RO115788B1 - Polipeptidă mgdf, derivat de polipeptidă mgdf, polipeptidă mgdf mono-pegilată şi procedee de obţinere a acestora - Google Patents

Abstract

Polipeptida MGDF are secvenţa de aminoacizi a unui membru selectat din grupul constând din MGDF-4, MGDF-5, MGDF-6, MGDF-7 şi MGDF-8, şi este codificată de o polinucleotidă izolată dintr-o celulă gazdă, transformată sau transfectată stabil cu un vector ADN, care codifică pentru polipeptidă. Derivatul de polipeptidă MGDF cuprinde o polipeptidă MGDF legată la cel puţin un polimer solubil în apă, printr-o legătură acil sau alchil, la capătul N-terminal al acestuia. Polipeptida MGDF mono-pegilată cuprinde o polipeptidă MGDF selectată din grupul constând din MGDF-1, MGDF-2, MGDF-3, MGDF-4, MGDF-5, MGDF-6, MGDF-7, MGDF-8, MGDF-11, MGDF-12, MGDF-13, MGDF-14 şi MGDF-15. Procedeul de obţinere a polipeptidei MGDF constă în aceea că se cultivă o celulă gazdă, transformată sau transfectată cu o secvenţă cADN, într-un mediu nutritiv cunoscut, după care se izolează polipeptida MGDF din celulă sau din mediul nutritiv.

Description

RO 115788 B

Prezenta invenție se referă la polipeptidă MGDF, derivat de polipeptidă MGDF, polipeptidă MGDF mono-pegilată și procedee de obținere a acestora.

Polipeptidele MGDF sunt liganzi care stimulează creșterea megacariocitelor și sporesc diferențierea sau maturarea megacariocitelor, cu efect final de creștere a numărului de plachete.

în ceea ce privește producerea plachetului din megacariocite, s-au arătat următoarele: plachetele sanguine sunt celule aflate în circulație care sunt esen-țiale pentru prevenirea sângerării și pentru coagularea sângelui. Megacariocitele sunt sursa celulară din plachete și apar într-o celulă precursoare comună măduvei osoase care dă naștere la toate liniile de celule hematopoietice. Această celulă precursoare comună este cunoscută ca celulă stemică pluripotentă sau PPSC.

S-a definit o ierarhie a celulelor progenitoare a megacariocitelor pe baza momentului apariției și mărimii coloniilor de megacariocite [MK], care apar în sisteme de cultură in vitro, ca răspuns la factorii de creștere corespunzători. Cea mai potrivită celulă progenitoare megacariocită este factorul de formare explozivă a megacariocitului [BFU-MK], BFU-MK sunt considerate esențiale pentru producerea de culturi numeroase de factori, care formează megacariocite [CFU-MK], care sunt celule progenitoare MK mai diferențiate.

Ulterior, celulele MF suferă diferențierea, acestea prezentând capacitatea de endoreduplicare. Endoreduplicarea [sau endomitoza] este fenomenul de diviziune a nucleului în celulă, în absența diviziunii celulei. Endoreduplicarea are ca rezultat final o MK, care este poliploidă. Maturarea ulterioară a MK are ca rezultate dobândirea organelor citoplasmatice și constituienților, care caracterizează plachetele.

Plachetele se produc din MK mature printr-un proces puțin definit care a sugerat că trebuie să fie o consecință a fragmentării fizice a MK sau altor mecanisme. Observațiile unor structuri membranare extinse în megacariocite au condus la un model de formare a plachetului în care un sistem de membrană de demarcare scoate în evidență în corpul celulei plachetele în curs de apariție. Alt model al formării plachetului s-a dezvoltat de la observațiile că, megacariocitele vor forma prelungiri citoplasmatice contractate la intervale de mărimea plachetului din care se presupune că se rup plachete ca urmare a presiunii de curgere a sângelui în măduvă și/sau în plămân. Aceste prelungiri citoplasmatice au fost denumite, în domeniul de specialitate, proplachete pentru a reflecta presupusul lor rol precursor în formarea plachetului.

în ceea ce privește reglarea formării plachetului, s-au arătat următoarele: un volum mare de date generate în numeroase laboratoare, arată că producerea plachetului este reglată umoral. Inițial, nu s-a apreciat complexitatea acestui proces biologic și în prezent se pare că numeroși factori de creștere umani posedă această capacitate.

Reglarea megacariocitului se întâlnește la niveluri celulare multiple. Un număr de citokine sporesc producerea plachetului prin mărimea rezervei de celule progenitoare, Un al doilea grup de factori de creștere umorală, servesc ca factori de maturare care acționează asupra mai multor celule, diferențiate pentru a iniția endoreduplicarea. Suplimentar, par a fi două bucle independente de biofeedback, care reglează aceste procese.

Unii factori de creștere hematopoietici de lineaj nespecific exercită efecte importante asupra maturării MK. Factorul stimulator de colonie granulocit-macrofag [MG+CSF], interleukina-3 [IL-3], IL-6, IL-11, factorul inhibitor al leukinei [LIF] și eritropoietina [EPO], fiecare individual, inițiază maturarea MK uman in vitro, așa cum s-a determinat prin efectele lor asupra mărimii, numărului sau ploidiei MK.

RO 115788 B

Efectele de maturare MK ale LIF, IL-6 și IL-11 sunt, fie parțial [LIF și IL-6], fie total [IL- 50 11], adăugate la cele ale IL-3. Astfel de date, din publicațiile din domeniu, au sugerat că unele combinații de citokine pot fi necesare pentru inițierea maturării MK in vivo.

□e asemenea, s-a raportat că serul uman aplastic conține o activitate de stimulare a coloniei de megacariocite IL-3, factorul de stimulare a coloniei de granulocite și factorii prezenți în mediu limfatic condiționat. Totuși, molecula responsabilă pentru 55 această activitate nu a fost izolată și nici caracterizată în stadiul anterior al tehnicii din domeniu de specialitate.

în ceea ce privește receptorii Mp1, s-au arătat următoarele: Virusul leucemie mieloproliferativ (MPLV) este un retrovirus murin deficient-replicativ, care produce leucemie acută la animalele infectate. S-a descoperit că o genă exprimată de către 60 MPLV constă dintr-o parte a genei, care codifică anvelopa retrovirală (sau proteina de acoperire externă] a virusului, fuzionată la o secvență care este înrudită la familia receptorului citokinei, incluzând receptorii pentru GM-CSF, G-CSF și EPO.

Expresia genei MPLV descrisă mai sus are proprietatea interesantă de a produce celule progenitoare murine de diverse tipuri la imediata dobândire a indepen- 65 denței și factorului de creștere pentru proliferarea și maturarea finală. Mai mult decât atât, unele culturi de celule de măduvă osoasă transformate acut prin MPLV au conținut megacariocite, sugerând o legătură între gena MPLV, creșterea megacariocitului și diferențiere, în prezent este cunoscut că gena virală MPLV [cunoscută ca v-Mp1] are un 70 analog în celule de mamifere, care este cunoscut ca o genă Mp1 celulară [sau cMp1]. Folosind sonde derivate v-Mp1, s-a donat cADN corespunzător genei umane c-Mp1 (datele sunt prezentate în literatura de specialitate]. Analiza secvenței a dovedit că produsul proteină codificat prin gena c-Mp1 aparține superfamiliei receptorului citokinei conservată, la fel ca produsul genei omoloage v-Mp1. 75

Această genă celulară c-Mp1, este considerat că joacă un rol în hematopoieză, pe baza observației că expresia s-a găsit în măduva osoasă, splină și ficat fetal de la șoareci normali prin sondă de protecție RN-ază și exprimate RT-PCR, dar nu și în alte țesuturi. In particular, c-Mp1 se exprimă pe megacariocite. De asemenea, s-a demonstrat că gena celulară umană, c-Mp1 uman, se exprimă în celule CD34 pozitive, 80 inclusiv megacariocite și plachete. CD34 este un antigen care indică celule hematopoietice progenitoare timpurii. în plus, expunerea celulelor CD 34 la oligonucleotide sintetice care sunt antisens pentru mARN c-Mp1 sau mesaj, inhibă semnificativ capacitatea de formare a progenitorilor megacariocitaro CF-MK, dar nu afectează progenitorii eritroizi sau granulo-macrofagi. 85

Datele de mai sus și observațiile sugerează că c-Mp1 codifică o moleculă de suprafață celulară, cunoscută până acum ca receptorul Mp1, care se leagă la un ligand, care activează receptorul, ducând posibil la producerea și/sau dezvoltarea megacariocitelor.

în literatura de specialitate, sunt cunoscute date care au fost orientate spre 90 secvența proteinei produse de către gena c-Mp1, atât din surse umane, cât și din surse murine. Acest produs genetic, care este considerat a fi un receptor, așa cum s-a explicat mai sus, este făcut din cel puțin trei regiuni generale sau domenii; un domeniu extracelular, un domeniu transmembranar și un domeniu intracelular (sau citoplasmatic]. Atașate împreună, aceste domenii fac Mp1 intact. De asemenea, în 95 datele din literatura de specialitate se face referire la o formă solubilă a receptorului care corespunde substanțial domeniului extracelular al proteinei c-Mp1 mature. Domeniul intracelular al proteinei conține o regiune hidrofobă, care atunci când s-a

RO 115788 B atașat pe calea regiunii transmembranare la domeniul extracelular al proteinei atribuie totalității proteinei posibilitatea agregării și insolubilizării. Pe de altă parte, când domeniul extracelular al produsului genei cMp1 se separă de domeniul transmembranare și intracelular, el devine solubil, în continuare forma extracelulară a proteinei fiind cunoscută ca o formă solubilă a receptorului.

In ceea ce privește necesitatea unui agent capabil să stimuleze producerea de plachete, s-au arătat următoarele: Recent s-a arătat că transfuziile de plachete au început să fie administrate la o rată mereu crescută în centre medicale. Această creștere pare a fi datorată în mare măsură progreselor în tehnologia medicală și accesului mai larg la astfel de tehnologii cum ar fi chirurgia cardiacă și transplantul de măduvă osoasă, inimă și ficat. Mărirea dozei, ca un mijloc de salvare a pacienților cu cancer, și a HIV-1 epidemic au contribuit, de asemenea, la cererea masivă de furnizare a plachetelor.

Folosirea plachetelor este considerată că este purtătoare a posibilităților de transmitere a numeroase boli infecțioase cu apariție în sânge precum și a alloimunizării. Mai mult, producerea de plachete purificate este un efort costisitor și prin urmare, folosirea în mare măsură de astfel de plachete purificate crește costurile medicale globale. Ca urmare, există o nevoie acută de noi metode îmbunătățite pentru producerea plachetelor care să poată fi folosite la oameni.

Exemple de abordări anterioare pentru sporirea producerii de plachete, sunt descrise în cele ce urmează.

Este cunoscut că interleukina-7[IL-7] este capabilă să stimuleze producerea de plachete, lnterleukina-7 este cunoscută, de asemenea, ca limfoproteina-1 și este un factor de creștere limfopoietică capabilă să stimuleze creșterea progenitorilor celulei B și T în măduva osoasă. In literatura de specialitate, sunt arătați vectori ADN și procedeele înrudite pentru producerea proteinelor mamifere IL-7 prin tehnologie de ADN recombinant. Datele prezentate, arată că IL-7 poate crește plachetele din circulație, la șoareci normali și iradiați subletal.

Tot în literatura de specialitate, se dezvăluie că megacariocitele și plachetele pot fi stimulate să prolifereze la mamifere prin tratarea lor cu interleukină-6. lnterleukina-6 umană, recombinantă, este o glicoproteină cu greutate moleculară de 2B00D cu activități multiple. Datele din literatură, arată că IL-6 are un efect de creștere in vitro a coloniilor de megacariocite.

Nici unul dintre materialele prezentate în literatura de spcialitate, nu menționează nimic în legătură cu liganzii Mp1, care sunt implicați în prezenta invenție.

Deci, în ciuda celor descrise mai sus, rămâne o mare nevoie de noi stimulatori ai megacariocitelor și/sau plachetelor la mamifere.

în continuare, vor fi prezentate date în legătură cu istoricul MGDF, care sunt modificate chimic.

Proteine pentru utilizare terapeutică sunt accesibile curent în forma corespunzătoare și în cantități adecvate, în mare măsură, ca urmare a progreselor în tehnologiile de ADN recombinant. Derivații chimici ai unor astfel de proteine pot bloca eficient o enzimă proteolitică de la contactul fizic cu însăși proteina principală și, astfel, se previne degradarea. Avantaje, suplimentare pot include în anumite împrejurări, creșterea stabilității și timpul de circulație a proteinei terapeutice și descreșterea imunogenității. Totuși, ar fi de remarcat că efectul modificării unei proteine anume nu poate fi anticipat. In literatura de specialitate se descrie modificarea proteinei și proteinei de fuziune.

RO 115788 B

Propilenglicolul (“PEG” sau peg”) este astfel, o jumătate chimică care s-a folosit în prepararea produselor proteice terapeutice, Adagen+, care este o formulare de adenozin de aminază peg-ilată, este aprobată pentru tratarea bolii severe combinată cu imunodeficiență; superoxid dismutaza peg-ilată a fost aplicată în examene clinice 150 pentru tratarea leziunii craniene; interferonul alfa peg-ilat s-a testat în faza I de examene clinice pentru tratarea hepatitei; glucocerebrozidaza peg-ilată și hemoglobina peg-ilată a fost raportat a fi bune în testarea preclinică. Pentru unele proteine, atașarea polietilenglicolului s-a dovedit a fi protectoare împotriva proteolizei (așa cum rezultă din literatura de specialitate, și sunt accesibile metode pentru atașarea unor 155 jumătăți de polietilenglicol [de asemenea, prezentat în literatura de specialitate).

S-au folosit și alți polimeri solubili pentru modificarea proteinelor, cum arji, copolimeri ai etilenglicolului/propilenglicol, carboximetilceluloza, alcool polivinilic, polivinilpirolidona, dextranui, poli-1,3-dioxolan, poli-1,3-trioxan, copolimerul etilena/ anhidridă maleică și poliaminoacizi. 160

Pentru polietilenglicol s-au folosit o diversitate de mijloace pentru atașarea moleculelor de polietilenglicol la proteine. In general, moleculele de polietilenglicol sunt conectate la proteină pe calea unei grupări reactive care se găsește pe proteină. Pentru astfel de atașare, sunt convenabile grupările amino, cum ar fi, cele de pe resturile de lizină sau la N-terminal. De exemplu, în literatura de specialitate, se afirmă 165 că s-a folosit alchilarea reductivă pentru atașarea moleculelor de polietilenglicol la o enzimă, precum și că peptide și compuși organici cu grupare(ri) amino liberâ[e) sunt modificați cu un derivat imidat al PEG, sau polimeri organici înrudiți și care sunt solubili în apă. Tot în literatura de specialitate, se face referire la modificarea numărului de resturi de lizină în proteine pentru atașarea moleculelor de polietilenglicol pe calea 170 grupărilor reactive amină.

O proteină terapeutică specifică care a fost modificată chimic este factorul stimulator al coloniei de granulocite “G-CFS” (de asemenea, prezentat în literatura de specialitate].

Alt exemplu este IL-6 peg-ilat (cunoscut din literatura de specialitate), când 175 molecule de polietilenglicol sunt adăugate la IL-6. In literatura de specialitate, se descrie o limfokină care reacționează cu o aldehidă a polietilenglicolului.

Capacitatea de a modifica MGDF este necunoscută în domeniu, deoarece susceptibilitatea fiecărei proteine individuale pentru modificare se determină prin parametrii structurali specifici ai acelei proteine. Mai mult, efectul unei asemenea 180 modificări asupra proprietăților biologice ale fiecărei proteine nu se poate deduce din domeniu. Datorită numeroaselor aplicații chimice ale MGDF, așa cum s-a menționat mai sus, este de dorit un produs MGDF derivat cu proprietăți modificate. Asemenea molecule pot avea perioada de înjumătățire și/sau activitatea in vivo crescută, precum și alte proprietăți care sunt modificate. 185

Peg-ilarea moleculelor de proteină va avea în general, ca rezultat un amestec de molecule de proteină modificate chimic. Ca o ilustrare, moleculele de proteină și cinci resturi de lizină și o grupare amino liberă la N-terminal, reacționează prin metodele care s-au arătat mai sus, și poate avea ca rezultat un amestec heterogen, unele având șase jumătăți polietilenglicol, unele cinci, unele patru, unele trei, unele două, 190 unele una și unele zero. Printre moleculele cu câteva, jumătățile de polietilenglicol pot să nu fie atașate la ceeași localizare pe diferite molecule. Adesea, va fi de dorit să se obțină un produs omogen, care conține în totalitate una sau un număr mic (de exemplu, 2...3) de specii de proteină modificată care să varieze în numărul și/sau localizarea jumătăților chimice precum PEG. 195

RO 115788 B

Totuși, amestecuri, de exempiu, de specii mono-, di- și/sau tri-peg-ilate pot fi dorite sau tolerabile pentru o indicație terapeutică care este de dorit,

Variabilitatea amestecului de la un lot la alt lot va fi dezavantajoasă când se obține un produs proteic terapeutic peg-ilat. într-o asemenea dezvoltare, este importantă previzibilitatea activității biologice. De exemplu, s-a dovedit că în cazul conjugării neselective a superoxid dismutazei cu polietilenglicol, unele fracțiuni ale enzimei modificate au fost complet inactive (datele sunt prezentate în literatura de specialitate). Se descrie, de asemenea, atașarea selectivă a grupării linker carbohidrazidă la gruparea carboxil C-terminală a unui substrat proteic (insulină). Prima nu poate avea o astfel de previzibilitate dacă proteina terapeutică diferă în compoziție de la un lot la un alt lot. Unele jumătăți polietilenglicol pot să nu fie legate stabil în unele localizări ca altele, și^ aceasta poate avea ca urmare că, astfel de jumătăți se disociază de proteină. Desigur, dacă astfel de jumătăți sunt atașate laîntîmplare și prin urmare, disociază la întîmplare, farmacocinetica proteinei terapeutice nu poate fi prezisă cu precizie.

De asemenea, este de dorit un produs MGDF derivat în care să nu fie o legare pe jumătate în jumătatea polimerului și jumătatea MGDF. O metodă, privind metodele de mai jos este că, de obicei ele necesită o legare pe jumătate între proteină și molecula de polietilenglicol. Aceste legări pe jumătate pot fi antigenice, ceea ce, de asemenea, este dezavantajos când se dezvoltă o proteină terapeutică.

O metodă care nu implică grupare de legare este descrisă în literatura de specialitate. Este cunoscut că se implică folosirea clorurii de tresil care nu are ca urmare o grupare de legare între jumătatea polietilenglicol și jumătatea proteinei, această metodă este dificilă de folosit pentru producerea produselor terapeutice, deoarece utilizarea clorurii de tresil poate produce subproduse toxice.

Tot în literatura de specialitate, se descrie modificarea imunoadezinei CD4 a monometdxi-polietilenglicdl (MePEGgiicol) aldehidă, pe calea alchilării reductive. Se afirmă că 50% din CD4-lg s-a modificat MePEG prin reacția selectivă la gruparea alfaamino a N-terminal, și, de asemenea, că descrește capacitatea de legare in vitro a CD4-lg modificat (la proteina gp12D) la o rată corelată cu extinderea MePEG-ilării.

Polipeptida MGDF, în conformitate cu prezenta invenție, are o secvență de aminoacizi a unui membru selectat din grupul constând din MGDF-4, MGDF-5, MGDF6, MGDF-7 și MGDF-8 și este codificată de o polinucleotidă izolată dintr-o celulă gazdă transformată sau transfectată stabil cu un vector ADN care codifică pentru polipeptidă. Polinucleotidă izolată este o secvență ADN. Polinucleotidă izolată ADN este un cADN. Secvența cADN are o secvență nucleotidică corespunzătoare fig. 11 sau 12. Secvența ADN este legată operativ la o secvență de control a expresiei ADN. Celula gazdă exprimă polipeptida MGDF codificată de către secvența ADN.

Procedeul de obținere a polipeptidei MGDF, constă în aceea că, se cultivă o celulă gazdă transformată sau transfectată cu o secvență cADN într-un mediu nutritiv cunoscut, după care se izolează polipeptida MGDF din celulă sau din mediul nutritiv. Celula gazdă este o celulă E.coli sau o celulă CHO.

Derivatul de polipeptidă MGDF, în conformitate cu prezenta invenție, cuprinde o polipeptidă MGDF legată, la cel puțin un polimer solubil în apă, care este acceptabil din punct de vedere farmaceutic și este ales din grupul constând din dextran, poli(Nvinil pirolidonă), polietileniglicoli, polipropilenglicol homopolimeri, polipropilenoxid/etilenoxid copolimeri, polioli polioxietilați, polivinilalcooli și amestecuri ale acestora, printr-o legătură acil sau alchil la capătul N-terminal al acestuia. Polipeptida MGDF este selectată din grupul constând din MGDF-1, MGDF-2, MGDF-4, MGDF-11, MGDF-12, MGDF-13, MGDF-14 și MGDF-15.

RO 115788 B

Polimerul solubil în apă este un polietilenglicol și anume este un monometoxi-poli 245 etilenglicol, cu o greutate moleculară, de 10 până la 50 kilodaltoni. Polipeptida MGDF este legată covalent la două molecule de polimer solubil în apă, ambele polietilenglicoli.

Procedeul de obținere a derivatului de polipeptidă MGDF, în conformitate cu prezenta invenție, constă în aceea că, polimerul solubil în apă are o singură grupare aldehidică reactivă și cuprinde reacția unui derivat aldehidă-terminal al polietilengli- 250 colului cu o polipeptidă MGDF în prezența unui agent reducător și izolarea polipeptidei MGDF atașată, la cel puțin un polimer solubil în apă și anume: a) punerea în contact a polipeptidei MGDF cu un polimer solubil în apă în condiții de alchilare reductivă, la un pH îndeajuns de acid pentru a permite grupării a/fe-amino din capătul amino-terminal al polipeptidei MGDF să fie reactivă și b) izolarea polipeptidei MGDF este legată, 255 la cel puțin un polimer solubil în apă.

Polipeptida MGDF mono-pegilată, în conformitate cu prezenta invenție, constă în aceea că, polipeptida MGDF este selectată dintr-un grup constând din MGDF-1, MGDF-2, MGDF-3, MGDF-4, MGDF-5, MGDF-6, MGDF-7, MGDF-8, MGDF-11, MGDF12, MGDF-13, MGDF-14 și MGDF-15. 260

Procedeul de obținere a polipeptidei MGDF mono-pegilată, în conformitate cu prezenta invenție, constă în aceea că, molecula de polietilenglicol are o singură grupare aldehidică reactivă, și cuprinde: a) punerea în contact a polipeptidei MGDF cu molecula de polietilenglicol în condiții de alchilare reductivă, la un pH suficient de acid pentru a permite grupării a/fa-amino de la capătul amino-terminal al polipeptidei MGDF 265 să fie reactivă, și b] obținerea unei polipeptide MGDF pegilate. Polipeptida MGDF este obținută prin clivarea Met²-Lys¹ dintr-o polipeptidă obținută prin exprimarea într-o celulă de E.coli a unui ADN codificând o polipeptidă care cuprinde aminoacizii 22-184 din fig. 11 și secvența Met-Lys de la capătul N-terminal al acestuia. Polipeptida este obținută prin: a] exprimarea într-o celulă de E.coli a unui ADN codificând o polipeptidă 270 care cuprinde aminoacizii 22-184 din fig. 11 și secvența Met-Lys, de la capătul terminal al acestora, b) izolarea polipeptidei exprimate, și c) clivarea Met^Lys¹ din polipeptida izolată. Molecula de polietilenglicol are o greutate moleculară, de 2 până la 1DD kDa. Polipeptida MGDF efectiv omogenă este mono-pegilată la gruparea alfaamino la capătul N-terminal al polipeptidei MGDF. Polipeptida MGDF este mono- 275 pegilată cu un polietilenglicol având o greutate moleculară medie, de 5 până la 50 kDa.

Polipeptida MGDF și derivatul de polipeptidă MGDF, în conformitate cu prezenta invenție, se administrează unui pacient într-o cantitate efectivă, pentru tratarea bolii ce prezintă o deficiență de polipeptidă MGDF, tratarea trombocitopeniei, a creșterii 280 numărului de megacariocite mature sau de creștere a numărului plachetelor sanguine. Trombocitopenia este selectată din grupul constând din anemie aplastică, trombocitopenie idiopatică, trombocitopenie rezultată în urma unui tratament cu medicamente sau iradiere.

Deci, pe larg, invenția se referă la o nouă clasă de derivați MGDF, în care o 285 moleculă MGDF este atașată la un polimer solubil în apă, și metode pentru obținerea de astfel de molecule. Invenția se mai referă la derivați MGDF, în care o moleculă MGDF este atașată la una sau mai multe grupări polietilenglicol, și procedee pentru prepararea lor.

în prezenta invenție sunt implicate cel puțin două domenii. Primul, se referă la 290 dezvoltarea megacariocitelor și producerea în continuare a plachetelor și, al doilea, la un membru polipeptidic al unei familii de receptori ai factorului de creștere, cunoscut până acum ca factorul Mp1 și liganzii acestuia.

RO 115788 B

Fiecare dintre aceste domenii, va fi arătat în cele ce urmează [și, de asemenea, cum 295 s-a prezentat și mai sus].

Deci, într-unul din aspecte, prezenta invenție asigură polipeptide care promovează, în mod specific, creșterea și/sau dezvoltarea megacariocitului (“liganzi Mpl sau MGDF-uri”), care sunt în principal libere de alte proteine (cu alte cuvinte izolate, de) și anume proteine de mamifer în cazul unui ligand Mpl obținut dintr-o sursă mami300 feră. Astfel de proteine pot fi purificate din surse celulare care produc factorii în mod natural sau la inducere cu alți factori. De asemenea, ei pot fi produși prin tehnici recombinante de inginerie genetică. Suplimentar, liganzii Mp1 pot fi sintetizați prin tehnici chimice sau o combinație a tehnicilor menționate mai sus.

Liganzii Mpl ai acestei invenții, se pot obține în forma lor nativă din surse^ 305 mamifere. în scopul exemplificării, s-au prezentat doi liganzi Mpl izolați din plasma aplastică canină. Totuși, în alte exemple s-a demonstrat că liganzii Mpl strâns înrudiți, sunt prezenți în plasma aplastică atât, din sursă umană, cât și porcine. De remarcat că, activitatea fiecăruia dintre liganzi Mp1 se poate inhiba, în mod specific, de către forma solubilă a receptorului Mpl murin, demonstrând că toți acești liganzi Mp1 310 (precum și din alte surse mamifere, inclusiv murină) sunt strâns înrudiți, atât structural, cât și la niveluri de activitate.

Este de așteptat ca liganzii Mp1 umani, porcini și alte mamifere să poată fi izolați din surse naturale prin proceduri în principal, așa cum se prezintă în această invenție (de exemplu, este prezentat în exemplul 10 de realizare a invenției). Pentru 315 conformitate, această invenție, în general, cuprinde liganzi Mp1 de la mamifere, cum ar fi, câini, porci, oameni, șoareci, cai, oi și iepuri. Liganzii Mp1, preferați în mod particular, sunt cei de la câini, porci și de la oameni.

în plus, gene care codifică liganzi Mp1 s-au donat și secvențializat din biblioteci de rinichi fetal și ficat uman, așa cum se va prezenta în cele ce urmează. S-au 320 determinat secvențele a două polipeptide umane ca având activitate într-o analiză în celulă [vezi exemplul 4). Aceste secvențe diferă în lungimea lor, dar cu identitate pe o întindere mare a secvențelor lor aminoacide. Porțiunile identice au omologie față de eritopoietină. Liganzii Mp1 au fost denumiți, de asemenea, până aici ca Factori de Creștere și Dezvoltare Megacariocjtari (MGDF): toate referințele generale la liganzi 325 Mp1 se vor aplica la ce s-a făcut referire până aici ca MGDF-uri și vice versa. Prin polipeptidă MGDF” se înțelege o polipeptidă care are o activitate de a stimula sau inhiba specific creșterea și/sau dezvoltarea megacariocitelor. Exemplare de acest fel, de polipeptide, sunt dezvăluite în cadrul prezentei invenții.

Liganzii Mp1 din prezenta invenție, s-au dovedit a fi activi în mod specific în linia 330 megacariocitară, sporind maturarea și/sau proliferarea megacariocitelor, așa cum s-a arătat în analizele din exemplele 2 și 4 de mai jos. Prin “specific se înțelege că polipeptidele prezintă activitate biologică la un grad relativ mai mare față de megacariocite cu alte tiprui de celule. Cele care sunt stimulatoare pentru megacariocite sunt de așteptat să aibă in vivo activitate de stimulare a producerii 335 plachetelor, prin stimularea maturării și diferențierii megacariocitelor.

Doi liganzi Mp1 preferați, dintr-o sursă canină, au greutăți moleculare aparente, de aproximativ 25 kd și 31 kd, așa cum s-a determinat prin electroforeză în gel poliacrilamidic-dodecil sulfat de sodiu (SDS-PAGE), în condiții nereducătoare. Ambele proteine s-au purificat în timpul aceluiași protocol, care s-a prezentat detaliat 340 în exemplele de mai jos.

Doi liganzi umani preferați, MGDF-1 și MGDF-2, sunt în lungime de 332 și, respectiv, 173 aminoacizi, care nu includ o peptidă presupusă semnal de 21 aminoacizi.

RO 115788 B

Aceste secvențe și o a treia moleculă înrudită, MGDF-3, sunt prezentate în fig. 11 și 12 (care vor fi prezentate în continuarea descrierii].

încă un aspect suplimentar al prezentei invenții, sunt procedee pentru izolarea 345 și purificarea liganzilor Mp1 ai invenției de față sau fragmente ale acestora din surse mamifere, de preferință, sânge integral, ser sau plasmă. Sânge aplastic, ser sau plasmă sunt materii prime preferate în mod deosebit. Sângele aplastic, serul sau plasma se pot obține printr-un procedeu care implică iradierea unui mamifer cu o sursă de radiație cum ar fi cobalt-60, la un nivel de radiație de circa 400. ..800 razi, 350 astfel, încât să le asigure aplasticitatea. O astfel de procedură, este cunoscută în domeniu, așa cum se va exemplifica în cadrul exemplului 1 de realizare, care urmează. In cazul oamenilor, sânge iradiat, ser sau plasmă se pot obține de la un pacient după iradiere terapeutică, de exemplu în tratamentul pentru tratarea cancerului.

