HU218893B - A megakariocita szaporodás és differenciálódás stimulálására szolgáló módszerek és vízoldható készítmények - Google Patents

A megakariocita szaporodás és differenciálódás stimulálására szolgáló módszerek és vízoldható készítmények Download PDF

Info

Publication number
HU218893B
HU218893B HU9600059A HU9600059A HU218893B HU 218893 B HU218893 B HU 218893B HU 9600059 A HU9600059 A HU 9600059A HU 9600059 A HU9600059 A HU 9600059A HU 218893 B HU218893 B HU 218893B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
mgdf
polypeptide
leu
mpl
polyethylene glycol
Prior art date
Application number
HU9600059A
Other languages
English (en)
Other versions
HU9600059D0 (en
HUT74257A (en
Inventor
Timothy D. Bartley
Jakob M. Bogenberger
Robert A. Bosselman
Pamela Hunt
Olaf B. Kinstler
Babru B. Samal
Original Assignee
Amgen Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from US08/321,488 external-priority patent/US5795569A/en
Application filed by Amgen Inc. filed Critical Amgen Inc.
Publication of HU9600059D0 publication Critical patent/HU9600059D0/hu
Publication of HUT74257A publication Critical patent/HUT74257A/hu
Publication of HU218893B publication Critical patent/HU218893B/hu

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K17/00—Carrier-bound or immobilised peptides; Preparation thereof
    • C07K17/02—Peptides being immobilised on, or in, an organic carrier
    • C07K17/08—Peptides being immobilised on, or in, an organic carrier the carrier being a synthetic polymer
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/524—Thrombopoietin, i.e. C-MPL ligand
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S930/00—Peptide or protein sequence
    • Y10S930/01—Peptide or protein sequence
    • Y10S930/14—Lymphokine; related peptides

