JP3177449B2 - 水溶性ポリマーで修飾したコンセンサスインターフェロン - Google Patents

水溶性ポリマーで修飾したコンセンサスインターフェロン

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Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明はタンパク質修飾の広
範な技術分野に関し、さらに詳しくは、タンパク質また
はその類似体に対する水溶性ポリマーの結合に関する
（「タンパク質」という用語は本明細書で使用する場
合、特に断わらない限り「ポリペプチド」またはペプチ
ドと同じ意味である）。また本発明は、タンパク質また
はその類似体のＮ末端を修飾する新規な方法およびその
結果得られる組成物に関する。別の態様で、本発明は新
規なＮ末端化学修飾Ｇ−ＣＳＦ組成物および関連する製
造法に関する。また本発明は化学的に修飾された共働性
インターフェロン（ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ ｉｎｔｅｒｆ
ｅｒｏｎ）に関する。
【０００２】
【従来の技術】及び
【発明が解決しようとする課題】治療に用いるタンパク
質は大部分が、組換えＤＮＡ法が広く進歩した結果、適
切な形態で充分な量を現在入手することができる。組換
えタンパク質が入手可能になったので、タンパク質の製
造と化学修飾が進歩している。このような修飾を行う目
的の一つはタンパク質の保護である。
【０００３】化学結合によって、タンパク質分解酵素が
タンパク質の骨格自体と物理的に接触するのを有効に遮
断することができその結果分解が防止される。追加の利
点としては、特定の条件下で、治療用タンパク質の安定
性と循環時間を増大しかつ免疫原性を減少させることが
挙げられる。タンパク質の修飾と融合タンパク質を説明
する総説の文献はＦｒａｎｃｉｓ、Ｆｏｃｕｓ ｏｎ
Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ、３巻、４〜１０頁、１
９９２年５月（英国、ロンドンＮ２０、オールド、フラ
イアン・バーネット・レーン、マウンビュー・コート所
在、Ｍｅｄｉｓｃｒｉｐｔ社発行）である。
【０００４】ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）
は、治療用タンパク質産物を製造するのに用いられてい
る化学薬剤部分の一つである［「ＰＥＧ化する（ｐｅｇ
ｙｌａｔｅ）」という動詞は少なくとも一つのＰＥＧ分
子を結合させることを意味する］。例えば、Ａｄａｇｅ
ｎすなわちアデノシンデアミナーゼのＰＥＧ化製剤は重
篤な合併型免疫不全症を治療することが証明されてい
る；ＰＥＧ化スーパーオキシドジスムターゼは頭部外傷
を治療するための臨床試験が行われている；ＰＥＧ化α
−インターフェロンは肝炎を治療するための第１相臨床
試験で試験されている；ＰＥＧ化グルコセレブロシダー
ゼとＰＥＧヘモグロビンは前臨床試験（ｐｒｅｃｌｉｎ
ｉｃａｌ ｔｅｓｔｉｎｇ）中であることが報告されて
いる。ポリエチレングリコールを結合すると、タンパク
質分解を起こさないよう防御することが報告されており
（Ｓａｄａら、Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｂｉｏ
ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、７１巻、１３７〜１３９頁、
１９９１年）そして特定のポリエチレングリコール部分
を結合する方法も利用できる（１９７９年１２月１８日
付け発行のＤａｖｉｓらの米国特許第４，１７９，３３
７号「Ｎｏｎ−Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ Ｐｏｌｙｐｅ
ｐｔｉｄｅｓ」；および１９７７年１月１１日付け発行
のＲｏｙｅｒの米国特許第４，００２，５３１号「Ｍｏ
ｄｉｆｙｉｎｇｅｎｚｙｍｅｓｗｉｔｈ Ｐｏｌｙｅｔ
ｈｙｌｅｎｅ Ｇｌｙｃｏｌ ａｎｄＰｒｏｄｕｃｔＰ
ｒｏｄｕｃｅｄ Ｔｈｅｒｅｂｙ」参照。総説について
は、Ｊ．Ｓ．ＨｏｌｃｅｒｂｅｒｇおよびＪ．Ｒｏｂｅ
ｒｔｓ編集「Ｅｎｚｙｍｅｓ ａｓ Ｄｒｕｇｓ」 ３
６７〜３８３頁、１９８１年のＡｂｕｃｈｏｗｓｋｉら
の報告参照）。
【０００５】以下のような他の水溶性ポリマーも使用さ
れている。すなわち、エチレングリコール／プロピレン
グリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロー
ス、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニル
ピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，
３，６−トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポ
リマー、ポリアミノ酸類（ホモポリマーまたはランダム
コポリマー）などである。
【０００６】ポリエチレングリコールの場合、その分子
をタンパク質に結合するのに各種の方法が用いられてい
る。一般にポリエチレングリコール分子は、タンパク質
に見られる反応性基を通じてタンパク質に結合される。
例えばリシン残基またはＮ末端のアミノ基などのアミノ
基は上記の結合を行うのに便利である。例えばＲｏｙｅ
ｒ（上記米国特許第４，００２，５３１号）は、ポリエ
チレングリコール分子を酵素に結合するのに還元的アル
キル化反応を用いたと述べている。１９９３年４月２８
日付けで発行されたＷｒｉｇｈｔのヨーロッパ特許第０
５３９１６７号「Ｐｅｇ Ｉｍｉｄａｔｅｓ ａｎｄ
Ｐｒｏｔｅｉｎ ＤｅｒｉｖａｔｅｓＴｈｅｒｅｏｆ」
には、遊離アミノ基を有するペプチドと有機化合物は、
ＰＥＧの直接的誘導体（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ ｄｅｒｉ
ｖａｔｉｖｅ）または類縁の水溶性有機ポリマーで修飾
されることが記載されている。１９９０年２月２７日付
けで発行されたＳｈａｗの米国特許第４，９０４，５８
４号には、ポリエチレングリコール分子を反応性アミン
基を通じて結合するためタンパク質中のリシン残基の数
を改変することが記載されている。
【０００７】化学修飾された治療用タンパク質の具体例
は顆粒球コロニー刺激因子すなわち「Ｇ−ＣＳＦ」であ
る。Ｇ−ＣＳＦは好中性顆粒球の迅速な増殖と血流中へ
の放出を誘発するので、感染と戦う治療効果がある。
【０００８】１９９０年１２月１２日付けで公表された
ヨーロッパ特許第０４０１３８４号「Ｃｈｅｍｉｃａｌ
ｌｙ ＭｏｄｉｆｉｅｄＧｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ Ｃｏ
ｌｏｎｙ Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ Ｆａｃｔｏｒ」に
は、ポリエチレングリコール分子が結合されるＧ−ＣＳ
Ｆを製造する場合の材料と方法が記載されている。
【０００９】修飾Ｇ−ＣＳＦとその類似体も、１９９２
年３月４日付けで公表されたヨーロッパ特許第０４７３
２６８号「Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｐ
ｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ
ｓ Ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇａ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ
Ｃｏｖａｌｅｎｔｌｙ ＣｏｎｊｕｇａｔｅｄＴｏ
Ａ Ｗａｔｅｒ Ｓｏｌｕｂｌｅ Ｐｏｌｙｍｅｒ」に
報告されており、その明細書には、ポリエチレングリコ
ールのような水溶性粒子ポリマーに共有結合させた各種
Ｇ−ＣＳＦと誘導体の使用が述べられている。
【００１０】ヒト顆粒球コロニー刺激因子活性を有する
修飾ポリペプチドは１９８９年１０月４日付けで公表さ
れたヨーロッパ特許第０３３５４２３号に報告されてい
る。
【００１１】他の例はＰＥＧ化ＩＬ−６であり、ヨーロ
ッパ特許第０４４２７２４号「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｈＩ
Ｌ−６」（同時係属中のアメリカ特許出願第０７／６３
２，０７０号参照）はＩＬ−６に付加されたポリエチレ
ングリコール分子を開示している。
【００１２】１９８５年９月１１日付けで公表されたヨ
ーロッパ特許第０１５４３１６号は、リンホカインと、
ポリエチレングリコールのアルデヒドとの反応を報告し
ている。
【００１３】ポリマーをタンパク質に結合する多くの方
法は結合基として作用する部分を用いて行われる。しか
しこのような部分は抗原性である。結合基を用いないト
レシルクロリド法（Ｔｒｅｓｙｌ ｃｈｌｏｒｉｄｅ
ｍｅｔｈｏｄ）を利用できるが、トレシルクロリドを使
用すると有毒な副生物を生成することがあるので、この
方法は治療用製品を製造するのに利用することは難しい
（Ａｈｅｒｎ．、Ｔ．およびＭａｎｎｉｎｇ、Ｍ．Ｃ．
編集「Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐ
ｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ：ｉｎ ｖｉｖｏ ｐａ
ｔｈｗａｙｓｏｆ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ａｎｄ
ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｔ
ａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ」Ｐｌｅｎｕｍ社、米国ニュー
ヨーク１９９１年のＦｒａｎｃｉｓらの報告およびＦｉ
ｓｈｅｒら編集「Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ Ｕｓｉｎｇ
Ａｑｕｅｏｕｓ Ｐｈａｓｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ａｐ
ｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇ
ｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」Ｐｌｅｎｕ
ｍＰｒｅｓｓ社、米国ニューヨーク州ニューヨーク、１
９８９年の２１１〜２１３頁のＤｅｌｇａｄｏらの論文
「Ｃｏｕｐｌｉｎｇ ｏｆ ＰＥＧ ｔｏ Ｐｒｏｔｅ
ｉｎ Ｂｙ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ Ｗｉｔｈ Ｔｒｅ
ｓｙｌ Ｃｈｌｏｒｉｄｅ、Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ
Ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏａｆｆｉｎｉｔｙ Ｃｅｌｌ Ｐ
ｒｅｐａｒａｔｉｏｎ」参照）。
