CN105483093A - Ⅱ型单纯疱疹病毒突变体在治疗癌症中的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用作治疗癌症的药物的经修饰的II型单纯疱疹病毒(HSV-2)的组合物和用途。经修饰的HSV-2具有膜融合活性，包含编码具有核糖核苷酸还原酶活性但缺乏蛋白激酶活性的多肽的经修饰的/突变的ICP10多聚核苷酸。

Description

Ⅱ型单纯疱疹病毒突变体在治疗癌症中的用途
相关申请的参考文献
本申请要求于2005年6月23日提交的临时申请第60/693,157号的优先权，在此通过参考的方式将其整体并入。
对于在联邦资助的研究或开发下所做出发明的权利的声明
本发明的研发至少部分地使用了由美国政府依照NIH基金号RO1CA106671-01提供的资金。美国政府可以拥有本发明的某些权利。
发明领域
本发明涉及包括癌症治疗学在内的病毒学、癌症生物学、细胞生物学、分子生物学和医学领域。具体地，本发明提供包含ICP10基因修饰的II型单纯疱疹病毒(HSV-2)突变体以及该HSV-2突变体在治疗恶性疾病中的用途。
发明背景
作为治疗实体瘤的抗肿瘤试剂，复制选择性的溶瘤病毒已显示出巨大的潜力。这些病毒能够偏爱地在肿瘤细胞中进行复制，而在正常细胞中其复制能力却受到限制。这种溶瘤病毒主要的抗肿瘤机理是通过当其繁殖和从最初感染的肿瘤细胞向周围肿瘤细胞扩散时的直接细胞病变效应，以达到更大限度的分布和抗癌效力。已出于溶瘤目的对单纯疱疹病毒(HSV)进行了修饰，最普遍的是通过删除在正常(非分裂的)细胞而非肿瘤细胞中复制所必须的病毒基因。这种修饰包括删除病毒γ34.5基因或ICP6基因。病毒γ34.5基因在HSV感染过程中作为神经毒性因子发挥功能(Chou,etal,(1990)Science250:1262-1266)。删除这个基因阻断非分裂细胞中的病毒复制(Mckie,etal.,(1996)BrJCancer74(5):745-52)。病毒ICP6基因编码核糖核苷酸还原酶的大亚基，该酶为病毒DNA有效的复制产生充足的dNTP池，并且在肿瘤细胞中大量表达，但不在非分裂细胞中大量表达。于是，在此基因发生突变的病毒能够偏爱地在肿瘤细胞中复制并杀死肿瘤细胞。已经在动物研究中进行广泛测试的溶瘤性HSVG207目前已经进入临床试验阶段，该病毒在γ34.5基因座的两个拷贝中都有缺失且通过大肠杆菌(E.coli)lacZ基因造成了ICP6基因中的插入突变(Walker,etal.,(1999)HumanGeneTher.10(13):2237-2243)。或者，通过使用肿瘤特异性启动子来驱动γ34.5或其它HSV复制所必需的基因能够构建溶瘤性的I型HSV(Chung,etal.,(1999)JVirol73(9):7556-64)。
最初，溶瘤性的单纯疱疹病毒(HSV)是为治疗脑瘤而设计并构建的(Andreansky,etal.,(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.92(21):11313-11318)。后来发现该病毒在多种其它人类实体瘤中也是有效的，包括乳腺癌(Toda,etal.,(1998)HumanGeneTher.9(15):2177-2185)，前列腺癌(Walker,etal.,(1999)HumanGeneTher.10(13):2237-2243)，肺癌(Toyoizumi,etal.,(1999)HumanGeneTher.10(18):3013-3029)，卵巢癌(Coukos,etal.,(1999)Clin.CancerRes.5(6):1523-1527)，结肠癌和肝癌(Pawlik,etal.,(2000)CancerRes.61(11):2790-2795)。溶瘤性HSVs的安全性也已在小鼠(Sundaresan,etal.,(2000)J.Virol.74(8):3832-3841)，以及对HSV感染非常敏感的灵长类动物(夜猴(Aotus))中被广泛测试(Todo,etal.,(2000)CancerGeneTher.7(6):939-946)。这些研究证实溶瘤性HSVs对于体内给药是非常安全的。
溶瘤性HSVs全部由HSV-1构建而成。尚未研究HSV-2用于构建溶瘤性病毒。然而，HSV-2具有某些独特的特征增强了其作为溶瘤性试剂的潜力。例如，已报道与HSV-1不同，HSV-2编码糖蛋白G(gG)的分泌形式，该蛋白影响嗜中性粒细胞、单核细胞核和自然杀伤性细胞的功能(Bellner,etal.,(2005)JImmunol.174(4):2235-41)。这种性质可能提供衍生自HSV-2的溶瘤性病毒，而该病毒具有抵制机体固有免疫的抑制效应的能力。固有免疫是宿主对于侵入的微生物作出的快速应答，并且发现其为体内限制HSV复制的主要因素(Dalloul,etal.,(2004)JClinVirol.30(4):329-36；Wakimoto,etal.,(2003)GeneTher.10(11):983-90)。因此，甚至当病人机体发展出抗HSV的固有免疫功能时，衍生自HSV-2的溶瘤性病毒也应该复制并扩散。
尽管临床前研究令人鼓舞，但早期临床试验的结果显示当前形式的溶瘤病毒虽然安全，但其自身可能仅具有有限的抗肿瘤活性(Nemunaitis,etal.,(2001)J.ClinOncol.19(2):289-298)。来自本发明人工作的研究已经证明将细胞膜融合活性包括到溶瘤性HSV中能够显著地改善病毒的抗肿瘤能力(Fu,etal.,(2002)Mol.Ther.7(6):748-754；Fu,etal.,(2003)CancerRes.62:2301-2312)。这种膜融合的溶瘤病毒在肿瘤中产生合胞体形成，直接增强了病毒的破坏力并促进了其肿瘤内的扩散(Fu,etal.,(2003)CancerRes.62:2301-2312)。这种合胞体形成和通过膜融合的溶瘤HSV直接进行细胞溶解的独特的联合肿瘤破坏机制还促进原位肿瘤抗原呈递，导致有效的抗肿瘤免疫应答(Nakamori,etal.,(2004)Mol.Ther.9(5):658-665)。此外，通过形成合胞体的膜融合溶瘤HSV的扩散将使其保持抗肿瘤活性，甚至是在宿主中存在中和抗病毒抗体的情况下。病毒仅能在活细胞内复制，且它们的复制通常需要某些细胞信号通路的激活。很多病毒在其进化过程中已经获得了多种激活这些信号通路以有益于其复制的方法。II型单纯疱疹病毒(HSV-2)核糖核苷酸还原酶(ICP10或RR1)的大亚基包含具有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(PK)活性的独特的氨基末端结构域。已发现该PK活性激活细胞的Ras/MEK/MAPK通路(Smith,etal.,(2000)JVirol.74(22):10417-29)。
Luo和Aurelian描述了多种包含HSV-2中ICP10基因不同删除的载体以证明特定基序和某些活性之间的关系(LuoandAurelian,(1992)JBiolChem267(14):9645-53)。HSV-2ICP10基因的修饰和删除构建体已经被用于证明核糖核苷酸还原酶结构域的特殊性质(Peng,etal.,(1996)Virology216(1):184-96)。
从核糖核苷酸还原酶基因中删除PK结构域(ICP10PK)严重地损害病毒在没有预先激活的Ras信号通路的细胞中复制的能力(Smith,etal.,(1998)JVirol.72(11):9131-9141)。
美国专利第6013265号涉及提供针对HSV-2的保护的疫苗，其中ICP10的蛋白激酶结构域被删除，导致了对HSV-2感染和转化细胞能力的有害影响。
本发明通过提供利用经修饰的HSV-2治疗癌症的新治疗方法而满足了本领域的需要。
发明的简明概要
本发明通过提供有效的经修饰的具有溶瘤特性的II型单纯疱疹病毒(HSV-2)满足了本领域的长期需求。在本发明的具体实施方案中，病毒含有经修饰的、编码具有核糖核苷酸还原酶活性但缺乏蛋白激酶活性的ICP10多肽的ICP10多聚核苷酸。在特定方面，该病毒用于治疗恶性细胞。在具体实施方案中，病毒选择性地在肿瘤细胞中复制。在其它具体实施方案中，病毒产生细胞膜融合，使培养物、组织或生物体摆脱至少一些不期望的细胞。在其它具体实施方案中，病毒至少抑制一些不期望细胞的增殖，和/或在至少一些期望的细胞中诱导凋亡，和/或诱导强烈的抗肿瘤免疫应答，和/或其组合。
天然HSV-2病毒含有ICP10多聚核苷酸(也可称为RR1多聚核苷酸)，该多聚核苷酸编码具有氨基末端结构域和C末端结构域的多肽，该氨基末端结构域具有蛋白激酶(PK)活性，如丝氨酸/苏氨酸激酶活性，该C末端结构域具有核糖核苷酸还原酶活性。在本发明的特定方面，内源性PK结构域经修饰，使病毒具有在肿瘤细胞中选择性复制的活性(因此包含破坏肿瘤细胞的活性)，和/或赋予病毒膜融合活性或增强病毒的融合活性，由于其包含膜融合(合胞体形成)活性。在一些实施方案中，ICP10多聚核苷酸通过至少删除编码蛋白激酶结构域的部分内源性序列而被修饰，以使被编码的多肽缺乏蛋白激酶活性。
在本发明的另一个实施方案中，第二多聚核苷酸取代至少部分编码至少部分蛋白激酶结构域的内源性ICP10多聚核苷酸。在本发明其它实施方案中，未被取代的ICP10序列包含整个RR结构域。对至少部分内源性ICP10多聚核苷酸的取代可通过任意适当的方法进行，如通过同源重组或其它适当的基因工程方法，包括使用PCR和本领域技术人员熟知的其它方法。
在本发明的其它方面中，取代ICP10的至少部分内源性PK结构域的多核苷酸可以是任何适当的序列。例如，取代PK结构域的多聚核苷酸可以编码报告基因产物或治疗性基因产物。经修饰的包含第二多聚核苷酸(至少取代PK结构域中的一部分)的ICP10多聚核苷酸将编码由取代多聚核苷酸和ICP10基因中剩余的未取代部分组成的融合蛋白。适合本发明使用的报告基因的非限制性实例包括绿色荧光蛋白(SEQIDNO:16；GeneBank登录号U55761)，β-半乳糖苷酶，荧光素酶和单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)。治疗性多聚核苷酸的非限制性实例可以包括单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)，胞嘧啶脱氨酶，半胱天冬酶(caspase)3和野生型p53。
在本发明的其它实施方案中，取代至少部分ICP10内源性PK结构域的多聚核苷酸可以是免疫调节基因，或编码融合性膜糖蛋白(FMG)的多聚核苷酸。适合本发明使用的免疫调节基因的非限制性实例包括IL2、IL12或GM-CSF和其它细胞因子；F42K和其它细胞因子类似物；或MIP-1、MIP-1β、MCP-1、RANTES和其它趋化因子。适合本发明使用的编码融合性膜糖蛋白的多聚核苷酸的非限制性实例包括副粘病毒F蛋白、HIVgp160蛋白、SIVgp160蛋白、逆转录病毒Env蛋白、埃博拉病毒Gp或流感病毒血凝素，来自长臂猿白血病病毒(GALV)的膜糖蛋白或长臂猿白血病病毒包膜糖蛋白(GALV.fus)的C末端截短形式。
在本发明的其它实施方案中，经修饰的ICP10多聚核苷酸与组成型启动子可操作地连接。适合本发明使用的组成型启动子的非限制性实例包括即早期巨细胞病毒(CMV)启动子、SV40早期启动子、RSVLTR、β鸡肌动蛋白启动子和HSV0-TK启动子。在本发明的其它实施方案中，取代至少部分内源性PK结构域(或TM结构域)的多聚核苷酸包含与其可操作地连接的调节序列。在具体实施方案中该调节序列在真核细胞中可操作，在其它方面中在癌细胞中是可操作的。用于实施本文所述的方法和组合物的非限制性示例性启动子可以包括肿瘤特异性启动子和/或组织特异性启动子，如前列腺特异性抗原(PSA)启动子、激肽释放酶2启动子、probasin启动子(用于前列腺癌)、L-plastin启动子(用于乳腺癌、卵巢癌和结肠癌)、甲状腺球蛋白核心启动子(用于甲状腺癌)、Midkine和环氧化酶-2启动子(用于胰腺癌)，以及用于大多数癌症的人的端粒酶启动子(hTERT)。