După aceasta, sângele aplastic, serul sau plasma se supun la un proces de 355 purificare. Procedeul de purificare furnizat prin prezenta invenție cuprinde următoarele proceduri cheie: cromatografia de afinitate lectină și cromatografia de afinitate a receptorului Mp1. Fiecare dintre aceste proceduri are ca urmare o purificare de aproximativ 300...500 de ori a proteinelor de 25 și 31 kd din plasma canină aplastică. Pentru purificarea suplimentară a liganzilor din prezenta invenție, pot fi 360 incluse alături de procedurile de mai sus și alte proceduri standard de purificare a proteinelor, precum și cele descrise în detaliu în cele ce urmează.

Alt aspect al prezentei invenții include polinucleotide care codifică expresia unei proteine ligand Mp1 de mamifer. Astfel de secvențe ADN pot include o secvență ADN izolată care codifică expresia proteinelor ligand Mp1 de mamifer, așa cum s-a descris. 365 De asemenea, secvențele ADN pot include secvențe 5' și 3' de mamifer necodificatoare, care mărginesc secvența care codifică ligandul Mp1. Secvențele ADN pot codifica în plus, o peptidă semnal amino-terminal. Asemenea secvențe se pot prepara prin orice metodă cunoscută, inclusiv sinteza chimică completă sau parțial. Gondonii pot fi optimizați pentru expresia în celula gazdă aleasă pentru expresia (de exemplu, 370 E.coli sau celule CHO],

De asemenea, prin prezenta invenție sunt asigurate molecule de ADN recombinant, fiecare cuprinzând vector ADN și o secvență ADN, care codifică un ligand Mp1. Moleculele ADN asigură ADN-ul ligandului Mp1 în asociere activă cu o secvență regulatoare care este capabilă să dirijeze replicarea și expresia ligandului 375 Mp1 într-o celulă gazdă aleasă. De asemenea, sunt asigurate prin prezenta invenție celule gazdă (de exemplu, bacteriene, de mamifere, de insecte, drojdie sau celule de plantă] transformate cu astfel de molecule ADN pentru utilizare în exprimarea unei proteine ligand Mp1 recombinante.

Moleculele Mp1 și celulele transformate ale invenției sunt folosite într-un alt 380 aspect al invenției, un procedeu nou pentru producerea proteinei ligand Mp1 recombinante de mamifer sau a fragmentelor peptidice ale acestora. în acest procedeu se cultivă, în condiții corespunzătoare care permit expresia ADN-ului recombinant, o linie celulară transformată cu o secvență ADN, care codifică expresia proteinei ligand Mp1 sau un fragment al acesteia (sau o moleculă ADN recombinant, așa cum s-a arătat 385 mai sus) în asociere activă cu o secvență regulatoare corespunzătoare sau secvență de control a expresiei capabilă să controleze expresia proteinei. Acest procedeu revendicat poate folosi un număr de celule cunoscute ca celule gazdă pentru expresia proteinei. Liniile celulare preferate până în prezent pentru producerea ligandului Mp1 sunt linii celulare de mamifere [de exemplu, celule CHO] și celule bacteriene (de 390 exemplu E.coli].

RO 115788 B în E.coli, pentru producerea ligandului Mp1, este de preferat să se folosească resturile Met și Lys la terminalul-N ai proteinei de exprimat, deoarece randamentul expresiei produsului este de obicei mai ridicat. Un produs de expresie, preferat în mod deosebit, este un MGDF uman Met-Lys, care are un total de aminoacizi [adică, Met^a Lys’¹ 1-163) MGDF [numerotate de la primul aminoacid al proteinei mature). După purificarea produsului exprimat într-o celulă bacteriană ca E.coli, resturile Met-Lys terminale se pot îndepărta prin tratament cu o enzimă, cum ar fi, o dipeptidază [de exemplu, catapsină C).

Proteina ligand Mp1 exprimată este recoltată apoi din celula gazdă, lizat de celulă sau din mediul de cultură prin mijloace convenționale corespunzătoare. Mediu condiționat poate fi prelucrat prin aceleași etape de purificare sau modificări ale, acestora, precum cele folosite pentru izolarea ligandului Mp1 din plasma aplicată [vezi exemplul, care urmează).

încă un aspect suplimentar al prezentei invenții, este faptul că sunt furnizate proteine ligand Mp1 recombinante. Aceste proteine ligand Mp1 sunt, în general, libere de alte materiale de la mamifere, în special, proteine. Proteinele ligand Mp1 ale acestei invenții sunt caracterizate, de asemenea, prin conținutul uneia sau mai multor activități fizice, biochimice, farmacologice sau biologice care s-au descris în prezența invenției.

Prezenta invenție se referă, de asemenea, la MGDF modificat chimic, care cuprinde o jumătate de proteină MGDF conectată la cel puțin un polimer solubil în apă, precum și la metoda de preparare și utilizare a astfel de compoziții. In special, invenția de față include MGDF modificat chimic în care specii de MGDF ce reacționează cu molecule de polietilenglicol reactive, astfel, încât să se atașeze polietilenglicolul la MGDF. Astfel de atașare, poate fi realizată prin reacții de peg-ilare, care se arată în prezenta invenție, cum ar fi acilarea sau alchilarea. Acilarea sau alchilarea cu polietilenglicol poate fi realizată în condiții în care produsul principal este monopeg-ilat sau polipeg-ilat. Polipeg-ilarea implică, în general, atașarea de polietilenglicol la grupările 2ramino ale resturilor de Uzină și poate implica suplimentar peg-ilarea la Nterminalul polipeptidei. Monopeg-ilarea implică, de preferință, atașarea de polietilenglicol, la gruparea «-amino la N-terminusul proteinei. Randamentul și omogenitatea unei astfel de reacții de monopeg-ilare poate fi sporită pe calea unui tip de alchilare reductivă care modifică selectiv gruparea «-amino a restului N-terminal al unei jumătăți de proteină MGDF, prin aceasta asigurând atașarea selectivă a unei jumătăți de polimer solubil în apă la N-terminusul proteinei. Aceasta asigură prepararea omogenă de molecule conjugate polimer/proteină MGDF, precum și [dacă se folosește polietilenglicol) o preparare a moleculelor de proteină MGDFpeg-ilată, care are jumătatea de polietilenglicol cuplată direct la jumătatea de proteină.

Alt aspect al acestei invenții asigură compoziții farmaceutice care conțin o cantitate terapeutică eficientă de ligand Mpl, care se găsește în mod natural, izolat sau recombinant, care poate fi supus derivării cu un polimer solubil în apă precum polietilenglicolul, împreună cu un purtător acceptabil din punct de vedere farmaceutic, diluant sau excipient. Aceste compoziții farmaceutice pot fi folosite în metoda pentru tratarea stărilor de boală sau tulburărilor caracterizate printr-o deficiență a megacariocitelor și/sau plachetelor, precum și într-o deficiență a ligandului Mp1 in vivo. Acestea pot fi, de asemenea, folosite profilactic pentru ameliorarea deficiențelor megacariocitului în situații în care este de așteptat ca acestea să se întâlnească (de exemplu, datorită intervențiilor chirurgicale).

RO 115788 Β

Astfel, liganzii Mpl ai prezentei invenții se pot folosi în tratamentul anemiei 440 aplastice, de exemplu, pentru mărirea producerii plachetelor la pacienții care produc plachete într-un mod slab (așa cum sunt pacienții cu SIDA sau pacienții care au cancer și sunt expuși chemoterapiei). Ligandul Mpl se poate folosi pentru tratarea tulburărilor sanguine precum trombocitopenia. Ligandul Mp1 poate fi folosit ca o terapie secundară pentru pacienții cu transplant de măduvă osoasă. Asemenea pacienți pot 445 fi oameni sau un alt mamifer. Este de așteptat ca ligandul Mpl de la una din specii să fie util în alte specii.

Un aspect suplimentar al invenției este prin urmare, o metodă pentru tratarea acestora și altor stări patologice care rezultă dintr-o deficiență a plachetelor prin administrarea la un pacient a unei cantități eficiente din punct de vedere farmaceutic 450 dintr-o compoziție, așa cum s-a descris mai sus. Aceste metode farmaceutice pot include administrarea, simultan sau secvențial cu ligandul Mpl, a unei cantități eficiente din cel puțin un alt factor de stimulare a coloniei de megacariocite, o citokină (de exmeplu, EPD] un receptor Mpl solubil, hematopoietină, interleukină, factor de creștere sau anticorp. 455 încă un alt aspect al prezentei invenții asigură anticorpi [de exemplu, policlonali, monoclonali, umanizați și recombinând) și fragmente de anticorpi care sunt orientați împotriva [cu alte cuvinte, reactivi) unui ligand Mp1 sau unui fragment de ligand. Ca parte a acestui aspect, invenția include prin urmare, celule care sunt capabile să secrete astfel de anticorpi (de exemplu, hibridomi în cazul anticorpilor monoclonali) și 460 metode pentru producerea și utilizarea lor în proceduri de diagnosticare sau terapeutice.

Alt aspect al invenției, este o analiză a unui fluid al corpului pentru prezența ligandului Mp1. O astfel de analiză poate folosi anticorpi care recunosc specific un ligand Mp1, într-un format anticorp unic sau sandwich”. Astfel de analiză ar putea fi 465 folosită când un pacient are nevoie de administrarea externă de ligand Mpl și/sau un astfel de pacient trece probabil printr-o deficiență sau tulburare plachetară. Astfel de analize ar putea fi incluse într-un format de trusă, incluzând controalele pozitive și negative, anticorpi) și alte componente standard ale unei truse.

Alte aspecte și avantaje ale prezentei invenții vor fi evident expuse în descrierea 470 care urmează în detaliu, și modurile preferate de realizare a acestora.

Aspecte și avantaje suplimentare ale prezentei invenții vor fi evidente pentru specialiștii în domeniu, după ce se va lua în considerare descrierea care urmează, care detaliază aspecte privind practica de aplicare a invenției.

Noii factori mamiferi de creștere a megacariocitului, care inițiază și/sau produc 475 plachete, cunoscuți ca liganzi Mpl, care sunt asigurați prin prezenta invenție sunt proteine omogene, în principal, fără asociere cu alte materiale ce reprezintă proteine. De preferință, proteinele sunt circa 90% lipsite de alte proteine, preferat în mod deosebit circa 95%, lipsite de alte proteine și, cel mai preferat, mai mult sau cel puțin 98%, lipsite de alte proteine. Aceste proteine produse pe calea tehnicilor recombi- 480 nante, pentru a face posibilă producerea în cantitate mare a ligandului Mpl pur, util pentru aplicații terapeutice. Alternativ, astfel de proteine se pot obține într-o formă omogenă din sânge aplastic, plasmă sau ser de la mamifere sau de la o linie celulară de la mamifere care secretă sau exprimă un ligand Mp1. In plus, ligandul Mpl sau fragmente active ale acestuia se pot sintetiza pe cale chimică. 485 în general, prin liganzi Mp1 așa cum se folosește în cadrul prezentei invenții, înseamnă acești liganzi Mp1 care s-au descris aici, precum și fragmente active și variante ale acestora, care sunt descrise în detaliu în cele ce urmează.

RO 115788 B

Doi liganzi Mp1 preferați, dintr-o sursă canină, au greutăți moleculare aparente, de aproximativ 23 kd și 31 kd, așa cum s-a determinat prin electroforeză Tn gel de poliacrilamidă-dodecil sulfat de sodiu (SDS-PAGE]în condiții nereducătoare. Ambele proteine s-au purificat în timpul aceluiași protocol de purificare care este prezentat Tn amănunt în secțiune, din exemplele de mai jos. Astfel, de exemplu, acești doi liganzi s-au legat de lecitina de grâu germinat și receptor Mp1 imobilizat. Forma de 25 kd include o secvență aminoacidă, precum urmează: Ala-Pro-Pro-Ala-Xaa-Asp-Pro-Arg-Leu-Leu-Asn-Lys-Met-Leu-Arg-Asp-Ser-His-Val-Leu-HisXaa-Arg-Leu-Xaa-GIn-Xaa-Pro-Asp-lle-Tyr [SECV ID nr.1).

Forma de 31 kd include o secvență de aminoacid precum, cea care urmează: Ala-Pro-Pro-Ala-Xaa-Asp-Pro-Arg-Leu-Leu-Asn-Lys-Met-Leu-Arg-Asp-Ser-His-Val-Leu-His^ (SECV ID nr.2],

Aminoacizii prezentați ca Xaa”în secvența ID nr. 1 și 2, nu sunt cunoscuți cu certitudine, dar este de așteptat să fie cisteină, serină, treonină sau (mai puțin probabil] triptofan.

Din secvențele de mai sus, se poate vedea că ligandul 31 kd cuprinde cel puțin o porțiune a formei de 25 kd. în special, primii 25 aminoacizi ai proteinei de 31 kd sunt exact aceeași precum și a proteinei, de 25 kd. Această evidență, și, în special, că ambele proteine au activitate în analizele activității ligandului Mp1, prezentate aici, duce la concluzia că ambele proteine sunt strâns înrudite în termeni ai structurii și activității. Este probabil ca forma 31 kd a proteinei să difere de forma de 25 kd la secvența Oterminală, diferență de glicozilare și/sau unire diferențială a genei care codifică proteinele.

în plus, la informația de secvență de mai sus, în timpul secvențializării s-a determinat altă secvență a benzii 25 kd înaintea etapei finale de purificare (folosind HPLC, fază inversă]. Această secvență s-a găsit asociată cu banda de 25 kd în condiții nereducătoare, dar nu și în condiții reducătoare, implicând că ea este rezultatul clivării în două porțiuni (de exemplu, printr-o protează] a proteinei 25 kd, porțiuni care sunt ținute împreună printr-o legătură disulfurică. Această secvență este: Thr-GIn-Lys-Glu-GIn-Thr-Lys-Ala-GIn-Asp-Val-Leu-Gly-Ala-Val-Ala-Leu (SECV ID nr.3]

Deși localizarea precisă a SECV ID nr.3, în secvența proteinei 25 kd este clară, analogia cu alte citokine, cum ar fi eritropoietina, susține posibilitatea că secvența se întâlnește în jurul aminoacidului cu nr. 114 din proteina 25 kd. Ar fi de notat că este probabil, deși nedovedit, că SECV ID nr.3 să se întâlnească, de asemenea, în proteina 31 kd, probabil din nou, începând din jurul aminoacidului numărul 114. Informația acestei secvențe este discutată în amănunte suplimentare în exemplul 7, care urmează.

Din timpul experimentelor inițiale de purificare a liganzilor canini prezentate pe scurt în prezenta invenție, s-a donat o genă care codifică un ligand. Ca urmare, s-a determinat secvența aminoacidă de lungime întreagă a acestui ligand canin ca fiind menționat în fig. 13, care va fi prezentată în cele ce urmează.

Pe baza calcului greutăților moleculare, s-a prezis că liganzii canini 25 kd și 31 kd sunt forme prelucrate C-terminal ale ligandului de lungime întreagă care este arătat în fig. 13A, care va fi prezentată. Suplimentar, s-a obținut un ligand Mp1 murin având secvența menționată în fig.13B, care, de asemenea, va fi prezentată în continuare.

Astfel de liganzi purificați pot fi caracterizați prin activitate specifică în analiza megacariocitului uman, a cel puțin circa 5,7 x 10⁹ unități megacariocite/mg. O unitate megacariocitară este definită ca o cantitate de material care rezultă în producerea a tot atât de multe megacariocite ca 1 microlitru de control APK9 standard, folosind testul descris în exemplul 2, care urmează.

RO 115788 B

Astfel de liganzi purificați sunt caracterizați, de asemenea, printr-o activitate specifică în analiza de creștere celulară dependentă Mp1 a exemplului 4, care ur- 540 mează, a cel puțin 6,9 x IO⁹ unități de creștere celulară/mg. O unitate de “creștere celulară este definită ca fiind capacitatea de ligand cerută pentru a rezulta creșterea a 200 celule 1A6.1. în testul exemplului 4, care urmează.

Tabelul 1, care urmează prezintă calculările suplimentare specifice activității pentru liganzii Mp1 canini purificați în prezent, în conformitate cu această invenție. 545

Tabelul 1

Ligand Mp1	Test1A6.1 [unități/mg]	Test megacariocite umane^ [unități/mg)
31 kd	6,52 x 103	5,7 x 109
25 kd	10,5 x 109	14 x 10s

Recapitulând informația de mai sus, unele exemple de liganzi Mp1 ai prezentei invenții sunt caracterizați, prin una sau mai multe dintre următoarele proprietăți biochimice și biologice: 555

[a] asemenea liganzi Mp1, s-au izolat din plasmă canină aplastică;

[b] astfel de liganzi Mp1 au greutăți moleculare aparente de aproximativ 25 kd sau 31 kd, așa cum s-a determinat prin electroforeză în gel de poliacrilamidă-dodecil sulfat de sodiu 12...14% (SDS-PAGE] în condiții nereducătoare;

(c) liganzii Mp1 cuprind următoarele secvențe aminoacide:SEC\/ IO nr.1, în 560 cazul proteinei de 25 kd sau SECV ID nr.2, în cazul proteinei de 31 kd;

(d) liganzii Mp1 cuprind în plus secvența aminoacidă SECV ID nr.3 [în mod deosebit, de preferință, în proteina de 25 kd);

(e) liganzii Mp1 se leagă la lecitină de grâu germinat;

(f) liganzii Mp1 se leagă la receptorul Mp1 murin, solubil imobilizat; 565

[g) activarea ligantului Mp1 poate fi inhibată in vitro prin receptorul Mp1 solubil;

și

[h] liganzii Mp1 se leagă la o coloană de schimb anionic la un pH de circa 8...9.

Activitățile biologice ale liganzilor Mp1 ai prezentei invenții au fost demonstrate prin capacitatea lor de a stimula specific creșterea și dezvoltarea megacariocitelor în 570 testul de inițiere a creșterii megacariocitelor de la exemplul 2, care urmează a fi prezentat. In acest test, liganzii Mp1 stimulează diferențierea celulelor sanguine periferice umane CD 34+ (cu alte cuvinte, celule CD-34 selectate prin imunoadsorbție) în timpul unei perioade de cultură de 8 zile. Megacariocitele s-au identificat prin colorare cu anticorpi specifici antigen anti-plachet și s-au numărat cu ajutorul 575 microscopului. Ligandul Mp1 stimulează, de asemenea, creșterea liniei celulare 1A6.1 dependentă de factor. In absența ligandului Mp1, celulele vor muri. Numărul celulelor 1 A6.1 s-a analizat după două zile de cultură.cu ligand Mp1.

Liganzii descriși mai sus au activități specifice, așa cum s-a descris în tabelul 1, care a fost prezentat mai sus. 580

Surse de liganzi Mp1 s-au determinat a fi din sânge aplastic de mamifer, plasmă sau ser. Totuși, sursa de astfel de liganzi nu este de așteptat să fie limitată la asemenea surse cunoscute și poate include și alte fluide corporale de mamifer, celule obținute din acestea, etc.

RO 115788 Β

Purificarea liganzilor Mpl nativi din surse mamifere se bazează pe două etape cheie de purificare:

[a] cromatografia de afinitate lectină, folosind de preferință o glutinină din germenii de grâu; și

[b] cromatografia de afinitate receptor Mpl imobilizat.

Se pot include etape suplimentare pentru purificarea în continuare a proteinei, cum ar fi, cromatografia de schimb ionic, cromatografia de filtrare în gel și cromatografia cu fază inversă.

Tehnicile de purificare folosite până în prezent în obținerea ligandului Mp1 din plasma aplastică canină cuprinde următoarele etape (vezi exmplul 7, care urmează],

a] cromatografie de afinitate lectină (este preferată în mod deosebit, cromato-, grafia aglutinină din germeni de grâu];

[b] cromatografia de afinitate receptor Mpl solubil (Mp1-X) (de preferință, folosind Mpl-X murin imobilizat);

(c) cromatografia de schimb ionic (anion sau cation], de preferință, cromatografia de schimb anionic, și, de preferință, în mod deosebit folosirea unei coloane MonoD;

[d] cromatografie de filtrare în gel, în condiții disociative (de preferință, folosind Superdex 200 plus SDS]; și (e) cromatografia în fază inversă (folosind, de preferință, o coloană C-4).

Ligand Mp1 omogen de la mamifere, inclusiv ligand uman, se poate obține prin aplicarea procedurilor de purificare de sânge aplastic, ser sau plasmă, sau alte surse de ligand Mp1 de mamifer, de exemplu, surse celulare sau tisulare. Nu este în mod necesar, ca etapele de mai sus să fie într-o anume ordine, dar ordinea care a fost arătată este de preferat. Proceduri pentru cultivarea unei surse de celule (sau țesut] care poate fi dovedită ca producătoare de ligand Mpl sunt cunoscute pentru cei care sunt specializați în domeniu și se pot folosi, de exemplu, pentru mărimea sursei de materie primă.

Ligand Mpl sau unul sau mai multe fragmente peptidice ale acestuia pot fi produse pe calea tehnicilor recombinante. Pentru obținerea secvenței AON pentru un ligand Mpl particular, materialul ligandului Mp1 purificat s-a redus și, opțional, s-a digerat cu o protează, ca tripsina. Fragmentele enzimatice s-au izolat și secvențializat prin tehnici convenționale. Alternativ, așa cum s-a exemplificat în exemplele de aici, proteina intactă purificată se poate secvențializa direct, pentru mărirea posibilității pe baza cantității proteinei accesibile și apoi, secțiunea (regiunea) secvența Uzată se poate folosi în mod analog pentru secvențializarea fragmentelor critice în proceduri ulterioare. Sondele oligonucleotidice s-au sintetizat folosind codul genetic pentru prezicerea tuturor secvențelor posibile care codifică secvențele aminoacide ale fragmentului (lor) secvențializat, De preferință, s-au generat ca sonde câteva secvențe degenerate, Gena ligandului Mp1 se identifică prin folosirea acestor sonde pentru cercetarea unei biblioteci genomice sau a altei surse. Alternativ, mARN-ul dintr-o sursă celulară de ligand Mp1 poate fi folosit să facă o bibliotecă cADN, care poate fi cercetată cu sondele pentru identificarea a cADN-ului, care codifică polipeptida ligand Mpl. In continuare, se poate folosi tehnica PCR pentru extinderea secvenței cADN, folosind primeri corespunzători.

Folosind aceste sonde pentru cercetarea unei biblioteci genomice s-a obținut o clonă ADN. Pentru obținerea clonei de lungime întreagă pot fi folosite sonde bazate pe secvența ADN obținut pentru recercetarea bibliotecii și hibridizare la secvența ADN de lungime Întreagă a ligandului Mpl.

RO 115788 B

Se poate obține, de asemenea, cADN-ul pentru ligandul Mp1 uman prin subcionarea unei clone genomice umane de lungime întreagă într-un vector de expresie, 635 transfectarea lui în celule COS, prepararea unei biblioteci cADN de la aceste celule COS transfectate și cercetarea prin hibridizare pentru cADN ligand Mpl. O dată ce întregul cADN s-a identificat, acesta sau orice porțiune a lui care codifică un fragment activ al ligandului Mpl, se poate introduce în oricare dintre diversitate de vectori de expresie pentru a face un sistem de expresie pentru ligandul Mp1 sau unul sau mai 640 multe fragmente ale acestuia.

Prin astfel de tehnici recombinante, sunt obținute secvențe ADN preferate care codifică polipeptida ligand Mpl. Prezenta invenție cuprinde, de asemenea, aceste secvențe ADN, fără asociere cu secvențe ADN care codifică alte proteine [adică, izolate) și care codifică pentru expresia polipeptidelor ligand Mp1 cu o activitate ligand Mp1 645 [de exemplu, creșterea și/sau dezvoltarea megacariocitului). Aceste secvențe ADN includ acele secvențe care codifică care hibridizează, de preferință, în condiții stringente de hibridizare la secvențele ADN [așa cum rezultă din literatura de specialitate din domeniu].

Exemple de condiții stringente de hibridizare sunt hibridizarea în 4 x 62-37°C, 650 urmată de spălarea în 0,1 x SSC, la 62...67°C, pentru aproximativ o oră. Alternativ, condiții stringente de hibridizare sunt hibridizarea, în 45...55% formamidă, 4 x SSC, la 4O’..45°C.

Secvențe ADN care hibridizează la secvențele pentru ligand Mp1 în condiții destinate de hibridizare, și care codifică peptide ligand Mp1 având proprietăți biologice 655 de ligand Mp1, de asemenea, codifică noile polipeptide ligand Mp1 ale acestei invenții. Exemple de astfel de condiții de stringență de hibridizare relaxată sunt 4 x SSC, la 45...55°C, sau hibridizare, cu 30...40% formamidă, la 4D...45°C. De exemplu, o secvență ADN care are regiuni de omologie semnificativă, cum ar fi, situri de glicozilare sau legături disulfurice cu secvențele ligandului Mp1 și codifică o proteină având 660 una sau mai multe dintre proprietățile ligandului Mpl, codifică în mod clar o polipeptidă ligand Mp1, codifică în mod clar o polipeptidă ligand Mp1, chiar dacă secvența AON nu va hibridiza stringent la secvența (b) a ligandului Mp1.

Variațiile alelice [schimbări de bază întâlnite în mod natural în speciile populației care pot sau nu să ducă la o schimbare de aminoacid) ale secvențelor ADN, care 665 codifică secvențele polipeptidei ligandului Mp1 sunt incluse, de asemenea, în invenția de față, precum și analogii sau derivații acestora. în mod similar, secvențe ADN care codifică pentru polipeptide ligand Mp1, dar care diferă în codonul folosit datorită degenerescenței codului genetic sau variațiilor în secvența ADN a ligandului Mp1, care sunt produse prin mutații punctuale sau prin modificări induse pentru creșterea 670 activității, timpului de înjumătățire sau producerii polipeptidelor codificate prin acestea, sunt de asemenea cuprinse în invenție.

S-a urmat o procedură de clonare, precum cea menționată în exemplul 11 care urmează mai jos, și au rezultat secvențele aminoacide și cADN ale proteinelor MGDF1, MGDF-2 și MGDF-3, care sunt descrise în prezenta invenție. MGDF-1 este prezen- 675 tată ca aminoacizii 22-353, din fig. 1 care urmează să fie prezentată, și conține 332 de aminoacizi. MGDF-2 este o porțiune truncată a MGDF-1 și este prezentată ca aminoacizii 22-195 din fig.11. Prin urmare, MGDF-2 conține 174 aminoacizi. MGDF-3 este prezentată ca aminoacizii 22-289 din fig. 12, care va fi prezentată, și conține 268 aminoacizi. In fiecare MGDF, care va fi discutat în prezenta invenție, 680 molecula care include peptida semnal, prezentată ca aminoacizii 1-21 în tabelele fig.11 și 12, este o parte a polipeptidelor din prezenta invenție, dar, de preferință, se îndepărtează pentru că aceste polipeptide să prezinte activitate de creștere și dezvoltare a megacariocitului.

RO 115788 Β în rezumat, MGDF-urile 1-3 sunt definite după cum urmează:

MGDF-1	aminoacizii	22-353	fig.11
MGDF-2	aminoacizii	22-195	fig. 11
MGDF-3	aminoacizii	22-289	fig. 12

In testele prezentate în invenție, MGDF-1 și MGDF-2 au fost active, în timp ce MGDF-3 nu a fost activă.

Pe baza datelor activității prezentate aici s-a emis ipoteza că MGDF este exprimat in vivo ca polipeptidă precursor substanțial inactivă sau puțin activă care conține aminoacizi C-terminali variabili. După clivarea aminoacizilor C-terminali (precum și peptidei semnal), forma(le) prelucrate ale moleculei păstrează activitatea sau devin* mai active. In lumina ipotezei de mai sus, se crede că MGDF-1 poate cere să fie prelucrată [de exemplu, clivaj cu o proteazăjîn scopul prezentării activității sale. Faptul că o formă truncată a MGDF-1 (adică, MGDF-2) este activă, sprijină această ipoteză.

Mediul condiționat de la celulele renale umane 293 [Invitrogen] transfectate cu gena MGDF-1 demonstrează activitate în testul celular al exmeplului 4, care va fi prezentat mai jos. Pe de altă parte, în alte linii celulare, de exemplu,celulele 32D, nu s-a observat nici o activitate pentru această moleculă. Se presupune că aceasta poate însemna că celule 293 sunt apte să prelucreze molecule MGDF-1 probabil prin scurtare, astfel, încât molecula respondabilă, în primul rând pentru activitate, să fie o formă truncată, în timp ce celulele 32 D sunt incapabile să prelucreze molecula.

Din punct de vedere al ipotezei de mai sus, din scurtări ale secvenței prezentate ca MGDF-1 (din fig.11, care urmează] pot rezulta diverse molecule active. Printre trăsăturile conservate în familia citokinei, cum ar fi, eritropoietina (EPO), include patru fascicule ^helicolidale și patru cisteine. Cu referire la secvența MGDF-1, Cys 172 este elementul C-terminal extrem al acestor structuri conservate evolutiv și esențial pentru funcționare. Prin urmare, variante truncate preferate ale MGDF-1 sunt oricare dintre cele care au truncări C-terminale de la aminoacidul 173 la 353 [alături de clivarea peptidei semnal). De preferință, secvența MGDF-1 va fi îndepărtată din ea, de la 50 până la 185 aminoacizi de la C-terminal, de preferat, în mod deosebit, de la 90 până la 172 aminoacizi de la C-terminal. Așa cum s-a descris în prezenta invenție, secvența semnal este considerată a fi în lungime de 21 aminoacizi: totuși, bazat pe secvența MGDF-1, peptida semnal poate avea 23 aminoacizi. Pentru conformitate polipeptidele corespunzătoare la cele prezentate aici, dar care încep la poziția 24, din fig.11 sau 12 [care vor fi prezentate în continuare], sunt, de asemenea, avute în vedere în mod specific.

