CZ303358B6 - Neurotrofní polypeptid, zpusob jeho výroby a použití, kódující polynukleotid, príslušný vektor a hostitelská bunka, syntetický gen a protilátka - Google Patents

Abstract

Izolovaný neublastinový polynukleotid, kódující polypeptid, který má neurotrofní aktivitu, kde polynukleotid je vybrán ze skupiny sestávající z a) polynukleotidu zahrnujícího nukleotidovou sekvenci SEQ ID NO: 1, b) polynukleotidu kódujícího neublastinový polypeptid nebo polypeptid z neho odvozený, kde maturovaná cást polypeptidu vykazuje stupen identity s aminokyselinami 1 až 105 ze SEQ ID NO: 2 alespon 90 %, c) polynukleotidu zahrnujícího nukleotidovou sekvenci, která je z alespon 90 % identická s polynukleotidovou sekvencí uvedenou jako SEQ ID NO: 1, a dále kódovaný polypeptid, zejména neublastinové polypeptidy neurotrofního faktoru, a protilátky, které se specificky váží na neublastinové polypeptidy, stejne jako zpusoby jejich výroby a použití.

Description

Neurotrofní polypeptid, způsob jeho výroby a použití, kódující polynukleotid, příslušný vektor a hostitelská buňka, syntetický gen a protilátka

Oblast techniky

Vynález se týká polypeptidických neurotrofních faktorů, nukleových kyselin kódujících polypeptidické neurotrofní faktory a protilátek, které se specificky váží na neurotrofní faktory.

io

Dosavadní stav techniky

Neurotrofní faktory jsou přirozeně se vyskytující faktory, které podporují přežití, udržují fenotypickou diferenciaci, brání degeneraci a zvyšují aktivitu neuronových buněk a tkání. Neurotrofní faktory se izolují z nervové tkáně a z nenervové tkáně, která je inervována nervovým systémem, a rozdělují se do funkčně a strukturně příbuzných skupin, které se také označují jako rodiny, nadrodiny nebo podrodiny. Mezi nadrodiny neurotrofních faktorů patří nadrodíny fibroblastového růstového faktoru, neutrofinu a transformačního růstového faktoru beta (TGF-β). Jednotlivé neurotrofní faktory se odlišují svou fyzikální strukturou, interakcí se svými kompozitními receptory a účinky na různé typy nervových buněk. Do nadrodiny TGF-β (massague, et al., Trends in Cell Biology, 1994, 4: 172 až 178). patří ligandy neurotrofních faktorů získané z gliové buněčné linie (GDNF, WO 93/06116), které zahrnují GDNF, persefin (PSP”, Milbrandt et al., Neuron 1989, 20: 245 až 253) a neurturin (NTN, WO 97/08196). Ligandy podrodiny GDNF mají společnou schopnost vyvolat signál prostřednictvím receptorové tyrosinové kinázy RET. Tyto tři ligandy podrodiny GDNF se liší svou relativní afinitou vůči jedné rodině neutrofhích receptorů, receptorům GFR.

Vzhledem k účinkům neurotrofních faktorů na neuronovou tkáň zůstává potřeba identifikovat a charakterizovat další neurotrofní faktory pro diagnostikování a léčbu poruch nerovového systé30 mu.

Podstata vynálezu

Vynález se týká nového neurotrofního faktoru, zde nazývaného neublastin nebo NBN.

Neublastin spadá do podrodiny GDNF, protože sdílí oblasti homologie s jinými ligandy GDNF (viz dále tabulky 3 a 4) a vzhledem k svojí schopnosti ínteragovat s RET (viz například Airaksinen et al., Mol. Cell. neuroscience, 1999, 13, 313 až 325) je neublastin nový a jedinečný neurotrofhí faktor. Na rozdíl od ostatních ligandů GDNF neublastin vykazuje vysokou afinitu vůči receptorovému komplexu GFRa3-RET a jedinečné podoblasti ve své aminokyselinové sekvenci.

Předmětem vynálezu je izolovaný neublastinový polynukleotid, kódující polypeptid, který má neurotrofní aktivitu, kde polynukleotid je vybrán ze skupiny sestávající z

a) polynukleotidu zahrnujícího nukleotidovou sekvenci SEQ ID NO: 1,

b) polynukleotidu kódujícího neublastinový polypeptid nebo polypeptid z něho odvozený, kde maturovaná část polypeptidu vykazuje stupeň identity s aminokyselinami 1 až 105 ze SEQ ID NO: 2 alespoň 90 %,

c) polynukleotidu zahrnujícího nukleotidovou sekvenci, která je z alespoň 90 % identická s polynukleotidovou sekvencí uvedenou jako SEQ ID NO: 1.

Přednostně má maturovaná část kódovaného polypeptidu stupeň identity s aminokyselinami 1 až 105 ze SEQ ID NO: 2 alespoň 95 %. Zvlášť výhodně kódovaný polypeptid sestává z aminokyselin 1 až 105 ze SEQ ID NO: 2, zejména je kódovaný polypeptidem SEQ ID NO: 2,4, 5, 6 nebo 7.

Polynukleotid přednostně zahrnuje sekvenci SEQ ID NO: 3.

Předmětem vynálezu je rovněž polypeptid, kde maturovaná část polypeptidu vykazuje alespoň identity s aminokyselinami 1 až 105 ze SEQ ID NO: 2 alespoň 90 %, přičemž polypeptid má neutroťhí aktivitu.

to

Výhodně jeho maturovaná část vykazuje stupeň identity s aminokyselinami l až 105 ze SEQ ID NO: 2 alespoň 95 %. Přednostně je polypeptidem polypeptid neutrofního faktoru neublastinu zahrnující aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO; 2,4, 5, 6 nebo 7.

Přednostně je polypeptid glykosy lovaný.

Polynukleotid, který kóduje neublastinový polypeptid, se označuje rovněž neublastinová nukleová kyselina”. Izolovaná neublastinová nukleová kyselina je tedy polynukleotidová molekula, která má otevřený čtecí rámec nukleotidových kodonu, které v případě expozice vhodnými složka20 mi, nutnými pro translaci, budou kódovat neublastinový polypeptid. Neublastinová nukleové kyseliny podle vynálezu mohou být RNA nebo DNA, například genomová DNA nebo DNA, která je komplementární s neublastinovou mRNA (cDNA) nebo se z ní přepisuje. Neublastinová nukleová kyselina podle vynálezu dále zahrnuje molekuly polynukleotidů, které specificky hybridizují za příslušných hybridizačních podmínek s polynukleotidem, který kóduje neublas25 tinový polypeptid. Vynález se rovněž týká primerů nukleových kyselin, které je možné použít při identifikaci, izolaci a amplifikaci polynukleotidů, které kódují neublastinové polypeptidy nebo jejich fragmenty. V jistých provedeních vynálezu tvoří určité primery sondy specifické pro neublastín, které se používají při hybridizaci s neublastinovou nukleovou kyselinou, ale nikoliv s nukleovými kyselinami, které kódují jiné členy rodiny GDNF. Termín ‘'specifický, specifíta nebo specificky znamená schopnost hybridizovat s neublastinovou nukleovou kyselinou a neschopnost hybridizovat s ne-neublastinovou nukleovou kyselinou, včetně neschopnosti hybridizovat s nukleovými kyselinami, které kódují pouze ligandy GDNF (například GDNF, persefin a neurturin).

V jiném provedení vynálezu je neublastinová nukleová kyselina podle vynálezu identifikována jako komplementární s polynukleotidem, který kóduje neublastinový polypeptid, buď tím, že má komplementární sekvenci nukleové kyseliny, nebo demonstruje, že specificky hybridízuje při přísných podmínkách hybridizace s polynukleotidem, který kóduje neublastin. Neublastinové nukleové kyseliny mohou mít například sekvence označené SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ

ID NO: 8, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 29 a SEQ ID NO: 30, stejně jako primery SEQ ID NO: 17 až 28, 31 a 32. Neublastinová nukleová kyselina podle vynálezu dále zahrnuje jedinečnou podobnost nebo fragment neublastinové nukleové kyseliny neublastinu, včetně, bez omezení, fragmentů nukleové kyseliny zobrazených na obrázku č. 8. Neublastinové nukleové kyseliny podle vynálezu se mohou použít při expresi neublastinového polypeptidu, například expresí neublastinového polypeptidu in vitro nebo amplifikaci neublastinové nukleové kyseliny za účelem exprese ve zvířeti in vivo. Neublastinové nukleové kyseliny se mohou nacházet ve vektoru nukleové kyselina, například v expresním vektoru nebo v klonovacím vektoru. Neublastinová nukleová kyselina se může, ale nutně nemusí, udržovat, reprodukovat, přenášet nebo exprimovat jako součást vektoru nukleové kyseliny. Rekombinantní expresní vektor obsahující neublastinovou polynukleotidovou sekvenci se může zavést do buňky a/nebo v ní udržovat. Hostitelské buňky neublastinového vektoru mohou být prokaiyonty. V jiném případě se může neublastinová nukleová kyselina zavést do neukaryontní buňky, například do eukaiyotní buňky, která obsahuje vhodné vybavení pro post-translační zpracování polypeptidu na zralý protein a/nebo vhodné orgány pro vylučování polypeptidu do extrabuněčného prostředí buňky.

-2CZ 303358 B6

Vynález popisuje neublastinový neurotrofní faktor neublastin. Neublastin může být ve formě polypeptidu nebo to může být multimer dvou nebo více neublastinových polypeptidu, například ditner neublastinu. Neublastinové polypeptidy se sdružují do mulemerů prostřednictvím vnitrobu5 něěných strukturálních spojení, které jsou dobře známy v oboru, mezi něž patří bez omezení interakce cystein-cystein, sulfylhydrylové vazby a nekovalentní interakce. Konkrétní neublastinové polypeptidy mohou mít aminokyselinové sekvence označené jako SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 a SEQ ID NO: 16.

io

Neublastinový polypeptid podle vynálezu je použitelný při výrobě farmaceutické kompozice, která je rovněž předmětem vynálezu, tato kompozice je použitelná při ošetření poruch neuronů, které zahrnují bez omezení porušené a traumatizované neurony. Periferní nervy, které byly poškozeny, zahrnují, ale neomezují se na ně, nervy dřeně nebo míchy. Neublastinové polypeptidy je možné použít při léčbě neurodegenerativního onemocnění například cerebrálního ischemického neuronálního poškození, neuropatie, například periferní neuropatie, Alzheimerovy nemoci, Huntingtonovy nemoci, Parkinsonovy nemoci, amyotrofní laterální sklerózy (ALS). Neublastinové polypeptidy mohou najít použití při léčbě porušené paměti, například spojené s demencí.

Přihlašovatel identifikoval nukleovou kyselinu, která kóduje nový neutrofický faktor, který se zde označuje jako neublastin” nebo NBN. Neublastin je člen podtřídy neurotrofických faktorů získaných z linie gliových buněk (GDNF) nadrodiny transformačních růstových faktorů β (TGFβ).

cDNA kódující neublastin se původně identifikovala následujícím způsobem. Za použití algoritmu TBLASTN 1.4.11 (Atschul et al., Nucl. Acids Res. 1997 25 3389 až 3402) a lidského persefinu jako dotazu (GenBank číslo uložení AF040962) se na počátku v genomové sekvenci s vysokým prostupem (HGDT) na dvou lidských bakteriálních syntetických chromozomech (BAC) v GenBank AC005038 a AC005051 identifikoval fragment o velikosti 290 bp. AC005038 je tvořen přibližně 190 00 bp 5 kontigů neuspořádaných sekvencí a AC005051 je tvořen přibližně 132 000 bp 12 kontigů neuspořádaných sekvencí. Ukázalo se, že fragment o velikosti 290 bp identifikovaný ve dvou klonech BAC má oblasti, které jsou homologní, ale ne identické s kódující oblastí cDNA neutrofního faktoru, kterým je lidský persefin.

Z této sekvence o velikosti 290 bp se syntetizovaly dva PCR primery specifické pro neublastin: ”primer horního řetězce” (SEQ ID NO: 17) a primer spodního řetězce (SEQ ID NO: 18). Uskutečnilo se testování cDNA knihovny mozku lidského plodu. Počáteční testování zahrnuje testy založené na PCR v 96 prohlubních se dvěma primery PCR (SEQ ID NO: 17 a 18) knihovny cDNA Master Plate” z 500 000 cDNA klonů, které obsahují přibližně 5 000 klonů/prohlubeň.

Druhý test založený na PCR se uskutečnil v knihovně cDNA mozku lidského zárodku SubPlate”, která obsahuje glycerolový zásobní roztok E. coli s přibližně 5000 klonů/prohlubeň.

Fragment o velikosti 102 bp (SEQ ID NO: 13) se identifikoval v testech založených na PCR na Master Plate i Sub Plate. Vybral se pozitivní klon cDNA (obsahující fragment o velikosti

102 bp), byl nanesen na dvě plotny obsahující antibiotika a LB a nechal se růst přes noc. Z těchto ploten se vybralo celkem 96 bakteriálních kolonií a jednotlivě se nanesly do prohlubní na nové PCR destičce s 96 prohlubněmi, které obsahují oba primery PCR (SEQ ID NO: 17 a 18) a požadovaná činidla pro ampliflkaci PCR. Uskutečnila se amplifikace PCR a 96 jednotlivých reakcí PCR se analyzovalo elektroforézou na 2% agarózovém genu. Pak se identifikovala pozitivní kolonie s klonem obsahujícím fragment o velikosti 102 bp. Z pozitivní kolonie s obsahem fragmentu 102 bp se získala plazmidová DNA a sekvenovala se. Následná sekvenační analýza ukázala přítomnost celé délky cDNA o velikosti 861 bp (SEQ ID NO: 8). Otevřený čtecí rámec (ORF) o velikosti 663 bp nebo kódující oblast (CDS) identifikovaná v SEQ ID NO: 8, kóduje pre-pro-polypeptid (označený pre-pro-neublastin”) a je zobrazena v sekvenci SEQ ID NO: 9.

Na základě sekvence SEQ ID NO: 9 se identifikovaly tři varianty neublastinových polypeptidu. Tyto varianty zahrnují (i) polypeptid obsahující 140 aminokyselin, zde označený jako NBN140, který má aminokyse5 línovou sekvenci označenou SEQ ID NO: 10, (ii) polypeptid obsahující 116 aminokyselin, zde označený jako NBN116, který má aminokyselinovou sekvenci označenou jako SEQ ID NO: 11 a io (iii) polypeptid obsahující 113 aminokyselin, zde označený jako NBN113, který má aminokyselinovou sekvenci označenou jako SEQ ID NO: 12.

Celá sekvence cDNA obsahující 5' nepřekládanou DNA o velikosti 782 bp, kódující DNA o velikosti 663 bp a 3' nepřekládanou DNA o velikosti 447 bp (celkové množství 1992 bp) se uložila do GenBank s přístupovým číslem AF 120274.

Genomová sekvence kódující neublastin se identifikovala následujícím způsobem:

Za účelem klonování genomové sekvence kódující neublastin se připravila další sada primerů.

Pár primerů č. 1 obsahoval sense primer odpovídající sekvenci SEQ ID NO: 23 a antisense přiměř odpovídající SEQ ID NO: 24 a pár primerů č. 2 obsahoval sense primer odpovídající sekvenci SEQ ID NO: 25 a antisense primer odpovídající SEQ ID NO: 26.

Při použití páru primerů č. 2 se amplifikoval fragment DNA o velikosti 887 bp pomocí PCR z preparátu lidské genomové DNA a klonoval se do vektoru pCRlI (Invitrogen) a transformoval se do E. coli. Výsledný plazmid se sekvenoval a předpověděla se putativní sekvence cDNA (uvedená jako SEQ ID NO: 3) o velikosti 861 bp (kódující protein, nazývaný zde neublastin). Podobně za použití páru primerů č. 1 se získal PCR fragment DNA o velikosti 870 bp pomocí PCR lidské genomové DNA. V tomto fragmentu se našla další oblast o velikosti 42 bp na 3' konci otevře30 ného čtecího rámce (ORF) v porovnání se sekvencí o velikosti 887 bp. Genomová struktura genu neublastinu se předpověděla jeho porovnáním se sekvencemi nukleových kyselin jiných neurotrofních faktorů mapováním rozhraní exon-intron. Tato analýza ukázala, že gen neublastinu má alespoň dva exony oddělené intronem o velikosti 70 bp.

Tato sekvence se také použila k testování GenBank v případě sekvencí EST neublastinu. Tři byly identifikovány se vzorky AA844072, AA931637 a AQA533512 v GenBank, což ukazuje, že neublastinové nukleové kyseliny se přepisují na mRNA.

Porovnáním celé získané sekvence cDNA (AF 120274) a genomové sekvence přítomné ve vzorcích GenBank pod číslem AC005038 a AC005051 se ukázalo, že gen neublastinu je tvořen alespoň pěti exony (včetně tří kódujících), oddělenými čtyřmi introny (viz například obrázek č. 8). Společně mají exony předpovězenou aminokyselinovou sekvenci neublastinového polypeptidu plné délky. Je nutné také poznamenat, že se zjistilo, že fragment o velikosti 887 bp obsahuje celou kódující oblast pro-neoblastinu. Predpovězená cDNA (SEQ ID NO: 3) obsahuje otevřený čtecí rámec (ORF) kódující pro-neoblastin (181 aminokyselinových zbytků), které vykazuje homologii se třemi známými lidskými proteiny - persefinem, neurturinem a GDNF.