在其它实施方案中，提供在第一细胞和第二细胞之间产生融合的方法，其包含通过向第一细胞引入本发明的组合物使第二细胞膜与第一细胞膜融合的步骤。在具体实施方案中，所述第一细胞，第二细胞或第一和第二细胞都是恶性细胞，如实体瘤中的细胞。适合用来实施本文所描述的方法和组合物的恶性细胞的非限制性实例可以包括乳腺癌细胞、肺癌细胞、皮肤癌细胞、前列腺癌细胞、胰腺癌细胞、结肠癌细胞、脑癌细胞、肝癌细胞、甲状腺癌细胞、卵巢癌细胞、肾癌细胞、脾癌细胞、白血病细胞和骨癌细胞。
在具体实施方案中，所述引入步骤被进一步定义为向人递送病毒，例如通过向人全身性地递送病毒。非限制性的给药途径可以包括将本文所描述的组合物通过静脉内、肿瘤内、腹膜内或任何其组合给予。在具体实施方案中，该组合物被引入大量的细胞。
在其它实施方案中，提供破坏恶性细胞的方法，如存在于人体内的恶性细胞，其包含将本发明的组合物引入细胞的步骤，其中在所述引入之后，恶性细胞的胞膜与另一细胞膜融合。
在本发明的其它实施方案中，有包含本发明组合物的哺乳动物细胞。该哺乳动物细胞可以是正常的淋巴细胞、巨噬细胞、自然杀伤性细胞，或是任何可以作为载体将本发明组合物送至肿瘤细胞的细胞类型。
在本发明的其它实施方案中，本文所述的经修饰的HSV-2病毒或病毒载体诱导感染该病毒的癌细胞发生凋亡。在本发明的其它实施方案中，未感染病毒的旁观细胞被诱导凋亡，而非感染了本文所述的经修饰的HSV-2病毒的周围细胞。
在本发明的其它实施方案中，本文所述的病毒或病毒载体包含部分用于测定病毒溶解细胞和或形成合胞体的效力的体系。该体系包含与本文所述的病毒或病毒载体接触的细胞。在一些实施方案中，所述细胞可以是真核细胞，如原发的癌细胞，或来自癌细胞系的细胞。在其它实施方案中，所述细胞可以是作为本文所述的病毒或病毒载体的宿主的原核细胞。在本发明的其它实施方案中，还含有病毒或病毒载体的所述细胞可以在体外培养。在本发明的其它实施方案中，还含有病毒或病毒载体的细胞被置于动物中，如小鼠。在本发明的其它实施方案中，所述癌细胞能够在接触病毒或载体之前被移植到动物中。
前述内容相当广泛地概述了本发明的特征和技术优势以便更好地理解以下对于本发明的具体描述。本领域技术人员会理解所公开的概念和具体实施方案可以容易地被用作为了实现本发明同样目的而修饰和设计其它结构的基础。本领域技术人员也会理解这些等价结构不脱离如所附权利要求中阐述的本发明的精神和范围。当连同所附实施例和附图考虑时，那些关于其组织和操作方法的被认为是本发明特点的新特征以及进一步的目的和优势将通过以下描述更好地被理解。然而，应当清楚地理解，仅出于说明和描述的目的提供每一实施例和附图，而不旨在作为对本发明限制的阐述。
附图简述
图1A-1C显示FusOn-H2的构建方案。图1A.HSV-2基因组的图示。基因组由灰色条代表，末端重复(TR)和内部重复(IR)由灰色方框表示。也显示了ICP10基因的位置。图1B.放大的ICP10基因视图，显示了PK和RR1结构域及天然启动子的位置。图1C.随后被插入病毒基因组以构建FusOn-H2的经修饰的ICP10基因。如图，PK结构域被EGFP基因取代(与RR基因符合读框)，基因的原始启动子被最强的哺乳动物基因启动子之一的巨细胞病毒即早期启动子取代。标出了在未修饰和已修饰的ICP10位点中的BamHI限制性酶切位点。被标记为PKL、PK、GFP和PKR的方框表示用于图2Southern杂交的4个探针将会杂交的位置。
图2显示对FusOn-H2的Southern印迹分析。Southern印迹杂交显示了来自亲本野生型HSV-2(w)或FusOn-H2(m)的BamHI酶切的病毒体DNA。用于Southern杂交的四个探针是：从左翼制备的PKL；从PK结构域制备的PK；从右翼区域制备的PKR；从EGFP基因制备的GFP。
图3显示使用抗GFPmAb对FusOn-H2进行的western印迹分析。细胞裂解液由感染了FusOn-H2(m)或其亲本野生型HSV-2(w)的Vero细胞，或转染了pSZ-EGFP质粒DNA(p)的Vero细胞制备。
图4显示培养细胞中FusOn-H2的表形特征。细胞以0.01pfu/细胞感染所标明的病毒或未被感染。显微照片为感染后24小时拍摄的。合胞体为白色箭头所示。在被检测的细胞中，MDA-MB-435是人乳腺癌细胞系，MPans-96是人胰腺癌细胞系，以及SKOV3是人卵巢癌细胞系。原始放大倍率：200倍。
图5A-C显示FusOn-H2的选择性复制。图5A.Vero细胞被保持处于完全周期状态(10％FBS)，或在以1pfu/细胞被病毒感染前血清饥饿24小时。在所标明的时间点收集细胞，病毒产量通过对单层Vero细胞进行空斑分析进行定量。图5B.Vero细胞在仅含低比例血清(2％)的培养基中孵育或在病毒感染期间存在50μMPD98059下孵育。在感染后24小时和48小时收集细胞。病毒复制的下降倍数通过用不含PD98059的孔中的总病毒产量除以含有药物的孔中的总病毒产量计算而得。图5C.用标明的病毒以1pfu/细胞感染体外培养的原代肝细胞。感染后在标明的时间收集病毒并通过对单层Vero细胞的空斑分析进行定量。*p<0.01，FusOn-H2与wt186比较(学生t检验)。
图6A和B.溶瘤的HSV体外杀伤人癌细胞的能力。细胞以0.01pfu/细胞(A)或以0.1pfu/细胞(B)感染病毒。在标明的时间点用LDH分析法测定细胞的生存能力。细胞杀伤的比例通过用感染病毒的细胞释放的LDH除以未感染病毒的细胞释放的LDH计算而得。p<0.01，FusOn-H2与wt186或Baco-1比较；Ψp<0.01，FusOn-H2与wt186比较(学生t检验)。
图7A和B.FusOn-H2针对异种移植的人乳腺癌细胞的体内抗肿瘤活性。图7A.肿瘤内递送的治疗效果。通过将MDA-MB-435细胞注射到第二乳腺的脂肪部分建立人乳腺肿瘤异种移植物。当肿瘤直径达5mm时，以1x106pfu的剂量肿瘤内注射病毒。处理组包括FusOn-H2、Baco-1或PBS。用病毒注射后在标明周数测得的肿瘤体积除以处理前的肿瘤体积确定肿瘤的生长率(n＝每组8只小鼠)。图7B.针对大乳腺肿瘤异种移植物的治疗效果。用于肿瘤内注射组和静脉注射组(n＝5)的肿瘤直径分别为10mm和10-15mm。对于肿瘤内注射和静脉注射，病毒的剂量分别为3x106pfu和1.5x107pfu。肿瘤的生长率的计算方法同图6A。Ψp<0.05，FusOn-H2与Baco-1比较；*p<0.01，FusOn-H2与Synco-2D比较(学生t检验)。
图8.FusOn-H2针对建立在裸鼠腹膜腔内的转移的人卵巢癌异种移植物的治疗效果。将2x106SKOV3细胞腹膜内接种至腹膜腔建立人卵巢癌异种移植物(n＝每个处理组8只小鼠)。肿瘤细胞接种后8天和15天时，小鼠在远离肿瘤植入处的位点接受3x106pfu剂量的溶瘤HSVs的腹膜内注射。初始肿瘤注射后4周(即肿瘤植入后5周)，小鼠被处安乐死。肿瘤结节的总外观在该图中显示，肿瘤结节的数量和每只动物中肿瘤的重量在表1中显示。
发明的详细描述
如实施例1中描述的HSV-2病毒组合物于2006年6月8日保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)，10801UniversityBlvd.Manassas，VA20110-2209USA。ATCC是依布达佩斯条约建立的国际保藏机构(IDA)。保藏证明编号是。
I.定义
本文用到的术语“单纯疱疹病毒”或“HSV”指感染包括人类在内的哺乳动物的带有包膜的二十面双链DNA病毒。野生型HSV在终末分化的非分裂细胞和分裂细胞中均发生感染和复制。“HSV-2”指包含ICP10基因的HSV家族的成员。本文用到的术语“FusOn-H2”指HSV-2突变体，该突变体具有经修饰的、编码本文所述的具有核糖核苷酸还原酶活性但缺乏蛋白激酶活性的多肽的ICP10多聚核苷酸。
本文用到的术语“细胞膜融合”指至少两个细胞的外膜融合，例如两个相邻细胞。
本文用到的术语“增强的融合活性”指细胞膜融合的增强、增多、强化、增加、放大或它们的组合。
本文用到的术语“溶瘤性”指试剂能够直接或间接地导致恶性细胞破坏的性质。在具体实施方案中，此性质包含造成恶性细胞膜与另一细胞膜融合。
本文用到的术语“选择性复制”或“条件性复制”指溶瘤病毒选择性地在某些组织(如肿瘤)中生长的能力。
本文用到的术语“合胞体”指包含显著大量融合细胞的多核巨细胞的形成。
本文用到的术语“载体”指运载核酸分子，该运载核酸分子中能够插入核酸序列用于引入核酸序列能够在其中被复制的细胞。当插入的核酸序列对于引入载体的细胞为外来的或当插入的核酸序列与细胞内的序列同源但处在宿主细胞核酸中通常不会发现该序列的位置时，插入的核酸序列被称为“外源的”。载体可以是非病毒DNA载体也可以是病毒载体。病毒载体被包裹到病毒蛋白中并能感染细胞。载体的非限制性实例包括：病毒载体、非病毒载体、裸DNA表达载体、质粒、粘粒、人工染色体(如YACs)、噬菌体载体、与阳离子凝聚剂相连的DNA表达载体、包裹在脂质体中的DNA表达载体、某种真核细胞如生产细胞。除非另外说明，否则此处用到的“载体”指DNA载体和病毒载体。本领域技术人员能够通过标准重组技术构建载体。通常，这些技术包括Sambrooketal.,MolecularCloning:ALabManual,2ndEd.(分子克隆：实验室手册，第二版),ColdSpringHarborLaboratoryPress(1989)和其中引用的参考文献。病毒学的考虑因素也被综述在CoenD.M.,MolecularGeneticsof AnimalVirusesinVirology,2ndEdition(病毒学中动物病毒的分子遗传学，第二版),B.N.Fields(编辑)，RavenPress,N.Y.(1990)和其中引用的参考文献。
术语“表达载体”指任何类型的包含能够被转录的编码RNA的核酸的基因构建体。在一些情况中，RNA分子随后被翻译成蛋白、多肽或肽。在其它情况中，这些序列不被翻译，如在反义分子或核酶的产生中。表达载体可以包含多种“控制序列”，其指可操作地连接的编码序列在特定宿主细胞中的转录和可能的翻译所必需的核酸序列。除了掌控转录和翻译的控制序列外，载体和表达载体可能包含还发挥其它功能的核酸序列并将在下文描述。
“启动子”是属于控制转录开始和速率的核酸序列一部分的控制序列。其可以包含调节蛋白和分子可以与之结合的遗传元件，所述调节蛋白和分子例如RNA聚合酶和其它转录因子以启动或调节核酸序列时间和空间转录。短语“可操作地置于”、“可操作地连接”、“处于控制中”和“处于转录控制中”意味着启动子处于相对核酸序列正确的功能位置和/或方向以控制转录开始和/或该段序列的表达。示例性的非限制性的启动子包括：组成型启动子、组织特异性启动子、肿瘤特异性启动子或在外源可诱导元件控制下的内源启动子。
本文用到的术语“组成型启动子”指驱动基因或多聚核苷酸在整个细胞周期中以连续时间方式表达的启动子。组成型启动子可以是细胞或组织类型特异性的只要其在整个细胞周期中以连续方式驱动与其相连的基因或多聚核苷酸的表达。示例性的非限制性的组成型启动子包括：巨细胞病毒(CMV)即早期启动子、SV40早期启动子、RSV-LTR、β鸡肌动蛋白启动子和HSVTK启动子。
术语“增强子”指涉及核酸序列转录激活控制的顺式作用调节序列。
当应用于细胞时，术语“接触”和“暴露”在本文中被用于描述病毒、病毒载体、非病毒载体、DNA载体或任何其它治疗剂，单独或组合地，被递送到靶细胞或靶细胞附近的过程。
短语“经修饰的ICP10多聚核苷酸”指编码具有核糖核苷酸还原酶(RR)活性但缺乏蛋白激酶活性的ICP10多肽的ICP10多聚核苷酸。
短语“核糖核苷酸还原酶活性”指由ICP10多聚核苷酸编码的多肽的C末端结构域产生足够的病毒复制所需的脱氧核苷三磷酸(dNTP)的能力。
短语“蛋白激酶活性”指由ICP10多聚核苷酸编码的多肽的氨基末端结构域磷酸化能够激活Ras/MEK/MAPK通路的丝氨酸和苏氨酸残基的能力。
本文使用的术语“旁观肿瘤细胞”指没有感染本文所述的经修饰的HSV-2病毒但邻近或靠近感染了本文所述的病毒或载体的肿瘤细胞的肿瘤细胞。
本文使用的术语“抗癌剂”指能够在个体中负面影响癌症的试剂，如通过杀死癌细胞、在癌细胞中诱导凋亡、降低癌细胞生长速率、降低转移的发生和数量、减小肿瘤尺寸、抑制肿瘤生长、减少对肿瘤或癌细胞的血液供应、促进抗癌细胞或肿瘤的免疫反应、防止或抑制癌症的进展或增加患癌症个体的寿命。