Description

A TALÁLMÁNY KÖRE
A jelen találmány olyan új proteinekre vonatkozik - a találmány során ezekre szinonimként Mpl-ligandumként vagy MGDF-ként hivatkozunk melyek stimulálják a megakariociták szaporodását, valamint fokozzák a megakariociták differenciálódását vagy érését, melynek végső következménye, a trombociták számának megnövekedése. Vonatkozik az MGDF-származékok egy olyan új osztályára, ahol az MGDF-molekula egy vízoldható polimerhez kapcsolódik, valamint az ilyen molekulák előállítására szolgáló módszerekre is. Egy megint más megvalósulásban a találmány olyan MGDF-származékokkal kapcsolatos, ahol az MGDFmolekula egy vagy több polietilénglikol („PEG”)-csoporthoz kapcsolódik, valamint kapcsolatos az ilyen molekulák előállítási módszerével is.
A TALÁLMÁNY HÁTTERE
Legalább két széles körű kutatási terület tartozik a találmányba. Az egyik a megakariociták fejlődésével, majd az ezt követő trombocitaképződéssel kapcsolatos, a második egy növekedésifaktorreceptor-család egy polipeptid tagjával kapcsolatos - melyre a találmány során Mpl-receptorként utalunk valamint ennek ligandumaival. Ezeket a kutatási területeket a következőkben részletezni fogjuk.
A) TROMBOCITAKÉPZŐDÉS MEGAKARIOCITÁKBÓL
A vér trombocitái olyan keringő sejtek, melyek alapvető fontosságúak a vérzés megakadályozásában és a véralvadásban. A megakariociták a trombociták celluláris fonásai, valamint egy közös csontvelő-prekurzorsejtből származnak, melyből az összes hematopoietikus sejtvonal származik. Ez a közös sejt a pluripotens törzssejtként vagy PPSC-ként ismert.
A megakariocita őssejtek hierarchiája a megakariocita (MK)-kolóniák megjelenési ideje és mérete szerint definiálható, mely megakariociták a megfelelő növekedési faktorokra adott válasz során jelennek meg in vitro tenyészrendszerekben. Az osztódási hullámot kiváltó egység megakariociták (BFU-MK) a legprimitívebb megakariocita őssejtek. Úgy vélik, a BFU-MK számos telepképző egység megakariocitát hoz létre, melyek már sokkal differenciáltabb MK-őssejtek.
Mivel az MK-sejtek újabb differenciálódáson mennek keresztül, elveszítik a mitózisban való részvételi képességüket, azonban rendelkeznek az endoreduplikálódási képességgel. Az endoreduplikáció (endomitózis) egy olyan jelenség, melynek során a sejtmag osztódik, azonban a sejtosztódás elmarad. Az endoreduplikáció végül egy poliploid MK-t eredményez. A további MKérési folyamat a citoplazmás szervek és membránalkotó részek megszerzéséhez vezet, mely a trombociták jellemzői.
A trombociták érett megakariocitákból jönnek létre kevéssé meghatározott folyamat során, melyről azt feltételezik, hogy a megakariociták fizikai fragmentációjának vagy más mechanizmusnak a következménye. A megakariocitákon belül levő kiterjedt membránszerkezetek megfigyelése a trombocitaképződés egy olyan modelljéhez vezetett, melyben egy demarkációs membránrendszer a keletkező trombocitákat határolja a sejten belül. A trombocitaképződés egy másik modelljét abból a megfigyelésből fejlesztették ki, hogy a megakariociták hosszú citoplazmás nyúlványokat hoznak létre, melyek trombocita méretű szakaszokra korlátozódnak, melyekből a trombociták feltehetően kitörnek a véráramlási nyomás hatására a csontvelőben és/vagy a tüdőben. Ezeket a citoplazmás nyúlványokat Becker- és DeBruyn-protrombocitáknak nevezték el, hogy tükrözzék feltételezett prekurzor szerepüket a trombocitaképzésben. Lásd Becker and DeBruyn, Amer. J. Anat. 145:183 (1976).
Az 1. ábrán a megakariocita- és trombocitafejlődésben részt vevő különböző prekurzorsejtek áttekintését mutatjuk be. Az ábra legszélső bal oldalán levő sejtek egy PPSC-t képviselnek, és a PPSC jobb oldalán levő további sejtek BFU-MK-t, majd pedig CFU-MK-t képviselnek az ábrán. Az endoreduplikáción áteső sejt, mely közvetlenül az ábrán levő PPSC-től jobbra található egy érett megakariocitasejt. Az endomitózis eredményeként ez a sejt poliploid lett. A jobb oldalon levő következő szerkezet egy hosszú citoplazmás nyúlványt foglal magában, mely az érett megakariocitasejt poliploid magjából nyúlik ki. Az ábra legszélső jobb oldalán olyan trombocitákat mutatunk, melyek a citoplazmás nyúlványok fragmentációjával jöttek létre.
A következőkben megadunk néhány korábbi közleményt, mely a megakariocitaérési folyamat és a trombocitatermelés fenti leírásával kapcsolatos.
1. Williams, N. and Levine, R. F., British Journal of
Haematology 52:173-180(1982)
2. Levin, J., Molecular Biology and Differentiation of
Megakariocytes, pub. Wiley-Liss, Inc. 1-10 (1990)
3. Gewirtz, A. M., The Biology of Hematopoiesis, pub. Wiley-Liss, Inc. 123-132 (1990)
4. Han, Z. C., et al., Int. J. Hematol. 54:3-14 (1991)
5. Nieuwenhuis, Η. K. and Sixma, J., New Eng. J. of
Med. 327:1812-1813 (1992)
6. Long, M„ Stem Cells 11:33-40 (1993)
B) A TROMBOCITAKÉPZŐDÉS SZABÁLYOZÁSA
A különböző laboratóriumokból származó óriás mennyiségű adat azt jelzi, hogy a trombocitaképződés humorális tényezők szabályozása alatt áll. Ezen biológiai folyamat komplexitását először tévesen ítélték meg, és jelenleg úgy tűnik, hogy számos humán növekedési faktor rendelkezik ezzel a képességgel.
A megakariocitaszabályozás több celluláris szinten fordul elő. Számos citokin fokozza a trombocitatermelést, kibővítve az őssejtraktárat. A humorális növekedési faktorok egy másik csoportja érési faktorként szolgál, melyek sokkal differenciáltabb sejtekre hatnak az endoreduplikáció elősegítése céljából. Továbbá, úgy tűnik, van még két független biofeedback-megerősítés, mely ezeket a folyamatokat szabályozza.
Számos nem specifikus hematopoietikus növekedési faktor fontos hatással van a megakariociták érésére. A granulocita-makrofág telep stimuláló faktor (GM-CSF), az interleukin-3 (IL—3), az IL-6, az IL-11, a leukémiagátló faktor (LIF), valamint az eritro2
HU 218 893 Β poietin (EPO) egyenként mind elősegítik a megakariociták érését in vitro, ahogy az a megakariociták méretére, számára vagy ploiditására kifejtett hatásuk alapján meghatározható. A LIF, IL-6 és IL-11 MK érési hatása vagy részleges (LIF és IL-6), vagy teljes (IL-11) az IL-3 hatásán túl. Az ilyen elsőbbségi közleményekből származó adatok azt sugallják, hogy a citokinek kombinációi szükségesek lehetnek az MK-érés elősegítésében in vivő.
A következőkben néhány elsőbbségi közlemény összefoglalóját adjuk meg, mely közlemények a megakariociták szabályozásával és a trombociták termelésével kapcsolatosak:
7. Hoffman, R. et al., Blood Cells 13:75-86 (1987)
8. Murphy, M. J., Hematology/Oncology Clinics of
North America 3 (3):465-478 (1988)
9. Hoffman, R., Blood 74 (4): 1196-1212 (1989)
10. Mazur, E. M. and Cohen, J. L., Clin. Pharmacol.
Ther., 46(3):250-256(1989)
11. Gewirtz, A. M. and Calabretta, B., Int. J. Cell Cloning 8:267-276 (1990)
12. Williams, N., progress in Growth Factor Research
2:81-95 (1990)
13. Gordon, M. S. and Hoffman, R., Blood (2):302-307 (1992)
14. Hunt, P. et al., Exp. Hematol. 21:372-381 (1993)
15. Hunt, P. et al., Exp. Hematol. 21:1295-1304 (1993)
Ártól is beszámoltak (lásd a 16. hivatkozást), hogy a humán aplasztikus szérum egy, az IL-3-étól eltérő megakariocitatelep-stimuláló aktivitással rendelkezik, a granulocitatelep-stimuláló faktorral, valamint a limfocitákkal kondicionált tápközegben jelen levő faktorokkal. Azonban az ezen aktivitásért felelős molekulát a korábbi közleményekben se nem izolálták, se nem jellemezték.
16. Mazur, E. M., et al., Blood 76:290-297 (1990)
C) AZ Mpl-RECEPTOR
A mieloproliferatív leukémiavírus (MPLV) egy patkány replikációdefektes retrovírus, mely akut leukémiát okoz fertőzött emlősökben. Felfedezték, hogy az MPLV által expresszált gén annak a génnek egy részét tartalmazza, mely a vírus retrovirális köpenyét (vagy extemális proteinburkát) kódolja a citokinreceptor-családdal kapcsolatos szekvenciához fuzionálva, ideértve a GM-CSF, a G-CSF és az EPO receptorait.
A fent leírt MPLV-gén expressziója azzal az érdekes biológiai tulajdonsággal rendelkezik, hogy a különböző típusú patkányőssejteket azonnal növekedésifaktor-fuggővé teszi mind a szaporodás, mind a terminális érés szempontjából. Továbbá az akut módon MPLV-vel transzformált csontvelősejtek néhány tenyészete megakariocitákat tartalmaz, ami azt sugallja, hogy kapcsolat van az MPLV-gén és a megakariocitaszaporodás és -differenciálódás között.
Nemrégiben derült ki, hogy az MPLV virális gén (melyre v-Mpl-ként utalunk) egy homológgal rendelkezik emlőssejtekben, melyre celluláris Mpl-génként (vagy c-Mpl) utalunk. v-Mpl-eredetű próbákat használva egy, a humán c-Mpl-génnek megfelelő cDNS került klónozásra. Lásd a WO 92/07074 számú PCT közzétételi iratot (melyet 1992. április 30-án tettek közzé, és a későbbiekben írjuk le). A szekvenciaanalízis azt mutatta, hogy a cMpl géntermék által kódolt protein az erősen konzervált citokinreceptor-szupercsaládba tartozik, akárcsak a homológ v-Mpl géntermék.
Ez a celluláris gén - a c-Mpl - feltehetően funkcionális szerepet játszik a hematopoiesisben arra a megfigyelésre alapozva, hogy expressziója RN-áz próba védelemmel és RT-PCR kísérletekkel megtalálható a normál egerekből származó csontvelőben, lépben és magzati májban, azonban más szövetekben nem. A c-Mpl különösen megakariocitákon expresszálódik. Az is bemutatásra került, hogy a humán celluláris gén - a humán c-Mpl CD34 pozitív sejtekben expresszálódik, ideértve a tisztított megakariocitákat és trombocitákat. A CD34 egy olyan antigén, mely a korai hematopoietikus őssejtek jelzője. Továbbá, a c-Mpl mRNS-sel vagy üzenettel szemben anti-sense szintetikus oligonukleotidoknak kitett CD34 pozitív sejtek szignifikánsan gátolják a CFU-MK megakariocita őssejtek telepképző képességét, azonban nincsenek hatással az eritroid vagy granulomakrofág őssejtekre.
A fenti adatok és megfigyelések azt sugallják, hogy a c-Mpl egy sejtfelszíni molekulát kódol - a találmány során Mpl-receptorként utalunk rá -, mely egy, a receptort aktiváló ligandumhoz kötődik, ami esetleg a megakariociták termeléséhez és/vagy fejlődéséhez vezethet.
A WO 92/07074 számú PCT közzétételi irat a humán és patkány forrásokból származó c-Mpl-gén által termelt proteinszekvenciára irányul. Ez a géntermék - mely a vélemények szerint egy receptor, ahogy azt a fentiekben említettük - legalább három általános régióból vagy doménből áll: egy extracelluláris doménből, egy transzmembrán doménből és egy intracelluláris (vagy citoplazmás) doménből. Egymáshoz kapcsolva ezek a domének az intakt Mpl-receptort teszik ki. Ez a PCT publikáció kapcsolatos azzal az oldható formájú receptorral, mely alapjában véve megegyezik az érett c-Mpl-protein extracelluláris doménjével. Az intracelluláris dómén tartalmaz egy hidrofób régiót, mely ha a transzmembránrégión keresztül kapcsolódik a protein extracelluláris doménjéhez, a teljes protein aggregációját és oldhatatlanságát okozza. Másrészt viszont ha a cMpl géntermék extracelluláris doménje a transzmemrán doméntől és az intracelluláris doméntől elkülönül, oldható lesz, ezért a protein extracelluláris formájára a receptor „oldható” formájaként utalnak.
A következőkben v-Mpl- és c-Mpl-receptorok és -gének korábbi leírásával kapcsolatos közleményeket adjuk meg:
17. Wendling, F., et al., Leukémia 3 (3):475-480 (1989)
18. Wendling, F., et al., Blood 73 (5):1161-1167 (1989)
19. Souyri, M., et al., Cell 6 3:1137-1147 (1990)
20. Vígon, I., et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 89:5640-5644(1992)
21. Skoda, R. C., et al., The EMBO Journal (7):2645-2653 (1993)
22. Ogawa, M„ Blood 81 (11): 2844-2853 (1993)
HU 218 893 Β
23. Methia, N„ et al., Blood 82 (5): 1395-1401 (1993)
24. Wendling, F., et al., Blood 80:246a (1993)
D) A TROMBOCITATERMELÉS STIMULÁLÁSÁRA KÉPES ANYA G IRÁNTI IGÉNY
Nemrégiben számoltak be arról, hogy a trombocitatranszfüziókat egyre növekvőbb arányban alkalmazzák az észak-amerikai, nyugat-európai és japán orvosi központokban. Lásd Gordon, M. S. and Hoffman, R., Blood 80 (2): 302-307 (1992). Úgy tűnik, ez a növekedés nagymértékben az orvosi technológia előrehaladásának, valamint az ilyen technológia jobb alkalmazhatóságának - szívsebészeti, csontvelő-, szív- és májátültetések - tulajdonítható. A rákos betegeknek biztosított terápia eszközeként szolgáló dózisnövelés, valamint a HIV-l-járvány szintén hozzájárulnak a trombocitakészlet iránti fokozott igényhez.
A trombociták felhasználása magában hordozza számos véreredetű fertőző betegség, valamint az alloimmunizálás átvitelének lehetőségét. Továbbá a tisztított trombociták termelése egy drága kísérlet, és így az ilyen trombociták felhasználásának növekedése növeli a teljes orvosi költséget. Ennek eredményeként nagy szükség van a humán használathoz való trombocitatermelés új és továbbfejlesztett módszereire.
A példaként szolgáló, a trombocitatermelés fokozására szolgáló korábbi bejelentéseket a következőkben írjuk le.
Az 5,032,396 számú US szabadalom arról számol be, hogy az interleukin-7 (IL-7) képes a trombocitatermelést stimulálni. Az interleukin-7 limfopoietin-1ként is ismert, ami egy limfopoietikus növekedési faktor, mely a csontvelőben levő B- és T-sejt-ősök szaporodását képes stimulálni. Az 1988. október 19-én iktatott 88/03747 sorozatszámú közzétett PCT-bejelentés, valamint az EP A 314415 számú európai közzétételi irat DNS-eket, vektorokat, valamint rekombináns DNStechnológiával való emlős IL-7 protein termelésére szolgáló eljárásokat írnak le. Az amerikai szabadalomban leírt adatok azt jelzik, hogy az IL-7 növelheti a keringő trombociták számát normális és szubletálisan besugárzott egerekben.
Az 5,087,448 számú US szabadalom azt írja le, hogy a megakariociták és a trombociták az interleukin-6-tal való kezeléssel emlősökben való szaporodásra stimulálhatók. A rekombináns humán interleukin6 egy 26 000 molekulasúlyú többszörös biológiai aktivitással rendelkező glükoprotein. Az ebben a szabadalomban bemutatott adatok azt mutatják, hogy az IL-6 fokozó hatással van a megakariocitatelepekre in vitro.
A fent említett szabadalmak egyike sem említ semmit a jelen találmányban szereplő Mpl-ligandumokkal kapcsolatban.
A fenti leírások ellenére még mindig nagy szükség van a megakariociták és/vagy trombociták emlősökben való stimulálására.
E) A KÉMIAILAG MÓDOSÍTOTT MGDF-FEL
KAPCSOLATOS HÁTTÉR-INFORMÁCIÓ
Terápiás használatra való proteinek jelenleg is beszerezhetők megfelelő formában és megfelelő mennyiségben, leginkább a rekombináns DNS-technológiák fejlődésének eredményeként. Az ilyen proteinek kémiai származékai hatékonyan képesek blokkolni a proteolitikus enzimeket a proteingerinccel való fizikai kapcsolattal szemben, és így megakadályozzák a lebontást. A további előnyök közé tartoznak bizonyos körülmények között a terápiás proteinek stabilitásának és keringési idejének növelése és az immunogenitás csökkentése. Azonban meg kell említeni, hogy egy adott protein módosításának hatását nem lehet előre megjósolni. A proteinmódosításról és fúziós proteinekről ad leírást egy összefoglaló közlemény: Francis, Focus on Growth Factors 3:4-10 (1992. május) (Mediscript, Mountview Court, Friem Bamet Lane, London N20 OLD, UK).
A polietilénglikol („PEG” vagy „peg”) egy olyan kémiai egység, mely a terápiás proteintermékek előállításánál felhasználásra került. Például az Adagent -egy pegilált adenozin deamináz készítmény - jóváhagyták súlyos, kevert immunhiányos betegség kezelésére; a pegilált szuperoxid diszmutázt klinikai kísérletekben használják fejsérülések kezelésére; a pegilált alfa-interferont
I- es fázisú klinikai kísérletekben tesztelték a hepatitis kezelésére; a pegilált glükocerebrozidázról és a pegilált hemoglobinról azt jelentették, hogy ezekkel klinikai előteszteket végeznek. Kimutatták, hogy néhány protein esetében a polietilénglikollal való kapcsolás véd a proteolízissel szemben, Sada et al., J. Fermentation Bioengineering 71:137-139 (1991), és a bizonyos polietilénglikol-egységek kapcsolására szolgáló módszerek rendelkezésre állnak. Lásd a 4,179,337 számú szabadalmat, Davis et al., „Non-Immunogenic Polipeptides” 1979. december 18-án iktatták; és a 4,002,531 számú US szabadalmat, Royer, „Modifying Enzymes with Poliethylen Glycol and Product Produced Thereby”, 1977. január
II- én iktatták. Áttekintés céljából lásd Abuchowski et al., az Enzymes as Drugs című műben (J. S. Holcberg and J. Roberts, eds. pp. 367-383,1981).
A proteinek módosítására más vízoldható polimerek is felhasználásra kerültek, mint például az etilénglikol-propilénglikol kopolimerjei, a karboxi-metil-cellulóz, a dextrán, a poli(vinil-alkohol), a poli(vinil-pirrolidon), a poli-l,3-dioxolán, a poli-l,3,6-trioxán, az etilén/maleinanhidrid kopolimer és a poliaminosavak (homopolimer vagy random kopolimerek).
Számos lehetőség alkalmazásra került a polietilénglikol-molekulák proteinhez való kapcsolása céljából. Általában a polietilénglikol-molekulákat a proteinhez egy, a proteinen található aktív csoporton keresztül csatlakoztatják. Az olyan aminocsoportok, mint a lizinmaradékokon levők vagy az N-terminuson levők, megfelelőek az ilyen kapcsolásokhoz. Például Royer (a fenti 4,002,531 számú US szabadalom) kijelenti, hogy reduktív alkilálást alkalmaztak a polietilénglikol-molekulák egy enzimhez való kapcsolásához. Wright (1993. április 28-án iktatott 0 539 167 számú EP, „Peg Imidates and Protein Derivatives Thereof’) arról számol be, hogy a szabad aminocsoport(ok)kal rendelkező peptideket és szerves vegyületeket a PEG egy imidátszármazékával vagy egy rokon vízoldható szerves polimerrel módosították. A 4,904,584 számú US szabadalom, Show (1990. február 27-én iktatták) a proteinekben levő lizin4
HU 218 893 Β maradékok számának módosításával kapcsolatos, mely módosítás az aktív csoportokon keresztüli polietilénglikol-molekulákhoz való kapcsoláshoz való.
Egy specifikus, kémiailag módosított terápiás protein a granulocitatelep-stimuláló faktor, a „G-CSF”. Lásd az EP 0 401 384, az EP 0 473 268 és az EP 0 335 423 számú európai közzétételi iratokat,
A másik példa a pegilált IL-6, a „Modified hIL-6” című 0 442 724 számú EP szabadalom (lásd az ekvivalens US 5,264,209 számú szabadalmat), mely az IL-6hoz adott polietilénglikol-molekulákat ír le. Az 1985. szeptember 11-én közzétett 0 154 316 számú E bejelentés egy limfokin a polietilénglikol egy aldehidjével való reakcióját írja le.
A tudomány e területén nem ismert az MGDF módosításának lehetősége, mivel az egyes proteinek módosítással szembeni érzékenysége az adott protein specifikus szerkezeti paramétereiből kerül meghatározásra. Továbbá az ilyen módosítások egyes proteinek biológiai tulajdonságaira kifejtett hatását nem lehet előre megjósolni. Az MGDF számos klinikai alkalmazása miatt, ahogy azt a találmány során bemutatjuk, szükség van egy megváltoztatott tulajdonságokkal rendelkező származtatott MGDF-termékre. Az ilyen molekulák megnövekedett felezési idővel és/vagy aktivitással rendelkezhetnek in vivő, valamint egyéb tulajdonságokkal.
A proteinmolekulák pegilálása általában kémiailag módosított proteinek keverékét eredményezi. Illusztrációként az 5 lizinmaradékkal és az N-terminuson egy szabad aminocsoporttal rendelkező proteinmolekula fenti módszerben való reagáltatása egy heterogén keveréket eredményezhet, néhány hat polietilénglikol-egységgel, néhány öt, néhány négy, néhány három, néhány kettő, néhány egy polietilénglikol-egységgel rendelkezik, és lesz olyan, amelyik eggyel sem. És a több polietilénglikol-egységgel rendelkező molekulák között a polietilénglikol-egységek esetleg nem kapcsolhatók különböző molekulák ugyanazon lokációjához. Gyakran kívánatos, hogy olyan homogén terméket kapjunk, mely alapjában véve tartalmazza az összes módosított proteint vagy ezekből néhányat (például kettőt-hármat), melyek különböznek a kémiai egységek számában és/vagy elhelyezkedésében, mint amilyen például a PEG. Mindazonáltal például a mono-, di- és/vagy tripegilált típusok keverékeire is szükség lehet, vagy tolerálhatok lehetnek egy adott terápiás indikációban.
A keverék variabilitása nem lenne túl előnyös egy terápiás pegilált proteintermék kifejlesztésekor. Egy ilyen kifejlesztésben a biológiai aktivitás kiszámíthatósága nagyon fontos. Például kimutatták, hogy a szuperoxid diszmutáz polietilénglikollal való nem szelektív konjugációjának esetében a módosított enzim számos frakciója teljesen inaktív (p. McGoff et al., Chem. Pharm. Bull. 36:3079-3091, 1988). Lásd Rose et al., Bioconjugate Chemistry 2:154-159, 1991, mely arról számol be, hogy a kötőcsoport karbohidrazidot szelektíven kapcsolják egy proteinszubsztrát (inzulin) C-terminális karboxilcsoportjához. Ha a terápiás protein összetételében nagyon jelentősen különbözik, ilyen becsléseket nem lehet tenni. A polietilénglikol-egységek közül néhány nem köthető olyan stabilan egyes helyekhez, mint mások és ez azt eredményezheti, hogy ezek az egységek disszociálnak a proteinről. Természetesen ha az ilyen egységek random módon kapcsolódnak és ezért random módon is disszociálódnak, a terápiás protein farmakokinetikája nem jósolható meg pontosan előre.
Szintén nagyon kívánatos egy olyan származtatott MGDF-termék, melyben nincs kapcsolódó egység a polimer egység és az MGDF-egység között. A fent említett módszerekkel kapcsolatban felmerül egy probléma, miszerint ezek tipikusan egy kötőegységet igényelnek a protein és a polietilénglikol-molekula között. Ezek a kapcsolódó egységek lehetnek antigenikusak, ami szintén nem kedvező egy terápiás protein kifejlesztésénél.
Kötőcsoportokat nem tartalmazó módszert írnak le Francis és munkatársai a „Stability of protein pharmaceuticals: in vivő pathways of degradation and strategies fór protein stabilization” című műben (Eds. Ahem., T. and Manning, M. C., PLenum, New York, 1991). Delgado és munkatársai a „Coupling of PEG to Protein by Activation with Tresyl Chloride, Applications in Immunoaffinity Cell Preparations” című műve (In: Fisher et al., ed., Separations Using Aqueous Phase Systems, Applications In cell Biology and Biotechnology, Plenum Press, N.Y., N.Y. 1989. pp. 211-213) a trezil-klorid használatát foglalja magában, ami azt eredményezi, hogy nincs kötőcsoport a polietilénglikol-egység és a proteinegység között. Ezt a módszert nehezen lehet alkalmazni terápiás termékek termeléséhez, mivel a trezil-klorid használata toxikus melléktermékeket eredményezhet.
Chamow és munkatársai (Bioconjugate Chem. 5:133-140, 1994) a CD4 immunoadhezin monometoxi-polietilénglikol („MePEG glikol) aldehiddel való reduktív alkiláláson keresztüli módosításáról számolnak be. A szerzők arról számolnak be, hogy a CD4-Ig 50%-a MePEG-módosított lett az N-terminus alfa-aminocsoportjánál levő szelektív reakción keresztül (lásd 137. oldal). A szerzők arról is beszámolnak, hogy a CD4-Ig in vitro kötési képessége (a protein gp 120hoz) az MePegilációs mértékkel arányban levő mértékben csökkent.
így szükség van MGDF-származékokra és még részletesebben pegilált MGDF-ekre. Szükség van ezenkívül az ilyen származtatás végrehajtására szolgáló módszerekre is.
A TALÁLMÁNY ÖSSZEFOGLALÁSA
Egy megvalósulásban a jelen találmány olyan új polipeptideket biztosít, melyek specifikusan segítik elő a megakariociták szaporodását és/vagy fejlődését („Mplligandumok” vagy „MGDF-ek”), melyek alapjában véve más proteinektől mentesek (azaz izoláltak), (azaz egy Mpl-ligandum esetében az emlősproteinek egy emlősforrásból származnak). Az ilyen proteinek sejtforrásokból tisztíthatok ki a faktorok természetes előállításával, vagy más faktorokkal való indukcióval. Előállíthatok rekombináns génsebészeti technikákkal is. Az Mpl-ligandumok továbbá szintetizálhatok kémiai technikákkal is vagy a fent felsorolt technikák kombinálásával.
HU 218 893 Β
A jelen találmány Mpl-ligandumai emlősforrásokból natív formájukban is kinyerhetők. Két példaértékű, nyúl aplasztikus plazmából származó Mpl-ligandum kerül leírásra a találmány példákat magában foglaló részében. Azonban a találmány során más példákban bemutatjuk, hogy szoros rokonságban álló Mpl-ligandumok vannak jelen humán és sertésforrásokból származó aplasztikus plazmában. Megjegyzendő, hogy az egyes humán, sertés-, és nyúl-Mpl-ligandumok aktivitása specifikusan gátolható a patkány-Mpl-receptor oldható formájával, azt jelezve, hogy ezek közül az összes Mpl-ligandum (valamint a más emlősforrásból származó, ideértve a patkányt) közeli rokonságban áll mind a szerkezeti, mind az aktivitási szinteket figyelembe véve.
Azt váijuk, hogy a humán, sertés- és más emlősMpl-ligandumok természetes forrásokból izolálhatok olyan eljárásokkal, melyek alapjában véve a találmányban leírtakkal megegyeznek. Lásd a 10. példát. Ennek megfelelően a jelen találmány általában magában foglalja az emlős-Mpl-ligandumokat, mint például a kutyából, sertésből, emberekből, egerekből, lovakból, birkából és nyúlból származókat. A különösen előnyben részesített Mpl-ligandumok a kutyákból, sertésekből és emberekből származó ligandumok.
Továbbá humán Mpl-ligandumokat kódoló géneket klónoztunk humán magzati vese- és májkönyvtárakból és ezeket szekvenáltuk is, ahogy azt a későbbi Példák című részben bemutatjuk. Két humán polipeptidszekvenciáról határoztuk meg, hogy sejtalapú vizsgálatban (lásd a 4. példát) aktivitással rendelkeznek. Ezek a szekvenciák hosszúságban különböznek, azonban aminosavszekvenciáik egy nagy szakaszán azonosságot mutatnak. Az azonos részek az eritropoietinnel mutatnak homológiát. A találmány során az Mpl-ligandumokra megakariocitaszaporodási és -fejlődési tényezőkként (Megacaryocyte Growth and Development Factors=MGDF-ek) is utalunk, az összes Mpl-ligandumra vonatkozó általános hivatkozás vonatkozik az MGDFekre vonatkozó hivatkozásokra, és ez fordítva is igaz. Az „MGDF-polipeptiden” egy olyan polipeptidet értünk, mely a megakariociták szaporodására és/vagy fejlődésére specifikus stimuláló- vagy gátlóaktivitással rendelkezik. A találmányban leírásra kerülnek példaként ilyen polipeptidek.
A jelen találmány Mpl-ligandumai specifikusan aktívnak bizonyultak a megakariocita vonalban, fokozva a megakariociták érését és/vagy szaporodását, ahogy azt a későbbiekben a 2. és 4. példák kísérleteiben leírjuk. A „specifikusan” kifejezésen azt értjük, hogy a polipeptid számos más sejttípussal összehasonlítva a megakariocitákkal szemben jóval nagyobb mértékű biológiai aktivitással rendelkezik. Azoktól, melyek a megakariocitákkal szemben stimuláló hatásúak, azt várjuk, hogy in vivő stimulálóaktivitással rendelkeznek a trombociták termelésére a megakariociták érésének és differenciálódásának strimulálásán keresztül.
Két előnyben részesített, nyúlból származó Mplligandum megközelítően 25 és 31 kd látszólagos molekulasúllyal rendelkezik, ahogy azt nem redukáló körülmények között nátrium-dodecil-szulfát poliakrilamidgélelektroforézissel (SDS-PAGE) meghatároztuk. Mindkét proteint a későbbiekben szereplő Példák című részben részletezett tisztítási eljárás során tisztítjuk.
A két előnyben részesített humán ligandum, az MGDF-1 és az MGDF-2 sorrendben 332 és 174 aminosav hosszúságú, nem számítva a 21 aminosav hosszúságú feltételezett jelpeptidet. Ezek a szekvenciák, valamint egy harmadik rokon molekula - az MGDF-3 - a 11. és a 12. ábrákon látható.
A találmány egy másik megvalósulása a jelen találmány Mpl-ligandumainak vagy íragmentjeinek emlősforrásokból - előnyösen vérből, szérumból vagy plazmából - való izolálására és tisztítására szolgáló eljárások. Az aplasztikus vér, szérum vagy plazma különösen előnyben részesített kiindulási anyagok. Az aplasztikus vér, szérum vagy plazma olyan eljárással nyerhetők ki, melynek során az emlőst egy sugárforrásból - mint a kobalt-60 - megközelítően 400-800 rád sugárzási szinttel besugározzuk aplasztikussá tétel céljából. Az ilyen eljárás a tudomány e területén jól ismert, ahogy azt az 1. példában idézett irodalmi hivatkozásokkal bemutatjuk. Emberek esetében a besugárzott vér, plazma vagy szérum kinyerhető sugárterápián átesett betegből, például rákkezelés után.
Ezután az aplasztikus vért, szérumot vagy plazmát tisztítási eljárásnak vetjük alá. A jelen találmány által biztosított tisztítási eljárás a következő kulcseljárásokat foglalja magában: lektin-affinitáskromatográfia és Mpl-receptor-affinitáskromatográfia. Ezen eljárások a nyúl aplasztikus plazmából származó 25 és 31 kd hosszúságú proteinek egy megközelítően 300-500-szoros tisztítását eredményezi. Más standard proteintisztítási eljárások is elvégezhetők a fenti eljárással együtt a jelen találmány Mpl-ligandumainak további tisztítása céljából, mint például az alábbiakban részletezett eljárások.
A jelen találmány egy másik megvalósulása olyan polinukleotidokat foglal magában, melyek egy emlősMpl-ligandum proteinexpresszióját kódolják. Az ilyen DNS-szekvenciák magukban foglalhatnak egy olyan izolált DNS-szekvenciát, mely az emlős-Mpl-ligandum proteinek expresszióját kódolja a találmányban leírtak szerint. A DNS-szekvenciák magukban foglalhatják az Mpl-ligandum-kódoló szekvenciát határoló 5’ és 3’ emlős nem kódoló szekvenciákat is. A DNS-szekvencia továbbá kódolhat egy aminoterminális jelpeptidet is. Az ilyen szekvenciák előállíthatok jól ismert módszerekkel, ideértve a teljes vagy részleges kémiai szintézist. A kodonok az expresszióra kiválasztott gazdasejtben az expresszióra optimalizálhatok (például E. coli vagy CHO sejtek).
A jelen találmány biztosít rekombináns DNSmolekulákat is, melyek mindegyike tartalmaz vektor DNS-t és egy emlős-Mpl-ligandumot kódoló DNSszekvenciát. A DNS-molekulák az Mpl-ligandumot az Mpl-ligandum kiválasztott gazdasejtben való replikációjának és expressziójának szabályozására képes szabályozószekvenciához működőképesen kapcsolva biztosítják. A jelen találmány a rekombináns Mpl-ligandum protein expresszálásában való felhasználásához
HU 218 893 Β biztosít az ilyen DNS-molekulákkal transzformált gazdasejteket is (például baktérium-, emlős-, rovar-, élesztőgomba- vagy növényi sejteket).
A találmány DNS-molekuláit és transzformált sejtjeit más megvalósulásokban is felhasználjuk, egy rekombináns emlős-Mpl-ligandum protein vagy annak egy peptidfragmentje előállítására szolgáló új eljárásban. Ebben az eljárásban a protein expressziójának szabályozására képes megfelelő szabályozó- vagy expressziószabályozó szekvenciával működőképesen kapcsolt, az Mpl-ligandum protein- vagy ennek egy fragmentje expresszióját kódoló DNS-sel (vagy egy, a fentiek szerint leírt rekombináns DNS-molekulával) transzformáit sejtvonalat megfelelő körülmények között tenyésztünk a rekombináns DNS expresszióját lehetővé téve. Ebben az igénypontokban szereplő eljárásban számos ismert sejt alkalmazható gazdasejtként a protein expressziójához. A jelen esetben az Mpl-ligandum termeléséhez előnyben részesített sejtvonalak az emlőssejtvonalak (például a CHO sejtek) és a bakteriális sejtek (például E. coli).
Az Mpl-ligandum E. coli-vai való termeléséhez előnyben részesül, ha az expresszálandó protein N-terminusán Met és Lys maradékokat alkalmazunk, mivel az expressziós termék hozama tipikusan magasabb. A különösen előnyben részesített expressziós termék, a Met-Lys humán MGDF összesen 165 aminosavat tartalmaz [azaz Met-2-Lys1 (1-163) MGDF (az érett protein első aminosavától indul a számozás)]. A bakteriális sejtben, mint például E. coli-ban expresszált termék tisztítása után a terminális Met-Lys maradék eltávolítható egy enzimmel, mint amilyen például egy dipeptidáz (például a katepszin C), való kezeléssel.
Ezután az expresszált Mpl-ligandum proteint a gazdasejtből, a sejtlizátumból vagy a tenyésztápközegből megfelelő hagyományos eszközökkel összegyűjtjük. A kondicionált tápközeg feldolgozható ugyanezen tisztítási lépésen keresztül vagy ennek egy módosított változatában, ahogy az Mpl-ligandum aplasztikus plazmából való izolálására használjuk (lásd a 7. példát).
A jelen találmány egy megint más megvalósulásában rekombináns Mpl-ligandum-proteineket biztosítunk. Ezek a proteinek alapjában véve más emlősanyagoktól - különösen proteinektől - mentesek. A jelen találmány Mpl-ligandum-proteinjei úgy is jellemezhetők, hogy a találmányban leírt egy vagy több fizikai, biokémiai, farmakológiai vagy biológiai aktivitással rendelkeznek.
A jelen találmány legalább egy vízoldható polimerhez kapcsolódó MGDF-protein egységet tartalmazó, kémiailag módosított MGDF-re is vonatkozik, valamint ilyen készítmények előállítására és alkalmazására. Részletesen a jelen találmány magában foglalja a kémiailag úgy módosított MGDF-et, ahol az MGDF reaktív polietilénglikol-molekulákkal reagál, hogy a PEG az MGDF-hez kapcsolódjon. Az ilyen kapcsolás a találmányban részletezett pegilálási reakciókkal, mint például acilálással vagy alkilálással valósítható meg. A PEG-gel való acilálás vagy alkilálás megvalósítható olyan körülmények között, ahol a fő termék monopegilált vagy polipegilált. A polipegilálás általában a PEG-lizin-maradék epszilon-aminocsoportjához való kapcsolását foglalja magában, és magában foglalhatja a polipeptid N-terminusánál való pegilálást is. A monopegilálás előnyösen a PEG-protein N-terminusánál elhelyezkedő alfa-aminocsoporthoz való kapcsolását foglalja magában. Az ilyen monopegilálási reakció hozama és homogenitása egy olyan reduktív alkiláláson keresztül növelhető, mely szelektíven módosítja egy MGDFprotein-egység N-terminális maradékának alfa-aminocsoportját, így lehetővé teszi a protein N-terminusánál egy vízoldható polimeregység szelektív kapcsolását. Ez lehetővé teszi a polimer/MGDF-protein konjugátummolekulák alapjában véve homogén készítményének megvalósítását, valamint (ha polietilénglikol kerül felhasználásra) olyan pegilált MGDF-protein-molekulák előállítását, ahol a polietilénglikol-egység közvetlenül a proteinegységhez kapcsolódik.
A jelen találmány egy megint más megvalósulása olyan gyógyszerészeti készítményeket biztosít, melyek az izolált természetesen előforduló vagy rekombináns Mpl-ligandum gyógyszerészetileg hatékony mennyiségét tartalmazzák, mely ligandum egy olyan vízoldható polimerrel származtatható, mint például a polietilénglikol, valamint egy gyógyszerészetileg elfogadható hordozót, hígítót vagy hatásjavítót. Ezek a gyógyszerészetileg elfogadható készítmények felhasználhatók a megakariociták és/vagy trombociták hiányával jellemezhető rendellenességek vagy betegségek kezelésére, valamint az Mpl-ligandum in vivő hiányának kezelésére. Ezek felhasználhatók profilaktikusan is a várt megakariocitavagy trombocitadeficiencia (hiány) javítására (például sebészeti beavatkozásnak köszönhetően).
így a jelen találmány Mpl-ligandumai felhasználhatók az aplasztikus anémiák kezelésére, például a károsodott trombocitatermeléssel rendelkező betegek trombocitatermelésének fokozására (például AIDS-es betegek vagy kemoterápiát kapó rákos betegek esetében). Az Mpl-ligandum felhasználható a vérrendellenességek, mint például a trombocitopenia kezelésére. Az Mpl-ligandum kisegítő terápiaként alkalmazható a csontvelő-transzplantációs betegek esetében. Az ilyen betegek lehetnek emberek vagy más emlősök. Az egyik fajból származó Mpl-ligandum esetében arra számítunk, hogy egy másik faj esetében is felhasználható.
A találmány egy további megvalósulása ezért egy olyan módszer, mely a trombocitahiányból eredő ilyen és más patológiai állapotok kezelésére szolgál, melynek során a fent leírtak szerint egy gyógyszerészeti készítmény gyógyszerészetileg hatékony mennyiségét adjuk egy betegnek. Ezek a terápiás módszerek magukban foglalhatják az Mpl-ligandum egyidejű vagy egymást követő alkalmazása mellett legalább egy másik megakariocitatelep-stimuláló faktor, egy citokin (például EPO), egy oldható Mpl-receptor, hematopoietin, interleukin, növekedési faktor vagy antitest hatékony mennyiségének alkalmazását.
A jelen találmány egy megint más megvalósulása egy emlős-Mpl-ligandum vagy egy ligandumfragmenttel szembeni (azaz ezzel reagáló) antitestet (például po7
HU 218 893 Β liklonális, monoklonális, humanizált és rekombináns) és antitestfragmenteket biztosít. Ezen megvalósulás részeként ezért a találmány magában foglalja az ilyen antitestek szekretálására képes sejteket (például hibridómákat a monoklonális antitestek esetében), valamint ezek előállítását és diagnosztikai vagy terápiás eljárásokban való felhasználását.
A találmány egy megint más megvalósulása az Mplligandum testfolyadékban való jelenlétének vizsgálata. Az ilyen vizsgálatok során alkalmazásra kerülhetnek az Mpl-ligandumot specifikusan felismerő antitestek, egyedüli antitest formában vagy egy „szendvics” formában. Egy ilyen vizsgálat felhasználható annak meghatározására, hogy a beteg igényel-e külső Mpl-ligandum-adagolást és/vagy az ilyen betegek mutatnak-e trombocitadeficienciát vagy -rendellenességet. Az ilyen vizsgálatok lehetnek kit formában, pozitív és negatív kontrollokat, valamint antitesteket és más standard kit alkotórészeket is magukban foglalva.
A jelen találmány más megvalósulásai és előnyei nyilvánvalóak lesznek az előnyben részesített megvalósulások következő részletes leírását figyelembe véve.
AZ ÁBRÁK RÖVID LEÍRÁSA
A jelen találmány számos jellemzője és előnye egyértelművé válik az ábrák áttekintése után, ahol:
Az 1. ábra a megakariociták és trombociták fejlődésének és érésének áttekintését adja.
A 2. ábra azt mutatja be, hogy a besugárzott kutyákból származó plazma („aplasztikus nyúl” vagy „APK9”) megakariocitafejlődés indukálására való képességét az oldható patkány-Mpl-receptor alapjában véve teljesen meggátolja. A megakariocitafejlődéshez való vizsgálatot a 2. példában írtuk le.
A 3. ábra azt mutatja, hogy az APK9-ből lektinaffinitási és Mpl-receptor-affmitási kromatográfiás eljárásokkal („Mpl-ligandum”) dúsított aktivitás stimulálja az 1A6.1 sejtek szaporodását és az oldható patkány-Mpl-receptor gátolja ezt a szaporodást.
A 4. ábra az aplasztikus nyúlplazmából származó nyúl-Mpl-receptor 25 és 31 kd formáinak tisztítási lépésében szereplő tisztítási lépések áttekintését mutatja.
Az 5. ábra az Mpl-ligandum reverz fázisú HPLCvel (RP-HPLC) való tisztítását mutatja. A 21-es frakció az erősen tisztított 31 kd hosszúságú Mpl-ligandumot tartalmazza; a 22-es frakció a 31 kd és a 25 kd hosszúságú Mpl-ligandumok keverékét tartalmazza; és a 23-as frakció az erősen tisztított 25 kd hosszúságú Mpl-ligandumot tartalmazza.
A 6. ábra a 25 és/vagy 31 kd hosszúságú Mplligandum proteineket tartalmazó reverz fázisú HPLC (C4 oszlop) frakciókban levő Mpl-ligandum-aktivitások összehasonlítását mutatja.
A 7. ábra az APK9-cel, Mpl-ligandummal és számos más faktorral stimulált CD24-szelektált perifériás vérsejtek tenyészetéből termelt megakariociták számát mutatja.
A 8. ábra az APK.9-cel, Mpl-ligandummal és számos más faktorral stimulált CD24-szelektált perifériás vérsejtek tenyészetéből termelt összes leukocitaszámot mutatja.
A 9. ábra az APK9-cel, Mpl-ligandummal és számos más faktorral stimulált CD24-szelektált perifériás vérsejtek tenyészetéből termelt megakariociták százalékát mutatja.
A 10. ábra azt mutatja, hogy az IL-3 nem vesz részt az Mpl-ligandum által indukált megakariocitafejlődésben.
A 11. ábra a humán MGDF-1 és MGDF-2 cDNS és származtatott aminosavszekvenciáit mutatja.
A 12. ábra a humán MGDF—3 cDNS és származtatott aminosavszekvenciáját mutatja.
A 13. ábra a nyúlforrásból (A) és patkányforrásból (B) származó MGDF-1 és MGDF-ek (Mpl-ligandumok) közötti összehasonlítást mutatja.
A 14. ábra a monometoxi-polietilénglikol N-hidroxi-szukcin-imidil (NHS) aktív észtereit felhasználó MGDF acilálás egy példáját mutatja, melynek során egy polipégilált termék keletkezik.
A 15. ábra monometoxi-polietilénglikol aldehideket felhasználó nem specifikus MGDF reduktív alkilezésének egy példáját mutatja, melynek során egy polipegilált termék keletkezik.
