JP4959566B2 - トランスホーミング増殖因子βファミリータンパク質の折りたたみ - Google Patents

トランスホーミング増殖因子βファミリータンパク質の折りたたみ Download PDF

Info

Publication number
JP4959566B2
JP4959566B2 JP2007528062A JP2007528062A JP4959566B2 JP 4959566 B2 JP4959566 B2 JP 4959566B2 JP 2007528062 A JP2007528062 A JP 2007528062A JP 2007528062 A JP2007528062 A JP 2007528062A JP 4959566 B2 JP4959566 B2 JP 4959566B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
concentration
refolding buffer
buffer contains
composition
potassium phosphate
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
JP2007528062A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2008510720A (ja
Inventor
アンソニー ロッソマンド，
アール． ブレーク ピピンスキー，
バンチアン コン，
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Biogen Inc
Biogen MA Inc
Original Assignee
Biogen Inc
Biogen Idec Inc
Biogen Idec MA Inc
Biogen MA Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Biogen Inc, Biogen Idec Inc, Biogen Idec MA Inc, Biogen MA Inc filed Critical Biogen Inc
Publication of JP2008510720A publication Critical patent/JP2008510720A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP4959566B2 publication Critical patent/JP4959566B2/ja
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/495—Transforming growth factor [TGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/06—Preparation of peptides or proteins produced by the hydrolysis of a peptide bond, e.g. hydrolysate products
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Description

