供的核酸还包含编码与编码免疫调节多肽的核酸可操作地连接的分泌或信号肽的核苷酸序列，使得从培养基、宿主细胞或宿主细胞周质中回收所得的可溶性免疫调节多肽。在其他实施方案中，选择合适的表达控制信号以允许免疫调节多肽的膜表达。此外，可商购试剂盒以及签约制造公司也可用于制备本文提供的工程化细胞或重组宿主细胞。
在一些实施方案中，其上具有DNA分子的所得表达载体用于转化(如转导)合适的细胞。可以使用本领域公知的方法进行引入。示例性方法包括用于转移编码受体的核酸的那些方法，包括经由病毒(例如逆转录病毒或慢病毒)、转导、转座子和电穿孔。在一些实施方案中，表达载体是病毒载体。在一些实施方案中，通过慢病毒或逆转录病毒转导方法将核酸转移至细胞中。
任何大量公共可获得的和公知的哺乳动物宿主细胞(包括哺乳动物T细胞或APC)都可用于制备多肽或工程化细胞。细胞的选择取决于本领域公认的许多因素。这些因素包括，例如，与所选表达载体的相容性、由DNA分子编码的肽的毒性、转化速率、肽的回收容易性、表达特征、生物安全性和成本。要平衡这些因素，必须认识到并非所有细胞对特定DNA序列的表达具有相同效果。
在一些实施方案中，宿主细胞可以是多种真核细胞(如酵母细胞)或哺乳动物细胞(如中国仓鼠卵巢(CHO)或HEK293细胞)。在一些实施方案中，宿主细胞是悬浮细胞，并且在培养的悬浮物中(例如在培养的悬浮CHO细胞例如CHO-S细胞中)工程化或产生该多肽。在一些实例中，细胞系是DHFR缺陷(DHFR-)的CHO细胞系，例如DG44和DUXB11。在一些实施方案中，细胞是谷氨酰胺合成酶(GS)缺陷的，例如CHO-S细胞、CHOK1 SV细胞和CHOZN((R))GS-/-细胞。在一些实施方案中，CHO细胞例如悬浮CHO细胞可以是CHO-S-2H2细胞、CHO-S-克隆14细胞或ExpiCHO-S细胞。
在一些实施方案中，宿主细胞也可以是原核细胞，如大肠杆菌。
在多肽表达条件下培养转化的重组宿主，然后纯化以获得可溶性蛋白质。可以在常规发酵条件下培养重组宿主细胞，使得表达所需的多肽。这种发酵条件是本领域公知的。最后，可以通过本领域公知的许多方法中的任何一种从重组细胞培养物中回收和纯化本文提供的多肽，该方法包括硫酸铵或乙醇沉淀、酸萃取、阴离子或阳离子交换色谱法、磷酸纤维素色谱法、疏水相互作用色谱法和亲和色谱法。根据需要，可以使用蛋白质重折叠步骤来完成成熟蛋白质的构型。最后，高效液相色谱法(HPLC)可用于最终的纯化步骤。
在一些实施方案中，细胞是免疫细胞，如与制备工程化细胞有关的上述任何免疫细胞。在一些实施方案中，这种工程化细胞是原代细胞。在一些实施方案中，工程化细胞对于受试者是自体同源的。在一些实施方案中，工程化细胞与受试者是同种异体的。在一些实施方案中，工程化细胞从受试者获得，如通过白细胞分离术，并离体转化以表达免疫调节多肽，例如跨膜免疫调节多肽或可分泌性免疫调节多肽。
还提供了编码本文所述的感染原中包含的任何变体免疫调节多肽的核酸。在一些实施方案中，感染原将核酸递送至受试者中的细胞，和/或允许编码的变体多肽在细胞中表达。还提供了用于生成、产生或修饰此类感染原的核酸。例如，在一些实施方案中，提供了载体和/或质粒，其含有编码变体免疫调节多肽的核酸，以用于产生感染原，递送至受试者中的细胞和/或在受试者的细胞中表达变体免疫调节多肽。
在一些实施方案中，提供的核酸是重组病毒或细菌载体，其含有编码变体免疫调节多肽的核酸序列。在一些实施方案中，重组载体可用于产生感染原，其含有编码变体免疫调节多肽和/或有待递送至受试者中的靶细胞以供靶细胞表达的核酸序列。在一些实施方案中，重组载体是表达载体。在一些实施方案中，重组载体包括生成和/或产生感染原和在靶细胞中表达所必需的合适序列。
在一些实施方案中，重组载体是质粒或粘粒。如本文所述，含有编码变体免疫调节多肽的核酸序列的质粒或粘粒很容易使用本领域公知的标准技术构建。为了生成感染原，载体或基因组可以以质粒形式构建，其随后可以转染至包装或生产细胞系或宿主细菌中。可以使用本领域已知的任何重组技术生成重组载体。在一些实施方案中，载体可包括原核复制起点和/或基因，该基因的表达赋予可检测的或可选择的标志物，如用于阻碍在原核系统中繁殖和/或选择的药物。
在一些实施方案中，重组载体是病毒载体。示例性重组病毒载体包括慢病毒载体基因组、痘病毒载体基因组、牛痘病毒载体基因组、腺病毒载体基因组、腺病毒相关病毒载体基因组、疱疹病毒载体基因组和α病毒载体基因组。病毒载体可以是活的、减毒的、有复制条件的或复制缺陷的、非致病的(有缺陷的)、可复制的病毒载体和/或经修饰以表达异源基因产物，例如本文提供的变体免疫调节多肽。用于生成病毒的载体还可以被修饰以改变病毒的衰减，其包括增加或减少转录或翻译负荷的任何方法。
可以使用的示例性病毒载体包括经修饰的牛痘病毒载体(参见例如Guerra等人，J.Virol.80：985-98(2006)；Tartaglia等人，AIDS Research and Human Retroviruses 8：1445-47(1992)；Gheradi等人，J.Gen.Virol.86：2925-36(2005)；Mayr等人，Infection 3：6-14(1975)；Hu等人，J.Virol.75：10300-308(2001)；美国专利号5,698,530、6,998,252、5,443,964、7,247,615和7,368,116)；腺病毒载体或腺病毒相关病毒载体(参见例如Molin等人，J.Virol.72：8358-61(1998)；Narumi等人，Am J.Respir.Cell Mol.Biol.19：936-41(1998)；Mercier等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101：6188-93(2004)；美国专利号6,143,290；6,596,535；6,855,317；6,936,257；7,125,717；7,378,087；7,550,296)；逆转录病毒载体，包括基于鼠白血病病毒(MuLV)、臂猿白血病病毒(GaLV)、亲嗜性逆转录病毒、猴免疫缺陷病毒(SIV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)和组合的那些病毒(参见例如Buchscher等人，J.Virol.66：2731-39(1992)；Johann等人，J.Virol.66：1635-40(1992)；Sommerfelt等人，Virology 176：58-59(1990)；Wilson等人，J.Virol.63：2374-78(1989)；Miller等人，J.Virol.65：2220-24(1991)；Miller等人，Mol.Cell Biol.10：4239(1990)；Kolberg，NIHRes.4：431992；Cornetta等人，Hum.Gene Ther.2：215(1991))；慢病毒载体，包括基于人类免疫缺陷病毒(HIV-1)、HIV-2、猫免疫缺陷病毒(FIV)、马传染性贫血病毒、猴免疫缺陷病毒(SIV)和maedi/visna病毒的那些病毒(参见例如Pfeifer等人，Annu.Rev.GenomicsHum.Genet.2：177-211(2001)；Zufferey等人，J.Virol.72：9873，1998；Miyoshi等人，J.Virol.72：8150，1998；Philpott和Thrasher，Human Gene Therapy 18：8，2007；Engelman等人，J.Virol.69：2729，1995；Nightingale等人，Mol.Therapy，13：1121，2006；Brown等人，J.Virol.73：9011(1999)；WO 2009/076524；WO 2012/141984；WO 2016/011083；McWilliams等人，J.Virol.77：11150，2003；Powell等人，J.Virol.70：5288，1996)或其任何变体，和/或可用于生成任何上述病毒的载体。在一些实施方案中，重组载体可以包括调节序列，如启动子或增强子序列，该调节序列可以调节病毒基因组(如在RNA病毒的情况下)在包装细胞系中的表达(参见例如美国专利号5,385,839和5,168,062)。
在一些实施方案中，重组载体是表达载体，例如，当递送至靶细胞(例如受试者中的细胞，例如肿瘤细胞、免疫细胞和/或APC)中时允许编码的基因产物进行表达的表达载体。在一些实施方案中，感染原中包含的重组表达载体能够在适合于蛋白质表达的条件下在受试者的靶细胞中表达免疫调节蛋白。
在一些方面，核酸或表达载体包含编码与合适的表达控制序列可操作地连接的免疫调节蛋白的核酸序列。在编码免疫调节蛋白的核酸序列插入载体中之前或之后实现这种可操作连接的方法是公知的。表达控制序列包括启动子、激活子、增强子、操纵子、核糖体结合位点、起始信号、终止信号、加帽信号、多腺苷酸化信号和涉及转录或翻译控制的其他信号。启动子可以与编码免疫调节蛋白的核酸序列的部分可操作地连接。在一些实施方案中，启动子是靶细胞中的组成型活性启动子(如组织特异性组成型活性启动子或其他组成型启动子)。例如，重组表达载体还可以包括淋巴组织特异性转录调节元件(TRE)，如B淋巴细胞、T淋巴细胞或树突细胞特异性TRE。淋巴组织特异性TRE是本领域已知的(参见例如Thompson等人，Mol.Cell.Biol.12：1043-53(1992)；Todd等人，J.Exp.Med.177：1663-74(1993)；Penix等人，J.Exp.Med.178：1483-96(1993))。在一些实施方案中，启动子是诱导型启动子，其可以对诱导剂(如T细胞激活信号)有响应。在一些实施方案中，递送至受试者中的靶细胞的核酸，例如肿瘤细胞、免疫细胞和/或APC，可以与上述任何调节元件可操作地连接。
在一些实施方案中，载体是细菌载体，例如，细菌质粒或粘粒。在一些实施方案中，经由细菌介导的质粒DNA转移至哺乳动物细胞(也称为“细胞转染”)将细菌载体递送至靶细胞，例如肿瘤细胞、免疫细胞和/或APC。在一些实施方案中，递送的细菌载体还含有用于在靶细胞中表达的合适的表达控制序列，例如启动子序列和/或增强子序列或上述任何调节或控制序列。在一些实施方案中，细菌载体含有合适的表达控制序列，以用于在感染原例如细菌中表达和/或分泌编码的变体多肽。
在一些实施方案中，本文提供的多肽也可以通过合成方法制备。固相合成是制备单独肽的优选技术，因为它是制备小肽的最划算的方法。例如，公知的固相合成技术包括保护基团、接头和固相支持体的使用以及特定的保护和去保护反应条件、接头裂解条件、清除剂的使用以及固相肽合成的其他方面。然后可将肽组装成本文提供的多肽。
IV.评估变体CD155多肽和免疫调节蛋白的活性免疫调节的方法
在一些实施方案中，本文提供的变体CD155多肽(例如全长和/或特异性结合片段或缀合物、堆叠构建体或其融合物或工程化细胞)显示出调节T细胞活化的免疫调节活性。在一些实施方案中，相对于野生型或未修饰的CD155对照，CD155多肽在T细胞测定中调节IFN-γ表达。在一些情况下，相对于对照，IFN-γ表达的调节可以增加或降低IFN-γ表达。用于确定特异性结合和IFN-γ表达的测定是本领域公知的，并且包括测量培养上清液中干扰素-γ细胞因子水平的MLR(混合淋巴细胞反应)测定(Wang等人，Cancer ImmunolRes.2014Sep：2(9)：846-56)、SEB(葡萄球菌肠毒素B)T细胞刺激测定(Wang等人，CancerImmunol Res.2014Sep：2(9)：846-56)和抗CD3T细胞刺激测定(Li和Kurlander，J TranslMed.2010：8：104)。
在一些实施方案中，相对于野生型CD155对照，变体CD155多肽在一些实施方案中可以增加或在替代实施方案中降低原代T细胞测定中的IFN-γ(干扰素-γ)表达。在一些实施方案中，这类活性可以取决于变体CD155多肽是以用于拮抗剂活性的形式提供的还是以用于激动剂活性的形式提供的。在一些实施方案中，变体CD155多肽或免疫调节蛋白是抑制型受体的拮抗剂，例如阻断细胞中的抑制性信号，该抑制性信号的出现会降低对活化刺激物(例如CD3和/或CD28共刺激信号或促有丝分裂信号)的应答。本领域技术人员会认识到存在用于确定IFN-γ表达的增加或减少的不同形式的原代T细胞测定。
在测定变体CD155在原代T细胞测定中增加或减少IFN-γ表达的能力时，可以使用混合淋巴细胞反应(MLR)测定。在一些情况下，可使用优先或特异性结合CD226的可溶形式的变体CD155来确定变体CD155拮抗T细胞并因此降低MLR中IFN-γ表达的能力。
或者，在一些实施方案中，以拮抗剂形式(例如可溶性形式)提供的变体CD155多肽或免疫调节蛋白(例如变体CD155-Fc或可分泌性免疫调节蛋白)阻断TIGIT抑制型受体的活性并因此增加测定中的MLR活性，例如通过测定中IFN-γ的产生增加而观察到的。因此，在一些实施方案中，优先结合TIGIT的可溶形式的变体CD155用于确定变体CD155阻断T细胞中的抑制性信号并因此增加MLR中IFN-γ表达的能力。
在一些实施方案中，以激动剂形式提供的变体CD155多肽或免疫调节蛋白(例如所提供的含有肿瘤定位部分的定位vIgD堆叠或缀合物，或表达跨膜免疫调节蛋白的工程化细胞)可以刺激TIGIT抑制型受体的活性并因此降低MLR活性，例如通过IFN-γ产生减少所证明的。在一些实施方案中，以激动剂形式提供的变体CD155多肽或免疫调节蛋白(例如所提供的含有肿瘤定位部分的定位vIgD堆叠或缀合物，或表达跨膜免疫调节蛋白的工程化细胞)可以阻断TIGIT抑制型受体的活性并因此增加MLR活性例如增加IFN-γ产生。
或者，在测定变体CD155在原代T细胞测定中调节IFN-γ表达的增加或减少的能力时，可以使用共固定化测定。在共固定化测定中，在一些实施方案中通过抗CD3抗体提供的TCR信号与共固定化变体CD155联合使用，以测定相对于CD155未修饰的或野生型对照增加或减少IFN-γ表达的能力。在一些实施方案中，变体CD155多肽或免疫调节蛋白例如共固定化变体CD155(例如CD155-Fc)在共固定化测定中减少IFN-γ产生。
在一些实施方案中，在测定变体CD155调节IFN-γ表达的增加或减少的能力时，可以使用T细胞报告基因测定。在一些实施方案中，T细胞是Jurkat T细胞系或来源于JurkatT细胞系。在报告基因测定中，还产生报告基因细胞系(例如Jurkat报告基因细胞)以过表达抑制型受体，该抑制型受体是变体IgSF结构域多肽的同源结合配偶体。例如，在变体CD155的情况下，产生报告基因细胞系(例如Jurkat报告基因细胞)以过表达TIGIT。在一些实施方案中，报告基因T细胞还含有报告基因构建体，其含有与报告基因可操作地连接的对T细胞活化有响应的诱导型启动子。在一些实施方案中，报告基因是荧光或发光报告基因。在一些实施方案中，报告基因是萤光素酶。在一些实施方案中，启动子对CD3信号传导有响应。在一些实施方案中，启动子是NFAT启动子。在一些实施方案中，启动子对共刺激信号传导例如CD28共刺激信号传导有响应。在一些实施方案中，启动子是IL-2启动子。
在报告基因测定方面，例如通过与表达抑制型受体的野生型配体(例如CD155)的抗原呈递细胞(APC)共同孵育来刺激报告基因细胞系。在一些实施方案中，APC是人TAPC。人TAPC是本领域技术人员熟知的。在一些实施方案中，人TAPC衍生自一种或多种哺乳动物细胞系例如K562、CHO或293细胞。
在一些实施方案中，Jurkat报告基因细胞在变体IgSF结构域分子或免疫调节蛋白(例如变体CD155多肽或免疫调节蛋白)的存在下与过表达抑制型配体的人TAPC共同孵育。在一些实施方案中，通过测定细胞的发光或荧光来监测报告基因的表达。在一些实施方案中，例如与对照(例如通过共同孵育对照T细胞与APC(其中不存在抑制型报告基因和配体相互作用，例如不过表达CD155的APC)得到的报告基因表达)相比，其抑制型受体与配体之间的正常相互作用导致报告基因信号的抑制或减少。在一些实施方案中，本文提供的变体CD155多肽或免疫调节蛋白拮抗该相互作用，例如当以可溶形式作为变体CD155-Fc提供时或当从APC表达作为可分泌性免疫调节蛋白时，因此导致与不存在变体CD155多肽或免疫调节蛋白的情况相比报告基因信号增加。在一些情况下，如本文所提供的特定形式的变体CD155多肽或免疫调节蛋白可以提供激动活性，因此与不存在变体CD155多肽或免疫调节蛋白的情况相比减少报告基因表达。
合适的对照的使用是本领域技术人员已知的，然而，在前述实施方案中，对照通常涉及使用未修饰的CD155，如来自相同哺乳动物物种的野生型天然CD155同种型(由其衍生或形成变体CD155)。在一些实施方案中，野生型或天然CD155具有与变体相同的形式或对应的形式。例如，如果变体CD155是含有与Fc蛋白融合的变体ECD的可溶形式，那么对照是含有与Fc蛋白融合的野生型或天然的CD155的ECD的可溶形式。不论对TIGIT的结合亲和力和/或选择性是增加还是降低，在T细胞测定中，相对于野生型CD155对照，变体CD155在一些实施方案中会增加IFN-γ表达，而在另外的实施方案中会减少IFN-γ表达。
在一些实施方案中，相对于野生型或未修饰的CD155对照，变体CD155多肽或免疫调节蛋白使IFN-γ表达(即蛋白质表达)增加至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更高。在其他实施方案中，相对于野生型或未修饰的CD155对照，变体CD155或免疫调节蛋白使IFN-γ表达(即蛋白质表达)减少至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更高。在一些实施方案中，野生型CD155对照是鼠CD155，如通常用于变体CD155，该变体CD155的序列改变自野生型鼠CD155序列的序列。在一些实施方案中，野生型CD155对照是人CD155，如通常用于变体CD155，该变体CD155的序列改变自野生型人CD155序列的序列，该野生型CD155对照例如包含SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：58或SEQ IDNO：155的氨基酸序列的CD155序列。
V.药物制剂
本文提供了含有本文所述的任何变体CD155多肽、免疫调节蛋白、缀合物、工程化细胞或感染原的组合物。药物组合物可进一步包含药学上可接受的赋形剂。例如，药物组合物可含有一种或多种赋形剂，以用于改变、维持或保持例如组合物的pH、渗透压、粘度、透明度、颜色、等渗性、气味、无菌性、稳定性、溶解或释放速率、吸附或渗透。在一些方面，技术人员理解含有细胞的药物组合物可以不同于含有蛋白质的药物组合物。
在一些实施方案中，药物组合物是固体，如粉末、胶囊或片剂。例如，可以冻干药物组合物的组分。在一些实施方案中，在给予之前将固体药物组合物重构或溶解在液体中。
在一些实施方案中，药物组合物是液体，例如溶解在水溶液(如生理盐水或林格氏溶液)中的变体CD155多肽。在一些实施方案中，药物组合物的pH为约4.0至约8.5(如约4.0至约5.0、约4.5至约5.5、约5.0至约6.0、约5.5至约6.5、约6.0至约7.0、约6.5至约7.5、约7.0至约8.0或约7.5至约8.5)。
在一些实施方案中，药物组合物包含药学上可接受的赋形剂，例如填充剂、粘合剂、包衣、防腐剂、润滑剂、调味剂、甜味剂、着色剂、溶剂、缓冲剂、螯合剂或稳定剂。药学上可接受的填充剂的例子包括纤维素、磷酸氢钙、碳酸钙、微晶纤维素、蔗糖、乳糖、葡萄糖、甘露醇、山梨糖醇、麦芽酚、预胶化淀粉、玉米淀粉或马铃薯淀粉。药学上可接受的粘合剂的例子包括聚乙烯吡咯烷酮、淀粉、乳糖、木糖醇、山梨糖醇、麦芽糖醇、明胶、蔗糖、聚乙二醇、甲基纤维素或纤维素。药学上可接受的包衣的例子包括羟丙基甲基纤维素(HPMC)、虫胶、玉米蛋白玉米醇溶蛋白或明胶。药学上可接受的崩解剂的例子包括聚乙烯吡咯烷酮、羧甲基纤维素或羟基乙酸淀粉钠。药学上可接受的润滑剂的例子包括聚乙二醇、硬脂酸镁或硬脂酸。药学上可接受的防腐剂的例子包括对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯甲酸或山梨酸。药学上可接受的甜味剂的例子包括蔗糖、糖精、阿斯巴甜或山梨糖醇。药学上可接受的缓冲剂的例子包括碳酸盐、柠檬酸盐、葡糖酸盐、乙酸盐、磷酸盐或酒石酸盐。
在一些实施方案中，药物组合物还包含用于控制或持续释放产物的试剂，如可注射的微球、生物可侵蚀的颗粒、聚合化合物(聚乳酸、聚乙醇酸)、珠粒或脂质体。
在一些实施方案中，药物组合物是无菌的。可以通过无菌过滤膜进行过滤或辐射来完成灭菌。在冻干组合物的情况下，可以在冻干和重构之前或之后使用该方法进行灭菌。用于肠胃外给药的组合物可以以冻干形式或溶液形式储存。此外，通常肠胃外组合物通常置于具有无菌进入口的容器中，例如具有可由皮下注射针刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小瓶。
在一些实施方案中，提供了含有跨膜免疫调节蛋白的药物组合物，包括表达这种跨膜免疫调节蛋白的工程化细胞。在一些实施方案中，药物组合物和制剂包括一种或多种任选的药学上可接受的载体或赋形剂。此类组合物可包含缓冲液，如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水等；碳水化合物，如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如氢氧化铝)；和防腐剂。优选配制本发明的组合物用于静脉内给药。
在一些实施方案中，药物组合物包含含有编码免疫调节变体多肽的核酸序列的感染原。在一些实施方案中，药物组合物含有一定剂量的感染原，该剂量适合于给予适合治疗的受试者。在一些实施方案中，药物组合物含有感染原，该感染原是单剂量或多剂量的病毒，其为或为约1×105至约1×1012噬斑形成单位(pfu)、1×106至1×1010pfu，或1×107至1×1010pfu，每个范围均包括端点，如至少或至少约或约1×106、1×107、1×108、1×109、2×109、3×109、4×109、5×109pfu或约1×1010pfu。在一些实施方案中，药物组合物可含有约105至约1010pfu/mL的病毒浓度，例如，5×106至5×109或1×107至1×109pfu/mL，如至少或至少约或约106pfu/mL、107pfu/mL、108pfu/mL或109pfu/mL。在一些实施方案中，药物组合物含有感染原，该感染原是单剂量或多剂量的细菌，其为或为约1×103至约1×109菌落形成单位(cfu)、1×104至1×109cfu或1×105至1×107cfu，每个范围均包括端点，如至少或至少约或约1×104、1×105、1×106、1×107、1×108或1×109cfu。在一些实施方案中，药物组合物可含有浓度为或为约103至约108cfu/mL的细菌，例如，5×105至5×107或1×106至1×107cfu/mL，如至少或至少约或约105cfu/mL、106cfu/mL、107cfu/mL或108cfu/mL。
例如，这种制剂可以是适合于静脉内输注的形式。药学上可接受的载体可以是药学上可接受的材料、组合物或媒介物，其涉及将感兴趣的细胞从身体的一个组织、器官或部分携带或运送至身体的另一个组织、器官或部位。例如，载体可以是液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或包封材料或它们的一些组合。载体的每种组分必须是“药学上可接受的”，因为它必须与制剂的其他成分相容。它也必须适合于与任何可能遇到的身体的组织、器官或部位接触，这意味着它不得带有毒性、刺激、过敏反应、免疫原性或胜过其治疗益处的任何其他并发症的风险。
在一些实施方案中，将药物组合物给予受试者。通常，根据标准药学实践，根据受试者的体型和状况确定药物组合物的剂量和给药途径。例如，最初可以在细胞培养测定中或在动物模型如小鼠、大鼠、兔、狗、猪或猴中估算治疗有效剂量。动物模型也可用于确定合适的浓度范围和给药途径。然后，这些信息可用于确定人体给药的有用剂量和途径。确切的剂量将根据与需要治疗的受试者相关的因素来确定。调整剂量和给药以提供足够水平的活性化合物或以维持所需效果。可以考虑的因素包括疾病状态的严重程度、受试者的一般健康状况、受试者的年龄、体重和性别、给药的时间和频率、一种或多种药物组合、反应敏感性以及对治疗的反应。
长效药物组合物可以根据特定制剂的半衰期和清除率每3至4天、每周或每两周给予一次。给药频率将取决于所用制剂中分子的药代动力学参数。通常，给予组合物直至达到实现所需效果的剂量。因此，组合物可以以单剂量的方式给予，或随时间以多剂量(以相同或不同的浓度/剂量)的方式给予，或以连续输注的方式给予。常规地对合适的剂量做出进一步改进。通过使用适当的剂量反应数据可以确定合适的剂量。可以监测许多针对治疗效果的生物标志物或生理学标志物，包括T细胞活化或增殖、细胞因子合成或产生(例如，TNF-α、IFN-γ、IL-2的产生)、诱导各种活化标志物(例如，CD25、IL-2受体)、炎症、关节肿胀或压痛、C反应蛋白的血清水平、抗胶原抗体产生和/或一种或多种T细胞依赖性抗体应答。
在一些实施方案中，药物组合物通过任何途径给予受试者，包括口服、透皮、吸入、静脉内、动脉内、肌肉内、直接施用于伤口部位、施用于手术部位、腹膜内、通过栓剂、皮下、皮内、经皮、通过雾化、胸膜内、心室内、关节内、眼内或脊柱内。