A 16. ábra monometoxi-polietilénglikol-aldehideket felhasználó, az N-terminális maradék alfa-aminocsoportjánál levő hely specifikus MGDF reduktív alkilezésének egy példáját mutatja, melynek során alapjában véve egy monopegilált termék keletkezik.
A 17. ábra az MePEG-MGDF konjugátumok - melyeket az MW 20 kDa MePEG aktivált származékát felhasználva állítjuk elő méretexklúziós (SEC) HPLC-analízisét mutatja:
A) a poli-MePEG-MGDF konjugátumot az MePEG NHS észterével való MGDF-acilálással állítjuk elő (PEG 11),
B) a poli-MePEG-MGDF konjugátumot az MePEG aldehiddel való MGDFalkilezéssel állítjuk elő (PEG 20),
C) a mono-MePEG-MGDF konjugátumot az MePEG aldehiddel való MGDFalkilezéssel állítjuk elő (PEG 16).
A 18. ábra a rekombináns humán MGDF-fel kezelt egerekből származó trombocitaszámot
HU 218 893 Β mutatja: az üres csillag=CHO-eredetű 22-353 MGDF; az üres kör=nem pegilált E. coli 22-184 MGDF (azaz 1-163 MGDF); a sötét kör=pegilált E. coli 22-184 MGDF.
A19. ábra az r-HuMGDF tisztítási folyamat vázlatát mutatja.
A 20. ábra az r-HuMGDF (E. coli 163) trombocitaszámra kifejtett hatását mutatja egy patkánykarboplatin modellben. Balb/c egereket intraperitoneálisan beinjekciózunk karboplatin (1,25 mg/egér) egyszeri dózissal a 0. napon. A csupán hatásjavítót kapó csoport nem kap karboplatint. Huszonnégy óra után a karboplatinnal kezelt állatokat vagy a hatásjavítóval, vagy 100 pg/kg r-HuMGDF-fel szubkután beinjekciózzuk naponta a vizsgálat hátralevő részében (n=10 minden csoport esetében; minden második időpontban 5 állatot kivéreztetünk).
A 21. ábra az r-HuMGDF (£. coli 1-163) trombocitaszámra kifejtett hatását mutatja a besugárzással kezelt egerek esetében. A Balb/c egereket 500 rád gamma-sugárzás (céziumforrás) egyszeri dózisával besugározunk a 0. napon. A csupán hatásjavitót kapó állatokat nem sugározzuk be. Huszonnégy óra után a sugárkezelt állatokat vagy a hatásjavítóval, vagy 100 pg/kg r-HuMGDF-fel szubkután beinjekciózzuk naponta a vizsgálat hátralevő részében (n=8 minden csoport esetében; minden második időpontban 4 állatot kivéreztetünk).
A 22. ábra az r-HuMGDF (E. coli 1-163) trombocitaszámra kifejtett hatását mutatja a besugárzással és karboplatinnal kombináltan kezelt egerek esetében. A Balb/c egereket 500 rád gamma-sugárzás (céziumforrás) egyszeri dózisával besugározunk, és 1,25 mg/egér karboplatint adunk a 0. napon. Huszonnégy óra után a kiválasztott állatokat vagy a hatásjavítóval, vagy 100 pg/kg r-HuMGDF-fel szubkután beinjekciózzuk naponta a vizsgálat hátralevő részében (n=8 minden csoport esetében). Az r-HuMGDF támogatás nélkül a legtöbb állat nem éli túl ezt a vizsgálatot. A kontrollcsoportban a 8 állatból egy élte túl a vizsgálatot. A kezelt csoportban a 8 állatból nyolc életben maradt.
A 23. ábra az r-HuMGDF (E. coli 1-163) besugárzással indukált trombocitopeniára kifejtett hatását vizsgáljuk rhesusmajmok esetében. A rhesusmajmokat 700 cGy Co-80 besugárzásnak vetjük alá. Huszonnégy órával a besugárzás után rHuMGDF-et (n=3) vagy humán szérumalbumint (n = 9) (mindegyik 25 pg/kg/nap) adunk szubkután módon az állatoknak 18 egymást követő napon. A vérsejtanalíziseket elektronikus vérsejt-analizátorral végezzük el. Az egyes szimbólumok az átlagértékeket (+/- sem) képviselik.
A 24. ábra a pegilált és glikolizált r-HuMGDF trombocitaszámra kifejtett hatását mutatja karboplatinnal és sugárzással kezelt egerek esetében. Az egereket a 22. ábránál elvégzett vizsgálatokhoz leírt kombinált karboplatin- és besugárzás-kezelésnek vetjük alá. A kezelés után huszonnégy órával az r-HuMGDF jelzett készítményének (50 pg/kg/nap) szubkután injektálását a vizsgálat ideje alatt naponta végezzük. A vérsejtszámokat a jelzett napokon egy elektronikus sejtszámlálóval (Sysmex, Baxter) számoljuk meg.
A 25. ábra a rekombináns humán MGDF, E. coli optimalizált kodonokkal rendelkező 1-163 aminosavának szintetikus génszekvenciáját mutatja.
A TALÁLMÁNY RÉSZLETES LEÍRÁSA A tudomány e területén képzett szakemberek számára a találmány további megvalósulásai és előnyei egyértelműek lesznek a következőkben megadott leírás figyelembevételével, melynek során a találmány gyakorlata kerül részletes leírásra.
A találmány által biztosított új emlősmegakariocitaszaporodást elősegítő és/vagy trombocitatermelő faktorok - melyekre Mpl-ligandumokként utalunk -olyan homogén proteinek, melyek más proteinszerű anyagoktól mentesek. Előnyösen a protein körülbelül 90%-ban mentes más proteinektől, különösen előnyben részesül, ha 95%-ban mentes más proteinektől és legelőnyösebben 98%-nál nagyobb mértékben mentes más proteinektől. Ezek a proteinek előállíthatók rekombináns technikákkal a terápiás alkalmazásokhoz való tiszta, aktív Mpl-ligandum nagy mennyiségű termelésének lehetővététele céljából. Másik lehetőségként ilyen proteinek nyerhetők homogén formában emlős aplasztikus vérből, plazmából vagy szérumból, vagy egy Mpl-ligandumot szekretáló vagy expresszáló emlőssejtvonalból. Továbbá, az Mpl-ligandum vagy ennek egy aktív fragmentje kémiailag is szintetizálható.
Általában az „Mp-ligandumon” - ahogy azt a jelen találmányban alkalmazzuk - a találmányban leírt Mplligandumokat értjük, valamint ezek aktív fragmentjeit és variánsait, melyeket az alábbiakban mutatunk be részletesen.
Nyúlforrásból származó két előnyben részesített Mpl-ligandum megközelítően 25 és 31 kd hosszúságú látszólagos molekulasúllyal rendelkezik, amit nátriumdodecil-szulfát-poliakrilamid gélelektroforézissel (SDS-PAGE) határozunk meg redukáló körülmények között. Mindkét proteint ugyanazzal a tisztítási eljárással tisztítjuk, melyet az alábbi példa című részben írunk
HU 218 893 Β le részletesen. így például mindkét Mpl-ligandum kötődik a búzacsíralektinhez és az immobilizált Mpl-receptorhoz. A 25 kd méretű forma a következő aminosavszekvenciát foglalja magában :
Ala-Pro-Pro-Ala-Xaa-Asp- Pro-Arg-Leu-Leu-AsnLys-Met-Leu-Arg-Asp-Ser-His-Val-Leu-His-XaaArg-Leu-Xaa-Gln-Xaa-Pro-Asp-Ile-Tyr (1. számú szekvencia).
A 31 kd méretű forma az alábbi aminosavszekvenciát foglalja magában:
Ala-Pro-Pro-Ala-Xaa-Asp-Pro-Arg-Leu-Leu-Asn-LysMet-Leu-Arg-Asp-Ser-His-Val-Leu-His (2. számú szekvencia).
Az 1. és 2. számú szekvenciákban mutatott „Xaa” aminosavak nem ismertek biztosan, azonban azt várjuk, hogy ezek, risztéin, szerin, treonin vagy (kisebb valószínűséggel) triptofán aminosavak.
A fenti szekvenciákból látható, hogy a 31 kd méretű ligandum a 25 kd méretű forma legalább egy részét tartalmazza. Részletesebben, a 31 kd méretű protein első 21 aminosava pontosan megegyezik a 25 kd méretű protein első aminosavaival. Ez a bizonyíték, és különösen az a tény, hogy mindkét protein aktivitással rendelkezik a találmányban bemutatott Mpl-ligandum-aktivitási vizsgálatokban, ahhoz a következtetéshez vezet, hogy mindkét protein közeli rokonságban van szerkezet és aktivitás tekintetében. Valószínűleg a protein 31 kd méretű formája a 25 kd méretű formától a megkülönböztető C-terminális szekvenciában, a megkülönböztető glikozilációs és/vagy a proteineket kódoló gén megkülönböztető hasításban tér el.
A fenti szekvenciaadatokon túl egy másik szekvenciát is meghatároztunk a 25 kd méretű sáv szekvenálása során az utolsó tisztítási lépés (reverz fázisú HPLC-t felhasználó) előtt. Azt találtuk, hogy ez a szekvencia nem redukáló körülmények között a 25 kd méretű sávval kapcsolatban van, azonban redukáló körülmények között nincs, beleértve azt, hogy ez a 25 kd méretű protein két részre való hasításának (például proteázzal) eredménye, mely két részt egy diszulfidkötés tart egybe. Ez a szekvencia:
Thr-Gln-Lys-Glu-Gln-Thr-Lys-Ala-Gln-Asp-ValLeu-Gly-Ala-Val-Ala-Leu (3. számú szekvencia).
Bár a 25 kd méretű protein szekvenciájában a 3. számú szekvencia pontos elhelyezkedése nem ismert, más citokinekkel - mint például az eritropoietin - való analógia alátámasztja azt a lehetőséget, hogy a szekvencia a 25 kd méretű proteinben a 114-es számú aminosav körül fordul elő. Meg kell jegyezni, hogy hasonlóképpen, bár nem bizonyított, a 3. számú szekvencia a 31 kd méretű proteinben feltehetően szintén a 114-es számú aminosav körül kezdődik. Ez a szekvenciaadat további részletekkel a 7. példában kerül leírásra.
Mivel a nyúlligandumok kezdeti tisztítási kísérleteit a fentiekben összefoglaltuk, egy, a nyúlligandumot kódoló gént klónozunk. Ennek eredményeként ezen nyúlligandum teljes hosszúságú aminosavszekvenciáját meghatározzuk, és ez a 13 A. ábrán kerül bemutatásra. A molekulasúly-számításokra alapozva, azt jósoljuk, hogy a 25 kd és a 31 kd méretű nyúlligandumok a 13 A. ábrán bemutatott teljes hosszúságú ligandum C-terminális feldolgozott formái. Továbbá egy patkány-Mpl-ligandumot nyerünk, melynek szekvenciáját a 13B. ábrán mutatjuk be.
Az ilyen tisztított ligandumok a 2. példa legalább 5,7 χ 109 megakariocita egység/mg szintű humán megakariocitavizsgálat specifikus aktivitásával is jellemezhető. Egy megakariocita egység úgy határozható meg, hogy az az anyagmennyiség, mely az APK.9 standard kontroll 1 μΐ mennyiségű megakariocitamennyiséggel azonos megakariocitamennyiséget eredményez a 2. példában leírt vizsgálatot használva.
Az ilyen tisztított ligandumok a legalább 6,9 χ 109 sejtszaporodási egység/mg szintű a 4. példában leírt Mpl-függő sejtszaporodási vizsgálatban kapott specifikus aktivitással is jellemezhetők. A „sejtszaporodási egység” úgy határozható meg, mint az a ligandummennyiség, mely a 4. példa vizsgálatában kapott 200 1A6.1 sejtszaporodás eléréséhez szükséges.
A következő 1. táblázat a jelen találmánnyal összhangban előállított ténylegesen tisztított nyúl-Mplligandumok esetében végzett további specifikus aktivitási számításokat mutatja be.
1. táblázat
Mpl- ligandum 1A6.1 vizsgálat (egység/mg) Humán Meg-vizsgálat (egység/mg)
31 kd 6,52x10’ 5,7x10’
25 kd 10,5x10’ 14x10’
A fenti adatokat összefoglalva, a jelen találmány néhány példaként szolgáló Mpl-ligandumai az alábbi biokémiai és biológiai tulajdonságok közül eggyel vagy többel jellemezhetők:
(a) az ilyen Mpl-ligandumok nyúl aplasztikus plazmából kerültek izolálásra;
(b) az ilyen Mpl-ligandumok megközelítően 25 kd vagy 31 kd méretű molekulasúllyal rendelkeznek, ahogy azt 12-14% nátrium-dodecil-szulfát-poliakrilamid gélelektroforézissel (SDS-PAGE) meghatároztuk nem redukáló körülmények között;
(c) az Mpl-ligandum a következő aminosavakat tartalmazza :
az 1. számú szekvenciát, a 25 kd méretű protein esetében;
a 2. számú szekvenciát a 31 kd méretű protein esetében;
(d) az Mpl-ligandum továbbá tartalmazza a 3. számú aminosavszekvenciát is (különösen előnyös esetben a 25 kd méretű proteinben);
(e) az Mpl-ligandum a búzacsíralektinhez kötődik;
(f) az Mpl-ligandum kötődik az immobilizált oldható patkány-Mpl-receptorhoz;
(g) az Mpl-ligandum-aktivitás in vitro gátolható oldható Mpl-receptorral; és (h) az Mpl-ligandum körülbelül 8-9 pH-értéken egy anioncserés oszlophoz kötődik.
A jelen találmány előnyben részesített Mpl-ligandumainak biológiai aktivitását azon képességükön keresztül demonstráljuk, hogy specifikusan stimulálják a megaka10
HU 218 893 Β riociták szaporodását és fejlődését a 2. példában leírt megakariocitaszaporodást elősegítő vizsgálatban. Ebben a vizsgálatban az Mpl-ligandum a humán perifériás vér CD34+ sejtek (azaz az immunoadszorpcióval szelektált CD34 sejtek) differenciálódását stimulálja egy 8 napos tenyésztési időtartam alatt. A megakariocitákat specifikus antitrombocita antigén antitestekkel festjük meg, és mikroszkóposán számoljuk meg ezeket. Az Mpl-ligandum a faktoríuggő sejtvonal - az 1A6.1 - szaporodását is stimulálja. Az Mpl-ligandum hiányában a sejtek elpusztulnak. Az 1 A6.1 sejtek számát az Mpl-ligandumot tartalmazó tenyészetben való két nap után becsüljük meg.
A fent leírt Mpl-ligandumok specifikus aktivitással rendelkeznek, ahogy azt a fenti 1. táblázatban leírtuk.
Az Mpl-ligandum forrásai az aplasztikus emlősvér, -plazma vagy -szérum. Azonban nem valószínű, hogy az ilyen ligandumok forrásai csak az ilyen ismert forrásokra korlátozódnának, és ezek közé tartozhatnak más emlőstestfolyadékok, ezekből nyert sejtek és hasonlók.
A natív Mpl-ligandumok emlősforrásokból való tisztítása két kulcs tisztítási lépésre alapul:
(a) lektin-affinitáskromatográfiára, előnyösen búzacsíra-agglutinint használva; és (b) immobilizált Mpl-receptor affinitáskromatográfiára.
A protein további tisztításának további lépései közé tartozhatnak például az ioncserés kromatográfia, a gélszűréses kromatográfia és a reverz fázisú kromatográfia.
Az Mpl-ligandum nyúl aplasztikus plazmából való kinyerésére szolgáló éppen alkalmazott tisztítási technika a következő lépésekből áll (lásd a 7. példát):
(a) lektin-affinitáskromatográfia (a búzacsíraagglutinin-kromatográfia különösen előnyben részesül);
(b) oldható Mpl-receptor (Mpl-X) affinitáskromatográfia (előnyösen immobilizált patkány-Mpl-X-et használva);
(c) ion (anion vagy kation)-cserés kromatográfia (előnyösen anioncserés kromatográfia; különösen a Mono Q oszlopot használó részesül előnyben);
(d) gélszűréses kromatográfia disszociatív körülmények között (előnyösen Superdex 200 plusz SDS-t használva); és (e) reverz fázisú kromatográfia (előnyösen C-4 oszlopot használva).
A homogén emlős-Mpl-ligaadum, ideértve a humán ligandumot, a fent leírt tisztítási eljárásokkal nyerhető aplasztikus vérből, szérumból vagy plazmából, vagy más emlős-Mpl-ligandum-forrásokból, például sejtvagy szövetforrásokból. A lépések nem kell, hogy egy adott sorrendben kövessék egymást, azonban a megadott sorrend előnyös. Egy sejt vagy szövet forrás tenyésztésére szolgáló eljárás - mely az Mpl-ligandum termelésére szolgálhat - a tudomány e területén képzett szakember számára jól ismert, és felhasználható például a kiindulási anyag növelésére.
Az Mpl-ligandum vagy annak egy vagy több peptidfragmentje szintén előállítható rekombináns technikákkal. Egy adott Mpl-ligandumhoz való DNS-szekvencia kinyeréséhez a tisztított Mpl-ligandum-anyagot redukáljuk, és tetszés szerint egy proteázzal, mint például tripszinnel emésztjük. Az enzimatikus fragmenteket izoláljuk, és hagyományos technikákkal szekvenáljuk. Másik lehetőségként, ahogy a példák között bemutatjuk, az intakt tisztított proteint a kinyerhető proteinmennyiségre lehetségesen alapozott mértékig közvetlenül szekvenáljuk, majd a szekvenált régió analóg módon használható a szekvenált triptikus ffagmentekhez a következő eljárás során. Oligonukleotidpróbákat szintetizálunk a genetikai kódot használva az összes lehetséges szekvencia megjósolásához, melyek a szekvenált fragmentek aminosavszekvenciáját kódolják. Előnyösen számos degenerált szekvenciát hozunk létre próbaként. Az Mplligandum-gént ezeket a próbákat felhasználva azonosítjuk az emlősgenomkönyvtár és más források szkrínelésére. Másik lehetőségként az Mpl-ligandum, egy sejtforrásából származó mRNS felhasználható egy cDNSkönyvtár létrehozásához, mely a próbákkal szkrínelhető az Mpl-ligandum polipeptidet kódoló cDNS azonosítására. Továbbá a PCR-technika felhasználható a cDNSszekvencia kibővítésére, megfelelő primerek felhasználásával.
Egy genomkönyvtár szkrinelésére használva ezeket a próbákat egy DNS-klónt nyerünk. Egy teljes hosszúságú klón kinyeréséhez a kapott DNS-szekvenciára alapozott próbák felhasználhatók a könyvtár újraszkrínelésére és a teljes hosszúságú Mpl-ligandum DNS-szekvenciához való hibridizáláshoz.
Az Mpl-ligandumhoz való humán cDNS kinyerhető, ha a teljes hosszúságú humán genom kiónt egy expressziós vektorba szubklónozzuk, annak COS-sejtekbe való transzfektálásával, ezekből a transzfektált COSsejtekből egy cDNS-könyvtárat készítünk, és hibridizálással az Mpl-ligandum cNS-re szkrínelünk. Ha a teljes cDNS-t azonosítottuk, ezt, vagy ennek az Mpl-ligandum egy aktív fragmentjét kódoló részét számos expressziós vektor bármelyikébe bejuttathatjuk egy, az Mpl-ligandumhoz vagy annak egy vagy több fragmentjéhez való expressziós rendszere előállításához.
A rekombináns technikák ilyen alkalmazásához az Mpl-ligandum polipeptidet kódoló, előnyben részesített DNS-szekvenciákat nyerünk. A jelen találmány vonatkozik ezekre a DNS-szekvenciákra, mentes más proteineket kódoló DNS-sel való kapcsolatoktól (azaz izolált), és melyek egy Mpl-ligandum-aktivitással (például megakariocitaszaporodás és/vagy -fejlődés) rendelkező Mplligandum polipeptidek expresszióját kódolja. Ezek közé a DNS-szekvenciák közé tartoznak azok a szekvenciák, melyek az Mpl-ligandum összes vagy egy fragmentjét kódolják, valamint azok a szekvenciák, melyek - előnyösen szigorú hibridizációs körülmények között - a cDNS-szekvenciákhoz hibridizálódnak [lásd T. Matiatis et al., Molecular Cloning (A Laboratory Manual) Cold Spring Harbor Laboratory (1982) pp 387-389],
A példaként említhető szigorú hibridizációs körülmények közé tartozik a 4 χ SSC-ben való hibridizáció 62-67 °C hőmérsékleten, melyet 0,1 χ SSC-ben való mosás követ 62-67 °C hőmérsékleten megközelítően 1 óráig. Másik lehetőségként a szigorú hibridizációs körülményekre példa a 45-55% formamidban 4 χ SSCben 40-45 °C hőmérsékleten való hibridizáció.
HU 218 893 Β
Az olyan DNS-szekvenciák, melyek nem olyan szigorú körülmények között hibridizálódnak az Mpl-ligandumhoz való szekvenciához, és melyek Mpl-ligandum biológiai tulajdonságokkal rendelkező Mpl-ligandum peptideket kódolnak, kódolják a jelen találmány új Mpl-ligandum polipeptidjeit is. Az ilyen nem annyira szigorú hibridizációs körülményekre példa a 4 χ SSC és a 45-55 °C hőmérséklet, vagy a 40-45 °C hőmérsékleten 30-40% formamiddal való hibridizáció. Például az Mpl-ligandum szekvenciáival jelentős homológiát mutató régiókkal, például glükozilációs vagy diszulfid kötési helyekkel rendelkező, valamint egy vagy több Mpl-ligandum biológiai tulajdonsággal rendelkező proteint kódoló DNS-szekvencia egyértelműen kódol egy Mpl-ligandum polipeptidet, még akkor is, ha egy ilyen DNS-szekvencia nem hibridizálódna szigorúan az Mplligandum szekvenciádhoz.
Az Mpl-ligandum peptidszekvenciáját kódoló DNS-szekvenciák allelikus variációi (természetesen előforduló bázisváltozások a fajpopulációban, melyek aminosawáltozást eredményezhetnek vagy ilyet nem eredményeznek) szintén részét képezik a jelen találmánynak, valamint ezek analógjai vagy származékai. Hasonlóképpen, az olyan DNS-szekvenciák, melyek Mpl-ligandum polipeptideket kódolnak, de melyek a kodonhasználatban - a genetikai kód degeneráltsága miatt - különböznek, vagy az Mpl-ligandum DNS-szekvenciájában levő variációk - melyeket pontmutációk vagy indukált módosítások okoztak az aktivitás növelése érdekében - a felezési idő, vagy az ezek által kódolt polipeptidek termelése szintén részét képezi a jelen találmánynak.
Egy, a 11. példában bemutatott klónozási eljárást követünk, és ez a jelen találmányban leírt humán MGDF-1, MGDF-2 és MGDF-3 proteineket eredményezi. Az MGDF-l-et all. ábra 22-353 aminosavjaiként mutatjuk be, mely 332 aminosavat tartalmaz. Az MGDF-2 az MGDF-1 egy csonkított része, ez a 11. ábra 22-195 aminosavaiként kerül bemutatásra. így az MGDF-2 174 aminosavat tartalmaz. Az MGDF-3 a 12. ábra 22-286 aminosavaként kerül bemutatásra, és 265 aminosavat tartalmaz. Az itt leírt MGDF-ekben a jelpeptidet - a 11. és a 12. ábrák 1-21 aminosavaiként mutatjuk be - is magában foglaló molekula szintén részét képezi a jelen feltalált polipeptideknek, de előnyösen ezt elkülönítjük a bemutatandó megakariocitaszaporodási és -fejlődési aktivitástól. Összefoglalva az MGDF-1-3 molekulák a következők szerint foglalhatók össze:
MGDF-1 aminosavak 22-353 11. ábra
MGDF-2 aminosavak 22-195 11. ábra
MGDF-3 aminosavak 22-289 12. ábra
Az itt bemutatott vizsgálatban az MGDF-1 és az MGDF-2 aktív, míg az MGDF-3 nem az.
Az itt bemutatott aktivitási adatokra alapozva, az a feltevés, hogy a humán MGDF in vivő alapjában véve egy inaktív vagy egy kevésbé aktív prekurzor polipeptidként expresszálódik, mely variábilis C-terminális aminosavakat tartalmaz. A C-terminális aminosavak (valamint a jelpeptid) hasításakor a feldolgozott molekula fonnák megtartják aktivitásukat vagy még aktívabbak lesznek. A fenti hipotézis fényében úgy véljük, hogy az MGDF-1 feldolgozást tesz szükségessé (proteázzal való hasítás) aktivitásának kimutatásához. Az a tény, hogy az MGDF-1 csonkított formája (azaz az MGDF-2) aktív, ezt a hipotézist támasztja alá.
Az MGDF-1 génnel transzfektált humán vese 293 sejtek kondicionált tápközege a 4. példa sejtvizsgálatában aktivitást demonstrál. Másrészt viszont más sejtvonalakban, például a 32 D sejtekben ezen molekula esetében nincs aktivitás. Azt feltételezzük, hogy ez azt jelentheti, hogy a 293 sejtek képesek az MGDF-1 molekula feldolgozására, feltehetően csonkítással történő feldolgozására, így az aktivitásért elsősorban felelős molekula a csonkított forma, míg a 32 D sejtek nem képesek a molekula feldolgozására.
A fenti hipotézis fényében számos aktív molekula nyerhető az MGDF-1 molekulaként bemutatott szekvencia csonkításából (11. ábra). A citokincsaládban konzerválódott strukturális tulajdonságok - mint az eritropoietin (EPO) - közé négy alfa-helikális kötés és négy cisztein tartozik. Az MGDF-1 szekvenciát tekintve a Cys 172 a leginkább C-terminális eleme ezen evolúció révén konzervált és funkcionális szempontból alapvető struktúráknak. Ezért az MGDF-1 előnyben részesített csonkított variánsai a 173-353 (a jelpeptid hasításával együtt) aminosavak közül való C-terminális csonkításokkal rendelkezők közül lehetnek bármelyikek. Előnyösen az MGDF-1 szekvenciája eltávozik az 50-185 aminosavakból a C-terminusból, és különösen előnyösen a 90-172 aminosavakból a C-terminusból. A találmányban leírtak szerint a jelpeptidről úgy véljük, hogy 21 aminosav hosszúságú, azonban a jelpeptid lehet 23 aminosav hosszúságú az MGDF-1 szekvenciájára alapozva. Ennek megfelelően, a jelen találmányban bemutatottaknak megfelelő polipeptideket, de amelyek all. vagy a 12. ábra 24. pozíciójánál kezdődnek, szintén figyelembe vesszük.
A következőkben bemutatottak a különösen előnyben részesített aktivitást mutató (azaz olyan képességgel rendelkeznek, hogy elősegítik a megakariociták és/vagy trombociták szaporodását; vagy a természetesen előforduló receptorokkal szemben gátló/stimuláló aktivitást mutatnak) MGDF-1-variánsok közül valók:
MGDF-4 aminosavak 22-172 11. ábra
MGDF-5 aminosavak 22-177 11. ábra
MGDF-6 aminosavak 22-191 11. ábra
MGDF-7 aminosavak 22-198 11. ábra
MGDF-8 aminosavak 22-265 11. ábra
MGDF-11 aminosavak 22-184 11. ábra
Néhány kiónban a 133-136 aminosavak az
MGDF-1 szekvenciában hiányoznak, így a fentiekben bemutatott szekvenciáknak megfelelő szekvenciák azonban, melyekből ezek az aminosavak hiányoznak (és a C-terminális aminosavak számát 4-re állítjuk), szintén aktívak lehetnek.
Egy kiónban, mely a 192-es pozícióban egy terminációs kodonnal rendelkezett, egy Alá maradék található egy Thr maradék helyett, ahogy azt a 11. ábra 191 -es pozíciójában bemutatjuk. Ezért a jelen találmány olyan
HU 218 893 Β
MGDF-molekula variánsokat is magában foglal, melyeknél a 191. pozícióban a Thr helyett Alá van.
Az MGDF-3 egy, az IVS-5-ként (intervening Sequence-5) hivatkozott szekvencia eltávolításával hozható létre, mivel ezt a szekvenciát a szekvencián belüli 5. exonon belül hasítjuk. Mivel az IVS-5 5’-vége egy kodonon belül található, ennek eltávolítása egy keretelmozdulást eredményez az MGDF fennmaradó szekvenciájában, mely úgy látszik, hogy az MGDF-3 160. pozíciójától kezdődik a molekula végéig.
Az MGDF-3 molekula esetében eddig nem találtunk aktivitást a 293 sejtekbe való transzfektálás révén és a kondicionált tápközeg 4. példában leírt sejtalapú vizsgálata során végzett aktivitási teszttel. Nyilvánvalóan az MGDF-1 molekulától eltérően a 293 sejtek nem képesek arra, hogy az MGDF-3 molekulát aktív formájúra változtassák. Mindazonáltal az MGDF-1 molekulával kapcsolatban a fentiekben leírt csonkítási hipotézisre alapozva az MGDF-3 molekulából származó C-terminális aminosavak csonkítása szintén aktivitást eredményezhet. Például az MGDF-3 C-terminális 40-102 aminosavakig tartó csonkítása szintén aktivitáshoz vezethet. Előnyösen az 50-90 aminosavakat távolítjuk el. Az MGDF-2 különösen előnyben részesített két variánsa
MGDF-9 22-179 12. ábra
MGDF-10 22-190 12. ábra
A jelen találmányban leírt összes Mpl-ligandumban - ideértve a fent leírt példának szolgáló MGDF-molekulákat - egy metionilmaradék lehet jelen az N-terminusnál, különösen ha ilyen polipeptidek kerülnek expresszálásra a bakteriális gazdasejtben.
Az Mpl-ligandum polipeptidek ismert hagyományos kémiai szintézissel is előállíthatók. A jelen találmány polipeptidjeinek előállítására szolgáló szintetikus eszközökkel megvalósítható módszerek a tudomány e területén képzett szakemberek számára jól ismertek. A szintetikusan megszerkesztett Mpl-ligandum polipeptid szekvenciák, miután az Mpl-ligandum polipeptidekkel azonos primer, szekunder vagy tercier szerkezeti és konformációs tulajdonságokkal rendelkeznek, azokkal közös biológiai tulajdonságokkal is rendelkezhetnek, így ezek felhasználhatók biológiailag aktív vagy immunológiai szubsztituensekként a természetes tisztított Mpl-ligandum polipeptidek helyett terápiás és immunológiai eljárásokban.
Az Mpl-ligandumot kódoló peptidek vagy DNSszekvenciákban való módosítások a tudomány e területén képzett szakember által jól ismert technikákkal megvalósíthatók. A kérdéses Mpl-ligandum módosításai közé tartozhatnak a helyettesítés, egy szelektált aminosavmaradék kódolószekvenciában való inzertációja vagy deléciója. Az ilyen helyettesítésekhez az inszekciókhoz vagy delécióhoz való mutagenezises technikák a tudomány e területén képzett szakember számára jól ismertek. (Lásd például 4,518,584 számú US szabadalom.) Előnyben részesülnek az 1-20 aminosavakban bekövetkező konzervatív változások. Az előnyben részesített peptideket proteolitikus enzimekkel, vagy közvetlen kémiai szintézissel lehet előállítani. Az ilyen variánsok a jelen találmány Mpl-ligandum polipeptidjeinek és polinukleotidjainak jelentésén belül esnek.
Az Mpl-ligandum polipeptidszekvenciájának specifikus mutációi magukban foglalhatják a glikozilációs hely (például a szerin, a treonin vagy az aszparagin) módosításait. A glikoziláció hiánya vagy a részleges glikoziláció az aminosavhelyettesítésből vagy -delécióból származik bármelyik aszparaginkötött glikozilációs felismerési helynél, vagy a molekula bármely olyan helyénél, mely az O-kötésű szénhidrát hozzáadásával módosul. Egy aszparaginkötött glikozilációs felismerőhely egy olyan tripeptidszekvenciát tartalmaz, melyet specifikusan ismernek fel megfelelő celluláris glikozilációs enzimek. Ezek a tripeptidszekvenciák az Asn-Xaa-Thr vagy az Asn-Xaa-SSer, ahol Xaa a Pro-tól eltérő bármely aminosav lehet. Egy glikozilációs felismerési hely első vagy harmadik aminosavpozíciójának egyikében vagy mindkettőben előforduló számos aminosavszubsztitúció vagy -deléció (és/vagy a második pozícióban levő aminosavdeléció) nem glikozilációt eredményez a módosított tripeptidszekvenciában. Az ilyen megváltozott nukleotidszekvenciák expresszálása olyan variánsokat eredményez, melyek ezen a helyen nem glikolizáltak.
AZ MGDF TOVÁBBI ANALÓGJAI/SZÁRMAZÉKAI
Az MGDF (Mpl-ligandum) szekvenciáinak más analógjai és származékai, melyek az MGDF (Mpl-ligandum)-aktivitást egészében vagy részben megőrzik, a tudomány e területén képzett szakember által a találmányban leírt módon előállíthatók. Az ilyen módosítások szintén részét képezik a találmánynak.
Még részletesebben, a jelen találmány magában foglalja a kémiailag módosított MGDF-készítményeket és az ezek előállítására szolgáló módszereket. A jelen találmány felfedi, hogy lehetőség van az MGDF-molekula módosítására és tulajdonságainak javítására.
Egy megvalósulásban a jelen találmány egy olyan MGDF-termékre vonatkozik, mely egy legalább egy vízoldható polimer egységhez kötött MGDF-proteint tartalmaz.
Egy másik megvalósulásban, a jelen találmány egy olyan MGDF-termékre vonatkozik, melyben az említett MGDF-protein legalább egy polietilénglikol-molekulához kapcsolódik.
Egy megint más megvalósulásban a jelen találmány olyan MGDF-molekulákra vonatkozik, melyek legalább egy polietilénglikol-molekulához kapcsolódnak acil- vagy alkilkötéseken keresztül.
Az MGDF-molekula pegilálása a tudomány e területén ismert bármely pegilálási reakcióval megvalósítható. Lásd például Focus on Growth Factors 3 (2) :4-10 (1992); 0 154 316 számú EP; 0 401 384 számú EP szabadalmak és más, a pegilálással kapcsolatos, a találmányban idézett publikációk. Előnyösen a pegilálást egy acilálási reakción keresztül vagy egy alkilálási reakción keresztül valósítjuk meg egy reaktív polietilénglikolmolekulával (vagy egy analóg reaktív vízoldható polimerrel). A polietilénglikol-molekulával való származtatás ezen előnyben részesített módjait az alábbiakban részletesen megvitatjuk.
HU 218 893 Β
ACILÁLÁS
Az acilálással való pegilálás általában a következőt foglalja magában a polietilénglikol (PEG) egy aktív észterszármazékát egy MGDF-proteinnel reagáltatjuk. Bármely ismert vagy a későbbiekben felfedezett reaktív PEG-molekula felhasználható az MGDF pegilálásának végrehajtásához. Egy előnyben részesített aktivált PEG-észter az N-hidroxi-szukcinimidhez („NHS”) észteresített PEG. A találmány szerinti használatban az „acilálás” az MGDF és egy vízoldható polimer - mint például a PEG - közötti kötések alábbiakban felsorolt típusaira való korlátozás nélkül az alábbiakat foglalja magában: amidcsoport, karbamátcsoport, uretáncsoport és a hasonló csoportok. Lásd Bioconjugate Chem. 5:133-140 (1994). A reakció körülményeit a pegilálási irodalomban ismertek közül választhatjuk ki, vagy a későbbiekben kifejlesztett körülmények közül, azonban el kell kerülni az olyan körülményeket, mint a módosítandó MGDF típust inaktiváló hőmérsékletet, oldószert és pH-értéket. Az MGDF-molekulák pegilálásához általában alkalmazott reakciókörülményeket az alábbiakban adjuk meg. A monometoxi-PEG egy NHS-észterével való reakcióra való példát a 14. ábrában adunk meg.
Az acilálással való pegilálás általában egy polipegilált MGDF-terméket eredményez, melyben a lizin epszilon-aminocsoportok egy acilkötő csoporton keresztül pegilálódnak. Előnyösen a kapcsolatot létesítő kötés amidkötés. Előnyös az is, ha a kapott termék alapjában véve csak (például 95% vagy annál nagyobb) mono, di- vagy tripegilált. Azonban néhány magasabb pegilálási fokú típus (a lizin epszilon-aminocsoportok maximális számáig és még egy alfa-aminocsoport az MGDF aminoterminusánál) jön létre összességében az alkalmazott specifikus reakciókörülményektől függően. Ha kívánatos, sokkal tisztítottabb pegilált típusok szeparálhatók a keverékből, különösen reagálatlan típusok, standard tisztítási technikákkal, többek között ideértve a dialízist, a kisózást, az ultraszűrést, az ioncserés kromatográfiát, a gélszűréses kromatográfiát és az elektroforézist.
ALKILEZÉS
Az alkilezéssel való pegilálás általában a PEG egy terminális aldehidszármazékának egy proteinnel, mint például az MGDF-molekulával való reagáltatását foglalja magában egy redukálóanyag jelenlétében. Ahogy az acilezéssel kapcsolatban fent már említettük, a reakciókörülményeket az alábbiakban írjuk le.
Az alkilezéssel való pegilálás szintén eredményezhet polipegilált MGDF-molekulát. Az MGDF-molekulával való reduktív alkilezési reakcióra való példát - melynek során polipegilált termék jön létre - a 15. ábrán mutatunk be. Továbbá a reakciókörülmények manipulálhatók a leírtak szerint, hogy a pegilálást alapjában véve csak az MGDF-molekulatípus (azaz egy monopegilált típus) N-terminusán levő alfa-aminocsoportnál segítsük elő. Az MGDF-molekulával való reduktív alkilezési reakcióra való példát - melynek során monopegilált termék jön létre - a 16. ábrán mutatunk be. A monopegilálási vagy polipegilálási esetek bármelyikében a PEG-csoportokat előnyösen -CH2-NH-csoporton keresztül kapcsoljuk a proteinhez. A CH2-csoportra való különös tekintettel erre a kötési típusra egy „alkil”kötésként hivatkozunk.
A reduktív alkilezésen keresztüli származtatás - mely egy monopegilált termék létrehozására irányul az MGDF-származtatáshoz felhasználható különböző típusú primer aminocsoportok (lizin versus az N-terminál) különböző reaktivitását használja fel. A reakciót olyan pH-értéken végezzük el (lásd később), mely lehetővé teszi a lizinmaradékok epszilon-aminocsoportjai és a protein N-terminális maradéka alfa-aminocsoportja közötti pKa-különbségekből adódó előnyök felhasználását. Az ilyen szelektív származtatás révén egy reaktív csoportot, mint egy aldehidet tartalmazó vízoldható polimer egy proteinhez való csatolása ellenőrzött: a polimerrel való konjugáció túlnyomóan a protein N-terminusán megy végbe, és nem következik be jelentős módosulás más reaktív csoportoknál, mint például a lizinoldallánc aminocsoportoknál. Egy fontos megvalósulásban a jelen találmány a monopolimer/MGDF-protein konjugátum molekula egy alapjában véve homogén készítményét biztosítja [olyan MGDF-proteint jelent, melyhez egy polimer molekulát kapcsoltunk alapjában véve csak (azaz 95% vagy annál nagyobb] egy egyedüli helyen]. Még specifikusabban, ha polietilénglikol kerül felhasználásra, a jelen találmány biztosít olyan pegilált MGDF-proteint, melyből hiányoznak a feltehetően antigénkötő csoportok, és mely a polietilénglikol-molekulát közvetlenül az MGDF-proteinhez kapcsolva tartalmazza.
így egy előnyben részesített megvalósulásban a jelen találmány olyan pegilált MGDF-molekulákra vonatkozik, ahol a PEG-csoportok acil- vagy alkilcsoportokon keresztül kapcsolódnak. Ahogy fent már említettük, az ilyen termékek lehetnek monopegiláltak vagy polipegiláltak (például 2-6, előnyösen 2-5 PEG-csoportot tartalmazhatnak). A PEG-csoportok általában a proteinhez a protein alfa- vagy az epszilon-csoportjainál kapcsolódnak, azonban azt is figyelembe vesszük, hogy a PEG-csoport csatolható bármely a proteinhez kapcsolódó aminocsoporthoz, mely megfelelőképpen reaktív ahhoz, hogy megfelelő körülmények között egy PEG-csoporthoz kapcsolódjon.
Az acilezésnél és az alkilezésnél használt polimer molekulák a vízoldható polimerek vagy ezek keverékéből szelektálhatok. A szelektált polimer vízoldható kell legyen, hogy a protein, melyhez ezt hozzákapcsoljuk, ne csapódjon ki vizes közegben, mint például fiziológiás körülmények között. A szelektált polimer úgy módosítandó, hogy egy egyedüli reaktív csoporttal rendelkezzen - mint például egy aktív észterrel az acilezéshez, vagy egy aldehiddel az alkilezéshez - előnyösen úgy, hogy a polimerizáció foka a jelen találmányban bemutatott módszerekkel szabályozható legyen. Egy előnyben részesített reaktív PEG-aldehid a polietilénglikol propion-aldehid, mely vízoldható, vagy ennek mono 1-10 szénatomszámú alkoxi- vagy aril-oxi-származékai (lásd 5,252,714 US szabadalmat). A polimer lehet elágazó vagy el nem ágazó. Előnyösen a végtermékkészítmény terápiás alkalmazásához a polimer
HU 218 893 Β gyógyszerészetileg elfogadható kell legyen. A vízoldható polimer szelektálható például a polietilénglikolt, a monometoxi-polietilénglikolt, dextránt, poli(N-vinil-pirrolidon) polietilénglikolt, propilénglikol homopolimereket, egy polipropilén-oxid/etilén-oxid kopoli- 5 mert, poli-oxi-etilált poliolokat (például glicerolt) és poli(vinil-alkohol)-t magában foglaló csoportból. Az acilálási reakcióhoz a szelektált polimer(ek) egy egyedüli reaktív észtercsoportot kell tartalmazzanak. A jelen reduktív alkilezéshez a szelektált polimer(ek) egy 10 egyedüli reaktív aldehidcsoportot kell tartalmazzanak. Általában a vízoldható polimert nem a természetesen előforduló glikozilmaradékok közül szelektáljuk, mivel ezek általában sokkal kényelmesebben előállíthatok emlős rekombináns expressziós rendszerekkel. A polimer 15 bármilyen molekulasúllyal rendelkezhet, és lehet elágazó vagy el nem ágazó.
Egy különösen előnyben részesített, a találmányban felhasználásra kerülő vízoldható polimer a polietilénglikol, melyet PEG-ként rövidítünk. A találmány szerin- 20 ti használatban a polietilénglikol a PEG bármely formáját magában foglalja, melyet más proteinek származtatására felhasználtunk, mint például a mono-(l-10 szénatomszámú) alkoxi- vagy aril-oxi-polietilénglikol.
A találmány szerinti alkalmazásban az MGDF-et 25 úgy határozzuk meg, hogy a találmányban leírt MGDF különböző formáinak bármelyikét magában foglalja. Például a teljes hosszúságú vagy a csonkított, a glikolizált vagy a nem glikolizált MGDF formák mind idetartoznak. A következőkben a származtatáshoz használha- 30 tó előnyben részesített MGDF-molekulákat adjuk meg (a számozás minden esetben all. ábrával összhangban levő aminosavszámozásra utal):
MGDF-1 aminosavak 22-353 11. ábra
MGDF-2 aminosavak 22-195 11. ábra 35
MGDF-4 aminosavak 22-172 11. ábra
MGDF-11 aminosavak 22-184 11. ábra
MGDF-12 aminosavak 27-353 11. ábra
MGDF-13 aminosavak 27-195 11. ábra
MGDF-14 aminosavak 27-172 11. ábra 40
MGDF-15 aminosavak 27-184 11. ábra
A fenti előnyben részesített formák lehetnek glikolizáltak, nem glikolizáltak vagy deglikolizáltak, előnyösen nem glikolizált formában vannak. Előállíthatok rekombináns módszerekkel bakteriális (például E. coli) 45 vagy emlős- (például CHO-) sejtekben.
A következők az ezen találmány kémiailag származtatott molekuláinak előnyben részesített alcsoportjai (minden esetben ezek olyan mono-, poli-, például 2-4 PEG-egységek, melyek acil- vagy alkilcsoporton ke- 50 resztül kapcsolódnak):
pegilált MGDF -11 pegilált MGDF-4 pegilált MGDF-2
Általában a kémiai származtatás elvégezhető bár- 55 mely olyan megfelelő körülmények között, melyeket egy biológiailag aktív anyag egy aktivált polimer molekulával való reagálása esetén használunk. A pegilált MGDF előállítására szolgáló módszerek általában a következő lépésekből állnak: (a) egy MGDF-polipeptidet 60 egy polietilénglikollal (mint például a PEG reaktív észter- vagy aldehidszármazékával) olyan körülmények között reagáltatjuk, aminek következtében az MGDF egy vagy több PEG-csoporttal kapcsolódik, és (b) a reakcióterméket kinyerjük. Általában az optimális reakciókörülmények acilálási reakciók esetén az ismert paraméterekre és a kívánt eredményre alapozva egy-egy alkalommal meghatározásra kerül. Például minél nagyobb a PEG:protein aránya, annál nagyobb a polipegilált termék százaléka.
A monopolimer/MGDF-protein konjugátum molekula alapjában véve homológ populációjának reduktív alkilezéssel való előállítása a következő lépésekből áll : (a) egy MGDF-proteint egy reaktív PEG-molekulával reagáltatjuk reduktív alkilezési körülmények között, olyan pH-értéken, mely megfelel az említett MGDFprotein aminoterminusánál található alfa-aminocsoport szelektív módosításának lehetővétételéhez; és (b) a reakciótermék(ek)et kinyerjük.
Monopolimer/MGDF-protein konjugátum molekulák alapjában véve homogén populációjához a reduktív alkilezési körülmények olyanok, melyek lehetővé teszik a vízoldható polimer egység MGDF N-terminusához való hozzácsatlakoztatását. Általában az ilyen reakciókörülmények pKa-különbségeket okoznak az N-terminusnál található lizin-amino-csoport és az alfa-aminocsoport között (a pIQ azt a pH-értéket jelenti, ahol az aminocsoportok 50%-a protonálódik, 50%-a nem). A pH-érték hatással van az alkalmazandó polimer:protein arányra is. Általában ha a pH-érték alacsonyabb, nagyobb polimer:protein felesleg kívánatos (azaz minél kevésbé reaktív az N-terminális alfa-aminocsoport, annál több polimerrre van szükség az optimális körülmények eléréséhez). Ha a pH-érték magasabb, nem szükséges, hogy a polimer:protein arány olyan nagy legyen (azaz ha reaktívabb csoportok állnak rendelkezésre, így kevesebb polimer molekulára van szükség). A jelen találmány céljaihoz a pH-érték általában 3-9 közé, előnyösen 3-6 közé kell essen.