本文使用的短语“制药学地”或“药理学可接受的”指当适当地给予动物或人后，不产生不利的、过敏的或其它不适当反应的分子实体和组合物。短语“药理学可接受的载体”包括任何或所有的溶剂、分散介质、包衣，抗细菌和抗真菌剂、等渗的和吸收延迟试剂等等。
术语“单位剂量”指适合在个体中使用的物理的不连续单位，每个单位包含预定量的治疗组合物，经计算以产生与其给药相关的期望的反应，所述给药即适当的途径和治疗计划。
本文使用的术语“有效的”或“治疗有效的”指抑制症状恶化、防止疾病发作、防止疾病扩散、疾病的至少一种症状的改善，或它们的组合。
II.介绍
病毒仅能在活细胞内复制并且它们的复制通常需要某些细胞信号通路的激活。很多病毒在其进化过程中已经获取了多种激活这些有益于其复制的信号通路的方法。II型单纯疱疹病毒(HSV-2)核糖核苷酸还原酶(ICP10或RR1)的大亚基包含具有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(PK)活性的独特的氨基末端结构域。已发现该PK活性激活细胞的Ras/MEK/MAPK通路(Smith,etal.,(2000)JVirol.74(22):10417-29)。因此，已报道了从核糖核苷酸还原酶基因中删除PK结构域(ICP10PK)严重地损害病毒在细胞中的复制能力，如那些不含有预先激活的Ras信号通路的细胞(Smith,etal.,(1998)JVirol.72(11):9131-9141)。
这里，本发明人显示当HSV-2的PK结构域被取代和/或经修饰致使由经修饰的ICP10基因编码的蛋白具有核糖核苷酸还原酶活性但缺乏蛋白激酶活性时，病毒选择性地在肿瘤细胞中复制并破坏肿瘤细胞(至少是由于肿瘤发生使其中的Ras信号通路被组成型活化的肿瘤细胞)。此外，本文所述的ICP10多聚核苷酸的修饰赋予病毒固有的融合性，即病毒对肿瘤细胞的感染诱导广泛的细胞膜融合(合胞体形成)。该性质增加了病毒对肿瘤细胞的破坏力。并且，体内研究显示该病毒对于局部或全身给药都是极其安全的。
在本发明的一些实施方案中，PK结构域的修饰包含报告基因的插入，如表达绿色荧光基因，和/或用例如巨细胞病毒即早期启动子的组成型启动子替代天然启动子基因。
在一些实施方案中，通过将第二多聚核苷酸插入到编码ICP10基因蛋白激酶结构域的多聚核苷酸中，或通过用第二多聚核苷酸取代蛋白激酶结构域的一部分来遗传工程化HSV-2，以使经修饰的多聚核苷酸编码的多肽具有核糖核苷酸还原酶活性但缺乏蛋白激酶活性。例如，所述第二多聚核苷酸可以编码糖蛋白，如融合性膜糖蛋白。本发明范围内使用的优选的糖蛋白是长臂猿白血病病毒包膜融合性膜糖蛋白(GALV.fus)的截短形式。在本发明的某些方面，对于本发明的溶瘤病毒，GALV.fus的表达显著增强了该病毒抗肿瘤效果。
在一些实施方案中，本发明中经修饰的HSV-2包含ICP10中的例如删除的突变，以提供病毒细胞膜融合特性。这样的突变可能是在病毒筛选中随机产生的或从自然界获得的，然后通过本文所述的和/或本领域已知的方法对拥有细胞膜融合特性的可能候选者库进行功能分析。导致膜融合表型的突变可以是点突变、移码、倒位、删除、剪接错误突变、转录后加工突变、某种病毒糖蛋白过表达、它们的组合等等。可以通过测序特定的HSV-2并将其与已知野生型序列比较来鉴定突变。
本发明的经修饰的HSV-2可用于恶性细胞的治疗，如抑制它们的扩散、降低或抑制它们分裂、根除它们、抑制它们的产生或增殖或这些的组合。恶性细胞可以来自任何形式的癌症，如实体瘤，虽然其它形式也是可治疗的。本发明的经修饰的HSV-2可用于治疗肺、肝、前列腺、卵巢、乳腺、脑、胰腺、睾丸、结肠、头和颈部的癌症、黑素瘤和其它恶性肿瘤。本发明可用于治疗处于癌症疾病包括该疾病转移阶段在内的任何阶段的恶性细胞。本发明可被用作独立的治疗方法或与包括化疗、手术、放疗等在内的其它治疗手段相结合。
III.经修饰的ICP10多聚核苷酸
本发明描述了具有经修饰的ICP10多聚核苷酸的HSV-2突变体，其中该经修饰ICP10多聚核苷酸编码具有核糖核苷酸还原酶活性但缺乏蛋白激酶(PK)活性的多肽。ICP10多聚核苷酸可以通过删除至少一些编码功能性PK结构域所需的序列，或通过用第二多聚核苷酸取代至少部分编码PK结构域的序列进行修饰。本领域技术人员会认识到任何合适的方法均可被用于产生经修饰ICP10多聚核苷酸，所述方法包括诱变、聚合酶链式反应、同源重组或任何本领域技术人员已知的其它的基因工程技术。
A.诱变
在本发明的具体实施方案中，HSV-2病毒的ICP10序列被突变，如通过使用多种标准诱变方法中的任何方法进行删除。突变能够包含核苷酸序列、单个基因或一批基因的突变。突变可以包含单个核苷酸(如单点突变，其包含在DNA序列中删除、添加或替代单个核苷酸碱基)，或其可以包含大量核苷酸的插入或缺失。突变可以由于DNA复制的保真度出错而自发产生，或暴露于化学或物理的诱变剂被诱导产生。突变还可以是定点的，通过使用本领域技术人员公知的特定靶向方法。
B.遗传重组
在本发明的其它实施方案中，使用遗传重组技术删除或取代至少部分编码PK结构域的序列对ICP10多聚核苷酸进行修饰。被删除/取代的PK结构域区域可以是任何合适的区域，只要由经修饰的ICP10多聚核苷酸编码的多肽保持核糖核苷酸还原酶活性但缺乏蛋白激酶活性。然而，在某些实施方案中，对PK结构域的修饰影响八个PK催化基序(氨基酸残基106-445，虽然PK活性可能被认为是氨基酸残基1-445)中的一个或多个、和/或跨膜(TM)区、和/或不变的赖氨酸(Lys176)。在SEQIDNO:15(美国国家生物技术信息中心登记号1813262A)中提供了示例性的野生型ICP10多肽序列。在SEQIDNO:17中提供了编码ICP10多肽的示例性的野生型多聚核苷酸。
在某些实施方案中，仅通过删除编码PK活性所必需的PK结构域的部分序列来修饰ICP10多聚核苷酸。在SEQIDNO:18中提供了缺失至少一些编码PK结构域的序列的示例性ICP10多聚核苷酸。在另一个示例性实施方案中，如在SEQIDNO:19中提供的，ICP10多聚核苷酸被修饰以至于PK结构域被整体删除。由于SEQIDNO:18和SEQIDNO:19均编码具有核糖核苷酸还原酶活性但缺乏蛋白激酶活性的多肽，因此两个序列都适合用于产生本文所述的HSV-2突变体。在本发明的某些实施方案中，在SEQIDNO:18和SEQIDNO:19中公开的经修饰的ICP10多聚核苷酸可以受控于内源的HSV-2启动子，或可操作地连接到组成型启动子，如SEQIDNO:20中所述的巨细胞病毒即早期启动子。
在本发明的其它实施方案中，通过用第二多聚核苷酸如绿色荧光蛋白取代至少部分编码PK结构域的序列来修饰ICP10多聚核苷酸，该第二多聚核苷酸与编码ICP10多聚核苷酸RR结构域的序列符合读框。这种构建体可以受控于内源的HSV-2启动子，或受控于组成型启动子如CMV启动子(SEQIDNO:20)。后一种构建体(包含GFP取代多聚核苷酸和CMV启动子)在实施例1中有更具体的描述。
在本发明的另一方面，取代至少部分HSV-2中内源ICP10的蛋白激酶活性的多聚核苷酸至少能够编码细胞膜融合诱导多肽的融合性部分，如病毒融合性膜糖蛋白(FMG)。多肽优选地能够在基本上中性的pH值(如约pH6-8)诱导细胞膜融合。
在特定实施方案中，FMG至少包含C型逆转录病毒包膜蛋白的融合性结构域，C型逆转录病毒如MLV(作为实例，SEQIDNO:6)或GALV(作为实例，SEQIDNO:5)。删除一些、大部分或全部胞质结构域的逆转录病毒包膜蛋白是有用的，因为这样的处理导致对人细胞的超膜融合活性。在一些实施方案中，引入特定的修饰到病毒膜糖蛋白中以增强其诱导细胞膜融合的功能。例如，已经显示许多逆转录病毒和疱疹病毒糖蛋白的胞质结构域的切除增加其膜融合活性，有时会伴随其并入病毒体效率的同时下降(Rein,etal.,(1994)JVirol68(3):1773-81)。
细胞膜融合多肽的一些实例包括麻疹病毒融合蛋白(SEQIDNO:7)、HIVgp160(SEQIDNO:8)和SIVgp160(SEQIDNO:9)蛋白、逆转录病毒Env蛋白(SEQIDNO:10)、埃博拉病毒Gp(SEQIDNO:11)和流感病毒血凝素(SEQIDNO:12)。
在其它实施方案中，第二功能性多聚核苷酸可以被插入PK结构域，或用于取代部分或全部PK结构域。此第二功能性多聚核苷酸可以编码免疫调节或其它治疗试剂。预期这些另外的试剂将影响细胞表面受体的上调和GAP连接，细胞生长抑制剂和分化试剂，抑制细胞粘附，或增加恶性细胞对凋亡的敏感性。编码免疫调节或其它治疗试剂的多聚核苷酸的示例性的非限制性实例包括肿瘤坏死因子，干扰素α、β、γ，白介素2(IL-2)，IL-12，粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，F42K，MIP-1，MIP-1β，MCP-1，RANTES，单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)，胞嘧啶脱氨酶和半胱天冬酶3。
在本发明的其它实施方案中，通过插入编码报告蛋白的多聚核苷酸来修饰ICP10多聚核苷酸。编码报告蛋白的多聚核苷酸的示例性非限制性实例包括绿色荧光蛋白、增强的绿色荧光蛋白、β半乳糖苷酶、荧光素酶和HSV-tk。
C.核糖核苷酸还原酶活性检测
RR的生物活性可如按以下修饰的前述方法被检测(Averett,etal.,J.Biol.Chem.258:9831-9838(1983)和Smithetal.,J.Virol.72:9131-9141(1998))。起初BHK细胞在完全GMEM(含有10％FBS)中生长至融合，然后在0.5％FBSEMEM中孵育3天，然后用感染20pfu的野生型HSV、HSV-2突变体感染或模拟感染。在感染后20小时收集细胞，重悬于500μl的HD缓冲液中(100mMHEPES缓冲液(pH7.6)，2mM二硫苏糖醇(DTT))，在超声30秒前在冰上孵育15分钟。离心(16000g，20分钟，4℃)去除细胞碎片，用45％饱和(0.258g/ml)的晶体硫酸铵沉淀上清。第二次离心(16000g，30分钟)后，将沉淀溶于100μl的HD缓冲液，从中取50μl与等体积的2X反应缓冲液(4mMHEPES缓冲液(pH8.0),20mMDTT和0.02mM[3H]-CDP(24Ci/mmol,Amersham,Chicago,IL)混合。通过加入100mM羟基脲和10mMEDTA(pH8.0)终止反应并煮沸3分钟。然后加入1ml菱斑响尾蛇(Crotaluxatrox)蛇毒(Sigma,St.Louis,MO),37℃孵育30分钟，并再煮沸3分钟。然后将溶液通过0.5mlDowex-1硼酸盐柱，用2ml水洗脱并收集在4个洗脱部分中的样品与Biofluor(NewEnglandNuclear,Boston,MA)混合后用于闪烁计数。核糖核苷酸还原酶活性表示为每毫克蛋白的单位数，其中1单位代表每毫克蛋白每小时将1nmol[3H]-CDP转化为dCDP。
D.蛋白激酶活性检测
为确定经修饰的ICP10多聚核苷酸是否编码缺乏蛋白激酶活性的多肽，将感染了含有经修饰ICP10多聚核苷酸的HSV-2或野生型HSV-2的细胞提取物(moi＝200，感染后16小时)用抗LA-1的抗体进行免疫沉淀，并进行如Chungetal.J.Virol.63:3389-3398,1998和美国专利第6,013,265号中所述的PK检测。通常，细胞提取物的免疫沉淀物使用BCA蛋白检测试剂盒(PIERCE,RockfordIL.)进行蛋白浓度的标准化，并用含20mMTris-HCL(pH7.4)、0.15MNaC1的TS缓冲液洗涤，重悬于50μl含20mMTris-HCL(pH7.4)、5rnMMgC12、2mMMnC12、10μCi[32P]ATP(3000Ci/mmol，DuPont，NewEnglandResearchProd.)的激酶反应缓冲液，30℃孵育15分钟。珠子用1mlTS缓冲液洗涤一次，重悬于100μl变性溶液中，并且煮沸5分钟。然后蛋白通过SDS-PAGE在7％的聚丙烯酰胺凝胶上进行分离。而后蛋白按以前所述(参见Aurelianet.al.,CancerCells7:187-1911989)被电转至硝酸纤维膜上，通过用特异抗体孵育，然后与蛋白A过氧化物酶(Sigma,St.Louis,MO)室温孵育1小时进行免疫印记。可以按Smithetal.,Virol.200:598-612,(1994)所述用ECL试剂(Amersham,Chicago,IL)进行检测。