Neublastinové nukleové kyseliny podle vynálezu

Vynález popisuje polynukleotidy schopné exprimovat polypeptidy podle vynálezu. Polynukleotidy podle vynálezu zahrnují sekvence DNA, cDNA a RNA, stejně jako antisense sekvence a zahrnují přirozeně se vyskytující syntetické a záměrně manipulované polynukleotidy. Polynukleotidy podle vynálezu také zahrnují sekvence, které jsou degenerované jako výsledek genetického kódu, ale také zajišťují expresi neublastinového polypeptidu.

-4CZ 303358 B6

Termín polynukleotid znamená polymemí formu nukleotidů o délce alespoň 10 bází, přednostně alespoň 15 bází. Termín izolovaný polynukleotid označuje polypeptid, který bezprostředně nesousedí s oběma kódujícími sekvencemi, s nimiž bezprostředně sousedí (s jednou na 5^f konci a s druhou na 3' konci) v přirozeně se vyskytujícím genomu organismu, ze kterého se získal. Ter5 min tedy zahrnuje rekombinantní DNA, která se začlenila do expresního vektoru, do samostatně se replikujícího plazmidu nebo viru nebo do genomová DNA prokaryontu nebo eukaryontu, nebo která existuje jako oddělená molekula, například cDNA, nezávislá na jiných sekvencích.

Polynukleotidy podle vynálezu také zahrnují alelické varianty a mutované polynukleotidy io mající nukleotidovou sekvenci, která se liší od nukleotidových sekvencí přítomných zde v jedné nebo více polohách nukleotidů.

V preferovaném provedení vynálezu polynukleotid podle vynálezu má sekvenci nukleové kyseliny (DNA) schopnou hybridizovat s polynukleotidovou sekvencí uvedenou jako SEQ ID NO: 1, polynukleotidovou sekvencí uvedenou jako SEQ ID NO: 3, polynukleotidovou sekvencí uvedenou jako SEQ ID NO: 8 nebo polynukleotidovou sekvencí uvedenou jako SEQ ID NO: 15, s jejím komplementárním řetězcem nebo jeho sub-sekvencí při alespoň středních, středních/přísných nebo velmi přísných hybridizačních podmínkách, jak je podrobněji popsáno dále.

V jiném preferovaném provedení vynálezu má izolovaný polynukleotid podle vynálezu sekvenci nukleové kyseliny (DNA), která vykazuje alespoň 70%, přednostně alespoň 80%, zejména alespoň 90 % a zvláště 95 % homologie s polynukleotidovou sekvencí uvedenou jako SEQ ID NO: 1, polynukleotidovou sekvencí uvedenou jako SEQ ID NO: 3, polynukleotidovou sekvencí uvedenou jako SEQ ID NO: 8 nebo polynukleotidovou sekvencí uvedenou jako SEQ ID NO: 15.

V nejvíce preferovaném provedení vynálezu polynukleotid vykazuje sekvenci DNA uvedenou jako SEQ ID NO: 1, sekvenci DNA uvedenou jako SEQ ID NO: 3, sekvenci DNA uvedenou jako SEQ ID NO: 8 nebo polynukleotidovou sekvenci uvedenou jako SEQ ID NO: 15.

Vynález dále poskytuje nové primery a sekvence DNA vhodné pro identifikaci, izolaci a amplifikaci neublastinových polynukleotidů, které kódují expresi neublastinových polypeptidů nebo jejich fragmentů. Takové primery zahrnují polynukleotidy uvedené v SEQ ID NO: 17 až 28 a 31 až 32. Nejvíc vynález poskytuje neublastinové sekvence DNA vytvořené z těchto primerů, včetně těch uvedených v SEQ ID NO: 13 a 14. Dále tento vynález poskytuje sekvence DNA od 3' nebo

5' nepřekládaných oblastí (UTR) v genomové DNA, které lemují exony neublastinu; takové sekvence je možné použít při identifikaci, izolaci a amplifikací neuroblastinových polypeptidů, které kódují expresi neublastinových polypeptidů nebo jejích fragmentů.

Sekvence 3' UTR podle vynálezu zahrnují sekvence uvedené jako:

nukleotidy 721 až 865 SEQ ID NO: 1, nukleotidy 718 až 861 SEQ ID NO: 3, nukleotidy 718 až 861 SEQ ID NO: 8, nukleotidy 1647 až 2136 SEQ ID NO: 15 a souvislé sekvence obsahující mezi 10 až 25 nukleotidy, odvozené (tj. spadající do nich) z předchozích sekvencí (které jsou použitelné například jako primery).

Sekvence 5' UTR podle vynálezu zahrnují sekvence uvedené jako:

nukleotidy 1 až 10 SEQ ID NO: 1, nukleotidy 1 až 57 SEQ ID NO: 8, nukleotidy I až 974 SEQ ID NO: 15 a souvislé sekvence mezi 10 až 25 nukleotidy odvozené (tj. spadající do nich) z předchozích sekvencí (které jsou použitelné například jako primery).

Polynukleotidy podle vynálezu se mohou přednostně získat postupem klonování, například jak se popisuje v Current Protocols in Molecular Biology”, Jahn Wiley and Sons, lne. V preferovaném provedení vynálezu se polynukleotid klonuje z lidské genomové DNA nebo knihovny cDNA lidského mozku nebo se získává v jejím základě.

Homologie sekvencí DNA

Výše zmíněná homologie sekvence DNA se může stanovit jako stupeň shody mezi dvěma sekvencemi, který indikuje odchylky první sekvence od druhé. Homologie se může vhodně stanovit použitím známých počítačových programů, jako je GAP poskytovaný v programovém balíku GCG (Needleman, S., B. a Wunsch C. D., Journal of Molecular Biology, 1970, 48, 443 až 453). Za použití GAP s následujícím nastavením pro porovnání sekvencí DNA: kreační operátor GAP má hodnotu 5,0 a extensní operátor GAP má hodnotu 0,3, výše uvedená kódující oblast analogických sekvencí DNA vykazuje stupeň shody přednostně alespoň 70 %, zejména alespoň 80 %, výhodně alespoň 90 %, zvláště alespoň 95 %, s (kódující) částí sekvence DNA CDS zobrazené v SEQ DI NO: 1 nebo s (kódující) částí sekvence DNA CDS zobrazené v SEQ ID NO: 8, s (kódující) částí sekvence DNA CDS zobrazené v SEQ ID NO: 15.

Termín shoda sekvencí znamená stupeň ve kterém jsou dvě polynukleotidové sekvence shodné na bázi nukleotid-nukleotid v určité oblasti srovnání. Termín procento shody sekvence se vypočítá porovnáním dvou optimálně uspořádaných sekvencí v této oblasti porovnání, přičemž se stanovuje počet poloh se shodnými bázemi nukleové kyseliny (například A, t, C, G, VI nebo I), které se objevují v obou sekvencích, což udává počet párovaných poloh, vydělí se počet párovaných poloh celkovým počtem poloh v oblasti porovnání (tj. velikostí okna) a výsledek se znásobí 100 a získá se procento shody sekvence. Termín podstatná shoda se používá k označení charakteristiky polynukleotidové sekvence, kde polynukleotid obsahuje přednostně alespoň 85% shodu sekvence a často 90 až 95% shodu sekvence, častěji alespoň 99% shodu sekvence ve srovnání referenční sekvencí v porovnávací oblasti.

Hybridizační protokol

Polynukleotidy podle vynálezu mají sekvenci nukleové kyseliny, která je schopná hybridizovat s polynukleotidovou sekvencí uvedenou jako SEQ ID NO: 1, s polynukleotidovou sekvencí uvedenou jako SEQ ID NO: 3 nebo polynukleotidovou sekvencí uvedenou jako SEQ ID NO: 8 nebo s polynukleotidovou sekvencí uvedenou jako SEQ ID NO: 15 nebo s jejich komplementárním řetězcem nebo s jejich sub-sekvencí při alespoň středních, středních/přísných nebo velmi přísných podmínkách hybridizace, jak je podrobněji popsáno dále.

Experimentální podmínky vhodné pro stanovení hybridizace mezi nukleotidovou sondou a homologní sekvencí DNA nebo RNA zahrnují smočení filtru, který obsahuje fragmenty DNA nebo RNA, pro hybridizaci v 5x SSC (chlorid sodný/citrát sodný, viz Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, NY 1989) po dobu 10 minut a prehybridizaci filtru v roztoku 5X SSC, 5x Denhardtův roztok (viz Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring harbor Lab., Cold Spring Harbor, NY, 1989), 0,5 % SDS a 100 pg/ml DNA denaturovaného sonifíkovaného spermatu lososa (viz Sambrook et al., Molecular Coning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, NY 1989), s následnou hybridizaci ve stejném roztoku, obsahující 10 ng/ml náhodně se vázající [Feinberg A P a Vogelstein B, Anal. Biochem. 1983, 132, 6 až 13]sondy značené ³²P-dCTP (specifická aktivita větší než lxlO⁹ cpm/pg) po dobu 12 hodin při teplotě přibližně 45 °C. Filtr se pak promyje dvakrát po dobu 30 minut v pufru 0,1 x SSC, 0,5 % SDS při teplotě

-6CZ 303358 B6 alespoň 60 °C (středně přísné podmínky), přednostně alespoň 65 °C (středně/velmi přísné podmínky), zejména alespoň 70 °C (přísné podmínky) a zvláště alespoň 75 °C (velmi přísné podmínky). Molekuly, se kterými oligonukleotidová sonda hybridizuje za těchto podmínek, se mohou detekovat za použití rentgenového filmu.

Klonované polynukleotidy

Izolovaným polynukleotidem podle vynálezu může být zejména klonovaný polynukleotid. Termín klonovaný polynukleotid'* znamená polynukleotid nebo sekvenci DNA klonovanou v souío ladu se standardními postupy klonování v současnosti používanými při genových manipulacích ke změně polohy segmentu DNA, kterým může zvláště být cDNA, tj. enzymaticky získaného z RNA, z jeho přirozené polohy na jiné místo, kde se bude reprodukovat.

Klonování se může uskutečnit libovolným vhodným způsobem a může zahrnovat metody, jako jsou reverzní transkripční technologie, PCR technologie a podobně, stejně jako excize a izolace požadovaného segmentu DNA.

Klonovaný polynukleotid podle vynálezu se může také označovat jako konstrukt DNA nebo izolovaná sekvence DNA a může se jednat zejména o komplementární DNA (cDNA).

Biologické zdroje

Izolovaný polynukleotid podle vynálezu se může získat z jakéhokoli vhodného zdroje.

V preferovaném provedení vynálezu, se polynukleotid podle vynálezu klonuje z knihovny cDNA nebo na jejím zárodku nebo dospělého jedince, zvláště pak předního mozku, zadního mozku, kůry mozkové, corpus striatum, mandlí, mozečku, nucleus caudatus, corpus callosum, hipokampu, nucleus thalamicus, nucleus subthalamicus, čichového nukleu, putamen, substantia nigra, dorzálního kořenového ganglia, ganglia trojklanného nervu, superiomí mezenterické arterie nebo thalamu, míchy, srdce, placenty, plic, jater, kosterního svalstva, ledvin, jater, pankreatu, střev, oka, sítnice, zubní dřeně, vlasového folikulu, prostaty, podvěsku mozkového nebo průdušnice.

Komerční knihovna cDNA z různých tkání, ať lidských nebo zvířecích, jsou dostupné například od firmy Stratagene a Clontech. Izolovaný polynukleotid podle vynálezu se může získat stan35 dardními metodami, například popsanými v příkladech.

Neublastinové polypeptidy podle vynálezu

Jak je výše uvedeno, neublastinový polypeptiď’ zde znamená polypeptid, který má neurotrofic40 kou aktivitu (například jak se popisuje v příkladu 6, 7, 8 a 9) zahrnuje ty polypeptidy, které mají aminokyselinovou sekvenci, která vykazuje alespoň 70% homologii s neublastinovými polypeptidy uvedenými v AK-95-AK105 v sekvenci SEQ ID NO: 2 , AK,-AK|₀₅ v sekvenci SEQ ID NO: 2, AK-qt-AKho v sekvenci SEQ ID NO: 4, AK-41-AK140 v sekvenci SEQ ID NO: 4, AKjAKuo v sekvenci SEQ ID NO: 4, AK ₈o-AK]_4o v sekvenci SEQ ID NO: 9, (divoký typ prepro),

AKL41-AK140 v sekvenci SEQ ID NO: 9 (pro) ΑΚι-ΑΚμο v sekvenci SEQ ID NO: 5 (maturovaný, 140 AK), AK1-AK116 v sekvenci SEQ ID NO: 6 (maturovaný, 116Ak) AKi-AKn₃ v sekvenci SEQ ID NO: 7, (maturovaný, 113Ak), AKi-AKi₄₀ v sekvenci SEQ ID NO: 10 (maturovaný, 140ΑΚ), AKi-AK_n6 v sekvenci SEQ ID NO: 11 (maturovaný, 116ΑΚ), AK|-AK_H3 v sekvenci SEQ ID NO: 12 (maturovaný 113 AK), AK_t-AK₂₂₄ v sekvenci SEQ ID NO: 16 (myší prepro), a varianty a deriváty každého z výše uvedených polypeptidů.

Upřednostňuje se, aby C-terminální sekvence shora uvedených neublastinových polypeptidů měla aminokyselinovou sekvenci uvedenou v AK₇₂-AKi_O5 v sekvenci SEQ DI NO: 2 (to je AK107-AK14O v sekvenci SEQ ID NO: 9), zejména ΑΚ41-ΑΚ105 v sekvenci SEQ ID NO: 2 (to je

AK76-AK140 v sekvenci SEQ ID NO: 9).

Také se upřednostňuje, aby neublastinový polypeptíd obsahoval 7 konzervativních zbytků Cys, které jsou charakteristické pro rodinu GDNF a nad rod inu TGF-beta.

Přednostně má neublastinový polypeptíd aminokyselinovou sekvenci s vyšší než 85% homologií, přednostně s vyšší než 95% homologií s výše uvedenými sekvencemi (to je AK95-AK105 v sekvenci SEQ ID NO: 2, AK1-AK105 v sekvenci SEQ ID NO: 2, AK 97-AK₁₄₀ v sekvenci SEQ ID NO: 4, AK 41-AK140 v sekvenci SEQ ID NO: 4, ΑΚι-ΑΚ^ο v sekvenci SEQ ID NO: 4, AK.g<jAKmo v sekvenci SEQ ID NO: 9 ('‘divoký typ prepro), AK41-AK140 v sekvenci SEQ ID NO: 9 (pro), AK1-AK140 v sekvenci SEQ ID NO: 5 (zralý I40AK), AK_t-AKn6 v sekvenci SEQ ID NO: 6 (zralý 116 AK), A^-AKm v sekvenci SEQ ID NO: 7 (zralý 113Ak), AKp-AKuo v sekvenci SEQ ID NO: 10 (zralý 140AK), AK,-AK_U6 v sekvenci SEQ ID NO: 11 (zralý 116AK), AK_tAKtn v sekvenci SEQ ID NO: 12 (zralý 113AK), AK)-AK₂₂₄ v sekvenci SEQ ID NO: 16 (myší prepro)) a přednostně libovolný z uvedených polypeptidů s C-terminální sekvencí shora identifikovaných neublastinových polypeptidů má aminokyselinovou sekvenci uvedenou v sekvenci AK₇₂-AK,_O5 v SEQ ID NO: 2 (to je AK,_O7-Ak,₄o v SEQ ID NO: 9), přednostně AK4_t-AK,₀5 v SEQ ID NO: 2 (to je AK₇₆-AK,₄o v SEQ ID NO: 9) nebo AK,₉,-AK₂₂₄ v SEQ ID NO: 16.

Vynález dále zahrnuje polypeptídy, které mají aminokyselinovou sekvenci vykazující alespoň 70% homologií s myšími neublastinovými polypeptídy uvedenými v AKi-AK₂₂₄ v SEQ ID NO: 16.

Přednostní polypeptídy podle vynálezu v jednom provedení reprezentuje prepro sekvence (jak se uvádí v SEQ ID NO: 2, 4, 9, resp. 16) pro sekvence (jak se uvádí v AK_₇₅-AK|₀₅ v SEQ ID NO: 2 nebo ΑΚ^|-ΑΚ₁₄₀ v SEQ ID NO: 4, resp. 9) a zralá sekvence neoblastinu (jak se uvádí v SEQ IDNO:5,6,7, 10, II nebo 12, přednostně SEQ ID NO: 10, 11, 12).

Polypeptídy podle vynálezu zahrnují variantní polypeptídy. Termín variantní polypeptíd znamená polypeptíd (nebo protein), který má aminokyselinovou sekvenci, jež se liší od sekvence prezentované jako SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 nebo SEQ ID NO: 16 v jedné nebo více poloh aminokyselin. Takové variantní polypeptídy zahrnují výše popsané modifikované polypeptídy, stejně jako konzervativní substituce, varianty sestřihu, izoformy, homology od jiných druhů a polymorfismy.

Jak se zde definuje, konzervativní substituce znamená nahrazení aminokyselinového zbytku jiným, biologicky podobným zbytkem. Například lze očekávat, že konzervativní substituce aminokyselin budou mít malý nebo vůbec žádný vliv na biologickou aktivitu, zvláště když představují méně než 10 % celkového počtu zbytků v polypeptidu nebo proteinu. Konzervativní substituce aminokyselin přednostně reprezentují změny u méně než 5 % polypeptidu nebo proteinu, zejména změny menší než 2 % polypeptidu nebo proteinu (například když se použije systém výpočtu v souladu sNBNl 13, nejvíce preferované konzervativní substituce budou reprezentovat méně než 3 substituce aminokyselin ve zralé aminokyselinové sekvenci divokého typu). Ve zvláště preferovaném provedení vynálezu existuje ve zralé sekvenci substituce jediné aminokyseliny, kde jak substituovaná, tak nahrazující aminokyselina není cyklická.