（関連出願の相互参照）
本出願は、２００４年８月１９日に出願された仮特許出願第６０／６０２，８２５号の優先権を主張する。この仮特許出願の全内容は、本明細書中でその全体が参考として援用される。
（技術分野）
本発明は、トランスホーミング増殖因子βスーパーファミリーに属するタンパク質の再折りたたみ（ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ）のための組成物および方法に関する。
（背景）
アルテミン（Ａｒｔｅｍｉｎ）およびエノビン（Ｅｎｏｖｉｎ）としても公知であるニューブラスチン（ｎｅｕｂｌａｓｔｉｎ）は、２４ｋＤａの分泌型ホモ二量体タンパク質であり、このタンパク質は、末梢神経系および中枢神経系のニューロン（例えば、ドパミン作動性ニューロン）の生存を促進する（非特許文献１、非特許文献２、ＧｅｎＢａｎｋＴＭＡＦ１２０２７４）。ニューブラスチンをコードする遺伝子は、クローニングされており、かつ、配列決定されている（非特許文献２、非特許文献３）。
ニューブラスチンは、神経膠細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）リガンドファミリーのメンバーである。ＧＤＮＦメンバーは、細胞レベルで、レセプターチロシンキナーゼ（ＲＥＴ）を活性化する。ＲＥＴは、コレセプター（ｃｏ−ｒｅｃｅｐｔｏｒ）でありＧＤＮＦファミリーレセプターα（ＧＦＲα）である、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）結合型膜タンパク質（これは、ＲＥＴについてのリガンド特異性を提供する）と会合する。４種のＧＦＲα（ＧＦＲα１〜ＧＦＲα４）が、公知である。ニューブラスチンは、ＲＥＴと共にＧＦＲα３に結合して三重シグナル伝達複合体を形成し（非特許文献１、非特許文献３）、この複合体は、主に侵害受容の感覚ニューロン上に局在する（非特許文献４）。これらのニューロンは、痛みおよび損傷を検出する。したがって、ニューブラスチンは、ニューロパシーの一般的処置において（より具体的には、神経障害性疼痛の処置において）、臨床的用途を有する。
ニューブラスチンおよび他のＧＤＮＦファミリーメンバーは、トランスホーミング増殖因子β（ＴＧＦβ）スーパーファミリーのメンバーであり、したがって、類似する間隔の７つの保存的システイン残基（これらの残基は、システイン節（ｃｙｓｔｅｉｎ ｋｎｏｔ）の構造を形成する）の存在によって特徴付けられる（非特許文献５）。各単量体は、２つのジスルフィド結合を含み、これらのジスルフィド結合は、第３のジスルフィドを取り囲む閉鎖型構造（ｃｌｏｓｅｄ ｌｏｏｐ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）を形成して、固い節構造を形成する。各単量体の中に含まれる第７のシステインは、分子間ジスルフィド結合を形成し、共有結合して、最終産物である二量体を形成する（非特許文献６）。
ＴＧＦβファミリーメンバーは、プレプロタンパク質として合成され、シグナルペプチドおよびプロドメイン（ｐｒｏ−ｄｏｍａｉｎ）の切断後、最終的に成熟型ホモ二量体として分泌される（非特許文献６、非特許文献７を参照のこと）。シグナルペプチドおよびプロドメインの両方は、ＴＧＦβファミリーメンバーの適切な分泌を媒介する（非特許文献６、非特許文献８）。
Ｂａｕｄｅｔら，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，２０００年，第１２７巻，ｐ．４３３５ Ｒｏｓｅｂｌａｄら，Ｍｏｌ．ＣｅｌｌＮｅｕｒｏｓｃｉ．，２０００年，第１５巻，第２号，ｐ．１９９ Ｂａｌｏｈら，Ｎｅｕｒｏｎ，１９９８年，第２１巻，ｐ．１２９１ Ｏｒｏｚｃｏら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，２００１年，第１３巻，第１１号，ｐ．２１７７ Ｓａａｒｍａ，Ｍｉｃｒｏｓｃ．Ｒｅｓ．Ｔｅｃｈ．，１９９９年，第４５巻，ｐ．２９２ Ｒａｔｔｅｎｈｏｌｌら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２０００年，第３０５巻，ｐ．５２３ Ｆａｉｒｌｉｅら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２００１年，第２７６巻，第２０号，ｐ．１６９１１ Ｒａｔｔｅｎｈｏｌｌら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２００１年，第２６８巻，ｐ．３２９６
（要旨）
本発明は、少なくとも部分的に、特定の緩衝組成物が、変性ポリペプチドの再折りたたみの誘導に特に有効であるという知見に基づく。本明細書中で記載される組成物および方法は、タンパク質の再折り畳みを誘導し、それによって適切な三次元構造およびそれに伴う生物学的活性を有するポリペプチドを生じるために開発された。
１つの局面において、本発明は、以下によって変性ポリペプチドの折りたたみ（ｆｏｌｄｉｎｇ）を誘導する方法を特徴とする：（１）変性ポリペプチドを提供する工程；ならびに（２）このポリペプチドをこのポリペプチドの折りたたみを誘導するために有効な量の再折りたたみ緩衝液と接触させる工程であって、ここで、この再折りたたみ緩衝液は、以下を含有する：（ｉ）２５ｍＭ〜１５０ｍＭの濃度のｐＨ５．８〜ｐＨ８．０のリン酸カリウムもしくはリン酸ナトリウム、（ｉｉ）０．３Ｍ〜２Ｍの濃度のグアニジン−ＨＣｌ、（ｉｉｉ）０．２５Ｍ〜１Ｍの濃度のＬ−アルギニン、（ｉｖ）０．０５％〜１％の濃度のＴｗｅｅｎ−８０、ならびに（ｖ）１ｍＭ〜４ｍＭの濃度の酸化グルタチオンおよび０．０５ｍＭ〜０．８ｍＭの濃度の還元グルタチオンであって、ここで、酸化グルタチオン：還元グルタチオンの比が、５：１〜２０：１である、酸化グルタチオンおよび還元グルタチオン。
いくつかの実施形態において、上記変性ペプチドは、ＴＧＦβスーパーファミリーメンバーを含むポリペプチドである。
「ＴＧＦβスーパーファミリーメンバー」は、本明細書中で使用される場合、ＴＧＦβスーパーファミリーの野生型メンバーと同一の配列を有するタンパク質、この野生型タンパク質の生物学的活性を保持する短縮形態（ｔｒｕｎｃａｔｅ）、またはこの野生型タンパク質（全長タンパク質もしくは成熟型タンパク質）の少なくとも７０％の配列同一性を有し、かつこの野生型タンパク質の生物学的活性を保持する改変体をいう。ＴＧＦβスーパーファミリーのメンバーとしては、例えば、ＴＧＦ−β、増殖分化因子、骨形成タンパク質、アクチビン、インヒビン、および神経膠細胞株由来神経栄養因子が挙げられる。いくつかの実施形態において、改変体は、全長野生型タンパク質に対して少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは９８％の配列同一性を有し、そしてこの野生型タンパク質の生物学的活性を保持する。いくつかの実施形態において、改変体は、成熟型野生型タンパク質に対して少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは９８％の配列同一性を有し、そしてこの野生型タンパク質の生物学的活性を保持する。
本明細書中で記載される方法において使用される「再折りたたみ緩衝液」成分の濃度の記載は、変性ポリペプチドを有する反応液中に存在する再折りたたみ緩衝液成分の最終濃度をいう（この折りたたみ反応液の他の成分の添加前の、再折りたたみ緩衝液のストック溶液における成分の濃度をいうのではない）。
本明細書中で使用される場合、「ポリペプチドの折りたたみを誘導する」とは、ポリペプチドの三次構造の誘導をいい、そして関連する生物学的活性（これは、野生型タンパク質の生物学的活性に対応する）の獲得をいう。
ＴＧＦβスーパーファミリーメンバーは、神経膠細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）ファミリーメンバーであってもよい。「ＧＤＮＦファミリーメンバー」とは、本明細書中で使用される場合、ＧＤＮＦファミリーの野生型メンバーと同一である配列を有するタンパク質、この野生型タンパク質の生物学的活性を保持する短縮形態、またはこの野生型タンパク質（全長タンパク質もしくは成熟型タンパク質）の少なくとも７０％の配列同一性を有し、かつこの野生型タンパク質の生物学的活性を保持する改変体をいう。ＧＤＮＦファミリーのメンバーとしては、ＧＤＮＦ、ニュールツリン（ｎｅｕｒｔｕｒｉｎ）、ニューブラスチン、およびパーセフィン（ｐｅｒｓｅｐｈｉｎ）が挙げられる。いくつかの実施形態において、改変体は、全長野生型タンパク質に対して少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは９８％の配列同一性を有し、そしてこの野生型タンパク質の生物学的活性を保持する。いくつかの実施形態において、改変体は、成熟型野生型タンパク質に対して少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは９８％の配列同一性を有し、そしてこの野生型タンパク質の生物学的活性を保持する。
いくつかの実施形態において、ＧＤＮＦファミリーメンバーは、ニューブラスチンタンパク質である。「ニューブラスチンタンパク質」とは、本明細書中で使用される場合、野生型ニューブラスチン（例えば、ヒトニューブラスチン）と同一である配列を有するタンパク質、この野生型タンパク質の生物学的活性を保持する短縮形態、またはこの野生型タンパク質（全長タンパク質もしくは成熟型タンパク質）の少なくとも７０％の配列同一性を有し、かつこの野生型タンパク質の生物学的活性を保持する改変体をいう。いくつかの実施形態において、改変体は、全長野生型タンパク質に対して少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは９８％の配列同一性を有し、そしてこの野生型タンパク質の生物学的活性を保持する。いくつかの実施形態において、改変体は、成熟型野生型タンパク質（例えば配列番号１のアミノ酸残基１０８〜２２０）に対して少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは９８％の配列同一性を有し、そしてこの野生型タンパク質の生物学的活性を保持する。ニューブラスチンタンパク質は、例えば、配列番号１のアミノ酸残基１２２〜２２０から構成されてもよく、配列番号１のアミノ酸残基１１７〜２２０から構成されてもよく、配列番号１のアミノ酸残基１０８〜２２０から構成されてもよい。
上記方法は、上記再折りたたみ緩衝液によって折りたたみを誘導する前に、上記ポリペプチドを、細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）中で発現させる工程をさらに包含する。いくつかの実施形態において、上記ポリペプチドは、上記再折りたたみ緩衝液によって折りたたみを誘導する前に、不溶性形態で細菌中で発現され、そしてこの不溶性ポリペプチドは、このポリペプチドを変性させるために有効な量の可溶化緩衝液に接触させられる。
いくつかの実施形態において、上記再折りたたみ緩衝液は、０．３０Ｍ〜０．５Ｍの濃度のＬ−アルギニンを含有する。他の実施形態において、上記再折りたたみ緩衝液は、少なくとも０．３０Ｍの濃度のＬ−アルギニンを含有する。他の実施形態において、上記再折りたたみ緩衝液は、少なくとも０．３５Ｍの濃度のＬ−アルギニンを含有する。他の実施形態において、上記再折りたたみ緩衝液は、０．３５Ｍの濃度のＬ−アルギニンを含有する。
いくつかの実施形態において、上記再折りたたみ緩衝液は、０．１％〜１％の濃度のＴｗｅｅｎ−８０を含有する。他の実施形態において、上記再折りたたみ緩衝液は、０．１％〜０．５％の濃度のＴｗｅｅｎ−８０を含有する。他の実施形態において、上記再折りたたみ緩衝液は、少なくとも０．１％の濃度のＴｗｅｅｎ−８０を含有する。他の実施形態において、上記再折りたたみ緩衝液は、０．１％の濃度のＴｗｅｅｎ−８０を含有する。
いくつかの実施形態において、上記再折りたたみ緩衝液は、５：１〜１０：１の比の酸化グルタチオンおよび還元グルタチオンを含有する。他の実施形態において、上記再折りたたみ緩衝液は、５：１の比の酸化グルタチオンおよび還元グルタチオンを含有する。いくつかの実施形態において、上記再折りたたみ緩衝液は、１ｍＭ〜２ｍＭの濃度の酸化グルタチオンを含有する。他の実施形態において、上記再折りたたみ緩衝液は、１ｍＭの濃度の酸化グルタチオンを含有する。
いくつかの実施形態において、上記再折りたたみ緩衝液は、０．５Ｍ〜１．０Ｍの濃度のグアニジン−ＨＣｌを含有する。他の実施形態において、上記再折りたたみ緩衝液は、少なくとも０．５Ｍの濃度のグアニジン−ＨＣｌを含有する。他の実施形態において、上記再折りたたみ緩衝液は、０．５Ｍの濃度のグアニジン−ＨＣｌを含有する。
いくつかの実施形態において、上記再折りたたみ緩衝液は、２５ｍＭ〜１００ｍＭの濃度のリン酸カリウムを含有する。他の実施形態において、上記再折りたたみ緩衝液は、２５ｍＭ〜７５ｍＭの濃度のリン酸カリウムを含有する。他の実施形態において、上記再折りたたみ緩衝液は、少なくとも５０ｍＭの濃度のリン酸カリウムを含有する。他の実施形態において、上記再折りたたみ緩衝液は、５０ｍＭの濃度のリン酸カリウムを含有する。いくつかの実施形態において、上記再折りたたみ緩衝液は、ｐＨ７．０〜ｐＨ８．０のリン酸カリウムを含有する。他の実施形態において、上記再折りたたみ緩衝液は、ｐＨ７．５〜ｐＨ８．０のリン酸カリウムを含有する。他の実施形態において、上記再折りたたみ緩衝液は、約ｐＨ７．８のリン酸カリウムを含有する。
上記折りたたみ緩衝液は、必要に応じて、以下の成分：（ｉ）５０ｍＭの濃度のｐＨ７．８のリン酸カリウム、（ｉｉ）０．５Ｍの濃度のグアニジン−ＨＣｌ、（ｉｉｉ）０．３５Ｍの濃度のＬ−アルギニン、（ｉｖ）０．１％の濃度のＴｗｅｅｎ−８０、（ｖ）１ｍＭの濃度の酸化グルタチオン、および（ｖｉ）０．２ｍＭの濃度の還元グルタチオンを含有してもよく、またはこれらの成分から構成されてもよい。
いくつかの実施形態において、上記折りたたみ緩衝液は、（ｉ）５０ｍＭの濃度のｐＨ７．８のリン酸カリウム、（ｉｉ）０．５Ｍの濃度のグアニジン−ＨＣｌ、（ｉｉｉ）０．３５Ｍの濃度のＬ−アルギニン、（ｉｖ）０．１％の濃度のＴｗｅｅｎ−８０、（ｖ）１ｍＭの濃度の酸化グルタチオン、および（ｖｉ）０．２ｍＭの濃度の還元グルタチオンから構成されない。
いくつかの実施形態において、上記再折りたたみ緩衝液は、尿素および／またはグリシンを含有しない。