Másik fontos szempont a polimer molekulasúlya. Általában minél nagyobb a polimer molekulasúlya, annál kisebb számú, a proteinhez kapcsolható polimer molekulára van szükség. Hasonlóképpen az ezen paraméterek optimalizálásánál figyelembe kell venni a polimer elágazását is. Általában minél nagyobb a molekulasúly (vagy minél több az elágazás), annál nagyobb a polimer: protein arány. Általában az itt figyelembe vett pegilálási reakciónál az előnyben részesített átlagos molekulasúly körülbelül 2 kDa-100 kDa (a „körülbelül” fogalma ±1 kDa értéket jelent). Az előnyben részesített átlagos molekulasúly körülbelül 5 kDa-körülbelül 50 kDa, különösen előnyös, ha körülbelül 12 kDa-körülbelül 25 kDa. A vízoldható polimer:MGDF-protein aránya általában 1:1-100:1, előnyösen (polipegilálás esetén) 1:1-20:1 és (monopegilálás esetén) 1:1-5:1.
A fent jelölt feltételeket alkalmazva, a reduktív alkilezés lehetővé teszi a polimer bármely, az N-terminusán egy alfa-aminocsoporttal rendelkező MGDF-molekulához való szelektív csatolását, és a monopolimer/MGDF-protein konjugátum alapjában véve homo15
HU 218 893 Β gén készítményét biztosítja. A „monopolimer/MGDFprotein konjugátum” kifejezés a találmány során egy MGDF-protein molekulához csatolt egyedüli polimer molekulát tartalmazó készítményt jelöl. A monopolimer/MGDF-protein konjugátum előnyösen az N-terminusnál elhelyezkedő polimermolekulát tartalmaz, de nem a lizin-amino oldalcsoportokon. A készítmény előnyösen 90%-nál több monopolimer/MGDF-protein konjugátumot tartalmaz, és még előnyösebben 95%-nál több monopolimer/MGDF-protein konjugátumot, a megfigyelhető molekulák maradéka nem reagál (azaz a proteinből hiányzik a polimer egység). Az alábbiakban bemutatott példák egy olyan készítményt biztosítanak, mely legalább 90% monopolimer/MGDF-protein konjugátumot tartalmaz és körülbelül 10% nem reagált proteint. A monopolimer/protein konjugátum biológiai aktivitással rendelkezik.
A jelen reduktív alkilezéshez a redukálóanyag stabil kell legyen vizes oldatban, és előnyösen csak a reduktív alkilezés kezdeti folyamatában képződött Schiff-bázist képes redukálni. Az előnyben részesített redukálóanyagokat a nátrium-bór-hidridet, nátrium-ciano-bór-hidridet, dimetil-amin-boránt, trimetil-amin-boránt és a piridin-boránt magában foglaló csoportból szelektáljuk. Egy különösen előnyben részesített redukálóágens a nátrium-ciano-bór-hidrid.
A többi reakcióparaméter, mint például az oldószer, a reakcióidő, a hőmérséklet stb. és a termék tisztításának eszközei a proteinek vízoldható polimerekkel való származtatásával kapcsolatos közzétett adatokra alapozva esetenként kerül meghatározására (lásd az itt hivatkozott publikációkat). A példaként szolgáló részleteket a Példák című részben mutatjuk be.
Választhatjuk egy polimer/protein konjugátum molekula keverékének acilálással és/vagy alkilezési módszerekkel való előállítását is, és az így biztosítható előny az, hogy a keverékben levő monopolimer/protein konjugátum arányát lehet kiválasztani. így ha szükséges, előállítható különböző protein és különböző számú polimer molekulák keveréke, melyek egymáshoz vannak kapcsolva (azaz di-, tri-, tetra- stb.), és a jelen találmányban megadott módszerekkel előállított monopolimer/protein konjugátum anyaggal kombinálható, így a monopolimerprotein konjugátum egy előre meghatározott keverékével rendelkezhetünk.
Az alábbiakban bemutatott előállítási példák a kémiailag módosított MGDF előállítását és az acilezéssel és alkilezéssel pegilált MGDF előállítását demonstrálják. így a jelen találmány más aspektusai ezekre az előállítási módokra vonatkoznak.
Általában azok az állapotok, melyek a jelen polimer/MGDF adagolásával csökkenthetők vagy módosíthatók, magukban foglalják az MGDF-molekulák esetében fent leírtakat is. Azonban a jelen találmányban leírt polimer/GDF molekulák rendelkezhetnek további aktivitással, fokozott vagy csökkent aktivitással, vagy más tulajdonságokkal a nem származtatott molekulákhoz viszonyítva.
A jelen találmány egy megint más megvalósulásában a fenti kémiailag módosított MGDF-molekulák gyógyszerészeti készítményét biztosítja. Az ilyen gyógyszerészeti készítmények tartalmazhatják a nem származtatott MGDF-molekulák itt specifikált bármelyik alkotórészét.
Mivel további vizsgálatok folynak, további információ fog rendelkezésre állni a a különböző betegek esetében fennálló különböző állapotok kezelésére megfelelő dózisszintekre vonatkozóan, és az átlagosan képzett szakember - a terápiás környezetet, kort és a fogadó általános egészségi állapotát figyelembe véve - képes lesz a megfelelő dózis megállapítására. Általában a dózis 0,01 pg/kg testsúly (magának a proteinnek a mennyiségét számítva a kémiai módosítás nélkül) - 300 pg/kg (ugyanilyen módon számítva). Az előnyben részesített dózis általában 5 pg/kg testsúly-100 pg/kg testsúly, különösen előnyösen 10 pg/kg testsúly-75 pg/kg testsúly.
A jelen találmány MGDF (azaz Mpl-ligandum) polipeptid vagy ezek aktív fragmentje előállítására szolgáló módszereket is biztosít. A jelen találmány egyik módszere magában foglalja egy Mpl-ligandum polipeptidet kódoló cDNS egy expressziós vektorba való bejuttatását, egy, az Mpl-ligandumhoz való expressziós rendszer előállítása céljából. A szelektált gazdasejtet a vektorral transzferáljuk és tenyésztjük. így a jelen találmány módszere magában foglalja egy Mpl-ligandum polipeptid ismert szabályozószekvenciák szabályozása alatt álló expresszálását kódoló DNS-szekvenciával transzfektált megfelelő sejt vagy sejtvonal tenyésztését. A szabályozószekvenciák közé tartoznak a promoter ffagmentek, a terminátor fragmentek és más olyan megfelelő, melyek egy megfelelő gazdasejtben a protein expresszióját irányítják/szabályozzák. Ezután az expresszált faktort a tenyésztápközegből (vagy a sejtből, ha intracellulárisan expresszálódik) a tudomány e területén képzett szakember számára ismert megfelelő eszközökkel kinyerjük, izoláljuk és tisztítjuk. Továbbá az 5,272,071 számú US szabadalomban leírt módszerek szintén alkalmazhatók a feltalált polinukleotidok/polipeptidek esetében.
A megfelelő sejtek vagy sejtvonalak lehetnek emlőssejtek, mint például kínaiaranyhörcsög-ováriumsejtek (CHO) vagy a 3T3 sejtek. A megfelelő emlősgazdasejtek szelektálása, valamint a transzformációs, tenyésztési, amplifikációs, szkrínelési és terméktermeltetési és -tisztítási módszerek ismertek a tudomány e területén. Lásd például Gething and Sambrook, Natúré 293:620-625 (1981), vagy másik lehetőségként Kaufman et al., Mól. Cell. Bioi., 5 (7):1750-1759 (1985) vagy a 4,419,446 számú US szabadalmat. Más megfelelő emlőssejtvonalak a majom COS-1 és COS-7 sejtvonal, valamint a CV-1 sejtvonal. A további példaként szolgáló emlősgazdasejtek közé tartoznak a főemlőssejtvonalak és a rágcsálósejtvonalak, ideértve a transzformált sejtvonalakat. A normális diploid sejtek a primer szövetek in vitro tenyészeteiből származó sejttörzsek, valamint a primer explantátumok szintén megfelelőek. A szóba jöhető sejtek esetleg genotípusosan nem tartalmazzák a szelekciós gént, vagy tartalmazhatnak egy dominánsan ható szelekciós gént. A további
HU 218 893 Β megfelelő emlőssejtvonalak közé tartoznak az ezekre való korlátozás nélkül a HeLa, az egér L-929 sejtek, a svájci Balb-c vagy NIH egerekből származó 3T3 sejtvonal, a BHK vagy HaK hörcsögsejtvonalak.
A bakteriális sejtek a jelen találmány számára megfelelő hasonlóképpen felhasználható gazdasejtek. Például az E. coli különböző törzsei (például a GB101, a DH5alfa, DH10, valamint az MC1061) jól ismert gazdasejtek a biotechnológia területén. A jelen találmány módszerében szintén felhasználhatók a B. subtilis, a Pseudomonas spp., más Bacillus spp., Streptomyces spp. törzsei és a hasonló törzsek.
A tudomány e területén képzett szakemberek számára számos élesztőgombatörzs szintén megfelelő gazdasejt lehet a jelen találmány polipeptidjei expresszálásához. Továbbá ahol szükséges, rovarsejtek is alkalmazhatók gazdasejtekként a jelen találmány módszereiben. Lásd, például Miller et al., Genetic Engineering 8:277-298 (1986) és a találmányban idézett hivatkozásokat.
A jelen találmány biztosít az új Mpl-ligandum polipeptidek expresszálására szolgáló módszerben felhasználható rekombináns molekulákat vagy vektorokat. Ezek a vektorok tartalmazzák az Mpl-ligandum DNS-szekvenciákat, melyek magukban vagy más szekvenciákkal kombinálva a jelen találmány Mpl-ligandum polipeptidjeit vagy ezek aktív fragmentjeit kódolják. Másik lehetőségként a fent leírtak szerint módosított szekvenciákat tartalmazó vektorok szintén a jelen találmány megvalósulásai és hasznosak az Mpl-ligandum polipeptidek termelésében. A módszerben alkalmazott vektor szelektált regulációs szekvenciákat tartalmaz a találmány DNS-kódoló szekvenciáival működőképesen kapcsolódva, és képes ezeknek a szelektált gazdasejtekben való replikációjának és expressziójának irányítására.
Egy vektor a pXM plazmid, mely különösen kívánatos a COS-sejtekben való expresszióhoz [Y. C. Yang et al., Cell 47:3-10(1986)]. Másik, az emlőssejtekben, például a CHO-sejtekben való expresszióhoz kívánatos vektor a pEMC2Bl plazmid. A találmányban leírt emlőssejt expressziós vektorok a tudomány e területén képzett szakember számára jól ismert technikákkal szintetizálhatok. A vektorok alkotórészei, például a replikonok, a szelekciós gének, az enhancerek, a promoterek és a hasonlók természetes forrásokból nyerhetők, vagy ismert eljárásokkal szintetizálhatok. Lásd Kaufinan et al., J. Mól. Bioi. 159:511-521 (1982); és Kaufman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:689-693 (1985), Másik lehetőségként a vektor-DNS magában foglalhatja a szarvasmarha-papillomavírus genom egészét vagy egy részét [Lusky et al., Cell 36:391-401 (1984)] és stabil episzomális elemként replikálható olyan sejtvonalakban, mint például a C127-es egérsejt. Ezen vektorok megfelelő gazdasejtbe való transzfektálása az Mpl-ligandum polipeptidek expresszióját eredményezheti.
Más megfelelő a tudomány e területén az emlős, rovar, élesztőgomba, fonalas gomba és bakteriális expresszióhoz ismert nagyszámú expressziós vektor szintén felhasználható a találmány céljaira.
A jelen találmány módszereivel és készítményeivel kezelendő állapotok általában azok, melyek egy már fennálló megakariocita/trombocita hiányt vagy egy, a jövőben várt (például tervezett sebészeti beavatkozás miatt) megakariocita/trombocita hiányt foglalnak magukba. Ezek az állapotok általában az aktív Mpl-ligandum in vivő (átmeneti vagy tartós) hiányának következményei. A trombocitahiány gyűjtőneve a thrombocytopenia, így a jelen találmány módszerei és készítményei általában felhasználhatók a thrombocytopenia kezelésére.
A thrombocytopenia (trombocitahiányok) számos ok miatt következhetnek be, ideértve a különböző gyógyszerekkel végzett kemoterápiát és más terápiákat, a besugárzásos kezelést, a sebészeti beavatkozásokat, a baleseti vérveszteséget és más specifikus betegségi állapotokat. A példaként szolgáló és a thrombocytopeniát magában foglaló betegségi állapotok, melyek a találmánnyal összhangban kezelhetők, a következők: aplasztikus anaemia, az idiopatikus thrombocytopenia, az áttétes tumorok, melyek thrombocytopeniát okoznak, a szisztémás lupus erythematosus, a splenomegala. Fanconi-szindróma, B12-vitamin-hiány, folsavhiány, May-Hegglin-anomália, Wiskott-Aldrich-szindrómaés a paroxismalis noctumalis haemoglobinuria. Az AIDS bizonyos kezelése (például AZT) is thrombocytopeniát eredményez. Bizonyos sebgyógyulási rendellenesség is hasznát veheti a trombocitaszám növekedésének.
A megelőzött trombocitahiányokra való tekintettel például a jövőbeni sebészeti beavatkozásnak köszönhetően, a jelen találmány egy Mpl-liganduma adható néhány nap-néhány óra időtartammal a trombocitákra való igényt megelőzően. Az akut állapotokat figyelembe véve, például baleseti és erős vérveszteség esetén Mpl-ligandum adható a vér vagy tisztított trombociták adásával egy időben.
A jelen találmány Mpl-ligandumai hasznosak lehetnek a megakariocitáktól eltérő bizonyos sejtek stimulálásában, ha azt tapasztaljuk, hogy ezek a sejtek Mpl-receptort expresszálnak. Az Mpl-receptort expresszáló ilyen sejtekkel - melyek reagálnak az Mpl-ligandummal való stimulálásra - kapcsolatos állapotok szintén a jelen találmány körén belül vannak.
Az itt bemutatott aktivitási vizsgálatokban magukban nem aktív MGDF-molekulák az Mpl-receptorok in vitro vagy in vivő modulátoraiként hasznosak lehetnek (például gátlóanyagokként vagy stimulálóanyagokként).
A jelen találmány polipeptidjei magukban vagy más citokinekkel, oldható Mpl-receptorokkal, hematopoetikus faktorokkal, interleukinokkal, növekedési faktorokkal vagy antitestekkel együtt használhatók a fent azonosított állapotok kezelésében.
Ezért a találmány egy megint más megvalósulásaként szolgálnak a fent hivatkozott állapotok kezelésére szolgáló terápiás készítmények. Az ilyen készítmények egy Mpl-ligandum polipeptid egy terápiásán hatékony mennyiségét, vagy annak egy terápiásán hatékony fragmentjét, gyógyszerészetileg elfogadható hordozóval együtt. A hordozóanyag lehet víz az injekció17
HU 218 893 Β záshoz, előnyösen az emlősöknek adott oldatok esetében általános más anyagokkal kiegészítve. Tipikusan egy Mpl-ligandum terapeutikumot egy olyan készítmény formájában adagoljuk, mely a tisztított proteint egy vagy több fiziológiailag elfogadható hordozóval, hatásjavítóval vagy hígítóval együtt tartalmazza. A semleges puffereit sóoldat, vagy a szérumalbuminnal kevert sóoldat példa a megfelelő hordozókra. Előnyösen a terméket liofilizátumként formulázzuk megfelelő hatásjavítókat használva (például szacharózt). Szükség esetén más standard hordozók, hígítók és hatásjavítók is szerepelhetnek. Más példaként szolgáló készítmények a Tris-puffer (pH 8,0) és az acetátpuffer (pH 5,0), melyek minden esetben tartalmazhatnak még szorbitolt is.
A jelen készítmények szisztemikusan alkalmazhatók parenterálisan. Másik lehetőségként a készítmények alkalmazhatók intravénásán vagy szubkután módon. A szisztémás alkalmazás esetén a találmány szerinti használathoz a terápiás készítmény lehet pirogénmentes, parenterálisan elfogadható vizes oldat. Az ilyen gyógyszerészetileg elfogadható proteinoldatok előállítása - kellő figyelemmel a pH-értékre, az izotonicitásra, a stabilitásra és más hasonlókra - ismert a tudomány e területén.
A fent leírt kezelési módszerekben alkalmazott dóziselőírásokat az alkalmazó orvos határozza meg, számos, a gyógyszer hatását módosító tényező figyelembevétele után, például a kor, az állapot, a testsúly, a nem és a beteg étrendje, bármely fertőzés súlyossága, a kezelés ideje és más klinikai tényezők. Általában a napi előírás 0,1-1000 pg Mpl-ligandum protein vagy ennek fragmentje/testsúly kg.
A jelen találmány terápiás módszerei, készítményei és polipeptidjei felhasználhatók magukban vagy más citokinekkel, oldható Mpl-receptorokkal, hematopoietikus faktorokkal, interleukinekkel, növekedési faktorokkal vagy antitestekkel közösen, a trombocitahiánnyal és más szimptómával jellemzett betegségi állapotok kezelésére. Számítani lehet arra, hogy az Mpl-ligandum molekula hasznos lehet a thrombocytopenia bizonyos formáinak kezelésében a hematopoesis általános stimulátoraival, mint például az IL-3-mal vagy GM-CSF-fel való együttes alkalmazás esetén. Más megakariocitikus stimulálófaktorok, azaz meg-CSF, törzssejtfaktor (SCF), leukémiagátló faktor (LIF), oncostatin M (OSM) vagy más megakariocitastimuláló aktivitással rendelkező molekulák szintén alkalmazhatók az Mpl-ligandummal. Az ilyen együttes alkalmazás esetén a citokinek vagy hematopoetikus faktorok további példái közé tartoznak az IL-l-alfa, az IL-l-béta, az IL-2, az IL-3, az IL-4, az IL-5, az IL-6, az IL-11, a telepstimuláló 1-es faktor (CSF-1), a GM-CSF, a granulocitastimuláló faktor (G-CSF) az EPO, az interferon-alfa (IFN-alfa), az IFN-béta vagy az IFN-gamma. Továbbá hasznos lehet egy oldható emlős-Mpl-receptor - mely úgy tűnik, hogy a megakariociták trombocitákká való fragmentálódását okozza - azonos idejű vagy egymást követő alkalmazása, ha a megakariociták elérték érett formájukat. így az Mpl-ligandum adagolásától (az érett megakariociták számának fokozása céljából), melyet az oldható Mpl-receptor adagolása (a ligandum inaktiválása céljából, és lehetővé teszi az érett megakariociták számára, hogy trombocitákat termeljenek) követ, azt várjuk, hogy különösen hatékony eszköz a trombocitatermelés stimulálásában. A fent idézett dózis úgy igazítandó, hogy kompenzálja az ilyen további komponenseket a terápiás készítményben. A kezelt beteg javulása hagyományos módszerekkel követhető nyomon.
Az ezen új polipeptidek egyéb felhasználása a hagyományos módszerekkel előállított antitestek fejlesztésében szerepel. így a jelen találmány Mpl-ligandumaival reagáló antitestek, valamint az ilyen antitestek reaktív ffagmentjei szintén a találmány részét képezik. Az antitestek lehetnek poliklonálisak, monoklonálisak, rekombináns, kiméra, egyláncú és/vagy bispecifikus stb. antitestek. Az antitestffagmentek lehetnek bármely, a jelen találmány Mpl-ligandumával reaktív fragmentek, mint például a Fab, Fab· stb. A jelen találmány biztosít hibridómákat is, melyeket egy szelektált emlősnek adott Mpl-ligandum vagy annak egy fragmentje segítségével hozunk létre, melyet az állat sejtjeinek (például lépsejtek) bizonyos rákos sejtekkel való fúziója követ halhatatlanná tett sejtvonal létrehozása céljából, melyhez ismert technikák kerülnek felhasználásra. Az ilyen sejtvonalak és a jelen találmány humán Mpl-ligandum polipeptidjeinek összességével vagy egy részével szemben irányított antitestek létrehozására felhasznált módszerek szintén a találmány részét képezik.
Az antitestek felhasználhatók terápiásán, mint például az Mpl-ligandum és receptora kötődésének gátlására. Az antitestek továbbá felhasználhatók in vivő és in vitro diagnosztikai célokra, mint például jelölt formában, a testfolyadékban való Mpl-ligandum jelenlétének detektálására.
***
A következő példák a jelen találmány még teljesebb bemutatását szolgálják. Továbbá ezek a példák a találmány előnyben részesített megvalósulásait biztosítják, az ezekre való korlátozás szándéka nélkül, hacsak másként nem jelöltük. A későbbi példákban leírt eljárásokhoz való standard módszerek közül sok, vagy ezek megfelelő alternatív eljárásai széleskörűen ismert molekuláris biológiai kézikönyvekben került leírásra, mint például Sambrook et al., Molecular Cloning, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1987) és Ausubel et al. Eds. Current Protocols in Molecular Biology, Greene associates/Wiley Interscience, New York (1990).
1. példa
Aplasztikus nyúlplazma
A következő publikációkban heparinizált aplasztikus nyúlplazma („APK9”) vagy normális nyúlplazma („NK9”) előállítása kerül leírásra, azzal az eltéréssel, hogy a te 450 ras teljes test besugárzást a recipiens kapja:
1. Mazur, E. and South, K., Exp. Hematol. 13:1164-1172(1985)
HU 218 893 Β
2. Arriaga, M., South, K., Cohen, J. L., and Mazur, Ε. M., Blood 69:486-492 (1987).
3. Mazur, E., Basilico, D., Newton, J. L., Cohen, J. L., Charland, C., Sohl, P. A., and Narendran, A. Blood 76:1771-1782 (1990).
2. példa
Humánmegakariocita-vizsgálat
APK9 és frakcionált APK9 esetében vizsgáljuk ezek CD34+ őssejtekből való humán megakariocita fejlődésének stimulálási képességét. A CD34-szelektált sejteket perifériás vérsejtekből nyeqük a leírás szerint (Hokom, Μ. H., Choi, E., Nichol, J. L., Homkohl, A., Arakawa, T., and Hunt, P. Molecular Biology of Haematopoiesis 3:15-31, 1994) és ezeket a következő tenyésztápközegben inkubáljuk: 1% glutamin PenStreppel (Irvine Scientific, Santa Ana, CA) és 10 heparinizált trombocitaszegény humán AB plazmával kiegészített Iscove-féle módosított Dulbecco-féle tápközeg (IMDM; GIBCO, Grand Island, NY). Szerepel még benne 10 4 M 2-merkapto-etanol, 110 pg/ml piroszőlősav, 7,8 pg/ml koleszterin, egyenként 10 pg/ml adenosin, guanin, citidin, uridin, timidin, 2-dezoxicitozin, 2-dezoxiadenozin, 2-dezoxiguanozin (Sigma), 10 pg/ml humán rekombináns inzulin, 300 pg/ml humán transzferrin, 1% (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) szójabablipid, 2 ng/ml (Genzyme, Cambridge, MA) humán rekombináns bázikus fibroblasztnövekedési faktor; 15 pg/ml humán rekombináns epidermális növekedési faktor, 10 ng/ml (Amgen, Inc., Thousand Oaks, CA) trombocitaeredetű növekedési faktor. A CD34 szelektált sejteket 2x 105/ml mennyiségben a tenyésztápközegre szélesztjük, 15 pl végtérfogatban Terasaki-stílusú mikrotiterlemezek (Vanguard, Inc., Neptune, NJ) üregeiben. A sejteket 37 °C hőmérsékleten 8 napig inkubáljuk nedvesített dobozokban 5% CO2-os levegőben a tenyésztőüregekhez közvetlenül rögzítjük a sejteket 1% glutáraldehiddel és egy monoklonálisantitest-koktéllal (anti-GPIb, anti-GPIIb, (Biodesign) és anti-GPIb (Dako, Carpinteria, CA) inkubáljuk. Az immunreakciót egy sztreptavidin-béta-galaktozidáz detektálási rendszerrel (HistoMark, Kirkegaard and Perry) hívjuk elő. A kék színnel azonosított megakariocitákat egy inverz fázisú mikroszkóppal számoljuk meg 100 χ nagyításban. Az eredményeket az átlag (SEM) a megakariocita(átlagos szám)/üreg±standard hiba értékként prezentáljuk. Bizonyos esetekben, az eredményeket „megakariocitaegység/ml” értékként fejezzük ki, ahol ahhoz a mértékhez, melyhez egy adott minta megakariocitafejlődést indukál, az adott kísérlet esetében a pozitív APK9 kontrolihoz normalizáljuk. Egy egység definíciója: az az anyagmennyiség, amely ugyanolyan megakariocitaszámot eredményez, mint 1 pl APK.9 standard. Az aktivitást akkor fogadjuk el az Mpl-ligandum hatásaként, ha az 5-10 pg/ml MP1-Xszel (oldható Mpl-receptor) blokkolható.
Az APK9-ről kimutattuk, hogy olyan faktorokat tartalmaz, melyek ebben a rendszerben stimulálják a humán megakariociták fejlődését. A 10% NP9-cel 8 napig inkubált CD34-szelektált sejtek elhanyagolható számú kékre festődött megakariocitát mutatnak, míg a 10% APK9-cel 8 napig inkubált CD34-szelektált sejtek nagyon nagy számú kékre festődő megakariocitát mutatnak.
A 2. ábra azt mutatja, hogy a humán megakariocita tenyészrendszerhez adott növekvő koncentrációjú MplX növekvő mértékben blokkolja a megakariociták fejlődését. Az 5 pg/ml koncentrációnál nagyobb koncentrációjú Mpl-X esetében a gátlás teljes. Ebben a kísérletben a CD34-szelektált sejteket 5% APK9-cel stimuláljuk. Ez azt mutatja, hogy az Mpl-X-szel (feltételezhető Mpl ligandum) kölcsönhatásba lépő aktivitásra szükség van a humán megakariocita fejlődéshez, és magába foglalja azt is, hogy az Mpl-ligandum jelen van magában az APK9-ben is.
A továbbiakban az is kimutatásra került, hogy a humán megakariocita fejlődéshez szükséges Mpl-ligandum-aktivitás jelen van az APK9-ben. Az APK.9 135 ml mennyiségét 6-szorosára hígítjuk Iscove-féle tápközegbe és egy Mpl-X affinitási oszlopra helyezzük. A nem kötött anyagot (keresztülfolyik) összegyűjtjük és a vizsgálat előtt az eredeti térfogatra koncentráljuk. A kötött anyagot 10 ml 1 M-os NaCl-ban eluáljuk és az összegyűjtött anyag 20%-át diaszűrésnek vetjük alá és 4szeresére koncentráljuk a vizsgálathoz. A tápközegbe egyedül inkubált CD34-szelektált sejtek magukban nem fejlődnek megakariocitákká. Az 5% APK9-cel (ugyanaz az összegyűjtött anyag, amit az oszlopra helyeztünk) inkubált sejtek üregenként 48 ±8 megakariocitává fejlődnek. A nem kötött anyag 10%-ában inkubált sejtek nem fejlődnek megakariocitákká. Az elúciós összegyűjtött anyag 10%-ában inkubált sejtek 120+44 megakariocitává fejlődnek üregenként. Mind az oszloptöltet, mind az elúciós összegyűjtött anyag aktivitása alapjában véve teljes értékben gátlódik 5 pg/ml Mpl-X-szel a vizsgálat során.
3. példa
A patkány- vagy humán Mpl-receptor egy patkánysejtvonalba való transzfektálása
A) Patkány-Mpl-receptor
A teljes hosszúságú patkány-Mpl-receptor cDNS-t egy, a Moloney Murine Sarcoma Vírus LTR-jéből származó transzkripciós promotert tartalmazó expressziós vektorba szubklónozzuk. Az ezen szerkezet 5 pg mennyiségét, valamint a pWLNeo (Stratagen) szelektálható marker plazmid 1 pg mennyiségét koelektroporációval egy IL-3-fijggő patkánysejtvonalba (32D, 23-as klón; Greenberger et al., PNAS 80:2931-2936, 1983) juttatjuk be. A sejteket 5 napig tenyésztjük az eljárásból való kinyeréshez, majd 800 pg/ml Geneticint (G418, Sigma) és 1 ng/ml patkány-IL-3-at tartalmazó szelekciós tápközegben inkubáljuk. Ekkor a túlélő sejteket 2x 105 sejtet tartalmazó csoportokra osztjuk, és addig szaporítjuk, míg a populáció kinő, mely aztán tovább analizálható. Hat populációt vizsgálunk az Mplreceptor felületi expresszálására FACS-analízissel poliklonális nyúlantipeptid-szérumot használva. Egy populációt választunk a FACS-szortírozáshoz, az előbbiekben használt antipeptidszérumot alkalmazva. A szülői
HU 218 893 Β sejt egy sejtből álló telepét 10% APK9-ben és Geneticinben való szaporítással szelektáljuk. APK9-ben való 35 napig tartó szelekció után a sejteket 1 ng/ml patkány-IL-3-ban tartjuk fenn. Az egyik szubklónt, az lA6.1-et használjuk ehhez a munkához.
B) Humán Mpl-receptor
A teljes hosszúságú humán Mpl-receptor szekvenciát [Vígon, I., et al., PNAS 89:5640-5644 (1992)] egy, a Moloney Murine Sarcoma Vírus transzkripciós promotert tartalmazó expressziós vektorba (ugyanaz a vektor, mint a patkányreceptor esetében használt) szubklónozzuk. Ezen szerkezet 6 pg mennyiségét és amfotróf retrovirális csomagolószerkezet [Landau, N. R., Littman, D. R„ J. Virology 66:5110-5113 (1992)] 6 pg mennyiségét transzfektáljuk 3 χ 104 * 6 293 sejtekbe, CaPO4 transzfekciós kitet (Stratagene) használva. Ugyanezeket a sejteket 2 nap múlva újratranszfektáljuk, majd 4 nap múlva ismét. Az utolsó transzfekció utáni napon a 293 sejteket együtt szaporítjuk az IL-3-fiiggő patkánysejtvonallal a 32D-vel (23-as klón; Greenberger et al., PNAS 80:2931-2936 (1983)]. 24 óra után a 32D sejteket kiszabadítjuk, és egy BSAgradiensben (Path-o-cyte, Mlles Inc.) sávokra bontjuk. A sejteket 1 ng/ml patkány-IL-3-ban szaporítjuk, majd 20% APK9-ben való szaporodásra szelektáljuk. A sejteket a receptorsejt felszíni expressziójához tároljuk, és poliklonális nyúl-antipeptidszérumot használva FACSszal vizsgáljuk. Ezeket a sejteket a vizsgálatokban utólag felhasználjuk.
4. példa
Az 1A6.1 Mpl-ligandumra való vizsgálat
Az 1 A6,l sejteket a tenyészetben levő IL-3-mentesre mossuk, majd Terasaki stílusú mikrotiterlemezekben újraszélesztjük (1000 sejt/15 pl teljes térfogat/üreg) 10 magzati boqúszérummal (FCS), 800 pg/ml Geneticinnel és 1% pen/streppel (Gibco) kiegészített alfaMEM-ben (Gibco), a tesztminta 1:1 arányú hígításával. 48 óra után az életképes sejtek üregenkénti számát mikroszkóposán meghatározzuk. Egy aktivitási egységet a következők szerint határozunk meg: az az aktivitási mennyiség, mely üregenként 200 életképes sejtet eredményez. Az aktivitást úgy határozzuk meg, mint ami az Mpl-ligandumnak köszönhető, ha az teljes mértékben blokkolható 5-10 pg/ml Mpl-X hozzáadásával. Az APK9-ben az Mpl-ligandum aktivitás átlagosan
4400±539 egység/ml aplasztikus plazmaértéket ad. Hacsak másként nem jelöltük, az Mpl-ligandum-aktivitás egységét az 1A6.1 vizsgálatban határoztuk meg.
A humán Mpl-receptor génnel transzfektált sejtekkel való vizsgálatokat (3B. példa) alapjában véve az 1A6.1 sejtek esetében leírtakkal azonos módon végezzük.
5. példa
Annak bemutatása, hogy az Mpl-ligandum jelen van az egér, kutya, sertés és humán források aplasztikus plazmájában vagy szérumában
Az Mpl-ligandum jelen van a patkány, nyúl, sertés és humán források aplasztikus plazmájában vagy szérumában (2. táblázat). BDF1 egerekből besugárzás előtt és 12 nappal a besugárzás (500 rád) után plazmát gyűjtünk. A plazmát az 1A6.1 vizsgálatban teszteljük, ahol az 2000 egység/ml aktivitást mutat, amit alapjában véve teljes mértékben gátolni lehet 10 pg/ml mennyiségű MplX-szel. A besugárzott egérplazma szintén pozitív a humán megakariocita vizsgálatban, ahol 1833 egység/ml aktivitást mutat. Plazmát veszünk kutyákból besugárzás előtt és a besugárzás (450 rád) után 10 nappal. A plazmát az 1A6.1 vizsgálatban és a humán megakariocita vizsgálatban is teszteljük. Aktivitást észlelünk, és ez teljes mértékben gátolható 10 pg/ml Mpl-X-szel mindkét vizsgálatban. Sertésekből plazmát gyűjtünk besugárzás előtt és besugárzás (650 rád) után 10 nappal. A plazmát az 1A6.1 vizsgálatban és a humán megakariocita vizsgálatban is teszteljük. Mindkét vizsgálatban kapunk Mpl-ligandum-aktivitást (melyet 10 pg/ml Mpl-X gátolt), ami az aplasztikus nyúlplazmában kapott eredményekkel összehasonlítható. Aplasztikus emberekből is nyerünk szérumot. Ezt az anyagot csontvelő-átültetéses betegekből nyerjük. A 6 betegből származó szérumot 1A6.1 vizsgálatban teszteljük, ahol az 903 egység/ml aktivitást mutat, ennek 88%-a az Mpl-ligandumnak tulajdonítható (az aktivitás 10 pg/ml Mpl-X-szel gátolható). 14 aplasztikus betegből származó szérumot humánmegakariocita-vizsgálatban is tesztelünk. Csoportként ezek lényeges aktivitást mutatnak (941 meg egység/ml), ami teljes mértékben gátolható 10 pg/ml Mpl-X-szel. A patkány-IL-3 adatokat azért mutatjuk be, hogy demonstráljuk az 1A6.1 vizsgálat specifitását. Bár ez a rekombináns citokin indukálja a sejtvonal szaporodását, 10 pg/ml Mpl-X-szel nem blokkolható.
2. táblázat
Fajok 1A6.1 sejtvizsgálat (egység/ml) Humán Meg meg (egység/ml)
tápközeg +Mpl-X tápközeg +Mpl-X
Normál egér 0±0 0±0 0±0 0±0
Aplasztikus egér 2000 0 1833 n. d.
Normál nyúl 0±0 0±0 0±0 0±0
Aplasztikus nyúl 4400+539 0±0 792+128 0±0
Normál sertés 0±0 0±0 0±0 0±0
HU 218 893 Β
2. táblázat (folytatás)
Fajok 1A6.1 sejtvizsgálat (egység/ml) Humán Meg meg (egység/ml)
tápközeg +Mpl-X tápközeg +Mpl-X
Aplasztikus sertés 3866±1136 0±0 1284±182 10±10
Normál humán 0±0 0±0 0±0 0±0
Aplasztikus humán 903 ±64 114±33 941±178 0±0
MurlL3 6000±565 6000±565 n. d. n. d.
n. d.=nem végeztük el
6. példa
Az Mpl-ligandum stimulálja az 1A6.1 sejt szaporodását és a humánmegakariocita-fejlődést Az Mpl-ligandum (amit legalább 100 000-szeresére dúsítunk lektines és affinitáskromatográfiás eljárások után, lásd a 7. példát) dózisfuggő módon stimulálja az 1A6.1 sejtvonal szaporodását és a CD34-szelektált perifériás vérsejtekből származó humán megakariociták fejlődését. Az aktivitási válasz az Mpl-ligandumnak köszönhető, ahogy azt a 2. és 3. ábrák mutatják, mivel az aktivitások mind a két vizsgálatban blokkolhatok MplX-szel.
A feltalálók azt is bemutatják, hogy a FACS tisztított perifériás vér CD34+ sejtek, 100 egység/ml Mplligandummal való 9 napig tartó inkubálás után ebben az esetben fenotípusosan normális, érett megakariocitákká fejlődnek. Ez azt jelenti, hogy a tisztított Mplligandum a megakariocitákra ugyanolyan hatással van, mint a nyers APK9. Továbbá ebben a vizsgálatban tisztított CD34+ sejteket (100 CD34+) használunk fel, szemben a CD34-szelektált sejtekkel, melyek általában 30-50% CD34+ tartalmaznak.
7. példa
A nyúl-Mpl-ligandum tisztítása
I. Összefoglalás
Az Mpl-receptorhoz való ligandumhoz becsült aktivitást mutató 25 és 31 kDa méretű proteineket tisztítjuk. A proteineket besugárzott kutyák plazmájából tisztítjuk búzacsíra-agglutinin (WGA) affinitáskromatográfiát, Mpl-receptor affinitáskromatográfiát, anioncserés kromatográfiát, gélszűréses kromatográfiát és C4 reverz fázisú HPLC-t használó sémát alkalmazva. Ezen tisztítási sémához lásd a 4. ábrát. A 25 és 31 kDa méretű Mpl-ligandumokat nyilvánvaló homogenitásig tisztítjuk, és a meghatározás szerint a találmányban leírt aminosavszekvenciát tartalmazzák.
II. Módszerek
A) A plazma tisztítása
Besugárzott kutyákból (lásd az 1. példát) származó összesen 20 liter mennyiségű fagyasztott plazmát olvasztunk ki egy éjszaka alatt 4 °C hőmérsékleten, a nagy lombikok kiolvasztását néhány óráig szobahőmérsékleten kezdjük a hideg szobába való helyezés előtt. Az oldhatatlan anyagot 6 óráig tartó centrifugálással (11 000 xg) eltávolítjuk. A plazmát 0,01% nátrium-azidot tartalmazó 7,3 pH-értékű foszfátpufferelt sóoldattal (PBS/azid) hígítjuk és egy 1,2 pm-es szűrőn átszűrjük. A tisztítási eljárás tipikusan a kiindulási anyag megközelítően kétszeres hígítását eredményezi.
B) Búzacsíraagglutinin-affinitáskromatográfia
Az összes műveletet 4 °C hőmérsékleten végezzük. A tisztított plazmát (két batchben) PBS/azidban ekvilibrált immobilizált búzacsíraagglutinin-oszlopra (1 liter, lOx 12 cm, E Y Laboratories) helyezzük. A minta amplifikálása után a nem kötött anyagot az oszlopból PBS/aziddal kimossuk, melyet 20 mM Tris-HCl-ban levő 0,5 M NaCl-dal (pH=8) való mosás követ. A WGAoszlop által kötött Mpl-ligandum-aktivitást 0,35 Μ Nacetil-glükóz-amin (GlcNAc), 0,5 M NaCl, 20 mM Tris-HCl elegyével (pH=8) eluáljuk. Az Mpl-ligandumaktivitás nem detektálható az átfolyó vagy mosófrakciókban.
C) Mpl-X receptor affinitáskromatográfia
A felhasznált oldható patkány-Mpl-receptor (MplX) megfelel az Mpl-receptor teljes extracelluláris doménje mínusz a 483-as pozíciónál levő Trp-vel [lásd Vígon, et al., 8:2607-2615 (1993)]. Az Mpl-ligandum Mpl-X receptoraffinitási oszlophoz való kötődésének optimalizálása céljából a WGA elúciós összegyűjtött anyagot egy 10 000 molekulasúly résméretű membránultraszűrőt (YM-10, Amicon) használva koncentráljuk és NaCl-dal állítjuk 0,2 M értékre az ezt követő hígítás során. A koncentrált WGA összegyűjtött anyagot egy 20 ml m-Mpl-X (patkány-Mpl oldható receptor)/CNBr aktivált Sepharose oszlopra (2,6 χ 4,2 cm, 1,5 mg mMpl-X/ml gyanta) helyezzük 0,9 ml/perc átfolyási sebességgel. Az oszlopot 40 ml PBS/azid elegyével mossuk 1,5 ml/perc átfolyási sebesség mellett, ezt pedig 405 ml 10 mM Tris-HCl, 1 M NaCl, 1 mM CHAPS elegyével (erős sóval, pH=8,0) való mosás követ. Az oszlopot ezután 20 mM CAPS, 1 M NaCl, 5 mM CHAPS elegyével (pH=10,5) eluáljuk. A megfelelő frakciókat összegyűjtjük. Minden frakcióhoz Trist adunk a pH semlegesítése céljából.
Az Mpl-X receptoraffinitási oszlop elúciós profiljának 280 nm hullámhosszon mért abszorbanciája és az SDS-PAGE egy korai proteincsúcsot mutat az 1-4 frakciókban, míg az Mpl-ligandum-aktivitás többsége az 5. frakció után eluálódott.
D) Mono-Q anioncserés kromatográfia
A különböző Mpl-X receptoraffinitási oszlopok legnagyobb tisztaságú frakcióit összeöntjük, koncentráljuk és 20 mM Tris-HCl, 5 mM CHAPS (pH=8,7) elegyé21
HU 218 893 Β vei szemben diafiltrációnak vetjük alá, így 58,5 ml végső térfogatot kapunk. Az összegyűjtött anyag koncentrációját 280 nm hullámhosszon való abszorbanciával 0,12 mg/ml (körülbelül 7 mg teljes protein) értéknek becsüljük. Az összegyűjtött anyagot 0,5 ml/perc sebességgel egy 20 mM Tris-HCl, 5 mM CHAPS 8,7 pH-értékű elegye vei ekvilibrált Mono Q HR 5/5 oszlopra (Pharmacia) helyezzük. Az oszlopot ugyanebben a pufferben levő 0,36 M NaCl lineáris gradiensével eluáljuk 27 percen keresztül. Az oszlopot ezután egy 6 perces 0,54 M NaCl-gradienssel mossuk, majd végül egy 0,9 M NaCldal való fokozatos mosással.
A Mono Q oszlop elúciós profilja azt mutatja, hogy nem detektálható Mpl-ligandum és jelentős mennyiségű protein az átfolyó- és mosófrakciókban. Az Mpl-ligandum-aktivitás többsége az 5-7 frakciókban eluálódik, az NaCl-gradiens kezdeti állapotában. Egy aktivitási „plató” figyelhető meg a 8-10 frakciókban, melyet a 11-15 frakciókat tartalmazó második főbb csúcs követ.
Egy világos 25 kd sáv figyelhető meg SDS-PAGE (nem redukáló) analízissel az aktív frakciókban. A sáv intenzitása közvetlenül a frakciókban levő Mpl-ligandum-aktivitásnak felel meg. A 3. és 4. frakciókban a sáv hiányzik (nincs aktivitás). Az 5. és 6. frakciókban (1A6.1 aktivitási csúcs) ez a sáv kiemelkedő, és a 11-14 frakciókban egy hasonló erősen festődő sáv (1A6.1 aktivitási csúcs) van jelen. A 15. és 16. frakciók összegyűjtött anyagában a sáv halvány, ez a 16. frakcióban levő sokkal alacsonyabb aktivitásnak felel meg.
E) Gélelúciós kísérletek
A gélelúciós vizsgálatokat a Mono Q 5 és 6 frakciók és a Mono Q 13. és 14. frakciók azonos mennyiségeit használva hajtjuk végre. Ezekhez a kísérletekhez, az 5. és 6. frakciókból egyenként 6 μΐ vagy a 13. és 14. frakciókból, egyenként 7,5 μΐ mennyiséget gyűjtünk, SDSPAGE nem redukáló minta pufferrel összekeverjük és 12% SDS-gélekre helyezzük. Az elektroforézis befejeződése után a kérdéses sávokat kimetsszük (1 mm) és a szeleteket borotvapengével apró darabokra vágjuk. A darabkákat 1,5 ml-es 0,5 ml PBS/5 mM CHAPS elegyet tartalmazó mikrocentrifijga-csövekbe helyezzük, és egy éjszakán át 4 °C hőmérsékleten gyengén rázatjuk. Másnap a csöveket rövid ideig forgatjuk, a folyadékot eltávolítjuk, és a mintát hordozó proteinként BSA-val kiegészített Iscove-féle tápközeggel szemben diafilterezésnek vetjük alá. A dialfilterezett anyagot vizsgálatnak vetjük alá.
Az eredmények két Mpl-ligandum-aktivitási csúcs megfigyelését teszik lehetővé. Az egyik csúcs a gél 25 kd méretű régiójának felel meg, míg az Mpl-ligandum-aktivitás második csúcsa a 31 kd régióban figyelhető meg.
F) Superdex 200 gélszűrés
A Mono Q anioncserés oszlopról származó 13-16 frakciókat, valamint egy második Mono Q frakcionálásból származó azonos frakciókat összekeverjük, és egy membránultraszűrőt (Centricon-10, Amicon) használva koncentráljuk. SDS-t adunk hozzá 0,1% végső koncentrációban és a mintát egy Superdex 200 HR 10/30 (Pharmacia) oszlopra injektáljuk. Az oszlopot 50 mM Tris-HCl, 0,1% SDS 7,5 pH-értékű elegyével ekvilibráljuk 0,3 ml/perc átfolyási sebességgel, és szobahőmérsékleten működtetjük. Az 1 perces frakciókat összegyűjtjük. Azt az eredményt kapjuk, hogy a mintában levő legtöbb protein a 32-40 frakciókban eluálódik, míg az Mpl-ligandum-aktivitás a 42-46 frakciókban detektálható. A frakciók SDS-PAGE analízise egy világos 25 kd sávot mutat az aktív frakciókban.
G, C4 reverz fázisú HPLC
A Superdex 200-as 43-46 frakciókat összekeverjük vagy a 42 frakciót magában egy membránultraszűrőt (Microcon-10, Amicon) használva koncentráljuk. A koncentrált összegyűjtött anyagokat külön-külön egy 1x100 mm C4 reverz fázisú mikroboroszlopra (SynChropak RP-4) helyezzük. Az oszlopot vízben levő 0,04 TFA-ban (A puffer) ekvilibráljuk; a B puffer 80% acetonitrilben levő 0,035% TFA. A minta injektálása után a B puffer 0-45% lineáris gradiensével eluálunk 4 percig, melyet a B puffer 0-75% lineáris gradiensével szembeni 40 percig tartó elúció követ. Az átfolyási sebesség 75 μΐ/perc. A 42. frakció tisztításának eredményeit az 5. ábra mutatja. Világos Mpl-ligandum-aktivitási csúcsok figyelhetők meg a 21-23 frakciókban. Ezeket a frakciókat egy 14% poliakrilamid gélen analizáljuk nem redukáló és redukáló körülmények között. A 21. frakció egy egyedüli 31 kd sávból áll; a 23. frakció egy egyedüli széles 25 kd sávból; a 22. frakció a 25 és a 31 kd régiókban is tartalmaz sávokat. Más jelentős sáv nem észlelhető. Említésre méltó, hogy a korábbi gélelúciós vizsgálatok az Mpl-ligandum-aktivitást mindkét régiónak tulajdonítják. Egy egyedüli kisebb, nagy molekulasúlyú sáv figyelhető meg a nem redukáló gél összes frakciójában, azonban a redukáló gélben ezek nem láthatók.
H) A 25 kd és a 31 kd méretű Mpl-ligandumok Nterminális szekvenciaanalizise
Az N-terminális szekvenciaanalízist az aktivitással rendelkező C4 RP-HPLC frakciókon végezzük el. Az ezen proteinekhez meghatározott szekvenciákat a fentiekben adtuk meg. A 25 kd sávnak megfelelő főszekvencián túl (az alkalmazott összes minta legalább 90%a) a szekvenálás detektál még két kisebb szekvenciát is (melyek a fenti G részben leírt kisebb szennyező sávval vannak összefüggésben). Az ismert szekvenciákkal való összehasonlítás felfedi, hogy a kisebb szekvenciák nyúl-Ig nehéz láncok és kappa-láncok. Ha szükséges, ezek a kisebb szennyeződések mennyiségileg tovább csökkenthetők egy másik tisztítási lépés alkalmazásával, mint például előnyösen egy másik gélszűrési lépés alkalmazásával.