Další příklady zvláště konzervativních substitucí zahrnují substituci jednoho hydrofobního zbytku, jako je isoleucin, valin, leucin nebo methionin, za jiných nebo substituci jednoho polárního zbytku za jiný tak, že lysin je nahrazen argininem, kyselina asparagová kyselinou glutamovou nebo asparagin glutamínem a podobně.

Termín konzervativní substituce také zahrnuje použití substituovaného aminokyselinového zbytku místo původního nesubstituovaného aminokyselinového zbytku, pokud protilátky vzniklé proti substituovanému polypeptidu také imunologicky reagují s nesubstituovaným polypeptidem.

-8CZ 303358 B6

Modifikace této primární aminokyselinové sekvence může vést ke vzniku proteinů, které vykazují v podstatě ekvivalentní aktivitu ve srovnání s nemodifikovaným polypeptidem, a tak se mohou považovat za funkční analogy původních proteinů. Takové modifikace mohou být záměrné, například místně řízenou mutagenesí, nebo se mohou objevit spontánně a zahrnují varianty sestřihu, izoformy, homology od jiných druhů a polymorfismy. Takové funkční analogy jsou ve vynálezu také zahrnuty.

Modifikace primární aminokyselinové sekvence mohou dále vést ke vzniku proteinů, které si neponechávají biologickou aktivitu původního proteinu, včetně dominantních negativních forem atd. Dominantní negativní protein může interferovat s proteinem divokého typu navázáním nebo jiným maskováním regulačních činidel, jako jsou komponenty ležící proti nebo po směru exprese genu, které normálně funkčně interagují s polypeptidem. Takové dominantní negativní formy vynálezu také zahrnuje.

Termín signální peptid znamená peptidickou sekvenci, která řídí nově syntetizovaný polypeptid, k němuž je signální peptid připojen v endoplazmatickému retikulu (ER) pro další post-translační zpracování a distribuci.

Termín heterologní signální peptid se používá ve spojení s neublastinem a znamená signální peptid, který není lidský neublastinový signální peptid, typicky signální peptid některého savčího proteinu jiného než neublastin.

V oboru je známo, že sekvence DNA lidského neublastinu (buď cDNA, nebo genomové DNA) nebo sekvence, které se liší od DNA lidského neublastinu, mohou být v důsledku tichých změn kodonu nebo změn kodonu, které produkují konzervativní aminokyselinové substituce, mohou být používány při genetické modifikaci kultivovaných lidských buněk tak, že budou nadměrně exprimovat a vylučovat enzym.

Polypeptidy podle vynálezu také zahrnují chimerové polypeptidy nebo štěpitelné fúzní polypeptidy, ve kterých je fúzován s N-koncem nebo s C-koncem polypeptídu nebo jeho fragmentu jiný polypeptid. Chimerový polypeptid se může produkovat fúzí sekvence nukleové kyseliny (nebo její části), která kóduje jiný polypeptid, se sekvencí nukleové kyseliny (nebo s její částí) podle vynálezu.

Metody produkce chimerových polypeptidů jsou standardní metody. Takové metody obvykle vyžadují spojení sekvencí takovým způsobem, že se obě nacházejí ve stejném čtecím rámci, a expresi fúzovaného polypeptidů za řízení stejného promotoru(ů) a terminátoru.

Polypeptidy podle vynálezu také zahrnují zkrácené formy úplné molekuly neublastinu. U takových zkrácených molekul je deletována jedna nebo více aminokyselin z N-konce nebo C-konce, přednostně z N-konce.

Homologie aminokyselinových sekvencí

Stupeň, do něhož zkoumaný peptid sdílí homologii s neublastinovým polypeptidem podle vynálezu, se stanoví jako stupeň shody mezi dvěma aminokyselinovými sekvencemi. Vysoký stupeň shody sekvence ukazuje na pravděpodobnost, že první sekvence se odvodila od druhé sekvence.

Homologie se stanoví počítačovou analýzou za použití například počítačového programu pro uspořádání sekvencí ClustalX (Thompson JD, Gibson TJ: Plewniak F, Jeanmougin F, Higgins DG: The ClustaíIX Windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by guality analysis tools, Nucleic Acids Res. 1997, 25 (24): 4876 až 82) a zde popsaných standardních parametrů. Za použití tohoto programu zralá Část polypeptidů kódovaná analogickou sekvencí DNA podle vynálezu vykazuje stupeň shody alespoň 90 %, zejména alespoň 95 % a zvláště alespoň 98 % s aminokyselinovou sekvencí popsanou zde v SEQ ID NO: 2, SEQ ID

-------------_₉_

NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SE ID

NO: 11, SEQ ID NO: 12 nebo SEQ ID NO: 16.

Na základě stanovení homologie je potvrzeno, že polypeptid podle vynálezu patřící do nadrodiny

TGF-β je příbuzný podrodině GDNF, ale reprezentuje samostatného člena této podrodiny.

B ioakti vn í polypeptidy

Polypeptid podle vynálezu se může připravit v bioaktivní formě, včetně forem pre-pro-proteinů, J pro-proteinů, zralých proteinů, gly kosy lo váných proteinů, fosforylovaných proteinů nebo libovolného jiného posttranslačně upraveného proteinu.

Polypeptid podle vynálezu může být zejména N-glykosylovaný polypeptid, kteiý je přednostně glykosylován na N-zbytcích, označených v seznamu sekvencí.

V preferovaném provedení může mít polypeptid podle vynálezu aminokyselinovou sekvenci uvedenou jako SEQ ID NO: 9, která obsahuje glykosylovaný asparaginový zbytek v poloze 122, aminokyselinovou sekvenci uvedenou jako SEQ ID NO: 10, která obsahuje glykosylovaný asparaginový zbytek v poloze 122, aminokyselinovou sekvenci uvedenou jako SEQ ID NO: 11, která obsahuje glykosylovaný asparaginový zbytek v poloze 98, nebo aminokyselinovou sekvenci uve- * děnou jako SEQ ID NO: 12, která obsahuje glykosylovaný asparaginový zbytek v poloze 95.

Tento vynález rovněž zahrnuje neublastinové fúzní proteiny, jako jsou Ig-fúze, jak se popisuje například v patentu Spojených států US 5 434 131.

Neublastinový polypeptid podle vynálezu může zahrnovat alelové varianty, například polypeptidové aminokyselinové sekvence SEQ ID NO: 5 až 7, kde Xaa označuje Asn nebo Thr a Yaa označuje Ala nebo Pro.

Biologický původ

Polypeptid podle vynálezu se může izolovat ze savčích buněk, přednostně z lidské buňky nebo buňky myšího původu.

V nejvýhodnějším provedení může být polypeptid podle vynálezu izolován z tkáně lidského srdce, z lidských kosterních svalů, z lidského pankreatu nebo z tkáně lidského mozku, zvláště z nukleus pankreatu nebo z tkáně lidského mozku, zvláště z nucleus caudatus nebo z thalamu, nebo se může získat z DNA savčího původu, jak se podrobněji popisuje dále.

Neurotrofní aktivita

Neublastinové polypeptidy podle vynálezu se mohou použít při úpravě metabolismu, růstu, diferenciace nebo přežití nervové nebo neuronální buňky. Zejména se neublastinové polypeptidy používají k léčbě nebo ke zmírněni poruchy nebo onemocnění u živých zvířat a lidí, reaguje-1 i tato porucha nebo onemocnění na činnost neurotrofního činidla. Takové léčby a metody se podrobněji popisují dále.

Protilátky

Neublastinové polypeptidy nebo polypeptidové fragmenty podle vynálezu se používají k produkci protilátek specifických pro neublastin. Protilátka specifická pro neublastin zde znamená protilátku, například polyklonální nebo monoklonální protilátku, která je imunologicky reaktivní s neublastinovým polypeptídem nebo polypeptidovým fragmentem nebo která se specificky váže na epitop neublastinového polypeptidu.

-10CZ 303358 B6

Příprava polyklonálních a monoklonálních protilátek je v oboru známa. Polyklonální protilátky se mohou zvláště získat způsobem, který popisuje například Green et al., Production of Polyclonal Antiséra v Immunological protocols (Manson Ed.), Humana Press, 1992, str. 1 až 5, Coligan et al., Production of Polyclonal Antiséra in Rabbits, Rats, Mica and Hamsters v Current Protocols in Immunology, 1992, Section 2.4.1. a Ed Harlow a David Lané (Eds.) v Antibodies: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Lab. Press 1988. Monoklonální protilátky se mohou zvláště získat postupy, které popisuje například Kohler a Milstein, Nátuře, 1975, 256: 249, Coligan et al., Current Protocols in Immunology, 1992, Sections 2.5.1 až 2.6.7 a Harbow et al., v Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Pub., 1988, str. 726.

to

Stručně řečeno je možno monoklonální protilátky získat injekcí přípravku zahrnujícího antigen například myším; načež se produkce protilátek ověří odebráním vzorku séra, odebráním sleziny za účelem získání B lymfocytů, fúzí B lymfocytů s buňkami myelomu za vzniku hybridomů, klonováním hybridomů, selekcí pozitivních klonů, které produkují protilátky proti antigenu a izolaci protilátek z kultur hybridomů.

Monoklonální protilátky se mohou izolovat a čistit z kultur hybridomů různými dobře zavedenými metodami, které zahrnují afinitní chromatografii na Sepharose s proteinem A, chromatografii dělicí na základě velikosti a chromatografii s výměnou iontů (viz například coligan et al.,

Current Protocols in Immunology, 1992, Section 2.7.1 až 2.7.12 a Section 2.9.1 až 2.9.3, a Bames et al., Purifícation for Immunoglobulin G (igG) v Methods in Molecular Biology, Humana Press, 1992, Vol. 10, str. 79 až 104. Polyklonální a monoklonální protilátky se mohou popřípadě dále čistit, například navázáním na matrici a eluci z matrice, na které je vázán polypeptid, proti kterému protilátky vznikly.

Protilátky, které se vážou na neublastinový polypeptid podle vynálezu, mohou být připravovány za použití intaktního polypeptidů nebo fragmentů, které obsahují jako imunizační antigen příslušné malé peptidy. Polypeptid užívaný k imunizaci zvířete se může také získat rekombinací DNA nebo chemickou syntézou a může se popřípadě konjugovat s nosičovým proteinem. Běžně použí3o váné nosičové proteiny, které se chemicky spojují s peptidem, zahrnují hemokyanin přílipkovitých plazů (KLH), thyroglobulin, albumin bovinního séra (BSA) a toxoid tetanu. Napojený peptid se pak může použít k imunizaci zvířete, kterým může být zvláště myš, krysa, křeček nebo králík.

V jednom provedení vynálezu se protilátky produkují za použití následujících peptidů:

Peptid 1: CRPTRYEAVSFMDVNST (aminokyseliny 108-124 SEQ ID NO: 9) nebo

Peptid 2: ALRPPPGSRPVSQP (aminokyseliny 93-107 SEQ ID NO: 9). Metody produkce protilátek za použití těchto polypeptidů jsou popsány v příkladu 10:

Vytvořili jsme také králičí polyklonální protilátky proti následujícím peptidům:

peptid R27: GPGSRARAAGARGC (aminokyseliny 30 až 43 SEQ ID NO: 9) peptid R28: LGHRSDELVRFRFC (aminokyseliny 57 až 70 SEQ ID NO: 9) peptid R29: CRRARSPHDLSL (aminokyseliny 74 až 85 SEQ ID NO: 9) peptid R30: LRPPPGSRPVSQPC (aminokyseliny 94 až 107 SEQ ID NO: 9) a peptid R31: STWRTVDRLSATAC (aminokyseliny 123 až 136 SEQ ID NO: 9)

V této skupině na Western blotu rozeznaly denaturovaný protein za redukčních podmínek pouze peptidy R30 a R31, které jsou relativně blízko C-konci.

- II CZ 303358 B6

Identifikovali jsme také další peptidy odvozené od neublastinu, které se získaly ze zralého proteinu, jak se popisuje dále, které tvoří předpokládané smyčky exponované na povrchu založené na známé struktuře GDNF (Eigenbrot a Gerber, Nat. Struct. Biol. 1997, 4, 435 až 438), a jsou tedy použitelné při přípravě protilátek.

oblast I: CRLRSQLVPRALGLGHRSDELVRFRFC (AK43-70 SEQ ID NO: 9) oblast 2: CRRSARSPHDLSLASLLGAGALRPPPGSPVSQPC (AK74-107 SEQ ID NO: 9) oblast 3: CRPTRYEAVSFMDVNSTWRTVDRLSATAC (AK 108-136 SEQ ID NO: 9)

V dalším aspektu vynálezu mohou být protilátky, které se specificky váží na neublastinové nebo od neublastinu odvozené polypeptidy používány při detekci přítomnosti takových neublastinových neurotrofických faktorů v různých médiích a zvláště při diagnóze stavů nebo onemocnění spojených s molekulami neoblastinu podle vynálezu. V oboru je známo mnoho protokolů v případě takové detekce, včetně ELISA, RIA a FACS.

Protilátky podle vynálezu se také mohou použít při blokování účinku neurotforického faktoru, a mohou to být zvláště neutralizační protilátky.

Metody produkce polypeptidu podle vynálezu

Buňka obsahující sekvenci DNA kódující neublastinový polypeptid podle vynálezu se kultivuje za podmínek, které umožňují produkci polypeptidu, načež se polypeptid získává z kultivačního média, jak se podrobněji popisuje dále. Mají-li být buňky geneticky modifikovány za účelem produkce neublastinového polypeptidu, mohou být upravovány běžnými způsoby nebo aktivací genu.

V souladu s běžnými metodami může být molekula DNA, která obsahuje cDNA neublastinu nebo sekvenci genomové DNA, obsažena v expresním konstruktu a může se transfekovat do buněk standardními metodami, které zahrnují, ale nejsou omezeny na transfekci zprostředkovanou liposomy, polybrenem nebo DEAE-dextranem, elektroporací, sražení fosforečnanem vápenatým, zavedení mikroinjekcí nebo ve formě mikroprojektilů s vysokou rychlostí (biolistika), V jiném případě je možné použít systém, který zavádí DNA pomocí virového vektoru. Víry, o nichž je známo, že jsou vhodné pro transfer genu, zahrnují adenoviry, adeno-asociovaný virus, lentivirus, herpesvirus, virus příušnic, poliovirus, retroviry, virus Sindbis a virus vakcinie, jako je virus planých neštovic, stejně jako infekce bakuloviry u hmyzích buněk, zvláště hmyzích buněk SfP9.

V jiném případě se buňky mohou upravit za použití přístupu genové aktivace (GA), jak se popisuje v patentech US 5 733 761 a US 5 730 376.

Termín geneticky modifikovaný, jak se zde používá ve vztahu k buňkám, má zahrnovat buňky, které exprimují určil·/ genový produkt po zavedení molekuly DNA kódující tento genový produkt a/nebo regulačních elementů, které řídí expresi sekvence kódující tento genový produkt. Molekula DNA se může zavést cílením genu, což umožňuje začlenění molekuly DNA do určitého místa genomu.

Rekombinantní expresní vektory

V dalším provedení poskytuje vynález rekombinantní expresní vektor, který obsahuje polynukleotid podle vynálezu. Rekombinantním expresním vektorem podle vynálezu může být jakýkoli vhodný eukaryontní expresní vektor. Preferované rekombinantní expresní vektory jsou pTEJ-8, který obsahuje ubiquitinový promotor (Johansen Te, Schoeller MS, Tolstoy S, Schwartz T, FEBS Lett. 1990, 267, 289 až 294) a jeho deriváty, například pUbilZ. Preferovaný obchodně dostupný eukaryotní expresní vektor je například virový promotor obsahující vektor pcDNA-3 (od firmy Invitrogen). Jiný preferovaný expresní vektor používá časný promotor SV40 a hlavní

-12CZ 303358 Β6 pozdní promotor adenoviru (získaný z plazmidu pAD2beta, Norton and Coffin, Mol. Cell, Biol. 1985, 5,281).

Vynález dále poskytuje prokaryontní expresní vektory a syntetické geny (syngeny) s optimalizovanými kodony vhodnými pro expresi v prokaryontech. Syngeny se zkontrolovaly tak, aby obsahovaly nižší obsah GC a preferované bakteriální kodony (například E. coli). Syn gen se klonuje do dvou vektorů, pET19b a pMJB164, což je derivát pET19b. Konstrukce s pET19b je zobrazena na obrázku č. 14. V tomto konstruktu se sekvence kódující zralou doménu neublastinu přímo fúzuje s počátečním methininem. Konstrukce s pMJB164 je zobrazena na obrázku č. 15.

Produkční buňky

V dalším aspektu poskytuje vynález geneticky upravené buňky tak, aby obsahovaly izolovanou polynukleotidovou sekvenci podle vynálezu a/nebo rekombinantní expresní vektor podle vynálezu. Buňka podle vynálezu může zvlášté být geneticky upravena tak, aby došlo k dočasné nebo stabilní expresi, nadměrné expresi nebo společné expresi polypeptidu podle vynálezu. Způsoby generující dočasnou a stabilní expresi jsou v oboru známy.