【００１４】Ｃｈａｍｏｗら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔ
ｅ Ｃｈｅｍ．、５巻、１３３〜１４０頁、１９９４年
は、還元的アルキル化反応で行う、ＣＤ４免疫アドヘジ
ン（ｉｍｍｕｎｏａｄｈｅｓｉｎ）のモノメトキシポリ
（エチレングリコール）アルデヒドによる修飾を報告し
ている。その著者らは、ＣＤ４−Ｉｇの５０％が、ＰＥ
Ｇ化度を制御できる条件下でＭｅＰＥＧで修飾されたと
報告している（上記文献の１３７頁）。またこれらの著
者は、修飾されたＣＤ４−Ｉｇの（タンパク質ｇｐ１２
０に対する）生体外での結合能はＭｅＰＥＧ化度に相関
する比率で低下すると報告している（上記文献参照）。
およびタンパク質基質（インスリン）のＣ末端カルボキ
シル基に対するリンカー基カルボヒドラジドの選択的結
合を報告するＲｏｓｅら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ
Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２巻、１５４〜１５９頁１９９１
年も参照）。
【００１５】しかし、特定のタンパク質に関する技術の
現在の一般的な技術水準では、Ｇ−ＣＳＦのようなタン
パク質のＮ末端に水溶性ポリマーを選択的に結合させる
ことはできない。むしろ、現在の方法では、例えばリシ
ン側基のような反応性基（タンパク質内のどこに位置し
ているかにかかわらず）またはＮ末端に非選択的に結合
する。そのため不均一な混合物が生成する。例えば、Ｐ
ＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ分子の場合、いくつかの分子は、他の
分子と異なる数のポリエチレングリコール部分を有して
いる。例えば、５個のリシン残基を有するタンパク質分
子が上記の方法で反応させると、ある分子は６個のポリ
エチレングリコール部分を有し、またある分子は５個、
またある分子は４個、またある分子は３個、またある分
子は２個、またある分子は１個のＰＥＧ部分を有し、ま
たある分子はＰＥＧ部分をもっていない。そして、いく
つかのポリエチレングリコール部分を有する分子におい
て、そのポリエチレングリコール部分は、異なる分子と
同じ位置に結合していないこともある。
【００１６】このことは、治療用のＰＥＧ化タンパク質
製品を開発する場合不利である。このような開発を行う
場合、生物活性を予知できることが重要である。例え
ば、スーパーオキシドジスムターゼとポリエチレングリ
コールの非選択的結合の場合、得られる修飾酵素のいく
つかの画分は全く不活性であったと報告されている
（Ｐ．ＭｃＧｏｆｆら、Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌ
ｌ．、３６巻、３０７９〜３０９１頁、１９８８年）。
治療用のタンパク質がロット毎に組成が異なる場合、上
記の予知を得ることができない。ポリエチレングリコー
ル部分のいくつかは、ある位置では他の位置の場合と同
様に安定に結合できないので、このようなＰＥＧ部分は
タンパク質から解離することになる。勿論、このような
ＰＥＧ部分がランダムに結合し、したがってランダムに
解離する場合、治療用タンパク質の薬物動態を正確に予
知することはできない。消費者からみれば、その循環時
間はロット毎に変動するので投与量が不正確になる。メ
ーカーから見ると、治療用タンパク質を販売するための
法律上の承認を得るのに複雑さが加わる。その上に、上
記の方法は、（タンパク質とポリマーの間に）結合部分
なしでは選択的Ｎ末端化学修飾を行えない。結合部分を
用いると、抗原性があるかもしれないので不利である。
【００１７】したがって、選択的にＮ末端が化学修飾さ
れたタンパク質とその類似体が得られる方法が要望され
ている。そのタンパク質としてはＧ−ＣＳＦや共働性イ
ンターフェロンなどがあるがこれら２種の化学修飾され
たタンパク質を以下に例示する。本発明はこの要望をい
くつかの態様で検討するものである。
【００１８】発明の要約 本発明は、Ｎ末端化学修飾タンパク質の実質的に均質な
製剤とその製造方法に関する。予想外のことであった
が、Ｇ−ＣＳＦのＮ末端を化学修飾すると、この分子の
別の位置に一つの化学修飾がなされている他のＧ−ＣＳ
Ｆ種にはみられない、安定性の利点を示した。またも予
想外であったが、Ｎ末端を化学修飾されたＧ−ＣＳＦを
製造する本発明の方法で、還元的アルキル化反応を用い
て、Ｎ末端を選択的に修飾する条件を提供することがで
き、かつこの方法はＧ−ＣＳＦのみならず他のタンパク
質（またはその類似体）に広く適用できることが見出さ
れたのである。また驚くべきことであるが、還元的アル
キル化反応を用いると、最終生成物（水溶性ポリマーと
のアミン結合を有するタンパク質）が、アミド結合を有
する同じポリマー／タンパク質結合体よりはるかに安定
であることが見出された。このように修飾された他の一
つのタンパク質（下記実施例で説明する）は共働性イン
ターフェロンである。したがって、一層詳細に以下に説
明するように、本発明には、特定のタンパク質の特定の
修飾のみならずタンパク質（またはその類似体）の化学
修飾に関するいくつかの態様がある。
【００１９】一つの態様で、本発明は、Ｎ末端を化学修
飾されたＧ−ＣＳＦ（またはその類似体）の実質的に均
質な製剤および関連する方法に関する。下記の一実施例
は、Ｎ末端モノＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦが他のタイプのモノ
ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦより安定であることを例証してい
る。さらに、Ｇ−ＣＳＦ分子のＮ末端はポリエチレング
リコールとの反応で利用し易いので、高比率のＮ末端が
ＰＥＧ化されるためこの分子種には加工面での利点があ
る。
【００２０】また本発明は、タンパク質またはその類似
体のＮ末端残基のα−アミノ基を選択的に活性化して、
そのＮ末端に水溶性ポリマー部分を選択的に結合させる
一つのタイプの還元的アルキル化反応に関する。この方
法によって、（ポリエチレングリコールが使用される場
合）タンパク質部分に直接結合されたポリエチレングリ
コール部分を有するＰＥＧ化タンパク質分子の製剤のみ
ならず、ポリマー／タンパク質結合分子の実質的に均質
な製剤が提供される。Ｇ−ＣＳＦと共働性インターフェ
ロンの場合についてこの方法を以下に説明するが、これ
らは本発明の追加の態様を提供する。
【００２１】
【発明の実態の形態】本発明はＮ末端化学修飾蛋白の実
質的に均質な調製物およびその製造方法に関する。
【００２２】１つの態様において、本発明はＮ末端化学
修飾Ｇ−ＣＳＦ組成物およびその製造方法に関する。
【００２３】本発明の方法（Ｎ末端修飾Ｇ−ＣＳＦの製
造方法および本発明の還元的アルキル化方法の両方）
は、モノポリマー／蛋白質結合体の実質的に均質な混合
物を与えるものである。本明細書で使用する「実質的に
均質な」という表現は、観察されるポリマー／蛋白質結
合体分子のみが１つのポリマー部分を有するものである
ことを指す。調製物は未反応の（即ちポリマー部分を欠
く）蛋白を含有してよい。ペプチド地図作成およびＮ末
端配列決定により確認されるとおり、後述する１つの実
施例は少なくとも９０％のモノポリマー／蛋白質結合体
および最大１０％の未反応蛋白質であるような調製物を
与えるものである。好ましくは、Ｎ末端モノＰＥＧ化物
質は、調製物の少なくとも９５％であり（後述する実施
例に示す）、そして最も好ましくは、Ｎ末端モノＰＥＧ
化物質は調製物の９９％以上である。モノポリマー／蛋
白質結合体は生物学的活性を有する。ここに提供される
本発明の「実質的に均質な」Ｎ末端ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ
調製物は、例えばロット毎の薬物動態を推測することが
臨床適用上容易であること等のような、均質な調製物の
利点を示すのに十分均質であるものである。
【００２４】ポリマー／蛋白質結合体分子の混合物を調
製することを選択してもよく、本発明により提供される
利点は、混合物中に含有されるモノポリマー／蛋白質結
合体の比率を選択してよい点である。即ち、所望によ
り、種々の数の連結ポリマー部分（即ち、ジ−、トリ
−、テトラ−等）を有する種々の蛋白の混合物を調製
し、本発明の方法で調製したモノポリマー／蛋白質結合
体物質と組合わせ、そして、所定の比率のモノポリマー
／蛋白質結合体を得てよい。
【００２５】前記した通り造血疾患の治療に用いる治療
用蛋白であるＧ−ＣＳＦを用いる実施例を以下に記載す
る。一般的に、本発明の実施に用いるＧ−ＣＳＦは哺乳
類動物から単離された形態であるか、または、化学合成
方法の生成物であるか、または、ゲノムまたはｃＤＮＡ
クローニングまたはＤＮＡ合成により得られる外来性Ｄ
ＮＡ配列の原核生物または真核生物の宿主発現による産
物であってよい。適当な原核生物宿主には、種々の細菌
（例えばＥ．ｃｏｌｉ）が包含され；適当な真核生物宿
主には酵母（例えばＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）および
哺乳類細胞（例えばチャイニーズハムスター卵巣細胞、
サル細胞）が包含される。使用する宿主に応じて、Ｇ−
ＣＳＦ発現産物は、哺乳類またはその他の真核生物炭水
化物によりグルコシル化されていてもよいし、または非
グリコシル化形態であってもよい。Ｇ−ＣＳＦ発現産物
はまた（−１位に）初期メチオニンアミノ酸残基を有し
てよい。とりわけＥ．ｃｏｌｉ由来の組み換えＧ−ＣＳ
Ｆが特に商業的な現実性が最も大きいという理由から好
ましいものの、本発明は上記した形態のＧ−ＣＳＦのい
ずれかおよび全ての使用を意図したものである。
【００２６】特定のＧ−ＣＳＦ類似体は、生物学的機能
性を有することが報告されており、これらはまた、例え
ば、１つ以上のポリエチレングリコール分子を付加する
ことにより、化学修飾してよい。Ｇ−ＣＳＦ類似体は米
国特許第４，８１０，６４３号に報告されている。生物
学的活性を有することが報告されているその他のＧ−Ｃ
ＳＦ類似体の具体例は、開示された各類似体の活性に関
する記載はないが、例えばＡＵ−Ａ−７６３８０／９１
号、ＥＰ ０ ４５９ ６３０号、ＥＰ ０２７２ ７
０３号、ＥＰ ０ ４７３ ２６８号およびＥＰ ０
３３５ ４２３号に記載されている。またＡＵ−Ａ−１
０９４８／９２、ＰＣＴ ＵＳ９４／００９１３号およ
びＥＰ ０ ２４３ １５３号も参照されたい。
【００２７】一般的に、本発明で有用なＧ−ＣＳＦおよ
びその類似体は、Ｎ末端αアミノ基を選択的に化学修飾
するための本明細書に記載した化学修飾方法を実施し、
得られた生成物が所望の生物学的特性を有するかどうか
を、本明細書に記載した生物活性検定法などにより調べ
ることにより確認してよい。当然ながら、非ヒト哺乳類
を治療する際に所望により、組み換えネズミ、ウシ、イ
ヌＧ−ＣＳＦ等のような組み換え非ヒトＧ−ＣＳＦを用
いてよい。例えばＰＣＴ ＷＯ ９１０５７９８号およ
びＰＣＴ ＷＯ ８９１０９３２号を参照されたい。
【００２８】即ち、本発明の別の態様は、Ｎ末端化学修
飾Ｇ−ＣＳＦ類似体組成物を包含する。前記したとお
