JPH10212243A - トロンボポエチン蛋白を含有する血小板止血血栓形成能回復促進用組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 長期保存により止血血栓形成能の低下した血
小板のその機能を回復すること。 【解決手段】 保存血小板の止血血栓形成能を回復させ
るための、トロンボポエチン（TPO ）含有組成物、およ
びこの組成物を、止血血栓形成能の低下が認められる血
小板液に添加することからなる血小板の止血血栓形成能
の回復方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、保存中に低下した
血小板の止血血栓形成能回復用組成物に関する。

【０００２】

【従来の技術】ヒトトロンボポエチン（thrombopoieti
n）（以下「TPO 」と称する）は、サイトカインのレセ
プタースーパーファミリーのひとつであるＭｐｌのリガ
ンドとしてクローニングされたタンパク質である（de S
auvageら、Nature(London) 369巻、533-565 頁、(199
4)、Bartley, T. D.ら、Cell 77 巻、1117-1124 頁、(1
994)）。これらのＭｐｌリガンドはいずれも血小板減少
症の動物（ヒト、マウス、イヌ）の血清や血漿中に検出
され、巨核球形成や血小板形成への関与が確認されてい
る。

【０００３】血小板減少症の治療剤の開発を念頭におい
て、本出願人も、ラット骨髄より高度に純化した巨核球
前駆細胞からの巨核球生成を促進する活性を指標にし
て、血小板減少症のラット血漿よりラットTPO を精製
し、その部分アミノ酸配列に基づいて、ラットTPO ｃＤ
ＮＡ、さらにはヒトTPO ｃＤＮＡをクローニングし、遺
伝子組換え技術によって大量に均一なヒトTPO を取得す
ることに成功した（H. Miyazaki ら、Exp. Hematol. 22
巻、838 頁、(1994)）。本出願人が取得に成功したこの
ヒトTPO は、前述のヒトＭｐｌのリガンドとして取得さ
れた因子と同一のアミノ酸配列を有することが判明して
いる（配列表：配列番号１）。

【０００４】本発明者らは、該ヒトTPO を制ガン剤や免
疫抑制剤の投与、あるいは放射線照射やＢＭＴによって
骨髄抑制の起きた血小板減少症のマウスに投与したとこ
ろ、血小板減少阻止効果、血小板増加促進効果、さらに
は、造血機能の亢進が認められ、本発明のTPO がこれら
の血小板減少症に有効であることを見いだしている。

【０００５】悪性腫瘍に対する化学療法の進歩、造血幹
細胞移植の普及に伴い、輸血製剤の使用量は年々増加し
ている。血小板は止血において重要な役割を果たしてお
り、血小板減少症あるいは先天性血小板機能異常症によ
る出血の治療や予防に対しては、血小板輸血以外に効果
的な治療はないのが現状である。現在、汎用されている
濃厚血小板(PC)は血漿で浮遊した状態で保存されている
が保存時間とともに血小板止血血栓形成能が低下するた
め（G. Rock ら、Transfusion 16巻、571 頁、(1976)、
S. Holmeら Blood 52 巻 425頁、(1978)）、PCの有効期
間は採血後72時間と規定されている（Blood Services 1
995, 25 頁， the Japanese Red CrossSociety ）。PC
の有効期間の延長のため、血小板採取方法（PRP 法から
buffy coat法）、保存温度、振蘯、容器の材質、血小板
濃度、白血球共存、血小板液の容量などの条件検討が試
みられてきている（J.D. Sweeneyら Immunol Invest 、
24巻、353 頁、(1995)）。また、長期保存を目的とし
て、凍結保存、乾燥保存あるいは人工血小板の開発が検
討されているが未だ研究段階といわざるをえない。

【０００６】上記の如く、血小板の保存期間が短いため
血小板は主に同種輸血されている。同種の血小板輸血
は、感染、白血球混入による移植片対宿主反応、等のリ
スクを伴い、また輸血の繰り返しにより抗血小板抗体が
出現し輸血が無効になる（CA Schiffer ら、Blood 77
巻、1 頁、(1991)）ことがある。悪性腫瘍に対する癌化
学療法剤の使用により血小板減少が予想される場合、ま
た外科手術により出血が予想されうる場合、予め患者の
血小板を採取・保存し、血小板減少期・出血時に輸血す
る方法が試みられているが、保存による血小板止血血栓
形成能の低下が問題となっている。

【０００７】血小板の保存に伴う血小板止血血栓形成能
の低下については種々の説明がなされている。血小板は
赤血球と異なりミトコンドリアを有している為、TCA 回
路によりCO₂ を産生し、酸化的リン酸化により酸素を消
費する。栄養源（グルコース、アミノ酸等）の不足によ
り機能が低下する。また、保存期間中通気が悪いとCO₂
が蓄積するとともに嫌気的呼吸により乳酸を発生するた
めpHが低下するため血小板止血血栓形成能が低下する。
これらに対して、栄養源としてグルコース、酢酸の添
加、緩衝作用を有する媒体の利用、等が試みられてい
る。また、保存期間中にヌクレオチドが蓄積し、血小板
に抑制的に作用することが報告されている。R Fijngeer
ら（Thromb Haemostas、68巻、595 頁、(1992)）は、保
存血小板を洗浄後、新鮮血漿で再浮遊させると血小板凝
集能が回復することを報告しているが、採血直後のレベ
ルまでは回復していない。また、保存期間中の血小板活
性化を抑制する目的でプロスタグランジンＩ₂ （JE Men
itove ら、Transfusion 24巻、528-31頁、(1984)）、PG
E1（JE Menitove ら、Transfusion 26巻、346 頁、(198
6)）、theophylline（AP Bodeら、Vox Sang 60 巻、10
5 頁、(1991)）、アプロチニン（A Bodeら、J Lab Clin
Med 113巻、753 頁、(1989)）、など種々の薬剤が単独
あるいは併用で試みられているが、保存後の血小板の止
血血栓形成能を採血直後のレベルに戻すような知見はな
い。

【０００８】したがって、使用期限を経過した血小板で
の止血血栓形成能についての検討は皆無であり、この保
存血小板が、TPO により活性化を受けるのか明らかでは
なかった。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、長期
保存により止血血栓形成能の低下した血小板の機能を回
復する方法およびそのための組成物を提供することであ
る。

【００１０】

【課題を解決するための手段】そこで、本発明者は、保
存血小板の止血血栓形成能を回復する方法を得るべく、
種々の検討を行った結果、TPO が長期保存により止血血
栓形成能の低下した血小板液の凝集能を回復することを
見出し、本発明を完成させた。

【００１１】したがって、本発明は、保存により止血血
栓形成能の低下した血小板のその機能回復を促進し、さ
らにその機能を延長するためのTPO 含有組成物、および
そのための方法を提供する。

【００１２】すなわち、本発明は以下のものからなる。

【００１３】（１） 保存血小板の止血血栓形成能を回
復させるための、トロンボポエチン（ＴＰＯ）含有組成
物。

【００１４】（２） 自己血小板輸血又は貯血に使用す
る、（１）に記載の組成物。

【００１５】（３） 同種血小板輸血に使用する、
（１）に記載の組成物。

【００１６】（４） 保存期限を経過した血小板に使用
する、（１）〜（３）のいずれかに記載の組成物。

【００１７】（５） 受容者体内で使用する、（１）〜
（４）のいずれかに記載の組成物。

【００１８】（６） ｅｘ ｖｉｖｏで使用する、
（１）〜（４）のいずれかに記載の組成物。

【００１９】（７） さらに、保存血小板の止血血栓形
成能の持続時間を延長させる、（１）〜（６）のいずれ
かに記載の組成物。

【００２０】（８） 止血血栓形成能の低下が認められ
る血小板液に、（１）〜（７）のいずれかに記載のＴＰ
Ｏ含有組成物を添加することを含む、血小板の止血血栓
形成能を回復する方法。

【００２１】定義 本明細書中で使用する用語の定義は、以下のとおりであ
る。

【００２２】「トロンボポエチン」又は「ＴＰＯ」と
は、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するタンパク
質およびTPO 活性をもつその誘導体を指す。

【００２３】「血小板凝集惹起」とは、凝集反応などを
引き起こすことを意味する。

【００２４】「凝集能亢進」とは、血小板凝集惹起物質
による凝集能を増強することをいい、それ自体では凝集
を惹起しない。

【００２５】「血小板活性化」とは、血小板の細胞内情
報伝達系を刺激し、粘着反応、放出反応、凝集反応を生
じやすくする状態にすることを意味する。

【００２６】血小板は生体内で起こる一連の止血反応の
最初に係わる因子であり、止血反応全体に大きな影響力
を与えている。この血小板の生理的な作用とは、血小板
が血管の損傷部位、即ち血管の内皮細胞が破壊されて露
出された内皮下組織（コラーゲンを含む）などに接触結
合し（粘着反応）、その場で他の流血の血小板を呼び込
み血小板同士が接着して（凝集反応）止血血栓を形成す
る（諸井、血栓形成と血栓溶解、44頁、1991）。この
際、ある程度活性化された血小板よりADP などの細胞内
顆粒が放出され（放出反応）、凝集反応が増幅される
（H. Holmsen、EurJ Clin Invest 、24巻、3-8 頁、(19
94)）。血小板凝集を全く欠如する血小板無力症患者が
著明な出血傾向を示すこと（Caen J、 Clin Haematol、
1 巻、383 頁、(1972)、Glazmann E、Ein Beitrag zur
Plattchen J Kinder、88巻、1 頁、(1918)）、また、血
小板粘着には影響を及ぼさず血小板凝集を抑制する薬剤
が抗血小板剤として有効である（Mehta A ら、Am J Car
diol、63巻、370 頁、(1989)）との報告から、血小板凝
集は止血血栓形成に重要な役割を果たしている（池田、
臨床血栓止血学、15頁、(1994)）。したがって、本発明
で実施した凝集能測定はin vitroでの検討ではあるが、
血小板の生体内における止血血栓形成作用を予測させる
ものである。さらに、本発明で認められたTPO による凝
集能の亢進した血小板を血小板減少あるいは血小板異常
により出血傾向のある患者に輸血することにより、止血
効果が期待される。

【００２７】

【発明の実施の形態】ＴＰＯおよびその調製方法 本発明におけるTPO とは、純度が高く、単離されたタン
パク質であればその製法による由来は問わないが、配列
番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質が用い
られる。配列番号１に示されたアミノ酸配列のうち、TP
O 活性を保持する限りにおいてその一部が改変（置換、
欠失、挿入、および／または付加）されているようなア
ミノ酸配列からなるタンパク質も本発明のTPO として用
いることができる。