Polynukleotid podle vynálezu se může začlenit do expresního vektoru, například plazmidu, viru nebo jiného nástroje exprese, a může se operativně spojit se sekvencemi řídícími expresi ligací tak, že exprese kódující sekvence se dosáhne za podmínek, které jsou kompatibilní se sekvencemi řídícími expresi. Vhodné sekvence řídící expresi zahrnují promotory, zesilovače, terminátory transkripce, startovací kodony, signály sestřihu pro introny a stop kodony, všechny udržované ve správném čtecím rámci polynukleotidu podle vynálezu tak, aby umožňovaly správnou translaci mRNA. Sekvence řídicí expresi mohou také zahrnovat další komponenty, jako jsou vedoucí sekvence a sekvence fuzních partnerů.

Jako promotor se může zvláště využít konstitutivní nebo indukovatelné promotor. Když probíhá klonování do bakteriálních systémů, používají se indukovatelné promotory, jako je pL bakteriofágu λ, plac, ptrp, ptač (hybridní promotor ptrp-lac). Když se klonuje do savčích systémů, mohou se použít promotory získané z genomu savčích buněk, například ubiguitinový promotor, promotor TK nebo promotor metalothioneinu, nebo ze savčích virů, například pouhá terminální repetíce retroviru, adenovirový pozdní promotor nebo promotor 7,5K viru vakcinie. Mohou se také použít promotory získaní rekombinací DNA nebo syntézou, aby se dosáhlo transkripce polynukleotidu podle vynálezu.

Vhodné expresní vektory v typickém případě obsahují počátek exprese, promotor a rovněž specifické geny, které umožňují fenotypickou selekci transformovaných buněk, a zahrnují vektory, jako je expresní vektor založený na T7 pro expresi v bakteriích (Rosenberg et al., Gene 1987, 56, 125) pTEJ—8, pUbilZ, pcDNA-3 a pMSXND, expresí vektory pro expresi v savčích buňkách (Lee a Nathans, J. Biol. Chem. 1988, 263, 3521), vektory odvozené z bakulovirů pro expresi ve hmyzích buňkách a oocytový expresní vektor PTLN (Lorenc C, Pusch M a Jentsch T J, Heteromultimeric CLC chloride channels with novel properties, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 1996, 93, 13 362 až 13 366).

V preferovaném provedení je buňkou podle vynálezu eukaryotní buňka, například savčí buňka, například lidská buňka, oocyt nebo kvasinková buňka. Buňka podle vynálezu může bez omezení být buňka ledvin lidského zárodku (HEK), například buňka HEK 293, buňka BHK21, buňka vaječníků čínského křečka (CHO), oocyt Xenopus leavis (XLO). V jiném provedení je buňkou podle vynálezu buňka plísně, například buňka vláknité houby. V jiném výhodném provedení vynálezu je buňkou hmyzí buňka, zvláště buňka Sf9. Další preferované savčí buňky podle vynálezu jsou buněčné linie PC 12, HiB5, RN33b a lidské neuronové progenitorové buňky. Nejvíce se preferují lidské buňky.

- 13 CZ 303358 B6

Příklady primárních a sekundárních buněk zahrnují fibroblasty, epiteliální buňky včetně mléčné žlázy a střevní epiteliálních buněk, endoteliální buňky, elementy krve zahrnující lymfocyty a buňky kostní dřevě, glyové buňky, hepatocyty, keratinocyty, buňky svalů, neuronové buňky i nebo prekursory těchto typů buněk.

,·;

Příklady imortalizovaných lidských buněčných linií, které jsou použitelné v uvedených metodách ž zahrnují, ale nejsou na ně omezeny, buňky Bowesova melanomu (číslo uložené ATCC je CRL 9607), Daudiho buňky (číslo uložení ATCC je CCL 213), buňky HeLa a deriváty buněk HeLa (číslo uložené ATCC je CCL 240), buňky HT-1080 (číslo uložené ATCC je CCL 121), Jurka- ;

io lovy buňky (číslo uložené ATCC je TIB 152), buňky karcinomu KB (číslo uložení ATCC je CCL 17), buňky leukemie K-562 (číslo uložení ATCC je CCL 243), buňky karcinomu prsu MCF-7 (číslo uložení ATCC je BTH 22), buňky MOLT-4 (číslo uložení ATCC 1582), buňky Namalwa (číslo uložení ATCC je CRTL 1432), buňky Ráji (číslo uložení ATCC je CCL 86), buňky RPM1 8226 (číslo uložení ATCC je CRL 155), buňky U-937 (číslo uložení ATCC je CRL 1593), subli15 nie buněk 2R4 W1-38VA13 (číslo uložení ATCC je CLL 75.1) a buňky karcinomu vaječníků 2780AD (Van der Blick et al., Cancer Res. 1988, 48, 5927 až 5932), stejně jako buňky heterohybridomu produkované fúzi lidských buněk a buněk jiného druhu. Mohou se také použít sekundární kmeny lidských fibroblastů, jako jsou Wi-38 (číslo uložení ATCc je CCL 75) a MCR-5 (číslo uložení ATCC JE CCL 171).

V případě, že buňka podle vynálezu je eukaryotní buňka, začlenění heterologního polynukleotidu podle vynálezu se může provést infekcí (použitím virového vektoru), transfekcí (použitím plazmídového vektoru), použitím precipitace fosforečnanem vápenatým, mikroinjekcí, elektroporací, lipofekcí nebo jinými fyzikálně-chemickými metodami, které jsou známé v oboru.

V preferovaném provedení vynálezu izolovaná polynukleotidová sekvence podle vynálezu a/nebo rekombinantní expresní vektor podle vynálezu se transfekuje do savčí hostitelské buňky, neuronové progenitorové buňky, astrocytové buňky, T-buňky, krvetvorné kmenové buňky, nedělící se buňky nebo cerebrální endoteliální buňky, která obsahuje alespoň jednu molekulu DNA, schopnou zprostředkovat buněčnou imortalizaci a/nebo transformaci.

Aktivace endogenního genu v hostitelské buňce se může provést zavedením regulačních elementů, zvláště zavedením promotoru schopného způsobit transkripci endogenního genu, který kóduje neublastinový polypeptid podle vynálezu.

Farmaceutické kompozice

V dalším aspektu poskytuje vynález nové farmaceutické kompozice obsahující terapeuticky účinné množství polypeptidu podle vynálezu.

V případě použití při terapii je možné polypeptid podle vynálezu aplikovat libovolnou vhodnou formou. V preferovaném provedení se polypeptid podle vynálezu začlení do farmaceutické kompozice spolu s jedním nebo více adjuvanty, plnidly, nosiči a/nebo ředidly a farmaceutický prostředek připraví odborník za použití běžných metod.

Takové farmaceutické prostředky mohou obsahovat polypeptid podle vynálezu nebo zde popsané protilátky. Farmaceutický prostředek se může aplikovat samotný nebo v kombinaci s jedním nebo více dalšími činidly, léky nebo hormony.

Farmaceutický prostředek podle vynálezu se může aplikovat libovolným vhodným způsobem, zahrnujícím, ale neomezujícím se na ně, orální, intravenózní, intramuskulámí, interarteriální, intramembranózní, intratekální, intraventrikulámí, transdermální, podkožní, intraperitoneální, intranasální, anterální, povrchový, podjazykový nebo rektální, lícní, vaginální, intraorbitální, intracerebrální, intrakraniální, intraspinální, intracistemální, intrakapsulámí, intrapulmonální a transmukosální aplikaci nebo aplikaci inhalací.

- 14CZ 303358 B6

Intrapulmonální metody zavedení, přístroje a léčba se popisují například v americkém patentu US 5 785 049, US 5 780 019 a US 5 775 320. Aplikace se může provést opakovanou injekcí bolusu přípravku nebo kontinuální intravenózní nebo intraperitoneální aplikací z rezervoáru, který je vně (například IV sáček), nebo uvnitř těla (například bioerodovatelný implantát, biogenní umělý orgán nebo kolonie implantovaných buněk produkujících neublastin; popisuje se například v amerických patentech US. 4 407 957, US 5 798 113 a US 5 800 828). Metody intrapulmonálního zavedení a přístroje se popisují například v americkém patentu US 5 654 007, US 5 780 014 a US 5 814 607.

Aplikace nebulastinu podle vynálezu je možné konkrétně dosáhnout za použití libovolného způsobu zavedení, včetně:

(a) čerpadla (popisuje se například v publikaci Annels of Pharmacotherapy, 27: 9123 (1993), Cancer, 41: 1270 (1993), Cancer Research, 44: 1698(1984)).

(b) mikrokapslí (popisuje se například v americkém patentu US 4 352 883, US 4 353 888 a US 5 084 350) (c) polymerové implantáty, které zaručují nepřetržité uvolňování aktivní látky (popisuje se například v americkém patentu US 4 883 666) (d) makrokapslí (popisuje s například v americkém patentu US 5 284 761, US 5 158 881, US 4 976 859 a US 4 968 733 a zveřejněných přihláškách PCT WO 92/19195, WO 95/05452) (e) nechráněných buněčných štěpů do CNS (popisuje se například v americkém patentu US 5 082 670 a US 5 618 531) (f) podkožní, intravenózní, intraarteriální, intramuskulámí injekce nebo injekce do jiného vhodného místa a (g) orální aplikace ve formě kapslí, tekutiny, tablet nebo formulace s prodlouženým uvolňováním.

V jednom provedení podle vynálezu se neublastin zavede přímo do CNS, přednostně do mozkových dutin, mozkového parenchymu, intratekálního prostoru nebo jiného vhodného místa CNS, zejména intratekálně.

V jiném provedení vynálezu se předpokládá systémové zavedení podkožní injekcí, intravenózní aplikací nebo intravenózní infúzí.

Jiné použitelné parenterální zaváděcí systémy zahrnují ethylvinylacetátové kopolymerové částice, osmotická čerpadla, implantovatelné infuzní systémy, zavedení čerpadlem, zavedení enkapsulovaných buněk, zavedení pomocí liposomů, zavedení injekcí sjehlou, injekcí bez jehly, nebul izerem, ve formě aerosolu, elektroporací a transdermální náplastí.

Další podrobnosti o metodách přípravy a aplikace je možno nalézt v nejnovějším vydání Remingtonů Pharmaceutical Sciences (Maack Publishing Co., Easton, PA).

Aktivní složka se může aplikovat v jedné nebo několika dávkách za den. Vhodné dávky se pohybují mezi 0,5 ng neublastinu na kilogram tělesné hmotnosti až do přibližně 50 gg/kg a od přibližně 1,0 ng/kg do až asi 100 gg/kg denně. Farmaceutický prostředek obsahující neublastin by měl být schopen zajistit lokální koncentraci neurotrofického faktoru od přibližně 5 ng/ml mozkomíšního moku (CSF) do až 25 ng/ml CSF.

-15CZ 303358 B6

Aplikovaná dávka se musí samozřejmě pečlivě přizpůsobit věku, tělesné hmotnosti a stavu jednotlivce, který se léčí stejně jako způsobu aplikace, formě dávky a režimu a požadovanému výsledku. Přesné dávkování by měl samozřejmě určovat ošetřující lékař.

V dalších provedení vynálezu se může neublastinový polypeptid aplikovat genetickým zavedením, použitím buněčných linií a vektorů, jak se popisuje dále v textu v odstavci léčebné metody. Aby vznikly takové terapeutické buněčné linie, může se polynukleotid podle vynálezu začlenit do expresního vektoru, například plazmidu, viru nebo jiného nástroje exprese, a operativně spojit se ío sekvencemi, jež řídí expresi, ligaci takovým způsobem, že exprese kódující sekvence se dosáhne za podmínek kompatibilních se sekvencemi řídicími expresi. Vhodné sekvence řídící expresi zahrnují promotory, zesilovače, terminátory transkripce, startovací kodony, signály sestřihu intronů a stop kodony, přičemž se všechny udržují ve správném čtecím rámci polynukleotidů podle vynálezu, čímž umožňují správnou translaci mRNA. Sekvence řídící expresi mohou také zahrnovat další komponenty, jako jsou vedoucí sekvence a sekvence fúzních partnerů.

Promotor může být konkrétně konstitutivní nebo indukovatelný. Konstitutivní promotory mohou být syntetické, virové nebo odvozené z genomu savčích buněk, jako je například promotor lidského ibukvitinu. V preferovaném provedení vynálezu terapeutickou buněčnou linií bude lidská imortilizovaná neurální buněčná linie, která exprimuje polypeptid podle vynálezu. V případě implantace se použije přibližně mezi 10⁵ až ÍO¹⁰ buněk, zejména 10⁶ až asi 10⁸ buněk.

Metody léčby

Předkládaný vynález, který se týká polynukleotidů a proteinů, polypeptidů, fragmentů nebo derivátů z nich vzniklých, stejně jako protilátek proti takovým proteinům, peptidům nebo derivátům, může být použit při léčbě nebo zmírnění poruch nebo onemocnění těla živých zvířat a lidí, jestliže tyto poruchy a onemocnění reagují na aktivitu neutrofíckých činidel.

Polypeptidy podle vynálezu se mohou použít přímo prostřednictvím například ínjektovatelného, implantovaného nebo požitého farmaceutického prostředku vhodného pro léčbu patologického procesu, který odpovídá na neublastinové polypeptidy.

Polynukleotid podle vynálezu, včetně jeho komplementárních sekvencí, se může použít při expresi neurotrofického faktoru podle vynálezu. Toho je možné dosáhnout použitím buněčných linií, které exprimují takové proteiny, peptidy nebo deriváty podle vynálezu, nebo virových vektorů, které kódují takové proteiny, peptidy nebo jejich deriváty podle vynálezu, nebo hostitelských buněk, které exprimují takové proteiny, peptidy nebo deriváty. Tyto buňky, vektory a kompozice se mohou aplikovat při léčbě cílových ploch, aby se ovlivnil proces onemocnění, které reaguje na neublastinové polypeptidy.

Vhodné expresní vektory se mohou odvodit od lentivirů, retrovirů, adenovirů, herpesvirů a víru vakctnie a z různých bakteriálně produkovaných plazmidů a mohou se použít při zavedení in vivo nukleotidových sekvencí do celého organismu nebo do cílového orgánu, tkáně nebo buněčné populace. Jiné metody zahrnují, ale nejsou na ně omezeny, liposomovou transfekci, elektroporaci, transfekci nosičovými peptidy obsahujícími jaderné nebo jiné lokalizační signály a zaváděním genů prostřednictvím systémů s pomalým uvolňováním. V dalším aspektu vynálezu mohou být antisense nukleotidové sekvence, komplementární s neublastinovým genem nebo s jeho částmi, používány k inhibici nebo zesílení exprese neublastinu.

V dalším aspektu se vynález týká způsobu léčby nebo zmírňování poruchy nebo onemocnění živého těla zvířete nebo člověka, přičemž tato porucha nebo onemocnění reaguje na aktivitu neutrofických činidel.

-16CZ 303358 B6

Poruchy nebo onemocnění mohou zvláště být poškození nervového systému způsobené traumatem, chirurgickým zákrokem, ischemií, infekcí, metabolickým onemocněním, nedostatečnou výživou, zhoubným bujením nebo toxickými činidly, a genetickými nebo idiopatickými procesy.

Poškození se může zvláště objevit u senzorických neuronů nebo nervových buněk sítnice, které zahrnují neurony v dorzálním kořenovém ganglíu nebo v libovolné z následujících tkání: ganglion geniculi, gang lion petrosus a uzlíkatá ganglia, vestibuloakustický komplex osmého hlavového nervu, ventrolaterální pól maxilomandribulámího laloku trigeminálního ganglia a mezencefalický trigeminální nukleus.

io

V preferovaném provedení vynálezu je onemocněním nebo poruchou neurodegenerativní onemocnění, které zahrnuje neurony z lézí nebo traumat, jako jsou traumatické leze periferních nervů a/nebo míchy, cerebrální ischemické neuronální poškození, neuropatie a zvláště periferní neuropatie, trauma nebo poranění periferních nervů, ischemická mrtvice, akutní poškození moz15 ku, akutní poškození míchy, nádory nervového systému, roztroušená skleróza, působení neurotoxinů, metabolické onemocnění, jako je cukrovka nebo reanální dysfunkce a poškození způsobené infekčními činidly, neurodegenerativní poškození včetně Alzheimerovy nemoci, Huntingtonovy nemoci, Parkinsonovy nemoci, syndromu Parkinson-Plus, progresivní supranukleámí paralázy (syndrom Steele-Richardson-Olszewski), olivopontocerebelámí atrofie (OPCA) syndromu Shy2o Drager (atrofie více systémů), komplex demence guamanian parkinsonismu, amyotrofní laterální sklerózy, nebo jiné vrozené nebo neurodegenerativní onemocnění a zhoršení paměti spojené s demencí.

V preferovaném provedení se předpokládá léčba neuronů senzorického a/nebo autonomního systému. V jiném preferovaném provedení se předpokládá léčba poruch motorických neuronů, jako je amyotrofní laterální skleróza (ALS) a spinální muskulámí atrofie. V jiném provedení vynálezu se předpokládá použití neublastinových molekul podle vynálezu při podpoře zotavování nervů po traumatickém poškození. V jednom provedení podle vynálezu se předpokládá použití nervového vodícího kanálu s matricí obsahující neublastinové polymery. Takové nervové vodicí kanály se popisují například v americkém patentu US 5 834 029.

V preferovaném provedení vynálezu se polypeptidy a nukleové kyseliny podle vynálezu (a farmaceutické kompozice je obsahující) používají při léčbě periferních neuropatií. Mezi periferní neuropatie, u kterých se předpokládá léčba pomocí molekul podle vynálezu, patří neutopatir vyvolané traumatem, například způsobené fyzickým poškozením nebo chorobným stavem, fyzickým poškozením mozku, fyzickým poškozením míchy, mrtvicí spojenou s poškozením mozku a neurologickými poruchami, souvisejícími s neurodegenerací.