り、Ｇ−ＣＳＦ類似体には、アミノ酸の付加、欠失およ
び／または置換を有するようなものが包含される（後記
する実施例１のＧ−ＣＳＦアミノ酸配列と比較され
る）。Ｎ末端ＰＥＧ化された場合に好中球の生産を選択
的に刺激するような機能を有すると予測されるようなＧ
−ＣＳＦ類似体は、Ｇ−ＣＳＦ受容体への結合のために
必要ではないＮ末端を有するものである。Ｈｉｌｌ等、
ＰＮＡＳ−ＵＳＡ ９０：５１６７−５１７１（１９９
３）およびＰＣＴＵＳ９４／００９１３参照。
【００２９】使用するポリマー分子は水溶性ポリマーか
ら選択してよい。（本明細書に記載する還元的アルキル
化のためには、ポリマーは単一の反応性アルデヒドを有
さなければならない。）選択されたポリマーは、それに
結合する蛋白が生理学的環境のような水性の環境で沈殿
しないように、水溶性でなければならない。還元的アル
キル化のためには、本発明の方法に関して記載したとお
り重合度を制御できるように、選択されたポリマーは単
一の反応性アルデヒドを有さなければならない。ポリマ
ーは分枝鎖または非分枝鎖であってよい。好ましくは、
最終製品調製物の治療上の使用のためには、ポリマーは
薬学的に許容されるものである。当業者は、ポリマー／
蛋白質結合体を治療に用いるのかどうかという判断、そ
して、そうであれば、所望の用量、循環時間、蛋白分解
に対する耐性およびその他の判断に基づき、所望の重合
体を選択できる。Ｇ−ＣＳＦについては、これらは本明
細書に記載した検定方法を用いて確認してよく、そし
て、当業者は、その他の治療用蛋白のための適切な検定
方法を選択しなければならない。水溶性ポリマーは例え
ば、上記したもの（発明の背景参照）、および、デキス
トランまたはポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）、ポリエチ
レングリコール、ポリプロピレングリコールホモポリマ
ー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシド共重合
体、ポリオキシエチル化ポリオールおよびポリビニルア
ルコールよりなる群から選択してよい。
【００３０】後述するような最適化のための条件につい
ては、ポリマーはどのような分子量のものでもよく、そ
して、分枝鎖または非分枝鎖であってよい。ポリエチレ
ングリコールについては、好ましい分子量は、約２ｋＤ
ａ〜約１００ｋＤａである（「約」という表現は、ポリ
エチレングリコールの調製においては、記載した分子量
よりも、一部の分子は高分子量、一部は低分子量になる
ことを指す）。後述する実施例１および２は、ＰＥＧ
６０００を使用しているが、これは精製が容易であり適
当なモデル系が得られることから選択したものである。
所望の治療特性（例えば所望の徐放性持続時間、作用、
場合により生物学的活性、取り扱いの容易さ、抗原性の
程度または非抗原性、および、治療用蛋白または類似体
に対するポリエチレングリコールのその他の知られた作
用）に応じて、その他の大きさのものも使用しうる。
【００３１】本発明の１つの特定の態様は、ポリエチレ
ングリコール部分およびＧ−ＣＳＦ部分を有するＮ末端
モノＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦである。本発明の組成物を得る
ためには、種々のポリエチレングリコール分子（分子
量、分枝鎖状態等による）、反応混合物中のＧ−ＣＳＦ
蛋白分子に対するポリエチレングリコール分子の比率、
実施するＰＥＧ化反応の種類、選択されたＮ末端ＰＥＧ
化Ｇ−ＣＳＦを得るための方法、および使用するＧ−Ｃ
ＳＦの種類を適宜選択してよい。更に、本発明の組成物
および方法は、医薬組成物の製造、治療および薬剤製造
の方法を包含する。
【００３２】蛋白分子に対するポリエチレングリコール
分子の比率は、反応混合物中のその濃度の変化に応じて
変化する。一般的に、最適な比率（未反応の蛋白または
ポリマーが過剰に存在しないという反応の効率の点で）
は選択されたポリエチレングリコールの分子量により決
定される。更に、本発明の１つの実施例では非特異的Ｐ
ＥＧ化およびＮ末端モノＰＥＧ化種の後の精製を行なう
ため、比率は使用できる反応性の基の数により異なる
（典型的にはαまたはεアミノ基）。本明細書に記載し
た１つの実施例では、一般的にモノＰＥＧ化物質を得る
ために蛋白：ＰＥＧ分子のかなり低い反応比を用いてい
る（蛋白分子当たり１．５ＰＥＧ分子）。
【００３３】Ｎ末端ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦを得るために
は、ＰＥＧ化の方法は前記したような種々の方法から選
択してよく、または、後述する実施例２に記載するとお
り本発明の還元的アルキル化を用いてよい。ポリエチレ
ングリコール部分と蛋白部分との間に連結基を用いない
方法は、Ｆｒａｎｃｉｓ等の蛋白性薬剤の安定性：分解
のｉｎ ｖｉｖｏ経路および蛋白安定化方法（Ｓｔａｂ
ｉｌｉｔｙ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｈａｒｍａｃｅ
ｕｔｉｃａｌｓ： ｉｎ ｖｉｖｏ ｐａｔｈｗａｙｓ
ｏｆ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｔｒａｔ
ｅｇｉｅｓ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｔａｂｉｌｉ
ｚａｔｉｏｎ）、（Ｅｄｓ。Ａｈｅｒｎ．、Ｔ ａｎｄ
Ｍａｎｎｎｉｎｇ、 Ｍ．Ｃ）Ｐｌｅｎｕｍ、Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ、１９９１）に記載されている。あるいは、
Ｄｅｌｇａｄｏ等の「トレシルクロライドを用いた活性
化による蛋白へのＰＥＧのカップリング、免疫親和性細
胞調製への応用（Ｃｏｕｐｌｉｎｇ ｏｆ ＰＥＧ ｔ
ｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＢｙＡｃｔｉｖａｔｉｏｎ Ｗｉ
ｔｈ Ｔｒｅｓｙｌ Ｃｈｌｏｒｉｄｅ，Ａｐｐｌｉ
ｃａｔｉｏｎｓＩｎ Ｉｍｍｕｎｏａｆｆｉｎｉｔｙ
Ｃｅｌｌ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）」、Ｆｉｓｈｅｒ
等編、水層系を用いた分離、細胞生物学およびバイオテ
クノロジーにおける応用、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、
Ｎ．Ｙ．Ｎ．Ｙ．、１９８９、ｐｐ．２１１−２１３は
トレシルクロライドを使用しており、このためポリエチ
レングリコール部分と蛋白部分との間には連結基が存在
しない。この方法は、トレシルクロライドの使用により
毒性副産物が形成されるため、治療用製品の製造のため
に使用するのは困難である。本発明の実施例の１つでは
カルボキシメチルメトキシポリエチレングリコールのＮ
−ヒドロキシスクシンイミジルエステルを使用してい
る。後に詳細に記載するとおり、別の実施例では本発明
の還元的アルキル化方法を用いている。
【００３４】Ｎ末端ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ調製物を得るた
めの方法（即ち必要に応じてこの部分を別のモノＰＥＧ
化部分から分離すること）は、ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ分子
の集団からＮ末端ＰＥＧ化物質を精製することにより行
なうことができる。例えば、下記に示す例ではＰＥＧ化
Ｇ−ＣＳＦをまずイオン交換クロマトグラフィーにより
分離してモノＰＥＧ化物質の電荷特性を有する物質を得
て（同じ見掛け上の電荷を有する別の多ＰＥＧ化物質が
存在する場合がある）、そして次に、モノＰＥＧ化物質
をサイズ排除クロマトグラフィーにより分離する。この
方法では、Ｎ末端モノＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦが別のモノＰ
ＥＧ化種並びに別の多ＰＥＧ化種から分離される。その
他の方法も報告されている。例えば、１９９０年５月３
日に公開されたＰＣＴ ＷＯ ９０／０４６０６号はＰ
ＥＧ含有水性２相系中でＰＥＧ／蛋白付加物を分配する
ことを包含するＰＥＧ−蛋白付加物の混合物の分画方法
を報告している。
【００３５】別の態様において、本発明は、Ｎ末端化学
修飾蛋白（または類似体）を選択的に得るための方法を
提供する。特定の蛋白における誘導体形成のために使用
できる種々のタイプの第一アミノ基の反応性の差（リジ
ンｖｓＮ末端）を利用した還元的アルキル化による蛋白
修飾方法を以下に記載する。適切な反応条件のもとでカ
ルボニル基含有ポリマーを用いてＮ末端において蛋白の
実質的に選択的な誘導体形成を行なうことができる。反
応は蛋白のリジン残基のεアミノ基とＮ末端残基のαア
ミノ基とのｐＫａの差を利用することができるようなｐ
Ｈで行なう。このような選択的誘導体形成により、水溶
性ポリマーの蛋白質への結合が制御でき、ポリマーとの
結合体形成は蛋白のＮ末端で主に起り、リジン側鎖アミ
ノ基のようなその他の反応性の基の修飾はほとんど起ら
ない。
【００３６】重要かつ意外な点は、本発明はその他の化
学修飾方法を用いる場合に必要とされるような更に進ん
だ精製を行なうことなく、モノポリマー／蛋白結合体分
子の実質的に均質な調製物を製造するための方法を提供
する。また、アミン結合を有する生成物は、意外にも、
アミド結合を用いて調製した生成物よりも安定であり、
これは後に記載する凝集試験で明らかにされる。特に、
ポリエチレングリコールを用いる場合は、本発明はま
た、抗原性を有する可能性のあるような結合基を有さ
ず、そして、蛋白部分に直接カップリングするポリエチ
レングリコール部分を有するＮ末端ＰＥＧ化蛋白を毒性
副生成物を生じることなく、提供する。
【００３７】反応は以下に示すようなダイアグラムで説
明できる（還元剤の例としてシアノホウ水素化ナトリウ
ムを示した）。
【００３８】
【化１】
【００３９】即ち本発明の１つの態様は、（ａ）アミノ
基１つ以上を有する蛋白部分を、水溶性ポリマー部分
と、還元的アルキル化条件下、上記蛋白部分のアミノ末
端でαアミノ基を選択的に活性化させるのに適するｐＨ
で反応させることにより、上記水溶性ポリマーを上記α
アミノ基に選択的に結合すること；および（ｂ）反応生
成物を得ること、を包含するポリマー／蛋白結合体の製
造方法である。場合により、そして治療用製品のために
は好ましくは反応生成物を未反応部分から分離する。
【００４０】本発明の別の態様は、このような還元的ア
ルキル化により、アミノ末端にαアミノ基を有するいか
なる蛋白にも重合体を選択的に結合することが可能であ
り、そしてモノポリマー／蛋白結合体の実質的に均質な
調製物が得られる点である。「モノポリマー／蛋白結合
体」という用語は、本明細書においては、蛋白部分に結
合した単一のポリマー部分を有する組成物を指す（更
に、本明細書に記載する蛋白類似体を用いた結合体も包
含される）。モノポリマー／蛋白結合体はＮ末端に位置
するポリマー部分を有するが、リジンの場合のようなア
ミノ側鎖基には有さない。調製物は、好ましくは８０％
を超えるモノポリマー／蛋白結合体、更に好ましくは９