他の局面において、本発明の特徴は、１〜１０の係数で希釈される場合に、ニューブラスチンポリペプチドの折りたたみを誘導するために有効な量の再折りたたみ緩衝液を含有する組成物であって、上記再折りたたみ緩衝液は、以下の成分：（ｉ）２５ｍＭ〜１５０ｍＭの濃度のｐＨ５．８〜ｐＨ８．０の範囲のｐＨを有するリン酸カリウムもしくはリン酸ナトリウム；（ｉｉ）０．３Ｍ〜２Ｍの濃度のグアニジン−ＨＣｌ；（ｉｉｉ）０．２５Ｍ〜１Ｍの濃度のＬ−アルギニン；（ｉｖ）０．０５％〜１％の濃度のＴｗｅｅｎ−８０；ならびに（ｖ）１ｍＭ〜４ｍＭの濃度の酸化グルタチオンおよび０．０５ｍＭ〜０．８ｍＭの濃度の還元グルタチオンであって、ここで、酸化グルタチオン：還元グルタチオンの比が、５：１〜２０：１である酸化グルタチオンおよび還元グルタチオン、を、上記濃度の１〜１０倍の濃度で含有する。このような組成物は、必要に応じて、折りたたみ反応の開始前に他の成分によって希釈される、ストック溶液として使用され得る。
いくつかの実施形態において、上記再折りたたみ緩衝液は、０．３０Ｍ〜０．５Ｍの濃度の１〜１０倍でＬ−アルギニンを含有する。他の実施形態において、上記再折りたたみ緩衝液は、少なくとも０．３０Ｍの濃度の１〜１０倍でＬ−アルギニンを含有する。他の実施形態において、上記再折りたたみ緩衝液は、少なくとも０．３５Ｍの濃度の１〜１０倍でＬ−アルギニンを含有する。他の実施形態において、上記再折りたたみ緩衝液は、０．３５Ｍの濃度の１〜１０倍でＬ−アルギニンを含有する。
いくつかの実施形態において、上記再折りたたみ緩衝液は、０．１％〜１％の濃度の１〜１０倍でＴｗｅｅｎ−８０を含有する。他の実施形態において、上記再折りたたみ緩衝液は、０．１％〜０．５％の濃度の１〜１０倍でＴｗｅｅｎ−８０を含有する。他の実施形態において、上記再折りたたみ緩衝液は、少なくとも０．１％の濃度の１〜１０倍でＴｗｅｅｎ−８０を含有する。他の実施形態において、上記再折りたたみ緩衝液は、０．１％の濃度の１〜１０倍でＴｗｅｅｎ−８０を含有する。
いくつかの実施形態において、上記再折りたたみ緩衝液は、５：１〜１０：１の比の酸化グルタチオンおよび還元グルタチオンを含有する。他の実施形態において、上記再折りたたみ緩衝液は、５：１の比の酸化グルタチオンおよび還元グルタチオンを含有する。いくつかの実施形態において、上記再折りたたみ緩衝液は、１ｍＭ〜２ｍＭの濃度の１〜１０倍で酸化グルタチオンを含有する。他の実施形態において、上記再折りたたみ緩衝液は、１ｍＭの濃度の１〜１０倍で酸化グルタチオンを含有する。
いくつかの実施形態において、上記再折りたたみ緩衝液は、０．５Ｍ〜１．０Ｍの濃度の１〜１０倍でグアニジン−ＨＣｌを含有する。他の実施形態において、上記再折りたたみ緩衝液は、少なくとも０．５Ｍの濃度の１〜１０倍でグアニジン−ＨＣｌを含有する。他の実施形態において、上記再折りたたみ緩衝液は、０．５Ｍの濃度の１〜１０倍でグアニジン−ＨＣｌを含有する。
いくつかの実施形態において、上記再折りたたみ緩衝液は、２５ｍＭ〜１００ｍＭの濃度の１〜１０倍でリン酸カリウムを含有する。他の実施形態において、上記再折りたたみ緩衝液は、２５ｍＭ〜７５ｍＭの濃度の１〜１０倍でリン酸カリウムを含有する。他の実施形態において、上記再折りたたみ緩衝液は、少なくとも５０ｍＭの濃度の１〜１０倍でリン酸カリウムを含有する。他の実施形態において、上記再折りたたみ緩衝液は、５０ｍＭの濃度の１〜１０倍でリン酸カリウムを含有する。いくつかの実施形態において、上記再折りたたみ緩衝液は、ｐＨ７．０〜ｐＨ８．０のリン酸カリウムを含有する。他の実施形態において、上記再折りたたみ緩衝液は、ｐＨ７．５〜ｐＨ８．０のリン酸カリウムを含有する。他の実施形態において、上記再折りたたみ緩衝液は、約ｐＨ７．８のリン酸カリウムを含有する。
上記再折りたたみ緩衝液は、必要に応じて、以下の成分：（ｉ）５０ｍＭの濃度のｐＨ７．８のリン酸カリウム；（ｉｉ）０．５Ｍの濃度のグアニジン−ＨＣｌ；（ｉｉｉ）０．３５Ｍの濃度のＬ−アルギニン；（ｉｖ）０．１％の濃度のＴｗｅｅｎ−８０；（ｖ）１ｍＭの濃度の酸化グルタチオン；および（ｖｉ）０．２ｍＭの濃度の還元グルタチオンを、上記濃度の１〜１０倍の濃度で含有してもよく、または上記濃度の１〜１０倍の上記成分で構成されてもよい。
いくつかの実施形態において、上記再折りたたみ緩衝液は、（ｉ）５０ｍＭの濃度のｐＨ７．８のリン酸カリウム、（ｉｉ）０．５Ｍの濃度のグアニジン−ＨＣｌ、（ｉｉｉ）０．３５Ｍの濃度のＬ−アルギニン、（ｉｖ）０．１％の濃度のＴｗｅｅｎ−８０、（ｖ）１ｍＭの濃度の酸化グルタチオンおよび（ｖｉ）０．２ｍＭの濃度の還元グルタチオンから構成されない。
いくつかの実施形態において、上記再折りたたみ緩衝液は、尿素および／またはグリシンを含有しない。
本明細書中に記載される組成物および方法は、適切に再折りたたみされた大量のＴＧＦβスーパーファミリータンパク質（例えば、ニューブラスチン）の再折りたたみおよび精製を、適切に折りたたみされた生物学的に活性な産物を生じない宿主（例えば、細菌）中でこのタンパク質が産生される環境において、可能にするという点で有利である。
他に規定されない限り、本明細書中で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって通常理解されている意味と同一の意味を有する。本明細書中に記載される方法および材料と同等であるかもしくは均等である方法および材料が、本発明の実施もしくは試験において使用され得るが、例示的な方法および材料が、以下に記載される。本明細書中で言及される全ての刊行物、特許出願、特許および他の参考文献は、その全体が参考として援用される。矛盾する場合、定義を含めて本出願が支配する。材料、方法および実施例は、例示に過ぎず、限定を意味しない。
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかになる。
（詳細な説明）
本発明は、ＴＧＦβスーパーファミリーに属する変性ポリペプチドの折りたたみの誘導のための組成物および方法を提供する。特定の組成物を変性ニューブラスチン（ＴＧＦβスーパーファミリーおよびＧＤＮＦサブファミリーのメンバーである）の折りたたみを誘導するための特定の組成物の適用は、添付の実施例において記載される。ニューブラスチンは、ＴＧＦβスーパーファミリーおよびＧＤＮＦサブファミリーに共通するシステイン節構造を有するので、本明細書中に記載される再折りたたみ緩衝液は、ＴＧＦβスーパーファミリーおよびＧＤＮＦサブファミリーに属する他のポリペプチドの折りたたみの誘導において有効であることが予測される。
（ニューブラスチン）
天然のヒトプレプロニューブラスチンポリペプチドは、２２０個のアミノ酸の長さであり、以下の配列を有する：
Figure 0004959566
 ヒトニューブラスチンシグナルペプチドは、１位のメチオニン（下線）で始まり、そして３９位のアラニン（下線）で終わる。ヒトニューブラスチンの全長プロドメインは、４０位のセリン（下線）で始まり、そして１０７位のアルギニン（下線）で終わる。成熟型ヒトニューブラスチンポリペプチドは、カルボキシ末端の１１３個のアミノ酸から構成され、１０８位のアラニンで始まり、２２０位のグリシンで終わる。本明細書中で記載される組成物および方法は、変性ニューブラスチンタンパク質（全長ニューブラスチン、成熟型ニューブラスチン（シグナルペプチドおよびプロドメインを欠く）、または成熟型ニューブラスチンの生物学的に活性な短縮形態もしくは改変体が挙げられる）の有効な折りたたみを提供する。
本明細書中に記載の方法に従って折りたたまれたニューブラスチンタンパク質は、長さにおいて変動し得る。成熟型ヒトニューブラスチンポリペプチドは、プレプロニューブラスチンのカルボキシ末端の１１３個のアミノ酸から構成され得るが、有用なニューブラスチン生物学的活性を達成するために、この１１３個のアミノ酸の全てが必要なわけではない。アミノ末端短縮（ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ）は、許容され得る。したがって、ニューブラスチンポリペプチドは、天然のヒトニューブラスチンのカルボキシ末端の９９〜１１３個のアミノ酸に対応し得る（すなわち、その長さは、９９個、１００個、１０１個、１０２個、１０３個、１０４個、１０５個、１０６個、１０７個、１０８個、１０９個、１１０個、１１１個、１１２個、もしくは１１３個のアミノ酸であり得る）。ニューブラスチンのカルボキシ末端の１０４個および１１３個のアミノ酸から構成されるニューブラスチンポリペプチドは、以下の実施例において例示される。
長さにおける変動に加えて、このニューブラスチンポリペプチドは、配列において変動し得る。特に、特定のアミノ酸置換が、本明細書中に記載されるニューブラスチンの生物学的活性の認め得る（ａｐｐｒｅｃｉａｂｌｅ）喪失を伴わずに、ニューブラスチン配列内に導入され得る。例示的な実施形態において、ポリペプチドは、配列番号１に対して少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％同一であり得る（または配列番号１のアミノ酸１０８〜２２０に対して７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％同一であり得る）。配列番号１（もしくは配列番号１のアミノ酸１０８〜２２０）に記載された配列と配列において異なっている改変体ニューブラスチンポリペプチドは、１個以上の保存的アミノ酸置換、１個以上の非保存的アミノ酸置換、および／または欠失もしくは挿入を含み得る。いくつかの実施形態において、改変体ニューブラスチンポリペプチドは、配列番号１（もしくは配列番号１のアミノ酸１０８〜２２０）と比較して少なくとも１個のアミノ酸置換を含み、このアミノ酸置換は、ポリマーが結合し得る内部ポリマー結合部位（例えば、ポリエチレングリコール部分のようなポリアルキレングリコール部分）を提供する（例として、ニューブラスチン改変体が、ＷＯ０２／０６０９２９に記載され、その内容は、本明細書中で参考として援用される）。いくつかの実施形態において、改変体ニューブラスチンポリペプチドは、配列番号１（もしくは配列番号１のアミノ酸１０８〜２２０）と比較して少なくとも１個のアミノ酸置換（例えば、非保存的置換）を含み、このアミノ酸置換は、ヘパリン結合を減少させる（例えば、Ｒ１５５Ｅ、Ｒ１５６Ｅ、Ｒ１５８Ｅ、もしくはＲ１５５、１５６Ｅ、または成熟型ニューブラスチンポリペプチドの対応する位置における１つ以上のこれらの置換）。
保存的置換は、代表的に、１つのアミノ酸と、類似の特性を有する別のアミノ酸との置換を含み、例えば、以下の群の中での置換である：バリン、アラニンおよびグリシン；ロイシン、バリン、およびイソロイシン；アスパラギン酸およびグルタミン酸；アスパラギンおよびグルタミン；セリン、システイン、およびトレオニン；リジンおよびアルギニン；ならびにフェニルアラニンおよびチロシン。非極性疎水性アミノ酸としては、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニンが挙げられる。極性中性アミノ酸としては、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギンおよびグルタミンが挙げられる。正に荷電した（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、リジンおよびヒスチジンが挙げられる。負に荷電した（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられる。上述の極性の群、塩基性の群および酸性の群のメンバーの１つの、同じ群の別のメンバーによる置換は、保存的置換であると判断され得る。
本明細書中に記載される方法において使用されるポリペプチドは、ニューブラスチンタンパク質に加えて、異種のアミノ酸配列を含み得る。本明細書中でアミノ酸配列についていうために使用される場合、「異種」は、特定の宿主細胞に対して異種である供給源に由来する配列、または同じ宿主に由来する場合はその元の形態から改変されている配列を意味する。異種配列の例としては、異種シグナル配列（例えば、天然のラットアルブミンシグナル配列、改変ラットシグナル配列、またはヒト成長ホルモンシグナル配列）またはニューブラスチンタンパク質の精製のために使用される配列（例えば、ヒスチジンタグ）が挙げられる。
（ニューブラスチン活性）
本明細書中で記載される方法において使用されるニューブラスチンポリペプチドは、天然のニューブラスチンの生物学的活性の少なくとも１つを示す。生物学的に活性なニューブラスチンポリペプチドは、二量体化の際に、ＧＦＲα３と共にＲＥＴに結合し得、そしてＲＥＴ二量体化および自己リン酸化を誘導し得るポリペプチドである（例えば、Ｓａｎｉｃｏｌａら，１９９７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９４：６２３８を参照）。レセプター結合およびレセプター自己リン酸化を決定する任意の方法が、ニューブラスチンポリペプチドの生物学的活性を評価するために使用され得る。例えば、実施例３において記載されるＫＩＲＡアッセイが、ニューブラスチン生物学的活性を評価するために使用され得る（また、Ｓａｄｉｃｋら，１９９６，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２３５（２）：２０７を参照のこと）。
（再折りたたみ緩衝液）
一般に、本明細書中に記載される方法において使用される再折りたたみ緩衝液は、以下の成分を含有する： （ｉ）２５ｍＭ〜１５０ｍＭの濃度のリン酸カリウム；（ｉｉ）０．３Ｍ〜２Ｍの濃度のグアニジン−ＨＣｌ；（ｉｉｉ）０．２５Ｍ〜１Ｍの濃度のＬ−アルギニン；（ｉｖ）０．０５％〜１％の濃度のＴｗｅｅｎ−８０；ならびに（ｖ）１ｍＭ〜４ｍＭの濃度の酸化グルタチオンおよび０．０５ｍＭ〜０．８ｍＭの濃度の還元グルタチオンであって、ここで、酸化グルタチオン：還元グルタチオンの比が、５：１〜２０：１である酸化グルタチオンおよび還元グルタチオン。
いくつかの実施形態において、２５ｍＭ〜１５０ｍＭの濃度のリン酸ナトリウムが、リン酸カリウムの代わりに使用され得る。これらの方法において使用されるリン酸ナトリウムもしくはリン酸カリウムのｐＨは、一般に、ｐＨ５．８〜ｐＨ８．０の範囲内である。さらに、いくつかの実施形態において、Ｔｗｅｅｎ−２０もしくはＮＰ４０のような界面活性剤が、０．０５％〜１％の濃度のＴｗｅｅｎ−８０の代わりに使用され得る。