în cele ce urmează sunt prezentate câteva variante specifice care sunt preferate, ale MGDF-1 care poate prezenta activitate (adică, capacitatea de a susține creșterea megacariocitelor și/sau plachetelor; sau activitatea de inhibare/stimulare față de receptorul natural):___________________________________________________

MGDF-1	aminoacizii	22-172	fig. 11
MGDF-5	aminoacizii	22-177	fig. 11
MGDF-6	aminoacizii	22-191	fig. 11
MGDF-7	aminoacizii	22-198	fig. 11
MGDF-8	aminoacizii	22-265	fig. 11
MGDF-11	aminoacizii	22-184	fig.11

RO 115788 B în unele clone, aminoacizii 133-136 din secvența MGDF-1 au fost absenți, de aceea, secvențele corespunzătoare celor menționate mai sus, dar în care acești aminoacizi au lipsit (și numărul aminoacizilor C-terminali a scăzut prin 4) pot fi, de asemenea, active.

într-una din clone, care a avut un codon de terminare la poziția 192, s-a găsit 735 un rest Ala în locul unui rest Thr ,așa cum s-a arătat la poziția 191 din fig.1. Prin urmare, invenția include variante ale moleculelor MGDF, în care poziția 191 este Ala în loc de Thr.

MGDF-3 rezultă din îndepărtarea unei secvențe denumite până acum IVS5[secvența de intervenție 5) deoarece această secvență este conexată în al 5-lea 740 hexon din secvență. Deoarece, capătul 5' al IVS-5 se întâlnește într-un codon, îndepărtarea sa are ca rezultat un cadru modificat în secvența MGDF, care rămâne și se poate observa întâlnindu-se, începând de la poziția 160 a MGDF-3 până la capătul moleculei.

Nu s-a observat încă nici o activitate pentru MGDF-3 ca atare la transfecția în 745 celule 294 și testarea mediului condiționat care a rezultat, pentru activitate în analiza bazată pe celulă, a exemplului 4 (care va fi prezentat). Aparent, spre deosebire de MGDF-1, celulele 293 sunt incapabile să prelucreze MGDF-3 la o formă activă. Cu toate acestea, pe baza ipotezei truncării menționate mai sus în legătură cu MGDF-1, truncarea aminoacizilor C-terminali de la MGDF-3 poate, de asemenea, rezulta în 750 activitate. De exemplu, truncarea C-terminală a MGDF-3, de la 40 până la 102 aminoacizi poate duce la rezultate în activitate. De preferință, se îndepărtează, de la 50 până la 9D aminoacizi.

MGDF-9 22-179 fig. 12 755

MGDF-10 22-190 fig. 12

Toți liganzii Mp1, care au fost descriși în prezenta invenție, inclusiv MGDF-urile menționate mai sus, la terminusul-N pot prezenta un rest metionil, în special, când astfel de polipeptide sunt exprimate în celule gazdă bacteriene. 760

Polipeptide ligand Mp1 pot fi produse, de asemenea, prin sinteze chimice convenționale care sunt cunoscute. Metode pentru construcția polipeptidelor prezentei invenții prin mijloace de sinteză sunt cunoscute pentru persoanele care lucrează în domeniu. Secvențele polipeptidele ale ligandului Mp1, care este construit sintetic, în virtutea împărtășirii caracteristicilor structurale primare, secundare sau terțiare, și 765 conformaționale cu polipeptide ligand Mp1 pot poseda proprietățile ligandului Mp1 în comun cu acesta. Astfel, ele pot fi folosite ca substituienți biologici sau imunologici activi pentru polipeptide ligand Mp1, purificate în procedee terapeutice și imunologice.

Modificări în secvențele peptidice sau ADN, care codifică ligandul Mp1 pot fi realizate de către un specialist în domeniu care folosește tehnici cunoscute. 770 Modificările de interes în secvențele ligandului Mp1 pot include înlocuirea, inserția sau deleția unui rest aminoacid ales din secvențele codificatoare. Tehnici de mutageneză pentru asemenea înlocuire, inserție sau deleție sunt binecunoscute pentru un specialist în domeniu (vezi, de exemplu, datele din literatura de specialitate). Sunt preferate schimbări conservative, de la 1 până la 20 aminoacizi. Peptide preferate se 775 pot genera prin enzime proteolitice sau prin sinteză chimică directă. Astfel de variante sunt incluse în înțelesul polipeptidelor ligandului Mp1 și polinucleotidelor din prezenta invenție.

RO 115788 B

Mutații specifice ale secvențelor polipeptidelor ligandului Mp1 pot implica modificări ale unui sit de glicozilare [de exemplu, serină, treonină sau asparagină). Absența glicozilării sau doar glicozilarea parțială rezultă din substituția sau deleția amonoacidă la orice asparagină legată la situl de recunoaștere al glicozilării sau la orice sit al moleculei, care este modificat prin adiția carbohidratului C-legat. Un sit de recunoaștere al glicozilării legat la asparagină cuprinde o secvență tripeptidică, care este recunoscută specific, prin enzime celulare de glicozilare corespunzătoare. Aceste secvențe tripeptidice sunt, fie Asn-Xaa-Thr, fie Asn-Xaa-Ser, unde Xaa poate fi oricare aminoacid diferit de Pro. O diversitate de substituienți sau delații aminoacide la una sau ambele dintre prima sau a 3-a poziție aminoacidă a unui sit de recunoaștere a glicozilării [și/sau delație aminoacidă la cea de a 2-a poziție) are ca urmare lipsa glico-₌ zilării la secvența tripeptidică modificată. Expresia unei astfel de secvențe nucleotidice modificate produce variante care nu sunt glicozilate la acel sit.

Analogi derivați suplimentari ai MGDF.

Alți analogi și derivați ai secvențelor MGDF (liganzi Mp1), care pot păstra activitatea MGDF (ligand Mp1 ] în întregime sau parțial, pot fi, de asemenea, preparați de către un specialist în domeniu, date fiind descrierile din prezenta invenție. Astfel de modificări sunt, de asemenea, cuprinse în prezenta invenție.

Mai ales, prezenta invenție include, de asemenea, pe larg, compoziții MGDF modificate chimice și metodele de obținere și utilizare a lor. Prezenta descriere arată că este posibilă modificarea MGDF pentru sporirea proprietăților sale.

într-un aspect, prezenta invenție se referă la un produs MGDF, care cuprinde o proteină MGDF legată, la cel puțin o jumătate de polimer, care este solubil în apă.

în alt aspect, prezenta invenție se referă la un produs MGDF, în care numita proteină MGDF este legată, la cel puțin o moleculă de polietilenglicol.

în alt aspect, prezenta invenție se referă la molecule MGDF atașate la cel puțin o moleculă de polietilenglicol pe calea unei legături acil sau alchil.

Peg-ilarea MGDF-ului se poate realiza prin orice reacții de peg-ilare, care sunt cunoscute în domeniu. De preferință, peg-ilarea se realizează pe calea unei reacții de acilare sau a unei reacții de alchilare cu o moleculă reactivă de polietilenglicol [sau un polimer care este analog reactiv solubil în apă). Aceste mijloace preferate pentru derivare cu polietilenglicol se vor discuta, în continuare, mai în amănunt.

Acilarea

Peg-ilarea prin acilare implică, în general, reacționarea unui derivat ester activ al polietilenglicolului (PEG) cu o proteină MGDF. Pentru a realiza peg-ilarea MGDF-ului se poate folosi orice moleculă PEG reactivă cunoscută până în prezent sau care este descoperită ulterior. Un ester PEG activat, preferat, este PEG esterificat N-hidroxisuccinimidă(NHS). Așa cum s-a folosit aici, “acilarea” are în vedere să includă, fără însă a se limita, la acestea următoarele tipuri de legături Între MGDF și un polimer solubil în apă ca polietilenglicol : amidă, carbamat, uretan și altele. Condițiile de reacție pot fi alese oricare dintre cele cunoscute în domeniul peg-ilării sau cele ce se vor descoperi, dar vor evita condiții ca temperatură, solvent și pH care, ar inactiva prin modificare specii MGDF. Condițiile de reacție ce se aplică, în general, la peg-ilarea MGDF-urilor vor fi descrise în cele ce urmează. □ reacție exemplificatoare cu un ester NHS al monometoxi-PEG este ilustrată în fig. 14.

Peg-ilarea prin acilare va da, în general, un produs MGDF poli-peg-ilat, în care grupările 2Aamino lizină sunt peg-ilate pe calea unei grupări de legare acil. De preferință, conexiunea va fi o amidă. De asemenea, de preferință, produsul rezultat va fi substanțial numai (de exemplu, mai mult de sau cel puțin 93%) mono, di- sau tri-,

RO 115788 B peg-ilate. Totuși, în mod normal se vor forma în cantități care depind de condițiile specifice de reacție folosite unele specii cu grade mai înalte de peg-ilare (până la numărul maxim al grupărilor e-aminoacide Uzină ale MGDF plus o grupare i^amino la terminusul 830 amino al MGDF). Dacă se dorește, se pot separa din amestec specii peg-ilate mai purificate, în special, specii nereacționate, prin tehnici de purificare standard, incluzând printre altele dializa, scoaterea de sare, ultrafiltrarea, cromatografia de schimb ionic, cromatografia de filtrare în gel și electroforeza.

Alchilarea 835

Peg-ilarea prin alchilare implică, în general, reacționarea unui derivat aldehidic terminal al polietilenglicolului cu o proteină ca MGDF în prezența unui agent reducător. Ca și în cazul acilării, care a fost discutată mai sus, condițiile de reacție sunt descrise în cele ce urmează.

Peg-ilarea prin alchilare poate avea, de asemenea, ca rezultat MGDF poli-peg- 840 ilat. O exemplificare a unei reacții de alchilare reductivă cu MGDF pentru a da un produs poli-peg-ilat este prezent în fig. 15, care va fi arătată în continuare. Suplimentar, se pot dirija condițiile de reacție, așa cum s-a descris aici, pentru favorizarea peg-ilării substanțial numai la gruparea <y-amino a terminusului-N al speciilor MGDF (adică, o specie mono-peg-ilată). □ reacție de exemplificare a alchilării reductive cu MGDF 845 pentru a da un produs mono-peg-ilat este prezentată în fig. 16, care urmează. Atât în cazul mono-peg-ilării, cât și poli-peg-ilării, grupările PEG sunt atașate, de preferință, la proteină prin intermediul unei grupări -CH₂-NH-. Cu referire specială la gruparea CH₂-, acest tip de legătură este denumit, în prezenta invenție, ca o legare “alchil”.

Derivarea pe calea alchilării reductive pentru a produce un produs mono-peg-ilat 850 exploatează reactivitatea diferită a tipurilor de grupări amino primare [lizină față de Nterminal] accesibile pentru derivare în MGDF. Reacția este realizată la un pH (vezi mai jos], care permite a se lua un avantaj al diferențelor pka dintre grupările ^amino ale resturilor lizină și cel al grupării ai-amino restului N-terminal al proteinei. Prin asemenea derivare selectivă, atașarea unui polimer solubil în apă care conține o grupare 855 reactivă, cum ar fi, o aldehidă, la o proteină, este controlată; conjugarea cu polimerul are loc predominant la terminusul N al proteinei și nu se întâlnește nici o modificare semnificativă a altor grupări reactive, cum ar fi, cele amino ale catenei laterale de lizină.

într-un aspect important, invenția de față asigură o preparare substanțial 860 omogenă de molecule conjugat monopolimer proteină MGDF [însemnând proteină MGDF, la care a fost atașată o moleculă de polimer, substanțial numai [adică mai mult sau cel puțin 95%) într-o singură localizare). Mai specific, dacă se folosește polietilenglicol prezența invenție asigură, de asemenea, proteină MGDF peg-ilată, la care lipsesc posibile grupări de legare antigenice și care are molecula de polietil- 865 englicol cuplată direct la proteina MGDF.

Astfel, într-un aspect preferat, invenția de față se referă la MGDF peg-ilat, în care gruparea(le) este [sunt] atașată, prin intermediul grupărilor acil sau alchil. Așa cum s-a discutat mai sus, astfel de produse pot fi mono-peg-ilate sau poli-peg-ilate (de exemplu, care conțin 2...6, de preferință, 2...5 grupări PEG). Grupările PEG sunt 870 atașate în general la proteină, la grupările «rsau e- amino ale aminoacizilor, dar este, de asemenea, de avut în vedere că grupările PEG ar putea fi atașate la oricare grupare amino atașată proteinei, care este suficient de reactivă pentru a ajunge să se atașeze la o grupare PEG în condiții de reacție adecvate.

Moleculele de polimer care sunt folosite în ambele abordări, acilare sau 875 alchilare, pot fi alese dintre polimerii solubili în apă sau un amestec al acestora.

RO 115788 B

Polimerul ales va fi solubil în apă, astfel, încât proteina la care el este atașat să nu precipite într-un mediu apos, așa cum ar fi un mediu fiziologic. Polimerul selectat va fi modificat pentru a avea o singură grupare reactivă ca un ester activ pentru acilare sau o aldehidă pentru alchilare, de preferință, astfel, încât gradul de polimerizare să poată fi controlat așa cum s-a asigurat prin modelele de față. O aldehidă PEG reactivă, preferată, este polietilenglicol propionaldehidă care este stabilă în apă, sau derivați mono alcoxi sau ariloxi ai acestuia [așa cum este cunoscut din literatura de specialitate]. Polimerul poate fi ramificat sau neramificat. De preferință, pentru utilizare terapeutică a produsului final, polimerul este acceptabil din punct de vedere farmaceutic. Polimerul solubil în apă poate fi ales dintr-un grup constând din, de exemplu, polietilenglicol, monometoxi-polietilenglicol, dextran, poli(N-vinilpirolidonă) polietilenglicol, _ homopolimeri propilenglicol, un copolimer oxid propilenă/oxid de etilena, polioli polioxietilați (de exemplu, glicerol] și alcool polivinilic. Pentru reacțiile de acilare, polimerul (ii] selectatfi] va avea o singură grupare esterică reactivă. Pentru prezenta alchilare reductivă, polimerul(ii) ales va avea o singură grupare reactivă aldehidică. In general, polimerul solubil în apă nu va fi ales de la reziduuri glicozil care se întâlnesc în mod natural, deoarece acestea sunt făcute de obicei mai convenabil prin sisteme de expresie recombinante de la mamifere. Polimerul poate fi de orice greutate moleculară și poate fi ramificat și neramificat.

Un polimer solubil în apă care este preferat în mod deosebit pentru utilizare în acest scop polietilenglicolul, abreviat PEG. Așa cum s-a folosit în prezenta invenție, polietilenglicolul are înțelesul de a cuprinde orice formă ale polietilenglicolului, care s-a folosit pentru a deriva alte proteine, cum ar fi, mono-fC^C^Jalcoxi-sau ariloxipolietilenglicol.

Așa cum s-a folosit în prezenta invenție, MGDF este definit ca incluzând oricare dintre diversele forme ale MGDF descrise aici. De exemplu, formele MGDF de lungime întreagă sau truncate, glicozilate sau neglicozilate sunt toate incluse. Următoarele molecule MGDF sunt preferate pentru a fi derivate [în fiecare caz, numerotarea se referă la aminoacizii numerotați în conformitate cu fig. 11].

MGDF-1	aminoacizii	22-353	fig. 11
MGDF-2	aminoacizii	22-195	fig. 11
MGDF-4	aminoacizii	22-172	fig. 11
MGDF-11	aminoacizii	27-184	fig. 11
MGDF-12	aminoacizii	27-353	fig.11
MGDF-13	aminoacizii	27-195	fig. 11
MGDF-14	aminoacizii	27-172	fig.11
MGDF-15	aminoacizii	27-184	fig. 11

Speciile preferate de mai sus pot fi glicozilate, neglicozilate sau de-glicozilate, de preferință, neglicozilate. Ele se pot face recombinant, atât în celule bacteriene (de exemplu, E.coli}, cât și de mamifere (de exemplu, CHO],

Următoarele subgrupuri de molecule derivate chimic ale acestei invenții, sunt preferate în mod deosebit (în fiecare caz, acestea sunt mono- sau poli-, de exemplu 2-4 jumătăți PEG, atașate prin intermediul unei grupări acil sau alchil).

RO 115788 B

MGDF - 11 peg-ilat

MGDF - 4 peg-ilat mGDF - 2 peg-ilat în general, derivarea chimică se poate realiza în orice condiții adecvate care 925 sunt folosite pentru a reacționa o substanță biologic activă cu o moleculă polimerică activată. Metode pentru separarea MGDF peg-ilat vor cuprinde, în general, etapele: [a] reacționarea unei polipeptide MGDF cu polietilenglicol [ca ester reactiv] sau derivat aldehidic al PEG) în condiții prin care MGDF se atașează la una sau mai multe grupări PEG și [b] obținerea produsului [lor] de reacție. în general, condițiile de reacție pentru 930 reacțiile de acilare se vor stabili, de la caz la caz, pe baza parametrilor cunoscuți în domeniu și a rezultatului care este dorit. De exemplu, raportul mai mare PEG: proteină, procentul mai mare al produsului poli-peg-ilat.

Alchilarea reductivă pentru producerea unei populații substanțial omogenă de moleculă conjugat monopolimer/proteină MGDF va cuprinde în general etapele: a) 935 reacționarea unei proteine MGDF cu o moleculă PEG reactivă în condiții de alchilare reductivă, la un pH corespunzător pentru a permite modificarea selectivă a grupării <2f-amino la terminusul amino al numitei proteine MGDF și [b] obținerea produsului(lor] de reacție.

Pentru o populație substanțial omogenă de molecule conjugat monopolimer/ 940 proteină MGDF, condițiile de reacție de alchilare reductivă sunt cele care permit atașarea selectivă a jumătății de polimer solubil în apă la terminusul-N al MGDF. Astfel de condiții de reacție asigură, în general, diferențele pKa dintre grupările amino lizină și gruparea cămine la terminusul-N(pKa fiind pH-ul la care 50% dintre grupările amino sunt protonate și 50% nu]. Raportul polimerului la proteina de folosit este afectat, de 945 asemenea, de valoarea pH-ului. în general, dacă pH-ul este mai scăzut va fi de dorit un exces mai mare al polimerului față de proteină (gruparea ^amino N-terminală] mai puțin reactivă, necesită mai mult polimer pentru a atinge condițiile optime). Dacă pH-ul este mai ridicat, raportul polimer : proteină nu necesită să fie la fel de mare (adică, cu cât sunt accesibile mai multe grupări reactive, cu atât mai puține molecule de 950 polimer sunt necesare]. Pentru scopurile prezentei invenții, pH-ul va fi, în general, în domeniul 3...9 și este de preferat în domeniul 3... 6.

Altă considerație importantă este greutatea moleculară a polimerului. în general, greutatea moleculară mai ridicată a polimerului, va micșora numărul moleculelor de polimer care pot fi atașate la proteină. în mod asemănător, ramificarea polimerului 955 va fi luată în considerare când se optimizează acești parametri. în general, greutatea moleculară mai ridicată (sau mai multe ramificații] va crește raportul polimer : proteină. în general, pentru reacțiile de peg-ilare avute în vedere aici, greutatea moleculară medie preferată este, de circa 2 kDa până la IDO kDa (termenul de “circa” indică o aproximație de ± 1 kDa). Greutatea moleculară medie care este de preferat 960 este, de circa 5 kDa până la circa 50 kDa, preferată în mod deosebit, de circa 12 kDa până la circa 25 kDa. Raportul polimer solubil în apă față de proteina MGDF va fi, în general, în domeniul, de la 1 : 1 până la 100 : 1, de preferință, (pentru poli-pegilare] 1:1 până la 20 : 1 și (pentru mono-peg-ilare] 1:1 până la 5:1.

Folosind condițiile care au fost arătate mai sus, alchilarea reductivă va asigura 965 atașarea selectivă a polimerului la orice proteină MGDF care are o grupare ^amino la terminusul-amino și asigură o preparare substanțial omogenă a conjugatului monopolimer/proteină MGDF. Termenul “conjugat monopolimer/proteină MGDF” este folosit în prezenta invenție pentru a înțelege o compoziție care conține o singură moleculă de polimer atașată la o moleculă de proteină MGDF. 97D

RO 115788 B

Conjugatul monopolimer/proteină MGDF va avea ,de preferință, o moleculă de polimer localizată la terminusul-N, dar nu pe grupările laterale aminolizină. Prepararea va fi, de preferință, mai mare decât 90% conjugat monopolimer/proteină MGDF și, mai preferat, mai mare decât 95% conjugat monopolimer/proteină MGDF, restul moleculelor observabile fiind nereacționate (adică proteină la care lipsește jumătatea de polimer]. Exemplele, care vor fi prezentate în continuarea descrierii de invenție, asigură o preparare, care este de cel puțin circa 90% conjugat monopolimer/proteină și circa 10% proteină nereacționată. Conjugatul monopolimer/proteină care s-a obținut are activitate biologică.

Pentru alchilarea reductivă de față, agentul reducător va fi stabil în soluție apoasă și, de preferință, va fi capabil să reducă numai baza Schiff formată în procedeul inițial al alchilării reductive. Agenții reducători preferați pot fi aleși dintr-un grup care constă din borchidrură de sodiu, cianoborohidrură de sodiu, dimetilamino boran, trimetilamino boran și piridin boran. Un agent reducător preferat în mod deosebit este cianoborohidrura de sodiu.

Alți parametri de reacție, ca solventul, timpii de reacție, temperaturile, etc. și mijloacele de purificare ale produselor se pot determina, de la caz la caz informației publicate în legătură cu derivarea proteinelor cu polimeri solubili în apă [așa cum este cunoscut din literatura de specialitate]. Detalii suplimentare și exemplificatoare sunt prezentate în capitolul exemple de realizare, care va fi prezentat în continuare.

Se poate opta să se prepare un amestec de molecule conjugat polimer/ proteină prin metode de acilare și/sau alchilare, și avantajul asigurat este acela că se poate alege proporția conjugat monopolimer/proteină ce urmează a se include în amestec. Astfel, dacă se dorește, se poate prepara un amestec de diverse proteine cu un număr diferit de molecule de polimer atașate [adică, di, tri-, tetra-, etc] și combina cu material conjugat monopolimer/proteină preparat folosind metodele de față și să se obțină astfel un amestec cu o proporție predeterminată de conjugat de monopolimer/proteină.

Exemplele de realizare ale invenției, care sunt prezentate în continuare, demonstrează prepararea MGDF modificat chimic și prepararea MGDF peg-ilat prin intermediul acilării și alchilării. Astfel de aspecte ale prezentei invenții se referă la aceste preparări. în general, condițiile care pot fi îmbunătățite sau modulate prin administrare de prezentul polimer/MGDF, le includ pe cele descrise, în general, mai sus pentru moleculele MGDF. Totuși, moleculele polimer/ MGDF care sunt descrise în cadrul prezentei invenții, pot avea activități suplimentare, activități sporite sau reduse sau alte caracteristici comparative cu moleculele nederivate.

încă un alt aspect al prezentei invenții, este acela de compoziții farmaceutice ale moleculelor MGDF modificate chimic, așa cum s-a arătat mai sus. Astfel de compoziții farmaceutice pot conține oricare dintre ingredientele specifice [care au fost arătate aici) pentru molecule MGDF nederivate.

După cum au fost dirijate studiile ulterioare, vor rezulta informații în legătură cu nivelurile de dozaj corespunzătoare, pentru tratamentul a diferite condiții de boală la diferiți pacienți, iar specialistul în domeniu care are pregătirea obișnuită, considerând contextul terapeutic, vârsta și starea generală de sănătate a receptorului, va fi capabil să stabilească o dozare adecvată. în general, dozajul va fi între 0,01 pg/kg greutate corporală (calculând doar masa proteinei, fără modificarea chimică) și circa 300 pg/kg [pe aceeași bază). Doza prefera tă va fi, în general, de la 5 pg/kg greutate corporală până la 100 pg/kg greutate corporală, preferată în mod deosebit de la 10 pg/kg greutate corporală până la 75 pg/kg greutate corporală.

RO 115788 B

Prezenta invenție asigură, de asemenea, □ metodă pentru producerea 1020 polipeptidelor MGDF [adică, ligand Mp1) sau a fragmentelor active ale acestora. O metodă a prezentei invenții implică introducerea cADN-ului, care codifică o polipeptidă ligand Mp1 într-un vector de expresie pentru a face un sistem de expresie pentru ligand Mp1. □ celulă gazdă aleasă s-a transfectat cu vectorul și, apoi, s-a cultivat, Metoda din această invenție cuprinde prin urmare, cultivarea unei celule sau linii 1025 celulare adecvate, care a fost transfectată cu o secvență AON codificând la expresie pentru o polipeptidă ligand Mp1 sub controlul secvențelor regulatoare cunoscute. Secvențele regulatoare includ fragmente de promotori, fragmente de terminatori și alte secvențe adecvate care dirijează/controlează expresia proteinei într-o celulă gazdă corespunzătoare. Factorul exprimat este apoi recuperat, izolat și purificat din 1030 mediul de cultură [sau din celulă dacă s-a exprimat intracelular) prin mijloace corespunzătoare care sunt cunoscute unui specialist în domeniu.

Suplimentar, sunt ,de asemenea, avute în vedere metodele care sunt descrise și în literatura de specialitate, pentru a fi aplicate la polinucleotide/ polipeptidele inventate. 1035

Celule sau linii celulare adecvate pot fi celule de mamifer, ca celule ovariene de hamster chinezesc [CHO] sau celule 3T3. Alegerea celulelor gazdă de mamifere, adecvate, metode pentru transformare, cultură, amplificare, selectare, producerea produsului și purificare sunt cunoscute în domeniu (datele sunt prezentate în literatura de specialitate). Alte linii de celule de mamifere adecvate, sunt COS-1 și COS-7 de la 1040 maimuță și linia celulară CV-1. Exemple suplimentare de celulă gazdă includ linii celulare de primate și linii celulare de rozătoare, inclusiv linii celulare transformate. Celule diploide normale, tulpini celulare derivate din cultura in vitro a țesutului primar precum și explante primare sunt, de asemenea, adecvate. Celulele candidat pot fi deficiente în gena de selecție sau pot să conțină o genă de selecție care acționează 1045 dominant. Alte linii celulare de la mamifere includ, dar nu limitează, HeLa, celule L929 de șoarece, liniile 3T3 derivate de la șoareci elvețieni, Balb-c sau NIH, liniile celulare de hamster BHK sau HaK.

In mod similar, folosite ca celule gazdă și adecvate pentru invenția de față sunt celulele bacteriene. De exemplu, diferite tulpini de E.coli [cum ar fi, de exemplu, 1050 HB1D1, DH5 a, DH10 și MC1D61) sunt binecunoscute ca celule gazdă în domeniul biotehnologiilor. De asemenea, pot fi folosite în această metodă și diferite tulpini de B.subtilis, Pseudomonas spp., alte Bacillus spp., Streptomyces spp. și alte asemenea.

Numeroase tulpini de celule de drojdie, cunoscute specialiștilor în domeniu, sunt de asemenea accesibile ca celule gazdă pentru expresia polipeptidelor prezentei 1055 invenții. Suplimentar, când se dorește, pot fi utilizate în metoda din invneția de față ca celule gazdă, și celulele de insecte (datele sunt arătate în literatura de specialitate].

Prezenta invenție asigură, de asemenea, molecule sau vectori recombinanți pentru utilizarea în metoda pentru expresie a noilor polipeptide ligand Mp1. Acești vectori conțin secvențele ADN ligand Mp1 și, care singure sau în combinație cu alte 1060 secvențe, codifică pentru polipeptidele ligand Mp1 (cu sau fără peptida semnal] ale invenției sau fragmente active ale acestora. Alternativ, vectorii care incorporează secvențe modificate precum cele care au fost descrise mai sus, sunt de asemenea realizări ale prezentei invenții și sunt utili în producerea polipeptidelor ligand Mp1. Vectorul folosit în metodă conține, de asemenea, secvențe regulatoare în asociere 1065 funcțională cu secvențele ADN codificatoare ale invenției și capabil să dirijeze replicarea și expresia acestuia în celulele gazdă alese.

Un vector este pXM, care este dorit în mod deosebit pentru expresie în celule C0S6 cunoscut din literatura de specialitate în domeniu.

RO 115788 B

Alt vector care este dorit pentru expresie în celule de mamifere, de exemplu OHO este pEMC2B1. Vectorii de expresie pentru celule de mamifere care sunt descriși în prezenta invenție, se pot sintetiza prin tehnici binecunoscute specialiștilor în acest domeniu. Componentele vectorilor, de exemplu, repliconi, gene de selecție, intensificatori, promotori și altele de acest fel se pot obține din surse naturale sau se pot sintetiza prin proceduri cunoscute (și care sunt arătate în literatura de specialitate). Alternativ, vectorul AON poate include total sau în parte genomul virusului papilloma bovin [de asemenea, cunoscut din literatura de specialitate] și se poate replica în linii celulare ca celulele C127 de șoarece ca un element epizomal stabil. Transfecția acestor vectori în celule gazdă corespunzătoare poate avea ca rezultat expresia polipeptidelor ligand Mp1.

Alți vectori de expresie adecvați, dintre care numeroase tipuri sunt cunoscute în domeniu de specialitate, pentru expresie la mamifere, insecte, drojdii, fungi și bacterii, care se pot, de asemenea, folosi pentru acest scop.

Condițiile care trebuie să fie tratate prin metodele și compozițiile invenției sunt, în general, acelea care implică existența unei deficiențe megacariocit/ plachet sau o deficiență megacariocit/plachet așteptată în viitor (de exemplu, datorită unei intervenții chirurgicale planificate]. Astfel de condiții vor fi de obicei urmarea unei deficiențe (temporară sau permanentă] a ligandului Mp1 activ in vivo. Termenul general pentru deficiența plachetară este trombocitopenie și deci, metodele și compozițiile prezentei invenții sunt accesibile, în general, pentru tratarea trombocitopeniei.

Trombocitopenia (deficiențele plachetare) poate fi tratată prin diferite metode, incluzând chemoterapia și alte terapii cu o multitudine de medicamente, terapia prin iradiere, intervenția chirurgicală, pierderea accidentală de sânge și condiții specifice de boală. Exemple de condiții specifice de boală, care implică trombocitopenie, ce pot fi tratate în conformitate cu prezenta invenție sunt: anemia aplastică, trombocitopenia idiopatică, tumori metastazate care au ca rezultat trombocitopenie, lupus eritromatos sistemic, splenomegalie, sindromul lui Franconi, deficiențe ale vitaminei B₁₂, deficiențe de acid folie, anomalia May-Hegglin, sindromul Wiskott-AIdrich și hemoglobinurie paroxistică nocturnă. De asemenea, anumite tratamente pentru SIDA au ca urmare trombocitopienia (de exemplu, AZT). Anumite tulburări în vindecarea rănilor pot beneficia, de asemenea, ca urmare a creșterii numărului de plachete.

