CN108064282A - 腺苷脱氨酶-2(ada2)、其变体的组合物及使用其的方法 - Google Patents

腺苷脱氨酶-2(ada2)、其变体的组合物及使用其的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了变体腺苷脱氨酶2(ADA2)蛋白。本发明还提供了含有ADA2蛋白或缀合物的ADA2缀合物和组合物。本发明还提供了ADA2蛋白或缀合物治疗疾病和状况如肿瘤或癌症的方法和应用，特别是治疗与升高的腺苷或其它相关标志物相关的任何疾病或状况。

Description

腺苷脱氨酶-2(ADA2)、其变体的组合物及使用其的方法
相关申请
要求Christopher Thanos,Lin Wang和H.Michael Shepard于2014年10月14日提交的题为“COMPOSITIONS OF ADENOSINE DEAMINASE-2(ADA2),VARIANTS THEREOF ANDMETHODS OF USING SAME”美国临时申请系列号62/063,936的优先权。允许时，这个申请的主题以其全文并入本文参考。
电子提交的序列表并入参考
在此提交序列表的电子形式，其内容以全文并入参考。电子文件于2015年10月14日创建，大小为3,177千字节，题目为3121seqPC1.txt。
发明领域
本发明提供了变体腺苷脱氨酶2(ADA2)蛋白。本发明还提供了ADA2缀合物及含有ADA2蛋白或ADA2缀合物的组合物。本发明还提供了ADA2蛋白或缀合物治疗如肿瘤或癌症等疾病和状况、特别是与升高的腺苷或其它相关标志物相关的的任何疾病或状况的方法和应用。
发明背景
腺苷是熟知的免疫功能效应物。在T细胞中，腺苷降低T细胞受体诱导的NF-Kb的激活并抑制IL-2、IL-4和IFN-γ。腺苷降低T细胞细胞毒性、增加T细胞失能及增加T细胞分化为Fop3+或Lag-3+调节性(T-reg)T细胞。对于NK细胞，已知腺苷降低IFN-γ产生并抑制NK细胞细胞毒性。已知腺苷阻断中性粒细胞附着和溢出、降低细胞吞噬作用及减弱超氧化物和氧化氮的水平。腺苷还降低TNF-α、IL-12和MIP-1α在巨噬细胞上的表达，减弱MHC II类分子表达及增加IL-10和IL-6的水平。此外，腺苷降低巨噬细胞上吞噬作用和超氧化物和氧化氮水平。通过这些免疫相关的活性及其它活性，腺苷的异常或累积水平与许多疾病和状况相关，包括其中腺苷介导的免疫抑制作用起作用的那些。因此，仍存在治疗这种疾病或状况的需要。
发明概述
本发明提供了变体腺苷脱氨酶2(ADA2)蛋白或其催化活性部分，其在未修饰的ADA2蛋白或其催化活性部分的氨基酸序列中含有一或多个修饰。在一些实施方案中，未修饰的ADA2蛋白可包含SEQ ID NO:5所示氨基酸序列，或者与SEQ ID NO:5所示氨基酸序列呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列，或者是其催化活性部分；所述氨基酸修饰选自氨基酸置换、缺失和插入；及当是二聚体形式时，变体ADA2与未修饰的ADA2蛋白的相应二聚体形式相比可以呈现出选自如下的一或多种性质：增加的腺苷脱氨酶活性，降低的肝素结合，较长的血清半衰期，改变的pH最佳值，增加的热稳定性，改变的受体结合和高糖基化。本发明提供了多种氨基酸修饰，包括置换、缺失和插入。应理解可以组合赋予特定活性或性质的独立的修饰；因为在蛋白质中突变或修饰的作用一般是累加的。本发明提供的含有修饰包括置换、缺失和插入的任何变体ADA2或其催化活性部分及编码变体ADA2或其催化活性部分的核酸可以用于本发明提供的任何方法、组合物、缀合物、修饰形式、载体、细胞、组合、应用和应用组合物及应用组合。
在一些实施方案中，当是二聚体形式时，变体ADA2蛋白或其催化活性部分呈现出增加的腺苷脱氨酶活性或者增加的腺苷脱氨酶活性及降低的肝素结合。
在一些实施方案中，未修饰的ADA2蛋白是同源二聚体，单体形式包含SEQ ID NO:5所示氨基酸残基序列。在一些实施方案中，变体ADA2是如本发明提供的变体ADA2蛋白的催化活性部分，其中未修饰的ADA2蛋白是其序列如SEQ ID NO:5所示的多肽的相应催化活性部分的同源二聚体，其中相应部分通过比对确定。
在一些实施方案中，ADA2蛋白或其催化活性部分不含有选自相应于如下的氨基酸置换的修饰：H7R、G18A、G18R、G18V、I64T、A80D、H83Q、V90A、C108G、A120V、H121R、W133G、R125C、R140Q、K141R、R142W、P164L、P222L、W235S、H306R、E330G、W333G、V365L、Y424C、F464S或者相应于R8-K14del→--的缺失，编号参照SEQ ID NO:5所示氨基酸残基。
在一些实施方案中，未修饰的ADA2蛋白可包含与SEQ ID NO:5所示氨基酸序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列相同性的氨基酸序列或者是其催化活性部分。例如，未修饰的ADA2蛋白与SEQ ID NO:5所示氨基酸序列或者与其相应催化活性部分具有至少95％序列相同性。例如，未修饰的ADA2蛋白包含SEQ ID NO:5、326-334、340、375或380-383任一所示氨基酸序列或者是其催化活性部分，或者未修饰的ADA2蛋白具有SEQ ID NO:5、326-334、340、375和380-383任一所示氨基酸序列或者是其催化活性部分。在特别的实施方案中，未修饰的ADA2蛋白包含SEQ ID NO:5所示氨基酸序列或者是其催化活性部分。
在一些实施方案中，ADA2蛋白的催化活性部分可以是缺少全部或部分推定的受体结合(PRB)结构域的ADA2蛋白。例如，ADA2蛋白的催化活性部分可包含SEQ ID NO:548-550所示氨基酸序列。在一些实施方案中，未修饰的ADA2蛋白的催化活性部分具有SEQ ID NO:5所示蛋白质的残基77-473所示序列。
在一些实施方案中，变体ADA2蛋白与未修饰的ADA2蛋白相比可包含多达1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70个或者更多个氨基酸修饰。在一些实施方案中，变体ADA2蛋白包含多达2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸修饰。在一些实施方案中，变体ADA2蛋白不含有SEQ ID NO:1、5、68、286-302、326-342或374-383任一所示氨基酸序列或其催化活性部分。在一些实施方案中，ADA2蛋白变体的一级氨基酸序列不是SEQ ID NO:1、5、68、286-302、326-342或374-383任一所示氨基酸序列。
在一些实施方案中，当是二聚体形式时，变体ADA2蛋白呈现出将腺苷转变为肌苷的腺苷脱氨酶活性。在一些实施方案中，当是二聚体形式时，变体ADA2蛋白可以呈现出至少或至少大约5×103M-1s-1、6×103M-1s-1、7×103M-1s-1、8×103M-1s-1、9×103M-1s-1、1×104M-1s-1、2×104M-1s-1、3×104M-1s-1、4×104M-1s-1、5×104M-1s-1、6×104M-1s-1、7×104M-1s-1、8×104M-1s-1、9×104M-1s-1、1×105M-1s-1、2×105M-1s-1、3×105M-1s-1、4×105M-1s-1、5×105M-1s-1或者更高的催化效率(kcat/KM)。
在一些实施方案中，当是二聚体形式时，变体ADA2蛋白可以呈现出解链温度(Tm)为至少58℃的热稳定性。例如，ADA2蛋白的Tm是至少59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、68℃、69℃、70℃、71℃、72℃或更高。
在一些实施方案中，变体ADA2蛋白可含有是氨基酸置换的修饰；并且参照SEQ IDNO:5所示氨基酸位置，变体ADA2蛋白在相应于氨基酸残基11、13、20、22、26、86、179、217、219、221、258、262、264、266、267、277、283、296、309、317、321、352、366、371、372、373、374、403、404、405、406、441、444、452、461、469或470的氨基酸位置包含一或多个氨基酸置换。例如，参照SEQ ID NO:5所示氨基酸位置，所述一或多个氨基酸置换是在相应于氨基酸残基11、20、219、221、262、264、366、371、372或452的位置。在一些实施方案中，参照SEQ ID NO:5所示氨基酸位置，变体ADA2蛋白可包含选自如下的一或多个氨基酸置换：K11A、K11D、K11E、K13A、K13D、K13E、R20A、R20D、R20E、R20N、V22S、K26A、K26D、K26E、D86A、D86C、D86E、D86F、D86G、D86H、D86I、D86K、D86L、D86M、D86N、D86P、D86Q、D86R、D86S、D86T、D86V、D86W、D86Y、E179A、E179C、E179D、E179F、E179G、E179H、E179I、E179K、E179L、E179M、E179N、E179P、E179Q、E179R、E179S、E179T、E179V、E179W、E179Y、R217A、R217D、R217E、R219A、R219C、R219D、R219E、R219F、R219G、R219H、R219I、R219K、R219L、R219M、R219N、R219P、R219Q、R219S、R219T、R219V、R219W、R219Y、L221A、L221C、L221D、L221E、L221F、L221G、L221H、L221I、L221K、L221M、L221N、L221P、L221Q、L221R、L221S、L221T、L221V、L221W、L221Y、K258A、K258D、K258E、S262A、S262C、S262D、S262E、S262F、S262G、S262H、S262I、S262K、S262L、S262M、S262N、S262P、S262Q、S262R、S262T、S262V、S262W、S262Y、H264A、H264C、H264D、H264E、H264F、H264G、H264I、H264K、H264L、H264M、H264N、H264P、H264Q、H264R、H264S、H264T、H264V、H264W、H264Y、S266A、S266C、S266D、S266E、S266F、S266G、S266H、S266I、S266K、S266L、S266M、S266N、S266P、S266Q、S266R、S266T、S266V、S266W、S266Y、K267A、K267C、K267D、K267E、K267F、K267G、K267H、K267I、K267L、K267M、K267N、K267P、K267Q、K267R、K267S、K267T、K267V、K267W、K267Y、R277A、R277D、R277E、R283A、R283D、R283E、V296A、V296C、V296D、V296E、V296F、V296G、V296H、V296I、V296K、V296L、V296M、V296N、V296P、V296Q、V296R、V296S、V296T、V296W、V296Y、K309A、K309D、K309E、K317A、K317D、K317E、K321A、K321D、K321E、R352A、R352D、R352E、R366A、R366D、R366E、K371A、K371D、K371E、K371N、K372A、K372D、K372E、K372N、D373S、I374S、T403N、G404N、H405S、P406S、R441A、R441D、R441E、K444A、K444D、K444E、K452A、K452D、K452E、K461A、K461D、K461E、K469A、K469D、K469E、K470A、K470D、K470E。例如，变体ADA2蛋白含有选自相应于如下的置换的一或多个氨基酸置换：H264A、H264Q、H264N、H264G、R219K、R219Q、R219N、R219A、L221A、L221V、L221G、E179D、E179A、E179S、E179T、E179V、E179G、S262A、S262V、S262M、S262N、D86A、D86C、D86E、D86F、D86G、D86H、D86I、D86K、D86L、D86M、D86N、D86P、D86Q、D86R、D86S、D86T、D86V、D86W、D86Y、E179C、E179F、E179H、E179I、E179K、E179L、E179M、E179N、E179P、E179Q、E179R、E179W、E179Y、R219C、R219D、R219E、R219F、R219G、R219H、R219I、R219L、R219M、R219P、R219S、R219T、R219V、R219W、R219Y、L221C、L221D、L221E、L221F、L221H、L221I、L221K、L221M、L221N、L221P、L221Q、L221R、L221S、L221T、L221W、L221Y、S262C、S262D、S262E、S262F、S262G、S262H、S262I、S262K、S262L、S262P、S262Q、S262R、S262T、S262W、S262Y、H264C、H264D、H264E、H264F、H264I、H264K、H264L、H264M、H264P、H264R、H264S、H264T、H264V、H264W、H264Y、S266A、S266C、S266D、S266E、S266F、S266G、S266H、S266I、S266K、S266L、S266M、S266N、S266P、S266Q、S266R、S266T、S266V、S266W、S266Y、K267A、K267C、K267D、K267E、K267F、K267G、K267H、K267I、K267L、K267M、K267N、K267P、K267Q、K267R、K267S、K267T、K267V、K267W、K267Y、V296A、V296C、V296D、V296E、V296F、V296G、V296H、V296I、V296K、V296L、V296M、V296N、V296P、V296Q、V296R、V296S、V296T、V296W和V296Y。
在一些实施方案中，参照SEQ ID NO:5所示氨基酸位置，变体ADA2蛋白在相应于氨基酸残基219和262的一或这两个位置含有氨基酸置换。例如，变体ADA2蛋白或其催化活性部分含有相应于S262N或S262Q的置换。在一些实施方案中，变体ADA2含有相应于S262N的置换。在一些实施方案中，变体ADA2含有相应于R219K、R219Q、R219N或R219A的置换。在其它实施方案中，变体ADA2含有相应于R219Q的置换或者R219Q/R20E置换。在其它实施方案中，变体ADA2含有相应于R219Q/S262N的置换。例如，变体ADA2蛋白或其催化活性部分含有选自如下的任一或多个修饰：R219Q/S262N/--→N1/--→A2/--→S3、R219Q/S262N/R20N/V22S、R219Q/S262N/K371N/D373S、R219Q/S262N/K372N/I374S、R219Q/S262N/T403N/H405S、R219Q/S262N/G404N/P406S、R219Q/S262N/C105-T147del→(Gly)15、R219Q/S262N/C105-T147del→(Gly)10、R219Q/S262N/C105-T147del→(Gly)7、R219Q/S262N/C105-T147del→(Gly)5、R219Q/S262N/C105-T147del→(Gly)3、R219Q/S262N/R125N/P126A、R219Q/S262N/S127N/K129S、R219Q/S262N/P126N/E128T、R219Q/S262N/R112N/I114T、R219Q/S262N/I134N/L135C/L136T、R219Q/S262N/I134N/L135S/L136T、R219Q/S262N/R142N/Q144S、R219Q/S262N/E137N/Y139T、R219Q/S262N/P111N/G113S、R219Q/S262N/F119S、R219Q/S262N/F119K、R219Q/S262N/Y224R、R219Q/S262N/Y224N、R219Q/S262N/Y191S、R219Q/S262N/Y191D、R219Q/S262N/F183K、R219Q/S262N/Y191D/Y224R、R219Q/S262N/F109S、R219Q/S262N/F109A、R219Q/S262N/R118D、R219Q/S262N/R118A、R219Q/S262N/Y139T、R219Q/S262N/Y139A、R219Q/S262N/W133S、R219Q/S262N/W133T、R219Q/S262N/P124A、R219Q/S262N/P124S、R219Q/S262N/V99-Q144del→(GGGGS)1、R219Q/S262N/V99-Q144del→(GGGGS)2、R219Q/S262N/V99-Q144del→(GGGGS)3、R219Q/S262N/C105-T147del→(GGGGS)1、R219Q/S262N/C105-T147del→(GGGGS)2、R219Q/S262N/C105-T147del→(GGGGS)3、R219Q/S262N/K371D/V99-Q144del→(GGGGS)1、R219Q/S262N/K371D/V99-Q144del→(GGGGS)2、R219Q/S262N/K371D/V99-Q144del→(GGGGS)3、R219Q/S262N/K371D/C105-T147del→(GGGGS)1、R219Q/S262N/K371D/C105-T147del→(GGGGS)2、R219Q/S262N/K371D/C105-T147del→(GGGGS)3、R219Q/S262N/C105-T147del→(Gly)n、R219Q/S262N/K11A、R219Q/S262N/K11D、R219Q/S262N/K11E、R219Q/S262N/K13A、R219Q/S262N/K13D、R219Q/S262N/V99-Q144del→(GGGGS)n、R219Q/S262N/C105-T147del→(GGGGS)n、R219Q/S262N/N98-N156del、R219Q/S262N/C105-E148del、R219Q/S262N/C105-T147del、R219Q/S262N/V99-Q144del、R219Q/S262N/K371D/C105-T147del→(Gly)n、R219Q/S262N/K371D/C105-T147del→(Gly)15、R219Q/S262N/K371D/C105-T147del→(Gly)10、R219Q/S262N/K371D/C105-T147del→(Gly)7、R219Q/S262N/K371D/C105-T147del→(Gly)5、R219Q/S262N/K371D/C105-T147del→(Gly)3、R219Q/S262N/K371D/V99-Q144del→(GGGGS)n、R219Q/S262N/K371D/C105-T147del→(GGGGS)n、R219Q/S262N/K371D/N98-N156del、R219Q/S262N/K371D/C105-E148del、R219Q/S262N/K371D/C105-T147del、R219Q/S262N/K371D/V99-Q144del、R219Q/S262N/K13E、R219Q/S262N/K371A、R219Q/S262N/K372A、R219Q/S262N/K372D、R219Q/S262N/K372E、R219Q/S262N/K452A、R219Q/S262N/K452D、R219Q/S262N/K452E、R219Q/S262N/R20A、R219Q/S262N/R20D、R219Q/S262N/R366A、R219Q/S262N/R366D、R219Q/S262N/R366E、R219Q/S262N/H264A、R219Q/S262N/H264Q、R219Q/S262N/H264N、R219Q/S262N/H264G、R219K/S262N、R219N/S262N、R219A/S262N、R219Q/S262N/L221A、R219Q/S262N/L221V、R219Q/S262N/L221G、R219Q/S262N/E179D、R219Q/S262N/E179A、R219Q/S262N/E179S、R219Q/S262N/E179T、R219Q/S262N/E179V、R219Q/S262N/E179G、R219Q/S262A、R219Q/S262V、R219Q/S262M、R219Q/S262N/K11A/R20A、R219Q/S262N/K11A/R20A/K371A、R219Q/S262N/R20A/K371A、R219Q/S262N/K11A/K371A、R219Q/S262N/K26A、R219Q/S262N/K26D、R219Q/S262N/K26E、R219Q/S262N/R217A、R219Q/S262N/R217D、R219Q/S262N/R217E、R219Q/S262N/K258A、R219Q/S262N/K258D、R219Q/S262N/K258E、R219Q/S262N/R277A、R219Q/S262N/R277D、R219Q/S262N/R277E、R219Q/S262N/R283A、R219Q/S262N/R283D、R219Q/S262N/R283E、R219Q/S262N/K309A、R219Q/S262N/K309D、R219Q/S262N/K309E、R219Q/S262N/K317A、R219Q/S262N/K317D、R219Q/S262N/K317E、R219Q/S262N/K321A、R219Q/S262N/K321D、R219Q/S262N/K321E、R219Q/S262N/R352A、R219Q/S262N/R352D、R219Q/S262N/R352E、R219Q/S262N/R441A、R219Q/S262N/R441D、R219Q/S262N/R441E、R219Q/S262N/K444A、R219Q/S262N/K444D、R219Q/S262N/K444E、R219Q/S262N/K461A、R219Q/S262N/K461D、R219Q/S262N/K461E、R219Q/S262N/K469A、R219Q/S262N/K469D、R219Q/S262N/K469E、R219Q/S262N/K470A、R219Q/S262N/K470D、R219Q/S262N/K470E、R219Q/S262N/D86A、R219Q/S262N/D86C、R219Q/S262N/D86E、R219Q/S262N/D86F、R219Q/S262N/D86G、R219Q/S262N/D86H、R219Q/S262N/D86I、R219Q/S262N/D86K、R219Q/S262N/D86L、R219Q/S262N/D86M、R219Q/S262N/D86N、R219Q/S262N/D86P、R219Q/S262N/D86Q、R219Q/S262N/D86R、R219Q/S262N/D86S、R219Q/S262N/D86T、R219Q/S262N/D86V、R219Q/S262N/D86W、R219Q/S262N/D86Y、R219Q/S262N/E179C、R219Q/S262N/E179F、R219Q/S262N/E179H、R219Q/S262N/E179I、R219Q/S262N/E179K、R219Q/S262N/E179L、R219Q/S262N/E179M、R219Q/S262N/E179N、R219Q/S262N/E179P,、R219Q/S262N/E179Q、R219Q/S262N/E179R、R219Q/S262N/E179W、R219Q/S262N/E179Y、R219C/S262N、R219D/S262N、R219E/S262N、R219F/S262N、R219G/S262N、R219H/S262N、R219I/S262N、R219L/S262N、R219M/S262N、R219P/S262N、R219S/S262N、R219T/S262N、R219V/S262N、R219W/S262N、R219Y/S262N、R219Q/S262N/L221C、R219Q/S262N/L221D、R219Q/S262N/L221E、R219Q/S262N/L221F,R219Q/S262N/L221H,R219Q/S262N/L221I、R219Q/S262N/L221K、R219Q/S262N/L221M、R219Q/S262N/L221N、R219Q/S262N/L221P、R219Q/S262N/L221Q、R219Q/S262N/L221R、R219Q/S262N/L221S、R219Q/S262N/L221T、R219Q/S262N/L221W、R219Q/S262N/L221Y、R219Q/S262C、R219Q/S262D、R219Q/S262E、R219Q/S262F、R219Q/S262G、R219Q/S262H、R219Q/S262I、R219Q/S262K、R219Q/S262L、R219Q/S262P、R219Q/S262Q、R219Q/S262R、R219Q/S262T、R219Q/S262W、R219Q/S262Y、R219Q/S262N/H264C、R219Q/S262N/H264D、R219Q/S262N/H264E、R219Q/S262N/H264F、R219Q/S262N/H264I、R219Q/S262N/H264K、R219Q/S262N/H264L、R219Q/S262N/H264M、R219Q/S262N/H264P、R219Q/S262N/H264R、R219Q/S262N/H264S、R219Q/S262N/H264T、R219Q/S262N/H264V、R219Q/S262N/H264W、R219Q/S262N/H264Y、R219Q/S262N/S266A、R219Q/S262N/S266C、R219Q/S262N/S266D、R219Q/S262N/S266E、R219Q/S262N/S266F、R219Q/S262N/S266G、R219Q/S262N/S266H、R219Q/S262N/S266I、R219Q/S262N/S266K、R219Q/S262N/S266L、R219Q/S262N/S266M、R219Q/S262N/S266N、R219Q/S262N/S266P、R219Q/S262N/S266Q、R219Q/S262N/S266R、R219Q/S262N/S266T、R219Q/S262N/S266V、R219Q/S262N/S266W、R219Q/S262N/S266Y、R219Q/S262N/K267A、R219Q/S262N/K267C、R219Q/S262N/K267D、R219Q/S262N/K267E、R219Q/S262N/K267F、R219Q/S262N/K267G、R219Q/S262N/K267H、R219Q/S262N/K267I、R219Q/S262N/K267L、R219Q/S262N/K267M、R219Q/S262N/K267N、R219Q/S262N/K267P、R219Q/S262N/K267Q、R219Q/S262N/K267R、R219Q/S262N/K267S、R219Q/S262N/K267T、R219Q/S262N/K267V、R219Q/S262N/K267W、R219Q/S262N/K267Y、R219Q/S262N/V296A、R219Q/S262N/V296C、R219Q/S262N/V296D、R219Q/S262N/V296E、R219Q/S262N/V296F、R219Q/S262N/V296G、R219Q/S262N/V296H、R219Q/S262N/V296I、R219Q/S262N/V296K、R219Q/S262N/V296L、R219Q/S262N/V296M、R219Q/S262N/V296N、R219Q/S262N/V296P、R219Q/S262N/V296Q、R219Q/S262N/V296R、R219Q/S262N/V296S、R219Q/S262N/V296T、R219Q/S262N/V296W和R219Q/S262N/V296Y。在一些实施方案中，变体ADA2蛋白包含选自如下的一或多个修饰：R219Q/K11A/R20A、R219Q/K11A/R20A/K371A、R219Q/R20A/K371A、219Q/K11A/K371A、S262N/K11A/R20A、S262N/K11A/R20A/K371A、S262N/R20A/K371A、S262N/K11A/K371A、R219Q/C105-T147del→(Gly)n、R219Q/V99-Q144del→(GGGGS)n、R219Q/C105-T147del→(GGGGS)n、R219Q/N98-N156del、R219Q/C105-E148del、R219Q/C105-T147del、R219Q/V99-Q144del、S262N/C105-T147del→(Gly)n、S262N/V99-Q144del→(GGGGS)n、S262N/C105-T147del→(GGGGS)n、S262N/N98-N156del、S262N/C105-E148del、S262N/C105-T147del和S262N/V99-Q144del。
在一些实施方案中，当是二聚体形式时，变体ADA2蛋白可以呈现出增加的腺苷脱氨酶活性。例如，当是二聚体形式时，变体ADA2蛋白可以呈现出未修饰的ADA2蛋白的相应二聚体形式的至少110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％、200％、225％、250％、300％、350％、400％、450％、500％、600％、700％、800％或更多的活性，其中腺苷脱氨酶活性在相同条件下评定。在一些实施方案中，当是二聚体形式时，变体ADA2蛋白与未修饰的ADA2蛋白的相应二聚体形式的催化效率(kcat/KM)相比，可以呈现出至少或者至少大约1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2.0倍、2.2倍、2.5倍、3.0倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5.0倍、6.0倍、7.0倍、8.0倍、9.0倍、10.0倍或更多倍的催化效率(kcat/KM)，其中腺苷脱氨酶活性的催化效率在相同条件下评定。例如，当是二聚体形式时，变体ADA2蛋白可以呈现出至少或至少大约2×104M-1s-1、3×104M-1s-1、4×104M-1s-1、5×104M-1s-1、6×104M-1s-1、7×104M-1s-1、8×104M-1s-1、9×104M-1s-1、1×105M-1s-1、2×105M-1s-1、3×105M-1s-1、4×105M-1s-1、5×105M-1s-1或更高的催化效率(kcat/KM)。
在一些实施方案中，变体ADA2蛋白或其催化活性部分含有选自如下的修饰：
K371D/V99-Q144del→(GGGGS)1、K371D/V99-Q144del→(GGGGS)2、K371D/V99-Q144del→(GGGGS)3、K371D/C105-T147del→(GGGGS)1、K371D/C105-T147del→(GGGGS)2、K371D/C105-T147del→(GGGGS)3、R219Q/S262N/--→N1/--→A2/--→S3、K371D/C105-T147del→(Gly)n、K371D/C105-T147del→(Gly)15、K371D/C105-T147del→(Gly)10、K371D/C105-T147del→(Gly)7、K371D/C105-T147del→(Gly)5、K371D/C105-T147del→(Gly)3、K371D/V99-Q144del→(GGGGS)n、K371D/C105-T147del→(GGGGS)n、K371D/N98-N156del、K371D/C105-E148del、K371D/C105-T147del和K371D/V99-Q144del。在一些实施方案中，变体ADA2蛋白或其催化活性部分含有选自如下的修饰：R125N/P126A、S127N/K129S、P126N/E128T、R112N/I114T、I134N/L135C/L136T、I134N/L135S/L136T、R142N/Q144S、E137N/Y139T、P111N/G113S、F119S、F119K、Y224R、Y224N、Y191S、Y191D、F183K、Y191D/Y224R、F109S、F109A、R118D、R118A、Y139T、Y139A、W133S、W133T、P124A、P124S、V99-Q144del、V99-Q144del→(GGGGS)n、C105-T147del→(GGGGS)n、V99-Q144del→(GGGGS)1、V99-Q144del→(GGGGS)2、V99-Q144del→(GGGGS)3、C105-T147del→(GGGGS)1、C105-T147del→(GGGGS)2和C105-T147del→(GGGGS)3。
在一些实施方案中，变体ADA2蛋白或其催化活性部分含有选自如下的修饰：R125N/P126A、S127N/K129S、P126N/E128T、R112N/I114T、I134N/L135C/L136T、I134N/L135S/L136T、R142N/Q144S、E137N/Y139T、P111N/G113S、F119S、F119K、Y224R、Y224N、Y191S、Y191D、F183K、Y191D/Y224R、F109S、F109A、R118D、R118A、Y139T、Y139A、W133S、W133T、P124A、P124S、V99-Q144del、V99-Q144del→(GGGGS)n、C105-T147del→(GGGGS)n、V99-Q144del→(GGGGS)1、V99-Q144del→(GGGGS)2、V99-Q144del→(GGGGS)3、C105-T147del→(GGGGS)1、C105-T147del→(GGGGS)2和C105-T147del→(GGGGS)3。
例如，参照SEQ ID NO:5所示氨基酸位置，这种变体ADA2蛋白是在相应于氨基酸残基11、20、219、221、262、264、366、371、372或452的氨基酸位置包含一或多个氨基酸置换的任何蛋白。例如，参照SEQ ID NO:5所示氨基酸位置，变体ADA2蛋白可包含选自如下的一或多个氨基酸置换：K11A、K11E、R20A、R20E、R219K、R219Q、L221A、L221V、L221G、S262N、H264Q、H264G、R366E、K371A、K371D、K371E、K372D、K372E、K452D和K452E。在一些实施方案中，参照SEQ ID NO:5所示氨基酸位置，变体ADA2蛋白可包含选自如下的氨基酸置换：K11A/R20A、K11A/R20A/K371A、R20A/K371A、K11A/K371A、S262N/K371D、S262N/K371E、S262N/R20E、S262N/R20E/K371D、S262N/R20E/K371E、R219Q/K371E、R219Q/K371D、R219Q/R20E、R219Q/K371E/R20E、R219Q/K371D/R20E、R219Q/S262N/K371E、R219Q/S262N/K371D、R219Q/S262N/R20E、R219Q/S262N/K371E/R20E、R219Q/S262N/K371D/R20E和R219Q/S262N。
在一些实施方案中，当是二聚体形式时，变体ADA2蛋白可以呈现出降低的肝素结合。例如，当是二聚体形式时，变体ADA2蛋白可以呈现出未修饰的ADA2蛋白的相应二聚体形式的不超过1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％的肝素结合，其中肝素结合在相同条件下评定。
例如，参照SEQ ID NO:5所示氨基酸位置，这种变体ADA2蛋白是在相应于氨基酸残基20、262、366、371、372或452的氨基酸位置包含一或多个氨基酸置换的任何蛋白。例如，参照SEQ ID NO:5所示氨基酸位置，变体ADA2蛋白可包含选自如下的一或多个氨基酸置换：R20A、R20D、R20E、S262N、R366A、R366D、R366E、K371A、K371D、K371E、K372A、K372D、K372E和K452E。在一些实施方案中，参照SEQ ID NO:5所示氨基酸位置，变体ADA2蛋白可包含选自如下的氨基酸置换：K11A/R20A、K11A/R20A/K371A、R20A/K371A、K11A/K371A、S262N/K371D、S262N/K371E、S262N/R20E、S262N/R20E/K371D和S262N/R20E/K371E。
在一些实施方案中，变体ADA2蛋白或其催化活性部分含有相应于如下的一或多个氨基酸置换：K11A、K11D、K11E、K13A、K13D、K13E、K371A、K371D、K371E、K372A、K372D、K372E、K452A、K452D、K452E、R20A、R20D、R20E、R366A、R366D、R366E、K26A、K26D、K26E、R217A、R217D、R217E、K258A、K258D、K258E、R277A、R277D、R277E、R283A、R283D、R283E、K309A、K309D、K309E、K317A、K317D、K317E、K321A、K321D、K321E、R352A、R352D、R352E、R441A、R441D、R441E、K444A、K444D、K444E、K461A、K461D、K461E、K469A、K469D、K469E、K470A、K470D和K470E。
在一些实施方案中，当是二聚体形式时，变体ADA2蛋白可以呈现出较长的血清半衰期(t1/2)。例如，当是二聚体形式时，变体ADA2可以呈现出是未修饰的ADA2蛋白的相应二聚体形式的至少或至少大约110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％、200％、225％、250％、300％、350％、400％、450％、500％、600％、700％、800％或更长的半衰期，其中半衰期在相同条件下评定。
在一些实施方案中，当是二聚体形式时，变体ADA2蛋白可以呈现出增加的热稳定性。例如，当是二聚体形式时，变体ADA2蛋白与未修饰的ADA2蛋白的相应二聚体形式的Tm相比，可以呈现出解链温度(Tm)增加至少或至少大约0.5℃、1.0℃、2.0℃、3.0℃、4.0℃、5.0℃、6.0℃、7.0℃、8.0℃、9.0℃、10.0℃或更多，其中Tm在相同条件下评定。例如，变体ADA2蛋白的解链温度(Tm)可以是至少或至少大约67.6℃、67.8℃、68.0℃、68.2℃、68.4℃、68.6℃、68.8℃、69.0℃、69.2℃、69.4℃、69.6℃、69.8℃、70.0℃、70.2℃、70.4℃、70.6℃、70.8℃、71.0℃、71.2℃、71.4℃、71.6℃、71.8℃或更高。
在本发明提供的任何变体ADA2蛋白的例子中，变体ADA2蛋白的腺苷脱氨酶活性可以在或大约在pH 6.5±0.2评定或呈现。在一些实例中，当是二聚体形式时，变体ADA2蛋白可以呈现出对于腺苷脱氨酶活性最佳的改变的pH。例如，当是二聚体形式时，变体ADA2蛋白可以呈现出对于腺苷脱氨酶活性最佳的pH，其与未修饰的ADA2蛋白的相应二聚体形式的最佳pH相比是更高的pH。例如，当是二聚体形式时，变体ADA2蛋白可具有pH是至少或至少大约6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5或更高的最佳pH。在其它实例中，当是二聚体形式时，变体ADA2蛋白可以呈现出对于腺苷脱氨酶活性的最佳pH，其与未修饰的ADA2蛋白的相应二聚体形式的最佳pH相比是更低的pH。例如，当是二聚体形式时，变体ADA2蛋白可具有pH是低于或低于大约6.5、6.4、6.3、6.3、6.2、6.1、6.0或更低的最佳pH。
在一些实施方案中，变体ADA2蛋白在推定的受体结合(PRB)结构域中可包含一或多个氨基酸的修饰，其中所述修饰是氨基酸缺失、插入或置换。在任何这种实例中，参照SEQID NO:5所示氨基酸位置，变体ADA2蛋白不包含是相应于氨基酸置换C108G、A120V、H121R、R125C、R140Q、K141R或R142W的氨基酸置换的修饰。
在一些实施方案中，变体ADA2蛋白或其催化活性部分缺少全部或部分推定的受体结合(PRB)结构域或者具有PRB的修饰，从而任何受体结合或生长因子活性被降低或消除，或者ADA2的除了脱氨酶活性之外的其它活性被降低或消除，或者与ADA结构域的相互作用被降低或消除，并且所述PRB结构域相应于SEQ ID NO:5所示序列中残基98-156。在一些实施方案中，参照SEQ ID NO:5所示氨基酸位置，变体ADA2缺少残基105-148或105-147或99-144。在一些实例中，变体ADA2蛋白或其催化活性部分含有SEQ ID NO:548-550和579任一所示氨基酸序列。在一些实施方案中，变体ADA2蛋白或其催化活性部分含有全部或部分PRB结构域的缺失及任选含有肽接头的插入。
在一些实例中，参照SEQ ID NO:5所示氨基酸位置，变体ADA2蛋白可具有相应于在或在大约氨基酸残基98-156或者氨基酸残基105-148(包括端点)之间的一或多个连续氨基酸残基的一或多个连续氨基酸残基的缺失。在任何这样的实例中，ADA2多肽的变体可进一步包含肽接头对缺失区域的取代。例如，所述肽接头可选自(Gly)n(SEQ ID NO:368)，其中n是2-20；(GGGGS)n(SEQ ID NO:343)，其中n是1-6；(SSSSG)n(SEQ ID NO:344)，其中n是1-6；(AlaAlaProAla)n(SEQ ID NO:350)，其中n是1-6；GKSSGSGSESKS(SEQ ID NO:345)；GGSTSGSGKSSEGKG(SEQ ID NO:346)；GSTSGSGKSSSEGSGSTKG(SEQ ID NO:347)；GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:348)和EGKSSGSGSESKEF(SEQ ID NO:349)。例如，所述肽接头可以选自GGG(SEQ ID NO:369)、GGGGG(SEQ ID NO:360)、GGGGGGG(SEQ ID NO:370)、GGGGGGGGGG(SEQ ID NO:371)和GGGGGGGGGGGGGGG(SEQ ID NO:372)。
在一些实施方案中，变体ADA2可含有变体ADA2多肽，参照SEQ ID NO:5所示氨基酸位置，其可在PRB结构域中包含相应于如下的修饰：C105-T147del→(Gly)n，其中n是2-20，如C105-T147del→(Gly)15、C105-T147del→(Gly)10、C105-T147del→(Gly)7、C105-T147del→(Gly)5或C105-T147del→(Gly)3。在一些实施方案中，参照SEQ ID NO:5所示氨基酸位置，变体ADA2可在PRB结构域中包含相应于如下的修饰：C105-T147del→(Gly)n,其中n＝2-20；C105-T147del→(Gly)15；C105-T147del→(Gly)10；C105-T147del→(Gly)7；C105-T147del→(Gly)5；C105-T147del→(Gly)3；N98-N156del；C105-E148del；C105-T147del；V99-Q144del；V99-Q144del→(GGGGS)n，其中n＝1-5；C105-T147del→(GGGGS)n，其中n＝1-5；V99-Q144del→(GGGGS)1；V99-Q144del→(GGGGS)2；V99-Q144del→(GGGGS)3；C105-T147del→(GGGGS)1；C105-T147del→(GGGGS)2；及C105-T147del→(GGGGS)3。
在一些实施方案中，参照SEQ ID NO:5所示氨基酸位置，变体ADA2蛋白或其催化活性部分含有选自相应于如下置换的一或多个氨基酸置换：F119S、F119K、Y224R、Y224N、Y191S、Y191D、F183K、Y191D/Y224R、F109S、F109A、R118D、R118A、Y139T、Y139A、W133S、W133T、P124A和P124S。在一些实施方案中，变体ADA2蛋白或其催化活性部分含有选自相应于如下置换的氨基酸置换：R219Q/S262N/F119S、R219Q/S262N/F119K、R219Q/S262N/Y224R、R219Q/S262N/Y224N、R219Q/S262N/Y191S、R219Q/S262N/Y191D、R219Q/S262N/F183K、R219Q/S262N/Y191D/Y224R、R219Q/S262N/F109S、R219Q/S262N/F109A、R219Q/S262N/R118D、R219Q/S262N/R118A、R219Q/S262N/Y139T、R219Q/S262N/Y139A、R219Q/S262N/W133S、R219Q/S262N/W133T、R219Q/S262N/P124A及R219Q/S262N/P124S。在一些实施方案中，变体ADA2含有选自如下的修饰：K371D/V99-Q144del→(GGGGS)1；K371D/V99-Q144del→(GGGGS)2；K371D/V99-Q144del→(GGGGS)3；K371D/C105-T147del→(GGGGS)1；K371D/C105-T147del→(GGGGS)2；K371D/C105-T147del→(GGGGS)3；R219Q/S262N/C105-T147del→(Gly)15；R219Q/S262N/C105-T147del→(Gly)10；R219Q/S262N/C105-T147del→(Gly)7；R219Q/S262N/C105-T147del→(Gly)5；R219Q/S262N/C105-T147del→(Gly)3；R219Q/S262N/V99-Q144del→(GGGGS)1；R219Q/S262N/V99-Q144del→(GGGGS)2；R219Q/S262N/V99-Q144del→(GGGGS)3；R219Q/S262N/C105-T147del→(GGGGS)1；R219Q/S262N/C105-T147del→(GGGGS)2；R219Q/S262N/C105-T147del→(GGGGS)3；R219Q/S262N/K371D/V99-Q144del→(GGGGS)1；R219Q/S262N/K371D/V99-Q144del→(GGGGS)2；R219Q/S262N/K371D/V99-Q144del→(GGGGS)3；R219Q/S262N/K371D/C105-T147del→(GGGGS)1；R219Q/S262N/K371D/C105-T147del→(GGGGS)2；R219Q/S262N/K371D/C105-T147del→(GGGGS)3；K371D/C105-T147del→(Gly)n，其中n＝2-20；K371D/C105-T147del→(Gly)15；K371D/C105-T147del→(Gly)10；K371D/C105-T147del→(Gly)7；K371D/C105-T147del→(Gly)5；K371D/C105-T147del→(Gly)3；K371D/V99-Q144del→(GGGGS)n，其中n＝1-5；K371D/C105-T147del→(GGGGS)n，其中n＝1-5；K371D/N98-N156del；K371D/C105-E148del；K371D/C105-T147del；K371D/V99-Q144del；R219Q/S262N/C105-T147del→(Gly)n，其中n＝2-20；R219Q/S262N/V99-Q144del→(GGGGS)n，其中n＝1-5；R219Q/S262N/C105-T147del→(GGGGS)n，其中n＝1-5；R219Q/S262N/N98-N156del；R219Q/S262N/C105-E148del；R219Q/S262N/C105-T147del；R219Q/S262N/V99-Q144del；R219Q/S262N/K371D/C105-T147del→(Gly)n，其中n＝2-20；R219Q/S262N/K371D/C105-T147del→(Gly)15；R219Q/S262N/K371D/C105-T147del→(Gly)10；R219Q/S262N/K371D/C105-T147del→(Gly)7；R219Q/S262N/K371D/C105-T147del→(Gly)5；R219Q/S262N/K371D/C105-T147del→(Gly)3；R219Q/S262N/K371D/V99-Q144del→(GGGGS)n，其中n＝1-5；R219Q/S262N/K371D/C105-T147del→(GGGGS)n，其中n＝1-5；R219Q/S262N/K371D/N98-N156del；R219Q/S262N/K371D/C105-E148del；R219Q/S262N/K371D/C105-T147del；R219Q/S262N/K371D/V99-Q144del；R219Q/C105-T147del→(Gly)n，其中n＝2-20；R219Q/V99-Q144del→(GGGGS)n，其中n＝1-5；R219Q/C105-T147del→(GGGGS)n，其中n＝1-5；R219Q/N98-N156del；R219Q/C105-E148del；R219Q/C105-T147del；R219Q/V99-Q144del；S262N/C105-T147del→(Gly)n，其中n＝2-20；S262N/V99-Q144del→(GGGGS)n，其中n＝1-5；S262N/C105-T147del→(GGGGS)n，其中n＝1-5；S262N/N98-N156del；及S262N/C105-E148del；S262N/C105-T147del；及S262N/V99-Q144del。
在变体ADA2蛋白、包括含有修饰的PRB结构域的实例的一些实施方案中，当是二聚体形式时，变体ADA2蛋白可呈现出与选自A1、A2A、A2B和A3的任一或多个腺苷受体(ADR)的结合与未修饰的ADA2蛋白与相同受体的结合相比，在相同条件下评定时是降低的。例如，变体ADA2蛋白的结合降低至少或至少大约0.5倍、1倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更多。
在本发明提供的变体ADA2的一些实施方案中，变体ADA2可以是糖基化的，例如在天然或非天然糖基化位点。在一些实施方案中，变体ADA2蛋白可包含通过导入非天然糖基化位点改变糖基化的修饰，从而当在能糖基化的细胞中表达时，变体ADA2蛋白与未修饰的ADA2多肽相比是高糖基化的。例如，非天然糖基化位点通过氨基酸置换或插入1、2或3个氨基酸导入。例如，参照SEQ ID NO:5所示氨基酸位置，所述修饰选自相应于--→N1/--→A2/--→S3、R20N/V22S、K371N/D373S、K372N/I374S、T403N/H405S和G404N/P406S的修饰。在一些实施方案中，变体ADA2或其催化活性部分含有相应于R219Q/S262N/--→N1/--→A2/--→S3、R219Q/S262N/R20N/V22S、R219Q/S262N/K371N/D373S、R219Q/S262N/K372N/I374S、R219Q/S262N/T403N/H405S或R219Q/S262N/G404N/P406S的修饰。在一些实施方案中，变体ADA2蛋白或其催化活性部分在推定的受体结合(PRB)结构域中含有相应于选自R125N/P126A、S127N/K129S、P126N/E128T、R112N/I114T、I134N/L135C/L136T、I134N/L135S/L136T、R142N/Q144S、E137N/Y139T、和P111N/G113S的一或多个修饰的修饰。在一些实施方案中，变体ADA2蛋白或其催化活性部分含有相应于如下的氨基酸置换：R219Q/S262N/R125N/P126A、R219Q/S262N/S127N/K129S、R219Q/S262N/P126N/E128T、R219Q/S262N/R112N/I114T、R219Q/S262N/I134N/L135C/L136T、R219Q/S262N/I134N/L135S/L136T、R219Q/S262N/R142N/Q144S、R219Q/S262N/E137N/Y139T或R219Q/S262N/P111N/G113S。
在一些实施方案中，变体ADA2蛋白可以是人ADA2。在一些实施方案中，变体ADA2蛋白可以是分离的或纯化的。
在一些实施方案中，变体ADA2蛋白可含有与SEQ ID NO:5呈现出至少65％序列相同性的多肽或其催化活性部分。例如，变体ADA2蛋白可含有与SEQ ID NO:5呈现至少70％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列相同性的多肽或其催化活性部分。例如，变体ADA2蛋白含有具有SEQ ID NO:13-63或71-285任一氨基酸序列的多肽或其催化活性部分。在一些实施方案中，变体ADA2蛋白或其催化活性部分含有SEQ IDNO:551-579或581-993任一氨基酸序列或其催化活性部分。
在一些实施方案中，参照SEQ ID NO:5，变体ADA2蛋白或其催化活性部分可含有选自相应于如下置换的氨基酸置换：K11A/R20A、K11A/R20A/K371A、R20A/K371A、K11A/K371A、S262N/K371D、S262N/K371E、S262N/R20E、S262N/R20E/K371D、S262N/R20E/K371E、R219Q/K371E、R219Q/K371D、R219Q/R20E、R219Q/K371E/R20E、R219Q/K371D/R20E、R219Q/S262N/K371E、R219Q/S262N/K371D、R219Q/S262N/R20E、R219Q/S262N/K371E/R20E、R219Q/S262N/K371D/R20E、R219Q/S262N、R219Q/S262N/K11A、R219Q/S262N/K11D、R219Q/S262N/K11E、R219Q/S262N/K13A、R219Q/S262N/K13D、R219Q/S262N/K13E、R219Q/S262N/K371A、R219Q/S262N/K372A、R219Q/S262N/K372D、R219Q/S262N/K372E、R219Q/S262N/K452A、R219Q/S262N/K452D、R219Q/S262N/K452E、R219Q/S262N/R20A、R219Q/S262N/R20D、R219Q/S262N/R366A、R219Q/S262N/R366D、R219Q/S262N/R366E、R219Q/S262N/H264A、R219Q/S262N/H264Q、R219Q/S262N/H264N、R219Q/S262N/H264G、R219K/S262N、R219N/S262N、R219A/S262N、R219Q/S262N/L221A、R219Q/S262N/L221V、R219Q/S262N/L221G、R219Q/S262N/E179D、R219Q/S262N/E179A、R219Q/S262N/E179S、R219Q/S262N/E179T、R219Q/S262N/E179V、R219Q/S262N/E179G、R219Q/S262A、R219Q/S262V、R219Q/S262M、R219Q/S262N/K11A/R20A、R219Q/S262N/K11A/R20A/K371A、R219Q/S262N/R20A/K371A、R219Q/S262N/K11A/K371A、R219Q/S262N/K26A、R219Q/S262N/K26D、R219Q/S262N/K26E、R219Q/S262N/R217A、R219Q/S262N/R217D、R219Q/S262N/R217E、R219Q/S262N/K258A、R219Q/S262N/K258D、R219Q/S262N/K258E、R219Q/S262N/R277A、R219Q/S262N/R277D、R219Q/S262N/R277E、R219Q/S262N/R283A、R219Q/S262N/R283D、R219Q/S262N/R283E、R219Q/S262N/K309A、R219Q/S262N/K309D、R219Q/S262N/K309E、R219Q/S262N/K317A、R219Q/S262N/K317D、R219Q/S262N/K317E、R219Q/S262N/K321A、R219Q/S262N/K321D、R219Q/S262N/K321E、R219Q/S262N/R352A、R219Q/S262N/R352D、R219Q/S262N/R352E、R219Q/S262N/R441A、R219Q/S262N/R441D、R219Q/S262N/R441E、R219Q/S262N/K444A、R219Q/S262N/K444D、R219Q/S262N/K444E、R219Q/S262N/K461A、R219Q/S262N/K461D、R219Q/S262N/K461E、R219Q/S262N/K469A、R219Q/S262N/K469D、R219Q/S262N/K469E、R219Q/S262N/K470A、R219Q/S262N/K470D、R219Q/S262N/K470E、R219Q/S262N/D86A、R219Q/S262N/D86C、R219Q/S262N/D86E、R219Q/S262N/D86F、R219Q/S262N/D86G、R219Q/S262N/D86H、R219Q/S262N/D86I、R219Q/S262N/D86K、R219Q/S262N/D86L、R219Q/S262N/D86M、R219Q/S262N/D86N、R219Q/S262N/D86P、R219Q/S262N/D86Q、R219Q/S262N/D86R、R219Q/S262N/D86S、R219Q/S262N/D86T、R219Q/S262N/D86V、R219Q/S262N/D86W、R219Q/S262N/D86Y、R219Q/S262N/E179C、R219Q/S262N/E179F、R219Q/S262N/E179H、R219Q/S262N/E179I、R219Q/S262N/E179K、R219Q/S262N/E179L、R219Q/S262N/E179M、R219Q/S262N/E179N、R219Q/S262N/E179P、R219Q/S262N/E179Q、R219Q/S262N/E179R、R219Q/S262N/E179W、R219Q/S262N/E179Y、R219C/S262N、R219D/S262N、R219E/S262N、R219F/S262N、R219G/S262N、R219H/S262N、R219I/S262N、R219L/S262N、R219M/S262N、R219P/S262N、R219S/S262N、R219T/S262N、R219V/S262N、R219W/S262N、R219Y/S262N、R219Q/S262N/L221C、R219Q/S262N/L221D、R219Q/S262N/L221E、R219Q/S262N/L221F、R219Q/S262N/L221H、R219Q/S262N/L221I、R219Q/S262N/L221K、R219Q/S262N/L221M、R219Q/S262N/L221N、R219Q/S262N/L221P、R219Q/S262N/L221Q、R219Q/S262N/L221R、R219Q/S262N/L221S、R219Q/S262N/L221T、R219Q/S262N/L221W、R219Q/S262N/L221Y、R219Q/S262C、R219Q/S262D、R219Q/S262E、R219Q/S262F、R219Q/S262G、R219Q/S262H、R219Q/S262I、R219Q/S262K、R219Q/S262L、R219Q/S262P、R219Q/S262Q、R219Q/S262R、R219Q/S262T、R219Q/S262W、R219Q/S262Y、R219Q/S262N/H264C、R219Q/S262N/H264D、R219Q/S262N/H264E、R219Q/S262N/H264F、R219Q/S262N/H264I、R219Q/S262N/H264K、R219Q/S262N/H264L、R219Q/S262N/H264M、R219Q/S262N/H264P、R219Q/S262N/H264R、R219Q/S262N/H264S、R219Q/S262N/H264T、R219Q/S262N/H264V、R219Q/S262N/H264W、R219Q/S262N/H264Y、R219Q/S262N/S266A、R219Q/S262N/S266C、R219Q/S262N/S266D、R219Q/S262N/S266E、R219Q/S262N/S266F、R219Q/S262N/S266G、R219Q/S262N/S266H、R219Q/S262N/S266I、R219Q/S262N/S266K、R219Q/S262N/S266L、R219Q/S262N/S266M、R219Q/S262N/S266N、R219Q/S262N/S266P、R219Q/S262N/S266Q、R219Q/S262N/S266R、R219Q/S262N/S266T、R219Q/S262N/S266V、R219Q/S262N/S266W、R219Q/S262N/S266Y、R219Q/S262N/K267A、R219Q/S262N/K267C、R219Q/S262N/K267D、R219Q/S262N/K267E、R219Q/S262N/K267F、R219Q/S262N/K267G、R219Q/S262N/K267H、R219Q/S262N/K267I、R219Q/S262N/K267L、R219Q/S262N/K267M、R219Q/S262N/K267N、R219Q/S262N/K267P、R219Q/S262N/K267Q、R219Q/S262N/K267R、R219Q/S262N/K267S、R219Q/S262N/K267T、R219Q/S262N/K267V、R219Q/S262N/K267W、R219Q/S262N/K267Y、R219Q/S262N/V296A、R219Q/S262N/V296C、R219Q/S262N/V296D、R219Q/S262N/V296E、R219Q/S262N/V296F、R219Q/S262N/V296G、R219Q/S262N/V296H、R219Q/S262N/V296I、R219Q/S262N/V296K、R219Q/S262N/V296L、R219Q/S262N/V296M、R219Q/S262N/V296N、R219Q/S262N/V296P、R219Q/S262N/V296Q、R219Q/S262N/V296R、R219Q/S262N/V296S、R219Q/S262N/V296T、R219Q/S262N/V296W、R219Q/S262N/V296Y、R219Q/K11A/R20A、R219Q/K11A/R20A/K371A、R219Q/R20A/K371A、R219Q/K11A/K371A、S262N/K11A/R20A、S262N/K11A/R20A/K371A、S262N/R20A/K371A及S262N/K11A/K371A。
变体ADA2蛋白可以是单体或二聚体。特别地，本发明提供的变体ADA2蛋白是变体ADA2蛋白的二聚体，其可包括提供的任何变体ADA2蛋白。在一些实例中，二聚体可以是同源二聚体。在其它实例中，二聚体可以是异源二聚体。
本发明提供了编码本发明提供的变体ADA2蛋白的核酸分子。本发明还提供了包含编码本发明提供的任何变体ADA2蛋白的核酸的载体。所述载体可以是真核载体或原核载体，如哺乳动物载体或病毒载体。例如，所述载体是腺病毒载体、腺伴随病毒载体、逆转录病毒载体、疱疹病毒载体、慢病毒载体、痘病毒载体或巨细胞病毒载体。在一些实施方案中，所述载体是溶瘤病毒载体。在一些实施方案中，所述载体也可以编码可溶的透明质酸酶。本发明还提供了含有本发明提供的任何载体的细胞。所述细胞可以是真核细胞，如哺乳动物细胞。如果是人，则细胞是分离的或者作为细胞培养物提供。例如，所述细胞是哺乳动物细胞，如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。在一些实施方案中，所述细胞表达变体ADA2蛋白，如二聚体。本发明还提供了变体ADA2蛋白，如变体ADA2二聚体，其由本发明提供的细胞产生。在一些实施方案中，所述细胞是分离的细胞或细胞培养物，如真核细胞、非人细胞、哺乳动物细胞，或者不是人干细胞的细胞。在一些实施方案中，所述细胞是免疫细胞，如T细胞、肿瘤侵润淋巴细胞(TIL)、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、天然杀伤(NK)细胞或者淋巴因子激活的杀伤(LAK)细胞。在一些实施方案中，所述细胞是编码和表达嵌合抗原受体(CAR)和变体ADA2蛋白或二聚体的T细胞。在一些实例中，所述CAR特异于肿瘤细胞抗原，所述肿瘤抗原选自HER2、CD19、HERV-K、CD20、CD22、ROR1、间皮素(mesothelin)、CD33/IL3Ra、c-Met、PSMA、糖脂F77、EGFRvIII、GD-2、NY-ESO-1TCR、MAGE A3TCR和GD2及其组合。
本发明提供了缀合物，其包含本发明提供的任何ADA2蛋白的变体ADA2蛋白或其催化活性部分，如本发明任何实施例中提供的变体ADA2二聚体，直接连接或者通过接头间接连接异源部分如毒素或治疗药物。
本发明还提供了缀合物，其包含直接连接或者通过接头间接连接异源部分的ADA2蛋白。在任何缀合物中，ADA2蛋白可以是单体或二聚体。在一些实例中，二聚体是同源二聚体；在其它实例中其是异源二聚体。在本发明实施例中的任何缀合物中，所述异源部分与二聚体中一或这两个亚基缀合。所述异源部分例如可选自肽、小分子、核酸、碳水化合物和聚合物。
在本发明提供的缀合物的一些实施方案中，所述异源部分是半衰期延长部分。例如，所述半衰期延长部分选自生物相容的脂肪酸及其衍生物、羟基烷基淀粉(HAS)、聚乙二醇(PEG)、Poly(Glyx-Sery)n、高氨基酸聚合物(HAP)、透明质酸(HA)、肝素糖聚合物(HEP)、基于磷酰胆碱的聚合物(PC聚合物)、Fleximers、葡聚糖、多唾液酸(PSA)、Fc结构域、运铁蛋白、白蛋白、弹性蛋白样肽、XTEN序列、白蛋白结合肽、CTP肽，及它们的任意组合。
在一些实例中，半衰期延长部分是PEG且ADA2蛋白是PEG化的。例如，PEG可以选自甲氧基聚乙二醇(mPEG)、PEG-缩水甘油醚(Epox-PEG)、PEG-氧基羰基咪唑(CDI-PEG)、支链PEG及聚氧化乙烯(PEO)。在一些实例中，PEG的分子量为或大约为1kDa至大约100kDa。PEG可以是线性或分支的。在本发明提供的缀合物的一些实施方案中，PEG部分得自与选自如下的PEG试剂的反应：mPEG-琥珀酰亚胺丙酸酯(mPEG-SPA)、mPEG琥珀酰亚胺羧甲基酯(mPEG-SCM)、mPEG-琥珀酰亚胺丁酸酯(mPEG-SBA)、mPEG2-N-羟基琥珀酰亚胺、mPEG-琥珀酰亚胺丁酸酯(mPEG-SBA)、mPEG-琥珀酰亚胺α-甲基丁酸酯(mPEG-SMB)、mPEG-丁醛、PEG-对-硝基苯基-碳酸酯及PEG-丙醛。例如，所述PEG部分得自与选自如下的PEG试剂的反应：mPEG-SCM(20kDa)、mPEG-SCM(30kDa)、mPEG-SBA(5kDa)、mPEG-SBA(20kDa)、mPEG-SBA(30kDa)、mPEG-SMB(20kDa)、mPEG-SMB(30kDa)、mPEG-丁醛(30kDa)、mPEG-SPA(20kDa)、mPEG-SPA(30kDa)、mPEG2-NHS(10kDa分支的)、mPEG2-NHS(20kDa分支的)、mPEG2-NHS(40kDa分支的)、mPEG2-NHS(60kDa分支的)、PEG-NHS-生物素(5kDa生物素酰化的)、PEG-对-硝基苯基-碳酸酯(30kDa)和PEG-丙醛(30kDa)。
在本发明提供的缀合物的实施方案中，ADA2蛋白可含有SEQ ID NO:5、326-334、340、375或380-383任何所示的氨基酸序列，与SEQ ID NO:5、326-334、340、375或380-383任何所示氨基酸序列呈现至少85％序列相同性的序列或者其催化形式。例如，ADA2蛋白可含有与SEQ ID NO:5、326-334、340、375或380-383任一所示氨基酸序列呈现至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列相同性的氨基酸序列或其催化活性部分。例如，ADA2蛋白可含有与SEQ ID NO:5所示氨基酸序列呈现出至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列相同性的氨基酸序列或其催化活性部分。在另一实例中，ADA2蛋白可包含具有SEQ ID NO:5所示氨基酸序列或其催化活性部分的多肽。
在本发明提供的缀合物的实施方案中，ADA2蛋白是变体ADA2蛋白，其包含在未修饰的ADA2蛋白或其催化活性部分的氨基酸序列中包含一或多个修饰的氨基酸序列，其中未修饰的ADA2蛋白含有SEQ ID NO:5所示氨基酸序列，或者与SEQ ID NO:5所示氨基酸序列呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列，或者其催化活性部分。在任何这种实例中，所述氨基酸修饰选自氨基酸置换、缺失和插入，及当是二聚体形式时，变体ADA2蛋白可以呈现出腺苷脱氨酶活性以将腺苷转变为肌苷。在本发明提供的任何缀合物中，当是二聚体形式时，ADA2蛋白可以呈现出是至少或至少大约5×103M-1s-1、6×103M-1s-1、7×103M-1s-1、8×103M-1s-1、9×103M-1s-1、1×104M-1s-1、2×104M-1s-1、3×104M-1s-1、4×104M-1s-1、5×104M-1s-1、6×104M-1s-1、7×104M-1s-1、8×104M-1s-1、9×104M-1s-1、1×105M-1s-1、2×105M-1s-1、3×105M-1s-1、4×105M-1s-1、5×105M-1s-1或更高的催化效率(kcat/KM)。
在本发明提供的缀合物的任何实施方案中，ADA2蛋白的修饰可以是氨基酸置换；且参照SEQ ID NO:5所示氨基酸位置，变体ADA2蛋白可在相应于氨基酸残基11、13、20、22、26、86、179、217、219、221、258、262、264、266、267、277、283、296、309、317、321、352、366、371、372、373、374、403、404、405、406、441、444、452、461、469或470的氨基酸位置包括一或多个氨基酸置换。例如，在本发明提供的缀合物的一些实施方案中，参照SEQ ID NO:5所示氨基酸位置，变体ADA2蛋白可包含选自如下的一或多个氨基酸置换：K11A、K11D、K11E、K13A、K13D、K13E、R20A、R20D、R20E、R20N、V22S、K26A、K26D、K26E、D86A、D86C、D86E、D86F、D86G、D86H、D86I、D86K、D86L、D86M、D86N、D86P、D86Q、D86R、D86S、D86T、D86V、D86W、D86Y、E179A、E179C、E179D、E179F、E179G、E179H、E179I、E179K、E179L、E179M、E179N、E179P、E179Q、E179R、E179S、E179T、E179V、E179W、E179Y、R217A、R217D、R217E、R219A、R219C、R219D、R219E、R219F、R219G、R219H、R219I、R219K、R219L、R219M、R219N、R219P、R219Q、R219S、R219T、R219V、R219W、R219Y、L221A、L221C、L221D、L221E、L221F、L221G、L221H、L221I、L221K、L221M、L221N、L221P、L221Q、L221R、L221S、L221T、L221V、L221W、L221Y、K258A、K258D、K258E、S262A、S262C、S262D、S262E、S262F、S262G、S262H、S262I、S262K、S262L、S262M、S262N、S262P、S262Q、S262R、S262T、S262V、S262W、S262Y、H264A、H264C、H264D、H264E、H264F、H264G、H264I、H264K、H264L、H264M、H264N、H264P、H264Q、H264R、H264S、H264T、H264V、H264W、H264Y、S266A、S266C、S266D、S266E、S266F、S266G、S266H、S266I、S266K、S266L、S266M、S266N、S266P、S266Q、S266R、S266T、S266V、S266W、S266Y、K267A、K267C、K267D、K267E、K267F、K267G、K267H、K267I、K267L、K267M、K267N、K267P、K267Q、K267R、K267S、K267T、K267V、K267W、K267Y、R277A、R277D、R277E、R283A、R283D、R283E、V296A、V296C、V296D、V296E、V296F、V296G、V296H、V296I、V296K、V296L、V296M、V296N、V296P、V296Q、V296R、V296S、V296T、V296W、V296Y、K309A、K309D、K309E、K317A、K317D、K317E、K321A、K321D、K321E、R352A、R352D、R352E、R366A、R366D、R366E、K371A、K371D、K371E、K371N、K372A、K372D、K372E、K372N、D373S、I374S、T403N、G404N、H405S、P406S、R441A、R441D、R441E、K444A、K444D、K444E、K452A、K452D、K452E、K461A、K461D、K461E、K469A、K469D、K469E、K470A、K470D、K470E。例如，参照SEQ ID NO:5所示氨基酸位置，变体ADA2蛋白可包括选自K11A、K11E、R20A、R20D、R20E、R219K、R219Q、L221A、L221V、L221G、S262N、H264Q、H264G、R366A、R366D、R366E、K371A、K371D、K371E、K372A、K372D、K372E、K452D和K452E的一或多个氨基酸置换。在一些实施例中，参照SEQ ID NO:5所示氨基酸位置，变体ADA2蛋白可包括选自如下的氨基酸置换：K11A/R20A、K11A/R20A/K371A、R20A/K371A、K11A/K371A、S262N/K371D、S262N/K371E、S262N/R20E、S262N/R20E/K371D、S262N/R20E/K371E、R219Q/K371E、R219Q/K371D、R219Q/R20E、R219Q/K371E/R20E、R219Q/K371D/R20E、R219Q/S262N/K371E、R219Q/S262N/K371D、R219Q/S262N/R20E、R219Q/S262N/K371E/R20E、R219Q/S262N/K371D/R20E和R219Q/S262N。
在本发明提供的缀合物的一些实施方案中，变体ADA2蛋白可在推定的受体结合(PRB)结构域中包括一或多个氨基酸的修饰，所述修饰是氨基酸缺失、插入或置换。例如，在本发明提供的缀合物的一些实施方案中，参照SEQ ID NO:5所示氨基酸位置，变体ADA2蛋白可包含相应于在或大约在氨基酸残基98-156或者氨基酸残基105-148(包括端点)之间的任一或多个连续氨基酸残基的一或多个连续氨基酸残基的缺失。在一些实例中，缀合物中的变体ADA2蛋白可进一步包含缺失的区域由肽接头取代。例如，所述肽接头可以选自(Gly)n(SEQ ID NO:368)，其中n是2-20；(GGGGS)n(SEQ ID NO:343)，其中n是1-6；(SSSSG)n(SEQID NO:344)，其中n是1-6；(AlaAlaProAla)n(SEQ ID NO:350)，其中n是1-6；GKSSGSGSESKS(SEQ ID NO:345)；GGSTSGSGKSSEGKG(SEQ ID NO:346)；GSTSGSGKSSSEGSGSTKG(SEQ ID NO:347)；GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:348)及EGKSSGSGSESKEF(SEQ ID NO:349)。在一些实例中，所述肽接头选自GGG(SEQ ID NO:369)、GGGGG(SEQ ID NO:360)、GGGGGGG(SEQ IDNO:370)、GGGGGGGGGG(SEQ ID NO:371)和GGGGGGGGGGGGGGG(SEQ ID NO:372)。例如，参照SEQ ID NO:5所示氨基酸位置，PRB结构域中的修饰可相应于C105-T147del→(Gly)n，其中n是2-20，如C105-T147del→(Gly)15，C105-T148del→(Gly)10,C105-T147del→(Gly)7,C105-T147del→(Gly)5或者C105-T147del→(Gly)3。
在本发明提供的缀合物的一些实施方案中，缀合物中的ADA2蛋白在一或多个天然或非天然糖基化位点可以是糖基化的。例如，在本发明提供的含有变体ADA2蛋白的缀合物的一些实施方案中，缀合物中的变体ADA2蛋白可包含通过导入非天然糖基化位点而改变糖基化的修饰。所述非天然糖基化位点可以通过导入一或多个氨基酸置换、插入或缺失1、2或3个氨基酸产生标准糖基化序列(NXT/S，其中X对于N连接的碳水化合物不是Pro，对于O连接的碳水化合物不是S/T)导入。例如，参照SEQ ID NO:5所示氨基酸位置，改变糖基化的修饰选自相应于--→N1/--→A2/--→S3、R20N/V22S、K371N/D373S、K372N/I374S、T403N/H405S和G404N/P406S的修饰。
在本发明提供的缀合物的一些实施方案中，缀合物中的变体ADA2蛋白可具有SEQID NO:13-63或71-285任一所示的氨基酸序列或其催化活性部分。
在本发明提供的含有ADA2或变体ADA2蛋白的缀合物的一些实施方案中，所述缀合物与未缀合的ADA2蛋白相比，保留腺苷脱氨酶活性。例如，所述缀合物可呈现出未缀合的ADA2蛋白的腺苷脱氨酶活性的50％-500％、50％-200％、50％-100％、50％-80％、80％-500％、80％-200％、80％-100％、100％-500％或者100％-200％、或大约50％-500％、50％-200％、50％-100％、50％-80％、80％-500％、80％-200％、80％-100％、100％-500％或者100％-200％(包括端点)，如未缀合的ADA2蛋白的腺苷脱氨酶活性的至少50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％、200％、300％、400％、500％或更高。在本发明提供的缀合物的一些实施方案中，缀合物中的ADA2可呈现出为至少或至少大约5×103M-1s-1、6×103M-1s-1、7×103M-1s-1、8×103M-1s-1、9×103M-1s-1、1×104M-1s-1、2×104M-1s-1、3×104M-1s-1、4×104M-1s-1、5×104M-1s-1、6×104M-1s-1、7×104M-1s-1、8×104M-1s-1、9×104M-1s-1、1×105M-1s-1、2×105M-1s-1、3×105M-1s-1、4×105M-1s-1、5×105M-1s-1或更高的催化效率(kcat/KM)。
本发明提供了含有本发明提供的任何变体ADA2蛋白或其催化活性部分、本发明提供的任何变体ADA2二聚体或者本发明提供的任何举例的任何缀合物及治疗剂的组合。本发明还提供了含有任何ADA2蛋白及治疗剂的组合。在本发明提供的组合的任何实例中，ADA2蛋白可以是单体或二聚体。例如，ADA2蛋白可以是二聚体，如同源二聚体。
在本发明提供的组合的一些实施方案中，所述治疗剂可以选自抗体、细胞毒性剂、化疗剂、细胞因子、生长抑制剂、抗激素剂、激酶抑制剂、抗血管发生剂、心脏保护剂、免疫刺激剂、免疫抑制剂、免疫检查点抑制剂、抗生素和血管发生抑制剂。例如，治疗剂可以是抗癌剂。在本发明提供的组合的一些实施方案中，抗癌剂可以是抗癌抗体、化疗剂、放射免疫治疗剂、抗血管发生剂或者免疫检查点抑制剂。
例如，抗癌剂可以是免疫检查点抑制剂；且免疫检查点抑制剂的靶可选自CTLA4、PD-1和PD-L1。在本发明提供的组合的一些实施方案中，免疫检查点抑制剂可以是抗体、融合蛋白、适体，或者其免疫检查点蛋白结合片段。例如，免疫检查点抑制剂是抗免疫检查点蛋白抗体或者其抗原结合片段。在特别的实例中，免疫检查点抑制剂选自：抗CTLA4抗体、其衍生物，或者其抗原结合片段；抗PD-L1抗体、其衍生物，或者其抗原结合片段；及抗PD-1抗体、其衍生物，或者其抗原结合片段。例如，免疫检查点抑制剂可选自：伊匹木单抗(Ipilimumab)、其衍生物，或者其抗原结合片段；曲美木单抗(Tremelimumab)、其衍生物，或者其抗原结合片段；纳武单抗(Nivolumab)、其衍生物，或者其抗原结合片段；及Pidilizumab、其衍生物，或者其抗原结合片段。
在本发明提供的组合的一些实施方案中，治疗剂可以是抗透明质酸剂。例如，抗透明质酸剂可以是可溶的透明质酸酶。在本发明提供的组合的一些实施方案中，可溶的透明质酸酶在中性pH可以呈现透明质酸酶活性。特别地，可溶的透明质酸酶可以选自牛、羊或者缺少全部或部分糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚附着序列的C末端截短的人PH20。例如，可溶的透明质酸酶是C末端截短的人PH20，其缺少全部或部分GPI锚附着序列，如SEQ ID NO:481-488、493-514或526-532任一所示，或者具有与SEQ ID NO:481-488、493-514或526-532任一所示氨基酸序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列相同性的氨基酸序列，及是可溶的且保留透明质酸酶活性。在本发明提供的组合的一些实施方案中，抗透明质酸剂或可溶的透明质酸酶可以与聚合物如PEG部分缀合。
在本发明提供的组合的一些实施方案中，ADA2蛋白可包括具有SEQ ID NO:5、326-334、340、375或380-383任一所示氨基酸序列、与SEQ ID NO:5、326-334、340、375或380-383所示氨基酸序列可呈现至少85％序列相同性的序列或其催化活性形式的多肽。例如，ADA2蛋白可包括具有与SEQ ID NO:5、326-334、340、375或380-383所示氨基酸序列可呈现至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列相同性的氨基酸序列或其催化活性部分的蛋白质。在特别的实例中，ADA2蛋白可含有与SEQ ID NO:5所示氨基酸序列可呈现出至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列相同性的氨基酸序列。例如，ADA2蛋白可含有SEQ ID NO:5所示氨基酸序列。
在本发明提供的组合的一些实施方案中，ADA2蛋白是具有在未修饰的ADA2多肽或其催化活性部分的氨基酸序列中包含一或多个修饰的氨基酸序列的变体ADA2蛋白。在任何这种实例中，未修饰的ADA2蛋白可包含SEQ ID NO:5所示氨基酸序列，或者与SEQ ID NO:5所示氨基酸序列可呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列，或者是其催化活性部分；所述氨基酸修饰选自氨基酸置换、缺失和插入；及当是二聚体形式时，变体ADA2蛋白可呈现腺苷脱氨酶活性以将腺苷转变为肌苷。
在本发明提供的组合的一些实施方案中，当是二聚体形式时，ADA2蛋白可呈现出是至少或至少大约5×103M-1s-1、6×103M-1s-1、7×103M-1s-1、8×103M-1s-1、9×103M-1s-1、1×104M-1s-1、2×104M-1s-1、3×104M-1s-1、4×104M-1s-1、5×104M-1s-1、6×104M-1s-1、7×104M-1s-1、8×104M-1s-1、9×104M-1s-1、1×105M-1s-1、2×105M-1s-1、3×105M-1s-1、4×105M-1s-1、5×105M-1s-1或更高的催化效率(kcat/KM)。
在本发明提供的组合的一些实施方案中，未修饰的ADA2蛋白的氨基酸序列中的修饰可包括氨基酸置换；并且参照SEQ ID NO:5所示氨基酸位置，变体ADA2蛋白在相应于氨基酸残基11、13、20、22、26、86、179、217、219、221、258、262、264、266、267、277、283、296、309、317、321、352、366、371、372、373、374、403、404、405、406、441、444、452、461、469或470的氨基酸位置可包含一或多个氨基酸置换。例如，参照SEQ ID NO:5所示氨基酸位置，变体ADA2蛋白可包含选自如下的一或多个氨基酸置换：K11A、K11D、K11E、K13A、K13D、K13E、R20A、R20D、R20E、R20N、V22S、K26A、K26D、K26E、D86A、D86C、D86E、D86F、D86G、D86H、D86I、D86K、D86L、D86M、D86N、D86P、D86Q、D86R、D86S、D86T、D86V、D86W、D86Y、E179A、E179C、E179D、E179F、E179G、E179H、E179I、E179K、E179L、E179M、E179N、E179P、E179Q、E179R、E179S、E179T、E179V、E179W、E179Y、R217A、R217D、R217E、R219A、R219C、R219D、R219E、R219F、R219G、R219H、R219I、R219K、R219L、R219M、R219N、R219P、R219Q、R219S、R219T、R219V、R219W、R219Y、L221A、L221C、L221D、L221E、L221F、L221G、L221H、L221I、L221K、L221M、L221N、L221P、L221Q、L221R、L221S、L221T、L221V、L221W、L221Y、K258A、K258D、K258E、S262A、S262C、S262D、S262E、S262F、S262G、S262H、S262I、S262K、S262L、S262M、S262N、S262P、S262Q、S262R、S262T、S262V、S262W、S262Y、H264A、H264C、H264D、H264E、H264F、H264G、H264I、H264K、H264L、H264M、H264N、H264P、H264Q、H264R、H264S、H264T、H264V、H264W、H264Y、S266A、S266C、S266D、S266E、S266F、S266G、S266H、S266I、S266K、S266L、S266M、S266N、S266P、S266Q、S266R、S266T、S266V、S266W、S266Y、K267A、K267C、K267D、K267E、K267F、K267G、K267H、K267I、K267L、K267M、K267N、K267P、K267Q、K267R、K267S、K267T、K267V、K267W、K267Y、R277A、R277D、R277E、R283A、R283D、R283E、V296A、V296C、V296D、V296E、V296F、V296G、V296H、V296I、V296K、V296L、V296M、V296N、V296P、V296Q、V296R、V296S、V296T、V296W、V296Y、K309A、K309D、K309E、K317A、K317D、K317E、K321A、K321D、K321E、R352A、R352D、R352E、R366A、R366D、R366E、K371A、K371D、K371E、K371N、K372A、K372D、K372E、K372N、D373S、I374S、T403N、G404N、H405S、P406S、R441A、R441D、R441E、K444A、K444D、K444E、K452A、K452D、K452E、K461A、K461D、K461E、K469A、K469D、K469E、K470A、K470D和K470E。在特别的实例中，参照SEQ ID NO:5所示氨基酸位置，变体ADA2蛋白可包含选自如下的一或多个氨基酸置换：K11A、K11E、R20A、R20D、R20E、R219K、R219Q、L221A、L221V、L221G、S262N、H264Q、H264G、R366A、R366D、R366E、K371A、K371D、K371E、K372A、K372D、K372E、K452D和K452E。在本发明提供的组合的一些实例中，参照SEQID NO:5所示氨基酸位置，变体ADA2蛋白可包含选自如下的氨基酸置换：K11A/R20A、K11A/R20A/K371A、R20A/K371A、K11A/K371A、S262N/K371D、S262N/K371E、S262N/R20E、S262N/R20E/K371D、S262N/R20E/K371E、R219Q/K371E、R219Q/K371D、R219Q/R20E、R219Q/K371E/R20E、R219Q/K371D/R20E、R219Q/S262N/K371E、R219Q/S262N/K371D、R219Q/S262N/R20E、R219Q/S262N/K371E/R20E、R219Q/S262N/K371D/R20E和R219Q/S262N。
在本发明提供的组合的一些实施方案中，变体ADA2蛋白可在推定的受体结合(PRB)结构域中包含一或多个氨基酸的修饰，其中所述修饰是氨基酸缺失、插入或置换。例如，参照SEQ ID NO:5所示氨基酸位置，变体ADA2可包含相应于在或大约在氨基酸残基98-156或者氨基酸残基105-148(包括端点)之间的任一或多个连续氨基酸残基的一或多个连续氨基酸残基的缺失。在一些实施方案中，ADA2多肽的变体可进一步包含缺失区域由肽接头取代。例如，所述肽接头可选自(Gly)n(SEQ ID NO:368)，其中n是2-20；(GGGGS)n(SEQ IDNO:343)，其中n是1-6；(SSSSG)n(SEQ ID NO:344)，其中n是1-6；(AlaAlaProAla)n(SEQ IDNO:350)，其中n是1-6；GKSSGSGSESKS(SEQ ID NO:345)；GGSTSGSGKSSEGKG(SEQ ID NO:346)；GSTSGSGKSSSEGSGSTKG(SEQ ID NO:347)；GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:348)；及EGKSSGSGSESKEF(SEQ ID NO:349)。在特别的实例中，肽接头选自GGG(SEQ ID NO:369)；GGGGG(SEQ ID NO:360)；GGGGGGG(SEQ ID NO:370)；GGGGGGGGGG(SEQ ID NO:371)及GGGGGGGGGGGGGGG(SEQ ID NO:372)。在本发明提供的组合的一些实施方案中，参照SEQ IDNO:5所示氨基酸位置，变体ADA2多肽的PRB结构域中的修饰相应于C105-T147del→(Gly)n，其中n是2-20，如C105-T147del→(Gly)15、C105-T147del→(Gly)10、C105-T147del→(Gly)7、C105-T147del→(Gly)5或C105-T147del→(Gly)3。
在本发明提供的组合的一些实施方案中，所述组合中的ADA2蛋白可以在一或多个天然或非天然糖基化位点是糖基化的。例如，在本发明提供的含有变体ADA2蛋白的组合的一些实施方案中，组合中的变体ADA2蛋白包含通过导入非天然糖基化位点而改变糖基化的修饰。所述非天然糖基化位点通过一或多个氨基酸置换或插入1、2或3个氨基酸导入。例如，参照SEQ ID NO:5所示氨基酸位置，改变高糖基化的修饰可选自相应于--→N1/--→A2/--→S3、R20N/V22S、K371N/D373S、K372N/I374S、T403N/H405S和G404N/P406S的修饰。
在本发明提供的组合的一些实施方案中，变体ADA2多肽具有SEQ ID NO:13-63或71-285任一所示氨基酸序列或其催化活性部分。
本发明提供了药物组合物，其可包含在药物可接受的运载体中的本发明提供的任何变体ADA2蛋白或其催化活性部分、本发明提供的任何变体ADA2二聚体或者本发明提供的任何缀合物。在一些实施方案中，所述药物组合物可以配制为局部或全身性给予。例如，所述药物组合物配制为经静脉内给予。
本发明提供了治疗对象的肿瘤或癌症的方法，其可包括给予对象本发明提供的任何变体ADA2蛋白或其催化活性部分、本发明提供的任何变体ADA2二聚体、本发明提供的任何缀合物，或者本发明提供的任何组合。本发明还提供了本发明提供的任何变体ADA2蛋白或其催化活性部分、本发明提供的任何变体ADA2二聚体或者本发明提供的任何缀合物在治疗对象的肿瘤或癌症中的医学应用或药物组合物。本发明还提供了本发明提供的任何组合用于治疗肿瘤或癌症的组合。
本发明还提供了治疗对象的肿瘤或癌症的方法，可包括给予对象任何ADA2蛋白。本发明还提供了ADA2蛋白或者含有ADA2蛋白的药物组合物治疗肿瘤或癌症的医学应用。本发明还提供了治疗肿瘤或癌症的含有ADA2蛋白和治疗剂的组合。
在本发明提供的方法、应用、药物组合物的一些实施方案中，所述肿瘤可以是实体瘤或转移瘤。在特别的实例中，所述肿瘤可以是癌(carcinoma)、神经胶质瘤、肉瘤、腺癌、腺肉瘤或腺瘤。在一些实施方案中，所述肿瘤可以是乳腺、心脏、肺、小肠、结肠、脾、肾、膀胱、头颈、卵巢、前列腺、脑、胰腺、皮肤、骨、骨髓、血液、胸腺、子宫、睾丸、子宫颈或肝脏的肿瘤。
在本发明提供的方法的一些实施方案中，基于升高的血浆腺苷、肿瘤相关的腺苷受体(ADR)表达或者肿瘤相关的核苷酸酶表达的水平选择治疗的对象。在特别的实例中，所述ADR是A2A或A2B。在特别的实例中，所述核苷酸酶是CD39或CD73。在本发明提供的方法的一些实施方案中，与预定水平或预定量或对照样品相比，所述升高的水平是至少0.5倍、1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、150倍、200倍、500倍、1000倍或更高。
在本发明提供的方法的一些实施方案中，治疗对象的肿瘤或癌症的方法可进一步包括给予一或多种抗癌剂或治疗。例如，抗癌剂可选自抗癌抗体、化疗剂、放射性免疫治疗剂、抗血管发生剂和免疫检查点抑制剂。
本发明提供了治疗对象的疾病或状况的方法，可包括给予对象本发明提供的任何变体ADA2蛋白或其催化活性部分、本发明提供的任何变体ADA2二聚体、本发明提供的任何缀合物或者本发明提供的任何组合以治疗非癌过度增生性疾病、纤维化疾病、感染性疾病、血管病变或者重症联合免疫缺陷(SCID)等疾病或状况。本发明还提供了本发明提供的任何变体ADA2蛋白或其催化活性部分、本发明提供的任何变体ADA2二聚体或本发明提供的任何缀合物用以治疗对象的非癌过度增生性疾病、纤维化疾病、感染性疾病、血管病变或者重症联合免疫缺陷(SCID)的医学应用或药物组合物。本发明还提供了本发明提供的任何组合用于治疗对象的非癌过度增生性疾病、纤维化疾病、感染性疾病、血管病变或者重症联合免疫缺陷(SCID)的组合。本发明还提供了治疗对象的疾病或状况的方法，可包括给予对象任何ADA2蛋白以治疗非癌过度增生性疾病、纤维化疾病、感染性疾病、血管病变或者重症联合免疫缺陷(SCID)等疾病或状况。本发明还提供了ADA2蛋白或含有ADA2蛋白的药物组合物治疗非癌过度增生性疾病、纤维化疾病、感染性疾病、血管病变或者重症联合免疫缺陷(SCID)等疾病或状况的医学应用。本发明还提供了治疗非癌过度增生性疾病、纤维化疾病、感染性疾病、血管病变或者重症联合免疫缺陷(SCID)等疾病或状况的含有ADA2蛋白和治疗剂的组合。
在本发明提供的方法、应用、药物组合物的一些实施方案中，ADA2蛋白可以是单体或二聚体。例如，ADA2蛋白可以是二聚体，特别是同源二聚体。在本发明提供的方法、应用、药物组合物或组合的一些实施方案中，ADA2蛋白可含有SEQ ID NO:5、326-334、340、375或380-383任一所示氨基酸序列，与SEQ ID NO:5、326-334、340、375或380-383所示氨基酸序列可呈现至少85％序列相同性的序列或其催化活性形式。例如，ADA2蛋白可含有与SEQ IDNO:5、326-334、340、375或380-383所示氨基酸序列可呈现至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列相同性的氨基酸序列或其催化活性部分。在特别的实例中，ADA2蛋白可含有与SEQ ID NO:5所示氨基酸序列可呈现至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列相同性的氨基酸序列或其催化活性部分。例如，ADA2蛋白可含有SEQ ID NO:5所示氨基酸序列。
在本发明提供的方法、应用、药物组合物或组合的一些实施方案中，ADA2蛋白是在未修饰的ADA2多肽的氨基酸序列中包含一或多个修饰的变体ADA2蛋白或其催化活性部分。在任何这种实例中，未修饰的ADA2蛋白可包含SEQ ID NO:5所示氨基酸序列，或者与SEQ IDNO:5所示氨基酸序列可呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列，或者是其催化活性部分；所述氨基酸修饰选自氨基酸置换、缺失和插入；当是二聚体形式时，变体ADA2蛋白可呈现腺苷脱氨酶活性以将腺苷转变为肌苷。
在本发明提供的方法、应用、药物组合物或组合的一些实施方案中，当是二聚体形式时，ADA2蛋白可呈现为至少或至少大约5×103M-1s-1、6×103M-1s-1、7×103M-1s-1、8×103M- 1s-1、9×103M-1s-1、1×104M-1s-1、2×104M-1s-1、3×104M-1s-1、4×104M-1s-1、5×104M-1s-1、6×104M-1s-1、7×104M-1s-1、8×104M-1s-1、9×104M-1s-1、1×105M-1s-1、2×105M-1s-1、3×105M-1s-1、4×105M-1s-1、5×105M-1s-1或更高的催化效率(kcat/KM)。
在本发明提供的方法、应用、药物组合物或组合的一些实施方案中，未修饰的ADA2多肽的氨基酸序列中的修饰可包括氨基酸置换；且参照SEQ ID NO:5所示氨基酸位置，变体ADA2蛋白在相应于氨基酸残基11、13、20、22、26、86、179、217、219、221、258、262、264、266、267、277、283、296、309、317、321、352、366、371、372、373、374、403、404、405、406、441、444、452、461、469或470的氨基酸位置可包含一或多个氨基酸置换。例如，参照SEQ ID NO:5所示氨基酸位置，变体ADA2蛋白可包含选自如下的一或多个氨基酸置换：K11A、K11D、K11E、K13A、K13D、K13E、R20A、R20D、R20E、R20N、V22S、K26A、K26D、K26E、D86A、D86C、D86E、D86F、D86G、D86H、D86I、D86K、D86L、D86M、D86N、D86P、D86Q、D86R、D86S、D86T、D86V、D86W、D86Y、E179A、E179C、E179D、E179F、E179G、E179H、E179I、E179K、E179L、E179M、E179N、E179P、E179Q、E179R、E179S、E179T、E179V、E179W、E179Y、R217A、R217D、R217E、R219A、R219C、R219D、R219E、R219F、R219G、R219H、R219I、R219K、R219L、R219M、R219N、R219P、R219Q、R219S、R219T、R219V、R219W、R219Y、L221A、L221C、L221D、L221E、L221F、L221G、L221H、L221I、L221K、L221M、L221N、L221P、L221Q、L221R、L221S、L221T、L221V、L221W、L221Y、K258A、K258D、K258E、S262A、S262C、S262D、S262E、S262F、S262G、S262H、S262I、S262K、S262L、S262M、S262N、S262P、S262Q、S262R、S262T、S262V、S262W、S262Y、H264A、H264C、H264D、H264E、H264F、H264G、H264I、H264K、H264L、H264M、H264N、H264P、H264Q、H264R、H654S、H264T、H264V、H264W、H264Y、S266A、S266C、S266D、S266E、S266F、S266G、S266H、S266I、S266K、S266L、S266M、S266N、S266P、S266Q、S266R、S266T、S266V、S266W、S266Y、K267A、K267C、K267D、K267E、K267F、K267G、K267H、K267I、K267L、K267M、K267N、K267P、K267Q、K267R、K267S、K267T、K267V、K267W、K267Y、R277A、R277D、R277E、R283A、R283D、R283E、V296A、V296C、V296D、V296E、V296F、V296G、V296H、V296I、V296K、V296L、V296M、V296N、V296P、V296Q、V296R、V296S、V296T、V296W、V296Y、K309A、K309D、K309E、K317A、K317D、K317E、K321A、K321D、K321E、R352A、R352D、R352E、R366A、R366D、R366E、K371A、K371D、K371E、K371N、K372A、K372D、K372E、K372N、D373S、I374S、T403N、G404N、H405S、P406S、R441A、R441D、R441E、K444A、K444D、K444E、K452A、K452D、K452E、K461A、K461D、K461E、K469A、K469D、K469E、K470A、K470D和K470E。
在特别的实例中，参照SEQ ID NO:5所示氨基酸位置，变体ADA2蛋白可包含选自如下的一或多个氨基酸置换：K11A、K11E、R20A、R20D、R20E、R219K、R219Q、L221A、L221V、L221G、S262N、H264Q、H264G、R366A、R366D、R366E、K371A、K371D、K371E、K372A、K372D、K372E、K452D和K452E。在本发明提供的方法、应用、药物组合物或组合的一些实施方案中，参照SEQ ID NO:5所示氨基酸位置，变体ADA2蛋白可包含选自如下的氨基酸置换：K11A/R20A、K11A/R20A/K371A、R20A/K371A、K11A/K371A、S262N/K371D、S262N/K371E、S262N/R20E、S262N/R20E/K371D、S262N/R20E/K371E、R219Q/K371E、R219Q/K371D、R219Q/R20E、R219Q/K371E/R20E、R219Q/K371D/R20E、R219Q/S262N/K371E、R219Q/S262N/K371D、R219Q/S262N/R20E、R219Q/S262N/K371E/R20E、R219Q/S262N/K371D/R20E和R219Q/S262N。
在本发明提供的方法、应用、药物组合物或组合的一些实施方案中，变体ADA2蛋白在推定的受体结合(PRB)结构域中可包含一或多个氨基酸的修饰，如氨基酸缺失、插入或置换。例如，参照SEQ ID NO:5所示氨基酸位置，变体ADA2可包含相应于在或大约在氨基酸残基98-156或者氨基酸残基105-148(包括端点)之间任一或多个连续氨基酸残基的一或多个连续氨基酸的缺失。在本发明提供的方法、应用、药物组合物或组合的任何这种实例中，ADA2蛋白的变体可进一步包含缺失的区域由肽接头取代。例如，所述肽接头选自(Gly)n(SEQ ID NO:368)，其中n是2-20；(GGGGS)n(SEQ ID NO:343)，其中n是1-6；(SSSSG)n(SEQID NO:344)，其中n是1-6；(AlaAlaProAla)n(SEQ ID NO:350)，其中n是1-6；GKSSGSGSESKS(SEQ ID NO:345)；GGSTSGSGKSSEGKG(SEQ ID NO:346)；GSTSGSGKSSSEGSGSTKG(SEQ ID NO:347)；GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:348)及EGKSSGSGSESKEF(SEQ ID NO:349)。在特别的实例中，肽接头选自GGG(SEQ ID NO:369)、GGGGG(SEQ ID NO:360)、GGGGGGG(SEQ ID NO:370)、GGGGGGGGGG(SEQ ID NO:371)和GGGGGGGGGGGGGGG(SEQ ID NO:372)。
例如，参照SEQ ID NO:5所示氨基酸位置，在ADA2蛋白的PRB结构域中的修饰相应于C105-T147del→(Gly)n，其中n是2-20，如C105-T147del→(Gly)15、C105-T147del→(Gly)10、C105-T147del→(Gly)7、C105-T147del→(Gly)5或C105-T147del→(Gly)3。
在本发明提供的方法、应用、药物组合物或组合的一些实施方案中，ADA2蛋白在一或多个天然或非天然糖基化位点可以是糖基化的。例如，在本发明提供的含有变体ADA2蛋白的一些实施方案中，变体ADA2蛋白包含通过导入非天然糖基化位点改变糖基化的修饰。例如，非天然糖基化位点通过氨基酸置换或插入1、2或3个氨基酸而导入。在特别的实例中，参照SEQ ID NO:5所示氨基酸位置，改变糖基化的修饰选自相应于--→N1/--→A2/--→S3、R20N/V22S、K371N/D373S、K372N/I374S、T403N/H405S和G404N/P406S的修饰。
在本发明提供的方法、应用、药物组合物或组合的一些实施方案中，变体ADA2可包括具有SEQ ID NO:13-63或71-285任一所示氨基酸序列的多肽或其催化活性部分。
在本发明提供的方法、应用、药物组合物或组合的一些实施方案中，所述对象可以是哺乳动物，特别是人。在本发明提供的方法的一些实施方案中，所述药物组合物可以经胃肠外、局部或者全身给予。例如，所述药物组合物可以经鼻内、肌肉、皮内、腹腔内、静脉内、皮下、口服或者通过肺部给予。
在本发明提供的变体ADA2蛋白或其催化活性部分、所述方法、组合物、缀合物、修饰形式、载体、细胞、组合、应用和组合物中的变体ADA2蛋白及编码本发明提供的变体ADA2的核酸和包括所述核酸的载体的一些实施方案中，所述修饰可以是如下氨基酸置换、插入、缺失的任一或多种及其任意组合。下文列出的修饰参照成熟编号，如SEQ ID NO:5所示氨基酸位置所示。举例的本发明提供的ADA2变体在下文示出；应理解可以组合不同类型的突变体(氨基酸修饰)以利用每种类型突变的性质。本领域技术人员理解蛋白质中的突变的作用一般至少是累加的，且可以是协同的。
1.肝素结合突变体
如下修饰可赋予降低的肝素结合。与肝素结合可消耗给予的ADA2的循环水平。因此，如下ADA2变体可以增加给予的ADA2的生物利用度和药动学：
K11A，K11D，K11E，K13A，K13D，K13E，K371A，K371D，K371E，K372A，K372D，K372E，K452A，K452D，K452E，R20A，R20D，R20E，R366A，R366D，R366E，K26A，K26D，K26E，R217A，R217D，R217E，K258A，K258D，K258E，R277A，R277D，R277E，R283A，R283D，R283E，K309A，K309D，K309E，K317A，K317D，K317E，K321A，K321D，K321E，R352A，R352D，R352E，R441A，R441D，R441E，K444A，K444D，K444E，K461A，K461D，K461E，K469A，K469D，K469E，K470A，K470D和K470E。
举例的含有这些置换的肝素结合突变体。
K11A(SEQ ID NO:13)，K11D(SEQ ID NO:14)，K11E(SEQ ID NO:15)，K13A(SEQ IDNO:16)，K13D(SEQ ID NO:17)，K13E(SEQ ID NO:18)，K371A(SEQ ID NO:19)，K371D(SEQ IDNO:20)，K371E(SEQ ID NO:21)，K372A(SEQ ID NO:22)，K372D(SEQ ID NO:23)，K372E(SEQID NO:24)，K452A(SEQ ID NO:25)，K452D(SEQ ID NO:26)，K452E(SEQ ID NO:27)，R20A(SEQ ID NO:28)，R20D(SEQ ID NO:29)，R20E(SEQ ID NO:30)，R366A(SEQ ID NO:31)，R366D(SEQ ID NO:32)，R366E(SEQ ID NO:33)，K26A(SEQ ID NO:71)，K26D(SEQ ID NO:72)，K26E(SEQ ID NO:73)，R217A(SEQ ID NO:74)，R217D(SEQ ID NO:75)，R217E(SEQ IDNO:76)，K258A(SEQ ID NO:77)，K258D(SEQ ID NO:78)，K258E(SEQ ID NO:79)，R277A(SEQID NO:80)，R277D(SEQ ID NO:81)，R277E(SEQ ID NO:82)，R283A(SEQ ID NO:83)，R283D(SEQ ID NO:84)，R283E(SEQ ID NO:85)，K309A(SEQ ID NO:86)，K309D(SEQ ID NO:87)，K309E(SEQ ID NO:88)，K317A(SEQ ID NO:89)，K317D(SEQ ID NO:90)，K317E(SEQ ID NO:91)，K321A(SEQ ID NO:92)，K321D(SEQ ID NO:93)，K321E(SEQ ID NO:94)，R352A(SEQ IDNO:95)，R352D(SEQ ID NO:96)，R352E(SEQ ID NO:97)，R441A(SEQ ID NO:98)，R441D(SEQID NO:99)，R441E(SEQ ID NO:100)，K444A(SEQ ID NO:101)，K444D(SEQ ID NO:102)，K444E(SEQ ID NO:103)，K461A(SEQ ID NO:104)，K461D(SEQ ID NO:105)，K461E(SEQ IDNO:106)，K469A(SEQ ID NO:107)，K469D(SEQ ID NO:108)，K469E(SEQ ID NO:109)，K470A(SEQ ID NO:110)，K470D(SEQ ID NO:111)，和K470E(SEQ ID NO:112)。
2.活性位点突变体
如下修饰可赋予增加的催化效率。所述修饰是在活性位点的选择残基中，且可以导致对于腺苷改良的催化效率(kcat/Km)。与肝素结合可消耗给予的ADA2的循环水平。因此，如下ADA2变体可以赋予增加的腺苷脱氨酶活性：
H264A，H264Q，H264N，H264G，R219K，R219Q，R219N，R219A，L221A，L221V，L221G，E179D，E179A，E179S，E179T，E179V，E179G，S262A，S262V，S262M，S262N，D86A，D86C，D86E，D86F，D86G，D86H，D86I，D86K，D86L，D86M，D86N，D86P，D86Q，D86R，D86S，D86T，D86V，D86W，D86Y，E179C，E179F，E179H，E179I，E179K，E179L，E179M，E179N，E179P，E179Q，E179R，E179W，E179Y，R219C，R219D，R219E，R219F，R219G，R219H，R219I，R219L，R219M，R219P，R219S，R219T，R219V，R219W，R219Y，L221C，L221D，L221E，L221F，L221H，L221I，L221K，L221M，L221N，L221P，L221Q，L221R，L221S，L221T，L221W，L221Y，S262C，S262D，S262E，S262F，S262G，S262H，S262I，S262K，S262L，S262P，S262Q，S262R，S262T，S262W，S262Y，H264C，H264D，H264E，H264F，H264I，H264K，H264L，H264M，H264P，H264R，H264S，H264T，H264V，H264W，H264Y，S266A，S266C，S266D，S266E，S266F，S266G，S266H，S266I，S266K，S266L，S266M，S266N，S266P，S266Q，S266R，S266T，S266V，S266W，S266Y，K267A，K267C，K267D，K267E，K267F，K267G，K267H，K267I，K267L，K267M，K267N，K267P，K267Q，K267R，K267S，K267T，K267V，K267W，K267Y，V296A，V296C，V296D，V296E，V296F，V296G，V296H，V296I，V296K，V296L，V296M，V296N，V296P，V296Q，V296R，V296S，V296T，V296W，和V296Y。
举例的含有这些置换的活性位点突变体：
H264A(SEQ ID NO:34)，H264Q(SEQ ID NO:35)，H264N(SEQ ID NO:36)，H264G(SEQID NO:37)，R219K(SEQ ID NO:38)，R219Q(SEQ ID NO:39)，R219N(SEQ ID NO:40)，R219A(SEQ ID NO:41)，L221A(SEQ ID NO:42)，L221V(SEQ ID NO:43)，L221G(SEQ ID NO:44)，E179D(SEQ ID NO:45)，E179A(SEQ ID NO:46)，E179S(SEQ ID NO:47)，E179T(SEQ ID NO:48)，E179V(SEQ ID NO:49)，E179G(SEQ ID NO:50)，S262A(SEQ ID NO:51)，S262V(SEQ IDNO:52)，S262M(SEQ ID NO:53)，S262N(SEQ ID NO:54)，D86A(SEQ ID NO:113)，D86C(SEQID NO:114)，D86E(SEQ ID NO:115)，D86F(SEQ ID NO:116)，D86G(SEQ ID NO:117)，D86H(SEQ ID NO:118)，D86I(SEQ ID NO:119)，D86K(SEQ ID NO:120)，D86L(SEQ ID NO:121)，D86M(SEQ ID NO:122)，D86N(SEQ ID NO:123)，D86P(SEQ ID NO:124)，D86Q(SEQ ID NO:125)，D86R(SEQ ID NO:126)，D86S(SEQ ID NO:127)，D86T(SEQ ID NO:128)，D86V(SEQ IDNO:129)，D86W(SEQ ID NO:130)，D86Y(SEQ ID NO:131)，E179C(SEQ ID NO:132)，E179F(SEQ ID NO:133)，E179H(SEQ ID NO:134)，E179I(SEQ ID NO:135)，E179K(SEQ ID NO:136)，E179L(SEQ ID NO:137)，E179M(SEQ ID NO:138)，E179N(SEQ ID NO:139)，E179P(SEQID NO:140)，E179Q(SEQ ID NO:141)，E179R(SEQ ID NO:142)，E179W(SEQ ID NO:143)，E179Y(SEQ ID NO:144)，R219C(SEQ ID NO:145)，R219D(SEQ ID NO:146)，R219E(SEQ IDNO:147)，R219F(SEQ ID NO:148)，R219G(SEQ ID NO:149)，R219H(SEQ ID NO:150)，R219I(SEQ ID NO:151)，R219L(SEQ ID NO:152)，R219M(SEQ ID NO:153)，R219P(SEQ ID NO:154)，R219S(SEQ ID NO:155)，R219T(SEQ ID NO:156)，R219V(SEQ ID NO:157)，R219W(SEQID NO:158)，R219Y(SEQ ID NO:159)，L221C(SEQ ID NO:160)，L221D(SEQ ID NO:161)，L221E(SEQ ID NO:162)，L221F(SEQ ID NO:163)，L221H(SEQ ID NO:164)，L221I(SEQ IDNO:165)，L221K(SEQ ID NO:166)，L221M(SEQ ID NO:167)，L221N(SEQ ID NO:168)，L221P(SEQ ID NO:169)，L221Q(SEQ ID NO:170)，L221R(SEQ ID NO:171)，L221S(SEQ ID NO:172)，L221T(SEQ ID NO:173)，L221W(SEQ ID NO:174)，L221Y(SEQ ID NO:175)，S262C(SEQID NO:176)，S262D(SEQ ID NO:177)，S262E(SEQ ID NO:178)，S262F(SEQ ID NO:179)，S262G(SEQ ID NO:180)，S262H(SEQ ID NO:181)，S262I(SEQ ID NO:182)，S262K(SEQ IDNO:183)，S262L(SEQ ID NO:184)，S262P(SEQ ID NO:185)，S262Q(SEQ ID NO:186)，S262R(SEQ ID NO:187)，S262T(SEQ ID NO:188)，S262W(SEQ ID NO:189)，S262Y(SEQ ID NO:190)，H264C(SEQ ID NO:191)，H264D(SEQ ID NO:192)，H264E(SEQ ID NO:193)，H264F(SEQID NO:194)，H264I(SEQ ID NO:195)，H264K(SEQ ID NO:196)，H264L(SEQ ID NO:197)，H264M(SEQ ID NO:198)，H264P(SEQ ID NO:199)，H264R(SEQ ID NO:200)，H264S(SEQ IDNO:201)，H264T(SEQ ID NO:202)，H264V(SEQ ID NO:203)，H264W(SEQ ID NO:204)，H264Y(SEQ ID NO:205)，S266A(SEQ ID NO:206)，S266C(SEQ ID NO:207)，S266D(SEQ ID NO:208)，S266E(SEQ ID NO:209)，S266F(SEQ ID NO:210)，S266G(SEQ ID NO:211)，S266H(SEQID NO:212)，S266I(SEQ ID NO:213)，S266K(SEQ ID NO:214)，S266L(SEQ ID NO:215)，S266M(SEQ ID NO:216)，S266N(SEQ ID NO:217)，S266P(SEQ ID NO:218)，S266Q(SEQ IDNO:219)，S266R(SEQ ID NO:220)，S266T(SEQ ID NO:221)，S266V(SEQ ID NO:222)，S266W(SEQ ID NO:223)，S266Y(SEQ ID NO:224)，K267A(SEQ ID NO:225)，K267C(SEQ ID NO:226)，K267D(SEQ ID NO:227)，K267E(SEQ ID NO:228)，K267F(SEQ ID NO:229)，K267G(SEQID NO:230)，K267H(SEQ ID NO:231)，K267I(SEQ ID NO:232)，K267L(SEQ ID NO:233)，K267M(SEQ ID NO:234)，K267N(SEQ ID NO:235)，K267P(SEQ ID NO:236)，K267Q(SEQ IDNO:237)，K267R(SEQ ID NO:238)，K267S(SEQ ID NO:239)，K267T(SEQ ID NO:240)，K267V(SEQ ID NO:241)，K267W(SEQ ID NO:242)，K267Y(SEQ ID NO:243)，V296A(SEQ ID NO:244)，V296C(SEQ ID NO:245)，V296D(SEQ ID NO:246)，V296E(SEQ ID NO:247)，V296F(SEQID NO:248)，V296G(SEQ ID NO:249)，V296H(SEQ ID NO:250)，V296I(SEQ ID NO:251)，V296K(SEQ ID NO:252)，V296L(SEQ ID NO:253)，V296M(SEQ ID NO:254)，V296N(SEQ IDNO:255)，V296P(SEQ ID NO:256)，V296Q(SEQ ID NO:257)，V296R(SEQ ID NO:258)，V296S(SEQ ID NO:259)，V296T(SEQ ID NO:260)，V296W(SEQ ID NO:261)，和V296Y(SEQ ID NO:262)。
3.高糖基化突变体
如下修饰在ADA2中导入非天然糖基化位点。非天然糖基化位点如N连接的糖基化位点的导入可赋予稳定性和药动学模式的增加。因此，如下ADA2变体可以导致ADA2的高糖基化及增加给予的ADA2的稳定性和药动学模式：
--→N1/--→A2/--→S3，R20N/V22S，K371N/D373S，K372N/I374S，T403N/H405S及G404N/P406S。
举例的含有这些置换的高糖基化突变体：
--→N1/--→A2/--→S3(SEQ ID NO:274)，R20N/V22S(SEQ ID NO:275)，K371N/D373S(SEQ ID NO:276)，K372N/I374S(SEQ ID NO:277)，T403N/H405S(SEQ ID NO:278)和G404N/P406S(SEQ ID NO:279)。
4.PRB缺失和置换突变体
如下变体含有修饰的PRB结构域。PRB结构域的修饰可包括缺失全部或部分PRB结构域(即缺失PRB结构域的一或多个残基)，在PRB结构域中插入一或多个氨基酸残基，PRB结构域的一或多个残基的氨基酸置换，或者其组合。缺失和/或取代PRB结构域可赋予改变的活性，例如降低与受体的结合和/或由受体介导的活性。
C105-T147del→(Gly)n，其中n＝2-20；C105-T147del→(Gly)15；C105-T147del→(Gly)10；C105-T147del→(Gly)7；C105-T147del→(Gly)5；C105-T147del→(Gly)3；N98-N156del；C105-E148del；C105-T147del；V99-Q144del；V99-Q144del→(GGGGS)n，其中n＝1-5；C105-T147del→(GGGGS)n，其中n＝1-5；V99-Q144del→(GGGGS)1；V99-Q144del→(GGGGS)2；V99-Q144del→(GGGGS)3；C105-T147del→(GGGGS)1；C105-T147del→(GGGGS)2及C105-T147del→(GGGGS)3。
举例的含有这些置换的PRB缺失和置换突变体：
C105-T147del→(Gly)n(SEQ ID NO:280)；C105-T147del→(Gly)15(SEQ ID NO:281)；C105-T147del→(Gly)10(SEQ ID NO:282)；C105-T147del→(Gly)7(SEQ ID NO:283)；C105-T147del→(Gly)5(SEQ ID NO:284)；C105-T147del→(Gly)3(SEQ ID NO:285)；N98-N156del(SEQ ID NO:548)；C105-E148del(SEQ ID NO:549)；C105-T147del(SEQ ID NO:550)；V99-Q144del(SEQ ID NO:579)；V99-Q144del→(GGGGS)n，其中n＝1-5(SEQ ID NO:581)；C105-T147del→(GGGGS)n，其中n＝1-5(SEQ ID NO:582)；V99-Q144del→(GGGGS)1(SEQ ID NO:583)；V99-Q144del→(GGGGS)2(SEQ ID NO:584)；V99-Q144del→(GGGGS)3(SEQID NO:585)；C105-T147del→(GGGGS)1(SEQ ID NO:586)；C105-T147del→(GGGGS)2(SEQ IDNO:587)及C105-T147del→(GGGGS)3(SEQ ID NO:588)。
5.PRB高糖基化突变体
如下修饰可以在PRB结构域中导入非天然糖基化位点。在PRB结构域中导入非天然糖基化位点如N连接的糖基化位点可以赋予稳定性和药动学模式增加和/或其它活性，例如降低与受体的结合。因此，如下ADA2变体可赋予PRB结构域中ADA2的高糖基化，降低受体结合，及增加给予的ADA2的稳定性和药动学模式：
R125N/P126A，S127N/K129S，P126N/E128T，R112N/I114T，I134N/L135C/L136T，I134N/L135S/L136T，R142N/Q144S，E137N/Y139T，和P111N/G113S.