変性ポリペプチドの折りたたみの誘導に対する特定の再折りたたみ緩衝液の有効性は、特定の緩衝液中での変性ポリペプチドのインキュベーション後に、吸光度（ＰＤ３２０）を測定することによって評価され得る（実施例１および図２を参照）。このようなアッセイにおいて検出される吸光度は、沈殿した、不適切に折りたたまれたタンパク質の存在を示す。添付の実施例における実施例２において示されるように、低い吸光度の読み取りは、この緩衝液が、変性ポリペプチドの折りたたみの誘導において有効であることを示す。折りたたまれたポリペプチドの生物学的活性もまた、本明細書中で記載されるインビトロ生物学的アッセイおよび／またはインビボ生物学的アッセイによって測定され得る。
以下は、本発明の実施例である。これらは、決して本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
（実施例１：ニューブラスチン再折りたたみ緩衝液の同定）
組換えニューブラスチンを、１０ヒスチジンタグ標識化（ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ−ｔａｇｇｅｄ）融合タンパク質（図１）として、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて、Ｔ７プロモーターの制御下で発現させた。ヒトおよびラットの１１３個アミノ酸形態および１０４個アミノ酸形態の両方とも、そのそれぞれの構築物（図１）に由来し、そして、本明細書中に記載される方法によってこれらを再折りたたみし、そして精製した。１１３個アミノ酸形態および１０４個アミノ酸形態の開始点を、図１において下線および太字で示す。
Ｅ．ｃｏｌｉ中で発現される際、ニューブラスチンは、封入体（ＩＢ）内に不溶性タンパク質として含まれる。したがって、可溶性かつ生物活性な産物を得るために、ニューブラスチンをＩＢから単離しそして再折りたたみしなければならない。ニューブラスチンを発現するＥ．ｃｏｌｉをＰＢＳ中でＧａｕｌｉｎ ｐｒｅｓｓを用いて溶菌し、その後遠心分離することにより、封入体を得た。他に記載しない限り、全ての遠心分離を４℃で実施し、他の全ての工程を室温で実施した。適切に再折りたたみされたニューブラスチンの最大可能収量を得るために、細胞屑を含まないＩＢペレットを用いて開始することが有利である。これを達成するために、ＩＢペレットを秤量し、そしてＩＢ洗浄緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．５）および０．５Ｍ ＥＤＴＡ；タンパク質１ｇあたり８ｍｌ）中でさらなる洗浄に供した。ＩＢペレットを、１５，０００×ｇで２０分間の遠心分離によって収集し、濁った上清を捨て、そして夾雑する脂質の除去を補助するために２％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ １００を含む同じ緩衝液（タンパク質１ｇあたり８ｍｌ）で再び洗浄した。界面活性剤を含有しない洗浄緩衝液（タンパク質１ｇあたり８ｍｌ）を用いて最終洗浄を実施してＴｗｅｅｎ−８０を除去し、そして上清を再び捨てた。
新しく作製した可溶化緩衝液（６Ｍ グアニジン−ＨＣｌ、０．０５Ｍ リン酸カリウム（ｐＨ７．８）、０．１Ｍ ＤＴＴ、および１．０ｍＭ ＥＤＴＡ）をペレットに加え、そしてポリトロンミキサーを用いてよく混合した。完全な可溶化を確実にするため、この混合物を、室温で一晩撹拌した。翌日、この溶液を１０，０００ｒｐｍで２０分間の遠心分離によって清澄化した。この上清を、新しい容器にデカントし、そして残った不溶性ペレットを秤量して、回収率の推定を可能にした。このプロセスによっては、全てのタンパク質が可溶化したわけではなかった。この時点で、標準的Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイを、コントロールとしての可溶化状態のＢＳＡと共に用いて、可溶性タンパク質を定量した。
どの特定の緩衝液条件が高収量の適切に折りたたまれたニューブラスチンをもたらし得るかを決定するために、９６ウェルプレート中に潜在的な再折りたたみ緩衝液のアレイを調製した（表１を参照のこと）。
（表１：９６ウェルプレート再折りたたみ緩衝液マップ）
Figure 0004959566
 表１に示されるように、グアニジンＨＣｌ（０．５Ｍ）、還元グルタチオン（０．２ｍＭ）およびリン酸カリウム（ｐＨ７．８；５０ｍＭ）を、プレート全体を通して一定に保ち、一方で、Ｌ−アルギニン、酸化グルタチオンおよびＴｗｅｅｎ−８０の濃度を変えた。Ｌ−アルギニンを、０．１５Ｍから０．３５Ｍまで変動させ（同様に０．８ＭまでのＬ−アルギニンの添加を行う）、一方で酸化グルタチオンを、１ｍＭから４ｍＭまで変動させた。さらに、Ｔｗｅｅｎ−８０を、０％から１％まで変動させた。いくつかの場合、グリシンは、再折りたたみの間Ｌ−アルギニンと置換され得るので、Ｌ−アルギニンを除いて同一である全ての緩衝液成分（２５ｍＭ〜１００ｍＭの範囲のグリシンで置換されている）を入れた別個のプレートを調製した。
各ウェルの中の緩衝液の最終容量は、２８０μｌであった（還元グルタチオンを、ストック溶液から新しく加えた）。次いで、２０μｌの可溶化ニューブラスチンを、０．１ｍｇ／ｍｌの最終濃度で各ウェルに加えた。吸光度を、４８時間にわたってモニタリングした。何らかの検出した吸光度は、沈殿の存在および適切に再折りたたみされなかったタンパク質の存在を示した。
沈殿の最大の出現は、０．１５ＭのＬ−アルギニンを含有するウェルで観察され、一方、最少量の沈殿は、０．３５ＭのＬ−アルギニンを含有するウェルで観察された（図２）。０．３５ＭのＬ−アルギニンを含有するウェルのうち、全体的な最良の結果は、０．１％のＴｗｅｅｎ−８０を含有するウェルで観察された。最もよい再折りたたみは、酸化グルタチオン対還元グルタチオンの比が２０：１である場合に観察された（しかし、５：１の比を、本明細書中に記載されるさらなる（再折りたたみ緩衝液中で必要とされる酸化グルタチオンの量を減少させるための）実験のために選択した）。これらの基準に基づき、以下の実施例において示す再折りたたみ緩衝液系を使用した。これらの系は、高収量かつ適切に再折りたたみされたニューブラスチンを提供した。全ての緩衝液条件下で、Ｌ−アルギニンのグリシンによる置き換えは、ニューブラスチン沈殿を生じた。
（実施例２：ニューブラスチンの再折りたたみおよび精製）
実施例１に記載される緩衝液分析の結果を適用して、本実施例および以下の実施例において使用した以下の再折りたたみ緩衝液を調製した：０．５Ｍ グアニジン−ＨＣｌ、０．３５Ｍ Ｌ−アルギニン、５０ｍＭ リン酸カリウム（ｐＨ７．８）、０．２ｍＭ 還元グルタチオン、１ｍＭ 酸化グルタチオン、および０．１％ Ｔｗｅｅｎ−８０。再折りたたみ緩衝液を、新しく作製した。可溶化したタンパク質を、０．０５〜０．５ｍｇ／ｍｌの最終タンパク質濃度で、迅速に再折りたたみ緩衝液中に希釈した。平均で、０．１ｍｇ／ｍｌの可溶化ニューブラスチンを使用した。この混合物を、室温で、少なくとも４８時間インキュベートした。撹拌は必要なかった。
（Ｎｉ−ＩＭＡＣクロマトグラフィーを使用した宿主細胞夾雑物除去）
Ｌ−アルギニンを、０．３５Ｍから０．１７５Ｍまで希釈し、ＮｉがＩＭＡＣ樹脂に浸出するのを避けた。これは、以下の方法のいずれかを使用して実施され得る。アルギニンを、０．５Ｍ グアニジン−ＨＣｌを用いて適切な濃度まで直接希釈し得る。単独での水の使用はしなかった。なぜなら、グアニジン濃度が維持されない場合、ニューブラスチンが沈殿し得（グアニジン−ＨＣｌは、以下で記載するカチオン性クロマトグラフィー工程まで緩衝液中で維持されなければならない）、回収産物の大部分の喪失をもたらし得るからである。Ｌ−アルギニンの直接希釈は、作業容量を実質的に増大し、および必要とされるグアニジンの量を増大するので、タンパク質を、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ接線フローＰｅｌｌｉｃｏｎユニットを用いて、元の量の１／２０に濃縮した。濃縮後、０．５Ｍのグアニジンを用いて、Ｌ−アルギニンを、０．１７５Ｍまで希釈した。
Ｌ−アルギニン希釈溶液を、カラム洗浄緩衝液（４０ｍＭ イミダゾールおよび０．５Ｍ グアニジンＨＣｌ）で事前に平衡化したＮｉ−ＮＴＡ ＩＭＡＣカラムに、５０〜１００ｍｌ／分の流速で適用した。ニューブラスチンは、ヒスチジンタグを介してＮｉ−ＮＴＡマトリックスに結合した。フロースルー液中に産物は観察されなかった。５カラム容量の洗浄緩衝液での洗浄後、ニューブラスチンを、０．５Ｍ グアニジン中０．２Ｍ イミダゾールを用いて溶出した。カラム洗浄緩衝液（ニューブラスチン非含有）を捨てた。タンパク質回収を、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイを使用してモニタリングした。さらに、宿主細胞夾雑物を、この時点からモニタリングした。
（プロテアーゼ消化によるニューブラスチンからのヒスチジンタグ分離）
必要なニューブラスチンの長さ（１１３個のアミノ酸または１０４個のアミノ酸）に依存して、２つの可能なヒスチジンタグ除去手順のうちの１つを行った。
野生型の１１３個のアミノ酸のニューブラスチン産物を作製するために、Ｅｎｄｏ Ｌｙｓ Ｃを使用して、タグ中に含まれるリジン残基のＣ末端を切断した。ニューブラスチン１ｇあたり５ユニットのＥｎｄｏ Ｌｙｓ Ｃ（ＷＡＫＯ，カタログ番号１２９−０２５４１）を、Ｎｉ−ＮＴＡ溶出物からの物質に添加した。緩衝液置換もしくはｐＨ調整は必要なかった（いくつかの場合、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．８）を用いた緩衝液置換を使用し、この置換は効率的に作用した）。ニューブラスチンおよびプロテアーゼを、一晩室温で撹拌し続けながらインキュベートした。
ニューブラスチンの１０４個のアミノ酸の形態を作製するため、ヒスチジンタグ標識化産物を、トリプシン（Ｃｏｏｐｅｒ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ ＃３７４０）を１：２０００のトリプシン対ニューブラスチンの比で用いて処理した。やはり、緩衝液置換もしくはｐＨ調整は必要なかった。この混合物を、一晩室温で撹拌し続けながらインキュベートした。
Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂を、洗浄緩衝液（０．５Ｍ グアニジン−ＨＣｌおよび０．０４Ｍ イミダゾール）で平衡化した。ニューブラスチン調製物内のイミダゾール濃度を、０．５Ｍ グアニジン−ＨＣｌを用いて０．０４Ｍ〜０．２Ｍに調整した後、この物質を、Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂に、５０〜１００ｍｌ／分の流速で適用した。タグ標識化されていないニューブラスチンを含有するカラムフロースルー液を、収集し、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイを用いてニューブラスチンについてモニタリングした。Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂を再生するため、ヒスチジンタグを、０．５Ｍ グアニジンＨＣｌ中０．２Ｍ イミダゾールを用いて溶出した。この物質を、樹脂フロースルー液とともにＳＤＳ／ＰＡＧＥに供し、プロテアーゼ消化の有効性を確立した。
前の工程からのＮｉ−ＮＴＡフロースルー液を、ｄｄＨ２Ｏの添加によって０．３５Ｍ グアニジン−ＨＣｌに調整した。より高い濃度のグアニジンは、ニューブラスチンがカチオン性マトリックスに結合するのを妨げ得る。Ｃ−１００フィルター結合カートリッジ（Ｓａｒｔｏｒｉｏｕｓ，カタログ番号Ｃ１００Ｘ）を、Ｃ−１００洗浄緩衝液（５ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ６．５）および０．３５Ｍ ＮａＣｌ）で平衡化した。
ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａｒｍａｃｉａ）は、Ｃ−１００膜フィルターと置き換わり得る。しかし、Ｃ−１００の表面積は古典的カラムクロマトグラフィーと比較して大きいので、Ｃ−１００を選択した。ニューブラスチンをＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ上で精製する場合、ニューブラスチンの局所的凝集は、より大きなカラム直径の選択および／またはタンパク質負荷の低減によって防止し得る。このことは、ニューブラスチンの高い局所的濃縮を防止する。ニューブラスチンの高い局所的濃縮は、特にリン酸ナトリウム緩衝液を用いる場合に、四量体形成および産物沈殿に寄与し得る。
０．３５Ｍ グアニジン−ＨＣｌ中のニューブラスチンを、５０〜１００ｍｌ／分の流速でＣ−１００フィルターに適用し、その後、Ｃ−１００洗浄緩衝液を用いてフィルターの広範囲な洗浄を行った。この工程は、いかなる残留するヒスチジンタグ、内毒素、およびニューブラスチン単量体をも除去する。ニューブラスチン二量体を、５ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ６．５）および１Ｍ 塩化ナトリウムを用いてＣ−１００マトリックスからタンパク質を溶出することによって回収した。この溶出を、２８０ｎｍにおけるＵＶ吸収によってモニタリングし、そしてニューブラスチンピークを、１つの容器に収集した。
（ニューブラスチン濃縮および緩衝液置換）
ニューブラスチンを、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｂｉｏｍａｘ−１０接線フロー濾過によって濃縮し、そして同じユニットを５ダイアフィルトレーション容量の５ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ６．５）および０．１５Ｍ 塩化ナトリウムに対してダイアフィルトレーションした。最終タンパク質濃度を１．０〜１．５ｍｇ／ｍｌにすることを目的とし、２．０ｍｇ／ｍｌを超える濃度を許容しないように努力した。さもなければ、この処方物中でニューブラスチンが沈殿し始めて、大量のタンパク質を失い得る。一旦、産物を１．０ｍｇ／ｍｌまで濃縮し、そして５ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ６．５）および０．１５Ｍ 塩化ナトリウム中に処方してから、ニューブラスチンを便利な大きさに等分し、そして必要なときまで−７０℃で保存した。
（実施例３：ニューブラスチンの分析的性質決定）