【００２８】別の言い方をすれば、アミノ酸配列が実質
的に配列番号１に示されたアミノ酸配列であるようなタ
ンパク質をも用いることができる。ここで言う「実質的
に配列番号１に示されたアミノ酸配列」とは、配列番号
１に示されたアミノ酸配列に加えて、「TPO 活性を保持
する限りにおいて、配列番号１に示されたアミノ酸配列
の一部に置換、欠失、挿入、および／または付加などが
あるアミノ酸配列」を含むことを意味する。

【００２９】本出願人は、ヒトTPO のＣ末端側について
は配列番号１に示されたアミノ酸配列の１５２位まで欠
失させても活性を保持していること、Ｎ末端側について
は６位まで欠失させても活性を保持していることを確認
している。具体的なデータについては表１に示した。

【００３０】

【表１】

【００３１】従って、本発明のTPO としては、配列番号
１に示されたアミノ酸配列の７位から１５１位のアミノ
酸配列を含み、かつTPO 活性を有するタンパク質も含ま
れる。より具体的には配列番号１に示されたアミノ酸配
列のうち、１位から２３１位、１位から２１１位、１位
から１９１位、１位から１７１位、１位から１６３位、
１位から１５７位、１位から１５６位、１位から１５５
位、１位から１５４位、１位から１５３位、１位から１
５１位、および７位から１６３位、からなるタンパク質
が本発明のTPO として挙げられる。

【００３２】更には、上記７位から１５１位の配列内部
または外部に、TPO 活性を損なわない範囲で、少なくと
も１つのアミノ酸の置換、欠失、挿入、および／または
付加を有しているアミノ酸配列からなるタンパク質も本
発明のTPO に含まれる。

【００３３】本発明のTPO を更に例示すれば、少なくと
も、配列番号１のアミノ酸配列を有するヒトTPO の１位
のセリン残基がアラニン残基に、かつ３位のアラニン残
基がバリン残基に置換されたタンパク質、２５位のアル
ギニン残基がアスパラギン残基に置換されたタンパク
質、３３位のヒスチジン残基がトレオニン残基に置換さ
れたタンパク質、２５位のアルギニン残基がアスパラギ
ン残基に、かつ２３１位のグルタミン酸残基がリジン残
基に置換されたタンパク質、更にこれらのタンパク質の
Ｃ末端にＴｈｒＳｅｒＩｌｅＧｌｙＴｙｒＰｒｏＴｙｒ
ＡｓｐＶａｌＰｒｏＡｓｐＴｙｒＡｌａＧｌｙＶａｌＨ
ｉｓＨｉｓＨｉｓＨｉｓＨｉｓＨｉｓのポリペプチドが
付加されたタンパク質を挙げることができる。

【００３４】更には、配列番号１のアミノ酸配列に対
し、少なくとも、３３位のヒスチジン残基が欠失したタ
ンパク質、１１６位のグリシン残基が欠失したタンパク
質、１１７位のアルギニン残基が欠失したタンパク質、
３３位のヒスチジン残基と３４位のプロリン残基の間に
トレオニン残基が挿入されたタンパク質、３３位のヒス
チジン残基と３４位のプロリン残基の間にアラニン残基
が挿入されたタンパク質、３３位のヒスチジン残基と３
４位のプロリン残基の間にグリシン残基が挿入されたタ
ンパク質、３３位のヒスチジン残基と３４位のプロリン
残基の間にグリシン残基が挿入され、かつ３８位のプロ
リン残基がセリン残基に置換されたタンパク質、１１６
位のグリシン残基と１１７位のアルギニン残基の間にア
スパラギン残基が挿入されたタンパク質、１１６位のグ
リシン残基と１１７位のアルギニン残基の間にアラニン
残基が挿入されたタンパク質、１１６位のグリシン残基
と１１７位のアルギニン残基の間にグリシン残基が挿入
されたタンパク質を挙げることができる。また、少なく
とも、１２９位のロイシン残基がアルギニン残基に置換
されたタンパク質、１３３位のヒスチジン残基がアルギ
ニン残基に置換されたタンパク質、１４３位のメチオニ
ン残基がアルギニン残基に置換されたタンパク質、８２
位のグリシン残基がロイシン残基に置換されたタンパク
質、１４６位のグリシン残基がロイシン残基に置換され
たタンパク質、１４８位のセリン残基がプロリン残基に
置換されたタンパク質、５９位のリジン残基がアルギニ
ン残基に置換されたタンパク質、１１５位のグルタミン
がアルギニン残基に置換されたタンパク質が挙げられ
る。

【００３５】本発明のTPO は、ｃＤＮＡ、染色体ＤＮ
Ａ、または化学合成により得られるＤＮＡを含む組換え
ベクターで、形質転換された宿主細胞から分離・精製し
て得られたものであることが好ましい。宿主としては、
原核細胞（例えば細菌、好ましくは大腸菌）、真核生物
（例えば、酵母、昆虫、哺乳動物）細胞を用いることが
できる。哺乳動物細胞の例としては、ＣＯＳ細胞、チャ
イニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、Ｘ63.6.5.3.
細胞、Ｃ-127細胞、ＢＨＫ（Baby Hamster Kidney ）細
胞、ヒト由来細胞（例えば、HeLa細胞）等が挙げられ
る。酵母の例としては、パン酵母（Saccharomyces cere
visiae）やメタノール資化性酵母（Pichia pastoris ）
等が挙げられる。昆虫細胞の例としては、蚕培養細胞
（例えば、Sf21細胞）等が挙げられる。

【００３６】ＣＨＯ細胞を用いた本発明TPO の製造例、
および大腸菌を用いた本発明TPO の製造例を後述の参考
例１、および２にそれぞれ示した。

【００３７】大腸菌を用いてTPO タンパク質を製造する
場合には、該タンパク質をコードするＤＮＡに、制限酵
素による切断部位の供与、および／または、発現を容易
にするようなＤＮＡを付加したものを、適切な発現ベク
ターに組み込み、該ベクターで形質転換された原核細胞
（例えば細菌、好ましくは大腸菌）を培養し、産生され
たTPO 活性を有するタンパク質を分離・精製することに
よって得ることができる。宿主として大腸菌を選択する
場合には、大腸菌における発現に好ましいコドン（優先
コドン）を組み込んでもよい。

【００３８】大腸菌を形質転換するために用いられるベ
クターには、 pKC30（Shimatake H.and M. Rosenberg,
Nature, 292, p128-132, 1981 ）、 pTrc99A（Amann
E.ら、Gene、108 、p193-200、1991）、 pCFM536（ATCC
No. 39934、特表昭６０−５０１９８８号参照）等が挙
げられる。

【００３９】例えば、配列番号１に示されたアミノ酸配
列１〜３３２位からなるTPO タンパク質を製造する場
合、１〜３３２位のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを
合成し、そのＮ末端にメチオニン残基とリジン残基をコ
ードするＤＮＡ配列、更にその上流にXba Ｉ部位となる
ようなＤＮＡ配列を付加し、またＣ末端に停止コドンを
コードするＤＮＡ配列、更にその下流にHindIII 部位と
なるようなＤＮＡ配列を付加する。

【００４０】このＤＮＡ断片を、Xba Ｉ／HindIII で処
理することにより、例えば配列番号２に示すようなＤＮ
Ａ断片を得ることができる。このＤＮＡを、Xba Ｉ、Hi
ndIII で消化したｐＣＦＭ５３６（ATCC No. 39934、特
表昭６０−５０１９８８号参照）にクローニングし、ｐ
ＭＷ１(ATCC No. 39933 ）で予め形質転換されたＥ．ｃ
ｏｌｉ ＪＭ１０９を使用し、発現ベクターを有する大
腸菌株をTPO タンパク質発現用の形質転換体とする。

【００４１】発現プラスミドｐＣＦＭ５３６の発現制御
はλＰＬプロモーターによるが、これ自体が、ｃＩ８５
７リプレッサー遺伝子の制御下にある。上記のような方
法で得られた形質転換株を培養し、発現されたTPO タン
パク質を分離精製する。

【００４２】精製の段階で、カテプシン処理等を行うこ
とによって、Ｎ末端に付加されたメチオニン−リジン残
基が切断され、アミノ酸１〜３３２位からなるTPO タン
パク質を得ることができる。

【００４３】なお、アミノ酸配列１〜３３２位をコード
するＤＮＡ（配列番号３参照）を有するプラスミドｐＨ
ＴＦ１は大腸菌ＤＨ５に担持され、１９９４年３月２４
日付で通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に
受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−４６１７として寄託されてい
る。

【００４４】本発明のTPO としては、上述のTPO 活性を
有する種々のタンパク質のみならず、該タンパク質が少
なくとも一つの水溶性ポリマーに結合している化学修飾
TPOタンパク質も含まれる。特に本発明のTPO として
は、前述のTPO タンパク質が反応性ポリエチレングリコ
ール（PEG ）分子と反応して、PEG をTPO タンパク質に
付加させた、即ち化学修飾TPO タンパク質を含む。この
ような付加は、次に述べるように、アシル化またはアル
キル化等のPEG 化反応によって実施され得る。

【００４５】PEG を使用するアシル化またはアルキル化
は、主要生成物がモノPEG 付加またはポリPEG 付加を呈
するような条件下にて行われる。ポリPEG 付加では一般
に、リジン残基のε−アミノ基へPEG が付加し、さらに
タンパク質のN −末端にあるα−アミノ基へPEG が付加
する。このようなモノPEG 化反応の収率および均一性
は、TPO タンパク質部分のN 末端残基のα−アミノ基を
選択的に修飾するような還元的アルキル化を介して増強
され、これによりタンパク質の N−末端に水溶性のポリ
マーの付加が提供される。PEG が付加した化学修飾TPO
タンパク質の製造例を後述の参考例３に示した。

【００４６】このようなタンパク質類の化学修飾体は、
タンパク分解酵素がタンパク質の構造体自体と物理的に
接触するのを効果的にブロックして、分解を防ぎ得る。
付加的利点には、特定の環境下において、治療用タンパ
ク質類の安定度と循環時間を増大させ、免疫原性を低下
させる点がある。しかし、特定タンパク質を修飾した場
合の効果を予言するのは不可能である点に留意すべきで
ある。タンパク質の修飾と融合タンパクについて記述し
た総説には、Fransis,Focus on Growth Factors 3:4-10
(May 1992)（Mediscript発行、Mountview Court, Frier
n Barnet Lane,London N20, OLD, UK）がある。