举例的含有这些置换的PRB高糖基化突变体：
R125N/P126A(SEQ ID NO:552)，S127N/K129S(SEQ ID NO:553)，P126N/E128T(SEQID NO:554)，R112N/I114T(SEQ ID NO:555)，I134N/L135C/L136T(SEQ ID NO:556)，I134N/L135S/L136T(SEQ ID NO:557)，R142N/Q144S(SEQ ID NO:558)，E137N/Y139T(SEQ ID NO:559)，和P111N/G113S(SEQ ID NO:560)。
6.PRB-ADA结构域相互作用突变体
如下修饰可赋予PRB结构域与剩余的ADA2(例如腺苷脱氨酶(ADA)结构域)之间改变的相互作用。改变PRB结构域与剩余的ADA2如ADA结构域之间的相互作用可赋予例如增加腺苷脱氨酶活性和降低受体结合等活性：
F119S，F119K，Y224R，Y224N，Y191S，Y191D，F183K，Y191D/Y224R，F109S，F109A，R118D，R118A，Y139T，Y139A，W133S，W133T，P124A，和P124S。
举例的含有这些置换的PRB-ADA结构域相互作用突变体：
F119S(SEQ ID NO:561)，F119K(SEQ ID NO:562)，Y224R(SEQ ID NO:563)，Y224N(SEQ ID NO:564)，Y191S(SEQ ID NO:565)，Y191D(SEQ ID NO:566)，F183K(SEQ ID NO:567)，Y191D/Y224R(SEQ ID NO:568)，F109S(SEQ ID NO:569)，F109A(SEQ ID NO:570)，R118D(SEQ ID NO:571)，R118A(SEQ ID NO:572)，Y139T(SEQ ID NO:573)，Y139A(SEQ IDNO:574)，W133S(SEQ ID NO:575)，W133T(SEQ ID NO:576)，P124A(SEQ ID NO:577)和P124S(SEQ ID NO:578)。
7.突变与高糖基化突变体的组合
如下变体组合了导致对腺苷改良的催化效率(kcat/Km)的修饰(如R219Q和/或S262N)与导入非天然糖基化位点的修饰：
R219Q/S262N/--→N1/--→A2/--→S3，R219Q/S262N/R20N/V22S，R219Q/S262N/K371N/D373S，R219Q/S262N/K372N/I374S，R219Q/S262N/T403N/H405S及R219Q/S262N/G404N/P406S。
含有这些置换的与高糖基化突变体的组合：
R219Q/S262N/--→N1/--→A2/--→S3(SEQ ID NO:596)，R219Q/S262N/R20N/V22S(SEQ ID NO:597)，R219Q/S262N/K371N/D373S(SEQ ID NO:598)，R219Q/S262N/K372N/I374S(SEQ ID NO:599)，R219Q/S262N/T403N/H405S(SEQ ID NO:600)及R219Q/S262N/G404N/P406S(SEQ ID NO:601)。
8.突变与PRB高糖基化突变体的组合
如下变体组合了导致对腺苷改良的催化效率(kcat/Km)的修饰(如R219Q和/或S262N)与在PRB结构域中导入非天然糖基化位点的修饰：
R219Q/S262N/R125N/P126A，R219Q/S262N/S127N/K129S，R219Q/S262N/P126N/E128T，R219Q/S262N/R112N/I114T，R219Q/S262N/I134N/L135C/L136T，R219Q/S262N/I134N/L135S/L136T，R219Q/S262N/R142N/Q144S，R219Q/S262N/E137N/Y139T及R219Q/S262N/P111N/G113S。
举例的含有这些置换的与PRB高糖基化突变体的组合:
R219Q/S262N/R125N/P126A(SEQ ID NO:607)，R219Q/S262N/S127N/K129S(SEQ IDNO:608)，R219Q/S262N/P126N/E128T(SEQ ID NO:609)，R219Q/S262N/R112N/I114T(SEQ IDNO:610)，R219Q/S262N/I134N/L135C/L136T(SEQ ID NO:611)，R219Q/S262N/I134N/L135S/L136T(SEQ ID NO:612)，R219Q/S262N/R142N/Q144S(SEQ ID NO:613)，R219Q/S262N/E137N/Y139T(SEQ ID NO:614)及R219Q/S262N/P111N/G113S(SEQ ID NO:615)。
9.与PRB-ADA结构域相互作用突变体的组合
如下变体组合了导致对腺苷改良的催化效率(kcat/Km)的修饰(如R219Q和/或S262N)与改变PRB结构域与剩余的ADA2(例如腺苷脱氨酶(ADA)结构域)之间相互作用的修饰：
R219Q/S262N/F119S，R219Q/S262N/F119K，R219Q/S262N/Y224R，R219Q/S262N/Y224N，R219Q/S262N/Y191S，R219Q/S262N/Y191D，R219Q/S262N/F183K，R219Q/S262N/Y191D/Y224R，R219Q/S262N/F109S，R219Q/S262N/F109A，R219Q/S262N/R118D，R219Q/S262N/R118A，R219Q/S262N/Y139T，R219Q/S262N/Y139A，R219Q/S262N/W133S，R219Q/S262N/W133T，R219Q/S262N/P124A及R219Q/S262N/P124S。
含有这些置换的与PRB-ADA结构域相互作用突变体的组合：
R219Q/S262N/F119S(SEQ ID NO:616)，R219Q/S262N/F119K(SEQ ID NO:617)，R219Q/S262N/Y224R(SEQ ID NO:618)，R219Q/S262N/Y224N(SEQ ID NO:619)，R219Q/S262N/Y191S(SEQ ID NO:620)，R219Q/S262N/Y191D(SEQ ID NO:621)，R219Q/S262N/F183K(SEQ ID NO:622)，R219Q/S262N/Y191D/Y224R(SEQ ID NO:623)，R219Q/S262N/F109S(SEQID NO:624)，R219Q/S262N/F109A(SEQ ID NO:625)，R219Q/S262N/R118D(SEQ ID NO:626)，R219Q/S262N/R118A(SEQ ID NO:627)，R219Q/S262N/Y139T(SEQ ID NO:628)，R219Q/S262N/Y139A(SEQ ID NO:629)，R219Q/S262N/W133S(SEQ ID NO:630)，R219Q/S262N/W133T(SEQ ID NO:631)，R219Q/S262N/P124A(SEQ ID NO:632)，和R219Q/S262N/P124S(SEQ IDNO:633)。
10.与PRB缺失突变体的组合
如下变体组合了导致对腺苷改良的催化效率(kcat/Km)的修饰(如R219Q和/或S262)和/或赋予降低的肝素结合的修饰(如K371D)与PRB结构域中的修饰，例如缺失、插入、取代和/或置换：
K371D/V99-Q144del→(GGGGS)1；K371D/V99-Q144del→(GGGGS)2；K371D/V99-Q144del→(GGGGS)3；K371D/C105-T147del→(GGGGS)1；K371D/C105-T147del→(GGGGS)2；K371D/C105-T147del→(GGGGS)3；R219Q/S262N/C105-T147del→(Gly)15；R219Q/S262N/C105-T147del→(Gly)10；R219Q/S262N/C105-T147del→(Gly)7；R219Q/S262N/C105-T147del→(Gly)5；R219Q/S262N/C105-T147del→(Gly)3；R219Q/S262N/V99-Q144del→(GGGGS)1；R219Q/S262N/V99-Q144del→(GGGGS)2；R219Q/S262N/V99-Q144del→(GGGGS)3；R219Q/S262N/C105-T147del→(GGGGS)1；R219Q/S262N/C105-T147del→(GGGGS)2；R219Q/S262N/C105-T147del→(GGGGS)3；R219Q/S262N/K371D/V99-Q144del→(GGGGS)1；R219Q/S262N/K371D/V99-Q144del→(GGGGS)2；R219Q/S262N/K371D/V99-Q144del→(GGGGS)3；R219Q/S262N/K371D/C105-T147del→(GGGGS)1；R219Q/S262N/K371D/C105-T147del→(GGGGS)2；R219Q/S262N/K371D/C105-T147del→(GGGGS)3；K371D/C105-T147del→(Gly)n，其中n＝2-20；K371D/C105-T147del→(Gly)15；K371D/C105-T147del→(Gly)10；K371D/C105-T147del→(Gly)7；K371D/C105-T147del→(Gly)5；K371D/C105-T147del→(Gly)3；K371D/V99-Q144del→(GGGGS)n，其中n＝1-5；K371D/C105-T147del→(GGGGS)n，其中n＝1-5；K371D/N98-N156del；K371D/C105-E148del；K371D/C105-T147del；K371D/V99-Q144del；R219Q/S262N/C105-T147del→(Gly)n，其中n＝2-20；R219Q/S262N/V99-Q144del→(GGGGS)n，其中n＝1-5；R219Q/S262N/C105-T147del→(GGGGS)n，其中n＝1-5；R219Q/S262N/N98-N156del；R219Q/S262N/C105-E148del；R219Q/S262N/C105-T147del；R219Q/S262N/V99-Q144del；R219Q/S262N/K371D/C105-T147del→(Gly)n，其中n＝2-20；R219Q/S262N/K371D/C105-T147del→(Gly)15；R219Q/S262N/K371D/C105-T147del→(Gly)10；R219Q/S262N/K371D/C105-T147del→(Gly)7；R219Q/S262N/K371D/C105-T147del→(Gly)5；R219Q/S262N/K371D/C105-T147del→(Gly)3；R219Q/S262N/K371D/V99-Q144del→(GGGGS)n，其中n＝1-5；R219Q/S262N/K371D/C105-T147del→(GGGGS)n，其中n＝1-5；R219Q/S262N/K371D/N98-N156del；R219Q/S262N/K371D/C105-E148del；R219Q/S262N/K371D/C105-T147del；R219Q/S262N/K371D/V99-Q144del；R219Q/C105-T147del→(Gly)n，其中n＝2-20；R219Q/V99-Q144del→(GGGGS)n，其中n＝1-5；R219Q/C105-T147del→(GGGGS)n，其中n＝1-5；R219Q/N98-N156del；R219Q/C105-E148del；R219Q/C105-T147del；R219Q/V99-Q144del；S262N/C105-T147del→(Gly)n，其中n＝2-20；S262N/V99-Q144del→(GGGGS)n，其中n＝1-5；S262N/C105-T147del→(GGGGS)n，其中n＝1-5；S262N/N98-N156del；及S262N/C105-E148del；S262N/C105-T147del及S262N/V99-Q144del。
举例的含有这些置换的与PRB缺失突变体的组合：
K371D/V99-Q144del→(GGGGS)1(SEQ ID NO:589)；K371D/V99-Q144del→(GGGGS)2(SEQ ID NO:590)；K371D/V99-Q144del→(GGGGS)3(SEQ ID NO:591)；K371D/C105-T147del→(GGGGS)1(SEQ ID NO:592)；K371D/C105-T147del→(GGGGS)2(SEQ ID NO:593)；K371D/C105-T147del→(GGGGS)3(SEQ ID NO:594)；R219Q/S262N/C105-T147del→(Gly)15(SEQ IDNO:602)；R219Q/S262N/C105-T147del→(Gly)10(SEQ ID NO:603)；R219Q/S262N/C105-T147del→(Gly)7(SEQ ID NO:604)；R219Q/S262N/C105-T147del→(Gly)5(SEQ ID NO:605)；R219Q/S262N/C105-T147del→(Gly)3(SEQ ID NO:606)；R219Q/S262N/V99-Q144del→(GGGGS)1(SEQ ID NO:634)；R219Q/S262N/V99-Q144del→(GGGGS)2(SEQ ID NO:635)；R219Q/S262N/V99-Q144del→(GGGGS)3(SEQ ID NO:636)；R219Q/S262N/C105-T147del→(GGGGS)1(SEQ ID NO:637)；R219Q/S262N/C105-T147del→(GGGGS)2(SEQ ID NO:638)；R219Q/S262N/C105-T147del→(GGGGS)3(SEQ ID NO:639)；R219Q/S262N/K371D/V99-Q144del→(GGGGS)1(SEQ ID NO:640)；R219Q/S262N/K371D/V99-Q144del→(GGGGS)2(SEQID NO:641)；R219Q/S262N/K371D/V99-Q144del→(GGGGS)3(SEQ ID NO:642)；R219Q/S262N/K371D/C105-T147del→(GGGGS)1(SEQ ID NO:643)；R219Q/S262N/K371D/C105-T147del→(GGGGS)2(SEQ ID NO:644)；R219Q/S262N/K371D/C105-T147del→(GGGGS)3(SEQID NO:645)；K371D/C105-T147del→(Gly)n，其中n＝2-20(SEQ ID NO:646)；K371D/C105-T147del→(Gly)15(SEQ ID NO:647)；K371D/C105-T147del→(Gly)10(SEQ ID NO:648)；K371D/C105-T147del→(Gly)7(SEQ ID NO:649)；K371D/C105-T147del→(Gly)5(SEQ IDNO:650)；K371D/C105-T147del→(Gly)3(SEQ ID NO:651)；K371D/V99-Q144del→(GGGGS)n，其中n＝1-5(SEQ ID NO:652)；K371D/C105-T147del→(GGGGS)n，其中n＝1-5(SEQ IDNO:653)；K371D/N98-N156del(SEQ ID NO:654)；K371D/C105-E148del(SEQ ID NO:655)；K371D/C105-T147del(SEQ ID NO:656)；K371D/V99-Q144del(SEQ ID NO:657)；R219Q/S262N/C105-T147del→(Gly)n，其中n＝2-20(SEQ ID NO:658)；R219Q/S262N/V99-Q144del→(GGGGS)n，其中n＝1-5(SEQ ID NO:664)；R219Q/S262N/C105-T147del→(GGGGS)n，其中n＝1-5(SEQ ID NO:665)；R219Q/S262N/N98-N156del(SEQ ID NO:666)；R219Q/S262N/C105-E148del(SEQ ID NO:667)；R219Q/S262N/C105-T147del(SEQ ID NO:668)；R219Q/S262N/V99-Q144del(SEQ ID NO:669)；R219Q/S262N/K371D/C105-T147del→(Gly)n，其中n＝2-20(SEQ ID NO:670)；R219Q/S262N/K371D/C105-T147del→(Gly)15(SEQ ID NO:671)；R219Q/S262N/K371D/C105-T147del→(Gly)10(SEQ ID NO:672)；R219Q/S262N/K371D/C105-T147del→(Gly)7(SEQ ID NO:673)；R219Q/S262N/K371D/C105-T147del→(Gly)5(SEQ IDNO:674)；R219Q/S262N/K371D/C105-T147del→(Gly)3(SEQ ID NO:675)；R219Q/S262N/K371D/V99-Q144del→(GGGGS)n，其中n＝1-5(SEQ ID NO:676)；R219Q/S262N/K371D/C105-T147del→(GGGGS)n，其中n＝1-5(SEQ ID NO:677)；R219Q/S262N/K371D/N98-N156del(SEQID NO:678)；R219Q/S262N/K371D/C105-E148del(SEQ ID NO:679)；R219Q/S262N/K371D/C105-T147del(SEQ ID NO:680)；R219Q/S262N/K371D/V99-Q144del(SEQ ID NO:681)；R219Q/C105-T147del→(Gly)n，其中n＝2-20(SEQ ID NO:918)；R219Q/V99-Q144del→(GGGGS)n，其中n＝1-5(SEQ ID NO:919)；R219Q/C105-T147del→(GGGGS)n，其中n＝1-5(SEQ ID NO:920)；R219Q/N98-N156del(SEQ ID NO:921)；R219Q/C105-E148del(SEQ IDNO:922)；R219Q/C105-T147del(SEQ ID NO:923)；R219Q/V99-Q144del(SEQ ID NO:924)；S262N/C105-T147del→(Gly)n，其中n＝2-20(SEQ ID NO:925)；S262N/V99-Q144del→(GGGGS)n，其中n＝1-5(SEQ ID NO:926)；S262N/C105-T147del→(GGGGS)n，其中n＝1-5(SEQ ID NO:927)；S262N/N98-N156del(SEQ ID NO:928)；S262N/C105-E148del(SEQ IDNO:929)；S262N/C105-T147del(SEQ ID NO:930)；及S262N/V99-Q144del(SEQ ID NO:931)。
11.其它组合突变体
如下变体组合了多个修饰，如导致对腺苷改良的催化效率(kcat/Km)的修饰如R219Q和/或S262N、赋予降低的肝素结合的修饰如K371D及其它修饰：
K11A/R20A，K11A/R20A/K371A，R20A/K371A，K11A/K371A，S262N/K371D，S262N/K371E，S262N/R20E，S262N/R20E/K371D，S262N/R20E/K371E，R219Q/K371E，R219Q/K371D，R219Q/R20E，R219Q/K371E/R20E，R219Q/K371D/R20E，R219Q/S262N/K371E，R219Q/S262N/K371D，R219Q/S262N/R20E，R219Q/S262N/K371E/R20E，R219Q/S262N/K371D/R20E，R219Q/S262N，R219Q/S262N/K11A，R219Q/S262N/K11D，R219Q/S262N/K11E，R219Q/S262N/K13A，R219Q/S262N/K13D，R219Q/S262N/K13E，R219Q/S262N/K371A，R219Q/S262N/K372A，R219Q/S262N/K372D，R219Q/S262N/K372E，R219Q/S262N/K452A，R219Q/S262N/K452D，R219Q/S262N/K452E，R219Q/S262N/R20A，R219Q/S262N/R20D，R219Q/S262N/R366A，R219Q/S262N/R366D，R219Q/S262N/R366E，R219Q/S262N/H264A，R219Q/S262N/H264Q，R219Q/S262N/H264N，R219Q/S262N/H264G，R219K/S262N，R219N/S262N，R219A/S262N，R219Q/S262N/L221A，R219Q/S262N/L221V，R219Q/S262N/L221G，R219Q/S262N/E179D，R219Q/S262N/E179A，R219Q/S262N/E179S，R219Q/S262N/E179T，R219Q/S262N/E179V，R219Q/S262N/E179G，R219Q/S262A，R219Q/S262V，R219Q/S262M，R219Q/S262N/K11A/R20A，R219Q/S262N/K11A/R20A/K371A，R219Q/S262N/R20A/K371A，R219Q/S262N/K11A/K371A，R219Q/S262N/K26A，R219Q/S262N/K26D，R219Q/S262N/K26E，R219Q/S262N/R217A，R219Q/S262N/R217D，R219Q/S262N/R217E，R219Q/S262N/K258A，R219Q/S262N/K258D，R219Q/S262N/K258E，R219Q/S262N/R277A，R219Q/S262N/R277D，R219Q/S262N/R277E，R219Q/S262N/R283A，R219Q/S262N/R283D，R219Q/S262N/R283E，R219Q/S262N/K309A，R219Q/S262N/K309D，R219Q/S262N/K309E，R219Q/S262N/K317A，R219Q/S262N/K317D，R219Q/S262N/K317E，R219Q/S262N/K321A，R219Q/S262N/K321D，R219Q/S262N/K321E，R219Q/S262N/R352A，R219Q/S262N/R352D，R219Q/S262N/R352E，R219Q/S262N/R441A，R219Q/S262N/R441D，R219Q/S262N/R441E，R219Q/S262N/K444A，R219Q/S262N/K444D，R219Q/S262N/K444E，R219Q/S262N/K461A，R219Q/S262N/K461D，R219Q/S262N/K461E，R219Q/S262N/K469A，R219Q/S262N/K469D，R219Q/S262N/K469E，R219Q/S262N/K470A，R219Q/S262N/K470D，R219Q/S262N/K470E，R219Q/S262N/D86A，R219Q/S262N/D86C，R219Q/S262N/D86E，R219Q/S262N/D86F，R219Q/S262N/D86G，R219Q/S262N/D86H，R219Q/S262N/D86I，R219Q/S262N/D86K，R219Q/S262N/D86L，R219Q/S262N/D86M，R219Q/S262N/D86N，R219Q/S262N/D86P，R219Q/S262N/D86Q，R219Q/S262N/D86R，R219Q/S262N/D86S，R219Q/S262N/D86T，R219Q/S262N/D86V，R219Q/S262N/D86W，R219Q/S262N/D86Y，R219Q/S262N/E179C，R219Q/S262N/E179F，R219Q/S262N/E179H，R219Q/S262N/E179I，R219Q/S262N/E179K，R219Q/S262N/E179L，R219Q/S262N/E179M，R219Q/S262N/E179N，R219Q/S262N/E179P，R219Q/S262N/E179Q，R219Q/S262N/E179R，R219Q/S262N/E179W，R219Q/S262N/E179Y，R219C/S262N，R219D/S262N，R219E/S262N，R219F/S262N，R219G/S262N，R219H/S262N，R219I/S262N，R219L/S262N，R219M/S262N，R219P/S262N，R219S/S262N，R219T/S262N，R219V/S262N，R219W/S262N，R219Y/S262N，R219Q/S262N/L221C，R219Q/S262N/L221D，R219Q/S262N/L221E，R219Q/S262N/L221F，R219Q/S262N/L221H，R219Q/S262N/L221I，R219Q/S262N/L221K，R219Q/S262N/L221M，R219Q/S262N/L221N，R219Q/S262N/L221P，R219Q/S262N/L221Q，R219Q/S262N/L221R，R219Q/S262N/L221S，R219Q/S262N/L221T，R219Q/S262N/L221W，R219Q/S262N/L221Y，R219Q/S262C，R219Q/S262D，R219Q/S262E，R219Q/S262F，R219Q/S262G，R219Q/S262H，R219Q/S262I，R219Q/S262K，R219Q/S262L，R219Q/S262P，R219Q/S262Q，R219Q/S262R，R219Q/S262T，R219Q/S262W，R219Q/S262Y，R219Q/S262N/H264C，R219Q/S262N/H264D，R219Q/S262N/H264E，R219Q/S262N/H264F，R219Q/S262N/H264I，R219Q/S262N/H264K，R219Q/S262N/H264L，R219Q/S262N/H264M，R219Q/S262N/H264P，R219Q/S262N/H264R，R219Q/S262N/H264S，R219Q/S262N/H264T，R219Q/S262N/H264V，R219Q/S262N/H264W，R219Q/S262N/H264Y，R219Q/S262N/S266A，R219Q/S262N/S266C，R219Q/S262N/S266D，R219Q/S262N/S266E，R219Q/S262N/S266F，R219Q/S262N/S266G，R219Q/S262N/S266H，R219Q/S262N/S266I，R219Q/S262N/S266K，R219Q/S262N/S266L，R219Q/S262N/S266M，R219Q/S262N/S266N，R219Q/S262N/S266P，R219Q/S262N/S266Q，R219Q/S262N/S266R，R219Q/S262N/S266T，R219Q/S262N/S266V，R219Q/S262N/S266W，R219Q/S262N/S266Y，R219Q/S262N/K267A，R219Q/S262N/K267C，R219Q/S262N/K267D，R219Q/S262N/K267E，R219Q/S262N/K267F，R219Q/S262N/K267G，R219Q/S262N/K267H，R219Q/S262N/K267I，R219Q/S262N/K267L，R219Q/S262N/K267M，R219Q/S262N/K267N，R219Q/S262N/K267P，R219Q/S262N/K267Q，R219Q/S262N/K267R，R219Q/S262N/K267S，R219Q/S262N/K267T，R219Q/S262N/K267V，R219Q/S262N/K267W，R219Q/S262N/K267Y，R219Q/S262N/V296A，R219Q/S262N/V296C，R219Q/S262N/V296D，R219Q/S262N/V296E，R219Q/S262N/V296F，R219Q/S262N/V296G，R219Q/S262N/V296H，R219Q/S262N/V296I，R219Q/S262N/V296K，R219Q/S262N/V296L，R219Q/S262N/V296M，R219Q/S262N/V296N，R219Q/S262N/V296P，R219Q/S262N/V296Q，R219Q/S262N/V296R，R219Q/S262N/V296S，R219Q/S262N/V296T，R219Q/S262N/V296W，R219Q/S262N/V296Y，R219Q/K11A/R20A，R219Q/K11A/R20A/K371A，R219Q/R20A/K371A，R219Q/K11A/K371A，S262N/K11A/R20A，S262N/K11A/R20A/K371A，S262N/R20A/K371A及S262N/K11A/K371A。
举例的含有这些置换的这些组合：
K11A/R20A(SEQ ID NO:55)，K11A/R20A/K371A(SEQ ID NO:56)，R20A/K371A(SEQID NO:57)，K11A/K371A(SEQ ID NO:58)，S262N/K371D(SEQ ID NO:59)，S262N/K371E(SEQID NO:60)，S262N/R20E(SEQ ID NO:61)，S262N/R20E/K371D(SEQ ID NO:62)，S262N/R20E/K371E(SEQ ID NO:63)，R219Q/K371E(SEQ ID NO:263)，R219Q/K371D(SEQ ID NO:264)，R219Q/R20E(SEQ ID NO:265)，R219Q/K371E/R20E(SEQ ID NO:266)，R219Q/K371D/R20E(SEQ ID NO:267)，R219Q/S262N/K371E(SEQ ID NO:268)，R219Q/S262N/K371D(SEQ ID NO:269)，R219Q/S262N/R20E(SEQ ID NO:270)，R219Q/S262N/K371E/R20E(SEQ ID NO:271)，R219Q/S262N/K371D/R20E(SEQ ID NO:272)，R219Q/S262N(SEQ ID NO:273)，R219Q/S262N/K11A(SEQ ID NO:659)，R219Q/S262N/K11D(SEQ ID NO:660)，R219Q/S262N/K11E(SEQ IDNO:661)，R219Q/S262N/K13A(SEQ ID NO:662)，R219Q/S262N/K13D(SEQ ID NO:663)，R219Q/S262N/K13E(SEQ ID NO:682)，R219Q/S262N/K371A(SEQ ID NO:683)，R219Q/S262N/K372A(SEQ ID NO:684)，R219Q/S262N/K372D(SEQ ID NO:685)，R219Q/S262N/K372E(SEQID NO:686)，R219Q/S262N/K452A(SEQ ID NO:687)，R219Q/S262N/K452D(SEQ ID NO:688)，R219Q/S262N/K452E(SEQ ID 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附图简述
图1A-1F示例地描述了SEQ ID NO:2(残基30-511相应于SEQ ID NO:5所示成熟ADA2)所示前体人腺苷脱氨酶2(ADA2)与其它ADA2蛋白的比对。“*”是指比对的残基是相同的，“:”是指比对的残基是不同的，但是是相似的且在比对的位置含有保守氨基酸残基，及“.”是指比对的残基是相似的且在比对的位置含有半保守氨基酸残基。相应于推定的受体结合结构域(PRB)的残基以下划线示出。举例的非限制性的用于氨基酸置换的相应位置以加粗示出。例如，图1A示出了SEQ ID NO:2所示ADA2与SEQ ID NO:286所示黑猩猩ADA2的比对。图1B示出SEQ ID NO:2所示ADA2与SEQ ID NO:287所示大猩猩ADA2的比对。图1C示出SEQID NO:2所示ADA2与SEQ ID NO:288所示矮小黑猩猩ADA2的比对。图1D示出SEQ ID NO:2所示ADA2与SEQ ID NO:289所示苏门答腊猩猩ADA2的比对。图1E示出SEQ ID NO:2所示ADA2与SEQ ID NO:290所示北部白颊长臂猿ADA2的比对。图1F示出SEQ ID NO:2所示ADA2与SEQ IDNO:291所示食蟹猕猴ADA2的比对。
图2示出胞外腺苷的生物合成和分解代谢及腺苷受体信号传导(源自Antonioliet al.(2013)Nat Rev Can 13:842-857)。生理条件如缺氧、缺血、炎症、肿瘤环境或创伤可促进ATP的胞外积累，其通过细胞表面酶CD39被代谢为AMP。AMP随之由CD73代谢为腺苷。胞外腺苷可以结合在附近的免疫、肿瘤或其它细胞的细胞表面上表达的四种不同的G蛋白偶联的腺苷受体(ADR；即A1、A2A、A2B和A3)，介导多种下游腺苷介导的信号传导和活性，如免疫抑制、癌细胞增殖、癌细胞迁移和/或转移、血管发生及其它作用。核苷转运蛋白(NT)促进胞外腺苷摄取进细胞中。腺苷脱氨酶2(ADA2)、包括外源ADA2或者如本发明提供的变体，可以通过催化腺苷转变为肌苷而分解胞外腺苷。
详细描述
大纲
A.定义
B.腺苷脱氨酶2(ADA2)及腺苷介导的肿瘤免疫抑制调节
1.肿瘤免疫性和免疫逃避
2.在癌症和肿瘤微环境(TME)中的腺苷免疫调节
3.癌症治疗中的腺苷脱氨酶和靶向腺苷
C.腺苷脱氨酶2(ADA2)及其变体
1.ADA2的结构和活性
a.ADA2的结构
b.ADA2的活性
2.ADA2变体
a.示例的修饰
i.氨基酸置换
ii.PRB结构域的修饰
iv.高糖基化
b.核酸分子
c.变体ADA2蛋白的产生
D.ADA2缀合物及融合蛋白
1.半衰期延长部分
a.低复杂度多肽
b.人绒毛膜促性腺激素的β亚基的C末端肽(CTP)
c.免疫球蛋白恒定区(Fc)或其部分
d.白蛋白或片段，或其变体
e.白蛋白结合部分
f.PAS序列
g.HAP序列
h.XTEN序列
i.运铁蛋白或其片段
j.聚合物缀合
i.聚乙二醇(PEG)
ii.羟乙基淀粉(HES)
iii.多唾液酸(PSA)
iv.其它聚合物
2.产生缀合物或融合蛋白的方法
接头
i.肽接头
ii.异源双功能连接剂
E.产生编码ADA2的核酸及其多肽的方法
1.分离或制备编码ADA2多肽的核酸
2.产生突变体或修饰的核酸及编码多肽
3.载体和细胞
编码和表达本发明提供的ADA2变体的免疫细胞
4.表达
a.原核细胞
b.酵母细胞
c.昆虫细胞
d.哺乳动物细胞
e.植物
5.纯化技术
F.评估ADA2的活性和物理性质的方法
1.腺苷脱氨酶测定
2.评估肝素结合的方法
a.亲和性测定
b.ELISA测定
c.斑点印迹及其它放射标记的肝素结合测定
3.评估稳定性的方法
a.条件
i.血浆中的稳定性
ii.热稳定性
iii.在pH或pH最佳状态的稳定性
iv.其它条件
b.确定物理性质
i.酶活性
ii.蛋白质纯度的层析分析
iii.差示扫描量热法
iv.差示扫描荧光测定法
v.内源荧光光谱测定
vi.圆二色性
vii.动态光散射
viii.静态光散射
ix.浊度测定
x.确定稳定性的其它方法
4.治疗活性测定
a.体外检测
b.体内动物模型
i.肿瘤代谢活性
ii.肿瘤大小和体积
c.临床监测
5.药效学/药动学和耐受性
G.药物组合物和制剂
1.制剂-液体、可注射的、乳状液
冻干的粉末
2.其它给予途径的组合物
3.剂量和给药
4.包装和生产产品
H.使用腺苷脱氨酶2(ADA2)的治疗方法
1.示例的疾病和状况
a.癌症与肿瘤
b.非癌过度增生性疾病
c.纤维化疾病
d.感染性疾病
e.其它疾病和状况
2.患者选择方法
a.腺苷相关的生物标志物
i.血浆腺苷水平
ii.腺苷受体(ADR)
iii.外核苷酸酶CD39和CD73
b.患者选择
3.剂量与给药
4.组合治疗
a.抗癌剂
i.抗癌抗体
ii.化疗剂
iii.放射治疗
iv.抗血管发生剂
v.免疫检查点抑制剂
(a)抗CTLA4治疗
(b)抗PD-1和抗PD-L1治疗
b.其它免疫调节剂
c.透明质酸降解酶
可溶的透明质酸降解酶(例如可溶的PH20)
d.治疗感染性疾病的抗体
e.抗生素和抗真菌剂
I.实施例
A.定义
除非特别指出，则本文使用的所有技术和科学术语均具有本发明所属领域技术人员通常了解的相同含义。除非特别指出，在本文全文中提及的所有专利、专利申请、公开的申请和公开、Genbank序列、数据库、网站和其它公开的材料均以其全文并入参考。在本文术语有多个定义的情况中，以本节内容为主。在提及URL或者其它这种标识符或地址的情况中，应理解这种标识符可改变，在互联网上的特定信息可以来来去去，但是等价信息可以通过搜索互联网而发现。对其的提及证实这种信息的可获得性和公开传播。
如本文所用，“腺苷”是指这样的嘌呤核苷，其由腺嘌呤分子通过β-N9-糖苷键附着于核糖糖分子(呋喃核糖)部分而组成。腺苷通过其与腺苷受体的相互作用而可以调节多个生理学过程。
如本文所用，“米氏常数”或者Km是发生有效催化所需的底物浓度的测量值。例如，对于底物具有高Km的酶与具有较低Km的酶相比可需要较高的底物浓度以实现指定的反应速度。Km可以表示酶对底物的亲和性。
如本文所用，“催化效率”是酶与底物反应形成产物的效率。其由kcat/Km(M-1s-1或者1/Ms)表示。评估催化活性的动力学参数包括kcat/Km的方法为技术人员熟知。通常，kcat/Km是在稳态条件下测量的。
如本文所用，“腺苷脱氨酶”或“ADA”是指催化腺苷水解脱氨形成肌苷的酶。ADA也可以使2'脱氧腺苷脱氨为2'脱氧肌苷，且因此包括具有2'脱氧腺苷脱氨酶活性的酶。在人体中有两种ADA同工酶，称作ADA1和ADA2，其分子量、催化参数及其它性质不同。
如本文所用，“腺苷脱氨酶1”或ADA1是指缺少信号肽及在细胞内遍在表达的ADA。其作为单体产生。举例的ADA1是人ADA1，其具有SEQ ID NO:11所示核苷酸序列及编码SEQID NO:12所示氨基酸序列。在人中，野生型ADA1特征在于Km为或大约为5.2×10-5M，最佳pH为或大约为7-7.5，且对腺苷和2’脱氧腺苷呈现出相似亲和性。例如，ADA1具有至少或至少大约0.70、如至少或至少大约0.75的2’脱氧腺苷/腺苷脱氨酶比率。提及ADA1包括存在于哺乳动物、包括人和非人对象中的野生型或天然ADA1。例如，提及ADA1包括含有具有SEQ IDNO:12所示氨基酸序列的多肽的人ADA1。提及ADA1还包括其变体，如等位基因变体、种变体、剪接变体及其它变体，其包含具有与SEQ ID NO:12具有至少65％、70％、75％、80％、85％、85％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列相同性的氨基酸序列的多肽及呈现腺苷脱氨酶活性。
如本文所用，“腺苷脱氨酶2”或“ADA2”是指在胞外环境、包括血浆中存在的ADA。ADA2从含有信号肽的前体多肽(例如SEQ ID NO:2所示ADA2)中产生，所述信号肽被除去以产生缺少信号肽的成熟蛋白(例如SEQ ID NO:5所示ADA2)。分泌的ADA2是含有链两个相同多肽链的同源二聚体，通过每个亚基的残基之间的非极性相互作用而相互作用。在人中，野生型ADA2特征在于Km为或大约为200×10-5M，最佳pH为或大约为6.5±0.2，及呈现出对于2’脱氧腺苷较弱的亲和性。例如，ADA2具有低于0.40，如低于或低于大约0.30或者低于或低于大约0.25的2’脱氧腺苷/腺苷脱氨酶比率。提及ADA2包括存在于哺乳动物包括人和非人对象中的野生型或天然ADA2。例如，提及ADA2包括含有具有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽的人ADA2，SEQ ID NO:5所示成熟形式，SEQ ID NO:5的催化活性部分及其二聚体形式。提及ADA2还包括是其变体的前体、成熟、催化活性形式及二聚体形式，如等位基因变体、种变体、剪接变体及其它变体，其包括具有与SEQ ID NO:2所示前体多肽或者SEQ ID NO:5所示其成熟形式具有至少40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、85％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列相同性的氨基酸序列的多肽，及当活性形式时，其呈现出腺苷脱氨酶活性。这种变体，当活性形式时，呈现出天然或野生型ADA2多肽的至少40％、50％、70％、90％、90％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％、1000％或更多的活性。如本文所用，提及ADA2时的“野生型”或“天然”是指含有由存在于自然界生物体包括人和其它动物中天然的或天然发生的ADA2基因包括等位基因变体编码的多肽的ADA2蛋白。提及野生型ADA2不涉及物种是意指涵盖任何物种的野生型ADA2。野生型ADA2多肽包括编码的前体多肽、其片段及其加工的形式，如缺少信号肽的成熟形式，以及其任何翻译前或翻译后加工的或修饰的形式。天然ADA2蛋白还包括翻译后修饰的那些蛋白，包括但不限于通过糖基化、羧基化和羟基化的修饰。天然ADA2蛋白还包括多肽单体以及二聚体形式。例如，人表达天然ADA2。野生型人ADA2如SEQ ID NO:2(前体形式)和SEQ ID NO:5(成熟形式)所示，且包括如本文所述其催化活性形式，及SEQ ID NOS:376-383任一所示等位基因变体(前体或成熟形式)，或者ADA2的异构体形式如SEQ ID NO:68所示ADA2。来自非人物种的野生型或天然ADA2包括但不限于来自如下动物的ADA2：Pantroglodytes(黑猩猩；前体形式SEQ ID NO:286，成熟形式SEQ ID NO:326；NCBI登录号XP_003317127.1)；Gorilla gorilla(大猩猩；前体形式SEQ ID NO:287，成熟形式SEQ ID NO:327；NCBI登录号XP_004063024.1)；Pan paniscus(矮小黑猩猩；前体形式SEQ ID NO:288,成熟形式SEQ ID NO:328；NCBI登录号XP_003828345.1)；Pongo abelii(苏门答腊猩猩；前体形式SEQ ID NO:289，成熟形式SEQ ID NO:329；NCBI登录号NP_001125360.1)；Nomascusleucogenys(北部白颊长臂猿；前体形式SEQ ID NO:290，成熟形式SEQ ID NO:330；NCBI登录号XP_004088517.1)；Macaca fascicularis(食蟹猕猴；前体形式SEQ ID NO:291，成熟形式SEQ ID NO:331；NCBI登录号XP_005568111.1)；Chlorocebus sabaeus(绿猴；前体形式SEQ ID NO:292，成熟形式SEQ ID NO:332；NCBI登录号XP_007972990.1)；Macaca mulatta(恒河猴；前体形式SEQ ID NOS:293,337，成熟形式SEQ ID NOS:333,340；GenBank登录号AFH32795.1,EHH20002.1)；Callithrix jacchus(狨猴；前体形式SEQ ID NOS:294、374，成熟形式SEQ ID NO:334、375；NCBI登录号XP_009004591.1，XP_009004586.1)；光滑爪蟾(Xenopus laevis)(非洲爪蟾；前体形式SEQ ID NO:295，成熟形式SEQ ID NO:335；NCBI登录号NP_001090531.1)；黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)(果蝇；前体形式SEQ ID NO:296-300，成熟形式SEQ ID NO:336、338、339；AAL40913.1,AAL40920.1、AAL40911.1、AAL40912.1及AAL40910.1)；家蚕(Bombyx mori)(蚕蛾；前体形式SEQ ID NO:301，成熟形式SEQ ID NO:341；NCBI登录号NP_001098698.1)；及秉氏麻蝇(Sarcophaga perigrina)(麻蝇；前体形式SEQ ID NO:302，成熟形式SEQ ID NO:342；GenBank登录号BAA11812.1)。
如本文所用，前体ADA2是指ADA2的非分泌的形式，其含有靶向蛋白质分泌的N末端信号肽。该信号肽在内质网中被裂解。举例的ADA2前体多肽是SEQ ID NO:2所示多肽或者其等位基因或种变体或其它变体，如SEQ ID NO:286-302、337或376-379任一所示的那些。
如本文所用，“成熟ADA2”是指缺少信号序列的ADA2。一个举例的成熟ADA2如SEQID NO:5所示，也包括其变体如种和等位基因变体及其它变体，如SEQ ID NO:326-336、338-342、375和380-383任一所示那些。提及成熟ADA2包括其二聚体形式。
如本文所用，种变体是指在不同物种、包括不同的哺乳动物物种如小鼠和人之中多肽的变体。
如本文所用，等位基因变体是指在相同物种的成员之中蛋白的变化。
如本文所用，结构域(典型为3或更多个、通常为5或7个或更多个氨基酸的序列)是指分子如蛋白质或编码核酸的一部分，其在结构和/或功能上与该分子的其它部分不同且是可鉴别的。例如，结构域包括多肽链的在由一或多个结构基序组成的蛋白质内可形成单独折叠结构和/或由于功能活性如蛋白酶解活性而被识别的那些部分。蛋白质可具有一或一个以上独特的结构域。例如，结构域可以通过序列与相关家族成员的同源性如与定义蛋白酶结构域的基序的同源性而鉴别、定义或区分。在另一实例中，结构域可以通过其功能如蛋白酶解活性或者与生物分子相互作用作用的能力如DNA结合、配体结合和二聚体化而区分。结构域单独地可呈现出生物功能或活性，由此单独的或者与另一分子融合的结构域可以发挥活性，例如蛋白酶解活性或配体结合。结构域可以是线性氨基酸序列或者非线性氨基酸序列。许多多肽含有多个结构域。这种结构域为本领域技术人员已知且可被鉴别。为例证在本文提供了定义，但是应了解本领域技术人员可以通过名称而识别特定结构域。如果需要，可以使用合适的软件鉴别结构域。
如本文所用，“催化结构域”或者“ADA结构域”是指赋予腺苷脱氨酶活性的结构域。酶的催化结构域含有该蛋白质其酶促活性如腺苷脱氨酶活性所需的全部必要性质。ADA结构域在结构上由8链平行β-折叠(闭合成桶(barrel)且被经典α/β-TIM桶基序螺旋包围的)及位于β1与α1之间(H1、H2和H3)及位于C末端(H4和H5)的另外5个组成(Zavialov et al.(2010)J.Biol.Chem.285:12367-12377)。β链与α螺旋之间的环含有许多为活性所需的活性位点残基。活性位点残基包括协调锌结合的残基、活性位点质子供体与受体残基及底物结合残基。在人ADA2中举例的这些残基在表4中示出。提及人ADA2，ADA结构域包含在相应于SEQ ID NO:2所示前体氨基酸序列的残基106-502的区域内(相应于SEQ ID NO:5所示成熟蛋白质的残基77-473)，除外的是相应于包含其中的推定的受体结合(PRB)结构域的残基不是催化活性必需的。
如本文所用，“其催化活性部分”或者“其催化活性片段”是指这样的ADA2多肽，其含有少于成熟ADA2多肽的全长序列、但是含有足以有腺苷脱氨酶活性的连续的ADA2的氨基酸部分，包括全部或部分催化结构域。例如，ADA2的催化活性部分是包括含有ADA2多肽的成熟序列的连续氨基酸序列的多肽的部分，参照SEQ ID NO:5所示氨基酸残基，其包含相应于残基83、85、327、330、355和412的氨基酸残基，但是不包含成熟ADA2多肽的全部氨基酸序列。例如，催化活性部分是包括含有SEQ ID NO:5所示ADA2成熟序列的连续氨基酸序列的多肽的部分，其包含氨基酸残基83、85、327、330、355和412，但是不包含SEQ ID NO:5所示全长氨基酸序列。当是活性形式时，含有ADA2多肽的催化活性部分的ADA2与含有全长成熟ADA2多肽的ADA2相比，呈现至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、或更多的活性，如至少120％、130％、140％、150％、200％、300％、400％、500％或更多的活性。在一个实例中，ADA2多肽的催化活性部分包括缺少全部或部分推定的受体结合(PRB)结构域的多肽。在另一实例中，ADA2多肽的催化活性部分包括缺少成熟多肽的一或多个C末端氨基酸的多肽，即与成熟ADA2多肽相比在C末端截短多至1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100或更多个连续C末端氨基酸残基。应理解本文提及变体ADA2或其催化活性部分是指所述催化活性部分含有一或多个修饰(例如氨基酸置换)。
如本文所用，“推定的受体结合结构域”或者“PRB结构域”是指ADA2的一部分，其形成由α-和β-折叠组成的独立折叠结构，含有称作SR1-SR2-SR3的三链反平行β-折叠，周围是HR，一侧是部分H2α-螺旋，另一侧是脯氨酸富集的SR2-SR3环(Zavialov et al.(2010)J.Biol.Chem.285:12367-12377)。PRB结构域含有保守的半胱氨酸残基，其在SEQ ID NO:2所示前体ADA2的C137-C159(SEQ ID NO:5所示成熟ADA2的位置C108-C130)之间形成二硫键。据报道PRB结构域参与ADA2与其受体的结合。应理解组成该结构域的特定残基例如根据用于鉴别结构域的方法可以变化(例如更长或更短)。关于人ADA2，据报道PRB结构域相应于SEQ ID NO:2所示前体ADA2的残基127-185或134-177(分别相应于SEQ ID NO:5所示成熟ADA2的残基98-156或105-148)。
如本文所用，缺少全部或部分结构域如全部或部分PRB结构域的蛋白质是指与参考或未修饰的蛋白质相比，缺失结构域如PRB结构域的一或多个氨基酸或者全部氨基酸的多肽。缺少全部或部分结构域的多肽中缺失的氨基酸可以是连续的，但是不必是同源多肽的结构域内的连续氨基酸。与参考或未修饰的蛋白质的活性相比，缺少全部或部分结构域的多肽可包括所述多肽活性的丧失或降低。
如本文所用，“活性形式”是指呈现腺苷脱氨酶活性的任何ADA2酶。活性形式的酶可含有全长氨基酸序列或者可以是其催化活性部分。活性形式的酶可以是单体或二聚体。典型地，活性酶是二聚体。活性酶是呈现至少或至少大约5×103M-1s-1、6×103M-1s-1、7×103M-1s-1、8×103M-1s-1、9×103M-1s-1、1×104M-1s-1、2×104M-1s-1、3×104M-1s-1、4×104M-1s-1、5×104M-1s-1、6×104M-1s-1、7×104M-1s-1、8×104M-1s-1、9×104M-1s-1、1×105M-1s-1、2×105M-1s-1、3×105M-1s-1、4×105M-1s-1、5×105M-1s-1、6×105M-1s-1、7×105M-1s-1、8×105M-1s-1、9×105M-1s-1、1×106M-1s-1、2×106M-1s-1、3×106M-1s-1、4×106M-1s-1、5×106M-1s-1或更高的催化效率(kcat/KM)的任何形式。
如本文所用，“多聚体”是指由例如通过非共价相互作用结合在一起或关联的几个相同或不同亚基组成的分子。
如本文所用，“二聚体”是指含有连接在一起的两个多肽的分子。典型地，多肽是非共价连接的。例如，ADA2二聚体是在两个多肽的残基之间通过非极性亚基间相互作用包括疏水性相互作用形成的。
如本文所用，“同源二聚体”是指由两个相同多肽形成的二聚体。
如本文所用，“异源二聚体”是指由两个不同多肽形成的二聚体。
如本文所用，“单体”是指单一蛋白质或多肽单位。单体与二聚体或其它多聚体相比具有相对低的分子量。单体可以单独地存在，或者其可以与其它分子结合形成二聚体或其它多聚体。
如本文所用，提及ADA2蛋白时的“相应形式”是指当对比两个ADA2蛋白的性质或活性时，所述性质是使用相同结构形式蛋白质对比的。例如，如果指出一个ADA2蛋白与第一个ADA2蛋白的相应形式的活性相比具有较低活性，这意味着特定形式如二聚体与第一个ADA2蛋白的二聚体相比具有较低活性。
如本文所用，“多肽”是指含有大量在链中键合在一起的氨基酸残基、形成部分或完整的蛋白质分子的线性有机聚合物。
如本文所用，“蛋白质”或“蛋白质分子”或其变体是指由线性氨基酸序列组成的一或多个多肽链组成的大分子。因此，蛋白质可以是单体，或者可以是二聚体或其它多聚体。蛋白质可以呈现结构、机械、生物化学或信号传导活性。
如本文所用，“多肽亚基”或“蛋白质亚基”是指能与其它多肽或单体装配形成是多聚体复合物的蛋白质分子的单一多肽或单体。一个亚基由一条多肽链组成。
如本文所用，“变体ADA2蛋白”是指与未修饰的ADA2蛋白相比，具有一或多个氨基酸差异的ADA2蛋白，包括其任何形式如全长、催化活性部分、单体或二聚体。所述一或多个氨基酸差异可以是氨基酸突变，如一或多个氨基酸置换(取代)、插入或缺失，或者可以是整个结构域的插入或缺失，及其任意组合。典型地，变体ADA2蛋白与未修饰的ADA2蛋白相比，在一级序列中具有一或多个修饰。例如，本发明提供的变体ADA2与未修饰的ADA2蛋白相比可具有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85或更多个氨基酸差异。只要所得蛋白呈现腺苷脱氨酶活性，则可以涵盖任何修饰。
如本文所用，修饰是指多肽的氨基酸残基序列或者核酸分子中的核苷酸序列的修饰，分别包括氨基酸和核苷酸的缺失、插入和置换。修饰也可以包括翻译后修饰或者由于与另一部分直接或间接缀合或连接所致的对分子的其它改变。修饰多肽的方法对本领域技术人员是常规的，如通过使用重组DNA方法。
如本文所用，当提及核酸或多肽序列的修饰时，“缺失”是指与如靶多核苷酸或多肽等序列或者天然或野生型序列相比，一或多个核苷酸或氨基酸的去除。因此，与野生型序列相比，含有一或多个缺失的氨基酸序列或核酸分子在线性序列长度内少含有一或多个氨基酸或核苷酸。
如本文所用，当提及核酸或氨基酸序列的修饰时，“插入”是指在靶序列、天然序列、野生型或其它相关序列内包含一或多个另外的核苷酸或氨基酸。因此，与野生型序列相比，含有一或多个插入的氨基酸或核酸分子在线性序列长度内含有一或多个另外的氨基酸或核苷酸。
如本文所用，核酸或氨基酸序列的“添加”是指与另一序列相比，在任一末端添加核苷酸或氨基酸。
如本文所用，关于修饰的“取代”或“置换”是指将天然序列、靶序列、野生型或其它核酸或多肽序列中的一或多个核苷酸或氨基酸置换为另一核苷酸或氨基酸，而不改变分子的长度(如在残基的数目描述)。因此，分子中的一或多个取代不改变分子氨基酸残基或核苷酸的数目。与特定多肽相比，氨基酸置换可以沿着多肽序列或参考多肽序列长度的氨基酸残基的数目表示。例如，修饰的多肽在氨基酸序列第19位的氨基酸存在异亮氨酸(Ile；I)由半胱氨酸(Cys；C)取代的修饰，可以表示为“在相应于位置19的位置用Cys或C置换”、I19C、Ile19Cys或者简单的C19，表明在修饰的第19位的氨基酸是半胱氨酸。在这个实例中，具有取代的分子在未修饰的多肽的Ile 19具有修饰。
如本文所用，“未修饰的多肽”或者“未修饰的ADA2”及其语法变化用语是指如本发明提供的选择用于修饰的起始多肽。起始多肽可以是天然发生的野生型形式的多肽。举例的未修饰的ADA2多肽是SEQ ID NO:5所示人ADA2或者其催化活性部分。此外，起始多肽可以被改变或突变，由此其与天然野生型同种型不同，但是在本文相对于随后从中产生的修饰的多肽仍作为起始未修饰的多肽。因此，可以选择本领域已知经修饰的与未修饰的参考蛋白质相比具有希望的增加或降低的特定活性或性质的现有蛋白质并用作起始未修饰的多肽。例如，已经从其天然形式通过一或多个单一氨基酸改变而被修饰并具有希望的性质增加或降低的蛋白质(例如一或多个氨基酸残基改变以改变糖基化)可以是靶蛋白，在本文称作未修饰的，用于对相同或不同性质的进一步修饰。
如本文所用，“相应残基”是指在比对的基因座存在的残基。对于本发明而言，将蛋白质的氨基酸序列与SEQ ID NO:2所示前体ADA2或者SEQ ID NO:5所示其成熟形式(见图1)比对，或者与用于Zavialov编号(Zavialov et al.(2010)J.Biol.Chem.285:12367-12377及PDB登录号3LGG和3LGD中使用的残基编号，在SEQ ID NO:4中示出)的ADA2序列比对。相关的或者变体多肽通过本领域技术人员已知的任何方法比对。这种方法典型最大化匹配，包括如使用人工比对及通过使用可利用的多种比对程序(例如BLASTP)及本领域技术人员已知的其它的方法。通过比对ADA2多肽的序列，使用保守和相同氨基酸残基为指导，本领域技术人员可以鉴别相应残基。通常，多肽的氨基酸相应于揭示的序列中的氨基酸是指在使用标准比对算法如GAP算法将所述多肽与揭示的序列以最大相同性或同源性比对(其中比对保守氨基酸)时鉴别的氨基酸。
如本文所用，ADA2的“性质”是指物理或结构性质，如三维结构、pI、半衰期、构象及其它这种物理特性。
如本文所用，ADA2的“活性”或者“ADA2活性”是指由活性形式ADA2蛋白、典型是二聚体形式呈现出的任何活性。这种活性可以在体外和/或体内检测，包括但不限于腺苷脱氨酶活性、生长因子活性、结合肝素的能力和/或结合腺苷受体(ADR)的能力。活性可以在体外或体内使用公认的测定法评估，例如通过测量在体外或体内的腺苷脱氨酶活性。这种测定的结果表明多肽呈现出可以与多肽在体内的活性相关的活性，其中体内活性可以称作生物活性。确定修饰形式的ADA2的功能性和活性的测定法为本领域技术人员已知，本文描述了一些示例的测定法。
如本文所用，“腺苷脱氨酶活性”是指酶催化腺苷水解脱氨形成肌苷的能力。ADA2活性可以通过测量酶反应产物的生产率而直接或者间接评估。例如可以直接或间接测量肌苷或氨的生产。在其它实例中，测量酶的底物如腺苷或2-脱氧腺苷的降低。评估腺苷脱氨酶活性的测定为本领域技术人员已知，包括但不限于其中通过分光光度法直接测量或者通过随后的使用生色底物或改变反应的吸收光谱的酶学或氧化还原反应间接测量底物的降低或者产物的增加的测定。
如本文所用，“增加的腺苷脱氨酶活性”是指ADA2蛋白如变体ADA2蛋白与参考蛋白质相比呈现出腺苷脱氨酶活性增强的能力。例如，变体ADA2蛋白呈现出腺苷脱氨酶活性的能力可以高于未修饰的ADA2蛋白的腺苷脱氨酶活性。所述腺苷脱氨酶活性与参考或未修饰的蛋白质的腺苷脱氨酶活性相比可以增加至少大约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％、1000％或更多。
如本文所用，糖基化位点是指多肽中可以附着碳水化合物部分的氨基位置。典型地，糖基化蛋白质含有一或多个氨基酸残基如天冬酰胺或丝氨酸以附着碳水化合物部分。
如本文所用，天然糖基化位点是指野生型多肽中碳水化合物部分附着的氨基位置。在ADA2中有四个N连接的天然糖基化位点，相应于参照SEQ ID NO:5的残基N98、N145、N156和N349。
如本文所用，非天然糖基化位点是指修饰的多肽中碳水化合物部分附着的氨基位置，其在野生型多肽中不存在。非天然糖基化位点可以通过氨基酸置换导入ADA2多肽中。O-糖基化位点可以例如通过用丝氨酸或苏氨酸置换天然残基的氨基酸置换而产生。N-糖基化位点可以例如通过建立基序Asn-Xaa-Ser/Thr/Cys而产生，其中Xaa不是脯氨酸。通过氨基酸修饰产生这个共有序列可包括例如：用天冬酰胺置换天然氨基酸残基的单一氨基酸置换，用丝氨酸、苏氨酸或半胱氨酸置换天然氨基酸残基的单一氨基酸置换，或者包括用天冬酰胺置换天然残基的第一氨基酸置换及用丝氨酸、苏氨酸或半胱氨酸置换天然残基的第二氨基酸置换的双重氨基酸置换，或者插入非天然N-糖基化基序，如基序Asn-Xaa-Ser/Thr/Cys，其中Xaa不是脯氨酸。
如本文所用，“糖基化水平”是指例如在能糖基化的宿主细胞中表达时能被聚糖占据的糖基化位点的数目。
如本文所用，糖基化水平增加是指参照未修饰的或野生型ADA2，能被聚糖占据的糖基化位点数目更大。如果与未修饰的或野生型ADA2相比被聚糖占据的糖基化位点数目更大，呈现出糖基化水平增加的变体ADA2可以是高糖基化的。
如本文所用，“蛋白质稳定性”是指蛋白质应答环境条件(例如温度升高)而保持一或多种物理性质的量度。在一个实施方案中，所述物理性质是维持蛋白质的共价结构(例如不存在蛋白水解裂解、不希望的氧化或脱氨化)。在另一个实施方案中，所述物理性质是蛋白质以其正确折叠的状态存在(例如不存在可溶或不溶的聚集物或沉淀物)。在一个实施方案中，蛋白质的稳定性是通过测定蛋白质的生物物理性质测量的，例如热稳定性、pH解折叠模式、稳定除去糖基化、溶解性、生物化学功能(例如结合蛋白质如受体的能力或者酶活性)和/或其组合。在另一个实施方案中，生物化学功能是通过相互作用的结合亲和性证实。稳定性可以使用本领域已知和/或本文描述的方法测量。
如本文所用，“半衰期”是指活体通过其正常消除途径消除一半数量的给予的物质需要的时间。正常的消除途径通常包括肾和肝，但是也可包括其它排泄途径。半衰期可以描述为某物质的浓度从稳定状态或从消除曲线上某一点减半其浓度需要的时间。半衰期典型在血浆中测量，可以通过给予单一剂量的药物、然后测量该药物在某时间点在血浆中的浓度以确定时间与作为该物质被消除的浓度下降之间的关系而确定。
如本文所用，“延长的半衰期”是指蛋白质分子与参考蛋白质相比其半衰更长。因此，这意味着某物质的浓度减半需要的时间长于参考蛋白质的浓度减半需要的时间。所述半衰期与未修饰的多肽的半衰期相比可以延长至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％、1000％、1100％、1200％、1300％、1400％、1500％、1600％、1700％、1800％、1900％、2000％、3000％、4000％、5000％、6000％、7000％、8000％、9000％、10000％或更长。评估半衰期的测定法为本领域已知且是标准方法。
如本文所用，“热稳定性”是指在暴露于高温或者升高的温度时发生的对蛋白质变性的抗性的量度，因此是蛋白质在特定温度下发挥功能的能力。多肽如果在某温度下保留其至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多的活性或性质，则认为其在该温度是热稳定的。热稳定性可以通过已知程序或者通过本文描述的方法测量。在某些实施方案中，热稳定性是通过测量蛋白质的解链温度(Tm)或者通过热挑战测定(Tc)评估的。
如本文所用，“增加的热稳定性”是指对于蛋白质变性的较高程度抗性。例如，这可以意味着蛋白质与参考蛋白质相比在较高温度是热稳定性的。这也可意味着蛋白质在特定温度下与参考蛋白质在相同温度下的活性相比呈现出较大程度地保留活性。在一些情况中，增加的热稳定性意味着蛋白质与参考蛋白质相比具有较高的解链温度Tm。例如，如果蛋白质的Tm比参考或未修饰的蛋白质高至少0.1℃、0.2℃、0.3℃、0.4℃、0.5℃、0.6℃、0.7℃、0.8℃、0.9℃、1.0℃、1.5℃、2.0℃、2.5℃.3.0℃、4.0℃、5.0℃或更高，则认为其热稳定性是增加的。
如本文所用，解链温度(Tm；也称作转变温度)是在热转变曲线中点的温度，在此50％的组合物分子是折叠状态。因此，这是50％的大分子变成变性的温度，及是描述蛋白质热稳定性的标准参数。确定Tm的方法为本领域技术人员熟知，包括例如光谱分析方法例如但不限于差示扫描量热法(DSC)、圆二色性(CD)光谱学、荧光发射光谱学或者核磁共振(NMR)光谱学。
如本文所用，“最佳pH”是在此pH下任何酶反应如腺苷脱氨酶活性在指定一组条件下是最有效。关于其腺苷脱氨酶活性，ADA2呈现出最佳pH是或是大约6.5。
如本文所用，“改变的最佳pH”是指pH的变化(增加或降低)，其对于腺苷脱氨酶活性是最佳pH。如果所述最佳pH与参考或未修饰的蛋白质的最佳pH相比高0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.0、2.5或更高，则存在增加的最佳pH。如果所述最佳pH与参考或未修饰的蛋白质的最佳pH相比低或小0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.0、2.5或更低，则存在降低的最佳pH。
如本文所用，“结合、“结合的”或者其语法用语变化是指分子与另一分子以任何吸引性相互作用的参与，导致其中两个分子彼此紧密接近的稳定结合。结合包括但不限于非共价键、共价键(如可逆和不可逆共价键)，及包括分子例如但不限于蛋白质、核酸、碳水化合物、脂质和小分子如化学化合物包括药物之间的相互作用。典型地，结合包括两或更多个分子通过一或多个共价键的结合。结合可以通过本领域已知的标准方法评定，包括但不限于平衡透析、放射免疫测定放射标记的靶抗原、免疫测定(例如酶联免疫吸附测定(ELISA))、表面等离子共振(SPR)、等温滴定量热法(ITC)及本领域技术人员熟知的其它方法。
如本文所用，结合活性是指分子例如多肽关于其是否及怎样结合一或多个结合配偶体的特性。结合活性包括结合结合配偶体的能力、其结合结合配偶体的亲和性(例如高亲和性)、其结合结合配偶体的亲合力、与结合配偶体的键的强度和/或与结合偶配体结合的特异性。
如本文所用，“肝素结合”是指ADA2结合肝素的能力，肝素是由可变的硫酸化重复二糖单位组成的高度硫酸化的糖胺聚糖。通常，肝素二糖单位由2-O-硫酸化艾杜糖醛酸和6-O-硫酸化、N-硫酸化葡糖胺、IdoA(2S)-GlcNS(6S)组成。
如本文所用，“减少的肝素结合”或者“弱化的肝素结合”是指与肝素减少或降低的结合活性。例如，这可意味着与ADA2蛋白如变体ADA2的的结合水平或程度低于参考蛋白质。例如，如果ADA2蛋白与肝素结合的水平或程度不超过参考或未修饰的ADA2蛋白与肝素结合的1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％，则其肝素结合降低。在一些情况中，肝素结合与参考或未修饰的ADA2蛋白的肝素结合相比降低至少或至少大约0.5倍、1倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更多。
如本文所用，“腺苷受体”或者ADR是指结合腺苷的一类G蛋白偶联受体。腺苷受体也可以结合ADA2。有四种类型的腺苷受体。例如，在人中ADR被称作A1(SEQ ID NO:533)、A2A(SEQ ID NO:534)、A2B(SEQ ID NO:535)和A3(SEQ ID NO:536-538)。
如本文所用，“受体结合”是指ADA2结合腺苷受体的能力。
如本文所用，“降低的受体结合”是指减少或降低的对于腺苷受体的结合活性。例如，这可意味着ADA2蛋白如变体ADA2的结合水平或程度低于参考蛋白对于相同腺苷受体的结合。例如，如果ADA2蛋白对于腺苷受体的结合水平或程度不超过参考或未修饰的ADA2蛋白对于相同腺苷受体的结合的1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％，则其受体结合是降低的。在一些情况中，受体结合与参考或未修饰的ADA2蛋白对于相同腺苷受体的受体结合相比降低至少或至少大约0.5倍、1倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更多。
如本文所用，关于蛋白质“在相同条件下对比”是指不同的蛋白质在相同或基本相同条件下处理，由此可影响蛋白质或物质的活性或性质的任一或多个条件在检测物质之间是不变的或者基本不变的。例如，当将ADA2与未修饰的ADA2蛋白对比腺苷脱氨酶活性时，任一或多个条件如蛋白质的量或浓度；配制物中除了活性剂之外的赋形剂、载体或其它成分的存在包括量；温度；pH和/或其它条件在对比的多肽之间和之中是相同或基本相同的。
如本文所用，“免疫检查点”是指免疫系统负责维持自身耐受性及调节外周组织中生理学免疫应答的持续时间和振幅以使旁系组织损害最小化的抑制途径。免疫检查点由免疫检查点蛋白调节。
“免疫检查点蛋白”是这样的蛋白质、典型为受体(例如CTLA4或PD-1)或配体(例如PD-L1)，其调节或调整免疫应答的程度。免疫检查点蛋白可以是抑制性或刺激性的。特别地，免疫检查点蛋白对于免疫应答的激活是抑制性的。因此，抑制性免疫检查点蛋白的抑制起刺激或激活免疫应答的作用，如T细胞激活和增殖。
如本文所用，“免疫检查点抑制剂”或“免疫检查点抑制物质”或者“免疫检查点阻断剂”是指结合抑制性免疫检查点蛋白并阻断其活性的物质。所述抑制可以是竞争性或非竞争性抑制，可以是空间位或变构抑制。在免疫检查点蛋白是免疫刺激蛋白的情况中，免疫检查点抑制剂起促进免疫刺激蛋白活性的作用，如通过结合并激活刺激性免疫检查点蛋白或者通过干扰(例如结合或失活)抑制刺激性免疫检查点蛋白的抑制剂。举例的免疫检查点抑制剂是抗免疫检查点蛋白抗体。
免疫检查点抑制剂的“靶”是免疫检查点蛋白，免疫检查点抑制剂或免疫检查点抑制物质结合并阻断其活性。典型地，免疫检查点抑制剂特异性结合该靶。例如称作伊匹木单抗的抗CTLA4抗体的靶是CTLA4。
如本文所用，抗免疫检查点蛋白抗体是指特异性结合免疫检查点蛋白或其可溶片段并阻断的任何抗体。抗免疫检查点蛋白抗体典型结合免疫检查点配体蛋白或免疫检查点受体蛋白并阻断受体与靶免疫检查点配体蛋白的结合或者配体与靶免疫检查点受体蛋白的结合，从而阻止抑制免疫应答的抑制性信号转导。因此，抗免疫检查点蛋白抗体是免疫检查点抑制剂。本文提及抗免疫检查点蛋白抗体包括全长抗体及特异性结合免疫检查点配体或受体蛋白的其抗原结合片段。举例的抗免疫检查点蛋白抗体包括但不限于抗细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA4)抗体及抗程序化细胞死亡蛋白1(PD-1)抗体。
如本文所用，抗免疫检查点蛋白抗体的抗原结合片段是指衍生自抗免疫检查点蛋白抗体的抗体，但是少于抗免疫检查点蛋白抗体的全长序列，但含有该抗体的至少一部分可变区(重链和轻链)足以形成抗原结合位点(例如一或多个CDR，通常为全部CDR)及因此保留抗免疫检查点蛋白抗体的结合特异性和/或活性。
如本文所用，抗-CTLA4抗体是指特异性结合细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA4)或其可溶片段并阻断配体结合CTLA4，从而导致竞争性抑制CTLA4及抑制CTLA4介导的T细胞激活抑制的任何抗体。因此，抗-CTLA4抗体是CTLA4抑制剂。本文提及抗-CTLA4抗体包括全长抗体及其衍生物，如特异性结合CTLA4的其抗原结合片段。举例的抗-CTLA4抗体包括但不限于伊匹木单抗或曲美木单抗，或者其衍生物或抗原结合片段。
如本文所用，抗-PD-1是指特异性结合程序化细胞死亡蛋白1(PD-1)或其可溶片段并阻断配体与PD-1结合、从而导致竞争性抑制PD-1及抑制PD-1-介导的T细胞激活抑制的任何抗体。因此，抗-PD-1抗体是PD-1抑制剂。本文提及抗-PD-1抗体包括全长抗体及其衍生物，如特异性结合PD-1的其抗原结合片段。举例的抗-PD-1抗体包括但不限于纳武单抗、MK-3475、Pidilizumab或者其衍生物或抗原结合片段。
如本文所用，抗-PD-L1抗体是指这样的抗体，其特异性结合程序化死亡-配体(PD-L1)或其可溶片段并阻断配体与PD-1结合，从而导致竞争性抑制PD-1及抑制PD-1介导的T细胞活性抑制。因此，抗-PD-L1抗体是PD-1抑制剂。本发明提及抗-PD-L1抗体包括全长抗体及其衍生物，如特异性结合PD-L1的其抗原结合片段。举例的抗-PD-L1抗体包括但不限于BMS-936559、MPDL3280A、MEDI4736或其衍生物或抗原结合片段。
如本文所用，“抗体”是指免疫球蛋白及免疫球蛋白片段，无论其是天然还是部分或全部合成的，如重组产生的，包括具有免疫球蛋白的至少一部分可变重链和轻链区足以形成抗原结合位点及当装配时特异性结合抗原的其任何片段。因此，抗体包括具有与免疫球蛋白抗原结合结构域(抗体结合位点)同源或基本同源的结合结构域的任何蛋白质。例如，抗体是指含有两条重链(可以标示为H和H’)和两条轻链(可以标示为L和L’)的抗体，其中每条重链可以是全长免疫球蛋白重链或者足以形成抗原结合位点的其一部分(例如重链包括但不限于VH链、VH-CH1链和VH-CH1-CH2-CH3链)，和每条轻链可以是全长轻链或者足以形成抗原结合位点的其一部分(例如轻链包括但不限于VL链和VL-CL链)。每条重链(H和H’)与一条轻链(分别L和L’)配对。典型地，抗体最低限度包括全部或至少一部分可变重链(VH)和/或可变轻链(VL)。抗体也可以包括全部或一部分恒定区。
对于本发明，术语抗体包括全长抗体及其一部分，包括抗体片段。抗体片段包括但不限于Fab片段、Fab'片段、F(ab’)2片段、Fv片段、二硫键连接的Fv(dsFv)、Fd片段、Fd’片段、单链Fv(scFv)、单链Fab(scFab)、双抗体、抗独特型(抗-Id)抗体或者任何上述抗体片段的抗原结合片段。抗体还包括合成抗体、重组产生的抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、人抗体、非人抗体、人源化抗体、嵌合抗体和细胞内抗体。本发明提供的抗体包括任何免疫球蛋白类型(例如IgG、IgM、IgD、IgE、IgA和IgY)、任何类别(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类(例如IgG2a和IgG2b)的成员。
如本文所用，当提及衍生自另一抗体如单克隆抗体的抗体片段时所用短语“衍生自”或者“衍生物”是指抗体片段(例如Fab、F(ab')、F(ab')2、单链Fv(scFv)、Fv、dsFv、双抗体、Fd和Fd'片段)的工程化，其保留原始或亲代抗体的结合特异性。这种片段可以通过本领域已知的各种方法衍生，包括但不限于酶裂解、化学交联、重组方式或其组合。通常，衍生的抗体片段共享亲代抗体的相同或基本相同的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，由此抗体片段与亲代抗体结合相同表位。
如本文所用，抗透明质酸剂是指调节透明质酸(HA)合成或降解从而改变组织或细胞中的透明质酸水平的任何物质。对于本发明，抗透明质酸剂与不存在该物质相比降低组织或细胞中透明质酸水平。这种物质包括调节编码HA合成酶(HAS)及参与透明质酸代谢的其它酶或受体的遗传材料表达的化合物，或者调节合成或降解透明质酸包括HAS功能或活性的蛋白质的化合物。所述物质包括小分子、核酸、肽、蛋白质或其它化合物。例如，抗透明质酸剂包括但不限于反义或有义分子、抗体、酶、小分子抑制剂和HAS底物类似物。
如本文所用，透明质酸降解酶是指催化透明质酸聚合物(也称作透明质酸或HA)裂解为更小分子量片段的酶。举例的透明质酸降解酶是透明质酸酶，及具有使透明质酸解聚能力的特定软骨素酶和裂解酶。是透明质酸降解酶的举例的软骨素酶包括但不限于软骨素ABC裂解酶(也称作软骨素酶ABC)、软骨素AC裂解酶(也称作硫酸软骨素裂解酶或硫酸软骨素消除酶)及软骨素C裂解酶。
如本文所用，透明质酸酶是指一类透明质酸降解酶。透明质酸酶包括细菌透明质酸酶(EC 4.2.2.1或EC 4.2.99.1)，来自水蛭、其它寄生物和甲壳纲动物的透明质酸酶(EC3.2.1.36)及哺乳动物类型透明质酸酶(EC3.2.1.35)。透明质酸酶包括任何非人来源，包括但不限于鼠、犬、猫、野兔、禽、牛、绵羊、猪、马、鱼、蛙、细菌，及来自水蛭、其它寄生物和甲壳纲动物的任何来源。例如，透明质酸酶包括人源那些透明质酸酶。举例的人透明质酸酶包括HYAL1、HYAL2、HYAL3、HYAL4和PH20(SEQ ID NO:480和551)。透明质酸酶还包括可溶透明质酸酶，包括绵羊和牛PH20、可溶人PH20和可溶rHuPH20。举例的可商购的牛和绵羊可溶透明质酸酶包括(绵羊透明质酸酶)、(牛透明质酸酶)和HydaseTM(牛透明质酸酶)。
提及透明质酸降解酶或透明质酸酶包括前体透明质酸降解酶多肽和成熟透明质酸降解酶多肽(如其中已经除去信号序列的那些)、其具有活性的截短形式，及包括等位基因变体和种变体、由剪接变体编码的变体，及其它变体，包括与前体多肽或其成熟形式具有至少40％、45％、50％、55％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列相同性的多肽。透明质酸降解酶和透明质酸酶还包括含有化学或翻译后修饰的那些酶及不含有化学或翻译后修饰的那些酶。这种修饰包括但不限于聚乙二醇化、白蛋白化、糖基化、法尼酰化、羧基化、羟基化、磷酸化及本领域已知的其它多肽修饰。截短的PH20透明质酸酶是其任何C末端截短形式，特别是当N-糖基化时截短和中性活性的形式。
如本文所用，“牛PH20”是指纯化自牛睾丸提取物的牛透明质酸酶(见美国专利号2,488,564、2,488,565、2,806,815、2,808,362、2,676,139、2,795,529、5,747,027和5,827,721)。举例的可商购的纯化的牛睾丸透明质酸酶包括和HydaseTM，及牛透明质酸酶包括但不限于得自Sigma Aldrich、Abnova、EMD Chemicals、GenWay Biotech,Inc.、Raybiotech,Inc.和Calzyme的那些。还包括重组产生的牛透明质酸酶。
如本文所用，“绵羊PH20”是指纯化自绵羊睾丸提取物的绵羊透明质酸酶(见美国专利号2,488,564、2,488,565和2,806,815及国际PCT公开号WO2005/118799)。举例的可商购的纯化的绵羊睾丸提取物包括及绵羊透明质酸酶，包括但不限于购自SigmaAldrich、Cell Sciences、EMD Chemicals、GenWay Biotech,Inc.、Mybiosource.com和Raybiotech,Inc的那些。还包括重组产生的绵羊透明质酸酶。
如本文所用，“PH20”是指在精子中发生的及是中性活性的一种类型透明质酸酶。PH-20在精子表面上及在溶酶体衍生的顶体精子中发生，在此其结合内部顶体膜。PH20包括任何来源的PH20，包括但不限于源自人、黑猩猩、食蟹猴、恒河猴、鼠、牛、绵羊、豚鼠、兔和大鼠。举例的PH20多肽包括来自人的那些(前体形式如SEQ ID NO:551示出，成熟形式如SEQID NO:480示出)。
如本文所用，“可溶PH20”是指在生理条件下可溶的任何形式的PH20。可溶PH20可以例如通过其在37℃分配至X-114溶液的水相而鉴别(Bordier et al.,(1981)J.Biol.Chem.,256:1604-7)。膜锚定的PH20如脂质锚定的PH20、包括GPI锚定的PH20将分配至去污剂富集相，但是在用磷脂酶C处理后将分配至去污剂贫乏相或水相。可溶PH20包括膜锚定的PH20，其中与PH20锚定膜相关的一或多个区域已经除去或修饰，其中可溶形式保留透明质酸酶活性。可溶PH20还包含重组可溶PH20及包含于或纯化自天然来源的那些，如来自羊或牛的睾丸提取物。举例的这种可溶PH20是可溶人PH20。举例的可溶人PH20多肽如SEQID NO:481-488、493-514或526-532任一示出，或者具有与SEQ ID NO:481-488、493-514或526-532任一所示氨基酸序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列相同性的氨基酸序列及是可溶的且保留透明质酸酶活性。
如本文所用，“可溶重组人PH20(rHuPH20)”是指含有在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中重组表达和分泌的可溶形式人PH20的组合物。可溶rHuPH20由包含信号序列及编码SEQ IDNO:481所示多肽的核酸分子编码。编码可溶rHuPH20的核酸在CHO细胞中表达，其分泌成熟多肽。由于在培养基中产生，在C末端具有异质性，由此产物包含可具有各种丰度的SEQ IDNO:481-486的任一或多个的物种混合物。
如本文所用，“透明质酸酶活性”是指酶学催化透明质酸裂解的能力。关于透明质酸酶的美国药典(USP)XXII测定法通过测量在使得酶与HA在37℃反应30分钟后剩余的较高分子量透明质酸(HA)底物的量而间接确定透明质酸酶活性(USP XXII-NF XVII(1990)644-645United States Pharmacopeia Convention,Inc.,Rockville,MD)。参考标准溶液可用于测定中以确定任何透明质酸酶的相对活性(单位)。确定透明质酸酶如PH20、包括可溶PH20与esPH20的透明质酸酶活性的体外测定法为本领域已知及在本文描述。举例的测定包括微浊度测定，其通过检测当未裂解的透明质酸结合血清白蛋白时形成的不溶沉淀物而间接测量透明质酸酶对透明质酸的裂解，及生物素酰化的透明质酸测定，其通过检测剩余的与具有链霉抗生物素蛋白-辣根过氧化物酶缀合物和生色底物的微滴定平板孔非共价结合的生物素酰化的透明质酸间接测量透明质酸的裂解。参考标准可用于例如产生标准曲线以确定检测的透明质酸酶的活性(单位)。
如本文所用，“中性活性”是指PH20多肽在中性pH(例如在或在大约pH 7.0)酶学催化透明质酸裂解的能力。
如本文所用，抗癌剂或者化疗剂是指能杀死快速分裂的细胞如癌细胞的物质。本领域技术人员熟知抗癌剂，包括化疗剂。举例的物质在本文描述。
如本文所用，“生物活性”是指化合物的体内活性或者在体内给予化合物、组合物或其它混合物时获得的生理反应。生物活性因此涵盖了这种化合物、组合物和混合物的治疗作用和药物活性。生物活性可以在设计为检测或使用这种活性的体外系统中观测。因此，对于本发明而言，ADA2的生物活性涵盖腺苷脱氨酶活性。
如本文所用，术语“评定”及其语法变化用语是指包括从获得多肽活性的绝对值的意义上及获得表示活性水平的指数、比率、百分比、目测或者其它数值的意义上的定量和定性确定。评定可以是直接或间接评定。例如，检测多肽对底物的裂解可以是直接测量产物，或者可以通过确定裂解的底物的所得活性而间接测量。
如本文所用，“成熟编号”或者“标准编号”是指按顺序基于成熟ADA2多肽的残基的编号。对于本发明，成熟编号基于SEQ ID NO:5所示成熟ADA2的残基编号。
如本文所用，“Zavialov编号”是指在Zavialov et al.(2010)J.Biol.Chem.285:12367-12377及在PDB登录号3LGG和3LGD中使用的残基编号。Zavialov编号基于SEQ ID NO:4所示ADA2的残基编号。因此，Zavialov编号可以通过与SEQ ID NO:4比对而确定。下表1示出成熟编号与Zavialov编号之间的相应位置编号。表1提供了SEQ ID NO:4所示氨基酸序列(Zavialov编号的参考序列)，其位置编号和SEQ ID NO:5相应位置编号(如本文所用的成熟编号的参考序列)。
如本文所用，“缀合物”是指与一或多个其它多肽或化学部分直接或间接连接的多肽。这种缀合物包括融合蛋白，通过化学缀合产生的那些及通过任何其它方法产生的那些。例如，缀合物是指与一或多个其它多肽或化学部分直接或间接连接的ADA2蛋白，从而至少一个ADA2多肽亚基与另一多肽或化学部分直接或间接连接，只要所述缀合物保留腺苷脱氨酶活性。
如本文所用，“偶联的”或者“缀合的”是指通过共价或非共价相互作用附着。
如本文所用，嵌合多肽是指含有来自至少两个不同多肽或者来自单一多肽的两个非连续部分的部分的多肽。因此，嵌合多肽通常包括一个多肽的全部或部分氨基酸残基的序列及另一个不同多肽的全部或部分氨基酸的序列。这两部分可以直接或间接连接，及可以通过肽键、其它共价键共价相互作用连接，强度足以维持嵌合多肽主要部分在平衡条件和生理条件下如在等渗pH 7缓冲盐水中的完整性。
如本文所用，融合蛋白是工程化的多肽以含有连接在一起的相应于两个单独多肽的氨基酸序列，例如通过从含有编码这两个多肽的两个核酸的载体沿着载体的长度彼此紧密接近如相邻地表达该融合蛋白。因此，融合蛋白是指含有直接或者通过肽键间接连接的两个或更多个蛋白质或肽的两个或多个部分的嵌合蛋白。两个分子在构建体中可以是相邻的或者由接头或者间隔多肽分隔开。
如本文所用，“接头”或者“间隔”肽是指连接两个多肽序列的短氨基酸序列(或者编码这种氨基酸序列的核酸)。“肽接头”是指连接两个多肽序列的短氨基酸序列。举例的多肽接头是连接肽转导结构域与抗体的接头，或者在合成的抗体片段如scFv片段中连接两个抗体链的接头。接头为本领域熟知，任何已知接头均可用于本发明提供的方法中。举例的多肽接头是(Gly-Ser)n氨基酸序列，其中遍及分布一些Glu或Lys残基以增加溶解性。其它举例的接头在本文中描述；任何这些及其它已知接头均可用于本发明提供的组合物和方法中。
如本文所用，多聚化结构域是指促进多肽分子与一或多个另外的多肽分子(其均含有互补多聚结构域，其可以是相同或不同的多聚结构域以与第一个结构域形成稳定的多聚体)稳定相互作用的氨基酸序列。通常，多肽与多聚结构域直接或间接连接。举例的多聚结构域包括免疫球蛋白序列或其一部分、亮氨酸拉链、疏水区、亲水区及相容的蛋白质-蛋白质相互作用结构域。多聚结构域例如可以是免疫球蛋白恒定区或结构域，例如来自IgG包括IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚型、IgA、IgE、IgD和IgM及其修饰形式的Fc结构域或部分。
如本文所用，“部分”或“异源部分”是指能与另一分子直接或者通过共价或非共价相互作用间接相关的分子。典型地，所述分子衍生自与其相关的实体不同的实体。在一个实施方案中，异源部分可以是融合于另一多肽的多肽以产生融合多肽或蛋白。在另一个实施方案中，异源部分可以是非多肽如聚合物，如缀合于多肽或蛋白的PEG。
如本文所用，“半衰期延长部分”是促进其缀合的分子的半衰期延长的异源部分。
如本文所用，“Fc”或者“Fc区”或者“Fc结构域”是指含有抗体重链恒定区的多肽，不包括第一个恒定区免疫球蛋白结构域。因此，Fc是指IgA、IgD和IgE的最后两个恒定区免疫球蛋白结构域，或者IgE和IgM的最后三个恒定区免疫球蛋白结构域。任选地，Fc结构域可包括这些结构域的全部或部分柔性铰链N末端。对于IgA和IgM，Fc可包含J链。对于举例的IgG的Fc结构域，Fc含有免疫球蛋白结构域Cγ2和Cγ3，及任选含有Cγ1与Cγ2之间的全部或部分铰链。Fc区的边界可以变化，但是典型包括至少部分铰链区。此外，Fc还包括任何等位基因或种变体或者任何变体或修饰形式，如改变与FcR结合或者改变Fc介导的效应子功能的任何变体或修饰形式。
如本文所用，“Fc嵌合体”是指嵌合多肽，其中一或多个多肽与Fc区域或其衍生物直接或间接连接。典型地，Fc嵌合体组合了免疫球蛋白的Fc区与另一多肽。Fc多肽衍生物或修饰的Fc多肽为本领域技术人员已知。
如本文所用，“聚合物”是指任何高分子量天然或合成部分，其与多肽缀合，即直接或者通过接头间接稳定连接。这种聚合物典型延长血清半衰期，及包含但不限于唾液酸部分、PEG化部分、葡聚糖及糖和其它部分，例如用于糖基化。例如，ADA2蛋白如变体ADA2可以与聚合物缀合。
如本文所用，“PEG化”是指聚合分子如聚乙二醇(PEG化部分PEG)与蛋白质包括ADA2如变体ADA2的共价或其它稳定附着。PEG化可延长ADA2的半衰期。
如本文所用，核酸包括DNA、RNA及其类似物，包括肽核酸(PNA)及其混合物。核酸可以是单链或双链的。当提及探针或引物时，其任选是标记的，如用可检测标记如荧光或放射性标记物标记，涵盖单链分子。这种分子典型是这样的长度，由此其靶对于探查或引发文库是统计学独特或低拷贝数(典型少于5个，通常少于3个)。通常，探针或引物含有与感兴趣的基因互补或相同的至少14、16或30个连续核苷酸序列。探针和引物的长度可以是10、20、30、50、100或更多个核苷酸。
如本文所用，肽是指长度为2-40个氨基酸的多肽。
如本文所用，在本发明提供的各个氨基酸序列中存在的氨基酸是根据其已知的三字母或单字母缩写标识的(表2)。在各个核酸片段中存在的核苷酸是根据本领域常用的标准单字母名称命名的。
如本文所用，“氨基酸”是含有氨基基团和羧酸基团的有机化合物。多肽含有两或更多个氨基酸。对于本发明，氨基酸包括20个天然发生的氨基酸、非天然氨基酸及氨基酸类似物(即其中α-碳有侧链的氨基酸)。
与在J.Biol.Chem.,243:3557-3559(1968)中描述及在37C.F.R.§§1.821-1.822中采用的标准多肽命名法保持一致，氨基酸残基的缩写在表2中示出。
应注意在本文所有公式表示的氨基酸残基序列均以从左到右以氨基末端至羧基末端的常规方向示出。此外，短语“氨基酸残基”广义限定包括在对应表(表2)中列出的氨基酸以及修饰的和不常见的氨基酸，如在37C.F.R.§§1.821-1.822中提及的那些，在此并入本文作参考。进一步地，应注意在氨基酸残基序列开始或结束处的破折号“-”表示与一或多个氨基酸残基的进一步序列、氨基末端基团如NH2或者羧基末端基团如COOH的肽键。
如本文所用，“疏水性氨基酸”包括使用Eisenberg疏水性共识量表确定是疏水性的任一氨基酸。例如是天然发生的疏水性氨基酸，如异亮氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、丙氨酸、甘氨酸、半胱氨酸和酪氨酸(Eisenberg et al.,(1982)FaradaySymp.Chem.Soc.17:109-120)。也包括非天然发生的疏水性氨基酸。
如本文所用，“酸性氨基酸”包括天然发生的氨基酸天冬氨酸和谷氨酸残基。也包括非天然发生的酸性氨基酸。
如本文所用，“极性氨基酸”是指亲水性的氨基酸，由此侧链优选存在于水相(即水)环境中。这种氨基酸通常位于蛋白质表面上。这种氨基酸通常被分为是否包括具有官能团如酸、酰胺、醇或胺的极性侧链，其含有氧或氮可参与与水的氢键结合。举例的这种氨基酸是Arg(R)、Asn(N)、Asp(D)、Glu(E)、Gln(Q)、His(H)、Lys(K)、Ser(S)、Thr(T)和Tyr(Y)。Cys(C)和Trp(W)也被认为是弱极性的。
如本文所用，极性和中性氨基酸是含有中性侧链的极性氨基酸。举例的用于置换的这种氨基酸残基是Asn(N)、Gln(Q)、Ser(S)、Thr(T)、Cys(C)或Tyr(Y)。
如本文所用，“天然发生的氨基酸”是指在多肽中存在的20个L-氨基酸。
如本文所用，“非天然氨基酸”是指含有氨基基团和羧酸基团的有机化合物，其不是表2中列出的天然发生的氨基酸之一。非天然发生的氨基酸因此包括例如除了20个天然发生的氨基酸之外的氨基酸或氨基酸类似物，包括但不限于氨基酸的D-立体异构体。举例的非天然氨基酸为本领域技术人员已知，可以包含在修饰的ADA2多肽中。
如本文所用，合适的保守氨基酸取代为本领域技术人员已知，可以通常产生而不改变所得分子的生物活性。本领域技术人员知道通常在多肽的非必需区域中的单一氨基酸取代基本上不改变生物活性(见例如Watson et al.Molecular Biology of the Gene,4thEdition,1987,The Benjamin/Cummings Pub.co.,p.224)。这种取代可以根据下表3所示产生。
其它取代也允许，可以根据经验或者根据已知保守取代确定。
如本文所用，DNA构建体是单链或双链线性或环形DNA分子，其含有以在天然未发现的方式组合及并列的DNA节段。DNA构建体以人工操纵的结果存在，包括操纵的分子的克隆及其它拷贝。
如本文所用，DNA节段是具有指定属性的较大DNA分子的一部分。例如，编码指定多肽的DNA节段是较长DNA分子的一部分，如质粒或质粒片段，当其从5’至3’方向读取时编码指定多肽的氨基酸序列。
如本文所用，术语多核苷酸是指从5’至3’末端读取的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸碱基的单链或双链聚合物。多核苷酸包括RNA和DNA，可以分离自天然来源、在体外合成或者从天然与合成分子的组合中制备。在本文中多核苷酸分子的长度根据核苷酸(缩写为nt)或碱基对(缩写为bp)给出。术语核苷酸根据语境允许用于单链和双链分子。当该术语用于双链分子时，其用于表示全长及应理解与术语碱基对等价。本领域技术人员知道双链多核苷酸的两条链在长度上可以略为不同，其末端可以是错列的；因此双链多核苷酸分子内的所有核苷酸可以不都是配对的。这种未配对的末端的长度通常不超过20个核苷酸。
如本文所用，“一级序列”是指多肽中氨基酸残基的序列。
如本文所用，两个蛋白质或核酸之间的“相似性”是指蛋白质的氨基酸序列或者核酸的核苷酸序列之间的相关性。相似性可以基于残基序列及其中包含的残基的相同性和/或同源性程度。评定蛋白质或核酸之间相似性程度的方法为本领域技术人员已知。例如，在评定序列相似性的一种方法中，将两个氨基酸或核苷酸序列以产生序列之间最大相同性水平的方式比对。“相同性”是指氨基酸或核苷酸序列是不变的程度。氨基酸序列及在一些程度上核苷酸序列的比对也考虑到氨基酸(或核苷酸)中的保守差异和/或常见取代。保守差异是保持涉及的残基的物理-化学性质的那些差异。比对可以是整体(对比序列在全长序列及包括所有残基的比对)或局部(仅包含最相似的一或多个区域的序列部分的比对)。
如本文所用，术语“同源性”和“相同性”可互换使用，但是对于蛋白质的同源性可包括保守氨基酸变化。通常为了鉴别相应位置，以获得最高级别匹配方式比对氨基酸序列(见例如Computational Molecular Biology,Lesk,A.M.,ed.,Oxford University Press,New York,1988；Biocomputing:Informatics and Genome Projects,Smith,D.W.,ed.,Academic Press,New York,1993；Computer Analysis of Sequence Data,Part I,Griffin,A.M.,and Griffin,H.G.,eds.,Humana Press,New Jersey,1994；Sequence Analysis in Molecular Biology,von Heinje,G.,Academic Press,1987；和Sequence Analysis Primer,Gribskov,M.and Devereux,J.,eds.,M Stockton Press,New York,1991；Carrillo et al.(1988)SIAM J Applied Math 48:1073所述)。
如本文所用，“序列相同性”是指在检测与参考多肽或多核苷酸对比中相同的氨基酸(或核苷酸碱基)的数目。同源多肽是指预定数目的相同或同源的氨基酸残基。同源性包括保守氨基酸取代以及相同残基。序列相同性可以通过标准比对算法程序确定，使用每个供应商制定的默认缺口罚分。同源核酸分子是指预定数目的相同或同源核苷酸。同源性包括不改变编码的氨基酸的取代(即沉默取代)以及相同残基。基本同源核酸分子典型地在中等严格或高度严格条件下均沿着核酸长度或者沿着至少大约70％、80％或90％的全长感兴趣核酸分子进行杂交。还涵盖含有简并密码子代替杂交核酸分子中的密码子的核酸分子。(对于确定蛋白质的同源性，可以比对保守氨基酸以及相同氨基酸；在这种情况中，相同性百分比和同源性百分比不同)。任两个核酸分子是否具有(或者任两个多肽具有)至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％“相同的”核苷酸序列(氨基酸序列)可以使用已知的计算机算法确定，如“FAST A”程序，使用例如Pearson et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:2444(1988)中的默认参数(其它程序包括GCG程序包(Devereux,J.,et al.,NucleicAcids Research 12(I):387(1984))、BLASTP、BLASTN、FASTA(Altschul,S.F.,et al.,J.Molec.Biol.215:403(1990)；Guide to Huge Computers,Martin J.Bishop,ed.,Academic Press,San Diego(1994)，及Carrillo et al.SIAM J Applied Math 48:1073(1988))。例如，国家生物技术信息中心(National Center for BiotechnologyInformation)数据库的BLAST功能可用于确定相同性。其它可商购或公开获得的程序包括DNAStar“MegAlign”程序(Madison,WI)及University of Wisconsin Genetics ComputerGroup(UWG)的“GAP程序”(Madison WI))。蛋白质和/或核酸分子的同源性或相同性百分比可以通过例如使用GAP计算机程序比较序列信息而确定(例如Needleman etal.J.Mol.Biol.48:443(1970)，如Smith and Waterman(Adv.Appl.Math.2:482(1981)改进)。简而言之，GAP程序定义相似性为相似的比对符号(即核苷酸或氨基酸)的数目除以两个序列中较短序列中的符号总数。GAP程序的默认参数可包括：(1)一元比较矩阵(含有相同性数值为1，非相同性数值为0)及Gribskov et al.Nucl.Acids Res.14:6745(1986)的加权比较矩阵，如Schwartz and Dayhoff,eds.,Atlas of Protein Sequence and Structure,National Biomedical Research Foundation,pp.353-358(1979)所述；(2)每个缺口罚分3.0，每个缺口中每个符号加罚0.10；(3)末端缺口不罚分。
因此，如本文所用，术语“相同性”表示检测与参考多肽或多核苷酸之间的比较。在一个非限制性实例中，“至少90％相同”是指相对于参考多肽的90-100％的相同性百分比。在90％或以上水平的相同性表示这样的事实，为例证而假设对比检测多核苷酸和参考多核苷酸长度为100个氨基酸，在检测多肽中有不超过10％(即100个中的10个)氨基酸与参考多肽中的氨基酸不同。相似对比可以在检测与参考多核苷酸之间进行。这种差异可以表示为在氨基酸序列全长随机分布的点突变，或者其可以簇集在直至最大允许的不同长度的一或多个位置，例如10/100氨基酸差异(大约90％相同性)。差异定义为核酸或氨基酸取代、插入或缺失。在大约85-90％同源性或相同性水平，结果应不依赖于所述程序和缺口参数设定；这种高水平相同性通常可以不依赖于软件而易于评定。
如本文所用，也应理解术语“基本相同”或者“相似”随着相关领域技术人员理解的语境而不同，但是技术人员可以评定其。
如本文所用，比对的序列是指使用同源性(相似性和/或相同性)比对核苷酸或氨基酸序列中的相应位置。典型地，比对50％或更高相同性相关的两或多个序列。一组比对的序列是指在相应位置比对的2或多个序列，可包括衍生自RNA的比对序列如EST及与基因组DNA序列比对的其它cDNA。
如本文所用，“特异性杂交”是指通过互补碱基配对，核酸分子(例如寡核苷酸)与靶核酸分子退火。本领域技术人员熟知影响特异性杂交的体外和体内参数，如特定分子的长度和组成。特别关于体外杂交的参数进一步包括退火和洗涤温度、缓冲液组成和盐浓度。在高度严格条件下除去非特异性结合的核酸分子的洗涤条件例如是0.1×SSPE、0.1％SDS、65℃，及中等严格条件是0.2×SSPE、0.1％SDS、50℃。等价严格条件为本领域已知。技术人员可容易地调整这些参数以实现核酸分子与靶核酸分子的特异性杂交以适于特定应用。