IV.载体构建
本发明涉及包含取代或删除至少部分ICP10序列的HSV-2载体，如由经修饰的ICP10多聚核苷酸编码的蛋白具有核糖核苷酸还原酶活性但缺乏蛋白激酶活性，并且在具体实施方案中，还包含调节序列，如组成型启动子。在一些实施方案中，该组合物为包含经修饰的ICP10基因的裸(非病毒的)DNA载体，而在其它实施方案中，该组合物为含有经修饰的ICP10基因的重组HSV-2。裸DNA载体和重组病毒均还能够包含以下组分中的一些或全部。
A.载体
前面所定义的载体包括但并不限于质粒、粘粒、病毒(噬菌体、动物病毒和植物病毒)和人工染色体(如YACs)。构建工程化的病毒和DNA载体的方法为本领域已知。通常，这些包括Sambrooketal.,MolecularCloning:ALabManual,2ndEd.(分子克隆：实验室手册，第二版),ColdSpringHarborLaboratoryPress(1989)和其中引用的参考文献。病毒学的相关考虑因素也被综述在CoenD.M.,MolecularGeneticsofAnimalVirusesin Virology,2ndEdition(病毒学中动物病毒的分子遗传学，第二版),B.N.Fields(编辑)，RavenPress,N.Y.(1990)和其中引用的参考文献中。
表达载体可以包含各种“控制序列”，其指对可操作地连接的编码序列在特定宿主细胞中转录和可能的翻译所必需的核酸序列。除了掌控转录和翻译的控制序列，DNA载体、表达载体和病毒可以包含还发挥其它功能的核酸序列并将在下文描述。
1.启动子和增强子
启动子通常包含对定位RNA合成起始位点起作用的序列。对此最为著名的例子为TATA盒，但在一些缺乏TATA盒的启动子(如哺乳动物末端脱氧核苷酸转移酶基因的启动子和SV40晚期基因启动子)中，重叠起始位点的不连续元件本身帮助固定起始位置。另外的启动子元件调节转录起始的频率。通常，这些元件位于起始位点上游30-110bp的区域，虽然很多启动子被显示在起始位点下游也包含功能性元件。为使得编码序列“受控于”启动子，安置所选启动子“下游”(也就是3’端)转录读码框的转录起始位点的5’端。“上游”启动子刺激DNA的转录并促进所编码的RNA的表达。
启动子元件之间的间隔常常是可变的，以便当元件被颠倒或相对于彼此发生移动时启动子的功能被保留。在tk启动子中，启动子元件之间的间隔可在活性开始衰减之前增加50bp的间隔。根据启动子的不同，似乎各个元件可协同地或独立地激活转录。启动子可能或可能不与增强子联合使用。
启动子可以与核酸序列天然地连接，如通过分离位于编码区段和/或外显子上游的5’非编码序列而得到。类似地，增强子可以与核酸序列天然地连接，位于该序列的下游或上游。或者，通过将编码核酸片段置于重组或异源启动子的控制之下将获得某些优势，重组或异源启动子指在其天然环境中在正常情况下不与核酸序列连接的启动子。重组或异源增强子指在天然环境中在正常情况下不与核酸序列连接的增强子。这样的启动子或增强子可以包括其它基因的启动子或增强子，以及从任何其它病毒或原核或或真核细胞中分离出的启动子或增强子，以及“非天然存在的”启动子或增强子，也就是包含不同转录调节区域中的不同元件，和/或改变表达的突变。例如，最经常用于重组DNA构建的启动子包括β内酰胺酶(青霉素酶)、乳糖和色氨酸(trp)启动子体系。除了合成产生启动子和增强子的核酸序列，可以使用与本文公开的组合物有关的重组克隆和/或核酸扩增技术产生序列，包括PCR(见美国专利第4683202号和5928906号)。并且，预期，指导如线粒体、叶绿体等非核细胞器中序列的转录和/或表达的控制序列也能够被利用。
很自然地，使用在被选择用于表达的细胞器、细胞类型、组织或生物中有效指导DNA片段表达的启动子和/或增强子将是十分重要的。所使用的启动子可能是组成型的、组织特异性的、可诱导的和/或可用于在适当条件下指导引入的DNA片段高水平的表达，如对于重组蛋白和/或肽的大规模生产有利的。启动子可以是异源的或内源的。
另外，任何启动子/增强子的组合都可被用于驱动表达。T3、T7或SP6胞质表达体系的使用是另一种可能的实施方案。如果提供适当的细菌聚合酶，则真核细胞可以支持来自某些细菌启动子的胞质转录，该细菌聚合酶作为递送复合体的一部分或另外的基因表达构建体。
组织特异性启动子或元件的确认以及表征其活性的方法为本领域技术人员所熟知。这样区域的非限制性实例包括人LIMK2基因(Nomotoetal.(1999)Gene236(2):259-271)、生长激素释放抑制因子受体2基因(Krausetal.,(1998)FEBSLett.428(3):165-170)、鼠附睾视黄酸结合基因(Lareyreetal.,(1999)J.Biol.Chem.274(12):8282-8290)、人CD4(Zhao-Emonetetal.,(1998)Biochem.Biophys.Acta,1442(2-3):109-119)、小鼠α-2(XI)胶原蛋白(Tsumaki,etal.,(1998),J.Biol.Chem.273(36):22861-4)D1A多巴胺受体基因(Lee,etal.,(1997),DNACellBiol.16(11):1267-1275)、胰岛素样生长因子II(Wuetal.,(1997)BiophysBiochemRes.Comm.233(1):221-226)和人血小板内皮细胞粘附分子-1(Almendroetal.,(1996)J.Immunol.157(12):5411-5421)。
2.起始信号和内部核糖体结合位点
编码序列的有效翻译还可能需要特定的起始信号。这些信号包括ATG起始密码子或邻近序列。可能需要提供包括ATG起始密码子在内的外源翻译控制信号。本领域普通技术人员能够很容易地确定此点和提供必需的信号。众所周知，起始密码子必需“符合”期望的编码序列的读码框才能保证整个插入序列的翻译。外源翻译控制信号和起始密码子可以是天然的或合成的。表达的效率可能通过包含适当的转录增强元件而被增强。
在本发明的某些实施方案中，内部核糖体进入位点(IRES)元件被用于创造多基因或多顺反子信息。IRES元件能够绕过5’甲基化帽依赖的翻译的核糖体扫描模型并在内部位点开始翻译。IRES元件可被连接到外源开放阅读框。多个开放阅读框可一起被转录，每一个由IRES分开，创造多顺反子信息。利用IRES元件，核糖体可接近每个开放阅读框以进行有效翻译。能够使用单个启动子/增强子转录单个信使来有效表达多个基因(见美国专利第5925565和5935819号)。
3.终止信号
本发明的载体或构建体通常会包含至少一个终止信号。“终止信号”或“终止子”由涉及通过RNA聚合酶的RNA转录本的特定终止的DNA序列组成。因此，在某些实施方案中，预期结束生成RNA转录本的终止信号。为达到期望的信使水平，终止子在体内可能是必需的。
在真核生物体系中，终止子区域还可以包含允许新转录本的位点特异性断裂以暴露多聚腺苷位点的特定DNA序列。这会向专门的内源聚合酶发出信号以在转录本的3’端末增加约200个A残基的延伸(多聚腺苷酸)。由这个多聚腺苷酸尾部修饰的RNA分子似乎更加稳定并更加有效地被翻译。因此，在涉及真核细胞的其它实施方案中，预期终止子包含用于RNA切割的信号，并且预期终止子信号促使信使的多聚腺苷酸化。终止子和/或多聚腺苷酸化位点元件能够用于增强信使水平并最小化从盒到其它序列的连读。
预期在本发明中使用的终止子包括本文所述的任何已知的转录终止子或本领域普通技术人员已知的转录终止子，包括但不限于，例如，基因的终止序列，如牛生长激素终止子或病毒终止序列，如SV40终止子。在某些实施方案中，终止信号可能是缺失可转录或可翻译序列，如由于序列的截短。
4.多聚腺苷酸化信号
对于表达，特别是真核生物的表达，通常会包括多聚腺苷酸化信号以达到转录本的正确多聚腺苷酸化。多聚腺苷酸化信号的性质被认为对于本发明的成功实施并不是至关重要的，并且任何这样的序列都可以被使用。优选的实施方案包括SV40多聚腺苷酸化信号或牛生长激素多聚腺苷酸化信号，二者均是很便利的并且已知在各种靶细胞中功能良好。多聚腺苷酸化可以增加转录本的稳定性或可以促进胞质运输。
5.可选择和可筛选的标志物
在本发明的某些实施方案中，通过将标志物包括在表达载体中可以体外或体内鉴别包含本发明的核酸构建体的细胞。这样的标志物使细胞具有可识别的转变，使包含表达载体的细胞很容易被鉴别。通常，可选择标志物具有允许选择的特性。正选择标志物是其中标志物的存在允许其被选择，而负选择标志物是其中标志物的存在防止其被选择。正选择标志物的实例是药物抗性标志物。
通常包含药物选择标志物帮助转化体的克隆和确认，例如，赋予新霉素、嘌呤霉素、潮霉素、DHFR、GPT、zeocin和组氨醇抗性的基因是有用的可选择标志物。除了赋予使得能够根据实施条件区别转化体的表型的标志物，还预期包括可筛选标志物如基于颜色分析的GFP在内的其它类型的标志物。或者，可利用可筛选的酶如单纯疱疹病毒胸苷激酶(tk)或氯霉素乙酰转移酶(CAT)。本领域技术人员还会知晓如何运用免疫标志物，可能与荧光激活细胞分选(FACS)分析联用。所使用的标志物被认为是不重要的，只要其能与编码基因产物的核酸同时表达。更多的可选择或可筛选标志物的实例为本领域技术人员所熟知。
通过适当的方法将载体引入最初感染的细胞。认为用于本发明的、用于细胞器、细胞、组织或生物体转化的核酸递送的这些方法事实上包括能够将核酸(如HSV载体)引入细胞器、细胞、组织或生物体的任何方法，如本文所述的或本领域普通技术人员已知的。非限制性的示例性方法包括：通过离体转染直接递送DNA；注射(美国专利第5994624,5981274,5945100,5780448,5736524,5702932,5656610,5589466和5580859号)；显微注射(美国专利第5789215号)；电穿孔(美国专利第5384253号)；磷酸钙沉淀；DEAE右旋糖苷及随后的聚乙二醇；直接声波负载；脂质体介导的转染；受体介导的转染；微粒轰击(PCT申请WO94/09699和95/06128；美国专利第5610042,5322783,5563055,5550318,5538877和5538880号)；碳化硅纤维搅拌(美国专利第5302523和5464765号)；农杆菌介导的转化(美国专利第5591616和5563055号)；PEG介导的原生质体的转化(美国专利第4684611和4952500)；干燥/抑制介导的DNA摄取，以及这些方法的任意组合，或本领域技术人员已知的其它方法。所述组合物还能够通过在药物可接受的赋形剂中全身给药被递送到哺乳动物的细胞中，如采用静脉内的方式。
B.DNA载体递送至细胞的方法
1.离体转化
在离体环境中转染分离自生物体的细胞和组织的方法为本领域技术人员已知。因此，预期在本发明中，细胞和组织可被分离并离体用本文所述的核酸或组合物进行转染。在特定方面，移植的细胞或组织可被置于生物体内。在一些实施方案中，核酸在移植的细胞或组织中表达。
2.注射
在某些实施方案中，核酸可以通过一次或多次注射(即针式注射)被导入细胞器、细胞、组织或生物体，如皮下、皮内、肌内、静脉、腹膜内等。注射的方法是本领域普通技术人员所熟知的(如含盐溶液的组合物的注射)。本发明更多的实施方案包括通过直接显微注射引入核酸。所用的本发明组合物的量可随受影响的细胞、组织或生物体的性质发生变化。
3.电穿孔
在本发明的某些实施方案中，核酸通过电穿孔被引入细胞器、细胞、组织或生物体内。电穿孔包括将细胞和DNA悬液暴露于高电压放电。在该方法的一些变化形式中，某些细胞壁降解酶，如果胶降解酶，被用来使靶受体细胞比起未处理细胞来对于电穿孔转化更加易感(美国专利第5384253号)。或者，可以使受体细胞对通过机械损伤的转化更加易感。
4.脂质体介导的转染
在本发明的其它实施方案中，本文所述的组合物，如具有经修饰的ICP10多聚核苷酸的载体，可能被包含在脂类复合物如脂质体中。脂质体为含有磷脂双层膜和内部水介质特征的囊状结构。多层脂质体含有由水介质分隔的多个脂质层。当磷脂悬浮于过量水溶液时会自然形成多层脂质体。脂组分在形成闭合结构之前会发生自身重排，并在脂双层之间捕获水和被溶解的溶解质。还预期与Lipofectamine(GibcoBRL)或Superfect(Qiagen)复合的核酸。