【００４７】ポリエチレングリコール（“PEG ”）は、
治療用タンパク質製品の調製に利用されてきた化学的部
分の1 例である。たとえば、Adagen（登録商標）は、PE
G 化アデノシンデアミナーゼ製剤であり、重症合併免疫
不全症の治療用に許可されてきた。PEG 化スーパーオキ
シドジスムターゼは、頭部傷害の治療を目的とした臨床
治験において、PEG 化α−インターフェロンは肝炎の治
療に向けて試験されてきた。PEG 化グルコセレブロシダ
ーゼおよびPEG 化ヘモグロビンは前臨床試験の段階にあ
ると報告されている。若干のタンパク質向けには、Sada
ら，J.fermentation Bioengineering 71:137-139(1991)
において、ポリエチレングリコールを付加することによ
り、タンパク分解から保護することが示されており、あ
る種のポリエチレングリコール部分の付加方法を入手で
きる。1979年12月18日発行の米国特許第4,179,337 のDa
vis ら，“Non-Immunogenic Polypeptides”および1977
年1 月11日発行の米国特許第4,002,531 号のRoyer,“Mo
difying enzymes with Polyethylene Glycol and Produ
ct Produced Thereby ”を参照のこと。総説には、Abuc
howskiらのin Enzymes as Drugs(J.S.Holcerberg and
J.Roberts,eds,pp367-383(1981)) がある。

【００４８】エチレングリコール／プロピレングリコー
ルのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキス
トラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリド
ン、ポリ-1,3- ジオキソラン、ポリ-1,3,6- トリオキサ
ン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、およびポリ
アミノ酸（ホモポリマーまたはランダムコポリマーのい
ずれか）のような他の水溶性ポリマーも、タンパク質を
修飾するために使われている。

【００４９】ポリエチレングリコールでは、ポリエチレ
ングリコール分子をタンパク質に結合させるために様々
な手段が利用される。一般に、ポリエチレングリコール
分子はタンパク質上に見い出される反応性の基を介して
タンパク質に結合する。リジン残基上のアミノ基または
Ｎ末端上のアミノ基のようなアミノ基は、かかる結合に
好都合である。たとえば、Royer ら（米国特許第 4,00
2,531）は、酵素にポリエチレングリコール分子を結合
させるために還元アルキル化を提唱している。1993年4
月28日に公開されたEP O 539 167(Wright)の“Peg Imid
ates and ProteinDerivates Thereof”は、ペプチドお
よび遊離アミノ基を伴う有機化合物が、PEG のイミデー
ト誘導体または関連する水溶性有機ポリマーで修飾され
ると提唱している。1990年2 月27日に発行されたShawの
米国特許第4.904.584 号は、反応性アミノ基を介してポ
リエチレングリコール分子と結合するタンパク質におけ
る、リジン残基の数の修飾に関連する。

【００５０】化学的に修飾された特異的治療用タンパク
質の１つは、顆粒球コロニー刺激因子“G-CSF ”であ
る。欧州特許EP O 401 384，EP O 473,268, およびEPO
335 423 を参照のこと。

【００５１】その他の例としては、PEG 化IL-6があり、
EP O 442 724［名称“Modified hIL-6”（U.S.S.N 07／
632,070 の同時係属出願）では、IL-6に付加したポリエ
チレングリコールについて開示している。1985年9 月11
日に公告されたEP O 154 316は、リンホカインとポリエ
チレングリコールのアルデヒドとの反応性について報告
している。

【００５２】ＴＰＯ含有組成物 本発明の組成物は、保存血小板の止血血栓形成能の回復
を促進する任意の量のTPO を含有する。一般に活性発現
に必要なTPO 濃度は、約１〜1000 ng/ml−血小板液であ
る。

【００５３】本発明の組成物はまた、TPO を安定化する
ための安定化剤を含有しうる。好ましい安定化剤として
は、薬剤的に許容可能な糖類、界面活性剤が挙げられ、
TPO組成物の振盪時、輸送時における凝集に対する安定
性を向上するものであれば、その種類を問わないが、例
えば下記のものが挙げられる。

【００５４】糖類としては、マンニトール、ラクトー
ス、シュクロース、マルトース、グルコース、イノシト
ール、キシロース、ソルビトール、フルクトース、ガラ
クトース、リボース、マンノース、セロビオース、シク
ロデキストリンなどが利用できる。これらの中でもソル
ビトール、マンニトール、シュクロースが好ましく、特
にソルビトールが好ましい。

【００５５】界面活性剤としては、ポリオキシエチレン
硬化ヒマシ油、ポリオキシエチレンヒマシ油、ポリソル
ベート８０やモノラウリン酸ポリオキシエチレンソルビ
タン（別名：ポリソルベート２０）などのポリオキシエ
チレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン
ポリオキシプロピレングリコール、モノオレイン酸ソル
ビタンなどのソルビタン脂肪酸エステル、ショ糖モノラ
ウリン酸エステルなどのショ糖脂肪酸エステル、塩化ベ
ンゼトニウム、塩化ベンザルコニウムなどの芳香族四級
アンモニウム塩、カプリル酸ナトリウム、亜硫酸ナトリ
ウムなどが利用できる。この中でも、ポリソルベート８
０やポリソルベート２０、ポリオキシエチレン硬化ヒマ
シ油が好ましく、特にポリソルベート８０やポリソルベ
ート２０が好ましい。

【００５６】本発明において用いられるこれらの糖類、
並びに界面活性剤は、TPO 含有組成物中、糖類の場合に
は０．１〜５０％（W/V ）、界面活性剤の場合には０．
０００１〜５０％（w/v ）の範囲で使用されうる。

【００５７】さらに本発明のTPO 含有組成物は、その製
剤化の目的に応じて希釈剤、可溶化剤、防腐剤、酸化防
止剤、安定化剤、吸着防止剤、賦形剤および等張化剤な
どを含有することができる。

【００５８】ＴＰＯ含有組成物の使用方法 本発明の組成物は、その目的に合致するいかなる添加方
法、投与経路をとってもよい。血小板輸血の場合、予め
調製した血小板液を本発明の組成物で処理した後、再び
体内に戻す、ex vivo での使用が可能である。血小板液
へのTPO の添加は、生体内における血小板の最も重要な
役割である止血血栓形成を考慮すると、採血直後より
も、一定期間保存した血小板を輸血する直前（１時間以
内）に添加する方が望ましい。ここでいう血小板液と
は、例えば、濃厚血小板液、凍結血小板を解凍したも
の、および凍結乾燥血小板を再浮遊させたもの、新鮮全
血を含み、かつ血小板としては自己および同種の血小板
が使用可能であり、また保存期限を経過した血小板にも
使用できる。また、赤血球膜に合成ぺプチド(Ac-CGGRGD
F-NH₂ ) を共有結合させた thromboerythrocyte は、血
小板と混合した状態でADPにより凝集することが知られ
ており(B.S. Collerら、J. Clin. Invest. 89 巻、546-
555頁、(1992)) 、thromboerythrocyteを含む現在開発
中の人工血小板と血小板を混合した血小板液でも使用可
能である。また、体外での添加だけでなく、本発明組成
物を生体内に投与して、輸血血小板のみならず患者血小
板の止血血栓形成能を亢進することもできる。投与経路
として、静脈内投与、動脈内投与、注射による局所投
与、腹腔または胸腔への投与、皮下投与、筋肉内投与に
より投与することができる。具体的な本発明組成物の添
加濃度は保存血小板の条件（例えば、保存期間、保存状
態など）、あるいは患者の諸条件（例えば、年齢、性
別、血小板輸血歴、血中血小板数、併用薬剤など）によ
り変化する。一般に本発明組成物の活性発現に必要なTP
O 濃度は 1〜1000 ng/ml程度であるため、例えば静脈内
投与でのTPO の用量は 0.1〜100/μg/kg程度で血小板輸
注の直前に投与するのが望ましい。

【００５９】

【実施例】以下の非限定的実施例によって、本発明をさ
らに具体的に説明する。

【００６０】実施例 TPO による保存濃厚血小板液の血小板凝集能亢進作用 実験前２週間、薬を服用していない健常人(n=6) から、
成分採血装置CS-3000(Baxter Biotech, Munich, German
y)にて acid-citrate-dextrose10% 添加濃厚血小板を約
5単位採取し、オレフィンバッグ（Lifecell PL732, Ba
xter, Brussels, Belgium ）に入れて、 20-24℃で振と
う保存した。刺激する時期は採血1,72,120および168 時
間後とし、刺激前の条件分けとして、TPO を添加せず37
℃にて 5分加温、TPO を50ng/ml 添加し37℃にて 5分加
温、TPO を50ng/ml 添加し37℃にて60分加温した群とし
た。刺激薬剤としてADP 、コラーゲン、およびその併用
を用いた。血小板凝集能は透過光型血小板凝集能測定器
（HEMA TRACER 6 （二光バイオサイエンス株式会社、東
京））にて刺激後 5分間測定し、最大凝集率にて血小板
機能を評価した。これはBornの方法に準じた測定方法で
ある（J. Physiol.162 巻、67頁、(1962)）。採血１時
間後に刺激した場合の最大凝集率を 100％として、それ
に対する％にて各凝集率を表示し、Wilcoxon検定によっ
て統計処理を行った。

【００６１】図１に示すように、TPO で処理しないと、
保存期間が長くなるにつれてADP による凝集能は顕著に
低下するが、測定前 5分あるいは60分前にTPO 処理する
と、有意な凝集能の回復が認められた。TPO による凝集
能回復作用は血小板の保存期間により減弱する傾向はあ
るものの、120 時間保存までは採血直後と同程度にまで
回復した。同様の結果はコラーゲン刺激（図２）、ADP+
コラーゲン刺激（図３）でも認められた。これらの結果
は、保存期間中に止血血栓形成能の低下した血小板に対
し、TPO を添加することにより、採血直後のレベルまで
血小板止血血栓形成能を上昇させ得ることを示す。

【００６２】以下、参考例として本発明の有効成分であ
るTPO の製造例を示す。

【００６３】参考例１ ＴＰＯ（1-332 ）／ＣＨＯの製造例 （１）ＣＨＯ細胞（dhfr−株、UrlaubとChasin; Proc.
Natl. Acad. Sci. USA;７７巻４２１６頁、１９８０
年）を６cm径のプレート（Falcon社製）中１０％牛胎児
血清を含むα最小必須培地（α-MEM（−）、チミジン、
ヒポキサンチン添加）で培養増殖させ、これをリン酸カ
ルシウム法（Cellphect 、ファルマシア社製）によっ
て、プラスミドｐＤＥＦ２０２- ｈTPO-Ｐ１で形質転換
した。