５％を超えるモノポリマー／蛋白結合体である。
【００４１】モノポリマー／蛋白結合体分子の実質的に
均質な集団を得るためには、反応条件は、所望の蛋白の
Ｎ末端への水溶性ポリマー部分の選択的結合を可能にす
るようなものである。このような反応条件は一般的に、
リジンアミノ基とＮ末端α−アミノ基におけるｐＫａの
差を与える（ｐＫはアミノ基の５０％がプロトン化さ
れ、５０％がされないようなｐＨである）。一般的に、
Ｎ末端のα−アミノ基の修飾を最適なものとするには、
異なる蛋白に対し、異なるｐＨを用いることができる。
【００４２】ｐＨは使用する蛋白に対するポリマーの比
率にも影響を及ぼす。一般的に、ｐＨがｐＫより低い場
合は、蛋白に対してより大過剰のポリマーが必要である
（即ち、Ｎ末端α−アミノ基の反応性が低いほど、最適
な条件を達成するためにはより多くのポリマーが必要に
なる）。ｐＨがｐＫより高い場合は、ポリマー：蛋白の
比はそれほど大きくなる必要は無い（即ち、より多くの
反応性の基が使用できるため、必要なポリマー分子数は
少なくなる）。
【００４３】もう１つの重要な条件はポリマーの分子量
である。一般的に、ポリマーの分子量が高いほど、蛋白
に結合するポリマー分子の数は少なくなる。同様に、こ
れらのパラメーターを最適にする際には、ポリマーの分
枝鎖状態を考慮しなければならない。一般的に、分子量
が高いほど（または分枝鎖が多いほど）、ポリマー：蛋
白の比は大きくなる。
【００４４】本発明の還元的アルキル化のためには、還
元剤は水溶液中で安定であることが必要であり、好まし
くは、還元的アルキル化の最初の工程で形成されるシッ
フ塩基のみを還元することができるものである。好まし
い還元剤は、ナトリウムボロハイドライド、ナトリウム
シアノボロハイドライド、ホウ酸ジメチルアミン、ホウ
酸トリメチルアミンおよびホウ酸ピリジンよりなる群か
ら選択される。後述する実施例ではナトリウムシアノボ
ロハイドライドを用いた。
【００４５】水溶性ポリマーは上記した種類のものであ
ってよく、そして、蛋白にカップリングするための単一
の反応性アルデヒドを有するものでなければならない。
ポリエチレングリコールについては、Ｇ−ＣＳＦへのカ
ップリングにはＰＥＧ ６０００、コンセンサスインタ
ーフェロンに対してはＰＥＧ １２０００の使用を以下
に記載している。ただし、Ｇ−ＣＳＦの場合は、ＰＥＧ
１２０００、２００００および２５０００も本発明の
方法で良好に使用される。ポリエチレングリコールプロ
ピオンアルデヒド（例えば米国特許第５，２５２，７１
４号参照）は水中の安定性の点で好都合である。
【００４６】前記したとおり、本発明の方法はＮ末端α
−アミノ基を有するいかなる蛋白またはその類似体にも
広範に適用できる。例えば、細菌内で発現された外来性
ＤＮＡ配列の産物であるような蛋白は、細菌による発現
の結果として、α−アミノ基を有するＮ末端メチオニル
残基を有している。前記したとおり、ペプチド、並びに
ペプチド類似物およびその他の修飾蛋白も包含される。
上記したＧ−ＣＳＦ類似体のような蛋白類似体、および
非天然コンセンサスインターフェロンも本発明の方法に
適している。
【００４７】即ち、本発明のＮ末端化学修飾Ｇ−ＣＳＦ
のためには、本明細書に記載したいずれのＧ−ＣＳＦま
たは類似体も使用できる（例えば上記したもの）。後述
する実施例では、１７４アミノ酸および余分にＮ末端メ
チオニル残基を有する細菌生産組み換えＧ−ＣＳＦを用
いる。本明細書に記載するとおり、化学修飾は本明細書
に記載するいずれの水溶性ポリマーを用いて行ってもよ
く、実施例ではポリエチレングリコールの使用を記載し
た。
【００４８】コンセンサスインターフェロンは本発明の
実施例で使用されるもう１つの蛋白である。Ｎ末端モノ
ＰＥＧ化のための本発明の還元的アルキル化方法を用い
た化学修飾コンセンサスインターフェロンの調製を以下
に記載する。即ち、本発明の別の態様は、これらの調製
に関する。本発明においては、「コンセンサスインター
フェロン」または「ＩＦＮ−ｃｏｎ」と記載するコンセ
ンサスヒト白血球インターフェロンは、非天然のポリペ
プチドであり、全ての天然のヒト白血球インターフェロ
ンサブタイプ配列に共通のアミノ酸残基を主に含んでお
り、全てのサブタイプに共通なアミノ酸を含まない１つ
以上の位置に、その位置に主に生じるアミノ酸であって
且つ、少なくとも１つの天然のサブタイプの該位置に存
在しないアミノ酸残基を有することがないアミノ酸を含
む、ものである。ＩＦＮ−ｃｏｎには、ＩＦＮ−ｃｏｎ
1 ，ＩＦＮ−ｃｏｎ2 およびＩＦＮ−ｃｏｎ3 という名
称のアミノ酸配列が包含され、これらは、同一の譲受人
の米国特許第４，６９５，６２３号および４，８９７，
４７１号に開示されており、これら明細書の記載内容全
体は参考のために本明細書に組み込まれる。（米国特許
第４，８９７，４７１号および４，６９５，６２３号は
本明細書で使用していない名称「α」を使用してい
る。）ＩＦＮ−ｃｏｎをコードするＤＮＡ配列は、上記
した特許に記載された通り、あるいは、その他の標準的
な方法で合成してよい。ＩＦＮ−ｃｏｎポリペプチドは
好ましくは、細菌宿主、特にＥ．ｃｏｌｉにトランスフ
ォームまたはトランスフェクトされた合成ＤＮＡ配列の
発現産物である。即ち、ＩＦＮ−ｃｏｎは組み換えＩＦ
Ｎ−ｃｏｎである。ＩＦＮ−ｃｏｎは好ましくはＥ．ｃ
ｏｌｉ中で生産され、当該分野で良く知られ、そして、
一般的にはＩＦＮ−ｃｏｎ１についてＫｌｅｉｎ等の
Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ．４５４：２０５−２１５（１
９８８）に記載された方法により精製される。精製され
たＩＦＮ−ｃｏｎはイソフォームの混合物を含有し、例
えば精製ＩＦＮ−ｃｏｎ１ はメチオニルＩＦＮ−ｃｏ
ｎ1 ，脱メチオニルＩＦＮ−ｃｏｎ1 およびブロックさ
れたＮ末端を有する脱メチオニルＩＦＮ−ｃｏｎ1 の混
合物を含有する（Ｋｌｅｉｎ等、Ａｒｃ．Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２７６：５３１−５３７（１９９
０））。あるいは、ＩＦＮ−ｃｏｎは特定の単離された
イソフォームを含有する。ＩＦＮ−ｃｏｎのイソフォー
ムは当業者の知る等電点電気泳動のような方法で相互に
分離される。
【００４９】即ち、本発明のもう１つの態様は、コンセ
ンサスインターフェロン部分がＩＦＮ−ｃｏｎ1、ＩＦＮ
−ｃｏｎ2 およびＩＦＮ−ｃｏｎ3 よりなる群から選択
される化学修飾コンセンサスインターフェロンである。
化学修飾は、ＰＥＧのような本明細書に記載する水溶性
ポリマーを用いて行ない、本発明の還元的アルキル化方
法を用いて選択的Ｎ末端化学修飾を行なってよい。本明
細書に記載する実施例３は、ポリエチレングリコール部
分（ＰＥＧ １２０００）にＮ末端で結合されたＩＦＮ
ｃｏｎ1 部分を有する化学修飾ＩＦＮ ｃｏｎ1 を説明
するものである。
【００５０】もう１つの態様において、本発明の方法
は、ポリエチレングリコール部分が蛋白部分に直接結合
し、別の連結基が存在せず、毒性副生成物が存在しない
ようなＰＥＧ化蛋白を提供する。実施例は本明細書に記
載するとおりＧ−ＣＳＦおよびコンセンサスインターフ
ェロンを含んでいる。ポリエチレングリコール部分がＧ
−ＣＳＦ蛋白部分に直接結合しているようなＰＥＧ化Ｇ
−ＣＳＦ蛋白分子の集団（Ｎ末端ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ分
子の集団である必要はない）を得るためには、酸性ｐＨ
を用いるか、又は用いることなく、上記還元的アルキル
化を実施してよい。
【００５１】本発明の更に別の態様においては、上記物
質の医薬組成物が提供される。このような医薬組成物は
注射による投与、または経口投与、肺投与、経鼻投与ま
たはその他の投与形態であってよい。一般的に、本発明
が意図するものは、本発明のモノポリマー／蛋白結合体
生成物の有効量を薬学的に許容される希釈剤、保存料、
可溶化剤、乳化剤、補助剤、および／または担体と共に
含有する医薬組成物である。このような組成物は、種々
の緩衝物質成分（例えばトリス−ＨＣｌ、酢酸、リン
酸）、ｐＨおよびイオン強度の希釈剤；洗剤および可溶
化剤（例えばＴｗｅｅｎ ８０、ポリソルベート ８
０）、抗酸化剤（例えばアスコルビン酸、メタ重亜硫酸
ナトリウム）、保存料（例えばチメルソール、ベンジル
アルコール）および増量剤（例えば乳糖、マンニトー
ル）のような添加物；ポリ酢酸、ポリグリコール酸等の
ような重合体化合物の粒状調製物への、または、リポソ
ームへの活性物質の配合を含む。このような組成物は、
本発明のＮ末端化学修飾蛋白の物理的性状、安定性、ｉ
ｎ ｖｉｖｏ徐放性、およびｉｎ ｖｉｖｏクリアラン
ス速度に影響する。例えば、ＲｅｍｉｎｇｔｏｎのＰｈ
ａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅ、１８版（１
９９０、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｅ
ａｓｔｏｎ、ＰＡ １８０４２）の１４３５−１７１２
ページに記載されており、その内容は参考のために本明
細書に組み込まれる。
【００５２】本発明の更に別の態様において、治療方法
および医薬の製造方法が提供される。本発明のポリマー
／Ｇ−ＣＳＦ結合体（または天然のＧ−ＣＳＦの造血生
物作用を有する類似体）の投与により軽減または調節さ
れる症状は、典型的には、低下した造血または免疫機
能、特に低好中球数により特徴づけられる症状である。
このような症状は、化学療法または放射線療法のような
他の目的のための治療の過程として誘発される。このよ
うな症状は、細菌、ウィルス、カビまたはその他の感染
性疾患のような感染症に起因する場合がある。例えば、
敗血症は細菌感染から生じる。あるいは、このような症
状は、重度の慢性好中球減少症または白血病のように、
遺伝的または環境的に誘発される。成人病分野では患者
は低好中球数または低好中球運動性を有するため、年齢
も重要な因子である。このような症状の一部は、Ｆｉｌ
ｇｒａｓｔｉｍ（ｒ−ｍｅｔ Ｈｕ Ｇ−ＣＳＦ）、Ｃ
ｌｉｎｉｃａｌ Ｐｒａｃｔｉｃｅ、Ｍｏｒｓｔｙｎ、
Ｇ．およびＴ．Ｍ．Ｄｅｘｔｅｒ、ｅｄｓ．、Ｍａｒｃ
ｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ、Ｉｎｃ．、Ｎ．Ｙ．、Ｎ．Ｙ．
（１９９３）、３５１頁に記載されている。本発明のポ
リマー／Ｇ−ＣＳＦ結合体の投与により軽減または調節
されるようなその他のあまり研究されていない症状に
は、Ｇ−ＣＳＦがプラスミノーゲン活性化物質の産生を
誘発することから、血流中の脂質（またはコレステロー
ル）の低下、および特定の心臓血管症状が包含される。
これらの分野におけるＧ−ＣＳＦ（または類似体）の作
用様式は、現時点では十分解明されていない。ポリエチ
レングリコールのような水溶性ポリマーを付加すること
は、生物活性の持続により治療過程当たりのＧ−ＣＳＦ
注射の回数が少なくできるため、実際の患者に利益をも
たらすものである。
【００５３】一般的に、本発明のポリマー／コンセンサ
スインターフェロンの投与により軽減または調節される
ような症状は、コンセンサスインターフェロンが適用可