如本文所用，分离的或纯化的多肽或蛋白质或其生物活性部分基本没有来自该蛋白质衍生自其中的细胞或组织的细胞材料或其它污染蛋白，或者当是化学合成时基本上没有化学前体或其它化学物。如果通过本领域技术人员用于评定这种纯度的标准分析方法如薄层层析(TLC)、凝胶电泳和高效液相层析(HPLC)确定制备物呈现出没有易于可检测的杂质，则确定其是基本纯的或者足够纯的，由此进一步纯化不明显改变该物质的物理和化学性质，如酶和生物活性。纯化化合物以产生基本上化学纯的化合物的方法为本领域技术人员已知。然而，基本上化学纯的化合物可以是立体异构体的混合物。在这种情况中，进一步纯化可以增加化合物的比活性。
因此，提及分离的或纯化的蛋白质或其催化活性部分是指其基本上没有来自该蛋白质衍生自其中的组织细胞的细胞材料或其它污染蛋白质，或者当是化学合成时基本上没有化学前体或其它化学物。如果通过本领域技术人员用于评定这种纯化的标准分析方法如薄层层析(TLC)、凝胶电泳和高效液相层析(HPLC)确定制备物呈现出没有易于可检测的杂质，则确定其是基本纯的或者足够纯的，由此进一步纯化不明显改变该物质的物理和化学性质，如酶和生物活性。纯化蛋白质以产生基本纯的多肽的方法为本领域技术人员已知。
术语基本上没有细胞材料包括蛋白质制备物中蛋白质与其从中分离或重组产生的细胞的细胞成分分离。在一个实施方案中，术语基本上没有细胞材料包括蛋白酶蛋白质制备物具有低于大约30％(干重)的非蛋白酶蛋白质(在本文也称作污染蛋白)，通常低于大约20％非蛋白酶蛋白质或者10％非蛋白酶蛋白质或者低于大约5％非蛋白酶蛋白质。当蛋白酶蛋白或其活性部分是重组产生的，其也基本上没有培养基，即培养基代表低于、大约或等于20％、10％或5％体积的蛋白酶蛋白质制备物。
如本文所用，术语基本上没有化学前体或其它化学物包括蛋白酶蛋白质制备物中蛋白质与参与蛋白质合成的化学前体或其它化学物分离。该术语包括蛋白酶蛋白质制备物具有低于大约30％(干重)、20％、10％、5％或者更低的化学前体或非蛋白酶化学物或成分。
如本文所用，通过重组方法使用重组DNA方法产生是指使用熟知的分子生物学方法表达由克隆的DNA编码的蛋白质。
如本文所用，载体(或者质粒)是指用于将异源核酸导入细胞中以表达或复制的分立的元件。载体典型保留附加型，但是可以设计为实现基因或其一部分整合进基因组的染色体中。还涵盖的载体是人工染色体如细菌人工染色体、酵母人工染色体和哺乳动物人工染色体。这种运载体的选择和使用为本领域技术人员熟知。
如本文所用，表达是指核酸被转录为mRNA及翻译为肽、多肽或蛋白质的过程。如果核酸衍生自基因组DNA，如果选择合适的真核宿主细胞或生物体，则表达可以包括如mRNA剪接等加工。
如本文所用，表达载体包括能表达DNA的载体，所述DNA与能实现这种DNA片段表达的调节序列如启动子区可操纵地连接。这种额外的节段可包括启动子和终止子序列，及任选可包括一或多个复制起点、一或多个可选择标记、增强子、聚腺苷酸化信号等。表达载体通常衍生自质粒或病毒DNA，或者可以含有这两种元件。因此，表达载体是指重组DNA或RNA构建体，如质粒、噬菌体、重组病毒或其它载体，在导入合适的宿主细胞时导致克隆的DNA表达。合适的表达载体为本领域技术人员熟知，包括在真核细胞和/或原核细胞中可复制的那些以及保留附加型的那些或者整合进宿主细胞基因组中的那些。
如本文所用，载体还包括“病毒载体”。病毒载体是工程化的病毒，其与外源基因可操纵地连接以将该外源基因转移(作为运载体或穿梭载体)进细胞中。
如本文所用，当提及DNA节段时，“可操纵地”或者“可操纵地连接”是指排列这些节段以便其功能与指定目的一致，例如在启动子下游和任何转录的序列上游起始转录。启动子通常是这样的结构域，转录机制与其结合以起始转录及通过编码节段行进至终止子。
如本文所用，人蛋白质是由存在于人基因组中的核酸分子如DNA编码的蛋白质，包括其所有等位基因变体和保守变异。如果修饰基于人蛋白质的野生型或主要序列，则蛋白质的变体或修饰是人蛋白质。
如本文所用，“组合物”是指两或多个产物或化合物的任何混合物。其可以是溶液、悬浮液、液体、粉末、糊状物、水溶液、非水溶液，或者其任意组合。
如本文所用，“组合”是指两或多个项目或元件的任何关联，例如两或多个项目可以一起使用。例如，组合可包括ADA2蛋白与另一治疗剂。这种组合可以包装为试剂盒。
如本文所用，试剂盒是包装的组合，任选包括所述组合的使用说明书和/或为了这种使用的其它反应和成分。
如本文所用，“生产物品”是制成和销售的产品。如在本申请书中所用，该术语涵盖包含于包装物品中的ADA2蛋白，例如变体ADA2蛋白。
如本文所用，直接给予是指组合物不用稀释而给予。
如本文所用，单一剂量配制物是指仅供一次使用的配制物。典型地，单一剂量配制物用于直接给予。
如本文所用，多剂量配制物是指用于重复给予的配制物。
如本文所用，当提及基于mg/kg对象的剂量时，认为人对象平均重量是大约70kg-75kg，如70kg，及体表面积(BSA)为1.73m2。
如本文所用，“疾病或失调”是指在生物体中得自包括但不限于感染、获得性状况、遗传状况等原因或状况的病理学状况，特征在于可鉴别的症状。本发明感兴趣的疾病和失调是与异常或高腺苷水平相关的任何疾病或失调。
如本文所用，肿瘤(也称作新生物)是当细胞以异常高速度增殖时导致的一种异常组织团块。肿瘤可以示出部分或全部缺少正常组织的的结构组构和功能协调。肿瘤可以是良性的(非癌性)或者恶性的(癌性)。如本文所用，肿瘤涵盖了血液肿瘤以及实体瘤。
恶性肿瘤可以广泛分为三种主要类型。癌瘤是从上皮结构产生的恶性肿瘤(例如乳腺癌、前列腺癌、肺癌、结肠癌和胰腺癌)。肉瘤是源自结缔组织或间充质细胞如肌肉、软骨、脂肪或骨的恶性肿瘤。白血病和淋巴瘤是影响造血结构(与血细胞形成相关的结构)包括免疫系统成分的恶性肿瘤。其它恶性肿瘤包括但不限于神经系统肿瘤(例如神经纤维瘤)、生殖细胞肿瘤和母细胞瘤。
如本文所用，肿瘤性疾病是指包括癌症的任何失调，包括肿瘤发展、生长、转移和进展。
如本文所用，癌症是由任何类型恶性肿瘤或者特征在于其的疾病术语，包括转移癌、淋巴肿瘤和血癌。举例的癌症包括但不限于膀胱、脑、乳腺、骨髓、子宫颈、结肠/直肠、肾、肝、肺/气管、卵巢、胰腺、前列腺、皮肤、胃、甲状腺或者子宫的癌症。
如本文所用，“静脉内给予”是指将治疗剂直接输入静脉中。
如本文所用，对照是指与检测样品基本相同的样品，除外的是其不用检测参数处理，或者如果其是血浆样品，则可以来自未感染感兴趣的状况的正常志愿者。对照也可以是内部对照。
如本文所用，正常水平或数值可以根据本领域技术人员已知的各种方式定义。典型地，正常水平是指在健康群体中标志物(例如腺苷、ADR或核苷酶)的表达水平。正常水平(或参考水平)基于健康对象的测量值，如来自指定来源(即血液、血清、组织或者其它来源)。通常，正常水平被指定为“正常范围”，其典型是指平均95％健康群体的数值范围。参考值在此与正常水平可以互换使用，但是可以根据对象或来源而与正常水平不同。参考水平典型依赖于特定群体部分的正常水平。因此，对于本发明而言，正常或参考水平是预定标准或检测患者可以与其比较的对照。
如本文所用，升高的水平是指标志物高于指定或正常阈值的量或表达的任何水平。
如本文所用，生物样品是指得自活的或者病毒来源或者其它大分子和生物分子来源的任何样品，包括从中可以获得核酸或蛋白质或其它大分子的对象的任何细胞类型或组织。生物样品可以是直接得自生物来源的样品或者处理的样品。例如，被扩增的分离的核酸构成生物样品。生物样品包括但不限于体液，如血液、血浆、血清、脑脊液、滑液、尿液和汗液，及来自动物的组织和器官样品，包括活检的肿瘤样品。
如本文所用，检测包括允许观测(通过眼睛或设备)蛋白质或标记物的方法。蛋白质可以使用特异于该蛋白质的抗体观测。也可以通过将蛋白质与一个标签包括表位标签或标记融合而便于蛋白质的检测。
如本文所用，“治疗”患有疾病或状况的对象是指在治疗后，对象的症状部分或全部缓解，或者保持稳定。因此，治疗涵盖预防、治疗和/或治愈。预防是指防止潜在的疾病和/或防止症状的恶化或疾病进展。
如本文所用，药物学有效物质包括任何治疗剂或生物活性剂，包括但不限于例如化疗剂、麻醉剂、血管收缩剂、分散剂、常规治疗药物包括小分子药物和治疗性蛋白质。
如本文所用，治疗是指其中状况、失调或疾病的症状或者其它指征得以减轻或者另外有益地改变的任何方式。
如本文所用，治疗作用是指治疗对象获得的效果，即改变、典型地改善或减轻疾病或状况的症状或者治愈疾病或状况。治疗有效量是指在给予对象后导致治疗作用的组合物、分子或化合物的量。
如本文所用，通过治疗如通过给予药物组合物或其它治疗剂减轻特定疾病或失调的症状是指无论永久或是暂时、持续或是瞬时的症状的任何减轻或状况的不利影响的任何减轻，例如与给予ADA2如变体ADA2相关或者给予其时发生的不利影响的降低。
如本文所用，防止或者预防是指降低发生疾病或状况的危险。
如本文所用，“治疗有效量”或者“治疗有效剂量”是指物质、化合物、材料或者含有化合物的组合物的量，其至少足以产生治疗作用。因此，其是预防、治愈、减轻、阻止或部分阻止疾病或失调的症状必需的数量。
如本文所用，单位剂量形式是指适于人和动物对象的物理学独立的单位及如本领域所已知单独包装。
如本文所用，术语“对象”是指动物，包括哺乳动物，如人。所述对象可包括任何动物，例如但不限于灵长类动物包括人、大猩猩和猴子；啮齿类动物如小鼠和大鼠；禽类动物如鸡；反刍动物如山羊、牛、鹿和绵羊；猪及其它动物。非人动物不包括人作为预期动物。
如本文所用，患者是指出现疾病或失调症状的人对象。
如本文所用，大约相同是指在某一量内本领域技术人员认为是相同的或者在可接受的误差范围内。例如，典型地对于药物组合物而言，在至少1％、2％、3％、4％、5％或10％内被认为是大约相同的。这种量可以根据对象对于特定组合物的变化的耐受性而变化。
如本文所用，除非特别指出，单数形式“一个”和“所述”包括其复数形式。因此，例如，提及一个包含或含有“一个胞外结构域”的化合物包括具有一或多个胞外结构域的多个化合物。
如本文所用，范围和量可以“大约”的特定数值或范围表示。大约也包括精确量。因此，“大约5个碱基”是指“大约5个碱基”和“5个碱基”。
如本文所用，“任选的”或“任选地”是指接下来描述的事件或情况发生或者不发生，该描述包括其中所述事件或情况发生的情况或者其中所述事件或情况不发生的情况。例如，任选取代的基团是指该基团是未取代的或者是取代的。
如本文所用，除非特别指出，任何保护基团、氨基酸和其它化合物的缩写均根据其一般用法、公认缩写或者IUPAC-IUB生物化学命名委员会(见(1972)Biochem.11:1726)一致。
B.腺苷脱氨酶2(ADA2)及腺苷介导的肿瘤免疫抑制的调节
本发明提供了通过给予对象任何腺苷脱氨酶2(ADA2)蛋白、包括其变体或缀合物治疗疾病或状况如癌症或肿瘤的方法。细胞外腺苷负责调节关键生物过程如免疫调节(Blay,J.(2012)Encyclopedia of Cancer pp.49-52)。在病理生理学状况如肿瘤微环境(TME)中，细胞外腺苷浓度在某些TME部分中迅速提高，产生促进肿瘤生长的免疫抑制性小生境(niche)。ADA2调节胞外环境中的腺苷水平，从而影响腺苷信号传导及腺苷依赖性免疫抑制。ADA2通过将腺苷转变为肌苷可降低胞外腺苷水平，以克服在TME中的免疫抑制作用。例如如本发明所示，给予ADA2可逆转腺苷依赖性免疫抑制及可降低体内肿瘤生长。
1.肿瘤免疫性及免疫逃避
癌细胞含有由免疫系统识别的肿瘤特异性抗原。在肿瘤免疫性中，免疫系统的目标是通过免疫细胞的作用攻击和根除这些癌细胞，所述免疫细胞包括细胞毒性T细胞、自然杀伤(NK)细胞和巨噬细胞。例如，CD4+和CD8+T细胞分别在识别主要组织相容性复合物(MHC)I类或II类分子上抗原呈递细胞上呈现的抗原性肽时被激活。激活的CD8+细胞或者细胞毒性T细胞可以杀死表达抗原的肿瘤细胞，这可以通过CD4+T细胞的存在而辅助。除了细胞毒性T细胞的直接杀伤作用之外，T细胞还产生各种细胞因子和趋化因子可以在肿瘤微环境中募集其它效应免疫细胞，如中性粒细胞、巨噬细胞或NK细胞。NK细胞也可直接杀死癌细胞。
研究表明免疫系统可以阻止肿瘤生长。例如，免疫缺陷小鼠比野生型小鼠发生更多的癌症(Dunn et al.(2004)Immunity,21:137-48)。淋巴细胞和IFN-γ已经示出合作阻止致癌物诱导肉瘤和自发上皮癌的形成(Shankaran et al.(2001)Nature,410:1107-1111)。进一步地，基因靶向的和淋巴细胞亚群耗竭的小鼠已经证实NK细胞在肿瘤排斥中的作用。例如，发现耗竭NK和NK1.1+T细胞的小鼠与对照小鼠相比具有增加的肿瘤形成易感性，在用选择性消除NK细胞的antisialo-GM1处理小鼠时观测到相似的结果(Smyth et al.(2001)Int Immunol.,13；459-63)。此外，原发肿瘤中肿瘤免疫侵润的数目、类型和位置对于人患者中癌症存活率是预后因素(Pages et al.(2005)N Engl J Med,353:2654-2666)。
然而，大多数肿瘤可以逃避免疫系统。肿瘤微环境是复杂的，包括可以是肿瘤细胞固有的或者由其它细胞或分子介导的各种免疫抑制机制。在单独或组合的这些机制中，免疫系统可促进肿瘤进展。这些机制包括但不限于消除激发免疫应答的肿瘤细胞抗原；阻止或下调为免疫激活所需的配体如主要组织相容性复合物I类(MHC I)的表达；产生免疫抑制介质如白细胞介素-10(IL-10)、转化生长因子-β或者腺苷；募集抑制效应免疫细胞功能的免疫细胞亚群，如T调节细胞(Tregs)或者骨髓衍生抑制细胞(MDSC)；或者上调检查点抑制剂，如细胞毒性T淋巴细胞抗原4(CTLA4)，其可以弱化效应T细胞功能。例如，腺苷在肿瘤微环境中是主要的免疫抑制剂。
2.癌症和肿瘤微环境(TME)中的腺苷免疫调节
腺苷(腺嘌呤-9-β-D-呋喃核糖苷；Ado)是作为腺嘌呤核苷酸(AMP，ADP和ATP)一部分存在的核苷，其广泛参与细胞能量代谢及在许多过程中作为前体分子。腺苷可以游离形式存在于细胞内部和外部。
腺苷是重要的体内信号传导分子，特别是对于免疫系统。特别地，腺苷是熟知的免疫功能效应物。在T细胞中，腺苷降低T细胞受体诱导的NF-κB激活并抑制IL-2、IL-4和IFN-γ。腺苷降低T细胞细胞毒性，增大T细胞无效能并增加T细胞分化为Foxp3+或Lag-3+调节性T细胞。腺苷降低NK细胞产生IFN-γ并抑制NK细胞细胞毒性。腺苷阻断中性粒细胞粘附和溢出，降低吞噬作用，及减弱超氧化物和氧化氮的水平。腺苷还降低巨噬细胞上TNF-α、IL-12和MIP-1α的表达，减弱MHC II类分子表达及增加IL-10和IL-6水平。此外，腺苷降低吞噬作用和巨噬细胞上超氧化物和氧化氮水平(Stagg and Smyth(2010)Oncogene 29:5346-5358)。
图2示出腺苷的生物合成和分解代谢。细胞外腺苷是通过膜结合的胞外酶CD39和CD73的相继活性产生的，其一起通过从死亡或临死细胞中产生的ATP或ADP的磷酸水解而产生腺苷。CD39(也称作外核苷三磷酸二磷酸水解酶；SEQ ID NO:542)将胞外ATP(或ADP)转变为5'AMP。然后，CD73(也称作5’核苷酸酶；SEQ ID NO:543)将5’AMP转变为腺苷。CD39的活性通过NDP激酶和腺苷酸激酶的作用是可逆的，而CD73的活性是不可逆的。CD39和CD73在肿瘤基质细胞包括内皮细胞和Tregs上表达，也在许多癌细胞上表达。例如，CD39和CD73在内皮细胞上的表达在肿瘤微环境缺氧条件下增加。肿瘤缺氧可得自不足的血供和削弱氧输送的紊乱肿瘤血管结构(Carroll and Ashcroft(2005),Expert.Rev.Mol.Med.7(6):1-16)。缺氧还抑制腺苷酸激酶(AK)，其将腺苷转变为AMP，导致极高的胞外腺苷浓度。因此，腺苷应答缺氧而高浓度释放，这是在实体瘤内或周围的肿瘤微环境(TME)中经常发生的状况。
因此，虽然腺苷浓度典型在组织和血液中低，但是由于损伤或应激如炎症、缺血和缺氧导致局部腺苷浓度可以显著增加。例如，在缺氧肿瘤微环境中腺苷的胞外浓度可以直至10μM腺苷，这比大约为0.1μM的典型胞外腺苷浓度高达大约100倍(Antonioli et al.(2013)Nat Rev Can 13:842-857)。由于肿瘤中缺氧区周围是微血管，因此该肿瘤区中的腺苷局部浓度实际上可以更高。
腺苷免疫调节活性在其释放进入肿瘤的胞外空间及靶免疫细胞、癌细胞或内皮细胞表面上腺苷受体(ADR)激活之后发生。有四种类型ADR，即A1(SEQ ID NO:533)、A2A(SEQ IDNO:534)、A2B(SEQ ID NO:535)和A3(SEQ ID NO:536-538)，其均是对于腺苷具有不同亲和性及具有不同下游信号传导途径的G蛋白偶联受体。A1和A3受体的激活降低细胞内环AMP(cAMP)水平，A2A和A2B受体的激活通过腺苷酸环化酶的激活而增加cAMP水平。A1、A2A和A3均可以在生理浓度腺苷(例如30-300nM)下激活，但是A2B对于腺苷具有较低亲和性且需要较高水平腺苷以激活(Stagg et al.(2010)Oncogene,29:5346-5358)。ADR激活的结果根据细胞类型和受体类型而不同：其可以导致激活或者抑制细胞功能和细胞死亡(Antonioli et al.(2013)Nat Rev Can 13:842-857)。所有四种类型的受体均可以存在于肿瘤微环境中的细胞上，包括癌细胞、基质细胞、内皮细胞，及炎症和免疫细胞，所有这些受体均可以在肿瘤微环境中存在的腺苷浓度被激活。
肿瘤微环境中高水平腺苷导致局部免疫抑制，这限制了免疫系统消除癌细胞的能力。例如，腺苷可抑制T淋巴细胞、天然杀伤(NK)细胞、多形核粒细胞和吞噬细胞如组织巨噬细胞的各种功能。特别地，已知A2A受体在单核细胞、巨噬细胞、肥大细胞、粒细胞、淋巴细胞、树突细胞(DC)、NK细胞和内皮细胞上表达，及其在许多细胞类型上的表达由缺氧诱导(Stagg and Smyth(2010)Oncogene,29:5346-5358)。A2A的激活已经示出抑制NK细胞功能、抑制T细胞增殖、抑制T细胞细胞毒性及细胞因子产生，以及抑制巨噬细胞激活(Stagg andSmyth(2010)；Antonioli et al.(2013))。A2B的激活已经示出抑制DC分化以限制T细胞激活及促进MSDC的扩增和积聚(Stagg and Smyth(2010)；Antonioli et al.(2013))。
除了抑制免疫系统的直接作用之外，腺苷还可以通过对癌细胞增殖、凋亡和血管发生的作用而控制癌细胞生长和传播。例如，腺苷可促进血管发生，主要是通过刺激A2A和A2B受体进行。内皮细胞上受体的刺激可调节细胞内粘附分子1(ICAM-1)和内皮细胞上E-选择素的表达，维持血管完整性及促进血管生长(Antonioli et al.(2013))。此外，各种细胞上腺苷对于一或多个A2A、A2B或A3的激活可以刺激促血管生成因子如血管内皮生长因子(VEGF)、白细胞介素-8(IL-8)或血管生成素2的产生(Antonioli et al.(2013))。
腺苷也可以通过与癌细胞上的受体相互作用而直接调节肿瘤细胞增殖、凋亡和转移。例如，研究表明A1和A2A受体的激活在一些乳腺癌细胞系中促进肿瘤细胞增殖，及A2B受体的激活在结肠癌细胞中具有癌症生长促进性质(Antonioli et al.(2013))。腺苷还触发癌细胞凋亡，各种研究已经将此活性与通过A3的外部凋亡途径或者通过A2A和A2B的内部凋亡途径的激活相关联(Antonioli et al.(2013))。此外，腺苷可以通过增加细胞能动性、与胞外基质粘附及表达细胞附着蛋白和受体以促进细胞运动能力而促进肿瘤细胞迁移和转移。
3.在癌症治疗中的腺苷脱氨酶及靶向腺苷
腺苷的水平可以通过腺苷脱氨酶(ADA)的作用调节，其是将腺苷转变为肌苷或者将2’-脱氧腺苷转变为2’-脱氧肌苷的酶。特别地，如下所示，ADA在存在水的条件下将腺苷或脱氧腺苷转变为肌苷或脱氧肌苷及氨：腺苷+H2O＝肌苷+NH3，或者2’-脱氧腺苷+H2O＝2’-脱氧肌苷+NH3。局部肿瘤微环境中氨的增加可提高pH。
在人体中有两种类型ADA，ADA1和ADA2。ADA1遍在存在于细胞内，对于腺苷和2’脱氧腺苷呈现出相似的结合亲和性，Km为大约5.2×10-5M。ADA1主要在细胞内起作用，降低对细胞如淋巴细胞可具有毒性的腺苷的水平。例如，腺苷脱氨酶1(ADA1)的缺陷与轻度免疫缺陷至重症联合免疫缺陷(SCID)相关，这是由于腺苷在不成熟淋巴细胞中的毒性积累从而导致淋巴细胞凋亡死亡及T、B和NK细胞重度耗竭(Hershfield,M.S.(2005)Eur.J.Immunol.35:25-30)。相反，ADA2含有分泌信号序列，是主要的胞外ADA。在正常人血清或血浆中的主要ADA活性来自ADA2(Neidzwicki and Aberneth(1991)BiochemicalPharmacology 41:1615-1624)。ADA2对于腺苷具有低得多的结合亲和性，Km为大约200×10-5M，并对2’脱氧腺苷呈现甚至更弱的亲和性。而且，与ADA1不同，ADA2具有酸性pH最佳值。
降低TME中腺苷的肿瘤特异性积聚是治疗肿瘤和癌症的一种有吸引力的治疗选项。本发明发现可以将重组形式的ADA2给予对象以选择性靶向TME，在此其通过使腺苷脱氨为肌苷可降低胞外腺苷水平，从而逆转腺苷的免疫抑制作用。特别地，ADA2是适合于高腺苷浓度的胞外腺苷脱氨酶。如上所述，腺苷在TME中主动产生，TME区域可具有比其它组织环境高直至大约100倍的腺苷浓度。如下文进一步论述，由于对于底物结合的疏水性小口袋(subpocket)，ADA2比ADA1对于腺苷的Km高大约100倍。然而，转换率(kcat)与ADA1相似。由于ADA2具有相似的转换率但是对于腺苷具有较低的亲和性，因此其可以在具有高腺苷浓度环境如TME或炎症部位中特异性激活，而不影响具有较低腺苷浓度的正常微环境中的腺苷代谢。
本发明的结果表明重组ADA2选择性靶向肿瘤环境。此外，本发明提供的结果证实在T细胞和NK细胞中腺苷介导免疫抑制，这种抑制可以通过给予腺苷脱氨酶2(ADA2)而逆转。ADA2在TME中降低腺苷水平的选择性活性可以限制不希望的或不需要的副作用，如果ADA2的活性更遍在而可以发生这种副作用。例如，许多现有的肿瘤治疗由于其在对象中缺少特异性或选择性可导致不利副作用而受限。在本发明提供的方法中使用ADA2或者其变体或缀合物可导致较少或较低的不希望的副作用和/或由于给予更高剂量的能力而呈现出改良的效力。
因此，ADA2与ADA1相比具有优势。除了允许使用ADA2作为选择性肿瘤靶向分子对于腺苷结合亲和性的差异之外，ADA1也不适合用于胞外环境中。例如，如本发明提供的结果示出，ADA1在体内主要在细胞内，在胞外环境如血浆中基本上不太稳定。相反，ADA2在胞外环境中由于保护分子免于在胞外环境中蛋白酶解的广泛糖基化和保守的二硫键而示出增加的稳定性。ADA2与ADA1相比在较高温度下基本上更稳定(Daddona and Kelley(1981)Biochim.Biophys.Acta 658:280-290)。本发明发现ADA2具有较高的热稳定性，及ADA2在胞外环境如血浆中也比ADA1更稳定。
ADA2在TME中常见的环境如酸性pH环境中也示出最佳活性。例如，野生型ADA2的最佳pH是大约pH 6.5，而ADA1是pH 7.5。TME是一种复杂微环境，肿瘤周围是由不同细胞类型和胞外条件组成。TME通常具有胞外环境是酸性的区域，这是由肿瘤缺氧条件下无氧糖酵解产生的乳酸及其它酸性代谢物导致(Kato et al.(2013)Cancer Cell International 13:89)。
此外，ADA2还克服了现有治疗遇到的其它问题，包括靶向腺苷的那些问题。例如，由于腺苷具有多个受体，因此使用抗-ADR抗体难以靶向腺苷，因为所有四种ADR受体均存在于TME中且均可以由腺苷激活。因此，靶向单一受体不能获得腺苷免疫调节活性的完全弱化。
因此，本发明提供的方法包括使用任何ADA2如重组人ADA2(rHuADA2)或者其变体和/或缀合物的治疗方法，用于治疗疾病或状况如癌症或肿瘤及与异常或累积的腺苷产生相关的其它疾病或状况。本发明还提供了ADA2变体及修饰形式，其具有改变的性质如降低的肝素结合、增加的催化效率、增加的稳定性、改变的糖基化状态和/或改变的最佳pH。任何ADA2蛋白均可用于本发明提供的治疗方法中。本发明还提供了使用任何ADA2及其它免疫调节剂、化疗剂、免疫检查点抑制剂或者透明质酸降解酶如可溶的透明质酸酶或者聚合物缀合的可溶透明质酸酶(例如PEGPH20)的组合治疗方法。
C.腺苷脱氨酶2(ADA2)及其变体
本发明提供了使用腺苷脱氨酶2(ADA2)包括野生型人ADA2、ADA2变体和/或缀合物或者其它修饰形式的治疗方法。本发明还提供了具有改变的性质的ADA2变体。ADA2可用于调节需要调节腺苷依赖性免疫调节或者其它腺苷依赖性活性的环境中的腺苷水平，如在肿瘤微环境或者炎症中。
1.ADA2的结构和活性
腺苷脱氨酶是将腺苷转变为肌苷的酶。有三种已知的ADA：ADA1、ADA2和ADA3，但是ADA3的活性尚未知。关于具有已知腺苷脱氨酶活性的蛋白质，人具有ADA2和ADA1二者，而在蝇类中ADA2的同系物(称作ADGF同系物)是唯一活性的腺苷脱氨酶，啮齿类动物仅具有ADA1，表明这两种蛋白质具有重叠功能也具有独特功能。独特功能涉及酶活性的表达、细胞定位和动力学性质中的差异，其它结构特点中的差异，以及另外的生长因子和肝素结合性质(Zavialov et al.(2010)J.Biol.Chem.285:12367-12377)。
ADA1和ADA2在结构上是相似的，呈现出将腺苷转变为肌苷的一个共有催化机制，但是呈现很低的序列相似性。ADA2具有SEQ ID NO:1所示氨核苷酸序列，其编码如SEQ IDNO:2所示含有信号序列(相应于SEQ ID NO:2的氨基酸残基1-29)的511个氨基酸的蛋白质。成熟ADA2是缺少信号序列的分泌的蛋白质，具有SEQ ID NO:5所示氨基酸序列。ADA1具有SEQ ID NO:11所示核苷酸序列，其编码不含有信号序列的363个氨基酸的蛋白质，具有如SEQ ID NO:12所示氨基酸序列。N末端甲硫氨酸残基被裂解，获得成熟的362个氨基酸的蛋白质，如SEQ ID NO:66所示。
如下文更详细描述，与ADA1相比，ADA2显著更长及包括在N末端的80-100个氨基酸延伸，这参与二聚体化及糖胺聚糖(例如肝素)结合(Maier et al.(2005)Mol Evol 61:776–794)。ADA2还具有另外的推定的受体结合(PRB)结构域，据报道其介导与细胞表面受体的结合和/或有助于其生长因子或其它信号传导功能。与ADA1不同，ADA2是二聚体的及分泌的，而ADA1是单体及主要在细胞内。ADA2也是广泛糖基化的并具有保守的二硫键。ADA2的结构和功能特点赋予了作为治疗分子的优势，包括但不限于更高的稳定性和增加的肿瘤选择性。
a.ADA2的结构
ADA2，也称作树突细胞衍生生长因子(DCDGF)或者腺苷脱氨酶生长因子(ADGF)，其是蛋白质腺苷ADGF家族成员。仅在真核生物中发现ADA2，且主要在多细胞生物体中。相反，在原核生物和真核生物中均发现ADA1。特别地，在昆虫及其它脊椎动物如光滑爪蟾(Xenopus laevis)以及人中已经鉴定了ADA2/ADGF同系物。昆虫中ADGF家族蛋白质最初鉴别为具有生长因子活性的蛋白质，后来发现还具有腺苷脱氨酶活性。
在人中，ADA2由猫眼综合征关键区基因1(CECR1)基因编码(Riazi et al.(2000)Genomics 64:277-285)。人CECR1基因(SEQ ID NO:1所示编码区的核苷酸序列)编码511个氨基酸的前体蛋白(SEQ ID NO:2所示序列；Uniprot登录号Q9NZK5)。ADA2具有一个N末端29个残基的信号序列(SEQ ID NO:2的氨基酸残基位置1-29)，其在转运至ER后被裂解，形成482个氨基酸的成熟蛋白质(SEQ ID NO:5所示序列)。成熟ADA2蛋白由于在两个多肽链之间的非极性相互作用而作为同源二聚体存在。也已经报道了人ADA2的其它序列，见例如美国专利号5,968,780(前体形式SEQ ID NO:376，成熟形式SEQ ID NO:380)、NCBI登录号BAG369969.1(前体形式SEQ ID NO:377和成熟形式SEQ ID NO:381)；NCBI登录号AAF65941(前体形式SEQ ID NO:378和成熟形式SEQ ID NO:382)；及NCBI登录号AAH51755(前体形式SEQ ID NO:379和成熟形式SEQ ID NO:383)。通过mRNA的可变剪接形成的非经典第二同种型编码较短的270个氨基酸的蛋白质(SEQ ID NO:68所示序列；Uniprot登录号Q9NZK5-2)，失去N末端241个氨基酸及在N末端含有与经典同种型不同的10个氨基酸的序列。
在其它物种中的ADA2同系物例如包括但不限于来自如下物种的ADA2：黑猩猩属(Pan troglodytes)(黑猩猩；前体形式SEQ ID NO:286，成熟形式SEQ ID NO:326；NCBI登录号XP_003317127.1)；Gorilla gorilla(大猩猩；前体形式SEQ ID NO:287，成熟形式SEQ IDNO:327；NCBI登录号XP_004063024.1)；Pan paniscus(矮小黑猩猩；前体形式SEQ ID NO:288，成熟形式SEQ ID NO:328；NCBI登录号XP_003828345.1)；Pongo abelii(苏门答腊猩猩；前体形式SEQ ID NO:289，成熟形式SEQ ID NO:329；NCBI登录号NP_001125360.1)；Nomascus leucogenys(北部白颊长臂猿；前体形式SEQ ID NO:290，成熟形式SEQ ID NO:330；NCBI登录号XP_004088517.1)；成束猴(Macaca fascicularis)(食蟹猴；前体形式SEQID NO:291,成熟形式SEQ ID NO:331；NCBI登录号XP_005568111.1)；Chlorocebus sabaeus(绿猴；前体形式SEQ ID NO:292，成熟形式SEQ ID NO:332；NCBI登录号XP_007972990.1)；Macaca mulatta(恒河猴；前体形式SEQ ID NO:293、337，成熟形式SEQ ID NO:333、340；GenBank登录号AFH32795.1,EHH20002.1)；Callithrix jacchus(狨猴；前体形式SEQ IDNO:294、374,成熟形式SEQ ID NO:334、375；NCBI登录号XP_009004591.1,XP_009004586.1)；光滑爪蟾(Xenopus laevis)(非洲爪蟾；前体形式SEQ ID NO:295，成熟形式SEQ ID NO:335；NCBI登录号NP_001090531.1)；黑腹果蝇(果蝇；前体形式SEQ ID NO:296-300，成熟形式SEQ ID NO:336、338、339；AAL40913.1、AAL40920.1、AAL40911.1、AAL40912.1及AAL40910.1)；家蚕(蚕蛾；前体形式SEQ ID NO:301，成熟形式SEQ ID NO:341；NCBI登录号NP_001098698.1)；及秉氏麻蝇(麻蝇；前体形式SEQ ID NO:302,成熟形式SEQ ID NO:342；GenBank登录号BAA11812.1)。
ADA2的结构域组构在Zavialov et al.(2010)J.Biol.Chem.285:12367-12377中描述。ADA2含有组成70％以上氨基酸序列的核心ADA结构域或者催化结构域，且与ADA1中的ADA结构域在结构上相似。在单体中，ADA结构域折叠为平行α/β桶的8条链，其环绕是活性位点的中心深袋(central deep pocket)。此外，ADA结构域还含有位于β1链与α1螺旋之间的三个另外的螺旋(称作H1、H2和H3)及在C末端的两个另外的螺旋(称作H4和H5)。ADA结构域包含于相应于SEQ ID NO:2所示前体ADA2的残基106-502的区域中(相应于SEQ ID NO:5所示成熟ADA2中的残基77-473)。在ADA区中，ADA2与ADA1相比含有氨基酸残基插入，包括组成推定的受体结合(PRB)结构域的残基(在下文论述)，其不参与ADA2的催化功能。所述ADA结构域与ADA1的结构域不具有高序列同源性(18-21％相同的残基)，但是两个ADA结构域具有高度结构相似性。表4概括了参与底物结合和催化作用的活性位点中的残基。
基于如Zavialov et al.(2010)J.Biol.Chem.285:12367-12377报道的具有肋间型霉素(CF)(模拟在腺苷C6位置的四面体中间物的过渡态抑制剂)的ADA2的晶体结构，鉴别了参与底物结合的残基。这些包括如SEQ ID NO:2所示前体ADA2的残基D115、I116、W204、F207、E208、F211、H293、V325、G326、E359、H384、L415、D441和D442(相应于SEQ ID NO:5所示成熟ADA2的残基D86、I87、W175、F178、E179、F182、H254、V296、G297、E330、H355、L386、D412和D413)。尽管在ADA2与ADA1之间催化位点的结构特点是相似的，但是ADA2的ADA结构域中疏水性底物结合小口袋更开放且含有较少的疏水性残基。这些差异可以说明ADA2对于腺苷的亲和性更低的原因。
ADA2是锌依赖性水解酶，其需要与结合的锌配位以发挥活性，其作为有力的亲电子体激活攻击水为氢氧离子。SEQ ID NO:2所示前体ADA2的氨基酸残基H112、H114、H356和D441(相应于SEQ ID NO:5所示成熟ADA2的残基H83、H85、H327、D412)参与配位锌活性中心。在催化期间，Zn++促进在活性位点水分子的氧原子对羰基碳的亲核攻击。SEQ ID NO:2所示前体ADA2的E359、H384和D441(相应于SEQ ID NO:5所示成熟ADA2的E330、H355和D412)组合参与作为锌配体。H384和D441位于攻击水位置，E359是活性位点催化质子供体残基，通过从攻击水分子提取质子促进反应，H384作为质子接受体。催化活性位点残基结构上反映ADA1的相应活性位点残基，表明催化机制在两个腺苷脱氨酶之间是相似的(Zavialov et al.(2010)J.Biol.Chem.285:12367-12377)。
活性ADA2作为同源二聚体存在。ADA2的二聚体化通过称作HN1、HN2、HN3和HN4的ADA2的N末端α-螺旋中的残基(相应于SEQ ID NO:2所示前体ADA2的残基29-105，或者SEQID NO:5所示成熟ADA2的残基1-76)以及通过称作H5的C末端α-螺旋中残基(相应于SEQ IDNO:2所示前体ADA2的残基503-511或者SEQ ID NO:5所示成熟ADA2的残基474-482)介导。由于这些区域负责70％以上的非极性亚基间相互作用，因此将其命名为二聚体化结构域。第一个N末端螺旋HN1形成螺旋锚，其由于在残基R34和E41(SEQ ID NO:5所示成熟ADA2的残基R5和E12)与邻近亚基的D373和H391(SEQ ID NO:5所示成熟ADA2的残基D344和H362)之间的离子相互作用以及残基I30、T33、L37、L38、K40和M44(SEQ ID NO:5所示成熟ADA2的残基I1、T4、L8、L9、K11和M15)与邻近亚基中的残基之间的疏水性相互作用而形成。疏水性结合口袋由残基M71、A74、M75、L78和F80形成，其容纳来自邻近亚基的W336残基(SEQ ID NO:5所示成熟ADA2的残基M42、A45、M46、L49和F51)。
ADA1不形成二聚体，不含有组成“二聚体化结构域”的残基。而且，与ADA1对比，ADA2中的残基W336插入在β5与α5之间活性位点区域，在此由于其参与二聚体化而间接有助于催化活性。W336G取代导致ADA2分子部分解离为单体，及呈现出改变的催化活性(Zavialov et al.(2010)J.Biol.Chem.285:12367-12377)。除了影响全部酶活性之外，二聚体化还参与ADA2的分泌。缺失氨基酸T33和E41(相应于SEQ ID NO:5所示成熟ADA2的T4和E12)消除了ADA2向进培养基中的分泌(Zavialov et al.(2010)J.Biol.Chem.285:12367-12377)。
ADA2结合糖胺聚糖(GAG)，包括肝素及其类似物，如硫酸类肝素和硫酸软骨素。蛋白质二聚体化导致在二聚体内表面的大的高度正电荷表面，形成GAG结合位点(Zavialovet al.(2010)J.Biol.Chem.285:12367-12377)。特别地，GAG结合位点包含前体ADA2的I30-R45、S389-T396和R422-T428位置附近的氨基酸残基(相应于SEQ ID NO:5所示成熟ADA2的I1-R16、S360-T367和R393-T399)。与GAG的相互作用看起来在稳定ADA2二聚体中起作用。
ADA2在催化结构域内具有插入序列，称作推定的受体结合(PRB)结构域，据报道其相应于SEQ ID NO:2所示前体ADA2的残基127-185或134-177(分别相应于SEQ ID NO:5所示成熟ADA2的位置98-156或105-148)。PRB结构域折叠为由α-和β-折叠组成的趋化因子样结构域，由在一侧由α-螺旋及在另一侧由富集脯氨酸环围绕的三链反平行β-折叠组成。前体ADA2位置137与159之间的二硫键(SEQ ID NO:5所示成熟ADA2的位置108与130)存在于PRB结构域中，其是ADA2分泌与结构稳定性所需的。ADA2的晶体结构示出PRB结构域虽然不参与ADA2的催化功能，但是位于在活性位点边缘的腺苷脱氨酶(ADA)结构域顶部。当ADA2二聚体化时，二聚体中的两个PRB结构域存在于二聚体的同一侧，且可以结合二聚体受体或者诱导受体二聚体化(Zavialov et al.(2010)J.Biol.Chem.285:12367-12377；Zavialov et al.(2010)J.Leukoc.Biol.88:279-290)。ADA2结合是二聚体受体的腺苷受体(ADR)。PRB结构域通过受体结合活性而与其生长因子活性有关(Zavialov et al.(2010)J.Biol.Chem.285:12367-12377；Zavialov et al.(2010)J.Leukoc.Biol.88:279-290)。因此，这个结构域的消除或修饰可以降低、减弱或者消除这个活性。
ADA2具有四个(4)天然N-连接的糖基化位点，在前体ADA2的N127、N174、N185和N378(相应于SEQ ID NO:5所示成熟ADA2的N98、N145、N156和N349)。三个糖基化位点存在于PRB结构域中，在N127、N174和N185，还有一个存在于该分子的对侧，在N378。位于ADA2分子的三个不同表面的寡糖链保护所述酶在胞外环境中免受蛋白酶解，提供了增加的稳定性(Zavialov et al.(2010)J.Biol.Chem.285:12367-12377)。
b.ADA2的活性
ADA2具有一些活性。ADA2具有腺苷脱氨酶(ADA)活性，其催化腺苷为肌苷(腺苷+H2O＝肌苷+NH3)及催化2’脱氧腺苷为2’脱氧肌苷(2'-脱氧腺苷+H2O＝2'-脱氧肌苷+NH3)的反应。肋间型霉素和2'-脱氧肋间型霉素是ADA1和ADA2的强力抑制剂。然而，由于底物结合口袋中的差异，抑制剂(+)-赤-9-(2-羟基-3-壬基)腺苷(EHNA)选择性抑制ADA1，但是不抑制ADA2。底物结合口袋中的差异也解释了ADA1与ADA2之间底物结合亲和性的差异。例如，虽然由于ADA1与ADA2中催化性残基的高度结构相似性导致对于腺苷的kcat值是相似的，但是对于腺苷的Km是不同的。ADA2对于腺苷的Km是大约2.25mM。由于ADA2具有对于底物结合的疏水性小口袋，因此ADA2对于底物的亲和性与ADA1的不同。ADA2对于腺苷的Km比ADA1的高大约100倍，ADA1对于腺苷的Km为大约0.1mM。
对于ADA2活性的最佳pH是大约pH 6.5，在pH高于7.0其活性降低。相反，对于ADA1的最佳pH是大约pH 7.5。不同的底物亲和性和pH最佳值表明ADA2适合于特定微环境，及在调节腺苷浓度和信号传导中发挥重叠但不同的功能(Zavialov et al.(2005)Biochem.J.391:51-57)。对于ADA2的酸性最佳pH和需要高浓度腺苷表明ADA2在特定环境如炎症或肿瘤部位可以是活性的，在此部位腺苷浓度升高而pH降低。在肿瘤微环境中，肿瘤细胞由于缺氧环境而可以经历广泛糖酵解，及在某些区域中的胞外微环境成为酸性的(pH6.5-6.9)。
ADA2在人体中广泛表达，最丰富的表达在成人心脏、肺、成淋巴细胞和胎盘以及胎儿肺、肝和肾。ADA2在血浆中在蛋白质水平也检测到。在正常人血清或血浆中的主要ADA活性来自ADA2(Neidzwicki and Aberneth(1991)Biochemical Pharmacology 41:1615-1624)。ADA2是由激活的细胞分泌的，包括激活的单核细胞及其它免疫细胞，以及在更限制的程度是由未刺激的淋巴细胞分泌的(Iwaki-Egawa et al.(2006)Biol.Chem.387:319-321)。免疫细胞如单核细胞在炎症部位和肿瘤处是激活的，在此胞外腺苷脱氨酶累积(Sitkovsky et al.(2004)Annu.Rev.Immunol.22:657-682)。ADA2可以参与调节这些特定环境中腺苷水平(Zavialov et al.(2010)J.Leukoc.Biol.88:279-290)。例如，ADA2可以发挥功能降低高腺苷浓度环境中的腺苷水平，如炎症部位或者缺氧条件的肿瘤微环境。
ADA2活性在患有肝病如慢性肝炎和肝硬化、AIDS、成人T细胞白血病、急性成淋巴细胞性白血病、结核和糖尿病患者的血浆中升高(Zavialov et al.(2005)Biochem.J.391:51-57)。此外，ADA2水平在新近的结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)(MTB)感染(Valdez)或者内脏利什曼病(Tripathi et al.,Clinica Chimica Acta 388(2008)135-138)的结核性胸腔积液中升高。MTB感染的胸腔积液含有大量巨噬细胞和CD4+细胞，表明由巨噬细胞分泌的ADA2在MTB感染期间可以调节免疫应答(Zavialov et al.(2010)J.Leukoc.Biol.88:279-290)。
ADA2通过GAG蛋白聚糖(例如肝素)和ADR结合细胞表面。肝素类似物如硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(HSPG)或者含有硫酸软骨素(CS)的蛋白聚糖存在于细胞表面上并参与蛋白质定位和细胞信号传导。ADA2通过这些肝素类似物可以结合各种类型的细胞，且与更高度硫酸化的硫酸肝素的结合比与较低硫酸化的肝素的结合更紧密，表明所述结合包含广泛的离子相互作用。与ADA2相反，ADA1不结合肝素(Zavialov et al.(2005)Biochem.J.391:51-57；Zavialov et al.(2010)J.Biol.Chem.285:12367-12377)。
除了含有蛋白聚糖的肝素类似物之外，ADA2二聚体还结合腺苷受体(ADR)，其作为二聚体起作用(Zavialov et al.(2005)Biochem.J.391:51-57,Zavialov et al.(2010)J.Biol.Chem.285:12367-12377)。据报道ADA2与细胞相互作用以介导生长因子活性。ADA2也可以直接结合一些二聚体腺苷受体，刺激单核细胞激活的CD4T细胞不依赖于其催化活性的增殖，诱导T细胞依赖性单核细胞分化为巨噬细胞并刺激巨噬细胞增殖。例如，ADA2增加单核细胞激活的CD4T细胞不依赖于其催化活性的增殖速度，及诱导T细胞依赖性单核细胞分化为巨噬细胞并刺激巨噬细胞增殖(Zavialov et al.(2010)J.Leukoc.Biol.88:279-290)。
ADA2中的缺损或缺陷与增加的血管炎症及血管病变相关，特别是与结节性多动脉炎或Sneddon综合征相关(Zhou et al.(2014)N.Engl.J.Med370:911-920；Navon Elkan etal.(2014)N.Engl.J.Med 370:921-931；Garg et al.(2014)Eur.J.Pediatr 173:827-830；Bras et al.(2014)New Eng.J.Med.,371:479-48；Belot et al.(2014)PediatricRheumatology 12:44)。例如，血管炎与编码ADA2的基因中的隐性突变相关，特征在于参照SEQ ID NO:2所示前体ADA2的突变G47A、G47R、G47V、A109D、H112Q、V119A、G142S、R169Q、P193L、P251L、W264S、Y453C(Navon Elkan et al.(2014)N.Engl.J.Med 370:921-931；Zhouet al.(2014)N.Engl.J.Med 370:911-920；Bras et al.(2014)New Eng.J.Med.,371:479-480)。
2.ADA2变体
本发明提供了ADA2的变体或突变体，包括与参考或未修饰的ADA2相比含有一或多个氨基酸修饰(即氨基酸序列改变)的多肽。所述修饰可以是在任何参考或未修饰的ADA2多肽中，只要参考ADA2在修饰的位置未含有氨基酸改变。例如，所述修饰可以是在含有SEQ IDNO:5或326-336、338-342、375或380-383任一所示氨基酸序列的ADA2多肽、其催化活性片段或者与SEQ ID NO:5或326-336、338-342、375或380-383任一所示序列或其催化活性片段呈现至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列相同性但不包含所述修饰的氨基酸序列中。
在特别的实例中，所述修饰是在SEQ ID NO:5所示ADA2多肽、其催化活性片段或者在与SEQ ID NO:5所示序列或其催化活性片段呈现至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列相同性但是不包含所述修饰的氨基酸序列中。例如，修饰可以在具有SEQ ID NO:5、326-334、340、375或380-383任一所示氨基酸序列的ADA2中。修饰也可以在SEQ ID NO:5的催化活性部分中。例如，催化活性ADA2可以是缺少全部或部分PRB结构域的多肽，如SEQ ID NO:548-550或579所示多肽。在特别的实例中，修饰是在含有SEQ ID NO:5所示氨基酸序列的人ADA2中。
在本发明提供的变体ADA2多肽的实例中，变体ADA2不具有SEQ ID NO:1、5、68、286-302、326-342或374-383任一所示氨基酸序列。而且，在本发明实例中，参照SEQ ID NO:5所示氨基酸残基编号，变体ADA2多肽也不含有如下修饰：缺失R8-K14del→--，或者氨基酸置换H7R、G18A、G18R、G18V、I64T、A80D、H83Q、V90A、C108G、H121R、W133G、R140Q、K141R、P164L、P222L、W235S、H306R、E330G、W333G、V365L、Y424C、F464S。
变体ADA2可以是单体或者可以是二聚体，如异源二聚体或者同源二聚体。本发明提供的变体ADA2多肽呈现出腺苷脱氨酶活性以催化腺苷转变为肌苷。应理解当变体ADA2多肽是活性形式时呈现这种活性，如当其作为二聚体存在时。典型地，这种活性是当ADA2是二聚体形式时呈现。因此，本发明提供的任何变体可用于调节其中需要调节腺苷依赖性免疫调节或其它腺苷依赖性活性的环境中的腺苷水平，如在肿瘤微环境或者炎症。因此，本发明提供的任何变体可用于本文所述治疗肿瘤或癌症的方法中。
当处于活性形式如当是二聚体形式时，含有变体ADA2多肽的变体ADA2与相应形式的不含有所述修饰的ADA2多肽(即未修饰的ADA2)如含有SEQ ID NO:5、326-334、340、375或380-383所示氨基酸序列的ADA2同源二聚体或其催化活性片段相比可以呈现出大约50％-500％、如大约50％-400％、50％-300％、50％-200％、50％-150％、50％-100％、50％-80％、80％-400％、80％-300％、80％-200％、80％-150％、80％-100％、100％-400％、100％-300％、100％-200％或者100％-150％的腺苷脱氨酶活性。例如，当是活性形式时，如当是二聚体形式时，含有变体ADA2多肽的变体ADA2与相应形式的不含所述修饰的ADA2多肽(即未修饰的ADA2)如含有SEQ ID NO:5、326-334、340、375或380-383所示氨基酸序列的ADA2同源二聚体或其催化活性片段相比可以呈现出至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％、200％、210％、220％、230％、240％、250％、260％、270％、280％、290％、300％、350％、400％、450％、500％或更多的腺苷脱氨酶活性。典型地，本发明提供的含有变体ADA2多肽的变体ADA2当是二聚体形式时保留相应形式的含有SEQ ID NO:5所示氨基酸序列的ADA2同源二聚体或其催化活性片段的腺苷脱氨酶活性，由此当是二聚体形式时，变体ADA2呈现出含有SEQ ID NO:5所示氨基酸序列的ADA2同源二聚体或其催化活性片段的腺苷脱氨酶活性的至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％、200％、210％、220％、230％、240％、250％、260％、270％、280％、290％、300％、350％、400％、450％、500％或更多。
典型地，本文提供的含有变体ADA2多肽的变体ADA2的催化效率或kcat/KM(M-1s-1)是至少5,000，这通常是如下范围：从或从大约5×103至5×106、5×103至2.5×106、5×103至1×106、5×103至5×105、5×103至2.5×105、5×103至1×105、5×103至8×104、5×103至5×104、5×103至2.5×104、5×103至1×104、1×104至5×105、1×104至2.5×105、1×104至1×105、1×104至8×104、1×104至5×104、1×104至2.5×104、2.5×104至5×106、2.5×104至2.5×106、2.5×104至1×106、2.5×104至5×105、2.5×104至2.5×105、2.5×104至1×105、2.5×104至8×104、2.5×104至5×104、5×104至5×106、5×104至2.5×106、5×104至1×106、5×104至5×105、5×104至2.5×105、5×104至1×105、5×104至8×104、8×104至5×106、8×104至2.5×106、8×104至1×106、8×104至5×105、8×104至2.5×105、8×104至1×105、1×105至5×106、1×105至2.5×106、1×105至1×106、1×105至5×105、1×105至2.5×105、2.5×105至5×106、2.5×105至2.5×106、2.5×105至1×106、2.5×105至5×105、5×105至5×106、5×105至2.5×106、或5×105至1×106M-1s-1。例如，本发明提供的含有变体ADA2多肽的变体ADA2的催化效率kcat/KM(M-1s-1)为至少5×103、6×103、7×103、8×103、9×103、1×104、2×104、3×104、4×104、5×104、6×104、7×104、8×104、9×104、1×105、2×105、3×105、4×105、5×105或更高，或者6×105、7×105、8×105、9×105、1×106、2×106、3×106、4×106、5×106M-1s-1或更高。
本发明提供的变体ADA2多肽可含有氨基酸置换(即取代)、添加(即插入)、缺失、截短或其组合。变体ADA2可以在ADA2多肽的任何区域或结构域中含有修饰，只要所得变体ADA2当是活性形式例如二聚体时至少保留腺苷脱氨酶活性。对于本发明，提及ADA2多肽中的修饰是参照SEQ ID NO:5所示成熟ADA2多肽的残基。氨基酸置换可以在任何ADA2多肽或其催化活性片段的相应残基进行，包括本领域已知的任何ADA2多肽或变体ADA2多肽。相应残基可以通过与SEQ ID NO:5所示成熟多肽比对而鉴别(见例如图1，表1)。在本说明书和实施例中也涉及基于Zavialov的编号(Zavialov et al.(2010)J.Biol.Chem.285:12367-12377)，这是基于SEQ ID NO:4所示氨基酸残基的编号。见表1，其示出了Zavialov编号(SEQID NO:4)和成熟ADA2编号(SEQ ID NO:5)的相应位置编号。
为了保留腺苷脱氨酶活性，修饰典型地不在对改变较低耐受的那些位置。这种位置可以在为催化活性、底物结合和/或二聚体化所需的结构域或区域内。例如，这种位置包括高度保守的区域，如为锌配位所需的残基或者活性位点残基。技术人员已知或者可易于鉴别为活性所需的氨基酸残基且应该不被改变的残基。而且，在一些情况中，如果修饰在这些位置，通常是保守氨基酸取代。本领域技术人员理解如在表3中提供的那些保守氨基酸取代可用于降低导致降低活性的修饰的可能性。
本发明提供的变体ADA2蛋白可含有与未修饰或参考ADA2多肽的多肽序列如SEQID NO:5、326-334、340、375或380-383任一所示那些序列或其催化活性片段呈现至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列相同性的多肽亚基。特别地，本发明提供的变体ADA2蛋白含有与SEQ ID NO:5所示多肽序列或其催化活性片段呈现出至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列相同性的多肽亚基。本发明提供的变体ADA2蛋白可含有与未修饰的或参考ADA2多肽的多肽序列相比可含有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、12、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50或更多个氨基酸修饰的多肽亚基。应理解当以二聚体或多聚体形式存在时，变体ADA2可含有至少或大约或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、12、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100或者更多个氨基酸修饰。
对于本发明，氨基酸置换是以被置换的氨基酸、氨基酸位置和置换氨基酸表示(例如K11A是成熟编号，表示在相应于SEQ ID NO:5的氨基酸残基11的位置的氨基酸例如赖氨酸由丙氨酸置换)。对于本发明，氨基酸置换也可以由被置换的氨基酸、氨基酸位置和置换氨基酸表示(例如K14A是Zavialov编号，表示在相应于SEQ ID NO:4的氨基酸残基14的位置的氨基酸例如赖氨酸由丙氨酸置换)。见表1，其示出了Zavialov编号(SEQ ID NO:4)与成熟ADA2编号(SEQ ID NO:5)的相应位置编号。在本文也使用命名法表示在根据成熟编号的SEQID NO:5和/或根据Zavialov编号的SEQ ID NO:4的相应位置插入(--→随后是插入位置)或者缺失(例如缺失位置(del)随后→--)氨基酸残基。例如，根据成熟编号的--→N1是指与SEQ ID NO:5所示成熟ADA2相应序列比较插入在位置1的残基。例如，根据Zavialov编号的--→N4表示与SEQ ID NO:4所示ADA2相应序列比较插入在位置4的残基。应理解在一些情况中，由于缺失或插入氨基酸残基，变体ADA2多肽中的残基编号与SEQ ID NO:5所示残基编号相比有改变。在这种情况中，本领域技术人员例如通过如图1所示比对可以鉴别相应于SEQ ID NO:5中残基的相应变体ADA2多肽中的残基。例如，变体ADA2多肽中残基编号可以基于Zavialov编号(Zavialov et al.(2010)J.Biol.Chem.285:12367-12377)，这是基于SEQID NO:4所示氨基酸残基编号。见表1，示出了Zavialov编号(SEQ ID NO:4)与成熟ADA2编号(SEQ ID NO:5)的相应位置编号。
举例的本发明提供的变体ADA2多肽中的修饰在下文进一步描述。本发明提供的变体ADA2包括当是活性形式时与相应形式的不含有所述修饰的参考或野生型ADA2(即未修饰的ADA2)相比呈现出改变或改良的活性或性质的那些多肽。例如，本发明提供的变体ADA2包括当是活性形式时与相应形式的未修饰的ADA2相比呈现出改变或改良的活性或性质的那些多肽，所述未修饰的ADA2包含具有与SEQ ID NO:5或其催化活性片段呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列的ADA2多肽，如SEQ ID NO:5、326-334、340、375或380-383任一所示的那些多肽或其催化活性片段。特别地，本发明提供的修饰可以影响任一或多种活性，包括与相应形式的不含有所述修饰的ADA2(即未修饰的ADA2)相比增加的腺苷脱氨酶活性、减弱的肝素结合、增加的半衰期、改变的pH最佳值、增加的热稳定性、降低的受体结合，或者高糖基化。
特别地，所述活性形式是二聚体形式，如同源二聚体形式，其含有变体ADA2多肽。因此，在本发明实例中，本发明提供的包含变体ADA2多肽的变体ADA2蛋白当是二聚体形式时与不含有所述修饰的参考或野生型ADA2的二聚体形式相比呈现出改变或改良的活性与性质。例如，本发明提供的变体ADA2包括当是二聚体形式时与相应二聚体形式的未修饰的ADA2相比呈现出改变或改良的活性或性质的那些ADA2，所述未修饰的ADA2包含具有与SEQID NO:5或其催化活性片段呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列的ADA1多肽，如SEQ IDNO:5、326-334、340、375或380-383任一所示那些多肽或其催化活性片段。例如，本发明提供的含有变体ADA2多肽的变体ADA2当是二聚体形式时与含有SEQ ID NO:5所示氨基酸序列或其催化活性片段的ADA2同源二聚体相比时呈现出改变或改良的活性或性质。特别地，本发明提供的修饰可以影响任一或多种活性，包括与相应形式的不含有所述修饰的ADA2(即未修饰的ADA2)相比增加的腺苷脱氨酶活性、减弱的肝素结合、增加的半衰期、改变的pH最佳值、增加的热稳定性、降低的受体结合，或者高糖基化。
例如，本发明提供了变体ADA2蛋白，当是活性形式如二聚体形式时。呈现出增加的腺苷脱氨酶活性。例如，变体ADA2蛋白当是活性形式如二聚体形式时可以呈现出相应形式的未修饰ADA2的至少110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％、200％、225％、250％、300％、350％、400％、450％、500％、600％、700％、800％、900％、1000％或更高的活性，其中腺苷脱氨酶活性是在相同条件下评定的。变体ADA2的催化效率(kcat/KM)与相应形式的未修饰的ADA2的催化效率(kcat/KM)相比呈现出至少或至少大约1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2.0倍、2.2倍、2.5倍、3.0倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5.0倍、6.0倍、7.0倍、8.0倍、9.0倍、10.0倍或更高，或11.0倍、12.0倍、13.0倍、14.0倍、15.0倍或更高的增加的腺苷脱氨酶活性，其中腺苷脱氨酶活性的催化效率是在相同条件下评定的。例如，当本发明提供的变体ADA2是二聚体形式时，其呈现出催化效率(kcat/KM)是至少2×104M-1s-1、3×104M-1s-1、4×104M-1s-1、5×104M-1s-1、6×104M-1s-1、7×104M-1s-1、8×104M-1s-1、9×104M-1s-1、1×105M-1s-1、2×105M-1s-1、3×105M-1s-1、4×105M-1s-1、5×105M-1s-1或更高、或6×105M-1s-1、7×105M-1s-1、8×105M-1s-1、9×105M-1s-1、1×106M-1s-1、2×106M-1s-1、3×106M-1s-1、4×106M-1s-1、5×106M-1s-1或更高。
在本文实例中，本发明提供了这样的变体ADA2蛋白，当其是活性形式如二聚体形式时，呈现出与任一或多种腺苷受体(ADR)降低的结合，所述受体选自A1、A2A、A2B和A3,及典型地是A2A或A2B之一或二者。不受理论限制，预期如果ADA2与ADR的结合降低，则本发明提供的将腺苷转变为肌苷的腺苷脱氨酶活性更高或更有效。例如，本发明提供了这样的变体ADA2，当其是活性形式如二聚体形式时，其中与相应形式的未修饰的ADA2相比，其与一或多种ADR的结合降低至少或至少大约0.5倍、1倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更多。
在本文实例中，本发明提供了这样的变体ADA2蛋白，当其是活性形式如二聚体形式时，呈现出降低的或减弱的肝素结合。ADA2结合糖胺聚糖(GAG)，包括肝素及其类似物，如硫酸乙酰肝素和硫酸软骨素。与肝素/GAG的高亲和性结合是由在二聚体界面的大的高度正电荷的表面介导的，ADA2的二聚体化形成肝素结合位点。由于糖胺聚糖在机体广泛存在，其可以与给予的ADA2相互作用并作为外围下沉(peripheral sink)。因此，具有降低的肝素结合的ADA2可增加给予的ADA2的生物利用度和药动学。例如，当给予本发明提供的具有减弱的肝素结合的ADA2变体时导致改良的生物利用度和药动学，例如增加的半衰期，因为给予的ADA2分子通过结合GAG而不在外围下沉中隐匿。特别地，本发明提供的是这样的变体ADA2蛋白，当其是活性形式如二聚体形式时，呈现出相应形式的未修饰的ADA2的肝素结合的不超过1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％，其中肝素结合是在相同条件下评定的。
在本文实例中，本发明提供了这样的变体ADA2蛋白，当其是活性形式如二聚体形式时，呈现出增加或延长的血浆或血清半衰期(t1/2)。例如，本发明提供的变体ADA2当是活性形式如二聚体形式时，呈现出半衰期是相应形式未修饰ADA2的半衰期的至少或至少大约110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％、200％、225％、250％、300％、350％、400％、450％、500％、600％、700％、800％或更长、或900％、1000％、1100％、1200％、1300％、1400％、1500％、1600％、1700％、1800％、1900％、2000％、3000％、4000％、5000％、6000％、7000％、8000％、9000％、10000％或更长，其中半衰期是在相同条件下评定的。
在本文实例中，本发明提供了这样的变体ADA2蛋白，当其是活性形式如二聚体形式时，呈现出增加的热稳定性。例如，当是活性形式如二聚体形式时，本发明提供的变体ADA2呈现出解链温度(Tm)与相应形式未修饰的ADA2的Tm相比增加至少或至少大约0.5℃、1.0℃、2.0℃、3.0℃、4.0℃、5.0℃、6.0℃、7.0℃、8.0℃、9.0℃、10.0℃或更高的热稳定性，其中Tm是在相同条件下评定的。当本发明提供的变体ADA2是活性形式如二聚体形式时，其解链温度(Tm)可以是至少或至少大约67.6℃、67.8℃、68.0℃、68.2℃、68.4℃、68.6℃、68.8℃、69.0℃、69.2℃、69.4℃、69.6℃、69.8℃、70.0℃、70.2℃、70.4℃、70.6℃、70.8℃、71.0℃、71.2℃、71.4℃、71.6℃、71.8℃或更高。
在本文实例中，ADA2或变体的腺苷脱氨酶活性呈现的pH最佳值可以是或大约是pH6.0-pH 7.6，如pH为至少pH 6、6.25、6.5、6.75、7、7.25或7.5。例如，ADA2的pH最佳值是或大约是6.5±0.2。本发明提供的变体ADA2蛋白对于腺苷脱氨酶活性呈现的pH最佳值是或大约是pH 6.0-6.8，例如是或大约是pH 6.5±0.2。在一些情况中，变体ADA2呈现出改变的pH最佳值，及催化活性可以在较高pH呈现，如是或大约是pH 6.8-pH 7.6，例如是或大约是pH7.0-pH 7.5或者pH 7.2-pH 7.4(均包括端点)。由于在TME中血管附近的增殖组织可具有更中性pH，这种变体在特定肿瘤环境中可以更具活性。例如，ADA2变体可呈现出对于腺苷脱氨酶活性的pH最佳值为至少pH 6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6或更高。
基于这个描述，本领域技术人员可以产生含有任一或多个所述修饰的变体ADA2，并检测每个变体的腺苷脱氨酶活性和/或如下本文描述的一或多种性质：肝素结合、半衰期、pH最佳值、热稳定性、受体结合和/或糖基化。
a.举例的修饰
i.氨基酸置换
在一个实例中，所述修饰可以是氨基酸置换。本发明提供了变体ADA2多肽，参照SEQ ID NO:5所示氨基酸残基，其在ADA2多肽中在相应于根据成熟编号的残基11、13、20、22、26、86、109、118、119、124、133、139、179、183、191、217、219、221、224、258、262、264、266、267、277、283、296、309、317、321、352、366、371、372、373、374、403、404、405、406、441、444、452、461、469或470的氨基酸位置含有一或多个氨基酸置换。例如，参照SEQ ID NO:5所示氨基酸残基，氨基酸置换可以是在相应于根据成熟编号的残基K11、K13、R20、V22、K26、D86、F109、R118、F119、P124、W133、Y139、E179、F183、Y191、R217、R219、L221、Y224、K258、S262、H264、S266、K267、R277、R283、V296、K309、K317、K321、R352、R366、K371、K372、D373、I374、T403、G404、H405、P406、R441、K444、K452、K461、K469或K470的氨基酸位置。
例如，本发明提供了变体ADA2多肽，其在ADA2多肽中含有一或多个氨基酸置换，参照SEQ ID NO:5所示氨基酸残基，所述置换是如下根据成熟编号的任一或多个：K11A、K11D、K11E、K13A、K13D、K13E、R20A、R20D、R20E、R20N、V22S、K26A、K26D、K26E、D86A、D86C、D86E、D86F、D86G、D86H、D86I、D86K、D86L、D86M、D86N、D86P、D86Q、D86R、D86S、D86T、D86V、D86W、D86Y、F109S、F109A、R118D、R118A、F119S、F119K、P124A、P124S、W133S、W133T、Y139T、Y139A、E179A、E179C、E179D、E179F、E179G、E179H、E179I、E179K、E179L、E179M、E179N、E179P、E179Q、E179R、E179S、E179T、E179V、E179W、E179Y、F183K、Y191S、Y191D、R217A、R217D、R217E、R219A、R219C、R219D、R219E、R219F、R219G、R219H、R219I、R219K、R219L、R219M、R219N、R219P、R219Q、R219S、R219T、R219V、R219W、R219Y、L221A、L221C、L221D、L221E、L221F、L221G、L221H、L221I、L221K、L221M、L221N、L221P、L221Q、L221R、L221S、L221T、L221V、L221W、L221Y、Y224R、Y224N、K258A、K258D、K258E、S262A、S262C、S262D、S262E、S262F、S262G、S262H、S262I、S262K、S262L、S262M、S262N、S262P、S262Q、S262R、S262T、S262V、S262W、S262Y、H264A、H264C、H264D、H264E、H264F、H264G、H264I、H264K、H264L、H264M、H264N、H264P、H264Q、H264R、H264S、H264T、H264V、H264W、H264Y、S266A、S266C、S266D、S266E、S266F、S266G、S266H、S266I、S266K、S266L、S266M、S266N、S266P、S266Q、S266R、S266T、S266V、S266W、S266Y、K267A、K267C、K267D、K267E、K267F、K267G、K267H、K267I、K267L、K267M、K267N、K267P、K267Q、K267R、K267S、K267T、K267V、K267W、K267Y、R277A、R277D、R277E、R283A、R283D、R283E、V296A、V296C、V296D、V296E、V296F、V296G、V296H、V296I、V296K、V296L、V296M、V296N、V296P、V296Q、V296R、V296S、V296T、V296W、V296Y、K309A、K309D、K309E、K317A、K317D、K317E、K321A、K321D、K321E、R352A、R352D、R352E、R366A、R366D、R366E、K371A、K371D、K371E、K371N、K372A、K372D、K372E、K372N、D373S、I374S、T403N、G404N、H405S、P406S、R441A、R441D、R441E、K444A、K444D、K444E、K452A、K452D、K452E、K461A、K461D、K461E、K469A、K469D、K469E、K470A、K470D和K470E。
特别地，本发明提供了变体ADA2多肽，其在ADA2多肽中含有一或多个氨基酸置换，参照SEQ ID NO:5所示氨基酸残基，所述置换是如下根据成熟编号的任一或多个：K11A、K11E、R20A、R20D、R20E、R219K、R219Q、L221A、L221V、L221G、S262N、H264Q、H264G、R366A、R366D、R366E、K371A、K371D、K371E、K372A、K372D、K372E和K452E。例如，本发明提供了变体ADA2多肽，其在ADA2多肽中含有一或多个氨基酸置换，参照SEQ ID NO:5所示氨基酸残基，所述置换是如下根据成熟编号的任一或多个：K11A、K11E、R20A、R20E、R219K、R219Q、L221A、L221V、L221G、S262N、H264Q、H264G、R366E、K371A、K371D、K371E、K372D、K372E、K452D和K452E。在另一实例中，本发明提供了变体ADA2多肽，其在ADA2多肽中含有一或多个氨基酸置换，参照SEQ ID NO:5所示氨基酸残基，所述置换是如下根据成熟编号的任一或多个：R20A、R20D、R20E、S262N、R366A、R366D、R366E、K371A、K371D、K371E、K372A、K372D、K372E和K452E。在实例中，本发明提供了变体ADA2多肽，其在ADA2多肽中含有一或多个氨基酸置换，参照SEQ ID NO:5所示氨基酸残基，所述置换是如下根据成熟编号的任一或多个：K11A、R20A、R20E、R219Q、S262N、K371A、K371D或K371E。
本发明还提供了变体ADA2多肽，其与不含有所述修饰的参考ADA2多肽(即未修饰的ADA2)相比含有2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸置换。变体ADA2多肽可含有如上提供的任两个或更多个氨基酸置换，只要所得ADA2变体呈现或者保留腺苷脱氨酶活性即可。所述两或更多个氨基酸置换可赋予同样改变的活性或者不同改变的活性。例如，一个氨基酸置换可赋予改变的肝素结性，另一个可赋予增加的腺苷脱氨酶活性。因此，所得ADA2多肽变体呈现出两或更多种改变的活性或性质。
例如，本发明提供了变体ADA2多肽，参照SEQ ID NO:5所示氨基酸残基，其含有根据成熟编号的如下氨基酸置换：K11A/R20A、K11A/R20A/K371A、R20A/K371A、K11A/K371A、S262N/K371D、S262N/K371E、S262N/R20E、S262N/R20E/K371D、S262N/R20E/K371E、R219Q/K371E、R219Q/K371D、R219Q/R20E、R219Q/K371E/R20E、R219Q/K371D/R20E、R219Q/S262N/K371E、R219Q/S262N/K371D、R219Q/S262N/R20E、R219Q/S262N/K371E/R20E、R219Q/S262N/K371D/R20E或者R219Q/S262N。
例如，本发明提供了变体ADA2多肽，参照SEQ ID NO:5所示氨基酸残基，其含有根据成熟编号的氨基酸置换K11A/R20A、K11A/R20A/K371A、R20A/K371A、K11A/K371A、S262N/K371D、S262N/K371E、S262N/R20E、S262N/R20E/K371D、S262N/R20E/K371E、R219Q/K371E、R219Q/K371D、R219Q/R20E、R219Q/K371E/R20E、R219Q/K371D/R20E、R219Q/S262N/K371E、R219Q/S262N/K371D、R219Q/S262N/R20E、R219Q/S262N/K371E/R20E、R219Q/S262N/K371D/R20E或R219Q/S262N。
举例的这种变体ADA2多肽是如SEQ ID NO:13-63或71-273任一所示或者其催化活性部分。
在其它实例中，本发明还提供了变体ADA2多肽，参照SEQ ID NO:5所示氨基酸残基，其含有根据成熟编号的氨基酸置换R219Q/S262N/K11A、R219Q/S262N/K11D、R219Q/S262N/K11E、R219Q/S262N/K13A、R219Q/S262N/K13D、R219Q/S262N/K13E、R219Q/S262N/K371A、R219Q/S262N/K372A、R219Q/S262N/K372D、R219Q/S262N/K372E、R219Q/S262N/K452A、R219Q/S262N/K452D、R219Q/S262N/K452E、R219Q/S262N/R20A、R219Q/S262N/R20D、R219Q/S262N/R366A、R219Q/S262N/R366D、R219Q/S262N/R366E、R219Q/S262N/H264A、R219Q/S262N/H264Q、R219Q/S262N/H264N、R219Q/S262N/H264G、R219K/S262N、R219N/S262N、R219A/S262N、R219Q/S262N/L221A、R219Q/S262N/L221V、R219Q/S262N/L221G、R219Q/S262N/E179D、R219Q/S262N/E179A、R219Q/S262N/E179S、R219Q/S262N/E179T、R219Q/S262N/E179V、R219Q/S262N/E179G、R219Q/S262A、R219Q/S262V、R219Q/S262M、R219Q/S262N/K11A/R20A、R219Q/S262N/K11A/R20A/K371A、R219Q/S262N/R20A/K371A、R219Q/S262N/K11A/K371A、R219Q/S262N/K26A、R219Q/S262N/K26D、R219Q/S262N/K26E、R219Q/S262N/R217A、R219Q/S262N/R217D、R219Q/S262N/R217E、R219Q/S262N/K258A、R219Q/S262N/K258D、R219Q/S262N/K258E、R219Q/S262N/R277A、R219Q/S262N/R277D、R219Q/S262N/R277E、R219Q/S262N/R283A、R219Q/S262N/R283D、R219Q/S262N/R283E、R219Q/S262N/K309A、R219Q/S262N/K309D、R219Q/S262N/K309E、R219Q/S262N/K317A、R219Q/S262N/K317D、R219Q/S262N/K317E、R219Q/S262N/K321A、R219Q/S262N/K321D、R219Q/S262N/K321E、R219Q/S262N/R352A、R219Q/S262N/R352D、R219Q/S262N/R352E、R219Q/S262N/R441A、R219Q/S262N/R441D、R219Q/S262N/R441E、R219Q/S262N/K444A、R219Q/S262N/K444D、R219Q/S262N/K444E、R219Q/S262N/K461A、R219Q/S262N/K461D、R219Q/S262N/K461E、R219Q/S262N/K469A、R219Q/S262N/K469D、R219Q/S262N/K469E、R219Q/S262N/K470A、R219Q/S262N/K470D、R219Q/S262N/K470E、R219Q/S262N/D86A、R219Q/S262N/D86C、R219Q/S262N/D86E、R219Q/S262N/D86F、R219Q/S262N/D86G、R219Q/S262N/D86H、R219Q/S262N/D86I、R219Q/S262N/D86K、R219Q/S262N/D86L、R219Q/S262N/D86M、R219Q/S262N/D86N、R219Q/S262N/D86P、R219Q/S262N/D86Q、R219Q/S262N/D86R、R219Q/S262N/D86S、R219Q/S262N/D86T、R219Q/S262N/D86V、R219Q/S262N/D86W、R219Q/S262N/D86Y、R219Q/S262N/E179C、R219Q/S262N/E179F、R219Q/S262N/E179H、R219Q/S262N/E179I、R219Q/S262N/E179K、R219Q/S262N/E179L、R219Q/S262N/E179M、R219Q/S262N/E179N、R219Q/S262N/E179P、R219Q/S262N/E179Q、R219Q/S262N/E179R、R219Q/S262N/E179W、R219Q/S262N/E179Y、R219C/S262N、R219D/S262N、R219E/S262N、R219F/S262N、R219G/S262N、R219H/S262N、R219I/S262N、R219L/S262N、R219M/S262N、R219P/S262N、R219S/S262N、R219T/S262N、R219V/S262N、R219W/S262N、R219Y/S262N、R219Q/S262N/L221C、R219Q/S262N/L221D、R219Q/S262N/L221E、R219Q/S262N/L221F、R219Q/S262N/L221H、R219Q/S262N/L221I、R219Q/S262N/L221K、R219Q/S262N/L221M、R219Q/S262N/L221N、R219Q/S262N/L221P、R219Q/S262N/L221Q、R219Q/S262N/L221R、R219Q/S262N/L221S、R219Q/S262N/L221T、R219Q/S262N/L221W、R219Q/S262N/L221Y、R219Q/S262C、R219Q/S262D、R219Q/S262E、R219Q/S262F、R219Q/S262G、R219Q/S262H、R219Q/S262I、R219Q/S262K、R219Q/S262L、R219Q/S262P、R219Q/S262Q、R219Q/S262R、R219Q/S262T、R219Q/S262W、R219Q/S262Y、R219Q/S262N/H264C、R219Q/S262N/H264D、R219Q/S262N/H264E、R219Q/S262N/H264F、R219Q/S262N/H264I、R219Q/S262N/H264K、R219Q/S262N/H264L、R219Q/S262N/H264M、R219Q/S262N/H264P、R219Q/S262N/H264R、R219Q/S262N/H264S、R219Q/S262N/H264T、R219Q/S262N/H264V、R219Q/S262N/H264W、R219Q/S262N/H264Y、R219Q/S262N/S266A、R219Q/S262N/S266C、R219Q/S262N/S266D、R219Q/S262N/S266E、R219Q/S262N/S266F、R219Q/S262N/S266G、R219Q/S262N/S266H、R219Q/S262N/S266I、R219Q/S262N/S266K、R219Q/S262N/S266L、R219Q/S262N/S266M、R219Q/S262N/S266N、R219Q/S262N/S266P、R219Q/S262N/S266Q、R219Q/S262N/S266R、R219Q/S262N/S266T、R219Q/S262N/S266V、R219Q/S262N/S266W、R219Q/S262N/S266Y、R219Q/S262N/K267A、R219Q/S262N/K267C、R219Q/S262N/K267D、R219Q/S262N/K267E、R219Q/S262N/K267F、R219Q/S262N/K267G、R219Q/S262N/K267H、R219Q/S262N/K267I、R219Q/S262N/K267L、R219Q/S262N/K267M、R219Q/S262N/K267N、R219Q/S262N/K267P、R219Q/S262N/K267Q、R219Q/S262N/K267R、R219Q/S262N/K267S、R219Q/S262N/K267T、R219Q/S262N/K267V、R219Q/S262N/K267W、R219Q/S262N/K267Y、R219Q/S262N/V296A、R219Q/S262N/V296C、R219Q/S262N/V296D、R219Q/S262N/V296E、R219Q/S262N/V296F、R219Q/S262N/V296G、R219Q/S262N/V296H、R219Q/S262N/V296I、R219Q/S262N/V296K、R219Q/S262N/V296L、R219Q/S262N/V296M、R219Q/S262N/V296N、R219Q/S262N/V296P、R219Q/S262N/V296Q、R219Q/S262N/V296R、R219Q/S262N/V296S、R219Q/S262N/V296T、R219Q/S262N/V296W、R219Q/S262N/V296Y、R219Q/K11A/R20A、R219Q/K11A/R20A/K371A、R219Q/R20A/K371A、R219Q/K11A/K371A、S262N/K11A/R20A、S262N/K11A/R20A/K371A、S262N/R20A/K371A或者S262N/K11A/K371A。
举例的这种变体ADA2多肽是如SEQ ID NO:659-663或682-917任一所示或者其催化活性部分。
ii.PRB结构域的修饰
在其它实例中，本发明还提供了含有修饰的PRB结构域的修饰的ADA2多肽。PRB结构域不是催化活性必需的，因此如本文示出可以除去以使得ADA2变体蛋白的除了由ADA2介导的脱氨酶活性之外的活性降低或者消除。根据报道的ADA2的结构域组构，PRB结构域相应于SEQ ID NO:5所示成熟ADA2的残基98-156或105-148。PRB结构域的修饰可包括缺失全部或部分PRB结构域(即缺失PRB结构域的一或多个残基)，在PRB结构域中插入一或多个氨基酸残基，PRB结构域的一或多个残基的氨基酸置换或者其组合，从而降低或者抑制该结构域与受体的结合或者其其它活性。例如，PRB结构域含有直至或大约或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、或者59个修饰位置，如通常直至或大约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43或者44个修饰位置。
在一个实例中，如在下文详细描述，例如通过缺失PRB结构域的一或多个连续氨基酸残基可以缺失全部或部分PRB结构域。例如，本发明提供了变体ADA2，参照SEQ ID NO:5所示残基，其中缺失在或大约在氨基酸残基98-156或者氨基酸残基105-148或者氨基酸残基105-147或者氨基酸残基99-144之间的一或多个连续氨基酸残基(包括端点)。举例的这种ADA2变体，参照SEQ ID NO:5所示氨基酸序列，是缺失相应于根据成熟编号的连续残基98-156、105-148、105-147、102-147或108-150的连续氨基酸残基。例如，参照SEQ ID NO:5所示氨基酸序列，举例的这种ADA2多肽包括根据成熟编号的多肽ADA2_del98-156(98-156del，SEQ ID NO:548)、ADA2_del105-148(105-148del，SEQ ID NO:549)、ADA2_del105-147(105-147del，SEQ ID NO:550)和ADA2_del99-144(99-144del，SEQ ID NO:579)。
在一些实例中，在PRB结构域中含有修饰如缺失连续残基的变体ADA2也含有用肽接头取代修饰的或缺失的区域。结果，全部或部分PRB结构域可以用空间可接受的肽接头序列置换。在这种实例中，PRB结构域的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或者全部更多的连续氨基酸可以用肽接头的氨基酸取代或置换，通常不超过60个氨基酸，及通常不超过2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45或50个氨基酸。可以选择任何合适的接头，只要所得变体ADA2呈现腺苷脱氨酶活性即可。
举例的肽接头包括但不限于：(Gly)n，其中n是2-20(SEQ ID NO:368)；-Gly-Gly-；GGG(SEQ ID NO:369)；GGGG(SEQ ID NO:362)；GGGGG(SEQ ID NO:360)；GGGGGGG(SEQ IDNO:370)；GGGGGGGGGG(SEQ ID NO:371)；GGGGGGGGGGGGGGG(SEQ ID NO:372)；GGGGS或(GGGGS)n(SEQ ID NO:343)；GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:580)；GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:367)；SSSSG或(SSSSG)n(SEQ ID NO:344)；GKSSGSGSESKS(SEQ ID NO:345)；GGSTSGSGKSSEGKG(SEQ ID NO:346)；GSTSGSGKSSSEGSGSTKG(SEQ ID NO:347)；GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:348)；EGKSSGSGSESKEF(SEQ ID NO:349)；或者AlaAlaProAla或(AlaAlaProAla)n(SEQ ID NO:350)，其中n是1-6，如1、2、3或4。在特定的实例中，所述肽接头是GGG(SEQ ID NO:369)、GGGGG(SEQ ID NO:360)、GGGGGGG(SEQ ID NO:370)、GGGGGGGGGG(SEQ ID NO:371)、GGGGGGGGGGGGGGG(SEQ ID NO:372)、GGGGS(SEQ IDNO:343)、GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:580)、或者GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:367)。
举例的这种修饰是称作C105-T147del→(Gly)n(SEQ ID NO:280)的变体ADA2，其中n是2-20，从而参照SEQ ID NO:5编号，在相应于残基105-147区域中的PRB结构域由长度为2-20个氨基酸残基的甘氨酸接头置换。例如，变体ADA2可以是C105-T147del→(Gly)15(SEQ ID NO:281)、C105-T147del→(Gly)10(SEQ ID NO:282)、C105-T147del→(Gly)7(SEQID NO:283)、C105-T147del→(Gly)5(SEQ ID NO:284)或者C105-T147del→(Gly)3(SEQ IDNO:285)。这种修饰的进一步实例是称作V99-Q144del→(GGGGS)n(SEQ ID NO:581)的变体ADA，其中n是1-5，从而参照SEQ ID NO:5编号，在相应于残基99-144的区域中的PRB结构域由(GGGGS)n接头置换，其中接头中的氨基酸序列重复1-5次，由此所述接头的长度是5、10、15、20或25个氨基酸残基。例如，变体ADA2可以是V99-Q144del→(GGGGS)1(SEQ ID NO:583)、V99-Q144del→(GGGGS)2(SEQ ID NO:584)或者V99-Q144del→(GGGGS)3(SEQ ID NO:585)。这种修饰的进一步实例是称作C105-T147del→(GGGGS)n(SEQ ID NO:582)的变体ADA，其中n是1-5，从而参照SEQ ID NO:5编号，相应于残基105-147的区域中的PRB结构域由(GGGGS)n接头置换，其中接头的氨基酸序列重复1-5次，由此接头的长度为5、10、15、20或25个氨基酸残基。例如，参照SEQ ID NO:5所示氨基酸序列，变体ADA2可以是根据成熟编号的C105-T147del→(GGGGS)1(SEQ ID NO:586)、C105-T147del→(GGGGS)2(SEQ ID NO:587)或C105-T147del→(GGGGS)3(SEQ ID NO:588)。举例的这种变体ADA2多肽是如SEQ ID NO:281-285和583-588任一所示或者其催化活性部分。
本发明还提供了这样的变体ADA2多肽，其含有PRB结构域中的缺失、插入、取代和/或氨基酸置换，组合本发明提供的其它缺失、插入、取代和/或氨基酸置换。例如，本发明提供了变体ADA2多肽，与未修饰的参考ADA2相比，其含有全部或部分PRB结构域的缺失如PRB结构域的一或多个连续氨基酸残基的缺失，组合1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个另外的氨基酸置换。本发明还提供了变体ADA2多肽，与未修饰的参考ADA2相比，其在PRB结构域中含有修饰如缺失连续残基，还含有用肽接头取代修饰或缺失的区域，组合1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个另外的氨基酸置换。例如，本发明提供了含有缺失全部或部分PRB结构域及如上提供的任一或多个氨基酸置换的变体ADA2多肽，只要所得ADA2变体呈现或保留腺苷脱氨酶活性即可。缺失和/或氨基酸置换可赋予相同的改变的活性或者不同的改变的活性。例如，缺失和/或取代PRB结构域可赋予一种改变的活性，例如降低与受体的结合，而氨基酸置换可赋予增加的腺苷脱氨酶活性。因此，所得ADA2多肽变体呈现出两或更多种改变的活性或性质。
例如，本发明提供了变体ADA2多肽，参照SEQ ID NO:5所示氨基酸残基，其含有如下根据成熟编号的缺失和/或取代和/或氨基酸置换的组合：K371D/V99-Q144del→(GGGGS)1；K371D/V99-Q144del→(GGGGS)2；K371D/V99-Q144del→(GGGGS)3；K371D/C105-T147del→(GGGGS)1；K371D/C105-T147del→(GGGGS)2；K371D/C105-T147del→(GGGGS)3；R219Q/S262N/C105-T147del→(Gly)15；R219Q/S262N/C105-T147del→(Gly)10；R219Q/S262N/C105-T147del→(Gly)7；R219Q/S262N/C105-T147del→(Gly)5；R219Q/S262N/C105-T147del→(Gly)3；R219Q/S262N/V99-Q144del→(GGGGS)1；R219Q/S262N/V99-Q144del→(GGGGS)2；R219Q/S262N/V99-Q144del→(GGGGS)3；R219Q/S262N/C105-T147del→(GGGGS)1；R219Q/S262N/C105-T147del→(GGGGS)2；R219Q/S262N/C105-T147del→(GGGGS)3；R219Q/S262N/K371D/V99-Q144del→(GGGGS)1；R219Q/S262N/K371D/V99-Q144del→(GGGGS)2；R219Q/S262N/K371D/V99-Q144del→(GGGGS)3；R219Q/S262N/K371D/C105-T147del→(GGGGS)1；R219Q/S262N/K371D/C105-T147del→(GGGGS)2；R219Q/S262N/K371D/C105-T147del→(GGGGS)3；K371D/C105-T147del→(Gly)n(其中n是2-20)；K371D/C105-T147del→(Gly)15；K371D/C105-T147del→(Gly)10；K371D/C105-T147del→(Gly)7；K371D/C105-T147del→(Gly)5；K371D/C105-T147del→(Gly)3；K371D/V99-Q144del→(GGGGS)n(其中n是1-5)；K371D/C105-T147del→(GGGGS)n(其中n是1-5)；K371D/N98-N156del；K371D/C105-E148del；K371D/C105-T147del；K371D/V99-Q144del；R219Q/S262N/C105-T147del→(Gly)n(其中n是2-20)；R219Q/S262N/V99-Q144del→(GGGGS)n(其中n是1-5)；R219Q/S262N/C105-T147del→(GGGGS)n(其中n是1-5)；R219Q/S262N/N98-N156del；R219Q/S262N/C105-E148del；R219Q/S262N/C105-T147del；R219Q/S262N/V99-Q144del；R219Q/S262N/K371D/C105-T147del→(Gly)n(其中n是2-20)；R219Q/S262N/K371D/C105-T147del→(Gly)15；R219Q/S262N/K371D/C105-T147del→(Gly)10；R219Q/S262N/K371D/C105-T147del→(Gly)7；R219Q/S262N/K371D/C105-T147del→(Gly)5；R219Q/S262N/K371D/C105-T147del→(Gly)3；R219Q/S262N/K371D/V99-Q144del→(GGGGS)n(其中n是1-5)；R219Q/S262N/K371D/C105-T147del→(GGGGS)n(其中n是1-5)；R219Q/S262N/K371D/N98-N156del；R219Q/S262N/K371D/C105-E148del；R219Q/S262N/K371D/C105-T147del；R219Q/S262N/K371D/V99-Q144del；R219Q/C105-T147del→(Gly)n(其中n是2-20)；R219Q/V99-Q144del→(GGGGS)n(其中n是1-5)；R219Q/C105-T147del→(GGGGS)n(其中n是1-5)；R219Q/N98-N156del；R219Q/C105-E148del；R219Q/C105-T147del；R219Q/V99-Q144del；S262N/C105-T147del→(Gly)n(其中n是2-20)；S262N/V99-Q144del→(GGGGS)n(其中n是1-5)；S262N/C105-T147del→(GGGGS)n(其中n是1-5)；S262N/N98-N156del；S262N/C105-E148del；S262N/C105-T147del及S262N/V99-Q144del。
举例的这种变体ADA2多肽是如SEQ ID NO:589-594、602-606、634-658、664-681、918-931任一所示或者其催化活性部分。
iii.PRB结构域与ADA2的其它区域之间具有改变的相互作用的氨基酸置换
在其它实例中，本发明还提供了修饰的ADA2多肽，其含有赋予在PRB结构域与ADA2剩余部分(例如腺苷脱氨酶(ADA)结构域)之间改变的相互作用的氨基酸置换。例如，根据报道的ADA2的结构域组构，PRB结构域相应于SEQ ID NO:5所示成熟ADA2的残基98-156或105-148。本发明提供了变体ADA2多肽，参照SEQ ID NO:5所示氨基酸残基，其在相应于根据成熟编号的氨基酸残基109、118、119、124、133、139、183、191或224的氨基酸位置含有一或多个氨基酸置换。例如，氨基酸置换可以是参照SEQ ID NO:5所示氨基酸残基，在相应于氨基酸残基F109、R118、F119、P124、W133、Y139、F183、Y191或Y224的氨基酸位置。在每个位置的修饰或其组合可以改变PRB结构域与ADA2中其它结构域如ADA结构域之间的相互作用。
例如，本发明提供了变体ADA2多肽，其在ADA2多肽中含有一或多个氨基酸置换，参照SEQ ID NO:5所示氨基酸残基，所述置换是如下根据成熟编号的任一或多个：F109S、F109A、R118D、R118A、F119S、F119K、P124A、P124S、W133S、W133T、Y139T、Y139A、F183K、Y191S、Y191D、Y224R或Y224N。
本发明还提供了变体ADA2多肽，其含有赋予改变的PRB结构域与ADA2剩余部分之间的相互作用的氨基酸置换，组合本发明提供的其它缺失、插入、取代和/或氨基酸置换。例如，本发明提供了变体ADA2多肽，其与不含有所述修饰的参考ADA2多肽(即未修饰的ADA2)相比含有2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸置换。变体ADA2多肽可含有如上提供的任两或更多个氨基酸置换，只要所得ADA2变体呈现或保留腺苷脱氨酶活性即可。所述两或更多个氨基酸置换可以赋予相同的改变的活性或者不同的改变的活性。例如，一个氨基酸置换可赋予PRB结构域与ADA结构域之间改变的相互作用，另一个可赋予增加的腺苷脱氨酶活性。因此，所得ADA2多肽变体呈现两或更多种改变的活性或性质。
例如，本发明提供了变体ADA2多肽，参照SEQ ID NO:5所示氨基酸残基，其含有如下根据成熟编号的氨基酸置换：Y191D/Y224R、R219Q/S262N/F119S、R219Q/S262N/F119K、R219Q/S262N/Y224R、R219Q/S262N/Y224N、R219Q/S262N/Y191S、R219Q/S262N/Y191D、R219Q/S262N/F183K、R219Q/S262N/Y191D/Y224R、R219Q/S262N/F109S、R219Q/S262N/F109A、R219Q/S262N/R118D、R219Q/S262N/R118A、R219Q/S262N/Y139T、R219Q/S262N/Y139A、R219Q/S262N/W133S、R219Q/S262N/W133T、R219Q/S262N/P124A或者R219Q/S262N/P124S。
举例的这种变体ADA2多肽是如SEQ ID NO:561-578或616-633任一所示或者其催化活性部分。