実施例２で記載した精製したニューブラスチンを、種々の分析用試験に供して、純度、一次アミノ酸配列、生物活性、およびジスルフィド構造完全性を検証した。
（純度および分子量のＳＤＳ／ＰＡＧＥ推定）
ニューブラスチン再折りたたみ／精製工程の各々から得たサンプルを、非還元条件下で、４〜２０％アクリルアミドゲルを通したＳＤＳ／ＰＡＧＥ分析に供した。ニューブラスチン最終産物は、２４，０００Ｄａの還元可能な二量体として移動し、９８％を超える純度と推定された。
（再折りたたみラットニューブラスチンの質量分析）
再折りたたみされた産物の純度を推定し、そして質量を決定するために、ニューブラスチンを、ＺＭＤ質量分析計上で質量分析に供した。ニューブラスチンを、８Ｍ尿素中で変性させ、そしてＤＴＴで処理して、全てのジスルフィド結合を還元し、そして二量体を単量体に変換してから、分析した。同定された主要なシグナルは、１０〜１１３個のラットニューブラスチン残基を表し、予測通り、これが調製物中の主要な種であることが示唆される。しかし、１０９９１Ｄａにおける主要なシグナルを同定し、これがロイシン欠失に対応すると予測した。そして１１０７６Ｄａにおけるシグナルを、少量のアルギニンからリジンへの置換であると予測した。低レベルのピークは、酸化、アセトニトリル付加物およびＴＦＡ付加物に対応する。また、ニューブラスチンの少量の１０６アミノ酸形態を同定した。トリプシン関連のピークは同定されなかった。
（ＡｓｐＮペプチドマッピングによるラット１０４アミノ酸ニューブラスチンの性質決定）
ＡｓｐＮペプチドマッピングを、ヒスチジンタグを除去するためのトリプシン消化によって産生したニューブラスチンにおいて実施した。このバッチを、いくつかの他のニューブラスチン調製物（野生型ラット１１３アミノ酸形態、野生型ヒト１１３アミノ酸形態、ヒト１０４アミノ酸形態を含む）と比較した。結果は、このバッチが予測どおり、Ｍｅｔ９２における８％の酸化、Ｌｅｕ６１における５％の欠失、低レベルのＡｒｇからＬｙｓへの突然変異および１％未満のＡｓｎ９５における脱アミドを有することを示した。
（ラット１０４アミノ酸ニューブラスチンのジスルフィド分析）
ジスルフィド分析を、ラット１０４アミノ酸ニューブラスチンにおいて実施した。野生型ラット１１３アミノ酸ニューブラスチンを、参照として平行に分析した。約１５０μＬの再折りたたみされかつ精製されたニューブラスチンを、ジスルフィドマッピングのために使用した。結果は、２つのサンプル中の全てのジスルフィド結合は、同等であることを示し、このことは予測通りであった。ニューブラスチンモノマーのプロフィールは、主要なモノマーのピークのすぐ前に溶出した低レベルのピーク下の面積を除き、参照のプロフィールと類似する。これらの早期溶出ピークは、部分的に、酸化モノマーを含んでいることが予測され、これらのピークは、下流の質量マッピングに含めなかった。ジスルフィド結合したペプチドを含む画分を、プールし、そしてＤＨＢをマトリックスとして用いるＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法によって分析した。このデータは、ＡｓｐＮ／トリプシン消化後のラット１０４アミノ酸ニューブラスチンは、予測通りであり、ジスルフィド結合性の混在の証拠はないことを示した。
（キナーゼレセプター活性化酵素結合免疫イムノソルベント（ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂａｎｔ）を用いるニューブラスチン活性のアッセイ）
ニューブラスチン活性を、ＮＢ４１Ａ３−ｍＲＬ３細胞においてｃ−Ｒｅｔリン酸化を刺激するその能力によって決定した。ＮＢ４１Ａ３−ｍＲＬ３細胞は、ＲｅｔおよびＧＦＲａ３を発現する接着性マウス神経芽腫細胞株である。ＮＢ４１Ａ３−ｍＲＬ３細胞を、１０％ ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ中に、２４ウェルプレート中に１ウェルあたり２×１０５細胞でプレート培養し、そして３７℃および５％ ＣＯ２で１８時間培養した。培地の除去および１ウェルあたり１ｍｌのＰＢＳでの細胞の洗浄後、細胞を、１１３アミノ酸ニューブラスチンもしくは１０４アミノ酸ニューブラスチンのいずれかを含有するＤＭＥＭで、３７℃および５％ ＣＯ２で１０分間刺激した。ニューブラスチン活性を停止するために、培地を除去し、そして細胞をＰＢＳで直ちに洗浄して、その後、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、０．５％ ＮＰ４０、０．２％ ＤＯＣ、５０ｍＭ ＮａＦ、０．１ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４、および１ｍＭ ＰＭＳＦで溶解させた。４℃で１時間のインキュベーション後、溶解物を、反復的なピペッティングにより撹拌し、そして抗ＲＥＴ ｍＡｂ（ＡＡ．ＧＥ７．３）でコーティングした９６ウェルＥＬＩＳＡプレートに（１ウェルあたり０．２５ｍｌで）移した。このウェルを、ブロッキング緩衝液（１％ 正常マウス血清および３％ ＢＳＡを含有するＴＢＳＴ）により室温で１時間ブロッキングし、その後、ＴＢＳＴのみで６回洗浄した。リン酸化ＲＥＴを、捕獲したレセプターをＨＲＰ−結合体化ホスホチロシン抗体（４Ｇ１０；１ウェルあたり０．２μｇ）と共に（２時間）インキュベーションすることによって検出した。インキュベーション後、ウェルを、ＴＢＳＴで６回洗浄し、そしてＨＲＰ活性を、４５０ｎｍで比色定量アッセイにより検出した。溶解物もしくは溶解緩衝液のみで処理したウェルからの吸光度の値を測定し、バックグラウンド補正し、そしてデータを活性混合物中に存在するニューブラスチンの濃度の関数としてプロットした。ラット１０４アミノ酸ニューブラスチンは、１１３アミノ酸ニューブラスチンのポジティブコントロールと同等に、ＫＩＲＡアッセイにおいて活性であった。このことは、再折りたたみ／精製プロセスが、生物学的に活性な産物を生じることを示す。
（内毒素アッセイ）
Ｌｉｍｕｌｕｓ Ａｍｅｂｏｃｙｔｅ Ｌｙｓａｔｅアッセイおよび製造業者推奨条件（Ｂｉｏ＊Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ）を用い、各々の精製工程における内毒素レベルを検出した。内毒素のほとんど大部分は、最初のＮｉ−ＮＴＡ洗浄工程の間に除去されている。トリプシンの添加後、内毒素レベルがわずかに上がったことを観察した。このことは、おそらく、使用したトリプシン調製物中の内毒素に起因する。大量の洗浄緩衝液によるＣ１００カラムの洗浄は、残留する内毒素を除去するために有用であると考えられる。最終産物中の内毒素レベルは、最大受容可能レベルより十分に下であった。
（宿主細胞タンパク質アッセイ）
Ｃｙｇｎｕｓ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからのＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞タンパク質アッセイキットおよび製造業者推奨条件を使用し、宿主細胞タンパク質夾雑を、精製工程の各々においてモニタリングした。このキットは、ＥＬＩＳＡベースのアッセイであり、これは、宿主細胞タンパク質に対して１ｎｇ／ｍｌまでの感度を有する。上の内毒素の結果と同様に、宿主タンパク質排除（ｃｌｅａｒａｎｃｅ）のほとんどは、最初のＮｉ−ＮＴＡクロマトグラフィーの間およびＣ１００洗浄の間に起こった。宿主細胞タンパク質を、最終産物の０．０００１％未満であると決定した。
（トリプシン排除アッセイ）
トリプシン排除を、Ｎ−Ｔ−ＢＯＣ−ＧＬＮ−ＡＬＡ−ＡＲＧ ７−アミド−４−メチルクマリンＨＣｌを基質として用いる蛍光ベースのアッセイ（これは、４０ｎｇ／ｍｌ未満までの感度を有する）を用いてモニタリングした。添加したトリプシンの全てではなくともほとんどが、Ｃ１００フロースルー洗浄によって除去された。最終産物中に残留するトリプシンの量は、０．００４％未満（感度レベル未満）であった。
（ヒスチジンタグ検出ＥＬＩＳＡ）
抗ポリヒスチジン抗体を用いるヒスチジンタグＥＬＩＳＡを、最終調製物中に残留するヒスチジンタグ標識化ニューブラスチンをモニタリングするために展開した。予測した通り、ヒスチジンタグの大部分を、最初のＮｉ−ＮＴＡ前の物質中で見出し、そしてはＮｉ−ＮＴＡフロースルー中には存在しなかった。このことは、ヒスチジンタグ標識化ニューブラスチンの大部分が、Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂に結合したことを示す。この物質を０．２Ｍ イミダゾール溶出により、樹脂から溶出した。このアッセイの感度は、約０．３μｇ／ｍｌであり、そして最終産物中で同定したヒスチジンタグ標識化ニューブラスチンの最終量を、タンパク質全体の０．１２％、すなわち０．８８ｍｇであると決定した。
（宿主細胞ＤＮＡ検出アッセイ）
宿主細胞ＤＮＡの排除を、ＥＬＩＳＡベースのサンドイッチアッセイにおいてアビジンに結合した一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質を使用するアッセイを用いて、モニタリングした。このアッセイは、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡの約２００ｐｇ／ｍｌまでの感度を示した。一本鎖ＤＮＡ結合アッセイに基づき、最終ニューブラスチン調製物が、０．０００１％未満の夾雑する宿主細胞ＤＮＡを有することを決定した。上述の他のアッセイと同様に、最初のＮｉ−ＮＴＡクロマトグラフィー工程およびＣ１００洗浄工程は、出発物質中のＤＮＡ不純物の除去において最も効率的であった。
（１０４アミノ酸ニューブラスチンで処置した慢性狭窄損傷（ＣＣＩ）ラット）
ニューブラスチン処置ＣＣＩラットは、ビヒクル処置コントロールと比較して、触覚異痛の軽減を示した。ニューブラスチン処置ＣＣＩラットは、同側の脚にかけたより大きな力に耐え得た。触覚異痛を、ｖｏｎ Ｆｒｅｙ Ｈａｉｒによって上げ下げ法を適用して評価した（Ｃｈａｐｌａｎら，１９９４）。ラットを、７日目、１０日目、１４日目、１７日目および２１日目に、侵害受容閾値の変化について検査した。適用したｖｏｎ Ｆｒｅｙ Ｈａｉｒについて、偽（ｓｈａｍ）（ｎ＝３）は、試験期間の間、異なるグラム閾値を示さなかったが、一方、全てのＣＣＩラットは、その基線の値と比較して、より低い閾値を有した。ニューブラスチン−１０４ １ｍｇ／Ｋｇ処置ラット（ｎ＝８）およびニューブラスチン−１０４ ３ｍｇ／Ｋｇ処置ラット（ｎ＝７）は、ビヒクル処置コントロール（ｎ＝８）と比較して、より高い閾値に耐え得た。ニューブラスチン処置動物によって耐えられた力は、ＣＣＩ実施後１７日目および２１日目において統計的に有意であった（ｐ＜０．０５）。温熱性痛覚過敏は、実施後２１日目に、３ｍｇ／Ｋｇ用量を用いたニューブラスチン処置ＣＣＩラットにおいて低減し、１ｍｇ／Ｋｇ用量を用いたラットよりも高い効力を示した。温熱性痛覚過敏を、Ｈａｒｇｒｅａｖｅｓデバイスを用いて決定し、熱除去潜伏時間を評価した。ラットを、脚下部の除去潜伏時間について、７日目、１０日目、１４日目、１７日目および２１日目に検査した。偽（ｎ＝３）は、試験期間の間、脚下部の除去潜伏時間の変化を示さなかったが、一方、全てのＣＣＩラットは、基線の値と比較して、より短い脚下部の除去潜伏時間を有した。ニューブラスチン−１０４ １ｍｇ／Ｋｇ（ｎ＝８）およびニューブラスチン−１０４ ３ｍｇ／Ｋｇ（ｎ＝７）は、ＣＣＩ誘導後、１４日目、１６日目および２１日目に、ビヒクル処置コントロール（ｎ＝８）と比較して、より長い熱刺激の適用に耐え得た。１０４アミノ酸ニューブラスチン ３ｍｇ／Ｋｇ処置ラットは、１０４アミノ酸ニューブラスチン １ｍｇ／Ｋｇ処置ラットと比較して、実施後２１日目に、有意に高い潜伏時間を示した。ニューブラスチン処置動物による脚除去潜伏時間の長さは、ＣＣＩ実施後１４日目、１７日目および２１日目に統計的に有意であった（ｐ＜０．０５）。
ニューブラスチンで処置したＣＣＩラットは、無能力試験（ｉｎｃａｐａｃｉｔａｎｃｅ ｔｅｓｔ）によって示されたように、慢性狭窄した後脚に対してより多い重量を適用可能であった。無能力を、無能力尺度（ｉｎｃａｐａｃｉｔａｎｃｅ ｍｅｔｅｒ）を用いて決定し、各脚の重量配分を評価した。基線において、ラットは、その脚に同じ重量を分配していたが、損傷後、同側の脚にはより少ない重量を適用した。偽（ｎ＝４）は、試験期間の間、その脚の間の重量分配の変化を示さなかったが、一方、全てのＣＣＩラットは、その基線の値と比較して、ＣＣＩを患う脚に対してより少ない重量を適用した。１０４アミノ酸ニューブラスチン １ｍｇ／Ｋｇ（ｎ＝８）および１０４アミノ酸ニューブラスチン ３ｍｇ／Ｋｇ（ｎ＝７）は、ビヒクル処置コントロール（ｎ＝８）と比較して、より多い重量を同側の脚に適用した。ニューブラスチン処置マウスにおける損傷した脚の無能力は、ＣＣＩ実施後１４日目、１７日目および２１日目において、統計的に有意であった（ｐ＜０．０５）。
冷却異痛試験において、ニューブラスチン処置ＣＣＩラットとビヒクル処置ＣＣＩラットとの間に、統計的に有意な差はなかったが、ニューブラスチン処置ラットは、１０日目においてより短い持続時間を有する傾向があった。冷却異痛を、５分間の試験時間にわたって、４℃で冷やした冷たい銅板を用いて決定した。ラットを、その基線の値と比較した脚除去持続時間の上昇について、７日目、１０日目、１４日目、１７日目および２１日目に、試験した。基線において、冷たさに反応した動物はいなかった。偽（ｎ＝３）は、試験期間の間中、脚除去持続時間の上昇を示さなかったが、一方、両方全てのＣＣＩラットは、その基線の値と比較して、脚除去持続時間上昇を有した。１０４アミノ酸ニューブラスチン １ｍｇ／Ｋｇ（ｎ＝８）および３ｍｇ／Ｋｇ（ｎ＝７）は、ＣＣＩ誘導後の１４日目、１７日目および２１日目において、ビヒクルコントロールと比較してより短い時間にわたって、損傷した脚を上昇させたが、ニューブラスチン処置動物による脚除去の持続時間は、統計的に有意ではなかった。
（他の実施形態）
本発明は、その詳細な説明に関連して記載されているが、上記の記載は、例示を目的とし、添付の特許請求の範囲によって規定される本発明の範囲の限定を意図しない。他の局面、利点および改変は、以下の特許請求の範囲内にある。
図１は、ヒトおよびラットのニューブラスチンの１１３個のアミノ酸および１０４個のアミノ酸の配列を示す。 図２は、表１（１％の濃度のＴｗｅｅｎ−８０を含有する緩衝液４は示さない）において詳述される再折りたたみ緩衝液の可溶化ニューブラスチンのインキュベーション後に検出された吸光を図示するグラフである。