能な症状であり、細胞増殖疾患、ウィルス感染、および
多発性硬化症のような自己免疫疾患が包含される。Ｍｃ
Ｍａｕｓ Ｂａｌｍｅｒ、ＤＩＣＰ、Ｔｈｅ Ａｎｎａ
ｌｓ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｙ ２４：
７６１−７６７（１９９０）（ガン治療における生物応
答調節剤の臨床使用：概説、第Ｉ部、インターフェロ
ン）参照。コンセンサスインターフェロンを用いた細胞
増殖疾患の治療のための方法および組成物は、１９９２
年４月３０日公開のＰＣＴ ＷＯ ９２／０６７０７号
に記載されており、その内容は参考のために本明細書に
組み込まれる。例えば、肝炎（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ）は
本発明のＰＥＧ化コンセンサスインターフェロン分子を
用いて治療可能である。後述する実施例では、ｉｎ ｖ
ｉｔｒｏで化学修飾されたコンセンサスインターフェロ
ンは非化学修飾コンセンサスインターフェロンの生物活
性の２０％を有している。
【００５４】上記した分子の全てについて、更に研究を
実施するに従って、種々の患者の種々の症状の治療のた
めの適切な用量に関する情報が得られ、そして、当業者
は、治療内容、投与対象の年齢および全身状態を考慮し
ながら、適切な用量を確認することが可能であろう。一
般的に、注射または注入のためには、用量は０．０１μ
ｇ／ｋｇ体重（化学修飾しない蛋白のみの質量を計算）
〜１００μｇ／ｋｇ（同じ計算に基づく）である。
【００５５】
【実施例】以下に記載する実施例は、上記した種々の態
様を説明するものである。実施例１では、Ｎ末端ＰＥＧ
化Ｇ−ＣＳＦの利点を（Ｇ−ＣＳＦ ｍｅｔ＋１７４ア
ミノ酸型の）リジン−３５またはリジン−４１でモノＰ
ＥＧ化されたＧ−ＣＳＦと比較しながら説明する。実施
例２はＮ末端ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦにおける本発明の還元
的アルキル化を説明するものである。この方法はＮ末端
ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦの実質的に均質な調製物を与える。
実施例３はＮ末端ＰＥＧ化コンセンサスインターフェロ
ンの本発明の還元的アルキル化を説明するものである。
【００５６】実施例１ Ａ．組換えヒトｍｅｔ−Ｇ−ＣＳＦの調製 組換えヒトｍｅｔ−Ｇ−ＣＳＦ（本明細書では“ｒｈＧ
−ＣＳＦ”または“ｒ−ｍｅｔ−ｈｕ−Ｇ−ＣＳＦ”と
呼ぶ）は、上述のようにＳｏｕｚａ特許、米国特許第
４，８１０，６４３号にある方法に従って調製した。こ
の特許は参考として本明細書に組み入れる。使用したｒ
ｈＧ−ＣＳＦは、以下に示す（ＤＮＡ配列によってコー
ドされる）アミノ酸配列をもつＥ．ｃｏｌｉ由来の組換
え発現産物であった（配列番号１および２）：
【００５７】
【化２】
【００５８】（これはまた対照動物に使用した非Ｐｅｇ
化組成物でもあった。）或いは以下のＰｅｇ化法には、
市販のNeupogen（登録商標）を使用してもよい（このパ
ッケージに入っているものは、本明細書に参考として組
み入れる）。
【００５９】Ｂ．Ｐｅｇ化Ｇ−ＣＳＦの調製 １０ｍｇ／ｍｌの上記ｒｈ−Ｇ−ＣＳＦ溶液を１００ｍ
Ｍ Ｂｉｃｉｎｅ ｐＨ８．０に溶かした溶液を、平均
分子量が６０００ダルトンの固体のＳＣＭ−ＭＰＥＧ
（カルボキシメチルメトキシポリエチレングリコールの
Ｎ−ヒドロキシスクシニミジルエステル）（Ｕｎｉｏｎ
Ｃａｒｂｉｄｅ）に添加した。これによってｒｈ−Ｇ
−ＣＳＦよりもＳＣＭ−ＭＰＥＧが１．５モル過剰にな
った。１時間軽く攪拌した後、滅菌水で混合液を２ｍｇ
／ｍｌに希釈し、希釈したＨＣｌによってｐＨを４．０
に調整した。反応は室温で起こさせた。この段階で反応
混合物は主に３形態のモノＰＥＧ化ｒｈ−Ｇ−ＣＳＦか
ら構成されており、その他、ジＰＥＧ化ｒｈ−Ｇ−ＣＳ
Ｆ、未修飾のｒｈ−Ｇ−ＣＳＦ、および反応の副産物
（Ｎ−ヒドロキシスクシニミド）が含まれていた。
【００６０】Ｃ．Ｎ末端ＰＥＧ化ｒＨ−Ｇ−ＣＳＦの調
製 ３形態のモノＰＥＧ化ｒｈ−Ｇ−ＣＳＦは、イオン交換
クロマトグラフィによって別々に分離した。反応混合液
を、緩衝液Ａ（２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．０）
で平衡化しているＰｈａｒｍａｃｉａ Ｓセファロース
ＦＦカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＸＫ５０／３０リザ
ーバ、ベッド容量４４０ｍｌ）に添加した（１ｍｇ蛋白
質／ｍｌ樹脂）。カラムを３カラム容量の緩衝液Ａで洗
浄した。蛋白質は０〜２３％の直線勾配の緩衝液Ｂ（２
０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．０、１Ｍ ＮａＣｌ）
を１５カラム容量用いて溶出した。次に１カラム容量の
１００％緩衝液Ｂでカラムを洗浄し、３カラム容量の緩
衝液Ａで再度平衡化させた。操作全体の流速は８ｍｌ／
分に維持した。溶離剤を２８０ｎｍでモニターし、５ｍ
ｌの分画を収集した。モノＰＥＧ化した個々の分子種を
含む分画は、図１Ａに従ってプールした。このようにプ
ールした液をＹＭ１０ ７６ｍｍメンブランを使った３
５０ｍＬ Ａｍｉｃｏｎ攪拌セルを使って濃縮した。
【００６１】モノＰＥＧ化分子種からジＰＥＧ化分子種
を分離するため、イオン交換クロマトグラフィで得たプ
ールした分画をサイズ排除クロマトグラフィにかけた。
一般に、５〜１０ｍｇが入った２〜５ｍｌの溶液を、２
０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ４．０で平衡化した１２
０ｍｌのＰｈａｒｍａｃｉａ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５
ＨＲ １６／６０カラムに添加した。カラムを１．５
ｍｌ／分で１００分間操作し、２ｍｌの分画を収集し
た。溶離剤の蛋白質含有量を２８０ｎｍでモニターし
た。分離されたピークの分画をプールして分析にかけ
た。以下の表は各ピークの収量比率を比較したものであ
る。
【００６２】
【表１】
【００６３】このような条件下では、位置１７および２
４にあるリジンは多分有意にＰＥＧ化されなかったと思
われる。
【００６４】Ｄ．特性化 各サンプルの特性を知るために５種類の分析を実施し
た：（１）ＳＤＳ−Ｐａｇｅ（図１Ｂ）、（２）サイズ
排除クロマトグラフィＨＰＬＣ（“ＳＥＣ ＨＰＬ
Ｃ”）（図２）、（３）ペプチドマッピング分析（図３
Ａ、３Ｂ、３Ｃ）、（４）ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｇ−ＣＳ
Ｆバイオアッセイ（図４）、および（５）ハムスターを
用いたｉｎ ｖｉｖｏ試験（図５Ａおよび５Ｂ）。 Ｎ
末端にモノＰＥＧ化したＧ−ＣＳＦの各サンプルの組成
に関する分析結果は、９５％以上がＮ末端にＰＥＧ化し
ており、残りは多分ＰＥＧ化していない物質だろうとい
うことを実証するものである（サンプルの残りはアッセ
イの検出限界より低かったが）。３種類のモノＰＥＧ化
物質（Ｎ末端、リジン３５でのＰＥＧ化、リジン４１で
のＰＥＧ化）の各々について、モノＰＥＧ化の割合を調
べたところ、Ｎ末端およびリジン４１は９７％以上がモ
ノＰＥＧ化されており、リジン３５でのＰＥＧ化物質は
これよりいくらか低かった。これは多分、アッセイ条件
において分子が不安定であることによると思われる。以
上をまとめると次の結果が得られた：
【００６５】
【表２】
【００６６】＊シーケンシング中に蛋白質のＮ末端から
ポリエチレングリコール分子が人為的に分離される可能
性があるため、Ｎ末端シーケンシングは、下記に説明す
るとおり、ここでは定量的とはいえない。
【００６７】
【表３】
【００６８】＊ＲＩ／ＵＶは屈折率／紫外線吸光度の比
のことを言い、蛋白質１分子当りのポリエチレングリコ
ール分子の数を推定するのに用いられる。これはＳＥＣ
ＨＰＬＣデータからポリエチレングリコールの屈折率
と蛋白質の紫外線吸光度を用いて計算される。
【００６９】＊＊この分子種は使用したアッセイ条件下
では不安定であることに注意。
【００７０】方 法 １．ＳＤＳ−ＰＡＧＥ。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは非還元４〜
２０％ ＩＳＳＤａｉｉｃｈｉ Ｐｕｒｅ Ｃｈｅｍｉ
ｃａｌｓ（東京）のミニゲルにおいて、コーマシーブリ
リアントブルーＲ−２５０染色剤を用いて実施された。
ゲルはＩｍａｇｅ Ｑｕａｎｔを用いた動的分子濃度計
によってスキャンした。
【００７１】結果：結果は図１Ｂに示してある。レーン
番号１（左から数えて）には蛋白質の分子量標準（Ｎｏ
ｖｅｘ Ｍａｒｋ １２分子量標準）が入っていた。レ
ーン２には３μｇのｒｈ−Ｇ−ＣＳＦ標準が含まれてい
る。レーン３には１０μｇのＳＣＭ−ＰＥＧ−ＧＣＳＦ
反応混合液が入っている。レーン４には１０μｇのＮ末
端モノＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦが含まれている。レーン５に
はＮ末端のメチオニンからの３５番目の残基に見出され
たリジンにＰＥＧ化したモノＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦが１０
μｇ入っている。レーン６にはＮ末端のメチオニンから
４１番目の残基に見出されたリジンにＰＥＧ化したモノ
ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦが１０μｇ含まれている。図から分
かるように、Ｎ末端にモノＰＥＧ化した物質が含まれて
いるレーン３はバンドが一つである。
【００７２】２．サイズ排除クロマトグラフィー高圧液
体クロマトグラフィー。ＳＥＣ−ＨＰＬＣはＷａｔｅｒ
ｓのＨＰＬＣシステム、Ｂｉｏｓｅｐ ＳＥＣ ３００
０カラム、１００ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ６．９
を用いて、１ｍｌ／分の流速で２０分間実施した。シグ
ナルは２８０ｎｍでモニターした。
【００７３】結果：図２から分かるように、Ｎ末端にモ
ノＰＥＧ化したｒｈ−Ｇ−ＣＳＦを含むライン“Ｃ”は
ピークが１個であり、ライン“Ｄ”（リジン３５にモノ
ＰＥＧ化した物質）および“Ｅ”（リジン４１にモノＰ
ＥＧ化した物質）もやはりピークが１個であった。これ
はモノＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦから分離した分画は純度が実
質的に高いことを示している。
【００７４】３．ペプチドマッピング。次の方法を用い
た。“モノ−ＰＥＧ−１”、“モノ−ＰＥＧ−２”、
“モノ−ＰＥＧ−３”と呼ばれる３つのサンプルを分析
した。 （ａ）還元アルキル化。モノ−ＰＥＧ Ｇ−ＣＳＦの５
００μｇのアリコートを高速真空乾燥し、６Ｍの塩酸グ
アニジンと１ｍＭのＥＤＴＡを含む０．３ＭのＴｒｉｓ
−ＨＣｌ（ｐＨ８．４）で濃度１ｍｇ／９５０μｌに再
構成した。次にサンプルにヨード酢酸を加えてＳ−カル
ボキシメチル化し、３７℃で２０分間インキュベートし