在一些实施方案中，药物组合物的剂量是单剂量或重复剂量。在一些实施方案中，向受试者给予剂量为每天一次、每天两次、每天三次或每天四次或每天更多次。在一些实施方案中，在一周内给予约1或更多(如约2或更多、约3或更多、约4或更多、约5或更多、约6或更多或约7或更多)个剂量。在一些实施方案中，在数天、数周、数月或数年的过程中给予多剂量。在一些实施方案中，治疗过程为约1或更多个剂量(例如约2或更多个剂量、约3或更多个剂量、约4或更多个剂量、约5或更多个剂量、约7或更多个剂量、约10或更多个剂量、约15或更多个剂量、约25或更多个剂量、约40或更多个剂量、约50或更多个剂量或约100或更多个剂量)。
在一些实施方案中，所给予的药物组合物的剂量为每kg受试者体重约1μg蛋白质或更多(如每kg受试者体重约2μg蛋白质或更多、每kg受试者体重约5μg蛋白质)或更多、每kg受试者体重约10μg蛋白质或更多、每kg受试者体重约25μg蛋白质或更多、每kg受试者体重约50μg蛋白质或更多、每kg受试者体重约100μg蛋白质或更高、每kg受试者体重约250μg蛋白质或更多、每kg受试者体重约500μg蛋白质或更多、每kg受试者体重约1mg蛋白质或更多、每kg受试者体重约2mg蛋白质或更多或每kg受试者体重约5mg蛋白质或更多)。
在一些实施方案中，给予治疗量的细胞组合物。通常，医生可以考虑到年龄、体重、肿瘤大小、感染或转移的程度以及患者(受试者)的状况的个体差异来确定待给予的本发明组合物的精确量。通常，可以说包含如本文所述的工程化细胞(例如，T细胞)的药物组合物可以以104至109个细胞/kg体重(如105至106个细胞/kg体重，包括在这些范围内的所有整数值)的剂量给予。工程化细胞组合物，如T细胞组合物，也可以按这些剂量多次给予。可以通过使用在免疫疗法中通常已知的输注技术来给予细胞(参见例如Rosenberg等人，NewEng.J.of Med.319：1676，1988)。通过监测患者的疾病体征并相应地调整治疗，医学领域的技术人员可以容易地确定特定患者的最佳剂量和治疗方案。
已知多种方法用于确定给予本发明的治疗组合物通过如下方式是否可充分调节免疫活性：消除、隔离或灭活介导或能够介导不希望的免疫应答的免疫细胞；诱导、产生或开启介导或能够介导保护性免疫应答的免疫细胞；改变免疫细胞的物理或功能特性；或这些效果的组合。免疫活性调节的测量的例子包括但不限于检查免疫细胞群的存在或不存在(使用流式细胞术、免疫组织化学、组织学、电子显微镜、聚合酶链反应(PCR))；测量免疫细胞的功能能力，包括响应于信号进行增殖或分裂的能力或抵抗增殖或分裂(如使用T细胞增殖测定和基于用抗CD3抗体、抗T细胞受体抗体、抗CD28抗体、钙离子载体、载有肽或蛋白质抗原的PMA(佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯)抗原呈递细胞刺激后刺激后3H-胸苷掺入的肽扫描分析；B细胞增殖测定)；测量杀死或溶解其他细胞的能力(如细胞毒性T细胞测定)；测量细胞因子、趋化因子、细胞表面分子、抗体和细胞的其他产物(例如，通过流式细胞术、酶联免疫吸附测定、Western印迹分析、蛋白质微阵列分析、免疫沉淀分析)；测量免疫细胞或免疫细胞内信号传导途径的活化的生化标志物(例如Western印迹和免疫沉淀分析酪氨酸、丝氨酸或苏氨酸磷酸化、多肽切割以及蛋白质复合物的形成或解离；蛋白质阵列分析；DNA转录、使用DNA阵列或消减杂交的分析)；通过细胞凋亡、坏死或其他机制测量细胞死亡(例如，膜联蛋白V染色、TUNEL测定、用于测量DNA梯度的凝胶电泳、组织学；荧光半胱天冬酶测定、半胱天冬酶底物的Western印迹分析)；测量由免疫细胞产生的基因、蛋白质和其他分子(例如，Northern印迹分析、聚合酶链反应、DNA微阵列、蛋白质微阵列、2维凝胶电泳、Western印迹分析、酶联免疫吸附测定、流式细胞术)；以及测量临床症状或结果，如改善自身免疫、神经退行性疾病和其他涉及自身蛋白质或自身多肽的疾病(临床评分、使用其他疗法的要求、功能状态、影像学研究)，例如，在多发性硬化的情况下通过测量复发率或者疾病严重程度(使用普通技术人员已知的临床评分)，在I型糖尿病的情况下测量血糖，或在类风湿性关节炎的情况下测量关节炎症。
VI.制品和试剂盒
本文还提供了在合适包装中的包含本文所述药物组合物的制品。用于本文所述组合物的合适包装是本领域已知的，并且包括例如小瓶(如密封小瓶)、器皿、安瓿、瓶子、罐子、软包装(例如，密封的聚酯薄膜(Mylar)或塑料袋)等。可进一步将这些制品灭菌和/或密封。
还提供了包含本文所述的药物组合物(或制品)的试剂盒，其可还包含关于使用该组合物(如本文所述的用途)的方法的说明书。本文所述的试剂盒还可包含商业和用户角度所需的其他材料，包括其他缓冲液、稀释剂、过滤器、针头、注射器以及具有针对执行本文所述任何方法的说明书的包装插页。
VII治疗应用
本文所述的药物组合物(包括包含本文所述的变体CD155多肽、免疫调节蛋白、缀合物和工程化细胞的药物组合物)可用于多种治疗应用，如疾病的治疗。例如，在一些实施方案中，药物组合物用于治疗哺乳动物的炎性或自身免疫性疾病、癌症、器官移植、病毒感染和/或细菌感染。药物组合物可以调节(例如增加或减少)免疫应答以治疗疾病。
在一些实施方案中，所提供的方法适用于本文所述的变体CD155多肽、免疫调节蛋白、缀合物、工程化细胞和感染原的治疗性给予。鉴于所提供的公开内容，技术人员能够根据所需的免疫应答的调节类型选择用于指示的形式。
在一些实施方案中，给予能刺激免疫应答的本文提供的药物组合物，其可用于例如治疗癌症、病毒感染或细菌感染。在一些实施方案中，药物组合物含有某种形式的变体CD155多肽，其显示出其同源结合配偶体TIGIT的拮抗剂活性和/或抑制经由TIGIT的信号传导。用于与此类治疗性应用结合使用的CD155多肽的示例性形式包括，例如，可溶性的变体CD155多肽(例如变体CD155-Fc融合蛋白)、免疫调节蛋白或变体CD155多肽和另一个IgSF结构域(包括为Fc融合物的其可溶形式)的“堆叠”、表达可分泌性免疫调节蛋白的工程化细胞、或包含编码可分泌性免疫调节蛋白的核酸分子的感染原(例如用于在被感染的细胞(例如肿瘤细胞或APC例如树突细胞)中表达并分泌该可分泌性免疫调节蛋白)。
在一些实施方案中，药物组合物可用于抑制哺乳动物癌细胞(如人癌细胞)的生长。治疗癌症的方法可包括向患有癌症的受试者给予有效量的本文所述的任何药物组合物。可给予有效量的药物组合物以抑制、中止或逆转癌症的进展，癌症包括对例如通过所提供的变体或免疫调节蛋白进行免疫学活性的调节敏感的癌症。可以体内或离体处理人癌细胞。在离体处理人患者时，在体外处理含有癌细胞的组织或流体，然后将该组织或流体重新引回到患者体内。在一些实施方案中，通过给予患者治疗性组合物而在人患者中体内治疗癌症。因此，本发明提供了抑制、中止或逆转肿瘤的进展或者以其他方式导致与使用对照的治疗相比无进展存活(即，患者存活的同时携带不恶化的癌症的治疗期间和治疗之后的时间长度)或者总体存活(也称为“存活率”；即研究或治疗组中被诊断患有癌症或治疗癌症后存活持续一定时间的人的百分比)统计学上显著增加的离体和体内方法。
可通过本文所述的药物组合物和治疗方法治疗的癌症包括但不限于黑色素瘤、膀胱癌、血液恶性肿瘤(白血病、淋巴瘤、骨髓瘤)、肝癌、脑癌、肾癌、乳腺癌、胰腺癌(腺癌)、结直肠癌、肺癌(小细胞肺癌和非小细胞肺癌)、脾癌、胸腺癌或血细胞癌(即白血病)、前列腺癌、睾丸癌、卵巢癌、子宫癌、胃癌、肌肉骨骼癌、头颈癌、胃肠癌、生殖细胞癌或内分泌和神经内分泌癌。在一些实施方案中，癌症是尤因氏肉瘤。在一些实施方案中，癌症选自黑色素瘤、肺癌、膀胱癌和血液恶性肿瘤。在一些实施方案中，癌症是淋巴瘤、淋巴性白血病、骨髓性白血病、宫颈癌、神经母细胞瘤或多发性骨髓瘤。
在一些实施方案中，药物组合物作为单一疗法(即，作为单一药剂)或作为组合疗法(即，与一种或多种另外的抗癌剂组合，如化学治疗药物、癌症疫苗或免疫检查点抑制剂)给予。在一些实施方案中，药物组合物还可以与放射疗法一起给予。在本发明的公开内容的一些方面，免疫检查点抑制剂是nivolumab、tremelimumab、pembrolizumab、ipilimumab等。
在一些实施方案中，药物组合物抑制免疫应答，其可用于治疗炎性或自身免疫性疾病或器官移植。在一些实施方案中，药物组合物含有某种形式的变体CD155多肽，其显示出其同源结合配偶体TIGIT的激动剂活性和/或经由TIGIT刺激抑制性信号传导。用于与此类治疗性应用结合使用的CD155多肽的示例性形式包括，例如，免疫调节蛋白或变体CD155多肽和IgSF结构域的“堆叠”或定位到炎性环境的细胞或组织的其变体、含有与定位到炎性环境的细胞或组织的部分连接的变体CD155多肽的缀合物、表达跨膜免疫调节蛋白的工程化细胞、或包含编码跨膜免疫调节蛋白的核酸分子的感染原(例如用于在被感染的细胞中表达该跨膜免疫调节蛋白)。
在一些实施方案中，该炎性或自身免疫病症是抗中性粒细胞胞浆抗体(ANCA)相关的血管炎、血管炎、自身免疫性皮肤病、移植、风湿性疾病、炎性胃肠疾病、炎性眼病、炎性神经疾病、炎性肺病、炎性内分泌疾病或自身免疫性血液病。
在一些实施方案中，可通过本文所述的药物组合物治疗的炎性和自身免疫病症是艾迪生病、过敏、斑秃、阿尔茨海默症、抗中性粒细胞胞浆抗体(ANCA)相关性血管炎、强直性脊柱炎、抗磷脂综合征(休斯综合征)、哮喘、动脉粥样硬化、类风湿性关节炎、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、自身免疫性内耳疾病、自身免疫性淋巴增生综合征、自身免疫性心肌炎、自身免疫性卵巢炎、自身免疫性睾丸炎、无精子症、白塞病、伯杰病、大疱性类天疱疮、心肌病、心血管疾病、口炎性腹泻/乳糜泻、慢性疲劳免疫功能障碍综合征(CFIDS)、慢性特发性多发性神经炎、慢性炎性脱髓鞘、多发性神经病变(CIDP)、慢性复发性多发性神经病(格林-巴利综合征)、Churg-Strauss综合征(CSS)、瘢痕性类天疱疮、冷凝激素病(CAD)、COPD(慢性阻塞性肺病)、CREST综合征、克罗恩病、皮炎、疱疹、皮肌炎、糖尿病、盘状狼疮、湿疹、获得性大疱性表皮松解症、原发性混合型冷球蛋白血症、埃文综合征、眼球突出、纤维肌痛、Goodpasture综合征、格雷夫斯病、桥本氏甲状腺炎、特发性肺纤维化、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、IgA肾病、免疫增殖性疾病或病症、炎性肠病(IBD)、间质性肺病、幼年型关节炎、幼年特发性关节炎(JIA)、川崎病、Lambert-Eaton肌无力综合征、扁平苔藓、狼疮性肾炎、淋巴细胞性垂体炎、Ménière病、米勒鱼综合征/急性播散性脑脊髓神经病变、混合性结缔组织病、多发性硬化(MS)、肌肉风湿病、肌痛性脑脊髓炎(ME)、重症肌无力、眼部炎症、落叶型天疱疮、寻常型天疱疮、恶性贫血、结节性多动脉炎、多软骨炎、多腺性综合征(Whitaker综合征)、风湿性多肌痛、多发性肌炎、原发性丙种球蛋白血症、原发性胆汁性肝硬化/自身免疫性胆管病、银屑病、银屑病关节炎、雷诺现象、瑞特综合征/反应性关节炎、再狭窄、风湿热、风湿性疾病、结节病、施密特综合征、硬皮病、综合征、僵人综合征、系统性红斑狼疮(SLE)、系统性硬皮病、大动脉炎、颞动脉炎/巨细胞动脉炎、甲状腺炎、1型糖尿病、溃疡性结肠炎、葡萄膜炎、血管炎、白癜风、间质性肠病或韦格纳肉芽肿病。在一些实施方案中，炎性或自身免疫性病症选自间质性肠病、移植、克罗恩病、溃疡性结肠炎、多发性硬化、哮喘、类风湿性关节炎和银屑病。
在一些实施方案中，给予药物组合物以调节自身免疫病况。例如，抑制免疫应答在用于抑制接受者对供体的组织、细胞或器官移植的排斥的方法中是有益的。因此，在一些实施方案中，本文所述的药物组合物用于限制或预防移植物相关或移植相关的疾病或病症，如移植物抗宿主病(GVHD)。在一些实施方案中，药物组合物用于抑制移植(transplant或graft)的骨髓、器官、皮肤、肌肉、神经元、胰岛或实质细胞的自身免疫排斥。
本文所述的包含工程化细胞的药物组合物和方法可用于过继细胞转移应用。在一些实施方案中，包含工程化细胞的细胞组合物可以在相关方法中使用，例如用于调节免疫疗法方法中的免疫活性以治疗例如哺乳动物癌症，或者在其他实施方案中，治疗自身免疫病症。所采用的方法通常包括在允许亲和力修饰的IgSF结构域的特异性结合和调节哺乳动物细胞的免疫活性的条件下使本发明的TIP与哺乳动物细胞接触的方法。在一些实施方案中，免疫细胞(如肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、T细胞(包括CD8+或CD4+细胞)或APC)被工程化以表达为膜蛋白和/或如本文所述的可溶性变体CD155多肽、免疫调节蛋白或缀合物。然后，工程化细胞可以接触哺乳动物细胞，如APC、第二淋巴细胞或肿瘤细胞，其中在允许亲和力修饰的IgSF结构域与哺乳动物细胞上的反结构特异性结合的条件下需要调节免疫活性，使得可以在哺乳动物细胞中调节免疫活性。细胞可以在体内或离体进行接触。
在一些实施方案中，工程化细胞是自体同源细胞。在其他实施方案中，细胞是同种异体的。在一些实施方案中，细胞是自体同源的工程化细胞，其重新输注至它所分离的哺乳动物细胞中。在一些实施方案中，细胞是输注至哺乳动物中的同种异体工程化细胞。在一些实施方案中，从患者的血液或肿瘤收获细胞，工程化以表达多肽(如本文所述的变体CD155多肽、免疫调节蛋白或缀合物)，在体外培养体系中扩增(例如，通过刺激细胞)，并重新输注至患者中以介导肿瘤破坏。在一些实施方案中，该方法通过过继性细胞转移进行，其中将表达TIP的细胞(例如，T细胞)输注回患者中。在一些实施方案中，本发明的治疗性组合物和方法用于治疗哺乳动物患者的癌症，如淋巴瘤、淋巴性白血病、骨髓性白血病、宫颈癌、神经母细胞瘤或多发性骨髓瘤。
VIII.示例性实施方案
其中所提供的实施方案为：
1.一种变体CD155多肽，其包含IgV结构域或其特异性结合片段、IgC结构域或其特异性结合片段、或二者，其中该变体CD155多肽包含未修饰的CD155或其特异性结合片段中的一个或多个氨基酸修饰，该一个或多个氨基酸修饰对应于选自以下的参照SEQ ID NO：47所示的位置的一个或多个位置：7、8、9、10、11、12、13、15、16、18、19、20、21、22、23、24、25、26、29、30、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、64、65、67、68、69、70、72、73、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、87、88、89、90、91、92、94、95、96、97、98、99、100、102、104、106、107、108、110、111、112、113、114、115或116。
2.实施方案1的变体CD155多肽，其中该氨基酸修饰包含氨基酸取代、缺失或插入。
3.实施方案1或实施方案2的变体CD155多肽，其中该未修饰的CD155是哺乳动物CD155或其特异性结合片段。
4.实施方案3的变体CD155多肽，其中该未修饰的CD155是人CD155或其特异性结合片段。
5.实施方案1-4中的任一项的变体CD155多肽，其中该未修饰的CD155包含(i)SEQID NO：47所示的氨基酸序列；(ii)与SEQ ID NO：47具有至少95％序列一致性的氨基酸序列；或(iii)(i)或(ii)的一部分，其包含IgV结构域或其特异性结合片段。
6.实施方案1-5中的任一项的变体CD155多肽，其中：
该IgV结构域的特异性结合片段的长度为至少50、60、70、80、90、100、110或更多个氨基酸；或
该IgV结构域的特异性结合片段包含SEQ ID NO：20的氨基酸24-139所示的IgV结构域的长度的80％的长度。
7.实施方案1-6中的任一项的变体CD155多肽，其中该变体CD155包含多达1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸修饰，任选氨基酸取代、插入和/或缺失。
8.实施方案1-7中的任一项的变体CD155多肽，其中该变体CD155多肽包含显示出与SEQ ID NO：47或其特异性结合片段至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列。
9.实施方案1-8中的任一项的变体CD155多肽，其中与未修饰的CD155相比，该变体CD155多肽显示出与TIGIT、CD226或CD96的胞外域的改变的结合。
10.实施方案1-9中的任一项的变体CD155多肽，其中与未修饰的CD155相比，该变体CD155多肽显示出与TIGIT或CD226的胞外域的改变的结合。
11.实施方案9或实施方案10的变体CD155多肽，其中该改变的结合是改变的结合亲和力和/或改变的结合选择性。
12.实施方案1-11中的任一项的变体CD155多肽，其中该一个或多个氨基酸修饰选自G7E、D8G、V9A、V9D、V9I、V9L、V10F、V10G、V10I、V11A、V11E、V11M、Q12H、Q12K、Q12L、A13E、A13R、T15I、T15S、Q16H、P18C、P18F、P18H、P18L、P18S、P18T、P18Y、G19D、F20I、F20S、F20Y、L21S、L21M、G22S、D23A、D23G、D23N、D23Y、S24A、S24P、V25A、V25E、T26M、C29R、Y30C、Y30F、Y30H、Q32L、Q32R、V33M、P34S、N35D、N35F、N35S、M36I、M36R、M36T、E37G、E37P、E37S、E37V、V38A、V38G、T39A、T39S、H40Q、H40R、H40T、V41A、V41M、S42A、S42C、S42G、S42L、S42N、S42P、S42Q、S42T、S42V、S42W、L44P、L44V、T45A、T45G、T45I、T45S、T45Q、T45V、W46C、W46R、A47E、A47G、A47V、R48Q、H49L、H49Q、H49R、G50S、E51G、E51K、E51V、S52A、S52E、S52G、S52K、S52L、S52M、S52P、S52Q、S52R、S52T、S52W、G53R、S54C、S54G、S54H、S54N、S54R、M55I、M55L、M55V、A56V、V57A、V57L、V57T、F58L、F58Y、H59E、H59N、N59R、Q60H、Q60K、Q60P、Q60R、T61A、T61G、T61K、T61M、T61R、T61S、Q62F、Q62H、Q62K、Q62L、Q62M、Q62R、Q62Y、P64S、S65A、S65C、S65G、S65D、S65T、S65Y、S65H、S65N、S65T、S65W、S67A、S67E、S67G、S67H、S67L、S67T、S67V、S67W、E68D、E68G、S69L、S69P、K70E、K70R、K70Q、L72Q、E73D、E73G、E73R、V75A、V75L、A76E、A76G、A76T、A77T、A77V、R78G、R78K、R78S、L79P、L79Q、L79V、G80D、G80S、A81E、A81P、A81T、A81V、E82D、E82G、L83P、L83Q、R84W、N85D、N85Y、N87T、L88P、R89K、M90I、M90L、M90V、F91S、F91T、F91P、G92A、G92E、G92W、R94H、V95A、E96D、D97G、E98D、E98S、G99D、G99Y、N100Y、T102S、L104E、L104M、L104N、L104P、L104Q、L104T、L104Y、V106A、V106I、V106L、T107A、T107L、T107M、T107S、T107V、F108H、F108L、F108Y、Q110R、G111D、G111R、S112I、S112N、S112V、R113G、R113W、S114N、S114T、V115A、V115M、D116G或D116N或其保守氨基酸取代。
13.实施方案1-12中的任一项的变体CD155多肽，其包含选自以下的一个或多个氨基酸修饰：P18S/P64S/F91S、P18S/F91S/L104P、P18L/L79V/F91S、P18S/F91S、P18T/F91S、P18T/S42P/F91S、G7E/P18T/Y30C/F91S、P18T/F91S/G111D、P18S/F91P、P18T/F91S/F108L、P18S/F91S、P18T/T45A/F91S、P18T/F91S/R94H、P18S/Y30C/F91S、A81V/L83P、A13E/P18S/A56V/F91S、P18T/F91S/V115A、P18T/Q60K、S52M、T45Q/S52L/L104E/G111R、S42G、Q62F、S52Q、S42A/L104Q/G111R、S42A/S52Q/L104Q/G111R、S52W/L104E、S42C、S52W、S52M/L104Q、S42L/S52L/Q62F/L104Q、S42W、S42Q、S52L、S52R、L104E、G111R、S52E、Q62Y、T45Q/S52M/L104E、S42N/L104Q/G111R、S52M/V57L、S42N/S52Q/Q62F、S42A/S52L/L104E/G111R、S42W/S52Q/V57L/Q62Y、L104Q、S42L/S52Q/L104E、S42C/S52L、S42W/S52R/Q62Y/L104Q、T45Q/S52R/L104E、S52R/Q62F/L104Q/G111R、T45Q/S52L/V57L/L104E、S52M/Q62Y、Q62F/L104E/G111R、T45Q/S52Q、S52L/L104E、S42V/S52E、T45Q/S52R/G111R、S42G/S52Q/L104E/G111R、S42N/S52E/V57L/L104E、S42C/S52M/Q62F、S42L、S42A、S42G/S52L/Q62F/L104Q、S42N、P18T/S65A/S67V/F91S、P18F/T39A/T45Q/T61R/S65N/S67L/E73G/R78G、P18T/T45Q/T61R/S65N/S67L、P18F/S65A/S67V/F91S、P18F/T45Q/T61R/S65N/S67L/F91S/L104P、P18S/L79P/L104M、P18S/L104M、L79P/L104M、P18T/T45Q/L79P、P18T/T45Q/T61R/S65H/S67H、P18T/A81E、P18S/D23Y/E37P/S52G/Q62M/G80S/A81P/G99Y/S112N、A13R/D23Y/E37P/S42P/Q62Y/A81E、A13R/D23Y/E37P/G99Y/S112N、A13R/D23Y/E37P/Q62M/A77V/G80S/A81P/G99Y、P18L/E37S/Q62M/G80S/A81P/G99Y/S112N、P18S/L104T、P18S/Q62H/L79Q/F91S、T45Q/S52K/Q62F/L104Q/G111R、T45Q/S52Q/Q62Y/L104Q/G111R、T45Q/S52Q/Q62Y/L104E/G111R、V57A/T61M/S65W/S67A/E96D/L104T、P18L/V57T/T61S/S65Y/S67A/L104T、P18T/T45Q、P18L/V57A/T61M/S65W/S67A/L104T、T61M/S65W/S67A/L104T、P18S/V41A/S42G/T45G/L104N、P18H/S42G/T45I/S52T/G53R/S54H/V57L/H59E/T61S/S65D/E68G/L104N、P18S/S42G/T45V/F58L/S67W/L104N、P18S/T45I/L104N、P18S/S42G/T45G/L104N/V106A、P18H/H40R/S42G/T45I/S52T/G53R/S54H/V57L/H59E/T61S/S65D/E68G/L104Y/V106L/F108H、E37V/S42G/T45G/L104N、P18S/T45Q/L79P/L104T、P18L/Q62R、A13R/D23Y/E37P/S42L/S52G/Q62Y/A81E、P18L/H49R/L104T/D116N、A13R/D23Y/E37P/Q62M/G80S/A81P/L104T、S65T/L104T、A13R/D23Y/E37P/S52G/V57A/Q62M/K70E/L104T、P18L/A47V/Q62Y/E73D/L104T、H40T/V41M/A47V/S52Q/Q62L/S65T/E73R/D97G/E98S/L104T/D116N、P18L/S42P/T45Q/T61G/S65H/S67E/L104T/D116N、P18S/H40T/V41M/A47V/S52Q/Q62L/S65T/E73R/L104M/V106A、H40T/V41M/A47V/S52Q/Q62L/S65T/E68G/E73R/D97G/E98S/L104T、T45Q/S52E/L104E、T45Q/S52E/Q62F/L104E、P18F/T26M/L44V/Q62K/L79P/F91S/L104M/G111D、P18S/T45S/T61K/S65W/S67A/F91S/G111R、P18S/L79P/L104M/T107M、P18S/S65W/S67A/M90V/V95A/L104Q/G111R、P18S/A47G/L79P/F91S/L104M/T107A/R113W、P18T/D23G/S24A/N35D/H49L/L79P/F91S/L104M/G111R、V9L/P18S/Q60R/V75L/L79P/R89K/F91S/L104E/G111R、P18S/H49R/E73D/L79P/N85D/F91S/V95A/L104M/G111R、V11A/P18S/L79P/F