Claims (64)

  1. 変性ポリペプチドの折りたたみを誘導する方法であって、該方法は、以下：
    トランスホーミング増殖因子β（ＴＧＦβ）スーパーファミリーメンバーを含む変性ポリペプチドを提供する工程；ならびに
    該ポリペプチドに、該ポリペプチドの折りたたみを誘導するために有効な量の再折りたたみ緩衝液を接触させる工程であって、ここで、該再折りたたみ緩衝液は、（ｉ）２５ｍＭ〜１５０ｍＭの濃度のｐＨ５．８〜ｐＨ８．０のリン酸カリウムもしくはリン酸ナトリウム、（ｉｉ）０．３Ｍ〜２Ｍの濃度のグアニジン−ＨＣｌ、（ｉｉｉ）０．２５Ｍ〜１Ｍの濃度のＬ−アルギニン、（ｉｖ）０．０５％〜１％の濃度のＴｗｅｅｎ−８０、ならびに（ｖ）１ｍＭ〜４ｍＭの濃度の酸化グルタチオンおよび０．０５ｍＭ〜０．８ｍＭの濃度の還元グルタチオンであって、ここで、酸化グルタチオン：還元グルタチオンの比が、５：１〜２０：１である酸化グルタチオンおよび還元グルタチオン、を含有する工程
    を、包含する、方法。
  2. 前記再折りたたみ緩衝液は、０．３０Ｍ〜０．５Ｍの濃度のＬ−アルギニンを含有する、請求項１に記載の方法。
  3. 前記再折りたたみ緩衝液は、少なくとも０．３０Ｍの濃度のＬ−アルギニンを含有する、請求項１に記載の方法。
  4. 前記再折りたたみ緩衝液は、少なくとも０．３５Ｍの濃度のＬ−アルギニンを含有する、請求項１に記載の方法。
  5. 前記再折りたたみ緩衝液は、０．３５Ｍの濃度のＬ−アルギニンを含有する、請求項１に記載の方法。
  6. 前記再折りたたみ緩衝液は、０．１％〜１％の濃度のＴｗｅｅｎ−８０を含有する、請求項１〜請求項５のいずれか１項に記載の方法。
  7. 前記再折りたたみ緩衝液は、０．１％〜０．５％の濃度のＴｗｅｅｎ−８０を含有する、請求項１〜請求項５のいずれか１項に記載の方法。
  8. 前記再折りたたみ緩衝液は、少なくとも０．１％の濃度のＴｗｅｅｎ−８０を含有する、請求項１〜請求項５のいずれか１項に記載の方法。
  9. 前記再折りたたみ緩衝液は、０．１％の濃度のＴｗｅｅｎ−８０を含有する、請求項１〜請求項５のいずれか１項に記載の方法。
  10. 前記再折りたたみ緩衝液は、５：１〜１０：１の比の酸化グルタチオンおよび還元グルタチオンを含有する、請求項１〜請求項９のいずれか１項に記載の方法。
  11. 前記再折りたたみ緩衝液は、５：１の比の酸化グルタチオンおよび還元グルタチオンを含有する、請求項１〜請求項９のいずれか１項に記載の方法。
  12. 前記再折りたたみ緩衝液は、１ｍＭ〜２ｍＭの濃度の酸化グルタチオンを含有する、請求項１〜請求項９のいずれか１項に記載の方法。
  13. 前記再折りたたみ緩衝液は、１ｍＭの濃度の酸化グルタチオンを含有する、請求項１〜請求項９のいずれか１項に記載の方法。
  14. 前記再折りたたみ緩衝液は、０．５Ｍ〜１．０Ｍの濃度のグアニジン−ＨＣｌを含有する、請求項１〜請求項１３のいずれか１項に記載の方法。
  15. 前記再折りたたみ緩衝液は、少なくとも０．５Ｍの濃度のグアニジン−ＨＣｌを含有する、請求項１〜請求項１３のいずれか１項に記載の方法。
  16. 前記再折りたたみ緩衝液は、０．５Ｍの濃度のグアニジン−ＨＣｌを含有する、請求項１〜請求項１３のいずれか１項に記載の方法。
  17. 前記再折りたたみ緩衝液は、２５ｍＭ〜１００ｍＭの濃度のリン酸カリウムを含有する、請求項１〜請求項１６のいずれか１項に記載の方法。
  18. 前記再折りたたみ緩衝液は、２５ｍＭ〜７５ｍＭの濃度のリン酸カリウムを含有する、請求項１〜請求項１６のいずれか１項に記載の方法。
  19. 前記再折りたたみ緩衝液は、少なくとも５０ｍＭの濃度のリン酸カリウムを含有する、請求項１〜請求項１６のいずれか１項に記載の方法。
  20. 前記再折りたたみ緩衝液は、５０ｍＭの濃度のリン酸カリウムを含有する、請求項１〜請求項１６のいずれか１項に記載の方法。
  21. 前記再折りたたみ緩衝液は、ｐＨ７．０〜ｐＨ８．０のリン酸カリウムを含有する、請求項１〜請求項２０のいずれか１項に記載の方法。
  22. 前記再折りたたみ緩衝液は、ｐＨ７．５〜ｐＨ８．０のリン酸カリウムを含有する、請求項１〜請求項２０のいずれか１項に記載の方法。
  23. 前記再折りたたみ緩衝液は、ｐＨ７．８のリン酸カリウムを含有する、請求項１〜請求項２０のいずれか１項に記載の方法。
  24. 前記折りたたみ緩衝液は、（ｉ）５０ｍＭの濃度のｐＨ７．８のリン酸カリウム、（ｉｉ）０．５Ｍの濃度のグアニジン−ＨＣｌ、（ｉｉｉ）０．３５Ｍの濃度のＬ−アルギニン、（ｉｖ）０．１％の濃度のＴｗｅｅｎ−８０、（ｖ）１ｍＭの濃度の酸化グルタチオン、および（ｖｉ）０．２ｍＭの濃度の還元グルタチオンから構成されない、請求項１〜請求項２３のいずれか１項に記載の方法。
  25. 前記再折りたたみ緩衝液は、（ｉ）５０ｍＭの濃度のｐＨ７．８のリン酸カリウム、（ｉｉ）０．５Ｍの濃度のグアニジン−ＨＣｌ、（ｉｉｉ）０．３５Ｍの濃度のＬ−アルギニン、（ｉｖ）０．１％の濃度のＴｗｅｅｎ−８０、（ｖ）１ｍＭの濃度の酸化グルタチオン、および（ｖｉ）０．２ｍＭの濃度の還元グルタチオンを含有する、請求項１に記載の方法。
  26. 前記再折りたたみ緩衝液は、（ｉ）５０ｍＭの濃度のｐＨ７．８のリン酸カリウム、（ｉｉ）０．５Ｍの濃度のグアニジン−ＨＣｌ、（ｉｉｉ）０．３５Ｍの濃度のＬ−アルギニン、（ｉｖ）０．１％の濃度のＴｗｅｅｎ−８０、（ｖ）１ｍＭの濃度の酸化グルタチオン、および（ｖｉ）０．２ｍＭの濃度の還元グルタチオンから構成される、請求項１に記載の方法。
  27. 前記再折りたたみ緩衝液が、尿素を含有しない、請求項１〜請求項２３のいずれか１項に記載の方法。
  28. 前記再折りたたみ緩衝液が、グリシンを含有しない、請求項１〜請求項２３のいずれか１項に記載の方法。
  29. 前記ＴＧＦβスーパーファミリーメンバーが、神経膠細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）ファミリーメンバーである、請求項１〜請求項２８のいずれか１項に記載の方法。
  30. 前記ＧＤＮＦファミリーメンバーは、ニューブラスチンタンパク質である、請求項２９に記載の方法。
  31. 前記ニューブラスチンタンパク質は、配列番号１のアミノ酸残基１２２〜２２０を含む、請求項３０に記載の方法。
  32. 前記ニューブラスチンタンパク質は、配列番号１のアミノ酸残基１１７〜２２０を含む、請求項３０に記載の方法。
  33. 前記ニューブラスチンタンパク質は、配列番号１のアミノ酸残基１０８〜２２０を含む、請求項３０に記載の方法。
  34. 請求項１〜請求項３３のいずれか１項に記載の方法であって、該方法は、前記再折りたたみ緩衝液によって折りたたみを誘導する前に、前記ポリペプチドを、細菌中で発現させる工程をさらに包含する、方法。
  35. 前記細菌は、Ｅ．ｃｏｌｉである、請求項３４に記載の方法。
  36. 請求項３４もしくは請求項３５に記載の方法であって、ここで、前記ポリペプチドは、前記再折りたたみ緩衝液によって折りたたみを誘導する前に、不溶性形態で細菌中で発現され、そして該不溶性ポリペプチドは、該ポリペプチドを変性させるために有効な量の可溶化緩衝液に接触させられる、方法。
  37. １〜１０の係数で希釈される場合に、ニューブラスチンポリペプチドの折りたたみを誘導するために有効な量の再折りたたみ緩衝液を含有する組成物であって、前記再折りたたみ緩衝液は、以下の成分：（ｉ）２５ｍＭ〜１５０ｍＭの濃度のｐＨ５．８〜ｐＨ８．０の範囲のｐＨを有するリン酸カリウムもしくはリン酸ナトリウム；（ｉｉ）０．３Ｍ〜２Ｍの濃度のグアニジン−ＨＣｌ；（ｉｉｉ）０．２５Ｍ〜１Ｍの濃度のＬ−アルギニン；（ｉｖ）０．０５％〜１％の濃度のＴｗｅｅｎ−８０；ならびに（ｖ）１ｍＭ〜４ｍＭの濃度の酸化グルタチオンおよび０．０５ｍＭ〜０．８ｍＭの濃度の還元グルタチオンであって、ここで、酸化グルタチオン：還元グルタチオンの比が、５：１〜２０：１である酸化グルタチオンおよび還元グルタチオン、を、該濃度の１〜１０倍の濃度で含有する、組成物。
  38. 前記再折りたたみ緩衝液は、０．３０Ｍ〜０．５Ｍの濃度の１〜１０倍でＬ−アルギニンを含有する、請求項３７に記載の組成物。
  39. 前記再折りたたみ緩衝液は、少なくとも０．３０Ｍの濃度の１〜１０倍でＬ−アルギニンを含有する、請求項３７に記載の組成物。
  40. 前記再折りたたみ緩衝液は、少なくとも０．３５Ｍの濃度の１〜１０倍でＬ−アルギニンを含有する、請求項３７に記載の組成物。
  41. 前記再折りたたみ緩衝液は、０．３５Ｍの濃度の１〜１０倍でＬ−アルギニンを含有する、請求項３７に記載の組成物。
  42. 前記再折りたたみ緩衝液は、０．１％〜１％の濃度の１〜１０倍でＴｗｅｅｎ−８０を含有する、請求項３７〜請求項４１のいずれか１項に記載の組成物。
  43. 前記再折りたたみ緩衝液は、０．１％〜０．５％の濃度の１〜１０倍でＴｗｅｅｎ−８０を含有する、請求項３７〜請求項４１のいずれか１項に記載の組成物。
  44. 前記再折りたたみ緩衝液は、少なくとも０．１％の濃度の１〜１０倍でＴｗｅｅｎ−８０を含有する、請求項３７〜請求項４１のいずれか１項に記載の組成物。
  45. 前記再折りたたみ緩衝液は、０．１％の濃度の１〜１０倍でＴｗｅｅｎ−８０を含有する、請求項３７〜請求項４１のいずれか１項に記載の組成物。
  46. 前記再折りたたみ緩衝液は、５：１〜１０：１の比の酸化グルタチオンおよび還元グルタチオンを含有する、請求項３７〜請求項４５のいずれか１項に記載の組成物。
  47. 前記再折りたたみ緩衝液は、５：１の比の酸化グルタチオンおよび還元グルタチオンを含有する、請求項３７〜請求項４５のいずれか１項に記載の組成物。
  48. 前記再折りたたみ緩衝液は、１ｍＭ〜２ｍＭの濃度の１〜１０倍で酸化グルタチオンを含有する、請求項３７〜請求項４５のいずれか１項に記載の組成物。
  49. 前記再折りたたみ緩衝液は、１ｍＭの濃度の１〜１０倍で酸化グルタチオンを含有する、請求項３７〜請求項４５のいずれか１項に記載の組成物。
  50. 前記再折りたたみ緩衝液は、０．５Ｍ〜１．０Ｍの濃度の１〜１０倍でグアニジン−ＨＣｌを含有する、請求項３７〜請求項４９のいずれか１項に記載の組成物。
  51. 前記再折りたたみ緩衝液は、少なくとも０．５Ｍの濃度の１〜１０倍でグアニジン−ＨＣｌを含有する、請求項３７〜請求項４９のいずれか１項に記載の組成物。
  52. 前記再折りたたみ緩衝液は、０．５Ｍの濃度の１〜１０倍でグアニジン−ＨＣｌを含有する、請求項３７〜請求項４９のいずれか１項に記載の組成物。
  53. 前記再折りたたみ緩衝液は、２５ｍＭ〜１００ｍＭの濃度の１〜１０倍でリン酸カリウムを含有する、請求項３７〜請求項５２のいずれか１項に記載の組成物。
  54. 前記再折りたたみ緩衝液は、２５ｍＭ〜７５ｍＭの濃度の１〜１０倍でリン酸カリウムを含有する、請求項３７〜請求項５２のいずれか１項に記載の組成物。
  55. 前記再折りたたみ緩衝液は、少なくとも５０ｍＭの濃度の１〜１０倍でリン酸カリウムを含有する、請求項３７〜請求項５２のいずれか１項に記載の組成物。
  56. 前記再折りたたみ緩衝液は、５０ｍＭの濃度の１〜１０倍でリン酸カリウムを含有する、請求項３７〜請求項５２のいずれか１項に記載の組成物。
  57. 前記再折りたたみ緩衝液は、ｐＨ７．０〜ｐＨ８．０のリン酸カリウムを含有する、請求項３７〜請求項５６のいずれか１項に記載の組成物。
  58. 前記再折りたたみ緩衝液は、ｐＨ７．５〜ｐＨ８．０のリン酸カリウムを含有する、請求項３７〜請求項５６のいずれか１項に記載の組成物。
  59. 前記再折りたたみ緩衝液は、ｐＨ７．８のリン酸カリウムを含有する、請求項３７〜請求項５６のいずれか１項に記載の組成物。
  60. 前記再折りたたみ緩衝液は、（ｉ）５０ｍＭの濃度のｐＨ７．８のリン酸カリウム、（ｉｉ）０．５Ｍの濃度のグアニジン−ＨＣｌ、（ｉｉｉ）０．３５Ｍの濃度のＬ−アルギニン、（ｉｖ）０．１％の濃度のＴｗｅｅｎ−８０、（ｖ）１ｍＭの濃度の酸化グルタチオンおよび（ｖｉ）０．２ｍＭの濃度の還元グルタチオンから構成されない、請求項３７〜請求項５９のいずれか１項に記載の組成物。
  61. 前記再折りたたみ緩衝液は、以下の成分：（ｉ）５０ｍＭの濃度のｐＨ７．８のリン酸カリウム；（ｉｉ）０．５Ｍの濃度のグアニジン−ＨＣｌ；（ｉｉｉ）０．３５Ｍの濃度のＬ−アルギニン；（ｉｖ）０．１％の濃度のＴｗｅｅｎ−８０；（ｖ）１ｍＭの濃度の酸化グルタチオン；および（ｖｉ）０．２ｍＭの濃度の還元グルタチオンを、該濃度の１〜１０倍の濃度で含有する、請求項３７に記載の組成物。
  62. 前記再折りたたみ緩衝液は、以下の成分：（ｉ）５０ｍＭの濃度のｐＨ７．８リン酸カリウム；（ｉｉ）０．５Ｍの濃度のグアニジン−ＨＣｌ；（ｉｉｉ）０．３５Ｍの濃度のＬ−アルギニン；（ｉｖ）０．１％の濃度のＴｗｅｅｎ−８０；（ｖ）１ｍＭの濃度の酸化グルタチオン；および（ｖｉ）０．２ｍＭの濃度の還元グルタチオンの、該濃度の１〜１０倍の濃度で構成される、請求項３７に記載の組成物。
  63. 前記再折りたたみ緩衝液は、尿素を含有しない、請求項３７〜請求項５９のいずれか１項に記載の組成物。
  64. 前記再折りたたみ緩衝液は、グリシンを含有しない、請求項３７〜請求項５９のいずれか１項に記載の組成物。
JP2007528062A 2004-08-19 2005-08-18 トランスホーミング増殖因子βファミリータンパク質の折りたたみ Expired - Fee Related JP4959566B2 (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US60282504P 2004-08-19 2004-08-19
US60/602,825 2004-08-19
PCT/US2005/029638 WO2006023782A2 (en) 2004-08-19 2005-08-18 Refolding transforming growth factor beta family proteins