Vynález také předpokládá léčbu neuropatií indukovaných chemoterapií (například způsobených zavedením chemoterapeutik, například taxolu nebo cisplatiny), neuropatií indukovaných toxinem, neuropatií indukovaných léčivy, neuropatií vyvolaných nedostatkem vitaminů, idiopatických neuropatií a diabetických neuropatií (viz například v americkém patentu US 5 496 804 aUS 5916555).

Vynález také předpokládá léčbu ne-neuropatií, mono-multiplexních neuropatií a polyneuropatií, včetně axonálních a demyelinizujících neuropatií, za použití neublastinových nukleotidů a polypeptidů podle vynálezu.

V jiném preferovaném provedení vynálezu se polypeptidy a nukleové kyseliny podle vynálezu (a farmaceutické kompozice je obsahující) používají při léčbě různých poruch očí, které zahrnují ztrátu fotoreceptoru na sítnici u pacienta postiženého makulámí degenerací, pigmentózou sítnice, zeleným zákalem a podobným onemocněním.

V dalším provedení poskytuje vynálezu způsob prevence degenerativních změn spojených se shora uvedenými onemocněními a poruchami, implantací do mozku savců včetně člověka vekto-17CZ 303358 B6 rů nebo buněk schopných produkovat biologicky aktivní formu neublastinu nebo prekursoru neublastinu, tj. molekuly, která může být v těle přeměněna na biologicky aktivní formu neublastinu, nebo dále mohou být buňky, které vylučují neublastin, enkapsulovány, například do semipermeabilních membrán.

Buňky se mohou kultivovat in vitro za účelem transplantace nebo zavedení štěpů do savčího včetně lidského mozku.

V preferovaném provedení podle vynálezu se gen kódující polypeptid podle vynálezu transfikuje do vhodné buněčné linie napřfklad do buněčné linie imortalizovaných krysích neurálních kmenových buněk, jako je HiB5 a RN33b nebo do lidské imortalizované neuronální progenitorové buněčné linie, a výsledná buněčná linie se implantuje do mozku živého těla, včetně lidského, aby se v CNS vylučoval terapeutický polypeptid podle vynálezu, například za použití expresních vektorů, které se popisují v mezinárodní patentové přihlášce WO 98/32869.

Způsoby diagnostikování a vyhledávání

Nukleová kyselina neublastinu se může použít ke stanovení zda jedinec je predisponován k vyvinutí neurologické poruchy vzniklé na základě porušení genu neublastinu, například defektu v alele neublastinu, který byl získán například energetickou dědičností, abnormálním ambryonálním vývojem nebo získaným poškozením DNA. Analýza se může provést například detekcí nebo bodových mutací v neublastinovém genu nebo detekcí dědičnosti takových predispozic těchto genetických defektů se specifickými polymorfísmy délky fragmentů (RFLP), detekcí přítomnosti nebo absence normálního neublastinového genu hybridizaci vzorku nukleové kyseliny pocházející z pacienta se sondou nukleové kyseliny specifickou pro neublastinový gen a stanovením schopnosti sondy hybridizovat s nukleovou kyselinou.

Konkrétně může být neublastinová nukleová kyselina použita jako hybridizační sonda. Takové hybridizační testy se mohou použít k detekci, prognóze, diagnóze nebo k monitorování různých stavů, poruch nebo chorobných stavů spojených s aberujícím množstvím mRNA, které kóduje neublastinový protein. Neublastinová nukleová kyselina se může zkonstruovat jako markér pro fyziologické postupy závislé na neublastinovém neurotrofíckém faktoru. Tyto procesy zahrnují, ale nejsou omezeny na normální fyziologické postupy (například neuronální funkci) a patologické postupy (například neuronální onemocnění). Charakterizace sub-populace určitého pacienta s abnormálním množstvím (to znamená zvýšeným nebo nedostatečným) neublastinového proteinu a/nebo mRNA kódující neublastin může vést ke klasifikaci nového onemocnění. Termín abnormální množství znamená zvýšené nebo snížené množství vzhledem k množství kontrolního vzorku nebo jednotlivce, který nevykazuje poruchu stanovenou kvantitativním nebo kvalitativním způsobem.

Neublastinové nukleové kyseliny nebo polypeptidy podle vynálezu se mohou také použít při testování a identifikaci neublastinových analogů včetně malých předpokládá metoda identifikace hledané sloučeniny, která vyvolává biologický účinek zprostředkovaný neublastinem. Tento způsob zahrnuje kroky poskytující testovanou buňku, která když je v kontaktu s neublastinem se indukuje k expresi detekovatelného produktu, působení sloučeniny na buňku a detekci detekovatelného produktu. Exprese detekovatelného produktu indikuje schopnost sloučeniny vyvolat biologický účinek zprostředkovaný neuroblastinem.

Nukleové kyseliny s polypeptidy neublastinu podle vynálezu s mohou dále použít na chipa DNA nebo proteinů nebo v počítačových programech k identifikaci příbuzných nových genových sekvencí a jimi kódovaných proteinů včetně alelických variant a polymorfismu jediného nukleotidu (SNP). Takové metody se popisují například v americkém patentu US 5 795 716, US 5 754 524, US 5 733 729, US 5 800 992, US 5 445 924 a US 5 525 464.

- 18CZ 303358 B6

Přehled obrázků na výkresech

Na obrázku č. 1 je fotografické znázornění dvou northem blotů testovaných neublastinovou cDNA značenou ³²P porovnávající relativní sílu exprese neublastinového genu v různých typech tkáně dospělého člověka (panel A) a v různých oblastech mozku dospělého člověka (panel B).

Na obrázku č. 2 je fotografické znázornění northem přenosu testovaného neublastinovou cDNA značenou ³²P porovnávající množství neublastinové cDNA exprimované v buněčné linii transfiio kované neublastinovou cDNA a s buněčnou linií transfekovanou gDNF-cDNA.

Na obrázku č. 3 je fotografické znázornění western přenosu, který porovnává sílu, kterou je neublastinový protein exprimován v netransfekovaných buňkách HiB5 (dráha 1), jenž jsou příbuzné se stabilně transfekovanými buňkami HiB5 s neublastinovou cDNA (dráha 2) se testoval buď protilátkami specifickými pro neublastin Ab-2 (levý blot, panel A), nebo protilátkami Ab-1 specifickými pro neublastin (pravý blot, panel B).

Na obrázku č. 4 je grafické znázornění účinku neublastinu na přežití kultivovaných krysích embryonálních, dopaminergických, ventrálních mezencefalických neuronů a Chat aktivity v cho20 linergních nervových motorických neuronech a aktivitu ChAt v cholínergických motorických neuronech hlavového nervu v médiu bez séra. Na obrázku č. 4A je zvláště zobrazena křivka odpovědí na dávku v případě rekombinantních GDNF v případě aktivity ChAt (dpm/hodina). Na obrázku č. 4B je znázorněna aktivita ChAT (dpm/hodinu) za použití ředěného upraveného média buď z produkce neublastinu, nebo buněk produkujících GDNF. Obrázek č. 4C je znázor25 nění počtu buněk v prohlubni imunologicky reaktivních buněk s tyrozinovou hydrolýzou.

Na obrázku č. 5 je znázorněn účinek neublastinu vylučovaného z buněk HiB5pUBilzNBN22 na funkci a přežití kultur dopaminergických nentrálních mezencefalických neuronů prasečího embrya, které se kultivují společně s buňkami HiB5uPbilzNBN22 (neublastin) nebo buňkami

HiB5 (kontrolní buňky). Obrázek č. 5A a 5B znázorňuje uvolnění dopaminu do média (DIV 12) (koncentrace dopaminu (pmol/ml) v den 12) a (DIV21) (koncentrace dopaminu (pmol/ml) - den 21). Obrázek č. 5C znázorňuje počet imunologicky reaktivních buněk s tyrozinovou hydrolýzou v kultuře (buňky TH- iv v kultuře) (DIV21).

Obrázek č. 6 znázorňuje účinek in vtvo neublastinu produkovaného lentivirem na nigrální dopaminové neurony.

Obrázek Č. 7 znázorňuje schematický diagram struktury genomu genu neublastinu, který zahrnuje primery nukleové kyseliny, které se mohou použít k identifikaci plné délky genu neublastinu a jejich prostorové orientace ve vztahu k sekvenci kódující neublastin (to je gen).

Obrázek č. 8 znázorňuje primery specifické pro neublastin, které se používají k identifikaci cDNA klonu, který kóduje polypeptid lidského neublastinu, jenž hybridizuje s nukleovými kyselinami kódujícími neublastinové polypeptidy, ale nehybridizují s nukleovými kyselinami kóduj í45 čími jiné známé členy rodiny GDNF (to je GDNF, persefin a neurturin).

Obrázek č. 9 znázorňuje neurotrofickou aktivitu na kultury disociovaných nervových buněk dorzálních kořenů u krys při různých vývojových stádiích polypeptidů podle vynálezu, což se porovnává s výsledky získanými se známými neurotrofickými faktory (0 kontrolní experiment (není přítomen faktor), 1 v přítomnosti GDNF, 2 v přítomnosti neurturinu, 3 v přítomnosti neublastinu podle vynálezu, E12 12. den embrya, E16 16. den embrya, PO den narození, P7 7 dní po narození, P15 15 dní po narození).

Obrázek č. 10 ilustruje produkci neublastinu v buněčné linii CHO.

- 19CZ 303358 B6

Obrázek Č. 11 ilustruje porovnání navázání neublastinu a GDNF na receptory GFRa-1 a GFRa3.

Na obrázku č. 12 je fotografické zobrazení western blotu, který ilustruje antipeptidové protilátky R30 a antipeptidové protilátky R31 k neublastinu.

Na obrázku č. 13 je obrázek gelu znázorňující expresi neublastinu navázání na RETL3-Ig.

Na obrázku č. 14 je mapa plazmídu pETl9b-Neublastin znázorňující sekvenci syntetického genu kódujícího neublastin.

Na obrázku č. 15 je mapa plazmídu pMJB164-HÍsNeublastin znázorňující sekvenci syntetického genu kódujícího HisNeublastin.

i5 Příklady provedení vynálezu

Příklad 1: Způsob izolace nukleových kyselin neublastinu

Způsob 1: Rychlé testování přítomnosti genu neublastinu v cDNA mozku lidského zárodku.

Ve dvou genomových sekvencích (HGTS) se identifikoval fragment o velikosti 290 bp obsažených v databázi GenBank (přístupové číslo AC005038 a ACOO5O51) na základě jeho homologie s lidským persefínem. Ze sekvence nukleové kyseliny fragmentu o velikosti 290 bp se syntetizo25 vály dva příměry specifické pro neublastin. Primer horního řetězce neublastinu („NBNint.sence“) vykazuje sekvenci 5'-CCT GGC CAG CCT ACT GGG-3' (SEQ ID N O: 17). Primer spodního řetězce neublastinu („NBNintantisence“) vykazuje sekvenci 5-AAG GAG ACC GCT TCG TAG CG-3' (SEQ ID NO: 18). Tyto primery se použily v reakcích PCR provedených v 96 prohlubních.

Destička s 96 prohlubněmi obsahující plazmidovou DNA z 500 000 cDNA klonů se naplnila přibližně 5000 klony na jednu destičku.

Nukleová kyselina neublastinu se identifikovala ve třech kolech amplifikací za použití metody

PCR. Amplifíkace zvyšuje počet kopií nukleové kyseliny ve vzorku.

Testování původní destičky

Za použití testovací metody PCR v 96 prohlubních, jak se popisuje shora v textu, původní destič4o ka s cDNA mozku lidského zárodku se testovala genově specifickými primery za účelem izolace cDNA lidského neublastinu.

Z odpovídajících prohlubní původní destičky se získalo 30 nanogramů cDNA mozku lidského zárodku (6 ng/μΐ, Origene Technologies) a umístily se do roztoku o celkovém objemu 25 μΐ, při45 čemž roztok obsahoval následující činidla 0,2 mM každého ze dvou dříve zmiňovaných primerů specifických pro gen (to je primery NBNint.sense a NBNintantisence), lx standardní pufř PCR (pufř V, Advanced Biotechnologies, UK), 0,2 mM dNTP (Amersham-Pharmacia), 0,1 M GCMelt (Clontech Laboratories, USA) a 0,5 jednotek Taq DNA polymerázy (5 U/μΙ, Advanced Biotechnologies, UK).

Reakce PCR se provedly za použití následujícího postupu a podmínek. DNA se na počátku denaturovala při teplotě 94 °C po dobu 3 minut a pak následovalo 35 cyklů denaturace při teplotě 94 °C po dobu 1 minuty, teplotní hybridizace pří teplotě 55 °C po dobu 1 minuty, první prodloužení při teplotě 72 °C po dobu 90 vteřin a konečné prodloužení při teplotě 72 °C po dobu 5 mi-20CZ 303358 B6 nut. Produkty 96 jednotlivých reakcí PCR se analyzovaly elektroforézou na 2% agarózovém gelu za použití ethidium bromidu. Zjistilo se, že pozitivní produkt PCR o velikosti 102 bp nacházející se v prohlubních koresponduje s jedinou prohlubní sub—destičky s 96 prohlubněmi.

Fragment nukleové kyseliny o velikosti 102 bp vykazuje následující sekvenci (SEQ ID NO: 13):

5' -CCTGGCCAGCCTACTGGGCGCCGGGCCCTGCGACCGCCCCCGGGCTCCCGGCCCGTCAG CCAGCCCTGCTGCCGACCCACGCGCTACGAAGCGGTCTCCTT-3'

Testování sub-destičky

Sub-destička s 96 prohlubněmi obsahující DNA mozku lidského zárodku se testovala amplifikaci PCR tak, že se umístilo do prohlubně 1 μΐ glycerolového zásobního roztoku zodpovídající prohlubně sub-destičky v celkovém objemu 25 μΙ, který obsahuje 0,2 mM každého z genové specifických primerů, lx standardní pufř PCR (pufr V, Advanced Technologies, UK), 0,2 mM dNTP (Amersham—Pharmacia), 0,1 M GC-Melt (Clontech Laboratories, USA) a 0,5 jednotek Taq DNA polymerázy (5 U/μΙ) Advanced Technologies, UK).

Stejné podmínky PCR se využívají při testování původní destičky. 96 jednotlivých reakcí PCR se analyzovalo na 2% agarózovém gelu, který obsahuje ethidiumbromid a identifikovala se pozitivní prohlubeň, ve které vzniká PCR fragment o velikosti 102 bp.

Kolonová PCR

Jeden mililitr glycerolového zásobního roztoku z pozitivní sub-destičky se ředil 1:100 v půdě

Luria (LB). Jeden mililitr a deset mililitrů zmiňovaného ředění se pak naneslo na dvě oddělené plotny s agarem, které obsahují půdu LB a karbenicilín v koncentraci 100 μg/ml. Plotny s půdou LB se inkubovaly přes noc při teplotě 30 °C. Z těchto ploten se vybralo 90 kolonií a přenesly se na novou destičku PCR s 96 prohlubněmi obsahující 0,2 mM každého z dříve v textu zmiňovaných genově specifických primerů, lx standardní PCR pufř (pufr V, od firmy Advanced Biotech30 nologies, UK), 0,2 mM dNTP (Amersham-Pharmacia), 0,1 M GC-Melt (Clontech Laboratories, USA) a 0,5 jednotek Taq DNA polymerázy (v koncentraci 5 U/μΙ, od firmy Advanced Biotechnologies, UK), přičemž konečný objem je 25 μΐ.

Stejné podmínky PCR se využívají pro testování původní destičky. 96 jednotlivých reakcí PCR se analyzovalo na 2% agarózovém gelu, který obsahuje ethidiumbromid. Pak se identifikovaly pozitivní kolonie obsahující fragment o velikosti 102 bp.

Sekvenování plazmidové DNA připravené z těchto pozitivních kolonií odhalilo cDNA v plné délce o velikosti 861 bp (SEQ ID NO: 8). cDNA kódovala pren-pro-neublastin (SEQ ID NO: 9).

Automatické sekvenování DNA se uskutečnilo za použití sekvenačního kitu BigDye® (PE Applied Biosystem, USA). Sekvenace na gelu se provedla na zařízení ABI Prism 377 (PE Applied Biosystems, USA).

Způsob 2: Klonování cDNA neublastinu z lidského mozku

Další způsob amplifikace cDNA neublastinu v plné délce nebo fragmentu cDNA se může provést pomocí RACE (rychlá amplifikace konců cDNA) za použití primerů specifických pro neublastin (NBNint.sence a NBNint.antisence, jak se popisuje shora v textu, v kombinaci s primery specifickými pro vektor nebo adaptor například za použití sady pro amplifikaci cDNA Marathon (Clon50 těch Laboratories, USA, č. kat, K1802-1).

Celá cDNA lidského mozku Marathon-Ready (Clontech Laboratories, USA, č.kat. 7400-1) se může použít při amplifikaci cDNA neublastinu v plné délce. Použitelné primery v plné délce zahrnují primer horního řetězce neublastinu 5-ATGGAACTTGGACTTGG-3' (SEQ ID NO: 19) (NBNext.sence) a primer spodního řetězce neublastinu 5-TCCATCACCCACCGGC-3' (SEQ ID NO: 20) (NBNext.antisence) kombinovaný sadaptorovým primerem API zahrnutým v cDNA Marathon-Ready. Také se může použít alternativní primer horního řetězce 5'CTAGGAGCCCATGCCC-3' (SEQ ID NO: 28). Také se může použít další alternativní primer spodního řetězce se sekvenci 5'-GAGCGAGCCCTCAGCC-3' (SEQ ID NO: 33). Také se mohou použít alternativní primery spodního řetězce SEQ ID NO: 24 a 26.