在本发明的某些实施方案中，脂质体可以与血凝病毒(HJV)复合。已显示这推动与细胞膜的融合并促进被脂质体包裹的DNA进入细胞((Kanedaetal.,(1989)Science20；243(4889):375-8)。在其它实施方案中，脂质体可以与核的非组蛋白染色体蛋白(HMG1)复合或联用(Katoetal.,(1991)JBiolChem.(1991)Feb25；266(6):3361-4)。在另一些实施方案中，脂质体可以与HJV和HMG1二者复合或联用。在其它实施方案中，递送载体可以包含配体和脂质体。
5.受体介导的转染
核酸可通过受体介导的递送载体被递送至靶细胞。这种方法利用大分子被受体介导的内吞作用选择性摄取。由于各种受体的细胞类型特异性分布，这种递送方法使本发明增加另外的特异性。
在某些实施方案中，受体介导的基因靶向载体包含受体特异性配体和核酸结合试剂。其它实施方案包含已有效粘附待递送核酸的受体特异性配体。已有几种配体被用于受体介导的基因转移，包括表皮生长因子(EGF)，如欧洲专利EPO0273085号所述该因子已被用于递送基因至鳞状癌细胞。
在其它实施方案中，细胞特异的核酸靶向载体中的核酸递送载体组分可以包含与脂质体组合的特异结合配体。待递送的核酸被置于脂质体中，且特异结合配体被功能性地并入脂质体膜中。于是该脂质体将特异地结合靶细胞的受体并递送内含物至细胞中。
在其它实施方案中，靶向递送载体的核酸递送载体组分可以是脂质体本身，其优选地包含一种或多种脂类或指导细胞特异性结合的糖蛋白。例如，乳糖神经酰胺，一种半乳糖末端唾液酸神经节苷脂(asialganglioside)，已被并入脂质体，并且已观察到肝细胞对胰岛素基因的摄取增加(Nicolauetal.,(1987)MethodsEnzymol.149:157-76)。预期本发明的组织特异性转化构建体能够以类似的方式被特异地传递送至靶细胞。
6.微粒轰击
微粒轰击技术可被用于将核酸引入到至少一个细胞器、细胞、组织或生物体中(美国专利第5550318号；美国专利第5538880号；美国专利第5610042号；PCT申请WO94/09699)。该方法依赖于将用DNA包被的或包含DNA的微粒加速至高速度以允许其刺穿细胞膜进入细胞且不杀死细胞的能力。该微粒可以由任意生物惰性物质组成，如钨、铂或金。对于轰击，悬浮细胞浓缩在滤器或固体培养基中。或者，未成熟的胚胎或其它靶细胞可以被安置于固体培养基中。待轰击的细胞被置于微粒轰击装置下方适当距离的挡板上。可用于本发明实施的多种微粒轰击技术将为本领域技术人员所知。
C.宿主细胞
本文用到的术语“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可互换使用。所有这些术语还包括它们的后代，即任一或所有后代。应理解由于有意或无意的突变可能不是所有的后代都相同。关于表达异源核酸序列，“宿主细胞”指原核或真核细胞，且其包括能复制载体和/或表达由载体编码的异源基因的任何可转化生物体。宿主细胞可以并且已经作为载体的接受者被使用。宿主细胞可以被“转染”或“转化”，其指外源核酸被转染或引入宿主细胞的过程。转化细胞包括原代个体细胞和它的后代。本文所使用的术语“工程化的”和“重组的”细胞或宿主细胞用来指被引入如载体的外源核酸序列的细胞。因此，重组细胞区别于天然存在的不含有重组引入核酸的细胞。
组织可以包含宿主细胞或将要用产生细胞膜融合性的HSV-2突变体转染的细胞。该组织可以是生物体的一部分或是从生物体中分离的。在某些实施方案中，组织可以包含但不限于脂肪细胞、牙槽的、成釉细胞、神经的、基底细胞、血液(如淋巴细胞)、血管、骨骼、骨髓、神经胶质细胞、乳腺、软骨、子宫颈、结肠、角膜、胚胎的、子宫内膜、内皮的、上皮的、食道、面部的、成纤维细胞、滤泡的、神经节细胞、神经胶质细胞、杯状细胞、肾、肝、肺、淋巴结、肌肉、神经元、卵巢、胰腺、外周血、前列腺、皮肤、小肠、脾、干细胞、胃、睾丸及所有它们的癌症。
在某些实施方案中，宿主细胞或组织可以被包含在至少一种生物体中。在某些实施方案中，如本领域普通技术人员所理解的，该生物体可以是但不限于原核生物(如真细菌或古细菌)或真核生物。
许多细胞系和培养物可作为宿主细胞被使用，并且通过一些组织如美国典型培养物保藏中心(ATCC)成为可商购的。本领域技术人员能够根据载体骨架和期望的结果确定适当的宿主。可用于载体复制和/或表达的示例性非限制性细胞类型包括细菌，如大肠杆菌(E.coli)(例如大肠杆菌菌株RR1、LE392、B、X1776(ATCC号31537)、W3110、F、λ、DH5α、JM109和KC8)；杆菌，例如枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)；其它肠细菌，例如鼠伤寒沙门菌(Salmonellatyphimurium)、粘质沙雷菌(Serratiamarcescens)，以及很多可商购的细菌宿主和感受态细胞如CompetentCells和SOLOPACKTMGoldCells(LaJolla,CA)。用于载体的复制和/或表达的真核宿主细胞的非限制性实例包括HeLa、NIH3T3、Jurkat、293、Cos、CHO、Saos和PC12。
一些载体可能使用允许其既能在原核细胞中也能在真核细胞中复制和/或表达的控制序列。本领域技术人员将进一步了解孵育所有上述宿主细胞以维持这些细胞并允许载体复制的条件。还了解和已知允许大规模载体生产以及允许大规模生产由载体编码的核酸及其同源多肽、蛋白或肽的技术和条件。
D.病毒载体包装和繁殖
1.病毒包装
在本发明的具体实施方案中，ICP10基因经修饰后通过同源重组被插入病毒中。通常，这通过使用Lipofectamine共转染包含经修饰的ICP10基因的质粒DNA和纯化的HSV-2基因组DNA至Vero细胞内完成。然后重组病毒被确认(通常通过可选择标志物的存在筛选病毒斑)并筛选包含经修饰的ICP10多聚核苷酸的空斑。然后，挑选的重组病毒被体外表征以确认经修饰的ICP10基因被正确地插入HSV-2基因组取代了原始的ICP10基因。病毒包装和体外表征会在实施例1和2中给予更加具体的描述。
2.病毒原种的制备
一旦选择了重组的HSV-2突变体病毒，按如下方法制备病毒原种。Vero细胞在10％胎牛血清(FBS)中培养，并以每个细胞0.01空班形成单位(pfu)感染病毒。2天后通过反复冻融和超声从细胞中收集病毒。然后，收集的病毒按(Nakamori,etal.,(2003)ClinicalCancer.Res.9(7):2727-2733)所述进行纯化。然后，纯化后的病毒进行滴定(按实施例10所述)，分装并储存于-80℃备用。
E.蛋白表达体系
蛋白表达体系可被用于本发明的DNA载体组合物的生成，以表达由经修饰的ICP10多聚核苷酸编码的多肽用于功能研究。存在许多包含至少部分或全部以上讨论的组合物的表达体系。基于原核生物和/或真核生物的体系能够被用于本发明以生成核酸序列，或它们的同源多肽、蛋白或肽。许多这样的体系已经是广泛商品化的。
昆虫细胞/杆状病毒体系能够产生异源核酸片段的高水平蛋白表达，如美国专利第5871986号和第4879236号所述，并且是商品化的(例如CLONTECH,Inc.MountainView,CA)。
其它商品化的表达体系的实例包括可诱导哺乳动物表达体系，其包含合成的蜕皮激素诱导受体，或pET表达体系，或大肠杆菌表达体系(STRATAGENE,LaJolla,CA)；四环素调节表达体系，使用全长CMV启动子的可诱导哺乳动物表达体系或用于在甲基营养酵母甲醇毕赤酵母(Pichiamethanolica)中高水平生产重组蛋白的酵母表达体系(INVITROGEN,Carlsbad,CA)。
预期按本发明方法生成的蛋白、多肽或肽可以是“过表达的”，也就是以相对于细胞中的正常表达升高的水平被表达。这样的过表达可由很多方法评估，包括放射性标记和/或蛋白纯化。然而，优选简单且直接的方法，如那些包含SDS/PAGE和蛋白染色或Western印迹的方法，然后进行定量分析，如对得到的凝胶或印迹的光密度扫描。与正常细胞中的水平相比，重组蛋白、多肽或肽水平的具体升高表明过表达，即该具体蛋白、多肽或肽与宿主细胞产生的其它蛋白相比的相对丰度，例如是凝胶可见的。
V.HSV-2突变体的功能性作用
本文所述的HSV-2突变体作为溶瘤试剂显示多种功能性作用。例如，病毒能够通过溶解破坏肿瘤细胞，以及通过合胞体形成和在受感染细胞和旁观细胞中均诱导凋亡而破坏肿瘤细胞。并且，HSV-2突变体引起的肿瘤破坏诱导有效的抗肿瘤免疫应答，该应答进一步有助于作为溶瘤试剂用于恶性疾病治疗的突变体病毒的治疗功效。
HSV-2突变体病毒显示在周期细胞中但不在非周期细胞中的选择性复制。如实施例4中更加具体的描述，与在周期细胞中的生长相比，缺乏蛋白激酶活性的突变体HSV-2在非周期细胞中的生长至少减少40倍。相反，野生型HSV-2在周期与非周期细胞之间的生长特性仅受到微弱影响。因此，本文所述的HSV-2突变体非常适合在含有激活的Ras通路的周期细胞中用作溶瘤试剂，该周期细胞如肿瘤细胞。
与其它溶瘤病毒和野生型HSV-2相比，本文所述的经修饰的HSV-2具有突出的杀死肿瘤细胞的能力。使用实施例5中所述的体外测定证明FusOn-H2针对不同组织来源的人肿瘤细胞的杀伤能力要显著地强于美国专利申请第10/397635号所述的和/或迄今为止测试的溶瘤HSV-1，并且甚至超过亲本野生型HSV-2。并且，如实施例6所述，本发明病毒以中等剂量(1x106空班形成单位)单次注射导致了在100％的动物中(n＝8)在裸鼠中同位建立的乳腺肿瘤完全消失，而给予同样剂量的溶瘤HSV-1仅在不到30％的小鼠中缩小肿瘤。
除了溶解细胞和膜融合活性，HSV-2突变体还具有有力的诱导凋亡的活性，并且能够诱导有效的抗肿瘤免疫应答。在体外环境中，HSV-2突变体可以诱导感染了病毒的细胞及感染细胞周围的未感染旁观细胞发生凋亡。并且，HSV-2突变体对于体内诱导肿瘤细胞凋亡有效。实施例8对此会有更加具体的描述。本文所述的组合物不仅比其它溶瘤病毒更加有效地杀死肿瘤细胞，而且HSV-2突变体显示通过诱导强烈抗肿瘤免疫应答的针对原发和转移肿瘤的强大体内治疗功效。如实施例9所述，来自FusOn-H2处理的小鼠的过继转移的CTL可以抑制原始肿瘤的生长并有效地防止转移的发生和发展。
凋亡，或细胞程序性死亡对于正常的胚胎发育、保持成体组织的稳态和抑制癌症发生是必需的过程。在本发明的一些实施方案中，经修饰的HSV-2在感染了病毒的肿瘤细胞和未感染的旁观肿瘤细胞中是凋亡的有力诱导物。例如，在特定实施方案中，用HSV-2构建体感染肿瘤细胞，该HSV-2构建体中ICP10基因的部分蛋白激酶结构域被编码绿色荧光蛋白(GFP)的基因取代。通过可视化GFP能够在荧光显微镜下鉴别感染的细胞，并且通过染色质浓缩作为证据鉴别发生凋亡的细胞。显示染色质浓缩和表达GFP的细胞比例为2.6:1，说明有大量未感染经修饰的HSV-2的肿瘤细胞发生凋亡。本发明的溶瘤病毒诱导凋亡的能力在实施例8中有更加具体的描述。
强烈的抗肿瘤免疫应答可用于抗击恶性疾病。本文所述的HSV-2突变体能够体内诱导针对原发和转移肿瘤的有效抗肿瘤免疫应答。在特定实施方案中，在使用4T1小鼠乳腺肿瘤细胞系的小鼠乳腺肿瘤模型中，突变体HSV-2(FusOn-H2)选择性地在肿瘤细胞中复制并溶解肿瘤细胞，并且显示通过诱导强烈抗肿瘤免疫应答的针对原发和转移肿瘤的强大体内治疗功效。特别是，来自FusOn-H2处理的小鼠的过继转移的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)能够抑制原始肿瘤的生长并有效地防止在未用FusOn-H2处理的小鼠中的转移。这在实施例9中会更加具体地描述。
VI.药物组合物和给药途径
A.一般考虑因素
本发明的组合物可被作为药物组合物给药，该药物组合物包含本文所述的含经修饰的ICP10基因的重组HSV-2突变体或含经修饰的ICP10基因的裸(非病毒的)DNA载体。本发明的组合物包括经典的药物制剂。通常，通过将所述组合物溶解或分散在药物可接受的载体或水溶液介质中，本发明的组合物能够作为药剂被给予。这样的介质或试剂用于药物活性物质为本领域所熟知。除非任何常规介质或试剂与本发明组合物不相容，否则预期其用于治疗组合物。辅助的活性成分，如其它抗病剂，也能够被包括在药物组合物中。该组合物的给药将会通过任何普通的途径，只要通过该途径可以到达靶细胞。示例性给药途径包括口服、鼻内、含服、直肠、阴道或局部。或者，给药可以是同位的、皮内、皮下、肌内、腹膜内、静脉或直接肿瘤内注射。对于本发明组合物的药物配方、剂量和给药途径将在下文中描述。