I) A C4 tisztított frakciók Mpl-ligandum-aktivitásának összehasonlítása
A 6. ábra olyan adatokat mutat, melyek azt demonstrálják, hogy a C4 RP-HPLC kromatográfiás lépésből származó 22 és a 23 frakciókban levő aktivitások alapjában véve azonosak. A 22. frakció a 25 és 31 kd méretű sávok keverékét tartalmazza, míg a 23. frakció csak a 25 kd sávot. Az egyes frakciók azonos mennyiségeit 1:45 000 arányban hígítjuk. A hígított frakciók az 1A6,1 sejtek szaporodását alapjában véve egyformán stimulálják (22. frakció 5400 sejt/üreg; 23. frakció
HU 218 893 Β
6000 sejt/üreg). A hígított frakciókat növekvő koncentrációjú Mpl-X-szel inkubáljuk. A frakciók egyformán érzékenyek az Mpl-X-szel való gátlással szemben, 7-1,4 pg/ml koncentráció teljesen blokkoló hatású. Ez azt jelzi, hogy az egyes frakciókban levő aktív protei- 5 nek azonos biológiai aktivitással rendelkező Mpl-ligandum típusok.
8. példa
Az Mpl-ligandum más faktorokhoz való hasonlítása 10 a megakariociták fejlődésére kifejtett hatás tekintetében
Számos rekombináns faktorról vagy szerves vegyületről, mint például a forbol-mirisztil-acetátról (PMA) kimutatták, hogy hatással van a megakariociták szapo- 15 rodására vagy fejlődésére. Ennek megfelelően ezen faktorok CD34-szelektált perifériás vérsejtekre kifejtett hatását vizsgálat alá vették. 1-2 ng/ml humán rekombináns interleukin-3-at (IL-3), 50 ng/ml törzssejtfaktort (SCF), 25 ng/ml interleukin-6-ot (IL-6), 1 egység/ml 20 eritropoietint (EPO), 10 ng/ml leukémiagátló faktort (LIF) és 25 ng/ml granulocita-makrofág telep stimuláló faktort (GM-CSF, Amgen, Inc.), 25 ng/ml interleukin-ll-et (IL-11, R+D rendszer, Minneapolis, MN), 10~10 M forbol-mirisztil-acetátot (PMA, Sigma) adunk 25 a tenyészetekhez a jelzés szerint. Az Mpl-ligandumot 275 egység/ml értékben használjuk, az APK9-et 5% mennyiségben (ez 220 egység/ml értéknek felel meg).
A kombinációban tesztelt faktorok ugyanolyan koncentrációban kerülnek felhasználásra, mint az egyedileg 30 teszteltek. Nyolcnapos tenyésztés után a sejteket közvetlenül az üregekhez rögzítjük, majd a megakariociták utáni keresés céljából megfestjük ezeket (n=6 üreg/állapot), vagy a teljes sejtszámot számoljuk (n=3 üreg/állapot). Az adatokat átlagérték ±SEM-ként mutatjuk be. 35
A 7. ábra azt mutatja, hogy az APK9 és az Mplligandum eredményezi a legmagasabb üregenkénti megakariocitaszámot. Az IL-3 szintén megakariocita fejlődést okoz, különösen az SCF-fel kombinációban.
Az IL-6, IL-11 vagy az EPO kis hatást gyakorol a 40 megakariociták számára akár magukban, akár az IL-3mal kerülnek együttes felhasználásra. A PMA, a LIF és a GM-CSF kis hatású. A 8. ábrán az ugyanezen kísérletből származó adatok láthatók, az üregenkénti teljes sejtszám („cellularitás”) bemutatásával. Az APK9 és az Mpl-li- 45 gandum kis hatással van a cellularitásra, míg az IL-3 és az SCF szerény hatással rendelkezik. Az SCF és IL-3 kombinációja adja a legnagyobb hatást. A 7. és a 8. ábrákon bemutatott adatokat a megakariocita/üreg százalékok kiszámítására használjuk, ahogy azt a 9. ábrán 50 bemutatjuk. Egyértelmű, hogy a legnagyobb megakariocita/üreg százalékot eredményező tényező, az Mpl-ligandum az APK9-ben levő aktív alkotórész. Ez jelzi az Mpl-ligandum megakariocitákkal szembeni specifitását.
9. példa
Az Mpl-ligandum megakariocita-elősegítő aktivitása nem függ a humán IL-3-tól Az Mpl-ligandum stimulálja a humán megakariociták fejlődését, ha a 2. példában leírt tenyésztápközeg 60 kiegészítőjeként kerül felhasználásra. Bár az IL-3 nem alkotórésze a tápközegnek, ki nem mutatható kis mennyiségekben jelen lehet a tápközegben levő normál humán plazmában. Azonban ha jelen is van, az IL-3 nem vesz részt az Mpl-ligandum által indukált megakariopoesisben. Ezt mutatja be a 10. ábra. A 2 ng/ml mennyiségben levő IL-3 a humán meg vizsgálatban 14 900 meg egység/ml aktivitással rendelkezik. Ezt az aktivitást az anti-IL-3 (3,3 pg/ml; Genzyme, Cambridge, MA) 97%-ban gátolja. A 8203 meg egység/ml mennyiségű Mpl-ligandumot az anti-IL-3 nem gátolja.
10. példa
A sertés-Mpl-ligandum analízise
I. Összefoglalás
Mpl-ligandum-aktivitással rendelkező besugárzott sertésplazmából származó proteineket jellemzünk WGA affinitáskromatográfiával, Mpl-receptor affinitáskromatográfiával, ioncserés kromatográfiával és C4 reverz fázisú HPLC-vel. Ezt az aktivitást az SDS-poliakrilamid gélekből származó kivágások eluálásával is jellemezzük.
Kromatográfia WGA affinitásoszlop
Mpl-receptor oszlop
Mono S ioncsere pH 6,0
C4 reverz fázisú HPLC Gélelúciós kísérletek
Megjegyzés
4.4 χ 106 egységet alkalmazunk
3.4 χ 106 egységet nyerünk 2,7 χ 106 egységet alkalmazunk
2.4 χ 106 egységet nyerünk
2.4 χ 106 egységet alkalmazunk
4.4 χ 106 egységet nyerünk aktivitást adó 23-25 frakciók Két aktivitás különböztethető meg tisztán, az egyik megközelítően 18 kd, a másik megközelítően 28 kd méretnél
11. példa
A humán Mpl-liqandum, a humán MGDF klónozása
Az alábbiakban két megközelítést írunk le:
I. Az első példaként szolgáló klónozási elképzelés
A) A humán MGDF-próba létrehozása
Számos degenerált PCR prímért tervezünk a nyúlprotein aminoterminus szekvenciájára alapozva. Különböző primer párokat használunk a humán genom DNSből származó MGDF-gén amplifikálására. 40 amplifikációs ciklus után, melynek során a nyúlprotein első öt aminosavát (1. számú szekvencia) kódoló az 5’ GCN CCN CCN GCN TGY GA 3’ (4. számú szekvencia) sense, valamint az 1. számú szekvencia 16-21 aminosavait kódoló antiszensz 5’ GCA RTG YAA CAC RTG NGA RTC 3’ primereket használunk, a PCR-terméket egy 2,0%-os agarózgélen futtatjuk TBE pufferben.
A 63 bázispár hosszúságú bandet kivágjuk az agarózgélből, és ugyanezen primer sorozatot használva újra amplifikáljuk. A PCR-terméket a PCR II vektorba (Invitrogen, San Diego) klónozzuk. DNS-szekvenálással számos telepet szkrínelünk. Egy, a nyúl-MGDF-proteinhez hasonló pepiidet kódoló plazmid-DNS-t haszná23
HU 218 893 Β lünk egy radioaktív próba forrásaként, melyet a cDNSkönyvtárak szkríneléséhez használunk. A génfragment által kódolt aminosavszekvencia a következő: Ala-Pro-Pro-Ala-Cys-Asp-Leu-Arg-Val-Leu-Ser-LysLeu-Leu-Arg-Asp-Ser-His-Val-Leu-His (6. számú szekvencia).
A humán MGDF-et tartalmazó agarózcsíkot forró PCR-ral való próba létrehozásához használjuk. 100 pl tipikus PCR-reakció a következő alkotórészeket tartalmazza :
templát DNS 2-3 pl
5’ primer (4. számú szekvencia) 1 pl, 20 pmol
3’ primer (5. számú szekvencia) 1 pl, 20 pmol
10 χ puffer 10 pl
dATP (0,1 mM) 2 pl
dTTP (10 mM) 2 pl
dGTP (10 mM) 2 pl
dCTP (0,1 mM) 2 pl
dCTP, P32 (10 pC/pl) 5 pl
dATP, P32 (10 pC/pl) 5 pl
Taq DNA polimeráz 0,5 pl, 2,5 egység
víz 77 pl
Teljes térfogat 100 pl
Az amplifikációs körülmények a következők:
kezdeti hevítés 94 °C, 2 perc
temperálás 53 °C, 30 mp
extenzió 72 °C, 30 mp
denaturálás 94 °C, 30 mp
Az amplifíkáció 40 ciklusát hajtjuk végre egy Perkin-Elmer GeneAmp System 9600 készülékben.
A terméket egy hordozóoszlopon (Stratagén, San Diego) való átengedéssel tisztítjuk. A próba 1 pl mennyiségét szcincillációs számlálóval számoljuk. Az 1-3 millió/ml számot tartalmazó próbákat hozzáadjuk a hibridizációs elegyhez.
B) Magzatimáj-könyvtár megszerkesztése
Humán magzati máj poliA+ RNS-t vásárolunk a
Clontech Laboratoriestől. A cDNS-szintézishez körülbelül 4 pg RNS-t használunk, melyben a primelést egy Xbal helyet tartalmazó oligóhoz kapcsolódó random hexamert - az 5’ GTACGC GTT CTA GAN NNN NNT 3’ - használva végezzük el.
A Gibco-BRL protokollt használjuk a kettős szálú cDNS létrehozásához. Az EcoRI-BstXI adaptert (Invitrogen, San Diego) a kettős szálú cDNS-hez ligáljuk, melyet a Xbal restrikciós enzimmel való emésztés követ. A cDNS-méret szelekcióját egy S500 Sephacryl oszlopon (Life Technologies, Inc.) végezzük el. A 400 bázispámál nagyobb cDNS-eket a vl9,8 (Martin, F., Cell 63:203-211) emlős expressziós vektorhoz ligáljuk, melyet már az EcoRI és Xbal enzimekkel emésztettünk. Kompetens E. coli DH10 sejteket transzformálunk, és a kapott cDNS-könyvtárat 7 csoportra osztjuk, melyek mindegyike 100 000 cDNS-t tartalmaz.
C) A lambda-könyvtár szkrínelése
Egy lambda-gt 11-ben levő humán magzati vesekönyvtárat vásárolunk a Clontechtől, 650 millió pfu/ml titerben. Körülbelül 2 millió plakkot szkrínelünk egy PCR-ral (lásd fent) létrehozott próbával. A hibridizációt
6xSSC, 5xDenhardt, 0,1 SDS, 100 pg/ml egyszálú lazacsperma-DNS elegyében 15 óráig 56 °C hőmérsékleten végezzük.
A szkrínelést többszörös egymás utáni ismétlésben hajtjuk végre. Az egyedülálló plakkokból a DNS-t amplifikálunk, és a 6. számú szekvencia 7-13 aminosavait kódoló 5’ AGT TTA CGT AGG ACT CGG AGG 3’ (8. számú szekvencia) belső printerrel hibridizáljuk az igazi pozitívok azonosítása céljából.
D) A cDNS-végek 3 prím gyorsamplifikálása (RACE)
Humán magzati veséből és magzati májból származó poliadenilált RNS-t vásárolunk a Clontechtől. Egy pg RNS-t reverz transzkripciónak vetünk alá printerként az oligo 5’ TTC GGC CGG ATA GGC CTT TTT TTT TTT TTT 3’ (9. számú szekvencia) szekvenciát használva.
Az első szál cDNS létrehozásához a Gibco-BRL cDNS-szintézises kitet (Life Technologies Inc., Cat #18267-013) használjuk. A végső térfogat 30 pl. A reakciót 500 mM EDTA hozzáadásával állítjuk le 10 mM végső koncentráció elérésével, és az elegyet -20 °C hőmérsékleten tároljuk.
A kezdeti PCR-hoz 0,5 pl cDNS-t használunk reakciónként! templátként. Antisense printerként a 9. számú szekvenciát és a kompetitor oligo 5’ TTC GGC CGG ATA GGC CTT TTT TTT TTT TT-P 3’ (10. számú szekvencia) szekvenciát, míg sense printerként a 6. számú szekvencia 5-11 aminosavait kódoló 5’ TGC GAC CTC CGA GTC CTC AG 3’ (11. számú szekvencia) oligonukleotidot használjuk. Az amplifíkáció 40 ciklusát hajtjuk végre a következő protokollt használva: 94 °C, 30 mp; 65 °C, 30 mp; 72 °C, 30 mp, a kezdeti 2 percig 94 °C hőmérsékleten való inkubálás után. Egy Perkin-Elmer GeneAmp System 9600 készüléket használunk az amplifíkáláshoz.
A beágyazást (nesting) sense primerként a 6. számú szekvencia 8-14 aminosavait kódoló 5’ GAG TCC TCA GTA AAC TGC TTC GT 3’ (12. számú szekvencia) szekvenciát, míg antisense primerként a 9. számú szekvenciát és a 10. számú szekvenciát használjuk. Az amplifikálás 40 ciklusát 65 °C hőmérsékleten való amplifikálással hajtjuk végre. A PCR-termékeket egy 0,8% agarózgélen futtatjuk, majd UV-fényben lefényképezzük. A 0,8-1,2 kb körüli sávok láthatóvá válnak.
Ezután a PCR-termékeket a PCR II vektorba (Invitrogen) klónozzuk. Az egyedülálló telepeket kigyüjtjük, és a plazmidokat 12143 és 12145 számú Qiagen kiteket használva izoláljuk. A kettős szálú festék príméit szekvenálást vektor primereket használva hajtjuk végre. A szekvenciákat különböző típusú GCG szoftverekkel analizáljuk.
E) Az 5’ és 3 'primer extenzió
A teljes hosszúságú MGDF-gén szekvenciájának izolálása céljából 3’ és 5’ primer extenziót hajtunk végre templátként magzatimáj-könyvtár különböző gyűjteményét használva. A cDNS 5 primerének amplifikálásához az egyes poolokból származó körülbelül 20 ng cDNS-t használjuk templátként. A 6. számú szekvencia 12-17 aminosavait kódoló 5’ GGA GTC ACG AAG
HU 218 893 Β
CAG TTT AC 3’ (13. számú szekvencia) antisense prímért és az 5’ vl9.8 vektor 5’ CCT TTA CTT CTA GGC CTG 3’ (14. számú szekvencia) sense prímért használjuk. Az amplifikációt 30 ciklusban végezzük el 53 °C hőmérsékleten való anneálással. A beágyazást 30 ciklusban végezzük a 6. számú szekvencia 1-6 aminosavait kódoló 5’ GAG GTC ACA AGC AGG AGG A 3’ antiszensz (15. számú szekvencia) primereket és a 14. számú szekvenciával rendelkező vektorprimert használva.
Az MGDF cDNS-ek 3’-végeinek primer extenziójához az 5’ GGC ATA GTC CGG GAC GTC G 3’ (16. számú szekvencia) antisense vektor prímért és a 6. számú szekvencia 1-6 aminosavait kódoló MGDF specifikus 5’ TCC TCC TGC TTG TG A CCT C 3’ prímért (17. számú szekvencia) használjuk. Az amplifikációt 30 ciklusban végezzük el 58 °C hőmérsékleten való anneálással.
A beágyazó amplifikálás 30 ciklusát az MGDF primer 12. számú szekvenciával rendelkező és a 16. számú szekvenciával rendelkező vektor prímért használva végezzük el. A specifikus bandek (sávok) az 1-es, 7-es és a 8-as számú poolokban jelennek meg, melyeket a PCR II vektorba klónozunk. Az egyedüli telepekből származó tisztított plazmid DNS-t tisztítjuk és szekvenáljuk.
F) A humán MGDF teljes hosszúságú klánjainak izolálása
A kezdeti kiónok közül sokban nem szerepel az MGDF aminoterminus része, mivel az MGDF szekvencia egy része felhasználásra került a primelésben és a beágyazásban. Az 5’ CCA GGA AGG ATT CAG GGG A 3’ (18. számú szekvencia) prímért, melynek szekvenciáját a fentiekben leírt 5 primer extenziós kísérletekből nyertük, használjuk sense primerként. A 16. számú szekvenciával rendelkező vektor primer szolgál antisense primerként. Az amplifikáció 35 ciklusát 58 °C hőmérsékleten való anneálással végezzük. Egy Sáli hellyel rendelkező MGDF-specifikus 5’ CAA CAA GTC GAC CGC CAG CCA GAC ACC CCG 3’ (19. számú szekvencia) prímért, valamint a 15. számú szekvenciával rendelkező vektor prímért használunk a 35 ciklus beágyazásához. A PCR-terméket a PCR II vektorba klónozzuk és szekvenáljuk.
11. Második példaként szolgáló klónozási elképzelés
A) A nyúl-MGDF N-terminális cDNS-klónozása
Degenerált oligonukleotid primereket tervezünk a korábbi szakaszban leírt nyúl-MGDF N-terminális aminosavszekvenciára alapozva, és ezt használjuk primerként a polimeráz láncreakcióban (PCR) az MGDFet kódoló cDNS-szekvenciák amplifikálására. Chomzynski és Sacchi (Biochem. 162:156-159 (1987)] guanidinium izotiocianát módszerét használva nyúlvese mintákból teljes RNS-t állítunk elő. Az első számú cDNS-t egy random primer adapter 5’ GGC CGG ATA GGC CAC TCN NNN NNT 3’ (20. számú szekvencia) szekvenciával állítjuk elő MoMULV reverz transzkriptázt felhasználva, és ezt használjuk templátként az ezt követő PCR-ekben.
A cDNS 0,5 pl, körülbelül 50 ng mennyiségével PCR-t végzünk, az 5’ GCN CCN CCN GCN TGY GA
3’ (4. számú szekvencia) A Prímért egy, az 1. számú szekvencia 1-6 aminosavait kódoló szensz szálú primer felhasználásával, valamint vagy az 5’ GCA RTG NAG NAC RTG NGA RTC 3’ (5. számú szekvencia) B Primer vagy az 5’ GCA RTG YAA NAC RTG NGA RTC 3’ (21. számú szekvencia) C Primer - melyek az 5’ terminusokon az anneálás stabilitásának növelése céljából három extra nukleotidot tartalmazó és az 1. számú szekvencia 16-21 aminsavait kódoló antiszensz szálú primerek - felhasználásával. A Taq polimerázzal való PCR-t 35-45 ciklusban végezzük el, egészen addig, míg a terméksávok az agarózgél elektroforetikus analízisben megjelennek. A PCR első két ciklusában a reanneálási lépést 37 °C hőmérsékleten hajtjuk végre 2 percig; a többi ciklusban a reanneálást 50 °C hőmérsékleten 1 percig végezzük. Az egyes reakciókban többszörös terméksávokat figyelünk meg. A körülbelül a várt méretű (66 bázispár) sávokat tartalmazó gélrészeket egy Pasteur-pipetta hegyével összegyűjtjük, és ugyanazzal a primerpárral reamplifikáljuk. A DNStermékeket a PCR II (Invitrogen) vektorba klónozzuk a gyártók utasításának megfelelően. Három kiónt szekvenálunk, és úgy véljük ezek kódolják egy leolvasási keretben a várt nyúl-MGDF-szekvenciát, az 1-21 maradékokat. Ily módon az egyedüli nyúl-MGDF cDNS-szekvenciát a 6. kodon harmadik nukleotidjától a 15 kodon harmadik nukleotidjáig tartó régió áthidalásával nyerjük. Ezen kiónok egyike templátként szolgál egy jelölt nyúl-MGDF cDNS-próba előállításához.
B) A cDNS-könyvtár humán magzati májból való megszerkesztése
Humán magzati májból (International Institute fór the Avancement of Medicine, Exton, PA) a szövet
5,5 M guanidinium tiocianátban való lízisével izoláljuk és CsTFA-n (Pharmacia) keresztüli centrifugálással tisztítjuk. Poliadenilált RNS-t szelektálunk oligo (dT)25 dynagyöngyöket (Dynal, a gyártók utasításának megfelelően) használunk. Ebből az RNS-ből kettős szálú cDNS-t hozunk létre a cDNS-szintézishez Superscript plazmid rendszert (Life Technologies, Inc.) használva, azzal az eltéréssel, hogy más kötő adaptereket használunk: 5’ TTG GTG TGC ACT TGT G 3’ (22. számú szekvencia) és 5’ CAC AAG TGC ACA CCA ACC CC 3’ (23. számú szekvencia). Méretszelekció után ezt a cDNS-t irányítottan az emlős pBCB expressziós vektor [a pBCB vektor az Rc/CMV plazmidból (Invitrogen) származik, és a pucl9 gerincet, a CMV promotert és BGH poliadenilációs helyet tartalmaz] BstXI és NotI helyeire inzertáljuk. A ligáit DNS-t elektrokompetens 10B bakteriális törzsbe (Life Technologies, Inc.) elektroporációval juttatjuk be.
C) A humán magzati máj cDNS-könyvtár MGDF utáni szkrínelése
A humán magzatimáj-könyvtár szűrletreplikáit radioaktív jelölésű nyúl-GDF N-terminális cDNS PCR termékhez hibridizáljuk (5 χ SSPE, 2 χ Denhardt-féle oldat, 0,05% Na pirofoszfát, 0,5% SDS, 100 pg/ml élesztőgomba-tRNS lizátum és 100 pg/ml denaturált lazacsperma DNS) 64 °C hőmérsékleten 18 órán keresztül. A szűrleteket 64 °C hőmérsékleten 5 χ SSPE, 0,5% SDS elegyé25
HU 218 893 Β ben mossuk és egy éjszakán át feltáljuk. Két, az ezen próbához hibridizáló kiónt izolálunk és analizálunk.
D) A humán MGDF cDNS-klónok expresszálása
Az MGDF cDNS-klónokból származó tisztított DNS-t 293 EBNA sejtekbe (Invitrogen) transzfektáljuk. A DNS 1,5 pg mennyiségét 100 pl szérummentes DMEM-ben levő 7,5 pl Lipofectaminnal (Life Technologies, Inc.) keverjük össze. Egy szobahőmérsékleten 20 percig tartó inkubálás után a DNS-Lipofectamin elegyet 400 pl DMEM és 1% szérum (Magzati Klón II) elegyében 5 χ 105 sejtet tartalmazó üregekhez (24 üregű négyzetes Greiner-lemez) adjuk, és 6 órán keresztül 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk. A sejtekhez 500 pl DMEM-t és 2% szérumot (Magzati Klón II) adunk. 16 óra eltelte után a tápközeget levegőztetjük, és 500 pl DMEM-et és 1% szérumot (Magzati Klón II) adunk hozzá. 72 óra után a kondicionált tápközeget összegyűjtjük, és egy 0,22 mikronos centrifugaszűrőn lecentrifugáljuk. A kondicionált tápközeget MGDF biológiai aktivitásra vizsgáljuk.
111. A humán MGDF-klónok leírása és aktivitása
A fent leírt klónozási stratégiára alapozva a 11. ábrán (MGDF-1 és MGDF-2; 24, 25; és 26, 27 számú szekvenciák) és a 12. ábrán (MGDF-3; 28, 29 számú szekvenciák) bemutatott humán cDNS-klónokat nyerjük. Az ábrákon bemutatott egyes szekvenciák az 1-21 aminosavak egy feltételezett jelszekvenciáját tartalmazzák, így az érett protein az egyes esetekben a 22-es aminosavnál kezdődik.
A sejtalapú fenti 4A. példában leírt MGDF 1-3 molekulákat felhasználó aktivitási vizsgálat eredményeit az alábbiakban szereplő 3. és 4. táblázatban mutatjuk be. A 3. táblázatban az egyes szerkezetekkel transzfektált 293 EBNA sejtekből nyert kondicionált tápközeget a tenyésztés két napja után gyűjtjük össze és ezután 1A6.1 sejteken (32D/mur-Mpl+)±10 pg/ml mur-MplX teszteljük. A 4. táblázatban az egyes szerkezetekkel transzfektált 293 EBNA sejtekből nyert kondicionált tápközeget a tenyésztés négy napja után gyűjtjük össze, és ezután 32D/mur-Mpl+ sejteken (3A. példa) és 32D/huMpl+ sejteken (3B. példa) teszteljük. Amint az látható, a humán MGDF-1 és MGDF-2 a patkány- és a humán Mpl formákat is expresszáló sejtvonalakkal szemben aktív, míg az MGDF-3 nem az. A humán Mpl-receptort expresszáló sejtvonal sokkal fogékonyabb a humán MGDF-l-gyel és MGDF-2-vel szemben, mint a patkány Mpl-receptort expresszáló sejtvonal.
3. táblázat
Klón U/ml (-mur-Mpl-X) U/ml (+mur-Mpl-X)
Tápközeg 0 0
PBCO (kontrollplazmid) 0 0
MGDF-1 12 800 800
MGDF-1 (ismétlés) 12 800 566
MGDF-2 4525 400
Klón U/ml (-mur-Mpl-X) U/ml (+mur-Mpl-X)
MGDF-2 (ismétlés) 12 800 1131
MGDF-3 0 0
MGDF-3 (ismétlés) 0 0
APK9 kontroll 4400±400 0
4. táblázat
Klón U/ml 32D/mur-Mpl+ U/ml 32 D/hu-mpl+
MGDF-1 1600 25 600
MGDF-2 6400 50 000
MGDF-2 (ismétlés) 6400 50 000-100 000
Az alábbiakban bemutatott 5. táblázat azt mutatja, hogy a humán MGDF-1 és MGDF-2 32D/hu-Mpl+ sejtekre (3B. példa) kifejtett aktivitását alapjában véve teljesen gátolja az oldható humán Mpl-receptor (huMpl-X). Hu-Mpl-X van jelen, amikor a proteint kódoló CHO-sejtekről a kondicionált tápközeget összegyűjtjük. A CHO hu-Mpl-X kondicionált tápközeget 120-szorosára koncentráljuk, majd 6,6%-ban a tenyészethez adjuk. A kontroll-CHO-tenyészetekről származó kondicionált tápközeg nincs hatással a vizsgálatra. A vizsgálatot a 4B. példában leírtak szerint hajtjuk végre azzal az eltéréssel, hogy az életképes sejteket 3 nap után értékeljük.
5. táblázat
Klón U/ml (-Hu-Mpl-X) U/ml (+Hu-Mpl-X)
MGDF-1 530 0
MGDF 2 270 0
Humánmegakariocita-vizsgálat
Az MGDF-1 és az MGDF-2 indukálja a perifériás vér CD34-szelektált sejtekből történő megakariocitaképződést, az MGDF-3 azonban nem. A 6. táblázatban leírt kísérletet alapjában véve a 2. példában leírtak szerint hajtjuk végre, azzal az eltéréssel, hogy a perifériás vérsejtek ülepítés (elutriáció) nélküli CD34-szelektált sejtek, és a tenyészetet 7 nap után gyűjtjük össze. Az egyes 293 EBNA MGDF szerkezetekből származó kondicionált tápközeget 20%-os végtérfogatban ±30 pg/ml murMpl-X alkalmazzuk. Az APK9 kontrollt 6%-os végtérfogatban alkalmazzuk.
6. táblázat
Klón Megakariocita/üreg (-mur-Mpl-X) Megakariocita/üreg (+mur-Mpl-X)
Vektorkontroll 0 0
APK9 kontroll 100±3 0
HU 218 893 Β
6. táblázat (folytatás)
Klón Megakariocita/üreg (-mur-Mpl-X) Megakariocita/üreg (+mur-Mpl-X)
MGDF-1 142±48 17±2
MGDF-2 100±3 6±2
MGDF-2, ismétlés 86±10 0
MGDF-3 2±2
12. példa
A következő példában 12 különböző pegilált MGDF-molekula, a PEG 9-PEG 12 és a PEG 14-PEG 21 szintézise kerül leírásra. Minden esetben a pegilált MGDF-molekula E. co/í-eredetű MGDF-11 (22-184 aminosavak, a jelpeptid vagy 1-163 aminosav kezdetétől számozva, az érett protein elejétől számozva). Az ezen pegilált molekulák részletezése a későbbiekben található 7-10. táblázatokban került összefoglalásra.
12.1 A poli-MePEG-MGDF konjugátumok aktivált
MeMGDF-származékokkal való MGDF-acilezéssel történő előállítása
A poli-MePEG (20 kDa)-MGDF konjugátum (PEG
11) előállítása
0,1 M BICINE pufferben (pH=8) levő 2,5 mg/ml, 4 °C hőmérsékletűre lehűtött MGDF oldatát 10-szeres moláris feleslegben levő szilárd MePEG szukcinimidil propionáthoz (MW 20 kDa) (Shearwater Polimers, Inc.) adjuk. A polimert gyenge keveréssel oldjuk fel, és a reakció a továbbiakban szobahőmérsékleten folyik.
A reakció során végrehajtott proteinmódosítás mértékét méretexklúziós (SEC) HPLC-vel követjük nyomon, Superdex 200 HR 10/30 oszlopot (Pharmacia Biotech) használva, melyet 6,9 pH-értékű 0,1 M nátriumfoszfát-pufferrel eluálunk 0,7 ml/perc értékkel.
A reakcióelegy 30 percenkénti SEC HPLC-analízise azt jelzi, hogy a reakcióelegyben nem marad szabad protein. Ezen a ponton a reakcióelegyben levő protein koncentrációját 1 mg/ml mennyiségre csökkentjük steril víz hozzáadásával, majd az elegy pH-értékét 4-re állítjuk 0,5 M ecetsav néhány csöppjének hozzáadásával.
Az MePEG-MGDF konjugátumot a feleslegben levő MePEG-től és más, a reakció melléktermékétől ioncserés kromatográfiával szeparáljuk SP Sepharose HP (Pharmacia Biotech) ioncserés gyantát használva.
A reakcióelegyet az oszlopban levő 2,5 mg/ml mennyiségű gyantára helyezzük és a nem reagált MePEg-et 3 oszloptérfogat kiindulási A pufferrel (20 mM nátrium-foszfát, pH=7,2, 15% glicerol) eluáljuk. Ezután az MePEG-MGDF konjugátumot eluáljuk 10 oszloptérfogatnyi B végpuffer (A pufferben levő 1 M NaCl) 0%-30% lineáris gradiensével. Az eluenst 280 nm hullámhosszon nyomon követjük. A poliMePEG-MGDF konjugátumokat tartalmazó frakciókat összegyűjtjük, koncentráljuk és sterilen szűrjük.
A tisztított poli-MePEG-MGDF konjugátumot HPLC SEC-kel analizáljuk sorozatba kötött TSK-GEL
G4000SWXL és G2000SWXL gélszűrő oszlopokat használva. A proteineket 280 nm hullámhosszon UVabszorbanciával detektáljuk. BIO-RAD gélszűrő standardok szolgálnak globuláris protein molekulasúly markerekként.
Ahogy az a 17A. ábrán is látható, a HPLC SEC két fő komponenst fed fel a készítményben (körülbelül 2:1 arányban) melyek elúciós pozíciói sorrendben megfelelnek a 370,9 kDa és 155,0 kDa globuláris proteinekének. Lásd a 8. táblázatot is.
A 6-50 kDa molekulasúlyú MePEG-ek szukcinimidil-észterekkel való MGDF acilezésével előállított PEG 9, PEG 10 és PEG 12 konjugátumokat hasonlóképpen hozzuk létre. Az ezen előállítások során alkalmazott fő reakcióparamétereket a 7. táblázatban foglaljuk össze.
Ezen konjugátumok HPLC SEC-analízisének eredményeit a 8. táblázatban mutatjuk be.
12.2 A poli-MePEG-MGDF konjugátumok előállítása az MGDF MePEG aldehidekkel való reduktív alkilezésével
A poli-MePEG (20 kDa)-MGDF konjugátum (PEG 20) előállítása mM NaCNBH3-at tartalmazó, 5 pH-értékű 100 mM nátrium-foszfátban levő 2 ml, 2,5 mg/ml koncentrációjú MGDF 4 °C hőmérsékletűre hűtött kevert oldatához 10-szeres moláris feleslegben levő monometoxi-polietilénglikol aldehidet (MePEG) (átlagos molekulasúlya 20 kDa) adunk, és a reakcióelegyet ugyanezen a hőmérsékleten tovább keveijük.
A reakció során végrehajtott proteinmódosítás mértékét SEC HPLC-vel követjük nyomon, Superdex 200 HR 10/30 oszlopot (Pharmacia Biotech) használva, melyet 6,9 pH-értékű 0,1 M nátrium-foszfát-pufferrel eluálunk 0,7 ml/perc értékkel.
óra után a SEC HPLC-analízise azt jelzi, hogy a protein kiindulási mennyiségének több mint 90%-a módosult. Ezen a ponton a reakcióelegyben levő protein koncentrációját 1 mg/ml mennyiségre állítjuk a reakcióelegy steril vízzel való hígításával, majd az elegy pH-értékét 4-re állítjuk 0,5 M ecetsavval.
Az MePEG-MGDF konjugátumot a feleslegben levő MePEG-től és más, a reakció melléktermékétől ioncserés kromatográfiával szeparáljuk SP Sepharose HP (Pharmacia Biotech) ioncserés gyantát használva.
A reakcióelegyet az oszlopban levő 2,5 mg/ml mennyiségű gyantára helyezzük, és a nem reagált MePEG-et 3 oszloptérfogat kiindulási A pufferrel (20 mM nátrium foszfát, pH=7,2, 15% glicerol) eluáljuk. Ezután az MePEG-MGDF konjugátumot eluáljuk 10 oszloptérfogatnyi B végpuffer (A pufferben levő 1 M NaCl) 0%-30% lineáris gradiensével. Az eluenst 280 nm hullámhosszon nyomon követjük. A poliMePEG-MGDF konjugátumokat tartalmazó frakciókat összegyűjtjük, koncentráljuk és sterilen szűrjük.
A tisztított poli-MePEG-MGDF konjugátumot HPLC SEC-kel analizáljuk sorozatba kötött TSK-GEL G4000SWXL és G2000SWXL gélszűrő oszlopokat használva. A proteineket 280 nm hullámhosszon UVabszorbanciával detektáljuk. BIO-RAD gélszűrő stan27
HU 218 893 Β dardok szolgálnak globuláris protein molekulasúly markerekként.
Ahogy az a 17A. ábrán is látható, a HPLC SEC két fő komponenst fed fel a készítményben (a teljes mennyiség 52%-át és 47%-át teszi ki), melyek elúciós pozíciói sorrendben megfelelnek a 359,4 kDa és 159,3 kDa globuláris proteinekének. Lásd a 8. táblázatot is.
A 6-25 kDa molekulasúlyú MePEG aldehidekkel való MGDF reduktív alkilezéssel előállított PEG 18, PEG 19 és PEG 21 konjugátumokat hasonlóképpen hozzuk létre. Az ezen előállítások során alkalmazott fő reakcióparamétereket a 7. táblázatban foglaljuk össze.
Ezen konjugátumok HPLC SEC analízisének eredményeit a 8. táblázatban mutatjuk be.
12.3. Az N-terminális alfa-aminomaradéknál levő hozzácsatolási hellyel rendelkező monometoxi-polietilénglikol MGDF konjugátumok előállítása A mono-MePEG (20 kDa)-MGDF konjugátum (PEG 16) előállítása mM NaCNBH3-at tartalmazó, 5 pH-értékű 100 mM nátrium-foszfátban levő 2 ml, 2,5 mg/ml koncentrációjú MGDF 4 °C hőmérsékletűre hűtött kevert oldatához 5-szörös moláris feleslegben levő monometoxi-polietilénglikol aldehidet (MePEG) (átlagos molekulasúlya 20 kDa) adunk, és a reakcióelegyet ugyanezen a hőmérsékleten tovább keverjük.
A reakció során végrehajtott proteinmódosítás mértékét SEC HPLC-vel követjük nyomon, Superdex 200 HR 10/30 oszlopot (Pharmacia Biotech) használva, melyet 6,9 pH-értékű 0,1 M nátrium-foszfát-pufferrel eluálunk 0,7 ml/perc értékkel.
óra után a SEC HPLC-analízise azt jelzi, hogy a protein kiindulási mennyiségének több mint 90%-a módosult. Ezen a ponton a reakcióelegyben levő protein koncentrációját 1 mg/ml mennyiségre állítjuk a reakcióelegy steril vízzel való hígításával, majd az elegy pH-értékét 4-re állítjuk 0,5 M ecetsavval.
A mono-MePEG(20 kDa)-MGDF konjugátumot a feleslegben levő MePEG-től és más, a reakció melléktermékétől ioncserés kromatográfiával szeparáljuk SP Sepharose HP (Pharmacia Biotech) ioncserés gyantát használva.
A reakcióelegyet az oszlopban levő 2,5 mg/ml mennyiségű gyantára helyezzük, és a nem reagált MePEg-et 3 oszloptérfogat kiindulási A pufferrel (20 mM nátrium-foszfát, pH=7,2, 15% glicerol) eluáljuk. Ezután az MePEG-MGDF konjugátumot eluáljuk 20 oszloptérfogatnyi B végpuffer (A pufferben levő 1 M NaCl) 0%-30% lineáris gradiensével. Az eluenst 280 nm hullámhosszon nyomon követjük. A poli-MePEG-MGDF konjugátumot tartalmazó frakciókat összegyűjtjük, koncentráljuk és sterilen szűrjük.
A mono-MePEG-MGDF konjugátumok homogenitását SDS-PAGE-val határozzuk meg 4-20% előregyártott gradiens géleket (NOVEX) használva. Egy, a 46,9 kDa protein pozíciójának megfelelő fő bandet nyerünk.
A tisztított poli-MePEG-MGDF konjugátumot HPLC SEC-kel analizáljuk TKS-GEL G4000SWXL és G2000SWXL gélszűrő oszlopokat használva, melyeket sorba kötöttünk. A proteineket 280 nm hullámhosszon UV-abszorbanciával detektáljuk. A BIO-RAD gélszűrő standardek szolgálnak globuláris protein molekulasúly markerekkért.
Ahogy az a 17C. ábrán látható, a SEC HPLC felfed egy fő komponenst a készítményben, melynek elúciós pozíciói megfelelnek a 181,1 kDa globuláris proteinének. Lásd a 9. táblázatot is.
A 6-25 kDa molekulasúlyú MePEG aldehidekkel való MGDF reduktív alkilezéssel előállított PEG 14, PEG 15 és PEG 17 mono-MePEG-MGDF konjugátumokat hasonlóképpen végezzük. Az ebben az előállításban alkalmazott fő reakcióparamétereket a 7. táblázatban foglaljuk össze.
Ezen konjugátumok HPLC SEC-analízises eredményeit a 9. táblázatban mutatjuk be.
7. táblázat
Az MGDF módosítási reakció paramétereinek összefoglalása
Kód Reaktív MePEG Reakciókörülmények
Típus MS kDa MGDF konc. mg/ml PH Hőmérséklet °C Idő óra Moláris arány MePEG/MGDF
PEG 9 NHS észter 6 2,5 8 sz.h. 0,5 15
PEG 10 NHS észter 6 2,5 8 sz.h. 0,5 10
PEG 11 NHS észter 20 2,5 8 sz.h. 0,5 10
PEG 12 NHS észter 50 2,5 8 sz.h. 0,5 5
PEG 14 ALDEHID 6 2,5 5 4 16 5
PEG 15 ALDEHID 12 2,5 5 4 16 5
HU 218 893 Β
7. táblázat (folytatás)
Kód Reaktív MePEG Reakciókörülmények
Típus MS kDa MGDF konc. mg/ml PH Hőmérséklet °C Idő óra Moláris arány MePEG/MGDF
PEG 16 ALDEHID 20 2,5 5 4 16 5
PEG 17 ALDEHID 25 2,5 5 4 16 10
PEG 18 ALDEHID 6 5 5 4 16 10
PEG 19 ALDEHID 12 5 5 4 16 10
PEG 20 ALDEHID 20 5 5 4 16 10
PEG 21 ALDEHID 25 5 5 4 16 10
8. táblázat
A poli-MePEG-MGDF SEC HPLC-vel való jellemzésének összefoglalása
Kód Reaktív MePEG Látszólagos MS SEC-kel, kDa Komponensmennyiség %
PEG 9 NHS észter 6 kDa 87,9 52,7 75 25 (kitöltés)
PEG 10 NHS észter 6 kDa 69,2 42,9 14 (kitöltés) 86
PEG 11 NHS észter 20 kDa 370,9 155,0 68 32
PEG 12 NHS észter 50 kDa 865,6 368,0 53 47
PEG 18 ALDEHID 6 kDa 84,6 41,5 60 40
PEG 19 ALDEHID 12 kDa 218,4 106,7 59 41
PEG 20 ALDEHID 20 kDa 359,4 159,3 52 47
PEG 21 ALDEHID 25 kDa 450,5 218,4 54 46
9. táblázat
A mono-MePEG-MGDF konjugátumok látszólagos molekulasúlyai
Kód Reaktív MePEG Látszólagos MW SEC-kel, kDa Látszólagos MW SDS PAGE-val, kDa
Típus MS
PEG 14 ALDEHID 6 kDa 44,5 27,7
PEG 15 ALDEHID 12 kDa 104,7 38,3
PEG 16 ALDEHID 20 kDa 181,1 46,9
PEG 17 ALDEHID 25 kDa 226,4 55,5
12.4. A DiMePEG (12 kDa)-MGDF konjugátumok MGDF metoxi-polietilénglikol aldehiddel (PEG 22) való reduktív alkilezésével történő előállítása A következőkben bemutatott eljárás egy, a PEG 22ként hivatkozott tisztított molekulát eredményez.
Metoxi-polietilénglikol aldehid (MePEG; azaz OHC-(CH2)2O-(CH2-CH2O)n-CH3 (ahol n=egy olyan ismétlődés, mely egy körülbelül 12 kDa méretű molekulasúlyt eredményez) (Shearwater Polimers) 560 szőrös feleslegben levő mennyiségét adjuk 100 mM
HU 218 893 Β nátrium-acetátban levő (pH 5,0) MGDF (E. coli-extáetű, 1-163) 2,5 mg/ml oldatához 5 °C hőmérsékleten.
Tíz percig tartó keverés után megfelelő mennyiségű nátrium-ciano-bór-hidridet (Aldrich) adunk hozzá, hogy a reakcióelegyben 20 mM koncentrációt kap- 5 junk.
Ezt az elegyet megközelítően 16 órán keresztül keverjük megközelítően 5 °C hőmérsékleten. Ekkor megfelelően tisztított vizet, USP-t adunk hozzá, az MGDF koncentrációjának 1 mg/ml értékre való állítása céljából. Ezt egy 0,2 mikronos vákuumszűrőn szüljük át.
A reakciótennék 90 mg mennyiségét ily módon állítjuk elő. 1,0 M monobázikus foszfát és 1 N nátrium-hidroxid-oldatok kis mennyiségeit adjuk ezután a reakció termék elegyéhez egy 10 mM foszfát (pH=6,8) oldat el- 15 érése céljából.
A konjugátumot egy kationcserés oszlopon tisztítjuk. Egy 40 ml SP-Sepharose HPLC-oszlopot készítünk 7,5 cm magas töltettel. Az oszlopot 10 mM foszfát, pH=6,8,15% glicerollal készített ekvilibrációs puf- 20 ferrel ekvilibráljuk. Az oszlopra 2,2 mg/ml gyantát helyezünk 0,15 oszloptérfogat (CV)/perc mennyiségben.
Ezt az ekvilibrációs puffenel való mosás követi addig, míg az alapvonalat elérjük. Az oszlopot 10 oszloptérfogat A puffer (20 mM foszfát, pH = 7,2 15% glicerollal) 25 - B puffer (A puffer plusz 0,3 M NaCl) lineáris gradiensével. Az átfolyási sebességet 0,15 CV/perc értéken tartjuk. Az eluenst 280 nm hullámhosszon nyomon követjük.
Az SDS-PAGE géleken a frakciókat megfuttatjuk, és a DiPEG konjugátumot tartalmazókat összegyűjtjük és egy 0,2 mikronos egységen keresztülszűrjük.
13. példa
A pegilált MGDF-molekulák biológiai aktivitása
A) PEG 9-PEG12 és PEG 14-PEG 21
A rekombináns humán MGDF-molekulával kezelt egerek trombocitaszámát megmérjük és az eredménye10 két a 18. ábrán mutatjuk be. A fenti ábrák esetében leírt koncentrációban levő CHO-eredetű 22-353 (üres csillag), nem pegilált E. coli 22-184 (üres körök) és a pegilált E. coli 22-184 (sötét körök) MGDF-molekulákat szubkután módon normál Balb/c egerekbe injekciózzuk naponta egyszer 5 napon keresztül. Tesztvért gyűjtünk a farokvénán ejtett kis laterális vágásból az utolsó injektálás után 24 órával. A vérsejtanalízist egy Sysmex elektronikus vérsejt-analizátorral (Baxter Diagnostics, Inc. Irvine, CA) végezzük el. Az adatokat 4 állat átlag meghatározásaival képviseltetjük az átlag ± standard hibájával. Ez a kezelés a többi vérsejtparamétert, mint például a teljes fehérvérsejtszámot vagy a vörösvérsejtszámot nem befolyásolja.
A fentiek szerint további rekombináns humán MGDF-formákat is tesztelünk. Az 50 pg/kg/nap vagy 10 pg/kg/nap megadott r-HuMGDF formákkal kezelt egerek trombocitaszámát az alábbiakban bemutatott 10. táblázatban foglaljuk össze. Az adatok 4 állat átlagát képviselik, a standard hibákat dőlt betű jelzi.
10. táblázat
Forma 50 pg/kg/nap 10 pg/kg/nap
Átlag (n=4) sem Átlag (n=4) sem
CHO 22-353 4343 309 2571 80
E. coli 22-184 2021 29 1439 18
PEG 9 2728 56 2369 34
PEG 10 2431 291 1556 126
PEG 11 3778 59 1861 73
PEG 12 3885 156 1740 88
PEG 14 3567 80 2020 63
PEG 15 4402 57 2834 99
PEG 16 4511 239 3215 11
PEG 17 4140 188 3113 261
PEG 18 4586 59 2931 129
PEG 19 3980 330 4189 80
PEG 20 3942 285 3054 339
PEG 21 4195 145 4002 91
ALAPVONAL 939 25
Kulcs a 10. táblázathoz
A következőkben a pegilált MGDF-molekula az E. co/Z-ból származó MGDF-11 (22-184 aminosavak, a 60 jelpeptid vagy az 1-163 aminosavak kezdetétől számozva, az érett protein kezdetétől számozva), ahogy a fenti 12. példában leírásra került.
HU 218 893 Β
Név Pegilálás A PEG átlagos MS-a Reaktív PEGmolekula a szintézishez
PEG 9 polipegilált 6 kDa az MePEG NHS észtere
PEG 10 polipegilált 6 kDa az MePEG NHS észtere
PEG 11 polipegilált 20 kDa az MePEG NHS észtere
PEG 12 polipegilált 50 kDa az MePEG NHS észtere
PEG 14 monopegilált 6 kDa az MePEG NHS aldehidje
PEG 15 monopegilált 12 kDa az MePEG NHS aldehidje
PEG 16 monopegilált 20 kDa az MePEG NHS aldehidje
PEG 17 monopegilált 25 kDa az MePEG NHS aldehidje
PEG 18 polipegilált 6 kDa az MePEG NHS aldehidje
PEG 19 polipegilált 12 kDa az MePEG NHS aldehidje
PEG 20 polipegilált 20 kDa az MePEG NHS aldehidje
PEG 21 polipegilált 25 kDa az MePEG NHS aldehidje
Az alapvonalszámok az olyan normális állatok esetében kapott adatok, melyek semmilyen kezelést nem kaptak.
Egyértelmű, hogy a rekombináns humán MGDF nincs káros hatással a molekula azon képességére, hogy recipiens állatokban növelje a trombocitaszámot, valamint valójában növelheti a 22-184 E. coli termék aktivitását, hogy az a CHO-eredetű 22-353 molekula esetében látható mértékű vagy akár nagyobb legyen.
B) PEG 22
A PEG 22 eredményeit a 24. ábrán mutatjuk be. Megjegyzendő, hogy a trombocitaszám PEG 22-vel való normalizálása néhány nappal hamarabb következik be, mint a teljes hosszúságú CHO-eredetű MGDFfel, a PEG 16-tal vagy a PEG 17-tel való normalizálás után.
14. példa
A rekombináns humán MGDF [1-163] E. coliban való expresszálása
Az r-HuMGDF E. coli-ban való expresszálásához az érett protein első 163 aminosavát kódoló szekvenciát kémiailag szintetizáljuk optimális E. coli kodonokat használva. Továbbá, a metionin- és lizin-aminosavakat kódoló szekvenciákat hozzáadjuk a gén 5’-végéhez. Ezért az ezen szekvencia által kódolt r-HuMGDF-protein 165 aminosav hosszúságú és Met-Lys-zel kezdődik. Ezen gén szekvenciáját a 25. ábrán mutatjuk be.
Az r-HuMGDF (1-163) gén szintézisét több lépésben valósítjuk meg. Először a gén szomszédos fragmentjeit képviselő komplementer oligonukleotidokat (60-70 bázispár hosszúságú) szintetizáljuk kémiai úton optimális E. coli kodonokat használva. Ezen szintézis alatt a metionin- és lizin-aminosavakhoz való kodonokat az érett gén 5’-végéhez helyezzük, és egy stopkodont helyezünk a gén 3’-végére. Továbbá, a Xbal és HindlII restrikciós enzimek hasítási helyeit sorrendben a gén legtávolabbi 5’- és 3’-végeihez illesztjük, valamint egy szintetikus riboszóma-kötőhelyet helyezünk megfelelő távolságra upstream irányba a kezdő metionintól. Másodszor az egyes génífagmentek komp20 lementer oligonukleotidjait anneáljuk. Harmadszor ezeket az egyéni szintetikus génfragmenteket polimeráz láncreakcióval amplifikáljuk. Negyedszer az amplifikált fragmenteket egy megfelelő vektorba szubklónozzuk. Ötödször a szubklónozott fragmentek szekvenciáit ellenőrizzük. Hatodszor az egyes fragmenteket egymáshoz Egáljuk és egy megfelelő vektorba szubklónozzuk, ami a teljes hosszúságú r-HuMGDF (1-163) gént eredményezi. Végül, a rekonstruált gén szekvenciáját ellenőrizzük.
A szintetikus r-HuMGDF génfragment - melyeket az 5’- és a 3’-végeken sorrendben Xbal és HindlII restrikciós helyek fognak közre, egy riboszóma-kötőhelyet, az ATG startkodont, az érett Met-Lys r-HuMGDFproteint kódoló szekvenciát és egy stopkodont tartal35 máz.
A fenti fragmentet a laktózindukálható expressziós vektor, a pAMGll, Xbal és HindlII helyeire klónozzuk. A pAMGll vektor egy kis kópiaszámú plazmid, mely egy pR.100 eredetű replikációs origóval rendelke40 zik. A pAMGll expressziós plazmid a pCFM1656 plazmidból származtatható (1994. február 24-én deponálták, ATCC #69576 számon) egy sor hely irányította bázisváltoztatás révén, melyet PCR-átfedő oligo-mutagenezissel valósítunk meg. A PcopB plazmid repliká45 ciós promotertől közvetlenül 5’ irányban levő BglII hellyel kezdve (#180 plazmidbázispár) a plazmidreplikációs gének felé haladva a bázispárváltozások a következők:
Táblázat
pAMGll bp# A pCFM 1656-ban levő bp bp-ra változtatás a pAMGll-ben
#204 T/A C/G
#428 A/T G/C
#509 G/C A/T
#617 - két G/C bp inzert
#679 G/C T/A
#980 T/A C/G
HU 218 893 Β
Táblázat (folytatás)
pAMGll bp# A pCFM 1656-ban levő bp bp-ra változtatás a pAMGl 1-ben
#994 G/C A/T
#1004 A/T C/G
# 1007 C/G T/A
#1028 A/T T/A
#1047 C/G T/A
#1178 G/C T/A
# 1466 G/C T/A
#2028 G/C bp deléció
#2187 C/G T/A
#2480 A/T T/A