た。次にＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５ Ｑｕｉｃｋ Ｓ
ｐｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ カラムを用いてサンプルを脱
塩し、緩衝液を交換した。脱塩しバッファ交換した後、
緩衝液を追加することによってサンプルの濃度を０．５
ｍｇ／ｍｌに調整した。（ｂ）エンドプロテイナーゼ
ＳＶ８消化。サンプルはＳＶ８を用いて２５℃で２６時
間消化した（酵素と基質の比は１：２５）。（ｃ）ＨＰ
ＬＣ ペプチドマッピング。蛋白質消化物をＶｙｄａｃ
Ｃ４カラム（４．６×２００ｍｍ、粒子サイズ５μ、
孔径３００オングストローム）に注入し、０．１％ＴＦ
Ａ中アセトニトリルの直線勾配を用いて、ペプチドをＨ
ＰＬＣによってマッピングした。ペプチドを手で収集
し、配列分析のために高速真空乾燥した。 結果：参照標準と比較して、（ｉ）（図３Ａ）“モノ−
ＰＥＧ−１”（Ｎ末端モノＰＥＧ化物質）の場合、ピー
クは５７．３分で消え、７７．５分で新しいピークが現
れた；（ｉｉ）（図３Ｂ）“モノ−ＰＥＧ−２”（リジ
ン３５にＰＥＧ化した物質）の場合、リテンションタイ
ム３０．３分のペプチドのピーク高さが低下し、６６．
３分に新しいピークが溶出された；（ｉｉｉ）（図３
Ｃ）“モノ−ＰＥＧ−３”（リジン４１にＰＥＧ化した
物質）の場合、リテンションタイム３０．３分のピーク
はなく、６６．４分に新しいピークが現れた。これらの
ペプチドはサンプルマップでの唯一の有意な差であっ
た。わずかな消化の差のために、８６．１分のペプチド
の一方の側にいくらか、小さい不完全な切断があった。
（ｄ）Ｎ末端の配列分析。上記のマップに現れた“新し
い”ペプチドの各々を、同定のためＮ末端を配列分析し
た。乾燥したペプチドを０．１％ ＴＦＡで再構成し、
ＡＢＩ蛋白質シーケンサで配列決定した。“モノ−ＰＥ
Ｇ−１”（Ｎ末端にＰＥＧ化した物質）の場合、“新し
い”ピーク（７７．５分）の６０％が１０サイクルで配
列決定された。初期収率は５％未満であったが、これは
Ｎ末端のメチオニル残基がポリエチレングリコール分子
によってブロックされていることを示している。この最
初のペプチドは初期収率が０％となるはずであったが、
収率が５％未満であったのは、配列分析中にＮ末端のメ
チオニルからポリエチレングリコールが脱着した結果か
もしれない。検出された配列は、Ｎ末端ペプチドのもの
でＭ−Ｔ−Ｐ−Ｌ−Ｇ−Ｐ−Ａ−Ｓ−Ｓであった。“モ
ノ−ＰＥＧ−２”（リジン３５にＰＥＧ化した物質）の
場合、総ピーク体積の８０％が６６．３分のピークに集
まり、９サイクルで配列決定された。リジン３５の回収
率は有意に低かったが、これは位置３５でのＰＥＧ化を
示している。リジン４１の回収率はその他の残基と同じ
くらいで、この位置では修飾が行われていないことを示
唆していた。３０．３分のペプチドは、標準参照マップ
の対応するピークと比べて、ピーク高さが低かった。３
０．３分のペプチドは、対応するペプチドのピーク面積
の５７．５％しかなかった。この分子種で検出された配
列はＫ−Ｌ−Ｃ−Ａ−Ｔ−Ｙ−Ｋ−Ｌであった。“モノ
−ＰＥＧ−３”（リジン４１にＰＥＧ化した物質）の場
合、６６．４分に溶出したペプチドについて収集された
総ピーク体積の８０％が９サイクルで配列決定された。
検出された配列はＫ−Ｌ−Ｃ−Ａ−Ｔ−Ｙ−Ｋ−Ｌであ
り、リジン残基３５および４１を含んでいた。リジン３
５の回収率は他の残基の回収率と同じであった。リジン
４１の回収率は有意に低く、これは位置４１でのＰＥＧ
化を示していた。結果：“モノ−ＰＥＧ−１”はＮ末端
にモノＰＥＧ化された物質である；“モノ−ＰＥＧ−
２”はリジン３５に一部ＰＥＧ化された物質である；ま
た“モノ−ＰＥＧ−３”はリジン４１にＰＥＧ化された
物質である。参照標準（非ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ）とＧＣ
ＳＦモノＰＥＧ化１、２、３のペプチドマップを比較す
ることによって、“モノ−ＰＥＧ−２”（リジン３５）
と“モノ−ＰＥＧ−３”（リジン４１）のマップは、Ｎ
末端ペプチドよりもピーク高さがわずかに低いことが分
かった。これはリジン３５およびリジン４１物質に少量
のＮ末端ＰＥＧ化物質が含まれていること、またはＮ末
端のメチオニンのＰＥＧ化率が低いことを示唆してい
る。
【００７５】４．Ｉｎ ｖｉｔｒｏ活性。物質は活性で
あった。図４はｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイの結果を表し
ている。記載の通り、Ｎ末端モノＰＥＧ化された物質の
活性は、未修飾ｒｈＧ−ＣＳＦの活性の６８％であっ
た。
【００７６】方法：Ｇ−ＣＳＦのｉｎ ｖｉｔｒｏバイ
オアッセイはマウス３２Ｄ細胞のＧ−ＣＳＦ依存クロー
ンを利用する細胞分裂アッセイである。細胞を５％のＦ
ＢＳおよび２０ｎｇ／ｍｌのｒｈＧ−ＣＳＦが入ったＩ
ｓｃｏｖｅｓ培地に入れて維持した。サンプルを加える
前に、ｒｈＧ−ＣＳＦを含まない成長培地で細胞を２回
洗浄した。４８から０．５ｎｇ／ｍｌ（４８００〜５０
ＩＵ／ｍｌに相当）までの長い１２ポイントのｒｈＧ−
ＣＳＦ標準曲線を作製した。標準曲線の直線部分（１０
００〜３０００ＩＵ／ｍｌ）に入ると予想される４つの
希釈液を各サンプルについて調製し、それぞれ３回ずつ
ランした。これらの物質の見かけのｉｎｖｉｔｒｏ活性
は低いため、ＰＥＧ化したｒｈＧ−ＣＳＦサンプルを約
４〜１０倍に希釈した。各希釈度のサンプルまたは標準
４０μｌを、１０，０００細胞／ウェルを含む９６ウェ
ル・マイクロタイタープレートの適当なウェルに添加す
る。３７℃、５．５％ＣＯ2 という条件下に４８時間置
いた後、各ウェルに０．５μｍＣｉのメチル− 3Ｈ−チ
ミジンを追加した。１８時間後、プレートを収穫し、カ
ウントした。用量応答曲線（ｒｈＧ−ＣＳＦ濃度の対数
（ｌｏｇ）ｖｓ ＣＰＭ−バックグラウンド）を作成
し、標準曲線の直線部分に入るポイントについて、直線
回帰分析を行った。未知のテストサンプルの濃度は、得
た直線式を使って求め、希釈率について補正した。
【００７７】結果：結果は図４に示した。記載の通り、
３種類のモノＰＥＧ化種のうちＮ末端にモノＰＥＧ化し
たＧ−ＣＳＦのｉｎ ｖｉｔｒｏ生物学的活性が最高で
ある。
【００７８】５．Ｉｎ ｖｉｖｏ活性。Ｉｎ ｖｉｖｏ
試験によってＮ末端にＰＥＧ化した物質の活性を確認し
た。Ｉｎ ｖｉｖｏ試験は０．１ｍｇ／ｋｇのサンプル
を１回皮下注射によって雄のゴールデンハムスターに投
与することによって行った。１群、１時点当り４匹の動
物から末梢血液を採取した。血清検体は採血当日に完全
血球算定にかけた。平均白血球数を計算した。図５Ａお
よび５Ｂから分かるように、各物質による反応は、０．
１ｍｇ／ｋｇの単回皮下注射の翌日後に最大に達してい
る。２つのモノＰＥＧ化物質（Ｎ末端とリジン３５）は
反応時間が長く、一方リジン４１で蛋白質をＰＥＧ化し
た物質の反応は未修飾ｒｈＧ−ＣＳＦのｉｎ ｖｉｖｏ
活性より高くなかった（実際低い、図５Ｂ）。これらの
結果は、ポリエチレングリコール分子を１個結合させる
ことによって、蛋白質の治療プロフィールが劇的に変化
する可能性があり、蛋白質をＰＥＧ化することの利点は
修飾の部位に依存する可能性があることを示唆してい
る。（単回皮下注射後の曲線下の正味平均ＷＢＣ面積
（ＣＲＣ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａ
ｌ Ｔａｂｌｅｓ、２６ｔｈ Ｅｄ．（Ｂｅｙｅｒ、
Ｗ．Ｈ．、Ｅｄ．）ＣＲＣＰｒｅｓｓ Ｉｎｃ．、Ｂｏ
ｃａ Ｒａｔｏｎ、ＦＬ １９８１．Ｐ．１２５）に従
って算出）は、リジン３５とＮ末端のモノＰＥＧ化種で
は類似していた。） Ｅ．安定性試験 更に、上述のように調製したＮ末端およびリジン３５に
モノＰＥＧ化した分子種について、安定性試験を実施し
た。（リジン４１物質は、活性が未修飾Ｇ−ＣＳＦを上
回らないことが実証されたため使用しなかった）。これ
らの試験によって、Ｎ末端にＰＥＧ化したＧ−ＣＳＦが
もう一方のモノＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦであるモノＰＥＧ化
リジン３５と比べて、保管中に予想外に安定しているこ
とが実証された。安定性はＳＥＣ−ＨＰＬＣを使って視
覚化させた生成物の分解という点で評価した。
【００７９】方法：Ｎ末端にＰＥＧ化したＧ−ＣＳＦと
リジン３５にモノＰＥＧ化したＧ−ＣＳＦを、ｐＨ４．
０およびｐＨ６．０という２種類のｐＨ、温度４℃の下
でそれぞれ最高１６日間保管した。ｐＨを６．０に上げ
ると、加速安定性試験の環境ができあがる。ｐＨ６．０
のサンプルの場合、上述のように調製した、Ｎ末端にモ
ノＰＥＧ化したＧ−ＣＳＦおよびリジン３５にモノＰＥ
Ｇ化したＧ−ＣＳＦを、２０ｍＭの燐酸ナトリウム、５
ｍＭの酢酸ナトリウム、２．５％マンニトール、０．０
０５％Ｔｗｅｅｎ−８０を含むｐＨ６．０の緩衝液に入
れ、最終蛋白質濃度が０．２５ｍｇ／ｍｌとなるように
した。このアリコート１ｍｌを３ｍｌの滅菌済み注射用
バイアルに入れて保管した。バイアルは各々４℃および
２９℃において最高１６日間保管した。安定性はＳＥＣ
−ＨＰＬＣトレーシングによって評価した。後の測定値
が最初（時間＝０）の測定値と同じであった場合（肉眼
検査によって確認）、そのサンプルはその期間だけ安定
していたと見なされた。
【００８０】結果：結果は図６Ａ〜６Ｃに示した。
【００８１】（ａ）ｐＨ６．０、温度４℃での比較。図
６ＡはＮ末端にモノＰＥＧ化したＧ−ＣＳＦをｐＨ６、
４℃で保管した場合のＳＥＣ−ＨＰＬＣプロフィールを
示しており、図６Ｂはリジン３５にモノＰＥＧ化したＧ
−ＣＳＦをｐＨ６、４℃で保管した場合のＳＥＣ−ＨＰ
ＬＣプロフィールを示している。リジン３５物質は分解
されて、未修飾Ｇ−ＣＳＦと類似の分子量の物質になり
つつあると解釈できる。
【００８２】（ｂ）ｐＨ４．０、温度４℃での長期保
管。ＰＨ４．０、温度４℃という条件は、Ｎ末端種が分
解を示さない比較的安定した条件を示すある種の対照を
提供する。リジン３５種の場合、物質の分解がまだ起こ
っているが、速度はかなり遅い。
【００８３】（ｃ）ｐＨ６．０、温度４℃での比較。図
６Ｃはこのような条件下に長期間保管した場合のモノＰ
ＥＧ化Ｇ−ＣＳＦのＳＥＣ−ＨＰＬＣプロフィールを示
している。記載の通り、ｐＨ６．０、温度４℃の場合、
リジン３５物質は１６日目または３５日目では、６日目
に観察されたもの（図６Ｂ）を上回る脱ＰＥＧ化は観察
されなかった。これはこのような条件下では６日目を越
えても脱ＰＥＧ化（不安定性）に変化がないことを示し
ている。
【００８４】実施例２ この実施例は、還元アルキル化を用いて実質的に均質な
モノＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ群を調製する方法、およびこの
群の特徴を示している。上記実施例で説明した組換えＧ
−ＣＳＦを使用した。記載のように、この方法は、Ｎ末
端を化学的に修飾した物質の収率という点で利点がある
だけでなく、この還元アルキル化法のアミン結合は実質
的に安定した生成物を産生するという利点がある。これ