91S/L104M/G111R、V11A/P18S/S54R/Q60P/Q62K/L79P/N85D/F91S/T107M、P18T/S52P/S65A/S67V/L79P/F91S/L104M/G111R、P18T/M36T/L79P/F91S/G111R、D8G/P18S/M36I/V38A/H49Q/A76E/F91S/L104M/T107A/R113W、P18S/S52P/S65A/S67V/L79P/F91S/L104M/T107S/R113W、T15I/P18T/L79P/F91S/L104M/G111R、P18F/T26M/L44V/Q62K/L79P/E82D/F91S/L104M/G111D、P18T/E37G/G53R/Q62K/L79P/F91S/E98D/L104M/T107M、P18L/K70E/L79P/F91S/V95A/G111R、V9I/Q12K/P18F/S65A/S67V/L79P/L104T/G111R/S112I、P18F/S65A/S67V/F91S/L104M/G111R、V9I/V10I/P18S/F20S/T45A/L79P/F91S/L104M/F108Y/G111R/S112V、V9L/P18L/L79P/M90I/F91S/T102S/L104M/G111R、P18C/T26M/L44V/M55I/Q62K/L79P/F91S/L104M/T107M、V9I/P18T/D23G/L79P/F91S/G111R、P18F/L79P/M90L/F91S/V95A/L104M/G111R、P18T/M36T/S65A/S67E/L79Q/A81T/F91S/G111R、V9L/P18T/Q62R/L79P/F91S/L104M/G111R、P18S/S65W/S67A/L104Q/G111R、P18T/G19D/M36T/S54N/L79P/L83Q/F91S/T107M/F108Y、V9L/P18L/M55V/S69L/L79P/A81E/F91S/T107M、P18F/H40Q/T61K/Q62K/L79P/F91S/L104M/T107V、P18S/Q32R/Q62K/R78G/L79P/F91S/T107A/R113W、Q12H/P18T/L21S/G22S/V57A/Q62R/L79P/F91S/T107M、V9I/P18S/S24P/H49Q/F58Y/Q60R/Q62K/L79P/F91S/T107M、P18T/W46C/H49R/S65A/S67V/A76T/L79P/S87T/L104M、P18S/S42T/E51G/L79P/F91S/G92W/T107M、V10F/T15S/P18L/R48Q/L79P/F91S/T107M/V115M、P18S/L21M/Y30F/N35D/R84W/F91S/T107M/D116G、P18F/E51V/S54G/Q60R/L79Q/E82G/S87T/M90I/F91S/G92R/T107M、Q16H/P18F/F91S/T107M、P18T/D23G/Q60R/S67L/L79P/F91S/T107M/V115A、D8G/V9I/V11A/P18T/T26M/S52P/L79P/F91S/G92A/T107L/V115A、V9I/P18F/A47E/G50S/E68G/L79P/F91S/T107M、P18S/M55I/Q62K/S69P/L79P/F91S/T107M、P18T/T39S/S52P/S54R/L79P/F91S/T107M、P18S/D23N/L79P/F91S/T107M/S114N、P18S/P34S/E51V/L79P/F91S/G111R、P18S/H59N/V75A/L79P/A81T/F91S/L104M/T107M、P18S/W46R/E68D/L79P/F91S/T107M/R113G、V9L/P18F/T45A/S65A/S67V/R78K/L79V/F91S/T107M/S114T、P18T/M55L/T61R/L79P/F91S/V106I/T107M、T15I/P18S/V33M/N35F/T39S/M55L/R78S/L79P/F91S/T107M、P18S/Q62K/K70E/L79P/F91S/G92E/R113W、P18F/F20I/T26M/A47V/E51K/L79P/F91S、P18T/D23A/Q60H/L79P/M90V/F91S/T107M、P18S/D23G/C29R/N35D/E37G/M55I/Q62K/S65A/S67G/R78G/L79P/F91S/L104M/T107M/Q110R、A13E/P18S/M36R/Q62K/S67T/L79P/N85D/F91S/T107M、V9I/P18T/H49R/L79P/N85D/F91S/L104T/T107M、V9A/P18F/T61S/Q62L/L79P/F91S/G111R、D8E/P18T/T61A/L79P/F91S/T107M、P18S/V41A/H49R/S54C/L79S/N85Y/L88P/F91S/L104M/T107M、V11E/P18H/F20Y/V25E/N35S/H49R/L79P/F91S/T107M/G111R、V11A/P18F/D23A/L79P/G80D/V95A/T107M、P18S/K70R/L79P/F91S/G111R、V9L/V11M/P18S/N35S/S54G/Q62K/L79P/L104M/T107M/V115M、V9L/P18Y/V25A/V38G/M55V/A77T/L79P/M90I/F91S/L104M、V10G/P18T/L72Q/L79P/F91S/T107M、P18S/H59R/A76G/R78S/L79P、V9A/P18S/M36T/S65G/L79P/F91S/L104T/G111R/S112I、P18T/S52A/V57A/Q60R/Q62K/S65C/L79P/F91T/N100Y/T107M、V11A/P18F/N35D/A47E/Q62K/L79P/F91S/G99D/T107M/S114N、V11A/P18T/N35S/L79P/S87T/F91S、V9D/V11M/Q12L/P18S/E37V/M55I/Q60R/K70Q/L79P/F91S/L104M/T107M、or T15S/P18S/Y30H/Q32L/Q62R/L79P/F91S/T107M。
14.实施方案1-13中的任一项的变体CD155多肽，其中该变体CD155多肽包含一个IgC结构域或两个IgC结构域或其特异性片段。
15.实施方案1-13中的任一项的变体CD155多肽，其包含SEQ ID NO：59-80、178-274、1230-1252、1269中的任一个所示的氨基酸序列或其特异性结合片段，或显示出与SEQID NO：59-80、178-274、1230-1252、1269中任一个或其特异性结合片段至少95％序列一致性并且含有该一个或多个氨基酸修饰的氨基酸序列。
16.实施方案1-15中的任一项的变体CD155多肽，其中该未修饰的CD155包含IgV结构域或其特异性结合片段，该IgV结构域或其特异性结合片段包含(i)SEQ ID NO：58或155所示的氨基酸序列；(ii)与SEQ ID NO：58或155具有至少95％序列一致性的氨基酸序列；或(iii)(i)或(ii)的一部分，其包含(i)或(ii)的特异性结合片段。
17.实施方案1-16中的任一项的变体CD155多肽，其中该变体CD155多肽包含该IgV结构域或其抗原结合片段。
18.实施方案1-17中的任一项的变体CD155多肽，其中IgV结构域或其特异性结合片段仅是该变体CD155多肽的CD155部分。
19.实施方案1-18中的任一项的变体CD155多肽，其包含SEQ ID NO：81-102、156-177、275-468、1184-1229、1270-1271、1656-1747中任一个所示的氨基酸序列或其特异性结合片段，以及表现出与SEQ ID NO：81-102、156-177、275-468、1184-1229、1270-1271、1656-1747中任一个或其特异性结合片段至少95％序列一致性并且含有该一个或多个氨基酸修饰的氨基酸序列。
20.实施方案1-19中的任一项的变体CD155多肽，其中与未修饰的CD155相比，该变体CD155多肽以增加的亲和力特异性地结合至TIGIT、CD226或CD96中的一个或多个的胞外域。
21.实施方案1-20中的任一项的变体CD155多肽，其中与未修饰的CD155相比，该变体CD155多肽以增加的亲和力特异性地结合至TIGIT或CD226的胞外域。
22.实施方案1-21中的任一项的变体CD155多肽，其中与未修饰的CD155相比，该变体CD155多肽以增加的亲和力特异性地结合至TIGIT的胞外域和CD226的胞外域。
23.实施方案1-20中的任一项的变体CD155多肽，其中与未修饰的CD155相比，该变体CD155多肽以增加的亲和力特异性地结合至TIGIT、CD226或CD96中的一个或多个的胞外域，并且以降低的亲和力特异性地结合至TIGIT、CD226或CD96中其余的一个或多个的胞外域。
24.实施方案23的变体CD155多肽，其中与未修饰的CD155相比，该变体CD155多肽以降低的亲和力特异性地结合至TIGIT的胞外域，并且以降低的亲和力特异性地结合至CD226的胞外域。
25.实施方案1-24中的任一项的变体CD155多肽，其中与未修饰的CD155相比，该变体CD155多肽以增加的选择性特异性地结合至TIGIT的胞外域。
26.实施方案25的变体CD155多肽，其中该增加的选择性包括与所述未修饰的CD155多肽对于TIGIT对比CD226的结合的比率相比，所述变体多肽对于TIGIT对比CD226的结合的更高的比率。
27.实施方案26的变体CD155多肽，其中该比例大至少或至少约1.5倍、2.0倍、3.0倍、4.0倍、5倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍或更多倍。
28.实施方案23的变体CD155多肽，其中与未修饰的CD155相比，该变体CD155多肽以增加的亲和力特异性地结合至CD226的胞外域并且以降低的亲和力特异性地结合至TIGIT的胞外域。
29.实施方案9-28中的任一项的变体CD155多肽，其中该TIGIT是人TIGIT。
30.实施方案9-29中的任一项的变体CD155多肽，其中该CD226是人CD226。
31.实施方案9-30中的任一项的变体CD155多肽，其中该CD96是人CD96。
32.实施方案1-31中的任一项的变体CD155多肽，其中与未修饰的CD155相比，该结合活性改变(增加或降低)超过1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍或50倍。
33.实施方案1-32中的任一项的变体CD155多肽，其是可溶性蛋白。
34.实施方案1-33中的任一项的变体CD155多肽，其中该变体CD155多肽与多聚化结构域连接。
35.实施方案34的变体CD155多肽，其中该多聚化结构域是具有降低的效应子功能的Fc结构域或其变体。
36.实施方案1-35中的任一项的变体CD155多肽，其中该变体CD155多肽与增加该多肽的生物半衰期的部分连接。
37.实施方案1-36中的任一项的变体CD155多肽，其中该变体CD155多肽与具有降低的效应子功能的Fc结构域或其变体连接。
38.实施方案37-39中的任一项的变体CD155多肽，其中：
该Fc结构域是哺乳动物的，任选人的；或
与哺乳动物的任选人的未修饰的Fc结构域相比，该变体Fc结构域包含一个或多个氨基酸修饰。
39.实施方案35、37和38中的任一项的变体CD155多肽，其中该Fc结构域或其变体包含SEQ ID NO：56或SEQ ID NO：57所示的氨基酸序列或显示出与SEQ ID NO：56或SEQ IDNO：57至少85％序列一致性的氨基酸序列。
40.实施方案35和37-39中的任一项的变体CD155多肽，其中该Fc结构域包含选自每个根据EU编号的E233P、L234A、L234V、L235A、L235E、G236del、G237A、S267K、N297G、V302C和K447del的一个或多个氨基酸修饰。
41.实施方案35和37-40中的任一项的变体CD155多肽，其中该Fc结构域包含氨基酸修饰根据EU编号的C220S。
42.实施方案34-41中的任一项的变体CD155多肽，其中该变体CD155多肽经由接头任选G4S接头与该多聚化结构域或Fc间接连接。
43.实施方案1-17和19-32中的任一项的变体CD155多肽，其中该变体CD155多肽是还包含与该变体CD155多肽的胞外结构域(ECD)或其特异性结合片段连接的跨膜结构域的跨膜免疫调节蛋白。
44.实施方案43的变体CD155多肽，其中该跨膜结构域包含SEQ ID NO：20的残基344-367所示的氨基酸序列或其功能变体，该功能变体显示出与SEQ ID NO：20的残基344-367至少85％序列一致性。
45.实施方案43或实施方案44的变体CD155多肽，还包含与该跨膜结构域连接的细胞质结构域。
46.实施方案47的变体CD155多肽，其中该细胞质信号传导结构域包含SEQ ID NO：20的残基368-417所示的氨基酸序列或其功能变体，该功能变体显示出与SEQ ID NO：20的残基368-417至少85％序列一致性。
47.实施方案1-48中任一项的变体CD155多肽，其中在体外原代T细胞测定中，相对于该未修饰的CD155，该变体CD155增加IFN-γ(干扰素-γ)表达。
48.实施方案1-48中任一项的变体CD155多肽，其中在体外原代T细胞测定中，相对于该未修饰的CD155，该变体CD155增加IFN-γ(干扰素-γ)表达。
49.实施方案1-50中任一项的变体CD155多肽，其是去糖基化的。
50.一种免疫调节蛋白，其包含直接或经由接头间接与包含IgSF家族成员的免疫球蛋白超家族(IgSF)结构域的第二多肽连接的实施方案1-49中的任一项的变体CD155。
51.实施方案50的免疫调节蛋白，其中该IgSF结构域是亲和力修饰的IgSF结构域，所述亲和力修饰的IgSF结构域包含与该IgSF家族成员的未修饰的或野生型IgSF结构域相比一个或多个氨基酸修饰。
52.实施方案50或实施方案51的免疫调节蛋白，其中与该IgSF家族成员的未修饰的或野生型IgSF结构域相比，该IgSF结构域经亲和力修饰并显示出与一种或多种其同源结合配偶体的改变的结合。
53.实施方案52的免疫调节蛋白，其中与该未修饰的或野生型IgSF结构域相比，该IgSF结构域显示出与一种或多种其同源结合配偶体的增加的结合。
54.实施方案50-53中的任一项的免疫调节蛋白，其中该变体CD155是第一变体CD155多肽，并且该第二多肽的该IgSF结构域是来自实施方案1-49中任一项的第二变体CD155多肽的IgSF结构域，其中该第一变体CD155多肽和第二变体CD155多肽是相同或不同的。
55.实施方案50-54中额任一项的免疫调节蛋白，其中该变体CD155多肽能够特异性地结合至TIGIT或CD226，并且该IgSF结构域能够与同源结合配偶体结合，该同源结合配偶体并非由该变体CD155多肽特异性地结合的同源结合配偶体。
56.实施方案50-55中的任一项的免疫调节蛋白，其中该IgSF结构域来自B7家族的成员。
57.实施方案50-55中的任一项的免疫调节蛋白，其中该IgSF结构域是与肿瘤上表达的配体结合的肿瘤定位部分，或者是与与炎性环境相关的细胞或组织上表达的配体结合的炎性定位部分。
58.实施方案57的免疫调节蛋白，其中该配体是B7H6。
59.实施方案57或实施方案58的免疫调节蛋白，其中该IgSF结构域来自NKp30。
60.实施方案50-55中的任一项的免疫调节蛋白，其中该第二多肽的IgSF结构域是与抑制型受体结合的配体的IgSF结构域，或者是其亲和力修饰的IgSF结构域。
61.实施方案60的免疫调节蛋白，其中该第二多肽的IgSF结构域是亲和力修饰的IgSF结构域，并且与该未修饰的IgSF结构域对于该抑制型受体的结合相比，该亲和力修饰的IgSF结构域显示出对于该抑制型受体的增加的结合亲和力和/或结合选择性。
62.实施方案60或实施方案61的免疫调节蛋白，其中：
该抑制型受体是TIGIT、CD112R、CTLA-4或PD-1；或
该抑制型受体的配体是CD112、CD80、PD-L1或PD-L2。
63.实施方案50-55和60-61中的任一项的免疫调节蛋白，其中该第二多肽选自：
(i)变体CD80多肽，其包含SEQ ID NO：896-928、930-968、970-1002、1004-1042、1044-1116中任一个所示的IgSF结构域；
(ii)变体PD-L1多肽，其包含SEQ ID NO：470-664、1753-1755、1757-2031中任一个所示的IgSF结构域；
(iii)变体PD-L2多肽，其包含SEQ ID NO：667-717、719-725、727-794、796-870、872-895中任一个所示的IgSF结构域；
(iv)变体CD112多肽，其包含SEQ ID NO：1273-1366、1368-1609中任一个所示的IgSF结构域；
(v)氨基酸序列，其显示出与(i)-(iv)中任一个SEQ ID NO至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、95％、97％、98％、99％或更多序列一致性并且包含氨基酸修饰，任选地是氨基酸取代、插入和/或缺失；或
(vi)(i)-(v)中任一个的特异性结合片段。
64.实施方案50-63中的任一项的免疫调节蛋白，其还含有第三多肽，该第三多肽包含IgSF家族成员的IgSF结构域或其亲和力修饰的IgSF结构域，所述亲和力修饰的IgSF结构域与该IgSF家族成员的未修饰的或野生型IgSF结构域相比含有一个或多个氨基酸修饰。
65.实施方案64的免疫调节蛋白，其中：
该第三多肽与该第一和/或第二多肽相同；或
该第三多肽与该第一和/或第二多肽不同。
66.实施方案64和实施方案65的免疫调节蛋白，其中该第三多肽选自：
(i)变体CD80多肽，其包含SEQ ID NO：896-928、930-968、970-1002、1004-1042、1044-1116中任一个所示的IgSF结构域；
(ii)变体PD-L1多肽，其包含SEQ ID NO：470-664、1753-1755、1757-2031中任一个所示的IgSF结构域；
(iii)变体PD-L2多肽，其包含SEQ ID NO：667-717、719-725、727-794、796-870、872-895中任一个所示的IgSF结构域；
(iv)变体CD112多肽，其包含SEQ ID NO：1273-1366、1368-1609中任一个所示的IgSF结构域；
(v)氨基酸序列，其显示出与(i)-(iv)中任一个SEQ ID NO至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、95％、97％、98％、99％或更多序列一致性并且包含氨基酸修饰，任选地是氨基酸取代、插入和/或缺失；或
(vi)(i)-(v)中任一个的特异性结合片段。
67.实施方案50-65中的任一项的免疫调节蛋白，其中该IgSF结构域或其亲和力修饰的IgSF，任选地该第二或第三多肽的IgSF结构域或其亲和力修饰的IgSF，是或包含IgV结构域。
68.实施方案50-67中的任一项的免疫调节蛋白，其中该变体CD155多肽是或包含IgV结构域。
69.实施方案64-68中的任一项的免疫调节蛋白，其还包含至少一个另外的多肽，该另外的多肽包含IgSF家族成员的IgSF结构域或其亲和力修饰的IgSF结构域，该亲和力修饰的IgSF结构域与该IgSF家族成员的未修饰的或野生型IgSF结构域相比含有一个或多个氨基酸修饰。
70.实施方案50-69中的任一项的免疫调节蛋白，其中该免疫调节蛋白还包含多聚化结构域，其与该变体CD155多肽或该第二多肽中的至少一个连接。
71.实施方案64-69中的任一项的免疫调节蛋白，其中该免疫调节蛋白还包含多聚化结构域，其与该变体CD155多肽、该第二多肽和/或该第三多肽中的至少一个连接。
72.实施方案69-71中的任一项的免疫调节蛋白，其中该多聚化结构域是具有降低的效应子功能的Fc结构域或其变体。
73.实施方案69-72中的任一项的免疫调节蛋白，其中该多聚化结构域促使异二聚体形成。
74.一种免疫调节蛋白，其包含实施方案34-42中的任一项的第一变体CD155多肽(其中该多聚化结构域是第一多聚化结构域)和实施方案34-42中的任一项的第二变体CD155多肽(其中该多聚化结构域是第二多聚化结构域)，其中该第一和第二多聚化结构域相互作用以形成含有该第一和第二变体CD155多肽的多聚体。
75.一种免疫调节蛋白，其包含实施方案70-72中的任一项的免疫调节蛋白，其中该多聚化结构域是第一多聚化结构域并且与第二多聚化结构域相互作用以形成包含该免疫调节蛋白的多聚体。
76.实施方案75的免疫调节蛋白，其中该免疫调节蛋白是第一免疫调节蛋白，并且第二免疫调节蛋白直接或经由接头间接与该第二多聚化结构域连接，其中该多聚体包含该第一和第二免疫调节蛋白。
77.实施方案76的免疫调节蛋白，其中该第二免疫调节蛋白是实施方案70-72中的任一个的免疫调节蛋白。
78.实施方案74或实施方案75的免疫调节蛋白，其中该多聚体是二聚体。
79.实施方案74-78中的任一项的免疫调节蛋白，其是同源二聚体。
80.实施方案74-79中的任一项的免疫调节蛋白，其是异二聚体。
81.实施方案74-80中的任一项的免疫调节蛋白，其中该第一和/或第二多聚化结构域是具有降低的效应子功能的Fc结构域或其变体。
82.实施方案74-81中的任一项的免疫调节蛋白，其中该第一和第二多聚化结构域相同或不同。
83.一种缀合物，其包含与一个部分连接的实施方案1-49中的任一项的变体CD155或实施方案50-72中的任一项的免疫调节蛋白。
84.实施方案83的缀合物，其中该部分是与细胞表面上的分子特异性结合的靶向部分。
85.实施方案84的缀合物，其中该靶向部分与免疫细胞表面上的分子特异性结合。
86.实施方案85的缀合物，其中该免疫细胞是抗原呈递细胞或淋巴细胞。
87.实施方案86的缀合物，其中该靶向部分是与肿瘤表面上的分子结合的肿瘤定位部分。
88.实施方案83-87中的任一项的缀合物，其中该部分是蛋白质、肽、核酸、小分子或纳米颗粒。
89.实施方案83-88中的任一项的缀合物，其中该部分是抗体或抗原结合片段。
90.实施方案83-89中的任一项的缀合物，其中该缀合物是二价的、四价的、六价的或八价的。
91.编码实施方案1-49中的任一项的变体CD155多肽或实施方案50-72中的任一项的免疫调节蛋白的一种或多种核酸分子。
92.实施方案91的核酸分子，其是合成的核酸。
93.实施方案91或实施方案92的核酸分子，其是cDNA。
94.一种载体，其包含实施方案91-93中的任一项的核酸分子。
95.实施方案94的载体，其是表达载体。
96.实施方案94或实施方案95的载体，其中该载体是哺乳动物表达载体或病毒载体。
97.一种细胞，其包含实施方案94-96中的任一项的载体。
98.实施方案97的细胞，其是哺乳动物细胞。
99.实施方案97或实施方案98的细胞，其是人细胞。
100.一种产生变体CD155多肽或免疫调节蛋白的方法，其包括在细胞中表达蛋白质的条件下将实施方案91-93中的任一项的核酸分子或实施方案94-96中的任一项的载体引入该宿主细胞中。
101.实施方案100的方法，还包括从该细胞中分离或纯化该变体CD155多肽或免疫调节蛋白。
102.一种将表达变体CD155多肽的细胞工程化的方法，包括在细胞中表达以下多肽的条件下将编码实施方案1-49中的任一项的变体CD155多肽或实施方案50-82中的任一项的免疫调节蛋白的核酸分子引入该细胞中。
103.一种工程化细胞，其表达实施方案1-49中的任一项的变体CD155多肽、实施方案50-82中的任一项的免疫调节蛋白、实施方案79-81中的任一项的核酸分子或实施方案94-96中的任一项的载体。
104.实施方案103的工程化细胞，其中该变体CD155多肽或免疫调节蛋白由包含编码信号肽的核苷酸序列的核酸编码。
105.实施方案103或实施方案104的工程化细胞，其中该变体CD155多肽或免疫调节蛋白不包含跨膜结构域和/或不在该细胞的表面上表达。
106.实施方案103-105中的任一项的工程化细胞，其中该变体CD155多肽或免疫调节蛋白由该工程化细胞分泌。
107.实施方案105或实施方案106的工程化细胞，其中该工程化细胞包含变体CD155多肽，该变体CD155多肽包含跨膜结构域和/或是实施方案43-49中的任一项的跨膜免疫调节蛋白。
108.实施方案103、104和107中的任一项的工程化细胞，其中该变体CD155多肽在该细胞的表面上表达。
109.实施方案103-108中的任一项的工程化细胞，其中该细胞是免疫细胞。
110.实施方案109的工程化细胞，其中该免疫细胞是抗原呈递细胞(APC)或淋巴细胞。
111.实施方案103-110中的任一项的工程化细胞，其是原代细胞。
112.实施方案103-111中的任一项的工程化细胞，其中该细胞是哺乳动物细胞。
113.实施方案103-112中的任一项的工程化细胞，其中该细胞是人细胞。
114.实施方案103-113中的任一项的工程化细胞，其中该淋巴细胞是T细胞。
115.实施方案110的工程化细胞，其中该APC是人工APC。
116.实施方案103-115中的任一项的工程化细胞，其还包含嵌合抗原受体(CAR)或工程化T细胞受体(TCR)。