iv.高糖基化
本发明提供的变体ADA2包括与未修饰的ADA2相比已经通过改变糖基化水平和/或类型而被修饰的那些变体ADA2。与未修饰的ADA2多肽相比，糖基化可以增加或降低。在一些情况中，糖基化的水平或程度是增加的，导致高糖基化的ADA2多肽或蛋白质。这可以通过例如在碳水化合物与之连接的未修饰的ADA2多肽或蛋白质中掺入未发现的至少一个非天然糖基化位点而实现。高糖基化的ADA2多肽也可以通过在未修饰的ADA2多肽中发现但是未糖基化的至少一个天然糖基化位点连接碳水化合物部分而产生。
本发明提供的变体ADA2蛋白可含有改变的如新的O-连接的糖基化、N-连接的糖基化或者O-连接的与N-连接的糖基化。在一些实例中，变体ADA2包含1、2、3、4、5或更多个碳水化合物部分，每个部分连接不同的糖基化位点。糖基化位点可以是天然糖基化位点和/或非天然糖基化位点。在一些实例中，变体ADA2在一个以上非天然糖基化位点是糖基化的。例如，变体ADA2可以被修饰以导入1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或者更多个非天然糖基化位点。
非天然糖基化位点可以通过氨基酸置换导入。O-糖基化位点可以通过例如用丝氨酸或苏氨酸置换天然残基的氨基酸置换而产生。N-连接的糖基化位点可以通过产生基序Asn-Xaa-Ser/Thr/Cys而产生，其中Xaa不是脯氨酸。通过氨基酸修饰产生这个共有序列可以包含用天冬酰胺置换天然氨基酸残基、用丝氨酸、苏氨酸或半胱氨酸置换天然氨基酸残基、或者用天冬酰胺置换天然氨基酸残基及用丝氨酸、苏氨酸或半胱氨酸氨基酸置换天然残基。非天然糖基化位点可以在ADA2多肽的任何区域中产生。糖基化水平(例如导入的非天然糖基化位点的数目)与相应形式的未修饰的或野生型ADA2的糖基化水平相比可以增加至少大约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％或更多。
举例的本发明提供的修饰包括通过一或多个氨基酸置换修饰导入非天然糖基化位点，参照SEQ ID NO:5所示位置，所述置换包括但不限于如下根据成熟编号所示位置的置换：在相应于位置20的位置用N置换及在相应于位置22的位置用S置换；在相应于位置371的位置用N置换及在相应于位置373的位置用S置换；在相应于位置372的位置用N置换及在相应于位置374的位置用S置换；在相应于位置403的位置用N置换及在相应于位置405的位置用S置换；及在相应于位置404的位置用N置换及在相应于位置406的位置用S置换。例如，参照SEQ ID NO:5所示氨基酸残基，导入非天然糖基化位点的氨基酸置换可包括：根据成熟编号的R20N/V22S、K371N/D373S、K372N/I374S、T403N/H405S或者G404N/P406S。
在其它实例中，本发明提供的修饰包括通过在PRB结构域中或附近用一或多个氨基酸置换修饰而导入非天然糖基化位点。举例的本发明提供的修饰包括通过用一或多个氨基酸置换修饰导入非天然糖基化位点，包括但非限于如下参照SEQ ID NO:5所示位置根据成熟编号的置换：在相应于位置125的位置用N置换及在相应于位置126的位置用A置换；在相应于位置127的位置用N置换及在相应于位置129的位置用S置换；在相应于位置126的位置用N置换及在相应于位置128的位置用T置换；在相应于位置112的位置用N置换及在相应于位置114的位置用T置换；在相应于位置134的位置用N置换、在相应于位置135的位置用C置换及在相应于位置136的位置用T置换；在相应于位置134的位置用N置换、在相应于位置135的位置用S置换及在相应于位置136的位置用T置换；在相应于位置142的位置用N置换及在相应于位置144的位置用S置换；在相应于位置137的位置用N置换及在相应于位置139的位置用T置换；在相应于位置111的位置用N置换及在相应于位置113的位置用S置换。例如，在PRB结构域中或附近导入非天然糖基化位点的氨基酸置换可包括参照SEQ ID NO:5所示氨基酸残基根据成熟编号的R125N/P126A、S127N/K129S、P126N/E128T、R112N/I114T、I134N/L135C/L136T、I134N/L135S/L136T、R142N/Q144S、E137N/Y139T或P111N/G113S。
在其它实例中，本发明提供了修饰的ADA2多肽，其在N末端或C末端含有添加(即插入)一或多个连续残基。这种置换可导入非天然糖基化位点。修饰的ADA2多肽可在N末端或C末端的一端或两端含有插入直至或大约或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个氨基酸残基。例如，添加或插入氨基酸可在编码的蛋白质中提供改变的糖基化位点。举例的修饰是参照SEQ ID NO:5所示氨基酸位置根据成熟编号在N末端插入--→N1/--→A2/--→S3。
举例的这种变体ADA2多肽是如SEQ ID NO:274-279和552-560任一所示。
本发明还提供了变体ADA2多肽，其包含导入非天然糖基化位点的一或多个氨基酸置换，组合本发明提供的其它缺失、插入、取代和/或氨基酸置换。例如，本发明提供了变体ADA2多肽，其与不含有所述修饰的参考ADA2多肽(即未修饰的ADA2)相比含有2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸置换。变体ADA2多肽可含有任两或更多个上述提供的氨基酸置换，只要所得ADA2变体呈现或保留腺苷脱氨酶活性即可。所述两或更多个氨基酸置换可赋予相同的改变的活性或者不同的改变的活性。例如，一或多个氨基酸置换可导入非天然糖基化位点，另一(些)氨基酸置换可赋予增加的腺苷脱氨酶活性。因此，所得ADA2多肽变体呈现两或更多种改变的活性或性质。
例如，本发明提供了变体ADA2多肽，其参照SEQ ID NO:5所示氨基酸残基，含有根据成熟编号的氨基酸置换R219Q/S262N/--→N1/--→A2/--→S3、R219Q/S262N/R20N/V22S、R219Q/S262N/K371N/D373S、R219Q/S262N/K372N/I374S、R219Q/S262N/T403N/H405S、R219Q/S262N/G404N/P406S、R219Q/S262N/R125N/P126A、R219Q/S262N/S127N/K129S、R219Q/S262N/P126N/E128T、R219Q/S262N/R112N/I114T、R219Q/S262N/I134N/L135C/L136T、R219Q/S262N/I134N/L135S/L136T、R219Q/S262N/R142N/Q144S、R219Q/S262N/E137N/Y139T或者R219Q/S262N/P111N/G113S。
举例的这种变体ADA2多肽是如SEQ ID NO:596-601或607-615任一所示或者其催化活性部分。
b.核酸分子
本发明还提供了编码本发明提供的任何变体ADA2多肽的核酸分子。编码本发明提供的任何变体ADA2多肽的修饰的核酸分子包含相应于本发明提供的修饰的密码子改变(例如置换或取代、插入或添加、或者缺失一或多个核苷酸)。本领域技术人员熟知相应于各个氨基酸的密码子，可以基于本文举例的修饰的氨基酸鉴别这种密码子改变。在特别的实例中，核酸序列可以是密码子优化的，例如以增加编码序列的表达水平。特定的密码子使用依赖于修饰的多肽在其中表达的宿主生物体。本领域技术人员熟知为了在哺乳动物或人细胞、细菌或酵母包括例如大肠杆菌(Escherichia coli)或酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)中表达的最佳密码子。例如，密码子使用信息可得自在kazusa.or.jp.codon可获得的Codon Usage Database(见例如Richmond(2000)Genome Biology,1:241关于数据库的描述)。也见Forsburg(2004)Yeast,10:1045-1047；Brown et al.(1991)Nucleic AcidsResearch,19:4298；Sharp et al.(1988)Nucleic Acids Res.,12:8207-8211；Sharp etal.(1991)Yeast,657-78)。本发明提供了含有核酸分子以表达和产生ADA2多肽的载体。
c.变体ADA2蛋白的产生
本发明提供的变体ADA2多肽及编码核酸可以通过本领域已知的标准重组DNA技术产生。可以使用本领域已知的在靶蛋白质中导致任一或多个氨基酸突变的任何方法。所述方法包括对编码核酸分子的标准定向诱变或者随机诱变方法，或者固相多肽合成方法。特别地，可以使用完全化学合成方法，包括肽合成随后肽连接。可以对编码ADA2多肽的核酸分子进行诱变，如编码核酸的随机诱变、易错PCR、定向诱变(使用例如试剂盒，如得自Stratagene的QuikChange试剂盒)、重叠PCR、基因改组，或者其它重组方法。编码多肽的核酸随后可以导入宿主细胞以异源表达。在一些实例中，变体ADA2多肽是合成产生的，如使用完全化学合成、固相或者溶液相肽合成。
举例的产生和表达编码ADA2多肽、包括任何变体ADA2多肽的核酸分子的方法在章节E中描述。根据变体ADA2分子是如何产生的或者特定的修饰性质，本发明提供的变体ADA2多肽可以作为单体、二聚体或者其它多聚体产生。例如，变体ADA2是异源二聚体或者同源二聚体。
特别地，ADA2通常以同源二聚体存在，其由两个相同的多肽链组成。如上所述，两个相同多肽亚基的残基之间的非极性相互作用在ADA2从细胞中分泌时介导同源二聚体的形成。由于野生型ADA2是同源二聚体，因此应理解提及参考或未修饰的ADA2多肽的氨基酸序列时是指单一ADA2多肽亚基的氨基酸序列。变体ADA2可含有一或多个ADA2多肽亚基，其是相同(即同源二聚体)或不同的(即异源二聚体)。例如，变体ADA2同源二聚体易于由编码变体ADA2多肽的核酸分子转化的细胞产生和分泌，如编码具有SEQ ID NO:13-63、71-285或552-931任一所示氨基酸序列的多肽或者其催化活性片段的核酸。如果细胞由两或更多个不同核酸分子编码，所述核酸分子均编码不同的ADA2多肽，则可以产生异源二聚体。
在一个实例中，本发明提供的变体ADA2多肽是二聚体。例如，所得变体ADA2多肽是同源二聚体，其含有相同的第一和第二多肽亚基，即每个亚基相对于参考或未修饰的ADA2多肽的氨基酸序列都具有含有相同修饰的相同氨基酸序列。同源二聚体可以通过将编码变体多肽的核酸分子转化进细胞中而形成，当分泌时导致两个变体多肽亚基的残基之间的非极性相互作用以介导二聚体形成。
在另一实例中，所得ADA2多肽是异源二聚体，其含有不同的第一和第二多肽亚基。在这个实例中，第一和第二多肽亚基之一或二者含有相对于参考或未修饰的ADA2多肽的氨基酸序列具有修饰的氨基酸序列。在一些情况中，第一和第二多肽亚基均可以含有与参考或未修饰的ADA2多肽相比具有修饰的氨基酸序列，但是修饰的性质是不同的。异源二聚体可以通过将编码第一变体多肽亚基的第一核酸分子和编码第二不同多肽亚基的第二核酸分子转化进细胞中而形成。第二核酸分子可以编码具有参考或野生型ADA2的氨基酸序列的多肽亚基，或者可以编码含有相对于参考或未修饰的ADA2的氨基酸序列具有修饰的氨基酸序列的变体多肽亚基。作为两个多肽亚基残基之间的非极性相互作用介导二聚体形成的结果，异源二聚体在从细胞中表达和分泌时产生。在这种过程中，通常形成包括同源二聚体和异源二聚体的二聚体分子的混合物。为了产生异源二聚体，可以需要另外的纯化步骤。例如，第一和第二多肽可以工程化为包含一个具有金属螯合物或者其它表位的标签，其中所述标签是不同的。被标签的结构域可用于通过金属螯合层析和/或通过抗体快速纯化，使得可以通过western印迹、免疫沉淀或者在生物测定中的活性耗竭/阻断而检测。
在其它实例中，变体ADA2多肽是单体。单体可以通过参与蛋白质二聚体化的一或多个残基的突变而产生，只要保留腺苷脱氨酶活性即可。参照SEQ ID NO:5所示氨基酸残基，举例的可以靶向诱变的残基包括但不限于氨基酸残基1、4、5、8、9、11、12、15、344、362或366。残基可以在此位置由其它19个氨基酸之一置换。本领域技术人员可以产生并评定多肽的单体形成。例如，通过大小排阻层析(SEC)可以评定单体形成及纯化单体。腺苷脱氨酶活性也可以例如使用本文所述或本领域已知的任何测定法评定。
在一些实例中，变体ADA2的二聚体或其它多聚体分子可以通过编码的变体ADA2多肽与其自身能相互作用形成稳定结构的任何部分或者其它多肽缀合或者融合而形成。例如，其中至少一个是变体ADA2多肽的单独编码的ADA2多肽，可以通过多聚体化结合，其中多肽的多聚体化由多聚体化结构域介导。变体ADA2二聚体或多聚体可以通过产生嵌合分子而形成，其中变体ADA2与多聚体化结构域直接或者间接连接。编码变体ADA2的核酸分子可以与编码多聚体化结构域的核酸结合(直接或间接)。例如，本发明提供的变体ADA2二聚体可以含有与多聚体化结构域直接或者通过接头间接连接的第一ADA2多肽亚基及与多聚体化结构域直接或者通过接头间接连接的第二ADA2多肽亚基，其中第一和第二多肽之一或二者是变体ADA2多肽。第一和第二ADA2多肽可以是相同或不同的。举例的多聚体化结构域是Fc结构域，其在下文进一步描述。
同源或异源多聚体多肽可以产生自共表达编码ADA2多肽的单独的核酸分子。嵌合ADA2多肽可易于由用合适的核酸分子转化的细胞如哺乳动物细胞产生和分泌。例如，细胞可以用编码变体ADA2的第一核酸分子及编码相同或不同ADA2的第二核酸分子转化。第二核酸分子可编码含有参考或野生型ADA2的氨基酸序列的多肽亚基，或者可编码含有相对于参考或未修饰的ADA2的氨基酸序列具有修饰的氨基酸序列的变体多肽亚基。分泌形式的ADA2多肽包括其中变体ADA2是第一编码的变体ADA2多肽的同源二聚体、第二编码的ADA2多肽如野生型或第二变体ADA2多肽的同源二聚体及含有不同的两个多肽亚基的ADA2异源二聚体的那些。在一些情况中，可以形成较高等级的多聚体。
多聚体化结构域为本领域技术人员熟知。通常，多聚体化结构域包括能形成稳定的蛋白质-蛋白质相互作用的任何结构域。多聚体化结构域可以通过免疫球蛋白序列(例如Fc结构域，见例如国际专利公开WO 93/10151和WO 2005/063816，美国专利公开号2006/0024298，美国专利号5,457,035)、亮氨酸拉链(例如来自核转化蛋白fos和jun或者原癌基因c-myc或者来自General Control of Nitrogen(GCN4))、疏水区、亲水区或者在同源或异源多聚体的嵌合分子之间形成分子间二硫键的游离硫醇相互作用。此外，多聚体化结构域可包含与包含空洞的氨基酸序列具有突出互补的氨基酸序列，例如在美国专利号5,731,168、国际专利公开WO 98/50431和WO 2005/063816；Ridgway et al.(1996)ProteinEngineering,9:617-621中描述。这种多聚体化区域可以工程化，由此空间相互作用不仅促进稳定的相互作用，而且还进一步促进从嵌合单体混合物中形成超过同源二聚体的异源二聚体。通常，突出是通过用较大侧链(例如酪氨酸或色氨酸)置换第一多肽界面的小氨基酸侧链而构建。通过用较小的氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)置换大氨基酸侧链，在第二多肽界面上任选产生与所述突出相同或相似大小的互补腔洞。
ADA2多肽，如本发明提供的任何变体ADA2多肽，可以在任何地方但典型是通过其N末端或C末端与多聚体化结构域的N末端或C末端连接以形成嵌合多肽。所述连接可以是直接连接或者通过接头间接连接。而且，嵌合多肽也可以是融合蛋白或者可以通过化学连接形成，如通过共价或非共价相互作用。例如，当制备含有多聚体化结构域的嵌合多肽时，编码ADA2多肽的核酸可以与编码多聚体化结构域序列的核酸可操纵地连接，直接或者间接或任选通过接头结构域连接。该构建体可编码嵌合蛋白，其中ADA2多肽的C末端与多聚体化结构域的N末端连接。在一些情况中，构建体可编码嵌合蛋白，其中ADA2多肽的N末端与多聚体化结构域的N或C末端连接。
在其中多聚体化结构域是多肽的实例中，将编码ADA2-多聚体化结构域嵌合多肽的基因融合体插入合适的表达载体中。所得ADA2多聚体化结构域嵌合蛋白可以在用该重组表达载体转化的宿主细胞中表达，使得装配为多聚体，其中多聚体化结构域相互作用形成多价多肽。多聚体化结构域与ADA2多肽的化学键连也可以使用异源双功能接头实现。
所得嵌合多肽及从中形成的多聚体可以通过任何合适方法纯化，例如通过经过蛋白质A或蛋白质G柱的亲和性层析纯化。在编码不同ADA2嵌合多肽的两个核酸分子转化进细胞中时，形成同源和异源二聚体。可以调整表达条件，以便异源二聚体形成超过同源二聚体形成。例如，对于Fc多聚体化结构域的通过二硫键相互作用形成的多聚体，在有利于破坏链间二硫键但不影响链内二硫键的条件下可以减少同源二聚体。或者，这种类型异源二聚体的形成可以通过遗传工程化及使用促进异源二聚体形成的多聚体化结构域表达ADA2融合分子而偏向，如使用c-jun和c-fos亮氨酸拉链组合。由于亮氨酸拉链主要形成异源二聚体，因此当需要时其可用于驱动异源二聚体的形成。ADA2多肽含有Fc区或者其它多聚体化结构域也可以工程化以包含标签以允许纯化希望的异源二聚体。核癌基因fos和jun的产物含有优先形成异源二聚体的亮氨酸拉链结构域(O’Shea et al.(1989)Science,245:646；Turner and Tijian(1989)Science,243:1689)。例如，人转录因子c-jun和c-fos的亮氨酸拉链结构域已经示出形成具有1:1化学计量的稳定的异源二聚体(见例如Busch andSassone-Corsi(1990)Trends Genetics,6:36-40；Gentz et al.(1989)Science,243:1695-1699)。尽管也已经示出形成jun-jun同源二聚体，但是其比jun-fos异源二聚体的稳定性低大约1000倍。
D.ADA2缀合物及融合蛋白
包括本发明提供的任何ADA2分子均可以与一或多个异源部分直接或者间接缀合。ADA2可以是野生型ADA2，包括等位基因变体和种变体，或者可以是上文章节C.2所述任何变体。缀合物中的ADA2分子可以是单体或二聚体，例如异源二聚体或者同源二聚体。典型地，缀合物中的ADA2是同源二聚体。异源部分可以缀合于二聚体的一或两个多肽亚基。
例如，ADA2可以是含有具有SEQ ID NO:5或326-336、338-342、375或380-383任一所示氨基酸序列或者与SEQ ID NO:5或326-336、338-342、375或380-383任一呈现至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列相同性的氨基酸序列或者其催化活性片段的多肽的任何ADA2。在一个实例中，本发明提供的缀合物中的ADA2可包括具有SEQ ID NO:5或326-336、338-342、375或380-383任一所示氨基酸序列的多肽或者其催化活性片段，如SEQ ID NO:5、326-334、340、375或380-383任一所示或其催化活性片段。例如，本发明提供的缀合物中的ADA2可包括具有SEQ IDNO:5所示氨基酸序列的多肽或者其催化活性部分。所述催化活性部分可以是缺少全部或部分PRB结构域的多肽，如SEQ ID NO:548-550或579任一所示的那些。
在本发明提供的缀合物的其它实例中，缀合物含有变体ADA2多肽，如本文所述任何多肽。例如，本发明提供的缀合物可以是含有SEQ ID NO:13-63、71-285或552-931任一所示变体多肽的ADA2。
异源部分可包括蛋白质或多肽部分或者非多肽部分。例如，异源部分可以是但不限于肽、小分子、核酸、碳水化合物和聚合物。异源部分可以与ADA2蛋白质分子直接或者间接连接。例如，异源部分可以是蛋白质或多肽部分，其与ADA2多肽可以直接或者间接缀合，或者作为直接或者间接融合的融合蛋白产生。在其它情况中，异源部分是与ADA2分子缀合的非肽部分。
ADA2蛋白可以与一或多个异源部分缀合，如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个异源部分。异源部分可以是异源多肽部分，或者异源非多肽部分，或者这二者。在其它实例中，异源部分可包括异源多肽与非多肽部分的组合。在一些实例中，所有异源部分均是相同的。在一些实例中，至少一个异源部分与其它异源部分不同。在一些实例中，本发明提供的任何ADA2均可以与2、3或3个以上的异源部分串联缀合。在其它实例中，本发明提供的任何ADA2可以与2、3或3个以上的异源部分缀合，其中至少一个另外的部分插入两个异源部分之间(例如ADA2多肽、接头、蛋白酶裂解底物、自杀性(self-immolative)间隔区或者其组合)。
与异源部分缀合与未与异源部分缀合的ADA2分子相比可赋予有益性质。举例的异源部分是增加分子的体内半衰期的部分。由异源部分提供的其它举例的有益性质例如包括但不限于增加哺乳动物表达系统中蛋白质表达、改良的生物物理性质如稳定性和溶解性、改良的蛋白质纯化和检测、观测和定位和/或增加的酶活性。例如，异源部分可以是促进含有异源部分的ADA2蛋白质分子或者其片段的检测、观测或定位的部分。任何ADA2或其片段的检测、观测和/或定位可以在体内、体外、离体或者组合进行。
在一些情况中，当与ADA2或其片段缀合时，异源部分增加ADA2或者其片段的稳定性。例如，异源部分的存在与不存在异源部分的物理性质相比可以维持ADA2应答环境条件(例如升高的温度或者低或高pH条件)的一或多种物理性质。在一些实例中，所述物理性质可包括维持ADA2的共价结构(例如不存在蛋白酶解、不希望的氧化或者脱酰胺化)。在其它实例中，所述物理性质可以是维持正确的折叠(例如不存在可溶或不溶的聚集物或沉淀)。任何ADA2或者ADA2缀合物的稳定性可以通过测定蛋白质的生物物理性质测量，例如热稳定性、pH解折叠模式、稳定除去糖基化、溶解性、生物化学功能(例如腺苷脱氨酶活性或者肝素结合活性)和/或其组合。稳定性可以使用本领域已知的方法测量，如HPLC(高效液相层析)、SEC(大小排阻层析)、DLS(动态光散射)。测量热稳定性的方法包括但不限于差示扫描量热法(DSC)、差示扫描荧光测定法(DSF)、圆二色性(CD)及热攻击测定。举例的评定任何ADA2或缀合物的稳定性的方法在下文章节F中描述。
在一些实例中，当与ADA2或其片段缀合时，异源部分的存在与不含有所述异源部分的ADA2蛋白质(即游离或者非缀合的ADA2)相比降低或者减弱ADA2与肝素及其它糖胺聚糖(GAG)的结合。例如，本发明提供的ADA2缀合物包括呈现出不超过不含有所述异源部分的ADA2蛋白质(即游离或者非缀合的ADA2)的肝素结合的1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的那些。例如，本发明示出聚乙二醇化的ADA2与相应非聚乙二醇化的ADA2相比呈现出降低的肝素结合(见例如实施例8)。典型地，当ADA2是二聚体形式形式及ADA2缀合物是二聚体时呈现肝素结合。也应理解缀合的与非缀合形式之间结合的对比是在相同或者基本相同条件下评定的。特别地，在缀合物中存在异源部分的条件下结合降低可以是由于空间阻碍和/或表面上静电电荷的改变所致。
在本发明提供的缀合物的实例中，异源部分改良ADA2的一或多种性质(例如半衰期)，而基本上不影响ADA2蛋白质的生物活性或者功能(例如腺苷脱氨酶活性)。例如，本发明提供的ADA2缀合物与不含有所述异源部分的ADA2蛋白质(即游离或者非缀合的ADA2)相比呈现出大约50％-500％如大约50％-400％、50％-300％、50％-200％、50％-150％、50％-100％、50％-80％、80％-400％、80％-300％、80％-200％、80％-150％、80％-100％、100％-400％、100％-300％、100％-200％或100％-150％的腺苷脱氨酶活性。例如，ADA2缀合物与不含有所述异源部分的ADA2多肽(即游离或者非缀合的ADA2)相比可以呈现至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％、200％、210％、220％、230％、240％、250％、260％、270％、280％、290％、300％、350％、400％、450％、500％或更多的腺苷脱氨酶活性。在一些情况中，本发明提供的ADA2缀合物与不含有所述异源部分的ADA2多肽(即游离或者非缀合的ADA2)相比呈现出增加的或改良的腺苷脱氨酶活性，如高于100％或更高的腺苷脱氨酶活性。典型地，腺苷脱氨酶活性是当ADA2是二聚体形式及ADA2缀合物是二聚体时呈现。也应理解缀合的与非缀合形式之间腺苷结合的对比是在相同或者基本相同条件下评定的。
1.半衰期延长部分
异源部分的非限制性实例包括当与ADA2分子缀合或者连接(直接或间接)时与游离或者非缀合的ADA2相比，赋予体内和/或体外半衰期增加的任何部分。本发明提供的任何ADA2的半衰期可以通过本领域技术人员已知和/或本文描述的任何方法确定，例如腺苷脱氨酶活性测定。举例的这种半衰期延长部分在下文描述。
例如，异源部分是具有与当与ADA2缀合时延长体内半衰期有关的非结构或结构特性的肽和多肽。非限制性实例包括白蛋白、白蛋白片段、免疫球蛋白的Fc片段、人绒毛膜促性腺激素的β亚基的C末端肽(CTP)的β亚基、HAP序列、XTEN序列、运铁蛋白或其片段、PAS多肽、聚甘氨酸接头、聚丝氨酸接头、白蛋白结合部分、基于非天然氨基酸的缀合或者半衰期延长，或者这些多肽的任何片段、衍生物、变体或者组合。
异源部分可以是半衰期延长部分，即与缺少这种异源部分的ADA2的体内半衰期相比增加本发明提供的任何ADA2的体内半衰期的异源部分。本发明提供的任何ADA2的体内半衰期可以通过本领域技术人员已知和/或本文描述的任何方法确定，例如腺苷脱氨酶活性测定。
可以与本发明提供的任何ADA2直接或间接缀合的半衰期延长部分例如包括：生物相容的脂肪酸及其衍生物、羟烷基淀粉(HAS)(例如羟乙基淀粉(HES))、聚乙二醇(PEG)、聚(Glyx-Sery)n、高氨基酸聚合物(HAP)、透明质酸(HA)、肝素糖聚合物(HEP)、基于磷酸胆碱的聚合物(PC聚合物)、Fleximers、葡聚糖、多唾液酸(PSA)、Fc结构域、运铁蛋白、白蛋白、弹性蛋白样肽、XTEN序列、白蛋白结合肽、CTP肽、非天然氨基酸或者非天然氨基酸缀合物，及其任意组合。
在一些实例中，当与ADA2或其片段缀合时，存在一或多个半衰期延长部分使得本发明提供的任何ADA2的半衰期与缺少这种一或多个半衰期延长部分的ADA2(即游离或非缀合的ADA2)的半衰期相比是增加的。例如，本发明提供的ADA2缀合物呈现出半衰期与不含有所述异源部分的ADA2多肽(即游离或非缀合的ADA2)的半衰期相比是至少大约110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％、200％、225％、250％、300％、350％、400％、450％、500％、600％、700％、800％或更长，或者与不含有所述异源部分的ADA2多肽(即游离或非缀合的ADA2)的半衰期相比是900％、1000％、1100％、1200％、1300％、1400％、1500％、1600％、1700％、1800％、1900％、2000％、3000％、4000％、5000％、6000％、7000％、8000％、9000％、10000％或更长。在一些实例中，本发明提供的与半衰期延长部分直接或间接连接的任何ADA2缀合物的半衰期呈现出半衰期是缺少这种半衰期延长部分的相应ADA2的半衰期的大约1.5倍-大约20倍、大约1.5倍-大约15倍、大约1.5倍-大约10倍、大约2倍-大约10倍、大约2倍-大约9倍、大约2倍-大约8倍、大约2倍-大约7倍、大约2倍-大约6倍、大约2倍-大约5倍、大约2倍-大约4倍、大约2倍-大约3倍、大约2.5倍-大约10倍、大约2.5倍-大约9倍、大约2.5倍-大约8倍、大约2.5倍-大约7倍、大约2.5倍-大约6倍、大约2.5倍-大约5倍、大约2.5倍-大约4倍、大约2.5倍-大约3倍、大约3倍-大约10倍、大约3倍-大约9倍、大约3倍-大约8倍、大约3倍-大约7倍、大约3倍-大约6倍、大约3倍-大约5倍、大约3倍-大约4倍、大约4倍-大约6倍、大约5倍-大约7倍或者大约6倍-大约8倍。典型地，体内活性的半衰期是当ADA2是二聚体形式及ADA2缀合物是二聚体时呈现的。也应理解缀合与非缀合形式之间半衰期对比是在相同或基本相同条件下评定的。
在一些实例中，本发明提供的与半衰期延长部分直接或间接连接的任何ADA2缀合物的半衰期可以是或是至少或是至少大约10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时、24小时、25小时、26小时、27小时、28小时、29小时、30小时、32小时、34小时、36小时、38小时、40小时、42小时、46小时、48小时、50小时、55小时、60小时、65小时、70小时、75小时、80小时或更长。例如，本发明提供的任何ADA2缀合物的半衰期可以是10-60小时，如12-48小时或者13-36小时。例如，实施例9示出ADA2缀合物是聚乙二醇化ADA2时呈现的半衰期是大约12-14小时，聚乙二醇化变体ADA2分子(例如R20E或K371D)呈现甚至更长的半衰期，为大约16-24小时。实施例14示出其它聚乙二醇化变体ADA2分子(例如R219Q/S262N)呈现甚至更长的半衰期，为大约39-47小时。
如下章节描述了举例的在本发明提供的ADA2缀合物中的半衰期延长部分。
a.低复杂度多肽
本发明提供的ADA2缀合物可包括与至少一种异源部分直接或间接连接的ADA2，所述异源部分是具有低组成和/或结构复杂性的多肽(例如在生理条件下在溶液中无二级或三级结构的无序多肽)。在一个实例中，低复杂度多肽序列是由无结构的亲水性氨基酸聚合物组成。低复杂度多肽在例如如果对蛋白质进行高温或严格条件处理如HPLC纯化时可以提供有益性质。
b.人绒毛膜促性腺激素的β亚基的C末端肽(CTP)
本发明提供的ADA2缀合物可包括与异源部分直接或间接连接的ADA2，所述异源部分包括一种人绒毛膜促性腺激素的β亚基的C末端肽(CTP)，或者其片段、变体或衍生物。已知在重组蛋白质中插入一或多个CTP肽可以增加该蛋白的体内半衰期(见例如美国专利号5,712,122)。举例的CTP肽包括DPRFQDSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPIL(SEQ ID NO:303)或者SSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ.(SEQ ID NO:304)(见例如美国专利公开号US 2009/0087411)。
c.免疫球蛋白恒定区(Fc)或其部分
本发明提供的ADA2缀合物可包括与Fc结构域或其变体直接或间接连接的ADA2。Fc结构域、片段、变体和衍生物为本领域技术人员已知，在例如美国专利号5,457,035、美国专利公开号US 2006/0024298、国际PCT公开WO 2011/069164、WO 2012/006623、WO 2012/006635或WO2012/006633中描述，所述专利以其全文并入本文作参考。已经描述了含有与抗体衍生多肽的各个部分(包括Fc结构域)融合的多肽的融合蛋白质的制备，见例如Ashkenazi et al.(1991)PNAS 88:10535；Byrn et al.(1990)Nature,344:667和Hollenbaugh and Aruffo,(2002)“Construction of Immunoglobulin FusionProteins,”in Current Protocols in Immunology,Ch.10,pp.10.19.1-10.19.11所述。
Fc区具有以CH(恒定重链)结构域(CHI、CH2、CH3(任选CH4))表示的结构域。根据同种型(即IgG、IgM、IgA、IgD或IgE)，Fc区可具有三个或四个CH结构域。一些同种型(例如IgG)Fc区还含有铰链区(见Janeway et al.2001,Immunobiology,Garland Publishing,N.Y.,N.Y)。在人中，有五种抗体同种型，基于其重链分为delta(δ)、gamma(γ)、mu(μ)、alpha(α)及epsilon(ε)，分别产生IgD、IgG、IgM、IgA和IgE类别抗体。IgA和IgG类别含有亚类IgA1、IgA2、IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。免疫球蛋白重链之间的序列差异导致各种同种型在例如C结构域数目、铰链区的存在及链间二硫键的数目和位置的不同。例如，IgM和IgE重链含有额外的C结构域(CH4)，其代替铰链区。IgG、IgD和IgA的Fc区通过其Cγ3、Cδ3和Cα3结构域彼此配对，而IgM和IgE的Fc区通过其Cμ4和Cε4结构域二聚体化。IgM和IgA形成分别具有10个和4个抗原结合位点的多聚体结构。
Fc区为本领域技术人员已知，任何Fc区均可用于本发明提供的缀合物中，只要所得缀合物保留腺苷脱氨酶活性即可。产生本发明提供的任何ADA2的Fc区或其一部分可以得自许多不同来源。在一些实例中，Fc区或其一部分衍生自人免疫球蛋白。Fc区或其一部分也可以衍生自另一哺乳动物物种的免疫球蛋白，包括例如啮齿动物(例如小鼠、大鼠、兔、豚鼠)或者非人灵长类动物(例如黑猩猩、恒河猴)物种。此外，Fc区或其一部分可以衍生自任何免疫球蛋白类别，包括IgG(包括人亚类IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)、IgA(包括人亚类IgA1和IgA2)、IgD、IgE和IgM。在一个实例中，使用人同种型IgG1。本发明提供的与免疫球蛋白Fc区缀合的ADA2可赋予一些希望的性质，包括增加的稳定性、增加的血清半衰期(见Capon etal.(1989)Nature 337:525)以及结合Fc受体如新生儿Fc受体(FcRn)(美国专利号6,086,875、6,485,726、6,030,613；WO 03/077834；US 2003/0235536，所述专利均以其全文并入本文作参考)。在其它实例中，在由Fc-Fc受体(FcR)相互作用介导的效应功能要被最小化时，考虑与补体或效应细胞募集不足的IgG同种型如IgG2或IgG4的Fc的融合。进一步地，可以使用接头将Fc与另一多肽共价连接产生Fc嵌合体。
人IgG亚型的重链恒定区序列例如SEQ ID NO:355(IgG1)、SEQ ID NO:356(IgG2)、SEQ ID NO:357(IgG3)和SEQ ID NO:358(IgG4)示出。例如，对于举例的SEQ ID NO:355所示重链恒定区，CH1结构域相应于氨基酸1-98，铰链区相应于氨基酸99-110，CH2结构域相应于氨基酸111-223，及CH3结构域相应于氨基酸224-330。
在本发明也考虑修饰的Fc结构域用于与本发明提供的任何ADA2缀合。在一些实例中，修饰Fc区以使其呈现与FcR改变的结合，导致与野生型免疫球蛋白重链的Fc区的效应功能相比改变的(即更多或更少)效应功能。因此，修饰的Fc结构域可具有改变的Fc受体亲和性，包括但不限于增加或降低或无亲和性。例如，不同的IgG亚类对于Fcγ受体(FcγR)具有不同的亲和性，IgG1和IgG3典型比IgG2和IgG4实质上更好地结合受体。此外，不同的FcγR介导不同的效应功能。FcγR1、FcγRIIa/c和FcγRIIIa是免疫复合物触发的激活的正调节物，特征在于具有基于免疫受体酪氨酸激活基序(ITAM)的细胞内结构域。然而，FcγRIIb具有基于免疫受体酪氨酸抑制基序(ITIM)，因此其是抑制性的。在一些情况中，包含本发明提供的Fc结构域的ADA2缀合物可以修饰为增强与补体蛋白C1q的结合。
在某些实例中，与本发明提供的任何ADA2缀合的Fc区可包含一或多个截短的Fc区，其仍然足以赋予对Fc区的Fc受体(FcR)结合性质。例如，结合FcRn的Fc区的部分(即FcRn结合部分)可包括IgG1的大约氨基酸282-438，主要接触位点是CH2结构域的氨基酸残基248、250-257、272、285、288、290-291、308-311和314及CH3结构域的氨基酸残基385-387、428和433-436(氨基酸编号基于EU编号系统，见Edelman et al.(1969)PNAS63:78-85和Kabat et al.(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,FifthEdition,U.S.Department of Health and Human Services,NIH Publication No.91-3242)。因此，本发明提供的任何ADA2中的Fc区可包含FcRn结合部分。FcRn结合部分可衍生自任何同种型包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的重链。改变Fc区对于受体的亲和性可以调节与Fc结构域相关的效应功能和/或药动学性质。修饰的Fc结构域为本领域技术人员已知及在文献中描述，见例如美国专利号5,457,035、美国专利公开号US 2006/0024298和国际专利公开号WO 2005/063816举例的修饰。
在某些实例中，与本发明提供的任何ADA2缀合的Fc区可包括如下至少之一：铰链(例如上、中和/或下铰链区)结构域(基于EU编号的抗体Fc区的大约氨基酸216-230)、CH2结构域(基于EU编号的抗体Fc区的大约氨基酸231-340)、CH3结构域(基于EU编号的抗体Fc区的大约氨基酸341-438)、CH4结构域，或者其变体、部分或片段。在其它实例中，Fc区可包含完整Fc结构域(即铰链结构域、CH2结构域和CH3结构域)。在一些实例中，Fc区可包括：与CH3结构域(或其一部分)融合的铰链结构域(或其一部分)，与CH2结构域(或其一部分)融合的铰链结构域(或其一部分)，与CH3结构域(或其一部分)融合的CH2结构域(或其一部分)，与铰链结构域(或其一部分)和CH结构域(或其一部分)融合的CH2结构域(或其一部分)。在其它实例中，Fc区缺少至少一部分CH2结构域(例如全部或一部分CH2结构域)。在特别的实例中，Fc区可包括相应于221-447的氨基酸(基于EU编号系统，见Edelman et al.(1969)PNAS 63:78-85和Kabat et al.(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,Fifth Edition,U.S.Department of Health and Human Services,NIH PublicationNo.91-3242)。
与本发明提供的任何ADA2缀合的Fc区可包括例如在如下专利中揭示的一或多个氨基酸位置的修饰(例如氨基酸取代)：国际PCT公开WO88/07089、W096/14339、WO98/05787、W098/23289、W099/51642、W099/58572、WO00/09560、WO00/32767、WO00/42072、WO02/44215、WO02/060919、WO03/074569、WO04/016750、WO04/029207、WO04/035752、WO04/063351、WO04/074455、WO04/099249、WO05/040217、WO04/044859、WO05/070963、WO05/077981、WO05/092925、WO05/123780、WO06/019447、WO06/047350及WO06/085967；美国专利公开号US2007/0231329、US2007/0231329、US2007/0237765、US2007/0237766、US2007/0237767、US2007/0243188、US2007/0248603、US2007/0286859、US2008/0057056；或者美国专利号5,648,260、5,739,277、5,834,250、5,869,046、6,096,871、6,121,022、6,194,551、6,242,195、6,277,375、6,528,624、6,538,124、6,737,056、6,821,505、6,998,253、7,083,784、7,404,956和7,317,091，所述专利以其全文并入本文作参考。在一个实例中，在一或多个揭示的氨基酸位置可以进行特定修饰(例如特定取代本领域揭示的一或多个氨基酸)。在另一实例中，可以在一或多个揭示的氨基酸位置进行不同改变(例如在本领域揭示的一或多个氨基酸位置的不同取代)。
在一些实例中，本发明提供的任何ADA2可以缀合至少一个Fc区形成融合蛋白。典型地，这种融合蛋白保留免疫球蛋白重链恒定区的至少一种功能活性铰链区、CH2和CH3结构域。例如，IgG1的全长Fc序列包括SEQ ID NO:355所示序列的氨基酸99-330。举例的hIgG1的Fc序列如SEQ ID NO:359示出，含有几乎全部铰链序列，CH2和CH3结构域的完整序列在SEQID NO:355中示出。另一举例的Fc多肽是如SEQ ID NO:361所示的Fc多肽。另一举例的Fc多肽在PCT公开号WO 93/10151中示出，其是从人IgG1抗体的N末端铰链区延伸至Fc区的天然C末端的单链多肽(SEQ ID NO:359)。产生连接的精确位置不是关键的：本领域熟知特定位点，且可以选择以优化ADA2蛋白质分子的生物活性、分泌或者结合特性。例如，其它举例的Fc多肽序列在SEQ ID NO:355所示序列的氨基酸C109或P113开始(见例如美国专利公开号2006/0024298)。
与本发明提供的任何ADA2缀合的Fc区也可以含有改变本领域已知嵌合蛋白的糖基化的氨基酸取代。例如，本发明提供的任何ADA2的Fc区可以缀合于具有导致降低的糖基化(例如N-或O-连接的糖基化)的突变的Fc区或者缀合于改变糖型的野生型Fc部分(例如低海藻糖或者无海藻糖聚糖)。
与本发明提供的任何ADA2缀合的Fc区也可以工程化为包含具有金属螯合物或其它表位的标签。被标签的结构域可用于通过金属-螯合物层析和/或通过抗体快速纯化，以使得可以通过western印迹、免疫沉淀或者在生物测定中活性耗竭/阻断而进行检测。
d.白蛋白或其片段或变体
本发明提供的ADA2缀合物可包括与异源部分包括白蛋白或其功能片段直接或间接连接的ADA2。人血清白蛋白(HSA或HA)，全长形式是具有609个氨基酸的蛋白质(示例序列如SEQ ID NO:305所示)，其负责血清渗透压的显著比例及也作为内源和外源配体的运载体发挥功能。白蛋白可以是全长白蛋白或者其功能片段、变体、衍生物或类似物。举例的白蛋白或其片段或变体在美国专利公开号2008/0194481、2008/0004206、2008/0161243、2008/0261877或2008/0153751或者PCT公开号2008/033413、2009/058322或2007/021494中揭示，所述专利以其全文并入本文作参考。
在一些实例中，本发明提供的任何ADA2可包含白蛋白、其片段或变体，其与选自免疫球蛋白恒定区或其部分(例如Fc区)、PAS序列、HES、XTEN序列、PEG或者其任意组合的异源部分进一步连接。
e.白蛋白结合部分
本发明提供的ADA2缀合物可包括与异源部分直接或间接连接的ADA2，所述异源部分是白蛋白结合部分，例如白蛋白结合肽、细菌白蛋白结合结构域、白蛋白结合抗体片段、脂肪酸，或者其任意组合。
例如，白蛋白结合蛋白可以是细菌白蛋白结合蛋白、抗体或者抗体片段包括结构域抗体(见美国专利号6,696,245)。例如，白蛋白结合蛋白可以是细菌白蛋白结合结构域，如一种链球菌蛋白G(Konig,T.and A.Skerra,A.(1998)J Immunol.Methods 218:73-83)。可用于缀合本发明提供的任何ADA2的白蛋白结合肽的其它实例是例如具有Cys-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Cys共有序列(SEQ ID NO:306)的那些，其中Xaa1是Asp、Asn、Ser、Thr或Trp；Xaa2是Asn、Gln、His、Ile、Leu或Lys；Xaa3是Ala、Asp、Phe、Trp或Tyr；及Xaa4是Asp、Gly、Leu、Phe、Ser或Thr(美国专利公开号2003/0069395；Dennis et al.(2002)J.Biol.Chem.277:35035-35043)。
来自链球菌蛋白G的结构域3(Kraulis et al,(1996)FEBS Lett.378:190-194；Linhult et al.(2002)Protein Sci.11:206-213)是细菌白蛋白结合结构域的一个实例。举例的白蛋白结合肽包括具有核心序列DICLPRWGCLW(SEQ ID NO:307)的一系列肽(见例如Dennis et al.(2002)J.Biol.Chem.277:35035-35043)。白蛋白结合肽的其它实例包括：RLIEDICLPRWGCLWEDD(SEQ ID NO:308)、QRLMEDICLPRWGCLWEDDF(SEQ ID NO:309)、QGLIGDICLPRWGCLWGDSVK(SEQ ID NO:310)及GEWWEDICLPRWGCLWEEED(SEQ ID NO:311)。
可以与本发明提供的任何ADA2缀合的白蛋白结合抗体片段的实例包括在Mullerand Kontermann,Curr.Opin.Mol.Ther.(2007)9:319-326；Roovers et al.(2007),CancerImmunol.Immunother.56:303-317；Holt et al.(2008)Prot.Eng.Design Sci.,21:283-288中揭示的那些，所述文献以其全文并入本文作参考。这种白蛋白结合部分的一个实例是2-(3-马来酰亚胺丙酰胺)-6-(4-(4-碘苯基)丁酰胺)己酸酯(“Albu”标签)(Trussel etal.(2009)Bioconjugate Chem.20:2286-2292)。
脂肪酸、特别是长链脂肪酸(LCFA)和长链脂肪酸样白蛋白结合化合物可用于延长本发明提供的任何ADA2的体内半衰期。LCFA-样白蛋白结合化合物的一个实例是16-(l-(3-(9-(((2,5-二氧吡咯烷-l-基氧)羰基氧)-甲基)-7-磺酸-9H-芴-2-基氨基)-3-氧丙基)-2,5-二氧吡咯烷-3-基硫代)十六酸(见例如WO 2010/140148所述)。
f.PAS序列
本发明提供的ADA2缀合物可包括与至少一个异源部分直接或间接连接的ADA2，所述异源部分是PAS序列，其是主要包含丙氨酸和丝氨酸残基或者主要包含丙氨酸、丝氨酸和脯氨酸残基的氨基酸序列。所述氨基酸序列在生理条件下形成随机卷曲构象。因此，PAS序列是由丙氨酸、丝氨酸和脯氨酸组成的构造模块、氨基酸聚合物或者序列盒，其可用作异源部分的一部分与本发明提供的任何ADA2缀合。
本领域技术人员意识到当除了丙氨酸、丝氨酸和脯氨酸之外的残基作为次要成分加入PAS序列中时，氨基酸聚合物也可以形成随机卷曲构象。次要成分包括除了丙氨酸、丝氨酸和脯氨酸的氨基酸，其可以在PAS序列中加入至一定程度，例如直至大约12％，即PAS序列的100氨基酸中的大约12个，直至大约10％，即PAS序列的100个氨基酸中的大约10个，直至大约9％，即100个氨基酸中的大约9个，直至大约8％，即100个氨基酸中的大约8个，大约6％，即100个氨基酸中的大约6个，大约5％，即100个氨基酸中的大约5个，大约4％，即100个氨基酸中的大约4个，大约3％，即100个氨基酸中的大约3个，大约2％，即100个氨基酸中的大约2个，或者大约1％，即100个氨基酸中的大约1个。与丙氨酸、丝氨酸和脯氨酸不同的氨基酸可选自Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Thr、Trp、Tyr或者Val。
在生理条件下，PAS序列节段形成随机卷曲构象，从而可以介导本发明提供的任何ADA2的增加的体内和/或体外稳定性。由于随机卷曲结构域未采取稳定结构或者其自身功能，因此由本发明提供的任何ADA2介导的生物活性基本被保留。在其它实例中，形成随机卷曲结构域的PAS序列是生物学惰性的，尤其对于血浆中的蛋白酶解、免疫原性、等电点/静电行为、结合细胞表面受体或者内在化方面，但是仍是可生物降解的，其提供显然超越合成聚合物如PEG的优势。
形成随机卷曲构象的PAS序列的非限制性实例包括氨基酸序列如ASPAAPAPASPAAPAPSAPA(SEQ ID NO:312)、AAPASPAPAAPSAPAPAAPS(SEQ ID NO:313),APSSPSPSAPSSPSPASPSS(SEQ ID NO:314)、APSSPSPSAPSSPSPASPS(SEQ ID NO:315)、SSPSAPSPSSPASPSPSSPA(SEQ ID NO:316)、AASPAAPSAPPAAASPAAPSAPPA(SEQ ID NO:317)、ASAAAPAAASAAASAPSAAA(SEQ ID NO:318)或者其任意组合。PAS序列的其它实例为本领域已知(见例如美国专利公开号2010/0292130和国际PCT公开号WO 2008/155134)。
g.HAP序列
本发明提供的ADA2缀合物可包括与至少一种异源部分直接或间接连接的ADA2，所述异源部分是甘氨酸富集的高氨基酸聚合物(HAP)。HAP序列可包含甘氨酸重复序列，其长度具有至少50个氨基酸、至少100个氨基酸、120个氨基酸、140个氨基酸、160个氨基酸、180个氨基酸、200个氨基酸、250个氨基酸、300个氨基酸、350个氨基酸、400个氨基酸、450个氨基酸或者500个氨基酸。在一个实例中，HAP序列能延长与HAP序列融合或连接的部分的半衰期。HAP序列的非限制性实例包括但不限于(Gly)n(SEQ ID NO:368)、(Gly4Ser)n(SEQ IDNO:343)或者Ser(Gly4Ser)n(SEQ ID NO:595)，其中n是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。在一个实例中，n是20、21、22、23、24、25、26、26、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40。在另一个实例中，n是50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或200。
h.XTEN序列
本发明提供的ADA2缀合物可包括与至少一种异源部分直接或间接连接的ADA2，所述异源部分包括XTEN序列、多肽或者其片段、变体或衍生物。XTEN是延长的多肽序列，具有非天然发生的基本非重复的序列，其主要由小亲水性氨基酸组成，序列在生理条件下具有低程度或无二级或三级结构(Schellenberger et al.(2009)Nat Biotechnol.27(12):1186-1190)。举例的XTEN序列是864个氨基酸的无结构的重组多肽(SEQ ID NO:373)，其延长与该部分融合的蛋白质的血浆半衰期。作为异源部分，XTEN序列可作为半衰期延长部分发挥功能。此外，XTEN序列可提供希望的性质，包括但不限于增强的药动学参数和溶解性特性。例如，XTEN序列与本发明提供的任何ADA2的缀合可赋予一或多种如下有利的性质：构象灵活性、增强的水溶解性、高度蛋白酶抗性、低免疫原性、与哺乳动物受体低水平结合或者增强的流体动力学(或Stokes)半径。在一些实例中，XTEN序列可以增加药动学性质如延长的体内半衰期或者增加的曲线下面积(AUC)，由此，本发明提供的任何ADA2与不含有XTEN异源部分的相同ADA2相比以延长的时间停留在体内并保留腺苷脱氨酶活性。
可用作与本发明提供的任何ADA2缀合的异源部分的XTEN序列的实例包括任何在美国专利号7,855,279和7,846,445；美国专利公开号2009/0092582、2010/0239554、2010/0323956、2011/0046060、2011/0046061、2011/0077199、2011/0172146、2012/0178691、2013/0017997或2012/0263701；或者国际专利公开号WO 2010091122、WO 2010144502、WO2010144508、WO 2011028228、WO 2011028229或WO 2011028344中描述的那些，所述专利以其全文并入本文作参考。
i.运铁蛋白或其片段
本发明提供的ADA2缀合物可包括与至少一种异源部分直接或间接连接的ADA2，所述异源部分是运铁蛋白或者其片段。任何运铁蛋白均可以缀合于本发明提供的任何ADA2。例如，野生型人Tf(Tf)是679个氨基酸的蛋白质(氨基酸序列如SEQ ID NO:320和324所示，GenBank登录号NP_001054.1和AAB22049.1；核酸序列如SEQ ID NO:319和322-323所示，GenBank登录号NM001063、M12530、XM039845和S95936)，大约75kDa(除外糖基化)，具有两个主要结构域，N末端结构域(大约330个氨基酸)和C末端结构域(大约340个氨基酸)，其似乎源自基因复制。N结构域包括两个亚结构域，N1结构域和N2结构域；C结构域包括两个亚结构域，即C1结构域和C2结构域。
在一个实例中，运铁蛋白异源部分包括运铁蛋白剪接变体。在一个实例中，运铁蛋白剪接变体可以是人运铁蛋白的剪接变体(SEQ ID NO:325；Genbank登录号AAA61140)。在另一实例中，嵌合蛋白的运铁蛋白部分包括运铁蛋白序列的一或多个结构域，例如N结构域、C结构域、N1结构域、N2结构域、C1结构域、C2结构域或者其任意组合。
j.聚合物缀合
本发明提供的ADA2缀合物可包括与至少一种异源部分直接或间接连接的ADA2，所述异源部分是聚合分子(聚合物)。举例的聚合物如多元醇(即poly-OH)、多胺(即poly-NH2)和聚羧酸(即poly-COOH)，及进一步的杂聚物，即含有一或多个不同的偶联基团的聚合物，例如羟基基团和胺基团。合适的聚合物分子例如包括选自如下的聚合分子：聚亚烷基氧化物(PAO)，如聚亚烷基二醇(PAG)，包括聚乙二醇(PEG)，乙二醇/丙二醇共聚物，甲氧基聚乙二醇(mPEG)和聚丙二醇，PEG-缩水甘油醚(Epox-PEG)，PEG-氧基羰基咪唑(CDI-PEG)分支的聚乙二醇(PEG)，聚乙烯醇(PVA)，聚羧酸酯，聚乙烯吡咯烷酮，聚噁唑啉，聚丙烯酰吗啉，聚-D,L-氨基酸，聚乙烯-共-马来酸酐，聚苯乙烯-共-马来酸酐，葡聚糖，包括羧甲基葡聚糖，肝素，同源白蛋白，纤维素，包括甲基纤维素，羧甲基纤维素，乙基纤维素，羟乙基纤维素，羧乙基纤维素及羟丙基纤维素，壳聚糖水解物，淀粉如羟乙基淀粉和羟丙基淀粉，糖原，琼脂糖及其衍生物，瓜尔胶，支链淀粉(pullulan)，菊粉，黄原胶，角叉菜胶，果胶，藻酸水解物，生物聚合物，及在本领域例如在美国专利号8,741,283和国际PCT公开号WO 2007/149686中所述那些。
例如，与本发明提供的任何ADA2缀合的聚合物通常可相应于下式：
[R—NH]z-(ADA2)
其中(ADA2)表示本文描述的任何ADFA2，如野生型、其变体或者修饰形式；
NH—是在本发明提供的ADA2上发现的为了附着于聚合物的氨基酸的氨基基团；
z是正整数，如从大约1至大约32，或者1-3、2-4、3-5、4-6、5-7、6-8、7-9、8-10、9-11、10-12、11-13、12-14、13-15、14-16、15-17、16-18、17-19、18-20、19-21、20-22、21-23、22-24、23-25、24-26、25-27、26-28、27-29、28-30、29-31或30-32；
R是基本上无抗原性的聚合物分子，其以可释放或不可释放形式附着于本发明提供的ADA2。举例的无抗原性聚合分子可以是本文描述的任何分子及本领域例如美国专利号8,741,283和国际PCT公开号WO2007/149686描述的那些。
例如，本发明描述的任何ADA2可以与至少一个聚乙二醇(PEG)分子缀合。在一些实例中，聚合物是水溶性的。在一些实例中，本发明提供的任何ADA2与PEG异源部分缀合，并进一步包括选自如下的异源部分：免疫球蛋白恒定区或其部分(例如Fc区)、PAS序列、羟乙基淀粉(HES)及白蛋白或其片段或变体、XTEN序列，或者其任意组合。
聚合分子如聚乙二醇(聚乙二醇化部分(PEG))与任何ADA2多肽包括变体ADA2多肽的共价或其它稳定附着(缀合)，为所得ADA2-聚合物组合物提供了有益的性质。这种性质包括改良的生物相容性、延长蛋白质在对象的血浆、细胞和/或其它组织中的半衰期(及酶活性)、有效屏蔽蛋白质免于蛋白酶解和水解、改良的生物分布、增强的药动学和/药效学、增加的稳定性、降低的免疫原性、在对象中延长/持续的治疗作用，以及增加的水溶解性(见美国专利号4,179,337)。
i.聚乙二醇(PEG)
聚乙二醇(PEG)广泛用于生物材料、生物技术和医药领域，主要是因为PEG是生物相容的、无毒性的、水溶性聚合物，其典型是无免疫原性的(Zhao and Harris,ACSSymposium Series 680:458-72,1997)。在药物输送领域，PEG衍生物已经广泛用于共价附着于蛋白质(即聚乙二醇化)以降低免疫原性、蛋白酶解和肾清除以及增强溶解性(Zalipsky,Adv.Drug Del.Rev.16:157-82,1995)。相似地，PEG附着于低分子量的、相对疏水性药物以增强溶解性、降低毒性和改变生物分布。典型地，聚乙二醇化药物是作为溶液注射的。
一个密切相关的应用是合成交联的可降解的PEG网络或配制物用于药物输送，因为用于设计可降解的、可溶的药物载体的许多相同化学方法也可用于设计可降解凝胶(Sawhney et al.,Macromolecules 26:581-87,1993)。本领域也已知大分子间复合物可以通过混合两种互补聚合物溶液而形成。这种复合物通常通过聚合物之间的静电相互作用(聚阴离子-聚阳离子)和/或氢键(聚酸-聚碱)、和/或水环境中聚合物之间的疏水相互作用而稳定(Krupers et al.,Eur.Polym J.32:785-790,1996)。例如，在适当条件下混合聚丙烯酸(PAAc)与聚亚烷基氧化物(PEO)的溶液导致主要基于氢键的复合物形成。这些复合物在生理条件下的解离用于输送游离药物(即非聚乙二醇化的)。此外，互补聚合物的复合物从均聚物与共聚物中形成。
本领域已经描述了许多聚乙二醇化试剂。这种试剂包括但不限于N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)激活的PEG、琥珀酰亚胺mPEG、mPEG2-N-羟基琥珀酰亚胺、mPEG琥珀酰亚胺α-甲基丁酸酯、mPEG琥珀酰亚胺丙酸酯、mPEG琥珀酰亚胺丁酸酯、mPEG羧甲基3-羟基丁酸琥珀酰亚胺酯、同型双功能PEG-琥珀酰亚胺丙酸酯、同型双功能PEG丙醛、同型双功能PEG丁醛、PEG马来酰亚胺、PEG酰肼、对硝基苯基-碳酸酯PEG、mPEG-苯并三唑碳酸酯、丙醛PEG、mPEG丁醛、分支的mPEG2丁醛、乙酰mPEG、mPEG哌啶酮、mPEG甲基酮、mPEG“无接头”马来酰亚胺、mPEG乙烯砜、mPEG硫醇、mPEG正吡啶硫酯、mPEG正吡啶二硫化物、Fmoc-PEG-NHS、Boc-PEG-NHS、乙烯砜PEG-NHS、丙烯酸PEG-NHS、荧光素PEG-NHS及生物素PEG-NHS(见例如Monfardini et al.,Bioconjugate Chem.6:62-69,1995、Veronese et al.,J.Bioactive CompatiblePolymers 12:197-207,1997、US 5,672,662、US 5,932,462、US 6,495,659、US 6,737,505、US 4,002,531、US 4,179,337、US 5,122,614、US 5,324,844、US 5,446,090、US 5,612,460、US 5,643,575、US 5,766,581、US 5,795,569、US 5,808,096、US 5,900,461、US 5,919,455、US 5,985,263、US 5,990,237、US 6,113,906、US 6,214,966、US 6,258,351、US6,340,742、US 6,413,507、US 6,420,339、US 6,437,025、US 6,448,369、US 6,461,802、US6,828,401、US 6,858,736、US 8,741,283、US 2001/0021763、US 2001/0044526、US 2001/0046481、US 2002/0052430、US 2002/0072573、US 2002/0156047、US 2003/0114647、US2003/0143596、US 2003/0158333、US 2003/0220447、US 2004/0013637、US 2004/0235734、WO 05000360、US 2005/0114037、US 2005/0171328、US 2005/0209416、EP 1064951、EP0822199、WO 01076640、WO 0002017、WO 0249673、WO 94/28024及WO 01/87925)。
特别地，所述聚合物是聚乙二醇(PEG)。附着于任何ADA2多肽、包括变体ADA2多肽的合适的聚合分子包括但不限于聚乙二醇(PEG)和PEG衍生物，如甲氧基聚乙二醇(mPEG)、PEG-缩水甘油醚(Epox-PEG)、PEG-氧羰基咪唑(CDI-PEG)、分支的PEG及聚氧化乙烯(PEO)(见例如Roberts et al.,Advanced Drug Delivery Review(2002)54:459-476；Harrisand Zalipsky,S(eds.)"Poly(ethylene glycol),Chemistry and BiologicalApplications"ACS Symposium Series 680,1997；Mehvar et al.,J.Pharm.Pharmaceut.Sci.,3(1):125-136,2000；Harris,(2003)Nature Reviews DrugDiscovery 2:214-221；及Tsubery,(2004)J Biol.Chem 279(37):38118-24)。
聚合部分如PEG部分可以是分子量典型是大约1kDa至大约100kDa。在一些实施方案中，与蛋白质如本发明提供的任何ADA2缀合的聚合分子的分子量为至少或至少大约或5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100kDa或者大于1000kDa。根据希望的模式可以使用其它大小(例如希望的持续释放时间，作用，如果对于生物活性，易于操纵，抗原性程度或缺少抗原性，或者聚乙二醇对蛋白质或类似物的其它已知作用)。
PEG部分可以是任何分子量，及可以是分支或者非分支的。在一些实例中，异源聚合物是具有分支结构的PEG。分支的聚乙二醇在例如美国专利号5,643,575；Morpurgo etal.(1996)Appl.Biochem.Biotechnol.56:59-72；Vorobjev et al.(1999)NucleosidesNucleotides 18:2745-2750；和Caliceti et al.(1999)Bioconjug.Chem.10:638-646中描述，所述文献以其全文并入本文作参考。
虽然针对聚乙二醇化已经描述了许多反应，但是最常用的那些反应赋予定向性、利用适度反应条件，及不必需大量的下游处理以除去毒性催化剂或副产物。例如，单甲氧基PEG(mPEG)仅具有一个反应末端羟基，因此使用其限制了所得PEG-蛋白质产物混合物的一些异质性。在聚合物与末端甲氧基基团相反的末端的羟基基团的激活通常是实现有效的蛋白质聚乙二醇化所要求的，目的是产生对于亲核性攻击更易感的衍生的PEG。攻击性亲核体通常是赖氨酸残基的ε-氨基基团，但是如果局部条件有利，其它胺也可以反应(例如组氨酸的N末端α-胺基或者环形胺)。
更直接的附着在含有单一赖氨酸或半胱氨酸的蛋白质中是可能的。后者残基可以通过PEG-马来酰亚胺靶向以进行硫醇特异性修饰。或者，PEG酰肼可以与高碘酸氧化的蛋白质反应，并在存在NaCNBH3条件下还原。更特别地，聚乙二醇化的CMP糖在存在合适羰糖基转移酶的条件下可以与蛋白质反应。或者，ADA2的聚乙二醇化可以在含有非天然氨基酸取代的变体中发生，使得在蛋白质内的优化位置进行位点特异性化学缀合。聚乙二醇化技术可以使得许多聚合分子与讨论的多肽偶联。当使用这种技术时，免疫系统在识别多肽表面上负责抗体形成的表位中有难度，从而降低免疫应答。对于直接导入人体循环系统中以产生特定生理学作用的多肽(即药物)，典型的潜在免疫应答是IgG和/或IgM应答，而通过呼吸系统吸入的多肽(即工业化多肽)潜在地可导致IgE应答(即变态反应)。解释降低的免疫应答的理论之一是所述聚合分子屏蔽负责导致抗体形成的免疫应答的多肽表面上的表位。另一理论或者至少部分因素是所述缀合物越重，则获得的免疫应答越降低。
典型地，为了产生本发明提供的聚乙二醇化的ADA2多肽，包括变体ADA2多肽，将PEG部分通过共价附着缀合于多肽。聚乙二醇化技术包括但不限于特定的接头和偶联化学(见例如Roberts et al.,Adv.Drug Deliv.Rev.54:459-476,2002)、多个PEG部分附着于单一缀合位点(如通过使用分支的PEG，见例如Guiotto et al.,Bioorg.Med.Chem.Lett.12:177-180,2002)、位点特异性聚乙二醇化和/或单一聚乙二醇化(见例如Chapman et al.,Nature Biotech.17:780-783,1999)，以及定向酶促聚乙二醇化(见例如Sato,Adv.DrugDeliv.Rev.,54:487-504,2002)。本领域描述的方法和技术可产生具有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或10个以上的PEG或PEG衍生物附着单一蛋白质分子(见例如U.S.2006/0104968)的蛋白质。
附着每个ADA2分子的聚乙二醇部分的数目也可以改变。例如，本发明提供的任何ADA2均可以缀合平均至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、17、20、25、30或者更多个聚乙二醇分子。例如，聚乙二醇化的ADA2多肽、包括变体ADA2多肽通常每个分子含有至少5个PEG部分。在其它实例中，每个蛋白质分子的PEG分子数的范围可以是1-3、2-4、3-5、4-6、5-7、6-8、7-9、8-10、9-1 1、10-12、11-13、12-14、13-15、14-16、15-17、16-18、17-19、18-20、19-21、20-22、21-23、22-24、23-25、24-26、25-27、26-28、27-29、28-30、29-31或30-32。例如，ADA2多肽、包括变体ADA2多肽，可具有的PEG与蛋白质摩尔比率在32:1与1:1之间，例如大约或直至30:1、20:1、15:1、10:1和5:1。每个蛋白质的PEG分子数目可以变化，以修饰组合的缀合物的物理学和动力学性质，以符合任何特定临床状况，这由本领域技术人员确定。确定PEG与蛋白质摩尔比率的方法在例如Delgado et al.(1992)Crit.Rev.Thera.Drug CarrierSys.9:249-304中揭示。
PEG与药物的共价附着(称作聚乙二醇化)可以通过已知的化学合成技术实现。例如，蛋白质的聚乙二醇化可以通过NHS激活的PEG与蛋白质在合适反应条件下反应而实现。本领域已知通过共价附着(缀合)PEG或者PEG衍生物修饰多肽(即聚乙二醇化)的各种方法(见例如U.S.5,672,662、U.S.6,737,505、U.S.2004/0235734、U.S.2006/0104968)。各种聚合物如PEG或PEG衍生物的共价附着在U.S.8,741,283中描述。
激活的聚合物和衍生物可用于促进聚合物与本发明提供的任何ADA2的缀合。激活的聚合物和衍生物具有离去或激活基团，其促进聚合物系统与在多肽如本发明提供的ADA2上发现的胺基附着。例如，激活的基团是能与在本发明提供的任何ADA2上发现的胺基(亲核体)反应的那些基团，如赖氨酸的ε-胺基基团。举例的激活基团包括：
或者其它合适的离去或激活基团如N-羟基苯并三唑基、卤素、N-羟基邻苯二甲酰亚胺基、咪唑基、O-酰基脲、五氟苯酚、2,4,6-三氯苯酚或者本领域技术人员已知的其它合适的离去基团。
举例的激活的PEG包括例如在美国专利号5,122,614、5,324,844、5,612,460和5,808,096(琥珀酰亚胺碳酸酯激活的聚乙二醇(SC-PEG)及相关激活的PEG)和美国专利号5,349,001(环状亚胺硫酮激活的PEG)中揭示的那些。缀合反应典型在合适的缓冲液中进行，使用超过激活的PEG几倍的摩尔量。在一些实例中，用线性PEG如SC-PEG制备的缀合物可含有每个蛋白质分子平均大约1至大约32个PEG分子。因此，对此可以使用超过几百倍如大约200至大约1000倍的摩尔量。用于分支聚合物和附着酶的聚合物的超出摩尔量可以较低，可以使用本领域已知技术确定。
在一些实例中，基于苯甲基消除或者三甲基的聚合系统的激活的聚合物接头锁住内酯化，如美国专利号6,180,095、6,720,306、5,965,119、6,624,142和6,303,569所述。在其它实例中，本发明提供的任何ADA2的聚合物缀合可以使用n,n-二(羟乙基)甘氨酸聚合物残基实现，例如如美国专利号7,122,189、7,087,229和8,741,283所述。在其它实例中，本发明提供的任何ADA2的聚合物缀合可以使用分支的聚合物残基实现，如在美国专利号5,681,567、5,756,593、5,643,575；5,919,455、6,113,906、6,153,655、6,395,266及6,638,499、6,251,382、6,824,766和8,741,283中所述那些。在其它实例中，本发明提供的任何ADA2的聚合物缀合可以使用阻碍的基于酯的接头实现，如在国际PCT公开号WO 2008/034119中所述那些。在一些实例中，激活的聚乙二醇提供与蛋白质如本发明提供的任何ADA2的氨基甲酸乙酯连接或者酰胺连接。
制备高纯度的具有末端羧酸的聚合物的方法在本领域例如美国专利公开号2007/0173615中描述。所述方法包括首先制备聚亚烷基氧化物的叔烷基酯，随后转化为其羧酸衍生物。所述方法第一步制备PAO羧酸包括形成中间物如聚亚烷基氧化物羧酸的t-丁基酯。这个中间物是通过PAO与t-丁基卤代乙酸酯在存在碱如t-丁醇钾的条件下反应形成的。一旦已经形成t-丁基酯中间物，则聚亚烷基氧化物的羧酸衍生物可易于以超过92％的纯度提供，如超过97％、99％或99.5％。
在其它实例中，具有末端胺基的聚合物可用以产生与本发明提供的ADA2的缀合物。制备高纯度含有末端胺基的聚合物的方法在本领域例如美国专利号7,868,131和7,569,657中描述。例如，将具有叠氮化物的聚合物与基于磷化氢的还原剂如三苯基膦或者碱金属硼氢化物还原剂如NaBH4反应。或者，包含离去基团的聚合物与保护的胺盐如甲基-叔丁基亚胺碳酸氢钾盐(KNMeBoc)或二-叔丁基亚胺碳酸氢钾盐(KNBoc2)反应，随后对保护的胺基去保护。通过这些方法形成的含有末端胺基的聚合物的纯度高于大约95％，如高于99％。
在一些实例中，本发明提供的ADA2的聚合物缀合物的PEG部分可选自：
J-O—(CH2CH2O)u—，
J-O—(CH2CH2O)u—CH2C(O)—O—，
J-O—(CH2CH2O)u—CH2CH2NR—，及
J-O—(CH2CH2O)u—CH2CH2SH—，
其中u是多聚体化程度，即大约10至大约2300；
R选自氢、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-12分支烷基、C3-8环烷基、C1-6取代的烷基、C2-6取代的烯基、C2-6取代的炔基、C3-8取代的环烷基、芳基取代的芳基、芳烷基、C1-6杂烷基、取代的C1-6杂烷基、C1-6烷氧基、苯氧基及C1-6杂烷氧基，及
J是封端基团，即在聚合物的末端发现的基团，及在一些方面可选自NH2(或CH2CH2NH2)、H、SH(或CH2CH2SH)、CO2H(或CH2CO2H)、C1-6烷基，如甲基或者本领域已知的其它PEG末端激活基团。
例如，聚合物缀合物的PEG部分可以选自：
CH3—O—(CH2CH2O)u—、CH3—O—(CH2CH2O)u—CH2C(O)—O—、CH3—O—(CH2CH2O)u—CH2CH2NH—及CH3—O—(CH2CH2O)u—
CH2CH2SH—，
其中u是正整数，由此聚合物部分的平均总分子量范围是大约2kDa至大约100kDa。
在其它实例中，本发明提供的ADA2的聚合物缀合物的PEG部分可以选自：
—Y1—(CH2CH2O)u—CH2CH2Y1—，
—Y1—(CH2CH2O)u—CH2C(═Y2)—Y1—，
—Y1—C(═Y2)—(CH2)a1—Y3—(CH2CH2O)u—CH2CH2—Y3—(CH2)a1—C(═Y2)—Y1—，
—Y1—(CR2R3)a2—Y3—(CH2)b1—O—(CH2CH2O)b1—(CH2)b1—Y3—(CR2R3)a2—Y1—，
—Y1—(CH2CH2O)u—CH2CH2—，
—Y1—(CH2CH2O)u—CH2C(═Y2)—，
—C(═Y2)—(CH2)a1—Y3—(CH2CH2O)u—CH2CH2—Y3—(CH2)a1—C(═Y2)—，及—(CR2R3)a2—Y3—(CH2)b1—O—(CH2CH2O)u—(CH2)b1—Y3—(CR2R3)a2—，
其中：
Y1和Y3单独地是O、S、SO、SO2、NR4或是一个键，
Y2是O、S或NR5；
R2-R5独立地选自氢、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-19分支烷基、C3-8环烷基、C1-6取代的烷基、C2-6取代的烯基、C2-6取代的炔基、C3-8取代的环烷基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、C1-6杂烷基、取代的C1-6杂烷基、C1-6烷氧基、芳氧基、C1-6杂烷氧基、杂芳氧基、C2-6烷酰基、芳基羰基、C2-6烷氧基羰基、芳氧基羰基、C2-6烷酰基氧基、芳基羰基氧基、C2-6取代的烷酰基、取代的芳基羰基、C2-6取代的烷酰基氧基、取代的芳氧基羰基、C2-6取代的烷酰基氧基及取代的芳基羰基氧基；
a1、a2和b1独立地是0或者是1-6的正整数，例如0、1或2；及
u是大约10-大约2300的整数。
在其它实例中，本发明提供的ADA2的聚合物缀合物的PEG部分可以例如以如下方式功能化：
—C(═Y4)—(CH2)m—(CH2CH2O)u—，
—C(═Y4)—Y—(CH2)m—(CH2CH2O)u—，
—C(═Y4)—NR2—(CH2)m—(CH2CH2O)u—，
—CR6R7—(CH2)m—(CH2CH2O)u—，
其中：
R2、R6和R7独立地选自H、C1-6烷基、芳基、取代的芳基、芳烷基、杂烷基、取代的杂烷基和取代的C1-6烷基；
M是0或者是正整数，如1或2，
Y4是O或S；及
U表示多聚化程度。
在一些实例中，本发明提供的ADA2的聚合物缀合物可以通过如下方法产生，包括将由NOF Corp、Tokyo、Japan产生的多臂PEG-OH或“star-PEG”产物转变为适当激活的聚合物，使用美国专利号5,122,614或5,808,096中描述的激活技术进行。在一个实例中，多臂聚合物可以含有四或更多个聚合物臂，及优选四个或八个聚合物臂。在一些实例中，四个PEG臂被转变为合适的官能团，如琥珀酰亚胺碳酸酯(SC)以促进与多肽如本发明提供的任何ADA2的附着。
本发明提供的聚合缀合物在室温可以是水溶性的。这种聚合物非限制性的列表包括聚亚烷基氧化物均聚物，如聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇、聚氧化乙烯化多醇，其共聚物及其嵌段共聚物。
作为产生聚乙二醇化ADA2多肽、包括变体ADA2多肽的举例说明方法，PEG醛、琥珀酰亚胺和碳酸酯均已用于缀合PEG部分，典型为琥珀酰亚胺PEG。举例的琥珀酰亚胺单PEG(mPEG)试剂包括mPEG-琥珀酰亚胺丙酸酯(mPEG-SPA)、mPEG琥珀酰亚胺羧甲基酯(mPEG-SCM)、mPEG-琥珀酰亚胺丁酸酯(mPEG-SBA)及(为了附着“分支的”PEG)mPEG2-N-羟基琥珀酰亚胺。这些聚乙二醇化的琥珀酰亚胺酯在PEG基团与激活的交联剂之间含有不同长度的碳主链，及单一或分支的PEG基团。这些差异可用于例如提供不同的反应动力学及潜在地限制在缀合过程期间用于PEG附着ADA2的位点。这种聚乙二醇化的ADA2组合物可以易于纯化产生具有至少大约90％-大约100％聚乙二醇化的ADA2分子的组合物，基本上没有非聚乙二醇化的ADA2(少于5％的非聚乙二醇化)。
在一个实例中，聚乙二醇化包括mPEG-SCM例如mPEG-SCM-20K(分子量为大约20kDa)或另一PEG衍生物的琥珀酰亚胺羧甲基酯与任何ADA2多肽包括变体ADA2多肽的缀合。PEG衍生物的琥珀酰亚胺羧甲基酯如mPEG-SCM-20K易于与蛋白质中赖氨酸的氨基基团或者生物活性分子N末端胺基偶联。例如，m-PEG-SCM-20K与ADA2(作为单体大小大约59kDa)的共价缀合提供了在ADA2与mPEG之间的稳定酰胺键。典型地，将mPEG-SCM-20K或其它PEG在合适缓冲液中以15:1的PEG:多肽摩尔比率加入任何ADA2多肽、包括变体ADA2多肽中，随后例如通过灭菌过滤进行灭菌，及例如在冷室中在4℃搅拌过夜以继续缀合。
本领域已知将PEG的琥珀酰亚胺酯包括丁酸衍生物如mPEG-SBA-30K与多肽偶联的其它方法(见例如U.S.5,672,662、U.S.6,737,505、U.S.8,784,791、U.S.2004/0235734和U.S.2005/0158273)。例如，多肽如本发明提供的任何ADA2可以通过在硼酸盐缓冲液(0.1M，pH 8.0)中在4℃反应1小时与NHS激活的PEG衍生物偶联。所得聚乙二醇化的蛋白质可以通过超滤纯化。或者，牛碱性磷酸酶的聚乙二醇化可以通过将磷酸酶与mPEG-SBA在含有0.2M磷酸钠和0.5M NaCl(pH 7.5)的缓冲液中在4℃混合30分钟而实现。未反应的PEG可以通过超滤或者使用树脂柱如Capto Phenyl树脂柱(GE Healthcare)除去。另一方法是将多肽与mPEG-SBA在加入三乙胺以使pH升至7.2-9的去离子水中反应。所得混合物在室温搅拌几小时以完成聚乙二醇化。
如本文示出，变体ADA2的聚乙二醇化赋予ADA2的肝素结合性质降低。肝素结合降低可以是除了降低肝素结合的氨基酸置换导致的任何减弱的肝素结合之外的降低。因此，ADA2的聚乙二醇化也改良了ADA2的药代动学性质，聚乙二醇化可用于代替氨基酸置换或者除了氨基酸置换之外也用于减弱肝素结合。
ii.羟乙基淀粉(HES)
在一些实例中，至少一种异源部分是聚合物，例如羟乙基淀粉(HES)或其衍生物。羟乙基淀粉(HES)是天然发生的支链淀粉的衍生物，其在体内由α-淀粉酶降解。HES是碳水化合物聚合物支链淀粉的取代的衍生物，其以直至95％(重量)的浓度存在于玉米淀粉中。HES呈现有利的生物学性质并用作血容量代替物及用于临床血液稀释治疗中。
支链淀粉含有葡萄糖部分，其中在主链中存在α-1,4-糖苷键及在分支部位发现α-1,6-糖苷键。这个分子的物理化学性质主要由糖苷键的类型决定。由于缺口的α-1,4-糖苷键，产生了每个转角具有大约6个葡糖糖单体的螺旋结构。聚合物的物理化学以及生物化学性质可以通过取代修饰。通过碱性羟乙基化可以实现导入羟乙基基团。通过调整反应条件，可以利用未取代的葡萄糖单体中各个羟基基团对于羟乙基化的不同反应性。本领域技术人员可以确定取代模式。HES主要特征在于分子量分布和取代程度(DS)，这是指取代的摩尔比率。
在一个实例中，羟乙基淀粉的平均分子量(加权平均)是1-300kD，2-200kD，3-100kD或者4-70kD。羟乙基淀粉可进一步呈现出摩尔取代度(DS)为0.1-3，优选0.1-2，更优选0.1-0.9，优选0.1-0.8，及关于羟乙基基团C2:C6取代比率在2-20范围。具有平均分子量为大约130kD的HES非限制性例子是具有DS为0.2-0.8如0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7或0.8及特别是DS为0.4-0.7如0.4、0.5、0.6或0.7的HES。
在一个实例中，HES的平均分子量为大约130kD且是(FreseniusKabi,Germany)。是一种人工胶质，用于例如在血容量减少的治疗和预防中在治疗适应症中用作血容量替代。的特性是平均分子量为130±20kDa，摩尔取代为0.4及C2:C6比率为大约9:1。在其它实例中，羟乙基淀粉的平均分子量范围是例如4-70kDa或者10-70kDa或者12-70kDa或18-70kDa或者50-70kDa或者4-50kDa或者10-50kDa或者12-50kDa或者18-50kDa或者4-18kDa或者10-18kDa或者12-18kDa或者4-12kDa或者10-12kDa或者4-10kDa。在其它实例中，使用的羟乙基淀粉的平均分子量范围是大于4kDa及小于70kDa，如大约10kDa，或者范围是9-10kDa或10-11kDa或9-11kDa，或者大约12kDa，或者范围是11-12kDa或12-13kDa或11-13kDa，或者大约18kDa，或者范围是17-18kDa或18-19kDa或17-19kDa，或者大约30kDa，或者范围是29-30kDa或30-31kDa，或者大约50kDa，或者范围是49-50kDa或50-51kDa或49-51kDa。
在一些实例中，异源部分可以是具有不同平均分子量和/或不同取代程度和/或不同C2:C6取代比率的羟乙基淀粉的混合物。因此，可以使用羟乙基淀粉的混合物，其具有不同平均分子量和不同取代程度和不同C2:C6取代比率，或者具有不同平均分子量和不同取代程度及相同或大约相同C2:C6取代比率，或者具有不同平均分子量及相同或大约相同取代程度及不同C2:C6取代比率，或者具有相同或大约相同平均分子量和不同取代程度及不同C2:C6取代比率，或者具有不同平均分子量和相同或大约相同取代程度和相同或大约相同C2:C6取代比率，或者具有相同或大约相同平均分子量和不同取代程度及相同或大约相同C2:C6取代比率，或者具有相同或大约相同平均分子量和相同或大约相同取代程度和不同C2:C6取代比率，或者具有大约相同平均分子量和大约相同取代程度和大约相同C2:C6取代比率。
iii.多唾液酸(PSA)
在某些实例中，至少一种异源部分是聚合物，例如多唾液酸(PSA)或其衍生物。多唾液酸(PSA)是由某些细菌菌株及在哺乳动物某些细胞中产生的唾液酸的天然发生的非分支聚合物(Roth J.,et al.(1993)in Polysialic Acid:From Microbes to Man,eds RothJ.,Rutishauser U.,Troy F.A.(Birkhauser Verlag,Basel,Switzerland),pp 335-348)。通过限制的酸水解或者通过神经氨酸酶消化、或者通过天然的细菌衍生形式的聚合物的分级分离，其可以从大约80或更多唾液酸残基至大约2的不同多聚体化程度产生。
不同多唾液酸的成分也是变化的，由此存在均聚物形式，即大肠杆菌菌株K1及B型脑膜炎球菌的荚膜多糖的α-2,8-连接的多唾液酸，其也在神经元细胞粘附分子(N-CAM)的胚胎形式上发现。也存在杂聚形式，如大肠杆菌菌株K92与C型脑膜炎球菌多糖的交互的α-2,8α-2,9多唾液酸。唾液酸也可见于与除了唾液酸之外的单体的交互共聚物，如脑膜炎球菌的W135或Y型。多唾液酸具有重要的生物功能，包括对病原性细菌的免疫和补体系统逃避及调节在胎儿发育期间不成熟神经元的神经胶质粘附(其中聚合物具有抗粘附功能)(Choand Troy,(1994)P.N.A.S.91:11427-11431)，但是在哺乳动物中没有已知的多唾液酸受体。
在其它实例中，使用大肠杆菌菌株K1的α-2,8-连接的多唾液酸，也称作多聚乙酰神经氨酸(各种长度)。已经描述了多唾液酸与多肽附着或缀合的各种方法(见例如美国专利号5,846,951、WO 01/87922和US 2007/0191597所述，所述文献以其全文并入本文作参考)。
iv.其它聚合物
在其它实例中，与本发明提供的任何ADA2缀合的聚合物部分可以选自一或多种有效的非抗原性材料，如葡聚糖、聚乙烯醇、基于碳水化合物的聚合物、羟丙基甲基丙烯酰胺(HPMA)、聚亚烷基氧化物，和/或其共聚物，包括本领域已知和/或美国专利号6,153,655中描述的其它聚合物。本领域技术人员可以基于使用目的选择聚合物及选择合适的缀合方法。
2.产生缀合物或融合蛋白的方法
异源部分与本发明提供的任何ADA2可以直接或者间接缀合。例如，异源部分可以通过翻译后方式在ADA2多肽重组产生之后通过直接化学连接或者通过接头间接缀合。在其它实例中，是蛋白质或多肽部分的异源部分可以与本发明提供的任何ADA2直接或者间接缀合。在一个实例中，所述蛋白质或多肽部分可以直接连接，例如作为融合蛋白。在其它实例中，异源部分通过接头间接缀合。在其它实例中，异源部分可以通过在异源部分中的硫醇基团与本发明提供的ADA2中的半胱氨酸残基之间形成的二硫键连接。
接头
接头或间隔物可用于连接异源部分与多肽如本发明提供的任何ADA2。接头是指肽或多肽序列(例如合成的肽或者多肽序列)，或者非肽接头，其主要功能是连接两个部分如本发明提供的ADA2与异源部分。接头可用于维持各个残基或者在多肽缀合物或融合蛋白的结构域或部分的二级、三级或者四级结构水平的结构灵活性及其它构象特性，以维持所述部分的功能性质。接头也可以为多肽缀合物或者融合蛋白提供另外有益的性质，如在哺乳动物表达系统中增加的蛋白质表达、改良的生物物理性质如稳定性和溶解性、改良的蛋白质纯化和检测和/或增加的酶活性。在一些实例中，两或更多个接头可以串联连接。接头可以是肽接头，其连接蛋白质或多肽部分与ADA2多肽。其它举例的接头包括化学连接剂和异双功能连接剂。
当在ADA2与异源部分之间存在多个接头时，每个接头可以是相同或不同的。通常，接头为多肽分子提供灵活性。接头典型不被裂解，然而在某些实例中，这种连接可能是希望的。因此，在一些实施方案中，接头可含有一或多个蛋白酶裂解位点，其可以位于接头序列内或者在接头序列任一末端的接头侧翼。
接头可以通过使用本领域已知的技术(例如化学缀合、重组技术或者肽合成法)导入多肽序列如本发明提供的任何ADA2中。修饰可以通过DNA序列分析证实。在一些实例中，可以使用重组技术导入接头。在其它实例中，接头可以使用固相肽合成法导入。在其它实例中，多肽如本发明提供的任何ADA2可以同时含有已经使用重组技术导入的一或多个接头及使用本领域已知的固相肽合成法或者化学缀合方法导入的一或多个接头。
i.肽接头
肽接头可用于连接异源部分与本发明提供的ADA2多肽。在一个实例中，肽接头可以与第一多肽(例如ADA2多肽)的C末端及第二多肽(例如蛋白质或多肽异源部分)的N末端融合。这个结构可以重复多次，由此至少1个、优选2、3、4或更多个多肽通过肽接头在其各自末端彼此连接。
例如，两个分子(例如ADA2多肽与异源部分)在构建体中可以相邻或者由含有1、2、3或更多个氨基酸的接头多肽分离。在一些实例中，肽接头可含有至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少10个、至少20个、至少30个、至少40个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个或者至少100个氨基酸。在其它实例中，肽接头可含有至少200、至少300、至少400、至少500、至少600、至少700、至少800、至少900或者至少1000个氨基酸。在一些实例中，肽接头可含有至少大约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900或2000个氨基酸。肽接头可含有1-5个氨基酸、1-10个氨基酸、1-20个氨基酸、10-50个氨基酸、50-100个氨基酸、100-200个氨基酸、200-300个氨基酸、300-400个氨基酸、400-500个氨基酸、500-600个氨基酸、600-700个氨基酸、700-800个氨基酸、800-900个氨基酸或900-1000个氨基酸。接头的长度是使得两个可变结构域桥连而无实质干扰。例如，接头多肽可具有序列Z1-X-Z2，其中Z1和Z2分别是ADA2多肽和异源部分，其中X是肽接头序列。在另一实例中，所述多肽具有序列Z1-X-Z2(-X-Z)n，其中“n”是任何整数，即通常是1或2。
典型地，肽接头是足够长的以使得ADA2多肽与异源部分均保留其构象结构和功能。举例的肽接头包括但不限于：-Gly-Gly-、GGGG(SEQ ID NO:362)、GGGGG(SEQ ID NO:360)、GGGGS或(GGGGS)n(SEQ ID NO:343)、SSSSG或(SSSSG)n(SEQ ID NO:344)、GKSSGSGSESKS(SEQ ID NO:345)、GGSTSGSGKSSEGKG(SEQ ID NO:346)、GSTSGSGKSSSEGSGSTKG(SEQ ID NO:347)、GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:348)、EGKSSGSGSESKEF(SEQ ID NO:349)、AlaAlaProAla或(AlaAlaProAla)n(SEQ ID NO:350)、SGGSGGS(SEQ ID NO:363)、GGSGGSGGSGGSGGG(SEQ ID NO:364)、GGSGGSGGGGSGGGGS(SEQ IDNO:365)、GGSGGSGGSGGSGGSGGS(SEQ ID NO:366)、GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:367)、Ser(Gly4Ser)n(SEQ ID NO:595)或者(Gly-Ser)n残基，一些Glu或Lys残基分布于其中以增加溶解性，其中n可以是1-20的整数，如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。其它举例的接头包括具有式[(Gly)x-Sery]z的肽接头，其中x是1-4，y是0或1，及z是1-50。在其它实例中，肽接头包括序列Gn，其中n可以是1-100的整数。在另一实例中，肽接头的序列可以是(GA)n或(GGS)n。其它举例的接头包括：
(1)Gly4Ser，具有NcoI末端(SEQ ID NO:351)
CCATGGGCGG CGGCGGCTCT GCCATGG
(2)(Gly4Ser)2，具有NcoI末端(SEQ ID NO:352)
CCATGGGCGG CGGCGGCTCT GGCGGCGGCG GCTCTGCCAT GG
(3)(Ser4Gly)4，具有NcoI末端(SEQ ID NO:353)
CCATGGCCTC GTCGTCGTCG GGCTCGTCGT CGTCGGGCTC GTCGTCGTCG GGCTCGTCGTCGTCGGGCGC CATGG
(4)(Ser4Gly)2，具有NcoI末端(SEQ ID NO:354)
CCATGGCCTC GTCGTCGTCG GGCTCGTCGT CGTCGGGCGC CATGG
连接部分在例如Huston et al.(1988)PNAS 85:5879-5883、Whitlow et al.(1993)Protein Engineering 6:989-995和Newton et al.,(1996)Biochemistry 35:545-553中描述。其它合适的肽接头包括任何在美国专利号4,751,180或4,935,233中描述的那些，所述专利以其全文并入本文作参考。编码希望的肽接头的多核苷酸可以使用任何合适的常规技术插入在编码本发明提供的任何ADA2与蛋白质或多肽异源部分的多核苷酸之间及相同读框中。连接部分也可以包括本领域已知的天然发生的氨基酸以及各种非天然发生的氨基酸(D-或L-)、疏水性或非疏水性氨基酸的衍生物和类似物。
在一些实例中，肽接头包括肽(或多肽)(例如天然或非天然发生的肽)，其包括连接或者遗传融合非天然连接或天然遗传融合的第一线性氨基酸序列与第二线性氨基酸序列的氨基酸序列。例如，肽接头可包括非天然发生的多肽，其是天然发生的多肽的修饰形式(例如包括如添加、取代或者缺失等突变)。在另一实例中，肽接头可包括非天然发生的氨基酸。在另一实例中，肽接头可在非天然发生的线性序列中包括天然发生的氨基酸。在另外的实例中，肽接头可包括天然发生的多肽序列。
ii.异双功能连接剂
本发明提供的任何ADA2与异源部分的连接可以是直接或者间接的。例如，可以通过如本领域已知或者本发明提供的化学连接或者通过双功能或者异双功能接头实现连接。
本领域技术人员已知用于在氨基基团与硫醇基团之间形成共价键及将硫醇基团导入蛋白质中的许多异双功能交联试剂(见例如PIERCE CATALOG,ImmunoTechnologyCatalog&Handbook,1992-1993，其描述了这种试剂的制备和使用并提供了这种试剂的商业来源；也见例如Cumber et al.(1992)Bioconjugate Chem.3:397-401；Thorpe et al.(1987)Cancer Res.47:5924-5931；Gordon et al.(1987)Proc.Natl.Acad Sci.84:308-312；Walden et al.(1986)J.Mol.Cell Immunol.2:191-197；Carlsson et al.(1978)Biochem.J.173:723-737；Mahan et al.(1987)Anal.Biochem.162:163-170；Wawrzynczaket al.(1992)Br.J.Cancer 66:361-366；Fattom et al.(1992)Infection&Immun.60:584-589)。这些试剂可用于在异源部分的N末端部分与本发明提供的ADA2的C末端部分之间、或者在每个这些部分与接头之间形成共价键。这些试剂包括但不限于：N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP；二硫键接头)；磺酸琥珀酰亚胺基6-[3-(2-吡啶基二硫代)丙酰胺]己酸酯(磺酸-LC-SPDP)；琥珀酰亚胺基氧基羰基-α-甲基苯甲基硫代硫酸酯(SMBT，位阻的二硫酸接头)；琥珀酰亚胺基6-[3-(2-吡啶基二硫代)丙酰胺己酸酯(LC-SPDP)；磺酸琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯(磺酸-SMCC)；琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶基二硫代)丁酸酯(SPDB；位阻的二硫键接头)；磺酸琥珀酰亚胺基2-(7-叠氮-4-甲基香豆素-3-乙酰胺)乙基-1,3'-二硫代丙酸酯(SAED)；磺酸-琥珀酰亚胺基7-叠氮-4-甲基香豆素-3-乙酸酯(SAMCA)；磺酸琥珀酰亚胺基-6-[α-甲基-α-(2-吡啶基二硫代)甲苯酰胺]-己酸酯(磺酸-LC-SMPT)；1,4-二-[3'-(2'-吡啶基二硫代)丙酰胺]丁烷(DPDPB)；4-琥珀酰亚胺基氧基羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基硫代)甲苯(SMPT，位阻的二硫酸接头)；磺酸琥珀酰亚胺基-6-[α-甲基-α-(2-吡啶基二硫代)甲苯酰胺]己酸酯(磺酸-LC-SMPT)；间-马来酰亚胺苯甲酰基-N-羟基-琥珀酰亚胺酯(MBS)；间-马来酰亚胺苯甲酰基-N-羟基磺酸-琥珀酰亚胺酯(磺酸-MBS)；N-琥珀酰亚胺基(4-碘乙酰)氨基苯甲酸酯(SIAB；硫醚接头)；磺酸琥珀酰亚胺基-(4-碘乙酰基)氨基苯甲酸酯(磺酸-SIAB)；琥珀酰亚胺基-4-(对-马来酰亚胺苯基)丁酸酯(SMPB)；磺酸琥珀酰亚胺基-4-(对-马来酰亚胺-苯基)丁酸酯(磺酸-SMPB)；叠氮苯甲酰酰肼(ABH)；马来酰亚胺己酰基(MC)；马来酰亚胺丙酰基(MP)；琥珀酰亚胺基4-(K-马来酰亚胺甲基)-环己烷-1-羧酸酯(SMCC)；间-马来酰亚胺苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)；N-琥珀酰亚胺基(4-碘乙酰基)氨基苯甲酸酯(SIAB)；及琥珀酰亚胺基6-[3-(2-吡啶基二硫代)-丙酰胺己酸酯(LC-SPDP)(见例如美国专利号7,375,078)。其它举例的接头包括但不限于具有下式的接头：
—C(O)CH2OCH2C(O)—，
—C(O)CH2NHCH2C(O)—，
—C(O)CH2SCH2C(O)—，
—C(O)CH2CH2CH2C(O)—，及
—C(O)CH2CH2C(O)—。
这些接头例如可与肽接头组合使用，如增加灵活性或者溶解性或者提供给或消除位阻的那些肽接头。可以应用本领域技术人员已知的连接多肽分子与另一分子的任何其它接头。一般性质是使得所得分子保留腺苷脱氨酶功能及蛋白质的稳定性。对于在体内使用ADA2缀合物或融合蛋白，通常所述接头必须与给予动物包括人是生物相容的。
E.产生编码ADA2的核酸及其多肽的方法
如本发明所述任何ADA2多肽、包括其变体或修饰形式可以通过本领域熟知的用于蛋白质纯化和重组蛋白质表达的方法获得。多肽也可以化学合成。修饰的或者变体形式可以从野生型多肽使用标准重组DNA方法工程化。例如，任何ADA2、包括变体或修饰形式均可以从野生型多肽通过如定向诱变工程化。
1.编码ADA2多肽的核酸的分离或制备
多肽可以使用本领域已知的克隆和分离核酸分子的任何可利用的方法克隆或分离。这种方法包括PCR扩增核酸及筛选文库，包括核酸杂交筛选、基于抗体的筛选及基于活性的筛选。例如，当多肽通过重组方式产生时，可以使用本领域技术人员已知的鉴别编码希望的基因的核酸的任何方法。本领域可获得的任何方法均可用于获得编码ADA2多肽的全长或部分(即涵盖完整编码区)cDNA或基因组DNA克隆，例如从细胞或者组织来源获得。
扩增核酸的方法可用于分离编码希望的多肽的核酸分子，包括例如聚合酶链反应(PCR)方法。这种方法的实例包括使用Perkin-Elmer Cetus热循环仪和Taq聚合酶(GeneAmp,Applied Biosystems,Carlsbad,CA)。含有核酸的材料可用作起始材料，从中可以分离编码希望的多肽的核酸分子。例如，DNA和mRNA制备物、细胞提取物、组织提取物、液体样品(例如血液、血清、唾液)、来自健康和/或患病对象的样品可用于扩增方法中。所述来源可以是任何真核生物物种包括但不限于脊椎动物、哺乳动物、人、猪、牛、猫、禽、马、犬及其它灵长类动物来源。核酸文库也可以用作起始材料的来源。可以设计引物以扩增希望的多肽。例如，可以基于从中产生希望的多肽的表达的序列来设计引物。引物可以基于多肽氨基酸序列的回译而设计。如果需要，简并引物可用于扩增。与希望的序列的3’和5’末端的序列杂交的寡核苷酸引物可用作引物以通过PCR扩增来自核酸样品的序列。引物可用于扩增全长ADA2。可以对通过扩增产生的核酸分子测序并证实其编码希望的多肽。
此外，编码ADA2多肽的核酸分子可以化学合成或者以半合成方式产生。合成或半合成产生的核酸分子可以编码任何ADA2的氨基酸序列，如在上文章节C中描述的任何ADA2。例如，合成或半合成产生的核酸分子可以由具有如本文所述任何核苷酸序列的核酸分子编码。化学合成的核酸分子可以跨越野生型ADA2基因全长或者其截短的序列。化学基因合成可以通过本领域已知的任何方法实现，如退火化学合成的寡核苷酸。半合成的基因装配如Gibson装配方法也可用于产生编码如本发明所述任何ADA2多肽、包括其变体的核酸分子。
编码任何ADA2多肽的核酸可以是密码子优化的核酸分子，其中密码子针对用于产生多肽的表达系统优化(即在表达系统生物体中优选的密码子在合成的核酸中更频繁使用)。例如，对于在大肠杆菌表达系统中产生多肽，每个氨基酸的密码子可以优化，由此在大肠杆菌中最优选的密码子用于每个氨基酸。
另外的核苷酸序列可以与多肽编码核酸分子、包括含有限制性核酸内切酶位点的接头序列结合，以将合成的基因克隆进载体中，例如蛋白质表达载体或者设计为扩增核心蛋白编码DNA序列的载体。进一步地，具有功能性DNA元件的另外的核苷酸序列可以与多肽编码核酸分子可操纵地连接。举例的这种序列包括但不限于设计为促进细胞内蛋白质表达的启动子序列，及设计为促进蛋白质分泌的分泌序列，如异源信号序列。这种序列为本领域技术人员已知。另外的核苷酸残基序列如具有蛋白质结合区的碱基序列也可以与酶编码核酸分子连接。这种区域包括但不限于促进或编码促进酶由特异靶细胞摄取或者另外改变合成基因产物的药代动力学的蛋白质的残基序列。