は保存後の凝集の程度に大きな差があることによって実
証される。
【００８５】Ａ．Ｎ末端のα−アミノ残基に結合させた
モノ−メトキシポリエチレングリコール−ＧＣＳＦ結合
体の調製 ２０ｍＭのＮａＣＮＢＨ3 を含む１００ｍＭのリン酸ナ
トリウム（ｐＨ５）中の、冷却し（４℃）攪拌したｒｈ
Ｇ−ＣＳＦ溶液（１ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ、上記実施例の
ところで説明済み）に、５倍モル過剰のメトキシポリエ
チレングリコールアルデヒド（ＭＰＥＧ）（平均分子
量、６ｋＤａ）を加えた。同じ温度で反応混合物を攪拌
し続けた。
【００８６】反応中に蛋白質の修飾がどの程度起こった
かは、Ｂｉｏ−Ｓｉｌ ＳＥＣ２５０−５カラム（ＢＩ
Ｏ−ＲＡＤ）を用いてＳＥＣ ＨＰＬＣによってモニタ
ーした。溶離剤には０．０５ＭのＮａＨ2 ＰＯ4 、０．
０５ＭのＮａ2 ＨＰＯ4 、０．１５ＭのＮａＣｌ、０．
０１ ＭのＮａＮ3 をｐＨ６．８にて用い、流速は１ｍ
ｌ／分とした。
【００８７】１０時間ＳＥＣ ＨＰＬＣ分析を行った結
果、蛋白質の９２％がモノ−ＭＰＥＧ−ＧＣＳＦ誘導体
に変換されていることが分かった。これは蛋白質濃度
（Ａ280 における吸光度によって決定）の記録である図
７から分かる。この図からは、８．７２分にモノＰＥＧ
化Ｇ−ＣＳＦの溶離ピークがあり、また９．７８分に溶
離する未反応Ｇ−ＣＳＦのマイナーピークがあることが
分かる。
【００８８】図８はＭＰＥＧのＮ−ヒドロキシサクシニ
ミジルエステルを用いて得たピークを示している。分子
量は約６ｋＤａであった。図から分かるように、この反
応によって得られた混合物は次のとおりであった：トリ
−ＭＰＥＧ−ＧＣＳＦ結合体（約７．２５分のところに
ショルダー）、ジ−ＭＰＥＧ−ＧＣＳＦ結合体（７．６
２分にピーク）、モノ−ＭＰＥＧ−ＧＣＳＦ結合体
（８．４３分にピーク）、および未反応のＧ−ＣＳＦ
（９．８７分にピーク）。
【００８９】蛋白質の９２％がモノＰＥＧ化物質に変換
されたこの１０時間の時点で、反応混合物のｐＨを１０
０ｍＭのＨＣｌでｐＨ４に調整し、反応混合物を１ｍＭ
のＨＣｌで５倍に希釈した。
【００９０】モノ−ＭＰＥＧ−ＧＣＳＦ誘導体は、２０
ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４）で平衡化したＨ
ｉＬｏａｄ １６／１０ＳセファロースＨＰカラム（Ｐ
ｈａｒｍａｃｉａ）を用いて、イオン交換クロマトグラ
フィによって精製した。反応混合物をカラムに添加して
流速１ｍｌ／分でランし、同緩衝液を３カラム容量用い
て未反応のＭＰＥＧアルデヒドを溶出した。次に１Ｍの
ＮａＣｌを含む０％〜４５％直線４００分勾配の２０ｍ
Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４）を用いて、４℃において蛋
白質−ポリマー結合体を溶出した。
【００９１】モノ−ＭＰＥＧ−ＧＣＳＦ誘導体を含む分
画をプールして濃縮し、滅菌濾過した。
【００９２】同様にして、種々の平均分子量（１２、２
０、２５ｋＤａ）のＭＰＥＧアルデヒドでｒｈ−Ｇ−Ｃ
ＳＦを修飾することによって得られる様々なモノ−ＭＰ
ＥＧ−ＧＣＳＦ結合体を調製した。
【００９３】Ｂ．モノＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦの分析 １．分子量 モノＰＥＧ化結合体における分子量は、ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ、ゲル濾過、マトリックスアシステッドレーザーデソ
ープション質量分析、平衡遠心分離によって求めた。結
果は以下の表４に示した。
【００９４】
【表４】
【００９５】調製したＮ末端モノ−ＭＰＥＧ−ＧＣＳＦ
結合体の構造は、Ｎ末端の蛋白質シーケンシングとペプ
チドマッピングによって確認した。Ｎ末端のメチオニル
残基の臭化シアン切断の結果、ポリエチレングリコール
が除去された。
【００９６】２．生物学的活性 ＰＥＧ化ＭＰＥＧ−ＧＣＳＦ結合体のｉｎ ｖｉｔｒｏ
生物学的活性は、 3Ｈチミジンのマウス骨髄細胞への刺
激取り込みを測定することによって求めた。
【００９７】Ｉｎ ｖｉｖｏ生物学的活性は、ＭＰＥＧ
−ＧＣＳＦ結合体またはｒｈＧ−ＣＳＦ（１００ｍｇ／
ｋｇ）をハムスターに皮下注射し、総白血球数を測定す
ることによって求めた。非誘導体化Ｇ−ＣＳＦと比較し
た生物活性は、ベヒクル（媒体）の対照曲線を引き算し
た後のＷＢＣ／時間曲線下の面積として計算した。ＭＰ
ＥＧ−ＧＣＳＦ誘導体の相対的生物活性は、未修飾Ｇ−
ＣＳＦと比較した生物活性のパーセンテージとして表し
た。
【００９８】これは、様々な分子量（６ｋＤａ、１２ｋ
Ｄａ、および２０ｋＤａ）のＭＰＥＧアルデヒドによる
ｒｈＧ−ＣＦの還元アルキル化によって調製したモノ−
Ｎ末端ＭＰＥＧ−ＧＣＳＦ結合体に対する総白血球反応
を示す図９に示してある。図から分かるように、モノＰ
ＥＧ化分子はすべて反応を誘導した。使用したポリエチ
レングリコールの分子量が高いほど、白血球数が多くな
った。但し、１２ｋＤａ型は２日目において２０ｋＤａ
型と比較して、白血球数がわずかに多いだけであった。
【００９９】３．安定性試験 ２種類の化学的方法（アミドｖｓ還元アルキル化のアミ
ン）によって調製したＮ末端にＰＥＧ化したＧ−ＣＳＦ
の凝集程度を比較した。予想外のことだが、アミン化学
を用いてＮ末端にＰＥＧ化したＧ−ＣＳＦは、アミド結
合によってＮ末端にＰＥＧ化したＧ−ＣＳＦよりもかな
り安定していることが分かった（ＮＨＳ化学反応は実施
例１に説明済み）。
【０１００】方法：Ｎ末端にＰＥＧ化したＧ−ＣＳＦサ
ンプルはどちらも、５％ソルビトールを含む１０ｍＭの
ＮａＯａｃ（ｐＨ４．０）に濃度１ｍｇ蛋白質／ｍｌで
含まれていた。Ｇ−ＣＳＦはどちらもＰＥＧ ６０００
でＰＥＧ化した。アミド結合結合体は実施例１のとおり
に調製し、アミン結合結合体は実施例２のとおりに調製
した。各々６個ずつのサンプルを４５℃において８週間
保存した。８週目の終りにサイズ排除クロマトグラフィ
およびイオン交換クロマトグラフィによって凝集程度を
判断した。
【０１０１】結果：現在の還元アルキル化法は、驚くべ
きことに高温で８週間保存した後も凝集が遥かに少ない
物質を生成し、アセチル化よりも利点があることが実証
された。以下の表は、サイズ排除クロマトグラフィ（Ｓ
ＥＣ）またはイオン交換（ＩＥ）を用いて得た、両方の
物質の非凝集物質（“メインピーク”物質）の割合を示
している：
【０１０２】
【表５】
【０１０３】＊イオン交換では凝集について完全な分析
はできないため、これはかなり高い。
【０１０４】実施例３ この実施例は化学的修飾コンセンサスインターフェロン
を実証するものである。もっと詳しく言えば、この例は
かなり均質なモノＰＥＧ化ＩＦＮ−ｃｏｎ1 群の調製方
法、およびこの群の特性を実証している。
【０１０５】この実施例はＩＦＮ−ｃｏｎ1 を使用して
いるが、上述のコンセンサスインターフェロンのいずれ
も化学的に修飾される可能性があることに注意すべきで
ある。このような化学的修飾には、上にリストしたよう
な任意の水溶性ポリマーを使用してよいが、ここではＰ
ＥＧを使用している。ＰＥＧ化にはここではＰＥＧ１２
０００を使用しているが、任意の水溶性ＰＥＧ種を使用
してもよい（ＰＥＧ１２０００は取扱いが容易で便利な
ために選択した）。また、化学的修飾の方法としては種
々あるが（アセチル化など）、Ｎ末端ＰＥＧ化のような
選択的Ｎ末端化学的修飾については、この実施例で説明
している本還元アルキル化法が好ましい。
【０１０６】Ａ．コンセンサスインターフェロンの調製 モノＰＥＧ化コンセンサスインターフェロンの調製に
は、米国特許第４，６９５，６２３号（この全体を参照
として本明細書に組み入れる）の図２にあるＩＦＮ−α
ｃｏｎ1 （本明細書ではＩＦＮ−ｃｏｎ1 と呼ぶ）を使
用した。ＩＦＮ−ｃｏｎ1 は細菌内での外因性ＤＮＡの
発現によって生成されたもので、Ｎ末端にメチオニル残
基を持っていた。
【０１０７】Ｂ．コンセンサスインターフェロンのＰＥ
Ｇ化 ２０ｍＭのＮａＣＮＢＨ3 を含む、冷却し（４℃）攪拌
しておいた１００ｍＭのリン酸ナトリウム中のＩＦＮ−
ｃｏｎ1 溶液、ｐＨ４．０（３．４５ｍｇ／ｍｌ、Ｎ末
端がブロックされた形態を３２．２５％含む）に、８倍
モル過剰のメトキシポリエチレングリコールアルデヒド
（ＭＰＥＧ）（平均分子量１２ｋＤａ）を加えた。
【０１０８】反応中に蛋白質修飾がどの程度起こるか
は、ＰＬＲＰ−Ｓ（ＰＬ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｓｃ
ｉｅｎｃｅｓ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉ
ｅｓ）のようなポリマーベースのポリ（スチレン／ジビ
ニルベンゼン）カラムを使った逆相ＨＰＬＣによってモ
ニターした。
【０１０９】１０時間の逆相ＨＰＬＣ分析の結果、Ｎ末
端にブロックされたα−アミノ基を持つ蛋白質の８０％
がＭＰＥＧ−ＩＦＮ−ｃｏｎ1 誘導体に変換されたこと
が分かった。
【０１１０】１０時間の時点で、反応混合物を５倍の水
で希釈し、モノ−ＭＰＥＧ−ＩＦＮ−Ｃｏｎ1 誘導体
を、２０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０）で
平衡化したＨｉＬｏａｄ １６／１０ Ｓセファロース
ＨＰカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いたイオン交換
クロマトグラフィで精製した。反応混合物を流速１ｍｌ
／分の流速でカラムに添加し、未反応のＭＰＥＧアルデ
ヒドを３カラム容量の同緩衝液で溶出した。次に１Ｍの
ＮａＣｌを含む２０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ４．０
の０％〜７５％の４２０分直線勾配を用いて、４℃にお
いて蛋白質−ポリマー結合体を溶出した。
【０１１１】モノ−ＭＰＥＧ−ＩＦＮ−Ｃｏｎ1 誘導体
を含む分画をプールし、濃縮して、滅菌濾過した。
【０１１２】Ｃ．モノＰＥＧ化コンセンサスインターフ
ェロンの分析 １．均質性 精製したモノ−ＭＰＥＧ−ＩＦＮ−Ｃｏｎ1 結合体の均
質性は、１０〜２０％または４〜２０％プレキャストグ
ラジェントゲル（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｓｅｐａｒａ
ｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥ
によって調べた。分子量３５ｋＤａのところにメインバ
ンドが現れた。
【０１１３】各モノ−ＭＰＥＧ−ＩＦＮ−ｃｏｎ1 種の
有効サイズ（流体力学的半径）を調べるために、Ｓｕｐ
ｅｒｏｓｅ ６ＨＲ １０／３０（Ｐｈａｒｍａｃｉ
ａ）ゲル濾過カラムを使用した。蛋白質は２８０ｎｍに
おける紫外線吸光度によって検出した。ＢＩＯ−ＲＡＤ
ゲル濾過標準は、球状蛋白質分子量マーカーとして用い
た。
【０１１４】精製されたＮ末端モノ−ＭＰＥＧ−ＩＦＮ
−ｃｏｎ1 結合体の構造は、Ｎ末端蛋白質シーケンシン
グおよびペプチドマッピングの手法によって確認した。
【０１１５】このＩＦＮ−ｃｏｎ1 調製物にはＮ末端が