117.一种感染原，其包含编码实施方案1-49中的任一项的变体CD155多肽或实施方案50-82中的任一项的免疫调节蛋白的核酸分子。
118.实施方案117的感染原，其中该编码的变体CD155多肽或免疫调节蛋白不包含跨膜结构域和/或不在表达它的细胞的表面上表达。
119.实施方案117或实施方案118的感染原，其中该编码的变体CD155多肽或免疫调节蛋白由表达它的细胞分泌。
120.实施方案119的感染原，其中该编码的变体CD155多肽包含跨膜结构域。
121.实施方案119或实施方案120的感染原，其中该编码的变体CD155多肽在表达它的细胞的表面上表达。
122.实施方案117-121中的任一项的感染原，其中该感染原是细菌或病毒。
123.实施方案122的感染原，其中该感染原是病毒，并且该病毒是溶瘤病毒。
124.实施方案123的感染原，其中该溶瘤病毒是腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、单纯疱疹病毒、水疱性口炎病毒、呼肠孤病毒、新城疫病毒、细小病毒、麻疹病毒、水疱性口炎病毒(VSV)、柯萨奇病毒或牛痘病毒。
125.实施方案123的感染原，其中该病毒特异性地靶向树突细胞(DC)和/或是噬树突细胞的。
126.实施方案125的感染原，其中该病毒是慢病毒载体，其用经修饰的辛德比斯病毒包膜产物假型化。
127.实施方案117-126中的任一项的感染原，其还包含编码另一基因产物的核酸分子，该另一基因产物导致靶细胞死亡或可增加或增强免疫应答。
128.实施方案127的感染原，其中该另一基因产物选自抗癌剂、抗转移剂、抗血管生成剂、免疫调节分子、免疫检查点抑制剂、抗体、细胞因子、生长因子、抗原、细胞毒性基因产物、促凋亡基因产物、抗凋亡基因产物、细胞基质降解基因、用于组织再生或将人类体细胞重编程为多能性的基因。
129.一种药物组合物，其包含实施方案1-49中的任一项的变体CD155多肽、实施方案50-82中的任一项的免疫调节蛋白、实施方案83-90中的任一项的缀合物、实施方案103-116中的任一项的工程化细胞或实施方案117-128中的任一项的感染原。
130.实施方案129的药物组合物，其包含药学上可接受的赋形剂。
131.实施方案129或实施方案130的药物组合物，其中该药物组合物是无菌的。
132.一种在小瓶或容器中的制品，其包含实施方案129-131中的任一项的药物组合物。
133.实施方案132的制品，其中该小瓶或容器是密封的。
134.一种试剂盒，其包含实施方案129-131中的任一项的药物组合物和使用说明书。
135.一种试剂盒，其包含实施方案133或实施方案134的制品和使用说明书。
136.一种调节受试者的免疫应答的方法，其包括向该受试者施用实施方案129-131中的任一项的药物组合物。
137.一种调节受试者的免疫应答的方法，其包括施用实施方案103-116中的任一项的工程化细胞。
138.实施方案137的方法，其中该工程化细胞对于该受试者是自体同源的。
139.实施方案138的方法，其中该工程化细胞对于该受试者是同种异体的。
140.实施方案136-139中的任一项的方法，其中调节该免疫应答治疗该受试者中的疾病或病况。
141.实施方案136-140中的任一项的方法，其中该免疫应答被增加。
142.实施方案136、140和141中的任一项的方法，其中可溶的变体CD155多肽或免疫调节蛋白被施用至该受试者。
143.实施方案142的方法，其中该可溶的免疫调节蛋白是免疫调节Fc融合蛋白。
144.实施方案136和140-143中的任一项的方法，其中实施方案1-42和47-49中的任一项的变体CD155多肽或实施方案50-82中的任一项的免疫调节蛋白被施用至该受试者。
145.实施方案136-144中的任一项的方法，其中包含可分泌性变体CD155多肽的工程化细胞被施用至该受试者。
146.实施方案136-141和145中的任一项的方法，其中实施方案103-106和109-116中的任一项的工程化细胞被施用至该受试者。
147.实施方案136、140和141中的任一项的方法，其中任选地是在感染原感染肿瘤细胞或免疫细胞并且可分泌性免疫调节蛋白从该被感染的细胞中分泌的条件下，编码为可分泌性免疫调节蛋白的变体CD155多肽的感染原被施用至该受试者。
148.实施方案140-147中的任一项的方法，其中该疾病或病况是肿瘤或癌症。
149.实施方案140-148中的任一项的方法，其中该疾病或病况选自黑色素瘤、肺癌、膀胱癌、血液恶性肿瘤、肝癌、脑癌、肾癌、乳腺癌、胰腺癌、结直肠癌、脾癌、前列腺癌、睾丸癌、卵巢癌、子宫癌、胃癌、肌肉骨骼癌、头颈癌、胃肠癌、生殖细胞癌或内分泌和神经内分泌癌。
150.实施方案136-139中的任一项的方法，其中该免疫应答降低。
151.实施方案136、140和150中的任一项的方法，其中与定位到炎性环境的细胞或组织的部分连接的包含变体CD155多肽的免疫调节蛋白或缀合物被施用至该受试者。
152.实施方案151的方法，其中该部分包含抗体或其抗原结合片段或包含第二多肽，该第二多肽包含野生型IgSF结构域或其变体。
153.实施方案136、140和150-152中的任一项的方法，其中实施方案57-59中的任一项的免疫调节蛋白或实施方案83-90中的任一项的缀合物被施用至该受试者。
154.实施方案136-140和150中的任一项的方法，其中为跨膜免疫调节蛋白的变体CD155多肽被施用至该受试者。
155.实施方案136-140、150和154中的任一项的方法，其中包含实施方案43-49中的任一项的为跨膜免疫调节蛋白的变体CD155多肽的工程化细胞被施用至该受试者。
156.实施方案136、140和150中的任一项的方法，其中任选地是在感染原感染该受试者中的细胞并且该跨膜免疫调节蛋白在该被感染的细胞的表面上表达的条件下，编码为跨膜免疫调节蛋白的变体CD155多肽的感染原被施用至该受试者。
157.实施方案136、140和150-156中的任一项的方法，其中该疾病或病况是炎性或自身免疫性疾病或病况。
158.实施方案136-140和150-157中的任一项的方法，其中该疾病或病况是抗中性粒细胞胞浆抗体(ANCA)相关的血管炎、血管炎、自身免疫性皮肤病、移植、风湿性疾病、炎性胃肠疾病、炎性眼病、炎性神经疾病、炎性肺病、炎性内分泌疾病或自身免疫性血液病。
159.实施方案136-140和150-158中的任一项的方法，其中该疾病或病况选自炎症性肠病、移植、克罗恩病、溃疡性结肠炎、多发性硬化、哮喘、类风湿性关节炎或银屑病。
IX.实施例
包括以下实施例仅用于说明目的，并不意图限制本发明的范围。
实施例1
生成IgSF结构域的突变DNA构建体
实施例1描述了人CD155 IgSF结构域的突变DNA构建体的生成，以用于在酵母表面上翻译和表达为酵母展示文库。
A.简并文库
生成编码CD155的IgV结构域的变体的突变DNA构建体。基于如下的SEQ ID NO：155中所示的野生型人CD155序列(含有免疫球蛋白样V型(IgV)结构域)生成构建体：
对于靶向对采用简并密码子的完全或部分随机化特定的残基的文库，编码SEQ IDNO：155的DNA作为一组长度多达80碱基对(bp)的重叠寡核苷酸购自Integrated DNATechnologies(Coralville，IA)。为了生成IgV结构域的多种变体的文库，寡核苷酸在所需的氨基酸位置含有所需的简并密码子，例如特定的混合碱基组用于编码多种氨基酸取代。使用URL：rosettadesign.med.unc.edu/SwiftLib/处的算法生成简并密码子。
通常，从晶体结构信息(PDB：3UDW)或由含有感兴趣的靶标-配体对的该结构构建的同源性模型选择突变和简并密码子的位置，以鉴定配体接触残基，例如与配体相互作用的靶侧链残基以及作为蛋白质相互作用界面的残基。使用URL：spdbv.vital-it.ch处可获得的结构查看器进行该分析。
文库设计的下一步是人、小鼠、大鼠和猴CD155序列的比对以鉴定保守残基。基于该分析，保守的靶残基与简并密码子一起突变，该简并密码子仅指定保守氨基酸变化以及野生型残基。不保守的残基更积极地突变，但也包括野生型残基。还部署编码野生型残基的简并密码子以避免靶蛋白的过度诱变。出于同样的原因，每个文库只有最多达20个位置被靶向进行诱变。突变分析专注于结合表面与涉及配体/配偶体结构的其侧链的内的接触和非接触界面残基。
将寡核苷酸溶解在无菌水中，以等摩尔比混合，加热至95℃持续五分钟并缓慢冷却至室温进行退火。然后使用退火至IgV结构域基因序列的起始和结束的IgV结构域特异性寡核苷酸引物以生成PCR产物。与修饰形式的pBYDS03克隆载体(Life Technologies，美国)重叠40bp(越过并包含BamH1和Kpn1克隆位点)的IgV结构域特异性寡核苷酸随后用于扩增来自先前步骤的100ng的PCR产物，以生成至少12μg的DNA用于每次电穿孔。两种PCR使用OneTaq 2x PCR主混合物(New England Biolabs，美国)。使用PCR纯化试剂盒(Qiagen，德国)纯化第二PCR的产物，并重悬于无菌去离子水中。或者，长度高达200bp的Ultramers(Integrated DNA Technologies)与大引物PCR(URL：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC146891/pdf/253371.pdf)联合使用以产生使用多个小的重叠引物不能轻易并入的简并密码子的更大延伸。使用大引物PCR产生全长产物之后，使用与修饰的PBYDSP03变体具有40bp重叠区的DNA引物再次PCR扩增突变IgV结构域文库，用于同源重组到酵母中。
为了准备文库插入，用BamHI和KpnI限制酶(New England Biolabs，美国)消化修饰的酵母展示形式的载体pBYDS03，并且凝胶纯化大的载体片段并将其溶解于无菌去离子水中。通过将12μg的文库DNA插入物与4μg的线性化载体混合于50μL总体积的去离子无菌水中，产生用于下一步的电穿孔就绪DNA。
B.随机文库
还构建了随机文库以鉴定含有IgV结构域的SEQ ID NO：155所示的CD155的该IgV结构域的变体。将编码野生型IgV结构域的DNA克隆在修饰的酵母展示载体pBYDS03的BamH1与Kpn1限制性位点之间。然后使用Genemorph II试剂盒(Agilent，美国)对该DNA进行诱变以生成每个文库变体平均三至五个氨基酸变化。然后通过两步PCR扩增诱变的DNA，并如上文针对靶向文库所述进行进一步加工。
实施例2
将DNA文库引入酵母中
实施例2描述了将CD155 DNA文库引入酵母中。
为了将简并和随机文库DNA引入酵母中，制备酵母菌株BJ5464(ATCC.org；ATCC号208288)的电穿孔感受态细胞，并在Gene Pulser II(Biorad，美国)上用来自基本上如上所述的步骤的电穿孔就绪DNA进行电穿孔(Colby，D.W.等人2004Methods Enzymology 388，348-358)。唯一不同的是转化的细胞在非诱导的最小选择性SCD-Leu培养基中生长，以供应由修饰的质粒pBYDS03携带的LEU2选择性标志物。1升的SCD-Leu培养基由14.7克的柠檬酸钠、4.29克一水合柠檬酸、20克右旋糖、6.7克酵母氮源基础和1.6克不含亮氨酸的酵母合成缺失培养基补充剂组成。在使用前将培养基使用0.2μM真空过滤装置过滤灭菌。
通过在SCD-Leu琼脂板上接种新鲜回收的细胞的系列稀释液，然后由来自接种(每个培养板生成至少50个菌落)的单菌落数量外推文库大小来确定文库大小。通常，基于该稀释测定，文库大小的范围为10E8至10E9个转化子。将剩余的电穿孔的培养物在SCD-Leu上培养至饱和，并且再次将来自该培养物的细胞传代培养(例如1/100)到新鲜的SCD-Leu中以最小化未转化的细胞部分，并且过夜培养。为了保持文库多样性，使用接种物进行该传代培养步骤，该接种物含有比计算的文库大小多至少10倍的细胞。将来自第二饱和培养物的细胞重悬于含有无菌25％(重量/体积)甘油的新鲜培养基中至密度为10E10个/ml，并在-80℃下冷冻并储存(冷冻文库原液)。将来自该过夜培养物的细胞重悬浮于无菌25％(重量/体积)甘油中至密度为10E10/ml，并在-80℃下冷冻储存(冷冻文库原液)。
实施例3
酵母选择
实施例3描述了表达亲和力修饰的CD155变体的酵母的选择。
将等于至少10倍预计文库大小的大量细胞从单个文库原液解冻，悬浮于非诱导SCD-Leu培养基中至0.1×10E6个细胞/ml，并培养过夜。第二天，将等于10倍文库大小的大量细胞以2000RPM离心2分钟，并重悬于诱导SCDG-Leu培养基中至0.5×10E6个细胞/ml。1升SCDG-Leu诱导培养基由溶解于水中并通过0.22μm膜过滤装置灭菌的5.4克Na2HPO4、8.56克NaH2PO4*H20、20克半乳糖、2.0克右旋糖、6.7克酵母氮源基础和1.6克不含亮氨酸的酵母合成缺失培养基补充剂组成。培养物在诱导培养基中在室温下生长1天，以诱导文库蛋白质在酵母细胞表面上表达。
用负载有同源配体的磁珠分选细胞2-3次以减少非结合物并针对具有与其外源重组反结构蛋白结合的能力的所有变体CD155进行富集。然后使用外源反结构蛋白染色进行一至两轮荧光激活细胞分选(FACS)，以富集显示改善的结合物的酵母细胞部分。通过流式细胞术的磁珠富集和选择基本上如Miller，K.D.Current Protocols in Cytometry4.7.1-4.7.30，2008年7月中所述进行。
对于CD155文库，如下采用靶配体蛋白：人rTIGIT.Fc(即重组TIGIT-Fc融合蛋白)和rCD226.Fc购买自美国R&D Systems。磁性蛋白A珠粒获得自美国New England Biolabs。对于双色流式细胞分选，使用Bio-Rad S3e分选仪。用Alexafluor 488标记的抗血凝素抗体(Life Technologies，美国)监测CD155展示水平。用PE缀合的人Ig特异性山羊Fab(JacksonImmunoResearch，美国)检测Fc融合蛋白rTIGIT.Fc或rCD226.Fc的配体结合。使用前向散射(FSC)/侧向散射(SSC)参数屏蔽双重酵母，并且分选门基于在FL2中检测到的更高配体结合，其在FL1中具有更有限的标签表达结合。
测定来自流式细胞分选的酵母输出的更高特异性结合亲和力。对分选输出酵母进行扩增并重新诱导以表达它们编码的特定IgSF亲和力修饰的结构域变体。然后可以通过流式细胞术将该群体与亲本、野生型酵母菌株或任何其他选择的输出(如珠粒输出酵母群)进行比较。
对于CD155，通过使用抗HA(血凝素)标签表达和抗人Fc第二对每个群体进行双重染色以检测配体结合，比较第二FACS输出(F2)与亲本CD155酵母的结合rTIGIT.Fc或rCD226.Fc。
将选择的变体CD155 IgV结构域的形式进一步改变为融合蛋白，并如下所述测试结合和功能活性。
实施例4
将选择输出的形式重新改变为Fc融合物和各种免疫调节蛋白类型
实施例4描述了将实施例3中鉴定的选择输出的形式重新改变为免疫调节蛋白，该免疫调节蛋白含有与Fc分子融合的CD155的亲和力修饰的(变体)免疫球蛋白样V型(IgV)结构域。
来自最终流式细胞术CD155分选的输出细胞在SCD-Leu培养基中生长至终末密度。使用酵母质粒DNA分离试剂盒(Zymo Research，美国)分离来自每个输出的质粒DNA。对于Fc融合物，使用具有适合于克隆至所选Fc融合载体中的添加的限制位点的PCR引物，由质粒DNA制剂批量扩增突变靶IgV结构域的编码DNA。在限制性消化后，将PCR产物连接至合适的Fc融合载体中，然后按供应商的指导热激转化至大肠杆菌菌株XL1蓝色(Agilent，美国)或NEB5α(New England Biolabs)中。或者，使用引物PCR扩增输出，该引物在每一末端含有40bp的与修饰的Fc融合载体的重叠区域以使用Gibson Assembly Mastermix(New EnglandBiolabs，USA)进行体外重组，随后PCR产物用于热激转化到大肠杆菌菌株NEB5α中。Fc融合载体的例子是pFUSE-hIgG1-Fc2(Invivogen，美国)。
将转化反应的稀释液接种在含有100μg/ml羧苄青霉素(Teknova，美国)的LB琼脂上以分离单菌落用于选择。然后使来自每次转化的多达96个菌落在96孔板中在37℃下LB肉汤(Teknova目录号L8112)中过夜生长至饱和，并且将来自每个孔的小等分试样提交用于IgV结构域插入片段的DNA测序，以便识别所有克隆中的一个或多个突变。使用由服务提供者(Genewiz；South Plainfield，新泽西)提供的方案进行用于DNA测序的样品制备。在移取用于DNA测序的样品后，然后将甘油加入剩余的培养物中，使最终甘油含量为25％，并将培养板在-20℃下储存以备将来用作主培养板(见下文)。或者，通过使用一次性96孔复制器(VWR，美国)从生长的液体培养物复制板培养至固体琼脂培养板，以生成用于DNA测序的样品。将这些培养板孵育过夜以生成生长斑，并将培养板按Genewiz的规定提交给Genewiz用于DNA测序。
分析Genewiz生成的DNA测序数据后，从主培养板回收感兴趣的克隆，并在含有100μg/ml羧苄青霉素(Teknova，美国)的5ml液体LB肉汤中单独生长至饱和，随后使用2ml的各培养物利用标准试剂盒如PureYield质粒小量制备系统(Promega，美国)制备每个克隆的约10μg小量制备质粒DNA。感兴趣的克隆的鉴定通常涉及以下步骤。首先，从Genewiz网站下载DNA序列数据文件。然后手动组织管理所有序列，使它们从IgV结构域编码区的起点开始。然后使用URL：www.ebi.ac.uk/Tools/st/emboss_transeq/处可获得的合适程序批量翻译组织管理的序列。然后使用URL：multalin.toulouse.inra.fr/multalin/multalin.html处可获得的合适程序比对翻译的序列。或者，使用Ugene软件(http://ugene.net)处理Genewiz序列以生成比对。
然后使用以下标准鉴定感兴趣的克隆：1)相同的克隆在比对中发生至少两次，和2)突变在比对中优选在不同的克隆中发生至少两次。最可能由于改善的结合，通过分选过程富集满足这些标准中的至少一个的克隆。
为了生成重组免疫调节蛋白(即含有具有至少一个亲和力修饰的结构域的CD155的IgV结构域的Fc融合蛋白，例如变体CD155 IgV-Fc)，生成编码DNA以编码如下蛋白质：变体(突变)CD155 IgV结构域，接着是三个丙氨酸的接头(AAA)，接着是含有依据EU编号的突变R292C、N297G和V302C(对应于参照SEQ ID NO：56所示的野生型人IgG1 Fc的R77C、N82G和V87C)的SEQ ID NO：1135所示的人IgG1 Fc。由于构建体不包括可与半胱氨酸形成共价键的任何抗体轻链，因此人IgG1 Fc还含有依据EU编号的位置220处的半胱氨酸残基取代为丝氨酸残基(C220S)(对应于参照SEQ ID NO：56所示的野生型或未修饰的Fc的位置5(C5S))。
实施例5
Fc融合物的表达和纯化
实施例5描述了以上实施例所描述的含有变体IgV CD155的Fc-融合蛋白的高通量表达和纯化。
用Expi293表达系统(Invitrogen，美国)从悬浮适应的人胚胎肾(HEK)293细胞产生重组变体Fc融合蛋白。将来自前一步骤的4μg每种质粒DNA加入200μL Opti-MEM(Invitrogen，美国)中，同时将10.8μL ExpiFectamine单独加入另外的200μL Opti-MEM中。5分钟后，将200μL质粒DNA与200μL ExpanFectamine混合，并进一步孵育另外20分钟，然后将该混合物加入细胞中。将一千万个Expi293细胞分配至无菌10ml的深锥形底24孔生长板(Thomson Instrument公司，美国)的不同孔中的体积为4mL的Expi293培养基(Invitrogen，美国)中。将培养板在设定为95％湿度和8％CO2的哺乳动物细胞培养箱中以120RPM摇动5天。孵育5天后，使细胞沉淀并保留培养物上清液。
使用高通量96孔蛋白A纯化试剂盒，利用制造商的方案(目录号45202，LifeTechnologies，美国)从上清液中纯化蛋白质。使用Zeba 96孔旋转脱盐板(目录号89807，Life Technologies，美国)利用制造商的方案将得到的洗脱级分缓冲液交换至PBS中。使用Nanodrop仪器(Thermo Fisher Scientific，美国)测量的280nm吸光度定量纯化的蛋白质，并通过在变性和还原条件下在NUPAGE预制聚丙烯酰胺凝胶(Life Technologies，美国)上加载5μg蛋白质以及随后的凝胶电泳来评估蛋白质纯度。使用标准考马斯染色在凝胶中将蛋白质可视化。
实施例6
评估含亲和力成熟的IgSF结构域的分子的结合和活性
A.与细胞表达的反结构结合
该实施例描述了来自以上实施例的纯化蛋白的Fc融合物结合研究，以评价CD155结构域变体免疫调节蛋白对同源结合配偶体的特异性和亲和力。
为了产生表达同源结合配偶体的细胞，在pcDNA3.1表达载体(LifeTechnologies)中设计并且从美国Genscript获得人CD226、TIGIT和CD96各自的全长哺乳动物表面表达构建体。在转染的HEK293细胞上进行结合研究，该转染的HEK293细胞是使用如上所述的瞬时转染系统(Life Technologies，美国)产生的，以表达全长哺乳动物表面配体。作为对照，还评价了与模拟(未转染的)细胞的结合。确定实验所需的细胞数，并使用制造商建议的方案进行适当的30mL规模的转染。对于每个CD226、TIGIT、CD96或模拟物30mL转染，75,000,000个Expi293F细胞与30μg表达构建体DNA和1.5mL稀释的ExpiFectamine 293试剂孵育48小时，此时收获细胞用于染色。
为了通过流式细胞术染色，将适当瞬时转染物或阴性对照(模拟物)的200,000个细胞接种在96孔圆底板中。将细胞旋转向下并重悬于染色缓冲液(PBS(磷酸盐缓冲盐水)、1％BSA(牛血清白蛋白)和0.1％叠氮化钠)中20分钟以阻断非特异性结合。然后，将细胞再次离心并且重悬于含有100nM至1nM变体CD155 Fc融合蛋白的50μL染色缓冲液中。在冰上进行初级染色45分钟，然后在染色缓冲液中洗涤细胞两次。将PE缀合的抗人Fc(JacksonImmunoResearch，美国)在50μL染色缓冲液中1∶150稀释，并添加至细胞并在冰上再孵育30分钟。将二级抗体洗去两次，将细胞在4％甲醛/PBS中固定，并在FACScan流式细胞仪(Becton Dickinson，美国)上分析样品。
使用Cell Quest Pro软件(Becton Dickinson，美国)计算每种转染子和阴性亲本系的平均荧光强度(MFI)。还计算了测试变体的MFI值与亲本(WT)MFI值相比的比率。表10中示出了与CD226、TIGIT、CD96或模拟细胞结合的示例性结果。表10还显示了如以上实施例中所述选择的变体CD155的IgV中的氨基酸取代。
B.生物活性表征
该实施例还描述了人原代T细胞体外测定中的Fc融合变体蛋白生物活性表征。
在抗CD3共固定化测定中测定CD155融合变体的共刺激生物活性。将1nM或4nM小鼠抗人CD3(OKT3，Biolegends，美国)在含有1nM至80nM rCD155.Fc变体蛋白的PBS中稀释。将该混合物加入组织培养物处理的平底96孔板(科宁，美国)中过夜，以促进刺激蛋白附着至培养板的孔。第二天，将未结合的蛋白质从培养板上洗掉，并将100,000个纯化的人全T细胞(BenTech Bio，美国)或人T细胞克隆BC3(Astarte Biologics，美国)加入每个孔中至最终体积为200μL的离体15培养基(Lonza，瑞士)。将细胞培养3天，然后收获培养物上清液，并用Duoset ELISA试剂盒(R&D Systems，美国)测量人IFN-γ水平。
表10中示出了选择的示例性变体的来自抗CD共固定化测定的示例性结果。
还在人混合淋巴细胞反应(MLR)中测试可溶性rCD155.Fc的生物活性。通过用500U/mL rIL-4(R&D Systems，美国)和250U/mL rGM-CSF(R&D Systems，美国)在离体15培养基(Lonza，瑞士)中体外培养分离自PBMC的单核细胞(BenTech Bio，美国)7天产生人原代树突细胞(DC)。在96孔圆底板中在200μL最终体积的离体15培养基中用变体CD155 Fc融合蛋白和对照共培养10,000个成熟DC和100,000个纯化的同种异体CD4+ T细胞(BenTechBio，美国)。第五天，使用人IFN-γDuoset ELISA试剂盒(R&D Systems，美国)分析培养物上清液中的IFN-γ分泌。通过VMax ELISA微孔板读板器(Molecular Devices，美国)测量光密度，并且根据IFN-γDuo-set试剂盒(R&D Systems，美国)中包含的滴定rIFN-γ标准进行定量。
实施例7
生成另外的变体Fc融合分子的酵母选择
实施例7描述了表达亲和力修饰的CD155的变体的酵母的选择，并且描述了将所选择的输出的形式重新改变为Fc融合物用于生成含有IgV CD155变体的另外的Fc融合蛋白。
实施例3中所述的亲和力成熟选择之后，使用酵母小量制备从酵母细胞中提取具有靶基因的质粒DNA，然后使用GeneMorph II随机诱变试剂盒进一步突变靶基因。为了降低聚合酶的保真度并因此增加其错误率，设置了若干PCR反应具有从0.0至1.0mM的改变浓度的MnCl2。使用OneTaq 2x PCR主混合物扩增所得到的基因达到足以进行电穿孔的量。将这些基因产物电穿孔到酵母细胞中，然后使其生长并诱导，然后进行另一轮选择。