B.HSV-2突变体的药物配方
本发明的突变体病毒组合物能够制备成药物可接受的配方。通常，突变体病毒与药物可接受的且和病毒相容的赋形剂混合。适合的赋形剂例如为水、盐水、右旋糖、甘油、乙醇等等以及它们的组合。另外，如果需要，制剂可以含有较少量的辅助物质，如润湿或乳化剂、pH缓冲剂、佐剂或免疫增强剂，其增强病毒突变体的效力(参见Remington'sPharmaceuticalSciences(雷明顿制药学),Gennaro,A.R.etal.,eds.,MackPublishingCo.,pub.,18thed.,1990)。例如，典型的用于注射目的的药物可接受载体可以是每毫升磷酸缓冲盐溶液中包含50mg高至约100mg的人血清白蛋白。另一些适合用于药物可接受组合物配方的非限制性代表性的非水溶剂包括聚丙二醇、聚乙二醇、植物油、芝麻油、花生油和可注射的有机酯如油酸乙酯。代表性的非限制性水性载体包括水、水溶液、盐溶液、肠胃外赋形剂如氯化钠、林格氏右旋糖等。静脉内赋形剂包括液体和营养补充物。确定药物组合物的pH和其中各组分的精确浓度是常规的，并在本领域普通技术人员知识范畴内(参见GoodmanandGilman'sThePharmacologicalBasisforTherapeutics(Goodman和Gilman氏治疗学的药理学基础),Gilman,A.G.etal.,eds.,PergamonPress,pub.,8thed.,1990)。
通过在适当溶剂中将需要量的活性化合物与所需的和如上所述的各种其它无菌成分混合而制备无菌注射溶液。通常，通过将各种已灭菌的活性成分并入包含基本分散介质和如上所述需要的其它成分的无菌赋形剂中而制备分散液。
C.给予HSV-2突变体的途径和剂量
突变体病毒组合物可通过任何提供通往靶组织的途径传送。示例性非限制性给药途径可以包括口服、鼻内、含服、直肠、阴道局部或通过注射(包括同位的、皮内、皮下、肌内、腹膜内、静脉或直接肿瘤内注射)。通常，病毒突变体会按可注射的液体溶液或混悬液制备；也可制备适合注射前溶于或悬浮于液体内的固体形式。这种制剂也可以是乳化的。
对于水溶液的肠胃外给药，例如，该溶液必要时应被适当地缓冲，并且液体稀释液首先应与足够的盐或葡萄糖是等张的。这些特定的水溶液特别适合静脉、肌内、皮下和腹膜内给药。关于这点，根据本公开，能够使用的无菌水性介质将被本领域技术人员所了解。例如，一剂可溶于1ml等张NaCl溶液中并加入到1000ml皮下灌输液体中或在输注的建议位点注射(例如参见"Remington'sPharmaceuticalSciences(雷明顿制药学)"第15版，1035-1038页和1570-1580页)。根据接受治疗的对象的状况，需要对剂量进行一些变化。负责给药的人在任何情况下都要针对个体对象确定合适的剂量。
本领域技术人员会认可使用本发明组合物以提供治疗的最好治疗方案可被简单明了地确定。这不是实验方法的问题，而是医学领域中常规进行的最优化的问题。例如，小鼠的体内研究提供了起点，从此开始优化剂量和递送方案。注射频率起初可能是一周一次。然而，这个频率可以被最优地调节，从一天到每两周一次再到每月一次，这取决于起初临床实验的结果和具体病人的需要。人剂量开始时能够通过从小鼠使用的组合物的量外推而确定。
1.剂量
递送的病毒载体的量将取决于几个因素，包括治疗的数量、治疗对象、对象的免疫系统合成抗病毒抗体的能力、待破坏的靶组织和期望的保护程度。待给予的病毒组合物的准确数量取决于从业人员的判断并对每一个个体都是特殊的。然而，适当的剂量为105空班形成单位(pfu)到1010pfu。在某些实施方案中，病毒DNA的剂量可以为约105、106、107、108、109高达并包括1010pfu。
D.非病毒DNA载体配方
除了上述用于病毒药物配方的配方之外，非病毒DNA载体还能够被制备为用于制备药物可接受的无菌溶液的无菌粉末。用于无菌粉末制备的典型方法包括真空干燥和冷冻干燥技术，此技术产生来自之前的无菌过滤溶液的活性组分加上任何另外的期望组分的粉末。
E.给予非病毒DNA载体的途径和剂量
预期用于将本发明的多聚核苷酸转移至哺乳动物细胞的非病毒载体递送的若干种方法。这些包括磷酸钙沉淀、DEAE-右旋糖苷、电穿孔、直接微注射、负载DNA的脂质体和lipofectamine-DNA复合物、细胞超声、使用高速微粒的基因轰击和之前讨论的受体介导的转染。这些技术中的一些可成功地适用于体内或离体。
在本发明的一些实施方案中，表达载体可以简单地由裸重组DNA或包含多聚核苷酸的质粒组成。构建体的转移可通过任何本文提及的、可物理或化学地透过细胞膜的方法进行。这特别适用于体外转移，但也可应用于体内。
在其它实施方案中，递送媒介物可以包含配体和脂质体。例如，Nicolau等人使用被并入脂质体中的乳糖神经酰胺，一种半乳糖末端唾液酸神经节苷脂，观察到肝细胞对胰岛素基因的摄取增加(Nicolauetal.,(1987)MethodsEnzymol.149:157-76)。因此，编码特定基因的核酸在有或无脂质体的情况下，通过任何数量的受体-配体体系被特异递送至细胞类型是可行的。例如，表皮生长因子(EGF)可被用作受体用于向EGF受体上调的细胞进行介导的核酸传送(如欧洲专利EP0273085所述)，甘露糖可被用于靶向肝细胞上的甘露糖受体。
在某些实施方案中，DNA传递在离体条件下更容易进行。离体基因治疗指从动物中分离细胞，体外将核酸递送至细胞中，以及随后将经修饰的细胞返回动物。这可能涉及从动物中手术切除组织/器官或细胞和组织的原代培养物。
1.剂量
在某些实施方案中，预见剂量可在约103pfu/kg体重至约108pfu/kg体重之间变化。在某些实施方案中，剂量可以从每kg体重约103、104、105、106、107高至并包括108pfu。当然，该剂量可以根据初始临床试验的结果和具体病人的需要向上或向下进行调整，如在这样的治疗方案中常规进行的那样。
VII.联合治疗
为了提高本发明的方法和组合物的效力，将本文公开的方法和组合物与其它抗癌试剂联用可能是期望的。这个过程可能包含用本发明的组合物以及至少一种其它的抗癌试剂与癌细胞接触。这可通过使用单纯的组合物或包括两种试剂的药物配方接触细胞而实现，或可通过用两种不同的组合物或配方接触细胞而实现。当使用两种不同配方时，可以用两种配方同时接触细胞，或者一种配方可以先于另一种(例如，本发明的组合物先于或在另一种抗癌剂给药之后给予)，或其任意组合或其重复循环。在本发明的组合物和其它试剂分别给予的实施方案中，通常会保证在每一递送时间之间有显著一段时间不失效，以使本发明的组合物和其它试剂仍能对癌细胞发挥有利的组合作用。这种在两种配方给药之间的时间间隔可在从数分钟至数周的范围内变化。
可用来与本发明的组合物或方法联合的抗癌试剂的非限制性实例包括化疗剂(例如，顺铂(CDDP)、卡铂、丙卡巴肼、氮芥、环磷酰胺、喜树碱、异环磷酰胺、左旋溶肉瘤素、苯丁酸氮芥、白消安、亚硝基脲、更生霉素、柔红霉素、阿霉素、博来霉素、plicomycin、丝裂霉素、依托泊甙(VP16)、他莫昔芬、雷洛昔芬、雌激素受体结合试剂、紫杉酚、吉西他滨、诺维本、法尼基-蛋白转移酶抑制剂、反式构型铂配合物、5-氟尿嘧啶、长春新碱、长春碱和甲氨蝶呤，或上述试剂的任何类似物或衍生变体)；放疗剂(例如，γ射线、X射线、微波和紫外照射，和/或将放射性同位素直接递送至肿瘤细胞)；免疫治疗和免疫调节剂；基因治疗剂；促凋亡剂和其它本领域技术人员熟知的细胞周期调节剂。
免疫治疗也可用来与本文所述的组合物和方法联合作为用于恶性疾病治疗的联合疗法。免疫治疗通常依赖使用免疫效应细胞和分子以靶向并破坏癌细胞。免疫效应物可以是，例如特异性针对肿瘤细胞表面一些标志物的抗体。该抗体可单独作为治疗的效应物，或可以募集其它细胞(例如，细胞毒性T细胞或NK细胞)以实际达到对细胞的杀伤。该抗体也可以与药物或毒素连接(例如，化疗药物、放射性核素、蓖麻毒素A链、霍乱毒素或百日咳毒素等)并仅作为靶向试剂。在一些实施方案中，效应物可以是载有与肿瘤细胞标靶直接或间接相互作用的表面分子的淋巴细胞。在其它实施方案中，肿瘤细胞必须具有一些可用于靶向的标志物。适用于靶向的非限制性示例性肿瘤标志物可包括癌胚抗原(CEA)、前列腺特异抗原、泌尿肿瘤相关抗原、胚胎抗原、酪氨酸酶(p97)、gp68、TAG-72、HMFG、SialylLewis抗原、MucA、MucB、PLAP、雌激素受体、层粘蛋白受体、erbB和p155。
基因治疗也可用来与本文所述的组合物和方法联合作为用于恶性疾病治疗的联合疗法。作为联合疗法的基因治疗依赖治疗基因的传送和表达，区别于本文所述的突变体HSV-2。基因治疗可于本文所述的HSV-2突变体之前、之后或同时给予。基因治疗的示例性非限制性目标包括免疫调节剂、影响细胞表面受体上调和GAP连接的试剂、细胞生长抑制剂和分化试剂、细胞粘附抑制剂、或者诱导或增加靶细胞对凋亡敏感性的试剂。可用作与本发明联合的基因治疗的一部分的示例性非限制性免疫调节基因包括肿瘤坏死因子；干扰素α、β、γ；白介素2和其它细胞因子；F42K和其它细胞因子类似物；或MIP-1、MIP-1β、MCP-1、RANTES和其它趋化因子。
一个示例性细胞增殖抑制剂是p16。真核细胞周期的主要转变由周期蛋白依赖的激酶或CDK’s引发。一种CDK，即周期蛋白依赖的激酶4(CDK4)调节通过G1期的进程。该酶的活性可能是在G1晚期磷酸化Rb。CDK4的活性通过活化亚基D型周期蛋白和特异性结合并抑制CDK4的抑制亚基p16INK4控制，因此可调节Rb的磷酸化。p16INK4基因属于最近描述的一类CDK抑制蛋白，还包括p16B、p19、p21WAF1和p27KIP1。在人肿瘤细胞系中常见p16INK4基因的纯合删除和突变。因为p16INK4蛋白是CDK4的抑制剂，所以这个基因的删除可能增加CDK4的活性，导致Rb蛋白的超磷酸化。其它可用于基因治疗以抑制细胞增殖的基因包括Rb、APC、DCC、NF-1、NF-2、WT-1、MEN-I、MEN-11、zacl、p73、VHL、MMACl/PTEN、DBCCR-1、FCC、rsk-3、p27、p27/p16融合、p21/p27融合、抗血栓形成基因(例如COX-1、TFPI)、PGS、Dp、E2F、ras、myc、neu、raf、erb、fms、trk、ret、gsp、hst、abl、ElA、p300、涉及血管生成的基因(例如VEGF、FGF、血小板反应蛋白、BAI-1、GDAIF或它们的受体)和MCC。
还预期细胞表面受体或它们的配体如Fas/Fas配体、DR4或DR5/TRAIL的上调会通过在超增殖的细胞中建立自分泌或旁分泌效应来加强本发明诱导凋亡的能力。通过提高GAP连接的数量增加细胞内信号传导会增强对邻近超增殖细胞群的抗超增殖作用。在其它实施方案中，细胞生长抑制剂和分化试剂可与本发明联用以提高治疗的抗超增殖效力。预期细胞粘附抑制剂增强本发明的功效。细胞粘附抑制剂的实例为病灶粘附激酶(FAKs)抑制剂和洛伐他汀。还预期其它增加超增殖细胞对凋亡敏感性的试剂，如抗体c225，与本发明联用以增强治疗功效。
激素治疗也可与本发明组合使用。激素可用于某些癌症的治疗，如乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌或子宫颈癌，以降低某些激素如睾丸激素和雌激素的水平或抑制其作用。该治疗作为一种治疗选择经常与至少一种其它癌症治疗组合使用以降低转移风险。
出于所有目的，所有在此申请中引用的专利、专利申请和其它出版物，包括发表的氨基酸或多聚核苷酸序列以参考的方式被整体并入。
实施例
包括以下实施例以说明本发明的优选实施方案。本领域技术人员应该理解，在以下实施例中公开的技术代表本发明人发现的在本发明的实践中很好地发挥作用的技术，因此可以被认为是组成其实践的优选方式。然而，本领域技术人员根据本公开的内容应该理解，能够在不偏离本发明本质和范围的情况下对公开的具体实施方案做出许多改变且仍然得到类似或相似的结果。
实施例1
FusOn-H2的构建