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2008510720A JP2008510720A (ja) 2008-04-10
JP4959566B2 true JP4959566B2 (ja) 2012-06-27

Family

ID=35968236

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2007528062A Expired - Fee Related JP4959566B2 (ja) 2004-08-19 2005-08-18 トランスホーミング増殖因子βファミリータンパク質の折りたたみ

Country Status (16)

Country Link
US (2) US8722862B2 (ja)
EP (1) EP1784203B1 (ja)
JP (1) JP4959566B2 (ja)
KR (1) KR101241551B1 (ja)
CN (2) CN101043899B (ja)
AT (1) ATE472333T1 (ja)
AU (1) AU2005277227B2 (ja)
BR (1) BRPI0514409A (ja)
CA (1) CA2577690C (ja)
DE (1) DE602005022082D1 (ja)
ES (1) ES2349043T3 (ja)
HK (1) HK1103988A1 (ja)
IL (1) IL181312A (ja)
IS (1) IS8609A (ja)
NZ (1) NZ553420A (ja)
WO (1) WO2006023782A2 (ja)

Families Citing this family (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1267914B2 (en) 2000-02-04 2013-11-06 Children's Hospital Research Foundation Use of lysosomal acid lipase for treating atherosclerosis and related diseases
US7442370B2 (en) 2001-02-01 2008-10-28 Biogen Idec Ma Inc. Polymer conjugates of mutated neublastin
US7276580B2 (en) * 2001-03-12 2007-10-02 Biogen Idec Ma Inc. Neurotrophic factors
JP4571776B2 (ja) * 2002-11-05 2010-10-27 Ｊｘ日鉱日石エネルギー株式会社 潤滑油組成物
EP2322205A1 (en) 2003-04-18 2011-05-18 Biogen Idec MA Inc. Polymer-conjugated glycosylated neublastin
MX2007002029A (es) * 2004-08-19 2007-03-28 Biogen Idec Inc Variantes de neublastina.
WO2006023782A2 (en) 2004-08-19 2006-03-02 Biogen Ideca Ma Inc. Refolding transforming growth factor beta family proteins
TWI501774B (zh) 2006-02-27 2015-10-01 Biogen Idec Inc 神經性病症之治療
ES2450065T3 (es) * 2006-03-01 2014-03-21 Biogen Idec Ma Inc. Composiciones y métodos para la administración de proteínas de la familia de ligandos del GDNF
GB0604966D0 (en) 2006-03-11 2006-04-19 Renovo Ltd Medicaments and proteins
GB0604938D0 (en) 2006-03-11 2006-04-19 Renovo Ltd Proteins, nucleic acids and medicaments
GB0604964D0 (en) * 2006-03-11 2006-04-19 Renovo Ltd Protein folding
JP5274795B2 (ja) * 2006-07-27 2013-08-28 三洋化成工業株式会社 タンパク質のリフォールディング方法
BRPI0718358A2 (pt) 2006-12-11 2014-10-07 Japan Science & Tech Agency Regulador de crescimento de planta para aumentar o índice de colheita , método para cultivar uma planta, método para aumentar o número de sementes e/ou flores de uma planta, método para aumentar o número de botões axilares e/ou hastes de uma planta e planta.
TWI445544B (zh) * 2007-05-01 2014-07-21 Biogen Idec Inc 增進血管形成之組合物及方法
WO2009020964A2 (en) * 2007-08-08 2009-02-12 Biogen Idec Ma Inc. Anti-neublastin antibodies and uses thereof
JP2010132649A (ja) * 2008-10-28 2010-06-17 Sanyo Chem Ind Ltd タンパク質のリフォールディング剤及びタンパク質の製造方法
CA2765154A1 (en) 2009-06-25 2010-12-29 Amgen Inc. Capture purification processes for proteins expressed in a non-mammalian system
AU2011242461B2 (en) 2010-04-23 2015-10-01 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Lysosomal storage disease enzyme
CA3209456A1 (en) 2010-09-09 2012-04-19 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Use of lysosomal acid lipase for treating lysosomal acid lipase deficiency in patients
WO2012112681A1 (en) 2011-02-15 2012-08-23 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Methods for treating lysosomal acid lipase deficiency
WO2013088956A1 (ja) 2011-12-12 2013-06-20 岡山県 植物のアミノ酸含量を高めるための化合物およびその利用
US9556427B2 (en) * 2013-02-27 2017-01-31 Syngenta Participations Ag Methods and compositions for preparation of nucleic acids
WO2015042580A1 (en) 2013-09-23 2015-03-26 Biogen Idec Ma Inc. Compositions and methods for treatment of neuropathic pain
WO2016022800A1 (en) 2014-08-07 2016-02-11 Biogen Ma Inc. Characterization of cystine knot superfamily proteins
CN109069636A (zh) * 2016-03-04 2018-12-21 恩格姆生物制药公司 用于调节体重的组合物和方法
WO2021050009A2 (en) * 2019-09-13 2021-03-18 National Science And Technology Development Agency Composition of renaturation buffer solution for dimeric proteins and method of renaturation dimeric proteins using the composition thereof
CN116874555B (zh) * 2023-09-08 2023-11-28 成都华任康生物科技有限公司 一种置换液及其试剂盒和相关应用