此外，可以加入标签或其它部分以例如有助于多肽的检测或者亲和性纯化。例如，另外的核苷酸残基序列如具有表位标签或其它可检测标记的碱基序列也可以与酶编码核酸分子连接。举例的这种序列包括编码标签或Strep标签的核酸序列。
然后可以将鉴别和分离的核酸插入合适的克隆载体中。可以使用本领域已知的大量载体-宿主系统。可能的载体包括但不限于质粒或修饰的病毒，但是载体系统必须与使用的宿主细胞相容。这种载体包括但不限于噬菌体如λ衍生物，或者质粒如pCMV4、pCMV-Script(Agilent Technologies,Santa Clara,CA)、pBR322、pUC质粒衍生物或者pBluescript载体(Stratagene,La Jolla,CA)。插入克隆载体中可例如通过将DNA片段与具有互补粘端的克隆载体连接而实现。也可以使用TOPO克隆载体(Invitrogen,Carlsbad,CA)实现插入。
如果用于使DNA片段化的互补限制位点在克隆载体中不存在，则DNA分子的末端可以用酶修饰。或者，任何希望的位点可以通过在DNA末端上连接核苷酸序列(接头)而产生；这些连接的接头可以含有编码限制性核酸内切酶识别序列的特异性化学合成的寡核苷酸。在另一方法中，裂解的载体和蛋白质基因可以通过均聚加尾而修饰。
重组分子可以通过例如转化、转染、感染、电穿孔和声孔效应导入宿主细胞中，以便产生基因序列的多个拷贝。在特定的实施方案中，用掺入分离的蛋白质基因的重组DNA分子、cDNA或者合成的非DNA序列转化宿主细胞使得可以产生基因的多个拷贝。因此，通过生长转化体、从转化体中分离重组DNA分子及当需要时从分离的重组DNA中挽回插入的基因，由此可以获得大量的基因。
除了重组产生之外，本发明提供的任何ADA2、包括其变体或修饰形式，可以通过使用固相技术通过直接肽合成法产生(见例如Stewart et al.(1969)Solid-Phase PeptideSynthesis,WH Freeman Co.,San Francisco；Merrifield J(1963)J Am Chem Soc.,85:2149-2154)。可以使用人工技术或者自动化进行体外蛋白质合成。自动化合成可以例如使用Applied Biosystems 431A肽合成仪(Perkin Elmer,Foster City CA)根据厂商指导进行。多肽的各种片段可以使用化学方法单独化学合成及组合。
2.突变体或修饰的核酸及编码多肽的产生
本发明提供的修饰可以通过本领域技术人员熟知的标准DNA重组技术产生。可以使用本领域已知的在靶蛋白质中产生任一或多个氨基酸突变的任何方法。所述方法包括标准定向诱变(使用例如得自Stratagene的QuikChange试剂盒)编码核酸分子，或者通过固相肽合成方法。如果这种方法用于产生编码ADA2的核酸序列，在化学基因合成或者半合成基因装配期间也可以在野生型ADA2或者本发明提供的任何ADA2变体中引入位点特异性变异。
3.载体和细胞
对于一或多个希望的蛋白质如本发明描述的任何ADA2多肽的重组表达，可以将含有编码所述蛋白质的全部或部分核苷酸序列的核酸插入合适的表达载体中，即含有转录和翻译插入的蛋白编码序列必需的元件的载体。必需的转录和翻译信号也可由酶基因的天然启动子和/或其侧翼区提供。
本发明还提供了含有编码酶的核酸的载体。本发明还提供了含有所述载体的细胞。所述细胞包括真核细胞和原核细胞，所述载体是适用于其中的任何载体。
本发明提供了含有载体的原核细胞和真核细胞，包括内皮细胞。这种细胞包括细菌细胞、酵母细胞、真菌细胞、古细菌、植物细胞、昆虫细胞和动物细胞。通过在编码的蛋白质由该细胞表达的条件下生长上述细胞并回收表达的蛋白质，由此将细胞用于产生其蛋白质。对于本发明，例如，所述酶可以分泌进培养基中。
本发明提供了这样的载体，其含有与天然或异源信号序列偶联的编码任何ADA2多肽或变体的核苷酸序列以及其多个拷贝。可以选择载体以在细胞中表达酶蛋白或者由此酶蛋白作为分泌的蛋白表达。
本领域技术人员已知的任何各种宿主-载体系统可用于表达蛋白质编码序列。这些包括但不限于用病毒(例如痘苗病毒、腺病毒及其它病毒)感染的哺乳动物细胞系统，用病毒(例如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；微生物如含有酵母载体的酵母，或者用噬菌体、DNA、质粒DNA或者粘粒DNA转化的细菌。载体的表达元件在其强度和特异性方面有不同。根据使用的宿主-载体系统，可以使用众多的合适的转录和翻译元件的任一。
本领域技术人员已知的将DNA片段插入载体中的任何方法均可用于构建含有嵌合基因的表达载体，所述嵌合基因含有合适的转录/翻译控制信号和蛋白质编码序列。这些方法可包括体外重组DNA和合成技术及体内重组(遗传重组)。编码蛋白质或者其结构域、衍生物、片段或同系物的核酸序列的表达可以由另一核酸序列调节，以便所述基因或其片段在用重组DNA分子转化的宿主中表达。例如，蛋白质的表达可以由本领域已知的任何启动子/增强子控制。在特定的实施方案中，启动子对于希望的蛋白质的基因不是天然的。可以使用的启动子包括但不限于SV40早期启动子(Bernoist and Chambon,Nature 290:304-310(1981))，包含于Rous肉瘤病毒的3’长末端重复中的启动子(Yamamoto et al.,Cell 22:787-797(1980))，疱疹病毒胸苷激酶启动子(Wagner et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA78:1441-1445(1981))，金属硫蛋白基因的调节序列(Brinster et al.,Nature 296:39-42(1982))；原核生物表达载体如β-内酰胺酶启动子(Jay et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA78:5543(1981))或者tac启动子(DeBoer et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:21-25(1983)；也见“Useful Proteins from Recombinant Bacteria”:in Scientific American242:74-94(1980))；含有胭脂碱合成酶启动子的植物表达载体(Herrera-Estrella etal.,Nature 303:209-213(1984))或者花椰菜花叶病毒35S RNA启动子(Gardner et al.,Nucleic Acids Res.9:2871(1981))，以及光合作用酶核酮糖二磷酸羧化酶的启动子(Herrera-Estrella et al.,Nature 310:115-120(1984))；来自酵母及其它真菌的启动子元件，如Gal4启动子，醇脱氢酶启动子，磷酸甘油激酶启动子，碱性磷酸酶启动子，以及呈现组织特异性且已经用于转基因动物中的如下动物转录控制区：弹性蛋白酶I基因控制区，其在胰腺腺泡细胞中是活性的(Swift et al.,Cell 38:639-646(1984)；Ornitz et al.,Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.50:399-409(1986)；MacDonald,Hepatology 7:425-515(1987))；胰岛素基因控制区，其在胰腺β细胞中是活性的(Hanahan et al.,Nature315:115-122(1985))，免疫球蛋白基因控制区，其在淋巴样细胞中是活性的(Grosschedlet al.,Cell 38:647-658(1984)；Adams et al.,Nature 318:533-538(1985)；Alexanderet al.,Mol.Cell Biol.7:1436-1444(1987))，小鼠乳腺肿瘤病毒控制区，其在睾丸、乳腺、淋巴样和肥大细胞中是活性的(Leder et al.,Cell 45:485-495(1986))，白蛋白基因控制区，其在肝脏中是活性的(Pinkert et al.,Genes and Devel.1:268-276(1987))，甲胎蛋白基因控制区，其在肝脏中是活性的(Krumlauf et al.,Mol.Cell.Biol.5:1639-1648(1985)；Hammer et al.,Science 235:53-58(1987))，α-1抗胰蛋白酶基因控制区，其在肝脏中是活性的(Kelsey et al.,Genes and Devel.1:161-171(1987))，β球蛋白基因控制区，其在骨髓细胞中是活性的(Magram et al.,Nature 315:338-340(1985)；Kollias etal.,Cell 46:89-94(1986))，髓鞘碱性蛋白基因控制区，其在脑的少突胶质细胞中是活性的(Readhead et al.,Cell 48:703-712(1987))，肌球蛋白轻链-2基因控制区，其在骨骼肌中是活性的(Shani,Nature 314:283-286(1985))，以及促性腺释放激素基因控制区，其在下丘脑的促性腺细胞中是活性的(Mason et al.,Science 234:1372-1378(1986))。
在特定的实例中，使用这样的载体，其含有与编码希望的蛋白质或其结构域、片段、衍生物或同系物的核酸可操纵地连接的启动子，一或多个复制起点及任选含有一或多个选择标记(例如抗生素抗性基因)。转化大肠杆菌细胞的质粒载体例如包括pQE表达载体(得自Qiagen,Valencia,CA)。pQE载体可以将6×His标签置于重组蛋白质的N或C末端。这种质粒包括pQE32、pQE30和pQE31，其提供所有三个读框的多克隆位点及供于N末端6×His标签的蛋白质的表达(需要补充I w/pCMV材料)。转化大肠杆菌细胞的其它举例的质粒载体包括例如pD444-SR(DNA2.0,Menlo Park,CA)，其含有异丙基β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)可诱导T5启动子，强核糖体结合位点(RBS)及pUC衍生的复制起点。转化大肠杆菌细胞的其它举例的质粒载体包括例如pET表达载体(见美国专利4,952,496；得自Novagen,Madison,WI；也见由Novagen描述该系统公开的文献)。这种质粒包括pET11a，其含有T7lac启动子、T7终止子、可诱导的大肠杆菌lac操纵基因及lac阻抑基因；pET12a-c，其含有T7启动子、T7终止子及大肠杆菌ompT分泌信号；及pET15b和pET19b(Novagen,Madison,WI)，其含有His-TagTM前导序列用于His柱纯化及凝血酶裂解位点，使得在经柱纯化后可以裂解，以及T7-lac启动子区和T7终止子。
举例的哺乳动物细胞表达载体是pCMV-Script表达载体(Agilent Technologies,Santa Clara,CA；Cat.No.212220)。pCMV-Script载体衍生自基于高拷贝数pUC的质粒，含有人巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子以在各种细胞系中组成型表达克隆的插入体。所述载体含有编码β-内酰胺酶启动子和SV40早期启动子的DNA，连接于新霉素/卡那霉素抗性基因(neo/kan)、f1复制起点、(CMV)立即早期启动子、SV40晚期聚腺苷酸化信号(SV40)及单纯疱疹病毒(HSV)-胸苷激酶(TK)polyA信号。哺乳动物表达自体的另一实例是HZ24表达载体，衍生自pCI载体主链(Promega)。其含有编码β-内酰胺酶抗性基因(AmpR)的DNA，F1复制起点，巨细胞病毒立即早期增强子/启动子区(CMV)及SV40晚期聚腺苷酸化信号(SV40)。表达载体还具有来自ECMV病毒(Clontech)的内部核糖体进入位点(IRES)以及小鼠二氢叶酸还原酶(DHFR)基因。
本发明提供的任何ADA2变体也可以在表达载体内编码以在体内表达，特别是在靶向肿瘤的或者溶瘤细胞载体中以在肿瘤细胞中表达。在体内表达的载体包括溶瘤细胞载体以输送至肿瘤并在此表达或者靶向输送至其它细胞和组织，或者基因治疗载体。溶瘤细胞载体包括新城疫病毒、细小病毒、痘苗病毒、呼肠病毒、麻疹病毒、水疱口炎病毒(VSV)、溶瘤细胞腺病毒和疱疹病毒的病毒载体。靶向输送的溶瘤细胞病毒载体为本领域技术人员熟知，包括例如水疱口炎病毒，见例如美国专利号7,731,974、7,153,510、6,653,103和美国专利公开号2010/0178684、2010/0172877、2010/0113567、2007/0098743、20050260601、20050220818和欧洲专利号1385466、1606411和1520175所述；单纯疱疹病毒，见例如美国专利号7,897,146、7731,952、7,550,296、7,537,924、6,723,316、6,428,968和美国专利公开号2011/0177032、2011/0158948、2010/0092515、2009/0274728、2009/0285860、2009/0215147、2009/0010889、2007/0110720、2006/0039894和20040009604；逆转录病毒，见例如美国专利号6,689,871、6,635,472、6,639,139、5,851,529、5,716,826、5,716,613和美国专利公开号20110212530所述；及腺伴随病毒，见例如美国专利号8,007,780、7,968,340、7,943,374、7,906,111、7,927,585、7,811,814、7,662,627、7,241,447、7,238,526、7,172,893、7,033,826、7,001,765、6,897,045和6,632,670。载体可以导入细胞中以进行细胞治疗，如本文所述用于免疫治疗的免疫细胞。
靶向输送本发明提供的任何ADA2变体的载体也可以编码另外的物质，如用于组合治疗的物质，其是蛋白质或多肽，例如其它免疫调节剂、化疗剂、免疫检查点抑制剂或者透明质酸降解酶如可溶的透明质酸酶或者聚合物缀合的可溶透明质酸酶(例如PEGPH20)。例如，除了本发明提供的任何ADA2变体之外，透明质酸降解酶可以在表达载体中编码以在体内表达，特别是在靶向肿瘤的或者溶瘤细胞载体中编码以在肿瘤细胞中表达(见例如美国专利号8,450,470和美国专利公开号2011/0152359；也见美国专利公开号2012/0148535所述)。
编码和表达本发明提供的ADA2变体的免疫细胞
本发明提供的任何修饰的腺苷脱氨酶2(ADA2)变体可用于过继免疫治疗方法中。本领域技术人员熟知过继免疫治疗方法，该方法使用修饰的免疫细胞表达治疗性蛋白质或者其它蛋白质及任选表达其它增加免疫应答的蛋白质和受体，以克服癌症的免疫抑制作用和/或使免疫细胞靶向特定细胞。因此，本发明提供了免疫细胞，其编码一或多种本发明提供的ADA2变体，及任选编码另外的分子以增强肿瘤靶向和免疫应答，特别是克服某些肿瘤的免疫抑制作用。所述免疫细胞包括但不限于肿瘤侵润淋巴细胞(TIL)、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、天然杀伤(NK)细胞、淋巴因子激活的杀伤(LAK)细胞，及免疫细胞如T细胞，其表达嵌合抗原受体(CAR)。
通过给予免疫细胞的免疫治疗方法为本领域熟知。免疫细胞可以是自体或者异源的，但是典型是从治疗对象收获的自体细胞，修饰为表达编码本发明提供的任一或多种ADA2变体的核酸，及处理为根据需要除去肿瘤细胞以及如果需要则进行扩增。核酸可以导入例如表达载体或者导致编码ADA2变体的DNA掺入免疫细胞的染色体中的载体或人工染色体中。将所述免疫细胞培养、扩增并导入具有待治疗肿瘤的对象。在一些实施方案中，免疫细胞靶向肿瘤细胞。例如，在一些实施方案中，细胞编码ADA2变体及也表达嵌合抗原受体(CAR)。含有靶向特定肿瘤抗原的CAR的细胞及制备这种细胞的方法为本领域技术人员已知(见例如国际PCT公开号WO 2014/186469)。
CAR为本领域熟知，见例如国际PCT公开号WO 2012/031744、WO 2012/079000、WO2013/059593、WO 2015/112626、WO 2014/011988和美国专利号8,465,743，其描述了CAR及表达其的细胞以及其应用和改良；也见美国专利公开号US 20150064154，其描述了产生用于细胞治疗的靶向肿瘤的免疫细胞的细胞和表达系统。细胞可以使用本领域技术人员已知的标准方法转染、转导或者另外修饰以表达这些异源蛋白质。CAR可以工程化为靶向感兴趣的任何肿瘤细胞，包括但不限于HER2、CD19、HERV-K、CD20、CD22、ROR1、间皮素、CD33/IL3Ra、c-Met、PSMA、糖脂F77、EGFRvIII、GD-2、NY-ESO-1TCR、MAGE A3TCR和GD2及其组合。举例的由CAR识别的肿瘤抗原为本领域技术人员已知(见例如Renkvist et al.Cancer ImmunolImmunother.50(1):3-15(2001)和Novelino et al.Cancer Immunol Immunother.54(3):187-207(2005))。抗原结合区可包括例如衍生自特异于肿瘤细胞抗原的特定人单克隆抗体的单链可变片段(scFv)的VH和VL链的片段，或者可包括人抗原特异性抗体的多个抗原结合结构域。例如，scFv可以与柔性跨膜结构域连接，随后是基于酪氨酸的激活基序(见例如Sadelain et al.Curr.Opin.Immunol.21,215-223(2009))。CAR可包括另外的来自共刺激分子如CD28和CD137的激活结构域以增强T细胞存活和增殖。CAR和/或表达其的细胞可进一步编码和表达共刺激信号区，其包括例如共刺激分子的细胞内结构域，如CD27、CD28、4-lBB、OX40、CD30、CD40、PD-1、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、特异性结合CD83的配体的细胞内结构域，及其任何组合。
本领域已知许多CAR构建体及其表达载体。所述表达载体可以是保留附加型的载体，或者是导致编码CAR和/或ADA2变体的核酸掺入染色体中的载体，如通过同源整合或者通过包含转座子序列，由此转座酶的存在使得编码序列整合进转染的细胞的染色体中。编码ADA2变体和CAR的核酸可以掺入相同载体中或者导入分别的载体中。如果使用转座子，则细胞可以表达促进编码CAR和/或ADA2变体的核酸整合进转染的细胞的染色体中的转座酶。转座子系统为本领域已知(见例如国际PCT公开号WO2014/186469)。转座酶可以提供在DNA表达载体中或者作为可表达的RNA或者瞬时表达的蛋白质。转座子系统为本领域技术人员已知，由此在转基因细胞中不发生转座酶的长期表达。根据所述实施方案可以使用任何转座酶系统。在其它方面，细胞可以用慢病毒感染以促进CAR编码序列和编码ADA2变体的核酸序列整合进细胞基因组中。
4.表达
任何腺苷脱氨酶2(ADA2)多肽、包括变体ADA2多肽，可以通过本领域技术人员已知的任何方法产生，包括体内和体外方法。希望的蛋白质可以在适于产生需要量和形式(例如给予及治疗需要的量和形式)的蛋白质的任何生物体中表达。表达宿主包括原核生物和真核生物，如大肠杆菌、酵母、植物、昆虫细胞、哺乳动物细胞，包括人细胞系和转基因动物。表达宿主的蛋白质产生水平以及在表达的蛋白质上呈现的翻译后修饰类型可不同。表达宿主的选择可以基于这些及其它因素进行，如管理和安全性考虑、生产成本和纯化的需要与方法。本发明提供的任何ADA2变体也可以在用于体内表达的表达载体中编码，特别是在靶向肿瘤的或溶瘤细胞载体中编码以在肿瘤细胞中表达。
许多表达载体可为本领域技术人员获得并已知，可用于表达蛋白质。表达载体的选择受选择的宿主表达系统的影响。通常，表达载体可包含转录启动子及任选包含增强子、翻译信号及转录和翻译终止信号。用于稳定转化的表达载体典型具有可选择标记，使得可以选择和维持转化的细胞。在一些情况中，复制起点可用于扩增载体的拷贝数。
ADA2多肽、包括变体ADA2多肽，也可以用作或者表达作为蛋白质融合体。例如，可以产生酶融合体以为所述酶加入另外的功能性。举例的酶融合蛋白包括但不限于融合信号序列、标签如定位标签例如His6标签或FLAGTM标签或者纯化标签例如GST融合体，以及融合指导蛋白质分泌和/或膜结合的序列。
a.原核细胞
原核细胞，尤其是大肠杆菌，提供了产生大量蛋白质的系统。大肠杆菌的转化是本领域技术人员熟知的简便快速的技术。大肠杆菌的表达载体可含有可诱导启动子，这种启动子可用于诱导高水平蛋白表达及表达对宿主细胞呈现一些毒性的蛋白。举例的可诱导启动子包括lac启动子、trp启动子、杂合tac启动子、T7和SP6RNA启动子以及温度调节的λPL启动子。
如本发明提供的任何蛋白质，可以在大肠杆菌的细胞质环境中表达。细胞质是还原环境，对于一些分子而言这可导致不溶包涵体形成。还原剂如二硫代苏糖醇和β-巯基乙醇及变性剂如盐酸胍和尿素可用于再溶解蛋白质。另一方法是蛋白质在细菌的周质空间表达，这提供了氧化环境及伴侣蛋白样和二硫化物异构酶，可以导致可溶蛋白质产生。典型地，前导序列与被表达的蛋白质融合，指导所述蛋白质至周质空间。然后通过周质内部的信号肽酶除去前导序列。举例的靶向周质的前导序列包括来自果胶裂解酶基因的pelB前导序列以及衍生自碱性磷酸酶基因的前导序列。在一些情况中，周质表达使得表达的蛋白质可以渗漏进培养基中。蛋白质的分泌允许从培养上清快速简便纯化。非分泌的蛋白质可以通过渗透溶解得自周质。与细胞质表达相似，在一些情况中蛋白质可能成为不溶的，可使用变性剂和还原剂促进溶解和再折叠。诱导和生长温度也可以影响表达水平和溶解性，典型地使用的温度在25℃-37℃。典型地，细菌产生无糖基化蛋白质。因此，如果蛋白质需要糖基化以发挥功能，可以在从宿主细胞纯化之后在体外加入糖基化。
b.酵母细胞
酵母如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisae)、裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)及巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)是熟知的可用于产生蛋白质的酵母表达宿主，如产生本发明所述的任何蛋白质。酵母可以用附加型复制载体转化或者通过同源重组稳定染色体整合而转化。典型地，可诱导启动子用于调节基因表达。举例的这种启动子包括GAL1、GAL7和GAL5及金属硫蛋白启动子，如CUP1、AOX1，或者其它毕赤酵母或其它酵母启动子。表达载体通常包括可选择标记如LEU2、TRP1、HIS3和URA3以选择和维持转化的DNA。在酵母中表达的蛋白质通常是可溶的。与伴侣蛋白如Bip及蛋白质二硫化物异构酶的共表达可改良表达水平和溶解性。此外，在酵母中表达的蛋白质可以使用分泌信号肽融合体定向分泌，如来自酿酒酵母的酵母交配型α-因子分泌信号及与酵母细胞表面蛋白如Aga2p交配粘附受体或者Arxula adeninivorans葡糖淀粉酶的融合体。蛋白酶裂解位点如Kex-2蛋白酶裂解位点可以工程化为在多肽退出分泌途径时从表达的多肽中除去融合的序列。酵母也能在Asn-X-Ser/Thr基序糖基化。
c.昆虫细胞
昆虫细胞，特别是使用杆状病毒表达，可用于表达多肽如任何ADA2多肽或变体。昆虫细胞表达高水平的蛋白质且能进行高等真核生物使用的大多数翻译后修饰。杆状病毒具有限制性宿主范围，其改良真核细胞表达的安全性及减少管理担忧。典型的表达载体使用启动子以高水平表达，如杆状病毒的多角体蛋白启动子。常用的杆状病毒系统包括杆状病毒如苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)核多角体病毒(AcNPV)及家蚕(Bombyxmori)核多角体病毒(BmNPV)及昆虫细胞系如衍生自草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)的Sf9、一星粘虫(Pseudaletia unipuncta)(A7S)和大红斑蝶(Danaus plexippus)(DpN1)。对于高水平表达，被表达的分子的核苷酸序列在病毒的多角体蛋白起始密码子的直接下游融合。哺乳动物分泌信号在昆虫细胞中精确加工并可用于将表达的蛋白质分泌进培养基中。此外，细胞系一星粘虫(A7S)和大红斑蝶(DpN1)产生具有与哺乳动物细胞系统相似的糖基化模式的蛋白质。
昆虫细胞中另一表达系统是使用稳定转化的细胞。细胞系如Schneider2(S2)和Kc细胞(黑腹果蝇(Drosophila melanogaster))及C7细胞(白纹伊蚊(Aedes albopictus))可用于表达。果蝇金属硫蛋白启动子可用于在镉或铜重金属诱导存在下诱导高水平表达。表达载体典型通过使用可选择标记如新霉素和潮霉素维持。
d.哺乳动物细胞
哺乳动物表达系统可用于表达蛋白质，包括任何ADA2多肽，包括变体ADA2多肽。可以通过病毒感染如腺病毒或者通过直接DNA转移如脂质体、磷酸钙、DEAE-葡聚糖及通过物理方式如电穿孔和显微注射等方式，将表达构建体转移至哺乳动物细胞。哺乳动物细胞表达载体典型包含mRNA帽位点、TATA框、翻译起始序列(Kozak共有序列)和聚腺苷酸化元件。也可以加入IRES元件以允许与另一基因如可选择标记的双顺反表达。这种载体通常包括转录启动子-增强子用于高水平表达，例如SV40启动子-增强子、人巨细胞病毒(CMV)启动子及Rous肉瘤病毒(RSV)的长末端重复。这些启动子-增强子在许多细胞类型中是活性的。组织和细胞类型启动子和增强子区域也可以用于表达。举例的启动子/增强子区域包括但不限于来自如下基因的那些：弹性蛋白酶I、胰岛素、免疫球蛋白、小鼠乳腺肿瘤病毒、白蛋白、甲胎蛋白、α1抗胰蛋白酶、β球蛋白、髓鞘碱性蛋白、肌球蛋白轻链2，及促性腺激素释放激素基因控制。可选择标记可用于选择和维持具有表达构建体的细胞。举例的可选择标记基因包括但不限于潮霉素B磷酸转移酶、腺苷脱氨酶、黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶、氨基糖苷磷酸转移酶、二氢叶酸还原酶(DHFR)和胸苷激酶。例如，表达可以在氨甲喋呤存在下进行，以仅选择表达DHFR基因的那些细胞。与细胞表面信号传导分子如TCR-ζ和FcεRI-γ的融合可以指导蛋白质以活性状态在细胞表面表达。
许多细胞系可用于哺乳动物表达，包括小鼠、大鼠、人、猴、鸡和仓鼠细胞。举例的细胞系包括但不限于CHO、Balb/3T3、HeLa、MT2、小鼠NS0(非分泌)及其它骨髓瘤细胞系、杂交瘤和异杂交瘤细胞系、淋巴细胞、成纤维细胞、Sp2/0、COS、NIH3T3、HEK293、293S、2B8和HKB细胞。细胞系也可以适于无血清培养基，其促进分泌的蛋白质从细胞培养基纯化。例子包括CHO-S细胞(Invitrogen,Carlsbad,CA,cat#11619-012)和无血清EBNA-1细胞系(Phamet al.,(2003)Biotechnol.Bioeng.84:332-342)。也可获得适合在为了最大表达而优化的特定培养基中生长的细胞系。例如，DG44CHO细胞适合在化学限定的无动物产物培养基中悬浮培养生长。
e.植物
转基因植物细胞和植物可用于表达蛋白质如本发明描述的任何蛋白质。典型地将表达构建体移至植物中，使用定向DNA转移如微粒轰击和PEG介导的转移进原生质体中，及用农杆菌介导的转化。表达载体可包括启动子和增强子序列、转录终止元件和翻译控制元件。表达载体和转化技术通常在双子叶植物宿主如拟南芥和烟草与单子叶植物宿主如玉米和水稻之间不同。用于表达的植物启动子例如包括花椰菜花叶病毒启动子、胭脂碱合成酶启动子、核糖二磷酸羧化酶启动子及遍在蛋白和UBQ3启动子。可选择标记如潮霉素、磷酸甘露糖异构酶和新霉素磷酸转移酶通常用于促进选择和维持转化的细胞。转化的植物细胞可以作为细胞、聚集体(愈伤组织)维持，或者再生为全植物。转基因植物细胞也可以包括工程化以产生任何ADA2多肽的藻类。由于植物具有与哺乳动物细胞不同的糖基化模式，这可以影响在这些宿主中产生的蛋白质的选择。
5.纯化技术
从宿主细胞纯化多肽、包括任何ADA2多肽、包括变体ADA2多肽的方法依赖于选择的宿主细胞和表达系统。对于分泌的分子，蛋白质通常在除去细胞之后从培养基纯化。对于细胞内表达，可以裂解细胞及从提取物纯化蛋白质。当转基因生物体如转基因植物和动物用于表达时，组织或器官可用作起始材料以产生裂解的细胞提取物。此外，转基因动物产生可包括在乳汁或蛋中产生多肽，将其收集，如果需要时可以使用本领域的标准方法提取蛋白质及进一步纯化。
蛋白质，如ADA2单多肽，可以使用本领域已知的标准蛋白质纯化技术纯化，包括但不限于SDS-PAGE、大小分级分离和大小排阻层析、硫酸铵沉淀及离子交换层析，如阴离子交换层析。亲和性纯化技术也可用于改良制备物的效力和纯度。例如，结合ADA2酶的抗体、受体及其它分子可用于亲和性纯化中。表达构建体也可以工程化为给蛋白质加入亲和性标签如FLAGTM表位、GST融合体或His6，及分别使用抗-FLAGTM抗体、谷胱甘肽树脂和Ni-树脂进行亲和性纯化。
当蛋白质由转化的细菌典型在启动子诱导后大量表达时，尽管表达可以是组成型的，多肽可以形成不溶聚集物。本领域技术人员已知适于纯化多肽包涵体的一些方案。众多的变化为本领域技术人员显而易见。例如，在一种方法中，通常将细胞悬浮液进行离心，将含有包涵体的沉淀物重悬浮于缓冲液中，其不溶解但是用例如20mM Tris-HCl(pH 7.2)、1mM DTA、150mM NaCl和2％Triton-X 100非离子去污剂洗涤包涵体。可以重复洗涤步骤以除去尽可能多的细胞碎片。剩余的包涵体沉淀可以重悬浮于适当缓冲液中(例如20Mm磷酸钠，pH 6.8，150mM NaCl)。其它合适的缓冲液为本领域技术人员熟知。
或者，可以从细菌周质纯化蛋白质。在蛋白质输出到细菌周质的情况中，除了本领域技术人员已知的其它方法之外，细菌的周质级分可以通过冷渗透压休克分离。例如，在一种方法中，为了从周质分离重组多肽，将细菌细胞离心形成沉淀。将沉淀重悬浮于含有20％蔗糖的合适缓冲液中。为了裂解细胞，可以离心细菌并将沉淀重悬浮于冰冷的5mM MgSO4中并在冰浴中保持大约10分钟。离心细胞悬浮液，倒出上清并保存。上清中存在的重组蛋白质可以通过本领域技术人员已知的标准分离技术如本文所述分离技术与宿主蛋白质分离。这些方法包括但不限于如下步骤：溶解性分级分离、大小差别过滤及柱层析。
可以收集并纯化分子量为或大约为95kDa-120kDa，通常是为或大约为100kDa-110kDa(包括端点)的ADA2蛋白质分子。当是单体形式时或者当在还原条件下在SDS PAGE上评定时，ADA2的分子量通常是或大约是50kDa-60kDa，如通常是或大约是57kDa-59kDa。应理解变体或其它修饰形式可以呈现出较高或较低的分子量。例如，本发明提供的典型高糖基化变体或者缀合物可以呈现出较高分子量。
纯度可以通过本领域已知的任何方法包括凝胶电泳方法和染色及分光光度技术评定。任何ADA2多肽、包括变体ADA2多肽，可以纯化为60％、70％、80％纯度，典型为至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％纯度。纯度可以通过标准方法如SDS-PAGE和考马斯蓝染色评定。
F.评定ADA2的活性和物理性质的方法
所述测定可用于评定本发明提供的任何ADA2蛋白分子、包括其野生型和变体和修饰形式的物理性质、稳定性和/或活性。所述性质和活性可以与生物活性和/或肿瘤治疗活性相关。所述测定可以在体外或体内进行。例如，所述测定可以用于评定ADA2的腺苷脱氨酶活性、肝素结合、热稳定性、pH最佳值、药代动力学、肿瘤生长抑制活性及其它活性和性质。在另一实例中，所述测定可用于评定给予本发明提供的任何ADA2的作用，包括给予剂量和途径的作用。所述测定也可以用于对本发明提供的配制物进行较小调整而同时保留ADA2用于治疗应用的活性。这种测定为本领域技术人员熟知。非限制性举例测定在下文章节中描述。
1.腺苷脱氨酶测定
本发明描述的任何ADA2、包括野生型、变体或缀合物的腺苷脱氨酶(ADA；EC3.5.4.4)活性可以使用本领域熟知的方法评定。ADA活性测定通常直接或间接测量酶反应产物的生产率。例如，肌苷或者氨的产生可以直接或者间接测量。在其它实例中，测量酶底物例如腺苷或2-脱氧腺苷的降低。底物的降低或者产物的增加可以通过分光光度测定法直接测量，或者通过随后使用生色底物或者改变反应吸收光谱的酶促或氧化还原反应间接测量。
例如，一些可商购的腺苷脱氨酶(ADA)测定如得自Q Kits(San Diego,CA；Cat.No.BQ014EALD)和Diazyme(Poway,CA；Cat.No.DZ117A-K)的ADA测定试剂盒，利用生色底物和分光光度测定读数确定通过ADA酶使腺苷至肌苷的转变。在这些测定中，肌苷的产生通过产生生色染料的多步骤酶反应检测。腺苷的酶促脱酰胺产生肌苷，其通过反应中存在的肌苷特异性嘌呤核苷磷酸化酶(PNP；EC 2.4.2.1)转变为次黄嘌呤。然后次黄嘌呤通过黄嘌呤氧化酶(XOD；EC 1.1.3.22)转变为尿酸和过氧化氢(H2O2)。H2O2进一步与N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺(EHSPT)和4-氨基安替比林(4-AA)在存在过氧化物酶(POD)下反应，产生醌染料，其使用UV分光光度计在556nm可以动力学方式检测。牛肝脏腺苷脱氨酶可用作标准物。测量在37℃在556nm随着时间的吸光度变化(ΔA556)。1单位的ADA定义为在37℃每分钟从腺苷中产生1μmole肌苷的ADA的量。腺苷脱氨酶活性使用下式计算：
1mU/mL＝(ΔA556/min×Tv)/(Sv×ε×l)
其中Tv＝反应总体积；Sv＝样品体积，ε＝32.2×10-3μM-1cm-1，l＝0.5cm。
ADA活性可以使用其它生色方法观测(见例如Manchenko,G.P.,Handbook ofDetection of Enzymes on Electrophoretic Gels,CRC Press,pp.453-454)。例如，在上述ADA测定中产生的H2O2可以通过加入吩嗪硫酸甲酯(PMS)观测，其通过H2O2被转变为二氢PMS，然后二氢PMS将氯化硝基四氮唑蓝(NBT)转变为甲甲的吸光度可以在570nm确定。
测量ADA活性的另一方法是测量当腺苷被脱氨形成肌苷时从中释放的氨。氨释放可以使用可商购的试剂盒测量，如Ammonia Assay kit(Cat.No.A0853,Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)。该试剂盒包含具有α-酮戊二酸和NADPH的干试剂。氨与α-酮戊二酸(KGA)和还原的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)在存在L-谷氨酸脱氢酶(GDH；Cat.No.G2294,Sigma-Aldrich)下反应。由于NADPH氧化为NADP+所致，在340nm吸光度的降低与氨浓度成比例，因此与腺苷脱氨酶活性成比例。吸光度的降低可以使用分光光度计测量。腺苷脱氨酶活性mU/mL(等价于μM/min)使用下式计算：
1mU/mL＝(ΔA/min×Tv)/(Sv×ε×l)
其中Tv＝总体积，Sv＝样品体积，ε＝6.22×10-3μM-1cm-1，l＝1cm。
其它基于分光光度测定的腺苷脱氨酶测定包括连续学光测定，其直接测量腺苷吸光度的变化。腺苷吸光度可以在265nm测量，测量随着时间的由于腺苷脱氨为肌苷而在265nm的吸光度降低。样品在25℃在含有0.1％(w/v)牛血清白蛋白(BSA)的100mM磷酸钾缓冲液pH7.5中制备，与1.35mM腺苷溶液pH 7.0在25℃保温。测量大约5分钟的在265nm吸光度的降低(ΔA265)。在这个测定中，ADA活性U/mL使用下式计算：
单位/mL酶＝(ΔA265/min)(Tv)(df))/(8.1)(VE)
其中Tv＝测定总体积(mL)；df＝稀释倍数；8.1＝在265nm腺苷的毫克分子消光系数；VE＝使用的酶的体积(mL)。
1单位每分钟在25℃在pH 7.5使1.0μmole腺苷脱氨为肌苷。这种方法可以较大规模进行，如在96孔微滴定平板中(见例如Lu et al.(2012)Clinica Chimica Acta 413:1637–1640)。
可以使用这种方法根据需要的变化形式以进行吸光度测量。腺苷和肌苷的UV吸收峰分别在261nm和249nm，光谱明显重叠。在脱氨反应期间，随着时间腺苷的吸光度降低而肌苷的吸光度而增加。为了确定其光谱与肌苷重叠的相对腺苷，进行两个分光光度测量。其中腺苷和肌苷具有相同消光系数并保持不变的等消光点是在253nm，是浓度非依赖性的。等消光点也根据参考点进行测量以校准体积和强度差异。在261nm的吸光度/253nm的吸光度(A261/A253)的比率用于基于标准曲线测量腺苷浓度的变化。
2.评定肝素结合的方法
肝素结合、或与另一GAG通过本发明描述的任何ADA2、包括其野生型、变体或缀合物的结合可以使用本领域熟知的方法评定。这些方法及本领域已知的评定与GAG结合的其它方法可用于评定结合和/或选择具有改变的肝素结合例如减弱的肝素结合或者增加的肝素结合的ADA2变体。通常，肝素结合对于金属离子、尿素和(阴离子、非离子及两性离子)洗涤剂的存在敏感。Ca2+和Mg2+及两性离子洗涤剂3-[(3-胆酰胺丙基)二甲铵]-1-丙磺酸盐增加肝素结合。NaCl、尿素、十二烷基硫酸钠和La3+的存在降低肝素结合。
a.亲和性测定
ADA2结合肝素的能力可以使用与固定肝素的亲和性结合测定评定。肝素是高度硫酸化糖胺聚糖，广泛用作一般的亲和性配体。其高度硫酸化赋予分子强酸性性质，因此其通过离子相互作用结合许多物质包括ADA2。此外，肝素含有独特的碳水化合物序列，作为一些蛋白质的特异性结合位点。含有固定肝素的柱用于评定与肝素具有高亲和性的蛋白质的结合与纯化，如DNA结合蛋白、凝固因子、脂蛋白和蛋白质合成因子。例如，可商购的肝素树脂柱如加载了肝素-SepharoseTM树脂的HiTrap Heparin HP(GE Healthcare,Pittsburgh,PA；Cat.No.17-0998-01)，可用于评定特定蛋白质如ADA2的结合。在肝素-SepharoseTM树脂中，肝素通过N-羟基琥珀酰胺偶联法与Sepharose High Performance base matrix偶联，提供高容量、性能及低渗漏水平。
肝素结合可以通过使用肝素-SepharoseTM树脂的亲和性测定评定。在这个示例的测定中，将35μL野生型或变体ADA2与20μL肝素-SepharoseTM树脂(GE Healthcare,Pittsburgh,PA；Cat.No.17-0998-01)混合，随后在室温保温30分钟。然后将混合物通过0.22μm离心过滤仪离心，收集含有未结合蛋白质的流出液(flow-through)以在SDS-PAGE凝胶上分析。在肝素-Sepharose树脂中加入35μL的1.5M NaCl并在室温(RT)保温10分钟以从肝素-Sepharose中洗脱剩余的肝素结合的蛋白质。肝素结合程度通过SDS-PAGE评定，通过对比结合树脂与流出液的野生型和变体ADA2的量与输入的量进行评定。
b.ELISA测定
蛋白质如本发明提供的任何ADA2的肝素结合可以使用基于酶联免疫吸附测定(ELISA)的方法评定。基于ELISA的方法使用在表面如微滴定平板上固定的肝素。将结合肝素的感兴趣的蛋白质如本发明提供的任何ADA2在肝素包被的平板中保温，结合情况使用检测感兴趣的蛋白质如本发明提供的任何ADA2的抗体检测。
例如，用在Na2CO3缓冲液(pH 9.6)中的100μL的200μg/Ml肝素钠盐(Calibochem,EMD Milipore,Billerica,MA；Cat.No.375095)包被的96孔平板可用于检测ADA2与肝素的结合。在ADA2如其野生型或变体或修饰形式结合后，洗涤孔并与辣根过氧化物酶(HRP)缀合的检测抗体如HRP-抗-FLAG抗体(Abcam,Cambridge,UK；Cat.No.Ab1238)保温以检测感兴趣的蛋白质如本发明提供的任何ADA2上的FLAG标签。在保温与洗涤后，感兴趣的蛋白质与平板上固定肝素的结合程度通过生色底物观测，如针对HRP加入3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(TMB)底物溶液(Pierce,Thermo Fisher Scientific,Rockford,IL)以显色。每个反应的光密度(OD)在平板读器上测量。
在另一实例中，肝素通过将链霉抗生物素蛋白包被的微滴定平板如链霉抗生物素蛋白包被的96孔平板(Thermo Fisher Scientific,Rockford,IL；Cat.No.15520)与生物素酰化的肝素如生物素-肝素(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO；Cat No.B9806-10MG)保温而固定。在ADA2、其野生型或变体或修饰形式结合后，洗涤孔并与辣根过氧化物酶(HRP)缀合的检测抗体如HRP-抗-FLAG抗体(Abcam,Cambridge,UK；Cat.No.Ab1238)保温以检测感兴趣的蛋白质如本发明提供的任何ADA2上的FLAG标签。在保温与洗涤后，感兴趣的蛋白质与平板上固定肝素的结合程度通过生色底物观测，如针对HRP加入3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(TMB)底物溶液(Pierce,Thermo Fisher Scientific,Rockford,IL)用于显色。每个反应的光密度(OD)在平板读器上测量。
也可以使用本领域已知的这些方法的任何变化形式。例如，本领域技术人员可以根据特定的测定条件如特定pH条件选择合适的固体支持物。镍包被的微平板不太适于His-标签的蛋白质的结合，因为缓冲液pH可影响抗原包被于Ni-包被的但非高度结合的平板。此外，可以使用各种方法将肝素固定于平板，如缀合牛血清白蛋白(BSA)或用硫酸鱼精蛋白与过量肝素包被的其它载体。
缓冲液、封闭溶液和反应条件也可以基于希望的结合测定选择。例如，封闭溶液包括含有人、牛、马或者其它血清白蛋白或凝胶的那些溶液。固体支持物如平板的封闭可以使用其中加入一或多种封闭剂的结合测定缓冲液进行。举例的封闭剂包含1-5％牛血清白蛋白(BSA)、1-5％脱脂奶、0.1-1％凝胶和25％人血清。洗涤剂如Tween-20和防腐剂如硫柳汞可加入封闭溶液中。结合测定缓冲液包括肿瘤微环境缓冲液或者正常生理缓冲液。蛋白质水溶液-固体支持物混合物典型维持30分钟、1小时或更长时间，可以根据温度而变化。封闭反应可以在任何温度进行，通常可以在4℃-37℃如4℃、室温(即22℃)或37℃进行。在一些实例中，反应在大约4℃-37℃温度进行至少1小时。例如，封闭可以在室温进行1小时而实现。在保温和封闭后，所得固相可以随后漂洗除去未结合的蛋白质，之后与检测分子接触(例如本发明提供的ADA2野生型、变体和修饰形式)。
举例的酶标记包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶和β-D-半乳糖苷酶。举例的可以加入以产生信号的酶底物包括PNPP(对-硝苯基磷酸盐，二钠盐)、ABTS(2,2'-联氮双[3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸]-二铵盐)、OPD(邻苯二胺二盐酸盐)和TMB(3,3',5,5'-四甲基联苯胺)(SOMA Labs,Romeo,Mich.)，包括Sureblue TMB Microwell Peroxidase Substrate 1-成分(KPL,#52-00-03)。反应可以通过加入终止试剂(例如TMB终止溶液)终止。可以确定在合适波长(即450nm)的吸光度。
对于荧光，可利用大量荧光计。对于化学发光检测，如检测辣根过氧化物酶(HRP)底物，可利用光度计或者胶片。使用酶，可以通过荧光测定、光度测定、分光光度测定或者目测确定或测量荧光、化学发光或者生色产物。例如，抗-标签试剂可以与辣根过氧化物酶(HRP)或者其它可检测物质缀合。
检测可以通过荧光、放射性或其它可检测部分的存在而促进。例如，本发明提供的任何ADA2多肽包括野生型和变体多肽及其修饰形式可以具有N或C末端标签，如FLAG标签，可以使用抗-标签试剂如抗-FLAG抗体检测。抗-标签试剂的选择可根据结合分子或蛋白使用的标签。此外，选择与测定中使用的环境条件(例如pH)相容的抗-标签试剂。本领域技术人员可以鉴别或选择这种试剂，并检测其与测定条件的相容性。抗-标签试剂易于获得如来自商业来源或者其它来源。举例的在本发明方法中可用于检测的抗-标签试剂包括但不限于抗-FLAG抗体或者抗-Myc抗体(得自供应商如Abcam,Cambridge,MA；GeneTex,Irvine,CA)。此外，根据感兴趣的蛋白质和信号强度，其它抗体和/或生色底物可用于变化形式的ELISA中。例如，对于不具有标签的天然蛋白质，可以使用两种抗体进行检测，例如一抗识别天然靶，二抗与用于检测的酶缀合。
典型地，在本发明的方法中，检测结合的复合物的方法是能被量化的方法。例如，标记可以产生信号，如比色信号、化学发光信号、化学荧光信号或者放射性信号。根据标记的性质，可以使用各种技术检测或者检测及量化所述标记。例如，量化方法包括但不限于分光光度法、荧光法和放射性方法。
c.斑点印迹及其它放射性标记的肝素结合测定
肝素结合程度也可以使用放射性标记的肝素用基于印迹的方法检测。例如，斑点印迹方法可用于检测和量化皮摩尔量的感兴趣的肝素结合蛋白。将蛋白质点印在硝化纤维素上，然后与125I-肝素保温。肝素与蛋白质的结合通过放射自显影术检测并通过扫描光密度测定量化；蛋白质通过酰胺黑染色的硝化纤维素的光密度测定分析量化(Hirose et al.(1986)Analytical Biochemistry 156(2):320-325)。在另一实例中，将放射性标记的肝素如3H-肝素在96孔微滴定平板中与感兴趣的肝素结合蛋白如本发明提供的任何ADA2、包括其野生型、变体或修饰形式保温。然后将混合物移至96孔微滴定过滤平板，滤除未结合的肝素和感兴趣的蛋白质。结合通过闪烁计数法检测(见Proudfoot et al.(2003).PNAS 100(4):1885-1890)。
3.评定稳定性的方法
本发明提供的任何ADA2在指定条件下的稳定性可以通过本领域技术人员已知用于评定蛋白质稳定性的任何方法确定。在指定条件(例如对于热稳定性的高温度条件，对于pH耐受性的高或低pH条件，对于血浆稳定性的血浆条件，及对于长期稳定性的长期贮存条件)下的稳定性可以通过确定所述多肽物理性质在没有暴露于指定条件之前与之后的变化而评定，所述物理性质包括但不限于结构构型或构象、酶活性、蛋白质解折叠、聚集和溶解性。稳定性也可以通过与天然、野生型或参考ADA2多肽相比，在一或多种变性条件存在下比较活性、聚集或其它物理性质的任一或多种而评定。
蛋白质稳定性包括蛋白质应答环境条件(例如升高的温度)的一或多种物理性质的维持的量度。在一个实例中，所述物理性质是维持蛋白质的共价结构(例如不存在蛋白酶解、不希望的氧化或脱酰胺化)。在另一实例中，所述物理性质是蛋白质以正确的折叠状态存在(例如不存在可溶或不溶的聚集物或沉淀)。在一个实例中，蛋白质的稳定性通过测定蛋白质的生物物理性质测量，例如测定热稳定性、pH解折叠模式、稳定除去糖基化、溶解性、生物化学功能(例如酶活性、结合蛋白质(例如配体、受体、抗原等)或者化学部分等的能力)，和/或其组合。在另一实例中，生物化学功能通过相互作用的结合亲和性证实。此外，稳定性可以通过目测、回收百分比、蛋白质纯度和表观解链温度评定。稳定性测量还提供了重要生物学信息，稳定性降低可以是蛋白质解折叠、错折叠和聚集的迹象，这可导致多肽的治疗无效。这种测定可以在导致蛋白质不稳定性的任何条件下进行，及可以对与ADA2蛋白相关的任何物理或功能性质进行评定。稳定性可以使用本领域已知和/或本文描述的任何方法测量。
a.条件
i.血浆中的稳定性
对于治疗应用，如治疗肿瘤或癌症，希望给予对象一定剂量的ADA2，以维持足够长时间的血浆腺苷脱氨酶(ADA)活性以达到治疗作用。因此，在血浆和肿瘤微环境(TME)中稳定性的足够保留是治疗效力必需的。本文描述的任何ADA2如野生型、变体或缀合物的血浆稳定性可以通过测量酶活性和/或其它物理性质在血浆如离体哺乳动物血浆中保温之前与之后的变化而确定。
稳定性可以在体外或体内评定。例如，稳定性可以在暴露于血浆希望长度的时间之后检测，这可以由技术人员根据希望的时间长度根据经验确定或者选择。例如，保温时间可以是至少1小时，如至少2、3、4、5、10、15、20、24、30、36、48、60、72小时或更长时间。蛋白质可以直接全身给予，如静脉内给予，并可以评定活性。在其它实例中，蛋白质可以在体外适当条件下保温。在一个实例中，本发明提供的任何ADA2的ADA活性的稳定性可以在37℃在25％离体血浆或血清如人或非人血浆或血清例如小鼠血浆中保温后测量。例如，如本文所示，ADA2在血浆中长时间(例如24小时)保温后比ADA1更稳定。其它条件如温度、血浆类型和缓冲液条件也可以基于希望的检测条件加以选择。
ii.热稳定性
蛋白质的耐热稳定性(或热稳定性)程度不同。特别地，具有生物活性的蛋白质如酶可具有不同的最佳温度。热稳定性，即蛋白质在相对高温度抵抗其化学或物理结构中不可逆改变的性质，可以表示蛋白质的整体稳定性。升高的温度通常诱导蛋白质解折叠及蛋白质的二级、三级和四级结构的破坏，导致蛋白质不稳定。蛋白质如本发明提供的任何ADA2多肽的热稳定性可以通过测量酶活性和/或其它物理性质在相对高或低温度保温之前与之后的变化而确定。
蛋白质的稳定性可以通过测量蛋白质随着时间的活性而确定。蛋白质的解链温度(Tm)可用作蛋白质的溶液稳定性及体内稳定性的标记。特定蛋白质的解折叠温度是指在此温度蛋白质丧失其二级结构及典型其活性，可以使用本领域技术人员已知及本文描述的方法确定，如差示扫描量热法(DSM)。在另一实例中，确定蛋白质的物理性质的其它方法如动态光散射(DLS)可用于鉴定蛋白质随着温度的稳定性。在其它实例中，热稳定性可以经生物化学测定测量。评定热稳定性的一个示例的生物化学方法是热挑战测定。在“热挑战测定”中，在一段时间使多肽经历一系列升高的温度。例如，在一个实施方案中，使检测多肽经历例如10分钟的一定范围的温度升高。然后通过相关生物化学测定(例如腺苷脱氨酶测定)测定蛋白质活性。热挑战测定可用于确定保留50％腺苷脱氨酶(ADA)活性的温度(即TC值或T50)。TC或T50值不一定等于生物物理学获得的Tm值。可以进行这种测定以评定本发明提供的任何ADA2、包括其野生型、变体、缀合物及其它修饰形式的热稳定性。
iii.在pH或pH最佳值的稳定性
蛋白质耐受pH变化的能力也不同，或者对于生物活性可具有不同的最佳pH。环境中pH的变化可导致蛋白质氨基酸侧链的碱性和酸性基团电荷变化，导致静电相互作用改变，进而使天然结构不稳定。相对小的pH变化可导致蛋白质构象稳定性显著降低，构象稳定性的改变也可以导致蛋白质聚集。溶液中离子强度和溶液的等电点(pI)也有助于蛋白质在不同pH条件下在溶液中的稳定性。
例如，肿瘤的pH环境及特定蛋白质的pH最佳值可以影响ADA2蛋白质的治疗效力。例如，肿瘤微环境(TME)具有通常在缺氧区域中具有相对酸性pH如pH 6.5-6.9或更低的区域。另一方面，在具有增生组织的区域中，如血管附近，TME pH是更中性的。因此，ADA2蛋白的pH最佳值对于确定本发明所述治疗肿瘤的方法中使用的蛋白质的剂量和配制是重要因素。
蛋白质如本发明提供的任何ADA2多肽在特定pH环境中的稳定性可以通过测量在相对高或低pH保温之前和之后的酶活性和/或其它物理性质的改变而确定。例如，本发明提供的任何ADA2的酶活性可以使用本文描述的ADA活性测定在不同pH测量(例如pH范围是或大约是6.0-8.0，如是或大约是6.5-7.5(包括端点)，例如6.5±0.2或7.4±0.2)。在另一实例中，确定蛋白质物理性质的其它方法如动态光散射(DLS)可用于鉴定蛋白质随着溶液pH的稳定性。
iv.其它条件
环境或配制物中的其它条件如离子强度、缓冲液组成、其它物质如肿瘤微环境中其它蛋白质的存在、药物赋形剂的存在或者用于组合治疗的其它物质的存在可有助于治疗方法中使用的多肽如本发明提供的任何ADA2多肽的稳定性。在可影响蛋白质稳定性和功能的条件下多肽的稳定性可以使用下文描述的方法检测，但是在待检测的指定条件中保温之后进行。可以使用所述测定对本发明提供的配制物进行微小调整，同时保留ADA2和/或组合治疗中使用的其它物质的稳定性。
b.确定物理性质
多肽如本发明提供的任何ADA2多肽的稳定性可以通过使用本领域已知的任何方法测量多肽的物理或功能性质或活性中的变化而确定，如测量酶活性、结构构型或构象、酶活性、蛋白质解折叠、聚集和溶解性。评定的功能或物理性质可以在存在和不存在指定条件(例如血浆、温度、pH或其它条件)下对比。应理解对比或评定在存在某条件下与不存在该条件下蛋白质稳定性的测定是基本相同的，除了所述条件的存在或程度。
蛋白质通过物理作用力如氢键、疏水性相互作用、静电相互作用、二硫键和vander Waals力而稳定。任何这些作用力的破坏均可以使蛋白质不稳定，这些作用力的破坏可以使用本领域已知的各种方法测量。而且，在某些条件，如特定pH或温度或者在过表达期间的高蛋白质浓度条件下，多肽可以形成蛋白质聚集物。蛋白质聚集物是不可逆装配的蛋白质分子，与天然是溶解或不溶的天然或非天然蛋白质结构形成较高级别寡聚物。聚集通常导致蛋白质的构象不稳定。
确定物理性改变的方法包括光谱测定、热动力学方法、流体动力学方法、层析法、电泳、生物活性分析及蛋白质-蛋白质相互作用分析(见例如Uversky,V.and E.Permiakov,eds.,Methods in Protein Structure and Stability Analysis,Nova SciencePublishers,New York(2007)；Chaudhury et al.(2014)The AAPS Journal 16(1):48-64)。颗粒大小增加和/或解链温度降低也可以表示ADA2多肽的变性和随后的聚集。此外，蛋白质稳定性可以通过电泳方法目测分析蛋白质完整性、计算回收百分比、蛋白质纯度和表观解链温度而评定。示例的评定蛋白质稳定性的测定在下文描述。
i.酶活性
稳定性的破坏可导致酶的活性位点的三级结构变化，导致酶活性破坏。生物活性通常与蛋白质的其它物理性质的改变密切相关，如圆二色性光谱。功能性测定如酶活性测定、包括上述任何腺苷脱氨酶(ADA)活性测定，可用于在存在和不存在评定条件下蛋白质稳定性的测量。例如，腺苷脱氨酶(ADA)的稳定性可以在暴露于指定条件如上文章节F.2.a所述条件之前和之后测量，以评定本发明提供的任何ADA2的稳定性。暴露于指定条件，如在血浆中保温，可以在固定时间点进行，或者在几个时间点评定。
ii.蛋白质纯度的层析分析
评定天然蛋白质的纯度的方法可用作确定蛋白质降解或其它不稳定事件的测量。蛋白质纯度可以使用层析方法测量，例如通过反相高效液相层析法(RP-HPLC)。通过RP-HPLC确定的蛋白质纯度是与存在的所有蛋白质种类相比，存在的主要ADA2蛋白质峰的百分比。因此，RP-HPLC及本领域技术人员已知的相似方法可评定酶的降解。蛋白质纯度可以随着时间评定。蛋白质纯度可以在存在一或多种条件如上文章节F.2.a中描述的条件下及以其不同量加以评定。回收百分比也可以确定为在不同时间长度在各种条件存在下与参考样品相比所述多肽的相对百分比。本发明提供的任何ADA2多肽、包括其野生型、变体、缀合物或其它修饰形式的稳定性也可以通过测量RP-HPLC多肽的氧化而确定。氧化百分比是主峰(ox-1)和次峰(ox-2)的峰面积总和的测量。
在另一实例中，其它层析方法如大小排阻层析法(SEC)可用于确定蛋白质的折叠或者多聚化状态。SEC可以在天然溶液条件下进行，保持大分子相互作用。大小排阻层析法测量流体力学体积(非分子量)，可以区分同一蛋白质的折叠与解折叠形式。通过SEC在蛋白质配制物中定量评定聚集物水平典型通过UV检测完成，有时在多个波长进行，经常组合通过多角度光散射检测的分子量鉴定。SEC也可用于研究可逆的蛋白质自缔合(Chaudhury etal.(2014)The AAPS Journal 16(1):48-64)。
iii.差示扫描量热法
溶液中的多肽如本发明提供的任何ADA2、包括其野生型、变体和修饰形式的热稳定性可以使用差示扫描量热法(DSC)确定。在DSC中，将样品细胞(含有蛋白质和缓冲液)与参考细胞(仅缓冲液)一起加热，以恒定速度升高温度，记录在样品细胞中维持两种细胞等温而需要的余热(由于随着温度增加从蛋白质的折叠的天然状态向解折叠形式的转变所致)。热转变的中点温度(或者热解链温度，Tm)常用作热稳定性的指征。如果实验条件允许可逆热转变，DSC还提供了关于蛋白质解折叠的热力学参数的详细信息，包括焓(ΔH)、熵(ΔS)、Gibb’s自由能(ΔG)和热容(ΔCp)的变化。DSC可用于在蛋白质配制期间确定溶液条件(pH、离子强度)和赋形剂对于蛋白质稳定性的作用(Chaudhury et al.(2014)The AAPSJournal 16(1):48-64)。
iv.差示扫描荧光测定
差示扫描荧光测定(DSF)也称作荧光热漂移测定，是用于在存在荧光染料时监测蛋白质的热转变如解折叠的方法。用于DSF的极性灵敏性荧光染料在非极性环境中(例如在(部分)解折叠蛋白质的疏水性口袋中)是高度荧光的，而荧光在水溶液和/或在存在天然蛋白质时猝灭。DSF可用于确定蛋白质的构象稳定性。当在存在蛋白质时将染料荧光强度根据温度绘图时，蛋白质的转变温度(Th)中点可得自所得S形图的拐点。得自DSF实验的各种蛋白质在不同溶液中的Th值与通过差示扫描量热法确定的热解链温度(Tm)值良好相关。此外，关于多结构域蛋白质中共存(双态)或复杂解折叠转变的信息可以通过DSF获得(Chaudhuryet al.(2014)The AAPS Journal 16(1):48-64)。
染料可以是小分子、肽或者核酸，可以使用常规实时PCR仪器进行。常用的荧光染料包括SYRPO Orange、ANS、ROXTM和尼罗红。例如，本发明提供的任何ADA2、包括其野生型、变体缀合物或者其它修饰形式的解链温度可以使用ROXTM蛋白质热转移染料(AppliedBiosystems,Carlsbad,CA；Cat.No.4461146)作为荧光染料及ViiA7RT-PCR系统(AppliedBiosystems,Carlsbad,CA)评定，测量荧光随着样品温度增加的位移。
v.固有荧光光谱测定
多肽如本发明提供的任何ADA2、包括其野生型、变体、缀合物及其它修饰形式的稳定性可以通过测量其固有荧光的变化而确定。固有荧光光谱测定检测了来自蛋白质内部荧光团如芳香氨基酸残基色氨酸和酪氨酸的荧光。色氨酸的荧光性质包括其最大发射强度和波长等对于其局部环境尤为灵敏。结果，所述发射通常可用作探针以研究蛋白质的较高级别结构中的变化。蛋白质解折叠通常伴随荧光强度降低及Trp残基的最大发射移向更长波长(红移)。装备了平板读数器和温度控制性能的荧光计可用于评定蛋白质治疗剂的构象稳定性(Chaudhury et al.(2014)The AAPS Journal 16(1):48-64)。
vi.圆二色性
圆二色性(CD)光谱学测量左和右侧圆偏振光的差别吸收，是鉴定随温度和溶液条件变化的蛋白质二级结构含量(即α-螺旋和β-折叠)的常用工具。为此目的使用远-UV CD光谱(160-250nm)，而近-UV CD光谱(230-320nm)可提供关于芳香氨基酸侧链和二硫键局部环境的信息，然后可用于监测三级结构中的改变。CD与具有高UV吸收的某些缓冲液和添加剂不相容(Chaudhury et al.(2014)The AAPS Journal 16(1):48-64)。
vii.动态光散射
动态光散射(DLS)也称作光子相关光谱学或者准弹性光散射，用于监测溶液中蛋白质流体动力学性质的改变(例如聚集)以及进行绝对大小测量。DLS测量溶液中散射光强度的时间依赖性波动，通过自相关分析可以提供包括扩散系数、水力学半径和大小为几个纳米至大约1μm的颗粒的大小分布等信息。DLS信号对于溶液中最大颗粒的存在非常灵敏。DLS可用于检测较高级别蛋白质寡聚物和聚集物。DLS已经用于鉴定随溶液pH和温度变化的蛋白质治疗剂如单克隆抗体的胶体稳定性。DLS也已经用于评定在许多蛋白质的生产、输送和给予期间蛋白质应答物理应激的聚集倾向(Chaudhury et al.(2014)The AAPS Journal16(1):48-64)。在暴露于指定条件后形成ADA2聚集物可以通过在各种条件下(例如变性条件或者其它贮存条件)的动态光散射测量颗粒的水力学半径而确定。
viii.静态光散射
静态光散射(SLS)是测量散射光的时间平均强度的技术，提供溶液中悬浮的颗粒的大小信息。多角度光散射(MALS)是从多角度收集和分析静态光散射强度的技术，可用于确定蛋白质及较大分子量寡聚物的绝对分子量和旋转半径。MALS检测可以结合大小排阻层析(SEC)或者流场分级分离(FFF)以分离及随后鉴定蛋白质聚集物。光散射也可以通过简便扫描含有荧光和光散射的全部光谱区用荧光检测法测量。这样可以既获得构象稳定性数据又获得聚集数据(Chaudhury et al.(2014)The AAPS Journal 16(1):48-64)。
ix.浊度测定
溶液的浊度(或者光密度)量级与溶液中蛋白质聚集物的大小和数量成比例(光密度＝吸光度+光散射)。浊度通常在波长320-400nm范围测量，因为蛋白质在这个波长范围典型地不具有明显的吸光度，及光散射信号的量级随着波长降低而升高。在稳定性检测期间，各种配制物中蛋白质的聚集倾向可以通过温度斜坡法(测量随着温度增加的浊度变化)或者动力学方法(测量在恒定温度随着时间的浊度变化(Chaudhury et al.(2014)The AAPSJournal 16(1):48-64)评估。
x.确定稳定性的其它方法
本领域技术人员已知的可用于确定本发明提供的任何ADA2、包括其野生型、变体和修饰形式在本发明提供的治疗方法中的稳定性的其它方法包括聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)和目视分析蛋白质完整性、免疫印迹、核磁共振(NMR)光谱学、等热滴定量热法、横向尿素梯度电泳(TUG-PAGE)、中子散射法、分析超速离心法、氚平面断层照相和粘度测定分析。目视分析蛋白质完整性可包括例如观测PAGE凝胶中较低分子量降解产物或者较高分子量聚集产物。
4.治疗活性测定
本发明提供的治疗方法中使用的任何ADA2的治疗活性如抗癌活性，可以使用体外和体内功能测定测量。本发明提供了用于监测使用本发明提供的任何ADA2的治疗的治疗效力的示例测定和系统。
a.体外测试
本发明提供的任何ADA2、包括其野生型和变体、缀合物及其它修饰形式及使用本发明提供的任何ADA2与其它物质的组合治疗的抗癌活性可以在体外检测，例如通过将癌细胞培养物与该衍生物保温，然后评估培养物中细胞生长抑制情况。对于这种测试的合适细胞包括但不限于鼠P388白细胞病细胞、B16黑色素瘤细胞和Lewis肺癌细胞，以及MCF7人乳腺癌细胞、OVCAR-3癌细胞、A549肺癌细胞、MX-1人乳腺肿瘤细胞、HT29结肠癌细胞系、HepG2肝癌细胞、HCT116结肠癌细胞、Caco-2人结肠癌细胞、U138MG人神经胶质瘤细胞系、DU 145人前列腺癌细胞、L1210淋巴性白血病细胞、L4946淋巴性白血病细胞、6C3HED淋巴肉瘤细胞、TA3乳腺腺癌细胞、E2Ehrlich癌细胞、755腺癌细胞、180肉瘤细胞及B16黑色素瘤细胞。
通过本发明提供的任何ADA2、包括其野生型和变体、缀合物及其它修饰形式及使用本发明提供的任何ADA2与其它物质的组合治疗对于腺苷介导的免疫抑制的逆转可以在体外例如通过进行增殖测定进行检测。这种测定包括但不限于在存在腺苷和/或本发明提供的任何ADA2和/或任何其它组合治疗剂时T细胞增殖测定或者混合NK和T(NK/T)细胞增殖测定。例如，腺苷对于各种免疫细胞如淋巴细胞、天然杀伤(NK)细胞、多形性粒细胞和吞噬细胞如组织巨噬细胞的免疫抑制作用可以通过增殖测定评定，使用免疫细胞或者其混合物，如从周围血单个核细胞(PBMC)制备的NK与T细胞(NK/T)混合物。本发明提供的任何ADA2及本发明提供的任何其它组合治疗剂的作用可以通过对比这种增殖测定在存在腺苷时在加入或者不加入本发明提供的任何ADA2和/或本发明提供的任何其它组合治疗剂包括免疫检查点抑制剂的结果而评定。组合治疗剂在下文章节H.4中描述。
增殖测定可用于测量本发明提供的任何ADA2、包括其野生型和变体、缀合物及其它修饰形式及使用本发明提供的任何ADA2与其它物质的组合治疗在存在腺苷时的活性。所述测定可测量其活性通过加入腺苷被抑制的免疫细胞的增殖。可以将细胞保温足够时间以使得细胞呈现增殖(例如12小时，或者1、2、3、4、5、6、7天，2、3、4、5周或更长时间)。细胞增殖可以使用本领域已知的任何方法测量，包括3H-胸苷掺入测定、5-溴-2-脱氧尿苷(BrdU)、ELISA、四唑微平板测定及酸性磷酸酶测定(例如Maghni et al.(1999)J.Immunol.Method.223(2):185-194)。细胞增殖也可以使用试剂盒测量，所述试剂盒得自Invitrogen(Cyquant NF细胞增殖测定试剂盒)、Cambrex(ViaLight HS(高灵敏性)BioAssay)、Promega(CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay)、GuavaTechnologies(CellGrowth测定)、Stratagene(Quantos细胞增殖测定)(例如Assays forCell Proliferation Studies,Genetic Eng.Biotechnol.News.26(6))。在一些实例中，细胞增殖可以标准化为在存在腺苷时的细胞增殖。在一些实例中，细胞增殖可以标准化为在不存在腺苷时的细胞增殖。在举例的增殖测定中，细胞可以加入96孔平板的孔中包含腺苷及本发明提供的任何ADA2或者待测定的任何其它组合治疗剂的正常生长培养基中。
b.体内动物模型
动物模型可用于评定治疗活性作用，如使用本发明提供的ADA2的肿瘤生长抑制活性。例如，动物模型可用于评定肿瘤大小、体积或生长。此外，动物模型可用于评定组合物或组合的药代动力学或耐受性。
动物模型包括但不限于小鼠、大鼠、兔、狗、豚鼠和非人灵长类动物模型，如食蟹猴或恒河猴。动物模型包括遗传模型以及异种移植模型。例如，异种移植模型包括其中在检测某物质之前肿瘤已经在合适的检测动物如在免疫缺陷或免疫感受态动物中确立的那些模型。在一些实例中，免疫缺陷小鼠如裸鼠或SCID小鼠是用如来自腺苷相关癌症的肿瘤细胞系移植的，以建立癌症的动物模型。在其它情况中，使用应用免疫感受态动物的同基因模型。
举例的细胞系、包括与腺苷信号传导相关的癌症包括但不限于CT26鼠结肠癌细胞、MCF7人乳腺癌细胞、HepG2肝癌细胞、Caco-2人结肠癌细胞、U138MG人神经胶质瘤细胞系、DU 145人前列腺癌细胞、L1210淋巴性白血病细胞、L4946淋巴性白血病细胞、6C3HED淋巴肉瘤细胞、TA3乳腺腺癌细胞、E2Ehrlich癌细胞、755腺癌细胞、180肉瘤细胞及B16黑色素瘤细胞。可用于动物异种移植模型中的其它癌细胞包括PC3前列腺癌细胞、BxPC-3胰腺腺癌细胞、MDA-MB-231乳腺癌细胞、BT474乳腺肿瘤细胞、Tramp C2前列腺肿瘤细胞、Mat-LyLu前列腺癌细胞、MH194小鼠胰腺癌细胞和KLN205鼠肺癌细胞。
举例的可用于评定使用本发明提供的ADA2的癌症治疗作用的动物肿瘤模型是CT26同基因肿瘤模型。这个模型通过在同基因BALB/c小鼠经皮下注射CT26鼠原发结肠癌(ATCC CRL-2638)细胞而产生。对小鼠进行分期直至肿瘤确立，然后给予用于治疗的物质如本发明提供的任何ADA2或者包括ADA2治疗的组合治疗。另一举例的胰腺癌动物肿瘤模型包括在动物中使用BxPC-3胰腺腺癌细胞产生肿瘤(见例如Von Hoff et al.(2011)J.Clin.Oncol.,29:4548-54)。其它举例的动物肿瘤模型包括鼠MH194+PSC4同基因肿瘤模型和鼠肺癌KLN205同基因肿瘤模型。
可以使用其它动物模型如开发用于研究癌症免疫治疗或组合治疗的小鼠模型，评定使用ADA2治疗的治疗作用。例如，可以使用开发用于研究癌症免疫治疗效力和免疫相关不利事件(irAE)的小鼠模型。靶向免疫调节受体的一些癌症免疫治疗如抗-CTLA4和抗-PD-1组合治疗也可以激发irAE，如皮疹、腹泻、结肠炎和肝脏损害。因此，使用模拟在临床观测到的反应动力学的小鼠模型及可反映可能的irAE的模型可用于评定与治疗相关的效力和可能的不利事件。这种模型包括致癌物质诱导的那些，如甲基胆蒽(MCA)诱导的纤维肉瘤和7,12-二甲基苯[α]蒽(DMBA)/12-O-十四酰佛波醇-13-乙酸酯(TPA)-诱导的皮肤乳头瘤或者遗传工程化的小鼠肿瘤模型，其具有强迫的致癌基因表达和/或丧失肿瘤阻抑物功能，通常是以组织特异性和/或时间控制方式。例如包括Her2/neu或PyMT转基因小鼠模拟乳腺癌，自发转移的黑色素瘤MT/ret模型及BrafCATyr-creERT2Ptenfl/fl小鼠，其中4-羟基三苯氧胺(4-HT)诱导新生黑色素瘤(de novo melanoma)以及使用编码Cre重组酶的腺病毒载体以在肺上皮中在致癌基因Kras和肿瘤阻抑物基因Tp53中选择性导入突变，以诱导原发肺肿瘤。致癌物质诱导的小鼠癌症模型优于是免疫原性的模拟癌。或者，在肿瘤移植模型中，肿瘤可以原位移植，即在正常的发生位置，而不是皮下，以更精确地反映肿瘤微环境。另一举例的评定组合癌症免疫治疗的效力和irAE的小鼠模型是Foxp3-DTR小鼠，其可以是条件性耗竭其Tregs以模拟对所有免疫细胞的最大抑制作用。这个模型可以评定调节共抑制性/共刺激性受体或者与其它治疗方法减弱抗肿瘤免疫性/irAE的效力(Liu et al.(2014)Clinical&Translational Immunology 3:e22)。
也可以使用遗传模型，其中使动物的一或多个基因缺陷，导致肿瘤产生或形成。这种遗传工程化的小鼠模型(GEMM)可以概括疾病的分子和临床特征。例如，举例的胰腺癌遗传模型包括内源突变体Kras和Trp53等位基因的胰腺特异性表达，导致呈现缺陷表型的突变小鼠(称作KPC小鼠；LSL-KrasG12D、LSL-Trp53R172H、Pdx-1-Cre)。KPC小鼠发生原发胰腺肿瘤，呈现出与人疾病相似的特征，包括对核苷类似物吉他西滨的抗性(见例如Frese et al.(2012)Cancer Discovery,2:260-269)。
i.肿瘤代谢活性
可以针对本发明提供的ADA2治疗检测肿瘤代谢活性的降低。肿瘤代谢活性可以使用本领域已知的标准方法评定。例如，可以使用[18F]-氟脱氧葡萄糖正电子发射断层摄影术(FDG-PET)。PET是非侵入性诊断，其提供灌注的图像和定量参数、细胞存活性、组织的增殖和/或代谢活性。图像得自使用用发射正电子的放射性同位素标记的不同生物物质(例如糖、氨基酸、代谢前体、激素)。例如，FDG是葡萄糖类似物，通过正常葡萄糖途径的第一阶段由活细胞摄取。在癌症中，存在增加的糖分解活性，导致在癌细胞中FDG的捕获。FDG捕获降低与降低的肿瘤代谢活性和抗癌活性相关。PET成像指导为本领域技术人员已知，且应由任何治疗医生或技术人员进行。
ii.肿瘤大小和体积
例如，可以监测肿瘤和/或转移的大小和位置。肿瘤和/或转移大小可以通过本领域已知的任何多种方法监测，包括外部评定方法或者断层或磁共振成像方法，例如本文中描述的检测方法。在一些时间点监测大小可以提供关于本发明提供的治疗方法的效力的信息。此外，监测肿瘤或转移的大小的增加或降低也可以提供关于对象中存在(即检测和/或诊断)另外的肿瘤和/或转移的信息。在一些时间点监测肿瘤大小可提供关于对象体内发生肿瘤性疾病的信息，包括对象肿瘤疾病治疗如本发明提供的治疗的效力。
在特别的实例中，肿瘤大小和/或体积降低表示治疗有效。肿瘤大小和体积可以基于本领域技术人员已知的技术监测。例如，肿瘤大小和体积可以通过放射性照相、超声成像、尸检、使用卡尺、通过microCT或者18F-FDG-PET监测。肿瘤大小也可以目测。在特别的实例中，肿瘤大小(直径)是使用卡尺直接测量的。
在其它实例中，肿瘤体积可以使用通过卡尺或者超声评定获得的肿瘤直径(D)的平均测量值测量。例如，肿瘤体积可以使用VisualSonics Vevo 770高分辨超声或者其它相似超声技术确定。可以通过下式确定体积：V＝D3xπ/6(对于使用卡尺测量的直径)或V＝D2xd xπ/6(对于使用超声测量的直径，其中d是深度或厚度)。例如，卡尺测量可以包括测量肿瘤长度(l)和宽度(w)，肿瘤体积用长度×宽度2×0.52计算。在另一实例中，可以使用microCT扫描测量肿瘤体积(见例如Huang et al.(2009)PNAS,106:3426-3430)。作为实例，可以为小鼠注射Optiray Pharmacy碘佛醇注射液74％造影剂(例如741mg的碘佛醇/mL)，麻醉小鼠，使用MicroCat 1A扫描仪或者其它相似扫描仪(例如IMTek)进行CT扫描(40kV,600μA,196旋转步骤，总角度或旋转＝196)。图像可以使用软件重建(例如RVA3软件程序；ImTek)。肿瘤体积可以使用可获得的软件确定(例如Amira 3.1软件；Mercury ComputerSystems)。肿瘤体积或大小也可以基于肿瘤大小或重量确定。
肿瘤生长抑制百分比可以基于体积使用等式％TGI＝[1–(Tn-T0)÷(Cn-C0)]×100％计算，其中Tn是治疗组在最终剂量ADA2之后第n天的平均肿瘤体积，T0是治疗组在治疗之前第0天的平均肿瘤体积，Cn是相应对照组在第n天的平均肿瘤体积，C0是对照组在治疗之前第0天的平均肿瘤体积。可以确定肿瘤体积的统计学分析。
c.临床监测
本发明提供的方法可进一步包括一或多个监测治疗作用的步骤，如使用本发明提供的任何ADA2的肿瘤治疗。可以通过监测对象的肿瘤、对象的一般健康状况和/或病程而监测对象。本发明提供的方法中可包括多个监测步骤的任何，包括但不限于监测肿瘤大小、监测抗(肿瘤抗原)抗体效价、监测转移的存在和/或大小、监测对象的淋巴结，及监测对象的体重或者其它健康指征包括血液和尿液标志物。监测的目的可以是评定对象的健康状况或者治疗进展，或者可以确定是否进一步给予ADA2，或者确定何时或是否给予进一步的制剂或治疗，或者可以确定是否给予或持续组合治疗。
也可以监测表示对象健康状况的参数。如本领域所已知，监测对象的健康状况可用于确定治疗方法的效力。如本文所已知，可以使用监测疾病如肿瘤性疾病或其它疾病的任何各种健康诊断方法。例如，对象的体重、血压、脉搏、呼吸、肤色、体温或其它可观测的状态可以表示对象的健康状态。此外，来自对象的样品中一或多种成分的存在与否或水平可以表示对象的健康状况。典型的样品可包括血液和尿液样品，其中一或多种成分的存在与否或水平可以通过进行例如一组血液或尿液诊断检验而确定。表示对象健康状况的举例的成分包括但不限于白细胞计数、血细胞比容或者反应蛋白浓度。
5.药效学/药代动力学和耐受性
单独或者组合另一治疗剂给予本发明提供的任何ADA2、包括其野生型、变体和修饰形式对于任何给予的物质的药效学和药代动力学性质的作用也可以使用动物模型和/或人对象在体内评定，如在临床试验中评定。药效学或药代动力学研究可以使用动物模型进行或者在给予患者本发明提供的任何ADA2、包括其野生型、变体和修饰形式的研究期间进行。
动物模型包括但不限于小鼠、大鼠、兔、狗、豚鼠和非人灵长类动物模型如食蟹猴或者恒河猴。在一些情况中，药代动力学或药效学研究使用健康动物进行。在其它实例中，研究使用考虑用ADA2治疗的疾病动物模型进行，如任何腺苷相关疾病或失调动物模型，如肿瘤模型。
本发明提供的任何ADA2、包括其野生型、变体和修饰形式的药代动力学性质可以通过测量在给予后如下这些参数评定：最大(峰)浓度(Cmax)、峰时间(即当发生最大浓度时的时间，Tmax)、最小浓度(即剂量之间的最小浓度，Cmin)、消除半衰期(T1/2)及曲线下面积(即通过绘制时间与浓度的图产生的曲线下面积，AUC)。ADA2的绝对生物利用度可以通过对比皮下给予之后ADA2的曲线下面积(AUCsc)与静脉内给予之后ADA2的AUC(AUCiv)而确定。绝对生物利用度(F)可以使用如下公式计算：F＝([AUC]sc×剂量sc)/([AUC]iv×剂量iv)。在药代动力学研究中可以给予剂量范围和不同的给药频率，以评定增加或降低给予的剂量中酶如本发明提供的任何ADA2、包括其野生型、变体和修饰形式的浓度的作用。
评定治疗的安全性和耐受性的研究也为本领域已知且可以用于本发明。在给予本发明提供的任何ADA2或者本发明提供的任何组合治疗之后，可以监测任何不良反应的产生情况。不良反应可包括但不限于注射部位反应，如水肿或肿胀、头痛、发热、疲乏、寒冷、面红、头晕、荨麻疹、气喘或胸闷、恶心、呕吐、寒战、背痛、胸痛、肌肉痉挛、癫痫或者抽搐，血压改变及变态反应或者重度超敏反应。典型地，在安全性和耐受性研究中给予一系列剂量和不同给药频率，以评定给予增加或降低剂量中任何ADA2或者组合治疗中所用物质的浓度的作用。
G.药物组合物和配制
本发明提供了含有腺苷脱氨酶2(ADA2)如野生型ADA2、其变体、缀合物或其他修饰形式与药物可接受的赋形剂或添加剂的药物组合物。药物组合物可用于治疗与升高的腺苷水平相关的疾病或状况(例如过度增生性疾病或状况，如肿瘤或癌症)。任何ADA2可以在单一药物治疗中给予，或者在与如本文所述进一步的物质或治疗的组合治疗中给予。所述组合物可以配制为用于单一剂量给予或者多剂量给予。所述物质可以配制为直接给予。组合物可以以液体或者冻干配制物形式提供。
药物可接受的组合物是根据管理机构或其它机构的许可根据在动物和人体中使用的一般公认的药典进行制备。所述组合物可以制备为溶液、悬浮液、粉末或者持续释放配制物。典型地，使用本领域熟知的技术和程序将化合物配制为药物组合物(见例如AnselIntroduction to Pharmaceutical Dosage Forms,Fourth Edition,1985,126)。所述配制物应适于给予模式。
组合物可以配制为通过本领域技术人员已知的任何途径给予，包括肌肉、静脉内、皮内、病灶内、腹膜内注射，皮下、肿瘤内、硬膜外、鼻、口服、阴道、直肠、表面(topical)、局部(local)、耳、吸入、口腔(例如舌下)以及经皮给予或者任何途径。也涵盖其它给予途径。根据治疗的部位可以局部、表面或全身给予。局部给予需要治疗的部位可以通过例如但不限于在手术期间局部注入、表面应用如在手术后与伤口敷料联合应用、注射、利用导管、利用栓剂或者利用植入体实现。组合物也可以与其它生物活性剂相继、间隔或者在同一组合物中一起给予。给予也可以包括控制释放系统，包括控制释放配制物和控制释放装置，如利用泵。
在任何指定情况中最合适的途径依赖于多种因素，如疾病性质、疾病进展、疾病严重度和使用的特定组合物。药物组合物可以配制为适于每种给予途径的剂量形式。特别地，所述组合物可以配制为任何合适的药物制备物用于全身、腹膜内、口服或直接给予。例如，所述组合物可以配制为用于皮下、肌肉、肿瘤内、静脉内或者皮内给予。在一些实施方案中，所述组合物含有编码本发明提供的变体ADA2多肽的核酸，如溶瘤细胞病毒载体或者基因治疗载体，或者细胞，如修饰的免疫细胞以进行过继性免疫治疗，特定的组合物可以配制为适于特定组合物的剂量形式。
可以应用给予方法以降低活性剂暴露于降解过程，如蛋白酶解及通过抗原性和免疫原性应答引起的免疫干预。举例的这种方法包括在治疗部位局部给予或者持续注入(例如ADA2多肽或其变体)。
化合物可以配制为合适的药物制备物，如溶液、悬浮液、片剂、可分散片剂、药丸、胶囊、粉末、持续释放配制物或酏剂，用于口服给予以及经皮贴剂制备物及干粉吸入剂。典型地，使用本领域已知的技术和程序将化合物配制为药物组合物(见例如AnselIntroduction to Pharmaceutical Dosage Forms,Fourth Edition,1985,126)。通常，配制模式与给予途径相关。通常，组合物配制为冻干或者液体形式。在组合物以冻干形式提供时，其可以在使用之前用合适的缓冲液如无菌盐水溶液重建。
1.配制-液体、注射液、乳状液
配制物通常适于给予途径。本发明预期胃肠外给予，其通常特征在于注射或者输注，经皮下、肌肉、静脉内或者皮内。胃肠外给予的制备物包括准备注射的无菌溶液，准备好在使用之前与溶剂组合的无菌干燥可溶产物如冻干粉末，包括皮下注射用片剂，贮备注射的无菌悬浮液，准备在使用之前与运载体组合的无菌不溶产物，及无菌乳状液。注射剂可以常规形式制备，液体溶液或者悬浮液，适于在注射之前在液体中形成溶液或悬浮液的固体形式，或者乳状液。冻干的配制物是为大单位剂量贮存为随后使用或贮存的理想剂型。
在一个实例中，药物制备物可以是液体形式，例如溶液、糖浆或者悬浮液。如果以液体形式提供，药物制备物可以浓缩的制备物提供，在使用之前稀释为治疗有效浓度。药物制备物还可以不需要稀释使用的剂型提供。这种液体制备物可以通过常规方式用药物可接受的添加剂如悬浮剂(例如山梨醇糖浆、纤维素衍生物或者氢化食用脂肪)；乳化剂(例如卵磷脂或阿拉伯胶)；非水相载体(例如杏仁油、油酯或者分级分离的植物油)；及防腐剂(例如甲基或者丙基-对-羟基苯甲酸酯或者山梨酸)制备。在另一实例中，药物制备物可以冻干形式呈现，在使用之前用水或者其它合适的运载体重建。
注射剂设计为局部或全身给予。注射剂可以常规方式制备，液体溶液或者悬浮液，适于在注射之前在液体中形成溶液或悬浮液的固体形式，或者是乳状液。合适的赋形剂是例如水、盐水、葡萄糖、甘油或乙醇。胃肠外给予的制备物包括注射用无菌溶液，使用之前与溶剂组合的无菌干燥可溶产物如冻干粉末，包括皮下注射用片剂，注射用无菌悬浮液，在使用之前与运载体组合的无菌干燥不溶产物，及无菌乳状液。溶液可以是水相或非水相的。如果静脉内给予，合适的载体包括生理盐水或者磷酸盐缓冲盐水(PBS)，及含有增稠剂和溶解剂的溶液，如葡萄糖、聚乙二醇和聚丙二醇及其混合物。
药物组合物可包括载体或其他赋形剂。例如，本发明提供的药物组合物可含有任一或多种稀释剂、佐剂、抗粘附剂、结合剂、包被剂、充填剂、香味剂、色素、润滑剂、助流剂、防腐剂、洗涤剂、吸附剂或者甜味剂及其组合，或者用其给予修饰的PH20多肽的载体。例如，胃肠外制备物中使用的药物可接受的载体或赋形剂包括水相运载体、非水相运载体、抗微生物剂、等渗剂、缓冲剂、抗氧化剂、局麻剂、悬浮和分散剂、乳化剂、螯合剂及其它药物可接受的物质。配制物、包括液体制备物，可以通过常规方式用药物可接受的添加剂或赋形剂制备。
药物组合物可包括载体如稀释剂、佐剂、赋形剂或者用其给予组合物的运载体。举例的合适药物载体在E.W.Martin所著“Remington's Pharmaceutical Sciences”中描述。这种组合物含有治疗有效量的化合物或物质，通常是纯化形式或者部分纯化形式，与合适量的载体一起提供适当给予患者的形式。这种药物载体可以是无菌液体，如水和油，包括石油、动物、植物或者合成来源的那些，如花生油、大豆油、矿物质油和芝麻油。水是典型的载体。盐水溶液和水相葡萄糖和甘油溶液也可以用作液体载体，特别是对于注射溶液。组合物中与活性成分一起还可含有：稀释剂，如乳糖、蔗糖、磷酸二钙或者羧甲基纤维素；润滑剂，如硬脂酸镁、硬脂酸钙和滑石；及结合剂，如淀粉、天然树胶如阿拉伯树胶、明胶、葡萄糖、糖蜜、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素及其衍生物、聚维酮、交聚维酮及本领域技术人员已知的其它这种结合剂。合适的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、水稻、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、无水脱脂奶、甘油、丙烯、乙二醇、水和乙醇。例如，合适的赋形剂是例如水、盐水、葡萄糖、甘油或者乙醇。如果需要，组合物也可以含有其它少量非毒性辅助物质如增湿或乳化剂、pH缓冲剂、稳定剂、溶解性增强剂及其它这种物质，如乙酸钠、失水山梨醇单月桂酸酯、油酸三乙醇胺和环糊精。
用于胃肠外制备物中的药物可接受的载体包括水相运载体、非水相运载体、抗微生物剂、等渗剂、缓冲剂、抗氧化剂、局麻剂、悬浮和分散剂、乳化剂、螯合剂及其它药物可接受的物质。举例的水相运载体包括氯化钠注射液、林格式注射液、等渗葡萄糖注射液、无菌注射用水、葡萄糖和乳化林格式注射液。非水相胃肠外运载体包括植物来源的不挥发油、棉籽油、玉米油、芝麻油和花生油。抑细菌或抑真菌浓度的抗微生物剂可以加入包装在多剂量容器中的胃肠外制备物中，其包括苯酚或甲酚、汞剂、苯甲醇、氯丁醇、甲基和丙基对-羟基苯甲酸酯、硫柳汞、苯扎氯铵和苄索氯铵。等渗剂包括氯化钠和葡萄糖。缓冲剂包括磷酸盐和柠檬酸盐。抗氧化剂包括硫酸氢钠。局麻剂包括盐酸普鲁卡因。悬浮和分散剂包括羧甲基纤维素钠、羟丙基甲基纤维素和聚乙烯吡咯烷酮。乳化剂包括聚山梨醇酯80(TWEEN80)。金属离子螯合剂包括EDTA。药物载体还包括乙醇、聚乙二醇和丙二醇为水溶性载体，及氢氧化钠、盐酸、柠檬酸或乳酸为pH调节剂。
特别地，抑细菌或者抑真菌浓度(例如抗微生物有效量)的抗微生物剂(例如防腐剂)可以加入包装在多剂量容器中的胃肠外制备物中，其包括苯酚或甲酚、汞剂、苯甲醇、氯丁醇、甲基和丙基对-羟基苯甲酸酯、硫柳汞、苯扎氯铵和苄索氯铵。
药物组合物还可以含有其它少量非毒性辅助物质，如增湿或乳化剂、pH缓冲剂、稳定剂、溶解性增强剂及其它这种物质如乙酸钠、失水山梨醇单月桂酸酯、油酸三乙醇胺和环糊精。本发明也预期缓释或持续释放系统的植入，由此维持恒定的剂量水平(见例如美国专利号3,710,795)。这种胃肠外组合物中含有的活性化合物的百分比高度依赖于其特定性质以及该化合物的活性和对象的需求。
冻干粉末
本发明感兴趣的是冻干粉末，其可以重建而以溶液、乳状液及其它混合物形式给予。其也可以作为固体或凝胶重建及配制。冻干粉末可以上述从任何溶液中制备。药物制备物可以冻干形式呈现，在使用之前用水或其它合适运载体重建。
无菌冻干粉末是通过将化合物溶解于缓冲溶液中制备的。缓冲溶液可含有赋形剂，其改良粉末或从该粉末制备的重建溶液的稳定性或其它药物成分。随后在本领域技术人员已知的标准条件下灭菌过滤溶液及随后冻干，提供希望的配制物。简言之，冻干粉末是通过将赋形剂如葡萄糖、山梨醇、果糖、玉米浆、木糖醇、甘油、葡萄糖、蔗糖或者其它合适物质在合适缓冲液如柠檬酸盐、磷酸钠或磷酸钾或者本领域技术人员已知的其它这种缓冲液中溶解而制备。然后，将选择的酶、物质或化合物加入所得混合物中，搅拌直至其溶解。所得混合物经灭菌过滤或者处理以除去微粒及保证无菌性，分配至小瓶中冻干。每个小瓶含有单一剂量(1mg-1g，通常为1-100mg，如1-5mg)或者本文描述的其它剂量，或者多剂量的化合物。冻干粉末可以在适当条件下贮存，如在大约4℃至室温。
这种冻干粉末与缓冲溶液的重建提供了用于胃肠外给予的配制物。精确量依赖于治疗的适应症及选择的混合物。这种量可以根据经验确定。
2.用于其它给予途径的组合物
根据治疗的状况，本发明也预期其它给予途径如表面应用、经皮贴剂、口服和经直肠给予。
例如，直肠给予的药物剂量形式是直肠栓剂、胶囊和片剂用于全身作用。直肠栓剂包括插入直肠中的固体实体，其在体温下融化或软化释放一或多种药理学或治疗活性成分。用于直肠栓剂中的药物学可接受的物质是基质或运载体和升高熔点的物质。举例的基质包括可可油(可可豆油)、甘油-明胶、carbowax(聚氧乙二醇)及脂肪酸甘油一酯、脂肪酸甘油二酯和脂肪酸甘油三酯的适当混合物。可以使用各种基质的组合。提高栓剂熔点的物质包括鲸油和蜡。直肠栓剂可以通过压缩方法或者通过模塑方式制备。典型的直肠栓剂重量是大约2-3gm。直肠给予的片剂和胶囊是使用相同药物可接受的物质及通过与配置口服制备物相同的方法生产的。适于直肠给予的配制物可以单位剂量栓剂形式提供。这些可以通过混合活性化合物与一或多种常规固体载体如可可油及然后对所得混合物塑形而制备。
对于口服给予，药物组合物可以是例如片剂或胶囊形式，通过常规方式用药物可接受的赋形剂制备，所述赋形剂如结合剂(例如预胶化玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或者羟丙基甲基纤维素)；充填剂(例如乳糖、微晶纤维素或者磷酸氢钙)；润滑剂(例如硬脂酸镁、滑石或者二氧化硅)；崩解剂(例如马铃薯淀粉或者羧基乙酸淀粉钠)；或者增湿剂(例如十二烷基硫酸钠)。片剂可以通过本领域熟知的方法包被。
适于口腔(舌下)给予的配制物包括例如含有在香味基质通常为蔗糖和阿拉伯树胶或黄芪胶中的活性化合物的锭剂(lozenges)；及含有在惰性基质如明胶和甘油或者蔗糖和阿拉伯树胶中的化合物的锭剂(pastilles)。
如针对局部和全身给予所述制备表面混合物。所得混合物可以是溶液、悬浮液、乳状液等，配制为乳霜、凝胶、软膏、乳状液、溶液、酏剂、洗剂、悬浮液、酊剂、糊剂、泡沫、气雾剂、冲洗剂、喷雾剂、栓剂、绷带、皮肤贴剂或者适于表面给予的任何其它配制物。
所述化合物或其药物可接受的衍生物可以配制为气雾剂以表面应用，例如吸入(见例如美国专利号4,044,126、4,414,209和4,364,923，其描述了气雾剂输送类固醇用于治疗炎症性疾病、特别是哮喘)。对于给予呼吸道的这些配制物可以是气雾剂或者喷雾溶液形式，或者是微细粉末吹入，单独或者组合惰性载体如乳糖。在这种情况中，配制物的颗粒的直径典型小于50微米，或者小于10微米。
化合物可以配制为局部或表面应用，如以凝胶、乳液和洗液形式表面应用于皮肤和粘膜，如眼中，及配制为应用于眼或者脑池内或者椎管内应用。表面给予是经皮输送，及也给予眼或粘膜，或者吸入治疗。也可以给予单独或者组合其它药物可接受的赋形剂的活性化合物的鼻用溶液。
本发明提供了适于经皮给予的配制物。其可以是任何合适形式，如独立的皮肤贴剂，其适应于以延长时间保持与接受者的表皮紧密接触。这种贴剂在任选缓冲的水溶液中含有活性化合物，例如活性化合物的浓度为0.1-0.2M。适于经皮给予的配制物也可以通过离子导入法输送(见例如Tyle,P,Pharmaceutical Research 3(6):318-326(1986))，及典型是活性化合物的任选缓冲的水溶液形式。
药物组合物也可以通过控制释放配制物和/或输送装置给予(见例如美国专利号3,536,809、3,598,123、3,630,200、3,845,770、3,916,899、4,008,719、4,769,027、5,059,595、5,073,543、5,120,548、5,591,767、5,639,476、5,674,533和5,733,566)。
3.剂量及给予
组合物中的ADA2，如本发明所述任何ADA2、包括野生型、变体、缀合物或者其它修饰形式，可以配制为物药物组合物用于单一剂量或多剂量给予。所述蛋白质可以对治疗对象不存在不希望的副作用的足以发挥治疗有益作用的量包含于组合物中。例如，调整药物活性化合物的浓度以便注射剂提供有效量以产生希望的药理学作用。治疗有效浓度可以通过在已知的体外和体内系统中检测蛋白质而根据经验确定，如使用本文描述或者本领域已知的测定。例如，可以应用标准临床技术。此外，体外测定和动物模型可用于帮助鉴别最佳剂量范围。可以根据经验确定的精确剂量可依赖于患者或动物的年龄、体重和状况、给予的特定ADA2分子、给予途径、治疗的疾病类型以及疾病的严重性。
因此，应理解精确剂量和治疗持续时间与治疗的疾病相关，可以使用已知的检测方案根据经验确定或者通过从体内或体外检测数据中推断。应注意浓度和剂量值也可以随着状况严重度的减轻而变化。应进一步了解的是对于任何特定对象，应根据个体需要及给予或监督组合物给予的人员的专业判断随时调整具体的剂量方案，本文陈述的浓度范围只是举例说明，无限制组合物及含有其的组合的范围或应用之意。所述组合物可以每小时、每天、每周、每月、每年给予或者只给予一次。通常，选择剂量方案以限制毒性。应注意由于毒性或者骨髓、肝脏或肾脏或其它组织功能障碍，主治医生已知怎样及何时终止、中断或者调整治疗至更低剂量。相反，如果临床反应不足够(排除毒性副作用)，主治医生也已知怎样及何时调整治疗至更高水平。
ADA2蛋白如其野生型、变体、缀合物或者其它修饰形式的组合物以足以发挥治疗有益作用的量包含于所述组合物中。例如，所述量是在过度增生性疾病或状况如癌症的治疗中达到治疗作用的量。通常，组合物含有0.5μg-100g的ADA2蛋白，例如20μg-10g、20μg-50g、20μg-1g、20μg-500mg、20μg-200mg、20μg-5mg、20μg-0.5mg、0.5mg-100g、0.5mg-10g、0.5mg-5g、0.5mg-1g、0.5mg-500mg、0.5mg-200mg、0.5mg-5mg、5mg-100g、5mg-10g、5mg-5g、5mg-1g、5mg-500mg、5mg-200mg、100mg-100g、100mg-10g、100mg-5g、100mg-1g、100mg-500mg、100mg-200mg、200mg-100g、200mg-10g、200mg-5g、200mg-1g、200mg-500mg、500mg-100g、500mg-10g、500mg-5g、500mg-1g、1g-100g、1g-10g、1g-5g、5g-100g、5g-10g或者10g-100g。例如，所述组合物可含有ADA2的量是至少或至少大约或者是1mg、5mg、10mg、20mg、30mg、40mg、50mg、60mg、70mg、80mg、90mg、100mg、200mg、300mg、400mg、500mg、600mg、700mg、800mg、900mg、1g、5g、10g、20g、30g、40g、50g、60g、70g、80g、90g、100g、200g、300g或更多。
在进一步的实例中，组合物含有或含有大约1毫单位(mU)至10,000单位(U)、1mU-1,000U、1mU-100U、1mU-10U、1mU-1U、1mU-100mU、1mU-10mU、10mU-10,000U、10mU-1,000U、10mU-100U、10mU-10U、10mU-1U、10mU-100mU、100mU-10,000U、100mU-1,000U、100mU-100U、100mU-10U、100mU-1U、1U-10,000U、1U-1,000U、1U-100U、1U-10U、10U-10,000U、10U-1,000U、10U-100U、100U-10,000U、100U-1,000U、1,000U-10,000U的ADA2。例如，组合物可含有的ADA2的量是至少或至少大约或者是1mU、2mU、3mU、4mU、5mU、6mU、7mU、8mU、9mU、10mU、20mU、30mU、40mU、50mU、60mU、70mU、80mU、90mU、100mU、200mU、300mU、400mU、500mU、600mU、700mU、800mU、900mU、1U、10U、20U、30U、40U、50U、60U、70U、80U、90U、100U、200U、300U、400U、500U、600U、700U、800U、900U、1000U、2000U、3000U、4000U、5000U、6000U、7000U、8000U、9000U、10000U或更多。
含有本发明提供的ADA2的组合物的体积可以在或在大约0.1mL-100mL，例如0.5mL-100mL、0.5mL-50mL、0.5mL-10mL、1mL-100mL、1mL-50mL、1mL-40mL、1mL-20mL、1mL-10mL、或者3mL-10mL。典型地，组合物的注射或者输注体积是至少或至少大约0.01mL、0.05mL、0.1mL、0.2mL、0.3mL、0.4mL、0.5mL、1mL、2mL、3mL、4mL、5mL、6mL、7mL、8mL、9mL、10mL、20mL、30mL、40mL、50mL或更多。
本发明提供的任何ADA2、野生型、变体或缀合物(例如聚乙二醇化ADA2)可以提供的浓度是或是大约或至少或至少大约1mU/mL、10mU/mL、20mU/mL、10mU/mL、20mU/mL、30mU/mL、40mU/mL、50mU/mL、60mU/mL、70mU/mL、80mU/mL、90mU/mL、100mU/mL、200mU/mL、300mU/mL、400mU/mL、500mU/mL、600mU/mL、700mU/mL、800mU/mL、900mU/mL、1U/mL、2U/mL、3U/mL、4U/mL、5U/mL、6U/mL、7U/mL、8U/mL、9U/mL、10U/mL、20U/mL、30U/mL、40U/mL、50U/mL、100U/mL、150U/mL、200U/mL、250U/mL、400U/mL、500U/mL、1000U/mL、2000Units/mL、3000U/mL、4000U/mL、5000U/mL、6000U/mL、7000U/mL、8000U/mL、9000U/Ml或者10,000U/mL。组合物可以制备为直接使用或者在使用之前稀释为有效浓度。
药物和治疗活性化合物及其衍生物典型以单位剂量形式或者多剂量形式配制和给予。每个单位剂量含有足以产生希望的治疗作用的预定数量的治疗活性化合物，联合需要的药物学载体、运载体或者稀释剂。单位剂量形式包括但不限于含有适量化合物或其药物可接受的衍生物的片剂、胶囊、药丸、粉末、颗粒剂、无菌胃肠外溶液或悬浮液及口服溶液或悬浮液，以及油水乳状液。单位剂量形式可以包含于安瓶和注射器中或者单独包装为片剂或胶囊。单位剂量形式可以分部分或多倍给予。多剂量形式是多个相同单位剂量形式包装在一个容器中，以隔离的单位剂量形式给予。举例的多剂量形式包括小瓶、片剂或胶囊瓶或者品脱或加仑瓶。因此，多剂量形式是多个单位剂量，其不是隔离包装的。通常，可以制备含有0.005％-100％范围的活性成分及由非毒性载体平衡的剂量形式或组合物。药物组合物可以适于每种给予途径的剂量形式配制。
单位剂量胃肠外制备物包装在安瓶、小瓶或者有针头的注射器中。含有所述药物活性化合物的液体溶液或者重建的粉末制备物的体积与治疗的疾病和选择包装的特定生产产品相关。所有胃肠外给予的制备物必须是无菌的，如本领域已知及实践。
如所述，本发明提供的组合物可以配制为用于本领域技术人员已知的任何途径，包括但不限于皮下、肌肉、静脉内、皮内、病灶内、腹膜内注射、硬膜外、阴道、直肠、局部、耳、经皮给予或者任何给予途径。适于这种途径的配制物为本领域技术人员已知。组合物也可以与其它生物活性物质相继、间隔或者在同一组合物中给予。
药物组合物可以通过控制释放配制物和/或输送装置给予(见例如美国专利号3,536,809、3,598,123、3,630,200、3,845,770、3,847,770、3,916,899、4,008,719、4,687,660、4,769,027、5,059,595、5,073,543、5,120,548、5,354,556、5,591,767、5,639,476、5,674,533和5,733,566)。
已知多种输送系统且可用于给予选择的组合物，例如但不限于脂质体中包囊、微粒、微囊、能表达化合物的重组细胞、受体介导的胞吞，及编码ADA2如其野生型、变体或修饰形式的核酸分子输送，或者其它物质如逆转录病毒输送系统。在一些实施方案中，组合物含有编码本发明提供的变体ADA2多肽的核酸，如溶瘤细胞病毒载体或者基因治疗载体，或者细胞，如修饰的免疫细胞以进行过继性免疫治疗，及特定组合物可以在适于特定组合物的输送系统中给予。
因此，在某些实施方案中，脂质体和/或纳米粒子也可以用于给予本发明的组合物和组合。脂质体是从磷脂形成的，其分散于水相介质中并自发形成多层同中心双层小泡(也称作多层小泡(MLV))。MLV通常具有25nm-4μm的直径。对MLV进行超声导致形成小单层小泡(SUV)，直径在200-500埃范围，在核心含有水溶液。在一些实施方案中，脂质体可以是多小泡脂质体(MVL)。
当分散于水中时，根据脂质与水的摩尔比率，磷脂可以形成除了脂质体之外的多种结构。在低比率，形成脂质体。脂质体的物理特性依赖于pH、离子强度及二价阳离子的存在。脂质体可示出对离子和极性物质的低通透性，但是在升高的温度经历明显改变其通透性的相变。所述相变包括从称作凝胶状态的密集有序结构变为称作液体状态的松散无序结构。这种转变是在特征性相变温度下发生，导致对离子、糖和药物的通透性增加。
脂质体通过不同机制与细胞相互作用：由网状内皮系统的吞噬细胞如巨噬细胞和中性粒细胞的胞吞；吸附于细胞表面，通过非特异性弱疏水性或静电力，或者通过与细胞表面成分特异性相互作用；与浆细胞膜融合，通过将脂质体的脂质双层插入浆膜中，同时将脂质体内容物释放进入细胞质中；及通过脂质体脂质转移至细胞或亚细胞膜，或者反之亦然，与脂质体内容物无任何关联。改变脂质体配制可以改变运行机制，尽管同时可以运行一种以上的机制。纳米胶囊可通常以稳定和可再生方式诱捕(entrap)化合物。为了避免由于细胞内聚合物超荷载的副作用，这种超细颗粒(大小约0.1μm)应使用在体内能降解的聚合物设计。预期符合这些要求的可生物降解的聚烷基氰基丙烯酸酯纳米粒子可用于本发明，这种粒子可易于产生。
4.包装与生产产品
本发明还提供了生产产品，其含有包装材料、本发明提供的任何药物组合物及标示所述组合物用于治疗如本文所述的疾病或状况的标签。例如，标签可标示所述治疗用于肿瘤或癌症。所述标签也可标示所述治疗用于如本文所述的与升高的标记物相关的疾病或状况，如在组织或细胞上升高的或积聚的腺苷水平、升高的腺苷受体(ADR)和/或升高的CD73或CD39水平。