示例性FusOn-H2的构建由图1阐明。起初包含ICP10左翼区域的HSV基因组区域(相当于HSV-2基因组中核苷序号85994-86999)用以下示例性的引物对5'-TTGGTCTTCACCTACCGACA(SEQIDNO:1)，和3'-GACGCGATGAACGGAAAC(SEQIDNO:2)进行扩增。RR结构域和右翼区域(相当于HSV-2基因组中核苷序号88228-89347)用以下示例性的引物对5'-ACACGCCCTATCATCTGAGG(SEQIDNO:13)和5'-AACATGATGAAGGGGCTTCC(SEQIDNO:14)进行扩增。这两个PCR产物通过EcoRI-NotI-XbaI连接被克隆到pNeb193中生成pNeb-ICP10-deltaPK。然后，包含CMV启动子-EGFP基因的DNA序列从pSZ-EGFP中用以下示例性的引物对5'-ATGGTGAGCAAGGGCGAG(SEQIDNO:3)和3'-CTTGTACAGCTCGTCCATGC(SEQIDNO:4)扩增出来。然后，将PCR扩增的DNA通过BglII和NotI连接克隆到pNeb-ICP10-deltaPK中删除了PK的位点生成pNeb-PKF-2。在PCR扩增方法的设计上，引物被设计为使得EGFP基因与ICP10基因剩余的RR结构域融合到同一读码框中以便于这个新的融合基因的新蛋白产物包含完整功能的EGFP，其在以下实验步骤中促进对重组病毒的选择。
通过lipofectamine共转染pNeb-PKF-2质粒DNA和纯化的HSV-2基因组DNA(病毒株186)到Vero细胞中将经修饰的ICP10基因通过同源重组插入到病毒中。重组病毒通过选择GFP阳性的病毒斑进行筛选和确认。在本发明的具体实施方案中，在筛选过程中，注意到所有GFP阳性病毒斑显示出清晰的被感染细胞合胞体的形成，说明这些经修饰病毒诱导普遍的细胞膜融合。选取了总共六个病毒斑。其中一个，称为FusOn-H2，被选择用于进一步的表征和所有后续实验。
实施例2
体外表征
用本领域标准方法表征示例性FusOn-H2载体。
Southern印迹分析
为了确认经修饰的ICP10基因已被正确地插入HSV-2基因组中取代了原始的ICP10基因，从纯化的FusOn-H2病毒储备(virusstock)中提取病毒体DNA。作为对照，按同样的方法提取源自亲本野生型HSV-2的病毒体DNA。病毒体DNA由BamHI酶切并在0.8％的琼脂糖凝胶中电泳。BamHI酶切从野生型HSV-2基因组中产生7390bpDNA片段，其包含整个ICP10基因及其左翼和右翼区域。然而，用同样的酶消化FusOn-H2基因组从ICP10基因座生成两个DNA片段：1)包含左翼和CMV启动子序列的4830bp片段，和2)包含GFP、RR和右翼区域的3034bp序列。DNA被转至尼龙膜上与四个探针杂交，该探针源自：1)DNA序列的左翼区域；2)完整的PK区域；3)PK的右翼区域；和4)GFP基因。结果(图2)显示出除了由GFP基因制备的探针外所有探针都与7390bpDNA条带杂交。左翼探针与由GFP和右翼DNA序列制得探针确认的DNA条带杂交。由PK结构域序列制得的探针不能与两个DNA片段中的任何一个杂交，说明PK结构域已经完全从FusOn-H2基因组中删除。
Western印迹杂交
为进一步确认FusOn-H2基因组中经修饰ICP10基因的正确性，从感染了FusOn-H2或亲本野生型HSV-2的Vero细胞，或从转染了pSZ-EGFP质粒DNA的细胞中提取蛋白。该蛋白由12％的SDS-PAGE凝胶分离并转移至Hybond-C膜上。该膜用抗GFP的单克隆抗体(Anti-GFP#Ab290,ABCAMInc.,Cambridge,MA)进行印迹反应。该抗GFP抗体识别转染了pSZ-EGFP的细胞表达的较小GFP蛋白(约28KD)。同样的抗体也识别显著较大的蛋白条带(融合蛋白的大小预期为约120KD)。然而，该抗体不能与任何源自感染了野生型HSV-2的细胞的蛋白产物发生反应，证明了该抗体的特异性。这些结果进一步确认了GFP基因已正确地与FusOn-H2基因组中ICP10基因的剩余RR结构域融合。
实施例3
FusOn-H2的体外表型表征
为了确定FusOn-H2的表型，本发明者用FusOn-H2或野生型HSV-2感染Vero细胞，或保持细胞不受感染。感染后24小时后，在感染了FusOn-H2的细胞单层中可见清晰的合胞体形成。在未感染细胞或感染了野生型HSV-2的细胞中未见到合胞体。在不同组织来源的人肿瘤细胞中也观察到类似的合胞体形成。在一些肿瘤细胞中，野生型HSV-2的感染也诱导一些合胞体形成。然而，FusOn-H2在这些细胞中诱导的合胞体形成通常明显更加显著。因此在这种情况下，与亲本野生型HSV-2相比，FusOn-H2具有增强的膜融合活性。这些结果表明FusOn-H2从表型上区别于亲本病毒，因为它的感染诱导广泛的合胞体形成或增强肿瘤细胞中合胞体形成的强度。PK结构域和完整的ICP10基因以前均未被报道过与细胞膜融合有任何功能性联系(Smithetal.,(1998)J.Virol.72(11):9131-9141；Smithetal.,(1994)Virol.200(2):598-612；Smithetal.,(1992)J.Gen.Virol.73(pt6):1417-1428)。在一些实施方案中，加入GFP基因和/或用强CMV启动子取代ICP10的天然启动子有助于这种病毒表型的改变。FusOn-H2的膜融合表型对于应用溶瘤目的非常重要，因为例如，已显示由I型溶瘤HSV诱导的合胞体形成显著增强病毒对人肿瘤细胞的杀伤能力(2003年3月26日提交的美国专利申请第10/397635号)。
实施例4
FusOn-H2在周期和非周期细胞中的生长曲线
为确定FusOn-H2在分裂(肿瘤)细胞中选择性复制的性质，本发明者用野生型HSV-2或FusOn-H2感染Vero细胞，该细胞培养在含10％胎牛血清(FBS)的培养基中(细胞因此处于完全周期状态)或培养在不含FBS的培养基中(细胞处于非周期状态)。感染后于不同的时间点收集病毒，并用Vero细胞滴定。当细胞处于非周期状态时，野生型病毒的生长仅受到微弱影响(不到2倍)。相反，与得自周期状态细胞中的病毒产量相比，FusOn-H2在非周期细胞中的生长显著降低(40倍以上)。这些结果(图5)说明，虽然FusOn-H2在肿瘤细胞中具有完全复制能力，但在通常代表身体中正常体细胞的非周期细胞中具有最小的复制能力，因此提供了FusOn-H2在肿瘤细胞中选择性复制的能力。
实施例5
FusOn-H2对人肿瘤细胞的体外杀伤测定
下面，本发明者直接比较了FusOn-H2和其亲本野生型HSV-2或由I型HSV构建的溶瘤病毒(HSV-1)的体外溶瘤作用。代表性的人卵巢癌细胞系Skov-3或人乳腺癌细胞系MDA-MB-435以每细胞0.01或0.1pfu的剂量感染病毒，细胞的生存能力由乳酸脱氢酶(LDH)比色法确定，如在感染后24或48小时后进行。结果(图6)证明了在所检测的溶瘤HSV中，FusOn-H2对两种人肿瘤细胞系均具有最强的杀伤能力。由于其诱导肿瘤细胞中合胞体形成的能力，它的杀伤能力甚至显著地高于其亲本野生型病毒。
实施例6
FusOn-H2的体内治疗评价
在体内条件下表征代表性的FusOn-H2病毒。
抗人乳腺癌异种移植物
为评价FusOn-H2的体内抗肿瘤作用，本发明者以非常中等的剂量(1x106pfu)将病毒直接注射到已建立的人乳腺癌异种移植物(直径约5-8mm)中(来自人乳腺脂肪垫的MDA-MB-435细胞的植入)。出于比较的目的，本发明者包括了源自HSV-1的溶瘤HSV(Baco-1)，使用与FusOn-H2相同的剂量；Baco-1在2003年3月26日申请的美国专利申请第10/397635号中有所描述。肿瘤的大小在4周中每周测量一次。与PBS对照相比，单次注射任一种病毒对肿瘤生长都具有立即的效果(图7)。病毒注射一周内，用任一种溶瘤病毒处理的小鼠体内的肿瘤要显著小于注射了PBS的肿瘤(P<0.001)。然而在2周至4周的时候，FusOn-H2产生了比Baco-1显著更强的抗肿瘤作用(P<0.01)。在给予FusOn-H2后两周后，所有的动物(全部8只)均无肿瘤。相反，注射Baco-1的组中仅有两只小鼠无肿瘤。在其它的6只小鼠中，开始时缩小的肿瘤在病毒注射后3周后开始重新生长。这些结果说明FusOn-H2是有效的抗人乳腺癌的抗肿瘤试剂并且比由HSV-1构建的融合性溶瘤HSV显著更加有效。
抗人卵巢癌异种移植物
卵巢癌的腹膜入侵是普遍而严重的临床问题。据报道约70％的晚期卵巢癌患者在腹膜腔内都存在转移性病变。因此，例如，本发明者选择了腹膜转移模型(异种移植的Skov-3细胞)作为检验FusOn-H2抗人卵巢癌效力的手段。新鲜收集的Skov-3细胞以每只小鼠3x106细胞的剂量接种到裸鼠的腹膜腔内。两周后，在远离肿瘤植入处的位置，小鼠接受3x106pfu的Baco-1、FusOn-H2、或PBS(对照)的单次腹膜(i.p.)注射。一周后重复这种治疗注射。在最初治疗注射4周后，小鼠被处以安乐死，并评估腹腔内肿瘤的生长情况。在用PBS或Baco-1处理的组中，出现清晰的肿瘤腹膜内分散，如在这些处理组的每只动物中都发现遍布腹腔的多个肿瘤节结所显示的(图8和表1)。
表1：人卵巢癌异种移植物的溶瘤治疗后腹腔内肿瘤结节的数量和重量。
与提供一定治疗建立的卵巢癌的作用的PBS、Baco-1处理相比，1只小鼠完全无肿瘤，1只具有显著减少的肿瘤结节(仅发现一个肿瘤结节)。然而，FusOn-H2的治疗作用明显更加显著。FusOn-H2处理组中8只小鼠中的7只在实验结束时完全无肿瘤(图8和表1)。仅1只没有免于肿瘤的小鼠具有1个远小于Baco-1或PBS处理的小鼠体内的肿瘤结节的肿瘤结节。这些结果清楚地证明了FusOn-H2在治疗建立在相对较大的腔内的人实体瘤方面也是非常有效的，甚至当以非常中等的剂量给予病毒时。
实施例7
FusOn-H2的体内毒性评价
作为FusOn-H2毒性评价的第一步，本发明者以5x106pfu的剂量将野生型HSV-1、HSV-2或FusOn-H2皮下注射到C57/black小鼠中(N＝5)。给予病毒后5天，在接受野生型HSV-1的组中，5只小鼠中的4只死亡。在接受野生型HSV-2的组中，1只小鼠死亡。然而，注射了FusOn-H2的组中没有小鼠死亡。这些结果说明，虽然FusOn-H2对杀死肿瘤细胞非常有效，但是对于受体宿主，其比野生型HSV具有显著更小的毒性，且在具体实施方案中，其临床应用是安全的。
实施例8
FusOn-H2诱导凋亡的能力
如本发明所述，本实施例显示经修饰的HSV-2病毒(FusOn-H2)能够在受感染和旁观肿瘤细胞中有效地诱导凋亡，提供了另外的肿瘤破坏机制。
非洲绿猴肾(Vero)细胞，SW403和SW480细胞(人结肠癌细胞系)，和A549细胞(人肺癌细胞系)从美国典型培养物保藏中心(Rockville,MD)得到。EC9706，一种人食道癌细胞系由Dr.MingrongWang(中国医学科学院)提供。SKOV3细胞，一种人卵巢癌细胞系由Dr.RobertBast(M.D.AndersonCancerCenter)提供。U20S细胞，一种人骨肉瘤细胞系由Dr.LawrenceDonehower提供。所有的细胞均在含10％胎牛血清(FBS)的DMEM中培养。
FusOn-H2从野生型HSV-2病毒株186(wt186)衍生而来，它的构建在实施例1中已述。Baco-1，一种基于HSV-1的溶瘤病毒，其构建在美国专利申请第10/397635号中已述。病毒原种通过用每细胞0.01空斑形成单位(pfu)感染Vero细胞而制备。2天后收集病毒并按(Nakamorietal.,(2003)ClinicalCancerRes.9(7):2727-2733)所述进行纯化。纯化后的病毒进行滴定、分装并储存于-80℃备用。
病毒生长表征
细胞以3个重复以50％的密度接种在24孔板中。第二天，用病毒以每细胞1pfu的剂量感染细胞1小时。用PBS洗涤细胞一次以去除未吸收和未内化的病毒，然后加入新鲜培养基。感染后24小时收集细胞。通过反复冻融和超声释放病毒。病毒滴度通过对Vero细胞进行空斑检测而确定。
被感染细胞的Hochest染料染色和染色质浓缩定量
接种于24孔板中的细胞在第二天以每细胞10pfu感染FusOn-H2、wt186或Baco-1，或模拟感染。感染后24小时后，细胞用终浓度为1μg/ml的Hochest染料33358(Sigma-Aldrich,MO)在37℃染色30分钟，然后在荧光显微镜下拍摄显微照片。
DNA梯测定