另一选择由以下步骤组成：使用所需反结构TIGIT(FACS1和FACS2)的两个阳性选择，随后是使用反结构CD226(FACS3)的一个阴性选择，以选择远离CD226并提高变体CD155的结合特异性。除了改变反结构(TIGIT)的浓度和阳性分选的选择严格度以优化优势(lead)鉴定之外，基本上如上文实施例3中所述进行FACS选择。用于阴性选择的CD226的浓度保持在100nM。
进行选择之后，将输出物如上文所述接种到SCD琼脂板上以分离单独克隆用于进行经由流式细胞术的分析，或者对其进行酵母小量制备以提取质粒DNA用作另一轮选择的诱变模板。为了分离单独的酵母克隆，从SCD琼脂板上挑取克隆，并使其在30摄氏度下以300rpm过夜生长在深96孔板(VWR，美国)中的500μL SCD起始培养物中。第二天，将酵母细胞传代到新鲜SCD培养基中至光密度(OD600)约为0.5，允许在30摄氏度下以300rpm摇动5-6小时直至OD600达到约2.0。然后通过离心收集细胞并将其以重悬于SCDG培养基中，在约1.0的OD600时在室温下诱导16小时。
诱导后，用在阳性(TIGIT)和阴性(CD226)选择中使用的反结构标记细胞，以鉴定含有所需表型的优势物(lead)。使用酵母小量制备以提取来自这些优势物的质粒DNA，并且使用OneTaq 2x PCR主混合物PCR扩增靶基因并且使用Gibson Assembly Master Mix(NewEngland Biolabs，美国)将其克隆到Fc载体中。将完整质粒DNA转化到化学感受态DH5α细胞(New England Biolabs，美国)中，将该细胞接种到含有羧苄青霉素的12x8网格形式的矩形LB琼脂板上，以分离单克隆用于测序和选择。将这些板孵育过夜以产生生长斑，将该板提交给Genewiz用于IgV结构域变体挿入物的DNA测序，以鉴定所有克隆中的一个或多个突变。
感兴趣的克隆的鉴定通常涉及以下步骤。首先，从Genewiz网站下载DNA序列数据文件。然后手动组织管理所有序列，使它们从IgV结构域编码区的起点开始。然后使用URL：www.ebi.ac.uk/Tools/st/emboss_transeq/处可获得的合适程序批量翻译组织管理的序列。然后使用URL：multalin.toulouse.inra.fr/multalin/multalin.html处可获得的合适程序比对翻译的序列。然后使用以下标准鉴定感兴趣的克隆：1)相同的克隆在比对中发生至少两次，和2)突变在比对中优选在不同的克隆中发生至少两次。最可能由于改善的结合，通过分选过程富集满足这些标准中的至少一个的克隆。
如实施例5所述将单独克隆转染到HEK293细胞中用于表达和纯化重组人Fc标记的蛋白。如下将另外的Fc变体的形式改变为Fc融合物。对于表11A-11C中所示的变体，将所选择的变体IgV结构域生成为Fc融合蛋白，该Fc融合蛋白含有：变体(突变)CD155 IgV结构域，接着是三个丙氨酸的接头(AAA)，接着是含有突变C220S、R292C、N297G和V302C的人IgG1 Fc(SEQ ID NO：1135)。对于表11D和11E中所示的变体，所选择的变体IgV结构域生成为Fc融合蛋白，该Fc融合蛋白含有：变体(突变)IgV结构域，接着是GSGGGGS接头，接着是含有依据EU编号的突变L234A、L235E、G237A、E356D和M358L的人IgG1 Fc(SEQ ID NO：1119)。
实施例8
评估与细胞表达的反结构的结合
该实施例描述了实施例7中鉴定和生成的纯化的变体IgV Fc融合蛋白的Fc融合物结合研究，以评估CD155结构域变体免疫调节蛋白对同源结合配偶体的特异性和亲和力。
生成表达人TIGIT、CD226或CD96的全长哺乳动物表面表达构建体的HEK293细胞，如实施例6所述评估结合。在该实验中，也用CD112R转染HEK293细胞。计算100nM每种变体Fc融合分子的结合的平均荧光强度(MFI)，并将其与不含有该一个或多个氨基酸取代的相应的未修饰的(野生型)ECD-Fc融合分子的结合进行比较。表11A-11B示出了示例性的变体Fc融合分子的结合结果，并且还显示了如实施例7中所描述的选择的变体CD155的IgV中的氨基酸取代。还测试了与野生型CD155 IgV-Fc分子和靶向人Fc的抗体(抗hFc PE)的结合作为对照。
如表11A和表11B所示，这些选择实现鉴定出显示出与至少一种同源结合配偶体的改变的结合的另外的变体CD155 IgV-Fc融合分子。
在两个单独的实验中计算同源结合配偶体TIGIT和CD226对于另外的选择的变体CD155 IgV-Fc融合分子的平均荧光强度(MFI)。还计算TIGIT MFI值与CD226 MFI值相比的比率。表11C-11E示出了示例性的变体Fc融合分子的结合结果，并且还显示了如实施例7中所描述的选择的变体CD155的IgV中的氨基酸取代。如表10C-10E所示，显示的变体CD155IgV-Fc融合分子显示出特异性地对于TIGIT而非CD226的增加的结合。
实施例9
使用Jurkat/IL2/TIGIT报告测定评估含有亲和力成熟的IgSF结构域的分子的生物活性
该实施例描述了Jurkat/IL2/TIGIT报告测定用于评估CD155结构域变体免疫调节蛋白的生物活性。
将在其表面表达IL-2萤光素酶报告基因和TIGIT的Jurkat效应细胞以2x106个细胞/mL悬浮于Jurkat测定缓冲液(RPMI1640+5％FBS)，并添加3μg/mL抗CD28。然后以50μL/孔接种Jurkat细胞，每孔总共100,000个细胞。
向含有接种的Jurkat细胞的每个孔中加入25μL的每种变体CD155 IgV-Fc融合分子或对照蛋白(野生型CD155 ECD-Fc或Fc对照)。所有蛋白质都以以下浓度加入：200nM、66.6nM、22.2nM和7.4nM。在室温下孵育具有CD155变体IgV-Fc融合分子或对照蛋白的Jurkat细胞15分钟。将展示细胞表面抗CD3单链Fv(OKT3)并且内源性表达CD155和CD112的K562衍生的人工抗原呈递细胞(aAPC)调整至0.67x106个细胞/mL，并且将25μL的细胞添加到每个孔中，使得每个孔的最终体积为100μL。每个孔具有6∶1的Jurkat∶K562细胞的最终比率，以及每个孔50、16.7、5.6或1.9nM和1.5μg/mL的抗CD28的蛋白质浓度。在湿润的5％CO2培养室中在37摄氏度下孵育Jurkat细胞和K562细胞5-6小时。然后从培养室中移出培养板，并适应至室温持续15分钟。将100μL的细胞裂解物和萤光素酶底物溶液(BioGlo萤光素酶试剂，Promega)加入到每孔中，在定轨摇床上孵育培养板10分钟。使用BioTek Cytation光度计以1秒/孔的整合时间测量发光。
测定每种变体CD155 IgV Fc的平均相对发光值，并且计算每种变体与野生型CD155 ECD-Fc蛋白相比的IL-2报告信号的倍数增加。
如表12A所示，对于一些测试的分子来说，与抗CD3/CD155 aAPC和变体CD155 IgV-Fc分子共培养的表达TIGIT和IL-2-萤光素酶报告基因的Jurkat效应细胞的萤光素酶活性改变(增加)。发光信号的差异证实了变体CD155 IgV-Fc分子与TIGIT的结合的差异和所得到的抑制活性的阻断的差异。在该表中，第二列示出了在测试的变体IgV-Fc融合分子中含有的每个变体IgV结构域的SEQ ID NO标识符。
使用用于评估CD155结构域变体免疫调节蛋白的生物活性的Jurkat/IL2/TIGIT报告测定以评估CD155结构域变体免疫调节蛋白的另外的生物活性。除了所有蛋白以两种浓度200nM或20nM添加之外，基本上如上文所述进行该测定。如上文所述在室温下孵育后，将展示细胞表面抗CD3单链Fv(OKT3)并且内源性表达CD155和CD112的K562衍生的人工抗原呈递细胞(aAPC)调整至0.8x106个细胞/mL，并且将25μL的细胞添加到每个孔中，使得每个孔的最终体积为100μL。每个孔具有5∶1的Jurkat∶K562细胞的最终比率以及每个孔50nM、5nM和1.5μg/mL的抗CD28的蛋白质浓度。如上文所述孵育Jurkat细胞和K562细胞，裂解细胞，并测量发光。测量每种变体CD155 IgV Fc的背景调整的相对发光值，并且计算每种变体与野生型CD155 ECD-Fc蛋白相比的IL-2报告信号的倍数增加(或减少)。
如表12B-12E所示，对于一些测试的分子来说，与表达抗CD3的aAPC和50或5nM变体CD155 IgV-Fc分子共培养的表达TIGIT和IL-2-萤光素酶报告基因的Jurkat效应细胞的萤光素酶活性改变。发光信号的差异证实了变体CD155 IgV-Fc分子与TIGIT的结合的差异和所得到的抑制活性的阻断或激活的差异。在表11B-11C中，第二列示出了在测试的变体IgV-Fc融合分子中含有的每个变体IgV结构域的SEQ ID NO标识符。
实施例10
另外的亲和力修饰的IgSF结构域
该实施例描述了另外的亲和力修饰的CD80(B7-1)、CD112、PD-L1、PD-L2和CD86(B7-2)免疫调节蛋白的设计、创建和筛选，其是在免疫激活和抑制中具有证实的双重作用的免疫突触(IS)的其他组分。还生成和筛选了亲和力修饰的NKp30变体。这些实施例表明IgSF结构域的亲和力修饰产生可以用于增加和减少免疫活性的蛋白质。与变体亲和力修饰的CD155成对融合(即，堆叠的)以形成II型免疫调节蛋白以实现免疫调节活性的那些结构域的各种组合。
基本上如实施例1所描述的产生突变DNA构建体，该突变DNA构建体编码人CD80的ECD结构域的变体或CD112、PD-L1和PD-L2的IgV结构域的变体，用于翻译和表达为酵母展示文库。基本上如实施例1中所描述的，对于靶向特定残基的靶文库，构建了具有简并密码子和/或随机文库的完全或部分随机化，以鉴定CD80的IgV(SEQ ID NO：1043)的变体、CD112的IgV(SEQ ID NO：1367)的变体、PD-L1的IgV(SEQ ID NO：665)的变体和PD-L2的IgV(SEQ IDNO：726)的变体。还使用相似的方法生成NKp30的IgC样结构域(SEQ ID NO：1168)的文库。
基本上如实施例2中所述将简并或随机文库DNA引入酵母中以生成酵母文库。基本上如实施例3中所述，该文库用于选择表达CD80、CD112、PD-L1、PD-L2、CD86(B7-2)和NKp30的亲和力修饰变体的酵母。基本上如实施例3所述，处理细胞以减少非结合物并针对具有结合其外源重组反结构蛋白的能力的CD80、CD112、PD-L1或PD-L2变体进行富集。
对于CD80、CD86和NKp30文库，靶配体蛋白来自R&D Systems(美国)，如下：人rCD28.Fc(即重组CD28-Fc融合蛋白)、rPD-L1.Fc、rCTLA4.Fc和rB7H6.Fc。基本上如实施例3中所述，进行双色流式细胞术。测定来自流式细胞分选的酵母输出的更高的特异性结合亲和力。对分选的输出酵母进行扩增并重新诱导以表达它们编码的特定IgSF亲和力修饰的结构域变体。然后可以通过流式细胞术将该群体与亲本、野生型酵母菌株或任何其他选择的输出(如珠粒输出酵母群)进行比较。
在选择NKp30酵母变体与B7-H6结合的情况下，当用16.6nM rB7H6.Fc染色时，F2分选输出给出MFI值533，而当用相同浓度的rB7H6.Fc染色时，测得亲本NKp30菌株MFI为90(改善6倍)。
在鉴定的NKp30变体中，一个变体是包含参照对应于SEQ ID NO：54所示位置的NKp30细胞外结构域中的位置的突变L30V/A60V/S64P/S86G的变体。
对于在表13A-B中提供的CD80变体，CD80文库由使用所需反结构CTLA4的阳性选择和使用反结构CD28的阴性选择组成。对于PD-L1和PD-L2，针对PD-1选择酵母展示靶向的或随机的PD-L1或PD-L2文库。或者，对于PD-L1，使用人rCD80.Fc(即，来自美国R&D Systems的人重组CD80融合蛋白)进行选择。较大程度地如对于PD-1所述，进行选择。然后使用外源反结构蛋白染色进行两至三轮流式细胞分选，其使用外源性反结构蛋白染色，以富集显示改善的结合物的酵母细胞部分。通过流式细胞术的磁珠富集和选择基本上如Miller，K.D.Current Protocols in Cytometry 4.7.1-4.7.30，2008年7月中所述进行。评估了表14A-B中的PD-L1变体与细胞表达的反结构的结合。表14C中示出了如上所述的筛选中鉴定的另外的PD-L1变体。
对于在表16A中提供的CD112变体，分别针对TIGIT、CD112R和CD226中的每个选择CD112文库。对于表16B-C中提供的另外的CD112变体，选择涉及使用所需的反结构TIGIT和CD112R的两个阳性选择，随后是使用反结构CD226的一个阴性选择以选择远离CD226并提高变体CD112的结合特异性。除了改变反结构(TIGIT/CD112R)的浓度和阳性分选的选择严格度以优化优势(lead)鉴定之外，基本上如上文实施例3中所述进行选择。用于阴性选择的CD226的浓度保持在100nM。
基本上如实施例4所示，将示例性的选择输出的形式改变为免疫调节蛋白，该免疫调节蛋白含有各自与Fc分子融合的亲和力修饰的CD80的(变体)IgV、CD112的变体IgV、PD-L1的变体IgV或ECD、PD-L2的变体IgV(变体IgV-Fc融合分子)，并且基本上如实施例5所示，表达和纯化该Fc融合蛋白。
然后基本上如实施例6中所述评估示例性ICOSL Fc融合变体与细胞表达的反结构的结合。基本上如实施例6中所述产生表达同源结合配偶体的细胞并且进行结合研究和流式细胞术。此外，基本上如实施例6中所述通过混合淋巴细胞反应(MLR)或抗CD3共固定化测定来表征Fc融合变体蛋白的生物活性。
如上所述，对于每个表，示例性氨基酸取代由对应于各个参照未修饰的ECD序列(表2)的氨基酸位置指定。在中间指定氨基酸位置，在数字之前列出相应的未修饰的(例如野生型)氨基酸，在数字之后列出鉴定的变体氨基酸取代(或由a指定插入)。
还显示了通过平均荧光强度(MFI)值测量的对于每个变体Fc-融合分子与工程化以表达同源反结构配体的细胞的结合的结合活性，以及与不含一个或多个氨基酸取代的相应未修饰的Fc融合分子与相同细胞表达的反结构配体的结合相比MFI的比率。还基于采用MLR测定中所示的变体Fc融合分子生成的培养物上清液中IFN-γ的计算水平(pg/ml)示出了PD-L2变体Fc融合分子调节T细胞活性的功能活性。表15B还描绘了在MLR测定中每种变体IgV-Fc产生的IFN-γ与相应的未修饰的IgV-Fc的比率。
如图13A-16C所示，该选择导致鉴定了许多CD112、PD-L1、PD-L2和CD80 IgSF结构域变体，这些IgSF结构域变体经亲和力修饰以显示出对至少一种(并且在一些情况下多于一种)同源反结构配体的增加的结合。此外，结果显示变体分子的亲和力修饰也显示出对于增加和降低免疫活性的改善的活性。
*在指示位置的终止密码子
实施例11
生成含有不同亲和力修饰的结构域的堆叠分子
该实施例描述了被生成为多结构域堆叠构建体的其它免疫调节蛋白，其含有来自以上所述的鉴定的变体PD-L2多肽和鉴定的变体CD155多肽的至少两个不同的亲和力修饰的IgV结构域。具体地，将示例性的变体PD-L2 IgV H15Q/T47A/K65R/S67L/Q82R/V89D(SEQID NO：880)和示例性的变体CD155 IgV分子P18S/S65W/S67A/L104Q/G111R(SEQ ID NO：1271)连接在一起，将其以各种构型与Fc融合。堆叠构建体作为编码整条链的基因块得到(Integrated DNA Technologies，Coralville，IA)，或者通过获得在其各种构型中编码PDL2-CD155的基因块产生，用于随后的使用Gibson组装试剂盒(New England Biolabs)Gibson组装到Fc融合载体中。如图5A所总结的和如下生成各种构型的同型二聚体和异二聚体堆叠。
生成含有相同Fc亚基的同型二聚体堆叠构建体，其中变体PD-L2 IgV和变体CD155IgV经由2xGGGS(SEQ ID NO：1182)或3xGGGGS(SEQ ID NO：1181)肽接头不同地连接到人IgG1 Fc区域的N末端或C末端。在这项研究中，示例性的IgG1 Fc区示出于SEQ ID NO：1119，并且含有根据EU编号的突变L234A、L235E、G237A、E356D和M358L(对应于参照SEQ ID NO：56示出的野生型人IgG Fc的L19A、L20E、G22A、E141D和M143L)。此外，与SEQ ID NO：56示出的野生型或未修饰的Fc相比，Fc区含有位置5的半胱氨酸残基取代为丝氨酸残基(C5S)(对应于根据EU编号的C220S)。在一些实例中，使用SEQ ID NO：1253所示的IgG1 Fc，其含有以上突变并且额外地缺少对应于SEQ ID NO：56所示的野生型或未修饰的Fc的位置232的C末端赖氨酸(对应于根据EU编号的K447del)。其它Fc区也适用于生成堆叠分子。示例性的生成的堆叠如下所示。
基本上如实施例5所述，表达和纯化同型二聚体变体IgV-堆叠的Fc融合分子，其含有来自PD-L2(SEQ ID NO：880)和CD155(SEQ ID NO：1271)的不同构型的变体IgV结构域。编码核酸分子被设计成产生具有以下所示顺序的序列的各种构型的同型二聚体堆叠：
·PD-L2/CD155堆叠1(SEO ID NO：1121)：CD155变体(SEQ ID NO：1271)-2xGGGS(SEQ ID NO：1182)-Fc(SEQ ID NO：1119)-3x GGGGS(SEQ ID NO：1181)-PD-L2(SEQ ID NO：880)
·PD-L2/CD155堆叠2(SEQ ID NO：1122)：PD-L2(SEQ ID NO：880)-2xGGGS(SEQ IDNO：1182)-Fc(SEQ ID NO：1119)-3x GGGGS(SEQ ID NO：1181)-CD155变体(SEQ ID NO：1271)
·PD-L2/CD155堆叠3(SEO ID NO：1123)：CD155变体(SEQ ID NO：1271)-3x GGGGS(SEQ ID NO：1181)-PD-L2(SEQ ID NO：880)-2xGGGS(SEQ ID NO：1182)-Fc(SEQ ID NO：1119)
·PD-L2/CD155堆叠4(SEQ ID NO：1124)：PD-L2(SEQ ID NO：880)-3x GGGGS(SEQID NO：1181)-CD155变体(SEQ ID NO：1271)-2xGGGS(SEQ ID NO：1182)-Fc(SEQ ID NO：1119)
·PD-L2/CD155堆叠5(SEQ ID NO：1125)：Fc(SEQ ID NO：1119)-3x GGGGS(SEQ IDNO：1181)-CD155变体(SEQ ID NO：1271)-3xGGGS(SEQ ID NO：1181)-PD-L2(SEQ ID NO：880)
·PD-L2/CD155堆叠6(SEQ ID NO：1126)：Fc(SEQ ID NO：1119)-3x GGGGS(SEQ IDNO：1181)-PD-L2(SEQ ID NO：880)-3xGGGS(SEQ ID NO：1181)-CD155变体(SEQ ID NO：1271)。
以两种方式生成异二聚体堆叠。第一种方式是通过共表达融合至(1)第一“隆突”Fc亚基(SEQ ID NO：1117所示，其含有根据EU编号的突变S354C和T366W，对应于参照SEQ IDNO：56所示的野生型人IgG1 Fc的S139C和T151W)的变体PD-L2 IgV和/或变体CD155 IgV和(2)第二“穴”Fc亚基(SEQ ID NO：1118所示，其含有根据EU编号的突变Y349C、T366S、L368A和Y407V，对应于参照SEQ ID NO：56所示的野生型人IgG1 Fc的Y134C、T151S、L153A和Y192V)，用于通过“隆突到穴中”工程化表达异二聚体分子。此外，隆突Fc和穴Fc二者还含有突变L19A、L20E、G22A以降低效应子功能，并且含有位置5的半胱氨酸残基取代为丝氨酸残基(C5S)，以上每个都与SEQ ID NO：56所示的野生型或未修饰的Fc相比(分别对应于根据EU编号的C220S、L234A、L235E和G237A)。第二种方式是PD-L2和/或CD155融合至隆突Fc和穴Fc二者以生成堆叠，其中每条链都含有具有融合的一个或多个IgV结构域的Fc。对于其中Fc序列是序列的N末端部分的构建体，在Fc序列之前紧接加入填充序列HMSSVSAQ(SEQ ID NO：1120)。
基本上如实施例5所述，表达和纯化异二聚体变体IgV-堆叠的Fc融合分子，其含有来自PD-L2(SEQ ID NO：880)和CD155(SEQ ID NO：1271)的不同构型的变体IgV结构域。对于每个堆叠，隆突和穴的编码核酸分子被设计成产生具有以下所示顺序的序列的各种构型的异二聚体堆叠：
·PD-L2/CD155堆叠7，其含有(1)隆突Fc融合(SEQ ID NO：1127)：CD155变体(SEQID NO：1271)-2xGGGS(SEQ ID NO：1182)-隆突Fc(SEQ ID NO：1117)-3x GGGGS(SEQ ID NO：1181)-PD-L2(SEQ ID NO：880)和(2)穴Fc(SEQ ID NO：1118加SEQ ID NO：1120所示的N-末端HMSSVSAQ)
·PD-L2/CD155堆叠8，其含有(1)隆突Fc融合(SEQ ID NO：1128)：PD-L2(SEQ IDNO：880)-2xGGGS(SEQ ID NO：1182)-隆突Fc(SEQ ID NO：1117)-3x GGGGS(SEQ ID NO：1181)-CD155变体(SEQ ID NO：1271)和(2)穴Fc(SEQ ID NO：1118加SEQ ID NO：1120所示的N-末端HMSSVSAQ)
·PD-L2/CD155堆叠9，其含有(1)隆突Fc融合(SEQ ID NO：1129)：CD155变体(SEQID NO：1271)-3x GGGGS(SEQ ID NO：1181)-CD155变体(SEQ ID NO：1271)-2xGGGS(SEQ IDNO：1182)-隆突Fc(SEQ ID NO：1117)-3x GGGGS(SEQ ID NO：1181)-PD-L2(SEQ ID NO：880)-3x GGGGS(SEQ ID NO：1181)-PD-L2(SEQ ID NO：880)；和(2)穴Fc(SEQ ID NO：1118加SEQ ID NO：1120所示的N-末端HMSSVSAQ)
·PD-L2/CD155堆叠10，其含有(1)隆突Fc融合(SEQ ID NO：1130)：PD-L2(SEQ IDNO：880)-3x GGGGS(SEQ ID NO：1181)-PD-L2(SEQ ID NO：880)-2xGGGS(SEQ ID NO：1182)-隆突Fc(SEQ ID NO：1117)-3x GGGGS(SEQ ID NO：1181)-CD155变体(SEQ ID NO：1271)-3xGGGGS(SEQ ID NO：1181)-CD155变体(SEQ ID NO：1271)；和(2)穴Fc(SEQ ID NO：1118加SEQID NO：1120所示的N-末端HMSSVSAQ)
·PD-L2/CD155堆叠11，其含有(1)隆突Fc融合(SEQ ID NO：1131)：CD155变体(SEQID NO：1271)-3x GGGGS(SEQ ID NO：1181)-CD155变体(SEQ ID NO：1271)-2xGGGS(SEQ IDNO：1182)-隆突Fc(SEQ ID NO：1117)；和(2)穴Fc fusion(SEQ ID NO：1132)：PD-L2(SEQ IDNO：880)-3x GGGGS(SEQ ID NO：1181)-PD-L2(SEQ ID NO：880)-2xGGGS(SEQ ID NO：1182)-穴Fc(SEQ ID NO：1118)
·PD-L2/CD155堆叠12，其含有(1)隆突Fc融合(SEQ ID NO：1133)：隆突Fc(SEQ IDNO：1117加SEQ ID NO：1120所示的N-末端HMSSVSAQ)-3x GGGGS(SEQ ID NO：1181)-CD155变体(SEQ ID NO：1271)-3x GGGGS(SEQ ID NO：1181)CD155变体(SEQ ID NO：1271)；和(2)穴Fc(SEQ ID NO：1134)：穴Fc(SEQ ID NO：1118加SEQ ID NO：1120所示的N-末端HMSSVSAQ)-3x GGGGS(SEQ ID NO：1181)-PD-L2(SEQ ID NO：880)-3x GGGGS(SEQ ID NO：1181)-PD-L2(SEQ ID NO：880)
·PD-L2/CD155堆叠13，其含有(1)隆突Fc融合(SEQ ID NO：1129)：CD155变体(SEQID NO：1271)-3x GGGGS(SEQ ID NO：1181)-CD155变体(SEQ ID NO：1271)-2xGGGS(SEQ IDNO：1182)-隆突Fc(SEQ ID NO：1117)-3x GGGGS(SEQ ID NO：1181)-PD-L2(SEQ ID NO：880)-3x GGGGS(SEQ ID NO：1181)-PD-L2(SEQ ID NO：880)；和(2)穴Fc(SEQ ID NO：1134)：穴Fc(SEQ ID NO：1118加SEQ ID NO：1120所示的N-末端HMSSVSAQ)-3x GGGGS(SEQ ID NO：1181)-PD-L2(SEQ ID NO：880)-3x GGGGS(SEQ ID NO：1181)-PD-L2(SEQ ID NO：880)