本发明描述的ADA2蛋白、包括变体、缀合物(例如聚乙二醇化的ADA2)或其它修饰形式与另一治疗剂的组合也可以包装在生产产品中。在一个实例中，生产产品包括包含ADA2如本发明提供的任何ADA2及无其它物质或治疗的药物组合物。在其它实例中，生产产品包括含有ADA2及另一种其它治疗剂的药物组合物。例如，生产产品包括含有ADA2及另一种治疗如免疫检查点抑制剂或者抗肿瘤剂的药物组合物。在这个实例中，所述物质可以一起或单独提供包装为生产产品。
本发明提供的生产产品含有包装材料。用于包装药物产品的包装材料为本领域技术人员熟知。见例如美国专利号5,323,907、5,052,558和5,033,252，所述专利均以其全文并入本文作参考。举例的药物包装材料包括但不限于泡罩包装、瓶、管、吸入器、泵、袋、小瓶、容器、注射器、瓶，及适于选择的配制物和指定给予模式和治疗的任何包装材料。举例的生产产品是容器，包括单腔和双腔容器。所述容器包括但不限于管、瓶和注射器。所述容器可进一步包括用于静脉内给予的注射针。
包装的选择依赖于所述物质及这种组合物是否一起或单独包装。通常，包装与包含于其中的组合物不反应。在其它实例中，一些成分可以作为混合物包装。在其它实例中，所有成分均单独包装。因此，例如所述成分可以包装为单独的组合物，在给予之前混合，可以直接一起给予。或者，所述成分可以包装为单独的组合物用于单独给予。
选择的组合物、包括其生产产品，也可以作为试剂盒提供。试剂盒可包含本文所述药物组合物及作为生产产品提供的给予物件。例如，ADA2可以用一个给予装置如注射器、吸入器、剂量杯、滴管或者涂药器提供。所述组合物可以包含于给予物件中或者单独提供在后期加入。试剂盒可任选包含应用说明书，包括剂量、给药方案和给予模式指导。试剂盒还可以包含本文描述的药物组合物及诊断物件。
H.使用腺苷脱氨酶2(ADA2)的治疗方法
本发明提供的方法包括给予或使用本发明所述任何腺苷脱氨酶2(ADA2)如其野生型、变体、缀合物(例如聚乙二醇化ADA2)或其它修饰形式用于治疗患有疾病或状况的对象的方法，所述对象的症状可以通过降低对象中腺苷或脱氧腺苷水平降低而改善或减轻。例如，所述疾病或状况是与升高的腺苷水平相关的。例如，由于ADA2呈现出对于腺苷的低结合亲和性，Km为大约200×10-5M，其在升高或较高腺苷水平条件下优先呈现出活性。因此，使用ADA2作为治疗剂赋予对于疾病或异常环境呈现特异性、而在其中腺苷水平较低的正常环境不呈现活性的益处。在特别的实例中，如下文所述，所述疾病或状况是肿瘤或癌症。可以基于胞外腺苷的水平、腺苷受体(ADR)表达的水平和/或外核苷酸酶表达的水平选择对象。此外，本发明还提供了与一或多种另外的治疗剂如抗癌剂或抗透明质酸剂的组合治疗方法。
1.举例的疾病和状况
腺苷的浓度在无应激组织的间隙液中以低水平生理性存在，其应答病理状况如缺氧、缺血、肿瘤环境或创伤时可以快速增加。当释放进入胞外间隙时，腺苷作为危险信号并通过腺苷受体(ADR)激活起作用，产生各种细胞应答以恢复组织内稳态。腺苷与各种活性相关，其可组成疾病和状况的病因学，包括但不限于刺激肿瘤生长和血管发生、抑制细胞因子合成及免疫细胞粘附内皮壁、抑制T细胞、巨噬细胞和天然杀伤细胞的功能，以及促进肿瘤转移。
腺苷脱氨酶如本发明描述的任何ADA2或其变体、缀合物或其它修饰形式在这种条件下通过使腺苷分子脱氨为肌苷而可以调节胞外腺苷水平。因此，任何这种疾病均可以用本发明描述的ADA2如野生型、变体、缀合物(例如聚乙二醇化ADA2)或其它修饰形式治疗。特别地，ADA2具有有助于胞外稳定性的性质，如广泛糖基化及存在保守二硫键，这使其是令人满意的治疗剂。本发明提供了举例的可以用ADA2治疗的疾病和状况。
含有ADA2的组合物可以通过治疗疾病或状况所需的任何途径给予。特定的给予途径可依赖于特定疾病或状况、疾病或状况的严重性、特定配制物及本领域技术人员已知的其它因素。典型地，所述组合物通过静脉内途径给予，但是也可以考虑其它给予途径，如本领域技术人员已知的任何途径，包括肌肉、腹膜内、静脉内、皮内、病灶内、腹膜内注射、经硬膜外、阴道、直肠、局部、耳、经皮给予或者任何给予途径。
a.癌症与肿瘤
ADA2，如本发明所述任何ADA2、包括野生型、变体、缀合物(例如聚乙二醇化ADA2)或其它修饰形式，可用于治疗肿瘤或癌症。在肿瘤微环境(TME)中的高水平胞外腺苷产生局部免疫抑制环境并抑制T和NK细胞活性。通过产生免疫抑制性TME及对特定肿瘤和免疫细胞的ADR信号传导，腺苷通常产生有利于肿瘤生长、血管化和转移的TME。
调节腺苷信号传导的物质已经示出在许多癌症类型中抑制肿瘤生长和调节下游细胞信号传导中的作用，所述癌症类型如乳腺癌、肺癌、结肠癌、前列腺癌和黑色素瘤细胞(Antonioli et al.(2013)Nat Rev Can 13:842-857)。腺苷脱氨酶如本发明所述任何ADA2或其变体、缀合物或修饰形式通过使腺苷分子脱氨为肌苷可以调节肿瘤环境中的胞外腺苷水平。因此，任何ADA2、其变体、缀合物(例如聚乙二醇化ADA2)或修饰形式可用作调节腺苷水平和信号传导的物质，逆转抗肿瘤免疫应答的免疫抑制作用，及最终降低肿瘤生长。
特别地，可以通过本发明提供的方法治疗或改善的疾病或状况包括例如其中肿瘤生长通过高浓度腺苷和/或腺苷受体(ADR)信号传导刺激的那些。例如，TME主动产生高浓度腺苷，从而产生局部免疫抑制环境，其对于ADA2治疗更敏感。与大约0.1μM的正常腺苷水平相比，TME中腺苷水平升高至大约10μM。由于ADA2具有高Km及在含有升高的腺苷如常见于肿瘤微环境(TME)的条件下具有优先活性，因此ADA2通过其腺苷脱氨酶活性可以在TME中降低腺苷水平。本发明提供的任何ADA2、包括ADA2野生型、其变体和修饰形式可用于治疗在TME中具有高浓度腺苷的肿瘤，包括实体瘤。
此外，如本发明示出，ADA2或其变体也呈现出不同的pH最佳值，其可优先靶向TME内的区域。例如，TME的缺氧区通常具有大约pH 6.5的低pH值，这与ADA2的pH最佳值相同。例如，改变的pH常见于疾病状态微环境如在TME中(见例如Fogh Andersen et al.(1995)Clin.Chem.,41:1522-1525；Bhujwalla et al.(2002)NMR Biomed.,15:114-119；Helmlinger et al.(1997)Nature Med.,3:177；Gerweck and Seetharaman(1996),CancerRes.56(6):1194-1198)。例如，在许多肿瘤中，Warburg作用产生pH范围为大约5.6-大约6.8、如低于或大约或者是pH 5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7或6.8的微环境。因此，在酸性pH比在中性pH更具活性的ADA2如本发明所述ADA2野生型或变体可用于治疗在低pH TME内的肿瘤，而在非靶疾病细胞或组织中活性最小。
因此，给予本发明提供的任何ADA2以通过将腺苷经酶促转变为肌苷从而降低TME中腺苷浓度可用于阻止肿瘤生长和转移，同时对非靶疾病细胞或组织的活性最小。
本发明提供的方法可用于治疗与治疗对象中升高的腺苷水平相关和/或易感于腺苷或脱氧腺苷水平降低的所有类型的肿瘤，包括癌症。这些肿瘤广泛地包括血液肿瘤以及实体瘤。所述肿瘤包括当腺苷水平降低时其生长被抑制的那些。肿瘤包括其中降低的腺苷水平使得对象免疫系统更有效抑制肿瘤生长的那些，和/或当降低的腺苷水平抑制血供时其生长被抑制的肿瘤，如缺氧性肿瘤。特别地，实体瘤易感于本发明提供的方法的治疗，因为其更敏感于得自腺苷水平降低的肿瘤血管发生的减少。在TME部分中高水平腺苷促进血管发生，使用本发明提供的方法降低腺苷水平可导致腺苷的血管发生作用降低。此外，高腺苷水平和CD73活性与癌细胞散播和转移相关。因此，通过给予本发明提供的任何ADA2实现的腺苷水平降低可导致癌细胞散播和转移的抑制。
通过本发明提供的方法治疗的肿瘤包括但不限于源自如下的那些：免疫系统、骨骼系统、肌肉和心脏、乳腺、胃肠道、中枢和周围神经系统、肾脏系统、生殖系统、呼吸系统、皮肤、结缔组织系统包括关节、脂肪组织、及循环系统包括血管壁。通过给予本发明提供的任何ADA2或其变体或修饰形式可以治疗的肿瘤例如包括癌瘤、神经胶质瘤、肉瘤(包括脂肪肉瘤)、腺癌、腺肉瘤和腺瘤。这种肿瘤事实上可以在全部机体中发生，包括例如乳腺、心脏、肺、小肠、结肠、脾、肾、膀胱、头颈、卵巢、前列腺、脑、胰腺、皮肤、骨、骨髓、血液、胸腺、子宫、睾丸、子宫颈或者肝。
骨骼系统的肿瘤包括例如肉瘤和胚细胞瘤如骨肉瘤、软骨肉瘤和软骨母细胞瘤。肌肉和心脏肿瘤包括骨骼肌和平滑肌的肿瘤，例如平滑肌瘤(良性平滑肌肿瘤)、平滑肌肉瘤、横纹肌瘤(良性骨骼肌肿瘤)、横纹肌肉瘤、心脏肉瘤。胃肠道肿瘤包括例如口腔、食管、胃、小肠、结肠和结肠直肠的肿瘤，以及胃肠道分泌器官如唾液腺、肝、胰腺和胆管的肿瘤。中枢神经系统的肿瘤包括脑、视网膜和脊髓的肿瘤，也可以源自相关结缔组织、骨、血管或者神经组织。本发明也考虑周围神经系统的肿瘤的治疗。周围神经系统的肿瘤包括恶性周围神经鞘瘤。肾脏系统的肿瘤包括肾的那些肿瘤，例如肾细胞癌，以及输尿管和膀胱的肿瘤。生殖系统的肿瘤包括子宫颈、子宫、卵巢、前列腺、睾丸和相关分泌腺的肿瘤。免疫系统的肿瘤包括血液肿瘤和实体瘤，包括淋巴瘤，例如Hodgkin's和非Hodgkin's淋巴瘤。呼吸系统肿瘤包括鼻道、气管和肺的肿瘤。乳腺的肿瘤包括例如小叶癌和导管癌。
可以用本发明提供的任何ADA2或其变体或修饰形式治疗的肿瘤的其它实例包括Kaposi's肉瘤、CNS肿瘤、成神经细胞瘤、毛细血管血管母细胞瘤、脑膜瘤和脑转移癌、黑色素瘤、胃肠道及肾癌和肉瘤、横纹肌肉瘤、胶质母细胞瘤(如多形性胶质母细胞瘤)和平滑肌肉瘤。可以用本发明提供的任何ADA2或其变体或修饰形式治疗的癌症的例子包括但不限于淋巴瘤、胚细胞瘤、神经内分泌肿瘤、间皮瘤、神经鞘瘤、脑膜瘤、黑色素瘤及白血病或淋巴恶性肿瘤。这种癌症的实例包括血液恶性肿瘤，如Hodgkin's淋巴瘤，非Hodgkin's淋巴瘤(Burkitt's淋巴瘤、小淋巴细胞性淋巴瘤/慢性淋巴细胞性白血病、蕈样肉芽肿病、套细胞淋巴瘤、滤泡淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、边缘带淋巴瘤、毛细胞白血病和淋巴浆细胞性白血病)，淋巴细胞前体细胞肿瘤，包括B细胞急性成淋巴细胞性白血病/淋巴瘤，及T细胞急性成淋巴细胞性白血病/淋巴瘤，胸腺瘤，成熟T和NK细胞肿瘤，包括周围T细胞白血病，成人T细胞白血病/T细胞淋巴瘤，及巨粒淋巴细胞白血病，Langerhans细胞组织细胞增多症，髓样瘤如急性髓性白血病，包括成熟AML、不分化AML、急性前髓细胞性白血病、急性髓单核细胞白血病、及急性单核细胞白血病，骨髓增生异常综合征，及慢性髓性增生性失调，包括慢性髓性白血病；中枢神经系统肿瘤，如神经胶质瘤，胶质母细胞瘤，神经母细胞瘤，星形细胞瘤，髓母细胞瘤，室管膜瘤及视网膜母细胞瘤；实体瘤，如头颈(例如鼻咽癌、唾液腺癌和食管癌)，肺(例如小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞癌)，消化系统(例如胃癌，包括胃肠癌，胆管癌，结肠癌，直肠癌，结肠直肠癌和肛管癌)，生殖系统(例如睾丸癌、阴茎癌或者前列腺癌，子宫、阴道、外阴、子宫颈、卵巢和子宫内膜癌)，皮肤(例如黑色素瘤，基底细胞癌，鳞状细胞癌，光化性角化病，表皮黑色素瘤)，肝(例如肝癌，肝部癌症(hepaticcarcinoma)，肝细胞癌和肝细胞瘤)，骨(例如破骨细胞瘤和溶骨性骨癌)，其它组织和器官(例如胰腺癌，膀胱癌，肾癌，甲状腺癌，乳腺癌，腹膜癌及Kaposi's肉瘤)，血管系统的肿瘤(例如血管肉瘤和血管外皮细胞瘤)，Wilms'肿瘤，视网膜母细胞瘤，骨肉瘤和Ewing's肉瘤。
b.非癌过度增生性疾病
本发明所述任何ADA2如其野生型、变体、缀合物(例如聚乙二醇化ADA2)或其它修饰形式可用于治疗对象的非癌增生性疾病。腺苷和ADR信号传导在对多种细胞应答如促分裂原激活的蛋白激酶激活、基因转录和增殖的许多信号传导途径中起作用，包括G蛋白偶联受体(GPCR)、环AMP(cAMP)信号传导和/或细胞因子信号传导。某些腺苷受体(ADR)如A1受体的激活可以起始细胞途径，导致细胞增殖。过表达和/或过刺激可导致过度增殖。本发明提供的任何ADA2通过降低参与过度增生性失调的细胞中ADR的激活可以用于治疗非癌过度增生性失调。
可以由本发明提供的任何ADA2、包括本发明提供的其野生型、变体和修饰形式治疗的过度增生性疾病包括任何过度增生性疾病，包括例如银屑病、日光性角化病、脂溢性角化病、疣、瘢瘤疙瘩和湿疹。也包括由病毒感染引起的过度增生性疾病，如乳头瘤病毒感染。不同类型的银屑病可展示如脓样水疱(脓疱性银屑病)、I型重度皮肤腐肉形成(红皮性银屑病)、滴状斑点(滴状银屑病)及光滑的炎症皮损(皮褶银屑病)等特性。应理解银屑病的治疗包括治疗所有类型银屑病(例如寻常性银屑病、脓疱性银屑病、红皮性银屑病、关节病性银屑病、类银屑病、掌跖脓疱病)。
c.纤维化疾病
本发明描述的任何ADA2如其野生型、变体、缀合物(例如聚乙二醇化ADA2)或其它修饰形式可用于治疗纤维化疾病，特别是与升高的腺苷相关的那些。腺苷水平在应激条件下升高，如缺氧、缺血、炎症、肿瘤环境或者创伤。在这些条件下，胞外腺苷是危险信号并促进组织内稳态的各种应答。然而，持续增加的腺苷浓度超过急性损伤期则通过激活触发免疫抑制或者促进不间断伤口愈合过程的途径而可变成对组织有害，导致纤维性重塑(Antonioli et al.(2013)Nat Rev Can 13:842-857)。给予本发明提供的ADA2，其可以降低应激相关的胞外腺苷增加，可用于治疗与过多的纤维化组织堆积相关的疾病或状况，如纤维化，在修复或反应过程中在器官或组织中形成过多的纤维结缔组织。与纤维化相关的疾病或状况包括例如肺纤维化，包括特发性肺纤维化和囊性纤维化；肝纤维化，包括肝硬化；心脏纤维化，包括心内膜心肌纤维化、心肌梗塞、心房纤维化；及其它纤维化状况，包括纵膈纤维化(纵膈软组织纤维化)、髓纤维化(骨髓纤维化)、腹膜后纤维化(腹膜后腔软组织纤维化)、进行性大块纤维化(肺纤维化)、肾源性系统性纤维化(皮肤纤维化)、Crohn's病(肠纤维化)、瘢痕(皮肤纤维化)、硬皮病/全身硬化(皮肤、肺的纤维化)、关节纤维化(膝、肩及其它关节的纤维化)、Peyronie's病(阴茎纤维化)、Dupuytren's挛缩(手、手指的纤维化)及粘连性关节囊炎(肩纤维化)。
d.感染性疾病
本发明提供的任何ADA2如其野生型、变体、缀合物(例如聚乙二醇化ADA2)或其它修饰形式可用于治疗与升高的腺苷相关的感染性疾病。侵袭性病原体可利用宿主内源性免疫抑制机制如腺苷介导的免疫抑制促进在宿主体内传播或存活。例如，白色念珠菌(Candida albicans)菌丝释放腺苷以抑制中性粒细胞介导的生物体杀伤，及金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)也产生腺苷以抑制宿主的免疫应答。此外，在新生儿及老年人中增加的感染易感性也与升高的腺苷水平信号传导相关(Hasko et al.(2013)FrontImmunol.4:85)。
因此，在某些感染性疾病中，ADA2可用作治疗以降低腺苷介导的免疫抑制。本发明提供的任何ADA2包括其野生型、变体和修饰形式可用于治疗感染性疾病。可以由本发明提供的任何ADA2治疗的感染性疾病包括但不限于由病原体导致的疾病，如病毒、细菌、真菌、原生动物和寄生物。感染性疾病可以由病毒导致，包括腺病毒、巨细胞病毒、登革病毒、Epstein-Barr病毒、汉坦病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、I型单纯疱疹病毒、II型单纯疱疹病毒、人免疫缺陷病毒(HIV)、人乳头瘤病毒(HPV)、流感病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、乳多空病毒、脊髓灰质炎病毒、呼吸道合胞病毒、牛瘟病毒、鼻病毒、轮状病毒、风疹病毒、SARS病毒、天花病毒和病毒性脑膜炎病毒。感染性疾病也可以由细菌导致，包括炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)、伯氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)、空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)、沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)、肉毒梭菌(Clostridium botulinum)、破伤风梭菌(Clostridium tetani)、白喉杆菌(Diphtheria)、大肠杆菌(Escherichia coli)、军团菌属(Legionella)、幽门螺旋杆菌(Helicobacterpylori)、分支杆菌立克次体(Mycobacterium rickettsia)、结核分支杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)、支原体奈瑟氏菌(Mycoplasma Neisseria)、百日咳杆菌(Pertussis)、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、链球菌属(Streptococcus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、霍乱弧菌(Vibrio cholera)及鼠疫杆菌(Yersinia pestis)。感染性疾病也可以由真菌导致，如烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、皮炎芽生菌(Blastomyces dermatitidis)、白色念珠菌(Candida albicans)、粗球孢子菌(Coccidioides immitis)、新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)、荚膜组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum)和马尔尼菲青霉菌(Penicillium marneffei)。感染性疾病也可以由原生动物和寄生物导致，如衣原体属、球虫病(kokzidiose)、利什曼虫属、疟疾、立克次体属和锥体虫属。
e.其它疾病和状况
在ADA1基因中携带有害突变的个体可以发生从轻度至重度的各种程度的免疫缺陷失调。这种免疫缺陷失调是由于酶底物腺苷和脱氧腺苷在不成熟淋巴样细胞中的毒性积聚所致。失调的发作根据遗传的突变而可以是从幼儿至成人。ADA1缺陷是导致儿童重症联合免疫缺陷疾病(SCID)的原因之一，及是基因治疗方法的主导靶位之一(R.Parkman etal.,2000,"Gene therapy for adenosine deaminase deficiency",Ann.Rev.Med.,51:33-47)。
本发明提供的ADA2如野生型、变体、缀合物(例如聚乙二醇化ADA2)或其它修饰形式可用于治疗SCID或者其它ADA1介导的免疫缺陷。免疫缺陷通常分类为获得性免疫缺陷或者遗传性免疫缺陷。获得性免疫缺陷包括人免疫缺陷病毒-1(HIV-1)感染、疱疹病毒感染、Epstein-Barr病毒感染、瘤型麻风及烧伤患者中皮肤烧伤导致的减少的免疫能力，即烧伤相关免疫缺陷。遗传性免疫缺陷包括一些遗传不同形式的SCID，包括腺苷脱氨酶缺陷依赖性SCID(ADA SCID)，有和无B细胞的常染色体隐性遗传SCID(无ADA缺陷)，无B细胞的X-连锁隐性遗传SCID，常染色体隐性遗传SCID(有ADA缺陷)，嘌呤核苷磷酸化酶缺陷(PNP SCID)，重症联合免疫缺陷(IL-2受体缺陷；即X-连锁的SCID)，及裸淋巴细胞综合征。其它免疫缺陷包括多种形式的先天或遗传决定的造血异常，一些高危白血病和一些形式的重症危及生命的再生障碍性贫血。可以治疗的其它免疫缺陷包括Wiskott-Aldrich综合征，Blackfan-Diamond综合征，Fanconi贫血，重度中性粒细胞功能障碍，儿童慢性肉芽肿病，重度(Kostman-型)粒细胞缺乏症，软骨毛发发育不良的免疫缺陷和中性粒细胞减少，婴儿和迟发型骨质疏松症，再生障碍性贫血-毒性化合物性、自发性、免疫性和遗传性(非-Fanconi)，急性髓性白血病，慢性髓性白血病，Burkitt淋巴瘤，及复发的急性淋巴细胞性白血病。在特别的实例中，治疗的免疫系统失调是腺苷脱氨酶缺陷依赖性重症联合免疫缺陷(ADASCID)。
2.患者选择方法
本发明提供了基于本文所述的腺苷相关的生物标记的水平选择患者使用本发明提供的任何ADA2进行治疗的方法。举例的腺苷相关的生物标记包括血浆腺苷水平、腺苷受体(ADR)水平和外核苷酸酶水平。
例如，血浆或其它样品中腺苷水平升高的对象可以对使用ADA2的治疗更敏感，因为给予ADA2的作用直接降低升高的胞外腺苷水平。在另一实例中，表达升高或高水平ADR如样品如肿瘤样品中A2A和A2B腺苷受体的对象可以对使用ADA2治疗更敏感，因为对于腺苷和肿瘤生长的作用可以通过结合在肿瘤细胞上表达的ADR直接介导。在进一步的实例中，肿瘤样品或其它样品中CD39和CD73外核苷酸酶的水平和表达升高的对象可以对使用ADA2治疗更敏感，因为增加的CD39和CD73表达导致升高的腺苷水平，升高的腺苷水平通过ADR信号传导具有下游癌症促进作用。因此，这些生物标记可用于选择或鉴别预测对于治疗有反应的患者，和/或监测治疗和治疗效力，从而提供使用本发明提供的任何ADA2治疗腺苷相关疾病或状况如肿瘤或癌症的改良的治疗方案。
a.腺苷相关生物标记
本发明提供了选择具有可用ADA2治疗的肿瘤的患者的方法。本发明提供的方法可用于治疗与治疗对象中升高的腺苷水平相关和/或易感于腺苷或脱氧腺苷水平降低的疾病和状况。例如，这种疾病或状况包括肿瘤或癌症。腺苷相关生物标记的水平如血浆腺苷水平、腺苷受体(ADR)水平和外核苷酸酶水平可用于诊断或预后腺苷相关疾病或状况，预测患有腺苷相关疾病或状况的对象对于本发明提供的任何ADA2或组合治疗的反应性，和/或监测或预测患有用本发明提供的ADA2包括其野生型、变体和修饰形式治疗的腺苷相关疾病或状况的对象的治疗效力。
在本发明提供的任何实例中，腺苷相关疾病或状况是其中腺苷水平升高的疾病或状况，所述腺苷水平升高是所述疾病或状况观测的原因、结果或者其他。举例的腺苷相关疾病或状况包括但不限于癌症、肿瘤、炎症性疾病、感染，及与治疗对象中升高的腺苷水平相关和/或易感于腺苷或脱氧腺苷水平降低的其它疾病或状况。特别地，腺苷相关疾病和状况包括但不限于在胞外环境中具有升高的腺苷水平的癌症，例如肿瘤，包括缺氧性实体瘤。本发明提供了治疗方法，包括测量腺苷相关生物标记及选择对象使用本发明提供的任何ADA2进行治疗。
i.血浆腺苷水平
在一个实例中，可以基于样品如血浆中胞外腺苷的水平或表达选择患者或对象使用本发明提供的任何ADA2进行治疗。在其它实例中，可以使用特定肿瘤的肿瘤微环境中胞外腺苷的水平。血浆腺苷水平可以使用本领域已知的任何方法测量，包括基于层析的方法。本领域技术人员可以使用本领域已知的测定法评定、量化、确定和/或检测血浆样品中的腺苷水平。测定包括体外或体内测定。可用于评定、评估、确定、量化和/或另外特异性检测样品中腺苷水平的举例的测定包括但不限于基于高效液相层析(HPLC)的测定(见例如Jackson and Ohnishi(1987)Hypertension 10:189-197)、分光光度法、放射性酶学测定(见例如German and Kredich(1984)Anal Biochem.142(2):536-541)、基于微电极的检测及体内成像方法，如基于生物发光的方法。在一些实例中，血浆腺苷水平可以使用修改的HPLC方法检测，其利用将腺苷转变为荧光衍生物如1,N6-乙醇腺苷的反应以检测腺苷水平(Howard et al.(1998)Investigative Opthalmology&Visual Science,39(10):1942-1946)。
ii.腺苷受体(ADR)
腺苷受体(ADR)的表达水平可用作生物标记来选择用本发明提供的任何ADA2治疗的患者或对象。特别地，可以使用在参与肿瘤免疫性的肿瘤细胞和/或免疫细胞中表达的ADR，如A2A(SEQ ID NO:534所示氨基酸序列)和A2B(SEQ ID NO:535所示氨基酸序列)腺苷受体。表达升高或高水平ADR如A2A和A2B腺苷受体的肿瘤对于使用ADA2治疗更具应答性，因为对于腺苷和肿瘤生长的作用可以通过腺苷结合在肿瘤细胞上表达的ADR而介导。一些肿瘤具有升高的ADR、特别是A2A和A2B表达，这些受体的表达具有下游癌症促进作用。在其它实例中，通过刺激A2A和A2B受体的腺苷信号传导调节内皮炎症过程和肿瘤血管发生。在其它实例中，ADR如A2A和A2B腺苷受体的表达对于免疫细胞如巨噬细胞和树突细胞的激活和分化具有抑制作用。因此，测量ADR如A2A和A2B腺苷受体可用于选择与升高的腺苷水平相关和/或易感于腺苷或脱氧腺苷水平降低的肿瘤，包括癌症。ADR如A2A和A2B腺苷受体的水平可用于选择或鉴别预测对于治疗有应答性的患者和/或监测治疗和治疗效力，从而提供对于腺苷相关疾病或状况如肿瘤或癌症的改良的治疗方案。
例如，可以基于样品如来自具有肿瘤或者怀疑具有肿瘤的对象的肿瘤或体液样品中A2A和A2B腺苷受体的水平或表达，选择使用本发明提供的任何ADA2进行治疗的患者或对象。ADR如A2A和A2B腺苷受体的表达水平可以使用本领域已知的确定细胞上胞外受体水平的任何方法测量。本领域技术人员可以使用本领域已知的测定法评定、量化、确定和/或检测样品中ADR如A2A和A2B腺苷受体的水平。测定包括体外或体内测定。可用于评定、评估、确定、量化和/或另外特异性检测样品中ADR如A2A和A2B腺苷受体水平的举例的测定包括但不限于固相结合测定(例如酶联免疫吸附测定(ELISA))、放射免疫测定(RIA)、免疫放射测定、荧光测定、化学发光测定、生物发光测定、western印迹及组织化学方法，如免疫组织化学(IHC)或者使用非抗体结合剂的假免疫组织化学。在固相结合测定方法如ELISA方法中，例如，所述测定可以是夹心形式或者竞争性抑制形式。在其它实例中，可以使用体内成像方法。
本发明提供的方法使用抗ADR如A2A和A2B腺苷受体的抗体测量样品中ADR蛋白质水平，如A2A和A2B腺苷受体水平，所述样品如来自患有肿瘤或者怀疑患有肿瘤的对象的肿瘤或体液样品。举例的抗腺苷受体A2A的抗体包括来自Santa Cruz Biotechnology(Dallas,TX；Cat no.sc-70321)、Abcam(Cambridge,UK；Cat no.ab3461)和EMD Milipore(Billerica,MA；Cat no.AB1559P)的那些抗体。举例的抗腺苷受体A2B的抗体包括来自Santa Cruz Biotechnology(Dallas,TX；Cat no.sc-7505)、Abcam(Cambridge,UK；Catno.ab40002)和EMD Milipore(Billerica,MA；Cat no.AB1589P)的那些抗体。所述抗体可用于检测样品中ADR蛋白水平，使用如免疫组织化学、ELISA、RIA、免疫放射测定、荧光测定、化学发光测定、生物发光测定和western印迹等方法进行。所述抗体可以通过与生物素、荧光部分、放射性标记或者其它可检测标记直接或者间接缀合而修饰。在其它实例中，可以使用与可检测标记缀合的二抗。
ADR水平、如A2A和A2B腺苷受体水平也可以使用体内成像方法确定。例如，正电子发射X线断层摄影术(PET)，给予具有A2A受体拮抗活性的黄嘌呤衍生物，用正电子发射体碳-11(11C)如11C-SCH442416、11C-KF1783、11C-KF18446、11C-KF19631、11C-CSC、11C-KW-6002和11C-TMSX放射标记(Grachev et al.(2014)Journal of Diagnostic Imaging inTherapy 1(1):1-19)。
确定ADR水平如A2A和A2B腺苷受体水平的其它方法包括基于核酸的方法，如逆转录酶-聚合酶链反应(RT-PCR)、微阵列、定量PCR、高通量转录组测序及其它这种方法。
iii.外核苷酸酶CD39和CD73
在肿瘤细胞中表达的外核苷酸酶CD39和CD73的表达水平可用作生物标记以选择使用本发明提供的任何ADA2治疗的患者或对象。CD39和CD73是外核苷酸酶，从三磷酸腺苷(ATP)产生胞外腺苷。CD39(外核苷三磷酸二磷酸水解酶1；EC 3.6.1.5；氨基酸序列如SEQID NO:542所示)代谢胞外ATP产生二磷酸腺苷(ADP)和一磷酸腺苷(AMP)，CD73(外-5'-核苷酸酶；EC 3.1.3.5；氨基酸序列如SEQ ID NO:543所示)代谢AMP产生腺苷。CD39和CD73在与快速升高的腺苷水平相关的状况如缺氧、缺血、炎症、肿瘤环境或者创伤期间是胞外腺苷的主要来源。在这些状况中，胞外ATP增加，通过CD39和CD73外核苷酸酶的作用导致随后腺苷水平增加。在某些癌症类型中，CD39和CD73的水平是过表达的，升高的CD73水平与不良预后和高度早期肿瘤复发相关。因此，外核苷酸酶CD39和CD73的表达水平可用作与升高的腺苷水平相关的肿瘤的生物标记及用于选择使用本发明提供的任何ADA2治疗的患者。
例如，可以基于样品如来自患有肿瘤或者怀疑患有肿瘤的对象的肿瘤或体液样品或者免疫细胞中CD39和CD73外核苷酸酶的表达水平，选择使用本发明提供的任何ADA2治疗的患者或对象。CD39和CD73外核苷酸酶的表达水平可以使用本领域已知的确定血浆膜或胞外蛋白水平的任何方法测量。本领域技术人员可以使用本领域已知的测定以评定、量化、确定和/或检测样品中CD39和CD73外核苷酸酶的表达水平。测定包括体外或体内测定。可以用于评定、评估、确定、量化和/或另外特异性检测样品中CD39和CD73外核苷酸酶表达水平的举例的测定包括但不限于固相结合测定(例如酶联免疫吸附测定(ELISA))、放射免疫测定(RIA)、免疫放射测定、荧光测定、化学发光测定、生物发光测定、western印迹及组织化学方法如免疫组织化学(IHC)或者使用非抗体结合剂的假免疫组织化学。在固相结合测定方法如ELISA方法中，测定可以是夹心形式或者竞争性抑制形式。在其它实例中，可以使用体内成像方法。
本发明提供的方法使用抗CD39和CD73外核苷酸酶的抗体测量样品如来自患有肿瘤或者怀疑患有肿瘤的对象的肿瘤或体液样品中的CD39和CD73外核苷酸酶。举例的抗CD39的抗体包括来自Santa Cruz Biotechnology(Dallas,TX；Cat no.sc-65262)、Abcam(Cambridge,UK；Cat no.ab49580)和EMD Milipore(Billerica,MA；Cat no.04-973)的那些抗体。举例的抗CD73抗体包括来自Santa Cruz Biotechnology(Dallas,TX；Cat no.sc-8502)、Abcam(Cambridge,UK；Cat no.ab4056)和EMD Milipore(Billerica,MA；Catno.IHCR2023-6)的那些抗体。所述抗体可用于检测样品中ADR水平，使用如免疫组织化学、ELISA、RIA、免疫放射测定、荧光测定、化学发光测定、生物发光测定和western印迹等方法进行。抗体可以通过与生物素、荧光部分、放射标记或者其它可检测标记直接或间接缀合而修饰。在其它实例中，可以使用与可检测标记缀合的二抗。
确定CD39和CD73外核苷酸酶水平的其它方法包括基于核酸的方法，如逆转录酶-聚合酶链反应(RT-PCR)、微阵列、定量PCR、高通量转录组测序及其它这种方法。
b.患者选择
一旦确定了生物标记的量，如血浆腺苷水平、ADR如A2A或A2B的水平或者CD39和CD73外核苷酸酶的水平，所述量可以与对照水平或阈值水平比较。对照水平或者阈值水平通常是预定的阈值水平或者量，其是与升高的腺苷水平相关疾病或状况(如肿瘤或癌症)的指征。这个水平或量可以由本领域技术人员根据经验确定。应理解针对本发明方法的特别预定的选择或分类标准依赖于用于检测腺苷相关生物标记水平的特定测定及检测的特定样品。本领域技术人员可以确定某测定法与检测特定样品是否相容。基于体外固相测定或者高效液相层析(HPLC)的测定可用于检测体液样品。如组织化学测定或免疫组织化学测定可用于检测组织样品。也应理解在包括与预定水平或量对比或者与对照或参考样品对比的方法中，所述参考是使用相同类型样品及使用相同测定和试剂(包括相同的可检测部分和检测方法)制备的。
例如，预定的阈值水平可以基于在参考或对照样品中所述标记的水平或量确定，如在一群对象中所述标记的中位数或平均水平或量，以评定水平或表达中的差异。在一个实例中，预定的阈值水平可表示来自健康对象或者已知具有与升高的腺苷水平相关状况或疾病(例如肿瘤或癌症)的对象的样品中腺苷相关生物标记的平均或中位数水平或量。在一个实施方案中，来自正常组织或体液样品的腺苷相关生物标记的预定水平或量是在正常样品(例如分析的所有正常样品)中观测到的平均水平或量。在另一个实施方案中，来自正常组织或体液样品的腺苷相关生物标记的水平或量是在正常样品中观测的水平或量的中位数值。预定的阈值水平也可以基于在细胞系或其它对照样品(例如肿瘤细胞系)中腺苷相关生物标记的水平或量。如本文所述，这些预定值可以通过对比或了解通过相同检测测定法和使用相同试剂例如相同抗体和检测方法确定的相应正常样品中腺苷相关生物标记水平而确定。
参考或对照样品可以是另一组织、细胞或体液，如正常组织、细胞或体液，例如与检测样品类似的但分离自不同对象的组织、细胞或体液。对照或参考对象可以是正常(即不具有疾病或状况)的一个对象或者一群对象，患有疾病但是不具有检测对象患有或怀疑患有的疾病或状况类型的对象，例如不具有与升高的腺苷水平相关的状况或疾病(例如肿瘤或癌症)的对象，或者来自具有相似疾病或状况、但是其疾病不严重和/或表达相对较低的腺苷相关生物标记的另一对象的类似组织。例如，当检测的细胞、组织或体液是具有癌症的一个对象或者一群对象时，可以将所述标记的水平或量与来自具有不太严重的癌症如早期、分化的或者其它类型的癌症的对象的组织、细胞或体液中所述标记的水平或量进行对比。在另一实例中，对照或参考样品是具有已知量或相对量的腺苷相关生物标记的体液、组织、提取物(例如细胞或核提取物)、核酸或肽制备物、细胞系、活检组织、标准或其它样品，例如肿瘤细胞系或来自使用这种细胞产生的肿瘤模型的肿瘤等样品。
在本发明的任何方法中，可以确定来自怀疑或已知具有与升高的腺苷水平相关的疾病或状况(例如癌症)的对象的样品中腺苷相关生物标记的水平，同时确定参考或正常组织中腺苷相关生物标记的水平。或者，来自怀疑或已知具有与升高的腺苷水平相关的疾病或状况(例如癌症)的对象的样品中腺苷相关生物标记的水平可以与在正常组织或体液中预先确定的腺苷相关生物标记的水平相比较。因此，用于任何检测、对比、确定或者评估中的正常或健康样品或者其它参考样品中的腺苷相关生物标记水平可以是在任何检测、确定或者评估人患者样品中腺苷相关生物标记的水平或量之前确定的水平或量。
确定腺苷相关生物标记的水平或量和/或评分并与疾病相关的腺苷相关生物标记的预定表型对比。本领域技术人员根据特定疾病、用于检测腺苷相关生物标记的测定和/或使用的检测试剂可以确定疾病诊断的阈值水平。本领域技术人员可以确定腺苷相关生物标记的阈值水平以划分对使用本发明提供的任何ADA2的治疗的反应性。本发明提供了举例的层化肿瘤样品或体液样品以诊断、预后或者选择治疗对象的方法。
应理解特定改变如腺苷相关生物标记的增加或降低依赖于使用的测定。在ELISA中，在特定波长的吸光度或者蛋白质数量的增加或降低倍数(例如通过使用标准曲线确定)可以相对于对照表示。在PCR测定中，如RT-PCR，表达水平可以使用本领域已知的方法与对照表达水平如使用标准物(例如以改变倍数表示)对比。
在本发明方法的特定实例中，如果确定样品中腺苷相关生物标记的量升高，则选择该对象作为使用本发明提供的任何ADA2治疗的候选者。例如，与健康或者正常对象相比，在患病对象中升高或积累的腺苷相关生物标记水平表示与升高的腺苷水平相关的状况或疾病(例如肿瘤或癌症)。腺苷相关生物标记可以升高0.5倍、1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、150倍、200倍、500倍、1000倍或更高。因此，在本发明方法的实例中，当检测对象样品中腺苷相关生物标记的量时，所述标记的检测可以确定来自对象的样品(例如癌细胞、组织或体液)中腺苷相关生物标记的量与预定水平或量或者对照样品相比是升高的。在一个实例中，如果在组织、细胞或者体液中的腺苷相关生物标记的量与预定水平或量或者对照样品相比升高或升高大约0.5倍、1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、150倍、200倍、500倍、1000倍或更高，则确定该对象患有与升高的腺苷水平相关的状况或疾病。
基于来自对象的样品(例如血浆)中腺苷水平或量，可以选择对象作为使用本发明提供的任何ADA2、包括其野生型、变体和修饰形式治疗的候选者。例如，血浆腺苷水平高于0.1mM、如0.1mM、0.2mM、0.3mM、0.4mM、0.5mM、0.6mM、0.7mM、0.8mM、0.9mM、1mM、2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10Mm或更高，与肿瘤或癌症的存在相关。使用这种方法，在本发明提供的示例方法中，如果体液样品如血浆样品中腺苷水平高于0.1mM、如0.1mM、0.2mM、0.3mM、0.4mM、0.5mM、0.6mM、0.7mM、0.8mM、0.9mM、1mM、2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10Mm或更高，则可以选择对象使用本发明提供的任何ADA2治疗。
基于细胞或组织样品中腺苷相关生物标记如ADR、如A2A(SEQ ID NO:534)和A2B(SEQ ID NO:535)腺苷受体或者CD39(SEQ ID NO:542)和CD73(SEQ ID NO:543)外核苷酸酶的水平或量，可以选择对象作为使用本发明提供的任何ADA2治疗的候选者。在这种实例中，如果所述水平表示疾病，则诊断患者患有与升高的腺苷水平相关的状况或疾病。例如，高百分比染色表示对象具有与升高的腺苷相关生物标记如ADR如A2A和A2B腺苷受体或者CD39和CD73外核苷酸酶相关的肿瘤，表示存在将得益于本发明提供的任何ADA2治疗的肿瘤，及因此是使用本发明提供的任何ADA2治疗的候选者。在其它实例中，基于染色百分比，例如如果腺苷相关生物标记染色程度是总染色区域的10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更高，通常为至少25％或更多，可以选择对象使用本发明提供的任何ADA2治疗。使用组织化学方法，量化检测的腺苷相关生物标记的量并给出腺苷相关生物标记阳性像素(positive pixels)的百分比和/或得分。例如，在样品中检测的腺苷相关生物标记的量可以量化为腺苷相关生物标记阳性像素的百分比。在一些实例中，样品中存在的腺苷相关生物标记的量量化为染色区域的百分比，例如腺苷相关生物标记阳性像素的百分比。例如，与总染色区域相比，样品可具有至少或者至少大约或大约0、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多的腺苷相关生物标记阳性像素。
使用本发明的任何ADA2的治疗效力或者治疗应答性也可以通过对比对象随着时间的腺苷相关生物标记的水平或量而监测。腺苷相关生物标记的水平或量的改变可用于优化使用本发明提供的任何ADA2治疗的给药或时序安排。在所述方法中，将来自治疗对象的样品中腺苷相关生物标记的水平与腺苷相关生物标记的预定水平对比。
对于监测治疗的目的，腺苷相关生物标记的预定水平可以来自正常或健康对象，在治疗之前的基线腺苷相关生物标记值，在同一对象中在治疗之后较早时间先前测量的腺苷相关生物标记水平，或者已知与疾病进展或者退行相关的腺苷相关生物标记水平的类别或层化。例如，如果腺苷相关生物标记水平与参考或对照样品大约相同或较低(或者降低)，则表示治疗有效及治疗可以继续或者停止或者改变。例如，腺苷相关生物标记的预定水平可以是来自正常或健康组织样品的腺苷相关生物标记水平，如果在治疗后对象中测量的腺苷相关生物标记的水平高于正常腺苷相关生物标记水平，则治疗重新开始或继续。例如，腺苷相关生物标记的预定水平可以是在治疗之前从基线腺苷相关生物标记值确定的腺苷相关生物标记水平，及因此确定治疗进程。例如，如果腺苷相关生物标记水平与基线水平相同，则治疗继续或重新开始；如果腺苷相关生物标记水平高于基线水平，则治疗继续或重新开始或者治疗加速或增加(例如通过增加ADA2剂量或者增加一个给药方案周期中的给药方案)；如果腺苷相关生物标记水平低于基线水平，则治疗继续或者重新开始、终止或者减少或降低(例如通过降低ADA2剂量或者减少一个给药方案周期中的给药方案)。在进一步的实例中，腺苷相关生物标记的预定水平可以是在同一对象的早期治疗过程中在先前测量中确定的腺苷相关生物标记水平。例如，如果腺苷相关生物标记的水平与先前测量的水平相同，则治疗继续或者重新开始；如果腺苷相关生物标记的水平高于先前测量水平，则治疗继续或者重新开始或者治疗加速或增强(例如通过增加ADA2的剂量或者增加一个给药方案周期中的给药方案)；如果腺苷相关生物标记的水平低于先前测量的水平，则治疗继续或者重新开始、终止或者减少或降低(例如通过降低ADA2的剂量或者降低在一个给药方案周期中的给药方案)。
在监测方法或确定治疗效力的方法中，在治疗进程期间可以改变特定的治疗以使得个体应答最大化。治疗的给药和时序安排可以改变以应答改变的水平。使用其它治疗剂如其它抗癌剂的组合治疗也可以用于这种治疗方法中。本领域的治疗医生可以确定准确的治疗进程。例如，可以改变治疗，由此相应调整给药量、时间(例如给予频率)或者方案，如停止、减低或者减少频率，或者组合对于该疾病或状况的另一治疗。另一方面，如果腺苷相关生物标记水平高于对比的参考或对照样品，表示患者对于该治疗无应答。在这种情况中，可以修改或者改变治疗剂如ADA2或者组合治疗的特定性质和类型。在其它情况中，可以相应调整给药、量、时间和/或方案，如增加或更频繁。治疗医生可以确定准确的治疗进程。
为了监测治疗效力，腺苷相关生物标记的预定水平或量可以根据经验确定，从而所述水平或量表示治疗有效。这些预定值可以通过对比或了解通过相同检测测定及使用相同试剂确定的相应正常样品或患病对象样品中腺苷相关生物标记水平而确定。例如，使用定量评分方案通过免疫组织化学方法评定的高水平的腺苷相关生物标记或者腺苷相关生物标记的肿瘤染色百分比高于25％，与存在一系列癌症类型的恶性疾病相关联，表示患者对于治疗不应答。
在本发明的方法中，与预定水平或者对照或参考样品的水平的对比可以通过本领域技术人员已知的任何方法确定。例如，腺苷相关生物标记的水平与参考、对照或预定水平的对比可以通过自动系统如软件程序或智能系统完成，所述软件和智能系统是进行所述测定的设备(例如计算机平台)的一部分或者与其相容。或者，这种对比可以由医生或者经训练或熟练的专业人士或者技师完成。
3.剂量与给予
本发明提供的任何ADA2包括其野生型、变体和修饰形式可以配制为用于单一剂量或者多剂量给予的药物组合物。ADA2多肽以在对于治疗患者不存在不希望的副作用的条件下足以发挥治疗有效作用的量包含于组合物中。治疗有效浓度可以通过在已知的体外和体内系统如使用本发明提供的或本领域已知的测定中检测多肽而根据经验确定(见例如Taliani et al.(1996)Anal.Biochem.,240:60-67；Filocamo et al.(1997)J Virology,71:1417-1427；Sudo et al.(1996)Antiviral Res.32:9-18；Bouffard et al.(1995)Virology,209:52-59；Bianchi et al.(1996)Anal.Biochem.,237:239-244；Hamatake etal.(1996)Intervirology 39:249-258；Steinkuhler et al.(1998)Biochem.,37:8899-8905；D’Souza et al.(1995)J Gen.Virol.,76:1729-1736；Takeshita et al.(1997)Anal.Biochem.,247:242-246；也见例如Shimizu et al.(1994)J.Virol.68:8406-8408；Mizutani et al.(1996)J.Virol.70:7219-7223；Mizutani et al.(1996)Biochem.Biophys.Res.Commun.,227:822-826；Lu et al.(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.,93:1412-1417；Hahm et al.,(1996)Virology,226:318-326；Ito et al.(1996)J.Gen.Virol.,77:1043-1054；Mizutani et al.(1995)Biochem.Biophys.Res.Commun.,212:906-911；Cho et al.(1997)J.Virol.Meth.65:201-207)，然后从中推断用于人的剂量。
治疗疾病或状况的本发明提供的任何ADA2的给予量可以通过标准临床技术确定。此外，体外测定和动物模型可用于帮助鉴别最佳剂量范围。可以根据经验确定的精确剂量可依赖于特定物质、给予途径、治疗的疾病类型以及疾病的严重度。在一些实施方案中，给予的组合物可含有编码本发明提供的变体ADA2多肽的核酸，如溶瘤细胞病毒载体或者基因治疗载体，或者细胞，如用于过继免疫治疗的修饰的免疫细胞。特定剂量可以依赖于特定的给予途径、特定疾病或状况、疾病或状况的严重性、特定配制物及本领域技术人员已知的其它因素。
因此，应理解精确剂量和治疗持续时间与治疗的疾病相关，可以使用已知的检测方案根据经验而定或者通过从体内或体外检测数据推断。应注意所述浓度和剂量值也可以随着状况的严重性减轻而变化。应进一步了解的是对于任何特定对象，应根据个体需要和给予或监管所述组合物施用的专业人士的专业判断随时调整具体的给药方案，本文示出的浓度范围只是举例说明，无限制所述组合物及包含其的组合的范围或应用之意。所述组合物可以每小时、每天、每周、每月、每年给予或者只给予一次。通常，选择给药方案以限制毒性。应注意主治医生已知由于毒性或者骨髓、肝或肾或者其它组织功能障碍而怎样及何时终止、中断或者调整治疗以降低剂量。相反，主治医生也已知如果临床应答不足(除外毒性副作用)而怎样及何时调整治疗至更高水平。
本领域技术人员可以在临床应用中根据个体对象如人或动物的肿瘤的临床应答和副作用模式确定给予本发明提供的ADA2的个体剂量。例如，本发明提供的聚乙二醇化ADA2的组合物可以配制为25U/mL。如果为25g小鼠注射0.2mL这种配制物，这将转换为200U/kg体重。本领域技术人员基于人体表面积可以确定对人的人等价剂量(HED)为大约16U/kg体重。适当的HED可以使用体表面积或者基于体重转换而计算(Reagan-Shaw et al.(2008)The FASEB Journal 22(3):659-661)。
本发明提供的任何ADA2的剂量范围可以是从或从大约10mU/kg体重至大约50U/kg体重或更高。例如，单一剂量可以是10mU/kg体重、10mU/kg、20mU/kg、30mU/kg、40mU/kg、50mU/kg、60mU/kg、70mU/kg、80mU/kg、90mU/kg、100mU/kg、200mU/kg、300mU/kg、400mU/kg、500mU/kg、600mU/kg、700mU/kg、800mU/kg、900mU/kg、1U/kg、2U/kg、3U/kg、4U/kg、5U/kg、6U/kg、7U/kg、8U/kg、9U/kg、10U/kg、20U/kg、30U/kg、40U/kg或者50U/kg体重。在其它实例中，单一剂量可以是或是大约10mU/kg体重至50U/kg体重，10mU/kg-40U/kg、10mU/kg-30U/kg、10mU/kg-20U/kg、10mU/kg-10U/kg、10mU/kg-9U/kg、10mU/kg-8U/kg、10mU/kg-7U/kg、10mU/kg-6U/kg、10mU/kg-5U/kg、10mU/kg-4U/kg、10mU/kg-3U/kg、10mU/kg-2U/kg、10mU/kg-1U/kg、10mU/kg-900mU/kg、10mU/kg-800mU/kg、10mU/kg-700mU/kg、10mU/kg-600mU/kg、10mU/kg-500mU/kg、10mU/kg-400mU/kg、10mU/kg-300mU/kg、10mU/kg-200mU/kg、10mU/kg-100mU/kg、100mU/kg-50U/kg、100mU/kg-40U/kg、100mU/kg-30U/kg、100mU/kg-20U/kg、100mU/kg-10U/kg、100mU/kg-9U/kg、100mU/kg-8U/kg、100mU/kg-7U/kg、100mU/kg-6U/kg、100mU/kg-5U/kg、100mU/kg-4U/kg、100mU/kg-3U/kg、100mU/kg-2U/kg、100mU/kg-1U/kg、100mU/kg-900mU/kg、100mU/kg-800mU/kg、100mU/kg-700mU/kg、100mU/kg-600mU/kg、100mU/kg-500mU/kg、100mU/kg-400mU/kg、100mU/kg-300mU/kg、100mU/kg-200mU/kg、500mU/kg-50U/kg、500mU/kg-40U/kg、500mU/kg-30U/kg、500mU/kg-20U/kg、500mU/kg-10U/kg、500mU/kg-9U/kg、500mU/kg-8U/kg、500mU/kg-7U/kg、500mU/kg-6U/kg、500mU/kg-5U/kg、500mU/kg-4U/kg、500mU/kg-3U/kg、500mU/kg-2U/kg、500mU/kg-1U/kg、500mU/kg-900mU/kg、500mU/kg-800mU/kg、500mU/kg-700mU/kg、500mU/kg-600mU/kg、1U/kg-50U/kg、1U/kg-40U/kg、1U/kg-30U/kg、1U/kg-20U/kg、1U/kg-10U/kg、1U/kg-9U/kg、1U/kg-8U/kg、1U/kg-7U/kg、1U/kg-6U/kg、1U/kg-5U/kg、1U/kg-4U/kg、1U/kg-3U/kg、1U/kg-2U/kg、5U/kg-50U/kg、5U/kg-40U/kg、5U/kg-30U/kg、5U/kg-20U/kg、5U/kg-10U/kg、5U/kg-9U/kg、5U/kg-8U/kg、5U/kg-7U/kg、5U/kg-6U/kg、10U/kg-50U/kg、10U/kg-40U/kg、10U/kg-30U/kg及10U/kg体重至20U/kg体重。
在另一实例中，本发明提供的任何ADA2的剂量范围可以在或大约在0.1mg/kg体重-50mg/kg体重、0.1mg/kg-40mg/kg、0.1mg/kg-30mg/kg、0.1mg/kg-20mg/kg、0.1mg/kg-10mg/kg、0.1mg/kg-9mg/kg、0.1mg/kg-8mg/kg、0.1mg/kg-7mg/kg、0.1mg/kg-6mg/kg、0.1mg/kg-5mg/kg、0.1mg/kg-4mg/kg、0.1mg/kg-3mg/kg、0.1mg/kg-2mg/kg、0.1mg/kg-1mg/kg、0.1mg/kg-0.9mg/kg、0.1mg/kg-0.8mg/kg、0.1mg/kg-0.7mg/kg、0.1mg/kg-0.6mg/kg、0.1mg/kg-0.5mg/kg、0.1mg/kg-0.4mg/kg、0.1mg/kg-0.3mg/kg、0.1mg/kg-0.2mg/kg、0.5mg/kg-50mg/kg、0.5mg/kg-40mg/kg、0.5mg/kg-30mg/kg、0.5mg/kg-20mg/kg、0.5mg/kg-10mg/kg、0.5mg/kg-9mg/kg、0.5mg/kg-8mg/kg、0.5mg/kg-7mg/kg、0.5mg/kg-6mg/kg、0.5mg/kg-5mg/kg、0.5mg/kg-4mg/kg、0.5mg/kg-3mg/kg、0.5mg/kg-2mg/kg、0.5mg/kg-1mg/kg、0.5mg/kg-0.9mg/kg、0.5mg/kg-0.8mg/kg、0.5mg/kg-0.7mg/kg、0.5mg/kg-0.6mg/kg、1mg/kg-50mg/kg、1mg/kg-40mg/kg、1mg/kg-30mg/kg、1mg/kg-20mg/kg、1mg/kg-10mg/kg、1mg/kg-9mg/kg、1mg/kg-8mg/kg、1mg/kg-7mg/kg、1mg/kg-6mg/kg、1mg/kg-5mg/kg、1mg/kg-4mg/kg、1mg/kg-3mg/kg、1mg/kg-2mg/kg、2mg/kg-50mg/kg、2mg/kg-40mg/kg、2mg/kg-30mg/kg、2mg/kg-20mg/kg、2mg/kg-10mg/kg、2mg/kg-9mg/kg、2mg/kg-8mg/kg、2mg/kg-7mg/kg、2mg/kg-6mg/kg、2mg/kg-5mg/kg、2mg/kg-4mg/kg、2mg/kg-3mg/kg、5mg/kg-50mg/kg、5mg/kg-40mg/kg、5mg/kg-30mg/kg、5mg/kg-20mg/kg、5mg/kg-10mg/kg、5mg/kg-9mg/kg、5mg/kg-8mg/kg、5mg/kg-7mg/kg、5mg/kg-6mg/kg、10mg/kg-50mg/kg、10mg/kg-40mg/kg、10mg/kg-30mg/kg、10mg/kg-20mg/kg、20mg/kg-50mg/kg、20mg/kg-40mg/kg、20mg/kg-30mg/kg、30mg/kg-50mg/kg、30mg/kg-40mg/kg、40mg/kg体重至50mg/kg体重。所述剂量可以一次或多次给予。适当的剂量可以由本领域技术人员基于给予方案而确定。本领域技术人员也可以选择在指定时期的总剂量。
给予包含本发明提供的任何ADA2包括其野生型、变体和修饰形式的组合物的最佳剂量范围可以通过血浆监测而调整。给予剂量可以是使得对象保持血浆ADA活性在大约10-1,000mM/hr水平，表明红细胞腺苷降低，即在红细胞亚积中dATP低于或等于大约0.001-大约0.057mM，例如大约0.005-大约0.015mM，或者低于或等于在预先给予样品中测量的正常腺苷水平的大约1％总红细胞腺苷(即ATP+dATP含量)。dATP的正常值低于大约0.001mM。
因此，本发明提供的方法包括给予对象有效量的ADA2的一种治疗肿瘤的方法。有效量易于由本领域技术人员确定以降低对象中腺苷或脱氧腺苷的组织水平，及其中肿瘤的生长或传播通过对象中腺苷的组织水平明显降低而抑制。本发明还提供了评定对象中腺苷相关生物标记水平的方法，以选择使用本发明提供的任何ADA2治疗的对象。剂量或者治疗方案基于患者对治疗的易感性而可以变化或调整，这由本领域技术人员使用本发明提供的方法确定。
当本发明提供的ADA2与另一治疗剂如免疫检查点抑制剂、透明质酸降解酶或者抗肿瘤剂共同配制或者共同给予时，剂量可以ADA2多肽的量与给予的其它治疗剂的量的比率提供。例如，ADA2多肽可以1U ADA:1U其它治疗剂(1:1)至50:1或更高的比率给予，例如是或是大约1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、20:1、25:1、30:1、35:1、40:1、45:1、50:1或更高。在其它实例中，ADA2多肽可以1U ADA:1U其它治疗剂(1:1)至1:50或更低的比率给予，例如是或是大约1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45、1:50或更低。
4.组合治疗
在本发明提供的方法中，本发明提供的ADA2包括其野生型、变体和修饰形式可以在一或多种其它治疗方案或治疗剂之前、之后或者同时给予。熟练的医学从业人员可以根据经验或者考虑到药代动力学及所述物质的作用模式，确定每种治疗方案或治疗剂的适当剂量以及适当的给予时间和方法。另外的治疗方案或治疗剂可以改良本发明提供的ADA2的效力或安全性。在一些实例中，另外的治疗方案或治疗剂可以治疗相同疾病或者同患多病，而不是改变本发明提供的ADA2的作用。在一些实例中，另外的治疗方案或治疗剂可以减轻、降低或者消除与给予本发明提供的任何ADA2相关的一或多种副作用。
例如，本发明描述的ADA2可以与化疗、放疗或者化疗与放疗二者一起给予。本发明提供的任何ADA2包括其野生型、变体和修饰形式可以组合一或多种功能其它预防性或者治疗性物质给予，包括但不限于抗体、细胞毒性剂、化疗剂、细胞因子、生长抑制剂、抗激素剂、激酶抑制剂、抗血管发生剂、心脏保护剂、免疫刺激剂、免疫抑制剂、免疫检查点抑制剂、抗生素、血管发生抑制剂，或者其它治疗剂。与使用本发明提供的ADA2的治疗组合使用的其它治疗剂可以是例如蛋白质、肽、核酸、小分子物质、毒素、脂质、碳水化合物或其组合，或者任何其它类型的治疗剂。在其它实例中，另外的治疗方案可以是放疗。
一或多种另外的物质可以与本发明提供的任何ADA2同时、相继或者间断给予。所述物质可以与ADA2共同给予，例如作为同一药物组合物或者同一输送方法的一部分。在一些实例中，所述物质可以与本发明提供的ADA2在同一时间但是通过不同输送方式共同给予。所述物质也可以在与给予ADA2的不同时间但是与给予ADA2的时间足够接近的时间给予，以具有组合的预防或治疗作用。在一些实例中，一或多种另外的物质在给予本发明的ADA2之后或者之前给予，相隔选择的时间间隔。在一些实例中，所述时间是1天、2天、3天、4天、5天、6天、1周、2周、3周、1个月、2个月或者3个月。在一些实例中，一或多种另外的物质多次给予和/或本发明提供的ADA2多次给予。在其它实例中，本发明提供的ADA2变体与是蛋白质的一或多种另外的物质可以在一或多个表达载体中编码以在体内表达，特别是在靶向肿瘤的或者溶瘤细胞载体中编码以在肿瘤细胞中表达。在再其它的实例中，本发明提供的ADA2变体及是蛋白质的一或多种另外的物质可以在修饰的免疫细胞中表达，修饰的免疫细胞可以给予用于过继免疫治疗，其可以靶向并输送ADA2及另外的物质至特定肿瘤细胞。
a.抗癌剂
使用本发明提供的ADA2的治疗方法可以与本领域已知的一或多种抗癌剂组合给予。本发明的组合治疗包括同时或相继给予ADA2及有效量的本文描述或本领域已知的抗癌剂。所述抗癌剂可以是例如化疗剂、抗体、肽或者基因治疗载体、病毒或者DNA，或者这些的组合。
举例的用于组合治疗的抗癌剂包括例如TaxolTM、贝伐单抗长春新碱、长春碱、新霉素、考布他汀、足叶草毒素、TNF-α、血管生成抑制因子、内皮他丁、血管抑制素(vasculostatin)、αv-β3拮抗剂、钙离子载体、钙运转诱导剂，及其任何衍生物或者前体药物。用于组合治疗的抗癌剂也包括化疗剂、放疗剂、细胞因子、抗血管发生剂、凋亡诱导剂或者抗癌免疫毒素或凝血配体(coaguligand)，例如(西妥昔单抗)。举例的化疗剂包括但不限于5-氮杂胞苷、5-氟尿嘧啶，任选组合甲酰四氢叶酸、5-氟脱氧尿苷、6-巯基嘌呤、6-硫代鸟嘌呤、米托蒽醌、氮丙啶基苯醌(AZQ)、卡莫司汀(BCNU或BCNU；Bristol-Myers Squibb)、博莱霉素、卡铂(CBDCA)、洛莫司汀(CCNU)、甲基-CCNU或MeCCNU、苯丁酸氮芥、2-氯脱氧腺苷、顺铂、环磷酰胺、阿糖胞苷、放线菌素D、柔红霉素、脱氧柯福霉素(deoxycoformycin)、多柔比星、脱氧柯福霉素(doxycoformycin)、DTIC(达卡巴嗪)、表柔比星、依托泊苷(VP-16)、氟达拉滨、六甲嘧啶、羟基脲、伊达比星、异环磷酰胺、异环磷酰胺和美司钠、左旋咪唑、N-乙酰半胱氨酸(NAC)、1-苯丙氨酸氮芥、4'-(9-吖啶基氨基)甲磺酰基-m-茴香胺(mAMSA)(4'-(9-acridinylamino)methanesulfon-m-anisidide)、多药抗性抑制剂(即MDR抑制剂)、美法仑、甲氨蝶呤，任选组合甲酰四氢叶酸、光神霉素、丝裂霉素-c、多药抗性相关蛋白抑制剂(MRP抑制剂)、紫杉酚、丙卡巴肼、链脲霉素、N,N'N'-三亚乙基硫代磷酰胺(塞替派)、拓扑异构酶I和/或拓扑异构酶II的抑制剂、紫杉醇、长春碱、长春花新碱、长春新碱、长春地辛及替尼泊苷
可以在给予本发明提供的任何ADA2包括其野生型、变体和修饰形式之后、同时或者之前给予的其它举例的抗癌剂包括但不限于阿西维辛；阿柔比星；阿考达唑；阿克罗宁；阿多来新；阿地白介素；阿仑珠单抗；阿利维A酸(9-顺式维生素A酸)；别嘌呤醇；六甲蜜胺；匹米诺定；安巴腙；安波霉素；阿美蒽醌；氨磷汀；氨鲁米特；安吖啶；阿那曲唑；阿那昔酮；安西他滨；氨茴霉素；Apaziquones；精美司那；三氧化二砷；天冬酰胺酶；曲林菌素；阿莫司汀；阿扎胞苷；氮替派；阿佐霉素；Banoxantrones；Batabulins；巴马司他；活卡介苗(BCGLive)；贝那昔滨；苯达莫司汀；苯佐替派；贝沙罗汀；贝伐单抗；比卡鲁胺；比他舍平；比立考达；比生群；比生群；Bisnafide Dimesylates；比折来新；博来霉素；硼替佐米；布喹那；溴匹立明；布度钛；白消安；放线菌素C；卡普睾酮；Canertinibs；卡培他滨；卡醋胺；卡贝替姆；卡铂；卡波醌；卡莫氟；卡莫司汀和聚苯丙生；卡莫司汀；卡柔比星；卡折来新；西地芬戈；塞来考昔；西马多丁；苯丁酸氮芥；塞奥罗奈；Ciplactin；西罗霉素；顺铂；克拉屈滨；克兰氟脲；氯法拉滨；克立那托；环磷酰胺；阿糖胞苷脂质体；阿糖胞苷；达卡巴嗪；放线菌素D；达依泊汀α；柔红霉素脂质体；柔红霉素/道诺霉素；柔红霉素；地西他滨；地尼白介素-毒素连接物(Denileukin Diftitoxes)；右尼古地平；Dexonas；右雷佐生；地扎胍宁；地吖醌；二溴螺氯铵；地诺孕素；地那林；Disermolides；多西紫杉醇；Dofequidars；去氧氟尿苷；多柔比星脂质体；盐酸多柔比星；盐酸多柔比星脂质体注射；多柔比星；屈洛昔芬；丙酸屈他雄酮；达佐霉素；依考莫司汀；依达曲沙；Edotecarins；依氟鸟氨酸；依拉克达；依利奈法德；埃利奥特B溶液(Elliott's B Solutions)；依沙芦星；乙嘧替氟；恩洛铂；恩普氨酯；Enzastaurins；依匹哌啶；表柔比星；阿法依伯汀；依他前列素；厄布洛唑；依索比星；雌氮芥；依他硝唑；依托格鲁；磷酸依托泊苷；依托泊苷VP-16；依托泊苷；氯苯乙嘧胺；依西美坦；依昔舒林；法倔唑；法扎拉滨；芬维A胺；非格司亭；氟尿苷；氟达拉滨；氟尿嘧啶；5-氟尿嘧啶；氟甲睾酮；氟西他滨；磷喹酮；福司曲星；福司曲星；福曲他明；氟维司群；加柔比星；加洛他滨；吉西他滨；吉姆单抗/奥佐米星；古罗酚；吉马替康(Gimatecans)；吉美嘧啶；格洛沙腙；葡磷酰胺；醋酸性瑞林；羟基脲；替伊莫单抗；伊达比星；异环磷酰胺；伊莫福新；伊洛马司他；甲磺酸伊马替尼；伊美克；英丙舒凡；Indisulams；氮丙啶丙氧醌；干扰素α-2a；干扰素α-2b；干扰素α；干扰素β；干扰素γ；干扰素；白细胞介素-2和其他白细胞介素(包括重组白细胞介素)；茚托利辛；碘苄胍[131-I]；异丙铂；伊立替康；伊索拉定；伊沙匹隆(Ixabepilones)；酮曲沙；L-阿拉诺新；兰瑞肽；拉帕替尼(Lapatinibs)；来多蒽琼；来曲唑；甲酰四氢叶酸；亮脯利特(Leuprolides)；亮丙瑞林(亮脯利特)；左旋咪唑；来沙骨化醇；利阿唑；洛铂；洛美曲索；洛莫司汀/CCNUs；洛莫司汀；法尼醇蛋白转移酶抑制剂(Lonafarnibs)；洛索蒽醌；勒托替康；马磷酰胺；甘露舒凡；马立马司他；马索罗酚；美坦辛；氮芥(Mechlorethamines)；氮芥(Mechlorethamines)/氮芥(Nitrogen mustards)；醋酸甲地孕酮；甲地孕酮；美仑孕酮；美法仑；美法仑L-PAM；美诺立尔；美雄烷；巯嘌呤；6-巯基嘌呤；美司钠；美替辛德；甲氨蝶呤；甲氧沙林；美托咪酯；氯苯氨啶；美妥替哌；米铂；米泼昔芬；米索硝唑；米丁度胺；Mitocarcins；丝裂红素；米托拉酮；米托洁林；米托胍腙；米托马星；丝裂霉素C；丝裂霉素；米托萘胺；米托喹酮；米托司培；米托坦；米托蒽醌；米托唑胺；米伏布林；咪唑立宾；莫法罗汀；莫哌达醇；Mubritinibs；霉酚酸；苯丙酸南诺龙；奈达铂；奈拉滨；奈莫柔比星；硝氨丙吖啶；诺考达唑；若莫单抗；诺拉霉素；诺拉曲塞；Nortopixantrones；奥曲肽；奥普瑞白介素；奥马铂；Ortataxels；奥替拉西；奥沙利铂；奥昔舒仑；氧芬胂；紫杉酚；氨羟二磷酸二钠；Patupilones；培加酶；培门冬酶；培非司亭；培得星；培利霉素；Pelitrexols；培美曲塞；戊氮芥(Pentamustines)；喷司他丁；培洛霉素；培磷酰胺；哌立福辛；Picoplatins；吡萘非特；哌泊溴烷；哌泊舒凡；吡非尼酮；吡罗蒽醌；Pixantrones；Plevitrexeds；普卡霉素光神霉素(Plicamycin Mithramycins)；普卡霉素；普洛美坦；普洛美坦；卟吩姆钠；卟菲尔钠；泊非霉素；泼尼莫司汀；丙卡巴肼；普罗帕脒；螺丙醇；嘌嘧替派；嘌呤霉素；吡唑呋喃菌素；奎纳克林；雷莫司汀；拉布立酶；利波腺苷；利曲舒凡；利妥昔单抗；罗谷亚胺；罗喹美克；链黑霉素；Sabarubicins；沙芬戈；沙格司亭；沙铂；司铂；司莫司汀；辛曲秦；西左非兰；索布佐生；索拉非尼；磷乙酰天冬氨酸盐/酯；磷乙天冬氨酸；司帕霉素；锗螺胺；螺莫司汀；螺铂；螺铂；角鲨胺；链黑霉素；链伐立星；链佐星；磺环磷酰胺；磺氯苯脲；苹果酸舒尼替尼；6-TG；Tacedinalines；滑石；他利霉素；他莫司汀；他莫昔芬；Tariquidars；牛磺莫司汀；替可加兰；替加氟；替洛蒽醌；替莫泊芬；替莫唑胺；替尼泊苷/VM-26s；替尼泊苷；替罗昔隆；睾内酯；硫咪嘌呤；硫鸟嘌呤；噻替派；硫咪嘌呤；噻唑羧胺核苷；噻氯咪索；替洛隆；汀考达；噻莫西酸；替拉扎明；Topixantrones；托泊替康；托瑞米芬；托西莫单抗；曲贝替定(海鞘素743)；曲妥珠单抗；曲托龙；维甲酸/ATRA；曲西立滨；曲洛司坦；三甲曲沙；TriplatinTetranitrates；曲普瑞林；曲磷胺；妥布氯唑；乌苯美司；尿嘧啶氮芥；乌瑞替派；戊柔比星；伐司朴达；伐普肽；维替泊芬；长春碱；长春新碱；长春地辛；长春匹定；长春氟宁；长春米特；长春甘酯；长春西醇；长春罗新；长春瑞滨；长春罗定；长春曲醇；长春利定；伏氯唑；黄链霉素A(胍甲环素)；折尼铂；亚苄维C[2-H]；净司他丁；唑来膦酸二钠；佐柔比星；和Zosuquidars；阿地白介素(例如)；阿仑珠单抗(例如)；阿利维A酸(例如)；别嘌呤醇(例如)；六甲蜜胺(例如)；氨磷汀(例如)；阿那曲唑(例如)；三氧化二砷(例如)；天冬酰胺酶(例如)；BCG Live(例如BCG)；贝沙罗汀(例如)；贝伐珠单抗博来霉素(例如)；静脉内白消安(例如)；口服白消安(例如MYLERANTM)；卡普睾酮(例如)；卡培他滨(例如)；卡铂(例如)；卡莫司汀(例如)；卡莫司汀和聚苯丙生(例如Wafer)；塞来昔布(例如)；苯丁酸氮芥(例如)；顺铂(例如)；克拉屈滨(例如)；环磷酰胺(例如)；阿糖胞苷(例如)；阿糖胞苷脂质体(例如)；达卡巴嗪(例如DTIC-Domeυ):放线菌素D(例如)；达依泊汀α(例如)；柔红霉素脂质体(例如)；柔红霉素/道诺霉素(例如)；Denileukin Diftitoxes(例如)；右雷佐生(例如)；多西紫杉醇(例如)；多柔比星(例如 )；多柔比星脂质体，包括多柔比星HCL脂质体注射液(例如)；丙酸甲雄烷酮(例如和注射液)；埃利奥特B溶液(例如Elliott's B)；表柔比星(例如)；阿法依伯汀(例如)；雌莫司汀(例如)；磷酸依托泊苷(例如)；依托泊苷VP-16s(例如)；依西美坦(例如)；非格司亭(例如)；氟尿苷(例如)；氟达拉滨(例如)；氟尿嘧啶包括5-FU(例如)；氟维司群(例如)；吉西他滨(例如)；吉妥珠单抗/奥佐米星(例如)；醋酸性瑞林(例如)；羟基脲(例如)；替伊莫单抗(例如)；伊达比星(例如)；异环磷酰胺(例如)；甲磺酸伊马替尼(例如)；干扰素α-2a(例如)；干扰素α-2b(例如 )；伊立替康(例如)；来曲唑(例如)；甲酰四氢叶酸(例如 )；左旋咪唑(例如)；洛莫司汀/CCNUs(例如)；氮芥(例如)；醋酸甲地孕酮(例如)；美法仑/L-PAMs(例如)；巯嘌呤包括6-MP(例如)；美司钠(例如)；甲氨蝶呤；甲氧沙林(例如)；丝裂霉素C(例如 )；米托坦(例如)；米托蒽醌(例如)；苯丙酸南诺龙(例如)；若莫单抗(例如)；奥普瑞白介素(例如)；奥沙利铂(例如)；紫杉酚(例如)；帕玛二磷酸(例如)；培加酶(例如)；培门冬酶(例如)；培非司亭(例如)；喷司他丁(例如)；哌泊溴烷(例如)；普卡霉素/光辉霉素(例如)；卟吩姆钠(例如)；丙卡巴肼(例如)；奎纳克林(例如)；拉布立酶(例如)；利妥昔单抗(例如)；沙格司亭(例如)；链佐星(例如)；苹果酸舒尼替尼(例如)；滑石(例如)；他莫昔芬(例如)；替莫唑胺(例如)；替尼泊苷/VM-26s(例如)；睾内酯(例如)；硫鸟嘌呤包括6-TG；塞替派(例如)；托泊替康(例如)；托瑞米芬(例如)；托西莫单抗(例如)；曲妥珠单抗(例如)；维甲酸/ATRA(例如)；尿嘧啶氮芥；戊柔比星(例如)；长春碱(例如)；长春新碱(例如)；长春瑞滨(例如)；和唑来膦酸(例如)。本发明提供的任何ADA2可以与其它抗癌剂用于组合治疗中，所述抗癌剂如本发明提供和/或Goodman and Gilman的ThePharmacological Basis of Therapeutics,Eds.Hardman and Limbird,Tenth edition(2002)中描述的那些。
i.抗癌抗体
可以与本发明提供的任何ADA2共同给予的抗癌抗体例如包括但不限于：抗17-IA细胞表面抗原抗体如(依决洛单抗)；抗-4-1BB抗体；抗-4Dc抗体；抗-A33抗体如A33和CDP-833；抗-α1整联蛋白抗体如那他珠单抗；抗-α4β7整联蛋白抗体如LDP-02；抗-αVβ1整联蛋白抗体如F-200、M-200和SJ-749；抗-αVβ3整联蛋白抗体如阿昔单抗、CNTO-95、Mab-17E6和抗-补体因子5(C5)抗体如5G1.1；抗-CA125抗体如(oregovomab)；抗-CD3抗体如(visilizumab)和Rexomab；抗-CD4抗体如IDEC-151、MDX-CD4、OKT4A；抗-CD6抗体如溶瘤素B和溶瘤素CD6；抗-CD7抗体如HB2；抗-CD19抗体如B43、MT-103和溶瘤素B；抗-CD20抗体如2H7、2H7.v16、2H7.v114、2H7.v115、(托西莫单抗)、(利妥昔单抗)和(替伊莫单抗)；抗-CD22抗体如(依帕珠单抗)；抗-CD23抗体如IDEC-152；抗-CD25抗体如巴利昔单抗和(达克珠单抗)；抗-CD30抗体如AC10、MDX-060和SGN-30；抗-CD33抗体如(吉妥珠单抗奥佐米星)、溶瘤素M和Smart Ml 95；抗-CD38抗体；抗-CD40抗体如SGN-40和toralizumab；抗-CD40L抗体如5c8、和IDEC-131；抗-CD44抗体如比伐单抗；抗-CD46抗体；抗-CD52抗体如(阿仑珠单抗)；抗-CD55抗体如SC-1；抗-CD56抗体如huN901-DM1；抗-CD64抗体如MDX-33；抗-CD66e抗体如XR-303；抗-CD74抗体如IMMU-1 10；抗-CD80抗体如galiximab和IDEC-1 14；抗-CD89抗体如MDX-214；抗-CD123抗体；抗-CD138抗体如B-B4-DM1；抗-CD146抗体如AA-98；抗-CD148抗体；抗-CEA抗体如cT84.66、labetuzumab和抗-CTLA4抗体如MDX-101；抗-CXCR4抗体；抗-EGFR抗体如ABX-EGF、(西妥昔单抗)、IMC-C225和Merck Mab 425；抗-EpCAM抗体如Crucell's抗-EpCAM、ING-1和IS-IL-2；抗-肝配蛋白(ephrin)B2/EphB4抗体；抗-Her2抗体如)、MDX-210；抗-FAP(成纤维细胞激活蛋白)抗体如西罗珠单抗；抗-铁蛋白抗体如NXT-211；抗-FGF-1抗体；抗-FGF-3抗体；抗-FGF-8抗体；抗-FGFR抗体，抗-纤维蛋白抗体；抗-G250抗体如WX-G250和抗-GD2神经节苷脂抗体如EMD-273063和TriGem；抗-GD3神经节苷脂抗体如BEC2、KW-2871和米妥莫单抗；抗-gpIIb/IIIa抗体如ReoPro；抗-肝素酶抗体；抗-Her2/ErbB2抗体如(曲妥珠单抗)、MDX-210及pertuzumab；抗-HLA抗体如Smart 1D10；抗-HM1.24抗体；抗-ICAM抗体如ICM3；抗-IgA受体抗体；抗-IGF-1抗体如CP-751871和EM-164；抗-IGF-1R抗体如IMC-A12；抗-IL-6抗体如CNTO-328和elsilimomab；抗-IL-15抗体如抗-KDR抗体；抗-层粘连蛋白5抗体；抗-Lewis Y抗原抗体如Hu3S193和IGN-311；抗-MCAM抗体；抗-Muc1抗体如BravaRex和TriAb；抗-NCAM抗体如ERIC-1和ICRT；抗-PEM抗原抗体如Theragyn和Therex；抗-PSA抗体；抗-PSCA抗体如IG8；抗-Ptk抗体；抗-PTN抗体；抗-RANKL抗体如AMG-162；抗-RLIP76抗体；抗-SK-1抗原抗体如Monopharm C；抗-STEAP抗体；抗-TAG72抗体如CC49-SCA和MDX-220；抗-TGF-β抗体如CAT-152；抗-TNF-α抗体如CDP571、CDP870、D2E7、(阿达木单抗)和(英利昔单抗)；抗-TRAIL-R1和TRAIL-R2抗体；抗-VE-钙粘蛋白-2抗体；及抗-VLA-4抗体如此外，可以使用抗-独特型抗体，包括但不限于GD3表位抗体BEC2和gp72表位抗体105AD7。此外，可以使用双特异性抗体，包括但不限于抗-CD3/CD20抗体Bi20。
ii.化疗剂
在一些实例中，本发明提供的任何ADA2包括其野生型、变体和修饰形式与一或多种化疗剂一起给予。举例的化疗剂包括但不限于烷化剂如噻替派和环磷酰胺烷基磺酸盐如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；雄激素如卡普睾酮、丙酸甲雄烷酮、环硫雄醇、美雄烷、睾内脂；抗肾上腺素如氨鲁米特、米托坦、曲洛司坦；抗雄激素如氟他胺、尼鲁米特、比卡鲁胺、亮脯利特和戈舍瑞林；抗生素如阿克拉霉素、放射菌素、安曲霉素、偶氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素C、卡奇霉素、卡柔比星、洋红霉素、嗜癌素、色霉素、放线菌素D、柔红霉素、地托比星、重氮氧代正亮氨酸、多柔比星、表柔比星、依索比星、伊达比、麻西罗霉素、丝裂霉素、霉酚酸、诺拉霉素、橄榄霉素、培洛霉素、泊非霉素、嘌呤霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑霉素、链佐星、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁、佐柔比星；抗雌激素，包括例如他莫昔芬、雷洛昔芬、芳香酶抑制4(5)-咪唑、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬、keoxifene、LY 117018、奥那司酮及托瑞米芬(法乐通)；抗代谢物如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物如二甲叶酸、甲氨蝶呤、蝶罗呤、三甲曲沙；氮丙啶如苯佐替派、卡波醌、美妥替哌和乌瑞替派；乙烯亚胺和甲基蜜胺，包括六甲蜜胺、三乙撑密胺、三亚乙基磷酰胺、亚乙基硫代磷酰胺及三羟甲基蜜胺；叶酸补充物如亚叶酸；氮芥如苯丁酸氮芥、萘氮芥、chlorophosphamide、雌氮芥、异环磷酰胺、氮芥、盐酸氧氮芥、美法仑、新氮芥、苯芥胆甾醇、泼尼莫司汀、曲磷胺、尿嘧啶氮芥；亚硝基脲如:卡莫司汀、氯乙链脲菌素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀、雷莫司汀；铂类似物如顺铂和卡铂；长春碱；铂；蛋白质如精氨酸脱亚氨基酶和天冬酰胺酶；嘌呤类似物如氟达拉滨、6-巯嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物如安西他滨、阿扎胞苷、6-阿扎尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、二脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨、氟尿苷、5-FU；紫杉烷例如紫杉酚(Bristol-Myers Squibb Oncology,Princeton,N.J.)和多西紫杉醇Rhone-Poulenc Rorer,Antony,France)；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；胸苷酸合酶抑制剂(如Tomudex)；另外的化疗剂，包括醋葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷；氨基酮戊酸；安吖啶；bestrabucil；比生群；依达曲沙；地磷酰胺；秋水仙胺；地吖醌；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；依氟鸟氨酸；依利醋铵；依托格鲁；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌达醇；硝氨丙吖啶；喷司他丁；蛋氨氮芥；吡柔比星；鬼臼酸；2-乙基酰肼；丙卡巴肼；雷佐生；西左非兰；锗螺胺；替奴佐酸；三亚胺醌；2,2',2"-三氯三乙胺；乌拉坦；长春地辛；达卡巴嗪；甘露醇氮芥；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；gacytosine；阿拉伯糖苷("Ara-C”)；环磷酰胺；噻替派；苯丁酸氮芥；吉西他滨；6-硫鸟嘌呤；巯嘌呤；甲氨蝶呤；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；丝裂霉素C；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨；去甲长春碱；诺消灵；替尼泊苷；道诺霉素；氨基蝶呤；希罗达；伊班膦酸盐；CPT-11；视黄酸；esperamycins；卡培他滨；及拓扑异构酶抑制剂如伊立替康。也可以使用上述任何制剂的药物可接受的盐、酸或者衍生物。
化疗剂可以作为前体药物给予。可以与本发明提供的任何ADA2一起给予的前体药物例如包括但不限于含有磷酸盐的前体药物、含有硫代磷酸盐的前体药物、含有硫酸盐的前体药物、含有肽的前体药物、D-氨基酸修饰的前体药物、糖基化前体药物、含有β-内酰胺的前体药物，任选取代的含有苯氧基乙酰胺的前体药物或者任选取代的含有苯乙酰胺的前体药物、5-氟胞嘧啶及可以转变为更活性的细胞毒性游离药物的其它5-氟尿苷前体药物。
iii.放射性治疗
本发明提供的任何ADA2包括其野生型、变体和修饰形式可以组合其它治疗方案。例如，在一个实施方案中，用本发明提供的任何ADA2治疗的患者可接受放疗。放疗可以根据本领域常用的及本领域技术人员已知的方案给予。这种治疗包括但不限于铯、铱、碘、钴放射，用X射线、γ射线照射，包括定向照射和断层成像靶向，用植入的放射性靶丸或“种子”治疗癌组织，用硼化合物引发的中子束照射组织，和/或本领域已知的其它类型的粒子束治疗。放疗可以是全身照射，或者可以直接局部照射机体内或上的特定部位或组织，如肺、膀胱或前列腺。典型地，放疗是在大约1-2周的一段时间内以脉冲方式给予。然而，放疗可以给予更长时间。例如，放疗可以给予头颈癌患者大约6-大约7周。任选地，放疗可以单一剂量或者多次连续剂量给予。医学从业人员可以根据经验确定适用于本发明的放疗的合适剂量。在一些实例中，本发明提供的任何ADA2包括其野生型、变体和修饰形式及任选一或多种其它抗癌治疗用于治疗离体癌细胞。预期这种离体治疗可用于骨髓移植及特别是自体骨髓移植中。例如，用本发明提供的任何ADA2与一或多种抗癌治疗治疗含有癌细胞的细胞或组织可用于在移植在受体患者中之前耗竭或者基本上耗竭所述癌细胞。放疗也可以包含用同位素标记的分子如抗体进行治疗。举例的放射免疫治疗剂包括但不限于(Y-90标记的抗-CD20)、(Y-90标记的抗-CD22)和(I-131标记的抗-CD20)。此外，预期本发明提供的任何ADA2包括其野生型、变体和修饰形式可以组合另外的其它治疗技术如手术或光疗法给予患者或对象。
iv.抗血管发生剂
在一些实例中，本发明提供的任何ADA2，包括其野生型、变体和修饰形式，与一或多种抗血管发生剂一起给予。例如，抗血管发生因子可以是结合参与促进血管发生的生长因子或者生长因子受体的小分子或者蛋白质(例如抗体、Fc融合体或者细胞因子)。举例的抗血管发生剂包括但不限于结合血管内皮生长因子(VEGF)或者结合VEGF-R的抗体，降低VEGF或VEGF-R表达水平的基于RNA的治疗剂，VEGF-毒素融合体，Regeneron's VEGF-trap，血管抑素(纤溶酶原片段)，抗凝血酶III，angiozyme，ABT-627，Bay 12-9566，BeneFin，贝伐单抗，二膦酸盐，BMS-275291，软骨衍生抑制剂(CDI)，CAI，CD59补体片段，CEP-7055，Col 3，考布他汀A-4，内皮抑素(胶原蛋白XVIII片段)，法尼基转移酶抑制剂，纤连蛋白片段，gro-beta，卤夫酮，肝素酶，肝素多聚己糖片段，HMV833，人绒毛膜促性腺激素(hCG)，IM-862，干扰素α，干扰素β，干扰素γ，干扰素可诱导蛋白10(IP-10)，白细胞介素-12，kringle 5(纤溶酶原片段)，马立马司他，金属蛋白酶抑制剂(例如TIMPs)，2-甲氧雌二醇，MMI 270(CGS27023A)，纤溶酶原激活物抑制剂(PAI)，血小板因子-4(PF4)，普啉司他，催乳素16kDa片段，增殖蛋白相关蛋白(PRP)，PTK 787/ZK 222594，类维生素A，索利司他，角鲨胺，SS3304，SU5416，SU6668，SU11248，四氢皮质醇-S，四硫钼酸盐，沙利度胺，血小板反应蛋白-1(TSP-1)，TNP470，转化生长因子β(TGF-β)，血管抑制素，血管抑制因子(钙网蛋白片段)，ZS6126和ZD6474。
v.免疫检查点抑制剂
在一些实例中，本发明提供的任何ADA2，包括其野生型、变体和修饰形式，与通过封闭免疫检查点蛋白而增加免疫应答的一或多种物质(即免疫检查点抑制剂)一起给予。在本发明提供的组合治疗中，免疫检查点抑制剂可以是抗免疫检查点蛋白的抗体，如抗细胞毒性T淋巴细胞抗原4(CTLA4或CD152)、程序化细胞死亡蛋白1(PD-1)或者程序化细胞死亡蛋白1配体1(PD-L1)的抗体。
特别地，本发明提供的组合治疗可用于治疗与治疗对象中升高的腺苷水平相关和/或易感于腺苷或脱氧腺苷水平降低的所有类型的肿瘤，包括癌症。这些肿瘤广泛地包括血液肿瘤以及实体瘤。举例的癌症包括但不限于源自免疫系统、骨骼系统、肌肉和心脏、乳腺、胃肠道、中枢和周围神经系统、肾脏系统、生殖系统、呼吸系统、皮肤、结缔组织系统包括关节、脂肪组织和循环系统包括血管的那些癌症。
治疗癌症的治疗包括免疫治疗(例如抑制性检查点蛋白拮抗剂或激动剂)，其抑制免疫抑制性信号传导或者增强免疫刺激信号传导。代替直接靶向肿瘤自身，这种治疗使用宿主的内源性防御机制对抗肿瘤。例如，共刺激性受体的抑制性检查点蛋白质拮抗剂和/或激动剂通过扩增抗原特异性T细胞应答可以刺激宿主内源性抗肿瘤免疫应答。增强宿主的免疫应答赋予优于细胞毒性治疗的优势在于作用可以长期持续，由此在停止治疗后对象可以产生持续几个月至几年的持久的抗肿瘤应答。
在特别的实例中，本发明提供的组合治疗应用靶向抑制性检查点蛋白的物质(例如抗体)。举例的抑制性免疫检查点靶蛋白和用于所述靶的治疗性抗体在表5中提供。
特别地，免疫抑制性分子CTLA4、PD-1和PD-L1的抑制剂预期用于本发明提供的组合和方法中。虽然CTLA4和PD-1均作为负调节物，但是在调节免疫应答中均发挥非冗余作用：CTLA4参与弱化稚T细胞和记忆(静息)T细胞的早期活化，而PD-1在调节周围组织中T细胞活性中起作用(见例如Keir et al.(2008)Annu Rev Immunol.26:677–704；Pardoll,(2012)Nat Rev Cancer.12(4):252–264；Quezada et al.,(2013)Br J Cancer.108(8):1560–1565；Callahan et al.,(2010)Semin Oncol.37(5):473-84)。
细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA4；也称作CD152；SEQ ID NO:544)是一种共抑制性受体，其包装在维持在稚或静息T细胞的细胞质中的小泡中。当T细胞活化起始时，也触发含有CTLA4的小泡转运至T细胞表面。CTLA4的抑制性活性抑制刺激信号的放大。在这种作用中，CTLA4降低T细胞活性并因此限制自身免疫性。CTLA4在下调辅助T细胞活性及增强调节性T(Treg)细胞活性中也起作用。例如通过给予抗-CTLA4抗体抑制CTLA4可通过增加CTL活性、增加效应和辅助T细胞的存在和/或通过抑制Treg细胞的抑制功能而增强免疫应答。CTLA4的抑制使得在免疫应答引发期间可以完全活化T细胞。
在T细胞活化及进入血流时，诱导程序化细胞死亡蛋白1(PD-1；SEQ ID NO:545)的表达，其是抑制T细胞活化的受体。PD-1也存在于调节性T(Treg)细胞、耗竭的T细胞、激活的B细胞、天然杀伤(NK)细胞、树突细胞(DC)和激活的单核细胞上。PD-1具有两个主要配体：PD-1配体(PD-L1；也称作B7-H1或CD274；SEQ ID NO:546)和PD-L2(也称作B7-DC或CD273)。组织中的炎症信号诱导PD-L1和PD-L2表达。在结合其配体之一时，PD-1通过抑制T细胞受体(TCR)的信号传导、下调免疫刺激性细胞因子的分泌和存活蛋白的表达以及增加免疫抑制性细胞因子IL-10的T细胞产生而弱化T细胞活性。这些活性在正常条件下免疫应答期间限制旁系组织损害及限制自身免疫性。例如通过给予抗-PD-1或抗-PD-L1抗体封闭PD-1信号传导途径，导致T细胞效应子功能恢复，如肿瘤特异性T细胞效应子功能，例如杀死肿瘤细胞及分泌免疫刺激性细胞因子，如干扰素γ(IFN-γ)、白细胞介素-2(IL-2)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)。
其它免疫检查点配体和受体参与调节免疫应答及可以作为目的在于增强抗肿瘤免疫性的治疗的靶。此外，封闭两或更多个协同表达的受体或配体可以产生附加或协同抗肿瘤活性。靶除了PD-L1和PD-L2之外还包括B7抑制性配体，如B7-H3和B7-H4，其在肿瘤细胞或者肿瘤侵润细胞上是上调的。与淋巴细胞活性抑制相关的其它靶包括淋巴细胞活化基因3(LAG3；也称作CD223)、2B4(也称作CD244)、B和T淋巴细胞弱化子(BTLA；或CD272)、T细胞膜蛋白3(TIM3；或HAVcr2)、腺苷A2a受体(A2aR)及杀伤细胞抑制性受体家族。许多这些免疫检查点受体调节效应T细胞和Treg细胞的活性。例如，LAG3在Treg细胞上高表达(这帮助预防自身免疫性)，在此其被认为对于扩大免疫抑制性活性是重要的。LAG3也与效应T细胞活性的抑制相关及可诱导T细胞无反应性(Pardoll,(2012)Nat Rev Cancer.12(4):252–264。靶向这些蛋白质的抗体单独或者组合地在动物癌症模型中可增强抗肿瘤免疫性。由于许多肿瘤细胞表达多个抑制性配体，及肿瘤侵润淋巴细胞表达多个抑制性受体，因此抑制这些蛋白质的组合方法在增强抗肿瘤免疫性中是有效的(见Pardoll,(2012)Nat Rev Cancer.12(4):252-264)。除了分泌的或者膜结合的抑制性配体，由通常侵润肿瘤的抑制性骨髓衍生阻抑细胞表达的代谢酶如吲哚胺2,3双加氧酶(IDO)和精氨酸酶，通过耗竭T细胞合成代谢必需的氨基酸而可以局部抑制免疫应答。这些酶可以通过小分子药物抑制。
由于免疫检查点抑制剂作用于免疫细胞以增强免疫应答，因此当与本发明提供的任何ADA2包括其野生型、变体和修饰形式组合提供时，增加的应答可以是由于增加免疫细胞(例如CTL)进入肿瘤的作用所致。例如，如上文所述，肿瘤和基质细胞产生高水平腺苷，其可发挥免疫抑制作用。通过降低腺苷介导的免疫抑制，可以增加循环中免疫细胞抗肿瘤活性，从而增加可用于杀死肿瘤细胞的细胞毒性细胞及其它免疫细胞的数目。也可以提高抗肿瘤剂或药物如免疫检查点抑制剂(例如抗-CTLA4抗体)的效力。
因此，使用本发明提供的任何ADA2，包括其野生型、变体和修饰形式例如聚乙二醇化ADA2，可以敏化肿瘤对免疫介导的应答，这在存在免疫检查点抑制剂(例如抗-CTLA4抗体，和抗-PD1抗体，或者抗-PD-L1抗体)时可进一步增加。通过本发明提供的任何ADA2增强免疫细胞抗肿瘤的活性，即降低腺苷介导的免疫抑制作用，可以降低免疫检查点抑制剂的剂量，同时保持或增强治疗效力。更有效地微调抗体剂量的能力也可以导致减少与抗体治疗相关的副作用。因此，本发明提供的组合治疗可促进对于消除肿瘤和肿瘤治疗的增强的抗肿瘤免疫应答。
本发明提供的组合治疗，包括组合物、组合及方法和其应用，含有免疫检查点蛋白的抑制剂，其封闭免疫检查点蛋白以刺激抗肿瘤免疫应答。这种免疫检查点抑制剂为本领域已知。举例的这种抑制剂在本文中提供，包括靶向表5所述抑制性检查点蛋白的任何抑制性物质。例如，免疫检查点抑制剂或者抑制性物质是CTLA4、PD-1和PD-L1的抑制剂。在特别的实例中，免疫检查点抑制剂是抗体或者适体。举例的CTLA4、PD-1和PD-L1的抑制剂包括抗-CTLA4、抗-PD-1和抗-PD-L1抗体及适体。
是适体的抑制剂可以用于本发明提供的组合治疗中。适体包括寡核苷酸(DNA、RNA或XNA)或者肽适体。适体可以是单价或多价如二价或四价。在一些情况中，适体可以通过聚合物如胆固醇或聚乙二醇(PEG)修饰以延长循环适体的半衰期。
在特别的实例中，免疫检查点抑制剂是封闭免疫检查点分子的抗体(例如抗-CTLA4、抗-PD-1和抗-PD-L1)。所述抗体可以是免疫特异性结合免疫检查点分子(例如CTLA4、PD-1和PD-L1)的全长抗体或者其抗原结合片段。预期用于本发明提供的组合、方法和应用中的其它免疫调节剂包括靶向抑制性受体淋巴细胞激活基因3(LAG3)和T细胞膜蛋白3(TIM3)的抑制性物质，抑制性配体如PD-L2(或B7-H2)、B7-H3、B7-H4和CD25，及免疫抑制性酶吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)。针对LAG3(例如融合蛋白IMP321和多种mAb)的物质及抗B7-H3抗体(例如MGA271)已经鉴定并用于临床试验。B7-H4和TIM3的抗体或者抑制性物质处于临床前开发阶段(Pardoll,Nat Rev Cancer.2012Mar 22；12(4):252-264)。这些物质的任一或多种均可包含于本发明提供的任何组合中。此外，抗体的变体或者修饰形式也可以用于本发明提供的组合治疗方法中。
(a)抗-CTLA4治疗
封闭CTLA4的两种抗体伊匹木单抗和曲美木单抗已经用于有效治疗一些癌症，如黑色素瘤、胰腺癌、卵巢癌、前列腺癌、肾细胞癌(RCC)、结肠直肠癌(CRC)、胃癌和NSCLC(见Kyi et al.,(2014)FEBS Letters 588:368-376)。治疗性CTLA4封闭在完成治疗后几个月至几年时间仍影响肿瘤衰退(Prieto et al.,(2012)Clin Cancer Res.18(7):2039-2047；Kirckwood et al.,(2010)Clin Cancer Res.16(3):1042-1048)，但是也降低其它宿主组织耐受性，导致不利事件，如免疫相关不利事件(irAE)。
本发明提供的组合治疗，包括其组合物和方法和应用，可包括抑制CTLA4的治疗剂。抑制剂包括抗体和适体。本领域已知结合CTLA4并抑制CTLA4信号传导的抗体和适体抑制剂。结合CTLA4、抑制CTLA4功能及增强肿瘤免疫性的举例的适体已经描述且如SEQ IDNOS:384-388、539-541所示(Santulli-Marotto(2003)Cancer Res.63(21):7483-7489；Gilboa et al.,(2013)Clin Cancer Res 19(5):1054-1062)。
本领域已经描述了结合并抑制CTLA4活性的一些抗体，其已经用于抗肿瘤免疫治疗中。抗-CTLA4抗体包括但不限于任何在美国专利号6,682,736、6,984,720；美国专利公开号2002/0086014；2009/0074787；EP 1262193；和WO 2000/037504中描述的那些。特别地，抗-CTLA4抗体包括伊匹木单抗(也称作MDX-010、MDX-101、10D1；Drug Bank登录号DB06186)和曲美木单抗(也称作Ticilimumab，CP-675,206或11.2.1)。
例如，用于本发明提供的组合治疗中的抗-CTLA4抗体可包括伊匹木单抗(也称作MDX-010，MDX-101，10D1；Drug Bank登录号DB06186)或其衍生物，如伊匹木单抗的变体或其抗原结合片段。伊匹木单抗是完全人IgG1κ单克隆抗体，特异性结合人CTLA4(见例如在美国专利公开号2002/0086014和美国专利号6,984,720中称作10D1的抗体)。伊匹木单抗的重链具有可变结构域(VH)，其具有SEQ ID NO:390所示氨基酸序列，由SEQ ID NO:389所示核苷酸序列编码。重链的互补决定区(CDR)包括VH CDR 1(SEQ ID NO:393所示)、VH CDR 2(SEQID NO:394所示)和VH CDR 3(SEQ ID NO:395所示)。伊匹木单抗的轻链具有可变结构域(VL)，其具有SEQ ID NO:392所示氨基酸序列，由SEQ ID NO:391所示核苷酸序列编码。轻链的CDR包括VL CDR 1(SEQ ID NO:396所示)、VL CDR 2(SEQ ID NO:397所示)和VL CDR 3(SEQID NO:398所示)。当重组产生时，伊匹木单抗由四条多肽链组成；两条相同的每条447个氨基酸的重链及两条相同的每条215个氨基酸的κ轻链。每对重链和轻链通过链间二硫键连接。
在另一实例中，用于本发明提供的组合治疗中的抗-CTLA4抗体可包括曲美木单抗(也称作Ticilimumab,CP-675,206或11.2.1)或其衍生物，如曲美木单抗的变体或其抗原结合片段。曲美木单抗是全长人IgG2单克隆抗体，特异性结合人CTLA4(见例如WO 00/37504中称作11.2.1的抗体)。曲美木单抗的重链具有可变结构域(VH)，其具有SEQ ID NO:400所示氨基酸序列，由SEQ ID NO:399所示核苷酸序列编码。重链的互补决定区(CDR)包括VH CDR1(SEQ ID NO:471所示)、VH CDR 2(SEQ ID NO:472所示)及VH CDR3(SEQ ID NO:473所示)。曲美木单抗的轻链具有可变结构域(VL)，其具有SEQ ID NO:402所示氨基酸序列，由SEQ IDNO:401所示核苷酸序列编码。轻链的CDR包括VL CDR 1(SEQ ID NO:474所示)、VL CDR 2(SEQID NO:475所示)和VL CDR 3(SEQ ID NO:476所示)。当重组产生时，曲美木单抗由四条多肽链组成，两条相同的重链和两条相同的κ轻链。每对重链和轻链通过链间二硫键连接。
这些抗-CTLA4抗体已经参与许多癌症治疗的临床试验。伊匹木单抗被FDA批准用于治疗黑色素瘤且已经在其它癌症如前列腺癌、肺癌和RCC中处于临床试验。曲美木单抗在临床试验中已经研究用于治疗CRC、胃癌、黑色素瘤和NSCLC。
本发明提供的组合治疗中的抗-CTLA4抗体还可包括伊匹木单抗或曲美木单抗的变体，或者其包括变化的抗原结合片段，其中变体抗体免疫特异性结合CTLA4。所述变化可以是例如氨基酸置换、插入或者缺失氨基酸。
(b)抗-PD-1和抗-PD-L1治疗
本发明提供的组合治疗，包括其组合物和方法及应用，包括抑制PD-1或PD-L1的治疗剂。抑制剂包括抗体和融合蛋白、适体、本领域已知结合PD-1或PD-L1及抑制PD-1抑制性信号传导的抗体、适体和融合蛋白抑制剂。举例的融合蛋白包括AMP-224(也称作B7-DCIg)，其是在WO2010/027827和WO2011/066342中描述的PD-L2-Fc融合可溶受体。
已描述结合PD-1或PD-L1及抑制PD-1抑制性活性的一些抗体已经用于抗肿瘤免疫治疗中。抗-PD-1抗体包括但不限于任何在美国专利号7,943,743、8,008,449、8,779,105、8,735,553；美国专利公开号2005/01809692007/0166281；国际专利公开号WO 2008/156712中描述的那些。抗-PD-L1抗体包括但不限于任何在美国专利公开号2013/0034559和2013/0045202；美国专利号7,943,743、8,217,149、8,679,767和8,779,108及国际专利公开号WO2010/077634和WO 2013/019906中描述的那些。
特别地，抗-PD-1抗体包括纳武单抗(也称作BMS-936558、MDX-1106、ONO-4538或5C4)、MK-3475(也称作Pembrolizumab、Lambrolizumab或h409A11)、Pidilizumab(也称作hBAT-1或CT-011)及AMP-224(也称作B7-DCIg)。这些抗-PD-1抗体已经参与多种癌症治疗的临床试验，如黑色素瘤、NSCLC、RCC、血液恶性肿瘤、淋巴瘤、白血病、胰腺癌、前列腺癌、肺癌和多发性骨髓瘤。
例如，用于本发明提供的组合治疗中的抗-PD-1抗体可包括纳武单抗(也称作BMS-936558、MDX-1106、ONO-4538或5C4)或其衍生物，如纳武单抗的变体或抗原结合片段。纳武单抗是完全人IgG4单克隆抗体，特异性结合人PD-1(见例如在美国专利号8,008,449中称作5C4的抗体)。纳武单抗的重链具有可变结构域(VH)，其具有SEQ ID NO:404所示氨基酸序列，由SEQ ID NO:403所示核苷酸序列编码。重链的互补决定区(CDR)包括VH CDR 1(SEQ IDNO:407所示)、VH CDR 2(SEQ ID NO:408所示)和VH CDR3(SEQ ID NO:409所示)。纳武单抗的轻链具有可变结构域(VL)，其具有SEQ ID NO:406所示氨基酸序列，由SEQ ID NO:405所示核苷酸序列编码。轻链的CDR包括VL CDR 1(SEQ ID NO:410所示)、VL CDR 2(SEQ ID NO:411所示)和VL CDR 3(SEQ ID NO:412所示)。当重组产生时，纳武单抗由四条多肽链组成，两条相同的重链和两条相同的κ轻链。每对重链和轻链通过链间二硫键连接。
在另一实例中，用于本发明提供的组合治疗中的抗-PD-1抗体可包括MK-3475(也称作Pembrolizumab、Lambrolizumab或h409A11)或者其衍生物，如MK-3475的变体或其抗原结合片段。MK-3475是人源化IgG4κ单克隆抗体，特异性结合人PD-1(见例如在WO 2008/156712中称作h409A11的抗体)。MK-3475的完整重链具有SEQ ID NO:414所示氨基酸序列，由SEQ ID NO:413所示核苷酸序列编码，完整轻链具有SEQ ID NO:416所示氨基酸序列，由SEQ ID NO:415所示核苷酸序列编码。重链由可变结构域(VH)组成，其具有SEQ ID NO:418所示氨基酸序列，由SEQ ID NO:417所示核苷酸序列编码。轻链由可变结构域(VL)及人源化κ轻链区组成，VL具有SEQ ID NO:420所示氨基酸序列，由SEQ ID NO:419所示核苷酸序列编码。当重组产生时，MK-3475由四条多肽链组成，两条相同的每条447个氨基酸的重链，及两条相同的每条218个氨基酸的κ轻链。每对重链和轻链通过链间二硫键连接。
MK-3475的CDR包括VH CDR 1(SEQ ID NO:421)、VH CDR 2(SEQ ID NO:422)、VHCDR 3(SEQ ID NO:423)、VL CDR 1(SEQ ID NO:424)、VL CDR2(SEQ ID NO:425)和VL CDR 3(SEQ ID NO:426)。