în legătură cu deficiențele plachetare anticipapte, de exemplu, datorită unei intervenții chirurgicale viitoare, un ligand Mp1 al prezentei invenții ar putea fi administrat câteva zile până la câteva ore, înaintea necesității de plachete. în legătură cu situații acute, de exemplu, pierderea masivă și accidentală de sânge, un ligand Mp1 se poate admnistra împreună cu sânge sau plachete purificate.

Liganzii Mp1 ai acestei invenții pot fi utili, de asemenea, în stimularea anumitor tipuri de celule, altele decât megacariocite, dacă astfel de celule se dovedesc a exprima receptor Mpl. Condiții asociate cu asemenea celule care exprimă receptorul Mp1, care sunt responsabile la stimulare prin ligandul Mp1 sunt, de asemenea, cuprinse în întinderea acestei invenții.

Molecule MGDF care nu sunt ele însele active, în testele de activitate prezentate aici, pot fi utile ca modulatori (de exemplu, inhibitori sau stimulatori) ai receptorilor Mp1 in vitro sau in vivo.

Polipeptidele invenției de față pot fi, de asemenea, folosite singure sau în combinație cu alte citokine, receptor Mp1 solubil, factori hematopoietici, interleukine, factori de creștere sau anticorpi în tratamentul condițiilor identificate mai sus.

RO 115788 B

Prin urmare, încă un alt aspect al invenției sunt compoziții terapeutice pentru tratarea condițiilor la care s-a făcut referire mai sus. Astfel de compoziții cuprind o cantitate eficientă din punct de vedere terapeutic a unei polipeptide ligand Mp1 sau 1120 un fragment al acestuia eficient terapeutic, în amestec cu un purtător acceptabil farmaceutic. Materialul purtător poate fi apă pentru injectare, de preferință, suplimentată cu alte substanțe care se folosesc în mod obișnuit în soluții, pentru administrare la mamifere. De obicei, un ligand Mp1 eficient din punct de vedere terapeutic se va administra sub forma unei compoziții cuprinzând proteina purificată 1125 împreună cu unul sau mai mulți purtători acceptabili fiziologic, excipienți sau diluanți. Purtătorii corespunzători, pentru exemplificare, sunt soluțiile saline neutre tamponate sau soluțiile saline amestecate cu albumină serică. De preferință, produsul este formulat ca un produs liofilizat, folosind excipiente corespunzătoare [de exemplu, sucroză). Dacă se dorește, pot fi incluși și alți purtători standard ca, diluenți sau exci- 1130 piente. Alte compoziții exemplificatoare, sunt tampon tris pH=8,0 și tampon acetat pH=5,0 și care, în fiecare caz, pot include suplimentar și sorbitol.

Compozițiile care au fost prezentate pot fi administrate sistemic parenteral. Alternativ, compozițiile pot fi administrate intravenos sau subcutanat. Când se administrează sistemic, compozițiile terapeutice care sunt utilizate în conformitate cu 1135 prezenta invenție, pot fi prezentate sub forma unei soluții apoase lipsită de pirogeni și care sunt acceptabile pentru administrare parenterală. Prepararea de astfel de soluții de proteină care sunt acceptabile din punct de vedere farmaceutic, cu pH corespunzător, izotonicitate, stabilitate și alte asemenea, este la îndemâna specialiștilor din domeniu. 1140

Regimul de dozare, care este prevăzut în metoda din prezenta invenție, pentru tratarea condițiilor descrise mai sus, va fi determinat de către persoana specialistă, luând în considerare diverși factori care modifică acțiunea medicamentelor, cum ar fi, de exemplu, vârsta, condiția generală, greutatea corporală, sexul și dieta pacientului, severitatea oricărei infecții, timpul de administrare și alți factori clinici. In general, 1145 regimul zilnic va fi în domeniul de 0,1 ...1000 pg proteină ligand Mp1 sau un fragment al acesteia/kg corp greutate corporală.

Metodele terapeutice, compozițiile și polipeptidele prezentei invenții pot fi folosite, de asemenea, singure sau în combinație cu alte citokine, receptor Mp1 solubil, factori hematopoietici, interleukine, factori de creștere sau anticorpi în tratamentul 1150 stărilor de boală care sunt caracterizate prin alte simptome decât deficiențele plachetare. S-a anticipat că o moleculă ligand Mp1 este utilă în unele forme de trombocitopenie, în combinație cu stimulatori generali ai hematopoiezei, cum ar fi, IL-3 sau GM-CFS. Alți factori stimulatori megacariocitici ca, meg-CFS, factorul celular stemic (SCF], factorul inhibitor leucemie (LIF), oncostatimul M(QMS) sau alte molecule cu 1155 activitate de sitmulare a megacariocitului pot fi, de asemenea, folosiți cu ligand Mp1. Exemple suplimentare de citokine sau factori hematopoietici pentru asemenea coadministrare includ IL-1 alfa, IL-1 beta, 11-2, !L-3, IL-4, IL-5, lL-6, IL-11, factorui-1 de stimulare al coloniei [CSF-1), GM-CSF, factorul de stimulare a coloniei de granulocite[GCFS], EPO. Interferon alfa(IFN-alfa], IFN-beta, IFN-gama. Suplimentar, el poate fi util 1160 administrării, fie simultane, fie secvențiale, a unei cantități eficiente a unui receptor Mp1 solubil de mamifer, care pare a avea un efect de producere a fragmentării megacariocitelor în plachete, o dată ce megacariocitele au atins forma matură. Astfel, administrarea ligandului Mp1 [pentru sporirea numărului megacariocitelor mature) urmată de administrarea receptorului Mp1 solubil (pentru inactivarea ligantului și 1165 permiterea megacariocitelor mature să producă plachete] este de așteptat să fie un

RO 115788 Β mijloc deosebit de eficient de stimulare a producerii de plachete. Dozajul prezentat mai sus va putea fi corectat pentru compensarea unor asemenea componente suplimentare din compoziția terapeutică. Progresul pacientului tratat se poate urmări prin 1170 metode convenționale, cunoscute în domeniu.

Alte utilizări a acestor noi polipeptide, sunt în dezvoltarea anticorpilor generați prin metode standard. Astfel, anticorpii care reacționează cu liganzii Mp1 ai prezentei invenții precum și fragmentele reactive ale unor astfel de anticorpi sunt, de asemenea, de avut în vedere. Anticorpii pot fi policlonali, monoclonali, recombinați, himerici, 1175 monocatenari și/sau bispecifici, etc. Fragmentele de anticorp, pot fi orice fragment care este reactiv cu ligandul Mp1 al prezentei invenții, cum ar fi F_ab, F_ab, etc. De asemenea, prin această invenție sunt asigurați hibridomi generați prin prezentarea, ligandului Mp1 sau a unui fragment al acestuia ca antigen față de un mamifer ales, urmat de fuziunea celulelor (de exemplu, celule splenice) ale animalului cu anumite 1180 cancer pentru a crea linii celulare stabile prin tehnici cunoscute. Metodele folosite pentru a genera astfel de linii celulare și anticorpi dirijați împotriva întregii polipeptide ligand Mp1 sau unei porțiuni a acesteia cum s-a arătat în prezenta invenție, sunt de asemenea cuprinse în descrierea acestei invenții.

Anticorpii pot fi folosiți terapeutic, cum ar fi, pentru legarea inhibării legării 1185 ligandului Mp1 la receptorul său. Anticorpii pot fi folosiți, în plus, în scop de diagnosticare in vivoșî în vitro pentru detectarea prezenței ligandului Mp1 într-un fluid al corpului.

Următoarele exemple, sunt prezentate pentru o ilustrare mai deplină a prezentei invenții. Suplimentar, aceste exemple asigură realizări preferate ale invenției, 1190 dar nu înseamnă că limitează întinderea acesteia, în afară de cazurile când este indicat astfel. Metode standard pentru numeroase dintre procedurile descrise în exemplele care urmează, sau proceduri alternative adecvate, sunt prezentate în manuale de biologie moleculară, care sunt cunoscute în domeniu.

Se dau în continuare 15 exemple de realizare a invenției, în legătură cu fig. 1195 1 ...25, care reprezintă:

- fig. 1, arată o vedere de ansamblu a dezvoltării și maturării megacariocitelor și plachetelor. Deci, prezintă o vedere de ansamblu a diferitelor celule precursoare implicate în dezvoltarea megacariocitului și plachetului. Prima celulă din stânga figurii reprezintă o PPSC și celulele suplimentare din dreapta acesteia reprezintă BFU-MK, 1200 urmate de CFU-MK. Celula care este supusă endoreplicării, localizată imediat la dreapta PPSC în figură este o celulă megacariocită. Ca urmare a endomitozei, această celulă a devenit poliploidă. Următoarea structură spre dreapta include prelungiri citoplasmatice lungi care pornesc din nucleul poliploid a celulei megacariocită. în partea cea mai din stânga a figurii sunt prezentate plachete care s-au produs din fragmen1205 tarea prelungirilor citoplasmatice.

- fig.2, demonstrează că receptorul Mpl murin solubil, inhibă substanțial și complet capacitatea plasmidei la cinci câini iradiați (“canină aplastică” sau “APK”), de a induce dezvoltarea megacariocitului. Analiza pentru dezvoltarea megacariocitului a fost cea descrisă în exemplul 2 de realizare, care va fi prezentat în continuarea 1210 descrierii.

- fig.3, arată că o activitate îmbogățită de la APK 9, prin afinitate lectină și receptor Mpl, prin proceduri de cromatografie de afinitate (“ligand Mp1) stimulează creșterea celulelor 1A6.1 și că receptorul Mp1 murin solubil blochează acea creștere.

RO 115788 B

- fig.4, arată o vedere de ansamblu a etapelor de purificare împlicate în 1215 purificarea formelor 25 și 31 kd ale receptorului Mp1 canin din plasma aplastică canină.

- fig.5, prezintă purificarea ligandului Mp1 prin HPLC fază inversă (RP-HPLC). Fracțiunea 21 conține ligandul Mp1 31 kd înalt purificat; fracțiunea 22 conține un amestec ale liganzilor Mp1 31 și 25 kd și fracția 23 conține ligandul Mp1 25 kd înalt 1220 purificat.

- fig.6, arată o comparație a activităților ligandului Mp1 din fracțiunile HPLÎn fază inversă (coloană 04), care conține proteine ligand Mp1 25 și/sau 31 kd.

- fig.7, arată numărul megacariocitelor produse din culturi de celule sanguine periferice selectate CD 34 stimulate cu APK9, ligand Mp1 și diverși alți factori. 1225

- fig.8, arată numărul total al leucocitelor produse din culturi de celule sanguine periferice selectate CD34 stimulate cu APK9, ligand Mpl și diverși alți factori.

- fig.9, arată procentul megacariocitelor care sunt produse în culturi de celule sanguine periferice selectate CD34, stimulate cu APK9, ligand Mp1 și diverși alți factori. 1230

- fig. 10, arată că IL-3 umană nu este implicată în dezvoltarea megacariocitului, indusă ligand Mp1.

- fig. 11, arată cADN-ul și secvențele aminoacide deduse ale MGDF-1 și MGDF-2 umane.

- fig. 12, arată cADN-ul și secvențele aminoacide deduse ale MGDF-3. 1235

- fig. 13, prezintă o comparație între MGDF-1 și MGDF-uri (liganzi Mp1) dintr-o sursă canină (A) și o sursă murină (B).

- fig. 14, arată un exemplu de acilare a MGDF, folosind esteri activi N-hidroxisuccinimidul (NHS) și mono-metoxi-polietilenglicol pentru a rezulta un produs poli-pegilat. ¹240

- fig. 15, prezintă un exemplu de alchilare reductivă nespecifică MGDF folosind aldehide mono-metoxi-polietilenglicol pentru a obține un produs poli-peg-ilat.

- fig. 16, arată un exemplu de alchilare reductivă specifică de sit MGDF gruparea Λ+amino a restului N-terminal, folosind un produs substanțial mono-peg-ilat.

- fig. 17, prezintă analiza HPLC de excludere de mărime (SEC) a conjugatelor 1245 MePEG-MGDF preparate folosind derivați activi și MW 20 kDa MePEG.

A. conjugat poli-MePEG-MGDF preparat prin acilare cu esterul NHS al MePEG(PEG 11);

B. Conjugat poli-MePEG-MGDF preparat prin alchilare MGDF cu aldehidă NaPEG[PEG 20); 1250

C. Conjugat mono-MePEG-MGDF preparat prin alchilare MGDF cu aldehidă MePEG(PEG 16],

- fig. 18, prezintă numărători de plachete de la șoareci tratați cu MGDF uman recombinant, romburi deschise - MGDF 22-353 derivat CHO; cercuri deschise; MGDF 22-184 nepeg-ilat, E.coli (adică MGDF-1-163) și cercuri-închise-MGDF peg-ilat E.coli. 1255

- fig. 19 , arată o diagramă de purificare pentru r-HuMGDF.

- fig.20, prezintă efectul r-HuMGDF(E-co//1-163) asupra numărului de plachete într-un model carboplatină murin. Șoareci Balb/c s-au injectat intraperitoneal cu o singură doză de carboplatină [1,25 mg/șoarece) în ziua 0. Grupul care nu a primit carboplatină a primit doar excipient. După 24 h animalele tratate cu carboplatină s-au 1260 injectat subcutanat, fie cu excipient, fie cu 100 pg/kg r-HuMGDF, zilnic, și în timpul rămas pentru studiu [n=10, pentru fiecare grup; de la 5 animale] s-a recoltat sânge la fiecare alt moment.

RO 115788 B

- fig.21, arată efectul HuMGDF(Eco//1-163] asupra numărului de plachete la șoareci tratați prin iradiere. S-au iradiat șoareci Ba!b/c cu o singură doză de 500 razi, iradiere-gama (sursă cesiu] în ziua O. Grupul care a primit doar excipient nu a fost iradiat. După 24 h, animalele iradiate s-au injectat subcutanat, fie cu excipient, fie cu 100 pg/kg r-HuMGDF zilnic, pentru perioada rămasă de experimentat (n=d pentru fiecare grup; de la 4 animale s-a recoltat sânge la fiecare alt moment],

- fig.22, arată efectul r-HuMGDF(Ecoli 1-163] asupra numărului de plachete la șoareci tratați cu o combinație de iradiere și carboplatină. Șoareci Balb/c s-au iradiat cu o singură doză de 500 razi, iradiere-gama [sursă cesiu] și au primit carboplatină [1,25 mg/șoarece] în ziua O. După 24 h, animalele compromise s-au injectat subcutanat, fie cu excipient, fie cu 100 pg/kg r-HuMGDF, zilnic pentru timpul, care a rămas pentru experiment (n=8, fiecare grup).

Fără sprijin r-HuMGDF, majoritatea animalelor nu au supraviețuit acestui experiment. în grupul de control, a supraviețuit un animal din opt animale. In grupul tratat, au supraviețuit 8 animale din 8.

- fig.23, prezintă efectul r-HuMGDF(Ecoli 1-163] asupra trombocitopeniei indusă prin iradiere la maimuță rhesus. S-au supus iradierii maimuțe rhesus (700 cGy Do.30). S-a administrat subcutanat, timp de 18 zile consecutiv, începând de la 3%, 24 h după iradiere, r-HuMGDF[n=3) sau albumină serică umană [n=9] (fiecare la 25 pg/kg/zi]. Analizele celulelor sanguine s-au realizat cu un analizator electronic de celule sanguine. Fiecare simbol reprezintă valoarea medie(+/-semn).

- fig.24, arată efectele r-HuMGDF peg-ilat și glicozilat asupra numărului de plachete la șoareci tratați cu carboplatină și iradiere. Șoarecii s-au supus la combinația de carboplatină și iradiere, așa cum s-a descris prin experimentele realizate la fig.22. S-au administrat injecții subcutanate de preparat indicat r-HuMGDF (50 pg/kg/zi), zilnic pe durata experimentului, începând la 24 h după tratament. Numărătorilor de celule sanguine s-au prelevat în ziua indicată și folosind un numărător electronic de celule.

- fig.25, arată secvența genei sintetice pentru MGDF uman recombinant, aminoacizii 1-163, având codoni E.coli optimizați.

Exemplul 1. Analiza megacariocitului uman

Plasma aplastică canină heparinizată [APK9] sau plasmă normală (NK9), s-au produs așa cum este descris în literatura de specialitate în domeniu, cu excepția că s-au eliberat spre receptori 450 razi iradiere totală a corpului.

S-au analizat APK9 și APK9 fracționat pentru capacitatea de a stimula dezvoltarea megacariocitelor umane din celule progenitoare CD34+. Celulele selectate s-au obținut din celule sanguine periferice, așa cum este descris în literatura de specialitate.

Acestea au fost incubateîn următorul mediu de cultură; mediul Iscove modificat □ulbecco suplimentat cu 1% glutamină Pen-strep și 10% heparinizat, sărac în plachete, plasmă umană AB. De asemenea, s-au inclus 2-mercaptoetanol (10^M), acid piruvic [110 pg/ml], colesterol (7, 8 pg/ml], adenozină, guanină, citidină, uridină, timidină, 2-deoxicitosină, 2-deoxiadenozină, 2-deoxiguanozină [fiecare 10 pg/ml); insulina umană recombinantă (10pg/ml), transferină umană [300 pg/ml], lipide de soia (1%); factor de creștere fibroblastic de bază uman recombinant [2 ng/ml); factor de creștere epidermală recombinant [15 ng/ml]; factor de creștere derivat plachetar (10 ng/ml]: Celulele selectate CD34 s-au depus la 2 x 10%/ml mediu de cultură, volum final 15 pl, în godeurile plăcilor microtitroare. Celulele s-au incubat 8 zile, la temperatura, de 37°C în boxe umidificate în aer și cu 5% C0₂, s-au fixat direct la

RO 115788 B godeurile de cultură, cu 1% glutaraldehidă și s-au incubat cu un amestec de anicorp monoclonal (anti-GPIb, anti-GPIIb] și anti-GPlb. Reacția imună s-a dezvoltat cu un sistem de detecție streptavidin-beta-galactozidază. Megacariocitele care au fost identificate 1315 printr-o culoare albastră s-au numărat cu un microscop cu fază inversată, la mărimea 100%. Rezultatele sunt ca numărul mediu al megacariocitelor per godeu +/-eroarea standard a mediei [SEM). In unele cazuri, datele s-au prezentat în termeni de “unități megacariocit/mr când gradul la care dezvoltarea megacariocitului indusă la o probă dată s-a normalizat față de controlul APK9, pozitiv pentru acel experiment. O unitate 1320 s-a definit ca fiind cantitatea de material care rezultă în același număr de megacariocite, ca 1 pl de APK9 standard. Activitatea s-a acceptat ca fiind datorată ligandulul Mp1, dacă ea a putut fi blocată cu 5... 10 pg/ml Mp1-X[receptor Mp1 solubil).

S-a demonstrat că APK9 că include factorul [ii] care stimulează dezvoltarea megacariocitului uman în acest sistem. Celule selectate CD34 incubate cu 10% NK9, 1325 timp de 8 zile au prezentat un număr neglijabil de megacariocite colorate albastru, în timp ce celule CD34 incubate cu 10% APK9, timp de 8 zile au prezentat un număr foarte mare de megacariocite colorate albastru.

Fig.2, arată că adăugarea de concentrații crescute de Mp1-X la sistemul de cultură megacariocite umane a crescut blocarea dezvoltării megacariocitului. La 1330 concentrații ale Mp1-X mai mari decât 5 pg/ml, inhibarea este completă. în acest experiment celule selectate CD34 s-au stimulat cu 5% APK9. Aceasta demonstrează că pentru dezvoltarea megacariocitului uman este necesară o activitate care interacționează cu Mp1-X(presupus ligand Mp1) și dovedește că ligandul Mp1 este prezent în însăși APK9. 1335

Ulterior s-a demonstrat că activitatea ligandului Mp1 necesară dezvoltării megacariocitului este prezentă în APK9. S-a diluat de 6 ori APK9 [135 ml) în mediul Iscove și s-a aplicat pe o coloană de afinitate Mp1-X. Materialul nelegat [trecut prin coloană) s-a colectat și s-a concentrat până la volumul inițial dinaintea analizei. Materialul care a fost legat s-a eluat în 10 ml soluție NaCI 1M, și 20% din cantitate 1340 s-a diafiltrat și concentrat de 4 ori pentru analiză. Celule CD34 selectate, incubate numai în mediu, nu s-au dezvoltat în megacariocite. Celule incubate în 5% APK9 (același depozit precum cel aplicat la coloană) s-a dezvoltat în 48 +/- 8 megacariocite per godeu. Celule incubate în 10% din materialul nelegat nu s-a dezvoltat în megacariocite. Celule incubate în 10%, colectate de la eluție s-au dezvoltat în 120 +/- 1345 44 megacariocite per godeu. Activitățile ambelor încărcături de coloană și depozitul de eluție au fost substanțial inhibate cu 5 pg/ml Mp1-Xîn test.

Exemplul 2. Transfecția receptorului Mp1 murin sau uman întno linie celulară murină

A. Receptor Mp 1 murin 1350

S-a subclonat cADN receptor murin de lungime întreagă într-un vector de expresie conținând un promotor transcripțional derivat de la LTR-ul virusului Sarcoma murin Moloney. S-a co-electroportat 5 pg din acest construct și 1 pg din plasmidul marker selectabil pWLNeo(Stratagena) într-o linie celulară murină dependentă IL-3 (32 D, clonă 23). Celulele s-au cultivat 5 zile pentru recuperare, apoi s-au 1355 incubat în mediul de selecție care include 800 pg/ml Geneticină [G418) și 1 ng/ml IL-3 murin. Celulele care au supraviețuit s-au înpărțit apoi, în două depozite de 2 x 10⁵ celule și s-au cultivat până la apariția unei populații care a putut fi analizată ulterior. S-au testat 6 populații pentru expresia la suprafață a receptorului Mp1 prin analiza FACS folosind un ser policlonal antipeptidă de iepure. S-a ales o populație pentru 1360 sortare FACS folosind același ser antipeptidă ca mai înainte. S-au ales clone monocelulare ale liniei celulare parentale prin creștere în 10% APK9 și Geneticină.

RO 115788 B

După selecție în AFX9, timp de 35 zile, celulele s-au menținut în 1ng/ml IL-3 murin. Una dintre aceste subclone 1A6.1 s-a folosit pentru această parte a lucrării.

B. Receptor Mp 1 uman

Secvența de lungime întreagă a receptorului Mp1 uman s-a subclonat într-un vector de expresie conținând promotorul transcripțional al virusului Sarcoma Murin Moloney [același vector ca și pentru receptorul murin). S-au transfectat 6 pg ale acestui construct și 6 pg ale unui construct retroviral amfotrofic împachetat în 3 x 10⁶ celule 293 folosind o trusă de transfecție la mamifere CaP04. Aceleași celule sau transfectat după 2 zile și din nou după 4 zile. Ziua după ultima transfecție celulele 293 s-au cultivat împreună cu linia celulară murină dependentă IL-3 [320, Clona 23], După 24 h, celulele 32 D s-au salvat și stratificat într-un gradient BSA. Celulele s-au^ extins într-un ng/ml IL-3 murin și apoi, s-au selectat pentru creștere în 20% APK9. Celulele s-au sortat pentru expresia la suprafața celulei a receptorului prin FACS folosind un ser policlonal antipeptidic de iepure. Aceste celule s-au folosit în continuare în analize.

Exemplul 3. Analiza 1A6,1 pentru ligand Mp1

S-au spălat liber de cultură IL-3 celule 1A6,1 și apoi, s-au redepus (100 celule/15 pl volum total/godeu) în plăci microtitroare de tip Terasaki în alfa- MEM suplimentat cu 10% ser fetal de vițel [FCS], Geneticină [800 pg/ml) și 1% pen/strep în diluții seriale ale probelor test. După 48 h, s-a determinat microscopic numărul celulelor viabile per godeu. O unitate de activitate s-a definit ca acea cantitate de activitate care a rezultat în 200 celule viabile per godeu. Activitatea s-a definit ca fiind datorată ligandului Mp1 dacă el a putut fi blocat complet prin includerea în analiză a 5...10 pg/ml Mp1-X. Activitatea ligandului Mp1 în APK9 a fost în medie 4400 +/539 unități/ml de plasmă aplastică. In afară de unde s-a indicat altfel, unitățile de activitate ale ligandului Mp1 sunt definite în analiza 1A6.1.

Analize cu celule transfectate cu gena receptorului Mpl uman (exemplul B] s-au realizat în principal Tn același mod ca și cu celule 1 A6.1.

Exemplul 4. Demonstrație că ligandul Mpl este prezent În plasmă aplastică sau ser de șoarece, câine, porc și surse umane

Ligandul Mp1 este prezent în plasma aplastică sau ser murin, canin, porcin și surse umane [tabelul 2], Plasma s-a colectat de la șoareci BDF1 preiradiați și la 12 zile după iradiere (500 razi).

Plasma s-a testat în testul 1A6.1 unde ea a demonstrat activitate 2000 unități/ml care a fost aproape complet inhibabilă cuMp1-X (10 pg/ml). Plasma de la șoarece iradiat a fost pozitivă în analiza megacariocit uman unde ea a prezentat o activitate de 1833 unități/ml. S-a colectat plasmă de la câini înaintea iradierii și la 10 zile după iradiere (450 razi). Plasma s-a testat în ambele teste 1A6.1 și megacariocit uman. S-a detectat activitate și a fost complet inhibată prin Mp1-X (10 pg/ml) în ambele analize. S-a colectat plasmă de la porci înaintea iradierii și 10 zile după iradiere (650 razi). Plasma s-a testat în analizele 1A6.1 și megacariocit uman. In ambele analize ea a prezentat activitate ligand Mp1 (s-a inhibat prin 10 pg/ml Mp1-X) comparabile celei găsite în plasmă aplastică canină. S-au obținut seruri de la oameni aplastici. Acest material s-a colectat de la pacienți cu transplant de măduvă osoasă. S-au analizat seruri de la 6 pacienți în testul 1 A6.1 unde ele au arătat o activitate de 903 unități/ml, din care 88% a fost datorată ligandului Mp1 [s-a putut inhiba cu 10 pg/ml Mp1-X). De asemenea, s-au testat seruri de la 14 pacienți aplastici în testul megacariocit uman. Ca grup, ei au prezentat activitate substanțială, 941 meg unități/ml, care a fost complet inhibată cu 10 pg/ml Mp1-X. Sunt incluse date de la

RO 115788 B

IL-3 muriri pentru demonstrarea specificității testului 1A6.1. Deși, această citokină recombinantă induce creșterea liniei celulare, ea nu este blocată prin 10 pg/ml Mp1X.

1415

Tabelul Ξ

Specii	Analiză celulară 1A6.1 (unități/ml)	Analiză meg. Uman (meg.unități/ml)
	medie	+Mp1-X	medie	+Mp1-X
Șoarece normal	0+/-0	0+/-0	0+/-0	0+/-0
Șoarece aplastic	2000	0	1833	neefectuată
Canin normal	□+/-0	0+/Ό	0+/Ό	0+/-0
Canin aplastic	4400+/-539	0+/-0	792+/0-128	0+/-0
Porcin normal	0+/-0	0+/-0	0+/-0	0+/-0
Porcin aplastic	3866+/-1136	0+/-0	1284+/-182	10+/-10
Uman normal	□+/-0	0+/-0	0+/-0	0+/-0
Uman aplastic	903+/-64	114+/-33	941+/-168	□+/-0
IL-9 murin	6000+/-565	6000+/-565	neefectuată	neefectuată

Exemplul 5, Ligandul Mpl stimulează creșterea celulei 1A6.1 și dezvoltarea megacariocitului uman 1430

Ligandul Mp1 [îmbogățit, de cel puțin, circa 100000 ori) după procedurile de cromatografie lectină și afinitate (vezi exemplul 6] stimulează creșterea liniei celulare 1A6.1 și dezvoltarea megacariocitelor umane din celule sanguine periferice alese CD34 într-un mod dependent de doză. Responsabil de activitate este ligandul Mp1, așa cum s-a arătat în fig. 2 și 3, deoarece în ambele analize activitățile au putut fi 1435 blocate complet cu Mp1-X.

De asemenea, s-a dovedit de către inventatori că celulele sanguine periferice CD34⁺ purificate FACS, când s-a incubatîn ligand Mpl (100 unități pe ml, timp de 9 zile, în acest caz), se dezvoltă în megacariocite mature normal fenotipic. Aceasta stabilește că ligandul Mp1 purificat are același efect asupra megacariocitelor ca și cel 1440 al APK9 brut. Mai mult decât atât, acest experiment a folosit celule CD34⁺ purificate (CD34⁺ 100%), spre deosebire de celulele selectate CD34, care, în general, sunt doar 3050% CD34L

Exemplul 6. Purificarea ligandului Mpl canin

Rezumat: 1445

Proteinele (25 kd și 31 kd] care prezintă activitățile presupuse ca ligand pentru receptorul Mp1 s-au purificat. Proteinele s-au purificat din plasmă de câini iradiați printr-o schemă folosind cromatografia de afinitate aglutinină din germen de grâu [WGA], cromatografia de afinitate receptor Mp1, cromatografia de schimb anionic, cromatografia de filtrare în gel și HPLCîn fază inversă C4.A se vedea fig.4, pentru o 1450 vedere de ansamblu a acestei scheme de purificare. Liganzii 25 kd și 31 kd au fost purificați strict, până la omogenitate aparentă și s-au determinat secvențele aminoacide care au fost descrise.