·PD-L2/CD155堆叠14，其含有(1)隆突Fc融合(SEQ ID NO：1129)：CD155变体(SEQID NO：1271)-3x GGGGS(SEQ ID NO：1181)-CD155变体(SEQ ID NO：1271)-2xGGGS(SEQ IDNO：1182)-隆突Fc(SEQ ID NO：1117)-3x GGGGS(SEQ ID NO：1181)-PD-L2(SEQ ID NO：880)-3x GGGGS(SEQ ID NO：1181)-PD-L2(SEQ ID NO：880)；和(2)穴Fc融合(SEQ ID NO：1132)：PD-L2(SEQ ID NO：880)-3x GGGGS(SEQ ID NO：1181)-PD-L2(SEQ ID NO：880)-2xGGGS(SEQ ID NO：1182)-穴Fc(SEQ ID NO：1118)
·PD-L2/CD155堆叠15，其含有(1)隆突Fc融合(SEQ ID NO：1130)：PD-L2(SEQ IDNO：880)-3x GGGGS(SEQ ID NO：1181)-PD-L2(SEQ ID NO：880)-2xGGGS(SEQ ID NO：1182)-隆突Fc(SEQ ID NO：1117)-3x GGGGS(SEQ ID NO：1181)-CD155变体(SEQ ID NO：1271)-3xGGGGS(SEQ ID NO：1181)-CD155变体(SEQ ID NO：1271)；和(2)穴Fc融合(SEQ ID NO：1132)：PD-L2(SEQ ID NO：880)-3x GGGGS(SEQ ID NO：1181)-PD-L2(SEQ ID NO：880)-2xGGGS(SEQ ID NO：1182)-穴Fc(SEQ ID NO：1118)
·PD-L2/CD155堆叠16，其含有(1)隆突Fc融合(SEQ ID NO：1130)：PD-L2(SEQ IDNO：880)-3x GGGGS(SEQ ID NO：1181)-PD-L2(SEQ ID NO：880)-2xGGGS(SEQ ID NO：1182)-隆突Fc(SEQ ID NO：1117)-3x GGGGS(SEQ ID NO：1181)-CD155变体(SEQ ID NO：1271)-3xGGGGS(SEQ ID NO：1181)-CD155变体(SEQ ID NO：1271)；和(2)穴Fc(SEQ ID NO：1134)：穴Fc(SEQ ID NO：1118加SEQ ID NO：1120所示的N-末端HMSSVSAQ)-3x GGGGS(SEQ ID NO：1181)-PD-L2(SEQ ID NO：880)-3x GGGGS(SEQ ID NO：1181)-PD-L2(SEQ ID NO：880)。
实施例12
评估含有亲和力成熟的IgSF结构域的堆叠分子与细胞表达的反结构的结合和其生物活性
该实施例描述了Fc融合结合研究，以显示出在实施例11中产生的示例性的PD-L2/CD155堆叠免疫调节蛋白对于同源结合配偶体的特异性和亲和力。还在人原代T细胞体外测定中评估了实施例11中产生的示例性的PD-L2/CD155堆叠免疫调节蛋白的Fc融合变体蛋白生物活性特征。
A.与细胞表达的反结构的结合
使用Jurkat/IL-2报告细胞(购买自美国Promega公司)进行结合研究，该报告细胞被转导以稳定表达人PD-1(Jurkat/PD-1细胞)、人TIGIT(Jurkat/TIGIT细胞)或PD-1和TIGIT二者(Jurkat/PD-1/TIGIT细胞)。为了通过流式细胞术染色，将100,000个Jurkat/PD-1、Jurkat/TIGIT、Jurkat/PD-1/TIGIT细胞或阴性对照(仅Jurkat)接种在96孔圆底板中。将细胞旋转向下并重悬于染色缓冲液(PBS(磷酸盐缓冲盐水)、1％BSA(牛血清白蛋白)和0.1％叠氮化钠)中20分钟以阻断非特异性结合。然后，将细胞再次离心并且重悬于含有100nM至46pM每种候选Fc融合蛋白的50μL染色缓冲液中。在冰上进行初级染色90分钟，然后在200μL染色缓冲液中洗涤细胞两次。将PE缀合的抗人Fc(Jackson ImmunoResearch，美国)在50μL染色缓冲液中1：150稀释，并添加至细胞并在冰上再孵育30分钟。将二级抗体洗去两次，将细胞在4％甲醛/PBS中固定，并在FACScan流式细胞仪(Becton Dickinson，美国)上分析样品。
使用FlowJo Version 10软件(FlowJo LLC，美国)计算平均荧光强度(MFI)。表17示出了通过平均荧光强度(MFI)值测量的6.25nM的每种堆叠Fc融合分子与Jurkat/PD-1、Jurkat/TIGIT和Jurkat/PD-1/TIGIT细胞的结合的结合活性。如表17所示，若干堆叠蛋白以高亲和力结合PD-1和TIGIT二者。
B.使用混合淋巴细胞反应(MLR)评估含有亲和力成熟的IgSF结构域的分子的生物活性
在人混合淋巴细胞反应(MLR)中测试可溶性PD-L2/CD155堆叠蛋白的生物活性。通过用在离体15培养基(Lonza，Switzerland)中的50ng/mL rIL-4(R&D Systems，美国)和80ng/mL rGM-CSF(R&D Systems，美国)体外培养分离自PBMC的单核细胞(BenTech Bio，美国)7天产生人原代树突细胞(DC)。为了诱导DC成熟，在第6天向DC培养物中添加脂多糖(LPS)(InvivoGen公司，美国)，并且孵育细胞另外的24小时。在96孔圆底板中在200μL最终体积的离体15培养基中用若干浓度的PD-L2/CD155堆叠或对照蛋白共培养大约10,000个成熟的DC和100,000个纯化的同种异体CD3+ T细胞(BenTech Bio，美国)。将不相关的人IgG和同型二聚体和异二聚体空Fc蛋白用作阴性对照。作为阳性对照，评估PD-L2-Fc(全PD-L2细胞外结构域)、野生型CD155-Fc(全CD155细胞外结构域)。测试20nM的变体PD-L2 IgV-Fc融合蛋白。在第5天，使用人IFN-γDuoset ELISA试剂盒(R&D Systems，美国)分析培养物上清液中的IFN-γ分泌。在BioTek Cytation多模式微孔板读板器(BioTek公司，美国)上测量光密度，并且根据IFN-γDuo-set试剂盒(R&D Systems，美国)中包含的滴定rIFN-γ标准进行定量。
表18中总结了示例性的测试的PD-L2/CD155堆叠蛋白的生物活性研究的结果，其示出了培养物上清液中的IFN-γ的计算水平(pg/ml)。第3列示出每种堆叠蛋白的序列标识符(SEQ ID NO)。如表18所示，在示例性的PD-L2/CD155堆叠蛋白的存在下孵育的培养物上清液在MLR测定中显示出改变水平的IFNg产生。
实施例13
生成含有不同亲和力修饰的结构域的多结构域堆叠分子
该实施例描述了被生成为多结构域堆叠构建体的免疫调节蛋白，其含有来自以上所述的鉴定的变体PD-L1多肽、鉴定的变体CD112多肽和鉴定的变体CD155多肽的至少两个不同的亲和力修饰的IgV结构域。具体地，将示例性的变体D43G/N45D/L56Q/V58A/G101G-ins(G101GG)(SEQ ID NO：659)、CD112 IgV分子S118F(SEQ ID NO：1374)和/或示例性的变体CD155 IgV分子P18S/S65W/S67A/L104Q/G111R(SEQ ID NO：1271)连接在一起，将其以各种构型与Fc融合。
如图5A和5B所总结的和如下生成各种构型的同型二聚体堆叠。在生成的同型二聚体堆叠构建体中，变体CD155 IgV变体、CD112 IgV和/或变体PD-L1 IgV经由2xGGGS(SEQ IDNO：1182)或3xGGGGS(SEQ ID NO：1181)肽接头不同地连接到人IgG1 Fc区域的N末端或C末端。在这项研究中，示例性的IgG1 Fc区域示出于SEQ ID NO：1119，并且含有根据EU编号的突变L234A、L235E、G237A、E356D和M358L(对应于参照SEQ ID NO：56示出的野生型人IgG Fc的L19A、L20E、G22A、E141D和M143L)。此外，与SEQ ID NO：56示出的野生型或未修饰的Fc相比，Fc区域含有位置5的半胱氨酸残基取代为丝氨酸残基(C5S)(对应于根据EU编号的C220S)。在一些实例中，Fc被进一步修饰以去除SEQ ID NO：56所示的野生型或未修饰的Fc的位置232处的C末端赖氨酸(对应于根据EU编号的K447del)。示例性的包含赖氨酸缺失的IgG1 Fc区域示出于SEQ ID NO：1253。其它Fc区域也适用于生成堆叠分子。示例性的生成的堆叠如下所示。
使用制造商的商业Expifectamine试剂和培养基在来自Invitrogen的Expi293HEK293细胞中瞬时表达编码感兴趣的Fc融合蛋白的表达构建体。收获上清液，并且使用AKTA蛋白纯化系统捕获并从蛋白A柱上洗脱蛋白。然后通过另外的制备型SEC步骤分离洗脱的物质，以便生成单体的高度纯化的物质。将纯化的蛋白配制在15mM乙酸盐、200mM NaCl、9％蔗糖、pH 5.0(ASU5)中。在无菌的生物安全柜中将蛋白装入小瓶，并在-80℃下冷冻。将小瓶融化，并通过分析型SEC评估以证实融化后该物质是稳定的并且主要是单体。
对于每种堆叠，编码核酸分子被设计成产生具有以下所示顺序的序列的各种构型的同型二聚体堆叠：
A.含有PD-L1和CD155的堆叠构建体
·PD-L1/CD155堆叠1(SEQ ID NO：1254)：CD155变体(SEQ ID NO：1271)-2xGGGS(SEQ ID NO：1182)-Fc(SEQ ID NO：1119)-3x GGGGS(SEQ ID NO：1181)-PD-L1(SEQ ID NO：659)
·PD-L1/CD155堆叠2(SEO ID NO：1255)：PD-L1(SEQ ID NO：659)-2xGGGS(SEQ IDNO：1182)-Fc(SEQ ID NO：1119)-3x GGGGS(SEQ ID NO：1181)-CD155变体(SEQ ID NO：1271)
·PD-L1/CD155堆叠3(SEO ID NO：1256)：CD155变体(SEQ ID NO：1271)-3x GGGGS(SEQ ID NO：1181)-PD-L1(SEQ ID NO：659)-2xGGGS(SEQ ID NO：1182)-Fc(SEQ ID NO：1119)
·PD-L1/CD155堆叠4(SEQ ID NO：1257)：PD-L1(SEQ ID NO：659)-3x GGGGS(SEQID NO：1181)-CD155变体(SEQ ID NO：1271)-2xGGGS(SEQ ID NO：1182)-Fc(SEQ ID NO：1119)
·PD-L1/CD155堆叠5(SEQ ID NO：1258)：N-terminal HMSSVSAQ set forth inSEQ ID NO：1120-Fc(SEQ ID NO：1119)-3x GGGGS(SEQ ID NO：1181)-CD155变体(SEQ IDNO：1271)-3xGGGS(SEQ ID NO：1181)-PD-L1(SEQ ID NO：659)
·PD-L1/CD155堆叠6(SEQ ID NO：1259)：SEQ ID NO：1120所示的N-末端HMSSVSAQ-Fc(SEQ ID NO：1119)-3x GGGGS(SEQ ID NO：1181)-PD-L1(SEQ ID NO：659)-3xGGGS(SEQ ID NO：1181)-CD155变体(SEQ ID NO：1271)。
B.含有CD112和CD155的堆叠构建体
·CD112/CD155堆叠1(SEQ ID NO：1260)：CD155变体(SEQ ID NO：1271)-2xGGGS(SEQ ID NO：1182)-去除赖氨酸的Fc(SEQ ID NO：1253)-3x GGGGS(SEQ ID NO：1181)-CD112(SEQ ID NO：1374)
·CD112/CD155堆叠2(SEQ ID NO：1261)：CD112(SEQ ID NO：1374)-2xGGGS(SEQID NO：1182)-去除赖氨酸的Fc(SEQ ID NO：1253)-3x GGGGS(SEQ ID NO：1181)-CD155变体(SEQ ID NO：1271)
·CD112/CD155堆叠3(SEQ ID NO：1262)：CD155变体(SEQ ID NO：1271)-3x GGGGS(SEQ ID NO：1181)-CD112(SEQ ID NO：1374)-2xGGGS(SEQ ID NO：1182)-Fc(SEQ ID NO：1119)
·CD112/CD155堆叠4(SEQ ID NO：1263)：CD112(SEQ ID NO：1374)-3x GGGGS(SEQID NO：1181)-CD155变体(SEQ ID NO：1271)-2xGGGS(SEQ ID NO：1182)-Fc(SEQ ID NO：1119)
·CD112/CD155堆叠5(SEQ ID NO：1264)：SEQ ID NO：1120所示的N-末端HMSSVSAQ-去除赖氨酸的Fc(SEQ ID NO：1253)-3xGGGGS(SEQ ID NO：1181)-CD112(SEQ IDNO：1374)-3xGGGS(SEQ ID NO：1181)-CD155变体(SEQ ID NO：1271)
·CD112/CD155堆叠6(SEO ID NO：1265)：SEQ ID NO：1120所示的N-末端HMSSVSAQ-去除赖氨酸的Fc(SEQ ID NO：1253)-3xGGGGS(SEQ ID NO：1181)-CD155变体(SEQID NO：1271)-3xGGGGS(SEQ ID NO：1181)-CD112(SEQ ID NO：1374)
C.含有PD-L1、CD112和CD155的堆叠构建体
·PD-L1/CD112/CD155堆叠1(SEQ ID NO：1266)：PD-L1(SEQ ID NO：659)-3xGGGS(SEQ ID NO：1181)-CD155变体(SEQ ID NO：1271)-2xGGGS(SEQ ID NO：1182)-去除赖氨酸的Fc(SEQ ID NO：1253)-3x GGGGS(SEQ ID NO：1181)-CD112(SEQ ID NO：1374)
·PD-L1/CD112/CD155堆叠2(SEQ ID NO：1267)：PD-L1(SEQ ID NO：659)-3xGGGS(SEQ ID NO：1181)-CD155变体(SEQ ID NO：1271)-3xGGGS(SEQ ID NO：1181)-CD112(SEQID NO：1374)-2xGGGS(SEQ ID NO：1182)-Fc(SEQ ID NO：1119)
·PD-L1/CD112/CD155堆叠3(SEQ ID NO：1268)：PD-L1(SEQ ID NO：659)-3xGGGS(SEQ ID NO：1181)-CD112(SEQ ID NO：1374)-3xGGGS(SEQ ID NO：1181)-CD155变体(SEQID NO：1271)-2xGGGS(SEQ ID NO：1182)-Fc(SEQ ID NO：1119)
实施例14
评估含有PD-L1/CD155堆叠的亲和力成熟的IgSF结构域的分子的结合和生物活性
该实施例描述了结合研究，其评估实施例13中产生的示例性的PD-L1/CD155变体IgV堆叠免疫调节蛋白(PD-L1/CD155堆叠的IgV-Fc)与同源结合配偶体的结合的特异性和亲和力。此外，使用Jurkat/IL2/PD1/TIGIT报告测定评估PD-L1/CD155堆叠的IgV-Fc分子的PD-1和TIGIT阻断活性。作为对照，还评估了分别含有与堆叠中使用的相同变体PD-L1 IgV(SEQ ID NO：659)或变体CD155 IgV(SEQ ID NO：1271)的非堆叠变体PD-L1 IgV-Fc或CD155IgV-Fc融合分子的结合和阻断活性。还评估了分别含有野生型CD155ECD(SEQ ID NO：20)或野生型PD-L1 ECD(SEQ ID NO：3)的野生型CD155-ECD-Fc和野生型PD-L1-ECD-Fc。
A.与细胞表达的反结构的结合
使用Jurkat/IL-2报告细胞(购买自美国Promega公司)进行结合研究，该报告细胞被转导以稳定表达人PD-1(Jurkat/PD-1细胞)、人TIGIT(Jurkat/TIGIT细胞)或PD-1和TIGIT二者(Jurkat/PD-1/TIGIT细胞)。为了通过流式细胞术染色，将100,000个Jurkat/PD-1、Jurkat/TIGIT、Jurkat/PD-1/TIGIT细胞或阴性对照(仅Jurkat)接种在96孔圆底板中。将细胞旋转向下并重悬于染色缓冲液(PBS(磷酸盐缓冲盐水)、1％BSA(牛血清白蛋白)和0.1％叠氮化钠)中20分钟以阻断非特异性结合。然后，将细胞再次离心并且重悬于含有100nM至6pM每种候选Fc融合蛋白(上文所述的变体PD-L1 IgV-Fc或CD155 IgV-Fc融合分子或PD-L1/CD155堆叠的IgV-Fc融合分子)的50μL染色缓冲液中。在冰上进行初级染色90分钟，然后在200μL染色缓冲液中洗涤细胞两次。将PE缀合的抗人Fc(JacksonImmunoResearch，美国)在50μL染色缓冲液中1∶150稀释，并添加至细胞并在冰上再孵育30分钟。将二级抗体洗去两次，将细胞在4％甲醛/PBS中固定，并在Intellicyt流式细胞仪(Intellicyt公司，美国)上分析样品。
使用FlowJo Version 10软件(FlowJo LLC，美国)计算平均荧光强度(MFI)。表19示出了通过平均荧光强度(MFI)值测量的20nM的每种堆叠Fc融合分子、非堆叠变体PD-L1IgV-Fc或CD155 IgV-Fc对照或野生型ECD对照与Jurkat/PD-1、Jurkat/TIGIT和Jurkat/PD-1/TIGIT细胞的结合的结合活性。如表19所示，若干堆叠蛋白以高亲和力结合PD-1和TIGIT二者。
B.评估含有亲和力成熟的IgSF结构域的分子的生物活性
将表达IL-2-萤光素酶报告基因和细胞表面PD-1和TIGIT的Jurkat效应细胞以2x106个细胞/mL悬浮在Jurkat测定缓冲液(RPMI1640+5％FBS)中，并加入抗CD28至终浓度为3μg/mL。然后以50μL/孔总共每孔100,000个细胞接种Jurkat细胞。
向每个孔中将25μL的PD-L1/CD155堆叠IgV-Fc测试蛋白加入至Jurkat细胞。作为对照，还评估了单独的或组合的非堆叠变体PD-L1 IgV-Fc或CD155 IgV-Fc融合分子用于比较。抗TIGIT抗体(克隆MBSA43)、抗PD-1抗体(nivolumab)或空Fc分子也用作对照。全部蛋白以五种浓度加入：400nM、100nM、25nM、6.25nM和1.56nM。将Jurkat细胞与测试蛋白或对照蛋白在室温下孵育15分钟。将展示转导的细胞表面抗CD3单链Fv(OKT3)、PD-L1和CD155的CHO衍生的人工抗原呈递细胞(aAPC)调整至0.8x106个细胞/mL，并向每个孔中加入25μL的细胞，使得每个孔的最终体积为100μL。每个孔的Jurkat∶CHO细胞的最终比率为5∶1，测试蛋白浓度为100、25、6.25、1.56或0.47nM，并且抗-CD28浓度为1.5μg/mL。在湿润的5％CO2培养室中在37摄氏度下将Jurkat细胞和CHO细胞孵育5小时。然后将板从培养箱中取出，并适应至室温持续15分钟。将100μL的细胞裂解物和萤光素酶底物溶液(BioGlo萤光素酶试剂，Promega)添加至每个孔，并在定轨摇床上孵育培养板10分钟。使用BioTek Cytation光度计以1秒/孔的整合时间测量发光。
测定每种测试样品的平均相对发光值，并且计算每种堆叠分子与非堆叠变体PD-L1 IgV-Fc和变体CD155 IgV-Fc蛋白相比的IL-2报告信号的倍数增加(或减少)。由于该测定是对抑制性信号的阻断的测量，与对照相比的发光信号的增加表明存在阻断活性。
如表20所示，与对照相比，对于每种测试分子来说，与抗CD3/PD-L1/CD155 aAPC和100nM PD-L1/CD155堆叠Fc分子共培养的Jurkat效应细胞的萤光素酶活性改变(增加)。发光信号的差异证实了PD-L1/CD155堆叠-Fc分子与PD-1和TIGIT的结合的差异和所得到的抑制活性的共阻断的差异。在该表中，第1列示出了测试的每种PD-L1/CD155堆叠-Fc变体的SEQ ID NO标识符。
实施例15
评估含有CD112/CD155堆叠的亲和力成熟的IgSF结构域的分子的结合和生物活性
该实施例描述了结合研究，其评估实施例13中产生的CD112/CD155变体堆叠免疫调节蛋白(CD112/CD155堆叠IgV-Fc)与同源结合配偶体的结合的特异性和亲和力。此外，使用Jurkat/IL2/PD1/TIGIT报告测定评估CD112/CD155堆叠IgV-Fc分子的CD112R和TIGIT阻断活性。作为比较，还评估了分别含有与堆叠中使用的相同变体CD112 IgV(SEQ ID NO：1374)或变体CD155 IgV(SEQ ID NO：1271)的非堆叠变体CD112 IgV-Fc或CD155 IgV-Fc融合分子的结合和阻断活性。还评估了分别含有野生型CD155ECD(SEQ ID NO：20)或野生型CD112 ECD(SEQ ID NO：21)的野生型CD155-ECD-Fc和野生型CD112-ECD-Fc。
A.与细胞表达的反结构的结合
使用内源性地表达CD112R的Jurkat/IL-2报告细胞(购买自美国Promega公司)进行结合研究，该报告细胞被转导以稳定表达人TIGIT(Jurkat/TIGIT细胞)。为了通过流式细胞术染色，将100,000个Jurkat亲本(CD112R)、或Jurkat/TIGIT细胞接种在96孔圆底板中。将细胞旋转向下并重悬于染色缓冲液(PBS(磷酸盐缓冲盐水)、1％BSA(牛血清白蛋白)和0.1％叠氮化钠)中20分钟以阻断非特异性结合。然后，将细胞再次离心并且重悬于含有100nM至6pM每种候选Fc融合蛋白的50μL染色缓冲液中。在冰上进行初级染色90分钟，然后在200μL染色缓冲液中洗涤细胞两次。将PE缀合的抗人Fc(Jackson ImmunoResearch，美国)在50μL染色缓冲液中1∶150稀释，并添加至细胞并在冰上再孵育30分钟。将二级抗体洗去两次，将细胞在4％甲醛/PBS中固定，并在LSRII流式细胞仪(Becton Dickinson公司，美国)上分析样品。
测定33.3nM浓度的每种堆叠Fc融合蛋白和非堆叠变体CD112 IgV-Fc或CD155IgV-Fc融合分子的表示为平均荧光强度(MFI)的结合值。使用FlowJo第10版软件(FlowJoLLC，美国)分析数据。表21示出了示例性的测试CD112/CD155堆叠Fc融合分子(以33.3nM测试)的结合研究的结果。如表21所示，若干堆叠蛋白以高亲和力结合TIGIT和/或CD112R。
B.评估含有亲和力成熟的IgSF结构域的分子的生物活性
将表达IL-2-萤光素酶报告基因和细胞表面CD112R和TIGIT的Jurkat效应细胞以2x106个细胞/mL悬浮在Jurkat测定缓冲液(RPMI1640+5％FBS)中，然后以50μL/孔总共每孔100,000个细胞接种Jurkat细胞。
向每个孔中将25μL的CD112/CD155堆叠IgV-Fc测试蛋白加入至Jurkat细胞。作为对照，还评估了单独的或组合的非堆叠变体CD112 IgV-Fc或CD155IgV-Fc融合分子用于比较。空Fc分子用作阴性对照。全部蛋白以三种浓度加入：400nM、100nM和25nM。将Jurkat细胞与测试蛋白或对照蛋白在室温下孵育15分钟。将展示内源性CD155和CD112和转导的细胞表面抗CD3单链Fv(OKT3)和CD80的K562衍生的人工抗原呈递细胞(aAPC)调整至0.8x106个细胞/mL，并向每个孔中加入25μL的细胞，使得每个孔的最终体积为100μL。每个孔的Jurkat∶K562的最终比率为5∶1，测试蛋白浓度为100、25或6.25。在湿润的5％CO2培养室中在37摄氏度下将Jurkat细胞和K562细胞孵育5小时。然后将板从培养箱中取出，并适应至室温持续15分钟。将100μL的细胞裂解物和萤光素酶底物溶液(BioGlo萤光素酶试剂，Promega)添加至每个孔，并在定轨摇床上孵育培养板10分钟。使用BioTek Cytation光度计以1秒/孔的整合时间测量发光。
测定每种测试样品的平均相对发光值，并且计算每种堆叠分子与非堆叠变体CD112 IgV-Fc和变体CD155 IgV-Fc蛋白相比的IL-2报告信号的倍数增加(或减少)。由于该测定是对抑制性信号的阻断的测量，与对照相比的发光信号的增加表明存在阻断活性。
如表22所示，与对照相比，对于每种测试分子来说，与抗CD3/CD112/CD155 aAPC和CD112/CD155堆叠Fc分子共培养的Jurkat效应细胞的萤光素酶活性改变(增加)。发光信号的差异证实了CD112/CD155堆叠-Fc分子与CD112R和TIGIT的结合的差异和所得到的抑制活性的共阻断的差异。在该表中，第2列示出了测试的每种CD112/CD155堆叠-Fc变体的SEQ IDNO标识符。