# 2499-2502 AGTG TCAC GTCA CAGT
pAMGl 1 bp# A pCFM 1656-ban levő bp bp-ra változtatás a pAMGl 1-ben
#2642 TCCGAGC AGGCTCG bp deléció
#3435 G/C
#3446 G/C A/T
#3643 A/T T/A
#4489-4512 inzert bp-ok GAGCTCACTAGT GTCGACCTGCAG CTCGAGTGATCA CAGCTGGACGTC
(30., 31. számú szekvenciák) valamint az egyedi AatlI és Clal restrikciós helyek közötti DNS-szekvencia az alábbiakban bemutatott oligo20 nukleotidokkal való helyettesítésével:
AatlI (#4358)
5’ CTCATAATTTTTAAAAAATTCATTTGACAAATGCTAAAATTCTT3’ TGCAGAGTATTAAAAATTTTTTAAGTAAACTGTTTACGATTTTAAGAA-GATTAATATTCTCAATTGTGAGCGCTCACAATTTAT 3’ -CTAATTATAAGAGTTAACACTCGCGAGTGTTAAATAGC 5’
Clal (#4438) (32., 33. számú szekvenciák)
A pAMGl 1-be klónozott r-HuMGDF expresszióját mint amilyen a Ps4, mely a következő szekvenciával egy szintetikus laktóz által indukált promoter irányítja, rendelkezik:
5’ GACGTCTCATAATTTTTAAAAAATTCATTTGACAAATGCTAAA-ATTCTTGATTAATATTCTCAATTGTGAGCGCTCACAATTTATCGAT 3’ (34. számú szekvencia)
A Ps4 promotert a laktóz represszor (Laci) az E. coli fermentorba juttatjuk. Az eljárás batch fázisát addig lacl génjének terméke represszálja. folytatjuk, míg a tenyészet eléri az 5,0±1,0 optikai
A pAMG 11-r-HuMGDF plazmidot utólag egy E. denzitás értéket 600 nm hullámhosszon mérve. Ekkor coli K-12 törzsbe transzformáljuk, mely a lacU alléit 40 tartalmazza. A lacU alléi egy a lacl promoteren belüli olyan mutáció, mely növeli a Laci expresszióját, és a protein Ps4 promoterből való expressziójának sokkal szigorúbb szabályozását eredményezi. Ezért ebben a törzsben laktóz hiányában az r-HuMGDF expresz- 45 szióját a Laci represszálja. Laktóz hozzáadásával a Ps4 promoter operátor helyéhez kötődő Laci protein redukálódik, és a Ps4 promoterből az r-HuMGDF transzkripciója megkezdődik. Az ezen példában alkalmazott E. coli gazdasejtet 1994. november 30-án deponáltuk 50 ATCC #69717 számon.
Az ATCC #69717 számú E. coli gazdát a pAMGl 1r-HuMGDF plazmiddal transzformáljuk és a következő fermentációs leírás szerint szaporítjuk. Az E. coli törzset Luria táplevesbe inokuláljuk, majd 30 °C hőmérsékleten körülbelül 12 óráig inkubáljuk. A sejteket ezután aszeptikusán a batch tápközeget (20 g/1 élesztőkivonat, 3,4 g/1 citromsav, 15 g/1 K2HPO4, 15 ml Dow P2000, 5 g/I glükóz, 1 g/I MgSO4.7H2O, 5,5 ml/1 fém nyomelem oldat, 5,5 ml/1 vitaminoldat) tartalmazó elkezdjük a fed-batch fázist az első töltet tapközeg (700 g/1 glükóz, 6,75 g/1 MgSO4.7H2O) adagolásának megkezdésével. A táplálási sebességet minden második órában egy meghatározott terv szerint állítjuk. A második töltet tápközeg (129 g/1 triptikáz pepton, 258 g/1 élesztőkivonat) hozzáadását akkor kezdjük, amikor a tenyészet optikai denzitása 600 nm hullámhosszon eléri a 10-25 értéket. A második töltet tápközeg adagolását egy állandó folyásos sebességen tartjuk, míg az első töltet tápközeg adagolását továbbra is állítjuk. A teljes fermentáció alatt körülbelül 30 °C hőmérsékletet tartunk fenn. A tenyészetet körülbelül 7 pH-értéken tartjuk szükség esetén sav és bázis hozzáadásával. A kívánt oldott oxigén szintet a rázatás és levegő input (bejuttatás) és oxigén input sebességek állításával tartjuk fenn a fermentorban. Amikor a tenyészet optikai denzitása eléri 600 nm hullámhosszon mérve az 57-63 értéket, a harmadik töltet tápközeg adagolását is megkezdjük. A harmadik töltet tápközeget (300 g/1 laktóz) állandó sebességgel juttatjuk a fermentorba; az első töltet tápközeg adagolását abbahagyjuk és a máso32
HU 218 893 Β dik töltet tápközeg adagolási sebességét egy új állandó értékre állítjuk. A fermentáció körülbelül a harmadik töltet tápközeg hozzáadása után 10 óráig tart. A fermentáció végén a tenyészetet 15±5 °C hőmérsékletre hűtjük. A sejteket centrifügálással összegyűjtjük. A kapott masszát csomagoljuk és -60 °C hőmérsékletnél kisebb hőmérsékleten tároljuk.
A fentiek szerint E. coliban előállított rekombináns MGDF tisztítását az alábbiak szerint végezzük el. A sejtmassza 1800 g mennyiségét 18 liter 10 mM EGTA-ban feloldjuk és egy nagynyomású homogenizátoron átengedjük 15 000 psi értéken. A feltárt sejtszuszpenziót centrifügáljuk és a pelletet 10 liter 10 mM EDTA-ban reszuszpendáljuk. A szuszpenziót centrifügáljuk és 200 g pelletet feloldunk 2 liter 10 mM Tris, 8 M guanidin-hidroklorid, 10 mM DTT, 5 mM EDTA elegyében (pH=8,7). Ezt az oldatot 10 mM CAPS, 3 M karbamid, 30% glicerol, 3 mM cisztamin, 1 mM cisztein elegyében (pH=10,5) lassan 200 literre hígítjuk.
A hígított oldatot lassan 16 órán keresztül keverjük szobahőmérsékleten és a pH-értéket 6,8-re állítjuk. A pH-állított oldatot tisztítjuk és egy 2 literes CM Sepharose oszlopra helyezzük, melyet előzőleg 10 mM nátrium-foszfát, 1,5 M karbamid, 15% glicerol 6,8 pHértékű elegyével ekvilibráltunk. A felvitel után az oszlopot 10 mM nátrium-foszfát, 15% glicerol 7,2 pH-értékű elegyével mossuk. Az MGDF-molekulát 0-0,5 M nátrium-klorid, 10 mM nátrium-foszfát 7,2 pH-értékű elegyének gradiensével eluáljuk.
A CM eluátumot koncentráljuk és a puffer cseréljük 10 mM nátrium-foszfáttal (pH 6,5) egy 10 000 molekulasúly résméretű membránnal. A koncentrált oldatot körülbelül 2 mg/ml koncentrációban katepszin C-vel (500:1 moláris arány) kezeljük 90 percig környezeti hőmérsékleten.
Az oldatot ezután egy 1,2 literes SP HP Sepharose oszlopra helyezzük, melyet 10 mM nátrium-foszfát, 15% glicerol 7,2 pH-értékű elegyével előzetesen ekvilibráltunk. A felvitel után az MGDF-t 0,1-0,25 M nátrium-klorid, 10 mM nátrium-foszfát gradiensével eluáljuk (pH=7,2).
Ammónium-szulfátot adunk 0,6 M-ig, az SP HP oszlopból származó eluátumhoz. Az eluátumot egy 1,6 literes Phenyl Toyopearl oszlopra helyezzük, melyet előzőén 10 mM nátrium-foszfát, 0,6 M ammónium-szulfát 7,2 pH-értékű elegyével ekvilibráltunk. Az MGDF-csúcsot 0,6-0 M ammónium-szulfát, 10 mM nátrium-foszfát gradiensével eluáljuk (pH=7,2).
A Phenyl Toyopearl eluátumot koncentráljuk és puffercserének vetjük alá egy 10 000 molekulasúly résméretű membránnal 10 mM Tris, 5% szorbitol 7,5 pH-értékű elegyébe.
15. példa
Az r-HuMGDF (E. coli 1-163) in vivő biológiai tulajdonságai
A fenti 14. példában leírtak szerint előállított rHuMGDF (£. coli 1-163) molekulát rágcsálókban értékeljük biológiai hatékonyságuk szempontjából. Normális Balb/c egereket injektálunk szubkután módon 5 egymást követő napon r-HuMGDF növekvő dózisaival. A dózisok 15 pg/kg/nap érték és 1500 pg/kg/nap érték között vannak. Az utolsó injektálás után 4 órával a vérsejt számokat mérjük elektronikus sejtszámlálót (Sysmex, Baxter) használva. A trombocitaszámban lineáris növekedést figyelünk meg a citokinlogaritmikusan növekvő koncentrációival. Ha a rendszerben 1500 pg/kg/nap citokin van, a trombociták száma az alapérték 300%-ára nő. A többi vérsejtparamétert - mint például a fehér- és a vörösvérsejtszámot vagy a hematokritértéket - ez a kezelés nem befolyásolja.
A trombocitákat a 300 pg/kg/nap r-HuMGDF (E. coli 1 -163) hat napig szubkután injektált patkányokból összegyűjtjük, és vizsgáljuk azon képességüket, hogy aggregálódnak-e az ADP-re való válaszként. Az adatok azt jelzik, hogy a kezelt állatokból származó trombociták gyakorlatilag megkülönböztethetetlenek a kontrollállatokból származó trombocitáktól abból a szempontból, hogy mindkét populáció egyformán érzékeny a trombocitaagonista ADP-vel szemben.
Az r-HuMGDF-eket azon képességükre is vizsgáljuk, hogy képesek-e feloldani a kemoterápiával és/vagy besugárzással kapcsolatos thrombocytopeniát. Az emberekben erős thrombocytopeniát okozó kemoterapeutikum karboplatint használjuk fel ezekhez a vizsgálatokhoz. Balb/c egereket injekciózunk szubkután 1,25 mg karboplatinnal a vizsgálat elején. 24 óra múlva az egereket naponta 100 pg/kg/nap r-HuMGDF-fel (E. coli 1-163) injektáljuk vagy hatásjavítóval a vizsgálat többi részén. A 9. napra a trombocitaszám durván 15%ra csökken a normál hatásjavítóval kezelt egerekben, azonban alapvonal szinten marad az r-HuMGDF-fel kezelt egerek esetében (lásd a 20. ábrát). A besugárzásos vizsgálatokhoz az egereket 500 rád egyszeri gammabesugárzásnak (céziumforrás) vetjük alá. Ez egy olyan szubletális dózis, mely 90%-os trombocitaszám-csökkenést okoz all. napra. A trombocitaszám nem tér vissza a normális értékre a 21. napig. Ha r-HuMGDF-et (E. coli 1-163) adunk naponta egyszer 100 pg/kg/nap dózisban a besugárzott egereknek az 1. naptól kezdve a 20. napig a trombocitaszám-csökkenés nem olyan komoly és az alapvonalszintre való visszaállás sokkal gyorsabb, mint a hatásjavítóval kezelt egerek esetében (21. ábra). Az r-HuMGDF extrém és meghosszabbított thrombocytopeniás modellben való teszteléséhez karboplatint és besugárzást alkalmaztunk együttesen. Ilyen körülmények mellett a trombocitaszám kiemelkedően alacsony értékre csökken (a normál érték 3-5%-ára), és az állatok többsége (8-ból 7) nem éli túl a kezelést. Azonban ha ezeket az állatokat naponta 100 pg/kg/nap dózisban szubkután módon r-HuMGDF-fel injektáljuk a vizsgálat teljes ideje alatt, a thrombocytopenia jelentősen javítható, az alapvonalértékre való visszaállás sokkal gyorsabb, és az összes r-HuMGDF-fel kezelt állat (8-ból 8) túléli a vizsgálatot.
Az r-HuMGDF-et rhesusmajmokban is vizsgáljuk. A normális rhesusmajmokat szubkután 2,5 vagy 25 pg/kg/nap dózisban injektáljuk 10 napig (0-9. nap). Az alacsonyabb dóziscsoportban a trombociták száma 400%-kal nő a 12. napon, és a magasabb dóziscso33
HU 218 893 Β portban szintén a 12. napon 700%-os a növekedés. Az injektálás leállítása után a trombociták száma visszatér a normális szintre a 25-30. napra. A fehérvérsejtek és a vörösvértestek számát nem befolyásolja ez a kezelés.
Az r-HuMGDF (£. coli 1-163) súlyos thrombocytopeniás főemlős modellben is tesztelésre kerül (23. ábra). Az állatokat besugározzuk (700 rád, kobaltforrás), ez a 15 napon a normál érték 1-2-%-ára csökkent trombocitaszám-csökkenést eredményez. A 35-40. napra a trombociták száma visszatér a normális értékre. Ezzel szemben a naponta 25 pg/kg/nap dózisú r-HuMGDF kezelést kapó besugárzott állatok trombocitaszáma a normál érték csupán 10%-ára csökken, és átlagban nem megy 20 000 pl érték alá, ez a határérték thrombocytopeniás emberekben a trombocitatranszfúzióhoz. Az alapvonalértékekre való visszaállás is sokkal gyorsabb az r-HuMGDF-fel kezelt állatok esetében, a 20. napon következik be.
Ezek a rágcsáló- és főemlősmodellekből származó in vivő adatok teljes mértékben alátámasztják azt a koncepciót, miszerint az r-HuMGDF (£. coli 1-163) lehetséges terápiás anyag azzal a kapacitással, hogy szignifikánsan képesek befolyásolni a klinikailag idetartozó thrombocytopeniát.
16. példa
Az r-HuMGDF 1-332 CHO-sejt-tenyészetben való termelése
Egy megfelelő promoter szabályozása alatt álló és egy amplifikálható szelekciós marker, a DHFR-t kódoló génhez kapcsolt MGDF 1-332 kódoló cDNS-t expresszáló transzfektált kínaiaranyhörcsög-ováriumsejtekből glikolizált r-Hu MGDF 1-332-t állítunk elő. Az MGDF CHO-sejtekben való expresszálásához való megfelelő promoter az SR-alfa. Lásd Mól. Cell. Bioi. 8:466-472 (1988) és WO 91/13160 (1991). A CHOsejtekben való MGDF-expresszióhoz a megfelelő vektor a pDSR-alfa2 plazmid. Lásd a WO 90/14363 (1990) szabadalmat. Az MGDF egy tipikus sejtvonalban való termeléséhez egy tenyészet kiterjeszthető szuszpenzióban vagy szövettenyésztő edényben való passzálással adherens szaporítási móddal, a szelekciós nyomás biztosítása céljából 15-10% magzati boíjúszérummal (FBS) vagy dializált magzati borjúszérummal és metotrexáttal (MTX) (ha szükséges; az MTX tipikus koncentrációja 200-600 nM) kiegészített egyenlő arányú Dulbeccoféle módosított Eagle-féle tápközeget (DMEM) és Ham-féle F12 tápközeget (DMEM/F12 Gibco) használva. Ezt a tápközeget ki kell egészíteni extra nem esszenciális aminosavakkal (NEAA) és glutaminnal. A szuszpenziós tenyészetek gyorsan szaporodhatnak 1-4χ 105 sejt/ml inokulációs (hasadási) és körülbelül 1 χ 106 maximális denzitásértékek között, ezen a ponton a tenyészetek kibővíthetők nagy térfogatokká való hígítással, ahol a kezdeti sejtdenzitás a specifikált hasítási denzitási értéken van.
Az MGDF forgólombikokban való termeléséhez egy megfelelő térfogatú és celluláris denzitású szuszpenzió tenyészetet kell létrehozni vagy mágneses keverővei kevert keverőtartályokat használva, melyeket egy hőmérséklet-szabályozott környezetbe (37±1 °C) helyezünk, vagy egy felszerelt, szabályozott, kevert tartályú bioreaktor-rendszerben. A forgólombikokat (mint amilyen a 850 cm2 Falcon-forgólombik) 1,5-3xlO7 sejt/lombik kezdeti denzitással oltjuk, és további szaporodási tápközeget (5-10% FBS-sel, lxNEAA-val és 1 χ L-glutaminnal kiegészített DMEM/F12) adunk hozzá olyan mennyiségben, mely 3-4 nap alatt egy konfluens monoréteg kialakításához megfelelő (150-300 ml/lombik). A szaporító tápközeget egy megfelelő módon pufferelni kell nátrium-bikarbonáttal 6,9-7,2 pH-értékre, szén-dioxiddal egyensúlyban 60-90 mmHg parciális nyomáson. A lombikokat 10% CO2/levegővel levegőztetni kell, és forgó tartókon (körülbelül 1 rpm) kell inkubálni 37 ±1 °C hőmérsékleten 3-4 napig. Konfluenciánál a forgólombikokat szérummentes termeltető tápközegre kell átállítani a szaporító tápközeg leöntésével vagy elpárologtatásával; a lombikok izotóniás pufferrel, mint például 50-100 ml/lombik mennyiségű Dulbecco-féle foszfátpufferelt sóoldattal (D-PBS) való mosásával; ezután megfelelő térfogatú bikarbonát-pufferelt, 1:1 arányú, 200-300 ml/lombik mennyiségű szérummentes, NEAA-val és L-glutaminnal és 1 -20 NM réz-szulfáttal - a kovalens aggregáció csökkentése céljából - kiegészített DMEM/F12 tápközeget adunk hozzá. A lombikokat 10% CO2/levegővel át kell áramoltatni és 6±1 napig 37±1 °C hőmérsékleten inkubáljuk forgó tartókon (körülbelül 1 rpm), vagy addig, amíg a metabolikus aktivitás a glükózszintet 0,5 g/liter és/vagy a pH-szintet 6,6 érték alá viszi. A kondicionált tápközeget a lombikokból való leöntéssel vagy aspirációval összegyűjtjük, és friss szérummentes termelési tápközeggel helyettesítjük, a fent leírtak szerint, a további összegyűjtéshez. Ez a folyamat addig ismételhető, amíg a sejtek fenn tudják tartani a szérummentes termelést és leválnak a lombikról.
Az összegyűjtött kondicionált tápközeg feldolgozható a tisztításhoz zárt végű mikroszűréssel egy 0,45 pm és/vagy 0,2 pm szűrőkkel (Sartorius Sartoban pH vagy Pali). A szűrt, kondicionált tápközeget 4 °C hőmérsékletre kell hűteni, és vagy 4 °C hőmérsékleten kell tárolni, vagy azonnal koncentrálni és alacsony ionerősségű eleggyé kell dializálni egy keresztfolyású ultraszűrőrendszert (például Filtron YM50) használva. Az ultraszűrés és a diafiltráció is 4 °C hőmérsékleten kell történjen a proteindegradáció minimalizálása céljából. A kondicionált tápközeg egy puffereit vizes oldattal dializálandó (például 10 mM kálium-foszfáttal, melynek pH-értéke 6,8), a kromatográfiás tisztítási lépések előtt.
A kondicionált tápközegben a termék minősége akkor követhető nyomon legjobban, ha nem redukáló SDS-PAGE Western lenyomatokat használunk, ami felfedheti az aggregált, monomer és proteolitikusan hasított MGDF-molekulák mintákban levő relatív mennyiségét.
A CHO-sejtekből való MGDF-termelésre szolgáló másik módszer azt jelentené, hogy egy, az MGDF-molekulát expresszáló sejtvonalat egy szérummentes tápközeghez, mint például a Gibco S-SFM II adaptálunk. A sejtek adaptálhatók olyan tápközegbe való sorozatos
HU 218 893 Β átoltással, mely minimális mennyiségű szérumkiegészítést, vagy semmilyen szérumkiegészítést nem tartalmaz. Ha úgy látszik, hogy egy sejtvonal ilyen tápközegben fenntartja a szaporodását, mialatt megfelelő mennyiségű szekretált MGDF-molekulát termel, a termelés folytatható egy inokulumtenyészet léptéknövelésével sorozatos átoltáson keresztül növekvő tenyésztérfogatokban, majd pedig egy megfelelő termelőtartály (egy műszerezett, szabályozott, kevert tartályú bioreaktor) inokulálható, és a tenyészet optimális szaporodási körülmények között (pH, tápanyagok, hőmérséklet, oxigén, áramlás) szaporítható maximális életképes sűrűségig. Az optimális termelési pontnál (ezt kísérleti úton határozzuk meg a termék mennyiségének és minőségének mérésével) a tenyészet összegyűjthető a bioreaktorból, és a sejtek eltávolíthatók a kondicionált tápközegből mikronbeosztású mélységi szűréssel vagy szubmikron keresztáramlásos mikroszűréssel. Ha mélységi szűrést alkalmazunk, a tápközeg a fent leírtak szerint végzett koncentráció és dialízis előtt szubmikron zárt végű szűréssel tovább tisztítandó.
Míg a jelen találmány a fentiekben általánosságban és az előnyben részesített megvalósulások szempontjából került leírásra, a tudomány e területén képzett szakemberek számára a fenti leírás fényében érthető, hogy variációk és módosulások is előfordulhatnak. Ezért az a szándékunk, hogy az igénypontok fedjék a találmány körében előforduló összes változást is, ahogy azt az igénypontokban lefektettük.
Továbbá a találmány hátterének megvilágítására idézett publikációk és egyéb anyagok, és különösen a találmány gyakorlatára vonatkozó további részletes leírások az irodalmi hivatkozás révén részét képezik a találmánynak.
SZEKVENCIALISTA (1) ÁLTALÁNOS INFORMÁCIÓ:
(i) FELTALÁLÓ: Bartley, Timothy D.
Bogenberger, Jákob M.
Ala Pro Pro Ala Xaa Asp Pro Arg 1 5
Ser His Val Leu His Xaa Arg Leu 20 (2) A 2. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI :
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZÚSÁG: 21 aminosav (B) TÍPUS: aminosav
Ala Pro Pro Ala Xaa Asp Pro Arg 1 5
Ser His Val Leu His 20 (2) A 3. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZÚSÁG: 17 aminosav (B) TÍPUS: aminosav
Bosselman, Róbert A.
Hunt, Pamela Kinstler, Olaf B.
Samal, Babru B.
(ii) A TALÁLMÁNY CÍME: A megakariocitaszaporodás és -differenciálódás stimulálására szolgáló készítmények és módszerek (iii) A SZEKVENCIÁK SZÁMA: 34 (iv) LEVELEZÉSI CÍM:
(A) CÍMZETT: Amgen Inc.
(B) UTCA: 1840 Dehavilland Drive (C) VÁROS: Thousand Oaks (D) ÁLLAM: Califomia (E) ORSZÁG: USA (F) IRÁNYÍTÓSZÁM: 91320-1789 (v) SZÁMÍTÓGÉPES LEOLVASÁSI FORMA:
(A) A HORDOZÓ TÍPUSA: Floppy disk (B) SZÁMÍTÓGÉP: IBM PC kompatibilis (C) OPERÁCIÓS RENDSZER: PC-DOS/MSDOS (D) SOFTWARE: Patentln Release #1,0 1.25 verzió (vi) A JELEN ALKALMAZÁS ADATAI:
(A) ALKALMAZÁSI SZÁM:
(B) IKTATÁSI DÁTUM:
(C) KLASSZIFIKÁCIÓ:
(viii) ÜGYVÉD/IRODA ADATAI:
(A) NÉV: Cook, Róbert R.
(B) REFERENCIA/DOKUMENTUM SZÁM: A-290-C (2) AZ 1. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZÚSÁG: 31 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: protein (xi) AZ 1. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
u Leu Asn Lys Met Leu Arg Asp 10 15 a Gin Xaa Pro Asp Ile Tyr 5 30 (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: protein (xi) A 2. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
u Leu Asn Lys Met Leu Arg Asp 10 15 (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: protein (xi) A 3. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
HU 218 893 Β
Thr Gin Lys Glu Gin Thr Lys Alá
5
Leu (2) A 4. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZÚSÁG: 17 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: cDNS (xi) A 4. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA: GCNCCNCCNG CNTGYGA 17 (2) AZ 5. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZÚSÁG: 21 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav
Alá Pro Pro Alá Cys Asp Leu Arg 1 5
Ser His Val Leu His 20 (2) A 7. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZÚSÁG: 21 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: cDNS (xi) A 7. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA: GTACGCGTTC TAGANNNNNN T 21 (2) A 8. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZÚSÁG: 21 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: cDNS (xi) A 8. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA: AGTTTACTGA GGACCTGGAG G 21 (2) A 9. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZÚSÁG: 30bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: cDNS (xi) A 9. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA: TTCGGCCGGA TAGGCCTTTT τττττγγγγγ 30 (2) A 10. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZÚSÁG: 29 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris n Asp Val Leu Gly Alá Val Alá 10 15 (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: cDNS (xi) AZ 5. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA: GCARTGYAAC ACRTGNGART C 21 (2) A 6. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZÚSÁG: 21 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: protein (xi) A 6. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Leu Ser Lys Leu Leu Arg Asp 15 (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: cDNS (xi) A 10. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA: TTCGGCCGGA TAGGCCTTTT TTTTTTTTT 29 (2) A 11. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZÚSÁG: 20 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: cDNS (xi) All. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA: TGCGACCTCC GAGTCCTCAG 20 (2) A 12. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZÚSÁG: 23 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: cDNS (xi) A 12. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA: GAGTCCTCAG TAAACTGCTT CGT 23 (2) A 13. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZÚSÁG: 20bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: cDNS (xi) A 13. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA: GGAGTCACGA AGCAGTTTAC 20 (2) A 14. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HU 218 893 Β (A) HOSSZÚSÁG: 18 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: cDNS (xi) A 14. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
CCTTTACTTC TAGGCCTG 18 (2) A 15. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZÚSÁG: 19 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: cDNS (xi) A 15. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA: GAGGTCACAA GCAGGAGGA (2) A 16. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZÚSÁG: 19 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: cDNS (xi) A 16. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA: GGCATAGTCC GGGACGTCG (2) A 17. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZÚSÁG: 19 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: cDNS (xi) A 17. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA: TCCTCCTGCT TGTGACCTC (2) A 18. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZÚSÁG: 19 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: cDNS (xi) A 18. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA: CCAGGAAGGA TTCAGGGGA (2) A 19. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZÚSÁG: 30 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: cDNS (xi) A 19. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA: CAACAAGTCG ACCGCCAGCC AGACACCCCG (2) A 20. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZÚSÁG: 24 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: cDNS (xi) A 20. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
GGCCGGATAG GCCACTCNNN NNNT 24 (2) A 21. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZÚSÁG: 21 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: cDNS (xi) A 21. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
GCARTGYAAN ACRTGNGART C 21 (2) A 22. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZÚSÁG: 16 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: cDNS (xi) A 16. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
TTGGTGTGCA CTTGTG 16 (2) A 23. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZÚSÁG: 20bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: cDNS (xi) A 23. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
CACAAGTGCA CACCAACCCC 20 (2) A 24. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZÚSÁG: 1342 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: cDNS (ix) JELLEMZŐK:
(A) NÉV/KULCS: CDS (B) LOKÁCIÓ: 99...1094 (xi) A 24. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 55
CAGGGAGCCA CGCCAGCCAA GACACCCCGG CCAGAATGGA GCTGACTGAA TTGCTCCTCG
HU 218 893 Β
TGGTCATGCT TCTCCTAACT GCAAGGCTAA CGCTGTCC AGC CCG GCT CCT CCT
Ser Pro Alá Pro Pro
5
GCT TGT GAC CTC CGA GTC CTC AGT AAA CTG CTT CGT GAC TCC CAT GTC Alá Cys Asp Leu Arg Val Leu Ser Lys Leu Leu Arg Asp Ser His Val
15 20
CTT CAC AGC AGA CTG AGC CAG TGC CCA GAG GTT CAC CCT TTG CCT ACA Leu His Ser Arg Leu Ser Gin Cys Pro Glu Val His Pro Leu Pro Thr
30 35
CCT GTC CTG CTG CCT GCT GTG GAC TTT AGC TTG GGA GAA TGG AAA ACC Pro Val Leu Leu Pro Alá Val Asp Phe Ser LeuGly Glu Trp Lys Thr
45 50
CAG ATG GAG GAG ACC AAG GCA CAG GAC ATT CTG GGA GCA GTG ACC CTT Gin Met Glu Glu Thr Lys Alá Gin Asp Ile Leu Gly Alá Val Thr Leu
60 65
113
161
209
257
305
CTG CTG GAG GGA GTG ATG GCA GCA CGG GGA CAA CTG GGA CCC ACT TGC Leu Leu Glu Gly Val Met Alá Alá Arg Gly Gin Leu Gly Pro Thr Cys
75 80 85
CTC TCA TCC CTC CTG GGG CAG CTT TCT GGA CAG GTC CGT CTC CTC CTT Leu Ser Ser Leu Leu Gly Gin Leu Ser Gly Gin Val Arg Leu Leu Leu
95 100
GGG GCC CTG CAG AGC CTC CTT GGA ACC CAG CTT CCT CCA CAG GGC AGG Gly Alá Leu Gin Ser Leu Leu Gly Thr Gin Leu Pro Pro Gin Gly Arg
105 110 115
ACC ACA GCT CAC AAG GAT CCC AAT GCC ATC TTC CTG AGC TTC CAA CAC Thr Thr Alá His Lys Asp Pro Asn Alá Ile Phe Leu Ser Phe Gin His
120 125 130
CTG CTC CGA GGA AAG GTG CGT TTC CTG ATG CTT GTA GGA GGG TCC ACC Leu Leu Arg Gly Lys Val Arg Phe Leu Met Leu Val Gly Gly Ser Thr
135 140 145
353
401
449
497
545
HU 218 893 Β
CTC TGC GTC AGG CGG GCC CCA CCC ACC ACA GCT GTC CCC AGC AGA ACC Leu Cys Val Arg Arg Alá Pro Pro Thr Thr Alá Val Pro Ser Arg Thr 150 155 160 165
TCT CTA GTC CTC ACA CTG AAC GAG CTC CCA AAC AGG ACT TCT GGA TTG Ser Leu Val Leu Thr Leu Asn Glu Leu Pro Asn Arg Thr Ser Gly Leu
170 175 180
TTG GAG ACA AAC TTC ACT GCC TCA GCC AGA ACT ACT GGC TCT GGG CTT Leu Glu Thr Asn Phe Thr Alá Ser Alá Arg Thr Thr Gly Ser Gly Leu
185 190 195
CTG AAG TGG CAG CAG GGA TTC AGA GCC AAG ATT CCT GGT CTG CTG AAC Leu Lys Trp Gin Gin Gly Phe Arg Alá Lys Ile Pro Gly Leu Leu Asn
200 205 210
CAA ACC TCC AGG TCC CTG GAC CAA ATC CCC GGA TAC CTG AAC AGG ATA Gin Thr Ser Arg Ser Leu Asp Gin Ile Pro Gly Tyr Leu Asn Arg Ile
215 220 225
CAC GAA CTC TTG AAT GGA ACT CGT GGA CTC TTT CCT GGA CCC TCA CGC His Glu Leu Leu Asn Gly Thr Arg Gly Leu Phe Pro Gly Pro Ser Arg
230 235 240 245
AGG ACC CTA GGA GCC CCG GAC ATT TCC TCA GGA ACA TCA GAC ACA GGC
Arg Thr Leu Gly Alá Pro Asp Ile Ser Ser Gly Thr Ser Asp Thr Gly
250 255 260
TCC CTG CCA CCC AAC CTC CAG CCT GGA TAT TCT CCT TCC CCA ACC CAT Ser Leu Pro Pro Asn Leu Gin Pro Gly Tyr Ser Pro Ser Pro Thr His
265 270 275
CCT CCT ACT GGA CAG TAT ACG CTC TTC CCT CTT CCA CCC ACC TTG CCC Pro Pro Thr Gly Gin Tyr Thr Leu Phe Pro Leu Pro Pro Thr Leu Pro
280 285 290
ACC CCT GTG GTC CAG CTC CAC CCC CTG CTT CCT GAC CCT TCT GCT CCA Thr Pro Val Val Gin Leu His Pro Leu Leu Pro Asp Pro Ser Alá Pro
295 300 305
593
641
689
737
785
833
881
929
977
1025
HU 218 893 Β
ACG CCC ACC CCT ACC AGC CCT CTT CTA AAC ACA TCC TAC ACC CAC TCC 1073
Thr ProTHr Pro Thr Ser Pro Leu Leu Asn Thr Ser Tyr Thr His Ser 310 315 320 325
CAG AAT CTG TCT CAG GAA GGG TAAGGTTCTC AGACACTGCC GACATCAGCA 1124
Gin Asn Leu Ser Gin Glu Gly
330
TTGTCTCGTG TACAGCTCCC TTCCCTGCAG GGCGCCCCTG GGAGACAACT GGACAAGATT 1184
TCCTACTTTC TCCTGAAACC CAAAGCCCTG GTAAAAGGGA TACACAGGAC TGAAAAGGGA 1244
ATCATTTTTC ACTGTACATT ATAAACCTTC AGAAGCTATT TTTTTAAGCT ATCAGCAATA 1304
CTCATCAGAG CAGCTAGCTC TTTGGTCTAT TTTCTGCA 1342 (2) A 25. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: 20 (i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZÚSÁG: 332 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZALTIPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: protein (xi) A 25. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA
Ser Pro Alá Pro Pro Alá Cys Asp Leu Arg Val Leu Ser Lys Leu Leu 15 10 15
Arg asp Ser His Val LEu His Ser Arg Leu Ser Gin Cys Pro Glu Val 20 25 30
His Pro Leu Pro Thr Pro Val Leu Leu Pro Alá Val Asp Phe Ser Leu 35 40 45
Gly Glu Trp Lys Thr Gin Met Glu Glu Thr Lys Alá Gin Asp Ile Leu 50 55 60
Gly Alá Val Thr Leu Leu Leu Glu Gly Val Met Alá Alá Arg Gly Gin 65 70 75 80
Leu Gly Pro Thr Cys leu Ser Ser Leu Leu Gly Gin Leu Ser Gly Gin
90 95 val Arg Leu Leu Leu Gly Alá Leu Gin Ser Leu Leu Gly Thr Gin Leu
100 105 110
Pro Pro Gin Gly Arg Thr Thr Alá His Lys Asp Pro Asn Alá Ile Phe
115 120 125
HU 218 893 Β
Leu Ser Phe Gin His Leu Leu Arg Gly Lys Val Arg Phe Leu Met Leu
130 135 140
Val Gly Gly Ser Thr Leu Cys Val Arg Arg Alá Pro Pro Thr Thr Alá 145 150 155 160
Val Pro Ser Arg Thr Ser Leu Val Leu Thr Leu Asn Glu Leu Pro Asn
165 170 175
Arg Thr Ser Gly Leu Leu Glu Thr Asn Phe Thr Alá Ser Alá Arg Thr 180 185 190
Thr Gly Ser Gly Leu Leu Lys Trp Gin Gin Gly Phe Arg ALa Lys Ile
195 200 205
Pro Gly LEu Leu Asn Gin Thr Ser Arg Ser Leu Asp Gin Ile Pro Gly
210 215 220
Tyr Leu Asn Arg Ile His Glu Leu LEu Asn Gly Thr Arg Gly Leu Phe 225 230 235 240
Pro Gly Pro Ser Arg ARg Thr Leu Gly Alá Pro Asp Ile Ser Ser Gly
245 250 255
Thr Ser Asp Thr Gly Ser Leu Pro Pro Asn Leu Gin Pro Gly Tyr Ser 260 265 270
Pro Ser Pro Thr His Pro Pro Thr Gly Gin Tyr Thr Leu Phe Pro Leu
275 280 285
Pro Pro Thr Leu Pro Thr Pro Val Val Gin Leu His Pro Leu Leu Pro
290 295 300
Asp Pro Ser Alá Pro Thr Pro Thr Pro Thr Ser Pro Leu Leu Asn Thr
305 310 315 320
Ser Tyr Thr His Ser Gin Asn Leu Ser Gin Glu Gly
325 330
HU 218 893 Β (2) A 26. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: cDNS (i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI: (ix) JELLEMZŐK:
(A) HOSSZÚSÁG: 1342 bázispár (A) NÉV/KULCS: CDS (B) TÍPUS: nukleinsav (B)LOKÁCIÓ: 99...621 (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú 5 (xi) A 26. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA (D) TOPOLÓGIA: lineáris
CAGGGAGCCCCA CGCCAGCCAA GACACCCCGG CCAGAATGGA GCTGACTGAA TTGCTCCTCG 60
TGGTCATGCT TCTCCTAACT GCAAGGCTAA CGCTGTCC AGC CCG GCT CCT CCT 113
Ser Pro Alá Pro Pro
5
GCT TGT GAC CTC CGA GTC CTC AGT AAA CTG CTT CGT GAC TCC CAT GTC 161
Alá Cys Asp Leu Arg Val Leu Ser Lys Leu Leu Arg Asp Ser His Val
15 20
CTT CAC AGC AGA CTG AGC CAG TGC CCA GAG GTT CAC CCT TTG CCT ACA 209
Leu His Ser Arg Leu Ser Gin Cys Pro Glu Val His Pro Leu Pro Thr
30 35
CCT GTC CTG CTG CCT GCT GTG GAC TTT AGC TTG GGA GAA TGG AAA ACC 257
Pro Val Leu Leu Pro Alá Val Asp Phe Ser Leu Gly Glu Trp Lys Thr
45 50
CAG ATG GAG GAG ACC AAG GCA CAG GAC ATT CTG GGA GCA GTG ACC CTT 305
Gin Met Glu Glu Thr Lys Alá Gin Asp Ile Leu Gly Alá Val Thr Leu
60 65
CTG CTG GAG GGA GTG ATG GCA GCA CGG GGA CAA CTG GGA CCC ACT TGC 353
Leu Leu Glu Gly Val Met Alá Alá Arg Gly Gin Leu Gly Pro Thr Cys 70 75 80 85
CTC TCA TCC CTC CTG GGG CAG CTT TCT GGA CAG GTC CGT CTC CTC CTT 401
Leu Ser Ser Leu Leu Gly Gin Leu Ser Gly Gin Val Arg Leu Leu Leu
95 100
GGG GCC CTG CAG AGC CTC CTT GGA ACC CAG CTT CCT CCA CAG GGC AGG 449
Gly Alá Leu Gin Ser Leu Leu Gly Thr Gin Leu Pro Pro Gin Gly Arg
105 110 115
HU 218 893 Β
ACC ACA GCT CAC AAG GAT CCC AAT GCC ATC TTC CTG AGC TTC CAA CAC 497
Thr Thr Alá His Lys Asp Pro Asn Alá He Phe Leu Ser Phe Gin His
120 125 130
TG CTC CGA GGA AAG GTG CGT TTC CTG ATG CTT GTA GGA GGG TCC ACC 545
Leu Leu Arg Gly Lys Val Arg Phe Leu Met Leu Val Gly Gly Ser Thr
135 140 145
CTC TGC GTC AGG CGG GCC CCA CCC ACC ACA GCT GTC CCC AGC AGA ACC 593
Leu Cys Val Arg Arg Alá Pro Pro Thr Thr Alá Val Pro Ser Arg Thr
150 155 160 165
TCT CTA GTC CTC ACA CTG AAC GAG CTC C CAAACAGGAC TTCTGGATTG 641
Ser Leu Val Leu Thr Leu Asn Glu Leu
170
TTGGAGACAA ACTTCACTGC CTCAGCCAGA ACTACTGGCT CTGGGCTTCT GAAGTGGCAG 701
CAGGGATTCA GAGCCAAGAT TCCTGGTCTG CTGAACCAAA CCTCCAGGTC CCTGGACCAA 761
ATCCCCGGAT ACCTGAACAG GATACACGAA CTCTTGAATG GAACTCGTGG ACTCTTTCCT 821
GGACCCTCAC GCAGGACCCT AGGAGCCCCG GACATTTCCT CAGGAACATC AGACACAGGC 881
TCCCTGCCAC CCAACCTCCA GCCTGGATAT TCTCCTTCCC CAACCCATCC TCCTACTGGA 941
CAGTATACGC TCTTCCCTCT TCCACCCACC TTGCCCACCC CTGTGGTCCA GCTCCACCCC 1001
CTGCTTCCTG ACCCTTCTGC TCCAACGCCC ACCCCTACCA GCCCTCTTCT AAACACATCC 1061
TACACCCACT CCCAGAATCT GTCTCAGGAA GGGTAAGGTT CTCAGACACT GCCGACATCA 1121
GCATTGTCTC GTGTACAGCT CCCTTCCCTG CAGGGCGCCC CTGGGAGACA ACTGGACAAG 1181 ATTTCCTACT TTCTCCTGAA ACCCAAAGCC CTGGTAAAAG GGATACACAG GACTGAAAAG 1241
GGAATCATTT TTCACTGTAC ATTATAAACC TTCAGAAGCT ATTTTTTTAA GCTATCAGCA 1301
ATACTCATCA GAGCAGCTAG CTCTTTGGTC TATTTTCTGC A 1342 (2) A 27. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: 45 (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI: (D) TOPOLÓGIA: lineáris (A) HOSSZÚSÁG: 174 aminosav (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: protein (B) TÍPUS: aminosav (xi) A 27. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA
Ser Pro Alá Pro Pro Alá Cys Asp Leu Arg Val Leu Ser Lys Leu Leu
5 10 15
Arg Asp Ser His Val Leu His Ser Arg Leu Ser Gin Cys Pro Glu Val
25 30
HU 218 893 Β
His Pro Leu Pro Thr Pro Val Leu Leu Pro Alá Val Asp Phe Ser Leu
40 45
Gly Glu Trp Lys Thr Gin Met Glu Glu Thr Lys Alá Gin Asp Ile Leu 50 55 60
Gly Alá Val Thr Leu Leu Leu Glu Gly Val Met Alá Alá Arg Gly Gin 65 70 75 80
Leu Gly Pro Thr Cys Leu Ser Ser Leu Leu Gly Gin Leu Ser Gly Gin
90 95
Val Arg Leu Leu Leu Gly Alá Leu Gin Ser Leu Leu Gly Thr Gin Leu
100 105 110
Pro Pro Gin Gly Arg Thr Thr Alá His Lys Asp Pro Asn Alá Ile Phe
115 120 125
Leu Ser Phe Gin His Leu Leu Arg Gly Lys Val Arg Phe Leu Met Leu
130 135 140
Val Gly Gly Ser Thr Leu Cys Val Arg Arg Alá Pro Pro Thr Thr Alá 145 150 155 160
Val Pro Ser Arg Thr Ser Leu Val Leu Thr Leu Asn Glu Leu
165 (2) A 28. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: (i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZÚSÁG: 1164 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris
170 (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: cDNS (ix) JELLEMZŐK:
(A) NÉV/KULCS: CDS 45 (B)LOKÁCIÓ: 97...894 (xi) A 28. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
AGGGAGCCAC GCCAGCCAGA CACCCCGGCC AGAATGGAGC TGACTGAATT GCTCCTCGTG 60 GTCATGCTTC TCCTAACTGC AAGGCTAACG CTGTCC AGC CCG GCT CCT CCT GCT 114
Ser Pro Alá Pro Pro Alá
5
TGT GAC CTC CGA GTC CTC AGT AAA CTG CTT CGT GAC TCC CAT GTC CTT 162
Cys Asp Leu Arg Val Leu Ser Lys Leu Leu Arg Asp Ser His Val Leu
15 20
HU 218 893 Β
CAC AGC AGA CTG AGC CAG TGC CCA GAG GTT CAC CCT TTG CCT ACA CCT 210
His Ser Arg Leu Ser Gin Cys Pro Glu Val His Pro Leu Pro Thr Pro
30 35
GTC CTG CTG CCT GCT GTG GAC TTT AGC TTG GGA GAA TGG AAA ACC CAG 258
Val Leu Leu Pro Alá Val Asp Phe Ser Leu Gly Glu Trp Lys Thr Gin
45 50
ATG GAG GAG ACC AAG GCA CAG GAC ATT CTG GGA GCA GTG ACC CTT CTG 306
Met Glu Glu Thr Lys Alá Gin Asp Ile Leu Gly Alá Val Thr Leu Leu 55 60 65 70
CTG GAG GGA GTG ATG GCA GCA CGG GGA CAA CTG GGA CCC ACT TGC CTC 354
Leu Glu Gly Val Met Alá Alá Arg Gly Gin Leu Gly Pro Thr Cys Leu
80 85
TCA TCC CTC CTG GGG CAG CTT TCT GGA CAG GTC CGT CTC CTC CTT GGG 402
Ser Ser Leu Leu Gly Gin Leu Ser Gly Gin Val Arg Leu Leu Leu Gly
95 100
GCC CTG CAG AGC CTC CTT GGA ACC CAG CTT CCT CCA CAG GGC AGG ACC 450
Alá Leu Gin Ser Leu Leu Gly Thr Gin Leu Pro Pro Gin Gly Arg Thr
105 110 115
ACA GCT CAC AAG GAT CCC AAT GCC ATC TTC CTG AGC TTC CAA CAC CTG 498
Thr Alá His Lys Asp Pro Asn Alá Ile Phe Leu Ser Phe Gin His Leu
120 125 130
CTC CGA GGA AAG GAC TTC TGG ATT GTT GGA GAC AAA CTT CAC TGC CTC 546
Leu Arg Gly Lys Asp Phe Trp Ile Val Gly Asp Lys Leu His Cys Leu
135 140 145 150
AGC CAG AAC TAC TGG CTC TGG GCT TCT GAA GTG GCA GCA GGG ATT CAG 594
Ser Gin Asn Tyr Trp Leu Trp Alá Ser Glu Val Alá Alá Gly Ile Gin
155 160 165
AGC CAA GAT TCC TGG TCT GCT GAA CCA AAC CTC CAG GTC CCT GGA CCA 642
Ser Gin Asp Ser Trp Ser Alá Glu Pro Asn Leu Gin Val Pro Gly Pro
170 175 180
HU 218 893 Β
AAT CCC CGG ATA CCT GAA CAG GAT ACA CGA ACT CTT GAA TGG AAC TCG 690
Asn Pro Arg Ile Pro Glu Gin Asp Thr Arg Thr Leu Glu Trp Asn Ser
185 190 195
TGG ACT CTT TCC TGG ACC CTC ACG CAG GAC CCT AGG AGC CCC GGA CAT 738
Trp Thr Leu Ser Trp Thr Leu Thr Gin Asp Pro Arg Ser Pro Gly His
200 205 210
TTC CTC AGG AAC ATC AGA CAC AGG CTC CCT GCC ACC CAA CCT CCA GCC 786
Phe Leu Arg Asn Ile Arg His Arg Leu Pro Alá Thr Gin Pro Pro Alá
215 220 225 230
TGG ATA TTC TCC TTC CCC AAC CCA TCC TCC TAC TGG ACA GTA TAC GCT 834
Trp Ile Phe Ser Phe Pro Asn Pro Ser Ser Tyr Trp Thr Val Tyr Alá
235 240 245
CTT CCC TCT TCC ACC CAC CTT GCC CAC CCC TGT GGT CCA GCT CCA CCC 882
Leu Pro Ser Ser Thr His Leu Alá His Pro Cys Gly Pro Alá Pro Pro
250 255 260
CCT GCT TCC TGACCCTTCT GCTCCAACGC CCACCCCTAC CAGCCCTCTT 931
Pro Alá Ser
265
CTAAACACAT CCTACACCCA CTCCCAGAAT CTGTCTCAGG AAGGGTAAGG TTCTCAGACA 991
CTGCCGACAT CAGCATTGTC TCGTGTACAG CTCCCTTCCC TGCAGGGCGC CCCTGGGAGA 1051
CAACTGGACA AGATTTCCTA CTTTCTCCTG AAACCCAAAG CCCTGGTAAA AGGGATACAC 1111
AGGACTGAAA AGGGAATCAT TTTTCACTGT ACATTATAAA CCTTCAGAAG CTA 1'64
(2) A 29. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: (i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI: (A) HOSSZÚSÁG: 265 aminosav 50 (B) TÍPUS: aminosav (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: protein (xi) A 29. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA
Ser Pro Alá Pro Pro Alá Cys Asp Leu Arg Val Leu Ser Lys Leu Leu
1 5 10 15
Arg Asp Ser His Val Leu His Ser Arg Leu Ser Gin Cys Pro Glu Val
20 25 30
HU 218 893 Β
His Pro Leu Pro Thr Pro Val Leu Leu Pro Alá Val Asp Phe Ser Leu
40 45
Gly Glu Trp Lys Thr Gin Met Glu Glu Thr Lys Alá Gin Asp Ile Leu
55 60
Gly Alá Val Thr Leu Leu Leu Glu Gly Val Met Alá Alá Arg Gly Gin
70 75 80
Leu Gly Pro Thr Cys Leu Ser Ser Leu Leu Gly Gin Leu Ser Gly Gin
90 95
Val Arg Leu Leu Leu Gly Alá Leu Gin Ser Leu Leu Gly Thr Gin Leu
100 105 110
Pro Pro Gin Gly Arg Thr Thr Alá His Lys Asp Pro Asn Alá Ile Phe
115 120 125
Leu Ser Phe Gin His Leu Leu Arg Gly Lys Asp Phe Trp Ile Val Gly
130 135 140
Asp Lys Leu His Cys Leu Ser Gin Asn Tyr Trp Leu Trp Alá Ser Glu 145 150 155 160
Val Alá Alá Gly Ile Gin Ser Gin Asp Ser Trp Ser Alá Glu Pro Asn
165 170 175
Leu Gin Val Pro Gly Pro Asn Pro Arg Ile Pro Glu Gin Asp Thr Arg
180 185 190
Thr Leu Glu Trp Asn Ser Trp Thr Leu Ser Trp Thr Leu Thr Gin Asp
195 200 205
Pro Arg Ser Pro Gly His Phe Leu Arg Asn Ile Arg His Arg Leu Pro
210 215 220
Alá Thr Gin Pro Pro Alá Trp Ile Phe Ser Phe Pro Asn Pro Ser Ser
225 230 235 240
HU 218 893 Β
Tyr Trp Thr Val Tyr Alá Leu Pro Ser Ser Thr His leu Alá His Pro 245 250 255
Cys Gly Pro Alá Pro Pro Pro Alá Ser
260 (2) A 30. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZÚSÁG: 24 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: cDNS (xi) A 30. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA: GAGCTCACTA GTGTCGACCT GCAG (2) A 31. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZÚSÁG: 24bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav
265 (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: cDNS (xi) A 31. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
CTGCAGGTCG ACACTAGTGA GCTC 24 15 (2) A 32. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZÚSÁG: 80 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: cDNS (xi) A 32. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
CTCATAATTT TTAAAAAATT CATTTGACAA ATGCTAAAAAT TCTTGATTAA TATTCTCAAT 60 TGTGAGCGCT CACAATTTAT 8 0 (2) A 33. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZÚSÁG: 86 bázispár 30 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZALTIPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: CDNS (xi) A 33. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA
CGATAAATTG TGAGCGCTCA CAATTGAGAA TGAATTTTTT AAAAATTATG AGACGT (2) A 34. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZÚSÁG: 89bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav
GACGTCTCAT AATTTTTAAA AAATTCATTT TCAATTGTGA GCGCTCACAA TTTATCGAT
TATTAATCAA GAATTTTAGC ATTTGTCAAA 60 86 (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: cDNS (xi) A 34. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
GACAAATGCT AAAATTCTTG ATTAATATTC 60