【００６４】すなわち、配列番号４のｃＤＮＡインサー
ト部分を含むｐＤＥＦ２０２- ｈTPO-Ｐ１プラスミド１
０μg にバッファーA ：１２０μl および H₂ O ：１２
０μl を加え混合したのち、室温で１０分間放置した。
つぎに、この溶液にバッファーB ：１２０μl を加え、
再度混合したのち、室温で３０分間放置した。このDNA
溶液を前述のプレートに滴下したのち、CO₂ インキュベ
ーター中で６時間培養した。プレートから培地を除去
し、α-MEM（−）にて２回洗浄後、１０％ジメチルスル
フォオキシド含有α-MEM（−）を添加し、室温で２分間
処理した。次いで、１０％透析牛胎児血清含有非選択培
地（α-MEM（−）、ヒポキサンチン、チミジン添加）を
添加して２日間培養したのち、１０％透析牛胎児血清含
有選択培地（α-MEM（−）、ヒポキサンチン、チミジン
無添加）での選択をおこなった。選択は細胞をトリプシ
ン処理した後、６cm径プレート１枚あたりを、１０cm径
プレート５枚あるいは２４ウエルプレート２０枚に分割
したのち、２日ごとに選択培地にて培地交換を行いなが
ら培養を続行することにより実施した。細胞が増殖して
きたプレートあるいはウエルについてはその培養上清中
のヒトTPO 活性を測定した。培養上清中にヒトTPO 活性
の認められたものについては新しいプレートあるいはウ
エルに２５nMのメソトレキセートを含む選択培地で１：
１５に細胞を分割し、培養を続行することによりメソト
レキセートに耐性の細胞を増殖させてクローニングを行
った。

【００６５】なお、ＣＨＯ細胞の形質転換はＣＨＯ細胞
に対しpHTP-1とpMG1を同時形質転換（co-transfection
）することによっても行うことができる。

【００６６】プラスミドｐＤＥＦ２０２−ｈTPO −Ｐ１
によって形質転換されたＣＨＯ細胞株（CHO-DUKXB11 ）
は１９９５年１月３１日付で通商産業省工業技術院生命
工学工業技術研究所に受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−４９８
８として寄託されている。

【００６７】（２）ヒトTPO 産生ＣＨＯ細胞株の培養お
よびヒトTPO の精製 MTX 耐性化を繰り返して得られたヒトTPO 産生ＣＨＯ細
胞株（CHO28/1/1/3-C6株、４００nM MTX耐性）は以下の
ようにして実施した。細胞を４００nM MTXおよび10％FC
S を含むDMEM/F-12 培地(GIBCO社) を用いて培養増殖さ
せた。この細胞をトリプシン溶液を用いて剥離したの
ち、200ml の同培地を含むFalcon社性ローラーボトエウ
（Falcon300 ）に１×１０⁷ 個の細胞を接種し37℃で１
rpm の回転速度で３日間培養した。３日後、培養液を吸
引除去し、50mlのPBS で細胞をリンスしたのち、400nM
MTX および10％FCS を含まず、２μg/mlインシュリン、
10μM 硫酸銅を含むDMEM/F-12 培地（GIBCO 社）を300m
l 加え、37℃で1rpmの回転速度で４日間培養し、４日後
その培養上清を回収した（ハーベスト１）。更に上記生
産培地を300ml 加え、同様に37℃で1rpmの回転速度で４
日間培養し、４日後その培養上清を回収した（ハーベス
ト２）。

【００６８】双方をあわせて得られたＣＨＯ細胞無血清
培養上清約220 Ｌを0.5 μｍフィルター（日本ポール社
製、FILTER CARTRIDGE）で濾過し、これを限外濾過（FI
LTRON 社製、CENTRASETTETM OMEGA 30k cut ）で濃縮か
つ溶媒を10mMリン酸カリウム緩衝液（pH6.8 ）に置換
し、容量を約5 Ｌとした。これに蛋白質分解酵素阻害剤
であるE-64（ペプチド研）を最終濃度10μM となるよう
に加え、予め10mMリン酸カリウム緩衝液（pH6.8 ）で平
衡化しておいたSP Sepharose FF カラム（ファルマシア
社製、直径11cm, ベッド高10cm）に流速100ml/mim で添
加した。その後、平衡化緩衝液で洗浄した後、0.3M塩化
ナトリウムを含む10mMリン酸カリウム緩衝液（pH6.8 ）
1700mlで溶出した。この溶出液に363gの硫酸アンモニウ
ムを加え、12000xg で20分遠心後、上清を1.2 Ｍ硫酸ア
ンモニウムを含む10mMリン酸カリウム緩衝液（pH6.8 ）
で平衡化しておいたMacroPrep Methyl HICカラム（Ｂｉ
ｏ−Ｒａｄ社製、直径６ｃｍ，ベッド高30cm）に流速10
0ml/mim で添加した。添加終了後、平衡化緩衝液で洗浄
した後、0.5 Ｍ硫酸アンモニウムを含む10mMリン酸カリ
ウム緩衝液（pH6.8 ）700ml で溶出した。この溶出液に
プロパノールを80ml加えた後、SOURCE15RPC カラム（フ
ァルマシア社製、直径3.5cm,ベッド高10cm）に流速16ml
/mimで添加した。添加終了後、10％プロパノールを含む
10mMトリス緩衝液（pH7.5）（展開溶媒Ａ）で洗浄後、
展開溶媒Ａから80％プロパノールを含む10mMトリス緩衝
液（pH7.5 ）（展開溶媒Ｂ）でプロパノール濃度が70％
になるまで60分間の直線グラジエントで溶出した。直線
グラジエントを始めてから25分付近の画分192ml を回収
し、これを2 回にわけてPBS で平衡化しておいたSuperd
ex200pg カラム（ファルマシア社製、直径10cm, ベッド
高56cm）に供し、流速40ml/mimで溶出した。溶出液をSD
S-PAGEで分析したところ、TPO と思われる分子量約6500
0-100000の分子は、保持時間42-52 分付近に得ることが
でき、単一なバンドであることが確認できた。さらにウ
ェスターン分析により、このタンパク質がTPO であるこ
とを確認した。このサンプルの一部を取り、Ｎ末端アミ
ノ酸分析およびアミノ酸組成分析を行った結果、非常に
高度に精製され、配列番号１のアミノ酸配列１位〜３３
２位を有するTPO が約230mg 得られたことがわかった。

【００６９】参考例２ 大腸菌におけるＴＰＯ（1- 163 ）／E. coli の製造例 （１）ｈＭＫＴ（1-163 ）の大腸菌発現用プラスミド p
AMG11-ｈＭＫＴ（1-163）の構築、大腸菌における発現 配列番号１の１位〜１６３位までのアミノ酸配列を有す
るタンパク質（以下、TPO （1-163 ）／E. coli とい
う。）を大腸菌で発現させるために、そのアミノ酸配列
をコードするＤＮＡを大腸菌における優先コドンを用い
て化学合成した。更に、そのＮ末端にメチオニン残基と
リジン残基を、またＣ末端側に停止コドンをコードする
ＤＮＡ配列を付加した。このＤＮＡ配列によりコードさ
れるタンパク質、即ち配列番号１の１位から１６３位の
アミノ酸配列のＮ末端にＭｅｔ- Ｌｙｓが付加されてい
るタンパク質（以下、「ｈＭＫＴ（1-163 ）」という）
のアミノ酸配列については配列番号５に示した。

【００７０】合成されたｈＭＫＴ（1-163 ）遺伝子フラ
グメントは、その５’末端、３’末端にそれぞれXba
Ｉ、HindIII 制限酵素部位を有しており、リボソーム結
合部位、ＡＴＧ開始コドン、ｈＭＫＴ（1-163 ）のアミ
ノ酸配列をコードする配列、および停止コドンを含んで
いる。

【００７１】上記フラグメントはラクトース誘導性発現
ベクター、pAMG11のXba Ｉ、HindIII 部位にクローニン
グされた。pAMG11ベクターは、pR100 由来の複製起源を
もつ低コピー数のプラスミドである。発現ベクター、pA
MG11はプラスミドpCFM1656（ATCC No.69576、１９９４
年２月２４日付で寄託されている。）からＰＣＲを利用
した変異導入法により一連の部位特異的塩基の変異を起
こすことによって得ることができる。このプラスミドの
複製プロモーター、ＰｃｏｐＢのすぐ５’側にあるBgl
II部位（プラスミドbp #180 ）から始まって、プラスミ
ド複製遺伝子が続いているが、塩基対の変異は表２に示
すとおりである。

【００７２】

【表２】

【００７３】更に、特異的なAat II部位とCla Ｉ部位と
の間のＤＮＡ配列を以下のオリゴヌクレオチドで置換し
た。

【００７４】

【表３】

【００７５】ｐＡＭＧ１１に導入されたｈＭＫＴ（1-16
3 ）遺伝子の発現は以下に示した配列を有するＰｓ４プ
ロモーターのような合成ラクトース誘導性プロモーター
によって誘導される。

【００７６】

【表４】

【００７７】Ｐｓ４プロモーターによる、ｈＭＫＴ（1-
1-63）遺伝子の発現は、大腸菌lacＩ遺伝子産物である
ラクトースリプレッサー（Lac Ｉ）、により抑制され
る。

【００７８】続いて、pAMG11- ｈＭＫＴ（1-163 ）プラ
スミドによってlaq Ｉｑ対立遺伝子を含む大腸菌K-12株
を形質転換した。laq Ｉｑ対立遺伝子はLac Ｉ遺伝子の
発現を増加させるlac Ｉプロモーターの内部における変
異であり、その結果、Ｐｓ４プロモータによるタンパク
質の発現に関し、より厳密なコントロールをうけること
になる。従って、この株においては、ラクトースの非存
在下では、ｈＭＫＴ（1-163 ）の発現はLac Ｉにより抑
制される。ラクトースの添加によりＰｓ４プロモーター
のオペレーター部位へのLac Ｉタンパク質の結合が減少
し、Ｐｓ４プロモーターによるｈＭＫＴ（1-163 ）遺伝
子の転写が開始される。この実施例で宿主細胞として用
いられた大腸菌は１９９４年１１月３０日付でATCCにAT
CC No.69717 として寄託されている。

【００７９】その大腸菌（ATCC No.69717 ）を、pAMG11
- ｈＭＫＴ（1-163 ）プラスミドにより形質転換し、以
下の培養条件にて培養した。

【００８０】（２）ｈＭＫＴ（1-163 ）を発現する組換
え大腸菌の培養、TPO （1-163 ）／E.coliの製造 得られた形質転換株をＬＢ培地にて３０℃、約１２時間
培養した。培養した細胞は、batch medium（酵母抽出物
20g/l；クエン酸3.4g/l； K₂ HPO ₄ 15g/l；Dow P200
0 15ml；グルコース 5g/l；MgSO₄ ・7H₂ O 1g/l ；
微量金属 5.5ml/l ；ビタミン 5.5ml/lを含む）を含む
発酵器に無菌的に移された。まず、最初の培養工程で
は、その培養液のＯＤがＡ６００で５．０±１．０に至
るまで続けた。

【００８１】次に、第１フィード培地（グルコース700g
/l；MgSO₄ ・7H₂ O 6.75g/lを含む）は添加速度を規定
の方法に従って、２時間ごとに調整しながら培養を行っ
た。

【００８２】第２フィード培地（トリプチカーゼペプト
ン 129g/l；酵母抽出物 258g/l）の添加は、培養液の
ＯＤがＡ６００で２０〜２５になってから開始した。そ
の第２フィード培地の添加は、第１フィード培地の添加
を調整し続ける一方で、一定の流速を維持した。