RO 115788 B

Metode:

A. Clarificarea plasmei

Plasma înghețată [un total de 90 I] de la câini iradiați [vezi în exemplul de mai sus) s-a desghețat peste noapte, la temperatura de 4°C, desghețarea recipientelor mai mari s-a inițiat la temperatura camerei câteva ore înaintea lăsării în camera rece. Materialul insolubil s-a îndepărtat prin centrifugare, timp de 6 h, la turația de 11000 x g. Plasma obținută s-a diluat cu fosfat salin tamponat pH=7,3, care conține 0,1% azidă de sodiu (PBS/azidă) și s-a filtrat printr-un filtru, de 1,0 pm. Procedura de clarificare a dus de obicei la o diluție de aproximativ 2 ori, a materialului inițial.

B. Cromatografie de afinitate aglutinină de germen de grâu

Toate operațiunile s-au realizat, la temperatura de 4°C. Plasma clarificată [în două bazine) s-a aplicat pe o coloană de aglutinină din grâu germinat imobilizată [1 l, 10 x 12 cm], echilibrată în PBS/azidă. După aplicarea probei, materialul nelegat din coloană s-a spălat cu PBS/azidă, urmat de o spălare cu NaCI 0,5 M, în tampon tris 20 mM, pH=8. Activitatea ligandului Mp1 legat de coloană WGA s-a eluat cu Nacetilglucozamină 0,35 M (GIcNAc], NaCI 0,5 M, tris-HCI 20 mM, pH=8. Nu s-a putut detecta activitate de ligand Mp1, în ceea ce a trecut prin coloană sau în fracțiunile de spălare.

C. Cromatografie de afinitate receptor Mp 1-X

Receptorul Mp1 solubil murin [Mp1-X], care s-a folosit a corespuns la întreg domeniul extraceluiar al receptorului Mp1, mai puțin Trp la poziția 483 (date cunoscute din literatura de specialitate). In scopul optimizării legării ligandului Mp1, la coloana de afinitate receptor Mp1-X, depozitul de eluție WGA s-a concentrat folosind o membrană de ultrafiltrare [greutate moleculară de separare 10000, YE-10) și s-a corectat NaCI, la 0,2 M diluție ulterioară. Depozitul WGA concentrat s-a aplicat pe o coloană Sepharoză 20 ml m-Mp1-X per/ml de rășină] la o rată de curgere de 0,9 ml/min. Coloana s-a spălat cu 40 ml de PBS/azidă la 1,5 ml/min, urmat de o spălare puternic alcalină (405 ml) cu tris-HCI 10 mM, NaCI 1M, CHAPS 1mM, pH=8,9. în continuare, coloana a fost eluată cu CAPS 20 mM, NaCI 1M, CAPS 5 mM pH=10,5. S-au colectat fracțiunile corespunzătoare. S-a adăugat tris la fiecare fracțiune, pentru neutralizarea pH-ului.

Atât, SDS-PAGE, cât și absorbția la 280 nm a profilului de eluție a unei coloane de afinitate receptor Mp1-X au arătat un maxim timpuriu al proteinei în fracțiunile 1 -4, în timp ce majoritatea activităii ligandului Mp1 a eluat după fracțiunea 5.

D. Cromatografia de schimb anionic mono-O

Fracțiunea cu cea mai ridicată puritate de la câteva coloane de afinitate receptor Mp 1-X, s-au combinat, s-au concentrat și s-au diafiltrat contra tris-HCI 20 mM, CHAPS 5 mM pH=8,7, până la un volum final de 58,5 ml. Concentrația proteinei s-a estimat a fi, prin absorbanță, la 280 nm 0,12 mg/ml (proteina totală aproximativ 7 mg). Depozitul s-a încărcat la 0,5 ml/min, pe c coloană MoncQ 5/5 echilibrată cu tris-HCI 20 mM, CHAPS 5 mM, pH= 8,7. Coloană s-a eluat cu un gradient liniar până la 0,36 M NaCI, în același tampon pentru 27 min. Apoi, coloana s-a spălat cu un gradient timp ,de până la 0,54 M NaCI și, în final, o etapă de spălare la 0,9 M NaCI. S-a colectat 1 ml fracțiune.

Profilul eluției coloanei Mono Q a arătat că nici un ligand Mp1 și proteină neglijabilă, s-au putut detecta în fracțiunile trecute prin coloană și cele de spălare. Mult din activitatea ligandului Mp1 eluează în fracțiunile 5...7, în timpul etapelor inițiale ale gradientului NaCI. Un umăr” al activității se observă îh fracțiunile 8...10, urmat de un al doilea maxim principal, care cuprinde fracțiunile 11... 15.

RO 115788 Β

Prin SDS-PAGE s-a observat [în condiții nereducătoare] o bandă distinctă 25 kd în fracțiunile active. Intensitatea benzii corespunde direct cu activitatea ligandului Mpl, din fracțiuni. Banda a fost observată în fracțiunile 3 și 4 [fără activitate). Nu a 1505 fost proieminentă în fracțiunile 5 și 6 [maximul activității 1A6,1] și o bandă colorată intens, similară, a fost prezentată în fracțiunile 11...14 [maximul activității 1A6.1). Banda este slabă în depozitul fracțiunilor 15 și 16, corespunzând cu activitatea semnificativ mai scăzută din fracțiunea 16.

E. Experimente de eluție În gel 1510

Experimente de eluție în gel s-au realizat folosind alicote ale fracțiunilor MonoQ 6 și 5 sau fracțiunile MonoQ 13 și 14. Pentru aceste experimente, depozitele fracțiunilor 5 și 6 [6 μΙ, fiecare) sau 13 și 14 [7,5 μΙ, fiecare] s-au amestecat cu tampon de probă SDS-PAGE (nereducător] și s-au aplicat la geluri SDS 12%. După definitivarea electroforezei, s-au decupat rândurile de interes (1 mm] și bucățile s-au 1515 fărâmițat în bucățele mici. Bucățile s-au transferat în eprubete de centrifugare de 1,5 ml, conținând 0,5 ml PBS/CHAPS 5 mM și s-au agitat atent peste noapte, la temperatura de 4°C. In ziua următoare eprubetele s-au rotit scurt, s-a îndepărtat un alicot și proba s-a diafiltrat contra mediu Iscove suplimentat cu BSA ca purtător de proteină. Probele diafiltrate s-au supus analizei. 1520

Rezultatele au arătat că pot fi observate două maxime de activitate ligand Mp1. Un maxim corespunde regiunii 25 kd a gelului, în timp ce un al doilea maxim de activitate ligand Mp1 se observă în regiunea 31 kd.

F. Filtrarea în gel Superdex 200

Fracțuniile 13...16 de la coloana de schimb anionic MonoQ, precum și două 1525 fracțiuni echivalente de la □ a doua fracționare MonoQ s-au combinat, și s-au concentrat folosind membrană de ultrafiltrare [Centricon-10], S-a adăugat SDS până la o concentrație finală de 0,1% și proba s-a injectat pe o coloană Superdex 200 HR 10/30. Coloana s-a echilibrat în tris-HCI 50 mM, 0,1% SDS, pH=7,5, la o rată de curgere de 0,3 ml/min și s-a pus să funcționeze la temperatura camerei. S-au 1530 colectat fracțiuni, timp de 1 min. Rezultatele au fost, că majoritatea proteinei din probă eluează, în fracțiunile 32-40, în timp ce activitatea ligandului Mpl se detectează, în fracțiunile 42-46. Analiza fracțiunilor SDS-PSGE a arătat o bandă distinctă 25 kd în fracțiunile active.

G. HPLC în fază inversă 04 1535

Fracțiunile Superdex 200 43-46 sau, numai fracțiunea 42 s-au concentrat folosind o membrană de ultrafiltrare [Microcon-10], Depozitele concentrate s-au aplicat separat la o coloană C4 microbor fază inversă de 1 x 100 mm (SyhChropak RP-4], Coloana s-a echilibrat în 0,4% TFA în apă [tampon A]; tamponul B a fost 0,0335% TFA, în 80% acetonitril. După injectarea probei, s-a realizat un gradient 1540 linear până la 45% B în patru minute, urmat de un gradient linear până la 75%, în 40 min. Rata de curgere a fost 75 μΙ/min. Rezultatele purificării fracțiunii 42 sunt prezentate în fig.5. S-au observat maxime de activitate ligand Mp1 distincte în fracțiunile 21...23. Aceste fracțiuni s-au analizat pe un gel de poliacrilamidă 14%în condiții nereducătoare și condiții reducătoare. Fracțiunea 21 a fost compusă dintr-o 1545 bandă unică 31 kd. Fracțiunea 23 a fost compusă dintr-o singură bandă largă 25 kd; și fracțiunea 22 a conținut benzi în ambele regiuni 25 kd și 31 kd. Nu au fost vizibile alte benzi semnificative. De remarcat faptul că, experimentele de eluție timpurie a gelului au atribuit activitate de ligand Mp1 la ambele dintre aceste regiuni. S-a observat o singură bandă minoră de greutate moleculară ridicată în toate fracțiile 1550 gelului nereducător dar nu s-a observat în gelul reducător.

RO 115788 B

H. Analiza secvenței N-terminale a liganzilor Mp 1 de 25 kd și 31 kd

Analiza secvenței N-terminale s-a efectuat asupra fracțiunilor HPLC-RP 04, care conține activitate. Secvențele determinate pentru aceste proteine sunt descrise mai sus. în plus, la secvența principală care corespunde benzii 25 kd (cel puțin 90% din totalul probei aplicate), secvențarea a detectat două secvențe minore [care au fost asociate cu banda minoră de contaminare, descrisă în secțiunea C de mai sus). Comparații cu secvențe cunoscute arată că secvențele minore au fost catenele Ig grea și Kappa canine. Dacă se dorește, aceste impurități pot fi reduse cantitativ ulterior prin aplicarea unei alte etape de purificare, cum ar fi, de preferință, altă etapă de filtrare în gel.

/. Comparația activităților ligandului Mp 1 În fracțiunile purificate C4

Fi g. 6 prezintă date care demonstrează că, activitățile prezente în fracțiunile 22 și 23 de la etapa de cromatografie HPLC-RP C4 sunt, în principal, echivalente. Fracțiunea 22 a conținut un amestec al benzilor 25 și 31 kd, în timp ce fracțiunea 23 a conținut numai banda 25 kd. Alicote ale fiecărei fracțiuni s-au diluat 1:45000. Fracțiunile diluate au stimulat creșterea celulei 1A6,1 în mod substanțial egal (fracțiunea 225400 celule/godeu; fracțiunea 236000 celule/godeu). Fracțiunile diluate s-au incubat cu concentrații crescute Mp1-X. Fracțiunile au fost egal sensibile la inhibare prin Mp1-X, ambele fiind complet blocate cu 7...1,4 pg/ml. Aceasta arată că proteina(le) activă din fiecare fracțiune este specie de ligand Mp1 cu activitate biologică echivalentă.

Exemplul 7. Comparația ligandului Mp1 față de alți factori privind dezvoltarea megacariocitului

Un număr de factori recombinanți sau compuși organici, precum forbolacetatul miristic (PMA) au fost raportați a avea un impact asupra creșterii sau dezvoltării megacariocitului. Pentru conformitate, s-au investigat efectele acestor factori asupra celulelor sanguine periferice, s-au adăugat la culturi așa cum s-a indicat interleukină 3 umană recombinantă [IL-3, 1-2 g/ml], factorul celulei stemice (SCF, 50 ng/ml], interleukină 6(IL-6, 25 ng/ml), eritropoietină (EPO, 1 unitate/ml), factorul inhibitor leucemie (LIF, 10 ng/ml) și factorul stimulator al coloniei granulocită-macrofag (GMCSF, 25 ng/ml]; interleukină-11 (IL-11, 25 ng/ml]; forbolacetat miristic (PMA, 1O¹⁰ M). Ligandul Mp1 s-a folosit la 275 unități/ml, iar APK9 s-a folosit la 5% (echivalent la 220 unități/ml). Factorii testați în combinație, au fost la aceeași concentrație ca atunci când s-au testat individual. După 8 zile de cultură, celulele s-au fixat direct în godeuri și s-au colorat pentru megacariocite (n=6 per condiție], sau s-a evaluat numărul total de celule (n=3 godeuri/condiție]. Datele s-au prezentat ca medie +/- SEM.

Fi g. 7 arată că APK9 și ligandul Mp1 au dat cel mai mare număr de megacariocite per godeu. De asemenea, IL-3 a avut ca urmare dezvoltarea megacariocitului, în special, în combinație cu SCF. IL-6, L-11 sau EPO au avut efect scăzut asupra numărului de megacariocite, atât singure, cât și în combinație cu L-3, PMA, LIF, și GM-CSF au avut efect scăzut. în fig.8 sunt date de la același experiment, care arată numărul total al leucocitelor găsite per godeu (“celularitatea). APK9 și ligandul Mp1 au avut efect redus asupra celularității în timp ce IL-3 și SCF au avut efecte moderate. Datele prezentate în fig .7 și 8, s-au folosit pentru calcularea procentelor de megacariocite per godeu, așa cum s-a arătat în fig.9. în mod clar, factorul care a dat cel mai mare procent de megacariocite per godeu de cultură este ligandul Mp1, ingredientul activ din APK9. Aceasta este indicator al specificității ligandului Mp1 față de megacariocite.

RO 115788 Β

Exemplul 8 .Activitatea de susținere a megacariocitului a ligandului Mpl nu 1600 este dependent de IL-3 uman

Ligandul Mp1 stimulează dezvoltarea megacariocitelor umane când s-a folosit ca supliment pentru mediul de cultură, descris în exmeplul 1. Deși IL-3 nu este un ingredient al mediului, el poate fi prezent în plasma umană normală la niveluri, atât de scăzute, încât să fie nedetectabil în mediu. Totuși, chiar dacă este prezent, IL-3 nu 1605 este implicat în megacariopoieza indusă prin ligand Mp1. Aceasta este prezentată în fig.10. De asemenea, IL-3 la 2 ng/ml conține o activitate în testul megacariocitului uman de 14900 unități megacariocite per ml. Această activitate s-a inhibat 97% cu anti-IL-3 (3,3 pg/ml). Ligandul Mp1 la 8203 unități megacariocit/ml nu a fost inhibat cu anti-IL-3. ,1610

Exemplul 9. Analiza ligandului Mpl porcin

Proteinele din plasma de porc iradiată având activitate de ligand Mp1 au fost caracterizate prin cromatografie de ligand Mp1 afinitate WGA cromatografie de afinitate receptor Mp1, cromatografie de schimb ionic și HPLC, în fază inversă C4. Activitatea s-a caracterizat, de asemenea, prin eluție din fragmentele de geluri SDS- 1615 poliacrilamidă.

Cromatografie	Comentarii
Coloană de afinitate WGA	4,4 x 10® unități aplicate 3,4 x 10® unități recuperate
Coloană receptor Mp1	2,7 x 10s unități aplicate 2,4 x 10B unități recuperate
Schimb ionic Mono S pH=6,0	2,4 x 10® unități aplicate 4,4 x 10® unități recuperate
HPLC fază inversă C4	Activitate recuperată în fracțiunile 23-25
Experimente de eluție din gel	S-au distins clar două activități, una la aproximativ 18 kd, alta la aproximativ 28 kd

1625

Exemplul 10. Clonarea ligandului Mpl uman, MGDF uman

In cele ce urmează s-au abordat și subliniat două aspecte:

/. Primul exemplu de abordare a donării

A. Generarea sondei MGDF uman

S-au desemnat un număr de primeri PCR pe baza secvenței amino terminale 1630 a proteinei canine. S-au folosit perechi diferite de primeri pentru aplicarea genei MGDF de la ADN genomic uman. După 40 cicluri de amplificare, folosind primerii sens, 5' GCN CCN CCN GCN TGY GA 3’ (SECV ID nr.4), care codifică primii cinci aminoacizi ai proteinei canine [SECV ID nr. 1) și primerul antisens: 5' GCA RTG YAA CAC RTG NGA RTC 3' (SECV ID nr.5), care codifică aminoacizii 16-21 ai SECV ID nr.1, produsul 1635 PCR a fost pus pe un gel de agaroză 2,0% în tampon TBE.

S-a decupat banda 63bp din gelul de agaroză și s-a reamplificat folosind același set de primeri. Produsul PCR s-a donat în vectorul PCR II (Invitrogen). Un număr de colonii s-au selectat prin secvențare ADN. Plasmidul ADN, care codifică o peptidă similară a proteinei MGDF canină s-a folosit ca sursă pentru a genera o sondă 1640 radioactivă pentru cercetarea bibliotecilor cADN. Secvența aminoacidă codificată prin fragmentul de genă este precum urmează:

Ala-Pro-Pro-Ala-Cys-Asp-Leu-Arg-Val-Leu-Ser-Lys-Leu-Leu-Arg-Asp-Ser-His-Val-LeuHis [SECV ID nr.6).

RO 115788 B

1645 Banda de agaroză, care conține MGDF uman s-a folosit pentru generarea sondei prin PCR fierbinte. O reacție PCR tipică, de 100 μΙ a conținut următoarele ingrediente:

1650

1655

1660

matriță ADN	2...3 μΙ
primer 5' [SECV ID nr.4]	1 μΙ, 20 pmol
primer 3' [SECV ID nr.5]	1 μΙ, 20 pmol
10 x tampon	10 μΙ
dATP (0,1 mM)	2 μΙ
dTTP [10 mM]	2 μΙ
dGTP [10 mM]	2 μΙ
dCTP (0,1 mM]	2 μΙ
dCTP, ρ3Ξ [10μ0/μΙ	5 μΙ
dATP, p3a (10 μθ/μΐ	5 μΙ
polimerază ADN Taq	0,5 μΙ, 2,5 unități
apă	77 μΙ
Volum total	100 μΙ

Condițiile amplificării au fost după cum urmează:

1665

încălzire inițială	94°C, 2 min
normalizare	53°C, 30 s
extensie	72°C, 30 s
denaturare	94°C, 30 s

1670 6-au realizat 40 cicluri de amplificare într-un Perkin Elmer GeneAmp System

9400

Produsul s-a purificat prin trecerea printr-o coloană de împingere (Stratagene). □in proba, de 1 pL s-a cuantificat într-un număr de scintilație. Sondele care au conținut, de la 1 până la 3 milioane per ml, s-au adăugat la amestecul de hibridizare.

1675 B. Construcția bibliotecii de ficat fetal

S-a procurat ARN poliA+ de ficat fetal uman. Pentru sinteza cARN s-au folosit circa 4 pg ARN ș i în care inițierea s-a realizat folosind un hexamer oarecare, 5' GTA CGC GTT CTA GAN NNN NNT 3' 8SECV ID nr.7] atașat la o oligonucleotidă, care conține un sit Xba I.

1680 Pentru generarea cADN dublu catenar s-a folosit protocolul Gibco-BRL. S-a ligat adaptorul EcoRI-Bst X I [Invitrogen] la cADN-ul dublu catenar urmat de digestie cu enzime de restricție Xba I. Selecția după mărime a cADN-ului s-a realizat pe o coloană Sephacryl S50D. S-au ligat cADN-urile mai mari de 40 bp la vectorul de expresie mamifer v19,8, care a fost deja digerat cu Eco Rl și Xba I. S-au transformat celule 1685 competente Eco//DH10 și biblioteca cADN s-a împărțit în 7 depozite de 100000 cADN fiecare.

RO 115788 B

C. Cercetarea bibliotecii lambda

S-a procurat rinichi fatal uman în lambda gt1 1 cu un titru de 650 milioane pfu/ml. S-au cercetat circa 2 milioane plăci cu o sondă generată prin PCRfvezi mai sus). Hibridizarea s-a făcut în 6 x SSC, 5 x Denhardt, 0,1% SDS, 100 pg/ml 1690 ADN din spermă de salmon monocatenară, timp de 15 h și la temperatura de 56°C.

S-au realizat mai multe runde de cercetare. S-a amplificat ADN de la plăci singulare și s-a hibridizat cu primerul intern 5' AGT TTA CTG AGG ACT CGG AGG 3' (SECVID nr.8), care codifică aminoacizii 7 la 13 din SECVID nr.6, pentru identificarea pozitivilor adevărați. 1695

D. Amplificarea rapidă 3' a capetelor cADN(RACE)

S-au procurat ARN poliadenilat din rinichi și ficat fetal uman. S-a transcris invers 1 pg ARN folosind ca primer oligonucleotida 5' TCC GGC CGG ATA GGC CTT TTT TTT TTT TTT 3' [SECV ID nr.9).

S-a folosit pentru generarea primei benzi cADN trusa de sintează cADN Gibco- 1700 BRL. Volumul final a fost de 30 μΙ. Reacția s-a stopat adăugând 500 mM EDTA, la o concentrație finală de 10 mM și menținerea la temperatura de -20°C. Pentru PCR inițial s-au folosit 0,5 μΙ cADN ca matriță de reacție. Primerul SECV ID nr.9 și oligonucleotida concurentă 5’ TTC GCG CGG ATA GGC CTT TTT TTT TTT TT-P 3' (SECV ID nr.1D) s-au folosit ca primeri antisens, în timp ce oligonucleptida 5' TGC GAC CTC 1705 CGA GTC CTC AG 3'[SECV ID nr. 11), care codifică aminoacizii 5-11 ai SECV ID nr. 6 ] s-a folosit ca primar sens. S-au realizat 40 cicluri de amplificare folosind următorul protocol: temperatura de 94°C, timp de 30 s. Temperatura de 65°C, timp de 30 s, temperatura de 72°C, timp de 30 s., după o incubare inițială de 2 min, la temperatura de 94°C. Pentru amplificare s-a folosit un Perkin Elmer GeneAmp System 1710 9600. Căutarea s-a realizat folosind sens 5' GAG TCC TCA GTA AAC TGC TTC GT 3' (SECV ID nr. 12), care codifică aminoacizii 8 -14 ai SECV ID nr.6, în același timp SECV ID nr.9 și SECV ID nr.1O au servit ca primeri antisens. S-au realizat 40 cicluri de amplificare cu decălire la temperatura de 65°C. Produsele PCR s-au pus pe un gel de agaroză 0,8% și apoi, s-au fotografiat în limină UV. Au fost vizibile benzi în jurul 0,8 1715 până la 1,2 kb.

Produsele PCR s-au donat, apoi în vectorul PCR. S-au cules coloniile individuale și s-au izolat plasmizii folosind trusele Qiagen catalog numărul 12143 și 12145. Secvențializarea catenelor duble colorate inițial s-a făcut folosind primerii vectorului. Secvențele s-au analizat prin diverse tipuri de software GCG. 1720

E. Extensia 5' și 3' a primerului în scopul izolării secvenței genei MGDF de lungime întreagă s-au realizat extensii 3' și 5' de primer, folosind ca matriță diferite depozite ale bibliotecii de ficat fetal. Pentru amplificarea primerului 5' al cADN-ului s-au folosit ca matriță aproximativ 20 ng de cADN din fiecare depozit. S-a folosit un primer antisens 5' GGA GTC ACG AAG 1725 CAG TTT AC 3' (SECV ID nr. 13] specific MGDF, care codifică aminoacizii 12 - 17 ai SECV ID nr.6 și 5' vector v19,8 primer sens 5' CCT TTA CTT CTA GGC CTG 3' (SECV ID nr.14). Amplificarea s-a realizat în 30 cicluri de normalizare, la temperatura de 53°C. Căutarea s-a făcut în 30 cicluri cu primerii antisens 5’ GAG GTC ACA AGC AGG AGG A 3' [SECV ID nr. 15), care codifică aminoacizii 1 - 6 ai SECV ID nr.6 și vectorul 1730 primer SECV ID nr. 14.

Pentru extensia primerului capetelor 5' ale cADN-urilor MGDF s-au folosit primerul vectorului 5' GGC ATA GTC CGG GAC GTC G 3' [SECV ID nr.16) și primerul specific MGDF 5' TCC TCC TGC TTG TGA CCT C 3' [SECV ID nr. 17) care codifică aminoacizii 1 - 6 ai SECV ID nr.6. Amplificarea s-a realizat în 30 de cicluri cu 1735 normalizare, la temperatura de 58°C.

RO 115788 B

Căutarea amplificării pentru 30 de cicluri s-a făcut folosind primerul MGDF SECV ID nr. 12 și vectorul primer SECV ID nr. 16. Au apărut benzi specifice în depozitele numerelor 1, 7 și 8 care s-au donat în vectorul PCR II. S-a purificat și secvențializat plasmidul ADN purificat din colonii singulare.

F. Izolarea clonelor MGDF umane de lungime întreagă

Numeroase dintre clonele inițiale au pierdut partea aminoterminală a MGDF, deoarece parte a secvenței MGDF s-a folosit pentru inițiere și căutare. Primerul 5' CCA GGA AGG ATT CAG GGG A 3' [SECV ID nr.18) a cărui secvență s-a obținut din experimentele de extindere a primerului 5 este, așa cum s-a descris mai sus, ca primer sens. Vectorul primer SECV ID nr. 16a servit ca primer antisens. S-au realizat 35 cicluri de amplificare cu decălire, la temperatura de 58°C. Primerul specific MGDF^ 5' CAA CAA GTC GAC CGC CAG CCA GAC ACC CCG 3' (SECV ID nr. 19] s-a folosit pentru căutare, timp de 35 cicluri. Produsul PCR s-a donat în vectorul PCR II și s-a secvențializat.

II. A doua exemplificare de abordare a donării

A. Clonarea cADN-ului N-terminal MGDF canin

S-au desemnat primeri ai oligonucleotidei degenerați pe baza secvenței aminoacide N-terminală MGDF canin, așa cum s-a descris în secțiunea anterioară și s-au folosit ca primeri în PCR-uri pentru amplificarea secvențelor cADN care codifică MGDF. S-a preparat ARN total din probe de rinichi canin prin metoda guanidină izotiocianat a lui Chomzynski și Sacchi. Prima bandă cADN s-a preparat cu un primer-adaptor oarecare 5' GGC CGG ATA GGC CAC TCN NNN NNT 3' (SECV ID nr.2O) folosind reverstranscriptază MoMULV și s-a folosit ca matriță în PCR-urile următoare.

S-a realizat PCR pe 0,5 pL circa 50 ng de cADN folosind primer A5’ GCN CCN CCN GCN TGY GA 3' (SECV ID nr.4), o catenă primer sens, care codifică aminoacizii 1 - 6 ai SECV ID nr.1 și, fie primer B 5' GCA RTG NAG NAC RTG NGA RTC 3' [SECV ID nr.5], fie primerul c 5' GCA RTG YAA NAC RTG NGA NTC 3' (SECV ID nr.21), care sunt primeri catenari antisens, care codifică aminoacizii 16-21 ai SECV ID nr.1 cu trei nucleotide extra la terminusurile 5' pentru creșterea stabilității normalizării. S-au realizat PCR cu polimeraza Tac, timp de 35-45 cicluri până când au fost aparente benzi la analiza electroforetică a gelului de agaroză. Pentru primele două cicluri ale PCR etapa de renormalizare s-a realizat, la temperatura de 37°C, timp de 2 min, pentru restul, ciclurile de renormalizare au fost, la temperatura de 50°C, timp de 1min. S-au observat benzi multiple la fiecare reacție.

Porțiunile gelului conținând benzile de mărime așteptată(66bp) s-au colectat cu vârvul unei pipete Pasteur și s-au reamplificat cu aceeași pereche de primeri. Produsele ADN s-au donat în vector PCR II [Invitrogen], când s-au urmat instrucțiunile fabricantului. S-au secvențializat trei clone și s-au găsit că se codifică într-un cadru de citire, secvența cADN MGDF canin așteptată începând din regiunea celei de a treia nucleotide a codonului 6, până la cea de a cincea nucleotidă a codonului 15. Una dintre aceste clone a servit ca matriță pentru prepararea unei sonde cADN MGDF canină marcată.

B. Construcția bibliotecii cADN din ficat fetal uman

S-a izolat ARN din ficat fetal uman, prin lipsa țesutului, în 5,5 M guanidină tiocianat și, apoi, purificat prin centrifugări CsTFA. S-a selectat ARN poliadenilat folosind oligonucleotida [dT)₂₅ dynabeads. S-a produs cADN dublu/catenar de la acest ARN folosind sistemul plamid superscript pentru sinteza cADN, cu excepția că s-a folosit un liker adaptor diferit: 5' TTC GTC TGC ACT TGT G 3' (SECV ID nr.22) și 5'

RO 115788 B

CAC AAG TGC AGA CCA ACC CC 3' (SECV IO nr.23], După selecția care se face după mărime, acest cADN s-a înserat direcțional în siturile Bst XI și Not I ale vectorului de expresie mamifer pBCB [pBCB este derivat de la plasmidul Rc/CMV, Invitrogen, cuprinzând partea principală puc 19, promotor CMV și situl de poliademilare BGH). ADN-ul ligat s-a electroporat în tulpina bacteriană electrocompetentă, 1GB. 1790

C. Cercetarea bibliotecii cADN de ficat fetal uman pentru MGDF

S-au hibridizat filtre replici ale bibliotecii de ficat fetal uman la produsul PCR cADN N-terminal MGDF canin marcat radioactiv (5 x SSPE, 2 x Denhardt, 0,05 pirofosfat de sodiu, 0,5% SDS, 100 pg/ml tARN din lizat de drojdie și 100 pg/ml ADN denaturat din spermă de salmon], la temperatura de 64°C, timp de 18 Ji. 1795 Filtrele s-au spălat, la temperatura de 64°C, în 5 x SSPE, 0,5% SDS și s-au expus peste noapte. S-au izolat și s-au analizat două clone diferite, care hibridizează în aceas tă sondă.

D. Expresia elenelor cADN MGDF uman

S-a transfectat ADN purificat de la clone cADN MGDF în celule 293 1800 EBNA(lnvitrogen). S-a amestecat 1,5 pg ADN cu 7,5 pl lipofectamină în 100 μΙ DMEM fără ser. După o incubare, de 20 min, la temperatura camerei, amestecul ADNlipofectamină s-a adăugat la 5 x 10⁵ celule per godeu (plăci Greiner cu 24 godeuri pătrate) în 400 μΙ DMEM, 1% ser (clonă fetală II] și s-a incubat 6 h, la temperatura de 37°C. La celule s-a adăugat 5DD μΙ DMEM, 20% ser (clonă fetală II). După o 1805 perioadă de 16 h s-a aspirat mediul și s-au adăugat 500 μΙ DMEM și 1% ser [clonă fetală II). Mediul s-a colectat condiționat 72 h, mai târziu și s-a centrifugat, printr-un filtru spin, de 0,22 μ. Mediul condiționat s-a analizat pentru activitate biologică MGDF.