Způsob 3: Klonování cDNA neublastinu z lidského mozku

Jiný způsob klonování cDNA neublastinu probíhá testováním knihoven lidského mozku dospělého jedince a zárodku jednou nebo více neublastinových sond, jak se popisuje shora v textu (a jak je zobrazeno na obrázku ě. 1). Tyto knihovny zahrnují lidský mozek Xgtl 1 (Clontech Laboratories, USA. č. Kat. HL3002b) nebo mozek lidského embrya Xgtl 1 (Clontech Laboratories, USA. ě. kat. HL3002b).

Způsob 4: Rychlé testování přítomnosti genu neublastinu v cDNA myšího zárodku

Rychlý postup testování přítomnosti genu neublastinu se uskutečnil následujícím způsobem. Původní destička s 96 prohlubněmi obsahující plazmidovou DNA z 500 000 cDNA klonů se naplnila přibližně 5000 klonů na jednu prohlubeň. Sub-destička obsahující 96 prohlubní se naplnila glycerolovým zásobním roztokem bakterií E. coli obsahující 50 klonů v jedné prohlubni. Za účelem zjištění přítomnosti genu neublastinu proběhla amplifikace zprostředkovaná PCR ve třech cyklech.

Testování původní destičky

Za účelem izolace cDNA myšího neublastinu se původní destička s myší čištěnou cDNA testovala pomocí PCR v 96 prohlubních za použití genově specifických primerů. Syntetizovaly se následující dva primery;

1) neublastinový primer C2 (NBNint.sence): 5'-GGCCACCGCTCCGACGAG-3' (SEQ ID NO: 21) a

2) neublastinový primer C2as (NBNintantisence): 5'-GGCGGTCCACGGTTCTCCAG-3' (SEQ ID NO: 22).

Za použití těchto dvou genově specifických primerů se identifikoval pozitivní PCR produkt o velikosti 220 bp. Nukleová kyselina obsahující 220 bp obsahuje následující sekvenci (SEQ ID NO: 14):

S^GGCCACCGCTCCGACGAGCTGATACGTTTCCGCTTCTGCAGCGG

CTCGTGCCGCCGAGCACGCTCCCAGCACGATCTCAGTCTGGCCAG

CCTACTGGGCGCTGGGGCCCTACGGTCGCCTCCCGGGTCCCGGC

CGATCAGCCAGCCCTGCTGCCGGCCCACTCGCTATGAGGCCGTCT

CCTTCATGGACGTGAACAGCACCTGGAGAACCGTGGACCGCC-3’

Reakce PCR s 96 prohlubněmi se uskutečnila následujícím způsobem. Z odpovídajících prohlubní původní destičky se získalo 30 nanogramů cDNA mozku lidského zárodku (6 ng/μΐ, Origene Technologies) a umístily se do roztoku o celkovém objemu 25 μΐ, přičemž roztok obsahoval následující Činidla 0,2 mM každého ze dvou dříve zmiňovaných primerů specifických pro gen (to je primery C2 (NBNint.sense) a neublastinový primer C2as (NBNint.antisense)), lx standardní pufr

-22CZ 303358 B6

PCR (pufr V, Advanced Biotechnologies, UK), 0,2 mM dNTP (Amersham-Pharmacía), 0,1 M GC-Malt (Clontech Laboratories, USA) a 0,5 jednotek Taq DNA polymerázy (5 U/μΙ, Advanced Biotechnologies, UK).

Reakce PCR se provedly za použití následujícího postupu a podmínek. DNA se na počátku denaturovala při teplotě 94 °C po dobu 3 minut a pak následovalo 35 cyklů denaturace při teplotě 94 °C po dobu 1 minuty, první prodloužení při teplotě 72 °C po dobu 90 vteřin a konečné prodloužení při teplotě 72 °C po dobu 5 minut. Produkty 96 jednotlivých reakcí PCR se analyzovaly elektroforézou na 2% agarózovém gelu za použití ethidium bromidu. Zjistilo se, že pozitivní produkt PCR o velikosti 220 bp nacházející se v prohlubních koresponduje s jedinou prohlubní subdestičky s 96 prohlubněmi.

Testování sub-destičky

Sub-destička s 96 prohlubněmi obsahující DNA mozku lidského zárodku se testovala amplifikací PCR tak, že se umístilo do prohlubně 1 μΐ glycerolového zásobního roztoku z odpovídající prohlubně sub-destičky v celkovém objemu 25 μΐ, který obsahuje 0,2 mM každého z genové specifických primerů, lx standardní pufr PCR (pufr V, Advanced Technologies, UK), 0,2 mM dNTP (Amersham-Pharmacía), 0,1 M GC-Melt (Clontech Laboratories, USA) a 0,5 jednotek Taq DNA polymerázy (5 U/μΙ, Advanced Technologies, UK).

Stejné podmínky PCR se využívají při testování původní destičky. 96 jednotlivých reakcí PCR se analyzovalo na 2% agarózovém gelu, který obsahuje ethidiumbromid a identifikovala se pozitivní prohlubeň, ve které vzniká PCR fragment o velikosti 220 bp.

Kolonová PCR

Jeden mililitr glycerolového zásobního roztoku z pozitivní sub-destičky se ředil 1:100 v půdě Luria (LB). Jeden mililitr a deset mililitrů zmiňovaného ředění se pak naneslo na dvě oddělené plotny s agarem, které obsahují půdu LB a karbenicilin v koncentraci 100 pg/ml. Plotny s půdou LB se ínkubovaly přes noc při teplotě 30 °C. Z těchto ploten se vybralo 90 kolonií a přenesly se na novou destičku PCR s 96 prohlubněmi obsahující 0,2 mM každého z dříve v textu zmiňovaných genově specifických primerů, lx standardní PCR pufr (pufr V, od firmy Advanced Biotechnologies, UK), 0,2 mM dNTP (Amersham-Pharmacia), 0,1 M GC-Melt (Clontech Laboratories, USA) a 0,5 jednotek Taq DNA polymerázy (v koncentraci 5 U/μΙ, od firmy Advanced Biotechnologies, UK), přičemž konečný objem je 25 μΐ.

Stejné podmínky PCR se využívají při testování původní destičky. 96 jednotlivých reakcí PCR se analyzovalo na 2% agarózovém gelu, který obsahuje ethidiumbromid. Pak se identifikovaly pozitivní kolonie, obsahující fragment o velikosti 220 bp. Z této pozitivní kolonie se připravila plazmidová DNA. Klon se sekvenoval za použití automatického sekvenování za použití sekvenačního kitu BigDey® s DNA poíymerázou AmplÍ7a^/. Sekvenace se provedla na gelu za použití zařízení ABI Prism 377 (PE Applied Biosystems). Výsledná sekvence tohoto klonu ukázala cDNA celé délky o velikosti 2 136 bp (SEQ ID NO: 15). cDNA zahrnuje otevřený čtecí rámec s předpokládanou aminokyselinovou sekvencí zobrazenou v SEQ ID NO: 16, která kóduje myší polypeptid pre-pro-neub lasti n.

Příklad 2: Klonování genomového neubfastinu

Jak se diskutuje shora v textu, ve dvou lidských klonech BAC se identifikoval fragment nukleové kyseliny o velikosti 290 bp zahrnutý v GenBank (s přístupovým číslem AC005038 a AC005051), který obsahuje oblasti homologie s persefinem a s lemujícími sekvencemi persefínu. Za účelem klonování nukleové kyseliny kódující neubtastin se navrhly další primery popsané shora v textu

--irCZ 303358 B6 za použití předpokládané sekvence o velikosti 861 bp. Při klonování neublastinového genu za použití PCR na genomové DNA se použily dva páry primerů. Tyto dva páry primerů se uvádějí dále v textu:

Pár primerů Č. I

5'CCA AgC CCA CCT ggg TgC CCT CTT TCT CC3'(sense) (SEQ ID NO: 23)

5'CAT CAC CCA CCg gCA ggg gCC TCT Cag 3' (antisense) (SEQ ID NO: 24)

Pár primerů č. 2

5'gAgCCAtgCCCggCCTgATCTCAgCCCgA ggACA 3' (sense) (SEQ ID NO:

25)

5'CCCTggCTgAggCCgCTggCTAgTgggACTCTgC3' (antisense) (SEQ ID NO:

26) .

Za použití páru primerů č. 1 se amplifikoval z lidské genomové DNA získané od firmy Clontech Laboratories (kat. Č. 6550-1) fragment DNA o velikosti 887 bp.

Protokol PCR:

PCR se provedlo za použití systému Expand” High Fidelity PCR (Boehringer Mannheim) s pufrem č. 1. Reakční směs PCR se doplnila 5% dimethylsulfoxidem (DMSO) a 17,5 pmol každého dNTP v celkovém objemu 50 μΐ. Teplotní cykly se uskutečnily predenaturačním krokem při teplotě 94 °C po dobu 2 minut. Pak následuje 35 cyklů ve dvou krocích při teplotě 94 °C po dobu 10 vteřin a 68 °C po dobu 1 minuty. Teplotní cykly se stanovily inkubací při teplotě 68 °C po dobu 5 minut. Teplotní cykly se provedly na teplotním cyklovači PTC-225 DNA Engine Tetrad (MJ Research, MA). Produkty PCR se analyzovaly elektroforézou na gelu na 2% agaróze (FMC) a pak se fotografovaly.

Fragment o velikosti 887 bp se amplifikoval z lidské genomové DNA s párem primerů č. 1 do vektoru pCRIl (Invitrogen) a ten se transformoval do kompetentních buněk E. coli XLl-Blue (Stratagene). Výsledný plazmid označený jako neublastin-2 se sekvenoval za použití termosekvenázy (Amersham Pharmacia Biotech). SekvenaČní produkty se analyzovaly elektroforézou na ALFExpress automatickém sekvenátoru (Amersham Pharmacia Biotech).

Fragmenty získané amplifikaci PCR lidské genomové DNA s druhým párem primerů (pár primerů č. 1 popsaný shora v textu) se sekvenovaly, přičemž se objevila další oblast o velikosti 42 bp na 3'konci otevřeného čtecího rámce. Sekvence plné délky se analyzovala jejím porovnáním se sekvencemi nukleových kyselin jiných neurotrofíckých faktorů stejně jako mapováním hranic exon-intron za použití softwarových programů pro nalezení genů, které identifikují pravděpodobné místo sestřihu a oblasti s vysokým kódujícím potencionálem za použití software Netgene a Gene Mark (Brunak et al., J. Mol. Biol. 1991 220 49 až 65), Borodovsky et al., Nucl. Acids Res. 1995 23 3554 až 62). Hranice exon-intron se potvrdily zcDNA získané rychlým testem, který se popisuje shora v textu.

Jak se ilustruje na obrázku č. 7 výsledný neublastinový gen má dva exony oddělené intronem 70 bp. Exony mají předpokládanou aminokyselinovou sekvenci polypeptidů neublastinu plné délky. Předpokládaná cDNA (SEQ ID NO: 3) obsahuje otevřený čtecí rámec (ORF) kódující 238 aminokyselinových zbytků (SEQ ID NO: 4). Klon neublastinu-2 obsahoval celou kódující sek-24CZ 303358 B6 věnci pro-neublastinu. Aminokyselinová sekvence kódovaná genem vykazuje vysokou homologii se třemi proteiny, kterými jsou persefin, neurturin a GDNF.

Příklad 3: Exprese nukleových kyselin neublastinu

Exprese neublastinové RNA se detekovala v nervové i nenervové tkáni u hlodavců a u lidí a v různých vývojových nezralých a dospělých stádiích za použití metod popsaných dále v textu. Způsob detekce exprese RNA neublastinu za použití RT-PCR:

Na základě sekvence DNA neublastinu identifikované jako SEQ ID N O: 1 se syntetizovaly následující primery: 1) neublastinový primer C2 5'-GGCCACCGCTCCGACGAG-3' (SEQ ID NO: 21) a 2) neublastinový primer C2as 5'-GGCGGTCCACGGTTCTCCAG-3' (SEQ ID NO: 22). Tato sada primerů se použila pro amplifikaci RT-PCR fragmentu DNA z mRNA celého mozku dospělého člověka a lidského zárodku. Mezi fragmenty DNA produkovanými touto reakcí byl jeden fragment o velikosti 220 bp. Identifikace tohoto fragmentu DNA o velikosti 220 bp potvrdila, že gen neublastinu se exprimuje v tkáni mozku dospělého jedince a zárodku. Fragment DNA o velikosti 220 bp se také amplifikoval z genomové DNA za použití uvedených primerů.

Způsob detekce exprese RNA neublastinu hybrid izací na northem přenosem

Northern bloty s RNA polyA⁺ z dospělé lidské tkáně se získaly od firmy Clontech Laboratories, USA a testovaly se za použití sondy, kterou je neublastinová cDNA značená ³²P. Značená neublastinová cDNA se připravila podle metod popsaných v příkladu 1 shora v textu.

Příprava sond: Fragment DNA neublastinu (nukleotidy 296 až 819 SEQ ID NO: 8) se značily značícím kitem Rediprimell (Amersham, kat. č. RPN1633) vhodným pro použití jako hybridizační sondy za podmínek doporučených výrobcem. Vzorek DNA se ředil na konečnou koncentraci 2,5 až 25 ng ve 45 μΐ lOmM pufru TE (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, lmM EDTA). DNA se pak denaturovala zahřátím vzorku na teplotu 95 až 100 °C po dobu 5 minut ve vodní lázni, rychlým ochlazením vzorku tím, že se umístil na pět minut na led a pak krátkou centrifugací, aby se dostal obsah na dno zkumavky. Celkové množství denaturované DNA se dalo dohromady s 5 μΐ Redivue [³²P] dCTP (Amersham Pharmacia Biotech Ltd.) ve zkumavce, která obsahuje pufrovaný roztok dATP, dGTP, dTTP, enzym Klenow bez exonukleázy a náhodný primer v sušené stabilizované formě. Roztok se 2krát zamíchal pipetou a reakční směs se inkubovala pří teplotě 37 °C po dobu 10 minut. Značící reakce se zastavila přidáním 5 μΐ 0,2M EDTA. Za účelem použití jako hybridizační sondy se značené DNA denaturovala na jednotlivé řetězce zahřátím vzorku DNA pří teplotě 95 až 100 °C po dobu 5 minut, pak se vzorek DNA rychle ochladil na ledu po dobu 5 minut. Zkumavka se centrifugovala a její obsah se dobře promíchal. Nakonec se sonda tvořená jednořetězcovou DNA čistila za použití sady pro odstranění nukleotidů (Qiagen). Postupy hybridizace:

Připravené northem bloty se získaly od uvedené firmy („Multiple Tissue Northem Blots, Clon45 těch Laboratories, USA, kat. č. 7760-1 a 7769-1) a hybridizovaly se podle doporučení výrobce za použití neublastinové sondy značené ³²P připravené shora v textu. V případě hybridizace se použil roztok ExpressHyb (Clontech Laboratories, USA) a použila se značená sonda v přibližné koncentraci 3 ng/ml. Roztok ExpresHyb se zahřál na teplotu 68 °C a míchal se do rozpuštění všech sraženin. Každá membrána s northem blotem (10x10 cm) se předem hybridizovala alespoň v 5 ml roztoku ExpressHyb při teplotě 68 °C po dobu 30 minut v hybridizační peci Hybaid podle instrukcí výrobce. Neublastinová sonda značená ³²P se denaturovala při teplotě 95 až 100 °C po dobu 2 minut a pak se rychle ochladila na ledu. 14 mikrolitrů značené sondy se přidal k 5 ml čerstvého roztoku ExpresHyb a vše se zamíchalo. Roztok ExpresHyb používaný při prehybridizaci se nahradil 5 ml čerstvého roztoku ExpresHyb, který obsahoval značenou sondu

DNA. Bloty se inkubovaly po dobu 1 hodiny při teplotě 68 °C v hybridizační peci Hybaid.

Po inkubaci se bloty spláchly a několikrát promyly za málo přísných podmínek (pufrem 2x SSC, který obsahuje 0,05 % SDS při teplotě místnosti), pak následuje promytí za přísných podmínek (OJx SSC obsahující OJ % SDS při teplotě 50 °C) (20x SSC je 0,3M NaCl/0,3M citrát sodný, pH 7,0). Bloty se exponovaly na Hyperfilm MP (Amersham Pharmacia Biotech Ltd) při teplotě -80 °C za použití desek zvyšujících intenzitu.

Výsledky northem hybridizačních experimentů jsou prezentovány na obrázku ě. 1. Na obrázku č. 1A (vlevo) a IB (vpravo) jsou northem bloty polyA* RNA, které se testovaly neublasti novou cDNA značenou ¹²P, jak se popisuje v příkladu 3. Markéry reprezentují polynukleotidy o velikosti 1,35 kb, 2,4 kb, 4,4 kb, 7,5 kb a 9,5 kb. Membrána zobrazená na obrázku č. 1A se připravila za použití mRNA extrahované z různých tkáních dospělého člověka. Z výsledků northem blotační hybridizační analýzy se došlo k závěru, že mRNA neublastinu se exprimovala u mnoha tkání dospělého člověka. Nejsilnější exprese neublastinu se detekovala v srdci, ve svalech skeletu a v pankreasu. Membrána na obrázku č. 1B se připravila s RNA extrahovanou z různých oblastí mozku dospělého jedince. V mozku dospělého jedince je možné nej silnější expresi pozorovat v nucleus caudatus a thalamu. Transkripce mRNA o přibližné velikosti 5 kb je převažující forma mRNA neublastinu exprimovaná v mozku.