【００８３】培養は全工程にわたって約３０℃で行っ
た。培養液は必要に応じて酸や塩基を添加することによ
りｐＨ約７．０に保たれた。望ましい溶存酸素濃度は発
酵器における撹拌速度、通気速度、および酸素流入速度
を調整することにより維持した。その培養液のＯＤがＡ
６００で５７〜６３に達してから、第３フィード培地
（ラクトース 300g/l）を一定の速度で発酵器に送りこ
んだ。第１フィード培地の添加を止め、第２フィード培
地の流速を新たに一定の速度に変更した。培養を第３フ
ィード培地の添加開始後、約１０時間続けた。培養後、
その培養液を１５±５℃まで冷却し、細胞を遠心分離に
より回収した。 得られたペレットは−６０℃以下で保
存された。

【００８４】こうして組換え大腸菌で産生されたｈＭＫ
Ｔ（1-163 ）の精製、およびTPO （1-163 ）／E.coliの
製造は次のように行った。

【００８５】細胞菌体 1800gを約１８L の10mM EDTA に
懸濁し、高圧ホモジナイザーに15,000psi にて通した。
破砕した細胞懸濁液を遠心分離にかけ、その沈澱物を１
０Lの10mM EDTA に再懸濁した。その懸濁液を遠心分離
にかけ、沈澱物200gを、２Lの8M塩酸グアニジン、10mM
DTT、5mM EDTAを含む10mM Tris 緩衝液、pH8.7 で可溶
化した。この溶液を２００L の3M 尿素、30％グリセロ
ール、3mM シスタミン、 1mM システインを含有する
10mM CAPS 、pH10.5でゆっくりと希釈した。

【００８６】この希釈液を１６時間、室温にてゆっくり
と撹拌し、pHを6.8 に調整した。pH調整後、清澄化し、
1.5M尿素、15％グリセロールを含む10mMリン酸ナトリウ
ム緩衝液、pH6.8 で予め平衡化した２L のCM Sepharose
カラム（ファルマシアバイオテク社製）に添加した。添
加終了後、15％グリセロールを含有するリン酸ナトリウ
ム緩衝液、pH7.2 で洗浄した。ｈＭＫＴ（1-163 ）は10
mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.2 ）中で塩化ナトリウ
ム濃度0 から0.5Mの直線濃度勾配により溶出された。

【００８７】このようにして得られたCM Sepharoseカラ
ムの溶出画分を、分子量10,000カットの膜を用いて10mM
リン酸ナトリウム緩衝液（pH6.5 ）で濃縮しかつバッフ
ァー交換した。その濃縮液（タンパク濃度約2mg/ml）
は、９０分間、室温にてカテプシンＣ（基質タンパク
質：酵素＝500:1 （モル比））により処理した。

【００８８】この反応液を、15％グリセロールを含有す
る10mMリン酸ナトリウム（pH7.2 ）で予め平衡化した1.
2LのSP High Performance Sepharose カラム（ファルマ
シアバイオテク社製）に添加した。添加終了後、ｈＭＫ
Ｔ（1-163 ）のＮ末端のＭｅｔ- Ｌｙｓが切断されたTP
O 活性タンパク質、即ち、TPO （1-1-63）／E. coliは1
0mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.2 ）中で塩化ナトリ
ウム濃度0.1 から0.25M の直線濃度勾配で溶出した。

【００８９】このSP High Performance カラムからの溶
出液に0.6Mになるまで硫酸アンモニウムを添加し、0.6M
硫酸アンモニウムを含む10mMリン酸ナトリウム緩衝液
（pH7.2 ）で予め平衡化した1.6LのPhenyl Toyopearlカ
ラム（東ソー社製）に添加した。TPO （1-163 ）／E.co
liのピークは、10mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.2 ）
中で硫酸アンモニウム濃度0.6 から0Mの直線濃度勾配に
より溶出された。

【００９０】このようにして得られたPhenyl Toyopearl
の溶出液を、分子量10,000カットの膜を用いて 5％ソル
ビトール含有10mM Tris 緩衝液（pH7.5 ）で濃縮かつバ
ッファー交換した。

【００９１】参考例３ ＰＥＧ化ＴＰＯタンパク質の製造例 この参考例では、12種のPEG 化 TPO分子、PEG9〜PEG12
と PEG14〜PEG21 の合成について示す。各ケースにおい
て、PEG 化された TPO分子は、E. coli 由来のTPO-11
（シグナルペプチドの始まりから数えてアミノ酸22-18
4、あるいは成熟したタンパク質の始まりから数えてア
ミノ酸 1-163）である。これら全てのPEG 化種に関する
詳細は、下記の表５〜７に概略してある。

【００９２】(1) TPO を活性化MePEG 誘導体でアシル
化した、poly-MePEG(20kDa)-TPO コンジュゲート(PEG1
1) の調製 0.1M BICINE バッファー、pH8 中の冷却(4℃) した TPO
(2.5 mg/ml) 溶液を、10倍モル過剰の固形 MePEGスクシ
ンイミジルプロピオナート(MW 20kDa)(Shearwater Poly
mers, Inc.) に加えた。ポリマーを穏やかな撹拌によっ
て溶解し、反応は室温でさらに続けた。

【００９３】反応中におけるタンパク質の修飾度は、Su
perdex 200 HR 10/30 カラム(Pharmacia Biotech) を用
いた、サイズ排除(SEC) HPLCによってモニターした。溶
離は、0.1Mリン酸ナトリウムバッファー、pH6.9 を用い
て、流速0.7ml/min で行った。

【００９４】30分時点での反応混合物のSEC HPLC分析
は、反応混合物中に遊離タンパク質は残っていないこと
を示した。この時点で反応混合物のタンパク質濃度を、
滅菌水を加えて、1mg/mlに下げ、数滴の0.5M酢酸を滴下
して混合物のpHを4 に調整した。

【００９５】MePEG-TPO コンジュゲートは、SP Sepharo
se HP (Pharmacia Biotech) イオン交換樹脂を用いたイ
オン交換クロマトグラフィーによって、過剰のMePEG と
他の反応副生物から分離させた。

【００９６】反応混合物をカラムにロード(2.5 mg/ml
（樹脂）) した。未反応のMePEG は、3 カラム容量のス
タートバッファー A（20mMリン酸ナトリウム、pH7.2 、
15%リセロール）で溶出させた。その後、MePEG-TPO コ
ンジュゲートを、10カラム容量で、エンドバッファーＢ
（バッファーＡ中、 1M NaCl）の、0%から30% の直線勾
配を用いて溶出させた。溶出液は280nm でモニターし
た。 poly-MePEG-TPO コンジュゲートを含んでいるフラ
クションをプールし、濃縮、滅菌濾過した。

【００９７】精製したpoly-MePEG-TPOコンジュゲート
は、TSK-GEL G4000SWXL とG2000SWXLのゲル濾過カラム
を連結した、HPLC SECで、分析した。タンパク質は280n
m におけるUV吸収によって検出した。球状タンパク質の
分子量マーカーとして、BIO-RAD ゲル濾過標準を使っ
た。

【００９８】HPLC SECでは、調製物には二つの主な成分
( およそ2 対1 の割合) が含まれており、その溶出位置
は、それぞれ、370.9kDaと155.0kDaの球状タンパク質に
相当した。下記の表６を参照のこと。

【００９９】MW=6-50kDaのMePEGsのスクシンイミジル・
エステルによる、TPO のアシル化で調製した、コンジュ
ゲートPEG9、PEG10 およびPEG12 も同じように行った。
これらの調製に用いた主な反応パラメータは、表５に要
約してある。

【０１００】これらのコンジュゲートのHPLC SEC分析の
結果は、表６に示してある。

【０１０１】(2) TPO をMePEG アルデヒドで還元アル
キル化することによる、 poly-MePEG(20kDa)-TPOコンジ
ュゲート(PEG20) の調製 20mM NaCNBH₃ を含む、100mM リン酸ナトリウム、pH5
、中のTPO(2ml, 2.5mg/ml)冷却(4℃) 、撹拌溶液に、1
0倍モル過剰のモノメトキシ−ポリエチレングリコール
アルデヒド（平均分子量 20kDa）を加えた。反応混合物
の撹拌は、同じ温度で続けた。

【０１０２】反応中におけるタンパク質の修飾度は、 S
uperdex 200 HR 10/30カラム(Pharmacia Biotech) を用
いた、SEC HPLCによってモニターした。溶離は0.1Mリン
酸ナトリウムバッファー、pH6.9 を用いて、流速0.7ml/
min で行なった。

【０１０３】16時間後、SEC HPLC分析は、タンパク質の
初めの量の90% 以上が修飾されていることを示した。こ
の時点で反応混合物のタンパク質濃度は、反応混合物を
滅菌水で希釈することによって、1mg/mlに下げ、0.5M酢
酸で混合物のpHを4 に調整した。

【０１０４】MePEG-TPO コンジュゲートは、SP Sepharo
se HP (Pharmacia Biotech) イオン交換樹脂を用いたイ
オン交換クロマトグラフィーによって、過剰のMePEG と
他の反応副生物から分離させた。

【０１０５】反応混合物をカラムにロード（2.5 mg/ml
（樹脂））した。未反応のMePEG は、3 カラム容量のス
タートバッファー A（20mMリン酸ナトリウム、pH7.2 、
15%グリセロール）で溶出させた。その後、MePEG-TPO
コンジュゲートは、10カラム容量で、エンドバッファー
Ｂ（バッファーＡ中、1M NaCl ）の、0%から30% の直線
勾配を用いて溶出させた。溶出液は280nm でモニターし
た。 poly-MePEG-TPOコンジュゲートを含んでいるフラ
クションをプールし、濃縮、滅菌濾過した。

【０１０６】精製したpoly-MePEG-TPOコンジュゲート
は、TSK-GEL G4000SWXL とG2000SWXLのゲル濾過カラム
を連結した、HPLC SECで、分析した。タンパク質は280n
m におけるUV吸収によって検出した。球状タンパク質の
分子量マーカーとして、BIO-RAD ゲル・フィルトレーシ
ョン・スタンダードを使った。

【０１０７】HPLC SECでは、調製物には二つの主な成分
（全量の52% と47% ）が含まれており、その溶出位置
は、それぞれ、359.4kDaと159.3kDaの球状タンパク質に
相当した。表６を参照のこと。

【０１０８】MW=6-25kDaのMePEG アルデヒドによる、TP
O の還元アルキル化で調製した、コンジュゲートPEG18
、PEG19 およびPEG21 も同じように行った。これらの
調製に用いた主な反応パラメータは、表５に要約してあ
る。