ブロックされている物質が少し含まれており、この物質
はＰＥＧ化されていなかった。しかしＰＥＧ化されてい
た物質は、Ｎ末端がモノＰＥＧ化されていた。このよう
に、この種の状況では、イオン交換クロマトグラフィや
サイズ排除クロマトグラフィといった他の方法によっ
て、ブロックされている物質とされていない物質を分離
したほうが良いかもしれない。
【０１１６】２．生物学的活性 モノ−ＭＰＥＧ−ＩＦＮ−Ｃｏｎ1 結合体のｉｎ ｖｉ
ｔｒｏ生物学的活性は、その抗ウイルス生物活性を測定
することによって決定した。モノ−ＭＰＥＧ−ＩＦＮ−
Ｃｏｎ1 結合体のｉｎ ｖｉｔｒｏ生物学的活性は、ヒ
ト（ＨｅＬａ）細胞におけるその抗ウイルス生物活性を
測定することによって決定した。
【０１１７】モノ−ＭＰＥＧ（１２ｋＤａ）−ＩＦＮ−
Ｃｏｎ1 結合体は、未修飾種と比較して２０％のｉｎ
ｖｉｔｒｏ生物活性（Ｕ／ｍｇ蛋白質）を示すことが分
かった。ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦのところで指摘したよう
に、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイは生物学的活性を実証す
るのには有用であるが、特徴的な徐放性のために、化学
的に修飾した蛋白質の活性がかなり低く出ることがあ
る。Ｉｎ ｖｉｖｏ生物学的活性はｉｎ ｖｉｔｒｏ生
物学的活性より高いかも知れない。
【０１１８】Ｄ．Ｎ末端ブロック分子を除去した化学的
修飾コンセンサスインターフェロン 予め除去したＮ末端ブロック分子の一部を持つ上述のＩ
ＦＮ−ｃｏｎ1 に対しても、本還元アルキル化を実施し
た。上述のように還元アルキル化法にはＰＥＧ１２００
０とＰＥＧ ２００００の両方を用いた。
【０１１９】分子の見かけの分子量は以下のとおりであ
った：
【０１２０】
【表６】
【０１２１】ＦＰＬＣイオン交換クロマトグラフィを使
ったＩＦＮ−ｃｏｎ1 ２０ｋＤＡＰＥＧ結合体の分析
では、３つのピークが現れた： モノＭＰＥＧ−ＩＦＮ−ｃｏｎ1 ：総面積の６６％（２
６５．９３ｍｌで溶出） 蛋白質凝集物およびオリゴＭＰＥＧ−ＩＦＮ−ｃｏｎ1
結合体：総面積の２４％（２３８．４２ｍｌで溶出） 未反応のＩＦＮ−ｃｏｎ1 ：総面積の１０％（３２８．
７７ｍｌで溶出）。
【０１２２】条件はこれ以上最適化しなかった。クロマ
トグラフィまたはその他の方法を使えば、モノＰＥＧ化
物質を更に分離することができるかも知れない。
【０１２３】本発明を好ましい実施例について説明した
が、当業者には修正や変更が可能であることは理解され
よう。従って添付の請求の範囲はその発明の範囲内にあ
るこういったすべての同等の変更を包含するものであ
る。
【０１２４】
【配列表】
配列番号：１ 配列の長さ：５３１塩基対 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列：
【０１２５】
【化３】
【０１２６】配列番号：２ 配列の長さ：１７５ 配列の型 ：アミノ酸 鎖の数 ：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列：
【０１２７】
【化４】
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦのイオン交換クロマトグ
ラフィーから得たピークのクロマトグラムを図示したも
のである。
【図１Ｂ】モノＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦの各種の分子種のＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥである。
【図２】ＳＥＣ−ＨＰＬＣプロフィールであり、（レー
ンＡ）：組換えヒトメチオニルＧ−ＣＳＦの標準品；
（レーンＢ）：ＳＣＭ−ＰＥＧ−ＧＣＳＦ反応混合物；
（レーンＣ）：Ｎ末端ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ；（レーン
Ｄ）：リシン３５モノＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ；（レーン
Ｅ）：リシン４１モノＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦである。
【図３Ａ】ＨＰＬＣエンドプロテイナーゼＳＶ８ペプチ
ドマッチングトレーシングであり、図３ＡはＮ末端ＰＥ
Ｇ化Ｇ−ＣＳＦを示す。
【図３Ｂ】ＨＰＬＣエンドプロテイナーゼＳＶ８ペプチ
ドマッチングトレーシングであり、図３Ｂはリシン３５
モノＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦを示す。
【図３Ｃ】ＨＰＬＣエンドプロテイナーゼＳＶ８ペプチ
ドマッチングトレーシングであり、図３Ｃはリシン４１
モノＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦを示す。
【図４】図４はモノＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ種のｉｎ ｖｔ
ｒｏ生物活性を非ＰＥＧ化標準品のそれと比較して示す
棒グラフである。
【図５Ａ】モノＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ誘導体のｉｎ ｖｉ
ｖｏ生物活性のアッセイ結果を示すグラフであり、図５
Ａは、Ｎ末端ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ、リシン３５モノＰＥ
Ｇ化Ｇ−ＣＳＦまたはリシン４１モノＰＥＧ化Ｇ−ＣＳ
Ｆを一回皮下注射した後のハムスターの平均白血球数を
示す。
【図５Ｂ】モノＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ誘導体のｉｎ ｖｉ
ｖｏ生物活性のアッセイ結果を示すグラフであり、図５
Ｂは上記の各種モノＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ誘導体を一回皮
下注射した後の、正味の平均白血球数の曲線下面積を示
す。
【図６Ａ】Ｎ末端ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦまたはリシン３５
モノＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦの安定性の試験結果のＳＥＣ−
ＨＰＬＣプロフィールである。図６Ａは、（６Ａ）Ｎ末
端モノＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦまたは（６Ｂ）リシン３５モ
ノＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦのｐＨ６．０で４℃にて行った安
定性試験のプロフィールを示す。
【図６Ｂ】Ｎ末端ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦまたはリシン３５
モノＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦの安定性の試験結果のＳＥＣ−
ＨＰＬＣプロフィールである。図６Ｂは、（６Ａ）Ｎ末
端モノＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦまたは（６Ｂ）リシン３５モ
ノＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦのｐＨ６．０で４℃にて行った安
定性試験のプロフィールを示す。
【図６Ｃ】Ｎ末端ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦまたはリシン３５
モノＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦの安定性の試験結果のＳＥＣ−
ＨＰＬＣプロフィールである。図６Ｃは、リシン３５モ
ノＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦのｐＨ６．０で４℃にて行った時
間を延長した安定性試験の結果を示すプロフィールであ
る。時間（「Ｔ」）は日数を示す。
【図７】ｒｈ−Ｇ−ＣＳＦとメトキシポリエチレングリ
コールアルデヒド（ＭＷ６ｋＤａ）との還元的アルキル
化反応の過程での反応混合物のサイズ排除ＨＰＬＣによ
る分析結果を示す。
【図８】ＭＰＥＧのＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエ
ステル（ＭＷはやはり６ｋＤａ）を用いた反応混合物の
サイズ排除ＨＰＬＣによる分析結果を示す。
【図９】分子量が異なる（６ｋＤａ、１２ｋＤａおよび
２０ｋＤａ）ＭＰＥＧアルデヒド類でｒｈ−Ｇ−ＣＳＦ
の還元的アルキル化を行うことによって製造したモノＮ
末端ＭＰＥＧ−ＧＣＳＦ結合体に対する、一回の皮下投
与後の全白血球応答を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ０７Ｋ 1/13 Ａ６１Ｋ 37/66 Ｃ (72)発明者 クリステイン・イー・フアーラー アメリカ合衆国、カリフオルニア・ 91320、ニユーベリイー・パーク、バリ ー・オーク・レーン・667 (72)発明者 ランドルフ・ビー・デプリンス アメリカ合衆国、ノースカロライナ・ 27614、ローリイ、ハートランド・コー ト・129 (56)参考文献 特開 昭58−225025（ＪＰ，Ａ) 国際公開90／6952（ＷＯ，Ａ１) Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅ ｍ．，Ｖｏｌ．５，Ｎｏ．２（1994) ｐ．133−140 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C07K 14/555 C07K 1/13 A61K 38/21 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＣＡ（ＳＴＮ) ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (3)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 細胞増殖疾患、ウイルス感染及び自己免
    疫疾患の治療のための、N末端がPEG化されたコンセンサ
    スインターフェロンの均一な製剤であって、N末端以外
    の部位がPEG化されたコンセンサスインターフェロンを
    含まない製剤。
  2. 【請求項２】 前記コンセンサスインターフェロン部分
    がIFN-con1, IFN-con2, IFN-con3からなる群から選択さ
    れる請求項１に記載の製剤。
  3. 【請求項３】 前記ポリエチレングリコール部分が前記
    コンセンサスインターフェロン部分に、追加の結合基な
    しで直接結合されている請求項１に記載の製剤。
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