Claims (34)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. MGDF-származék, mely legalább egy vízoldható polimerhez kapcsolódó MGDF-1, MGDF-2, MGDF-4, MGDF-11, MGDF-12, MGDF-13, MGDF-14 és MGDF-15 aminosavszekvenciájú MGDF-polipeptidet tartalmaz.
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti MGDF-származék, melyben az említett MGDF-polipeptid bakteriális sejtben rekombináns módon létrehozott.
  3. 3. Az 1. igénypont szerinti MGDF-származék, melyben a vízoldható polimer gyógyszerészetileg elfogadható polimer.
  4. 4. Az 1. igénypont szerinti MGDF-származék, melyben a vízoldható polimer dextrán, poli(N-vinil-pirrolidon), polietilénglikol, polipropilénglikol homopolimer, polipropilén-oxid/etilén-oxid kopolimer, polioxietilezett poliol, poli(vinil-alkohol) és/vagy ezek elegyei.
  5. 5. Az 1. igénypont szerinti MGDF-származék, melyben a vízoldható polimer egy polietilénglikol.
  6. 6. Az 5. igénypont szerinti MGDF-származék, melyben a polietilénglikol egy monometoxi-polietilénglikol.
  7. 7. Az 5. igénypont szerinti MGDF-származék, melyben a polietilénglikol az MGDF-polipeptidhez egy acilvagy egy alkilkötésen keresztül kapcsolódik.
  8. 8. A 7. igénypont szerinti MGDF-származék, melyben a polietilénglikol-csoport az MGDF-származék Nterminusához kapcsolódik.
  9. 9. A 7. igénypont szerinti MGDF-származék, melyben a polietilénglikol-csoport 10-50 kilodalton átlagos molekulatömeggel rendelkezik.
    HU 218 893 Β
  10. 10. Az 1. igénypont szerinti MGDF-származék, mely két vízoldható molekulához kovalensen kapcsolódó MGDF-polipeptidet tartalmaz.
  11. 11. A 10. igénypont szerinti MGDF-származék, melyben a vízoldható polimer molekulák polietilénglikol-molekulák.
  12. 12. Eljárás egy 1. igénypont szerinti MGDF-származék előállítására egy vízoldható polimernek az MGDFpolipeptidhez való kötésével, azzal jellemezve, hogy a vízoldható polimer egy reakcióképes aldehidcsoporttal rendelkezik, és a polietilénglikol terminális aldehidjének és az MGDF-polipeptidnek reakcióját egy redukálóanyag jelenlétében végezzük, és a legalább egy vízoldható polimerhez kapcsolódó MGDF-polipeptidet izoláljuk.
  13. 13. A 12. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a vízoldható polimer egy egyedüli reakcióképes aldehidcsoporttal rendelkezik, és az alábbi lépéseket végezzük:
    (a) az MGDF-polipeptidet reduktív alkilezési körülmények között egy vízoldható polimerrel hozzuk érintkezésbe, olyan pH-érték mellett, mely elegendően savas ahhoz, hogy az említett MGDF-polipeptid aminoterminusán levő alfa-aminocsoport reakcióképes legyen; és (b) a legalább egy vízoldható polimerhez kapcsolódó MGDF-polipeptidet izoláljuk.
  14. 14. Eljárás egy 1. igénypont szerinti MGDF-származék előállítására vízoldható polimernek az MGDFpolipeptidhez való kötésével, azzal jellemezve, hogy a vízoldható polimer egy egyedüli reakcióképes észtercsoporttal rendelkezik, és az alábbi lépéseket végezzük:
    (a) az MGDF-polipeptidet olyan körülmények között hozzuk kapcsolatba egy vízoldható polimerrel, hogy az említett MGDF-polipeptid egy acilkötésen keresztül a vízoldható polimerhez kapcsolódik; és (b) a legalább egy vízoldható polimerhez kapcsolódó MGDF-polipeptidet izoláljuk.
  15. 15. A12-14. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a polimer egy gyógyszerészetileg elfogadható polimer.
  16. 16. A 12-14. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a vízoldható polimer dextrán, poli(N-vinil-pirrolidon), polietilénglikol, polipropilénglikol homopolimer, polipropilén-oxid/etilén-oxid kopolimer, polioxietilezett poliol és/vagy poli(vinilalkohol).
  17. 17. A 12-14. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a vízoldható polimer polietilénglikol.
  18. 18. Monopegilált MGDF-1, MGDF-2, MGDF-3, MGDF-4, MGDF-5, MGDF-6, MGDF-7, MGDF-8, MGDF-11, MGDF-12, MGDF-13, MGDF-14 és MGDF-15 polipeptid.
  19. 19. Eljárás a 18. igénypont szerinti monopegilált MGDF-polipeptidek előállítására, melyben egy polietilénglikol-molekulát egy MGDF-polipeptidhez kapcsolunk, azzal jellemezve, hogy a polietilénglikol-molekula egy egyedüli reakcióképes aldehidcsoporttal rendelkezik, és a következő lépéseket végezzük :
    (a) az MGDF-polipeptidet a polietilénglikol-molekulával alkilezési körülmények között érintkeztetjük olyan pH-értéken, mely elegendően savas ahhoz, hogy az említett MGDF-polipeptid aminoterminusán levő alfa-aminocsoport reakcióképes legyen; és (b) kívánt esetben a pegilált MGDF-polipeptidet izoláljuk.
  20. 20. A 19. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egy E. coli sejtben egy, a 11. ábra 22-184 aminosavait magában foglaló polipeptidet és annak az N-terminusán levő Met-Lys szekvenciát kódoló DNS expresszálásával nyert polipeptidből a Met-2-Lys-l hasításával nyert MGDF-polipeptidet alkalmazunk.
  21. 21. A 20. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a következők szerint előállított MGDF-polipeptidet alkalmazzuk:
    (a) egy E. coli sejtben egy, all. ábra 22-184 aminosavait magában foglaló polipeptidet és annak N-terminusán levő Met-Lys szekvenciát kódoló DNS-t expresszáljuk;
    (b) az expresszált polipeptidet izoláljuk; és (c) az izolált polipeptidől a Met 2-Lys ’-et hasítjuk.
  22. 22. A 17. vagy 19. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a polietilénglikol-molekula 2-100 kd molekulatömegű.
  23. 23. A 19. igénypont szerint előállított monopegilált MGDF-polipeptid.
  24. 24. A 18. igénypont szerinti MGDF-polipeptid homogén készítménye, melyben az MGDF-polipeptid N-terminusánál levő alfa-aminocsoport monopegilált.
  25. 25. A 24. igénypont szerinti készítmény, melyben az MGDF-polipeptid egy 5-50 kilodalton átlagos molekulatömegű polietilénglikol-molekulával monopegilált.
  26. 26. A 18. igénypont szerinti monopegilált MGDFpolipeptid, melyben a polietilénglikol-csoport a polipeptid N-terminusához kapcsolódik.
  27. 27. A 18. igénypont szerinti monopegilált MGDFpolipeptid, melyben az MGDF-polipeptidet E. coli-bw termeltetjük.
  28. 28. Gyógyszerészeti készítmény, mely egy 1. igénypont szerinti MGDF-származékot és legalább egy gyógyszerészetileg elfogadható hígítót, hatásjavítót vagy hordozót tartalmaz.
  29. 29. Gyógyszerészeti készítmény, mely egy 18. igénypont szerinti monopegilált MGDF-polipeptidet és legalább egy gyógyszerészetileg elfogadható hígítót, hatásjavítót vagy hordozót tartalmaz.
  30. 30. Az 1. igénypont szerinti MGDF-származék alkalmazása MGDF-polipeptiddel nem rendelkező betegek kezelésére alkalmas gyógyszerészeti készítmény előállítására.
  31. 31. Az 1. igénypont szerinti MGDF-származék alkalmazása thrombocytopeniás állapotú betegek kezelésére alkalmas gyógyszerészeti készítmény előállítására.
    HU 218 893 Β
  32. 32. A 31. igénypont szerinti módszer, ahol az említett állapot az aplasztikus anémia, idiopatikus thrombocytopenia és a gyógyszerezés vagy sugárkezelés következtében fellépő thrombocytopenia.
  33. 33. Az 1. igénypont szerinti MGDF-származék 5 alkalmazása érett megakariociták számának növelésére alkalmas gyógyszerészeti készítmény előállítá sára.
  34. 34. Az 1. igénypont szerinti MGDF-származék al kalmazása a vérlemezkék számának növelésére alkal más gyógyszerészeti készítmény előállítására.
HU9600059A 1994-03-31 1995-03-30 A megakariocita szaporodás és differenciálódás stimulálására szolgáló módszerek és vízoldható készítmények HU218893B (hu)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US22176894A 1994-03-31 1994-03-31
US25262894A 1994-05-31 1994-05-31
US08/321,488 US5795569A (en) 1994-03-31 1994-10-12 Mono-pegylated proteins that stimulate megakaryocyte growth and differentiation
US34778094A 1994-11-30 1994-11-30