Způsob detekce exprese RNA neublastinu za použití hybridizace ín šitu v tkáních

Následující metody je možné použít při měření exprese RNA neublastinu ve zvířecích tkáních, například v tkáních hlodavců s anti-sense sondou neublastinu.

Exprese u myší

Příprava vzorků tkáně:

Gravidní myši (B and K Universal, Stockholm, Sweden) se usmrtily cervíkální dislokací v 13,5 nebo 18,5 den gravidity. Embrya se odstranila disekcí za sterilních podmínek a bezprostředně se ponořila do roztoku 0,lM fosfátového pufru (PB), který obsahuje 4 % paraformaldehydu (PFA) po dobu 24 až 30 hodin. Pak se odstranily z PFA a skladovaly se v PBS. Tkáň se připravila nakrájením imerzní tkáně v roztoku 30% sacharózy a pak se zalila do TissueTech (sloučenina O.C.T., Sakura Finetek USA, Torrance, CA). Připravilo se šest sérií koronálních a sagitálních sekcí (12 gm) v kryostatu a nechaly se roztát na pozitivně nabitém skleněném sklíčku. Neonatální hlavičky/mozky (Pl, P7) se fixovaly podle stejného protokolu, jako embryonální stádia a dále se rozřezala tkáň mozku dospělého jedince, bezprostředně se zmrazila na suchém ledu a rozřezala se v kryostatu, aniž se předem fixovala.

Příprava neublastinových ribosond:

Sonda antimediátorové neublastinové RNA (neublastinová ribosonda) se připravila následujícím způsobem. Nukleotidy 1109 až 1863 sekvence myší neublastinové cDNA (SEQ ID NO: 15) se sub-klonovala do vektoru BlueScript (Stratagene). Výsledný plazmid se štěpil na lineární DNA za použití restrikční endonukleázy EcoRI. Fragment DNA EcoRI se in vitro přepisoval pomocí RNA polymerázy T3 a značícího kitu pro RNA pomocí digoxigeninu (DIG) podle instrukcí výrobce (Boehringer Mannheim).

Hybridizace:

Sekce vytvořené v kryostat u se fixovaly po dobu 10 minut ve 4% PFA, ošetřily se po dobu 5 minut proteinázou K v koncentraci 10 mg/ml a postupně se dehydratovaly v 70% a 95% ethanolu po dobu 5 a 2 minut. Pak se nechaly usušit na vzduchu. Hybridizační pufr (50 % deionizovaný formám i d, 10 % z 50% roztoku síranu dextranu, 1% Denhardtův roztok, 250 gg/ml kvasinkové tRNA, 0,3 M NaCl, 20 tnM Tris-HCI (pH 8), 5mM EDTA, 10 mM NaPO₄, 1% sarkosyl), který obsahuje 1 gg/ml sondy značené DIG se zahrál na teplotu 80 °C po dobu 2 minut a apliko26CZ 303358 B6 val se n a jednotlivé sekce. Sekce se pak pokryly parafilmem a inkubovaly se při teplotě 55 °C po dobu 16 až 18 hodin.

Příští den se sekce promyly za velmi přísných podmínek (2x SSC, která obsahuje 50% formami) 5 při teplotě 55 °C po dobu 30 minut a pak se promyly RNázovým pufrem a inkubovaly se μ^ιηΙ RNázy A po dobu 30 minut pri teplotě 37 °C. Za účelem detekovat sondu značenou

DIG se sekce pre-inkubovaly blokačním roztokem (PBS obsahující 0,1 % Tween-20 a 10 % teplem deaktivované kozí sérum) po dobu 1 hodiny a pak se vše inkubovalo přes noc pri teplotě 4 °C s alkalickou fosfatázou spojenou s protilátkami proti DIG v ředění 1:5 000 (Boehringer Mannío heim). Následující den se každá sekce čtyřikrát promyla po dobu 2 hodin v PBS, který obsahuje

0,1 % Tween-20, a pak dvakrát deset minut promytí v pufru NTMT (100 mM NaCl, 100 mM

Tris-HCl (pH 9,5), 50 mM MgCl₂, 0,1 % Tween-20). Sekce se inkubovaly v BM-červeném substrátu, který obsahuje 0,5 mg/ml levamisolu, po dobu 48 hodin. Barvicí reakce se zastavila promytím v PBS. Sekce se sušily na vzduchu a překryly se krycím sklíčkem s DPX (KEBO-lab.

Sweden).

Výsledky reakcí hybridizace in sítu se prezentovaly v tabulce Č. 1.

Tabulka č. 1: Exprese neublastinu u myší

struktura	E13.5	E18.5	PÍ	P7	dospělí
přední mozek	+ +
ventrální střední mozek	-
ganglie dorzálních kořenů	4- +
mícha	+
sítnice		+++	+++
bulbus olfactorius		++	++	+ +
zubní dřeň		++	++	+
trojklanná ganglia		++	+ +	+ +
striatum		+	+	+ +
kůra mozková		+	+	++	+
gyrus dentatus				++	+

Jak je zobrazeno v tabulce č. 1, 13,5 dnu embrya (E13,5) se neublastin exprimoval v míše a v zadním mozku a slabě v předním mozku. Exprese neublastinu se také detekovala ve vyvíjející se sítnici a v senzorické ganglii (ganglia dorzálního kořene a troj klaná ganglia (V)). Mimo nervový systém se slabý signál zjistil v ledvinách, v plicích a ve střevu, což indikuje, že neublastin se také expritnuje v uvedených tkáních.

18,5 den embrya (El8.5) se neublastin exprimoval nejvíce v trojklaném ganglionu (V). Exprese neublastinu se také detekovala v sítnici, v striatu a v kůře mozkové. Navíc se exprese pozorovala v zubním lůžku.

V tabulce č. 1 zesílenou expresi neublastinu ode dne El8.5 do postnatálního dne l a 7 je možné pozorovat v mozkové kůře, striatu a trojklaném ganglionu (V). Exprese neublastinu byla nejsilnější ve vnějších vrstvách mozkové kůry ve srovnání s vnitřními vrstvami mozkové kůry. V den P7 se exprese zjistila ve stejných strukturách jak v den 1, ale další neublastinové exprese se zjisti-27CZ 303358 B6 la v hippocampus, zvláště v gyrus dentatus v cerebelu. V dospělém myším mozku se neublastin silně exprimoval v gyrus dentatus a v ostatních tkáních se detekovala velmi nízká nebo žádná exprese neublastinu.

Exprese u krys

Následující experiment popisuje hybridizaci krysích tkání s oligodeoxynukleotidovou neuNástinovou sondou nekódujícího řetězce značenou alkalickou fosfatázou.

i o Příprava tkáňových vzorků:

Krysí embrya (El4) se získala z krys Wistar (Mollegaard Breeding, Denmark) po anestezi pentobarbitalem. Postanatální krysy (PO, P7 a dospělí jedinci) se usmrtily dekapitací. Rozřezaný mozek a celé hlavy se ihned ponořily do chlazeného 0,9% NaCl, čerstvě zamrazené se nařezaly na 20 μπι sekce v kryostatu (koronální a sagitální sekce, 10 sérií).

Hybridizace in sítu:

Dvě série sekcí se hybridizovaly za použití antisense oligodeoxynukleotidové sondy spojené s alkalickou fosfatázou (AP) (5'-NCA GGT GGT CCG TGG GGG GCG CCA AGA CCG G-3') (SEQ ID NO: 27), oligo. č. 164 675, DNA Technology, Dánsko). Tato sonda je komplementární s bázemi 1140 až 1169 cDNA myšího neublastinu SEQ ID NO: 15).

Před hybridizaci se sekce sušily na vzduchu při teplotě místnosti, zahřály se na teplotu 55 °C po dobu 10 minut a pak se ošetřily 96% etanolem při teplotě 4 °C přes noc. Sekce se pak sušily na vzduchu a inkubovaly se pak v hybridizačním médiu (5,0 pmol sondy v jednom mililitru) přes noc při teplotě 39 °C (popisuje se v publikaci Fínsen et al., Neurosci. 1992 47, 105 až 113, West et al., J. Comp. Neurol. 1996,370, 11 až 22).

Ošetření po hybridizaci zahrnuje čtyři promytí po dobu 30 minut v 1 x SSC (0,15 M NaCl, 0,015 M citrát sodný) při teplotě 55 °C, pak následuje třikrát promytí po deseti minutách v TrisHCI, pH 9,5 při teplotě místnosti a pak se aplikuje AP vývojka. AP vývojka se připravila bezprostředně před použitím a obsahovala tetrazolem nitrátovou modr (NBT, Sigma), 5-bromo, 4— chloro, 3-indolyl fosfát (BCIP, Sigma) a pufr obsahující Tris-HCl-MgCI₂ pH 9,5 (popisuje se v publikaci Finsen et al., Neurosci. 1992, 47, 105 až 113). Vyvíjení AP probíhá ve tmě při teplotě místnosti po dobu 48 hodin. Barvicí reakce se zastavila promytím sekcí destilovanou vodou. Sekce se dehydratovaly v acetonu, změkčily se xylenfenolkreosotem (Allchem, UK), čistily se xylenem a překryly za použití Eukitt (Bie and Bemtsen, Denmark).

Kontrolní reakce obsahují 1) ošetření sekcí s RNázou A (50 gg/ml, Pharmacia, Sweden) před hybridizaci, 2) hybridizace sekcí se stonásobným přebytkem neznačené sondy a 3) hybridizaci sekcí se samotným hybridizačním pufrem. Výsledky hybrid izačních reakcí jsou uvedeny v tabulce č. 2.

-28CZ 303358 B6

Tabulka č. 2: Exprese neublastinu u krys

struktura	E14	P0/P1	P7	dospělí
přední mozek	++
ventrální střední mozek	-
ganglie dorzálních kořenů	++
mícha	+
sítnice	+
bulbus olfactorius	( + )	++	++
malý mozeček		+	++	+
trojklanná ganglia		++	++
striatum		+	+ < + )
kůra mozková	{ + )	++	++	+
hyppocampus		(+)	++	++

14. den embrya (El4) se neublastin slabě exprimoval v embryích krys v předním mozku, v zadním mozku a v míše. mRNA neublastinu se také detekovala v očích (sítnice), v gangliích dorzálních kořenů, v troj klaných gangliích (V) a v ledvinách, plicích, srdci, játrech a ve střevech. U nově narozených krys (PO) se zjistila exprese neublastinu v mozkové kůře a v striatu. Exprese io neublastinu se také detekovala v bulbus ofaktorius a v hippocampusu. U 7 dní starých krys (P7) se neublastin exprimoval v mozkové kůře, stratiu, bulbus olfactorius a v malém mozečku. Signál se zjistil také v hippokampusu. U dospělých krys se detekovala velmi nízká nebo žádná exprese neublastinu ve většině oblastí mozku. Slabé signály se detekovaly v thalamickém jádru a znatelná exprese neublastinu se detekovala v hippokampusu.

Příklad 4: Neublastinové polypeptídy

Otevřený čtecí rámec nebo kódující oblast (CDS) identifikované v SEQ ID NO: 8 kóduje pre20 pro-polypeptid (označený pre-pro-neublastin). Aminokyselinová sekvence předpovězená na základě otevřeného čtecího rámce je zobrazena v SEQ ID NO: 9. Na základě sekvence SEQ ID

NO: 9 se identifikovaly tři varianty neublastinových polypeptidů. Tyto varianty zahrnují:

i) polypeptíd označený jako NBN140, který má aminokyselinovou sekvenci označenou jako

SEQ ID NO: 10, ii) polypeptíd označený jako NBN116, který má aminokyselinovou sekvenci označenou jako SEQ ID NO: 11a iii) polypeptíd označený jako NBN113, který má aminokyselinovou sekvenci označenou jako SEQ ID NO: 12.

Podobně na základě kódující oblasti (CDS) jak se uvádí v sekvenci SEQ ID NO: 3, která kóduje pre-pro-polypeptid má aminokyselinovou sekvenci (označenou jako SEQ ID NO: 4), se ídenti35 fikovaly tři varianty neublastinu. Tyto varianty zahrnují:

i) polypeptíd, který má aminokyselinovou sekvenci označenou jako SEQ ID NO: 5,

-29CZ 303358 B6 ii) polypeptid, který má aminokyselinovou sekvenci označenou jako SEQ ID NO: 6 a iii) polypeptid, který má aminokyselinovou sekvenci označenou jako SEQ ID NO: 7.

Na základě uspořádání více sekvencí založeném na ClustalW (1.75) se SEQ ID NO: 9 seřadila s aminokyselinovými sekvencemi GDNF, persefmu a neurtutinu. Toto uspořádání se uvádí v tabulce č. 3.

Tabulka č. 3: Porovnání aminokyselinové sekvence neublastinu, neurtrinu a GDNF neurturin - celý neublastin persefin - celý GDNF __ lidský - celý

--------------------MQFWIOOUUJISVIXZSSVLSIWMCRZGLLLSHRLOPA

MEIX3tXXn^TLSHCPWPimQPJUAfFrLAALALLSSVAEAStX3SAPRSPAPRSSPFP

MKLWDWAVCLVLLHTASAFPLPAGKRPPEAPABDRSLGRRRAPFALSSDS neurturin - celý neublastin persefin - celý GDNF _ lidský - celý neurturin - celý neublastin persefin - celý

LVPLKRLPRTliDARIARLAOYRALLQGAPDAMELRELTPMAGRPPGPRRRAGPRRíl

VLASPAGHLPGGRTARWCSGRARRPPPQPSRPAPPPPAPPSALPRGGRAARAGGPG

-HAVGKPlJjGSl^iIXSI^IXXX^PnAI^GVPVADGEFSSEQVAKAGOTWIjGTHRPL

NMPEDYPDQFDDVMDFIQATIKRLKRSPDKQMAVLPRRERNRQAAAANPENSRQKG «ARAIUZ^UU>CgiJtEI£VRVS£LgI^ASDgIVLFlTCUiaXeEA-AAinfifDLCLRR sraraagargcrlrsqlvpvhamxohrsdelvhiwfcotscrr-arsphdlsias

AJUJmLSGPC?QLWSLTLSVAELGgZ3YASEEKVinrrCAOSCPRGARTQHGIALAR

GDNF _ lidský - celý RJUXJRGWmGCVLTKtHUnrrDMWYETKEELIIEEESKS^-AE™^!!^

neurturin - celý neublastin persefin - celý GDNF _ lidský - celý * * · ***** * ^; -* *

LRQRRBLRRE- --RVRAQPCCRPTAYEDEVSFLDAHSKYHTVHELSARBCACVLLGAGAL>RPPPGSRPVSQPCCRPTRYE-AVSFMDVNSTWRTVDRL3ATACqCLG lqgqgrahgg

DQSQGRAHOG--------PCCRPTRYT- ΡνΑΡΙ43ΡΚΗΗΜΟΒ1,ΓΟΙ'3ΑΑΑΕΟΟΟΟ

LSRNRRLVSD----KvdQACCRPXAFDDDLSPWDMLVYHILRKHaAKRCOCI kde symbol * označuje polohu, která vykazuje jediný zcela konzervativní zbytek.

symbol : označuje, že jedna z následujících „silných“ skupin je plně konzervativní: -STA, NEQK, NHQK, NDEQ, QHRK, MILV, MILF, HY, FYW.

symbol . označuje, že jedna z následujících „slabých“ skupin je zcela konzervativní: -CSA, ATV, SAG, STNK, STPA, SGND, SNDEQK, NDEQHK, NEQHRK, VLIM, HFY.

Na základě uspořádání aminokyselinových sekvencí uvedených v tabulce č, 3 je možné spatřit, že neublastin má sedm konzervativních cysteinových zbytků v polohách, které jsou konzervativní v superrodině TGF-β. V jednom preferovaném provedení vynálezu preferovaný polypeptid neublastinu obsahuje (sedm) cysteinových zbytků konzervovaných jako v SEQ ID NO: 2 v poloze 8, 35,39, 72, 73, 101 a 103 nebo jako SEQ ID NO: 4 a 9 v polohách 43, 70, 74, 107, 108, 136 a 138. Těchto sedm konzervativních zbytků se objevuje v super-rodině TGF-b, přičemž tvoří tři intramonomerické disulfidové vazby (uvažuje se například v SEQ ID NO: 2 mezi cysteinovými zbytky 8až73,35až 101 a39ažl03a například v SEQ ID NO: 4 a 9 mezi cysteinovými zbytky 43 až 108, 70 až 136 a 74 až 138) a jednu intermonomerickou disulfidovou vazbu (uvažuje se například v SEQ ID NO: 2 mezi cysteinovými zbytky 72 až 72 a například v SEQ ID NO: 4 a 9 mezi cysteinovými zbytky 107 až 107), které dohromady s rozsáhlou oblastí beta řetězce tvoří

-30CZ 303358 B6 konzervovaný strukturální motiv pro superrodinu TGF-b (popisuje se v publikaci Daopin et al., Proteins 1993, 17, 176-192).

Na základě uspořádání této sekvence se ukázalo, že neublastin je členem subrodiny GDNF 5 neutrofických faktorů (LGLG-FR(Y/F)CSGSC-QxCCRP-SAxxCGC, peptidová mapa subrodiny GNDF, podtrženo v tabulce č. 3).