///. Descrierea și activitatea clonelor MGDF umane

Pe baza strategiilor de donare descrise mai sus s-au obținut clonele cADN 1810 umane prezentate în fig. 11 [MGDF-1 și MGDF-2; SECV ID nr.24 și 25] și fig.12 [MGDF-3; SECV ID nr.26]. Fiecare dintre aceste secvențe din figuri conține o presupusă secvență semnal a aminoacizilor 1-2,1 astfel că proteinele mature încep de la aminoacidul 22, în fiecare caz.

Rezultatele aminoacizilor analizelor de activitate, folosind testul bazat pe celulă 1815 care este descris în exemplul arătat mai sus cu MGDF-urile 1 - 3 și sunt prezentate în tabelele 3 și 4, care urmează. Astfel, în tabelul 3, s-a colectat mediu de la celule 293 EBNA transfectate cu fiecare dintre constructe după 2 zile de cultură și apoi, s-a testat pe celule 1A6,1(32D/mur-Mp1+) +/-10 pg/ml mur-Mp1-X. în tabelul 4, s-a colectat mediul condiționat de la celule 293 EBNA transfectate cu fiecare 1820 construct după patru zile de cultură apoi, s-a testat pe celule 32D/mur-Mp1 + [Exemplul 2A] și 32D/hu-Mp1+ (Exemplul 2B). Așa cum se observă, MGDF-1 și MGDF-2 umane, dar nu și MGDF-3, s-au găsit a fi active asupra liniilor celulare, care exprimă ambele forme ale Mp1 murină și umană. Linia celulară care exprimă receptorul Mp1 uman răspunde mai bine la MGDF-1 și MGDF-2 uman decât răspunde 1825 linia celulară care exprimă receptorul Mp1 murin.

RO 115788 B

Tabelul 3

Clonă	U/ml	U/ml
(-mur-Mp1-X)	(+mur-Mp1-X)
Mediu	□	0
PBCO(plasmid control)	0	0
MGDF-1	12800	800
MGDF-1 [repetiție]	12800	566
MGDF-2	4525	400
MGDF-2[repetiție)	12800	1131
MGDF-3	0	0
MGDF-3(repetiție)	0	0
APK9 control	4400+/-400	0

Tabelul 4

Clonă	U/ml	U/ml
[32D/mur-Mp1+]	(32D/hu-Mp1+)
MGDF-1	1600	25600
MGDF-2	6400	50000
MGDF-2(repetiție]	6400	50000-100000

Tabelul 5 care urmează arată că activitățile MGOF-1 și MGDF-2 uman asupra celulelor 32D/hu-Mp1+[Exemplul 3B] sunt aproape complet inhibate de către receptorul Mp1 uman solubil (Hu-Mp1-X). Hu-Mp1-X a fost prezentat ca mediu condițiionat colectat de la celule CHO, care produc proteina. Mediul condiționat CHO Hu-Mp1-X s-a concentrat de 120 ori și apoi, s-a adăugat la culturi în cantitate de 6,6%. Mediul condiționat de la culturi CHO de control nu a avut nici un efect asupra testului. Testul s-a realizat, așa cum a fost descris în cadrul exemplului 3B, cu excepție că celulele viabile s-au analizat după 3 zile.

Tabelul 5

Clonă	U/ml	U/m!
	(-Hu-Mp1-X)	[+Hu-Mp1-X]
MGDF-1	530	0
MGDF-2	270	□

Testul megacariocitului uman:

MGDF-1 și MGDF-2, dar nu și MGDF-3, au indus formarea de megacariocite din celule sanguine periferice selectate CD34.Experimentul descris în tabelul 6, s-a realizat în principiu, așa cum s-a descris în exemplul 1, cu excepția că celulele sanguine periferice s-au selectat CD34 fără elutriere, și cultura s-a recoltat după 7 zile.

RO 115788 B

Mediul condiționat de la fiecare construct MGDF 293 EBNA s-a folosit la un volum final 20% +/-30 pg/ml mur-Mp1-X. Controlul APK9 s-a folosit la un volum final 6%.

Tabelul 6 1870

Clonă	Megacariocite/godeu	Megacariocite/godeu
(-mur-Mp1-X)	(+mur-Mp1-X)
Vector control	0	0
APK9 control	100+/-3	0
MGDF-1	142+/-48	17+/-2
MGDF-2	100+/-3	6+/-2
MGDF-2(repetiție]	86+/-10	0
MGDF-3	2+/-2	0

Exemplul 11. Exemplul acesta descrie sinteza a 12 molecule diferite MGDF 1880 peg-ilate, PEG 9 PEG12 și PEG 14 PEG 21. în fiecare caz, molecula MGDF, care s-a peg-ilat a fost MGDF-11 derivat E.coli.(aminoacizii 22-184 numărați de la începutul peptidei semnal sau aminoacizii 1-163 numărați de la începutul proteinei mature). Detalii în legătură cu toate aceste specii peg-ilate sunt rezumate în tabelele 7 - 1 □, care sunt prezentate în cele ce urmează. 1885

11,1. Prepararea conjugaților poli-MePEG-MGDFprin acilarea MGDF cu derivați MePEG activați

Prepararea conjugatului poli-MePEG(2OkDa)-MGDF[PEG11]

S-a adăugat o soluție răcită [la temperatura, de 4°C) de MGDF [2,5 mg/ml] în tampon BICINE D,1M, pH=8, la un exces de 10 x ori molar de succinimidil 1890 propionat MePEG solid [gr.moleculară 20 kDa). Polimerul s-a agitat în condții blânde pentru dizolvarea și reacția s-a dirijat în continuare la temperatura camerei.

Mărirea modificării proteinei, în timpul cursului reacției, s-a urmărit prin HPLC de excludere după mărime (SEC), folosind coloană Superdex 200 HR 10/30 eluată cu tampon fosfat de sodiu, 0,1 M pH=6,9, la 0,7 ml/ min. 1895

Analiza HPLC SEC a amestecului de reacție, la momentul 30 min, a arătat că nu a rămas nici o proteină liberă în amestecul de reacție. La acest moment concentrația proteinei, din amestecul de reacție, s-a redus până la 1 mg/ml prin adăugare de apă sterilă și pH-ul amestecului s-a corectat la valoarea de 4, cu câteva picături de acid acetic de concentrație 0,5 M. 1900

Conjugatul MePEG-MGDF s-a separat de excesul MePEG și alte produse secundare de reacție prin cromatogragie de schimb ionic folosind rășini schimbătoare de ioni SP Sepharose HP.

Amestecul de reacție s-a încărcat (2,5 mg/ml rășină) pe coloană și MePEG s-a eluat cu trei volume din tamponul start A (fosfat de sodiu 20 mM, pH=7,2, glicerol 1905 15%) . După aceasta, conjugatul MePEG-MGDF s-a eluat folosind un gradient liniar, de la O până la 30%în voi., de 10 ori volumul coloanei tamponului final B (NaCl 1M în tamponul A). Eluentul s-a urmărit la 280 nm. Fracțiunile care constituie conjugat poli-MePEG-MGDF s-au colectat, concentrat și s-au filtrat steril.

Conjugatul purificat poli-MePEG-MGDF s-a analizat prin HPLC SEC folosind 1910 coloane de filtrare în gel TSK-GEL G4000SWXL și G2000SWXL cuplate în serii.

RO 115788 Β

Proteinele e-au decantat prin absorbantă la 280 nm. Ca markeri de greutate moleculară proteină globulare, au servit standarde BIORAD de filtrare Tn gel.

Așa cum se poate vedea în fig.17A, HPLC SEC arată două componente 1915 principale în preparare (in raport de circa 2 la 1 ] în pozițiile de eluție, care corespund proteinelor globulare de 370,9 kDa și respectiv 155,0 kDa.

Conjugații PEG 9, PEG 10 și PEG 12 s-au preparat prin acilare MGDF cu esteri succinimidil ai MePEG cu greutăți moleculare 6-50 kDa, în mod similar. Parmetri principali de reacție, care au fost folosiți în aceste preparări sunt arătați în tabelul 7, 1920 care urmează.

Rezultatele analizelor HPLC SEC ale acestor conjugați sunt prezentate în tabelul 8, care urmează.

11.2. Prepararea conjugațîlor poli-MePEG-MGDFprin alchilare reductivă MGDP cu aldehide MePEG

1925 Prepararea conjugatului poli-MePEG[2O kDa)-MGDF[PEG2O]

La o soluție care este răcită, la temperatura de 4°C și în condiții de agitare, de MGDF (2ml, 2,5 mg/ml) în fosfat de sodiu 100 mM și pH=5, conținând 20 mM NaCNBHS s-a adăugat un exces de 10 ori molar de aldehidă monometoxi-polietilenglicol(MePEG) cu greutate moleculară medie de 20 kDa, și agitând amestecarea 1930 reacției la aceeași temperatură.

Extinderea modificării proteinei în timpul reacției s-a urmărit prin HPLC SEC folosind coloană Superdex 200 HR 10/30, care este eluată cu tampon fosfat de sodiu 0,1M pH=6,9, la 0,7 ml/min.

După 16 h, analiza HPLC SEC a arătat că mai mult de 90% din cantitatea 1935 inițială a proteinei s-a modificat. La acest moment concentrația proteinei s-a adus la 1 mg/ml prin diluarea amestecului de reacție cu apă sterilă și pH-ul s-a ajustat la valoarea 4 [cu acid acetic 0,5 M].

Conjugatul MePEG-MGDF s-a separat din excesul de MePEG și alte subproduse de reacție prin cromatografie de schimb ionic, folosind cromatografia pe rășină SP 1940 Sepharose HP.

Amestecul de reacție s-a încărcat (2,5 mg/ml de rășină] pe coloană și MePEG nereacționat s-a eluat cu trei volume de coloană de tamon start A(20 mM fosfat de sodiu, pH=7,2, 15% glicerol]. După aceasta, conjugatul MePEG-MGDF s-a eluat folosind un gradient linear, de la O la 30%, în 10 voi. de coloană de tampon final B ( 1945 NaCI 1M în tampon A], Eluentul s-a urmărit la 280 nm. Fracțiunile care conțin conjugat poli-MePEG-MGDF s-au colectat, concentrat și s-au filtrat steril.

Conjugatul poli-MePEG-MGDF purificat s-a analizat prin HPLC SEC folosind coloane de filtrare în gel TSK-GEL G4000 SWXL și G200SWXL cuplate în serii. Proteinele au fost detectate prin absorbanță UV la lungimea de undă 280 nm. 1950 Standarde de filtrare în gel BIORAD au servit ca markeri de greutate moleculară de proteine globulare.

Așa cum se poate vedea în fig. 17B, HPLC SEC arată două componente principale (constituind 52% și 47% din cantitatea totală) în prepararea pozițiilor de eluție, care corespund la cele 359,4 kDa și, respectiv, 159,3 kDa proteine globulare. 1955 Vezi, de asemenea, tabelul 8, care va fi prezentat în continuare.

Conjugații PEG 18, PEG 19 și PEG 21, care sunt preparați prin alchilare reductivă MGDF cu aldehide MePEG de greutăți moleculare 6-25 kDa s-au dirijat în mod similar. Parametrii principali de reacție, care au fost folosiți în aceste preparări sunt arătați pe scurt în tableul 7, care urmează.

1960 Rezultatele analizelor HPLC SEC ale acestor conjugați sunt prezentate în tabelul

8.

RO 115788 B

11.3. Prepararea conjugalilor monometoxi-polietilenglicol-MGDF cu silul de atașare la restul alfa-amino la N-terminal

Prepararea conjugatului mono-MePEG(PO kDa]-MGDF(PEG16)

La o soluție care este răcită, la temperatura de 4°C și care este agitată, MGDF 1965 (2ml, 2,5 mg/ml] în 100 mM fosfat de sodiu, pH=5, care conține 20 mM NaCNBH3 s-a adăugat un exces de 5 ori molar de aldehidă metoxipolietilen glicol(MePEG) cu greutate moleculară medie de 20 kDa și agitarea amestecului de reacție s-a continuat la aceeași temperatură.

Extinderea modificării proteinei în timpul reacției s-a urmărit prin HPLC SEC 1970 folosind coloana Superdex 200 HR 10/30, eluată cu tampon fosfat de sodiu 0,1 M pH=6,9, la 0,7 ml/min.

După 16 h, analiza HPLC SEC a arătat că circa 90% din cantitatea totală inițială a proteinei s-a modificat. La acest moment concentrația proteinei, din amestecul de reacție, s-a redus la 1 mg/ml prin diluție cu apă sterilă și pH-ul amestecului 1975 de reacție s-a ajustat la valoarea 4, utilizând acid acetic 0,5 M.

Conjugatul mono-MePEG(2O kDa]-MGDF s-a separat din excesul de MePEG și alte suproduse de reacție prin cromatografie de schimb ionic folosind rășină de schimb ionic SP Sepharose HP.

Amestecul de reacție s-a încărcat (2,5 mg/ml de rășină) pe coloană, și MePEG 1980 nereacționat s-a eluat cu 3 voi. de coloană de tampon start A (20 mM fosfat de sodiu, pH=7,2, 15% glicerol). După acestea, conjugatul MePEG-MGDF s-a eluat folosind un gradient linear, de la O până la ,25% din tamponul final B(NaCI 1M în tampon A) în 20 voi. de coloană. Eluentul s-a urmărit la lungimea de undă 280 nm. Fracțiunile care conțin conjugat poli-MePEG-MGDF s-au colectat, s-au concentrat și s-au filtrat steril. 1985

Omogenitatea conjugatelor mono-MePEG-MGDF s-a determinat prin electroforeză ADS-PAGE folosind gradiente de geluri 4-20% preturnate(NOVEX). S-a evidențiat o bandă principală, care corespunde poziției unei proteine de 46,9 kDa.

Conjugatul poli-MePEG-MGDF s-a analizat prin HPLC SEC folosind coloane de filtrare în gel TSK-GEL G4000SWXL și G200DSWXL cuplate în serii. S-au detectat 1990 proteinele, prin absorbanță UV la lungimea de undă 280 nm. Standardele de filtrare în gel BIDRAD au servit ca markeri de greutate moleculară de proteină globulară.

Așa cum se poate vedea în fig. 17C, HPLC SEC evidențiază în preparare o componentă principală ale cărei poziții de eluție corespund proteinei globulare de 181,1 kDa. Vezi, de asemenea, tabelul 9 care urmează. 1995

Conjugați mono-MePEG-MGDF, PEG 14, PEG 15 și PEG 17, care sunt preparați prin alchilare reductivă MGDF cu aldehide MePEG de greutăți moleculare 6-25 kDa s-au dirijat în mod asemănător. Parametrii principali de reacție folosiți în aceste preparări sunt prezentați în mod sumar în tabelul 7.

Rezultatele analizelor HPLC SEC ale acestor conjugate sunt prezentate în 2D00 tabelul 9, care urmează mai departe.

RO 115788 B

Tabelul 7

Rezumatul modificărilor parametrilor reacției MGDF______________

2005	Cod	MePEG reactiv	Condiții de reacție
		Tip	GM	Conc. MGDF mg/ml	PH	Temp. [°C]	Timp (h)	Raport molar MePEG/MG DF
	PEG 9	ester NHS	6 kDa	2,5	3	T.camerei	0,5	15
	PEG 10	ester NHS	6 kDa	2,5	8	T. camerei	0,5	10
	PEG 11	ester NHS	20 kDa	2,5	8	T.camerei	0,5	10 -
2010	PEG 12	ester NHS	50 kDa	2,5	8	T.camerei	16	5
	PEG 14	aldehidă	6 kDa	2,5	5	4°C	16	5
	PEG 15	aldehidă	12 kDa	2,5	5	4°C	16	5
	PEG 16	aldehidă	20 kDa	2,5	5	4°C	16	10
	PEG 17	aldehida	25 kDa	2,5	5	4°C	16	10
2015	PEG 18	aldehidă	6 kDa	5	5	4°C	16	10
	PEG 19	aldehidă	12 kDa	5	5	4°C	16	10
	PEG 20	aldehidă	20 kDa	5	5	4°C	16	10
	PEG 21	aldehidă	25 kDa	5	5	4°C	16	10

2020 Tabelul 8

Rezultatul caracteristicilor poli-MePEG-MGDF prin HPLC SEC

	Cod	MePEG reactiv	Greutatea moleculară aparentă	Cantitate componentă [%]
prin SECV.	kDa
2D25	PEG 9	ester NHS	6 kDa	87,9 52,7	75 25 (umăr
	PEG 10	ester NHS	6 kDa	69,2 42,9	14[umăr] 86
	PEG 11	ester NHC	20 kDa	370,9 155,0	68 32
2030	PEG 12	ester NHS	50 kDa	865,6 368,0	53 47
	PEG 18	aldehidă	6 kDa	84,6 41,5	60 40
	PEG 19	aldehidă	12 kDa	218,4 106,7	59 41
2035	PEG 20	aldehidă	20 kDa	359,4 159,3	52 47
	PEG 21	aldehidă	25 kDa	450,5 218,4	54 46

RO 115788 B

Tabelul 9

2040

Greutăți moleculare aparente ale conjugatelor mono-MePEG-MGDF _
Cod	MePEG reactiv	Greut.molec. aparentă prin SEC, kDa	Greut. molec. aparentă prin SDS PAGE, kDa
	Tip	Greutate moleculară			2045
PEG 14	aldehidă	6 kDa	44,5	27,7
PEG 15	aldehidă	12 kDa	104,7	38,3
PEG 16	aldehidă	20 kDa	181,1	46,9
PEG 17	aldehidă	25 kDa	226,4	55,5
					2050

11.4. Prepararea conjugaților DiMePEG (19 kDaj-MGDF prin alchilarea reductivă a MGDF cu aldehidă metoxi poli(etilenglicol](PEGPP]

Următoarea procedură a avut ca rezultat o moleculă purificată care este denumită în continuare PEG 22.

S-a adăugat un exces de 5 ori de aldehidămetoxipolietilenglicol [MePEG: adică 2055 CHO-[CH₂)₂O-[CH₂-CH₂O]_n-CH₃: unde n=o repetiție, astfel ,încât greutatea moleculară este de circa 12 kDa, la o soluție 2,5 mg/ml de MGDF [1-163 derivat de E.coli] în 100 mM acetat de sodiu, pH=5,0, care este ținut la temperatura de 5°C. După amestecare timp de 10 min, s-a adăugat suficientă cianoborohidrură de sodiu, pentru a atinge o concentrație de 20 mM, în amestecul de reacție. Acest amestec s-a agitat, 2060 timp de 16 h, la temperatura de 5°C. La sfârșitul acestei perioade, s-a adăugat suficientă apă purificată USP pentru aducerea concentrației la 1 mg/ml. în continuare, aceasta s-a filtrat în vid printr-un filtru, de 0,2 μ. în acest mod, s-au preparat 90 mg produs de reacție. La acest amestec de produs de reacție, s-au adăugat cantități mici de fosfat monobazic 1,0 M și hidroxid de sodiu 1 N, pentru a se obține o soluție 10 2065 mM fosfat cu pH=6,8.

Conjugatul s-a purificat pe o coloană de schimb cationic.

S-a preparat o coloană 40 ml SP-Sepharose de înaltă performanță cu o înălțime a patului de 7,5 cm. Coloana s-a echilibrat cu tampon de echilibrare [10 mM fosfat, pH=6,8, cu 15% glicerol). Coloana s-a încărcat la 2,2 mg/ml rășină la 0,15 voi. de 2070 coloană [CV] pe min. Aceasta a fost urmată de o spălare cu tampon de echilibrare până când s-a atins linia de bază. Coloana s-a eluat cu un gradient linear de 10 voi. coloană tampon A [20 mM fosfat, pH=7,2, cu 15% glicerol] până la tampon B [tampon A plus 0,3 M NaCI). Rata de curgere s-a menținut la 0,15 CV/min. Fluentul obținut s-a urmărit la lungimea de undă 280 nm. 2075

S-au montat geluri SDS-PAGE ale fracțiilor și cele care conțin conjugatul DiPEG, care s-au depozitat și s-au filtrat printr-o unitate de 0,2 μ.

Exemplul 12. Activitatea biologică a moleculelor MGDF peg-ilate

A. PEG-9-PEG-19 și PEG-14-PEG-21

S-au măsurat numerele plachetelor de la șoareci tratați cu MGDF uman 2080 recombinant, și rezultatele obținute sunt prezentate în fig. 18. S-au injectat subcutanat la șoareci Balb/c normali o dată pe zi și timp de 5 zile, MGDF derivat CHO 22-353 [romburi deschise), MGDF nepeg-ilat E.coli22-184 (cercuri deschise) și MGDF-peg-ilat E.coli 22-184 (cercuri închise] la concentrațiile indicate în descrierea figurilor de mai sus.

2085

RO 115788 B

S-au colectat probe de sânge dintr-o tăietură mică laterală din vena cozii, la 24 h, după ultima injectare. Analizele celulelor sanguine s-au realizat cu un analizor de celule sanguine electronic Sysmex. Datele sunt prezentate ca medie a determinărilor la 4 animale, plus +/- eroarea standard a mediei. Alți parametri ai celulelor sanguine, cum ar fi, numerele totale de celule albe sau roșii nu au fost afectate prin acest tratament.

Au fost testate ca mai sus, forme suplimentare ale MGDF uman recombinant. Numărul plachetelor de la șoareci tratați cu 50 pg/kg/zi sau 10 pg/kg/zi ale formelor indicate ale r-Hu-MGDF sunt prezentate în tabelul 10 care urmează. Datele rezultă din media a 4 animale și au fost prezentate și erorile standard.

Tabelul IO

	50 pg/kg/zi	10 pg/kg/ml
Forma	medie (n=4)	sem	medie(n=4)	sem
CHC 22-353	4343	309	2571	80
E.coli 22-184	2021	29	1439	18
PEG 9	2728	56	2369	34
PEG 10	2431	291	1556	126
PEG 11	3778	59	1861	73
PEG 12	3885	156	1740	88
PEG 14	3567	80	2020	63
PEG 15	4402	57	2234	99
PEG 16	4511	239	3215	11
PEG 17	4140	188	3113	261
PEG 18	4586	59	2931	129
PEG 19	3980	330	4189	80
PEG 20	3942	285	3054	339
PEG 21	4195	145	4002	91
Linie de bază	939	25	-	-

Cheie la tabelul 10:

In fiecare dintre cele care urmează, molecula MGDF care a fost peg-ilată a fost MGDF-11 derivată E.coli (aminoacizii 22-184, numărând de la începutul peptidei semnal sau aminoacizii 1-163 numărând de la începutul proteinei mature), așa cum s-a descris în cadrul exemplului 11 de mai sus.

RO 115788 B

Nume	Peg-ilare	Gr. molec. medie a PEG	Molec.PEG reactivă pentru sinteză	2120
PEG 9	polipeg-ilat	6 kDa	ester NHS al MePEG
PEG 10	polipeg-ilat	6 kDa	ester NHS al MePEG
PEG 11	polipeg-ilat	20 kDa	ester NHS al MePEG
PEG 12	polipeg-ilat	50 kDa	ester NHS al MePEG	2125
PEG 14	monopeg-ilat	6 kDa	aldehidă a MePEG
PEG 15	monopeg-ilat	12 kDa	aldehidă a MePEG
PEG 16	monopeg-ilat	20 kDa	aldehidă a MePEG
PEG 17	monopeg-ilat	25 kDa	aldehidă a MePEG
PEG 18	polipeg-ilat	6 kDa	aldehidă a MePEG	2130
PEG 19	polipeg-ilat	12 kDa	aldehidă a MePEG
PEG 20	polipeg-ilat	20 kDa	aldehidă a MePEG
PEG 21	polipeg-ilat	25 kDa	aldehidă a MePEG
Numărătorile liniei de	jază sunt la animale normale, fără administrarea altui
material.				2135

Este clar că peg-ilarea MGDF uman recombinat nu afectează în mod deosebit capacitatea moleculei de creștere a numărului de plachete la animalele receptoare și de fapt, poate să crească activitatea produsului 22-184 E.coli pentru a fi la fel de mare sau mai mare decât cea observată cu molecule 22-353 derivată CHO.

B. PEG-38 2140

Rezultatele cu PEG-22 sunt prezentate în fig.24. De remarcat că, normalizarea numărului de plachete cu PEG-22 s-a întâlnit câteva zile mai devreme decât cu MGDF de lungime întreagă derivat CHO, PEG-16 sau PEG-17.

Exemplul *13. Expresia MGDF uman recombinant (1-163) în E.coli

Pentru a exprima r-Hu-MGDF în E.coli, secvența care codifică primii 163 2145 aminoacizi ai proteinei mature s-a sintetizat chimic folosind codoni E.coli. Suplimentar, s-au adăugat secvențe ADN, care codifică aminoacizii metionină și lizină la capătul 5' al genei. Prin urmare, proteina n-HuMGDF codificată prin această secvență este în lungime de 165 aminoacizi începând cu Met-Mys. Secvența acestei gene este menționată în fig.25. 2150

Sinteza genei r-HuMGDF (1-163) s-a realizat în câteva etape. Inițial, s-au sintetizat chimic oligonucleotide complementare (60-70 bpîn lungime), care reprezintă fragmente alăturate ale genei și în care se folosesc codoni E.coli optimi. în timpul acestei sinteze, codonii pentru aminoacizii metionină și lizină s-au plasat la capătul 5' al genei mature, și un coton stop s-a plasat la capătul 3' al genei. în plus, s-au plasat 2155 la extrema capetelor 5’ și, respectiv, 5' ale genei situri de tăiere pentru enzimele de restricție Xbal și Hindlll, și s-a plasat un sit de legare ribozomică sintetic la o distanță corespunzătoare în amontele de inițiere al metioninei. în al doilea rând, s-au normalizat oligonucleotidele complementare, pentru fiecare fragment de gene. în al treilea rând, aceste fragmente individuale sintetice de genă s-au amplificat folosind POR. în al 2160 patrulea rând, fragmentele amplificate au fost subclonate într-un vector corespunzător. în al cincilea rând, s-au verificat secvențele fragmentelor subclonate. Un al șaselea rând, s-au ligat fragmentele individuale împreună și s-au subclonat într-un vector corespunzător reconstruind gena r-HuMEGDF(1-163) de lungime întreagă. în sfârșit, s-a verificat secvența genei reconstruite. 2165

RO 115788 B

Fragmentul genei sintetice r-HuMGDF flancat prin situri de restricție Xbal și Hind III, la capetele 5’ și .respectiv, 3', conține un sit de legare ribozomică, codonul de start ATG, secvența care codifică proteina matură Met-Lys r-HuMGDF și codonul stop. Fragmentul de mai sus s-a donat în siturile Xbal și Hindlll ale vectorului 217G pAMG11, care induce expresie lactoză. Vectorul pAMG11 este un plasmid de număr redus de copii cu o origine de replicare derivată pFUOG. Plasmidul de expresie pAMG11 poate fi derivat din plasmidul pCFM1656 [ATCC nr. 69576, depozitat pe data de 24 februarie 1994] făcând o serie de schimbări de bază prin mutageneze orientate în sit prin oligo PCR de suprapunere. Începând cu situl Bg III [plasmid bp 2175 nr.18G] imediat 5' ,față de plasmidui replicării promotorului P_CDpB Și acționând spre genele de replicare ale plasmidulu schimbările perechi de baze sunt cele care^

l	jrmează:
pAMG11 bp nr.	bp în pCFMI 656	bp schimbate în pAMG11
	nr. 204	T/A	C/G
2180	nr. 428	A/T	G/C
	nr, 509	G/C	A/T
	nr. 617	—	insert două bp G/C
	nr. 679	G/C	T/A
	nr. 980	T/A	C/G
2185	nr. 994	G/C	A/T
	nr. 1004	A/T	C/G
	nr. 1007	C/G	T/A
	nr. 1028	A/T	T/A
	nr. 1047	C/G	T/A
2190	nr. 1178	G/C	T/A
	nr. 1466	G/C	T/A
	nr. 2028	G/C	deleție bp
	nr. 2187	C/G	T/A
	nr. 2480	A/T	T/A
2195	nr. 2499-2502	AGTG TCAC	GTCA CAGT
	nr. 2642	TCCGAGC AGGCTCG	deleție bp
	nr. 3435	G/C	A/T
	nr. 3446	G/C	A/T
	nr. 3643	A/T	T/A
2200	nr. 4489-4512	-	insert bp-uri
		GAGCTCACTAGTGTCGACCTGCAG CTCGAGTGATCACAGCTGGACGTC
	[SECV IO nr. 27]

RO 115788 B și prin substituirea secvenței ADN, între siturile de restricție Aatll și Clal cu oligonucleotida următoare:2205

Aatll [nr.4358]

5' CTCATAATTTTTAAAAAATTCATTTGACAAATGCTAAAATTCTT3’ TGCAGAGTATTAAAAATTTTTTAAGTAAACTGTTTACGATTTTAAGAA-GATTAATATTCTCAATTGTGAGCGCTCACAATTTAT 3' -CTAATTATAAGAGTTAACACTCGCGAGTGTTAAATAGC 5’2210

Clal (nr.4438) (SECV ID nr.28)

Expresia lui r-HuMGDF, donat în pAMG11 este condusă printr-un promotor sintetic indus lactoză ca Ps4, care are următoarea secvență: 5'GACGTCTCATAATTTTTAAAAAATTCATTTGACAAATGCTAAA-2215

-ATTCTTGATTAATATTCTCAATTGTGAGCGCTCACAATTTATCGAT (SECV ID nr.29)

Promotorul Ps4 este represat prin represorul lactoză (Lacl]produsul genei Lacl E. coli.

Plasmidul pAMG11-r-HuMGDF a fost transformat în continuare, într-o tulpină 2220 K-12 E.coli, care conține alela lacl^q. Alela lacl^q este o mutație în promotorul Lacl, care crește expresia lui Lacl și are ca urmare un control mai stringent al expresiei proteinei din promotorul Ps4. Prin urmare, în această tulpină, în absența lactozei, expresia rHuMGDF este represată de către Lacl. La adăugarea lactozei, proteina Lacl, care leagă la sit operatorul pe promotorul Ps4 este redusă și este inițiată transcripția lui 2225 r-HuMGDF din Ps4. Celula gazdă E.coli folosită în acest exemplu este depozitată la ATCC sub nr. 69717 la 30 nov. 1994.