以70％的密度在6孔板中接种细胞。第二天，用病毒以每细胞10pfu的剂量感染细胞。感染病毒后24小时后，收集细胞，用DNAzol试剂(Invitrogen,CA)从细胞中提取DNA。所提取的DNA用RNA酶(100μg/ml)处理，然后再用苯酚：氯仿混合物抽提，并用乙醇沉淀。然后将DNA上样至1％的琼脂糖凝胶进行电泳，经溴化乙锭染色后在紫外灯下观察。
EGFP的表达对应染色质浓缩
接种于12孔板中的细胞在第二天以每细胞1pfu的剂量感染FusOn-H2。如上所述进行染色质浓缩的Hochest染料染色。使用SpotImageSofhvare(DiagnosticInstrument,Inc,IL)进行来自同一视野不同荧光的显微图像的叠加。在同一视野分别计算GFP阳性和GFP阴性的凋亡细胞。每一视野中计算约100个凋亡细胞。总共计算三个视野以证明由感染FusOn-H2的细胞引起的旁观作用。
末端脱氧核苷酸转移酶介导的切口末端标记(Tunel)测定
雌性Hsd无胸腺(nu/nu)小鼠(从Harlan,Indianapolis,Indiana得到)饲养在特定无病原体条件下，并当它们达到5-6周年龄时用于实验。通过0.25％胰蛋白酶和0.05％EDTA的短时处理从亚融合培养物中收集EC9706细胞。在用含10％FBS的培养基终止胰蛋白酶消化后，用无血清培养基洗涤细胞一次并重悬于PBS中。在第0天，将0.5x106EC9706细胞接种于裸鼠的右侧胁腹。肿瘤细胞植入2周后，当肿瘤直径达到约5mm时，小鼠接受单次肿瘤内注射100μl的含3x106pfu的FusOn-H2或Baco-1，或同样体积的PBS。每周测量肿瘤并通过公式确定其体积：肿瘤体积[mm3]＝(长[mm]x宽[mm])2x0.52。对于Tunel测定，在肿瘤内注射1x107pfu的FusOn-H2病毒或Baco-1病毒后3天，小鼠通过暴露于CO2被安乐死。从体内取出肿瘤组织并切片以进行Tunel染色。
FusOn-H2在不同组织来源的人肿瘤细胞中诱导凋亡
由于某些HSV-2基因产物的抗凋亡活性，感染HSV-2并不能常规地诱导凋亡，除非病毒蛋白合成被翻译抑制剂如放线菌酮所阻断(Aubertetal.,(1999)JVirol73(12):10359-70)。HSV-2的ICP10基因的PK结构域已被确认为具有抗凋亡功能的病毒基因产物之一，已报道了将其从病毒基因组中删除使病毒具有诱导某些类型体细胞凋亡的能力(Perkins,etal.,(2002)JVirol76(3):1435-49)。
为了确定FusOn-H2是否诱导肿瘤细胞凋亡，我们用病毒以m.o.i.10感染了一组不同组织来源的人肿瘤细胞。包括从HSV-1衍生的溶瘤病毒Baco-1作为对照。在肿瘤细胞中，EC9706是人食道癌细胞系，SKOV3是人卵巢癌细胞系以及SW403和SW480是人结肠癌细胞系。在6孔板中接种细胞并在第二天感染病毒。感染后24小时后，用Hochest染料33358对细胞进行染色。用FusOn-H2感染肿瘤细胞诱导了广泛的染色质浓缩，意味着发生凋亡。通过在FusOn-H2感染细胞中出现强烈而紧密的蓝色核染色，此点很明显。总体上，超过80％的感染了FusOn-H2的肿瘤细胞显示出染色质浓缩。未受感染的肿瘤细胞显示出非常少的凋亡特点或没有凋亡特点。用亲本野生型HSV-2(wt186)或Baco-1感染这些肿瘤细胞没有显著增加代表染色质浓缩的蓝色荧光染色的背景水平。
为了进一步验证FusOn-H2在肿瘤细胞中诱导凋亡的能力，进行了DNA断裂分析。在前面实验中使用的三种肿瘤细胞以每细胞10pfu感染病毒或进行模拟感染。感染后24小时后，收集细胞。从细胞中提取DNA并在1％琼脂糖凝胶中分离。在加载感染了FusOn-H2的样品孔道中存在明显的阶梯。而在加载来自感染了wt186或Baco-1细胞的DNA样品的孔道中没有发现这种阶梯，因此证实了上面呈现的染色质浓缩的结果。综上，这些结果证明了感染FusOn-H2在这些人肿瘤细胞中有效地诱导凋亡，而亲本野生型HSV-2或基于HSV-1的溶瘤病毒都不具有这样的性质。
感染FusOn-H2还诱导旁观细胞凋亡
由于FusOn-H2携带编码增强的绿色荧光蛋白的基因，其传染力可很容易地在荧光显微镜下确定。在染色质浓缩和传染力的荧光检测的相互交换中，我们注意到在显示蓝色荧光染色质浓缩的细胞比例和显示GFP染色的细胞比例之间存在明显差异。当逐一清点显示染色质浓缩和GFP表达的细胞的绝对数量时，比率约为2.6:1。这个结果说明了FusOn-H2感染对周围肿瘤细胞的显著的旁观者凋亡作用。
FusOn-H2诱导的凋亡加速肿瘤细胞的死亡并损害肿瘤细胞中的病毒复制
还注意到，关于细胞显示细胞病变效应(CPE)的时间，在感染了FusOn-H2和源于HSV-1的溶瘤病毒的肿瘤细胞之间存在明显差异。以每细胞1pfu的剂量感染FusOn-H2的肿瘤细胞通常在24小时内显示完全CPE，而以同样剂量感染Baco-1的肿瘤细胞看起来形态上相当正常。它们通常在感染后72小时以上才显示出CPE的明显迹象。在感染后24小时可以很容易地在感染了FusOn-H2的孔中看出典型的CPE，包括细胞变圆和彼此分离，而感染了Baco-1的细胞甚至在感染后48小时看起来基本上像是模拟感染的细胞。这些结果说明由FusOn-H2诱导的凋亡式细胞死亡在病毒感染后会立即发生，而病毒的溶瘤作用则需要显著更长的时间才能发生。
凋亡式肿瘤细胞死亡是重要的病毒体内抗肿瘤机制
评价了FusOn-H2抗从在之前实验中使用的肿瘤细胞之一建立的肿瘤异种移植物的体内抗肿瘤活性。本实验中包括Baco-1以便将这两种病毒的治疗作用直接进行比较。通过皮下注射5x106新鲜收集的EC9706细胞在右侧胁腹内建立肿瘤异种移植物。当肿瘤直径达到约5mm时，小鼠接受3x106pfu剂量的任一病毒(FusOn-H2或Baco-1)或作为对照的PBS的单次肿瘤内注射。在6周内定期测量肿瘤，肿瘤生长率通过用治疗前的肿瘤体积除以治疗后不同时间点测得的肿瘤体积而确定。FusOn-H2的治疗性给药在一周内就基本上阻止了肿瘤的生长。然后肿瘤开始萎缩，到实验结束时，平均肿瘤大小仅约为病毒治疗前的一半，并且一半以上的小鼠完全无肿瘤。当与对照PBS比较时，Baco-1的给药直到第3周才显示出治疗作用。然而，似乎肿瘤萎缩仅是暂时的，因为第35天时肿瘤又开始生长。总的说来，FusOn-H2的治疗作用在所有评价的时间点均显著强于Baco-1(p<0.05)，尽管由于凋亡的诱导FusOn-H2在这些肿瘤细胞中的复制有限。这些结果说明由FusOn-H2诱导的凋亡及伴随的旁观效应很可能是此体内研究中的主要抗肿瘤机制。
实施例9
FusOn-H2引起的肿瘤破坏诱导有效的抗肿瘤免疫
FusOn-H2的抗肿瘤活性用两个同系肿瘤模型评价：鼠乳腺肿瘤(4T1细胞)和鼠成神经细胞瘤((Neuro2A细胞)。在这两种情况中，FusOn-H2均产生了伴随有强烈肿瘤特异性免疫应答的统计学上显著的抗肿瘤作用。以下呈现的是乳腺肿瘤模型研究中的典型数据。
4T1细胞被用于此评价，该细胞在同系BALB/c小鼠中是非免疫原性的、高度恶性和高转移性的(AslaksonandMiller(1992)CancerRes52(6):1399-405；PulaskiandOstrand-Rosenberg(1998)CancerRes.58(7):1486-93)。将4T1细胞(1x105)同位注射到具有免疫能力的BALB/c小鼠的乳腺脂肪垫中以建立同位肿瘤。小鼠被放置10天，之后在该组中的90％以上检测到肺转移。长有肿瘤的小鼠被分为3组(每组n＝10)，然后肿瘤内注射1x107pfu的FusOn-H2或衍生自HSV-1的其它溶瘤HSVs，包括之前显示在该模型中诱导有效的抗肿瘤免疫的双重融合性Synco-2D(Naltamori,Fuetal.,(2004)Mol.Ther.9(5):658-665)。2周内每周一次测量同位肿瘤的重量，之后小鼠被处死用于免疫学检测及肺转移评价(用Indianink浸泡后在解剖显微镜下计数)。对于免疫学检测，脾细胞由外植的脾中得到，并用经辐照的4T1细胞体外刺激5天，然后用于以下检测：1)通过51Cr释放测定检测肿瘤特异性CTL活性(用4T1细胞或同系肉瘤细胞系Meth-A作为靶细胞)；2)小鼠IFNγ分泌细胞的Elispot分析，使用购自BDBiosciences的检测试剂盒；3)细胞因子分泌的定量(针对干扰素γ和IL-10)。结果显示局部肿瘤内给予FusOn-H2产生了比其它病毒显著更好的治疗效果，这不仅针对同位肿瘤而且还针对远处的肺转移。与Baco-1相比，Synco-2D可以抑制同位和转移瘤的生长，该结果类似于我们之前的观察(Nakamori,Fuetal.,(2004)Mol.Ther.9(5):658-665)。然而，对于治疗这种肿瘤，显然FusOn-H2比Synco-2D甚至更加有效。由FusOn-H2诱导的伴随的抗肿瘤免疫应答，包括瘤特异性CTL活性和频率以及细胞因子释放，也比Synco-2D更加显著，说明其有助于消除局部和转移瘤。
实施例10
用于确定病毒滴度的空斑形成测定
在制备好病毒原种后，使用之前所述的空斑形成测定确定病毒滴度(见LanczGJ.(1974).ArchVirol.,46,36-43)。Vero细胞经胰蛋白酶消化、计数，并以每孔4x105细胞接种于6孔板中，并在37℃、5％CO2和90％湿度下孵育并培养24小时。第二天，病毒在基本必需培养基(MEM)中按1:10系列稀释，得到10-3至10-86个浓度。从孔中吸出培养基，并在每个孔中加入0.5ml病毒稀释液，做三个重复。然后将板孵育1小时，并每15分钟摇动一次。孵育期后，吸出病毒溶液，在每个孔中加入2ml含1％琼脂糖的MEM，将该板孵育3天，之后，细胞用含0.1％结晶紫和20％乙醇的溶液进行染色。孵育30分钟后，吸出染色液，用立体显微镜在10倍放大倍率下计数空斑。然后病毒滴度用每毫升空斑形成单位表示。

Claims (8)

1.产生具有溶瘤和融合性质的II型单纯疱疹病毒的方法，包括步骤：
a)修饰ICP10多聚核苷酸，其中该经修饰的ICP10多聚核苷酸编码在蛋白激酶结构域含有氨基酸1至402缺失的ICP10多肽，
b)将所述经修饰的ICP10多聚核苷酸与组成型启动子可操作地连接。
2.包含具有溶瘤和融合性质的II型单纯疱疹病毒的组合物，其中所述II型单纯疱疹病毒包含经修饰的ICP10多聚核苷酸，所述经修饰的ICP10多聚核苷酸编码在蛋白激酶结构域含有氨基酸1至402缺失的ICP10多肽，并且其中所述经修饰的ICP10多聚核苷酸与组成型启动子可操作地连接。
3.如权利要求2所述的组合物，其中所述II型单纯疱疹病毒还包含插入到ICP10基因的剩余蛋白激酶活性结构域中的编码融合性膜糖蛋白的多聚核苷酸，并且其中所述融合性膜糖蛋白选自长臂猿白血病病毒包膜融合性膜糖蛋白、长臂猿白血病病毒包膜糖蛋白的C末端截短形式、鼠白血病病毒包膜蛋白、缺乏胞质结构域的逆转录病毒包膜蛋白、麻疹病毒融合蛋白、HIVgp160蛋白、SIVgp160、逆转录病毒Env蛋白、埃博拉病毒Gp和流感病毒血凝素。
4.如权利要求2所述的组合物，其中所述II型单纯疱疹病毒包含插入到ICP10基因的剩余蛋白激酶活性结构域中的多聚核苷酸，所述多聚核苷酸编码选自绿色荧光蛋白、β半乳糖苷酶、荧光素酶和单纯疱疹病毒胸苷激酶的报道蛋白。
5.如权利要求2所述的组合物，其中所述II型单纯疱疹病毒包含插入到ICP10基因的剩余蛋白激酶活性结构域中的多聚核苷酸，所述多聚核苷酸编码选自肿瘤坏死因子、干扰素α、干扰素β、干扰素γ、白介素2、白介素12、GM-CSF、F42K、MIP-1、MIP-1β和MCP-1的免疫调节基因。
6.如权利要求2所述的组合物，其中所述II型单纯疱疹病毒还包含插入到ICP10基因的剩余蛋白激酶活性结构域中的治疗性多聚核苷酸，其中所述治疗性多聚核苷酸选自单纯疱疹病毒胸苷激酶、胞嘧啶脱氨酶和半胱天冬酶3。
7.如权利要求2所述的组合物，其中所述组成型启动子为即早期巨细胞病毒启动子。
8.包含溶瘤和融合性质的II型单纯疱疹病毒载体的组合物，所述载体包含编码在蛋白激酶结构域含有氨基酸1至402缺失的ICP10多肽的经修饰的ICP10多聚核苷酸，其中所述经修饰的多聚核苷酸与组成型启动子可操作地连接。
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