在另一实例中，用于本发明提供的组合治疗中的抗-PD-1抗体可包括Pidilizumab(也称作hBAT-1或CT-011)或其衍生物，如Pidilizumab的变体或抗原结合片段。Pidilizumab是人源化IgG1单克隆抗体，其从针对B淋巴细胞膜产生的鼠抗体(BAT)产生，且已经示出激发基于T细胞和NK细胞的活性。Pidilizumab结合人PD-1(见例如在US 2005/0180969中称作BAT-1RκD/RHC的抗体)。Pidilizumab的完整重链具有SEQ ID NO:428所示氨基酸序列，由SEQ ID NO:427所示核苷酸序列编码，完整轻链具有SEQ ID NO:430所示氨基酸序列，由SEQ ID NO:429所示核苷酸序列编码。重链由可变结构域(VH)组成，其具有SEQID NO:432所示氨基酸序列，由SEQ ID NO:431所示核苷酸序列编码。轻链由可变结构域(VL)及一个人源化κ轻链恒定区组成，VL具有SEQ ID NO:434所示氨基酸序列，由SEQ IDNO:433所示核苷酸序列编码。当重组产生时，Pidilizumab由四条多肽链组成，两条相同的重链及两条相同的κ轻链。每对重链和轻链通过链间二硫键连接。
Pidilizumab的CDR包括VH CDR 1(SEQ ID NO:435所示氨基酸序列)、VH CDR 2(SEQ ID NO:436所示氨基酸序列)、VH CDR 3(SEQ ID NO:437所示氨基酸序列)、VL CDR 1(SEQ ID NO:438所示氨基酸序列)、VL CDR 2(SEQ ID NO:439所示氨基酸序列)及VL CDR 3(SEQ ID NO:440所示氨基酸序列)。
本发明提供的组合治疗中的抗-PD-1抗体也可包括纳武单抗、MK-3475、Pidilizumab和AMP-224的变体或者其包含变化的抗原结合片段，其中所述变体抗体免疫特异性结合PD-1。所述变化可以是例如氨基酸置换、插入或缺失氨基酸。
特别地，抗-PD-L1(或抗-B7H1)抗体包括但不限于称作BMS-936559(也称作MDX-1105或12A4)、MPDL3280A(也称作RG7446)和MEDI4736的抗体。这些抗-PD-L1抗体已经参与许多癌症治疗的临床试验，如黑色素瘤、NSCLC、卵巢癌、RCC和肺癌。
例如，用于本发明提供的组合治疗中的抗-PD-L1抗体可包括BMS-936559(也称作MDX-1105或12A4)或其衍生物，如BMS-936559的变体或抗原结合片段。BMS-936559是完全人IgG4单克隆抗体，特异性结合人PD-L1(见例如美国专利号7,943,743中称作12A4的抗体)。BMS-936559的重链具有可变结构域(VH)，其具有SEQ ID NO:442所示氨基酸序列，由SEQ IDNO:441所示核苷酸序列编码。重链的互补决定区(CDR)包括VH CDR 1(SEQ ID NO:445所示)、VH CDR 2(SEQ ID NO:446所示)和VH CDR3(SEQ ID NO:447所示)。BMS-936559的轻链具有可变结构域(VL)，其具有SEQ ID NO:444所示氨基酸序列，由SEQ ID NO:443所示核苷酸序列编码。轻链的CDR包括VL CDR 1(SEQ ID NO:448所示)、VL CDR 2(SEQ ID NO:449所示)和VL CDR 3(SEQ ID NO:450所示)。当重组产生时，BMS-936559由四条多肽链组成，两条相同重链和两条相同κ轻链。每对重链和轻链通过链间二硫键连接。
在另一实例中，用于本发明提供的组合治疗中的抗-PD-L1抗体可包括MPDL3280A(也称作RG7446)或其衍生物，如MPDL3280A的变体或抗原结合片段。MPDL3280A是完全人IgG4单克隆抗体，特异性结合人PD-L1(见例如美国专利号8,217,149和WO 2013/019906)。MPDL3280A含有重链可变结构域(VH)及轻链可变结构域(VL)，VH具有SEQ ID NO:463所示氨基酸序列，VL具有SEQ ID NO:464所示氨基酸序列。全长抗体含有SEQ ID NO:477或479所示氨基酸序列的重链序列及SEQ ID NO:478所示氨基酸序列的轻链序列。据报道全长抗体还含有SEQ ID NO:461所示的重链氨基酸序列及SEQ ID NO:462所示的轻链序列(见WO2013019906)。重链的互补决定区(CDR)包括VH CDR 1(SEQ ID NO:465所示)、VH CDR 2(SEQID NO:466所示)和VH CDR 3(SEQ ID NO:467所示)。轻链的CDR包括VL CDR 1(SEQ ID NO:468所示)、VL CDR 2(SEQ ID NO:469所示)和VL CDR 3(SEQ ID NO:470所示)。当重组产生时，MPDL3280A由四条多肽链组成，两条相同重链和两条相同κ轻链。每对重链和轻链通过链间二硫键连接。
在另一实例中，用于本发明提供的组合治疗中的抗-PD-L1抗体可包括MEDI4736或其衍生物，如MEDI4736的变体或抗原结合片段。MEDI4736是完全人IgG1κ单克隆抗体，特异性结合人PD-L1(见例如在美国专利公开号2013/0034559称作2.7A4OPT的抗体)。MEDI4736的重链具有可变结构域(VH)，其具有SEQ ID NO:452所示氨基酸序列，由SEQ ID NO:451所示核苷酸序列编码。重链的互补决定区(CDR)包括VH CDR 1(SEQ ID NO:455所示)、VH CDR2(SEQ ID NO:456所示)和VH CDR 3(SEQ ID NO:457所示)。MEDI4736的轻链具有可变结构域(VL)，其具有SEQ ID NO:454所示氨基酸序列，由SEQ ID NO:453所示核苷酸序列编码。轻链的CDR包括VL CDR 1(SEQ ID NO:458所示)、VL CDR 2(SEQ ID NO:459所示)和VL CDR 3(SEQ ID NO:460所示)。当重组产生时，MEDI4736由四条多肽链组成，两条相同的重链和两条相同的κ轻链。每对重链和轻链通过链间二硫键连接。
本发明提供的组合治疗中的抗-PD-L1抗体还可包括BMS-936559、MPDL3280A和MEDI4736的变体或其包含变化的抗原结合片段，其中变体抗体免疫特异性结合PD-L1。所述变化可以是例如氨基酸置换、插入或缺失氨基酸。
b.其它免疫调节剂
在一些实例中，本发明提供的任何ADA2，包括其野生型、变体和修饰形式，与一或多种免疫调节剂一起给予。这种物质可增加或降低一或多种细胞因子的产生、上调或下调自身抗原呈递、掩蔽MHC抗原，或者促进一或多种类型免疫细胞的增殖、分化、迁移或激活状态。举例的免疫调节剂包括但不限于非类固醇抗炎药物(NSAID)，如阿司匹林、布洛芬、塞来考昔、双氯芬酸、依托度酸、非诺洛芬、吲哚美辛、酮咯酸、奥沙普秦、萘丁美酮、舒林酸、托美汀、罗非昔布、萘普生、酮洛芬和萘丁美酮；类固醇(例如糖皮质激素、地塞米松、可的松、羟化可的松(hydroxycortisone)、甲泼尼龙、泼尼松、泼尼松龙、曲安西龙、类花生酸柳氮磺吡啶(azulfidine eicosanoids)如前列腺素、凝血噁烷及白细胞三烯；以及局部用类固醇如地蒽酚、卡泊三烯、氯倍他索和他扎罗汀)；细胞因子如TGFb、IFNa、IFNb、IFNg、IL-2、IL4、IL-10；细胞因子、趋化因子或者受体拮抗剂，包括抗体、可溶受体，及针对BAFF的受体-Fc融合体、B7、CCR2、CCR5、CD2、CD3、CD4、CD6、CD7、CD8、CD11、CD14、CD15、CD17、CD18、CD20、CD23、CD28、CD40、CD40L、CD44、CD45、CD52、CD64、CD80、CD86、CD147、CD152、补体因子(C5、D)CTLA4、嗜酸细胞活化趋化因子(eotaxin)、Fas、ICAM、ICOS、IFNα、IFNβ、IFNγ、IFNAR、IgE、IL-1、IL-2、IL-2R、IL-4、IL-5R、IL-6、IL-8、IL-9IL-12、IL-13、IL-13R1、IL-15、IL-18R、IL-23、整联蛋白、LFA-1、LFA-3、MHC、选择蛋白、TGFβ、TNFα、TNFβ、TNF-R1、T细胞受体，包括(依那西普)、(阿达木单抗)和(英利昔单抗)；异源抗淋巴细胞球蛋白；其它免疫调节分子如2-氨基-6-芳基-5取代的嘧啶，MHC结合肽和MHC片段的抗独特型抗体，咪唑硫嘌呤、布喹那、溴麦角环肽、环磷酰胺、环孢霉素A、D-青霉胺、脱氧精胍菌素、FK506、戊二醛、金、羟氯喹、来氟米特、丙二腈酰胺(例如来氟米特)、甲氨蝶呤、米诺环素、咪唑立宾、麦考酚酸吗乙酯、雷帕霉素和柳氮磺胺吡啶。
在一些实例中，本发明提供的任何ADA2，包括其野生型、变体和修饰形式，与一或多种细胞因子一起给予。举例的细胞因子包括但不限于淋巴因子、单核因子和传统的多肽激素。细胞因子包括生长激素如人生长激素、N-甲硫氨酰基人生长激素和牛生长激素；甲状旁腺激素；甲状腺素；胰岛素；胰岛素原；松弛素；松弛素原；糖蛋白激素如卵泡刺激激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)及促黄体激素(LH)；肝生长因子；成纤维细胞生长因子；催乳素；胎盘催乳激素；肿瘤坏死因子α和β；副中肾管抑制物质；小鼠促性腺素关连肽；抑制素；激活素；血管内皮生长因子；整联蛋白；血小板生成素(TPO)；神经生长因子如NGF-β；血小板生长因子；转化生长因子(TGF)如TGF-α和TGF-β；胰岛素样生长因子-I和-II；红细胞生成素(EPO)；骨诱导因子；干扰素如干扰素-α、β和γ；集落刺激因子(CSF)如巨噬细胞-CSF(M-CSF)；粒细胞-巨噬细胞-CSF(GM-CSF)；及粒细胞-CSF(G-CSF)；白细胞介素(IL)如IL-1、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12；IL-15，肿瘤坏死因子如TNF-α或TNF-β；及其它多肽因子包括LIF和kit配体(KL)。
除了靶向和抑制免疫检查点蛋白的抑制性抗体之外，预期能通过结合其靶蛋白/受体刺激免疫应答的激动性抗体用于本发明提供的组合、方法和应用中。例如，Urelumab(也称作BMS-663513和抗-4-1BB)是靶向CD137共受体(其是受体的肿瘤坏死因子(TNF)/神经生长因子(NGF)家族成员及在树突细胞、滤泡树突细胞、天然杀伤细胞、粒细胞和炎症部位血管壁细胞上表达，具有免疫刺激性质)的激动性人源化单克隆抗体。Urelumab特异性结合并激活表达CD137-的免疫细胞，刺激免疫应答，特别是细胞毒性T细胞应答，当其作为本发明提供的组合治疗的一部分给予时可以对抗肿瘤细胞(见例如Vinay et al.,(2012)MolCancer Ther.11(5):1062-1070)。其它4-1BB激动剂也可以包含在本发明提供的组合中，如Snell et al.in Immunol Rev.244:197–217(2011)所述的任何激动剂。OX40(也称作CD134)是TNF家族的另一种免疫刺激受体，其可以通过在本发明提供的组合中掺入OX40激动剂而靶向，如Weinberg et al.in Immunol Rev.244(1):218-231(2011)所述的那些激动剂。本领域也已经描述了结合并刺激4-1BB或OX40信号传导的适体配体(Gilboa et al.,Clin Cancer Res.19(5):1054-1062)并预期包含在本发明提供的组合治疗中。
在一些实例中，本发明提供的任何ADA2，包括其野生型、变体和修饰形式，与刺激免疫系统细胞并增强希望的效应子功能的一或多种细胞因子或其它物质一起给予。例如，刺激NK细胞的物质，包括但不限于IL-2，可与本发明提供的任何ADA2一起给予。在另一实施方案中，刺激巨噬细胞的物质，包括但不限于C5a、甲酰肽如N-甲酰-甲硫氨酰基-亮氨酰-苯丙氨酸(Beigier-Bompadre et.al.(2003)Scand.J.Immunol.57:221-8)可以与本发明提供的任何ADA2一起给予。而且，刺激中性粒细胞的物质，包括但不限于G-CSF和GM-CSF，可以与本发明提供的任何ADA2一起给予。此外，促进这种免疫刺激性细胞因子迁移的物质可以与本发明提供的任何ADA2一起给予。而且，另外的物质，包括但不限于干扰素γ、IL-3和IL-7可促进一或多种效应子功能。在一些实例中，本发明提供的任何ADA2与一或多种细胞因子或者抑制效应细胞功能的其它物质一起给予。
c.透明质酸降解酶
本发明提供的组合治疗，包括其组合、方法和应用，除了本发明提供的ADA2之外可含有抗透明质酸剂，如可溶透明质酸降解酶。透明质酸降解酶是催化透明质酸水解的酶，且可以暂时降解透明质酸。透明质酸是胞外基质的一种成分及是间质屏障的一种主要组成成分。透明质酸降解酶通过裂解透明质酸聚合物(其由重复二糖单位D-葡萄糖醛酸(GlcA)和N-乙酰-D-葡萄糖胺(GlcNAc)组成，通过交替的β-1→4和β-1→3糖苷键连接在一起)而降解透明质酸。透明质酸链的长度可达到大约25,000个二糖重复或更多，透明质酸聚合物在体内的大小可以是大约5,000-20,000,000Da。通过催化透明质酸(间质屏障的一种主要成分)水解，透明质酸降解酶降低透明质酸的粘度，从而增加组织通透性。如此，透明质酸降解酶如透明质酸酶已经用于用作例如传播或分散剂，联合其它物质、药物和蛋白质以增强其分散和输送。
某些疾病也与透明质酸的表达和/或产生相关，包括炎症性疾病与癌症。HA与多种生物过程包括这种疾病的进展相关(见例如Itano et al.(2008)Semin Cancer Biol 18(4):268-274；Tammi et al.(2008)Semin Cancer Biol18(4):288-295)。例如，HA与肿瘤进展的生物过程相关，包括上皮-间充质转变及p53肿瘤抑制物途径。HA也参与在疾病组织如肿瘤中增加的水吸收和组织间隙液压(IFP)，从而导致压缩的肿瘤血管结构。例如，在炎症部位或者肿瘤病灶，具有透明质酸、其它基质成分和水的快速积聚。由于这种快速积聚，患病部位不能与其环境平衡，因此具有比正常组织更高的组织间隙液压。
用透明质酸降解酶如聚合物缀合的可溶透明质酸酶(例如PEGPH20)处理可降解积聚组织和细胞包括肿瘤细胞上的HA。这种处理可降低透明质酸，由此组织紧缩、血管扩展，更多的血液流过这个部位。因此，用透明质酸降解酶如可溶透明质酸酶或者聚合物缀合的可溶透明质酸酶(例如PEGPH20)处理可以在所述组织部位减小组织间隙液压(IFP)和水含量及相关增加的血管灌注，从而治疗透明质酸相关疾病和状况，如肿瘤和癌症。因此，用于本发明提供的组合、应用和方法中的透明质酸降解酶包括具有催化透明质酸二糖链或聚合物裂解的能力的任何酶。
透明质酸降解酶包括透明质酸酶以及其它酶如软骨素酶和具有裂解透明质酸的能力的裂解酶。透明质酸酶是透明质酸降解酶大家族成员。有三种一般类别的透明质酸酶：哺乳动物类型透明质酸酶、细菌透明质酸酶及来自水蛭、其它寄生物和甲壳类动物的透明质酸酶。哺乳动物类型透明质酸酶(EC 3.2.1.35)是内-β-N-乙酰-己糖胺酶，其水解透明质酸的β-1→4糖苷键为各种寡糖长度如四糖和己糖。这些酶具有水解和转糖苷酶活性，可以降解透明质酸和硫酸软骨素(CS)，通常为C4-S和C6-S。在人基因组中已经鉴别了五种透明质酸酶样基因：PH20(或SPAM1)、HYAL1、HYAL2、HYAL3、HYAL4和HYALP1。
哺乳动物透明质酸酶可以进一步细分为中性活性的、主要在睾丸提取物中发现的及酸性活性的、主要在器官如肝脏中发现的那些。HYALP1是假基因，HYAL3未示出具有对于任何已知底物的酶活性。HYAL4是软骨素酶，对于透明质酸几乎不呈现活性。HYAL1是典型酸活性酶，PH20(SEQ ID NO:551所示前体多肽及SEQ ID NO:480所示成熟多肽)是典型的中性活性酶。酸活性透明质酸酶如HYAL1和HYAL2通常在中性pH(即pH 7)缺少催化活性。例如，HYAL1在体外在高于pH 4.5几乎不具有催化活性(Frost et al.(1997)Anal.Biochem.251:263-269)。HYAL2是酸活性酶，在体外具有极低特异性活性。透明质酸酶样酶也可以鉴定为是通常通过糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚附着于浆膜的那些酶，如人HYAL2和人PH20(Danilkovitch-Miagkova et al.(2003)Proc Natl Acad Sci USA 100(8):4580-4585)，及通常是可溶的那些酶如人HYAL1(Frost et al.(1997)Biochem Biophys ResCommun.236(1):10-15)。许多透明质酸酶也是糖基化的，需要糖基化以发挥活性。例如，人PH20含有六个N-连接的糖基化位点，在SEQ ID NO:551所示多肽的N82、N166、N235、N254、N368、N393和S490。
PH20是天然参与精子-卵粘附并且通过消化透明质酸帮助精子穿透卵丘细胞层。PH20位于精子表面，及在溶酶体衍生的顶体中，在此其结合顶体内膜。人PH20mRNA转录物通常被翻译产生509个氨基酸的前体多肽(SEQ ID NO:551)，其在N末端含有35个氨基酸的信号序列(氨基酸残基位置1-35)及在C末端含有19个氨基酸的糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚附着信号序列(氨基酸残基位置491-509)。因此成熟PH20是SEQ ID NO:480所示的474个氨基酸的多肽。在前体多肽转运至ER及除去信号肽之后，C末端GPI-附着信号肽被裂解以促进GPI锚与在相应于SEQ ID NO:551所示前体多肽的位置490的氨基酸位置新形成的C末端氨基酸的共价附着。相反，在除了人之外的许多其它PH20种类中未预测到清晰的GPI锚。因此，从绵羊和牛中产生的PH20多肽天然以可溶形式存在。尽管牛PH20以极为松散地附着于浆膜存在，但是其不是通过磷脂酸敏感的锚附着的(Lalancette et al.(2001)Biol Reprod.65(2):628-636)。牛透明质酸酶的这种独特特征允许可溶牛睾丸透明质酸酶作为提取物可用于临床应用
因此，透明质酸降解酶以膜结合的或从细胞中分泌的可溶形式存在。透明质酸降解酶可以制成可溶形式以在细胞中表达及从中分泌。例如，在透明质酸降解酶包括糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚和/或另外是膜锚定或不溶的情况中，通过截短或者缺失所有或部分GPI锚以使得所述酶分泌和可溶，由此提供可溶形式的透明质酸降解酶。可溶的透明质酸降解酶可用于本发明提供的组合治疗方法中。因此，透明质酸降解酶包括截短变体，例如截短以除去全部或部分GPI锚。举例的这种可溶透明质酸酶包括可溶PH20透明质酸酶，如美国专利号7,767,429、美国专利公开号US20040268425、US20100143457或者US20130302275所示任何酶，也见SEQ ID NO:481-488、493-514或者526-532任一所示的举例的可溶人PH20透明质酸酶。
已经制备并批准在对象包括人中用于治疗性应用的多种形式透明质酸降解酶，包括透明质酸酶。例如，衍生自动物的透明质酸酶制备物包括(ISTAPharmaceuticals)，这是一种纯化的绵羊睾丸透明质酸酶；(AmphastarPharmaceuticals)，这是一种牛睾丸透明质酸酶；及HydaseTM(Prima Pharm Inc.)，这是一种牛睾丸透明质酸酶。(Halozyme Therapeutics)是一种人重组透明质酸酶，称作rHuPH20，由遗传工程化的含有编码可溶形式PH20的核酸的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞产生(见例如美国专利公开号US20040268425；美国专利号7,767,429)。应理解任何透明质酸酶制备物均可用于本发明提供的组合治疗方法中(见例如美国专利号2,488,564、2,488,565、2,676,139、2,795,529、2,806,815、2,808,362、5,747,027和5,827,721及国际PCT公开号WO2005/118799；美国专利公开号US20040268425；美国专利号7,767,429；或者任何如本发明提供的)。
本发明描述了透明质酸降解酶的非限制性实例，如透明质酸酶或者可溶透明质酸酶，例如PH20，用于本发明提供的组合和方法中。通常，这种透明质酸降解酶包括与聚合物缀合的那些酶。透明质酸降解酶，如透明质酸酶，可以例如是人来源、哺乳动物来源、细菌来源或者其它生物来源。在其它实例中，透明质酸降解酶可以通过例如与聚合物缀合而修饰。
可溶透明质酸降解酶(例如可溶PH20)
特别地，本发明提供了一种组合治疗方法和组合物，其包含本发明提供的任何ADA2蛋白如任何变体ADA2蛋白及可溶透明质酸降解酶，如可溶透明质酸酶(例如可溶PH20)。可溶透明质酸降解酶包括在表达时从细胞(例如CHO细胞)分泌的且以可溶形式存在的任何透明质酸降解酶。这种酶包括但不限于可溶透明质酸酶，包括非人可溶透明质酸酶，包括非人动物可溶透明质酸酶，细菌可溶透明质酸酶和人透明质酸酶。Hyal1，牛PH20和绵羊PH20，其等位基因变体及其它变体。例如，可溶透明质酸降解酶包括已经修饰为可溶的任何透明质酸降解酶。例如，含有GPI锚的透明质酸降解酶通过截短和除去所有或部分GPI锚可以使其可溶。在一个实例中，人透明质酸酶PH20，通常通过GPI锚与膜锚定，可以通过截短及除去在C末端的所有或部分GPI锚而使其可溶。
可溶透明质酸降解酶还包括中性活性的和酸性活性的透明质酸酶。根据例如但不限于在给予后希望的酶活性水平和/或给予部位等因素，可以选择中性活性和酸性活性的透明质酸酶。在特定的实例中，透明质酸降解酶是可溶中性活性透明质酸酶，如可溶PH20多肽。
可溶PH20多肽可以是绵羊PH20、牛PH20或者C末端截短的并缺少全部或部分GPI锚附着序列的可溶PH20。例如，举例的可溶透明质酸酶是来自任何物种的PH20或者其缺少所有或部分C末端GPI锚的截短形式，只要所述透明质酸酶是可溶的(在表达时分泌的)且保留透明质酸酶活性即可。在一些情况中，可溶透明质酸降解酶如可溶PH20通常是GPI锚定的(例如人PH20)及通过在C末端截短而是可溶的。这种截短可以除去全部GPI锚附着信号序列，或者可以除去仅一些GPI锚附着信号序列。例如，可以除去多达2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45或者更多个C末端氨基酸残基。然而，所得多肽是可溶的。在其中可溶透明质酸降解酶如可溶PH20保留一部分GPI锚附着信号序列的情况中，GPI锚附着信号序列中多达1、2、3、4、5、6、7、8、9或更多个氨基酸残基可以保留，只要多肽是可溶的。本领域技术人员使用本领域熟知的方法可确定多肽是否是GPI锚定的。这种方法包括但不限于使用已知算法预测GPI-锚附着信号序列和ω位点的存在和位置，及在用磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C(PI-PLC)或D(PI-PLD)消化之前和之后进行溶解性分析。
典型地，可溶透明质酸降解酶如可溶PH20是人可溶PH20。尽管可以利用来自其它动物的透明质酸降解酶如PH20，但是这种制备物是潜在免疫原性的，因为其是动物蛋白。例如，相当一部分的患者证实在继发于摄取食物的在先致敏，由于这些食物是动物蛋白，因此所有患者均具有随后致敏的危险。因此，非人制备物也许不适于长期使用。如果需要非人制备物，预期这种多肽可以制备为已经降低免疫原性。这种修饰为本领域技术人员已知，可包括例如除去和/或置换分子上的一或多个抗原性表位。
举例的可溶透明质酸酶是可溶人PH20。可溶形式的重组人PH20已经产生且为本领域已知。这种可溶形式PH20的产生在美国公开的专利申请号US20040268425、US20050260186、US20060104968、US20100143457及国际PCT申请号WO2009111066中描述。这些多肽包括可溶PH20多肽，其完全缺少全部或部分GPI-锚附着信号序列。例如，可溶PH20(esPH20)多肽可含有GPI锚的至少一个氨基酸或者可以缺少GPI锚的所有氨基酸残基。因此，代替具有GPI-锚共价附着于ER中蛋白质的C末端及锚定于浆膜的外片，这些多肽是分泌的及是可溶的。C末端截短的PH20多肽与全长野生型多肽如具有所示SEQ ID NO:480所示序列的全长野生型多肽相比可以是C末端截短1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60或更多个氨基酸，或者其等位基因变体或种变体或者其它变体。
可溶形式的人PH20通常包括含有SEQ ID NO:551所示氨基酸36-464的那些多肽。例如，可溶形式包括但不限于SEQ ID NO:551所示人PH20的、具有SEQ ID NO:551所示氨基酸序列的C末端氨基酸残基465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499或500的C末端截短多肽，其成熟形式，或者与其呈现至少85％相同性的多肽。例如，当在哺乳动物细胞中表达时，35个氨基酸的N末端信号序列在加工期间被裂解，产生蛋白质的成熟形式且可被分泌。因此，成熟可溶多肽含有SEQ ID NO:441的氨基酸36-464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499或500。表6提供了举例的C末端截短的可溶PH20多肽的非限制性实例，包括其前体和成熟形式。在下表6中，提供了前体和成熟多肽的长度(氨基酸)及序列标识符(SEQ ID NO)，其中示出了举例的C末端截短的PH20蛋白质的前体和成熟多肽的氨基酸序列。野生型PH20多肽也包含于表6中用于对比。
例如，用于本发明提供的组合中的可溶形式PH20包括例如多肽，其具有SEQ IDNO:481-488、493-514或526-532任一所示氨基酸序列，或者与SEQ ID NO:481-488、493-514或526-532任一所示氨基酸序列呈现至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列相同性的氨基酸序列，且是可溶的及保留透明质酸酶活性。氨基酸变体包括保守和非保守突变。应理解对于透明质酸酶活性重要的或者另外需要的残基，如上文描述或者本领域技术人员已知的任何残基，通常是不变的及不可改变。这些残基包括例如活性位点残基。因此，例如，人PH20多肽或其可溶形式的氨基酸残基111、113和176(相应于SEQ ID NO:551所示成熟PH20多肽中的残基)通常是不变的且不改变。赋予为了正确折叠需要的糖基化和二硫键形成的其它残基也可以是不变的。
特别地，可溶人PH20多肽是在SEQ ID NO:551所示序列的氨基酸482之后截短的多肽。这种多肽可以从含有信号序列和编码氨基酸36-482的核酸分子产生。信号序列可以是能加工蛋白质用于分泌的天然信号序列、IgGκ信号序列或者其它信号序列。翻译后加工除去信号序列，剩下474个氨基酸的可溶重组人PH20(SEQ ID NO:480)。表达时产生的产物导致在培养基中分泌的产物，称作rHuPH20，其呈现出在C末端的异质性，由此产物包括可包含不同丰度的任一或多个SEQ ID NOS:481-486所示的种类混合物。典型地，rHuPH20在促进正确N-糖基化以保留活性的细胞中产生，如哺乳动物细胞例如CHO细胞(例如DG44CHO细胞)。(Halozyme)是由遗传工程化的含有编码截短的人PH20多肽(称作rHuPH20)的核酸的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞产生的人重组透明质酸酶。
本领域已知PH20变体如人PH20(例如可溶人PH20)，在美国公开申请号US2013/0302275中描述。在美国公开申请号US2013/0302275中描述的任何PH20变体均可掺入可溶PH20多肽中以用于本发明提供的组合中。这种变体包括对于变性条件(例如酚类防腐剂)呈现增加的抗性或者呈现增加的活性的那些变体。这种多肽的一个实例是可溶人PH20，参照SEQ ID NO:480所示全长人PH20所示氨基酸序列或者在SEQ ID NO:481-488、493-514或526-532任一所示的可溶人PH20的氨基酸序列，其含有氨基酸置换F204P、V58K或V58R。
通常，可溶形式的PH20使用蛋白质表达系统产生，其促进正确N-糖基化以保证多肽保留活性，因为糖基化对于透明质酸酶的催化活性和稳定性是重要的。这种细胞包括例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞(例如DG44CHO细胞)。
本发明提供的组合中的透明质酸降解酶，包括透明质酸酶(例如PH20)，可以重组产生或者可以纯化或部分纯化自天然来源，如来自睾丸提取物。产生重组蛋白包括重组透明质酸降解酶的方法在本发明别处提供且为本领域熟知。
透明质酸降解酶可以延长半衰期的形式给予。例如，透明质酸降解酶可以作为脂质体或者多细胞层小泡或其他这种输送载体的一部分提供(见例如本发明实施例24)。透明质酸降解酶可以在载体中编码，如溶瘤细胞载体或者靶向输送载体。
本发明的组合中提供的透明质酸降解酶如可溶透明质酸酶(例如可溶PH20多肽)可以被聚合物修饰。在一些实例中，所述聚合物是聚亚烷基二醇、葡聚糖、支链淀粉或者纤维素。聚亚烷基二醇聚合物可以修饰透明质酸降解酶，其包括聚乙二醇(PEG)和甲氧基聚乙二醇(mPEG)。在透明质酸降解酶由PEG修饰的情况中，PEG可以是分支的或者线性的。在一些实施方案中，聚合物可以通过与如下反应而产生：甲氧基-聚乙二醇-琥珀酰亚胺丁酸酯(mPEG-SBA)(5kDa)；甲氧基-聚乙二醇-琥珀酰亚胺丁酸酯(mPEG-SBA)(20kDa)；甲氧基-聚乙二醇-琥珀酰亚胺丁酸酯(mPEG-SBA)(30kDa)；甲氧基-聚乙二醇-琥珀酰亚胺α-甲基丁酸酯(mPEG-SMB)(20kDa)；甲氧基-聚乙二醇-琥珀酰亚胺α-甲基丁酸酯(mPEG-SMB)(30kDa)；甲氧基-聚乙二醇-丁醛(mPEG-丁醛)(30kDa)，甲氧基-聚乙二醇-琥珀酰亚胺丙酸酯(mPEG-SPA)(20kDa)；甲氧基-聚乙二醇-琥珀酰亚胺丙酸酯(mPEG-SPA)(30kDa)；(甲氧基-聚乙二醇)2-N-羟基琥珀酰亚胺酯(mPEG2-NHS)(10kDa分支的)；(甲氧基-聚乙二醇)2-N-羟基琥珀酰亚胺酯(mPEG2-NHS)(20kDa分支的)；(甲氧基-聚乙二醇)2-N-羟基琥珀酰亚胺酯(mPEG2-NHS)(40kDa分支的)；(甲氧基-聚乙二醇)2-N-羟基琥珀酰亚胺酯(mPEG2-NHS)(60kDa分支的)；生物素-聚乙二醇-N-羟基琥珀酰亚胺酯(生物素-PEG-NHS)(5kDa生物素化的)；聚乙二醇-对-硝基苯基碳酸酯(PEG-对-硝基苯基-碳酸酯)(30kDa)或者聚乙二醇-丙醛(PEG-丙醛)(30kDa)。在一些实施方案中，聚合物可以是分子量为30kD或大约30kD的PEG。
d.治疗感染性疾病的抗体
在一些实例中，本发明提供的任何ADA2如其野生型、变体和修饰形式与一或多种抗体或抗体片段一起给予以治疗感染性疾病。可以共同给予以治疗感染性疾病的抗体例如包括但不限于抗炭疽抗体如ABthrax，抗CMV抗体如CytoGam和司韦单抗，抗隐孢子虫抗体如CryptoGAM、Sporidin-G，抗螺杆菌抗体如Pyloran，抗乙型肝炎病毒抗体如HepeX-B、Nabi-HB，抗HIV抗体如HRG-214，抗RSV抗体如非维珠单抗、HNK-20、帕利珠单抗、RespiGam，及抗葡萄球菌抗体如Aurexis、Aurograb、BSYX-A110和SE-Mab。
e.抗生素和抗真菌剂
在一些实例中，本发明提供的任何ADA2，包括其野生型、变体和修饰形式，与一或多种抗生素一起给予，包括但不限于：氨基糖苷类抗生素(例如安普霉素、阿贝卡星、班贝霉素、布替罗星、地贝卡星、庆大霉素、卡那霉素、新霉素、奈替米星、巴龙霉素、核糖霉素、西索米星、壮观霉素)；氨基环多醇类(例如壮观霉素)；氯霉素类抗生素(例如叠氮氯霉素、氯霉素、氟苯尼考和甲砜霉素)、安沙霉素类抗生素(例如利福米特和利福平)、碳青霉烯类抗生素(例如亚胺培南、美罗培南、帕尼培南)；头孢菌素类(例如头孢克洛、头孢羟氨苄、头孢孟多、头孢曲嗪、头孢西酮、头孢唑兰、头孢咪唑、头孢匹胺、头孢匹罗、头孢丙烯、头孢呋辛、头孢克肟、头孢氨苄、头孢拉定)、头霉素类(头孢拉宗、头孢西丁、头孢米诺、头孢美唑和头孢替坦)；林可胺类(例如克林霉素、林可霉素)；大环内酯类(例如阿奇霉素、布雷菲德菌素A、克拉霉素、红霉素、罗红霉素、妥布霉素)、单菌胺类(例如氨曲南、卡卢莫南和替吉莫南)；莫匹罗星；氧头孢烯类(例如氟氧头孢、拉氧头孢(latamoxef)和拉氧头孢(moxalactam))；青霉素(例如阿德诺西林、匹美西林、阿莫西林、巴氨西林、苄基青霉酸、青霉素钠、依匹西林、芬贝西林、氟氯西林、培那西林、氢碘酸喷沙西林)、苯明青霉素O(penicillin o-benethamine)、青霉素O、青霉素V、苯甲酸青霉素V(penicillin V benzoate)、哈胺青霉素V、青哌环素和苯氧乙基青霉素钾)；多肽类(例如杆菌肽、粘菌素、多粘菌素B、替考拉宁、万古霉素)；喹诺酮类(氨氟沙星、西诺沙星、环丙沙星、依诺沙星、恩氟沙星、氟罗沙星、氟甲喹、加替沙星、吉米沙星、格帕沙星、洛美沙星、莫西沙星、萘啶酸、诺氟沙星、氧氟沙星、奥索利酸、培氟沙星、吡哌酸、罗索沙星、芦氟沙星、司帕沙星、替马沙星、托氟沙星和曲伐沙星)；利福平；链阳性菌素类(奎奴普丁、达福普汀)；氨笨磺胺类(磺胺、磺胺甲噁唑)；四环素类(金霉素、盐酸去甲金霉素、去甲金霉素、多西环素、耐久霉素、米诺环素、新霉素、土霉素、链霉素、四环素和万古霉素)。
在一些实例中，本发明提供的任何ADA2，包括其野生型、变体和修饰形式，与一或多种抗真菌剂一起给予，包括但不限于两性霉素B、环吡酮、克霉唑、益康唑、氟康唑、氟胞嘧啶、伊曲康唑、酮康唑、咪康唑、制霉菌素、特比萘芬、特康唑和噻康唑。在一些实例中，本发明提供的ADA2与一或多种抗病毒剂一起给予，包括但不限于蛋白酶抑制剂、逆转录酶抑制剂等，包括I型干扰素、病毒融合抑制剂、神经氨酸酶抑制剂、阿昔洛韦、阿德福韦、金刚烷胺、氨普那韦、克来夫定、恩夫韦肽、恩替卡韦、膦甲酸、更昔洛韦、碘苷、茚地那韦、洛匹那韦、普来可那立、利巴韦林、金刚乙胺、利托那韦、沙奎那韦、曲氟尿苷、阿糖腺苷和齐多夫定。
I.实施例
如下实施例只是例证本发明而无限制本发明范围之意。
实施例1：人腺苷脱氨酶2(ADA2)的克隆及ADA2变体的产生
A.野生型(WT)ADA2的克隆
野生型人腺苷脱氨酶(ADA2)基因包括其信号序列(SEQ ID NO:1所示核酸序列；编码SEQ ID NO:2所示氨基酸序列(前体))在pCMV-Script载体的ScaI和XhoI限制位点之间扩增和克隆(Agilent Technologies,Santa Clara,CA；Cat.No.212220；SEQ ID NO:6所示序列)。在编码序列的C末端，终止密码子由编码FLAGTM标签(SEQ ID NO:8所示核酸序列；编码SEQ ID NO:9所示氨基酸序列)和终止密码子的核酸序列置换，以进行蛋白质纯化和/或检测。所得构建体pCMV-Script-hADA2-FLAG编码野生型重组人ADA2-FLAG多肽(SEQ ID NO:7所示氨基酸序列)。
B.ADA2变体的产生
将上述编码WT rHuADA2的所得构建体用于导入位点特异性氨基酸取代以产生ADA2变体。如下文章节所述，位点特异性氨基酸取代基于ADA2的建模研究产生，以鉴别表示参与肝素结合、催化活性和/或减弱ADA2与ADA2结合的任何其它受体之间蛋白质-蛋白质相互作用的残基。每个产生的ADA2变体使用QuikChange Lightning Multi Site-DirectedMutagenesis Kit(Agilent Technologies,Santa Clara,CA；Cat.No.210514)根据厂商指导通过位点特异性取代从上述pCMV-Script-hADA2-FLAG载体产生。
产生的变体在下表7-12中示出。变体根据Zavialov编号命名，采用在PDB登录号3LGG和3LGD中使用的编号(用于SEQ ID NO:4所示晶体结构的多肽的氨基酸序列；基于Zavialov et al.,J.Biol.Chem.285:12367-12377(2010))，及根据成熟ADA2编号命名，基于SEQ ID NO:5所示成熟人ADA2氨基酸序列(基于Uniprot登录号Q9NZK5；前体氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，含有氨基酸残基1-29的信号序列)。表1示出Zavialov编号(SEQ IDNO:4)与成熟ADA2编号(SEQ ID NO:5)的相应位置编号。
a.具有改变的肝素结合的候选变体
肝素是天然糖胺聚糖，广泛存在于机体组织表面。已知ADA2和肝素物理性相互作用(Zavialov et al.,J.Biol.Chem.285:12367-12377(2010)),与肝素结合可以耗尽循环水平的给予的ADA2。为产生具有改良的药代动力学的ADA2变体，基于建模研究，进行本文鉴定的参与肝素结合的残基置换。两个可获得的人ADA2晶体结构，如Zavialov et al.,J.Biol.Chem.285:12367-12377(2010)所述，用于鉴定用于诱变的候选位置：缺少结合的肝素并自果蝇细胞表达的ADA2的晶体结构(RCSB Protein Data Bank(PDB)No.3LGG；结合过渡态类似物肋间型霉素的人ADA2)；和apo形式的人ADA2(Protein Data Bank登录号3LGD；不具有任何辅因子或结合物质的空酶)。由所述晶体结构，计算静电表面电位以鉴定ADA2上具有正静电电位的表面，使用开源3D分子可视化软件包PyMOL。具有正静电电位的表面可以与高度荷负电的硫酸肝素形成互补静电相互作用。从静电表面电位计算，鉴别一系列赖氨酸和精氨酸残基作为用氨基酸丙氨酸(置换具有亚甲基基团的荷正电的赖氨酸或精氨酸侧链，不影响蛋白质phi-psi角)、天冬氨酸或谷氨酸(两种已知荷负电的氨基酸)取代的候选位点，以在肝素与ADA2变体之间产生电荷排斥。
基于建模，靶向根据Zavialov编号的氨基酸残基14、16、23、29、220、261、280、286、312、320、324、369、374、375、444、447、455、464、472或473(分别相应于成熟编号的残基11、13、20、26、217、258、277、283、309、317、321、352、366、371、372、441、444、452、461、469或470)进行诱变。ADA2变体通过在所述位置的氨基酸置换为丙氨酸、天冬氨酸或谷氨酸的氨基酸置换产生。也产生单一氨基酸置换以及双重或者三重氨基酸置换。表7示出了在举例的候选变体中的氨基酸置换。实施例7描述了评定选择如表7所示候选变体的肝素结合与腺苷脱氨酶活性的研究。
b.候选活性位点(AS)变体
为了产生具有改良的催化效力的ADA2变体，通过置换基于分子建模研究鉴别的活性位点中的氨基酸残基产生候选变体。使用开源3D分子建模程序PyMol，观测如上所述结合过渡态类似物肋间型霉素(Protein Data Bank登录号3LGG)及是apo形式(Protein DataBank登录号3LGD)的人ADA2的晶体结构。使用PyMol进行电脑模拟(in silico)定向诱变以评估导入的氨基酸侧链对活性位点内腺苷或邻近残基的填充，评定对活性位点邻近或者活性口袋裂口(pocket cleft)的残基的填充，测量导入残基的空间冲突的距离和潜力，评定活性位点袋的相对凹度的改变，及评定腺苷接近活性位点的潜力。选择的靶向诱变的残基是在本发明中鉴别作为候选的那些残基，其实现对腺苷改良的催化效力(kcat/Km)，从而具有增加的腺苷脱氨酶活性。
基于建模，靶向根据Zavialov编号的氨基酸残基89、182、222、224、265、267、269、270和299(相应于根据成熟编号的残基86、179、219、221、262、264、266、267或296)进行诱变。ADA2变体是通过将在所述位置的氨基酸置换为所有19个其它氨基酸的氨基酸置换产生的。表8示出举例的候选变体的氨基酸置换。实施例10描述了评定选择候选变体的腺苷脱氨酶活性的研究。
c.具有改变的糖基化的候选变体
为产生高糖基化的ADA2变体，通过残基突变(例如插入和/或氨基酸置换)产生候选变体，通过掺入新的N-糖基化位点基序(Asn-Xaa-Ser/Thr)产生N-糖基化位点。表9示出了举例的候选变体的突变。
d.缺少受体结合(PRB)结构域的候选变体
为产生缺少受体结合(PRB)结构域的ADA2变体，缺失残基V102-Q147(成熟编号的V99-Q144)或者C108-T150(成熟编号的C105-T147)并用不同长度的甘氨酸接头置换(例如3、5、7、10或15个；见SEQ ID NO:280)或者不同长度的(GGGGS)n接头置换(例如n＝1、2或3；见SEQ ID NOS:581和582)。表10示出举例的候选变体的突变。
e.在受体结合(PRB)结构域中具有改变的糖基化的候选变体
为破坏ADA2通过受体结合(PRB)与潜在受体的潜在相互作用，通过导入残基突变(例如插入和/或氨基酸置换)产生ADA2候选变体，通过在PRB结构域中掺入新的N-糖基化位点基序(Asn-Xaa-Ser/Thr)产生N-糖基化位点。表11示出举例的候选变体的突变。
f.在受体结合(PRB)结构域与ADA结构域之间具有改变的相互作用的候选变体
为产生在受体结合(PRB)结构域与剩余的ADA2(例如腺苷脱氨酶(ADA)结构域)之间具有改变的相互作用的ADA2变体，在PRB结构域的个别或多个氨基酸中导入突变。基于设计的结构用于鉴别在其三维结构中在ADA2表面上的残基，其可以破坏PRB结构域与ADA2中PRB结构域外其它接触残基相互作用的能力。表12示出举例的候选变体的突变。
实施例2：重组人腺苷脱氨酶2(rHuADA2)及变体的产生
A.瞬时表达
为了瞬时表达野生型ADA2及在实施例1中产生的变体，将300ml的1.0×106细胞/ml CHO-S细胞(Invitrogen,Cat.No.11619-012)用375μg的pCMV-Script-hADA2-FLAG质粒或变体质粒使用FreeStyleTM MAX Reagent(Life Technologies,Carlsbad,CA；Cat.No.16447-500)转染。将转染的细胞生长4天，并通过在100rpm离心10分钟收集培养上清。
收集的上清用于纯化蛋白质，如SEQ ID NO:5所示成熟ADA2或者成熟变体(例如表7-12所述变体)，每种蛋白质均具有FLAG标签。使用抗FLAG M2亲和性树脂(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,Cat.No.A2220)根据厂商指导进行分批纯化。使用FLAGTM肽从树脂洗脱ADA2。洗脱的蛋白质的纯度使用SDS-PAGE和大小排阻层析(SEC)评定。SEC结果证实纯化的蛋白质是二聚体。也进行N末端测序，证实信号序列相应于SEQ ID NO:2的氨基酸残基1-29，由此纯化的成熟蛋白质起始于SEQ ID NO:5所示氨基酸残基IDET。
C.克隆与稳定表达
将野生型人ADA2基因(SEQ ID NO:1所示核酸序列)或者具有C末端FLAGTM标签的变体(SEQ ID NO:8所示核酸序列；编码SEQ ID NO:9所示氨基酸序列)亚克隆进慢病毒表达载体pLV-EF1a-MCS-IRES-GFP-Bsd的多克隆位点(MCS)。所得表达载体pLV-EF1a-hADA2-Flag-IRES-GFP-Bsd(SEQ ID NO:10所示核苷酸序列)用于产生能稳定转染CHO-S细胞的慢病毒。在所述表达载体中，重组人ADA2基因的表达由EF1a启动子驱动。将IRES序列插入在转基因之后，随后是用于通过显微镜鉴别转导的细胞的绿色荧光蛋白(GFP)的cDNA，组合用于选择转导的细胞的杀稻瘟素抗性基因(Bsd)。将Woodchuck肝炎病毒转录后调节元件(WPRE)插入在GFP-Bsd序列之后以增强基因表达。
如ViraPowerTM(Invitrogen,Carlsbad,CA)厂商指导手册所述，构建的慢病毒表达载体pLV-EF1a-hADA2-Flag-IRES-GFP-Bsd用于产生慢病毒。简而言之，将293FT细胞以6×106细胞铺板于10cm组织培养平板。24小时后，9μg的ViraPowerTM Packaging Mix(含有在TE缓冲液pH 8.0中的1μg/μl的pLP1、pLP2和pLP/VSVG质粒的混合物，厂商提供)和3μg的pLV-EF1a-hADA2-Flag-IRES-GFP-Bsd慢病毒表达质粒在1.5mL的Opti-MEM(LifeTechnologies)培养基中混合。将36μL的LipofectamineTM 2000(LF2000；LifeTechnologies,Carlsbad,CA)在1.5mL Opti-MEM(Life Technologies)中稀释。轻轻混合DNA与LF2000，在室温保温20分钟，使得DNA与脂质形成复合物。在此期间，将过夜培养基用无抗生素的5.0mL Opti-MEM+10％FBS置换。将DNA-LF2000复合物加入293FT细胞中转染。将细胞在37℃湿化的5％CO2培养箱中保温过夜。将含有DNA-LF2000复合物的培养基用10mL完全培养基更换，并将细胞在37℃在湿化的5％CO2培养箱中保温过夜。在转染后48小时收集上清，并将培养基移至无菌贮存管中。将含有病毒的培养基在3000rpm离心5分钟以沉淀在收集期间残留的任何293FT细胞。将上清小心移至无菌贮存管中。
为了转导，将CHO-S细胞(Life Technologies,Carlsbad,CA；Cat.No.16447-500)在CD CHO培养基(Life Technologies,Carlsbad,CA；Cat.No.10743-029)中培养。在含有于2mL补加了4mM Glutamax(Invitrogen,Carlsbad CA)和4μg/mL海美溴铵(Polybrene；Biosettia,San Diego,CA)的CD-CHO培养基中的2×107慢病毒感染单位(IU)和2×106CHO-S细胞的6孔平板中进行CHO-S细胞系转导。将感染的细胞在大约30rpm在37℃在具有5％CO2的湿化空气培养箱中摇动保温6小时。然后收获细胞并低速离心(1000×g，5分钟)，除去转导培养基，并用新鲜CD-CHO培养基更换。将细胞移至T-25mL有开口培养瓶中并返回培养箱中。在初始感染后4天，为培养基补加1μg/mL杀稻瘟素(Invitrogen,Carlsbad,CA)。每3-4天更换一次培养基直至CHO-S细胞汇合达到大约90％及细胞开始从培养瓶中分离。将细胞移至摇瓶以进行扩增、细胞贮库(cell banking)及蛋白质产生。
收集条件化培养基以纯化蛋白质，SEQ ID NO:5所示成熟ADA2或者成熟变体(例如表7-12所示)，每种蛋白质均具有FLAG标签。收获2-5L的条件培养基并经过抗FLAG M2亲和性树脂(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,Cat.No.A2220)。将树脂用大约10个床体积的洗涤缓冲液(Tris Buffered Saline(TBS),pH 7.5)以4mL/min流速平衡，之后加样条件培养基。然后用～10个床体积的TBS洗涤加样的柱，然后连接AKTA纯化仪(GE Healthcare,Pittsburgh,PA)，使用低pH缓冲液(0.1M的甘氨酸-HCl，pH 2.7)洗脱结合的蛋白质。将级分立即用1/10体积的1M Tris-HCl,pH 8.8中和。
集合纯化的蛋白质级分并使用Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette(20kD MWCO；Thermo Fisher Scientific,Rockford,IL)在4L PBS中透析，更换两次缓冲液。然后将透析的蛋白质产物使用Amicon Ultra离心浓缩仪(30kD MWCO；EMD Milipore,Billerica,MA)浓缩，并使用PierceTM BCA Protein Assay Kit(Thermo Fisher Scientific,Rockford,IL)确定最终蛋白质浓度。制备物的纯度使用SDS-PAGE评定，腺苷脱氨酶活性如下文实施例4所述检测。
通过SDS-PAGE评定的rHuADA2-FLAG蛋白质制备物的纯度为95％或更高。该制备物也通过大小排阻层析(SEC)鉴定，其示出通过曲线下面积(AUC)计算评定，rHuADA2-FLAG蛋白以高于95％纯度的单一分子量种类存在。
或者，使用CHO Freedom CHO-S Kit(Invitrogen)根据厂商指导表达野生型rHuADA2及变体并如上述进行纯化。
实施例3：重组人腺苷脱氨酶1(rHuADA1)的产生
A.野生型(WT)ADA1的克隆
将人腺苷脱氨酶1(ADA1)基因(SEQ ID NO:11所示核酸序列；编码SEQ ID NO:12所示氨基酸序列)扩增并克隆进在异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)可诱导启动子(DNA 2.0,Menlo Park,CA)控制下的pD444-SR:T5-sRBS-ORF(DNA 2.0,Menlo Park,CA；Cat.No.FPB-27-444)大肠杆菌表达载体中。该构建体还包含接头(SEQ ID NO:64所示氨基酸序列)和C末端Strep-标签(SEQ ID NO:65所示氨基酸序列)以促进蛋白质的亲和性纯化。编码的ADA1-Strep的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。在成熟形式蛋白中，N末端甲硫氨酸被除去，由此成熟ADA1-Strep多肽具有SEQ ID NO:67所示氨基酸序列(相应于SEQ ID NO:66所示成熟多肽序列，无Strep标签)。
B.ADA1变体的产生
将这个所得的编码WT rHuADA1-Strep的构建体用于导入位点特异性氨基酸取代以产生ADA1变体C74S，基于SEQ ID NO:67所示成熟ADA1编号(相应于基于SEQ ID NO:12所示多肽编号的C75S)。产生这个变体作为候选物以稳定活性，因为ADA1中溶剂暴露的半胱氨酸残基在血浆中可被氧化及在血浆中负面影响酶活性。使用QuikChange Lightning MultiSite-Directed Mutagenesis Kit(Agilent Technologies,Santa Clara,CA；Cat.No.210514)根据厂商指导进行位点特异性取代。在成熟形式蛋白质中，成熟C74S-ADA1-Strep变体具有SEQ ID NO:69所示氨基酸序列(相应于SEQ ID NO:70所示成熟多肽序列，无Strep标签)。
C.在大肠杆菌中表达
为了表达野生型ADA1和变体，将所得克隆的构建体转化进大肠杆菌BL21-DE3(Calbiochem,San Diego,CA)中。将转化的细菌铺板于Luria Broth(LB)琼脂-氨苄青霉素平板(TekNova,Hollister,CA)上并选择单一菌落进行大规模培养。来自选择的菌落的细菌在补加抗生素羧苄青霉素(50μg/mL；EMD Millipore,Billerica,MA)的LB培养基中生长过夜(37℃,200rpm)。将培养物用于种植较大的摇动培养物。使培养物生长直至达到OD600为大约0.8，然后通过加入1mM IPTG诱导蛋白质表达。将培养物移至25℃培养箱中，使其在200rpm摇动生长过夜(～15小时)。次日，将细菌细胞在9000×g离心30分钟，并沉淀中的细胞在冰上使用Branson Sonifier 250(Emerson,Danbury,CT)在20％工作周期通过重复脉冲超声裂解大约5分钟。然后将细菌裂解物与溶菌酶(100μg/mL；Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)和Benzonase(50U/mL；Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)在4℃轻轻搅动保温4小时。将细菌裂解物离心(5000×g；45min)除去细胞碎片。
培养物裂解物用于纯化蛋白质，SEQ ID NO:66所示成熟ADA1或者SEQ ID NO:69所示成熟C74S-ADA1变体，每个蛋白质均具有Strep标签。取出澄清的裂解物及灭菌过滤，之后加样于含有StrepTactinTM亲和性树脂的StrepTrapTM柱(5mL容量；GE Healthcare,Pittsburgh,PA)。然后将该柱连接AKTA纯化仪，使用在缓冲液(100mM Tris-HCl,pH 8.0,150mM NaCl,1mM EDTA)中的2.5mM d-脱硫生物素的溶液洗脱蛋白质。集合含有纯化的蛋白质的级分并在4℃在4L的1×磷酸盐缓冲盐水(PBS)中使用Slide-A-Lyzer DialysisCassette(20kD MWCO；Thermo Fisher Scientific,Rockford,IL)透析4小时，更换2次缓冲液。然后将蛋白质制备物使用Amicon Ultra离心浓缩仪(30kD MWCO；EMD Milipore,Billerica,MA)浓缩并使用PierceTM BCA Protein Assay Kit(Thermo FisherScientific,Rockford,IL)确定最终蛋白质浓度。蛋白质制备物的纯度通过SDS-PAGE评定为95％或更高。
实施例4：腺苷脱氨酶酶活性检测
腺苷脱氨酶活性使用腺苷脱氨酶(ADA)测定试剂盒(Genway,San Diego,CA；Cat.No.BQ014EALD)略加修改进行确定。ADA测定基于腺苷至肌苷的酶促脱氨，其通过嘌呤核苷磷酸酶(PNP)转变为次黄嘌呤。然后次黄嘌呤通过黄嘌呤氧化酶(XOD)转变为尿酸和过氧化氢。过氧化氢进一步与N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺(EHSPT)和4-氨基安替吡啉(4-AA)在存在过氧化物酶时反应，产生醌染料，这可以动力学方式监测。
简而言之，根据厂商指导，将5μL样品一式两份(适当稀释以测量稳态非饱和酶活性)加入96孔平板的120μL R1试剂(由厂商提供；50mM Tris HCL,pH 8.0,2mM 4-AA,0.1U/mL PNP,0.2U/mL XOD,0.6U/mL过氧化物酶)中。将混合物在37℃保温大约5分钟并将60μL的R2试剂(由厂商提供；50mM Tris HCl,pH 4.0,10mM腺苷,2mM EHSPT)加入混合物中。然后，测量在37℃在556nm的吸光度随着时间的变化(ΔA)。1单位的ADA是在37℃每分钟从腺苷中产生1μmole肌苷的ADA的量。腺苷脱氨酶活性mU/mL使用如下公式计算：
1mU/mL＝(ΔA/min×Tv)/(Sv×ε×l)
其中Tv＝总体积(185μL)，Sv＝样品体积(5μL)，ε＝32.2×10-3μM-1cm-1,l＝0.5cm。
实施例5：ADA1相对ADA2的体外血浆稳定性
测定WT rHuADA1、rHuADA1-C74S和rHuADA2的纯化制备物在哺乳动物血浆中保温24小时之前和之后的酶活性，以检测重组蛋白质制备物的稳定性。也检测变体rHuADA1-C74S以确定在血浆中的稳定性是否可以通过取代溶剂暴露的半胱氨酸残基而改良。
A.在血浆中保温纯化的rHuADA1和rHuADA2制备物
将纯化的rHuADA1、rHuADA2和rHuADA1-C74S制备物单独加入离体的25％BALB/c小鼠血浆中，终浓度为0.17mg/ml(相应于大约10mg/kg小鼠等价剂量)。将样品在37℃保温24小时。作为对照，将蛋白质在含有0.2％BSA(作为稳定剂)的PBS中以0.17mg/ml浓度单独保温。在保温后0、4和24小时，取出每个血浆保温样品和每个PBS保温对照样品的3个小等份并在-20℃贮存直至随后的分析。
蛋白质在离体血浆中保温后的稳定性通过对比腺苷脱氨酶酶活性的改变而确定，使用实施例4中所述的方法进行。蛋白质的分子量和稳定性也通过Western印迹检验，以检测任何可能的蛋白质降解。使用Western印迹单独测定大约200ng蛋白质，蛋白质条带使用ECL(Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA)检测。兔抗人ADA1(Abcam,Cambridge,MA)和山羊抗兔辣根过氧化物酶(HRP)(EMD Millipore,Billerica,MA)分别用作rHuADA1的一抗和二抗。抗FLAG-HRP(Abcam)用于检测rHuADA2。
B.结果
1.rHuADA1稳定性
表13示出WT rHuADA1和rHuADA1-C74S的腺苷脱氨酶活性检测的平均和标准偏差(stdev)。结果示出在37℃在血浆中保温24小时后rHuADA1活性显著降低。例如，在用血浆处理24小时后保留低于1％的活性，而当在对照PBS/BSA中相同时间，保留超过80％的活性。观测到的活性降低不是由于蛋白质降解所致，因为通过western印迹测量，蛋白质水平在所有时间点相对恒定。
结果还示出溶剂暴露的半胱氨酸残基(C74)未示出对血浆中酶活性的负面影响，因为针对C74S变体获得相似结果。例如，尽管在位置74不具有暴露的硫醇，但是变体仍示出在血浆中保温24小时后活性显著降低。结果示出在24小时后，变体酶在用血浆处理后保留大约1％的活性，而当在对照PBS/BSA中时保留高于80％的活性。
通常，ADA1以在胞内方式表达，已知易位且与胞外二肽基肽酶-4(DPPIV)结合。这些结果表明在这个环境之外，ADA1通过暴露于血浆而快速失活，表面暴露的半胱氨酸74的突变不阻止失活。
2.rHuADA2稳定性
表14示出了rHuADA2在与血浆保温24小时后腺苷脱氨酶活性的平均值和标准偏差(stdev)。与ADA1的结果相反，该结果示出ADA2在血浆中在37℃保温24小时后明显更稳定。例如，在用血浆处理24小时后保留大约65％的活性，而当用对照PBS/BSA处理相同时间时观测到活性无变化。
实施例6：ADA2对于腺苷介导的免疫应答调节的作用
胞外腺苷是一种免疫应答的炎症性调节物，在肿瘤微环境中腺苷升高的水平可降低和/或抑制T细胞和NK细胞的效应子功能，因此有利于肿瘤生长。为了评定腺苷的作用是否可以通过评定免疫细胞增殖而监测，使用NK细胞和T细胞的混合物(NK/T)进行增殖实验。此外，进行实验以评定rHuADA2通过其将腺苷酶促转变为肌苷是否可以从腺苷介导的增殖抑制中挽救免疫细胞。
A.评定腺苷对于NK/T细胞增殖的作用
从健康供体的周围血单个核细胞(PBMC)制备NK和T细胞的混合物(NK/T)。简而言之，将10×107人PBMC在具有来自AB血型供体的5％人血清(人AB血清；Cat.No.35-060-Cl,Mediatech,Mannassas,VA)的干细胞生长培养基(SCGM；Order No.20802-0500,CellGenix,Freiburg,Germany)中在存在20ng/mL抗CD3eBioscience,San Diego,CA；Cat.No.16-0039)和500IU/mL重组人白细胞介素2(rhIL-2；Cat.No.200-02,PeproTech,Rocky Hill,NJ)条件下培养6-7天。然后将细胞在SCGM中在存在500IU/mL rhIL-2条件下再培养2-3周。将培养2-4周的NK/T细胞用于实验。
为了检测腺苷介导的NK/T细胞增殖的抑制，将NK/T细胞(10,000细胞/孔)以200μL体积铺板于96孔具有透明底部的白色平板中。将细胞用20μL腺苷(SKU No.A925,SigmaAldrich)处理，浓度得自起自1mM的3倍系列稀释即，1mM、300μM、100μM、30μM、10μM、3μM、1μM、0.3μM和0.1μM。使NK/T细胞在具有5％CO2的湿化的组织培养培养箱中在37℃生长5天。处理5天后，将细胞在96孔平板中在12,000rpm离心5分钟。从每个孔中取出100μL培养基，随后加入100μL的Cell Titer Glow(CTG)试剂(Cat.No.G7570,Promega,Madison,WI)并在室温保温15分钟，之后在SpectraMax M3平板读器上根据厂商指导测量发光。平均细胞存活率(％)通过对比测量的发光与未用腺苷处理的对照细胞而确定。
结果在表15中示出。结果示出用腺苷处理NK/T细胞5天导致腺苷以剂量依赖性方式抑制NK/T细胞增殖。应答降低一半的腺苷浓度IC50是16.2μM。
B.评定ADA2对于腺苷介导的NK/T细胞增殖抑制的作用
检测rHuADA2以评定在1mM腺苷浓度其是否可逆转腺苷介导的NK/T细胞增殖抑制。将NK/T细胞(10,000个细胞/孔)铺板于具有透明底部的96孔白色平板中，总体积180μL。将细胞用20μL rHuADA2处理，浓度得自3倍系列稀释，最终rHuADA2浓度为100nM、30nM、10nM、3nM、1nM、0.3nM、0.1nM和0.03nm，然后每个孔也用1mM的20μL腺苷处理。处理后，如上述培养NK/T细胞、加工并测量发光。平均细胞存活率(％)通过对比测量的发光与未用腺苷或rHuADA2处理的对照细胞而确定。
结果示于表16。结果示出rHuADA2以剂量依赖性方式拯救腺苷介导的NK/T细胞增殖抑制。诱导在基线与最大值之间一半的应答的rHuADA2浓度的EC50是8.5nM。
还进行实验以评定rHuADA2逆转在不同腺苷浓度的腺苷介导的NK/T细胞增殖抑制的作用。以与如上述相似方式进行实验，最终腺苷浓度为1mM、100、50或25μM，最终rHuADA2浓度为100nM、30nM、10nM、3nM、1nM、0.3nM、0.1nM和0.03nM。
结果在表17中示出。与上述结果相似，观测到在不同腺苷浓度的rHuADA2剂量依赖性拯救NK/T细胞增殖。rHuADA2在不同的固定浓度腺苷的EC50值在表18中示出。结果示出腺苷抑制NK/T细胞增殖，加入rHuADA2可从腺苷介导的增殖抑制中拯救人NK/T细胞。
MS％＝平均存活率(％)
SD–标准偏差
实施例7：鉴别呈现降低的肝素结合的ADA2肝素结合位点变体
筛选选择的如上表7所述候选变体，其在参与肝素结合的一个残基具有氨基酸取代，以评定是否任何变体呈现减弱的肝素结合。表19列出了检测的变体。肝素结合使用肝素亲和性层析和/或使用酶联免疫吸附测定(ELISA)评定。此外，变体的腺苷脱氨酶活性也进行评定。为了进行实验，制备0.3mg/mL浓度的纯化的WT rHuADA2和检测的变体，以标准化每个实验中的蛋白质的量。
A.肝素结合
1.肝素亲和性层析
为了评定变体与肝素的结合，应用肝素-亲和性层析鉴别肝素结合的变体。肝素结合通过混合35μL的rHuADA2WT和变体与20μL肝素-SepharoseTM树脂(GE Healthcare,Pittsburgh,PA；Cat.No.17-0998-01)、随后在室温保温30分钟进行检测。然后将混合物通过0.22μm离心滤器离心，收集含有未结合的蛋白质的流出液，在SDS-PAGE凝胶上分析。将35μL的1.5M NaCl加入肝素-Sepharose树脂并在室温(RT)保温10分钟以从肝素-Sepharose洗脱剩余的肝素结合的蛋白质。通过SDS-PAGE分析在与肝素-Sepharose树脂混合之前和之后的纯化的WT rHuADA2和检测的变体样品，以对比肝素结合程度。
结果如表19所示。结果示出在25个检测变体中有16个变体获得降低的蛋白质洗脱，表示这些变体与WT rHuADA2相比呈现出减弱的肝素结合。其它变体呈现出与WTrHuADA2相似的洗脱。
2.肝素结合性质的ELISA测定
使用肝素包被的微滴定平板进行酶联免疫吸附测定(ELISA)以证实如上筛选的rHuADA2HBP变体的减弱的肝素结合性质。将96孔平板用100μL在Na2CO3缓冲液(pH 9.6)中的200μg/mL肝素钠盐(Calibochem,EMD Milipore,Billerica,MA；Cat.No.375095)在4℃包被过夜。将孔用在PBS中的5％牛奶封闭，及用PBS洗涤6次。在孔中分别加入3μM选择的rHuADA2变体(见表20)、WT rHuADA2(阳性对照)和WT rHuADA1(阴性对照)并在室温保温2小时，随后用PBS洗涤6次。将100μL的1:1000稀释的辣根过氧化物酶(HRP)-抗FLAG抗体(Abcam,Cambridge,UK；Cat.No.Ab1238)加入孔中以检测结合并在室温保温1小时。通过加入3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(TMB)底物溶液(Pierce,Thermo Fisher Scientific,Rockford,IL)根据厂商指导进行ELISA反应并在平板读器上读取450nm(OD450)光密度。
结果在表20中示出，示出了检测变体的平均OD450读数和标准偏差(Stdev)。结果示出WT ADA2具有任何检测的蛋白质的最高的测量OD，表示与肝素结合，而阴性对照ADA1未导致可检测的信号。结果示出如上述鉴别的呈现与肝素结合降低的所有检测的变体与WTADA2相比均呈现更低的测量OD读数及因此降低的与肝素包被的平板的结合。因此，与上述结果一致，这个结果示出与野生型人rHuADA2相比减弱的肝素结合。
B.腺苷脱氨酶活性测定
WT rHuADA2及如上检测的变体的腺苷脱氨酶活性使用实施例4中描述的腺苷脱氨酶活性(ADA)测定确定。对稀释为5μg/mL的纯化的rHuADA2WT和变体评定活性，然后系列稀释2倍以产生4个测量。
表21示出结果。最后一列示出与rHuADA2WT相比的相对酶活性(％活性比WT)。
结果示出呈现降低的肝素结合的大多数变体呈现与WT ADA2相似或增加的腺苷脱氨酶活性。特别地，根据Zavialov编号的变体R23E、K374D、K374E、K375D、K375E、K455D、K455E和R369E(分别相应于成熟编号的R20E、K371D、K371E、K372D、K372E、K452D、K452E和R366E)不仅示出减弱的肝素结合，而且也呈现改良的酶活性。
相反，变体R23A、R23D和R369A(分别相应于成熟编号R20A、R20D和R366A)呈现降低的肝素结合，但是也呈现降低的腺苷脱氨酶活性。
结果示出K14E变体(成熟编号K11E)和K455D变体(成熟编号K452D)相对于WTrHuADA2呈现改良的酶活性，同时肝素结合性质不减弱。
实施例8：rHuADA2的聚乙二醇化及腺苷脱氨酶活性与肝素结合评定
将rHuADA2、K374D-ADA2变体(成熟编号K371D)或者R23E-ADA2变体(成熟编号R20E)在赖氨酸暴露的表面上通过与线性PEG-20K反应而被聚乙二醇化。评定聚乙二醇化-rHuADA2或变体的肝素结合及腺苷脱氨酶活性。
A.聚乙二醇化
为使所述酶聚乙二醇化，将3mg/mL WT rHuADA2,rHuADA2-K374D(成熟编号K371D)或者rHuADA2-R23E(成熟编号R20E)变体单独与线性PEG-20K(JenKem Technology,Plano,TX；Cat.No.M-SCM-20K)以1:15摩尔比率混合并在4℃保温16小时。将反应混合物通过0.22μm离心滤器离心并收集含有聚乙二醇化的酶的流出液。
聚乙二醇化的程度通过SDS-PAGE分析评定。结果示出至少80％的WT rHuADA2、rHuADA2-K374D(成熟编号K371D)和rHuADA2-R23E(成熟编号R20E)在反应条件下被聚乙二醇化，通过未修饰的rHuADA2条带密度降低伴随表示聚乙二醇化rHuADA2分子的多个较大条带显现而示出。
B.肝素结合ELISA
聚乙二醇化的rHuADA2或变体的肝素结合通过捕获ELISA评定。rHuADA1的结合作为阴性对照。将100μL的0.2mg/mL生物素-肝素(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO；CatNo.B9806-10MG)加入链霉抗生物素蛋白包被的96孔平板(Thermo Fisher Scientific,Rockford,IL；Cat.No.15520)中，在室温保温1小时。将平板用PBS洗涤6次。然后，将150μL的1μM聚乙二醇化rHuADA2加入肝素包被的平板，以3×系列稀释滴定，在室温保温2小时。然后将平板用PBS洗涤6次。将1000×稀释的山羊HRP-抗FLAG pAb(Abcam,Cambridge,UK；Cat.No.Ab1238)加入ELISA平板，在室温保温1小时。然后将ELISA平板用具有Tween的磷酸盐缓冲盐水(PBST)洗涤6次，用3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(TMB)底物溶液(Pierce,ThermoFisher Scientific,Rockford,IL)根据厂商指导显色，在平板读器上读取在450nm的光密度(OD450)。
表22示出来自聚乙二醇化rHuADA2野生型和变体的肝素结合捕获ELISA测定的平均OD450读数及标准偏差(Stdev)。结果示出聚乙二醇化rHuADA2和变体的肝素结合显著降低。对于聚乙二醇化rHuADA2-K374D(成熟编号K371D)和rHuADA2-R23E(成熟编号R20E)变体，与肝素结合降低的非聚乙二醇化形式相比，聚乙二醇化赋予另外的肝素结合性质降低。因此，这些结果表示用PEG部分修饰rHuADA2蛋白通过空间位阻和/或改变rHuADA2表面上的静电电荷降低肝素结合。
C.腺苷脱氨酶活性测定
聚乙二醇化rHuADA2和变体的腺苷脱氨酶活性使用如实施例4所述方法评定，并与相应非聚乙二醇化形式的活性对比。
结果示于表23。结果示出聚乙二醇化WT rHuADA2与非聚乙二醇化形式相比具有相当的腺苷脱氨酶活性。相似地，聚乙二醇化rHuADA2-K374D(成熟编号K371D)和rHuADA2-R23E(成熟编号R20E)变体也示出与非聚乙二醇化形式相比相当的腺苷脱氨酶活性。尽管WTrHuADA2作为单体含有32个赖氨酸残基及作为二聚体含有64个赖氨酸残基，但是在赖氨酸残基的聚乙二醇化不影响rHuADA2的腺苷脱氨酶活性。
D.结论
实验结果表明rHuADA2变体的聚乙二醇化除了得自氨基酸取代的肝素结合降低之外，另外降低肝素结合，但是不丧失腺苷脱氨酶活性。因此，结果示出肝素结合变体的聚乙二醇化可改良rHuADA2变体的药代动力学性质，而不影响腺苷脱氨酶活性。聚乙二醇化可用于代替突变以减弱肝素结合。
实施例9：rHuADA2、ADA2变体及聚乙二醇化形式的体内药代动力学分析
在免疫感受态小鼠模型中分析非聚乙二醇化及聚乙二醇化形式的WT rHuADA2、根据Zavialov编号的ADA2-K374D和ADA2-R23E变体(分别相应于成熟编号K371D和R20E)的药代动力学(PK)。
A.研究设计
将54只雄性BALB/c小鼠分成6个剂量组，每组进一步分为3组，每组在不同时间点取血样。因此，小鼠被随机分为共18组。在开始研究之前为小鼠称重，基于其体重随机分为18组。在每个样品组，3组(3只)小鼠用于给予每个试验样品以防止从动物过量取血液样品。为了测量基线ADA2水平，从12只随机选择的小鼠获得血液样品，使用抗凝钾(K3)乙二胺四乙酸(K3-EDTA)制备血浆。所有血液通过颌下静脉穿刺收集。
为每只小鼠通过尾静脉注射7.5mg/kg剂量的如表24所示6个ADA2试验样品之一，即rHuADA2-K374D(成熟编号K371D)、PEG-rHuADA2-K374D(成熟编号PEG-K371D)、rHuADA2-R23E(成熟编号R20E)、PEG-rHuADA2-R23E(成熟编号PEG-R20E)或者WT ADA2和PEG-WTADA2。聚乙二醇化ADA2变体使用如实施例8.A所述聚乙二醇化方法制备。每个试验样品的浓度为1.5mg/mL，根据小鼠体重(BW)所得剂量体积范围为93-119μL。各个动物的剂量体积和体重在表25中提供。
如下表24所示在指定取样时间点从适当小鼠组中收集血液，在冰上保持直至制备血浆。血浆通过将血液离心(500×g，5min，4℃)而制备，将血浆移至新鲜的试管中并立即在-80℃冷冻直至进行腺苷脱氨酶活性测定。腺苷脱氨酶活性如实施例4所述确定。计算半衰期或者ADA2蛋白的活性降至一半的时间。也通过计算浓度-时间曲线下面积(AUC)测量总暴露。
B.结果
1.非聚乙二醇化rHuADA2WT和变体的药代动力学
WT rHuADA2与根据Zavialov编号的变体ADA2-K374D和ADA2-R23E(分别相应于成熟编号的K371D和R20E)的药代动力学(PK)性质在表26和27中示出。表26示出使用曲线下面积(AUC)计算测量的总暴露，表27示出半衰期(t1/2)。结果示出每个变体与野生型ADA2相比呈现改良的药代动力学参数。例如，变体rHuADA2-R23E(成熟编号R20E)呈现出AUC比WTrHuADA2高19％，其半衰期比WT rHuADA2长119％。变体rHuADA2-K374D呈现出AUC比WTrHuADA2高128％，及半衰期比WT rHuADA2长230％。
2.聚乙二醇化rHuADA2WT和变体的药代动力学
天然与聚乙二醇化WT rHuADA2与聚乙二醇化形式变体PEG-R23E(成熟编号R20E)和PEG-K374D(成熟编号K371D)相比的药代动力学(PK)性质在表28和29中示出。表28示出使用曲线下面积(AUC)计算测量的总暴露，表29示出半衰期(t1/2)。
对于野生型ADA2，结果示出聚乙二醇化充分改良药代动力学模式。结果示出PEG-WT ADA2呈现出AUC比非聚乙二醇化的WT ADA2高4291％，半衰期比非聚乙二醇化的WT ADA2长1078％。同样，聚乙二醇化变体形式与非聚乙二醇化形式相比也获得改良的药代动力学。因此，对于测量的两种PK成分AUC和t1/2，聚乙二醇化与非聚乙二醇化形式相比均获得改良的PK值。
结果还示出聚乙二醇化形式的ADA2变体与PEG-WT ADA2相比也呈现一或两个PK成分的改良，但是这些改良对于变体PEG-K374D(成熟编号K371D)比对于PEG-R23E(成熟编号R20E)更高。例如，PEG-R23E(成熟编号R20E)呈现出AUC比非聚乙二醇化WT ADA2高4271％(与PEG-WT ADA2相比高4291％)，半衰期与非聚乙二醇化的WT ADA2相比长1420％(与PEG-WT ADA2相比长1078％)。相反，PEG-K374D(成熟编号K371D)呈现出AUC比非聚乙二醇化WTADA2高8187％(与PEG-WT ADA2比高4291％)，半衰期比非聚乙二醇化WT ADA2相比长1791％(与PEG-WT ADA2相比长1078％)。
实施例10：鉴别具有增加的酶活性的ADA2活性位点变体
选择的在上表8中描述的在酶活性中起作用的残基含有氨基酸取代的候选变体使用实施例4中描述的方法评定其腺苷脱氨酶活性。表30列出了检测的变体。为了进行实验，制备5μg/mL浓度的纯化的WT rHuADA2和检测的变体以标准化在每个实验中的蛋白质的量。
腺苷脱氨酶活性测定结果在下表30中示出。表中示出与WT-ADA2相比每个变体的活性百分比(％)。结果示出所有检测的在位置182(成熟编号位置179)具有取代的变体的活性显著降低，表示谷氨酸(E)残基对于酶活性是重要的。
相反，其它取代保留或者呈现增加的酶活性。特别地，鉴别的具有增加的活性的变体包括：R222Q变体(成熟编号R219Q)活性是WT的170％，H267Q变体(成熟编号H264Q)活性是WT的114％，H267G(成熟编号H264G)活性是WT的153％，R222K(成熟编号R219K)活性是WT的152％，L224A(成熟编号L221A)活性是WT的128％，L224V(成熟编号L221V)活性是WT的123％，L224G(成熟编号L221G)活性是WT的113％及S265N(成熟编号S262N)活性是WT的211％。
实施例11：组合变体的产生
产生具有增加的酶活性及减弱的肝素结合的氨基酸取代的组合变体。特别地，将如实施例10所述赋予酶活性最大程度增加的氨基酸取代S265N和/或R222Q(成熟编号S262N和/或R219Q)与在实施例7中鉴别的一或多个氨基酸取代K374D、K374E和/或R23E(分别相应于成熟编号K371D、K371E和/或R20E)组合。如实施例1所述使用QuikChange LightningMulti Site-Directed Mutagenesis Kit产生变体。产生的组合变体如表31所示。评定所述组合变体与相应单一氨基酸取代的腺苷脱氨酶的动力学参数及肝素结合。
评定含有SEQ ID NO:59-63所示S265N(成熟编号S262N)和/或SEQ ID NO:263-273所示R222Q(成熟编号R219Q)突变的组合变体及相应单一氨基酸取代的腺苷脱氨酶活性的动力学参数。评定含有SEQ ID NO:59-63所示突变S265N(成熟编号S262N)的组合变体及相应单一氨基酸取代的肝素结合活性。
A.腺苷脱氨酶活性的动力学评定
1.测定方法
腺苷脱氨酶活性通过测量当腺苷分解成肌苷时从腺苷中释放的氨而确定。使用可商购的Ammonia Assay kit(Cat.No.AA0100,Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)测量氨。该试剂盒包含具有α-酮戊二酸和NADPH的干试剂，其在用于测定之前用5mL水重建。氨与α-酮戊二酸(KGA)及还原的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)在存在L-谷氨酸脱氢酶(GDH)条件下反应。由于NADPH氧化在340nm的吸光度降低与氨浓度成比例，因此与腺苷脱氨酶活性成比例。
使用这个测定在不同腺苷浓度在pH 7.6和6.5对比rHuADA2WT和变体的动力学参数。使用20μM-20mM的腺苷浓度。在1N NaOH中制备亚摩尔浓度的腺苷原液。
对于在pH 7.6的酶测定，将腺苷用100mM乙酸钠(NaOAc)pH 4.9系列稀释。制备2×反应混合物，含有重建的氨测定试剂(含有大约4mMα-酮戊二酸和大约300μM NADPH)、1μg/mL(17nM)WT rHuADA2或变体及谷氨酸脱氢酶(GDH，1:50稀释)。将85μL腺苷加入在UV-透明半区平板中的85μL 2X混合物中，一式两份。监测在室温随着时间在340nm的吸光度改变(ΔA)。
对于在pH 6.5的酶测定，将腺苷用200mM哌嗪-N,N′-二(2-乙磺酸)(PIPES)pH 6.5系列稀释。在200mM PIPES、pH 6.5中制备2×反应混合物，含有4mMα-酮戊二酸、300μMNADPH、1μg/mL(17nM)WT rHuADA2或变体及50U/mL GDH(Cat No.G2626,Sigma-Aldrich)。通过在如上述UV-透明半面积平板中的2×混合物中加入等体积腺苷起始酶反应，并监测在室温随着时间在340nm的吸光度变化(ΔA)。
腺苷脱氨酶活性mU/mL(等价于μM/min)使用如下公式计算：
1mU/mL＝-(-ΔA/min×Tv)/(Sv×ε×l)
其中Tv＝总体积(170μL)，Sv＝样品体积(85μL)，ε＝6.22×10-3μM-1cm-1，l＝1cm。
活性数据使用Graphpad Prism软件与Michaelis-Menten方程非线性回归拟合获得Km和Vmax。也确定其它动力学参数如kcat和kcat/Km。
kcat(1/s)＝Vmax/[E]0
Vmax单位＝μM/min
[E]0＝8.5nM或0.0085μM
kcat＝Vmax/0.0085/60
kcat/Km单位＝1/Ms
2.结果
表32和33示出rHuADA2野生型和变体分别在pH 7.6和pH 6.5的动力学参数。WTrHuADA2的Km在pH 7.6是5.25mM，在pH 6.5是3.66mM，WT rHuADA2催化效率(kcat/Km)在pH7.6是9,753，在pH 6.5是17,060。因此，这些结果示出WT rHuADA2在pH 6.5呈现更高活性。所有检测的变体与WT-ADA2相比均呈现改良的酶动力学。通常，观测到设计的变体的改良的酶动力学在pH 6.5比在pH 7.6更显著。
例如，S265N(成熟编号S262N)与WT相比具有显著改良的动力学性质。在rHuADA2活性位点的丝氨酸残基265(成熟编号262)取代为天冬酰胺降低了Km值，在pH 7.6为3.02mM，在pH 6.5为1.49mM，增加了催化效力(kcat/Km)，在pH 7.6从9,753增加至52,208(1/Ms)，在pH 6.5从17,060增加至60,339(1/Ms)。R222Q(成熟编号R219Q)与WT相比也具有显著改良的动力学性质。赖氨酸残基222(成熟编号219)取代为谷氨酰胺降低了Km值，在pH 7.6为1.92mM及在pH 6.5为0.994mM，增加了催化效率(kcat/Km)，在pH 7.6从9,753增加至60,697(1/Ms)，在pH 6.5从17,060增加至83,146(1/Ms)。
经鉴别赋予减弱的肝素结合的Zavialov编号ADA2变体K374D、K374E和R23E(分别相应于成熟编号K371D、K371E和R20E)也呈现出与WT相比改良的动力学性质，其在pH 6.5更高。含有S265N(成熟编号S262N)的组合变体与WT相比进一步呈现出改良的催化活性。特别地，组合变体S265N/K374E、S265N/R23E和S265N/R23E/K374E在检测的变体中在pH6.5呈现出最大的催化活性改良。
结果还示出含有R222Q(成熟编号R219Q)的组合变体与WT ADA2和R222Q(成熟编号R219Q)相比具有显著改良的动力学性质。在检测的ADA2组合变体中，双重突变R222Q/S265N(成熟编号R219Q/S262N)呈现出动力学性质的最大改良，与WT ADA2相比示出在pH 7.6的Km降低4.7倍及催化效率(kcat/Km)高15倍，在pH 6.5的Km降低5.0倍及催化效率(kcat/Km)高8.2倍。结果还示出ADA2WT及所有检测的含有R222Q(成熟编号R219Q)的变体均在pH 6.5比在pH7.6具有更低的Km。
B.组合变体的肝素结合
使用如上述实施例7.A所述基于ELISA的肝素结合测定评定单一突变体及含有S265N(成熟编号S262N)的组合变体的肝素结合活性。结果在表34中示出。结果证实变体K374D、K374E和R23E与WT-ADA2相比呈现出减弱的肝素结合。此外，针对改良的酶活性通过修饰活性位点残基而设计的S265N(成熟编号S262N)变体也具有减弱的与肝素包被平板的结合，表示所述酶活性位点的修饰可以变构方式影响肝素结合。进一步地，所有检测的组合变体示出显著减弱的肝素结合，例证了可以产生对于腺苷呈现改良的酶活性及对肝素呈现减弱的结合的变体的组合。
实施例12：rHuADA2WT和变体的热稳定性
rHuADA2WT和变体的稳定性通过差示扫描量热法(DSF)在升高的温度进行测量。DSF测量构象稳定性，其与热稳定性相关。DSF中解链温度(Tm)定义为蛋白质解折叠转变的中点。
制备浓度为0.1-1mg/mL的非聚乙二醇化WT rHuADA2、非聚乙二醇化rHuADA2变体和聚乙二醇化形式的WT rHuADA2和rHuADA2变体并与ROXTM蛋白质热移染料(AppliedBiosystems,Carlsbad,CA；Cat.No.4461146)混合，最终染料浓度相应于125倍稀释的ROXTM溶液原液。然后将蛋白质样品一式三份加样于96孔平板，体积为20μL/孔。使用ViiA7RT-PCRSystem(Applied Biosystems,Carlsbad,CA)测量荧光随着样品温度增加的位移。反应进行如下步骤：在25℃保温2分钟；将温度以0.05℃/秒速度从25升至99℃；随后在99℃保温2分钟。用于发射和激发的波长分别为623纳米(nm)和580nm。
表35示出从DSF分析确定的解链温度(Tm)。结果示出变体K374E(成熟编号K371E)的Tm比WT ADA2高1.4℃，这表示变体的热稳定性改良。其它检测的变体示出与WT ADA2相当或略低的Tm。结果示出所有聚乙二醇化形式均呈现出比相应非聚乙二醇化形式更高的Tm，这也表明聚乙二醇化改良酶的热稳定性。
实施例13：rHuADA2WT和变体的pH最佳值
评定rHuADA2和变体在不同pH的腺苷脱氨酶活性以确定每个蛋白的pH最佳值。腺苷脱氨酶活性通过直接测量腺苷吸光度的变化而经分光光度法确定。腺苷(ADO)和肌苷(INO)的UV吸光度光谱非常相似且显著重叠，各自的吸光度峰值在261nm和249nm。在脱氨反应期间，随着时间ADO吸光度降低而INO吸光度增加。因为吸光度的动态变化使得难以监测在单一波长的活性，因此以ADO峰值与等消光点(即ADO和INO具有相同消光系数的波长)的比率来确定相对ADO活性。等消光点是253nm，保持不变且是浓度非依赖性的，由此作为参考点以校准体积或强度差异。因此，以261nm吸光度/253nm吸光度(A261/A253)比率基于标准曲线评定腺苷浓度中的变化及因此评定腺苷脱氨酶活性的变化。
A.标准曲线
为了构建ADO和INO的标准曲线，制备在0.001％Tween-20中含有不同浓度ADO和INO的一系列溶液混合物。ADO和INO混合物的总浓度是在1X PBS(10Mm磷酸盐,137mM NaCl,2.7mM KCl)pH 7.4中50μM。将样品用在220nm-300nm的波长进行扫描以确定其中所有光谱均穿过的等消光点。表36示出标准曲线测量。根据ADO浓度绘制A261/A253比率和线性拟合获得标准曲线A261/A253＝0.0249[ADO]-0.0152(R2＝0.999)。
B.腺苷脱氨酶活性分光光度测定
为了对ADA2和变体进行分光光度腺苷脱氨酶测定，制备含有于100mM磷酸钾缓冲液(KPB)中的10mM ADO、0.1％Tween-20在不同pH(即5.5、6、6.5、6.75、7、7.25、7.4、7.75和8)的2X溶液。制备在相同100mM磷酸钾缓冲液(KPB)、0.1％Tween-20中含有2μg/mL WTrHuADA2或变体的在各个pH(即5.5、6、6.5、6.75、7、7.25、7.4、7.75和8)的单独的2X溶液。混合等体积的ADO溶液与ADA2溶液(野生型或变体)以起始反应。在每个时间点(即1、3、5、7、9、11、13和15分钟)，取出小等份(4μl)，通过加入196μl 1X PBS,pH 7.4稀释50倍。将稀释的样品通过将85μl样品加入在UV-透明半区平板中85μl的1X PBS中进一步稀释2倍(一式两份)。测量每个稀释的样品在253nm和261nm的吸光度。
使用A261/A253比率和标准曲线确定腺苷浓度。腺苷脱氨酶活性通过ADO浓度/min×100中的负变化测量。
表37示出通过分光光度测定在不同pH测量的腺苷脱氨酶活性结果。结果示出WTrHuADA2活性的最佳pH(最高脱氨酶活性)是大约6.5。ADA2变体K374D(成熟编号K371D)和K374E(成熟编号K371E)具有与WT rHuADA2相似的活性pH谱。
相反，ADA2S265N变体(成熟编号S262N)的pH最佳值在较高的pH7.25。含有S265N突变(成熟编号S262N)的双重和三重变体也获得相似的pH最佳值为7.25。
实施例14：聚乙二醇化rHuADA2组合变体的体内药代动力学分析
在免疫感受态小鼠模型中分析根据Zavialov编号的聚乙二醇化ADA2-K374D、聚乙二醇化ADA2-R222Q/S265N和聚乙二醇化ADA2-R222Q/S265N/K374D变体(分别相应于成熟编号K371D、R219Q/S262N和R219Q/S262N/K371D)的药代动力学(PK)。
A.研究设计
将27只雄性BALB/c小鼠分成3个给药组，并均再分为在不同时间点取血样的3组。因此，小鼠共被随机分为9组。在开始研究之前为小鼠称重，并基于其体重随机分为9组。在每个取样组，3组(3只)小鼠用于给予每种试验样品以防止从动物中过量取血样。为了测量基线ADA2水平，从12只随机选择的小鼠获得血样，使用抗凝钾(K3)乙二胺四乙酸(K3-EDTA)制备血浆。通过颌下静脉穿刺收集所有血液。
为每只小鼠经尾静脉静脉注射3mg/kg剂量的如表38所示三种聚乙二醇化ADA2变体试验样品之一，即PEG-rHuADA2-K374D(成熟编号K371D)、PEG-rHuADA2-R222Q/S265N(成熟编号R219Q/S262N)或者PEG-rHuADA2-R222Q/S265N/K374D(成熟编号R219Q/S262N/K371D)。使用如实施例8.A所述聚乙二醇化方法略加修改制备聚乙二醇化ADA2变体。简而言之，将所有10mg/mL的ADA2变体用线性PEG-20K(JenKem Technology,Plano,TX；Cat.No.M-SCM-20K)以1:15摩尔比率聚乙二醇化，在37℃首先保温30分钟，然后在4℃保温16小时。SDS-PAGE和分析性SEC结果示出100％的ADA2变体在优化的聚乙二醇化条件下均被聚乙二醇化，及所有聚乙二醇化ADA2变体均保留100％酶活性。
如表38所示在指定的取样时间点从合适的小鼠组收集大约200μL全血，在冰上保持直至进行血浆制备。最初的2个血样通过颌下静脉穿刺收集。最终样品从末端放血收集。通过将血液离心(500×g，5min，4℃)制备血浆，将血浆移至新鲜试管中并立即在-80℃冷冻直至进行腺苷脱氨酶活性测定。腺苷脱氨酶活性如实施例4所述确定。
使用Phoenix WinNonlin version 6.3(Pharsight Corp,St.Louis,MO 63101)进行非区室分析(NCA)。计算半衰期或者ADA2蛋白质的活性降低一半的时间。而且，通过计算浓度-时间曲线下面积(AUC)测量总暴露。AUC和半衰期数值得自每个试验样品组的未加权的平均值。在Phoenix WinNonlin程序中如下选项用于数据分析：(i)对于AUC，线性梯形/线性插值选项；(ii)对于终末斜率，最佳拟合斜率选择选项；及(iii)数据统一加权。
B.结果
1.非聚乙二醇化rHuADA2WT和变体的药代动力学
聚乙二醇化ADA2变体PEG-K374D(成熟编号K371D)、PEG-R222Q/S265N(成熟编号R219Q/S262N)和PEG-R222Q/S265N/K374D(成熟编号R219Q/S262N/K371D)的药代动力学(PK)性质在表39和40示出。表39示出使用曲线下面积(AUC)计算测量的总暴露，表40示出检测的聚乙二醇化rHuADA2变体的半衰期(t1/2)。
结果示出聚乙二醇化显著改良ADA2的药代动力学谱，所有检测的聚乙二醇化ADA2变体与非聚乙二醇化的WT rHuADA2相比呈现出显著较高的AUC和较长的半衰期(见实施例9和表26和27)。PEG-R222Q/S265N(成熟编号R219Q/S262N)呈现出最大的改良，AUC比非聚乙二醇化WT rHuADA2高49661％，半衰期比非聚乙二醇化的长4043％。PEG-K374D(成熟编号K371D)与在实施例9和表26和27中相同试验样品组相比呈现出较高的PK性质改良，这可有助于优化在制备试验样品中使用的聚乙二醇化条件。
实施例15：产生其它组合变体
组合增加酶活性的氨基酸取代和/或赋予减弱的肝素结合的氨基酸取代与赋予其它改变活性的其它修饰如缺失/插入/取代和氨基酸置换，产生另外的组合变体。特别地，将如在实施例10中所述赋予酶活性最大增加的氨基酸取代S265N和/或R222Q(成熟编号S262N和/或R219Q)与在先前实施例中描述的其它ADA2修饰组合。将氨基酸置换K374D(成熟编号K371D)也与先前实施例中描述的其它ADA2修饰组合。所述组合变体在表41示出。
实施例16：rHuADA2PRB结构域缺失组合变体的腺苷脱氨酶活性的动力学评定
使用上述实施例11.A所述测定方法评定含有K374D突变(成熟编号K371D)和用SEQID NO:588-593所示(GGGGS)n接头置换PRB缺失的组合变体的腺苷脱氨酶活性的动力学参数。第一组变体含有缺失残基V102-Q147(成熟编号V99-Q144)用不同长度的(GGGGS)n接头置换(例如n＝1、2或3；SEQ ID NO:588-590所示)，第二组变体含有缺失残基C108-T150(成熟编号C105-T147)用不同长度的(GGGGS)n接头置换(例如n＝1、2或3；SEQ ID NO:591-593所示)。动力学参数在pH 7.6检测，及结果示于表42。
结果表明所有检测的ADA2PRB结构域缺失突变体保留酶活性，通常呈现出与WTADA2相比在pH 7.6的Km降低大约5-7倍，催化效率(kcat/Km)提高大约8-11倍。
实施例17：使用CT26同系肿瘤模型评定聚乙二醇化rHuADA2-K374D的肿瘤生长抑制(TGI)
使用鼠CT26同系肿瘤模型评定ADA2的抗肿瘤活性。
A.同系肿瘤模型和治疗
为44只雄性BALB/c小鼠每只皮下接种0.1mL的5×106鼠结肠癌肿瘤细胞(CT26，ATCC CRL-2638)。肿瘤体积使用数显卡尺通过卡尺测量实体瘤的长度(L)和宽度(W)确定。使用公式(L×W2)/2计算肿瘤体积(TV)。使肿瘤生长，当肿瘤显现且测量为大约50-100mm3时，对携带肿瘤的小鼠分期。
如实施例8.A所述略加修改制备聚乙二醇化rHuADA2-K374D(成熟编号K371D)，产生通过SDS-PAGE评定其中大约100％的分子是聚乙二醇化的制备物。简而言之，将10mg/mL的rHuADA2-K374D(成熟编号K371D)制备物与线性PEG-20K(JenKem Technology,Plano,TX；Cat.No.M-SCM-20K)以1:15摩尔比率混合，首先在4℃保温16小时，然后在30℃保温60分钟。
对于治疗，将动物随机分为4组(n＝8/组)。然后每隔一天为携带CT26肿瘤的小鼠静脉内注射(IV)3mg/kg体重、10mg/kg体重或30mg/kg体重剂量的PEG-K374D(成熟编号PEG-K371D)或者运载体对照(仅缓冲液)。在第0天和第8天使用如上述卡尺测量测量肿瘤体积。每个肿瘤模型的肿瘤生长抑制(TGI)百分比使用如下等式计算：
％TGI＝[1–(Tn-T0)÷(Cn-C0)]×100％
其中Tn是治疗组在最终剂量PEG-K374D或对照后第n天的平均肿瘤体积；T0是治疗组在治疗前第0天的平均肿瘤体积；Cn是相应对照组在第n天的平均肿瘤体积；C0是对照组在治疗前第0天的平均肿瘤体积。来自运载体组的一只小鼠由于显著肿瘤生长抑制而除外。
B.结果
表43示出与运载体注射的对照相比，在给予PEG-K374D的小鼠中在第8天平均肿瘤体积和肿瘤生长抑制的结果。在第8天，运载体对照组的平均肿瘤体积是446.67mm3(n＝7)。对于注射3mg/kg的PEG-K374D的治疗组，平均肿瘤体积为257.72mm3，表明肿瘤生长抑制(TGI)为50％(n＝8；p值＝0.037)。对于给予10mg/kg的PEG-K374D的治疗组，平均肿瘤体积为207.84mm3，表示TGI为63％(n＝8；p值＝0.0056)。对于注射30mg/kg的PEG-K374D的治疗组，平均肿瘤体积为187.32mm3，表示TGI为68％(n＝8；p值＝0.0085)。结果示出给予PEG-K374D获得明显的肿瘤生长抑制。
实施例18：评定聚乙二醇化rHuADA2、抗PD-1和抗CTLA4的组合治疗的肿瘤生长抑制(TGI)
鼠CT26同系肿瘤模型用于对比使用聚乙二醇化ADA2与检查点抑制剂抗PD-1和抗CTLA4抗体的组合治疗的抗肿瘤活性。CT26同系肿瘤通过在雄性Balb/C小鼠的右侧胫骨肌肉为每只动物注射0.05mL体积的2×105CT26细胞而产生。当平均肿瘤大小达到150mm3时，将携带肿瘤的小鼠分成治疗组。
对于治疗，将动物随机分为如下8组(n＝8/组)：1)盐水运载体对照，2)PEG-ADA2-K374D，3)α-CTLA4抗体(Clone 9D9,Cat.No.BE0164；BioXCell,West Lebanon,NH，4)α-PD-1抗体(Clone RMP1-14,Cat.No.BE0146；BioXCell,West Lebanon,NH)，5)PEG-ADA2-K374D+α-CTLA4；6)PEG-K374D+α-PD-1；7)α-CTLA4+α-PD-1或者8)三重组合(PEG-ADA2-K374D+α-CTLA4+α-PD-1)。PEG-ADA2-K374D经静脉内每周给予3次10mg/kg，α-CTLA4经腹膜内每两周给予一次4mg/kg，α-PD-1经腹膜内每两周给予一次4mg/kg。组合组中的给药顺序如下：PEG-ADA2-K374D，随后α-CTLA4，随后α-PD-1。
使用Vevo2100(Visual Sonics,Toronto,Canada)通过超声成像每周评定2次肿瘤体积，以确定肿瘤生长抑制(TGI)。使用光异氟醚麻醉动物，同时测量肿瘤体积。对于肿瘤测量，将感兴趣的区域用超声凝胶(Parker Laboratories,Fairfield,NJ)覆盖，将RMV-716(焦点深度＝17.5mm)扫描头直接放在感兴趣的区域上。在2D模式中，定位大约的肿瘤中心，随后使用3D模式捕获图像(～150-200帧)。分析150-200帧中的大约15-30帧，计算肿瘤体积并以mm3表示。如上述计算肿瘤生长抑制(TGI)。
结果在表44中示出。表44示出每组在研究第10天(SD10)、在给予PEG-ADA2-K374D后48小时和给予α-CTLA4和α-PD-1后72小时的平均肿瘤体积，及组中所有动物的肿瘤体积范围。表中也示出了与运载体对照相比的TGI。结果示出PEG-ADA2-K374D、α-CTLA4和α-PD-1均单独地呈现出肿瘤生长抑制活性，组合使用α-CTLA4呈现出比其它单一治疗更高的肿瘤生长降低。结果示出PEG-ADA2-K374D与α-CTLA4或α-PD-1的组合治疗的略微的协同作用。在三重组合治疗中观测到进一步增加的肿瘤生长抑制。相反，α-CTLA4与α-PD-1的组合治疗与用α-CTLA4治疗相比仅略微增加肿瘤生长抑制。
实施例19：CT26Peritibial肿瘤或者正常器官中的PEG-ADA2分布
为了评定在肿瘤微环境或正常器官中给予的PEG-ADA2-K374D的分布与消除，使用免疫荧光评定给予小鼠的PEG-ADA2-K374D的存在。将PEG-ADA2-K374D用近-IR荧光素DyLight755Sulfydryl-Reactive Dye(DL755)使用DyLight 755Antibody Labeling Kit(Thermo Scientific,Rockford,IL)在室温标记60分钟。Alexa Fluor 750(AF 750)标记的牛血清白蛋白(BSA,1mg/mL)购自(Life Technology,Carlsbad,CA)。
A.在CT26Peritibial肿瘤中的分布
CT26同系小鼠通过在雄性Balb/C小鼠右侧胫骨前肌给每只动物注射0.05mL体积的2×105细胞而产生。当平均肿瘤大小达到600mm3时，将携带肿瘤的小鼠分为2组(n＝4/组)，静脉内接受0.5mg/kg的PEG-ADA2-K374DDL755或者0.5mg/kg的BSAAF750。使用IVISCaliper荧光成像系统评定小鼠肿瘤中DL755标记的PEG-ADA2-K374D(PEG-ADA2-K374DDL755)和AF 750标记的BSA(BSAAF750)的分布，激发波长为745nm，发射波长为800nm(Caliper LifeSciences,Alameda,CA)，信号强度使用LivingImage软件测量。在给予标记的蛋白质之前及给予标记的蛋白质之后10分钟、2小时、6小时及每天捕获图像。
结果在表45中示出。图像示出在所有治疗组中在肿瘤部位的强荧光强度。图像的荧光强度表明PEG-ADA2-K374DDL755快速接近CT26肿瘤并在48小时达到稳定。在注射PEG-ADA2-K374DDL755后第6天，仅30％的PEG-ADA2-K374DDL755从肿瘤消除。相反，较少的对照剂BSAAF750接近肿瘤，并且荧光强度迅速降低。接近100％的BSAAF750在第6天从肿瘤消除。因此，结果表明PEG-ADA2-K374DDL755对于CT26肿瘤具有高亲和性。
B.在携带CT26肿瘤的小鼠或Balb/C首次接受试验小鼠中的分布对比
为了对比在首次接受试验小鼠中的分布，如上述产生携带CT26肿瘤的小鼠，经静脉内给予0.5mg/kg的PEG-ADA2-K374DDL755(n＝3)。单独地，为首次接受试验Balb/c小鼠经静脉内给予0.5mg/kg的PEG-ADA2-K374DDL755(n＝4)。处死小鼠并在注射PEG-ADA2-K374DDL755后24小时经穿心灌注肝素正常盐水。收集来自携带肿瘤小鼠的肿瘤和来自首次接受试验小鼠的器官，用IVIS成像系统成像，DL755信号强度使用LivingImage软件如上述测量。信号强度通过组织器官重量标准化。