Gazda E.coliATCC nr.69717 s-a transformat cu plasmidul pAMG11-r-HuMGDF și a crescut în conformitate cu următoarea descriere de fermentare. Tulpina E.coli s-a inoculat în bulion Luria și apoi, s-a incubat, la temperatura, de 30°C, timp de aproxi- 2230 mativ 12 h. Celulele s-au transferat apoi aseptic într-un fermentator care conține mediu pentru șarjă [20 g/1 extract de drojdie, 3,4 g/l acid citric, 15 g/l fosfat bipotasic, 15 ml Dow P2000, 5 g/l glucoză, 1 g/l sulfat de magneziu, 5,5 ml/l urme de metale, 5,5 ml/l vitamine]. Faza de șarjă a procesului continuă până când cultura atinge o densitate optică de 5,0 ± 1,0 la 600 nm. Apoi, s-a început faza de alimen- 2235 tare în șarjă cu inițierea primei alimentări de mediu (700 g/l glucoză, 6,75 g/l sulfat de magneziu x 7 H₂0). Rata de alimentare se ajustează la fiecare două ore, după un program stabilit. Inițierea celei de a doua faze de alimentare cu mediu (129 g/l peptonă tripticazică, 285 g/l extract de drojdie] începe, când cultura atinge o densitate optică la o rată de curgere constantă, în timp ce prima alimentare de mediu 2240 continuă să fie ajustată. Temperatura în timpul întregii fermentații se menține, la aproximativ 30°C. Cultura se menține la un pH de circa 7, cu adăugare de acid sau de bază, după cum este necesar. Nivelul dorit de oxigen dizolvat se menține prin ajustarea agitării, intrării aerului și ratelor de intrare ale oxigenului în fermentator.

Când densitatea optică a culturii atinge 57...63 la 600 nm, se inițiază adăugarea celei 2245 de a treia alimentări de mediu. Cea de a treia alimentare de mediu [300 g/l lactoză) se introduce în fermentator la o rată de curgere constantă; adăugarea primului mediu este discontinuă și rata de curgere a celui de al doilea mediu de alimentare se schimbă la o nouă rată constantă. Fermentația durează, aproximativ la 10 h, după inițierea celei de a treia alimentări de mediu. La sfârșitul fermentării, cultura se 2250 răcește la 15 ± 5°C. Celulele au fost recoltate prin centrifugare. Pasta de celule care a rezultat este împachetată și apoi depozitată la mai puțin de -60°C.

RO 115788 B

Purificarea de MGDF recombinant produs în E.coli, așa cum s-a descris mai sus, s-a realizat după cum urmează. S-au suspendat 1800 g pastă de celule care au fost obținute ca mai sus, în 18 I EDTA și s-au trecut printr-un omogenizator de presiune ridicată la 15000 psi. Suspensia celulelor rupte s-a centrifugat și peletul s-a resuspendat în 10 I EDTA 10 mM. S-a centrifugat suspensia și 200 g de paiet sau solubilizat în 2 I tris 10 mM, clorhidrat de guanidină 8M, DTT 10 mM, EDTA 5 mM, pH=8,7. Această soluție s-a diluat ușor în 200 I de CAPS 10 mM, uree 3 M, glicerol 30%, cistamină 3 mM, cisteină 1 mM, pH=10,5.

Soluția diluată s-a agitat ușor la temperatura camerei, timp de 16 h și pH-ul s-a ajustat la valoarea de 6,8. Soluția cu pH-ul ajustat s-a clarificat și s-a aplicat pe o coloană Sepharose CM de capacitate de 2 I și echilibrată cu fosfat de sodiu 10 mM,^ uree 1,5 M, glicerol 15%, pH=6,8. După încărcare, coloana s-a spălat cu fosfat de sodiu 10 mM, glicerol 15%, pH=7,2. MGOF-ul s-a eluat cu un gradient de până la 0,5 M NaCI, fosfat de sodiu 10 mM, pH=7,2.

Eluatul CM s-a concentrat și s-a schimbat tamponul cu fosfat de sodiu 10 mM, pH=6,5 cu o membrană cu separare de greutate moleculară 10000. Soluția concentrată, la circa 2 mg/ml, s-a tratat cu catepsină C (raport molar 500 la 1), timp de 90 min, la temperatura ambinată.

în continuare, soluția s-a încărcat pe o coloană Sepharose SP de înaltă performanță de capacitate de 1,2 I, care este echilibrată cu fosfat de sodiu 10 mM, glicerol 15%, pH=7,2. După încărcare, s-a eluat MGDF cu un gradient de 0,1 până la NaCI 0,25 M, fosfat de sodiu 10 mM, pH=7,2.

S-a adăugat sulfat de amoniu la 0,6 M, la eluatul din coloana SP de înaltă performanță. Eluatul s-a încărcat la o coloană de 1,6 litri fenil-ToyopearI echilibrată cu fosfat de sodiu 10 mM, sulfat de amoniu 0,6 M, pH=7,2. Maximul de MGDF s-a eluat cu un gradient de O până la 0,6 M sulfat de amoniu, fosfat de sodiu 10 mM, pH=7,2.

Eluatul fenil-TopopearI s-a concentrat și s-a schimbat tamponul cu o membrană cu greutate moleculară de separare 10000 în tris 10 mM, sorbitol 5%, pH=7,5.

Exemplul 14. Proprietățile biologice in vivo ale r-Hu-MGDF [E.coli 1-163)

S-a evaluat la rozătoare, pentru eficacitate biologică, r-Hu-MGDF [E.coli 1-163), care a fost preparat așa cum s-a descris în exemplul 13 de mai sus. S-au injectat subcutanat 5 zile consecutiv cu doze crescute de r-Hu-MGDF șoareci Balb/c femele normale. Dozele au fost cuprinse în domeniu de la 15 pg/kg/zi până la 1500 pg/kg/zi.

La 20 h, după ultima injectare, s-au efectuat măsurători ale numărului de celule sanguine folosind un numărător electronic de celule (cunoscut din domeniu de specialitate). S-a observat o creștere lineară în numărul de plachete cu creșterea logaritmică a concentrațiilor de citokină. Numărul plachetelor a crescut până la 300% față de valorile de bază cu 1500 pg/kg/zi în acest sistem. Alți parametrii ai celulelor sanguine, cum ar fi, numărul de celule albe sau roșii sau hematocritul, nu au fost afectate prin acest tratament.

S-au recoltat plachete de la șobolani injectați subcutanat cu 300 pg/kg/zi r-Hu-MGDF [E.coli 1-163), timp de 6 zile și s-au evaluat pentru abilitatea lor de a agrega ca răspuns la ADP. Datele indică faptul că, plachetele de la animalele tratate nu pot fi distinse de plachetele din animale de control, în care ambele populații sunt sensibile în mod echivalent față de agonistul plachetar ADP.

S-au evaluat, de asemenea, r-Hu-.MGDF pentru capacitatea de a înlătura trombocitopenia asociată cu chemoterapia și/sau iradierea. în studii s-a folosit carboplatinul, un chemoterapeutic care produce la oameni trombocitopenie profundă.

RO 115788 B

S-au injectat subcutanat cu 1,25 mg carboplatin, la începutul studiului, șoareci Balb/c. După o perioadă de 24 h, șoarecii s-au injectat zilnic cu 1DO pg/kg/zi cu rHu-MGDF [E.coli 1-163] sau excipient pentru restul studiului. în ziua a 9-a, numărul de plachete a scăzut până la circa 15% din normal, la șoareci tratați cu excipient, dar 23D5 a rămas la nivelurile de bază la șoareci tratați cu r-Hu-MGDF (vezi fig.20]. Pentru studiile de iradiere, șoarecii au fost supuși la o singură doză de 500 razi radiație gama (sursă Cesiu], Aceasta este o doză subletală care are ca urmare o reducere 90% în numărul plachetelor în ziua 11. Numărul de plachete nu a revenit la valorile normale până în ziua 21. Când s-a administrat r-HuMGDF [E.coli 1-163] o dată pe zi (100 2310 pg/zi] la șoareci iradiați, din ziua 1 până în ziua 20, scăderea numărului de plachete a fost mai puțin severă și a revenit la nivelurile de bază mai rapid decât la șoarecii tratați cu excipient (fig.21). în scopul testării, r-HuMGDF Într-un model de trombocitopenie și prelungită, s-au aplicat în combinație carboplatin și iradiere (fig. 22], în această situație, numărul plachetelor a scăzut la niveluri extrem de mici [3-5% din 2315 normal] și majoritatea animalelor (7/8) nu au supraviețuit acestui tratament. Cu toate acestea, când aceste animale s-au tratat zilnic cu injecții subcutanate de r-HuMGDF la 100 pg/kg/zi pe întreaga durată a studiului, trombocitopenia a fost înlăturată semnificativ, revenirea la numerele de bază a fost mai rapidă și toate animalele (8/8) tratate r-HuMGDF au supraviețuit. 2320

De asemenea, s-a evaluat r-HuMGDF în situația rhesus.

Maimuțe rhesus normale au fost injectate subcutanat cu 2,5 sau 25 pg/kg/zi timp de 10 zile (ziua 0-9). în grupul cu doză mai scăzută, numărul de plachete a crescut cu 400%, în ziua 12 și în grupul cu doză mai ridicată, numărul de plachete a crescut cu 700%în ziua 12. După oprirea injectărilor, numărul plachetelor 2325 a revenit la normal în ziua 25-30. Prin acest tratament, numărul celulelor sanguine albe și roșii nu a fost afectat.

De asemenea, s-a testat r-HuMGDF [E.coli 1-163) într-un model de trombocitopenie severă la primate (fig.23). Animalele s-au supus la radiere (700 razi, sursă Cobalt) ceea ce a dus la reducere în numărul plachetelor la 1...2% din 2330 normal în ziua 15. în ziua 35...40 numărul plachetelor a revenit la normal. Spre deosebire, numărul plachetelor la animalele iradiate tratate zilnic cu r-HuMGDF [25 pg/kg/zi) a scăzut până la numai 10% din normal și în medie nu a ajuns sub 20000/pl, punctul de declanșare al transfuziilor de plachete la oamenii trombocitopenici. Revenirea la numerele de bază a fost, de asemenea, mai rapidă la 2335 animalele tratate r-HuMGDF, întâlnindu-se în ziua 20.

Aceste date in vivoîn studiile la rozătoare și primate, sprijină integral concepția că r-HuMGDF (E.coli 1-163) este un agent terapeutic potențial având capacitate de a influența semnificativ trombocitopenii relevante clinic.

Exemplul 15. Metodă pentru producerea de r-HuMGDF 1-332 în culturi, de 2340 celule CHO

S-a produs r-HuMGDF glicozilat din celule transfectate ovariene de hamster chinezesc, care exprimă un cADN pentru MGDF 1-332 sub un promotor adecvat și legat la o genă, care codifică pentru markerul de selecție amplificabil, DHFR. Un promotor adecvat pentru expresia MGDF în celule CHO este SR-alfa (cum este 2345 cunoscut din literatura de specialitate]. Un vector corespunzător pentru expresia MGDF, în celule CHO este pDSR-a/fa2 [de asemenea, cunoscut din literatura de specialitate). Exemple de linii celulare CHO pot produse MGDF secretat în domeniul 10-20 mg/l în mediul de cultură celulară standard, dar se poate crește la 25, până la mai mult sau cel puțin egal cu 100 mg/l. Pentru a produce MGDF cu o linie 2350

RO 115788 Β celulară obișnuită, o cultură poate fi extinsă prin trecere în suspensie sau în vase de cultură tisulară în modul de creștere aderent folosind mediu care cuprinde în proporții egale mediul Dulbecco modificat cu Eagle [DMEM) și HamF12 (DMEM/F12) suplimentat cu 5-10% ser fetal bovin (FBS) sau ser fetal bovin dializat și metotrexat [MTX] și [dacă este necesar, concentrația tipică a MTX este 200-600 nM) pentru menținerea presiunii de selecție. Acest mediu va fi suplimentat cu aminoacizi suplimentari neesențiali [NEAA] și glutamină. Culturile la suspensie pot fi propagate imediat prin inoculare (împărțirea) densităților de 1-4 x 10⁵ celule/ml și densități maxime de circa 1 x 10⁶ celule/ml, punct la care culturile sunt extinse prin diluțieîn volume mai mari cu densitățile celulare inițiale la densitățile de separare specificate.

Pentru a produce MGDF în baloane rotative, un volum adecvat și o densitate celulară corespunzătoare de cultură în suspensie trebuie să fie generate folosind vase rotative agitate magnetic, plasate într-un mediu controlat de temperaturi (37±1 °C] sau un sistem bioreactor tanc-agitat controlat și prevăzut cu instrumentele necesare. Baloanele rotative (cum ar fi, baloane rotative Falcon de 850 cm²) vor fi însămânțate la densități inițiale de 1,5 până la 3 x 10⁷ celule/balon și suplimentate cu mediu suplimentar de creștere [DMEM/ F12 cu 5-10% FBS, 1 x NEAA și 1 x L-glutamină) într-o cantitate adecvată pentru a genera un monostrat confluent în 3-4 zile (150 - 300 ml/balon). Mediul de creștere va fi tamponat în mod corespunzător cu bicarbonat de sodiu la un pH de 6,9 până la 7,2 în echilibru cu dioxid de carbon la o presiune parțială de 60-90 mmHg. Baloanele vor fi alimentate cu gaz cu 10% C0₂/aer și incubate pe suporturi rotative [circa 1 rot/min), la temperatura de 37 ± 1°C, timp de 3-4 zile. La confluență, baloanele rotative vor fi schimbate la mediul de producere fără aer, prin golirea sau aspirarea mediului de creștere; spălarea baloanelor cu un tampon izotonic, cum ar fi, Dulbecco fosfat salin tamponat (D-PBS), 50-100 ml/balon, apoi, adăugarea unui volum corespunzător de DMEM/F12 lipsit de ser tamponat bicarbonat (1:1)(200-300 ml/balon] suplimentat cu NEAA și L-glutamină și cu sulfat de cupru pentru micșorarea agregării covalente (1-20 pM], Baloanele vor fi alimentate cu 10% C0₂/aer și incubate 6±1 zile, la temperatura de 37±1°C, pe suporturi rotative [circa 1 rot/min] sau până când activitatea metabolică a condus nivelul de glucoza sub 0,5 g/l și/sau nivelulpH-ului sub 6,6. Mediul condiționat va fi recoltat prin turnare sau aspirare din baloane și înlocuit cu mediul proaspăt, care este lipsit de ser, așa cum s-a descris mai sus pentru recoltări suplimentare. Aceasta poate continua, până când celulele nu mai pot fi susținute de mediul lipsit de ser și se desprind de baloanele rotative.

Mediul condiționat recoltat, poate fi prelucrat pentru purificare prin microfiltrare prin filtre 0,45 pm și/sau 0,2 pm. Mediul condiționat filtrat va fi răcit la temperatura de 4°C și apoi, va fi depozitat, la temperatura de 4°C, concentrat imediat și dializat la tărie ionică joasă folosind un sistem de ultrafiltrare cross-flow (Filtron YM50). Ultrafiltrarea și diafiltrarea ar putea avea loc, la 4°C pentru micșorarea degradării proteinei. Mediul condiționat va fi dializat cu o soluție apoasă tamponată [fosfat de potasiu 10 mM, pH=6,8) înaintea etapelor de purificare cromatografică.

Calitatea produsului din mediul condiționat se poate urmări cel mai bine folosind urmele Western SDS-PAGE, nereducător, care poate arăta cantitățile relative de MGDF agregate, monomerice și degradate proteolitic din probe.

Altă metodă, pentru producerea MGDF din celule CHO, va fi adaptarea unei linii celulare, care exprimă MGDF la un mediu lipsit de ser, cum ar fi Gibco S-SFM II. Celulele pot fi adaptate prin pasaje seriale în mediul care conține suplimente minime de ser sau sunt lipsite de astfel de suplimente. Dacă o linie celulară se găsește, ea crește susținut într-un asemenea mediu, în același timp, producând cantități adecvate

RO 115788 B de MGDF secretat; producția poate fi făcută prin trecerea la scară mare a unei culturi inocul prin intermediul pasajelor seriale în volume de culturi mai mari, apoi, inocularea unui vas de producție corespunzător (un bioreactor tanc-agitat controlat și prevăzut cu instrumentele necesare] și lăsarea culturii să prolifereze la densitatea sa viabilă maximă, în condiții optime de creștere (pH, nutrienți, temperatură, oxigen, agitare). 2405 La punctul de producere optimă (determinat experimental, prin măsurarea cantității și calității produsului], cultura poate fi recoltată din bioreactor și celulele pot fi îndepărtate din mediul condiționat prin filtrare la scară micrometrică sau microfiltrare submicrometrică. Dacă este folosită filtrarea, ulterior mediul va fi clarificat prin filtrare submicrometrică înaintea concentrării și dializei care s-a descris mai sus. 2410

Revendicările care vor fi prezentate în invenție, este de înțeles că vor cuprinde și alte variații și modificări care vor fi întâlnite la specialiștii din domeniu, în lumina descrierii, așa cum s-a prezentat mai sus.

în continuare sunt prezentate secvențele 1 - 34.

INFORMAȚIE PENTRU SECV. ID nr. 1: 2415 (i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ (A) LUNGIME: 31 aminoacizi (B) TIP: aminoacid

[C] ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: lineară2420 (ii] TIPUL MOLECULEI: proteină (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID nr. 1,

Ala Pro Pro Ala Xaa Asp Pro Arg Leu Leu Asn Lys Met Leu Arg Asp 15 1015

Ser His Val Leu His Xaa Arg Leu Xaa Gin Xaa Pro Asp lle Tyr2425

2530

INFORMAȚIE PENTRU SECV ID nr. 2 (i] CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

(A) LUNGIME: 21 aminoacizi2430

[B] TIP: aminoacid (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: lineară

[ii ] TIPUL MOLECULEI: proteină (xi ) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID nr. 2,2435

Ala Pro Pro Ala Xaa Asp Pro Arg Leu Leu Asn Lys Met Leu Arg Asp 1 5 1015

Ser His Val Leu His 20

INFORMAȚIE PENTRU SECV ID nr. 32440 (i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ: (A] LUNGIME: 17 aminoacizi [B] TIP: aminoacid [C] ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: lineară 2445 (ii] TIPUL MOLECULEI: proteină (xi] DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID nr. 3,

Thr Gin Lys Glu Gin Thr Lys Ala Gin Asp Val Leu Gly Ala Val Ala Leu 15 10 15

RO 115788 B

2450	INFORMAȚIE PENTRU SECV ID nr. 4 (i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ: (A) LUNGIME: 17 aminoacizi [B] TIP: acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simplă
2455	(D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIPUL MOLECULEI: cADN (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID nr. 4, GCNCCNCCNG CNTGYGA 17
2460	INFORMAȚIE PENTRU SECV ID nr. 5 (i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ: (A) LUNGIME: 21 baze perechi (B) TIP: acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simplă
2465	(D) TOPOLOGIE: lineară (ii] TIPUL MOLECULEI: cADN (xi] DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID nr. 5 GCARTGYAAC ARCTGNGART C 21
2470	INFORMAȚIE PENTRU SECV ID nr.6 (i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ (A) LUNGIME: 21 aminoacizi (B) TIP: aminoacid (C) ÎMPLETIRE: simplă
2475	[D] TOPOLOGIE: lineară [ii] TIPUL MOLECULEI: proteină (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID nr. 6 Ala Pro Pro Ala Cys Asp Leu Arg Val Leu Ser Lys Leu Leu Arg Asp Ser His Val 15 10 15
2480	Leu His 20 INFORMAȚIE PENTRU SECV ID nr. 7 (i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:
2485	(A] LUNGIME: 21 perechi baze (B) TIP: acid nucleic [C] ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: lineară [ii] TIPUL MOLECULEI: cADN
2490	[xi] DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID nr. 7 GTACGCGTTC TAGANNNNNN T 21 INFORMAȚIE PENTRU SECV ID nr. 8 (i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:
2495	[A] LUNGIME: 21 baze perechi (B) TIP: acid nucleic [C] ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: lineară [ii] TIPUL MOLECULEI: cADN
2500	(xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID nr. 8 AGTTACTGA GGACTCGGAG G

RO 115788 Β

INFORMAȚIE PENTRU SECV ID nr. 9 (j) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

(A] LUNGIME: 30 baze perechi (B) TIP: acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: lineară

[ii ] TIPUL MOLECULEI: cADN (xi ) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID nr. 9 TTCGGCCGGA TAGGCCTTTT I II I I I I I I I

INFORMAȚIE PENTRU SECV ID nr. 10 (i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

[A] LUNGIME: 29 baze perechi

[B] TIP: acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simplă

[D] TOPOLOGIE: lineară (ii) TIPUL MOLECULEI: cADN

[xi] DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID nr. 10 TTCGGCCGGA TAGGCCTTTT I I I Η I I I I

INFORMAȚIE PENTRU SECV IO nr. 11 (i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

[A] LUNGIME: 20 baze perechi

[B] TIP: acid nucleic

[C] ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: lineară

[ii] TIPUL MOLECULEI: cADN

[xi] DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID NR: 11, TGCGACCTCC GAGTCCTCAG

INFORMAȚIE PENTRU SECV ID nr. 12

[i] CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

(A] LUNGIME: 23 baze perechi (B) TIP: acid nucleic

[C] ÎMPLETIRE: simplă (0) TOPOLOGIE: lineară

[ii] TIPUL MOLECULEI: cADN (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID nr. 12 GAGTCCTCAG TAAACTGCTT CGT

INFORMAȚIE PENTRU SECV ID nr. 13 (i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

(A] LUNGIME: 20 baze perechi (B) TIP: acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: lineară

[ii] TIPUL MOLECULEI: cADN (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID nr. 13 GGAGTCACGA AGCAGTTTAC

	2505
30	2510
	2515
29	2520
	2525
20	2530
	2535
23	2540
	2545
20	2550

RO 115788 B

INFORMAȚIE PENTRU SECV ID nr. 14 (i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

(A) LUNGIME: 18 baze perechi

[B] TIP: acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: lineară (ii] TIPUL MOLECULEI: cADN (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID nr. 14

CCTTTACTTC TAGGCCTG 18

INFORMAȚIE PENTRU SECV ID nr. 15 (i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

(A) LUNGIME: 19 perechi baze

[B] TIP: acid nucleic

[C] ÎMPLETIRE: simplă (D] TOPOLOGIE: lineară

[ii] TIPUL MOLECULEI: cADN (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID nr. 15

GAGGTCACAA GCAGGAGGA 19

INFORMAȚIE PENTRU SECV ID nr. 16 (i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

(A] LUNGIME: 19 baze perechi

[B] TIP: acid nucleic

[C] ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: lineară

[ii] TIPUL MOLECULEI: cADN (xi] DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID nr. 16

GGCATAGTCC GGGACGTCG 19

INFORMAȚIE PENTRU SECV ID nr. 17 (i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

(A] LUNGIME: 19 baze perechi (B) TIP: acid nucleic (O ÎMPLETIRE: simplă

[D] TOPOLOGIE: lineară

[ii] TIPUL MOLECULEI: cADN (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID NR: 17

TCCTCCTCGT TGATGACCTC 19

INFORMAȚIE PENTRU SECV ID nr. 18 (i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

(A) LUNGIME: 19 baze perechi (B) TIP: acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: lineară

[ii] TIPUL MOLECULEI: cADN

[xi] DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID nr. 18

CCAGGAAGGA TTCAGGGGA 19

INFORMAȚIE PENTRU SECV ID nr. 19 (i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

(A] LUNGIME: 30 baze perechi (B) TIP: acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: lineară

RO 115788 B (ii) TIPUL MOLECULEI: cADN

[xi] DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID nr. 19

CAACAAGTCG ACCGCCAGCC AGACACCCCG 30

INFORMAȚIE PENTRU SECV ID nr. 20 (i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

[A] LUNGIME: 24 baze perechi (B] TIP: acid nucleic

[C] ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIPUL MOLECULEI: cADN (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID nr. 20

GGCCGATAG GCCACTCNNN NNNT 24 „

INFORMAȚIE PENTRU SECV ID nr. 21 (i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

(A) LUNGIME: 21 baze perechi

[B] TIP: acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: lineară

[ii] TIPUL MOLECULEI: cADN (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID nr. 21

GCARTGYAAN ACRTGNGART C 21

INFORMAȚIE PENTRU SECV ID nr. 22 (i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

(A) LUNGIME: 16 baze perechi (B) TIP: acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIPUL MOLECULEI: cADN

[xi] DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID nr. 22

TTGGTGTGCA CTTGTG 16

INFORMAȚIE PENTRU SECV ID nr. 23

[i] CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

[A] LUNGIME: 20 baze perechi (B) TIP: acid nucleic

[C] ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIPUL MOLECULEI: cADN

[xi] DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID nr. 23

CACAAGTCCA CACCAACCCC , 20

INFORMAȚIE PENTRU SECV ID nr. 24 (i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

[A] LUNGIME: 1342 baze perechi (B) TIP: acid nucleic

[C] ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: lineară

[ii] TIPUL MOLECULEI: cADN (ix) TRĂSĂTURA: [A] NUME/COD: CDS; (B) LOCALIZARE: 99...1094

[xi] DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID nr. 24

CAGGGAGCCA CGCCAGCCAA GACACCCCGG CCAGAATGGA GCTGACTGAA

TTGCTCCTCG

TGGTCATGCT TCTCCTAACT GCAAGGCTAA CGCTGTCC AGC CCG GCT

CCT CCT Ser Pro Ala

Pro Pro 1

2610

2615

2620

2625

2630

2635

2640

2645

2650

2655

RO 115788 B

2660

GCT Ala

TGT GAC CTC CGA GTC

CTC AGT

AAA Lys

CTG CTT CGT GAC

TCC Ser

CAT His 20

GTC Val

161

Cys Asp

Leu

Arg Val 10

Leu

Ser

Leu 15

Leu

Arg Asp

2665

CTT

CAC AGC

AGA

CTG AGC

CAG

TGC

CCA

GAG

GTT

CAC CCT

TTG

CCT

ACA

209

Leu

His Ser

Arg

Leu Ser

Gin

Cys

Pro

Glu

Val

His Pro

Leu

Pro

Thr

25

30

35

CCT

GTC CTG

CTG

CCT GCT

GTG

GAC

TTT

AGC

TTG

GGA GAA

TGG

AAA

ACC

257

Pro

Val Leu

Leu

Pro Ala

Val

Asp

Phe

Ser

Leu

Gly Glu

Trp

Lys

Thr

40

45

50

2670

CAG

ATG GAG

GAG

ACC AAG

GCA

CAG

GAC

ATT

CTG

GGA GCA

GTG

ACC

CTT

305

Gin

Met Glu

Glu

Thr Lys

Ala

Gin

Asp

Ile

Leu

Gly Ala

Val

Thr

Leu

55

60

65

CTG

CTG GAG

GGA

GTG ATG

GCA

GCA

CGG

GGA

CAA

CTG GGA

CCC

ACT

TGC

353

Leu

Leu Glu

Gly

Val Met

Ala

Ala

Arg

Gly

Gin

Leu Gly

Pro

Thr

Cys

70

75

80

85

2675

CTC

TCA TCC

CTC

CTG GGG

CAG

CTT

TCT

GGA

CAG

GTC CGT

CTC

CTC

CTT

401

Leu

Ser Ser

Leu

Leu Gly

Gin

Leu

Ser

Gly

Gin

Val Arg

Leu

Leu

Leu

90

95

100

GGG

GCC CTG

CAG

AGC CTC

CTȚ

GGA

ACC

CAG

CTT

CCT CCA

CAG

GGC

AGG

449

Gly

Ala Leu

Gin

Ser Leu

Leu

Gly

Thr

Gin

Leu

Pro Pro

Gin

Gly

Arg

2680

105

110

115

ACC

ACA GCT

CAC

AAG GAT

CCC

AAT

GCC

ATC

TTC

CTG AGC

TTC

CAA

CAC

497

Thr

Thr Ala

His

Lys Asp

Pro

Asn

Ala

Ile

Phe

Leu Ser

Phe

Gin

His

120

125

130

CTG

CTC CGA

GGA

AAG GTG

CGT

TTC

CTG

ATG

CTT

GTA GGA

GGG

TCC

ACC

545

2685

Leu

Leu Arg

Gly

Lys Val

Arg

Phe

Leu

Met

Leu

Val Gly

Gly

Ser

Thr

135

140

145

CTC

TGC GTC

AGG

CGG GCC

CCA

CCC

ACC

ACA

GCT

GTC CCC

AGC

AGA

ACC

593

Leu

Cys Val

Arg

Arg Ala

Pro

Pro

Thr

Thr

Ala

Val Pro

Ser

Arg

Thr

150

155

160

165

2690

TCT

CTA GTC

CTC

ACA CTG

AAC

GAG

CTC

CCA

AAC

AGG ACT

TCT

GGA

TTG

641

Ser

Leu Val

Leu

Thr Leu

Asn

Glu

Leu

Pro

Asn

Arg Thr

Ser

Gly

Leu

170

175

180

TTG

GAG ACA

AAC

TTC ACT

GCC

TCA

GCC

AGA

ACT

ACT GGC

TCT

GGG

CTT

689

Leu

Glu Thr

Asn

Phe Thr

Ala

Ser

Ala

Arg

Thr

Thr Gly

Ser

Gly

Leu

1Θ5

190

195

2695

CTG

AAG TGG

CAG

CAG GGA

TTC

AGA

GCC

AAG

ATT

CCT GGT

CTG

CTG

AAC

737

Leu

Lys Trp

Gin

Gin Gly

Phe

Arg

Ala

Lys

Ile

Pro Gly

Leu

Leu

Asn

200

205

210

CAA

ACC TCC

AGG

TCC CTG

GAC

CAA

ATC

CCC

GGA

TAC CTG

AAC

AGG

A TA

785

Gin

Thr Ser

Arg

Ser Leu

Asp

Gin

Ile

Pro

Gly

Tyr Leu

Asn

Arg

Ile

2700

215

220

225

RO 115788 B

CAC GAA His Glu 230

CTC TTG AAT GGA

ACT CGT GGA CTC TTT CCT GGA CCC TCA CGC

833

27D5

Leu

Leu Asn

Gly 235

Thr

Arg

Gly

Leu

Phe Pro Gly Pro Ser Arg

240

245

AGG

ACC

CTA

GGA

GCC

CCG

GAC

ATT

TCC

TCA

GGA

ACA

TCA

GAC

ACA

GGC

881

Arg

Thr

Leu

Gly

Ala

Pro

Asp

ile

Ser

Ser

Gly

Thr

Ser

Asp

Thr

Gly

250

255

260

TCC

CTG

CCA

CCC

AAC

CTC

CAG

CCT

GGA

TAT

TCT

CCT

TCC

CCA

ACC

CAT

929

2710

Ser

Leu

Pro

Pro

Asn

Leu

Gin

Pro

Gly

Tyr

Ser

Pro

Ser

Pro

Thr

His

265

270

275

CCT

CCT

ACT

GGA

CAG

TAT

ACG

CTC

TTC

CCT

CTT

CCA

CCC

ACC

TTG

CCC

977

Pro

Pro

Thr

Gly

Gin

Tyr

Thr

Leu

Phe

Pro

Leu

Pro

Pro

Thr

Leu

Pro

280

285

290

2715

ACC

CCT

GTG

GTC

CAG

CTC

CAC

CCC

CTG

CTT

CCT

GAC

CCT

TCT

GCT

CCA

1025

Thr

Pro

Val

Val

Gin

Leu

His

Pro

Leu

Leu

Pro

Asp

Pro

Ser

Ala

Pro

295

300

305

ACG

CCC

ACC

CCT

ACC

AGC

CCT

CTT

CTA

AAC

ACA

TCC

TAC

ACC

CAC

TCC

1073

Thr

Pro

Thr

Pro

Thr

Ser

Pro

Leu

Leu

Asn

Thr

Ser

Tyr

Thr

His

Ser

310

315

320

325

c / îzU

CAG

AAT

CTG

TCT

CAG

GAA

GGG

TAAGGTTCTC AGACACTGCC GACATCAGCA

1124

Gin

Asn

Leu

Ser

Gin

Glu

Gly

330

TTGTCTCGTG

TACAGCTCCC TTCCCTGCAG GGCGCCCCTG

GGAGACAACT GGACAAGATT

1184

2725

TCCTACTTTC

TCCTGAAACC CAAAGCCCTG GTAAAAGGGA

TACACAGGAC TGAAAAGGGA

1244

ATCATTTTTC

ACTGTACATT ATAAACCTTC AGAAGCTATT

TTTTTAAGCT ATCAGCAATA

1304

CTCATCAGAG

CAGCTAGCTC TTTGGTCTAT TTTCTGCA

1342

INFORMAȚIE PENTRU SECV: ID NR: 25

2730

(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

(A) LUNGIME: 332 aminoacizi

(B) TIP: aminoacid

(C) TOPOLOGIE: lineară

2735

(ii) TIPUL MOLECULEI: proteină

(xi) DESCRIEREA SECVENȚEI:

SECV. ID NR: 25

Ser

Pro

Ala

i Pro

Pro

Ala

Cys

Asp

Leu

Arg

Val

Leu

Ser

Lys

Leu

Leu

1

5

10

15

2740

Arg

Asp

Ser His

Val

Leu

His

Ser

Arg

Leu

Ser

Gin

Cys

Pro

Glu

Val

20

25

30

Hîs Pro Leu Pro Thr Pro Val Leu Leu Pro Ala Val Asp Phe Ser Leu 35 40 45

2745

RO 115788 B

2750

Gly Gly 65

Glu 50 Ala

Trp Val

Lys Thr

Thr Leu

Gin Leu 70

Met 55 Leu

Glu Glu

Glu Gly

Thr Val

Lys Met 75

Ala 60 Ala

Gin Ala

Asp Arg

Ile Gly

Leu Gin 80

Leu

Gly

Pro

Thr

Cys 85

Leu

Ser

Ser

Leu

Leu 90

Gly

Gin

Leu

Ser

Gly 95

Gin

2755

Val

Arg

Leu

Leu 100

Leu

Gly

Ala

Leu

Gin 105

Ser

Leu

Leu

Gly

Thr 110

Gin

Leu

Pro

Pro

Gin 115

Gly

Arg

Thr

Thr

Ala 120

His

Lys

Asp

Pro

Asn 125

Ala

ile

Phe

2760

Leu

Ser 130

Phe

Gin

His

Leu

Leu 135

Arg

Gly

Lys

Val

Arg 140

Phe

Leu

Met

Leu

Val 145

Gly

Gly

Ser

Thr

Leu 150

Cys

Val

Arg

Arg

Ala 155

Pro

Pro

Thr

Thr

Ala 160

2765

Val

Pro

Ser

Arg

Thr 165

Ser

Leu

Val

Leu

Thr 170

Leu

Asn

Glu

Leu

Pro 175

Asn

Arg

Thr

Ser

Gly 190

Leu

Leu

Glu

Thr

Asn 185

Phe

Thr

Ala

Ser

Ala 190

Arg

Thr

2770

Thr Pro

Gly Gly 210

Ser 195 Leu

Gly Leu

Leu Asn

Leu Gin

Lys Thr 215

Trp 200 Ser

Gin Arg

Gin Ser

Gly Leu

Phe Asp 220

Arg 205 Gin

Ala Ile

Lys Pro

Ile Gly

Tyr 225

Leu

Asn

Arg

Ile

His 230

Glu

Leu

Leu

Asn

Gly 235

Thr

Arg

Gly

Leu

Phe 240

2775

Pro

Gly

Pro

Ser

Arg 245

Arg

Thr

Leu

Gly

Ala 250

Pro

Asp

Ile

Ser

Ser 255

Gly

Thr

Ser

Asp

Thr 260

Gly

Ser

Leu

Pro

Pro 265

Asn

Leu

Gin

Pro

Gly 270

Tyr

Ser

2780

Pro

Ser

Pro 275

Thr

His

Pro

Pro

Thr 280

Gly

Gin

Tyr

Thr

Leu 285

Phe

Pro

Leu

Pro

Pro 290

Thr

Leu

Pro

Thr

Pro 295

Val

Val

Gin

Leu

His 300

Pro

Leu

Leu

Pro

2785

Asp 305

Pro

Ser

Ala

Pro

Thr 310

Pro

Thr

Pro

Thr

Ser 315

Pro

Leu

Leu

Asn

Thr 320

Ser

Tyr

Thr

His

Ser 325

Gin

Asn

Leu

Ser

Gin 330

Glu

Gly

RO 115788 B

2790

INFORMAȚIE PENTRU SECV: ID NR: 26 (i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

(A) LUNGIME: 1342 baze perechi (B) TIP: acid nucleic2795 (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIPUL MOLECULEI: cADN (ix) TRĂSĂTURĂ * (A) NUME/COD: CDS (B) LOCALIZARE: 99 ....621 (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV. ID NR: 26

CAGGGAGCCA CGCCAGCCAA GACACCCCGG CCAGAATGGA GCTGACTGAA TTGCTCCTCG60

2805

TGGTCATGCT TCTCCTAACT GCAAGGCTAA CGCTGTCC AGC CCG GCT CCT CCT113

Ser Pro Ala Pro Pro

GCT

TGT

GAC

CTC

CGA

GTC

CTC

AGT

AAA

CTG

CTT

CGT

GAC

TCC

CAT

GTC

161

Ala

Cys

Asp

Leu

Arg

Val

Leu

Ser

Lys

Leu

Leu

Arg

Asp

Ser

His

Val

10

15

20

2810

CTT

CAC

AGC

AGA

CTG

AGC

CAG

TGC

CCA

GAG

GTT

CAC

CCT

TTG

CCT

ACA

209

Leu

His

Ser

Arg

Leu

Ser

Gin

Cys

Pro

Glu

Val

His

pro

Leu

Pro

Thr

25

30

35

CCT

GTC

CTG

CTG

CCT

GCT

GTG

GAC

TTT

AGC

TTG

GGA

GAA

TGG

AAA

ACC

257

Pro

Val

Leu 40

Leu

Pro

Ala

Val

Asp 45

Phe

Ser

Leu

Gly

Glu 50

Trp

Lys

Thr

2815

CAG

ATG

GAG

GAG

ACC

AAG

GCA

CAG

GAC

ATT

CTG

GGA

GCA

GTG

ACC

CTT

305

Gin

Met

Glu

Glu

Thr

Lys

Ala

Gin

Asp

Ile

Leu

Gly

Ala

val

Thr

Leu

55

60

65

CTG

CTG

GAG

GGA

GTG

ATG

GCA

GCA

CGG

GGA

CAA

CTG

GGA

CCC

ACT

TGC

353

2820

Leu

Leu

Glu

Gly

Val

Met

Ala

Ala

Arg

Gly

Gin

Leu

Gly

Pro

Thr

Cys

70

75

80

85

CTC

TCA

TCC

CTC

CTG

GGG

CAG

CTT

TCT

GGA

CAG

GTC

CGT

CTC

CTC

CTT

401

Leu

Ser

Ser

Leu

Leu

Gly

Gin

Leu

Ser

Gly

Gin

Val

Arg

Leu

Leu

Leu

90

95

100

GGG

GCC

CTG

CAG

AGC

CTC

CTT

GGA

ACC

CAG

CTT

CCT

CCA

CAG

GGC

AGG

449

2825

Gly

Ala

Leu

Gin

Ser

Leu

Leu

Gly

Thr

Gin

Leu

Pro

Pro

Gin

Gly

Arg

105

110

115

ACC

ACA

GCT

CAC

AAG

GAT

CCC

AAT

GCC

ATC

TTC

CTG

AGC

TTC

CAA

CAC

497

Thr

Thr

Ala

His

Lys

Asp

Pro

Asn

Ala

Ile

Phe

Leu

Ser

Phe

Gin

His

120

125

130

2830

RO 115788 B

TG CTC CGA GGA AAG GTG CGT TTC CTG ATG CTT GTA GGA GGG TCC ACC 545

Leu Leu Arg 135	Gly Lys Val Arg Phe Leu Met Leu 140	Val Gly Gly 145	Ser Thr
CTC TGC GTC Leu Cys Val 150	AGG CGG GCC CCA CCC ACC ACA GCT Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala 155 160	GTC CCC AGC Val Pro Ser	AGA ACC Arg Thr 165	593
TCT CTA GTC Ser Leu Val	CTC ACA CTG AAC GAG CTC C CAAACAGGAC TTCTGGATTG Leu Thr Leu Asn Glu Leu 170	641
TTGGAGACAA	ACTTCACTGC	CTCAGCCAGA	ACTACTGGCT	CTGGGCTTCT	GAAGTGGCAG	701
CAGGGATTCA	GAGCCAAGAT	TCCTGGTCTG	CTGAACCAAA	CCTCCAGGTC	CCTGGACCAA	761
ATCCCCGGAT	ACCTGAACAG	GATACACGAA	CTCTTGAATG	GAACTCGTGG	ACTCTTTCCT	821
GGACCCTCAC	GCAGGACCCT	AGGAGCCCCG	GACATTTCCT	CAGGAACATC	AGACACAGGC	881
TCCCTGCCAC	CCAACCTCCA	GCCTGGATAT	TCTCCTTCCC	CAACCCATCC	TCCTACTGGA	941
CAGTATACGC	TCTTCCCTCT	TCCACCCACC	TTGCCCACCC	CTGTGGTCCA	GCTCCACCCC	1001
CTGCTTCCTG	ACCCTTCTGC	TCCAACGCCC	ACCCCTACCA	GCCCTCTTCT	AAACACATCC	1061
TACACCCACT	CCCAGAATCT	GTCTCAGGAA	GGGTAAGGTT	CTCAGACACT	GCCGACATCA	1121
GCATTGTCTC	GTGTACAGCT	CCCTTCCCTG	CAGGGCGCCC	CTGGGAGACA	ACTGGACAAG	1181
ATTTCCTACT	TTCTCCTGAA	ACCCAAAGCC	CTGGTAAAAG	GGATACACAG	GACTGAAAAG	1241
GGAATCATTT	TTCACTGTAC	ATTATAAACC	TTCAGAAGCT	ATTTTTTTAA	GCTATCAGCA	1301
ATACTCATCA	GAGCAGCTAG	CTCTTTGGTC	TATTTTCTGC	A		1342

INFORMAȚIE PENTRU SECV: ID NR: 27 (i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

(A) LUNGIME: 174aminoacizi (B) TIP: aminoacid (C) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIPUL MOLECULEI: proteină (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV. ID NR: 27

Ser 1

Pro

Ala

Pro

Pro 5

Ala Cys

Asp

Leu Arg Val 10

Leu

Ser

Lys

Leu 15

Leu

Arg

Asp

Ser

His 20

Val

Leu His

Ser

Arg Leu Ser 25

Gin

Cys

Pro 30

Glu

Val

His Pro Leu Pro Thr Pro Val Leu Leu Pro Ala Val Asp Phe Ser Leu 35 40 45

RO 115788 B

Gly Glu Trp Lys Thr Gin Met Glu Glu Thr Lys Ala Gin Asp Ile Leu 50 5560

Gly Ala Val Thr Leu Leu Leu Glu Gly Val Met Ala Ala Arg Gly Gin 65 70 7580

Leu Gly Pro Thr Cys Leu Ser Ser Leu Leu Gly Gin Leu Ser Gly Gin 85 9095 val Arg Leu Leu Leu Gly Ala Leu Gin Ser Leu Leu Gly Thr Gin Leu 100 105110

Pro Pro Gin Gly Arg Thr Thr Ala His Lys Asp Pro Asn Ala Ile Phe 115 120125

Leu Ser Phe Gin His Leu Leu Arg Gly Lys Val Arg Phe Leu Met Leu 130 135140

Val Gly Gly Ser Thr Leu Cys Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala

145 150 155160

Val Pro Ser Arg Thr Ser Leu Val Leu Thr Leu Asn Glu Leu 165170

INFORMAȚIE PENTRU SECV: ID NR: 28 (I) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

(A) LUNGIME: 1164 baze perechi (B) TIP: acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIPUL MOLECULEI: cADN (ix) TRĂSĂTURĂ (A) NUME/COD: CDS (B) LOCALIZARE: 97 ....894 (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV. ID NR: 28

AGGGAGCCAC GCCAGCCAGA CACCCCGGCC AGAATGGAGC TGACTGAATT GCTCCTCGTG 60

2875

2880

2885

2890

2895

2900

GTCATGCTTC TCCTAACTGC AAGGCTAACG CTGTCC AGC CCG GCT CCT CCT GCT 114

Ser Pro Ala Pro Pro Ala

5

2905

TGT GAC CTC CGA GTC CTC

AGT Ser

AAA Lys

CTG CTT CGT

GAC TCC

CAT His 20

GTC Val

CTT Leu

162

Cys

Asp

Leu Arg 10

Val

Leu

Leu 15

Leu

Arg

Asp

Ser

CAC

AGC

AGA

CTG

AGC

CAG

TGC

CCA

GAG

GTT

CAC

CCT

TTG

CCT

ACA

CCT

210

His

Ser

Arg

Leu

Ser

Gin

Cys

Pro

Glu

Val

His

Pro

Leu

Pro

Thr

Pro

25

30

35

2910

RO 115788 Β

2915

GTC CTG CTG CCT GCT GTG GAC TTT AGC TTG GGA GAA TGG AAA ACC CAG258 val Leu Leu Pro Ala Val Asp Phe Ser Leu Gly Glu Trp Lys Thr Gin

4550

2920 ATG GAG GAG ACC AAG GCA CAG GAC ATT CTG GGA GCA GTG ACC CTT CTG30 6

Met Glu Glu Thr Lys Ala Gin Asp Ile Leu Gly Ala Val Thr Leu Leu 55 60 6570

CTG GAG GGA GTG ATG GCA GCA CGG GGA CAA CTG GGA CCC ACT TGC CTC354

Leu Glu Gly Val Met Ala Ala Arg Gly Gin Leu Gly Pro Thr Cys Leu 75 8085

2925

TCA TCC CTC CTG GGG CAG CTT TCT GGA CAG GTC CGT CTC CTC CTT GGG402

Ser Ser Leu Leu Gly Gin Leu Ser Gly Gin Val Arg Leu Leu Leu Gly 90 95100

GCC CTG CAG AGC CTC CTT GGA ACC CAG CTT CCT CCA CAG GGC AGG ACC450

Ala Leu Gin Ser Leu Leu Gly Thr Gin Leu Pro Pro Gin Gly ArgThr

2930 105 110115

ACA GCT CAC AAG GAT CCC AAT GCC ATC TTC CTG AGC TTC CAA CAC CTG498

Thr Ala His Lys Asp Pro Asn Ala Ile Phe Leu Ser Phe Gin HisLeu

120 125130

CTC CGA GGA AAG GAC TTC TGG ATT GTT GGA GAC AAA CTT CAC TGC CTC546

2935 Leu Arg Gly Lys Asp Phe Trp Ile Val Gly Asp Lys Leu His Cys Leu

135 140 145150

AGC CAG AAC TAC TGG CTC TGG GCT TCT GAA GTG GCA GCA GGG ATT CAG594

Ser Gin Asn Tyr Trp Leu Trp Ala Ser Glu Val Ala Ala Gly IleGin

155 160165

2940 AGC CAA GAT TCC TGG TCT GCT GAA CCA AAC CTC CAG GTC CCT GGA CCA642

Ser Gin Asp Ser Trp Ser Ala Glu Pro Asn Leu Gin Val Pro Gly Pro

170 175180

AAT CCC CGG ATA CCT GAA CAG GAT ACA CGA ACT CTT GAA TGG AAC TCG690

Asn Pro Arg Ile Pro Glu Gin Asp Thr Arg Thr Leu Glu Trp Asn Ser

185 190195

2945

TGG ACT CTT TCC TGG ACC CTC ACG CAG GAC CCT AGG AGC CCC GGA CAT738

Trp Thr Leu Ser Trp Thr Leu Thr Gin Asp Pro Arg Ser Pro Gly His 200 205210

TTC CTC AGG AAC ATC AGA CAC AGG CTC CCT GCC ACC CAA CCT CCA GCC78 6

Phe Leu Arg Asn Ile Arg His Arg Leu Pro Ala Thr Gin Pro ProAla

2950 215 220 225230 tcc ata ttc tcc ttc ccc aac cca tcc tcc tac tcc aca cta tac cctS34

Trp Ile Phe Ser Phe Pro Asn Pro Ser Ser Tyr Trp Thr Val TyrAla

235 240245

CTT CCC TCT TCC ACC CAC CTT GCC CAC CCC TGT GGT CCA GCT CCA CCC882

2955 Leu Pro Ser Ser Thr His Leu Ala His Pro Cys Gly Pro Ala Pro Pro

250 255260

RO 115788 B

CCT GCT TCC TGACCCTTCT GCTCCAACGC CCACCCCTAC CAGCCCTCTT 931

Pro Ala Ser

265

29B0

CTAAACACAT	CCTACACCCA	CTCCCAGAAT	CTGTCTCAGG AAGGGTAAGG	TTCTCAGACA	991
CTGCCGACAT	CAGCATTGTC	TCGTGTACAG	CTCCCTTCCC tgcagggcgc	CCCTGGGAGA	1051
CAACTGGACA	AGATTTCCTA	CTTTCTCCTG	AAACCCAAAG CCCTGGTAAA	AGGGATACAC	1111
AGGACTGAAA	agggaatcat	TTTTCACTGT	ACATTATAAA CCTTCAGAAG	CTA	1164

2965

INFORMAȚIE PENTRU SECV: ID NR: 29 (i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

(A) LUNGIME: 265aminoacizi (B) TIP: aminoacid

2970 (C) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIPUL MOLECULEI: proteină (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV. ID NR: 29

2975

Ser 1

Pro

Ala

Pro Pro Ala 5

Cys

Asp Leu

Arg 10

Val

Leu

Ser

Lys

Leu 15

Leu

Arg

Asp

Ser

His Val Leu 20

His

Ser Arg 25

Leu

Ser

Gin

Cys

Pro 30

Glu

Val

His

Pro

Leu 35

Pro Thr Pro

Val

Leu Leu 40

Pro

Ala

Val

Asp 45

Phe

Ser

Leu

Gly

Glu 50

Trp

Lys Thr Gin

Met 55

Glu Glu

Thr

Lys

Ala 60

Gin

Asp

lle

Leu

Gly 65

Ala

Val

Thr Leu Leu 70

Leu

Glu Gly

Val

Met 75

Ala

Ala

Arg

Gly

Gin 80

Leu

Gly

Pro

Thr Cys Leu 85

Ser

Ser Leu

Leu 90

Gly

Gin

Leu

Ser

Gly 95

Gin

Val

Arg

Leu

Leu Leu Gly 100

Ala

Leu Gin 105

Ser

Leu

Leu

Gly

Thr 110

Gin

Leu

Pro

Pro

Gin 115

Gly Arg Thr

Thr

Ala His 120

Lys

Asp

Pro

Asn 125

Ala

lle

Phe

Leu

Ser 130

Phe

Gin His Leu

Leu 135

Arg Gly

Lys

Asp

Phe 140

Trp

lle

Val

Gly

Asp 145

Lys

Leu

His Cys Leu 150

Ser

Gin Asn

Tyr

Trp 155

Leu

Trp

Ala

Ser

Glu 160

Val

Ala

Ala

Gly lle Gin 165

Ser

Gin Asp

Ser 170

Trp

Ser

Ala

Glu

Pro 175

Asn

2980

2985

2990

2995

INFORMAȚIE PENTRU SECV ID nr. 30 (i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

(A) LUNGIME: 24 baze perechi (B] TIP: acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simplă

[D] TOPOLOGIE: lineară

3005

3000

RO 115788 B

3010

3015

3020

3025

3030

3035

3040

3045

3050

3055 (ii) TIPUL MOLECULEI: cADN (xi] DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID nr. 30

GAGCTCACTA GTGTCGACCT GCAG

INFORMAȚIE PENTRU SECV ID nr. 31

[i] CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

(A) LUNGIME: 24 baze perechi

[B] TIP: acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simplă (D] TOPOLOGIE: lineară (ii ) TIPUL MOLECULEI: cADN (xi ) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID nr. 31

CTGCAGGTGG ACACTAGTGA GCTC

INFORMAȚIE PENTRU SECV ID nr. 32 (i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

[A] LUNGIME: 80 baze perechi (B) TIP: acid nucleic

[C] ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIPUL MOLECULEI: cADN

[xi] DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID nr. 32

CTCATAATTT TTAAAAAATT CATTTGACAA ATGCTAAAAT TTCTTGATTAA TATTCT CAAT 60 TGTGAGCGCT CACAATTTAT 80

INFORMAȚIE PENTRU SECV ID nr. 33 (i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

(A) LUNGIME: 86 baze perechi

[B] TIP: acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simplă

[D] TOPOLOGIE: lineară

[ii] TIPUL MOLECULEI: cADN (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID nr. 33

CGATAAATTG TGAGCGCTCA CAATTGAGAA TATTAATCAA GAATTTTAGC

ATTTGTCAAA 60

TGAAI I I I I I AAAAATTATG AGACGT 86

INFORMAȚIE PENTRU SECV ID nr. 34 (i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

(A) LUNGIME: 89 baze perechi (B) TIP: acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: lineară

[ii] TIPUL MOLECULEI: cADN (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID nr. 34

GACGTCTCAT AATTTTTAAA AAATTCATTT GACAAATGCT AAAATTCTTG ATTAATATTC 60

TCAATTCTGA GCGCTCACAA TTTATCGAT

Claims (23)

1. RO 115788 B

   Revendicări

   1. Polipeptidă MGDF, caracterizată prin aceea că are secvența de aminoacizi a unui membru selectat din grupul constând din MGDF-4, MGDF-5, MGDF-6, MGDF-7 și MGDF-8 și este codificată de o polinucleotidă izolată dintr-o celulă gazdă transfer- 3060 mată sau transfectată stabil cu un vector ADN, care codifică pentru polipeptidă.
2. 2. Polipeptidă MGDF, conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că polinucleotidă izolată este o secvență ADN.
3. 3. Polipeptidă MGDF, conform revendicărilor 1 și 2, caracterizată prin aceea că polinucleotidă izolată ADN este un cADN. 3065
4. 4. Polipeptidă MGDF, conform revendicărilor 1, 2 și 3, caracteirzată prin aceea că secvența cADN are o secvență nucleotidică corespunzătoare fig. 11 sau 12.
5. 5. Plipeptidă MGDF, conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că secvența ADN este legată operativ la o secvență de contro! a expresiei ADN.
6. 6. Polipeptidă MGDF, conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că 3070 celula gazdă exprimă polipeptidă MGDF codificată de către secvența ADN.
7. 7. Procedeu de obținere a polipeptidei MGDF .caracterizat prin aceea că se cultivă o celulă gazdă transformată sau transfectată cu o secvență cADN într-un mediu nutritiv cunoscut, după care se izolează polipeptidă MGDF din celulă sau din mediul nutritiv. 3075
8. 8. Procedeu, conform revendicării 7, caracterizat prin aceea că, celula gazdă este o celulă E.coli sau o celulă CHO.
9. 9. Derivat de polipeptidă MGDF, caracterizat prin aceea că .cuprinde o polipeptidă MGDF legată la cel puțin un polimer solubil în apă care este acceptabil din punct de vedere farmaceutic și este ales din grupul constând din dextran, poli[N- 3080 vinilpirolidonă), polietilenglicoli, polipropilenglicolhomopolimeri, polipropilenoxid/ etilenoxid copolimeri, polioli polioxietilați, polivinilalcooli și amestecuri ale acestora, printr-o legătură acil sau alchil la capătul N-terminal al acestuia.
10. 10. Derivat, conform revendicării 9, caracterizat prin aceea că polipeptidă MGDF este selectată din grupul constând din MGDF-1, MGDF-2, MGDF-4, MGDF-11, 3085 MGDF-12, MGDF-13, MGDF-14și MGDF-15.
11. 11. Derivat, conform revendicării 9, caracterizat prin aceea că polimerul solubil în apă este un polietilenglicol și, anume, este un monometoxi-polietilenglicol, cu o greutate moleculară, de 10 până la 50 kDa.
12. 12. Derivat, conform revendicării 9, caracterizat prin aceea că polipeptidă 3090 MGDF este legată covalent la două molecule de polimer solubil în apă.
13. 13. Derivat, conform revendicării 9. caracterizat prin aceea că moleculele de polimer solubil în apă sunt ambele polietilenglicoli.
14. 14. Procedeu de obținere a derivatului de polipeptidă MGDF, caracterizat prin aceea că polimerul solubil în apă are o singură grupare aldehidică reactivă și cuprinde 3095 reacția unui derivat aldehidă-terminal al polietilenglicolului cu o polipeptidă MGDF, în prezența unui agent reducător și izolarea polipeptidei MGDF atașată, la cel puțin, un polimer solubil în apă și anume: a) punerea în contact a polipeptidei MGDF cu un polimer solubil în apă în condiții de alchilare reductivă, la un pH îndeajuns de acid pentru a permite grupării a/fa-amino din capătul amino-terminal al polipeptidei MGDF, 3100 să fie reactivă și b) izolarea polipeptidei MGDF legată, la cel puțin un polimer solubil în apă.

    RO 115788 B
15. 15. Polipeptidă MGDF mono-pegilată, caracterizată prin aceea că polipeptida MGDF este selectată din grupul constând din MGDF-1, MGDF-2, MGDF-3, MGDF-4, MGDF-5, MGDF-6, MGDF-7, MGDF-8, MGDF-11, MGDF-12, MGDF-13, MGDF-14 și MGDF-15.
16. 16. Procedeu de obținere a polipeptidei MGDF mono-pegilată, caracterizat prin aceea că molecula de polietilenglicol are o singură grupare aldehidică reactivă, și cuprinde: a] punerea în contact a polipeptidei MGDF cu molecula de polietilenglicol în condiții de alchilare reductivă, la un pH suficient de acid pentru a permite grupării a/fa-amino de la capătul amino-terminal al polipeptidei MGDF să fie reactivă și b) obținerea unei polipeptide MGDF pegilate.
17. 17. Procedeu, conform revendicării 16, caracterizat prin aceea că polk peptida MGDF este obținută prin clivarea Met²-Lys¹ dintr-o polipeptidă obținută prin exprimarea într-o celulă de E.coli a unui ADN codificând o polipeptidă, care cuprinde aminoacizii 22-184 din fig. 11 și secvența Met-Lys de la capătul N-terminal al acestuia.
18. 18. Procedeu, conform revendicării 16, caracterizat prin aceea că polipeptida MGDF este obținută prin: a) exprimarea într-o celulă de E.coli a unui ADN codificând o polipeptidă, care cuprinde aminoacizii 22-184 din fig. 11 și secvența MetLys de la capătul N-terminal al acestora, b) izolarea polipeptidei exprimate și c] clivarea Met^a-Lys¹ din polipeptida izolată.
19. 19. Procedeu, conform revendicării 16, caracterizat prin aceea că molecula de polietilenglicol are o greutate moleculară, de 2 până la 100 kDa.
20. 20. Procedeu, conform revendicării 16, caracterizat prin aceea că polipeptida MGDF efectiv omogenă este mono-pegilată la gruparea a/fa-amino la capătul N-terminal al polipeptidei MGDF.
21. 21. Procedeu, conform revendicării 20, caracterizat prin aceea că polipeptida MGDF este mono-pegilată cu un polietilenglicol .având o greutate moleculară medie, de 5 până la 50 kDa.
22. 22. Polipeptidă MGDF și derivat de polipeptidă MGDF, conform revendicărilor 1 și 19, caracteriziate prin aceea că se administrează unui pacient o cantitate efectivă din produs, pentru tratarea bolii ce prezintă o deficiență de polipeptidă MGDF, tratarea trombocitopeniei, a creșterii numărului de megacariocite mature sau de creștere a numărului plachetelor sanguine.
23. 23. Polipeptidă MGDF și derivat de polipeptidă MGDF, conform revendicării 22, caracterizate prin aceea că trombocitopenia este selectată din grupul constând din anemie aplastică, trombocitopenie idiopatică, trombocitopenie rezultată în urma unui tratament cu medicamente sau iradiere.

    Președintele comisiei de examinare: bicchim. Crețu Adina

    Examinator: farm. Pentelescu Elena