【０１０９】これらのコンジュゲートのHPLC SEC分析の
結果は、表６に示してある。

【０１１０】(3) N-末端α−アミノ基に付着部位を有
する、mono-MePEG(20kDa)-TPO コンジュゲート(PEG16)
の調製 20mM NaCNBH₃ を含む、100mM リン酸ナトリウム、pH5
、中のMGDF(2 ml,2.5mg/ml)冷却(4℃) 、撹拌溶液に、
5 倍モル過剰のメトキシポリエチレングリコールアルデ
ヒド(MePEG)(平均分子量 20kDa) を加えた。反応混合物
の撹拌は、同じ温度で続けた。

【０１１１】反応中におけるタンパク質の修飾度は、 S
uperdex 200 HR 10/30カラム(Pharmacia Biotech) を用
いた、SEC HPLCによってモニターした。溶離は0.1Mリン
酸ナトリウムバッファー、pH6.9 を用いて、流速0.7ml/
min で行った。

【０１１２】16時間後、SEC HPLC分析は、タンパク質の
初めの量の約90% が修飾されていることを示した。この
時点で反応混合物のタンパク質濃度は、滅菌水で希釈す
ることによって、1mg/mlに下げ、0.5M酢酸で反応混合物
のpHを4 に調整した。

【０１１３】mono-MePEG(20kDa)-TPO コンジュゲート
は、 SP Sepharose HP(Pharmacia Biotech) イオン交換
樹脂を用いたイオン交換クロマトグラフィーによって、
過剰のMePEG と他の反応副生物から分離させた。

【０１１４】反応混合物をカラムにロード(2.5 mg/ml
（樹脂）) した。未反応のMePEG は、3 カラム容量のス
タートバッファーA(20mMリン酸ナトリウム、pH7.2 、15
% グリセロール) で溶出させた。その後、MePEG-TPO コ
ンジュゲートは、20カラム容量で、エンドバッファーＢ
（バッファーＡ中、 1M NaCl）の、0%から25% の直線勾
配を用いて溶出させた。溶出液は280nm でモニターし
た。poly-MePEG-TPOコンジュゲートを含んでいるフラク
ションをプールし、濃縮、滅菌濾過した。

【０１１５】mono-MePEG-TPOコンジュゲートの均一性
は、4-20% のプレキャスト・ 勾配・ ゲル(NOVEX) を用い
たSDS-PAGE（ナトリウム・ドデシル・スルファート・ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動）で判定した。46.9kDa
のタンパク質の位置に相当する、1 本のメジャーバンド
が現れた。

【０１１６】精製したpoly-MePEG-TPOコンジュゲート
は、TSK-GEL G4000SWXL とG2000SWXLのゲル濾過カラム
を連結した、HPLC SECで、分析した。タンパク質は280n
m におけるUV吸収によって検出した。球状タンパク質の
分子量マーカーとして、BIO-RAD ゲル濾過標準を使っ
た。

【０１１７】HPLC SECでは、調製物には一つの主成分が
含まれており、その溶出位置は、181.1kDaの球状タンパ
ク質に相当した。表７を参照のこと。

【０１１８】MW=6-25kDaのMePEG アルデヒドによる、TP
O の還元アルキル化で調製した、mono-MePEG-TPOコンジ
ュゲートPEG14 、PEG15 およびPEG17 も同じように行っ
た。これらの調製に用いた主な反応パラメータは、表５
に要約してある。

【０１１９】これらのコンジュゲートのHPLC SEC分析の
結果は、表７に示してある。

【０１２０】

【表５】

【０１２１】

【表６】

【０１２２】

【表７】

【０１２３】(4) TPO をメトキシ−ポリ（エチレング
リコール）アルデヒドで還元アルキル化することによ
る、DiMePEG(12kDa)-TPOコンジュゲート(PEG22) の調製 次の操作によって、PEG22 と称する、精製された分子を
得た。

【０１２４】5 ℃に保った100mM 酢酸ナトリウム、pH5
中の、2.5 mg/ml のTPO(E. coli 由来、1-163)溶液に、
5 倍過剰モルのメトキシ−ポリエチレングリコールアル
デヒド（MePEG;すなわち， OHC- （CH₂ ）₂ O -(CH₂ -
CH₂ O)_n - CH₃ ; ここでｎは、分子量が約12kDa となる
繰り返し数である）(Shearwater Polymers) を加えた。
10分間混合した後、十分量のNaCNBH₃ （ナトリウム−シ
アノボロヒドリド）(Aldrich) を、反応混合物中の濃度
が20mMになるように、加えた。

【０１２５】この混合物をおよそ5 ℃で、16時間、撹拌
した。16時間経過後、十分量の純水、USP を加えて、TP
O 濃度を1mg/mlにした。これを0.2 ミクロンの減圧・フ
ィルターを通して濾過した。このようにして、90mgの反
応生成物を調製した。少量の1.0M−一塩基性ホスフェー
ト(monobasic phosphate) と1N NaOH 溶液を、この反応
生成物の混合物に加えて、pH6.8 、10mMのホスフェート
溶液にした。

【０１２６】コンジュゲートは、陽イオン交換カラムで
精製した。40mlのSP-Sepharose High Performance カラ
ムを、ベッド高7.5cm で、作成した。カラムは、平衡化
バッファー（10mMホスフェート、pH6.8 、15% グリセロ
ール）で平衡化しておいた。カラムに、2.2 mg/ml （樹
脂）、0.15CV（カラムボリューム）／分でロードした。
ベースラインが安定するまで平衡化バッファーで洗浄し
た。カラムは、バッファー A（20mMホスフェート、pH7.
2 、15% グリセロール）からバッファーＢ（バッファＡ
中、 0.3M NaCl）への、10カラム容量の直線勾配で溶出
させた。流速は0.15CV（カラムボリューム）／分を維持
した。溶出液は280nm でモニターした。

【０１２７】SDS-PAGEゲルでフラクションを調べ、DiPE
G コンジュゲートを含んでいるフラクションをプール
し、0.2 ミクロン・ユニットを通して濾過した。