实施例16
评估含有PD-L1/CD112/CD155堆叠的亲和力成熟的IgSF结构域的分子的结合和生物活性
该实施例描述了结合研究，其评估实施例13中产生的PD-L1/CD112/CD155堆叠免疫调节蛋白(PD-L1/CD112/CD155堆叠IgV-Fc)与同源结合配偶体的结合的特异性和亲和力。此外，使用Jurkat/IL2/PD1/CD112R/TIGIT报告测定评估PD-L1/CD112/CD155堆叠IgV-Fc分子的PD-1、CD112R和TIGIT阻断活性。作为比较，还评估了分别含有与堆叠中使用的相同变体PD-L1(SEQ ID NO：659)、CD112 IgV(SEQ ID NO：1374)或CD155 IgV(SEQ ID NO：1271)的非堆叠变体PD-L1 IgV-Fc、CD112 IgV-Fc或CD155 IgV-Fc融合分子的结合和阻断活性。
A.与细胞表达的反结构的结合
使用内源性地表达CD112R的Jurkat/IL-2报告细胞(购买自美国Promega公司)进行结合研究，该报告细胞被转导以稳定表达人PD-1(Jurkat/PD-1细胞)、人TIGIT(Jurkat/TIGIT细胞)或PD-1和TIGIT二者(Jurkat/PD-1/TIGIT细胞)。为了通过流式细胞术染色，将100，000个Jurkat亲本(CD112R)、Jurkat/PD-1、Jurkat/TIGIT、Jurkat/PD-1/TIGIT细胞接种在96孔圆底板中。将细胞旋转向下并重悬于染色缓冲液(PBS(磷酸盐缓冲盐水)、1％BSA(牛血清白蛋白)和0.1％叠氮化钠)中20分钟以阻断非特异性结合。然后，将细胞再次离心并且重悬于含有100nM至6pM每种候选Fc融合蛋白的50μL染色缓冲液中。在冰上进行初级染色90分钟，然后在200μL染色缓冲液中洗涤细胞两次。将PE缀合的抗人Fc(JacksonImmunoResearch，美国)在50μL染色缓冲液中1∶150稀释，并添加至细胞并在冰上再孵育30分钟。将二级抗体洗去两次，将细胞在4％甲醛/PBS中固定，并在LSRII流式细胞仪(BectonDickinson公司，美国)上分析样品。
测定33.3nM浓度的每种堆叠Fc融合蛋白和非堆叠变体PD-L1 IgV-Fc、CD112-IgV-Fc和CD155-IgV-Fc蛋白的表示为平均荧光强度(MFI)的结合值。使用FlowJo第10版软件(FlowJo LLC，美国)分析数据。表23示出了示例性的测试PD-L1/CD112/CD155堆叠Fc融合分子(以33.3nM测试)的结合研究的结果。如其所示，若干堆叠蛋白以高亲和力结合PD-1、TIGIT和/或CD112R。
B.评估含有亲和力成熟的IgSF结构域的分子的生物活性
将表达IL-2-萤光素酶报告基因和细胞表面PD-1、CD112R和TIGIT的Jurkat效应细胞以2x106个细胞/mL悬浮在Jurkat测定缓冲液(RPMI1640+5％FBS)中并添加抗CD28至最终浓度为3μg/mL，然后以50μL/孔总共每孔100,000个细胞接种Jurkat细胞。
向每个孔中将25μL的PD-L1/CD112/CD155堆叠IgV-Fc测试蛋白加入至Jurkat细胞。作为对照，还评估了单独的或组合的非堆叠变体PD-L1 IgV-Fc、CD112 IgV-Fc或CD155IgV-Fc融合分子用于比较。抗TIGIT抗体(克隆MBSA43)、抗PD-1抗体(nivolumab)或空Fc分子用作对照。全部蛋白以五种浓度加入：400nM、100nM、25nM、6.25nM、1.56nM或0.49nM。将Jurkat细胞与测试蛋白或对照蛋白在室温下孵育15分钟。将展示转导的细胞表面抗CD3单链Fv(OKT3)、PD-L1和CD155的CHO衍生的人工抗原呈递细胞(aAPC)调整至0.8x106个细胞/mL，并向每个孔中加入25μL的细胞，使得每个孔的最终体积为100μL。每个孔的Jurkat∶CHO细胞的最终比率为5∶1，测试蛋白浓度为100、25、6.25、1.56、0.47或0.12nM，并且抗-CD28浓度为1.5μg/mL。在湿润的5％CO2培养室中在37摄氏度下将Jurkat细胞和CHO细胞孵育5小时。然后将板从培养箱中取出，并适应至室温持续15分钟。将100μL的细胞裂解物和萤光素酶底物溶液(BioGlo萤光素酶试剂，Promega)添加至每个孔，并在定轨摇床上孵育培养板10分钟。使用BioTek Cytation光度计以1秒/孔的整合时间测量发光。
测定每种测试样品的平均相对发光值(RLU)，并且计算每种堆叠分子与非堆叠变体PD-L1 IgV-Fc、变体CD112 IgV-Fc和变体CD155 IgV-Fc蛋白相比的IL-2报告信号的倍数增加(或减少)。由于该测定是对抑制性信号的阻断的测量，与对照相比的发光信号的增加表明存在阻断活性。
如表24所示，对于每种测试分子来说，与抗CD3/PD-L1/CD112 aAPC和PD-L1/CD112/CD155堆叠Fc分子共培养的Jurkat效应细胞的萤光素酶活性改变(增加)。发光信号的差异证实了PD-L1/CD112/CD155堆叠-Fc分子与PD-1、CD112R和TIGIT的结合的差异和所得到的抑制活性的共阻断的差异。在该表中，第1列示出了测试的每种PD-L1/CD112/CD155堆叠-Fc变体的SEQ ID NO标识符。
本发明并不旨在限于具体公开的实施方案的范围，所提供的实施例例如是为了说明本发明的各个方面。根据本文的描述和传授，对所描述的组合物和方法的各种修改将变得清楚。可以在不脱离本公开文本的真实范围和精神的情况下实践这些变化，并且这些变化旨在落入本公开文本的范围内。
Claims (159)
1.一种变体CD155多肽，其包含IgV结构域或其特异性结合片段、IgC结构域或其特异性结合片段、或二者，其中所述变体CD155多肽包含在未修饰的CD155或其特异性结合片段中的一个或多个位置的一个或多个氨基酸修饰，所述一个或多个氨基酸修饰对应于选自以下的参照SEQ ID NO：47所示的位置的一个或多个位置：7、8、9、10、11、12、13、15、16、18、19、20、21、22、23、24、25、26、29、30、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、64、65、67、68、69、70、72、73、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、87、88、89、90、91、92、94、95、96、97、98、99、100、102、104、106、107、108、110、111、112、113、114、115或116。
2.权利要求1的变体CD155多肽，其中所述氨基酸修饰包含氨基酸取代、缺失或插入。
3.权利要求1或权利要求2的变体CD155多肽，其中所述未修饰的CD155是哺乳动物CD155或其特异性结合片段。
4.权利要求3的变体CD155多肽，其中所述未修饰的CD155是人CD155或其特异性结合片段。
5.权利要求1-4中的任一项的变体CD155多肽，其中所述未修饰的CD155包含(i)SEQ IDNO：47所示的氨基酸序列；(ii)与SEQ ID NO：47具有至少95％序列一致性的氨基酸序列；或(iii)(i)或(ii)的一部分，其包含IgV结构域或其特异性结合片段。
6.权利要求1-5中的任一项的变体CD155多肽，其中：
所述IgV结构域的特异性结合片段的长度为至少50、60、70、80、90、100、110或更多个氨基酸；或
所述IgV结构域的特异性结合片段包含SEQ ID NO：20的氨基酸24-139所示的IgV结构域的长度的80％的长度。
7.权利要求1-6中的任一项的变体CD155多肽，其中所述变体CD155包含多达1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸修饰，任选氨基酸取代、插入和/或缺失。
8.权利要求1-7中的任一项的变体CD155多肽，其中所述变体CD155多肽包含显示出与SEQ ID NO：47或其特异性结合片段至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列。
9.权利要求1-8中的任一项的变体CD155多肽，其中与所述未修饰的CD155与相同胞外域的结合相比，所述变体CD155多肽显示出与TIGIT、CD226或CD96的胞外域的改变的结合。
10.权利要求1-9中的任一项的变体CD155多肽，其中与所述未修饰的CD155与相同胞外域的结合相比，所述变体CD155多肽显示出与TIGIT或CD226的胞外域的改变的结合。
11.权利要求9或权利要求10的变体CD155多肽，其中所述改变的结合是改变的结合亲和力和/或改变的结合选择性。
12.权利要求1-11中的任一项的变体CD155多肽，其中所述一个或多个氨基酸修饰选自G7E、D8G、V9A、V9D、V9I、V9L、V10F、V10G、V10I、V11A、V11E、V11M、Q12H、Q12K、Q12L、A13E、A13R、T15I、T15S、Q16H、P18C、P18F、P18H、P18L、P18S、P18T、P18Y、G19D、F20I、F20S、F20Y、L21S、L21M、G22S、D23A、D23G、D23N、D23Y、S24A、S24P、V25A、V25E、T26M、C29R、Y30C、Y30F、Y30H、Q32L、Q32R、V33M、P34S、N35D、N35F、N35S、M36I、M36R、M36T、E37G、E37P、E37S、E37V、V38A、V38G、T39A、T39S、H40Q、H40R、H40T、V41A、V41M、S42A、S42C、S42G、S42L、S42N、S42P、S42Q、S42T、S42V、S42W、L44P、L44V、T45A、T45G、T45I、T45S、T45Q、T45V、W46C、W46R、A47E、A47G、A47V、R48Q、H49L、H49Q、H49R、G50S、E51G、E51K、E51V、S52A、S52E、S52G、S52K、S52L、S52M、S52P、S52Q、S52R、S52T、S52W、G53R、S54C、S54G、S54H、S54N、S54R、M55I、M55L、M55V、A56V、V57A、V57L、V57T、F58L、F58Y、H59E、H59N、N59R、Q60H、Q60K、Q60P、Q60R、T61A、T61G、T61K、T61M、T61R、T61S、Q62F、Q62H、Q62K、Q62L、Q62M、Q62R、Q62Y、P64S、S65A、S65C、S65G、S65D、S65T、S65Y、S65H、S65N、S65T、S65W、S67A、S67E、S67G、S67H、S67L、S67T、S67V、S67W、E68D、E68G、S69L、S69P、K70E、K70R、K70Q、L72Q、E73D、E73G、E73R、V75A、V75L、A76E、A76G、A76T、A77T、A77V、R78G、R78K、R78S、L79P、L79Q、L79V、G80D、G80S、A81E、A81P、A81T、A81V、E82D、E82G、L83P、L83Q、R84W、N85D、N85Y、N87T、L88P、R89K、M90I、M90L、M90V、F91S、F91T、F91P、G92A、G92E、G92W、R94H、V95A、E96D、D97G、E98D、E98S、G99D、G99Y、N100Y、T102S、L104E、L104M、L104N、L104P、L104Q、L104T、L104Y、V106A、V106I、V106L、T107A、T107L、T107M、T107S、T107V、F108H、F108L、F108Y、Q110R、G111D、G111R、S112I、S112N、S112V、R113G、R113W、S114N、S114T、V115A、V115M、D116G或D116N或其保守氨基酸取代。
13.权利要求1-12中的任一项的变体CD155多肽，其中所述一个或多个氨基酸修饰选自P18S/P64S/F91S、P18S/F91S/L104P、P18L/L79V/F91S、P18S/F91S、P18T/F91S、P18T/S42P/F91S、G7E/P18T/Y30C/F91S、P18T/F91S/G111D、P18S/F91P、P18T/F91S/F108L、P18S/F91S、P18T/T45A/F91S、P18T/F91S/R94H、P18S/Y30C/F91S、A81V/L83P、A13E/P18S/A56V/F91S、P18T/F91S/V115A、P18T/Q60K、S52M、T45Q/S52L/L104E/G111R、S42G、Q62F、S52Q、S42A/L104Q/G111R、S42A/S52Q/L104Q/G111R、S52W/L104E、S42C、S52W、S52M/L104Q、S42L/S52L/Q62F/L104Q、S42W、S42Q、S52L、S52R、L104E、G111R、S52E、Q62Y、T45Q/S52M/L104E、S42N/L104Q/G111R、S52M/V57L、S42N/S52Q/Q62F、S42A/S52L/L104E/G111R、S42W/S52Q/V57L/Q62Y、L104Q、S42L/S52Q/L104E、S42C/S52L、S42W/S52R/Q62Y/L104Q、T45Q/S52R/L104E、S52R/Q62F/L104Q/G111R、T45Q/S52L/V57L/L104E、S52M/Q62Y、Q62F/L104E/G111R、T45Q/S52Q、S52L/L104E、S42V/S52E、T45Q/S52R/G111R、S42G/S52Q/L104E/G111R、S42N/S52E/V57L/L104E、S42C/S52M/Q62F、S42L、S42A、S42G/S52L/Q62F/L104Q、S42N、P18T/S65A/S67V/F91S、P18F/T39A/T45Q/T61R/S65N/S67L/E73G/R78G、P18T/T45Q/T61R/S65N/S67L、P18F/S65A/S67V/F91S、P18F/T45Q/T61R/S65N/S67L/F91S/L104P、P18S/L79P/L104M、P18S/L104M、L79P/L104M、P18T/T45Q/L79P、P18T/T45Q/T61R/S65H/S67H、P18T/A81E、P18S/D23Y/E37P/S52G/Q62M/G80S/A81P/G99Y/S112N、A13R/D23Y/E37P/S42P/Q62Y/A81E、A13R/D23Y/E37P/G99Y/S112N、A13R/D23Y/E37P/Q62M/A77V/G80S/A81P/G99Y、P18L/E37S/Q62M/G80S/A81P/G99Y/S112N、P18S/L104T、P18S/Q62H/L79Q/F91S、T45Q/S52K/Q62F/L104Q/G111R、T45Q/S52Q/Q62Y/L104Q/G111R、T45Q/S52Q/Q62Y/L104E/G111R、V57A/T61M/S65W/S67A/E96D/L104T、P18L/V57T/T61S/S65Y/S67A/L104T、P18T/T45Q、P18L/V57A/T61M/S65W/S67A/L104T、T61M/S65W/S67A/L104T、P18S/V41A/S42G/T45G/L104N、P18H/S42G/T45I/S52T/G53R/S54H/V57L/H59E/T61S/S65D/E68G/L104N、P18S/S42G/T45V/F58L/S67W/L104N、P18S/T45I/L104N、P18S/S42G/T45G/L104N/V106A、P18H/H40R/S42G/T45I/S52T/G53R/S54H/V57L/H59E/T61S/S65D/E68G/L104Y/V106L/F108H、E37V/S42G/T45G/L104N、P18S/T45Q/L79P/L104T、P18L/Q62R、A13R/D23Y/E37P/S42L/S52G/Q62Y/A81E、P18L/H49R/L104T/D116N、A13R/D23Y/E37P/Q62M/G80S/A81P/L104T、S65T/L104T、A13R/D23Y/E37P/S52G/V57A/Q62M/K70E/L104T、P18L/A47V/Q62Y/E73D/L104T、H40T/V41M/A47V/S52Q/Q62L/S65T/E73R/D97G/E98S/L104T/D116N、P18L/S42P/T45Q/T61G/S65H/S67E/L104T/D116N、P18S/H40T/V41M/A47V/S52Q/Q62L/S65T/E73R/L104M/V106A、H40T/V41M/A47V/S52Q/Q62L/S65T/E68G/E73R/D97G/E98S/L104T、T45Q/S52E/L104E、T45Q/S52E/Q62F/L104E、P18F/T26M/L44V/Q62K/L79P/F91S/L104M/G111D、P18S/T45S/T61K/S65W/S67A/F91S/G111R、P18S/L79P/L104M/T107M、P18S/S65W/S67A/M90V/V95A/L104Q/G111R、P18S/A47G/L79P/F91S/L104M/T107A/R113W、P18T/D23G/S24A/N35D/H49L/L79P/F91S/L104M/G111R、V9L/P18S/Q60R/V75L/L79P/R89K/F91S/L104E/G111R、P18S/H49R/E73D/L79P/N85D/F91S/V95A/L104M/G111R、V11A/P18S/L79P/F91S/L104M/G111R、V11A/P18S/S54R/Q60P/Q62K/L79P/N85D/F91S/T107M、P18T/S52P/S65A/S67V/L79P/F91S/L104M/G111R、P18T/M36T/L79P/F91S/G111R、D8G/P18S/M36I/V38A/H49Q/A76E/F91S/L104M/T107A/R113W、P18S/S52P/S65A/S67V/L79P/F91S/L104M/T107S/R113W、T15I/P18T/L79P/F91S/L104M/G111R、P18F/T26M/L44V/Q62K/L79P/E82D/F91S/L104M/G111D、P18T/E37G/G53R/Q62K/L79P/F91S/E98D/L104M/T107M、P18L/K70E/L79P/F91S/V95A/G111R、V9I/Q12K/P18F/S65A/S67V/L79P/L104T/G111R/S112I、P18F/S65A/S67V/F91S/L104M/G111R、V9I/V10I/P18S/F20S/T45A/L79P/F91S/L104M/F108Y/G111R/S112V、V9L/P18L/L79P/M90I/F91S/T102S/L104M/G111R、P18C/T26M/L44V/M55I/Q62K/L79P/F91S/L104M/T107M、V9I/P18T/D23G/L79P/F91S/G111R、P18F/L79P/M90L/F91S/V95A/L104M/G111R、P18T/M36T/S65A/S67E/L79Q/A81T/F91S/G111R、V9L/P18T/Q62R/L79P/F91S/L104M/G111R、P18S/S65W/S67A/L104Q/G111R、P18T/G19D/M36T/S54N/L79P/L83Q/F91S/T107M/F108Y、V9L/P18L/M55V/S69L/L79P/A81E/F91S/T107M、P18F/H40Q/T61K/Q62K/L79P/F91S/L104M/T107V、P18S/Q32R/Q62K/R78G/L79P/F91S/T107A/R113W、Q12H/P18T/L21S/G22S/V57A/Q62R/L79P/F91S/T107M、V9I/P18S/S24P/H49Q/F58Y/Q60R/Q62K/L79P/F91S/T107M、P18T/W46C/H49R/S65A/S67V/A76T/L79P/S87T/L104M、P18S/S42T/E51G/L79P/F91S/G92W/T107M、V10F/T15S/P18L/R48Q/L79P/F91S/T107M/V115M、P18S/L21M/Y30F/N35D/R84W/F91S/T107M/D116G、P18F/E51V/S54G/Q60R/L79Q/E82G/S87T/M90I/F91S/G92R/T107M、Q16H/P18F/F91S/T107M、P18T/D23G/Q60R/S67L/L79P/F91S/T107M/V115A、D8G/V9I/V11A/P18T/T26M/S52P/L79P/F91S/G92A/T107L/V115A、V9I/P18F/A47E/G50S/E68G/L79P/F91S/T107M、P18S/M55I/Q62K/S69P/L79P/F91S/T107M、P18T/T39S/S52P/S54R/L79P/F91S/T107M、P18S/D23N/L79P/F91S/T107M/S114N、P18S/P34S/E51V/L79P/F91S/G111R、P18S/H59N/V75A/L79P/A81T/F91S/L104M/T107M、P18S/W46R/E68D/L79P/F91S/T107M/R113G、V9L/P18F/T45A/S65A/S67V/R78K/L79V/F91S/T107M/S114T、P18T/M55L/T61R/L79P/F91S/V106I/T107M、T15I/P18S/V33M/N35F/T39S/M55L/R78S/L79P/F91S/T107M、P18S/Q62K/K70E/L79P/F91S/G92E/R113W、P18F/F20I/T26M/A47V/E51K/L79P/F91S、P18T/D23A/Q60H/L79P/M90V/F91S/T107M、P18S/D23G/C29R/N35D/E37G/M55I/Q62K/S65A/S67G/R78G/L79P/F91S/L104M/T107M/Q110R、A13E/P18S/M36R/Q62K/S67T/L79P/N85D/F91S/T107M、V9I/P18T/H49R/L79P/N85D/F91S/L104T/T107M、V9A/P18F/T61S/Q62L/L79P/F91S/G111R、D8E/P18T/T61A/L79P/F91S/T107M、P18S/V41A/H49R/S54C/L79S/N85Y/L88P/F91S/L104M/T107M、V11E/P18H/F20Y/V25E/N35S/H49R/L79P/F91S/T107M/G111R、V11A/P18F/D23A/L79P/G80D/V95A/T107M、P18S/K70R/L79P/F91S/G111R、V9L/V11M/P18S/N35S/S54G/Q62K/L79P/L104M/T107M/V115M、V9L/P18Y/V25A/V38G/M55V/A77T/L79P/M90I/F91S/L104M、V10G/P18T/L72Q/L79P/F91S/T107M、P18S/H59R/A76G/R78S/L79P、V9A/P18S/M36T/S65G/L79P/F91S/L104T/G111R/S112I、P18T/S52A/V57A/Q60R/Q62K/S65C/L79P/F91T/N100Y/T107M、V11A/P18F/N35D/A47E/Q62K/L79P/F91S/G99D/T107M/S114N、V11A/P18T/N35S/L79P/S87T/F91S、V9D/V11M/Q12L/P18S/E37V/M55I/Q60R/K70Q/L79P/F91S/L104M/T107M、or T15S/P18S/Y30H/Q32L/Q62R/L79P/F91S/T107M。
14.权利要求1-13中的任一项的变体CD155多肽，其中所述变体CD155多肽包含一个IgC结构域或其特异性序列，或两个IgC结构域或其特异性片段。
15.权利要求1-13中的任一项的变体CD155多肽，其包含SEQ ID NO：59-80、178-274、1230-1252、1269中的任一个所示的氨基酸序列或其特异性结合片段，或显示出与SEQ IDNO：59-80、178-274、1230-1252、1269中任一个或其特异性结合片段至少95％序列一致性并且含有其所述一个或多个氨基酸修饰的氨基酸序列。
16.权利要求1-15中的任一项的变体CD155多肽，其中所述未修饰的CD155包含IgV结构域或其特异性结合片段，所述IgV结构域或其特异性结合片段包含(i)SEQ ID NO：58或155所示的氨基酸序列；(ii)与SEQ ID NO：58或155具有至少95％序列一致性的氨基酸序列；或(iii)(i)或(ii)的一部分，其包含(i)或(ii)的特异性结合片段。
17.权利要求1-16中的任一项的变体CD155多肽，其中所述变体CD155多肽包含所述IgV结构域或其抗原结合片段。
18.权利要求1-17中的任一项的变体CD155多肽，其中IgV结构域或其特异性结合片段仅是所述变体CD155多肽的CD155部分。