Family Cites Families (105)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4352883A (en) * 1979-03-28 1982-10-05 Damon Corporation Encapsulation of biological material
US4353888A (en) * 1980-12-23 1982-10-12 Sefton Michael V Encapsulation of live animal cells
US4407957A (en) * 1981-03-13 1983-10-04 Damon Corporation Reversible microencapsulation of a core material
US5525464A (en) * 1987-04-01 1996-06-11 Hyseq, Inc. Method of sequencing by hybridization of oligonucleotide probes
US4883666A (en) * 1987-04-29 1989-11-28 Massachusetts Institute Of Technology Controlled drug delivery system for treatment of neural disorders
US5283187A (en) * 1987-11-17 1994-02-01 Brown University Research Foundation Cell culture-containing tubular capsule produced by co-extrusion
US5158881A (en) * 1987-11-17 1992-10-27 Brown University Research Foundation Method and system for encapsulating cells in a tubular extrudate in separate cell compartments
DE3829766A1 (de) * 1988-09-01 1990-03-22 Akzo Gmbh Verfahren zur herstellung von membranen
DE3829752A1 (de) * 1988-09-01 1990-03-22 Akzo Gmbh Integrale asymmetrische polyaethersulfonmembran, verfahren zur herstellung und verwendung zur ultrafiltration und mikrofiltration
US5143854A (en) * 1989-06-07 1992-09-01 Affymax Technologies N.V. Large scale photolithographic solid phase synthesis of polypeptides and receptor binding screening thereof
US5800992A (en) * 1989-06-07 1998-09-01 Fodor; Stephen P.A. Method of detecting nucleic acids
US5194596A (en) * 1989-07-27 1993-03-16 California Biotechnology Inc. Production of vascular endothelial cell growth factor
US5350836A (en) * 1989-10-12 1994-09-27 Ohio University Growth hormone antagonists
GB8927546D0 (en) * 1989-12-06 1990-02-07 Ciba Geigy Process for the production of biologically active tgf-beta
US5084350A (en) * 1990-02-16 1992-01-28 The Royal Institution For The Advance Of Learning (Mcgill University) Method for encapsulating biologically active material including cells
US5618531A (en) * 1990-10-19 1997-04-08 New York University Method for increasing the viability of cells which are administered to the brain or spinal cord
DE69221484T2 (de) 1991-04-25 1998-02-19 Univ Brown Res Found Implantierbare, biokompatible immunisolator-trägersubstanz zum abgeben ausgesuchter, therapeutischer produkte
CA2444415A1 (en) * 1991-07-02 1993-01-21 Nektar Therapeutics Method and device for delivering aerosolized medicaments
HU220795B1 (hu) 1991-09-20 2002-05-28 Amgen Inc. Gliasejtvonal-eredetű neurotróf faktorfehérjék, továbbá berendezések és gyógyászati készítmények idegsejtkárosodás megelőzésére és kezelésére
US5939524A (en) * 1991-12-09 1999-08-17 The Scripps Research Institute Platelet GPIII P1A1 and P1A2 epitopes, their preparation and use
US5414135A (en) * 1991-12-30 1995-05-09 Sterling Winthrop Inc. Vinyl sulfone coupling of polyoxyalkylenes to proteins
US5785049A (en) * 1994-09-21 1998-07-28 Inhale Therapeutic Systems Method and apparatus for dispersion of dry powder medicaments
CZ286632B6 (cs) * 1992-09-29 2000-05-17 Inhale Therapeutic Systems Farmaceutický prostředek
US6472178B1 (en) 1998-02-27 2002-10-29 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Nucleic acids encoding a modified ciliary neurotrophic factor and method of making thereof
US5349056A (en) * 1992-10-09 1994-09-20 Regeneron Pharmaceuticals Modified ciliary neurotrophic factors
CA2092271C (en) * 1993-03-09 2009-10-13 Eddie Reed Use of g-csf for treating taxol side-effects
AU7568094A (en) 1993-08-12 1995-03-14 Cytotherapeutics, Inc. Improved compositions and methods for the delivery of biologically active molecules using genetically altered cells contained in biocompatible immunoisolatory capsules
DE4339605A1 (de) * 1993-11-20 1995-05-24 Beiersdorf Ag Desodorierende Wirkstoffkombinationen auf der Basis von alpha, omega-Alkandicarbonsäuren und Fettsäurepartialglyceriden
US5834029A (en) * 1994-07-20 1998-11-10 Cytotherapeutics, Inc. Nerve guidance channel containing bioartificial three-dimensional hydrogel extracellular matrix derivatized with cell adhesive peptide fragment
US5824784A (en) 1994-10-12 1998-10-20 Amgen Inc. N-terminally chemically modified protein compositions and methods
US5795716A (en) * 1994-10-21 1998-08-18 Chee; Mark S. Computer-aided visualization and analysis system for sequence evaluation
US5770577A (en) * 1994-11-14 1998-06-23 Amgen Inc. BDNF and NT-3 polypeptides selectively linked to polyethylene glycol
US5780014A (en) * 1995-04-14 1998-07-14 Inhale Therapeutic Systems Method and apparatus for pulmonary administration of dry powder alpha 1-antitrypsin
US5654007A (en) * 1995-06-07 1997-08-05 Inhale Therapeutic Systems Methods and system for processing dispersible fine powders
US5739307A (en) 1995-08-28 1998-04-14 Washington University Polynucleotide encoding neurturin neurotrophic factor
US5733729A (en) * 1995-09-14 1998-03-31 Affymetrix, Inc. Computer-aided probability base calling for arrays of nucleic acid probes on chips
US6184200B1 (en) 1995-09-28 2001-02-06 Amgen Inc. Truncated glial cell line-derived neurotrophic factor
AU1121997A (en) 1995-11-29 1997-06-19 Amgen, Inc. Method for treating sensory neuropathy using glial cell line-derived neurotrophic factor (gdnf) protein product
US6063757A (en) * 1995-11-29 2000-05-16 Urso; Richard G. Wound treatment method with nerve growth factor
US5641749A (en) * 1995-11-29 1997-06-24 Amgen Inc. Method for treating retinal ganglion cell injury using glial cell line-derived neurothrophic factor (GDNF) protein product
WO1997023638A1 (fr) * 1995-12-21 1997-07-03 Ajinomoto Co., Inc. Procede pour replier l'activine a humaine
US6299895B1 (en) * 1997-03-24 2001-10-09 Neurotech S.A. Device and method for treating ophthalmic diseases
US6878544B2 (en) 1996-04-19 2005-04-12 Neurotech Sa Retinal cell lines with extended life-span and their applications
US6677135B1 (en) * 1996-05-08 2004-01-13 Biogen, Inc. Ret ligand (RetL) for stimulating neutral and renal growth
US5754524A (en) * 1996-08-30 1998-05-19 Wark; Barry J. Computerized method and system for analysis of an electrophoresis gel test
US6083725A (en) * 1996-09-13 2000-07-04 Transkaryotic Therapies, Inc. Tranfected human cells expressing human α-galactosidase A protein
EP0928336A1 (en) * 1996-09-26 1999-07-14 Medical Research Council Chaperone fragments
KR100195886B1 (ko) * 1996-11-01 1999-06-15 김상조 당뇨병 치료용 의약조성물
WO1998032869A1 (en) 1997-01-29 1998-07-30 Neurosearch A/S Expression vectors and methods for in vivo expression of therapeutic polypeptides
CA2296770A1 (en) 1997-07-14 1999-01-28 Bolder Biotechnology, Inc. Derivatives of growth hormone and related proteins
GB9718908D0 (en) 1997-09-05 1997-11-12 Rowett Research Services Limit Proteins
US20020192209A1 (en) 1997-09-17 2002-12-19 Genentech, Inc. Methods and compositions for inhibiting neoplastic cell growth
US6653098B1 (en) 1998-02-23 2003-11-25 G. D. Searle & Co. Method of producing mouse and human endostatin
DE69930374T2 (de) 1998-03-23 2006-12-07 Genentech, Inc., South San Francisco Gfr-alpha3 und seine verwendungen
US20020055467A1 (en) 1998-07-06 2002-05-09 Johansen Teit E. Novel neurotrophic factors
CZ303358B6 (cs) * 1998-07-06 2012-08-15 Nsgene A/S Neurotrofní polypeptid, zpusob jeho výroby a použití, kódující polynukleotid, príslušný vektor a hostitelská bunka, syntetický gen a protilátka
US6593133B1 (en) 1998-07-06 2003-07-15 Nsgene A/S Neurotrophic factors
CA2333910C (en) * 1998-07-14 2016-11-15 Janssen Pharmaceutica N.V. Neurotrophic growth factor
US7067473B1 (en) * 1998-07-14 2006-06-27 Janssen Pharmaceutica N.V. Neurotrophic growth factor
WO2000015665A2 (en) 1998-09-14 2000-03-23 Pedersen Lars Oestergaard A method of producing a functional immunoglobulin superfamily protein
JP2003524381A (ja) * 1998-09-22 2003-08-19 ユニヴァーシティ オブ メリーランド，ボルチモア システインノット成長因子ミュータント
US20020002269A1 (en) * 1998-09-29 2002-01-03 Jeffrey D. Milbrandt Artemin, a neurotrophic factor
EP1137774A2 (en) 1998-12-09 2001-10-04 Amgen Inc. Grnf4, a gdnf-related neurotrophic factor
DK1623989T3 (da) 1999-03-08 2007-10-15 Genentech Inc Sammensætninger og fremgangsmåder til diagnosticering af tumorer
US6361771B1 (en) * 1999-04-06 2002-03-26 Neurotech S.A. ARPE-19 as a platform cell line for encapsulated cell-based delivery
MXPA01010692A (es) * 1999-04-22 2004-09-06 Univ Zuerich Matrices de proteina modificadas para ingenieria de tejidos o liberacion controlada.
DK1185648T3 (da) 1999-06-02 2007-07-30 Genentech Inc Fremgangsmåder og sammensætninger til inhibition af neoplastisk cellevækst
EP1223966B1 (en) * 1999-10-29 2003-05-02 BIOPHARM GESELLSCHAFT ZUR BIOTECHNOLOGISCHEN ENTWICKLUNG VON PHARMAKA mbH Use of gdnf for treating corneal defects
US6866851B1 (en) 1999-12-28 2005-03-15 Washington University GFRα1-RET specific agonists and methods therefor
AU2001289307A1 (en) 2000-04-06 2001-10-23 Pharmacia Corporation Chemically-modified myelopoietin conjugates
DE60129432T2 (de) 2000-05-16 2008-04-17 Bolder Biotechnology, Inc., Louisville Verfahren zur rückfaltung von proteinen mit freien cysteinresten
JP2001329126A (ja) 2000-05-22 2001-11-27 Bridgestone Corp 硬化性組成物
CA2327208A1 (en) * 2000-11-30 2002-05-30 The Government Of The United States Of America Methods of increasing distribution of therapeutic agents
IL140110A0 (en) 2000-12-05 2002-02-10 Applied Research Systems Improvement of homogeneity and secretion of recombinant proteins in mammalian systems
IL156559A0 (en) * 2000-12-22 2004-01-04 Genentech Inc New use of artemin, a member of the gdnf ligand family
ATE365748T1 (de) * 2001-02-01 2007-07-15 Biogen Idec Inc Polymer-konjugate von neublastin und methoden für deren verwendung
US7442370B2 (en) * 2001-02-01 2008-10-28 Biogen Idec Ma Inc. Polymer conjugates of mutated neublastin
US7276580B2 (en) * 2001-03-12 2007-10-02 Biogen Idec Ma Inc. Neurotrophic factors
US20040077543A1 (en) * 2001-03-28 2004-04-22 Sah Dinah W. Y. Treatment using neublastin polypeptides
ATE526982T1 (de) 2001-03-28 2011-10-15 Biogen Idec Inc Verwendung von neublastin-polypeptide zur behandlung von neuropathischen schmerzen
WO2002092107A1 (en) * 2001-04-24 2002-11-21 Purdue Research Foundation Method and compositions for treating mammalian nerve tissue injuries
US7135334B2 (en) * 2001-06-20 2006-11-14 Genentech, Inc. PRO20044 nucleic acids
US20040028613A1 (en) * 2001-06-25 2004-02-12 Nastech Pharmaceutical Company Inc Dopamine agonist formulations for enhanced central nervous system delivery
US7129085B2 (en) * 2001-10-11 2006-10-31 Bristol-Myers Squibb Company Polynucleotides encoding a human leucine-rich repeat domain containing protein, HLLRCR-1
EP1314739A1 (en) 2001-11-22 2003-05-28 Bayer Ag Process for renaturation of recombinant, disulfide containing proteins at high protein concentrations in the presence of amines
GB0205022D0 (en) * 2002-03-04 2002-04-17 Univ Cambridge Tech Materials and methods for the treatment of cns damage
JP4310608B2 (ja) 2002-04-25 2009-08-12 東洋紡績株式会社 Ｈｓｐ７０ファミリータンパク質基質結合ドメインフラグメントの利用方法
DE10229175A1 (de) 2002-06-28 2004-01-15 Valeo Klimasysteme Gmbh Zylinderklappe mit strukturierter rauher Oberfläche
JP4742025B2 (ja) * 2003-01-31 2011-08-10 バイオジェン・アイデック・エムエイ・インコーポレイテッド 変異ニューブラスチンのポリマー結合体
EP2322205A1 (en) 2003-04-18 2011-05-18 Biogen Idec MA Inc. Polymer-conjugated glycosylated neublastin
WO2004108760A2 (en) 2003-06-10 2004-12-16 Nsgene A/S Improved secretion of neublastin
US7598059B2 (en) * 2003-10-02 2009-10-06 Biogen Idec Ma Inc. Neublastin expression constructs
NZ547185A (en) 2003-10-20 2009-03-31 Nsgene As In vivo gene therapy of parkinson's disease
US20050180957A1 (en) * 2004-01-16 2005-08-18 Scharp David W. Method of using fibrin-bound angiogenic factors to stimulate vascularization of transplant site of encapsulated cells
ES2376332T3 (es) * 2004-06-23 2012-03-13 Tissuegene, Inc. Regeneración de nervios.
US7598356B2 (en) * 2004-07-08 2009-10-06 Board of Regents of the University of Nebraska by and on behalf of the University of Nebraska Medical Center Method for purifying a protein of the cystine-knot superfamily
WO2006023782A2 (en) 2004-08-19 2006-03-02 Biogen Ideca Ma Inc. Refolding transforming growth factor beta family proteins
MX2007002029A (es) * 2004-08-19 2007-03-28 Biogen Idec Inc Variantes de neublastina.
US20060165667A1 (en) 2004-12-03 2006-07-27 Case Western Reserve University Novel methods, compositions and devices for inducing neovascularization
WO2007042040A2 (en) 2005-10-11 2007-04-19 Ns Gene A/S TREATMENT OF RETINOPATHIES USING GFRα3 AGONISTS
TWI501774B (zh) 2006-02-27 2015-10-01 Biogen Idec Inc 神經性病症之治療
ES2450065T3 (es) 2006-03-01 2014-03-21 Biogen Idec Ma Inc. Composiciones y métodos para la administración de proteínas de la familia de ligandos del GDNF
PL2019683T5 (pl) * 2006-04-25 2022-12-05 The Regents Of The University Of California Podawanie czynników wzrostu do leczenia zaburzeń OUN
TWI445544B (zh) * 2007-05-01 2014-07-21 Biogen Idec Inc 增進血管形成之組合物及方法
WO2009020964A2 (en) 2007-08-08 2009-02-12 Biogen Idec Ma Inc. Anti-neublastin antibodies and uses thereof

Also Published As

Publication number Publication date
ES2349043T3 (es) 2010-12-22
KR20070050965A (ko) 2007-05-16
IL181312A0 (en) 2007-07-04
WO2006023782A3 (en) 2007-01-04
US8722862B2 (en) 2014-05-13
NZ553420A (en) 2010-02-26
ATE472333T1 (de) 2010-07-15
AU2005277227A1 (en) 2006-03-02
BRPI0514409A (pt) 2008-06-10
DE602005022082D1 (de) 2010-08-12
JP2008510720A (ja) 2008-04-10
IL181312A (en) 2013-12-31
US20140322752A1 (en) 2014-10-30
CA2577690A1 (en) 2006-03-02
EP1784203A2 (en) 2007-05-16
CA2577690C (en) 2013-08-06
EP1784203B1 (en) 2010-06-30
EP1784203A4 (en) 2008-08-20
AU2005277227B2 (en) 2011-10-06
HK1103988A1 (en) 2008-01-04
CN101123978B (zh) 2012-12-12
IS8609A (is) 2007-02-14
US8969042B2 (en) 2015-03-03
US20080249287A1 (en) 2008-10-09
CN101043899A (zh) 2007-09-26
CN101123978A (zh) 2008-02-13
CN101043899B (zh) 2011-03-30
WO2006023782A2 (en) 2006-03-02
KR101241551B1 (ko) 2013-03-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP4959566B2 (ja) トランスホーミング増殖因子βファミリータンパク質の折りたたみ
KR101651697B1 (ko) Ｆｇｆ２１ 돌연변이체 및 그의 용도
HU222666B1 (hu) Eljárás neuorotrofinok tisztítására
Alexander et al. Characterization and modelling of the hydrophobic domain of a sunflower oleosin
JP2008500816A (ja) 改善された性質を有するｂｍｐ−７変異体
JP2006508049A (ja) 増殖因子βタンパク質を形質転換するための可溶化賦形剤としてのペプチド
CA2867796C (en) Methods for refolding g-csf from inclusion bodies
JP7030934B2 (ja) ナノ粒子製剤
JP2009011323A (ja) ヘパリン結合能の亢進したポリペプチド変異体
KR102650035B1 (ko) 내열성 fgf2 폴리펩타이드 및 그 용도
Garrick et al. Primary structure of the major β-chain of rat haemoglobins
IE911103A1 (en) Method to purify basic fibroblast growth factor
Jin et al. Refolding and purification of unprocessed porcine myostatin expressed in Escherichia coli
EP0625198B1 (en) Expression of osteogenic factor op-1 in cells of spodoptera frugiperda infected with recombinant baculovirus
Boumaiza et al. Expression and purification of a new recombinant camel hepcidin able to promote the degradation of the iron exporter ferroportin1
SG193483A1 (en) Variants of human gdnf
Fincham et al. Isolation and partial characterization of a human amelogenin from a single fetal dentition using HPLC techniques
KR102075256B1 (ko) 대식세포 콜로니 자극인자의 분리 및 정제 방법
JP2013545440A (ja) マカカ・ファシキュラリス（Ｍａｃａｃａｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）ＣＣＬ１７
Burrus Purification, cloning, and characterization of a cysteine-rich fibroblast growth factor receptor.
Xu et al. Putative rat sperm lipid‐binding protein: Isolation and partial characterization
WO2017210598A1 (en) Compositions and methods for treating an articular disorder
AU2016213791A1 (en) Single domain TDF-related compounds and analogs thereof

Legal Events

Date Code Title Description
A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20080401

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20101028

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20110127

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20110203

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20110225

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20110304

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20110325

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20110401

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20120118

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20120216

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20120315

A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20120321

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20150330

Year of fee payment: 3

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

S531 Written request for registration of change of domicile

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313531

S533 Written request for registration of change of name

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313533

R350 Written notification of registration of transfer

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350

LAPS Cancellation because of no payment of annual fees