【０１２８】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：３３２ 配列の型：アミノ酸 配列の種類：タンパク質 起源：ヒト（Ｈｏｍｏ Ｓａｐｉｅｎｓ） 配列 Ser Pro Ala Pro Pro Ala Cys Asp Leu Arg Val Leu Ser Lys Leu Leu 1 5 10 15 Arg Asp Ser His Val Leu His Ser Arg Leu Ser Gln Cys Pro Glu Val 20 25 30 His Pro Leu Pro Thr Pro Val Leu Leu Pro Ala Val Asp Phe Ser Leu 35 40 45 Gly Glu Trp Lys Thr Gln Met Glu Glu Thr Lys Ala Gln Asp Ile Leu 50 55 60 Gly Ala Val Thr Leu Leu Leu Glu Gly Val Met Ala Ala Arg Gly Gln 65 70 75 80 Leu Gly Pro Thr Cys Leu Ser Ser Leu Leu Gly Gln Leu Ser Gly Gln 85 90 95 Val Arg Leu Leu Leu Gly Ala Leu Gln Ser Leu Leu Gly Thr Gln Leu 100 105 110 Pro Pro Gln Gly Arg Thr Thr Ala His Lys Asp Pro Asn Ala Ile Phe 115 120 125 Leu Ser Phe Gln His Leu Leu Arg Gly Lys Val Arg Phe Leu Met Leu 130 135 140 Val Gly Gly Ser Thr Leu Cys Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala 145 150 155 160 Val Pro Ser Arg Thr Ser Leu Val Leu Thr Leu Asn Glu Leu Pro Asn 165 170 175 Arg Thr Ser Gly Leu Leu Glu Thr Asn Phe Thr Ala Ser Ala Arg Thr 180 185 190 Thr Gly Ser Gly Leu Leu Lys Trp Gln Gln Gly Phe Arg Ala Lys Ile 195 200 205 Pro Gly Leu Leu Asn Gln Thr Ser Arg Ser Leu Asp Gln Ile Pro Gly 210 215 220 Tyr Leu Asn Arg Ile His Glu Leu Leu Asn Gly Thr Arg Gly Leu Phe 225 230 235 240 Pro Gly Pro Ser Arg Arg Thr Leu Gly Ala Pro Asp Ile Ser Ser Gly 245 250 255 Thr Ser Asp Thr Gly Ser Leu Pro Pro Asn Leu Gln Pro Gly Tyr Ser 260 265 270 Pro Ser Pro Thr His Pro Pro Thr Gly Gln Tyr Thr Leu Phe Pro Leu 275 280 285 Pro Pro Thr Leu Pro Thr Pro Val Val Gln Leu His Pro Leu Leu Pro 290 295 300 Asp Pro Ser Ala Pro Thr Pro Thr Pro Thr Ser Pro Leu Leu Asn Thr 305 310 315 320 Ser Tyr Thr His Ser Gln Asn Leu Ser Gln Glu Gly 325 330 配列番号：２ 配列の長さ：１０４３ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 起源：ヒト（Ｈｏｍｏ Ｓａｐｉｅｎｓ） 配列 CTAGAAAAAA CCAAGGAGGT AATAAATA 28 ATG AAA AGT CCT GCA CCA CCT GCA TGT GAT TTA CGG GTC CTG TCT AAA 76 Met Lys Ser Pro Ala Pro Pro Ala Cys Asp Leu Arg Val Leu Ser Lys -2 +1 5 10 CTG CTG CGC GAC TCT CAC GTG CTG CAC TCT CGT CTG TCC CAG TGC CCG 124 Leu Leu Arg Asp Ser His Val Leu His Ser Arg Leu Ser Gln Cys Pro 15 20 25 30 GAA GTT CAC CCG CTG CCG ACC CCG GTT CTG CTT CCG GCT GTC GAC TTC 172 Glu Val His Pro Leu Pro Thr Pro Val Leu Leu Pro Ala Val Asp Phe 35 40 45 TCC CTG GGT GAA TGG AAA ACC CAG ATG GAA GAG ACC AAA GCT CAG GAC 220 Ser Leu Gly Glu Trp Lys Thr Gln Met Glu Glu Thr Lys Ala Gln Asp 50 55 60 ATC CTG GGT GCA GTA ACT CTG CTT CTG GAA GGC GTT ATG GCT GCA CGT 268 Ile Leu Gly Ala Val Thr Leu Leu Leu Glu Gly Val Met Ala Ala Arg 65 70 75 GGC CAG CTT GGC CCG ACC TGC CTG TCT TCC CTG CTT GGC CAG CTG TCT 316 Gly Gln Leu Gly Pro Thr Cys Leu Ser Ser Leu Leu Gly Gln Leu Ser 80 85 90 GGC CAG GTT CGT CTG CTG CTC GGC GCT CTG CAG TCT CTG CTT GGC ACC 364 Gly Gln Val Arg Leu Leu Leu Gly Ala Leu Gln Ser Leu Leu Gly Thr 95 100 105 110 CAG CTG CCG CCA CAG GGC CGT ACC ACT GCT CAC AAG GAT CCG AAC GCT 412 Gln Leu Pro Pro Gln Gly Arg Thr Thr Ala His Lys Asp Pro Asn Ala 115 120 125 ATC TTC CTG TCT TTC CAG CAC CTG CTG CGT GGC AAA GTT CGT TTC CTG 460 Ile Phe Leu Ser Phe Gln His Leu Leu Arg Gly Lys Val Arg Phe Leu 130 135 140 ATG CTG GTT GGC GGT TCT ACC CTG TGC GTT CGT CGG GCG CCG CCA ACC 508 Met Leu Val Gly Gly Ser Thr Leu Cys Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr 145 150 155 ACT GCT GTT CCG TCT CGT ACC TCT CTG GTT CTG ACC CTG AAC GAG CTC 556 Thr Ala Val Pro Ser Arg Thr Ser Leu Val Leu Thr Leu Asn Glu Leu 160 165 170 CCG AAC CGT ACC AGC GGC CTG CTG GAA ACC AAC TTT ACC GCG AGC GCG 604 Pro Asn Arg Thr Ser Gly Leu Leu Glu Thr Asn Phe Thr Ala Ser Ala 175 180 185 190 CGT ACC ACC GGC AGC GGC CTG CTG AAA TGG CAG CAG GGC TTT CGT GCG 652 Arg Thr Thr Gly Ser Gly Leu Leu Lys Trp Gln Gln Gly Phe Arg Ala 195 200 205 AAA ATC CCG GGC CTG CTG AAC CAG ACC AGC CGT AGC CTG GAT CAG ATC 700 Lys Ile Pro Gly Leu Leu Asn Gln Thr Ser Arg Ser Leu Asp Gln Ile 210 215 220 CCG GGC TAT CTG AAC CGT ATC CAT GAA CTG CTG AAC GGC ACC CGT GGC 748 Pro Gly Tyr Leu Asn Arg Ile His Glu Leu Leu Asn Gly Thr Arg Gly 225 230 235 CTG TTT CCG GGC CCG AGC CGT CGC ACC CTG GGC GCG CCG GAT ATC AGC 796 Leu Phe Pro Gly Pro Ser Arg Arg Thr Leu Gly Ala Pro Asp Ile Ser 240 245 250 TCT GGC ACC AGC GAT ACC GGC AGC CTG CCG CCG AAC CTG CAG CCG GGC 844 Ser Gly Thr Ser Asp Thr Gly Ser Leu Pro Pro Asn Leu Gln Pro Gly 255 260 265 270 TAT AGC CCG AGC CCG ACC CAT CCG CCG ACC GGC CAG TAT ACC CTG TTT 892 Tyr Ser Pro Ser Pro Thr His Pro Pro Thr Gly Gln Tyr Thr Leu Phe 275 280 285 CCG CTG CCG CCG ACC CTG CCG ACC CCG GTG GTT CAG CTG CAT CCG CTG 940 Pro Leu Pro Pro Thr Leu Pro Thr Pro Val Val Gln Leu His Pro Leu 290 295 300 CTG CCG GAT CCG AGC GCG CCG ACC CCG ACC CCG ACC AGC CCG CTG CTG 988 Leu Pro Asp Pro Ser Ala Pro Thr Pro Thr Pro Thr Ser Pro Leu Leu 305 310 315 AAC ACC AGC TAT ACC CAT AGC CAG AAC CTG AGC CAG GAA GGC 1030 Asn Thr Ser Tyr Thr His Ser Gln Asn Leu Ser Gln Glu Gly 320 325 330 TAATGAAGCT TGA 1043 配列番号：３ 配列の長さ：１７２１ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ 起源：ヒト（Ｈｏｍｏ Ｓａｐｉｅｎｓ） 組織の種類：肝臓 配列 GCGGCACGAG GGGGGTGTCT GGCTGGCGTG GCTCCCTGTT TGGGGCCTCT CCCCTGAATC 60 CTTCCTGGGG CCATGGAGGC CAGACAGACA CCCCGGCCAG A 101 ATG GAG CTG ACT GAA TTG CTC CTC GTG GTC ATG CTT CTC CTA ACT GCA 149 Met Glu Leu Thr Glu Leu Leu Leu Val Val Met Leu Leu Leu Thr Ala -20 -15 -10 AGG CTA ACG CTG TCC AGC CCG GCT CCT CCT GCT TGT GAC CTC CGA GTC 193 Arg Leu Thr Leu Ser Ser Pro Ala Pro Pro Ala Cys Asp Leu Arg Val -5 1 5 10 CTC AGT AAA CTG CTT CGT GAC TCC CAT GTC CTT CAC AGC AGA CTG AGC 245 Leu Ser Lys Leu Leu Arg Asp Ser His Val Leu His Ser Arg Leu Ser 15 20 25 CAG TGC CCA GAG GTT CAC CCT TTG CCT ACA CCT GTC CTG CTG CCT GCT 293 Gln Cys Pro Glu Val His Pro Leu Pro Thr Pro Val Leu Leu Pro Ala 30 35 40 GTG GAC TTT AGC TTG GGA GAA TGG AAA ACC CAG ATG GAG GAG ACC AAG 341 Val Asp Phe Ser Leu Gly Glu Trp Lys Thr Gln Met Glu Glu Thr Lys 45 50 55 GCA CAG GAC ATT CTG GGA GCA GTG ACC CTT CTG CTG GAG GGA GTG ATG 389 Ala Gln Asp Ile Leu Gly Ala Val Thr Leu Leu Leu Glu Gly Val Met 60 65 70 75 GCA GCA CGG GGA CAA CTG GGA CCC ACT TGC CTC TCA TCC CTC CTG GGG 437 Ala Ala Arg Gly Gln Leu Gly Pro Thr Cys Leu Ser Ser Leu Leu Gly 80 85 90 CAG CTT TCT GGA CAG GTC CGT CTC CTC CTT GGG GCC CTG CAG AGC CTC 485 Gln Leu Ser Gly Gln Val Arg Leu Leu Leu Gly Ala Leu Gln Ser Leu 95 100 105 CTT GGA ACC CAG CTT CCT CCA CAG GGC AGG ACC ACA GCT CAC AAG GAT 533 Leu Gly Thr Gln Leu Pro Pro Gln Gly Arg Thr Thr Ala His Lys Asp 110 115 120 CCC AAT GCC ATC TTC CTG AGC TTC CAA CAC CTG CTC CGA GGA AAG GTG 581 Pro Asn Ala Ile Phe Leu Ser Phe Gln His Leu Leu Arg Gly Lys Val 125 130 135 CGT TTC CTG ATG CTT GTA GGA GGG TCC ACC CTC TGC GTC AGG CGG GCC 629 Arg Phe Leu Met Leu Val Gly Gly Ser Thr Leu Cys Val Arg Arg Ala 140 145 150 155 CCA CCC ACC ACA GCT GTC CCC AGC AGA ACC TCT CTA GTC CTC ACA CTG 677 Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Arg Thr Ser Leu Val Leu Thr Leu 160 165 170 AAC GAG CTC CCA AAC AGG ACT TCT GGA TTG TTG GAG ACA AAC TTC ACT 725 Asn Glu Leu Pro Asn Arg Thr Ser Gly Leu Leu Glu Thr Asn Phe Thr 175 180 185 GCC TCA GCC AGA ACA ACT GGC TCT GGG CTT CTG AAG TGG CAG CAG GGA 773 Ala Ser Ala Arg Thr Thr Gly Ser Gly Leu Leu Lys Trp Gln Gln Gly 190 195 200 TTC AGA GCC AAG ATT CCT GGT CTG CTG AAC CAA ACC TCC AGG TCC CTG 821 Phe Arg Ala Lys Ile Pro Gly Leu Leu Asn Gln Thr Ser Arg Ser Leu 205 210 215 GAC CAA ATC CCC GGA TAC CTG AAC AGG ATA CAC GAA CTC TTG AAT GGA 869 Asp Gln Ile Pro Gly Tyr Leu Asn Arg Ile His Glu Leu Leu Asn Gly 220 225 230 235 ACT CGT GGA CTC TTT CCT GGA CCC TCA CGC AGG ACC CTA GGA GCC CCG 917 Thr Arg Gly Leu Phe Pro Gly Pro Ser Arg Arg Thr Leu Gly Ala Pro 240 245 250 GAC ATT TCC TCA GGA ACA TCA GAC ACA GGC TCC CTG CCA CCC AAC CTC 965 Asp Ile Ser Ser Gly Thr Ser Asp Thr Gly Ser Leu Pro Pro Asn Leu 255 260 265 CAG CCT GGA TAT TCT CCT TCC CCA ACC CAT CCT CCT ACT GGA CAG TAT 1013 Gln Pro Gly Tyr Ser Pro Ser Pro Thr His Pro Pro Thr Gly Gln Tyr 270 275 280 ACG CTC TTC CCT CTT CCA CCC ACC TTG CCC ACC CCT GTG GTC CAG CTC 1061 Thr Leu Phe Pro Leu Pro Pro Thr Leu Pro Thr Pro Val Val Gln Leu 285 290 295 CAC CCC CTG CTT CCT GAC CCT TCT GCT CCA ACG CCC ACC CCT ACC AGC 1109 His Pro Leu Leu Pro Asp Pro Ser Ala Pro Thr Pro Thr Pro Thr Ser 300 305 310 315 CCT CTT CTA AAC ACA TCC TAC ACC CAC TCC CAG AAT CTG TCT CAG GAA 1157 Pro Leu Leu Asn Thr Ser Tyr Thr His Ser Gln Asn Leu Ser Gln Glu 320 325 330 GGG TAAGGTTCTC AGACACTGCC GACATCAGCA TTGTCTCGTG TACAGCTCCC 1210 Gly TTCCCTGCAG GGCGCCCCTG GGAGACAACT GGACAAGATT TCCTACTTTC TCCTGAAACC 1270 CAAAGCCCTG GTAAAAGGGA TACACAGGAC TGAAAAGGGA ATCATTTTTC ACTGTACATT 1330 ATAAACCTTC AGAAGCTATT TTTTTAAGCT ATCAGCAATA CTCATCAGAG CAGCTAGCTC 1390 TTTGGTCTAT TTTCTGCAGA AATTTGCAAC TCACTGATTC TCTACATGCT CTTTTTCTGT 1450 GATAACTCTG CAAAGGCCTG GGCTGGCCTG GCAGTTGAAC AGAGGGAGAG ACTAACCTTG 1510 AGTCAGAAAA CAGAGAAAGG GTAATTTCCT TTGCTTCAAA TTCAAGGCCT TCCAACGCCC 1570 CCATCCCCTT TACTATCATT CTCAGTGGGA CTCTGATCCC ATATTCTTAA CAGATCTTTA 1630 CTCTTGAGAA ATGAATAAGC TTTCTCTCAG AAATGCTGTC CCTATACACT AGACAAAACT 1690 G 以下ポリＡ尾部３０塩基 1721 配列番号：４ 配列の長さ：１０８６ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ 起源：ヒト（Ｈｏｍｏ Ｓａｐｉｅｎｓ） 組織の種類：肝臓 配列 GGCCAGCCAG ACACCCCGGC CAGA 24 ATG GAG CTG ACT GAA TTG CTC CTC GTG GTC ATG CTT CTC CTA ACT GCA 72 Met Glu Leu Thr Glu Leu Leu Leu Val Val Met Leu Leu Leu Thr Ala -20 -15 -10 AGG CTA ACG CTG TCC AGC CCG GCT CCT CCT GCT TGT GAC CTC CGA GTC 120 Arg Leu Thr Leu Ser Ser Pro Ala Pro Pro Ala Cys Asp Leu Arg Val -5 1 5 10 CTC AGT AAA CTG CTT CGT GAC TCC CAT GTC CTT CAC AGC AGA CTG AGC 168 Leu Ser Lys Leu Leu Arg Asp Ser His Val Leu His Ser Arg Leu Ser 15 20 25 CAG TGC CCA GAG GTT CAC CCT TTG CCT ACA CCT GTC CTG CTG CCT GCT 216 Gln Cys Pro Glu Val His Pro Leu Pro Thr Pro Val Leu Leu Pro Ala 30 35 40 GTG GAC TTT AGC TTG GGA GAA TGG AAA ACC CAG ATG GAG GAG ACC AAG 264 Val Asp Phe Ser Leu Gly Glu Trp Lys Thr Gln Met Glu Glu Thr Lys 45 50 55 GCA CAG GAC ATT CTG GGA GCA GTG ACC CTT CTG CTG GAG GGA GTG ATG 312 Ala Gln Asp Ile Leu Gly Ala Val Thr Leu Leu Leu Glu Gly Val Met 60 65 70 75 GCA GCA CGG GGA CAA CTG GGA CCC ACT TGC CTC TCA TCC CTC CTG GGG 360 Ala Ala Arg Gly Gln Leu Gly Pro Thr Cys Leu Ser Ser Leu Leu Gly 80 85 90 CAG CTT TCT GGA CAG GTC CGT CTC CTC CTT GGG GCC CTG CAG AGC CTC 408 Gln Leu Ser Gly Gln Val Arg Leu Leu Leu Gly Ala Leu Gln Ser Leu 95 100 105 CTT GGA ACC CAG CTT CCT CCA CAG GGC AGG ACC ACA GCT CAC AAG GAT 456 Leu Gly Thr Gln Leu Pro Pro Gln Gly Arg Thr Thr Ala His Lys Asp 110 115 120 CCC AAT GCC ATC TTC CTG AGC TTC CAA CAC CTG CTC CGA GGA AAG GTG 504 Pro Asn Ala Ile Phe Leu Ser Phe Gln His Leu Leu Arg Gly Lys Val 125 130 135 CGT TTC CTG ATG CTT GTA GGA GGG TCC ACC CTC TGC GTC AGG CGG GCC 552 Arg Phe Leu Met Leu Val Gly Gly Ser Thr Leu Cys Val Arg Arg Ala 140 145 150 155 CCA CCC ACC ACA GCT GTC CCC AGC AGA ACC TCT CTA GTC CTC ACA CTG 600 Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Arg Thr Ser Leu Val Leu Thr Leu 160 165 170 AAC GAG CTC CCA AAC AGG ACT TCT GGA TTG TTG GAG ACA AAC TTC ACT 648 Asn Glu Leu Pro Asn Arg Thr Ser Gly Leu Leu Glu Thr Asn Phe Thr 175 180 185 GCC TCA GCC AGA ACT ACT GGC TCT GGG CTT CTG AAG TGG CAG CAG GGA 696 Ala Ser Ala Arg Thr Thr Gly Ser Gly Leu Leu Lys Trp Gln Gln Gly 190 195 200 TTC AGA GCC AAG ATT CCT GGT CTG CTG AAC CAA ACC TCC AGG TCC CTG 744 Phe Arg Ala Lys Ile Pro Gly Leu Leu Asn Gln Thr Ser Arg Ser Leu 205 210 215 GAC CAA ATC CCC GGA TAC CTG AAC AGG ATA CAC GAA CTC TTG AAT GGA 792 Asp Gln Ile Pro Gly Tyr Leu Asn Arg Ile His Glu Leu Leu Asn Gly 220 225 230 235 ACT CGT GGA CTC TTT CCT GGA CCC TCA CGC AGG ACC CTA GGA GCC CCG 840 Thr Arg Gly Leu Phe Pro Gly Pro Ser Arg Arg Thr Leu Gly Ala Pro 240 245 250 GAC ATT TCC TCA GGA ACA TCA GAC ACA GGC TCC CTG CCA CCC AAC CTC 888 Asp Ile Ser Ser Gly Thr Ser Asp Thr Gly Ser Leu Pro Pro Asn Leu 255 260 265 CAG CCT GGA TAT TCT CCT TCC CCA ACC CAT CCT CCT ACT GGA CAG TAT 936 Gln Pro Gly Tyr Ser Pro Ser Pro Thr His Pro Pro Thr Gly Gln Tyr 270 275 280 ACG CTC TTC CCT CTT CCA CCC ACC TTG CCC ACC CCT GTG GTC CAG CTC 984 Thr Leu Phe Pro Leu Pro Pro Thr Leu Pro Thr Pro Val Val Gln Leu 285 290 295 CAC CCC CTG CTT CCT GAC CCT TCT GCT CCA ACG CCC ACC CCT ACC AGC 1032 His Pro Leu Leu Pro Asp Pro Ser Ala Pro Thr Pro Thr Pro Thr Ser 300 305 310 315 CCT CTT CTA AAC ACA TCC TAC ACC CAC TCC CAG AAT CTG TCT CAG GAA 1080 Pro Leu Leu Asn Thr Ser Tyr Thr His Ser Gln Asn Leu Ser Gln Glu 320 325 330 GGG TAA 1086 Gly 配列番号：５ 配列の長さ：５３５ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 起源：ヒト（Ｈｏｍｏ Ｓａｐｉｅｎｓ） 配列 CTAGAAAAAA CCAAGGAGGT AATAAATA 28 ATG AAA AGT CCT GCA CCA CCT GCA TGT GAT TTA CGG GTC CTG TCT AAA 76 Met Lys Ser Pro Ala Pro Pro Ala Cys Asp Leu Arg Val Leu Ser Lys +1 5 10 CTG CTG CGC GAC TCT CAC GTG CTG CAC TCT CGT CTG TCC CAG TGC CCG 124 Leu Leu Arg Asp Ser His Val Leu His Ser Arg Leu Ser Gln Cys Pro 15 20 25 30 GAA GTT CAC CCG CTG CCG ACC CCG GTT CTG CTT CCG GCT GTC GAC TTC 172 Glu Val His Pro Leu Pro Thr Pro Val Leu Leu Pro Ala Val Asp Phe 35 40 45 TCC CTG GGT GAA TGG AAA ACC CAG ATG GAA GAG ACC AAA GCT CAG GAC 220 Ser Leu Gly Glu Trp Lys Thr Gln Met Glu Glu Thr Lys Ala Gln Asp 50 55 60 ATC CTG GGT GCA GTA ACT CTG CTT CTG GAA GGC GTT ATG GCT GCA CGT 268 Ile Leu Gly Ala Val Thr Leu Leu Leu Glu Gly Val Met Ala Ala Arg 65 70 75 GGC CAG CTT GGC CCG ACC TGC CTG TCT TCC CTG CTT GGC CAG CTG TCT 316 Gly Gln Leu Gly Pro Thr Cys Leu Ser Ser Leu Leu Gly Gln Leu Ser 80 85 90 GGC CAG GTT CGT CTG CTG CTC GGC GCT CTG CAG TCT CTG CTT GGC ACC 364 Gly Gln Val Arg Leu Leu Leu Gly Ala Leu Gln Ser Leu Leu Gly Thr 95 100 105 110 CAG CTG CCG CCA CAG GGC CGT ACC ACT GCT CAC AAG GAT CCG AAC GCT 412 Gln Leu Pro Pro Gln Gly Arg Thr Thr Ala His Lys Asp Pro Asn Ala 115 120 125 ATC TTC CTG TCT TTC CAG CAC CTG CTG CGT GGC AAA GTT CGT TTC CTG 460 Ile Phe Leu Ser Phe Gln His Leu Leu Arg Gly Lys Val Arg Phe Leu 130 135 140 ATG CTG GTT GGC GGT TCT ACC CTG TGC GTT CGT CGG GCG CCG CCA ACC 508 Met Leu Val Gly Gly Ser Thr Leu Cys Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr 145 150 155 ACT GCT GTT CCG TCT TAATGAAAGC TT 535 Thr Ala Val Pro Ser 160