19.权利要求1-18中的任一项的变体CD155多肽，其包含SEQ ID NO：81-102、156-177、275-468、1184-1229、1270-1271、1656-1747中任一个所示的氨基酸序列或其特异性结合片段，或表现出与SEQ ID NO：81-102、156-177、275-468、1184-1229、1270-1271、1656-1747中任一个或其特异性结合片段至少95％序列一致性并且含有其所述一个或多个氨基酸修饰的氨基酸序列。
20.权利要求1-19中的任一项的变体CD155多肽，其中与所述未修饰的CD155与相同的TIGIT、CD226或CD96的胞外域的结合相比，所述变体CD155多肽以增加的亲和力特异性地结合至TIGIT、CD226或CD96中的一个或多个的胞外域。
21.权利要求1-20中的任一项的变体CD155多肽，其中与所述未修饰的CD155与相同的TIGIT或CD226的胞外域的结合相比，所述变体CD155多肽以增加的亲和力特异性地结合至TIGIT或CD226的胞外域。
22.权利要求1-21中的任一项的变体CD155多肽，其中与所述未修饰的CD155与相同的TIGIT的胞外域的结合相比，所述变体CD155多肽以增加的亲和力特异性地结合至TIGIT的胞外域和CD226的胞外域。
23.权利要求1-20中的任一项的变体CD155多肽，其中与所述未修饰的CD155与相同的胞外域的结合相比，所述变体CD155多肽以增加的亲和力特异性地结合至TIGIT、CD226或CD96中的一个或多个的胞外域，并且以降低的亲和力特异性地结合至TIGIT、CD226或CD96中其余的一个或多个的胞外域。
24.权利要求23的变体CD155多肽，其中与所述未修饰的CD155与相同的胞外域的结合相比，所述变体CD155多肽以降低的亲和力特异性地结合至TIGIT的胞外域，并且以降低的亲和力特异性地结合至CD226的胞外域。
25.权利要求1-24中的任一项的变体CD155多肽，其中与所述未修饰的CD155与相同的TIGIT的胞外域的结合相比，所述变体CD155多肽以增加的选择性特异性地结合至TIGIT的胞外域。
26.权利要求25的变体CD155多肽，其中所述增加的选择性包括与所述未修饰的CD155多肽对于相同的TIGIT的胞外域对比CD226的胞外域的结合的比率相比，所述变体多肽对于TIGIT对比CD226的结合的更高的比率。
27.权利要求26的变体CD155多肽，其中所述比例大至少或至少约1.5倍、2.0倍、3.0倍、4.0倍、5倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍或更多倍。
28.权利要求23的变体CD155多肽，其中与所述未修饰的CD155与相同的胞外域的结合相比，所述变体CD155多肽以增加的亲和力特异性地结合至CD226的胞外域并且以降低的亲和力特异性地结合至TIGIT的胞外域。
29.权利要求9-28中的任一项的变体CD155多肽，其中所述TIGIT是人TIGIT。
30.权利要求9-29中的任一项的变体CD155多肽，其中所述CD226是人CD226。
31.权利要求9-30中的任一项的变体CD155多肽，其中所述CD96是人CD96。
32.权利要求1-31中的任一项的变体CD155多肽，其中所述结合活性改变(增加或降低)超过1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍或50倍。
33.权利要求1-32中的任一项的变体CD155多肽，其是可溶性蛋白。
34.权利要求1-33中的任一项的变体CD155多肽，其中：
所述变体CD155多肽缺少所述CD155跨膜结构域和细胞外信号传导结构域；
和/或
所述变体CD155多肽不能在细胞表面上表达。
35.权利要求1-34中的任一项的变体CD155多肽，其中所述变体CD155多肽与增加所述多肽的生物半衰期的部分连接。
36.权利要求1-35中的任一项的变体CD155多肽，其中所述变体CD155多肽与多聚化结构域连接。
37.权利要求36的变体CD155多肽，其中所述多聚化结构域是Fc结构域或具有降低的效应子功能的变体Fc结构域。
38.权利要求37的变体CD155多肽，其中：
所述Fc结构域是哺乳动物的，任选人的；或
与哺乳动物的任选人的未修饰的Fc结构域相比，所述变体Fc结构域包含一个或多个氨基酸修饰。
39.权利要求37或权利要求38的变体CD155多肽，其中所述Fc结构域或其变体包含SEQID NO：56或SEQ ID NO：57所示的氨基酸序列或显示出与SEQ ID NO：56或SEQ ID NO：57至少85％序列一致性的氨基酸序列。
40.权利要求35和37-39中的任一项的变体CD155多肽，其中所述Fc结构域包含选自每个根据EU编号的E233P、L234A、L234V、L235A、L235E、G236del、G237A、S267K、N297G、V302C和K447del的一个或多个氨基酸修饰。
41.权利要求35和37-40中的任一项的变体CD155多肽，其中所述Fc结构域包含氨基酸修饰根据EU编号的C220S。
42.权利要36-41中的任一项的变体CD155多肽，其中所述变体CD155多肽经由接头任选G4S接头与所述多聚化结构域或Fc间接连接。
43.权利要求1-17和19-32中的任一项的变体CD155多肽，其中所述变体CD155多肽是还包含跨膜结构域的跨膜免疫调节蛋白，任选地其中所述跨膜结构域直接或间接与所述变体CD155多肽的细胞外结构域(ECD)或其特异性结合片段连接。
44.权利要求43的变体CD155多肽，其中所述跨膜结构域包含SEQ ID NO：20的残基344-367所示的氨基酸序列或其功能变体，所述功能变体显示出与SEQ ID NO：20的残基344-367至少85％序列一致性。
45.权利要求43或权利要求44的变体CD155多肽，还包含细胞质结构域，任选地其中所述细胞质结构域直接或间接与所述跨膜结构域连接。
46.权利要求45的变体CD155多肽，其中所述细胞质信号传导结构域包含SEQ ID NO：20的残基368-417所示的氨基酸序列或其功能变体，所述功能变体显示出与SEQ ID NO：20的残基368-417至少85％序列一致性。
47.权利要求1-46中任一项的变体CD155多肽，其中在体外原代T细胞测定中，相对于所述未修饰的CD155，所述变体CD155增加IFN-γ(干扰素-γ)表达。
48.权利要求1-46中任一项的变体CD155多肽，其中在体外原代T细胞测定中，相对于所述未修饰的CD155，所述变体CD155增加IFN-γ(干扰素-γ)表达。
49.权利要求1-48中任一项的变体CD155多肽，其是去糖基化的。
50.一种免疫调节蛋白，其包含直接或经由接头间接与包含IgSF家族成员的免疫球蛋白超家族(IgSF)结构域的第二多肽连接的权利要求1-49中的任一项的变体CD155。
51.权利要求50的免疫调节蛋白，其中所述IgSF结构域是亲和力修饰的IgSF结构域，所述亲和力修饰的IgSF结构域包含与所述IgSF家族成员的未修饰的或野生型IgSF结构域相比一个或多个氨基酸修饰。
52.权利要求51的免疫调节蛋白，其中与所述IgSF家族成员的未修饰的或野生型IgSF结构域与相同的一种或多种同源结合配偶体的结合相比，所述亲和力修饰的IgSF结构域显示出与一种或多种其同源结合配偶体的改变的结合。
53.权利要求52的免疫调节蛋白，其中与所述未修饰的或野生型IgSF结构域与相同的一种或多种同源结合配偶体的结合相比，所述IgSF结构域显示出与一种或多种其同源结合配偶体的增加的结合。
54.权利要求50-53中的任一项的免疫调节蛋白，其中所述变体CD155是第一变体CD155多肽，并且所述第二多肽的所述IgSF结构域是来自权利要求1-49中任一项的第二变体CD155多肽的IgSF结构域，其中所述第一变体CD155多肽和第二变体CD155多肽是相同或不同的。
55.权利要求50-54中额任一项的免疫调节蛋白，其中所述变体CD155多肽能够特异性地结合至TIGIT或CD226，并且所述IgSF结构域能够与同源结合配偶体结合，所述同源结合配偶体并非由所述变体CD155多肽特异性地结合的同源结合配偶体。
56.权利要求50-55中的任一项的免疫调节蛋白，其中所述IgSF结构域来自B7家族的成员。
57.权利要求50-55中的任一项的免疫调节蛋白，其中所述IgSF结构域是与肿瘤上表达的配体结合的肿瘤定位部分，或者是与与炎性环境相关的细胞或组织上表达的配体结合的炎性定位部分。
58.权利要求57的免疫调节蛋白，其中所述配体是B7H6。
59.权利要求57或权利要求58的免疫调节蛋白，其中所述IgSF结构域来自NKp30。
60.权利要求50-55中的任一项的免疫调节蛋白，其中所述第二多肽的IgSF结构域是与抑制型受体结合的配体的IgSF结构域，或者是其亲和力修饰的IgSF结构域。
61.权利要求60的免疫调节蛋白，其中所述第二多肽的IgSF结构域是亲和力修饰的IgSF结构域，并且与所述未修饰的IgSF结构域与相同的抑制型受体的结合相比，所述亲和力修饰的IgSF结构域显示出对于所述抑制型受体的增加的结合亲和力和/或结合选择性。
62.权利要求60或权利要求61的免疫调节蛋白，其中：
所述抑制型受体是TIGIT、CD112R、CTLA-4或PD-1；或
所述抑制型受体的配体是CD112、CD80、PD-L1或PD-L2。
63.权利要求50-55和60-61中的任一项的免疫调节蛋白，其中所述第二多肽选自：
(i)变体CD80多肽，其包含SEQ ID NO：896-928、930-968、970-1002、1004-1042、1044-1116中任一个所示的IgSF结构域；
(ii)变体PD-L1多肽，其包含SEQ ID NO：470-664、1753-1755、1757-2031中任一个所示的IgSF结构域；
(iii)变体PD-L2多肽，其包含SEQ ID NO：667-717、719-725、727-794、796-870、872-895中任一个所示的IgSF结构域；
(iv)变体CD112多肽，其包含SEQ ID NO：1273-1366、1368-1609中任一个所示的IgSF结构域；
(v)氨基酸序列，其显示出与(i)-(iv)中任一个SEQ ID NO至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、95％、97％、98％、99％或更多序列一致性并且包含所述氨基酸修饰，任选地是其氨基酸取代、插入和/或缺失；或
(vi)(i)-(v)中任一个的特异性结合片段。
64.权利要求50-63中的任一项的免疫调节蛋白，其还含有第三多肽，所述第三多肽包含IgSF家族成员的IgSF结构域或其亲和力修饰的IgSF结构域，所述亲和力修饰的IgSF结构域与所述IgSF家族成员的未修饰的或野生型IgSF结构域相比含有一个或多个氨基酸修饰。
65.权利要求64的免疫调节蛋白，其中：
所述第三多肽与所述第一和/或第二多肽相同；或
所述第三多肽与所述第一和/或第二多肽不同。
66.权利要求64和权利要求65的免疫调节蛋白，其中所述第三多肽选自：
(i)变体CD80多肽，其包含SEQ ID NO：896-928、930-968、970-1002、1004-1042、1044-1116中任一个所示的IgSF结构域；
(ii)变体PD-L1多肽，其包含SEQ ID NO：470-664、1753-1755、1757-2031中任一个所示的IgSF结构域；
(iii)变体PD-L2多肽，其包含SEQ ID NO：667-717、719-725、727-794、796-870、872-895中任一个所示的IgSF结构域；
(iv)变体CD112多肽，其包含SEQ ID NO：1273-1366、1368-1609中任一个所示的IgSF结构域；
(v)氨基酸序列，其显示出与(i)-(iv)中任一个SEQ ID NO至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、95％、97％、98％、99％或更多序列一致性并且包含所述氨基酸修饰，任选地是其氨基酸取代、插入和/或缺失；或
(vi)(i)-(v)中任一个的特异性结合片段。
67.权利要求50-66中的任一项的免疫调节蛋白，其中所述IgSF结构域或其亲和力修饰的IgSF，任选地所述第二或第三多肽的IgSF结构域或其亲和力修饰的IgSF，是或包含IgV结构域。
68.权利要求50-67中的任一项的免疫调节蛋白，其中所述变体CD155多肽是或包含IgV结构域。
69.权利要求64-68中的任一项的免疫调节蛋白，其还包含至少一个另外的多肽，所述另外的多肽包含IgSF家族成员的IgSF结构域或其亲和力修饰的IgSF结构域，所述亲和力修饰的IgSF结构域与所述IgSF家族成员的未修饰的或野生型IgSF结构域相比含有一个或多个氨基酸修饰。
70.权利要求50-69中的任一项的免疫调节蛋白，其中所述免疫调节蛋白还包含多聚化结构域，其与所述变体CD155多肽或所述第二多肽中的至少一个连接。
71.权利要求64-69中的任一项的免疫调节蛋白，其中所述免疫调节蛋白还包含多聚化结构域，其与所述变体CD155多肽、所述第二多肽和/或所述第三多肽中的至少一个连接。
72.权利要求70或权利要求71的免疫调节蛋白，其中所述多聚化结构域是具有降低的效应子功能的Fc结构域或其变体。
73.权利要求70-72中的任一项的免疫调节蛋白，其中所述多聚化结构域促使异二聚体形成。
74.一种免疫调节蛋白，其包含权利要求36-42中的任一项的第一变体CD155多肽(其中所述多聚化结构域是第一多聚化结构域)和权利要求36-42中的任一项的第二变体CD155多肽(其中所述多聚化结构域是第二多聚化结构域)，其中所述第一和第二多聚化结构域相互作用以形成包含所述第一和第二变体CD155多肽的多聚体。
75.一种免疫调节蛋白，其包含权利要求70-73中的任一项的免疫调节蛋白，其中所述多聚化结构域是第一多聚化结构域并且与第二多聚化结构域相互作用以形成包含所述免疫调节蛋白的多聚体。
76.权利要求75的免疫调节蛋白，其中所述免疫调节蛋白是第一免疫调节蛋白，并且第二免疫调节蛋白直接或经由接头间接与所述第二多聚化结构域连接，其中所述多聚体包含所述第一和第二免疫调节蛋白。
77.权利要求76的免疫调节蛋白，其中所述第二免疫调节蛋白是权利要求70-73中的任一项的免疫调节蛋白，其中所述多聚化结构域是所述第二多聚化结构域。
78.权利要求74-77中的任一项的免疫调节蛋白，其中所述多聚体是二聚体。
79.权利要求74-78中的任一项的免疫调节蛋白，其是同源二聚体。
80.权利要求74-78中的任一项的免疫调节蛋白，其是异二聚体。
81.权利要求74-80中的任一项的免疫调节蛋白，其中所述第一和/或第二多聚化结构域是具有降低的效应子功能的Fc结构域或其变体。
82.权利要求74-81中的任一项的免疫调节蛋白，其中所述第一和第二多聚化结构域相同或不同。
83.一种缀合物，其包含与一个部分连接的权利要求1-49中的任一项的变体CD155或权利要求50-73中的任一项的免疫调节蛋白。
84.权利要求83的缀合物，其中所述部分是与细胞表面上的分子特异性结合的靶向部分。
85.权利要求84的缀合物，其中所述靶向部分与免疫细胞表面上的分子特异性结合。
86.权利要求85的缀合物，其中所述免疫细胞是抗原呈递细胞或淋巴细胞。
87.权利要求86的缀合物，其中所述靶向部分是与肿瘤表面上的分子结合的肿瘤定位部分。
88.权利要求83-87中的任一项的缀合物，其中所述部分是蛋白质、肽、核酸、小分子或纳米颗粒。
89.权利要求83-88中的任一项的缀合物，其中所述部分是抗体或抗原结合片段。
90.权利要求83-89中的任一项的缀合物，其中所述缀合物是二价的、四价的、六价的或八价的。
91.编码权利要求1-49中的任一项的变体CD155多肽或权利要求50-73中的任一项的免疫调节蛋白的一种或多种核酸分子。
92.权利要求91的核酸分子，其是合成的核酸。
93.权利要求91或权利要求92的核酸分子，其是cDNA。
94.一种载体，其包含权利要求91-93中的任一项的核酸分子。
95.权利要求94的载体，其是表达载体。
96.权利要求94或权利要求95的载体，其中所述载体是哺乳动物表达载体或病毒载体。
97.一种细胞，其包含权利要求94-96中的任一项的载体。
98.权利要求97的细胞，其是哺乳动物细胞。
99.权利要求97或权利要求98的细胞，其是人细胞。
100.一种产生变体CD155多肽或免疫调节蛋白的方法，其包括在细胞中表达蛋白质的条件下将权利要求91-93中的任一项的核酸分子或权利要求94-96中的任一项的载体引入所述宿主细胞中。
101.权利要求100的方法，还包括从所述细胞中分离或纯化所述变体CD155多肽或免疫调节蛋白。
102.一种将表达变体CD155多肽的细胞工程化的方法，包括在细胞中表达以下多肽的条件下将编码权利要求1-49中的任一项的变体CD155多肽或权利要求50-82中的任一项的免疫调节蛋白的核酸分子引入所述细胞中。
103.一种工程化细胞，其表达权利要求1-49中的任一项的变体CD155多肽、权利要求50-82中的任一项的免疫调节蛋白、权利要求79-81中的任一项的核酸分子或权利要求94-96中的任一项的载体。
104.权利要求103的工程化细胞，其中所述变体CD155多肽或免疫调节蛋白由包含编码信号肽的核苷酸序列的核酸编码。
105.权利要求103或权利要求104的工程化细胞，其中所述变体CD155多肽或免疫调节蛋白不包含跨膜结构域和/或不在所述细胞的表面上表达。
106.权利要求103-105中的任一项的工程化细胞，其中所述变体CD155多肽或免疫调节蛋白由所述工程化细胞分泌或能够由所述工程化细胞分泌。
107.权利要求103或权利要求104的工程化细胞，其中所述工程化细胞包含变体CD155多肽，所述变体CD155多肽包含跨膜结构域和/或是权利要求43-49中的任一项的跨膜免疫调节蛋白。
108.权利要求103、104和107中的任一项的工程化细胞，其中所述变体CD155多肽在所述细胞的表面上表达。
109.权利要求103-108中的任一项的工程化细胞，其中所述细胞是免疫细胞。
110.权利要求109的工程化细胞，其中所述免疫细胞是抗原呈递细胞(APC)或淋巴细胞。
111.权利要求103-110中的任一项的工程化细胞，其是原代细胞。
112.权利要求103-111中的任一项的工程化细胞，其中所述细胞是哺乳动物细胞。
113.权利要求103-112中的任一项的工程化细胞，其中所述细胞是人细胞。
114.权利要求103-113中的任一项的工程化细胞，其中所述淋巴细胞是T细胞。
115.权利要求110的工程化细胞，其中所述APC是人工APC。
116.权利要求103-115中的任一项的工程化细胞，其还包含嵌合抗原受体(CAR)或工程化T细胞受体(TCR)。
117.一种感染原，其包含编码权利要求1-49中的任一项的变体CD155多肽或权利要求50-82中的任一项的免疫调节蛋白的核酸分子。
118.权利要求117的感染原，其中所述编码的变体CD155多肽或免疫调节蛋白不包含跨膜结构域和/或不在表达它的细胞的表面上表达。
119.权利要求117或权利要求118的感染原，其中所述编码的变体CD155多肽或免疫调节蛋白由表达它的细胞分泌或能够由表达它的细胞分泌。
120.权利要求117的感染原，其中所述编码的变体CD155多肽包含跨膜结构域。
121.权利要求119或权利要求120的感染原，其中所述编码的变体CD155多肽在表达它的细胞的表面上表达。
122.权利要求117-121中的任一项的感染原，其中所述感染原是细菌或病毒。
123.权利要求122的感染原，其中所述感染原是病毒，并且所述病毒是溶瘤病毒。
124.权利要求123的感染原，其中所述溶瘤病毒是腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、单纯疱疹病毒、水疱性口炎病毒、呼肠孤病毒、新城疫病毒、细小病毒、麻疹病毒、水疱性口炎病毒(VSV)、柯萨奇病毒或牛痘病毒。
125.权利要求123的感染原，其中所述病毒特异性地靶向树突细胞(DC)和/或是噬树突细胞的。
126.权利要求125的感染原，其中所述病毒是慢病毒载体，其用经修饰的辛德比斯病毒包膜产物假型化。
127.权利要求117-126中的任一项的感染原，其还包含编码另一基因产物的核酸分子，所述另一基因产物导致靶细胞死亡或可增加或增强免疫应答。
128.权利要求127的感染原，其中所述另一基因产物选自抗癌剂、抗转移剂、抗血管生成剂、免疫调节分子、免疫检查点抑制剂、抗体、细胞因子、生长因子、抗原、细胞毒性基因产物、促凋亡基因产物、抗凋亡基因产物、细胞基质降解基因、用于组织再生或将人类体细胞重编程为多能性的基因。
129.一种药物组合物，其包含权利要求1-49中的任一项的变体CD155多肽、权利要求50-82中的任一项的免疫调节蛋白、权利要求83-90中的任一项的缀合物、权利要求103-116中的任一项的工程化细胞或权利要求117-128中的任一项的感染原。
130.权利要求129的药物组合物，其包含药学上可接受的赋形剂。
131.权利要求129或权利要求130的药物组合物，其中所述药物组合物是无菌的。
132.一种在小瓶或容器中的制品，其包含权利要求129-131中的任一项的药物组合物。
133.权利要求132的制品，其中所述小瓶或容器是密封的。
134.一种试剂盒，其包含权利要求129-131中的任一项的药物组合物和使用说明书。
135.一种试剂盒，其包含权利要求132或权利要求133的制品和使用说明书。
136.一种调节受试者的免疫应答的方法，其包括向所述受试者施用权利要求129-131中的任一项的药物组合物。
137.一种调节受试者的免疫应答的方法，其包括施用权利要求103-116中的任一项的工程化细胞。
138.权利要求137的方法，其中所述工程化细胞对于所述受试者是自体同源的。
139.权利要求137的方法，其中所述工程化细胞对于所述受试者是同种异体的。
140.权利要求136-139中的任一项的方法，其中调节所述免疫应答治疗所述受试者中的疾病或病况。
141.权利要求136-140中的任一项的方法，其中所述免疫应答被增加。
142.权利要求136、140和141中的任一项的方法，其中可溶的任选缺少CD155跨膜和细胞内信号传导结构域的变体CD155多肽或免疫调节蛋白被施用至所述受试者。
143.权利要求142的方法，其中所述可溶的免疫调节蛋白是免疫调节Fc融合蛋白。
144.权利要求136和140-143中的任一项的方法，其中权利要求1-42和47-49中的任一项的变体CD155多肽或权利要求50-82中的任一项的免疫调节蛋白被施用至所述受试者。
145.权利要求136-141中的任一项的方法，其中包含可分泌性变体CD155多肽的工程化细胞被施用至所述受试者。
146.权利要求136-141和145中的任一项的方法，其中权利要求103-106和109-116中的任一项的工程化细胞被施用至所述受试者。
147.权利要求136、140和141中的任一项的方法，其中任选地是在感染原感染肿瘤细胞或免疫细胞并且可分泌性免疫调节蛋白从所述被感染的细胞中分泌的条件下，编码为可分泌性免疫调节蛋白的变体CD155多肽的感染原被施用至所述受试者。
148.权利要求140-147中的任一项的方法，其中所述疾病或病况是肿瘤或癌症。
149.权利要求140-148中的任一项的方法，其中所述疾病或病况选自黑色素瘤、肺癌、膀胱癌、血液恶性肿瘤、肝癌、脑癌、肾癌、乳腺癌、胰腺癌、结直肠癌、脾癌、前列腺癌、睾丸癌、卵巢癌、子宫癌、胃癌、肌肉骨骼癌、头颈癌、胃肠癌、生殖细胞癌或内分泌和神经内分泌癌。
150.权利要求136-140中的任一项的方法，其中所述免疫应答降低。
151.权利要求136、140和150中的任一项的方法，其中与定位到炎性环境的细胞或组织的部分连接的包含变体CD155多肽的免疫调节蛋白或缀合物被施用至所述受试者。
152.权利要求151的方法，其中所述部分包含抗体或其抗原结合片段或包含第二多肽，所述第二多肽包含野生型IgSF结构域或其变体。
153.权利要求136、140和150-152中的任一项的方法，其中权利要求57-59中的任一项的免疫调节蛋白或权利要求83-90中的任一项的缀合物被施用至所述受试者。
154.权利要求136-140和150中的任一项的方法，其中为跨膜免疫调节蛋白的变体CD155多肽被施用至所述受试者。
155.权利要求136-140、150和154中的任一项的方法，其中包含权利要求43-49中的任一项的为跨膜免疫调节蛋白的变体CD155多肽的工程化细胞被施用至所述受试者。
156.权利要求136、140和150中的任一项的方法，其中任选地是在感染原感染所述受试者中的细胞并且所述跨膜免疫调节蛋白在所述被感染的细胞的表面上表达的条件下，编码为跨膜免疫调节蛋白的变体CD155多肽的感染原被施用至所述受试者。
157.权利要求136、140和150-156中的任一项的方法，其中所述疾病或病况是炎性或自身免疫性疾病或病况。
158.权利要求136-140和150-157中的任一项的方法，其中所述疾病或病况是抗中性粒细胞胞浆抗体(ANCA)相关的血管炎、血管炎、自身免疫性皮肤病、移植、风湿性疾病、炎性胃肠疾病、炎性眼病、炎性神经疾病、炎性肺病、炎性内分泌疾病或自身免疫性血液病。
159.权利要求136-140和150-158中的任一项的方法，其中所述疾病或病况选自炎症性肠病、移植、克罗恩病、溃疡性结肠炎、多发性硬化、哮喘、类风湿性关节炎或银屑病。
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