结果在表46中示出。将信号强度或每个器官与肿瘤的信号强度对比，以(肿瘤/器官)比率示出。结果示出与其它器官对比，在肿瘤中观测到最高的信号强度。肝和脾示出高荧光强度，其比在肿瘤中的强度分别低1.5倍和2.1倍。其它器官如脑和心脏，示出比肿瘤信号强度分别低29倍和11倍的低信号强度。因此，结果示出PEG-ADA2-K374DDL755对于正常器官具有较低亲和性。
实施例20：使用MH194+PSC4同系肿瘤模型评定聚乙二醇化rHuADA2-R222Q/S265N的肿瘤生长抑制(TGI)和存活
鼠MH194+PSC4同系肿瘤模型用于评定聚乙二醇化重组腺苷脱氨酶2(ADA2)、聚乙二醇化rHuADA2-R222Q/S265N(PEG-R222Q/S265N；成熟编号PEG-R219Q/S262N)的抗肿瘤效力。MH194小鼠胰腺癌细胞衍生自KrasLSL.G12D/+p53R172H/+PdxCretg/+遗传工程化的小鼠模型。分离PSC4细胞并使得胰腺星状细胞永生化。
A.同系肿瘤模型
鼠MH194+PSC4同系肿瘤模型用于评定聚乙二醇化重组腺苷脱氨酶2(ADA2)、聚乙二醇化rHuADA2-R222Q/S265N(PEG-R222Q/S265N；成熟编号PEG-R219Q/S262N)的抗肿瘤效力。
分离PSC4细胞并使得胰腺星状细胞永生化。为了产生PSC4细胞，将来自C57BL/6小鼠的胰腺用剃须刀片切碎并置于含有0.05％胶原酶P、0.1％DNAse及在Gey’s平衡的盐溶液中0.02％链霉蛋白酶(GBSS)的2mL消化缓冲液中。在两次在37℃消化保温15分钟后，每次保温后彻底混合，所得细胞悬浮液通过100μm尼龙网眼过滤，在具有0.3％牛血清白蛋白(BSA)的GBSS中洗涤2次，重悬于10mL GBSS/BSA中。将8mL的Histodenz(Sigma,Cat.No.D2158)加入细胞悬浮液中，将全部体积移液至6mL GBSS/BSA下，以产生不连续的密度梯度。制动(brake)设置为0，在1,400g离心20分钟后，从两种密度体积之间的界面收获希望的细胞，用PBS洗涤2次，用补加2mM L-谷氨酰胺、10％胎牛血清和1％两性霉素-B的DMEM培养基(完全DMEM)洗涤1次。使用Lenti-SV40(Capital Biosciences,Cat.No.CIP-0011)根据厂商指导使细胞永生化。所得细胞系称作PSC4，将其作为附着单层在完全DMEM中在37℃和5％CO2条件下维持在组织培养物中。MH194小鼠胰腺癌细胞衍生自KrasLSL.G12D/+p53R172H/+PdxCretg/+遗传工程化的小鼠模型。
为了产生MH194+PSC4同系肿瘤模型，为小鼠(4-6周龄雄性C57BL/6小鼠，得自Taconic Farms，4只/笼饲养)在右侧胫骨骨膜邻近肌肉注射50μL含有亲代MH194细胞以及5×105PSC4(共5×106个细胞)的细胞悬浮液。
为39只雄性C57BL/6小鼠每只动物在皮下共接种0.1mL注射体积的5×106的鼠MH194胰腺癌肿瘤细胞和鼠PSC4胰腺星状细胞。使用数显卡尺通过测量实体瘤的长度(L)和宽度(W)确定肿瘤体积。肿瘤体积(TV)使用公式(L×W2)/2计算。使肿瘤生长，当肿瘤显现且测量为大约50-100mm3时，对携带肿瘤的小鼠分期给予试验样品。
使用如实施例8.A所述相似方法略加修改制备PEG-R222Q/S265N，产生其中通过SDS-PAGE评定大约100％的分子均是聚乙二醇化的制备物。简而言之，将10mg/mL的rHuADA2-R222Q/S265N(成熟编号R219Q/S262N)的制备物与线性PEG-20K(JenKemTechnology,Plano,TX；Cat.No.M-SCM-20K)以1:15摩尔比率混合，首先在4℃保温16小时，然后在30℃保温60分钟。
对于治疗，携带MH194+PSC4肿瘤的小鼠随机分为5个治疗组(n＝≤8)：运载体对照(仅缓冲液)或者四个治疗剂量的PEG-R222Q/S265N治疗组。然后为携带MH194+PSC4肿瘤的小鼠每隔一天经静脉内注射(IV)0.003mg/kg体重、0.03mg/kg体重、0.3mg/kg体重和3mg/kg体重的PEG-R222Q/S265N或者运载体。在第0天和第8天使用卡尺测量如上述测量肿瘤体积。每个肿瘤模型的肿瘤生长抑制(TGI)百分比使用如下等式计算：
％TGI＝[1–(Tn-T0)÷(Cn-C0)]×100％
其中Tn是治疗组在最终剂量PEG-R222Q/S265N或对照之后第n天的平均肿瘤体积；T0是治疗组在治疗前第0天的平均肿瘤体积；Cn是相应对照组在第n天的平均肿瘤体积；C0是对照组在治疗前第0天的平均肿瘤体积。计算平均存活时间(MST)(天)，此时间是各个组的50％的小鼠达到如下终点之一：(1)肿瘤体积达到2000mm3，(2)动物丧失其体重>25％，或者(3)动物呈现出垂死状态。
B.结果
表47示出与运载体对照相比在第11天在给予PEG-R222Q/S265N的小鼠中平均肿瘤体积和肿瘤生长抑制的结果。在第11天，运载体对照组的平均肿瘤体积为大约840mm3。对于PEG-R222Q/S265N(0.003mg/kg)治疗组，平均肿瘤体积为大约324mm3，相对治疗组的肿瘤生长抑制(TGI)为大约72％(n＝8；p＝0.036)，表明给予PEG-R222Q/S265N导致显著的肿瘤生长抑制。
表48示出相对于运载体对照组，给予PEG-R222Q/S265N的小鼠的平均存活时间结果。对照组中所有小鼠在13-36天死亡，中位数存活时间(MST)为27天。8只注射PEG-R222Q/S265N(0.003mg/kg剂量)的小鼠中有5只存活超过41天，0.003mg/kg剂量的PEG-R222Q/S265N处理小鼠组的MST为46天。结果表明给予PEG-R222Q/S265N显著延长携带MH194+PSC4肿瘤的小鼠的存活。
**Log-rank(Mantel-Cox)检验
实施例21：聚乙二醇化rHuADA2与抗PD-1组合治疗的肿瘤生长抑制(TGI)评定
使用鼠肺癌KLN205同系肿瘤模型对比聚乙二醇化ADA2-K374D(PEG-K374D；成熟编号PEG-K371D)组合检查点抑制剂抗PD-1抗体的抗肿瘤活性。
通过为32只DBA/2小鼠皮下注射0.1mL注射体积的5×105KLN205鼠肺癌肿瘤细胞(ATCC CRL-1453)产生KLN205同系肿瘤模型。当平均肿瘤大小达到大约100mm3时，将携带肿瘤的小鼠分成治疗组。
对于治疗，将动物随机分为4组(n＝8/组):1)盐水运载体对照，2)PEG-K374D，3)α-PD-1抗体(克隆RMP1-14,Cat.No.BE0146；BioXCell,West Lebanon,NH)，或者4)PEG-K374D+α-PD-1。PEG-K374D组两周一次经静脉内给予0.3mg/kg，及两周一次经腹膜内给予2mg/kg的α-PD-1。组合组中给药顺序是给予PEG-K374D，之后立即给予α-PD-1。
肿瘤体积如实施例17.A所述使用卡尺测量每周测量两次。使用如下等式计算每个肿瘤模型的肿瘤生长抑制(TGI)百分比：
％TGI＝[1–(Tn-T0)÷(Cn-C0)]×100％
其中Tn是治疗组动物在最终剂量PEG-K374D和α-PD-1或对照之后第n天的平均肿瘤体积；T0是治疗组在治疗前第0天的平均肿瘤体积；Cn是相应对照组在第n天的平均肿瘤体积，C0是对照组在治疗之前第0天的平均肿瘤体积。
结果在表49中示出。表49描述了在研究第14天(SD14)每组的平均肿瘤体积。结果示出单独的PEG-K374D、单独的α-PD-1及PEG-K374D+α-PD-1的组合与对照组相比均抑制肿瘤生长。单独的PEG-K374D呈现出比单独α-PD-1治疗或者PEG-K374D+α-PD-1组合治疗更大的肿瘤生长抑制。
实施例22：除去游离聚乙二醇化部分
使用Capto苯基树脂柱从聚乙二醇化ADA2变体反应中除去未缀合的游离聚乙二醇化部分。从使用如实施例8.A和20.A所述聚乙二醇化方法制备的聚乙二醇化ADA2-K374D(PEG-K374D；成熟编号PEG-K371D)和聚乙二醇化rHuADA2-R222Q/S265N(PEG-R222Q/S265N；成熟编号PEG-R219Q/S262N)制备物中除去游离PEG。
为了从PEG-K374D制备物中除去游离PEG，将3.5M硫酸铵加入在PBS中的PEG-K374D中，终浓度为在PBS中0.70M硫酸铵。然后将具有硫酸铵的PEG-K374D应用于预先用在PBS中0.70M硫酸铵平衡的Capto苯基树脂柱(GE Healthcare)，比率为5mg聚乙二醇化蛋白/ml树脂。将加样的Capto苯基树脂用10个柱体积的在PBS中的0.70M硫酸铵洗涤。用从在PBS中0.70M硫酸铵至在PBS中0M硫酸铵的降低梯度洗脱PEG-K374D。集合在40％梯度洗脱(在PBS中0.42M硫酸铵)之后的洗脱级分。将集合的洗脱级分浓缩至浓度为1-2mg/mL，通过SDS-PAGE分析。使用CoronaTM Charged Aerosol Detector(Thermo Scientific,Sunnyvale,CA)检测游离PEG。
为了从PEG-R222Q/S265N中除去游离PEG，将3.5M硫酸铵加入在PBS中PEG-R222Q/S265N，达到终浓度为在PBS中0.64M硫酸铵。然后将具有硫酸铵的PEG-R222Q/S265N应用于预先用在PBS中0.64M硫酸铵平衡的Capto苯基树脂柱(GE Healthcare)，比率为5mg聚乙二醇化蛋白质/ml树脂。加样的Capto苯基树脂用10个柱体积的在PBS中0.64M硫酸铵洗涤。使用从在PBS中0.64M硫酸铵至在PBS中0M硫酸铵的降低梯度洗脱PEG-R222Q/S265N。集合在60％梯度洗脱(在PBS中0.256M硫酸铵)之后的洗脱级分。用20个柱体积15mM磷酸钠pH7.0的另外的洗脱液与第一次集合的洗脱级分集合在一起。集合的洗脱级分浓缩为浓度1-2mg/mL，通过SDS-PAGE分析。使用CoronaTM Charged Aerosol Detector(Thermo Scientific,Sunnyvale,CA)检测游离PEG。
游离PEG去除结果示于表50。结果显示PEG-K374D制备物的游离PEG量从大约3.7mg游离PEG/mg蛋白质降低至0.13mg游离PEG/mg蛋白质，PEG-R222Q/S265N制备物从3.8mg游离PEG/mg蛋白质降低至0.2mg/游离PEG/mg蛋白质。
实施例23：多泡脂质体(MVL)PH20配制物
对于全身性给予，透明质酸酶，包括可溶透明质酸酶，可以在脂质小泡如脂质体中制备。举例的这些脂质体是多泡脂质体(MVL)。使用如下一般程序制备各种缓释多泡脂质体PH20(MVL-PH20)配制物，也见国际PCT公开号WO 2012/109387和美国专利公开号2013/0251786所述。脂质溶液含有多种中性脂质的混合物，包括甘油三酯(TG)三油酸酯(C18:1)、三辛酸甘油酯(C8:0)和胆固醇，具有正电荷和负电荷的脂质，包括磷脂酰胆碱(PC)、二油酰磷脂酰胆碱(DOPC,C18:1)、二芥酰基磷脂酰胆碱(dierucoyl phosphatidylcholine)(DEPC,C22:1)及二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG，C16:1)。总PC浓度直至19.8mM，胆固醇浓度为30mM，TG浓度为直至3.9mM及DPPG浓度为4.2mM。
A.产生MVL-PH20配制物
制备含有不同摩尔百分比的DEPC与DOPC(0-100％及不同摩尔百分比的三油酸酯与三辛酸甘油酯(0-100％)、DPPG、胆固醇和0.1、0.25、0.5、1或2mg/mL PH20的MVL配制物。在第一步中，组合在氯仿中的脂质(油相)与在第一个水溶液中的PH20(水相)并乳化形成油包水乳状液，从而PH20被磷脂单层包囊。在第二个步骤中，加入第二个水溶液并乳化，从而形成水包油包水乳状液。在加入第二个水溶液的第二个等份后，通过蒸发除去氯仿，含有多泡脂质体的所得产物在第三个水溶液中洗涤多次并重悬浮至大约50％脂肪比容(包装的颗粒体积)并在2-8℃贮存。
使用小涡旋制备举例的配制物或者使用Omni混合器(Omni Macro ES,OmniInternational,Kennesaw,GA)较大规模制备。在后者Omni混合器方法中，将在氯仿中的脂质溶液(6mL)在7,000rpm使用Omni Mixer乳化8分钟，使用6mL第一个水溶液(10mM His-HCl,pH 6.5，具有含有不同浓度PH20的5％蔗糖溶液)，产生油包水乳状液。随后在4500rpm与20mL第二个水溶液(含有40mM赖氨酸pH 10.0的3.2％葡萄糖溶液)乳化1-3分钟，获得水包油包水的第二个乳状液。将第二个乳状液相同移至两个Erlenmeyer培养瓶中，在这两个培养瓶中加入另外50mL等份的第二个水溶液。通过在乳状液表面上在35℃氮气冲洗除去氯仿。含有PH20的MVL颗粒通过加入50mL第三个水溶液(25mM His-HCl缓冲液，pH 6.0，含有120mM NaCl)洗涤3次，通过倒置混合离心管，在冷却的台式离心机中在4℃以3500rpm离心10分钟。最后，将MVL颗粒重悬浮于第三个水溶液中以形成大约50％脂肪比容配制物并在2-8℃冷却贮存。所述小涡旋程序相似进行，使用表30所示参数。
下表51概括示出第一个、第二个和第三个水溶液。表51还概括示出MVL方法每个步骤的体积、试剂浓度及其它参数。
B.举例的MVL-PH20配制物概述
使用如上文所述相同的一般程序制备了含有不同摩尔比率的脂质、PH20及其它添加剂的一些MVL-PH20配制物。不同的另外的添加剂包含于第一个水溶液中以增强和保护包囊的PH20的稳定性。例如，配制物F68和F69含有氯化钙。配制物F82含有150μL甘油作为中间相分离600μL氯仿相与600μL第一个水溶液相。配制物F83含有0.1％葡聚糖40,000和0.1％PEG-6000。配制物F85-F87含有透明质酸(HA)寡聚物。一些配制物的混合/乳化方法不同。例如，对于配制物F66，第一个乳化步骤进行4分钟而不是8分钟，获得较小的脂质体团块。配制物F67用叶轮(rotor wheel)混合代替小涡旋以在混合期间产生较小剪切。
下表52示出了各种MVL-PH20配制物，包括配制物编号、配制物PC(磷脂酰胆碱)与TG(甘油三酯)摩尔比率％、PH20起始浓度mg/mL，用于产生乳状液的混合器，及包含于第一个水溶液中的任何添加剂。
1较短的第一次乳化混合时间(4分钟)
2动物衍生的胆固醇用于代替脂质溶液中植物衍生的胆固醇
3较短的第一次乳化混合时间(4分钟)和较短的第二次乳化混合时间(30秒)
实施例24：举例的ADA2变体及蛋白质修饰区的表格概述
表53提供了本发明举例说明的变体ADA2多肽的概述。该表提供了基于Zavialov和成熟序列编号的修饰位置，及包含这种修饰的ADA2变体蛋白的举例的SEQ ID NO:。应理解所述修饰可以组合及可以预期另外的变体。标示的氨基酸残基通常可以用保守氨基酸取代置换(见例如表3)，除外在其中保守取代将不产生糖基化位点的高糖基化情况中。因此，例如N可以由Q或H置换。本发明提供了包含每种标示的修饰的ADA2变体多肽。这些多肽包括其序列以序列标识符提及的那些多肽。本发明提供了任何修饰的组合。本发明还提供了修饰的ADA2变体二聚体，包括同源二聚体和异源二聚体。本发明还提供了变体的多聚体。本发明还提供了含有变体和多聚体和二聚体的缀合物，及如本文所述的治疗方法、治疗应用、组合和药物组合物。最后一列标示修饰的区域或结构域或者修饰赋予的活性。通常，所述突变例如增加活性、降低肝素结合、导入糖基化以干扰不希望的相互作用和/或增加血清半衰期、干扰或降低PRB结构域与ADA催化活性部分的相互作用和/或降低除了脱氨酶活性之外的活性如ADA2的生长因子活性，通过干扰与介导这种活性的受体结合进行。
由于修改为本领域技术人员显而易见，因此本发明仅受所附权利要求书的范围限制。

Claims (209)

1.一种变体腺苷脱氨酶2(ADA2)蛋白或者其催化活性部分，其在未修饰的ADA2多肽或其催化活性部分的氨基酸序列中包含一或多个修饰，其中：
所述未修饰的ADA2蛋白包含SEQ ID NO:5所示氨基酸序列，或者与SEQ ID NO:5所示氨基酸序列呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列，或者是其催化活性部分；
所述氨基酸修饰选自氨基酸置换、缺失和插入；
当是二聚体形式时，所述变体ADA2蛋白与SEQ ID NO:5的未修饰的ADA2蛋白的相应二聚体形式或者其相应的催化活性部分的二聚体形式相比，呈现选自如下的一或多种性质：增加的腺苷脱氨酶活性、降低的肝素结合、更长的血清半衰期、改变的pH最佳值、增加的热稳定性、改变的受体结合和高糖基化；及
当是二聚体形式时，所述变体ADA2蛋白呈现腺苷脱氨酶活性以将腺苷转变为肌苷。
2.权利要求1的变体ADA2蛋白或其催化活性部分，当是二聚体形式时，其呈现增加的腺苷脱氨酶活性及降低的肝素结合。
3.权利要求1或2的变体ADA2蛋白或其催化活性部分，其中所述未修饰的ADA2蛋白是同源二聚体，且单体形式包含SEQ ID NO:5所示氨基酸残基序列。
4.权利要求1或2的变体ADA2蛋白的催化活性部分，其中所述未修饰的ADA2蛋白是序列由SEQ ID NO:5示出的多肽的相应催化活性部分的同源二聚体，其中相应部分通过比对确定。
5.权利要求1-4任一项的变体ADA2蛋白或其催化活性部分，其中ADA2蛋白不包含选自如下氨基酸置换的修饰：相应于H7R、G18A、G18R、G18V、I64T、A80D、H83Q、V90A、C108G、A120V、H121R、W133G、R125C、R140Q、K141R、R142W、P164L、P222L、W235S、H306R、E330G、W333G、V365L、Y424C、F464S的氨基酸置换，或者相应于R8-K14del→--的缺失，编号参照SEQID NO:5所示氨基酸残基。
6.权利要求1-5任一项的变体ADA2蛋白或其催化活性部分，其中所述未修饰的ADA2蛋白包含与SEQ ID NO:5所示氨基酸序列或其相应催化活性部分呈现至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列相同性的氨基酸序列。
7.权利要求1-6任一项的变体ADA2蛋白或其催化活性部分，其中所述未修饰的ADA2蛋白与SEQ ID NO:5所示氨基酸序列或者与其相应催化活性部分具有至少95％序列相同性。
8.权利要求1-7任一项的变体ADA2蛋白，其中所述未修饰的ADA2蛋白包含SEQ ID NO:5、326-334、340、375和380-383任一所示氨基酸序列或者是其催化活性部分。
9.权利要求1-7任一项的变体ADA2蛋白，其中所述未修饰的ADA2蛋白由SEQ ID NO:5、326-334、340、375和380-383任一所示氨基酸序列组成或者是其催化活性部分。
10.权利要求1-7任一项的变体ADA2蛋白，其中所述未修饰的ADA2蛋白包含SEQ ID NO:5所示氨基酸序列或者其催化活性部分。
11.权利要求1-10任一项的变体ADA2蛋白，其中所述未修饰的ADA2蛋白的催化结构域具有SEQ ID NO:5所示蛋白的残基77-473所示的序列。
12.权利要求1-11任一项的变体ADA2蛋白或其催化活性部分，其中所述变体ADA2包含多达1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70或更多个氨基酸修饰。
13.权利要求1-12任一项的变体ADA2蛋白或其催化活性部分，其中所述变体包含多达2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸修饰。
14.权利要求1-13任一项的变体ADA2蛋白或其催化活性部分，其中所述ADA2蛋白变体的一级氨基酸序列不是由SEQ ID NO:1、5、68、286-302、326-342或374-383任一所示氨基酸序列组成。
15.权利要求1-14任一项的变体ADA2蛋白或其催化活性部分，其中当是二聚体形式时，所述变体ADA2蛋白呈现至少是或者至少大约是5×103M-1s-1、6×103M-1s-1、7×103M-1s-1、8×103M-1s-1、9×103M-1s-1、1×104M-1s-1、2×104M-1s-1、3×104M-1s-1、4×104M-1s-1、5×104M-1s-1、6×104M-1s-1、7×104M-1s-1、8×104M-1s-1、9×104M-1s-1、1×105M-1s-1、2×105M-1s-1、3×105M-1s-1、4×105M-1s-1、5×105M-1s-1或更高的催化效率(kcat/KM)。
16.权利要求1-15任一项的变体ADA2蛋白或其催化活性部分，其中当是二聚体形式时，所述变体ADA2蛋白呈现出解链温度(Tm)为至少58℃的热稳定性。
17.权利要求16的变体ADA2蛋白或其催化活性部分，其中所述Tm是至少59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、68℃、69℃、70℃、71℃、72℃或更高。
18.权利要求1-17任一项的变体ADA2蛋白或其催化活性部分，其中：
所述一或多个修饰是氨基酸置换；及
参照SEQ ID NO:5所示氨基酸位置，所述变体ADA2蛋白在相应于氨基酸残基11、13、20、22、26、86、179、217、219、221、258、262、264、266、267、277、283、296、309、317、321、352、366、371、372、373、374、403、404、405、406、441、444、452、461、469或470的氨基酸位置包含一或多个氨基酸置换。
19.权利要求1-17任一项的变体ADA2蛋白，其中参照SEQ ID NO:5所示氨基酸位置，所述变体ADA2蛋白在相应于氨基酸残基11、20、109、118、119、124、133、139、183、191、219、221、224、262、264、366、371、372或452的氨基酸位置包含一或多个氨基酸置换。
20.权利要求1-19任一项的变体ADA2蛋白或其催化活性部分，其中：
所述一或多个修饰是氨基酸置换；及
参照SEQ ID NO:5所示氨基酸位置，所述变体ADA2蛋白在相应于氨基酸残基219和262的位置之一或二者包含氨基酸置换。
21.权利要求1-19任一项的变体ADA2蛋白或其催化活性部分，其包含相应于S262N或S262Q的置换。
22.权利要求1-19任一项的变体ADA2蛋白或其催化活性部分，其包含相应于S262N的置换。
23.权利要求1-22任一项的变体ADA2蛋白或其催化活性部分，其包含相应于R219K、R219Q、R219N或R219A的置换。
24.权利要求1-23任一项的变体ADA2蛋白或其催化活性部分，其包含相应于R219Q的置换或者置换R219Q/R20E。
25.权利要求1-24任一项的变体ADA2蛋白或其催化活性部分，其包含相应于R219Q/S262N的置换。
26.权利要求25的变体ADA2蛋白或其催化活性部分，选自如下任何：R219Q/S262N/R20N/V22S、R219Q/S262N/K371N/D373S、R219Q/S262N/K372N/I374S、R219Q/S262N/T403N/H405S、R219Q/S262N/G404N/P406S、R219Q/S262N/C105-T147del→(Gly)15、R219Q/S262N/C105-T147del→(Gly)10、R219Q/S262N/C105-T147del→(Gly)7、R219Q/S262N/C105-T147del→(Gly)5、R219Q/S262N/C105-T147del→(Gly)3、R219Q/S262N/R125N/P126A、R219Q/S262N/S127N/K129S、R219Q/S262N/P126N/E128T、R219Q/S262N/R112N/I114T、R219Q/S262N/I134N/L135C/L136T、R219Q/S262N/I134N/L135S/L136T、R219Q/S262N/R142N/Q144S、R219Q/S262N/E137N/Y139T、R219Q/S262N/P111N/G113S、R219Q/S262N/F119S、R219Q/S262N/F119K、R219Q/S262N/Y224R、R219Q/S262N/Y224N、R219Q/S262N/Y191S、R219Q/S262N/Y191D、R219Q/S262N/F183K、R219Q/S262N/Y191D/Y224R、R219Q/S262N/F109S、R219Q/S262N/F109A、R219Q/S262N/R118D、R219Q/S262N/R118A、R219Q/S262N/Y139T、R219Q/S262N/Y139A、R219Q/S262N/W133S、R219Q/S262N/W133T、R219Q/S262N/P124A、R219Q/S262N/P124S、R219Q/S262N/V99-Q144del→(GGGGS)1、R219Q/S262N/V99-Q144del→(GGGGS)2、R219Q/S262N/V99-Q144del→(GGGGS)3、R219Q/S262N/C105-T147del→(GGGGS)1、R219Q/S262N/C105-T147del→(GGGGS)2、R219Q/S262N/C105-T147del→(GGGGS)3、R219Q/S262N/K371D/V99-Q144del→(GGGGS)1、R219Q/S262N/K371D/V99-Q144del→(GGGGS)2、R219Q/S262N/K371D/V99-Q144del→(GGGGS)3、R219Q/S262N/K371D/C105-T147del→(GGGGS)1、R219Q/S262N/K371D/C105-T147del→(GGGGS)2、R219Q/S262N/K371D/C105-T147del→(GGGGS)3、R219Q/S262N/C105-T147del→(Gly)n、R219Q/S262N/K11A、R219Q/S262N/K11D、R219Q/S262N/K11E、R219Q/S262N/K13A、R219Q/S262N/K13D、R219Q/S262N/V99-Q144del→(GGGGS)n、R219Q/S262N/C105-T147del→(GGGGS)n、R219Q/S262N/N98-N156del、R219Q/S262N/C105-E148del、R219Q/S262N/C105-T147del、R219Q/S262N/V99-Q144del、R219Q/S262N/K371D/C105-T147del→(Gly)n、R219Q/S262N/K371D/C105-T147del→(Gly)15、R219Q/S262N/K371D/C105-T147del→(Gly)10、R219Q/S262N/K371D/C105-T147del→(Gly)7、R219Q/S262N/K371D/C105-T147del→(Gly)5、R219Q/S262N/K371D/C105-T147del→(Gly)3、R219Q/S262N/K371D/V99-Q144del→(GGGGS)n、R219Q/S262N/K371D/C105-T147del→(GGGGS)n、R219Q/S262N/K371D/N98-N156del、R219Q/S262N/K371D/C105-E148del、R219Q/S262N/K371D/C105-T147del、R219Q/S262N/K371D/V99-Q144del、R219Q/S262N/K13E、R219Q/S262N/K371A、R219Q/S262N/K372A、R219Q/S262N/K372D、R219Q/S262N/K372E、R219Q/S262N/K452A、R219Q/S262N/K452D、R219Q/S262N/K452E、R219Q/S262N/R20A、R219Q/S262N/R20D、R219Q/S262N/R366A、R219Q/S262N/R366D、R219Q/S262N/R366E、R219Q/S262N/H264A、R219Q/S262N/H264Q、R219Q/S262N/H264N、R219Q/S262N/H264G、R219K/S262N、R219N/S262N、R219A/S262N、R219Q/S262N/L221A、R219Q/S262N/L221V、R219Q/S262N/L221G、R219Q/S262N/E179D、R219Q/S262N/E179A、R219Q/S262N/E179S、R219Q/S262N/E179T、R219Q/S262N/E179V、R219Q/S262N/E179G、R219Q/S262A、R219Q/S262V、R219Q/S262M、R219Q/S262N/K11A/R20A、R219Q/S262N/K11A/R20A/K371A、R219Q/S262N/R20A/K371A、R219Q/S262N/K11A/K371A、R219Q/S262N/K26A、R219Q/S262N/K26D、R219Q/S262N/K26E、R219Q/S262N/R217A、R219Q/S262N/R217D、R219Q/S262N/R217E、R219Q/S262N/K258A、R219Q/S262N/K258D、R219Q/S262N/K258E、R219Q/S262N/R277A、R219Q/S262N/R277D、R219Q/S262N/R277E、R219Q/S262N/R283A、R219Q/S262N/R283D、R219Q/S262N/R283E、R219Q/S262N/K309A、R219Q/S262N/K309D、R219Q/S262N/K309E、R219Q/S262N/K317A、R219Q/S262N/K317D、R219Q/S262N/K317E、R219Q/S262N/K321A、R219Q/S262N/K321D、R219Q/S262N/K321E、R219Q/S262N/R352A、R219Q/S262N/R352D、R219Q/S262N/R352E、R219Q/S262N/R441A、R219Q/S262N/R441D、R219Q/S262N/R441E、R219Q/S262N/K444A、R219Q/S262N/K444D、R219Q/S262N/K444E、R219Q/S262N/K461A、R219Q/S262N/K461D、R219Q/S262N/K461E、R219Q/S262N/K469A、R219Q/S262N/K469D、R219Q/S262N/K469E、R219Q/S262N/K470A、R219Q/S262N/K470D、R219Q/S262N/K470E、R219Q/S262N/D86A、R219Q/S262N/D86C、R219Q/S262N/D86E、R219Q/S262N/D86F、R219Q/S262N/D86G、R219Q/S262N/D86H、R219Q/S262N/D86I、R219Q/S262N/D86K、R219Q/S262N/D86L、R219Q/S262N/D86M、R219Q/S262N/D86N、R219Q/S262N/D86P、R219Q/S262N/D86Q、R219Q/S262N/D86R、R219Q/S262N/D86S、R219Q/S262N/D86T、R219Q/S262N/D86V、R219Q/S262N/D86W、R219Q/S262N/D86Y、R219Q/S262N/E179C、R219Q/S262N/E179F、R219Q/S262N/E179H、R219Q/S262N/E179I、R219Q/S262N/E179K、R219Q/S262N/E179L、R219Q/S262N/E179M、R219Q/S262N/E179N、R219Q/S262N/E179P、R219Q/S262N/E179Q、R219Q/S262N/E179R、R219Q/S262N/E179W、R219Q/S262N/E179Y、R219C/S262N、R219D/S262N、R219E/S262N、R219F/S262N、R219G/S262N、R219H/S262N、R219I/S262N、R219L/S262N、R219M/S262N、R219P/S262N、R219S/S262N、R219T/S262N、R219V/S262N、R219W/S262N、R219Y/S262N、R219Q/S262N/L221C、R219Q/S262N/L221D、R219Q/S262N/L221E、R219Q/S262N/L221F,R219Q/S262N/L221H,R219Q/S262N/L221I、R219Q/S262N/L221K、R219Q/S262N/L221M、R219Q/S262N/L221N、R219Q/S262N/L221P、R219Q/S262N/L221Q、R219Q/S262N/L221R、R219Q/S262N/L221S、R219Q/S262N/L221T、R219Q/S262N/L221W、R219Q/S262N/L221Y、R219Q/S262C、R219Q/S262D、R219Q/S262E、R219Q/S262F、R219Q/S262G、R219Q/S262H、R219Q/S262I、R219Q/S262K、R219Q/S262L、R219Q/S262P、R219Q/S262Q、R219Q/S262R、R219Q/S262T、R219Q/S262W、R219Q/S262Y、R219Q/S262N/H264C、R219Q/S262N/H264D、R219Q/S262N/H264E、R219Q/S262N/H264F、R219Q/S262N/H264I、R219Q/S262N/H264K、R219Q/S262N/H264L、R219Q/S262N/H264M、R219Q/S262N/H264P、R219Q/S262N/H264R、R219Q/S262N/H264S、R219Q/S262N/H264T、R219Q/S262N/H264V、R219Q/S262N/H264W、R219Q/S262N/H264Y、R219Q/S262N/S266A、R219Q/S262N/S266C、R219Q/S262N/S266D、R219Q/S262N/S266E、R219Q/S262N/S266F、R219Q/S262N/S266G、R219Q/S262N/S266H、R219Q/S262N/S266I、R219Q/S262N/S266K、R219Q/S262N/S266L、R219Q/S262N/S266M、R219Q/S262N/S266N、R219Q/S262N/S266P、R219Q/S262N/S266Q、R219Q/S262N/S266R、R219Q/S262N/S266T、R219Q/S262N/S266V、R219Q/S262N/S266W、R219Q/S262N/S266Y、R219Q/S262N/K267A、R219Q/S262N/K267C、R219Q/S262N/K267D、R219Q/S262N/K267E、R219Q/S262N/K267F、R219Q/S262N/K267G、R219Q/S262N/K267H、R219Q/S262N/K267I、R219Q/S262N/K267L、R219Q/S262N/K267M、R219Q/S262N/K267N、R219Q/S262N/K267P、R219Q/S262N/K267Q、R219Q/S262N/K267R、R219Q/S262N/K267S、R219Q/S262N/K267T、R219Q/S262N/K267V、R219Q/S262N/K267W、R219Q/S262N/K267Y、R219Q/S262N/V296A、R219Q/S262N/V296C、R219Q/S262N/V296D、R219Q/S262N/V296E、R219Q/S262N/V296F、R219Q/S262N/V296G、R219Q/S262N/V296H、R219Q/S262N/V296I、R219Q/S262N/V296K、R219Q/S262N/V296L、R219Q/S262N/V296M、R219Q/S262N/V296N、R219Q/S262N/V296P、R219Q/S262N/V296Q、R219Q/S262N/V296R、R219Q/S262N/V296S、R219Q/S262N/V296T、R219Q/S262N/V296W和R219Q/S262N/V296Y。
27.权利要求24的变体ADA2蛋白或其催化活性部分，其中所述变体ADA2蛋白包含选自如下的氨基酸置换：R219Q/K11A/R20A、R219Q/K11A/R20A/K371A、R219Q/R20A/K371A、R219Q/K11A/K371A、S262N/K11A/R20A、S262N/K11A/R20A/K371A、S262N/R20A/K371A、S262N/K11A/K371A、R219Q/C105-T147del→(Gly)n、R219Q/V99-Q144del→(GGGGS)n、R219Q/C105-T147del→(GGGGS)n、R219Q/N98-N156del、R219Q/C105-E148del、R219Q/C105-T147del、R219Q/V99-Q144del、S262N/C105-T147del→(Gly)n、S262N/V99-Q144del→(GGGGS)n、S262N/C105-T147del→(GGGGS)n、S262N/N98-N156del、S262N/C105-E148del、S262N/C105-T147del和S262N/V99-Q144del。
28.权利要求18-27任一项的变体ADA2蛋白，其中当是二聚体形式时，所述变体ADA2蛋白呈现未修饰的ADA2的相应二聚体形式的至少110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％、200％、225％、250％、300％、350％、400％、450％、500％、600％、700％、800％或更高的活性，其中腺苷脱氨酶活性是在相同条件下评定的。
29.权利要求28的变体ADA2蛋白，其中当是二聚体形式时，所述变体ADA2蛋白呈现出与未修饰的ADA2蛋白的相应二聚体形式的催化效率(kcat/KM)相比至少或者至少大约1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2.0倍、2.2倍、2.5倍、3.0倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5.0倍、6.0倍、7.0倍、8.0倍、9.0倍、10.0倍或更多倍的催化效率(kcat/KM)，其中腺苷脱氨酶活性的催化效率是在相同条件下评定的。
30.权利要求28或29的变体ADA2蛋白，其中当是二聚体形式时，所述变体ADA2呈现出至少或者至少大约2×104M-1s-1、3×104M-1s-1、4×104M-1s-1、5×104M-1s-1、6×104M-1s-1、7×104M-1s-1、8×104M-1s-1、9×104M-1s-1、1×105M-1s-1、2×105M-1s-1、3×105M-1s-1、4×105M-1s-1、5×105M-1s-1或更高的催化效率(kcat/KM)。
31.权利要求1-25任一项的变体ADA2蛋白或其催化活性部分，其中所述变体ADA2蛋白包含选自如下的氨基酸置换：K371D/V99-Q144del→(GGGGS)1、K371D/V99-Q144del→(GGGGS)2、K371D/V99-Q144del→(GGGGS)3、K371D/C105-T147del→(GGGGS)1、K371D/C105-T147del→(GGGGS)2、K371D/C105-T147del→(GGGGS)3、R219Q/S262N/--→N1/--→A2/--→S3、K371D/C105-T147del→(Gly)n、K371D/C105-T147del→(Gly)15、K371D/C105-T147del→(Gly)10、K371D/C105-T147del→(Gly)7、K371D/C105-T147del→(Gly)5、K371D/C105-T147del→(Gly)3、K371D/V99-Q144del→(GGGGS)n、K371D/C105-T147del→(GGGGS)n、K371D/N98-N156del、K371D/C105-E148del、K371D/C105-T147del和K371D/V99-Q144del。
32.权利要求1-25任一项的变体ADA2蛋白或其催化活性部分，其中所述变体ADA2蛋白包含选自如下的氨基酸置换：R125N/P126A、S127N/K129S、P126N/E128T、R112N/I114T、I134N/L135C/L136T、I134N/L135S/L136T、R142N/Q144S、E137N/Y139T、P111N/G113S、F119S、F119K、Y224R、Y224N、Y191S、Y191D、F183K、Y191D/Y224R、F109S、F109A、R118D、R118A、Y139T、Y139A、W133S、W133T、P124A、P124S、V99-Q144del→(GGGGS)n、C105-T147del→(GGGGS)n、V99-Q144del→(GGGGS)1、V99-Q144del→(GGGGS)2、V99-Q144del→(GGGGS)3、C105-T147del→(GGGGS)1、C105-T147del→(GGGGS)2和C105-T147del→(GGGGS)3。
33.权利要求1-32任一项的变体ADA2蛋白，其中参照SEQ ID NO:5所示氨基酸位置，所述变体ADA2蛋白包含选自相应于如下的置换的一或多个氨基酸置换：K11A、K11D、K11E、K13A、K13D、K13E、R20A、R20D、R20E、R20N、V22S、K26A、K26D、K26E、D86A、D86C、D86E、D86F、D86G、D86H、D86I、D86K、D86L、D86M、D86N、D86P、D86Q、D86R、D86S、D86T、D86V、D86W、D86Y、E179A、E179C、E179D、E179F、E179G、E179H、E179I、E179K、E179L、E179M、E179N、E179P、E179Q、E179R、E179S、E179T、E179V、E179W、E179Y、R217A、R217D、R217E、R219A、R219C、R219D、R219E、R219F、R219G、R219H、R219I、R219K、R219L、R219M、R219N、R219P、R219Q、R219S、R219T、R219V、R219W、R219Y、L221A、L221C、L221D、L221E、L221F、L221G、L221H、L221I、L221K、L221M、L221N、L221P、L221Q、L221R、L221S、L221T、L221V、L221W、L221Y、K258A、K258D、K258E、S262A、S262C、S262D、S262E、S262F、S262G、S262H、S262I、S262K、S262L、S262M、S262N、S262P、S262Q、S262R、S262T、S262V、S262W、S262Y、H264A、H264C、H264D、H264E、H264F、H264G、H264I、H264K、H264L、H264M、H264N、H264P、H264Q、H264R、H264S、H264T、H264V、H264W、H264Y、S266A、S266C、S266D、S266E、S266F、S266G、S266H、S266I、S266K、S266L、S266M、S266N、S266P、S266Q、S266R、S266T、S266V、S266W、S266Y、K267A、K267C、K267D、K267E、K267F、K267G、K267H、K267I、K267L、K267M、K267N、K267P、K267Q、K267R、K267S、K267T、K267V、K267W、K267Y、R277A、R277D、R277E、R283A、R283D、R283E、V296A、V296C、V296D、V296E、V296F、V296G、V296H、V296I、V296K、V296L、V296M、V296N、V296P、V296Q、V296R、V296S、V296T、V296W、V296Y、K309A、K309D、K309E、K317A、K317D、K317E、K321A、K321D、K321E、R352A、R352D、R352E、R366A、R366D、R366E、K371A、K371D、K371E、K371N、K372A、K372D、K372E、K372N、D373S、I374S、T403N、G404N、H405S、P406S、R441A、R441D、R441E、K444A、K444D、K444E、K452A、K452D、K452E、K461A、K461D、K461E、K469A、K469D、K469E、K470A、K470D和K470E。
34.权利要求1-33任一项的变体ADA2蛋白或其催化活性部分，其中所述变体ADA2蛋白包含选自相应于如下的置换的一或多个氨基酸置换：H264A、H264Q、H264N、H264G、R219K、R219Q、R219N、R219A、L221A、L221V、L221G、E179D、E179A、E179S、E179T、E179V、E179G、S262A、S262V、S262M、S262N、D86A、D86C、D86E、D86F、D86G、D86H、D86I、D86K、D86L、D86M、D86N、D86P、D86Q、D86R、D86S、D86T、D86V、D86W、D86Y、E179C、E179F、E179H、E179I、E179K、E179L、E179M、E179N、E179P、E179Q、E179R、E179W、E179Y、R219C、R219D、R219E、R219F、R219G、R219H、R219I、R219L、R219M、R219P、R219S、R219T、R219V、R219W、R219Y、L221C、L221D、L221E、L221F、L221H、L221I、L221K、L221M、L221N、L221P、L221Q、L221R、L221S、L221T、L221W、L221Y、S262C、S262D、S262E、S262F、S262G、S262H、S262I、S262K、S262L、S262P、S262Q、S262R、S262T、S262W、S262Y、H264C、H264D、H264E、H264F、H264I、H264K、H264L、H264M、H264P、H264R、H264S、H264T、H264V、H264W、H264Y、S266A、S266C、S266D、S266E、S266F、S266G、S266H、S266I、S266K、S266L、S266M、S266N、S266P、S266Q、S266R、S266T、S266V、S266W、S266Y、K267A、K267C、K267D、K267E、K267F、K267G、K267H、K267I、K267L、K267M、K267N、K267P、K267Q、K267R、K267S、K267T、K267V、K267W、K267Y、V296A、V296C、V296D、V296E、V296F、V296G、V296H、V296I、V296K、V296L、V296M、V296N、V296P、V296Q、V296R、V296S、V296T、V296W和V296Y。
35.权利要求1-34任一项的变体ADA2蛋白，其中所述变体ADA2蛋白包含选自如下的一或多个氨基酸置换：R125N/P126A、S127N/K129S、P126N/E128T、R112N/I114T、I134N/L135C/L136T、I134N/L135S/L136T、R142N/Q144S、E137N/Y139T、P111N/G113S、F119S、F119K、Y224R、Y224N、Y191S、Y191D、F183K、Y191D/Y224R、F109S、F109A、R118D、R118A、Y139T、Y139A、W133S、W133T、P124A、P124S、V99-Q144del、V99-Q144del→(GGGGS)n、C105-T147del→(GGGGS)n、V99-Q144del→(GGGGS)1、V99-Q144del→(GGGGS)2、V99-Q144del→(GGGGS)3、C105-T147del→(GGGGS)1、C105-T147del→(GGGGS)2和C105-T147del→(GGGGS)3。
36.权利要求18-35任一项的变体ADA2蛋白，其中参照SEQ ID NO:5所示氨基酸位置，所述变体ADA2蛋白包含选自如下的一或多个氨基酸置换：K11A、K11E、R20A、R20E、R219K、R219Q、L221A、L221V、L221G、S262N、H264Q、H264G、R366E、K371A、K371D、K371E、K372D、K372E、K452D和K452E。
37.权利要求1-36任一项的变体ADA2蛋白，其中参照SEQ ID NO:5所示氨基酸位置，所述变体ADA2蛋白包含选自如下的氨基酸置换：K11A/R20A、K11A/R20A/K371A、R20A/K371A、K11A/K371A、S262N/K371D、S262N/K371E、S262N/R20E、S262N/R20E/K371D、S262N/R20E/K371E、R219Q/K371E、R219Q/K371D、R219Q/R20E、R219Q/K371E/R20E、R219Q/K371D/R20E、R219Q/S262N/K371E、R219Q/S262N/K371D、R219Q/S262N/R20E、R219Q/S262N/K371E/R20E、R219Q/S262N/K371D/R20E和R219Q/S262N。
38.权利要求1-36任一项的变体ADA2蛋白或其催化活性部分，其中当是二聚体形式时，所述变体ADA2蛋白与SEQ ID NO:5所示ADA2蛋白或其相应催化活性部分相比呈现出降低的肝素结合。
39.权利要求38的变体ADA2蛋白或其催化活性部分，其中当是二聚体形式时，所述变体ADA2蛋白呈现出不超过未修饰的ADA2蛋白的相应二聚体形式的肝素结合的1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％，其中肝素结合是在相同条件下评定的。
40.权利要求39的变体ADA2蛋白或其催化活性部分，其中参照SEQ ID NO:5所示氨基酸位置，所述变体ADA2蛋白在相应于氨基酸残基20、262、366、371、372或452的氨基酸位置包含一或多个氨基酸置换。
41.权利要求1-30任一项的变体ADA2蛋白或其催化活性部分，其包含相应于如下的一或多个氨基酸置换：K11A、K11D、K11E、K13A、K13D、K13E、K371A、K371D、K371E、K372A、K372D、K372E、K452A、K452D、K452E、R20A、R20D、R20E、R366A、R366D、R366E、K26A、K26D、K26E、R217A、R217D、R217E、K258A、K258D、K258E、R277A、R277D、R277E、R283A、R283D、R283E、K309A、K309D、K309E、K317A、K317D、K317E、K321A、K321D、K321E、R352A、R352D、R352E、R441A、R441D、R441E、K444A、K444D、K444E、K461A、K461D、K461E、K469A、K469D、K469E、K470A、K470D和K470E。
42.权利要求38-41任一项的变体ADA2蛋白或其催化活性部分，其中参照SEQ ID NO:5所示氨基酸位置，所述变体ADA2蛋白包含选自如下的一或多个氨基酸置换：R20A、R20D、R20E、S262N、R366A、R366D、R366E、K371A、K371D、K371E、K372A、K372D、K372E和K452E。
43.权利要求37-41任一项的变体ADA2蛋白或其催化活性部分，其中参照SEQ ID NO:5所示氨基酸位置，所述变体ADA2蛋白包含选自如下的氨基酸置换：K11A/R20A、K11A/R20A/K371A、R20A/K371A、K11A/K371A、S262N/K371D、S262N/K371E、S262N/R20E、S262N/R20E/K371D和S262N/R20E/K371E。
44.权利要求18-35任一项的变体ADA2蛋白或其催化活性部分，其包含相应于如下的修饰：R219Q/S262N/--→N1/--→A2/--→S3、R219Q/S262N/R20N/V22S、R219Q/S262N/K371N/D373S、R219Q/S262N/K372N/I374S、R219Q/S262N/T403N/H405S或者R219Q/S262N/G404N/P406S。
45.权利要求1-43任一项的变体ADA2蛋白或其催化活性部分，其中当是二聚体形式时，所述变体ADA2蛋白呈现出更长的血清半衰期(t1/2)。
46.权利要求45的变体ADA2蛋白或其催化活性部分，其中当是二聚体形式时，所述变体ADA2蛋白呈现出是未修饰的ADA2蛋白的二聚体形式在相应条件的半衰期的至少或至少大约110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％、200％、225％、250％、300％、350％、400％、450％、500％、600％、700％、800％或更长的半衰期，其中半衰期是相同评定的。
47.权利要求1-46任一项的变体ADA2蛋白或其催化活性部分，其中当是二聚体形式时，所述变体ADA2蛋白呈现出增加的热稳定性。
48.权利要求47的变体ADA2蛋白或其催化活性部分，其中当是二聚体形式时，所述变体ADA2蛋白呈现出解链温度(Tm)与未修饰的ADA2蛋白的相应二聚体形式的Tm相比增加至少或至少大约0.5℃、1.0℃、2.0℃、3.0℃、4.0℃、5.0℃、6.0℃、7.0℃、8.0℃、9.0℃、10.0℃或更高的热稳定性，其中Tm是在相同条件下评定的。
49.权利要求47或48的变体ADA2蛋白或其催化活性部分，其中所述变体ADA2蛋白具有至少或至少大约67.6℃、67.8℃、68.0℃、68.2℃、68.4℃、68.6℃、68.8℃、69.0℃、69.2℃、69.4℃、69.6℃、69.8℃、70.0℃、70.2℃、70.4℃、70.6℃、70.8℃、71.0℃、71.2℃、71.4℃、71.6℃、71.8℃或更高的解链温度(Tm)。
50.权利要求1-31任一项的变体ADA2蛋白或其催化活性部分，其中所述变体或其催化活性部分在pH 6.5±0.2或在大约pH 6.5±0.2呈现腺苷脱氨酶活性。
51.权利要求1-50任一项的变体ADA2蛋白或其催化活性部分，其中当是二聚体形式时，所述变体ADA2蛋白对于腺苷脱氨酶活性呈现出改变的pH最佳值。
52.权利要求51的变体ADA2蛋白或其催化活性部分，其中当是二聚体形式时，所述变体ADA2蛋白对于腺苷脱氨酶活性呈现出的pH最佳值与未修饰的ADA2的相应二聚体形式的pH最佳值相比是更高的pH。
53.权利要求52的变体ADA2蛋白或其催化活性部分，其中当是二聚体形式时，所述变体ADA2蛋白的pH最佳值是至少或至少大约6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5或更高的pH。
54.权利要求51的变体ADA2蛋白，其中当是二聚体形式时，所述变体ADA2蛋白呈现出对于腺苷脱氨酶活性的pH最佳值与未修饰的ADA2的相应二聚体形式的pH最佳值相比是更低的pH。
55.权利要求51的变体ADA2蛋白，其中当是二聚体形式时，所述变体ADA2蛋白的pH最佳值是低于或者低于大约6.5、6.4、6.3、6.3、6.2、6.1、6.0或更低的pH。
56.权利要求1-54任一项的变体ADA2蛋白或其催化活性部分，其包含一或多个另外的糖基化位点。
57.权利要求56的变体ADA2蛋白或其催化活性部分，其包含相应于选自如下的一或多个修饰的修饰：--→N1/--→A2/--→S3、R20N/V22S、K371N/D373S、K372N/I374S、T403N/H405S及G404N/P406S。
58.权利要求18-35任一项的变体ADA2蛋白或其催化活性部分，其包含相应于如下的氨基酸置换：R219Q/S262N/R125N/P126A、R219Q/S262N/S127N/K129S、R219Q/S262N/P126N/E128T、R219Q/S262N/R112N/I114T、R219Q/S262N/I134N/L135C/L136T、R219Q/S262N/I134N/L135S/L136T、R219Q/S262N/R142N/Q144S、R219Q/S262N/E137N/Y139T或R219Q/S262N/P111N/G113S。
59.权利要求56的变体ADA2蛋白或其催化活性部分，其在推定的受体结合结构域(PRB)中包含相应于选自如下的一或多个修饰的修饰：R125N/P126A、S127N/K129S、P126N/E128T、R112N/I114T、I134N/L135C/L136T、I134N/L135S/L136T、R142N/Q144S、E137N/Y139T、和P111N/G113S。
60.权利要求1-58任一项的变体ADA2蛋白或其催化活性部分，其中所述变体ADA2蛋白在推定的受体结合(PRB)中包含一或多个氨基酸的修饰，其中所述修饰是氨基酸缺失、插入或置换及其组合，条件是所述修饰不相应于氨基酸置换C108G、A120V、H121R、R125C、R140Q、K141R或R142W。
61.权利要求60的变体ADA2蛋白或其催化活性部分，其中：
其催化活性部分缺少全部或部分的推定的受体结合(PRB)结构域或者具有PRB的修饰，从而任何受体结合或生长因子活性被降低或消除，或者ADA2的除了脱氨酶活性之外的其它活性被降低或消除，或者与ADA结构域的相互作用被降低或消除；及
所述PRB结构域相应于SEQ ID NO:5所示残基98-156。
62.权利要求61的变体ADA2蛋白或其催化活性部分，其缺少残基105-148或者105-147或者99-144。
63.权利要求61或62的变体ADA2蛋白或其催化活性部分，其中所述变体ADA2蛋白的催化活性部分包含SEQ ID NO:548-550和579任一所示氨基酸序列。
64.权利要求60-63任一项的变体ADA2蛋白或其催化活性部分，其包含所述PRB结构域全部或部分的缺失及任选包含肽接头的插入。
65.权利要求60-64任一项的变体ADA2蛋白或其催化活性部分，其中参照SEQ ID NO:5所示氨基酸位置，所述变体ADA2蛋白包含一或多个连续氨基酸残基的缺失，所述一或多个连续氨基酸残基的缺失相应于在或在大约氨基酸残基98和156之间或者氨基酸残基105和148之间(含)的任一或多个连续氨基酸残基。
66.权利要求65的变体ADA2蛋白或其催化活性部分，其中所述变体ADA2蛋白进一步包含用肽接头取代缺失的区域。
67.权利要求66的变体ADA2蛋白或其催化活性部分，其中所述肽接头选自(Gly)n(SEQID NO:368)，其中n是2-20；(GGGGS)n(SEQ ID NO:343)，其中n是1-6；(SSSSG)n(SEQ ID NO:344)，其中n是1-6；(AlaAlaProAla)n(SEQ ID NO:350)，其中n是1-6；GKSSGSGSESKS(SEQ IDNO:345)；GGSTSGSGKSSEGKG(SEQ ID NO:346)；GSTSGSGKSSSEGSGSTKG(SEQ ID NO:347)；GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:348)及EGKSSGSGSESKEF(SEQ ID NO:349)。
68.权利要求66或67的变体ADA2蛋白或其催化活性部分，其中所述肽接头选自GGG(SEQID NO:369)、GGGGG(SEQ ID NO:360)、GGGGGGG(SEQ ID NO:370)、GGGGGGGGGG(SEQ ID NO:371)和GGGGGGGGGGGGGGG(SEQ ID NO:372)。
69.权利要求60-68任一项的变体ADA2蛋白或其催化活性部分，其中参照SEQ ID NO:5所示氨基酸位置，所述PRB结构域中的修饰相应于C105-T147del→(Gly)n，其中n是2-20。
70.权利要求60-69任一项的变体ADA2蛋白或其催化活性部分，其中参照SEQ ID NO:5所示氨基酸位置，所述PRB结构域中的修饰相应于C105-T147del→(Gly)15、C105-T147del→(Gly)10、C105-T147del→(Gly)7、C105-T147del→(Gly)5或者C105-T147del→(Gly)3。
71.权利要求60-70任一项的变体ADA2蛋白或其催化活性部分，其在所述PRB结构域中包含相应于且选自如下的修饰：参照SEQ ID NO:5所示氨基酸位置，C105-T147del→(Gly)n，其中n＝2-20；C105-T147del→(Gly)15；C105-T147del→(Gly)10；C105-T147del→(Gly)7；C105-T147del→(Gly)5；C105-T147del→(Gly)3；N98-N156del；C105-E148del；C105-T147del；V99-Q144del；V99-Q144del→(GGGGS)n，其中n＝1-5；C105-T147del→(GGGGS)n，其中n＝1-5；V99-Q144del→(GGGGS)1；V99-Q144del→(GGGGS)2；V99-Q144del→(GGGGS)3；C105-T147del→(GGGGS)1；C105-T147del→(GGGGS)2及C105-T147del→(GGGGS)3。
72.权利要求59-70任一项的变体ADA2蛋白或其催化活性部分，其包含选自相应于SEQID NO:5的F119S、F119K、Y224R、Y224N、Y191S、Y191D、F183K、Y191D/Y224R、F109S、F109A、R118D、R118A、Y139T、Y139A、W133S、W133T、P124A、及P124S的置换的氨基酸置换。
73.权利要求59-72任一项的变体ADA2蛋白或其催化活性部分，其包含选自相应于如下的置换的氨基酸置换：R219Q/S262N/F119S、R219Q/S262N/F119K、R219Q/S262N/Y224R、R219Q/S262N/Y224N、R219Q/S262N/Y191S、R219Q/S262N/Y191D、R219Q/S262N/F183K、R219Q/S262N/Y191D/Y224R、R219Q/S262N/F109S、R219Q/S262N/F109A、R219Q/S262N/R118D、R219Q/S262N/R118A、R219Q/S262N/Y139T、R219Q/S262N/Y139A、R219Q/S262N/W133S、R219Q/S262N/W133T、R219Q/S262N/P124A和R219Q/S262N/P124S。
74.权利要求59-72任一项的变体ADA2蛋白或其催化活性部分，其包含选自相应于如下的置换的氨基酸置换：K371D/V99-Q144del→(GGGGS)1；K371D/V99-Q144del→(GGGGS)2；K371D/V99-Q144del→(GGGGS)3；K371D/C105-T147del→(GGGGS)1；K371D/C105-T147del→(GGGGS)2；K371D/C105-T147del→(GGGGS)3；R219Q/S262N/C105-T147del→(Gly)15；R219Q/S262N/C105-T147del→(Gly)10；R219Q/S262N/C105-T147del→(Gly)7；R219Q/S262N/C105-T147del→(Gly)5；R219Q/S262N/C105-T147del→(Gly)3；R219Q/S262N/V99-Q144del→(GGGGS)1；R219Q/S262N/V99-Q144del→(GGGGS)2；R219Q/S262N/V99-Q144del→(GGGGS)3；R219Q/S262N/C105-T147del→(GGGGS)1；R219Q/S262N/C105-T147del→(GGGGS)2；R219Q/S262N/C105-T147del→(GGGGS)3；R219Q/S262N/K371D/V99-Q144del→(GGGGS)1；R219Q/S262N/K371D/V99-Q144del→(GGGGS)2；R219Q/S262N/K371D/V99-Q144del→(GGGGS)3；R219Q/S262N/K371D/C105-T147del→(GGGGS)1；R219Q/S262N/K371D/C105-T147del→(GGGGS)2；R219Q/S262N/K371D/C105-T147del→(GGGGS)3；K371D/C105-T147del→(Gly)n，其中n＝2-20；K371D/C105-T147del→(Gly)15；K371D/C105-T147del→(Gly)10；K371D/C105-T147del→(Gly)7；K371D/C105-T147del→(Gly)5；K371D/C105-T147del→(Gly)3；K371D/V99-Q144del→(GGGGS)n，其中n＝1-5；K371D/C105-T147del→(GGGGS)n，其中＝1-5；K371D/N98-N156del；K371D/C105-E148del；K371D/C105-T147del；K371D/V99-Q144del；R219Q/S262N/C105-T147del→(Gly)n，其中n＝2-20；R219Q/S262N/V99-Q144del→(GGGGS)n，其中n＝1-5；R219Q/S262N/C105-T147del→(GGGGS)n，其中n＝1-5；R219Q/S262N/N98-N156del；R219Q/S262N/C105-E148del；R219Q/S262N/C105-T147del；R219Q/S262N/V99-Q144del；R219Q/S262N/K371D/C105-T147del→(Gly)n，其中n＝2-20；R219Q/S262N/K371D/C105-T147del→(Gly)15；R219Q/S262N/K371D/C105-T147del→(Gly)10；R219Q/S262N/K371D/C105-T147del→(Gly)7；R219Q/S262N/K371D/C105-T147del→(Gly)5；R219Q/S262N/K371D/C105-T147del→(Gly)3；R219Q/S262N/K371D/V99-Q144del→(GGGGS)n，其中n＝1-5；R219Q/S262N/K371D/C105-T147del→(GGGGS)n，其中n＝1-5；R219Q/S262N/K371D/N98-N156del；R219Q/S262N/K371D/C105-E148del；R219Q/S262N/K371D/C105-T147del；R219Q/S262N/K371D/V99-Q144del；R219Q/C105-T147del→(Gly)n，其中n＝2-20；R219Q/V99-Q144del→(GGGGS)n，其中n＝1-5；R219Q/C105-T147del→(GGGGS)n，其中n＝1-5；R219Q/N98-N156del；R219Q/C105-E148del；R219Q/C105-T147del；R219Q/V99-Q144del；S262N/C105-T147del→(Gly)n，其中n＝2-20；S262N/V99-Q144del→(GGGGS)n，其中n＝1-5；S262N/C105-T147del→(GGGGS)n，其中n＝1-5；S262N/N98-N156del；及S262N/C105-E148del；S262N/C105-T147del；以及S262N/V99-Q144del。
75.权利要求59-74任一项的变体ADA2蛋白或其催化活性部分，其中当是二聚体形式时，与未修饰的ADA2多肽在相同条件下与相同受体的结合相比，所述变体ADA2呈现出降低的与选自A1、A2A、A2B和A3的任一或多个腺苷受体(ADR)的结合。
76.权利要求75的变体ADA2蛋白或其催化活性部分，其中所述结合降低至少或至少大约0.5倍、1倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更多。
77.权利要求1-76任一项的变体ADA2蛋白或其催化活性部分，其中所述变体ADA2蛋白包含通过导入非天然糖基化位点而改变糖基化的一或多个修饰，从而当在能糖基化的细胞中表达时，所述变体ADA2与未修饰的ADA2蛋白相比是高糖基化的。
78.权利要求77的变体ADA2蛋白或其催化活性部分，其中所述非天然糖基化位点通过氨基酸置换或者插入1、2或3个氨基酸而导入。
79.权利要求77或78的变体ADA2蛋白或其催化活性部分，其中参照SEQ ID NO:5所示氨基酸位置，所述修饰选自相应于如下的修饰：--→N1/--→A2/--→S3、R20N/V22S、K371N/D373S、K372N/I374S、T403N/H405S和G404N/P406S。
80.权利要求1-79任一项的变体ADA2蛋白或其催化活性部分，其是分离的或纯化的。
81.权利要求1-80任一项的变体ADA2蛋白，其中所述变体ADA2蛋白与SEQ ID NO:5或其相应催化活性部分具有至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列相同性。
82.权利要求1的变体ADA2蛋白或其催化活性部分，其中所述变体ADA2蛋白包含SEQ IDNO:13-63或71-285任一所示氨基酸序列或者其催化活性部分。
83.权利要求1的变体ADA2蛋白或其催化活性部分，其中所述变体ADA2蛋白包含SEQ IDNO:551-579或581-931任一所示氨基酸序列或者其催化活性部分。
84.权利要求1-81任一项的变体ADA2蛋白或其催化活性部分，参照SEQ ID NO:5，其包含选自相应于如下的置换的氨基酸置换：K11A/R20A、K11A/R20A/K371A、R20A/K371A、K11A/K371A、S262N/K371D、S262N/K371E、S262N/R20E、S262N/R20E/K371D、S262N/R20E/K371E、R219Q/K371E、R219Q/K371D、R219Q/R20E、R219Q/K371E/R20E、R219Q/K371D/R20E、R219Q/S262N/K371E、R219Q/S262N/K371D、R219Q/S262N/R20E、R219Q/S262N/K371E/R20E、R219Q/S262N/K371D/R20E、R219Q/S262N、R219Q/S262N/K11A、R219Q/S262N/K11D、R219Q/S262N/K11E、R219Q/S262N/K13A、R219Q/S262N/K13D、R219Q/S262N/K13E、R219Q/S262N/K371A、R219Q/S262N/K372A、R219Q/S262N/K372D、R219Q/S262N/K372E、R219Q/S262N/K452A、R219Q/S262N/K452D、R219Q/S262N/K452E、R219Q/S262N/R20A、R219Q/S262N/R20D、R219Q/S262N/R366A、R219Q/S262N/R366D、R219Q/S262N/R366E、R219Q/S262N/H264A、R219Q/S262N/H264Q、R219Q/S262N/H264N、R219Q/S262N/H264G、R219K/S262N、R219N/S262N、R219A/S262N、R219Q/S262N/L221A、R219Q/S262N/L221V、R219Q/S262N/L221G、R219Q/S262N/E179D、R219Q/S262N/E179A、R219Q/S262N/E179S、R219Q/S262N/E179T、R219Q/S262N/E179V、R219Q/S262N/E179G、R219Q/S262A、R219Q/S262V、R219Q/S262M、R219Q/S262N/K11A/R20A、R219Q/S262N/K11A/R20A/K371A、R219Q/S262N/R20A/K371A、R219Q/S262N/K11A/K371A、R219Q/S262N/K26A、R219Q/S262N/K26D、R219Q/S262N/K26E、R219Q/S262N/R217A、R219Q/S262N/R217D、R219Q/S262N/R217E、R219Q/S262N/K258A、R219Q/S262N/K258D、R219Q/S262N/K258E、R219Q/S262N/R277A、R219Q/S262N/R277D、R219Q/S262N/R277E、R219Q/S262N/R283A、R219Q/S262N/R283D、R219Q/S262N/R283E、R219Q/S262N/K309A、R219Q/S262N/K309D、R219Q/S262N/K309E、R219Q/S262N/K317A、R219Q/S262N/K317D、R219Q/S262N/K317E、R219Q/S262N/K321A、R219Q/S262N/K321D、R219Q/S262N/K321E、R219Q/S262N/R352A、R219Q/S262N/R352D、R219Q/S262N/R352E、R219Q/S262N/R441A、R219Q/S262N/R441D、R219Q/S262N/R441E、R219Q/S262N/K444A、R219Q/S262N/K444D、R219Q/S262N/K444E、R219Q/S262N/K461A、R219Q/S262N/K461D、R219Q/S262N/K461E、R219Q/S262N/K469A、R219Q/S262N/K469D、R219Q/S262N/K469E、R219Q/S262N/K470A、R219Q/S262N/K470D、R219Q/S262N/K470E、R219Q/S262N/D86A、R219Q/S262N/D86C、R219Q/S262N/D86E、R219Q/S262N/D86F、R219Q/S262N/D86G、R219Q/S262N/D86H、R219Q/S262N/D86I、R219Q/S262N/D86K、R219Q/S262N/D86L、R219Q/S262N/D86M、R219Q/S262N/D86N、R219Q/S262N/D86P、R219Q/S262N/D86Q、R219Q/S262N/D86R、R219Q/S262N/D86S、R219Q/S262N/D86T、R219Q/S262N/D86V、R219Q/S262N/D86W、R219Q/S262N/D86Y、R219Q/S262N/E179C、R219Q/S262N/E179F、R219Q/S262N/E179H、R219Q/S262N/E179I、R219Q/S262N/E179K、R219Q/S262N/E179L、R219Q/S262N/E179M、R219Q/S262N/E179N、R219Q/S262N/E179P、R219Q/S262N/E179Q、R219Q/S262N/E179R、R219Q/S262N/E179W、R219Q/S262N/E179Y、R219C/S262N、R219D/S262N、R219E/S262N、R219F/S262N、R219G/S262N、R219H/S262N、R219I/S262N、R219L/S262N、R219M/S262N、R219P/S262N、R219S/S262N、R219T/S262N、R219V/S262N、R219W/S262N、R219Y/S262N、R219Q/S262N/L221C、R219Q/S262N/L221D、R219Q/S262N/L221E、R219Q/S262N/L221F、R219Q/S262N/L221H、R219Q/S262N/L221I、R219Q/S262N/L221K、R219Q/S262N/L221M、R219Q/S262N/L221N、R219Q/S262N/L221P、R219Q/S262N/L221Q、R219Q/S262N/L221R、R219Q/S262N/L221S、R219Q/S262N/L221T、R219Q/S262N/L221W、R219Q/S262N/L221Y、R219Q/S262C、R219Q/S262D、R219Q/S262E、R219Q/S262F、R219Q/S262G、R219Q/S262H、R219Q/S262I、R219Q/S262K、R219Q/S262L、R219Q/S262P、R219Q/S262Q、R219Q/S262R、R219Q/S262T、R219Q/S262W、R219Q/S262Y、R219Q/S262N/H264C、R219Q/S262N/H264D、R219Q/S262N/H264E、R219Q/S262N/H264F、R219Q/S262N/H264I、R219Q/S262N/H264K、R219Q/S262N/H264L、R219Q/S262N/H264M、R219Q/S262N/H264P、R219Q/S262N/H264R、R219Q/S262N/H264S、R219Q/S262N/H264T、R219Q/S262N/H264V、R219Q/S262N/H264W、R219Q/S262N/H264Y、R219Q/S262N/S266A、R219Q/S262N/S266C、R219Q/S262N/S266D、R219Q/S262N/S266E、R219Q/S262N/S266F、R219Q/S262N/S266G、R219Q/S262N/S266H、R219Q/S262N/S266I、R219Q/S262N/S266K、R219Q/S262N/S266L、R219Q/S262N/S266M、R219Q/S262N/S266N、R219Q/S262N/S266P、R219Q/S262N/S266Q、R219Q/S262N/S266R、R219Q/S262N/S266T、R219Q/S262N/S266V、R219Q/S262N/S266W、R219Q/S262N/S266Y、R219Q/S262N/K267A、R219Q/S262N/K267C、R219Q/S262N/K267D、R219Q/S262N/K267E、R219Q/S262N/K267F、R219Q/S262N/K267G、R219Q/S262N/K267H、R219Q/S262N/K267I、R219Q/S262N/K267L、R219Q/S262N/K267M、R219Q/S262N/K267N、R219Q/S262N/K267P、R219Q/S262N/K267Q、R219Q/S262N/K267R、R219Q/S262N/K267S、R219Q/S262N/K267T、R219Q/S262N/K267V、R219Q/S262N/K267W、R219Q/S262N/K267Y、R219Q/S262N/V296A、R219Q/S262N/V296C、R219Q/S262N/V296D、R219Q/S262N/V296E、R219Q/S262N/V296F、R219Q/S262N/V296G、R219Q/S262N/V296H、R219Q/S262N/V296I、R219Q/S262N/V296K、R219Q/S262N/V296L、R219Q/S262N/V296M、R219Q/S262N/V296N、R219Q/S262N/V296P、R219Q/S262N/V296Q、R219Q/S262N/V296R、R219Q/S262N/V296S、R219Q/S262N/V296T、R219Q/S262N/V296W、R219Q/S262N/V296Y、R219Q/K11A/R20A、R219Q/K11A/R20A/K371A、R219Q/R20A/K371A、R219Q/K11A/K371A、S262N/K11A/R20A、S262N/K11A/R20A/K371A、S262N/R20A/K371A及S262N/K11A/K371A。
85.权利要求25的变体ADA2蛋白或其催化活性部分，其中所述ADA2蛋白的序列在SEQID NO:273中示出。
86.权利要求1-85任一项的变体ADA2蛋白或其催化活性部分，其中所述催化活性部分包含ADA结构域。
87.变体ADA2多聚体，其包含多个权利要求1-86任一项的变体ADA2蛋白或其催化活性部分，其中变体ADA2蛋白或其催化活性部分。
88.变体ADA2二聚体，其包含权利要求1-86任一项的变体ADA2蛋白或其催化活性部分。
89.权利要求88的变体ADA2二聚体或其催化活性部分，其是包含相同的两个变体ADA2蛋白或其催化活性部分的同源二聚体。
90.变体ADA2二聚体，其包含至少一个权利要求1-86任一项的变体ADA2蛋白或其催化活性部分及一个不同的ADA2蛋白或其催化活性部分，其中所述不同的ADA2蛋白或其催化活性部分可以是变体或未修饰的ADA2蛋白或其催化活性部分。
91.权利要求88的变体ADA2二聚体或其催化活性部分，其是包含彼此不同的两个变体ADA2蛋白或其催化活性部分的异源二聚体。
92.编码权利要求1-91任一项的变体ADA2蛋白或其催化活性部分或二聚体的核酸。
93.载体，其包含权利要求92的核酸分子。
94.权利要求93的载体，其中所述载体是原核载体或者真核载体。
95.权利要求93或94的载体，其是病毒载体。
96.权利要求93-95任一项的载体，其中所述载体是哺乳动物载体。
97.权利要求95的载体，其中所述病毒载体选自腺病毒、腺伴随病毒、逆转录病毒、疱疹病毒、慢病毒、痘病毒和巨细胞病毒。
98.权利要求95的载体，其中所述病毒载体是溶瘤病毒载体。
99.权利要求96-98任一项的载体，其中所述载体还编码可溶透明质酸酶。
100.分离的细胞或细胞培养物，其包含权利要求93-99任一项的载体。
101.权利要求100的细胞或细胞培养物，其是真核细胞。
102.权利要求101的细胞，其是非人细胞或者其不是人干细胞。
103.权利要求101或102的细胞或细胞培养物，其中所述真核细胞是哺乳动物细胞。
104.权利要求103的细胞或细胞培养物，其中所述哺乳动物细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
105.权利要求100-104任一项的细胞或细胞培养物，其中所述细胞是免疫细胞。
106.权利要求105的细胞或细胞培养物，其中所述细胞是T细胞。
107.权利要求105的细胞或细胞培养物，其中所述细胞选自肿瘤侵润淋巴细胞(TIL)、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、天然杀伤(NK)细胞或者淋巴因子激活的杀伤(LAK)细胞。
108.权利要求106的细胞或细胞培养物，其中所述细胞是编码和表达嵌合抗原受体(CAR)和所述变体ADA2蛋白或二聚体的T细胞。
109.权利要求108的细胞或细胞培养物，其中所述CAR特异于肿瘤细胞抗原。
110.权利要求109的细胞或细胞培养物，其中所述肿瘤抗原选自HER2、CD19、HERV-K、CD20、CD22、ROR1、间皮素、CD33/IL3Ra、c-Met、PSMA、糖脂F77、EGFRvIII、GD-2、NY-ESO-1TCR、MAGE A3TCR和GD2及其组合。
111.产生ADA2变体或其催化活性部分的方法，包括在使得所述ADA2变体表达的条件下培养权利要求100-106任一项的细胞。
112.权利要求11的方法，其中所述ADA2变体或其催化活性部分是分离的。
113.权利要求111的方法，其中所述ADA2变体或其催化活性部分是表达的及其二聚体是分离的。
114.权利要求111的方法，其中所述细胞包含编码两种不同ADA2多肽的核酸，从而在表达时形成异源二聚体。
115.治疗癌症的方法，包括：
培养或扩增权利要求105-110任一项的细胞；及
将所述细胞给予人对象以治疗肿瘤。
116.权利要求115的方法，其中所述细胞预先得自人对象。
117.权利要求115或116的方法，其中所述细胞被修饰以表达可溶透明质酸酶。
118.权利要求105-110任一项的细胞或细胞培养物，用于治疗肿瘤。
119.权利要求105-110任一项的细胞或细胞培养物，用于配制治疗肿瘤的药物。
120.权利要求105-110任一项的细胞或细胞培养物，用于治疗肿瘤。
121.一种缀合物，其包含权利要求1-86任一项的变体ADA2蛋白或其催化活性部分或者权利要求87-91任一项的变体ADA2二聚体，其直接地或者通过接头间接地与异源部分连接。
122.一种缀合物，其包含直接地或者通过接头间接地与异源部分连接的ADA2蛋白。
123.权利要求122的缀合物，其中所述ADA2蛋白是单体或二聚体。
124.权利要求123的缀合物，其中所述ADA2蛋白是同源二聚体。
125.权利要求121-124任一项的缀合物，其中所述异源部分与二聚体中的一或两个多肽亚基缀合。
126.权利要求121-125任一项的缀合物，其中所述异源部分选自肽、小分子、核酸、碳水化合物和聚合物。
127.权利要求121-126任一项的缀合物，其中所述异源部分是半衰期延长部分或是聚合物。
128.权利要求127的缀合物，其中所述半衰期延长部分选自生物相容脂肪酸及其衍生物、羟基烷基淀粉(HAS)、聚乙二醇(PEG)、聚(Glyx-Sery)n、高氨基酸聚合物(HAP)、透明质酸(HA)、肝素糖聚合物(HEP)、基于磷酰胆碱的聚合物(PC聚合物)、Fleximer、葡聚糖、多唾液酸(PSA)、Fc结构域、运铁蛋白、白蛋白、弹性蛋白样肽、XTEN序列、白蛋白结合肽、CTP肽，及其任意组合。
129.权利要求127或128的缀合物，其中所述聚合物或半衰期延长部分是PEG，且所述ADA2蛋白分子是聚乙二醇化的。
130.权利要求129的缀合物，其中所述PEG选自甲氧基-聚乙二醇(mPEG)、PEG-缩水甘油醚(Epox-PEG)、PEG-氧基羰基咪唑(CDI-PEG)、分支的PEG及聚氧化乙烯(PEO)。
131.权利要求129或130的缀合物，其中所述PEG的分子量是或者是大约1kDa-大约100kDa。
132.权利要求129-131任一项的缀合物，其中所述PEG是线性或分支的。
133.权利要求129-132任一项的缀合物，其中所述PEG部分得自与选自如下的PEG试剂的反应：mPEG-琥珀酰亚胺丙酸酯(mPEG-SPA)、mPEG琥珀酰亚胺羧甲基酯(mPEG-SCM)、mPEG-琥珀酰亚胺丁酸酯(mPEG-SBA)、mPEG2-N-羟基琥珀酰亚胺、mPEG-琥珀酰亚胺丁酸酯(mPEG-SBA)、mPEG-琥珀酰亚胺α-甲基丁酸酯(mPEG-SMB)、mPEG-丁醛、PEG-对-硝基苯基-碳酸酯及PEG-丙醛。
134.权利要求129-133任一项的缀合物，其中所述PEG部分得自与选自如下的PEG试剂的反应：mPEG-SCM(20kDa)、mPEG-SCM(30kDa)、mPEG-SBA(5kDa)、mPEG-SBA(20kDa)、mPEG-SBA(30kDa)、mPEG-SMB(20kDa)、mPEG-SMB(30kDa)、mPEG-丁醛(30kDa)、mPEG-SPA(20kDa)、mPEG-SPA(30kDa)、mPEG2-NHS(10kDa分支的)、mPEG2-NHS(20kDa分支的)、mPEG2-NHS(40kDa分支的)、mPEG2-NHS(60kDa分支的)、PEG-NHS-生物素(5kDa生物素酰化的)、PEG-对-硝基苯基-碳酸酯(30kDa)及PEG-丙醛(30kDa)。
135.权利要求121-134任一项的缀合物，其中所述变体ADA2蛋白或其催化活性部分包含氨基酸置换R219Q和S262N之一或二者。
136.权利要求121-134任一项的缀合物，其中所述变体ADA2蛋白或其催化活性部分包含氨基酸置换R219Q/S262N。
137.权利要求136的缀合物，其中所述变体ADA2蛋白或其催化活性部分包含氨基酸置换R219Q/S262N，且所述变体ADA2蛋白或其催化活性部分是聚乙二醇化的。
138.权利要求137的缀合物，其包含聚乙二醇化的同源二聚体。
139.权利要求135-138任一项的缀合物，其中所述ADA2部分的序列在SEQ ID NO:273中示出。
140.一种组合，其包含：
权利要求1-86任一项的变体ADA2蛋白、权利要求87-91任一项的变体ADA2多聚体或二聚体或者权利要求121-139任一项的缀合物；及
治疗剂，其中所述治疗剂用于治疗癌症或其它过度增生性疾病。
141.一种组合，其包含：
ADA2蛋白，及
治疗剂，其中所述治疗剂用于治疗癌症或其它过度增生性疾病。
142.权利要求141的组合，其中所述ADA2蛋白是单体或二聚体。
143.权利要求142的组合，其中所述二聚体是同源二聚体。
144.权利要求140-143任一项的组合，其中所述治疗剂选自抗体、细胞毒性剂、化疗剂、细胞因子、生长抑制剂、抗激素剂、激酶抑制剂、抗血管发生剂、心脏保护剂、免疫刺激剂、免疫抑制剂、免疫检查点抑制剂、抗生素和血管发生抑制剂。
145.权利要求140-144任一项的组合，其中所述治疗剂是抗癌剂。
146.权利要求145的组合，其中所述抗癌剂选自抗癌抗体、化疗剂、放射免疫治疗剂、抗血管发生剂和免疫检查点抑制剂。
147.权利要求146的组合，其中：
所述抗癌剂是免疫检查点抑制剂，及
所述免疫检查点抑制剂的靶选自CTLA4、PD-1和PD-L1。
148.权利要求146或147的组合，其中所述抗癌剂是选自抗体、融合蛋白、适体及其免疫检查点蛋白结合片段的免疫检查点抑制剂。
149.权利要求146-148任一项的组合，其中所述抗癌剂是免疫检查点抑制剂，其是抗免疫检查点蛋白抗体或其抗原结合片段。
150.权利要求146-149任一项的组合，其中所述抗癌剂是选自如下的免疫检查点抑制剂：
抗-CTLA4抗体，其衍生物，或者其抗原结合片段；
抗-PD-L1抗体，其衍生物，或者其抗原结合片段；及
抗-PD-1抗体，其衍生物，或者其抗原结合片段。
151.权利要求146-150任一项的组合，其中所述抗癌剂是免疫检查点抑制剂，选自：
伊匹木单抗，其衍生物，或者其抗原结合片段；
曲美木单抗，其衍生物，或者其抗原结合片段；
纳武单抗，其衍生物，或者其抗原结合片段；及
Pidilizumab，其衍生物，或者其抗原结合片段。
152.权利要求140-151任一项的组合，其中所述治疗剂是抗透明质酸剂。
153.权利要求152的组合，其中所述抗透明质酸剂是可溶透明质酸酶。
154.权利要求152或153的组合，其中所述可溶透明质酸酶是PH20透明质酸酶，其选自牛、绵羊或者缺少全部或部分糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚附着序列的C末端截短的人PH20。
155.权利要求152-154任一项的组合，其中所述抗透明质酸剂或可溶透明质酸酶与聚合物缀合或者提供在脂质体中或者在载体中编码。
156.权利要求155的组合，其中所述透明质酸酶与PEG缀合。
157.权利要求140-156任一项的组合或者权利要求121的缀合物，其中所述ADA2蛋白包含SEQ ID NO:5、326-334、340、375或380-383任一所示氨基酸序列，与SEQ ID NO:5、326-334、340、375或380-383所示氨基酸序列呈现至少95％序列相同性的序列，或者其催化形式。
158.权利要求140-156任一项的组合或者权利要求121的缀合物，其中所述ADA2蛋白包含SEQ ID NO:5所示氨基酸序列。
159.权利要求140-156任一项的组合，其中所述ADA2蛋白或其催化活性部分包含氨基酸置换R219Q/S262N。
160.权利要求140-156任一项的组合，其中所述ADA2蛋白包含SEQ ID NO:273所示氨基酸序列或其催化活性部分。
161.药物组合物，其包含在药物可接受的运载体中的权利要求1-86任一项的变体ADA2蛋白、ADA2二聚体、权利要求87-91任一项的ADA2多聚体或二聚体或者权利要求121-139任一项的缀合物。
162.药物组合物，其包含在药物可接受的运载体中的权利要求85的变体ADA2蛋白或其催化活性部分或者权利要求137的缀合物。
163.权利要求161或162的药物组合物，其配制为局部或全身给予。
164.权利要求161-163任一项的药物组合物，其配制为静脉内给予。
165.权利要求161-164任一项的药物组合物，其中所述ADA2蛋白是ADA2变体或其催化活性形式，其包含氨基酸置换R219Q/S262N。
166.权利要求165的药物组合物，其中所述ADA2变体或其催化活性部分是聚乙二醇化的。
167.权利要求165的药物组合物，其中所述ADA2变体包含SEQ ID NO:273所示氨基酸残基序列或其催化活性部分。
168.一种治疗对象的肿瘤或癌症、非癌过度增生性疾病、纤维化疾病、感染性疾病、血管病变、免疫缺陷疾病的方法，包括给予权利要求1-86任一项的ADA2变体或其催化活性部分、ADA2二聚体、权利要求87-91任一项的ADA2多聚体或二聚体，或者权利要求121-139任一项的缀合物，或者权利要求140-160任一项的组合。
169.一种治疗对象的肿瘤、癌症、非癌过度增生性疾病、纤维化疾病、感染性疾病、血管病变、免疫缺陷疾病的方法，包括给予对象ADA2蛋白，其中所述ADA2蛋白包含SEQ ID NO:5所示氨基酸序列或其催化活性部分或者与SEQ ID NO:5所示氨基酸序列或其相应催化活性部分具有至少85％、90％或9％％序列相同性的变体ADA2蛋白。
170.一种治疗对象的肿瘤或癌症或非癌过度增生性疾病的方法，包括给予对象变体ADA2蛋白，包括权利要求1-86任一项的ADA2变体或其催化活性部分、ADA2二聚体、权利要求87-91任一项的ADA2多聚体或二聚体、权利要求121-139任一项的缀合物或者权利要求140-160任一项的组合。
171.权利要求168-170任一项的方法，其中所述疾病是癌症，且所述肿瘤是实体瘤或转移瘤或血癌。
172.权利要求168-171任一项的方法，其中所述肿瘤是癌瘤、神经胶质瘤、肉瘤、腺癌、腺肉瘤或腺瘤。
173.权利要求168-171任一项的方法，其中所述肿瘤是乳腺、心脏、肺、小肠、结肠、脾、肾、膀胱、头颈、卵巢、前列腺、脑、胰腺、皮肤、骨、骨髓、血液、胸腺、子宫、睾丸、子宫颈或肝脏的肿瘤。
174.权利要求168-173任一项的方法，其中所述对象基于预先得自对象的样品中增高的水平的血浆腺苷、肿瘤相关腺苷受体(ADR)表达或者肿瘤相关核苷酸酶表达而选择进行治疗。
175.权利要求174的方法，其中所述ADR是A2A或A2B。
176.权利要求174的方法，其中所述核苷酸酶是CD39或CD73。
177.权利要求174-176任一项的方法，其中与预先确定的水平或预先确定的量或对照样品相比，增高的水平是0.5倍、1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、150倍、200倍、500倍、1000倍或更多。
178.权利要求168-177任一项的方法，进一步包括给予一或多种抗癌剂或治疗。
179.权利要求178的方法，其中所述抗癌剂选自抗癌抗体、化疗剂、放射免疫治疗剂、抗血管发生剂及免疫检查点抑制剂。
180.权利要求168-179任一项的方法，包括共同给予所述ADA2蛋白及可溶透明质酸酶。
181.权利要求180的方法，其中所述可溶透明质酸酶是PH20透明质酸酶，其选自牛、羊或者缺少全部或部分糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚附着序列的C末端截短的人PH20。
182.权利要求180或181的方法，其中所述可溶透明质酸酶与聚合物缀合或者提供在脂质体中或者在载体中编码。
183.权利要求180-182任一项的方法，其中所述透明质酸酶与ADA2蛋白分别给予或者共同配制。
184.权利要求168-170及174-183任一项的方法，其中所述疾病是非癌过度增生性疾病。
185.权利要求184的方法，其中所述疾病或状况选自非癌过度增生性疾病、纤维化疾病、感染性疾病、血管病变及重症联合免疫缺陷(SCID)。
186.权利要求168-185任一项的方法，其中所述对象是人。
187.权利要求168-186任一项的方法，其中所述ADA2蛋白经胃肠外、局部或全身给予。
188.权利要求168-187任一项的方法，其中所述ADA2蛋白经鼻内、肌肉、皮内、腹腔内、静脉内、皮下、口服给予或者通过肺部给予。
189.权利要求1-86任一项的ADA2变体或其催化活性部分、ADA2二聚体、权利要求87-91任一项的ADA2多聚体或二聚体、权利要求121-139任一项的缀合物或者权利要求140-160任一项的组合，其中所述ADA2蛋白是糖基化的。
190.权利要求1-86任一项的ADA2变体或其催化活性部分、ADA2二聚体、权利要求87-91任一项的ADA2多聚体或二聚体、权利要求121-139任一项的缀合物或者权利要求140-160任一项的组合在配制治疗肿瘤或癌症、非癌过度增生性疾病、纤维化疾病、感染性疾病、血管病变或重症联合免疫缺陷(SCID)的药物中的应用。
191.一种药物组合物，其用于治疗肿瘤或癌症、非癌过度增生性疾病、纤维化疾病、感染性疾病、血管病变或重症联合免疫缺陷(SCID)，其包含权利要求1-86任一项的ADA2变体或其催化活性部分、ADA2二聚体、权利要求87-91任一项的ADA2多聚体或二聚体、权利要求121-139任一项的缀合物。
192.权利要求140-160任一项的组合，其用于治疗肿瘤或癌症、非癌过度增生性疾病、纤维化疾病、感染性疾病、血管病变或重症联合免疫缺陷(SCID)。
193.ADA2蛋白在配制治疗肿瘤或癌症、非癌过度增生性疾病、纤维化疾病、感染性疾病、血管病变或重症联合免疫缺陷(SCID)的药物中的应用。
194.一种包含ADA2蛋白的药物组合物，其用于治疗肿瘤或癌症、非癌过度增生性疾病、纤维化疾病、感染性疾病、血管病变或重症联合免疫缺陷(SCID)。
195.一种包含ADA2蛋白和治疗剂的组合，其用于治疗肿瘤或癌症、非癌过度增生性疾病、纤维化疾病、感染性疾病、血管病变或重症联合免疫缺陷(SCID)。
196.权利要求190-195任一项的应用、药物组合物或组合，其中所述疾病或状况是肿瘤或癌症。
197.权利要求190-196任一项的应用、药物组合物或组合，其中所述肿瘤是实体瘤或转移瘤。
198.权利要求190-197任一项的应用、药物组合物或组合，其中所述肿瘤是癌瘤、神经胶质瘤、肉瘤、腺癌、腺肉瘤或腺瘤。
199.权利要求190-198任一项的应用、药物组合物或组合，其中所述肿瘤是乳腺、心脏、肺、小肠、结肠、脾、肾、膀胱、头颈、卵巢、前列腺、脑、胰腺、皮肤、骨、骨髓、血液、胸腺、子宫、睾丸、子宫颈或肝脏的肿瘤。
200.权利要求190-199任一项的应用、药物组合物或组合，其中所述ADA2蛋白是单体或二聚体。
201.权利要求200的应用、药物组合物或组合，其中所述二聚体是同源二聚体。
202.权利要求190-201任一项的应用、药物组合物或组合，其中所述ADA2蛋白包含SEQID NO:5所示氨基酸序列或者与其具有至少85％、90％或95％序列相同性的变体或者SEQID NO:5所示ADA2蛋白质的催化活性部分。
203.权利要求190-202任一项的应用、药物组合物或组合，其中参照SEQ ID NO:5，所述ADA2蛋白或其催化活性部分包含氨基酸置换R219Q/S262N。
204.权利要求203的应用、药物组合物或组合，其中所述ADA2蛋白包含SEQ ID NO:273所示氨基酸残基序列或其催化活性部分。
205.权利要求204的应用、药物组合物或组合，其中所述ADA2蛋白或其催化活性部分是聚乙二醇化的。
206.一种包含ADA2蛋白的药物组合物，其用于治疗肿瘤或癌症、非癌过度增生性疾病、纤维化疾病、感染性疾病、血管病变或重症联合免疫缺陷(SCID)，其中所述ADA2蛋白包含权利要求1-86任一项的变体或其催化活性部分、ADA2二聚体、权利要求87-91任一项的ADA2多聚体或二聚体或者权利要求121-139任一项的缀合物。
207.权利要求206的药物组合物，其中参照SEQ ID NO:5，所述ADA2蛋白或其催化活性部分包含氨基酸置换R219Q/S262N。
208.权利要求207的药物组合物，其中所述ADA2蛋白包含SEQ ID NO:273所示氨基酸残基序列或者其催化活性部分。
209.权利要求208的药物组合物，其中所述ADA2蛋白或其催化活性部分是聚乙二醇化的。
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