【０１２９】

【発明の効果】本発明により、保存期間中に止血血栓形
成能の低下した血小板に対しTPO を添加することによ
り、採血直後のレベルまで血小板の止血血栓形成能を回
復させることが可能である。したがって、このような処
置を施した血小板を出血傾向のある患者に輸血すること
により、より一層の止血効果が期待できる。

【図面の簡単な説明】

【図１】健常人から採取した保存濃厚血小板液をTPO 処
理した際の、TPO による血小板凝集能亢進作用（刺激薬
剤としてADP 使用）を示す。

【図２】健常人から採取した保存濃厚血小板液をTPO 処
理した際の、TPO による血小板凝集能亢進作用（刺激薬
剤としてコラーゲン使用）を示す。

【図３】健常人から採取した保存濃厚血小板液をTPO 処
理した際の、TPO による血小板凝集能亢進作用（刺激薬
剤としてADP とコラーゲン使用）を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 保存血小板の止血血栓形成能を回復させ
   るための、トロンボポエチン（ＴＰＯ）含有組成物。
2. 【請求項２】 自己血小板輸血又は貯血に使用する、請
   求項１に記載の組成物。
3. 【請求項３】 同種血小板輸血に使用する、請求項１に
   記載の組成物。
4. 【請求項４】 保存期限を経過した血小板に使用する、
   請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
5. 【請求項５】 受容者体内で使用する、請求項１〜４の
   いずれか一項に記載の組成物。
6. 【請求項６】 ｅｘ ｖｉｖｏで使用する、請求項１〜
   ４のいずれか一項に記載の組成物。
7. 【請求項７】 さらに、保存血小板の止血血栓形成能の
   持続時間を延長させる、請求項１〜６のいずれか一項に
   記載の組成物。
8. 【請求項８】 止血血栓形成能の低下が認められる血小
   板液に、請求項１〜７のいずれか一項に記載のＴＰＯ含
   有組成物を添加することを含む、血小板の止血血栓形成
   能を回復する方法。