Publications (3)

Publication Number Publication Date
HU9600059D0 HU9600059D0 (en) 1996-03-28
HUT74257A HUT74257A (en) 1996-11-28
HU218893B true HU218893B (hu) 2000-12-28

Family

ID=27499246

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9600059A HU218893B (hu) 1994-03-31 1995-03-30 A megakariocita szaporodás és differenciálódás stimulálására szolgáló módszerek és vízoldható készítmények

Country Status (32)

Country Link
US (1) US5766581A (hu)
EP (3) EP0755263A4 (hu)
JP (2) JP2996415B2 (hu)
KR (2) KR100303810B1 (hu)
CN (2) CN1229385C (hu)
AT (1) ATE169335T1 (hu)
AU (1) AU691606B2 (hu)
BG (1) BG62685B1 (hu)
BR (1) BR9506017A (hu)
CA (1) CA2167090C (hu)
CZ (2) CZ288926B6 (hu)
DE (1) DE69503849T2 (hu)
DK (1) DK0690127T3 (hu)
EE (1) EE9600121A (hu)
ES (1) ES2119250T3 (hu)
FI (1) FI960136A (hu)
GE (1) GEP20002180B (hu)
GR (1) GR3027593T3 (hu)
HK (2) HK1004231A1 (hu)
HU (1) HU218893B (hu)
IL (1) IL113206A0 (hu)
LV (2) LV11783B (hu)
MY (1) MY113048A (hu)
NO (1) NO960111L (hu)
NZ (1) NZ283863A (hu)
PL (1) PL182567B1 (hu)
RO (1) RO115788B1 (hu)
SI (1) SI0690127T1 (hu)
SK (1) SK166695A3 (hu)
TW (3) TW414799B (hu)
WO (1) WO1995026746A1 (hu)
YU (1) YU20095A (hu)

Families Citing this family (87)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5824784A (en) * 1994-10-12 1998-10-20 Amgen Inc. N-terminally chemically modified protein compositions and methods
WO1996017062A1 (en) * 1994-11-30 1996-06-06 Zymogenetics, Inc. Low molecular weight thrombopoietin
US5986049A (en) * 1994-12-30 1999-11-16 Zymogenetics, Inc. Purified thrombopoietin and method of making it
TW387940B (en) * 1995-01-17 2000-04-21 Kirin Brewery Anti-tpo monodonal antibody
AU4658596A (en) 1995-02-03 1996-08-21 G.D. Searle & Co. Novel c-mpl ligands
US5696250A (en) 1995-02-15 1997-12-09 Amgen Inc. DNA encoding megakaryocyte growth and development factor analogs
US5989538A (en) * 1995-02-15 1999-11-23 Amgen Inc. Mpl ligand analogs
WO1996025498A2 (en) * 1995-02-15 1996-08-22 Amgen Inc. Mpl ligand analogs
TW434020B (en) * 1995-03-15 2001-05-16 Kirin Brewery Methods for preventing adsorption of thrombopoietin (TPO), and stable top-containing compositions
TW434021B (en) * 1995-03-15 2001-05-16 Kirin Brewery Methods for preventing adsorption of thrombopoietin (TPO), and stable TPO-containing compositions
US5869451A (en) * 1995-06-07 1999-02-09 Glaxo Group Limited Peptides and compounds that bind to a receptor
DK0885242T3 (da) 1995-06-07 2008-07-14 Glaxo Group Ltd Peptider og forbindelser, der binder til en trombopoietinreceptor
US6251864B1 (en) 1995-06-07 2001-06-26 Glaxo Group Limited Peptides and compounds that bind to a receptor
TW497972B (en) * 1995-06-08 2002-08-11 Kirin Brewery Stable thrombopoietin (TPO)-containing lyophilized compositions
EP0870027A1 (en) * 1995-10-05 1998-10-14 G.D. Searle & Co. Novel c-mpl receptor agonists
US6066318A (en) 1995-10-05 2000-05-23 G.D. Searle & Co. Multi-functional hematopoietic fusion proteins between sequence rearranged C-MPL receptor agonists and other hematopoietic factors
US5879673A (en) * 1996-01-25 1999-03-09 Genentech, Inc. Administration of thrombopoietin on a single day only
US7091311B2 (en) 1996-06-07 2006-08-15 Smithkline Beecham Corporation Peptides and compounds that bind to a receptor
KR100408229B1 (ko) * 1996-10-04 2003-12-01 암겐 인코포레이티드 Ｍｐｌ 리간드를 함유하는 제약학적 조성물
US5914251A (en) * 1996-10-22 1999-06-22 Amgen Inc. Nucleic acid molecules encoding placental-derived growth factors
JP4562815B2 (ja) * 1997-05-21 2010-10-13 ジェネンテック， インコーポレイテッド トロンボポエチンの新規な投与
AU2006201129B2 (en) * 1997-05-21 2008-03-13 Genentech, Inc. Novel administration of thrombopoietin
CA2330451A1 (en) 1998-04-28 1999-11-04 Applied Research Systems Ars Holding N.V. Polyol-ifn-beta conjugates
US20030228666A1 (en) 1998-06-30 2003-12-11 Daewoong Pharmaceutical Co., Ltd. Novel human thrombopoietin mutein
US6660843B1 (en) 1998-10-23 2003-12-09 Amgen Inc. Modified peptides as therapeutic agents
CN1810832B (zh) 1998-10-23 2012-12-12 麒麟-安姆根有限公司 与MPl受体结合并具有血小板生成活性的模拟二聚体血小板生成素肽
AU3877800A (en) 1999-03-30 2000-10-16 Trustees Of Boston University Compositions and methods for producing platelets and/or proplatelets from megakaryocytes
US20030211094A1 (en) 2001-06-26 2003-11-13 Nelsestuen Gary L. High molecular weight derivatives of vitamin k-dependent polypeptides
KR100886276B1 (ko) 2000-08-11 2009-03-04 기린 파마 가부시끼가이샤 인산 대사, 칼슘 대사, 석회화 및 비타민 ｄ 대사를조절하는 폴리펩티드 및 그것을 코딩하는 ｄｎａ
WO2002015926A1 (fr) * 2000-08-24 2002-02-28 Kirin Beer Kabushiki Kaisha Compositions medicinales contenant des ligands c-mpl, destinees a l'augmentation des plaquettes et des erythrocytes
UY26317A1 (es) * 2000-08-30 2000-10-31 Alfonso Cayota Carlos Pritsch Sistema de produccion de trombopoyetina humana por celulas de mamiferos en cultivo
EP1234583A1 (en) * 2001-02-23 2002-08-28 F. Hoffmann-La Roche Ag PEG-conjugates of HGF-NK4
US7332474B2 (en) 2001-10-11 2008-02-19 Amgen Inc. Peptides and related compounds having thrombopoietic activity
US20030191056A1 (en) 2002-04-04 2003-10-09 Kenneth Walker Use of transthyretin peptide/protein fusions to increase the serum half-life of pharmacologically active peptides/proteins
US20040028661A1 (en) * 2002-08-07 2004-02-12 Bartelmez Stephen H. Expansion of cells using thrombopoietin and anti-transforming growth factor-beta
US20040121953A1 (en) * 2002-08-09 2004-06-24 Chirino Arthur J. Thrombopoiesis-stimulating proteins having reduced immunogenicity
CA2499625A1 (en) 2002-09-18 2004-04-01 Ortho-Mcneil Pharmaceutical, Inc. Methods of increasing platelet and hematopoietic stem cell production
PL219741B1 (pl) * 2002-12-26 2015-07-31 Mountain View Pharmaceuticals Sposób zwiększania antyproliferacyjnego potencjału nieglikozylowanego interferonu-beta-1b in vitro, koniugat wytworzony tym sposobem i jego zastosowanie oraz kompozycja farmaceutyczna zawierająca koniugat i jej zastosowanie
TWI364295B (en) * 2002-12-26 2012-05-21 Mountain View Pharmaceuticals Polymer conjugates of cytokines, chemokines, growth factors, polypeptide hormones and antagonists thereof with preserved receptor-binding activity
JP4505449B2 (ja) * 2003-02-11 2010-07-21 アイアールエム・リミテッド・ライアビリティ・カンパニー 新規二環式化合物および組成物
US20090123367A1 (en) * 2003-03-05 2009-05-14 Delfmems Soluble Glycosaminoglycanases and Methods of Preparing and Using Soluble Glycosaminoglycanases
US7871607B2 (en) 2003-03-05 2011-01-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminoglycanases
CA2517145C (en) * 2003-03-05 2017-08-01 Halozyme, Inc. Soluble hyaluronidase glycoprotein (shasegp), process for preparing the same, uses and pharmaceutical compositions comprising thereof
US20060104968A1 (en) 2003-03-05 2006-05-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminogly ycanases
AU2004227937B2 (en) * 2003-03-31 2007-09-20 Xencor, Inc Methods for rational pegylation of proteins
US7610156B2 (en) * 2003-03-31 2009-10-27 Xencor, Inc. Methods for rational pegylation of proteins
US7642340B2 (en) 2003-03-31 2010-01-05 Xencor, Inc. PEGylated TNF-α variant proteins
MXPA06002292A (es) 2003-08-28 2006-09-04 Johnson & Johnson Peptidos y compuestos que se unen a un receptor.
US7723295B2 (en) 2003-08-28 2010-05-25 Ortho-Mcneil Pharmaceutical, Inc. Peptides and compounds that bind to a receptor
EP1675871A2 (en) 2003-10-10 2006-07-05 Xencor Inc. Protein based tnf-alpha variants for the treatment of tnf-alpha related disorders
WO2005063965A1 (de) 2003-12-30 2005-07-14 Bionethos Holding Gmbh Verfahren zur regeneration von gewebe
WO2005118551A2 (en) * 2004-05-28 2005-12-15 Ligand Pharmaceuticals Inc. Thrombopoietin activity modulating compounds and methods
WO2005123113A2 (en) * 2004-06-14 2005-12-29 Intermune, Inc. Interferon compositions and methods of use thereof
MX2007000216A (es) 2004-07-08 2007-03-15 Amgen Inc Peptidos terapeuticos.
ES2355642T3 (es) * 2004-07-16 2011-03-29 Nektar Therapeutics Conjugados que comprenden una porcion de gm-csf y un polimero.
WO2006047344A1 (en) * 2004-10-25 2006-05-04 Ligand Pharmaceuticals, Inc. Thrombopoietin activity modulating compounds and methods
US8008453B2 (en) 2005-08-12 2011-08-30 Amgen Inc. Modified Fc molecules
US9012605B2 (en) 2006-01-23 2015-04-21 Amgen Inc. Crystalline polypeptides
US7981425B2 (en) 2006-06-19 2011-07-19 Amgen Inc. Thrombopoietic compounds
US8318153B2 (en) * 2006-06-29 2012-11-27 Nalin David R Method of medically treating an individual
MX2009012609A (es) 2007-05-22 2009-12-07 Amgen Inc Composiciones y metodos para producir proteinas de fusion bioactivas.
TWI395593B (zh) 2008-03-06 2013-05-11 Halozyme Inc 可活化的基質降解酵素之活體內暫時性控制
SG187427A1 (en) 2008-04-14 2013-02-28 Halozyme Inc Modified hyaluronidases and uses in treating hyaluronan-associated diseases and conditions
TWI394580B (zh) 2008-04-28 2013-05-01 Halozyme Inc 超快起作用胰島素組成物
KR101546563B1 (ko) 2008-12-09 2015-08-28 할로자임, 아이엔씨 연장된 가용성 ｐｈ20 폴리펩티드 및 그의 용도
CN102245675B (zh) 2008-12-16 2013-08-14 道康宁公司 硅氧烷的制备
US20110294733A1 (en) 2009-01-20 2011-12-01 Hanall Biopharma Co., Ltd. Modified human thrombopoietin polypeptide fragment and manufacturing method thereof
US8680150B2 (en) * 2009-05-28 2014-03-25 Ligand Pharmaceuticals, Inc. Small molecule hematopoietic growth factor mimetic compounds that activate hematopoietic growth factor receptors
ES2605593T3 (es) 2009-05-29 2017-03-15 Novartis Ag Métodos de administración de compuestos agonistas de trombopoyetina
IN2012DN03219A (hu) 2009-09-17 2015-10-23 Baxter Healthcare Sa
WO2011098095A1 (en) 2010-02-09 2011-08-18 Aplagen Gmbh Peptides binding the tpo receptor
EP2595624B1 (en) 2010-07-20 2018-01-31 Halozyme, Inc. Methods of treatment or prevention of the adverse side-effects associated with administration of an anti-hyaluronan agent
EP2672958A1 (en) 2011-02-08 2013-12-18 Halozyme, Inc. Composition and lipid formulation of a hyaluronan-degrading enzyme and the use thereof for treatment of benign prostatic hyperplasia
EP2720713A2 (en) 2011-06-17 2014-04-23 Halozyme, Inc. Continuous subcutaneous insulin infusion methods with a hyaluronan degrading enzyme
US9993529B2 (en) 2011-06-17 2018-06-12 Halozyme, Inc. Stable formulations of a hyaluronan-degrading enzyme
US20130071394A1 (en) 2011-09-16 2013-03-21 John K. Troyer Compositions and combinations of organophosphorus bioscavengers and hyaluronan-degrading enzymes, and methods of use
SG11201401797TA (en) 2011-10-24 2014-09-26 Halozyme Inc Companion diagnostic for anti-hyaluronan agent therapy and methods of use thereof
PT3130347T (pt) 2011-12-30 2019-12-10 Halozyme Inc Variantes de polipéptidos de ph20, suas formulações e utilizações
PT2833905T (pt) 2012-04-04 2018-08-06 Halozyme Inc Terapia de combinação com hialuronidase e um taxano dirigido a tumor
WO2014062856A1 (en) 2012-10-16 2014-04-24 Halozyme, Inc. Hypoxia and hyaluronan and markers thereof for diagnosis and monitoring of diseases and conditions and related methods
TW201534726A (zh) 2013-07-03 2015-09-16 Halozyme Inc 熱穩定ｐｈ２０玻尿酸酶變異體及其用途
EP3186281B1 (en) 2014-08-28 2019-04-10 Halozyme, Inc. Combination therapy with a hyaluronan-degrading enzyme and an immune checkpoint inhibitor
NZ730563A (en) 2014-10-14 2019-05-31 Halozyme Inc Compositions of adenosine deaminase-2 (ada2), variants thereof and methods of using same
CN111107870A (zh) 2017-06-22 2020-05-05 催化剂生物科学公司 经修饰的膜型丝氨酸蛋白酶1（mtsp-1）多肽及其使用方法
US20190351031A1 (en) 2018-05-16 2019-11-21 Halozyme, Inc. Methods of selecting subjects for combination cancer therapy with a polymer-conjugated soluble ph20
KR20210110848A (ko) 2018-12-28 2021-09-09 카탈리스트 바이오사이언시즈, 인코포레이티드 변형된 유로키나제 유형 플라스미노겐 활성제 폴리펩타이드 및 사용 방법
US11613744B2 (en) 2018-12-28 2023-03-28 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Modified urokinase-type plasminogen activator polypeptides and methods of use

Family Cites Families (50)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4179337A (en) * 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
US4002531A (en) * 1976-01-22 1977-01-11 Pierce Chemical Company Modifying enzymes with polyethylene glycol and product produced thereby
JPS6023084B2 (ja) * 1979-07-11 1985-06-05 味の素株式会社 代用血液
US4640835A (en) * 1981-10-30 1987-02-03 Nippon Chemiphar Company, Ltd. Plasminogen activator derivatives
DE3380726D1 (en) * 1982-06-24 1989-11-23 Japan Chem Res Long-acting composition
EP0154316B1 (en) * 1984-03-06 1989-09-13 Takeda Chemical Industries, Ltd. Chemically modified lymphokine and production thereof
DE3675588D1 (de) * 1985-06-19 1990-12-20 Ajinomoto Kk Haemoglobin, das an ein poly(alkenylenoxid) gebunden ist.
US4810643A (en) * 1985-08-23 1989-03-07 Kirin- Amgen Inc. Production of pluripotent granulocyte colony-stimulating factor
US4894440A (en) * 1986-09-17 1990-01-16 Massachusetts Institute Of Technology Method of isolating megakaryocyte stimulatory factor
ZA887773B (en) * 1987-10-26 1989-07-26 Immunex Corp Interleukin-7
US4904584A (en) * 1987-12-23 1990-02-27 Genetics Institute, Inc. Site-specific homogeneous modification of polypeptides
US4847325A (en) * 1988-01-20 1989-07-11 Cetus Corporation Conjugation of polymer to colony stimulating factor-1
CA1340810C (en) * 1988-03-31 1999-11-02 Motoo Yamasaki Polypeptide derivatives of human granulocyte colony stimulating factor
IL90719A0 (en) * 1988-06-28 1990-01-18 Yissum Res Dev Co Novel nuclei acids and polypeptides encoded thereby
US5128449A (en) * 1988-07-05 1992-07-07 The University Of Tennessee Research Corporation Polypeptide and a method for its production
US5258324A (en) * 1988-09-21 1993-11-02 Meiji Seika Kaisha, Ltd. Megakaryocyte colony stimulating factor and process for its preparation
GB8824591D0 (en) * 1988-10-20 1988-11-23 Royal Free Hosp School Med Fractionation process
DE68925966T2 (de) * 1988-12-22 1996-08-29 Kirin Amgen Inc Chemisch modifizierte granulocytenkolonie erregender faktor
US5087448A (en) * 1989-02-02 1992-02-11 The Board Of Regents Of The University Of Oklahoma Enhancing growth of megakaryocytes in mammals using interleuking 6
US5032396A (en) * 1989-02-17 1991-07-16 Immunex Corporation IL-7 to stimulate platelet production
EP0466780A4 (en) * 1989-04-03 1992-08-26 Genetics Institute, Inc. Megakaryocyte growth promoting activity
US5260417A (en) * 1989-04-03 1993-11-09 Genetics Institute, Inc. Megakaryocyte growth promoting activity protein
WO1990012877A1 (en) * 1989-04-19 1990-11-01 Cetus Corporation Multifunctional m-csf proteins and genes encoding therefor
ATE144780T1 (de) * 1989-08-08 1996-11-15 Genetics Inst Megakaryocytopoietischer faktor
US6433142B1 (en) * 1989-08-08 2002-08-13 Genetics Institute, Llc Megakaryocyte stimulating factors
US5215895A (en) * 1989-11-22 1993-06-01 Genetics Institute, Inc. Dna encoding a mammalian cytokine, interleukin-11
JPH04218000A (ja) * 1990-02-13 1992-08-07 Kirin Amgen Inc 修飾ポリペプチド
EP0672684A1 (en) * 1990-05-31 1995-09-20 Meija Seika Kabushiki Kaisha, Ltd. Novel megakaryocyte colony stimulating factor and production thereof
EP0540575A4 (en) * 1990-07-02 1994-06-08 Hipple Cancer Res Center Human meg-csf protein and methods
IE912365A1 (en) * 1990-07-23 1992-01-29 Zeneca Ltd Continuous release pharmaceutical compositions
AU639378B2 (en) * 1990-10-05 1993-07-22 Systemix, Inc. Megakaryocyte and platelet growth, production and composition
JPH05503302A (ja) * 1990-10-12 1993-06-03 アムジエン・インコーポレーテツド 巨核球成熟因子
WO1992007074A1 (fr) * 1990-10-19 1992-04-30 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Polypeptide de la famille d'un recepteur de facteur de croissance, application au diagnostic et a la therapie des maladies myeloproliferatives
CA2073177A1 (en) * 1990-12-28 1992-06-29 Shuhei Kondo Megakaryocyte potentiator and method for producing the same
JP3283288B2 (ja) * 1991-03-08 2002-05-20 電気化学工業株式会社 生理活性ペプチド製剤
JPH04295500A (ja) * 1991-03-26 1992-10-20 Asahi Chem Ind Co Ltd 新規な巨核球増幅因子とその製法
WO1993000109A1 (en) * 1991-06-28 1993-01-07 Genentech, Inc. Method of stimulating immune response using growth hormone
WO1993000433A1 (en) * 1991-06-28 1993-01-07 New England Deaconess Hospital A differentiated megakaryocyte line producing novel megakaryocyte differentiation factors
US5250732A (en) * 1991-07-18 1993-10-05 Genentech, Inc. Ketamine analogues for treatment of thrombocytopenia
NZ244778A (en) * 1991-10-21 1994-03-25 Ortho Pharma Corp Peg imidates and protein derivatives thereof
JP3328341B2 (ja) * 1991-12-27 2002-09-24 中外製薬株式会社 新規な巨核球増幅因子
AU3463493A (en) * 1992-02-07 1993-09-03 Asahi Kasei Kogyo Kabushiki Kaisha Novel megakaryocyte amplifier and production thereof
AU4190893A (en) * 1992-07-17 1994-01-20 Suntory Limited Megakaryocyte differentiation factor
GB2285446B (en) * 1994-01-03 1999-07-28 Genentech Inc Thrombopoietin
CA2169173C (en) * 1994-02-14 2002-10-15 Kenneth Kaushansky Methods for stimulating erythropoiesis using thrombopoietin
JPH09508797A (ja) * 1994-02-14 1997-09-09 ザイモジェネティクス，インコーポレイティド 造血タンパク質及びそれを製造するための材料及び方法
WO1995021919A2 (en) * 1994-02-14 1995-08-17 Kirin Brewery Company, Limited Protein having tpo activity
EP0668352A1 (en) * 1994-02-14 1995-08-23 Kirin Brewery Company, Ltd. Protein having TPO activity
US5547931A (en) * 1994-02-23 1996-08-20 Immtech International Inc. Methods of stimulatory thrombocytopoiesis using modified C-reactive protein
US5571686A (en) * 1994-04-14 1996-11-05 Massachusetts Institute Of Technology Method of using megapoietin for prolonging the survival & viability of platlets

Also Published As

Publication number Publication date
WO1995026746A1 (en) 1995-10-12
CA2167090A1 (en) 1995-10-12
TW414799B (en) 2000-12-11
US5766581A (en) 1998-06-16
PL182567B1 (pl) 2002-01-31
JP2996415B2 (ja) 1999-12-27
HK1004231A1 (en) 1998-11-20
SK166695A3 (en) 1997-02-05
EE9600121A (et) 1997-04-15
EP0690127B1 (en) 1998-08-05
AU2230895A (en) 1995-10-23
BG62685B1 (bg) 2000-05-31
JP3485842B2 (ja) 2004-01-13
CZ288890B6 (cs) 2001-09-12
LV12275A (lv) 1999-05-20
DE69503849T2 (de) 1999-04-01
HU9600059D0 (en) 1996-03-28
EP0755263A1 (en) 1997-01-29
LV11783B (en) 1997-12-20
YU20095A (sh) 1998-08-14
NO960111D0 (no) 1996-01-10
PL312577A1 (en) 1996-04-29
DE69503849D1 (de) 1998-09-10
GEP20002180B (en) 2000-07-25
FI960136A0 (fi) 1996-01-11
CN1322759A (zh) 2001-11-21
CN1103782C (zh) 2003-03-26
TW565568B (en) 2003-12-11
KR100303810B1 (ko) 2001-12-01
SI0690127T1 (en) 1998-12-31
NO960111L (no) 1996-09-24
BR9506017A (pt) 1997-10-14
EP0755263A4 (en) 2005-02-09
LV11783A (lv) 1997-06-20
EP0675201A1 (en) 1995-10-04
MY113048A (en) 2001-11-30
CZ350595A3 (en) 1997-01-15
AU691606B2 (en) 1998-05-21
CA2167090C (en) 2002-05-14
CZ288926B6 (cs) 2001-09-12
EP0690127A1 (en) 1996-01-03
NZ283863A (en) 1997-12-19
GR3027593T3 (en) 1998-11-30
CN1229385C (zh) 2005-11-30
ES2119250T3 (es) 1998-10-01
CN1137757A (zh) 1996-12-11
FI960136A (fi) 1996-03-11
DK0690127T3 (da) 1999-05-03
HK1041275A1 (en) 2002-07-05
TW496870B (en) 2002-08-01
MX9600206A (es) 1998-11-30
ATE169335T1 (de) 1998-08-15
HUT74257A (en) 1996-11-28
IL113206A0 (en) 1995-06-29
LV12275B (en) 1999-08-20
KR100203824B1 (ko) 1999-06-15
BG100625A (bg) 1997-04-30
RO115788B1 (ro) 2000-06-30
JP2000103799A (ja) 2000-04-11
JPH10510980A (ja) 1998-10-27
HK1041275B (zh) 2006-07-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US5766581A (en) Method for treating mammals with monopegylated proteins that stimulates megakaryocyte growth and differentiation
US5795569A (en) Mono-pegylated proteins that stimulate megakaryocyte growth and differentiation
CA2178752C (en) N-terminally chemically modified protein compositions and methods
AU762616B2 (en) Polymer conjugates of interferon beta-1a and uses
US5264209A (en) Modified HIL-6
EP0811064B1 (en) Mpl ligand analogs
AU727978B2 (en) MPL ligand analogs
RU2158603C2 (ru) Способы и препараты для стимулирования роста и дифференцировки мегакариоцитов
MXPA96000206A (en) Compositions and methods to stimulate the growth and differentiation of the megacarioci
JP2003024076A (ja) Ｔｐｏ変異体タンパク質
JPH10212243A (ja) トロンボポエチン蛋白を含有する血小板止血血栓形成能回復促進用組成物
PL183631B1 (pl) Pochodna polipeptydu stanowiącego czynnik wzrostu i rozwoju megakariocytów-(polipeptydu MGDF), sposób jej wytwarzania oraz kompozycja farmaceutyczna zawierająca taką pochodną
MXPA00002467A (en) Mpl ligand analogs

Legal Events

Date Code Title Description
HMM4 Cancellation of final prot. due to non-payment of fee