Vypočítala se homologie neublastinu s jinými členy rodiny GNDF a výsledek se uvádí v tabulce č. 4 dále v textu.

io

Tabulka Č. 4: Homologie neublastinových polypeptidů s jinými členy rodiny GDNF

	zralý protein NBN140	zralý protein NBN113
	homologie	homologie peptidú v plné délce	homologie	homologie peptidů v plné délce
neucotrof ický	shoda	přesah	vysoká homologie	shoda	shoda	přesah	vysoká homologie	shoda
faktor		(ak)				(ak)
GDNF	34%	137	48%	31,9%	36%	111	52%	29,5%
	(47/137)		(67/137)		(41/111)		(59/111)
NTN	48%	127	56%	36,9%	49%	114	57%	44, 7%
	(61/127)		(72/127)		(56/114)		(66/114)
PSP	44%	125	56%	36,9	45%	111	57%	44,3%
	(55/125)		(71/125)		(51/111)		(65/111)
IHA	31%	81	-	25,2%	31%	81	-	22,5%
	(25/81)				(25/81)
TGF-P2	23%	73	-	18,5	23%	73	-	20,2%
	(17/73)				(17/73)

GDNF = neurotrofický faktor získaný z gliální buněčné linie

NTN = neurturin

PSP = persefín

IHA = inhibin-a

TF-p2 = transformační růstový faktor beta 2 vysoká homologie indikuje, že jedna z následujících „silných“ skupin je konzervativní: STA, NEQK, NHQK, NDEQ, QHRK, MILV, MILF, HY, FYW.

nr25

Příklad 5: Produkce neublastinu

V eukaryontních a prokaryontních buňkách se produkoval neublastin, jak se popisuje dále v textu.

Expresívní vektory cDNA v plné délce kódující neublastin se začlenila do eukaryontního expresívního vektoru pUbilZ. Tento vektor se vytvořil klonováním lidského promotoru UbC do upravené verze pcDNA3/Zeo. Neupravený pcDNA3.1/Zeo je možné získat u firmy Invitrogen. Upravená forma pcDNA3.1/Zeo je menší než rodičovský vektor, protože se odstranil gen kódující ampicilin (od polohy 3933 do 5015) a sekvence od polohy 2838 do 3134. V této upravené verzi pcDNA3.1/Zeo se promotor CMV nahradil promotorem UbC z pTEJ-8 (popisuje se v publikaci Johansen et al., FEBS Lett. 1990,267, 289 až 294), přičemž výsledný plazmid se označil jako pUbilZ.

Exprese v savčích buňkách

Vektor pUbilZ, který obsahuje sekvenci kódující neublastin, se pak transfekoval do savčí buněčné linie HiB5, kterou tvoří tmortilizované krysí nervové buňky (popisuje se v publikaci Renfranz et ak, Cell, 1991, 66, 713 až 729). Vytvořilo se několik buněčných linií HiB5 stabilně exprimující neublastin (jak se stanovilo RT-PCR). V jedné z těchto stabilních linií se potvrdila exprese HiB5pUbilzNBN22 hybridizaci celkové RNA na northem bíotu s neublastinovou sondou značenou ³² P. Výsledky těchto studií jsou zobrazeny na obrázku č. 2. HiB5pUbilzNBN22 se pak použil jako zdroj neublastinu při studiu neublastinové neutrofické aktivity.

Obrázek č. 2 z obrazuje expresi neublastinové cDNA v klonu HiB5pUbilzNBN22 (to znamená, že northem blot se testuje za použiti sondy cDNA neublastinu značeného ^{3 2}P podle vynálezu, jak se popisuje shora v textu). Blot se připravil celkovou extrakcí RNA z netransfekovaných buněk HiB5, buněk HiB5pUbilzNBN22 a buněk HiB5pUbilzGDNF14. Polohy pruhů 28S a 18S rRNA odpovídající velikosti 4,1 kb a 1,9 kb jsou označeny na blotu.

Jak je zobrazeno na obrázku č. 3, protilátky vzniklé proti polypeptidům odvozených od neublastinu také rozeznávají protein o velikosti přibližně 13 kD v upraveném médiu, které pochází z klonu HiB5pUbilzNBN22, ale nikoli z netransfekovaných buněk HiB5 (příklad 6).

Předpokládané molekulové hmotnosti neupravených (například chybí post-translační úpravy) neublastinových polypeptidů NBN140 (SEQ ID NO: 10), NBNl 16 (SEQ ID NO: 11) a NBN113 (SEQ ID NO: 12) se stanovily jako hodnoty 14,7 kD, 12,4 kD a 12,1 kD.

Metody

Northem blot obsahující celkovou RNA (10 pg) z netransfekovaných buněk HiB5 a klon HiB5pUbilzNBN22 se připravil elektroforézou na 0,8% agarózovém gelu ve formaldehydu a blotovaly se na nylonovou membránu (Duralone, Stratagene). Blot se hybridizoval a promyl, jak se popisuje v příkladu 3 se sondou o velikosti 1,3 kb značenou ³²P, která se připravila náhodným značením a pokrývá SEQ ID NO: 8 a další nukleotidy z 5'UTR a 3'UTR neublastinové cDNA. Blot se exponoval na Hyperfilm MP (Amersham) při teplotě —80 °C za použití destiček zvyšujících intenzitu signálu.

Upravené médium z HiB5pUbilzNBN22 nebo z netransfekovaných buněk Hib5 se inkubovalo přes noc v médiu, které neobsahuje sérum doplněné doplňkem N2 (Life Technologies, kat. č. 17502-048) se zakoncentrovalo a separovalo na 15% polyakrylových gelech (Amersham Pharmacie Biotech, kat č. 80—1262—01). Proteiny se přenesly na membrány PVDF (Amersham Pharmacia Biotech, kat. č. RPN-303F) a vazebná místa nespecifických proteinů se blokovala 5%

-32CZ 303358 B6 sušeným mlékem bez tuku v PBS s 0,1 % Tween-20. Membrány se inkubovaly přes noc polyklonálními neublastickými protilátkami (1:1 000), pak následovala inkubace se sekundárními protilátkami proti králičímu IgG (Amersham Phannacia Biotech, kat. č. NA 934). Imunologické barvení se zviditelnilo za použití zesílené chemoluminiscence (ECL) (Amersham Phannacia Bio5 těch, kat. č. RPN2109) nebo ECL+ (Amersham Pharmacia Biotech, kat. č. RPN2132) podle instrukcí výrobce (Amersham).

Výsledky uvedených experimentů jsou zobrazeny na obrázku č. 3, Obrázky č. 3A a 3B jsou zobrazení exprese neublastinového proteinu v transfekovaných buňkách HiB5. Kultivační io médium pocházející z netransfekovaných buněk HiB5 kultivovaných přes noc (dráha 1) nebo z klonu HiB5 stabilně transfekovaných cDNA neublastinu (dráha 2) se zakoncentrovalo, jak se popisuje shora v textu. Kultivační médium se pak analyzovalo western přenosem za použití dvou různých polykíonálních protilátek Ab-1 a Ab-2 popsaných v příkladu 10, které jsou specifické pro neublastin. V kultivačním médiu získaném z transfekovaných buněk se zjistily protilátky, které rozeznávají protein s molekulovou hmotností přibližně 15 kDa, Tento protein se objevil v případě netransfekovaných buněk HiB5.

Klonovaná cDNA kódující neublastin se také začlenila do jiného eukaryotního expresívního vektoru, například eukaryotního expresívního vektoru TEJ-8 (popisuje se v publikaci Johansen et al., FEBS Lett. 1990, 267, 289 až 294) nebo pcDNA-3 (Invitrogen) a výsledkem je expresivní plazmid transfekovaný do alternativní buněčné linie, jako jsou například buňky vaječníků čínských křečků (CHO), HEK293, COS, PC 12 nebo buňky RN33b nebo lidské nervové kmenové buňky. Stabilní buněčné linie exprimující neublastin se používají například při produkci neublastinového proteinu.

Exprese v buňkách CHO Konstrukce plazmidu pJC070.14

Za účelem exprimovat cDNA neublastinu v buňkách vaječníků čínských křečků se fragment cDNA kódující prepro-formu lidského neublastinu začlenil do savčího expresívního vektoru pEAG347, aby vznikl plazmid pJC070.14. Vektor pEAG347 obsahuje tandem časného promotoru SV40 a adenovirového hlavního pozdního promotoru (získaného z plazmidu pAD2beta, popisuje se v publikaci Norton and Coffin, Mo. Cell. Biol. 1985, 5,281) a jediného klonovacího místa

Notl, po němž následují SV40 pozdní terminační signály transkripce a póly A signál (získaný z plazmidu pCMVbeta, popisuje se v publikaci MacGregor and Caskey, Nucl. Acids. Res. 1989, 17, 2365). Navíc vektor pEAG347 obsahuje plazmidovou kostru získanou z vektoru pUC19 a dhfr získaný z pSV2dhfr pro selekci MTX a amplifikaci v transfekovaných buňkách CHO.

Plazmid pJCO70.14 se vytvořil ve dvou krocích. Nejdříve se vytvořil fragment kódující preproformu lidského neublastinu izolovaný z plazmidu pUbilZ-NBN za použití pCR s oligonukleotidy KD2-824 5'AAGGAAAAAAGCGGCCGCCA TGGAACTTGGACTTGGAGG3' (SEQ ID NO: 31), KD2-825 5'TTTTTTCCTT GGCGGCCGCT CAGCCCAGGC AGCCGCAGG3' (SEQ ID NO: 32) a polymeráza PFU. Ve druhém kroku se provedlo částečné štěpení enzymem Not-1 plazmidu pJC069 za vzniku fragmentu o velikosti 685 bp (obsahuje gen neublastinu), který se klonoval do restríkčního místa Not-1 plazmidu pEAG347 za vzniku plazmidu pJC070.14. Transkripce neublastinového genu v plazmidu pJC070.14 se řídila adenovirovým hlavním pozdním promotorem.

Vytvoření buněčných linií CHO exprimující neublastin

200 pg vektoru pJC070.14 se línearizovalo štěpením restrikční endonukleázou Mlu-1. DNA se pak extrahovala směsí fenol .chloroform Jsoamylalkohol (25:24:1) a srážela se etanolem. Linearizovaná DNA se resuspendovala v 20mM Hepes pH 7,05, 137mM NaCl, 5mM KC1,

0,7mM Na₂HPO4, 6mM dextrózou (HEBS) a zavedla se do ME7 CHO dukx Bt {dhfr-} buněk

-33CZ 303358 B6 (p23) elektroporací (280V a 960 gF). Po elektroporaci se buňky dále kultivovaly v a+ upraveném kultivačním Eagle's médiu (MEM) doplněném 10% zárodečním bovinním sérem (FBS) po dobu 2 dní. Buňky se pak ošetřily trypsinem a nanesly se na plotnu o průměru 100 mm (100 000 buněk/plotnu) v kultivačním médiu a-MEM (které neobsahuje ribo- a deoxyribonukleotidy) doplněném 10% dialyzovaným FBS po dobu 5 dní. Buňky se následně rozdělily na plotny o průměru 100 mm s hustotou 100 000 buněk na jednu plotnu a vybraly se v 200mM metatroxátu. Izolovaly se rezistentní kolonie a nanesly se na plotny se 6 prohlubněmi. Upravená kultivační média z každého klonu se testovaly za použití specifického testu vhodného pro stanovení neublastinu, jak se popisuje dále v textu. 12 klonů, které exprimují nejvyšší množství neublastinu se vneslo do lahvi TI 62 a následně se testovalo, Na obrázku Č, 10 je znázorněno, že buněčné linie CHO produkovaly neublastin v rozmezí 25 až 50 ng/ml.

Temámí komplexní test vhodný pro neublastin

Testovala se přítomnost neublastinu v kultivačním médiu supematantů buněčné linie CHO za použití upravené formy temámího komplexního testu popsaného v publikaci Sanicola et al. Proč. Nati. Acad., Sci USA 1997,94, 6238).

V tomto testu se u molekul podobných GDNF hodnotí schopnost zprostředkovat navázání mezi extrabuněčnou oblastí RET a různými receptory GFRal, GFRa2 a GFRot3. Rozpustné formy RET a ko-receptorů se vytvořily jako fúzní proteiny. Fúzní protein mezí extrabuněčnou oblastí krysího RET a placentámí alkalickou fosfatázou (RET-AP) a fúzní protein mezi extrabuněčnou oblastí krysího GFRal (popisuje se ve zveřejněné přihlášce WO 97/44356, listopad 27, 1997) a oblastí Fc lidského IgGl (rGFRal-Ig), jak se popisuje v publikaci Sanicola et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 1997, 94,6238.

Aby vznikl fúzní protein mezi extrabuněčnou oblastí myšího GFRa3 a oblastí Fc lidského IgGl (mGFRa3-Ig), fragment DNA kódující aminokyseliny 1 až 359 myšího RETU se ligoval s fragmentem, který obsahuje oblast Fc lidského IgGl a klonoval se do expresívního vektoru pEAG347 za vzniku plazmídu pGJ144. Plazmid pGJ144 se transfekoval do buněk vaječníků čínských křečků (CHO) za vzniku stabilní buněčné linie produkující fúzní protein, který se čistil na imunoafinitní koloně na sefaróze s proteinem A za použití standardních metod. Jestliže molekula podobná GDNF může v tomto testu zprostředkovat navázání ko-receptoru na RET, pak fúzní protein RET-AP se uchová na plotně a množství, které se uchová se měří za použití chemoluminiscenčního substrátu vhodného pro alkalickou fosfatázu.

Destičky vhodné pro test ELISA Microlite-1 (Dynex Technologies) se potáhly kozími protilátkami v koncentraci 1 gg/ml, které jsou specifické pro lidský Fc v 50 mM hydrogenuhličitan/uhličitan při hodnotě pH 9,6 po dobu 16 hodin. Destičky se vyprázdnily a naplnily se 300 μΐ 1% roztoku I-block (Tropix) v TBS/0,5% Tween-20 (TBST) po dobu 1 hodiny. Po promytí třikrát s TBST se prohlubně naplnily 100 μΐ rGFRal-Ig nebo mGFRa3-Ig v koncentraci 1 gg/mi Čeděnými v upraveném kultivačním médiu, který pochází z kultivace buněk 293 EBNA, které exprimují fúzní gen RET-AP. 100 gl upraveného média, které pochází z neublastinových klonů CHO se pak přidalo do horní prohlubně sloupce prohlubní a provedlo se dvojnásobné sériové ředění v každé řadě prohlubní a vše se inkubovalo po dobu 1,5 hodiny při teplotě místnosti. Destičky se pak promyly třikrát TBST a dvakrát 200 mM Tris pH 9,8, 10 mM MgCl₂ (pufr CSPD). Promývací roztok se pak nahradil 425 μΜ CSPD (Tropix) v pufru CSPD, který obsahuje zesilovač chemiluminiscence Saphire (Tropix) v koncentraci 1 mg/ml a vše se inkubovalo po dobu 30 minut při teplotě místnosti. Chemoluminiscence se měřila za použití luminometru Dynatech.

V počátečních experimentech se zkoumalo, zda neublastin produkovaný buněčnými liniemi CHO zprostředkovávané navázání GFRal nebo GFRa3 na extrabuněčnou oblast RET. Jak je zobrazeno na obrázku č. 11 upravené kultivační médium pocházející z buněk CHO klon #53 vykazoval v temámím komplexním testu silný signál, když se zahrnul fúzní protein rGFRal-Ig indikující,

-34CZ 303358 B6 že neublastin se váže na GFRa3, ale nikoli na GFRal. Toto chování je odlišné od neublastinu získaného z GDNF, jak se uvádí na obrázku č. 11, přičemž GDNF se váže na GFRal, ale nikoli na GFRa3. Žádný signál se nepozoroval ani s ko-receptorem fúzního proteinu, když se testovalo upravené médium pocházející z rodičovské buněčné linie CHO nebo přímo kultivačním médium.

Za účelem kvantifikovat sílu exprese neublastinu v buněčných liniích CHO se připravila za použití rGFRal-Ig a GDNF standardní křivka začínající při koncentraci 1 ng/ml. Koncentrace neublastinu v případě různých buněčných linií se pak vypočítaly za použití standardní křivky. Množství neublastinu produkované pěti buněčnými liniemi CHO jsou uvedeny na obrázku č. 10. io Protože tento odhad závisí na testovaném předpokladu, že vazebná afinita mezi GDNF a GFRal je podobná vazebné afinitě mezi neublastinem a GFRa3, přičemž uvedené množství je pouze při* bližné.

Analýza neublastinu ze supematantů buněčné linie CHO

Za účelem dále analyzoval neublastin produkovaný buněčnými liniemi CHO se protein extrahoval z kultivačního média za použití fúzního proteinu GFRa3-Ig a analyzoval se western přenosem za použití polyklonálních protilátek vytvořených proti neublastinovým peptidům.

V prvním experimentu se neublastin extrahoval za použití mGFRa3-Ig, který je přichycen na kuličky sefarózy. mGFRa3-Ig se připojil na kuličky sefarózy za použití podmínek, které doporučuje výrobce (Pharmacia lne.). Ke vzorkům upraveného kultivačního média z buněčné linie CHO, která slouží jako negativní kontrola, nebo z neublastinu, který produkuje buněčná linie #16, o objemu 1 ml se přidalo 100 μΐ mGFRa3-Ig-sefarÓ2y. Suspenze se inkubovaly po dobu dvou hodin za stálého míchání. Každá suspenze se centrifugovala a odstranil se supematant, pak následují tři promytí 1 ml lOmM HEPES, 100 mM NaCl, pH 7,5. Každá pryskyřice se resuspendovala ve 100 μΐ 2x koncentrovaného redukčního pufru a vše se zahřálo na teplotu 100 °C po dobu 5 minut. 20 μΐ vzorkového pufru supematantu a 10 μΐ standardu molekulové hmotnosti (FMC) se aplikovalo do každé prohlubně 10 až 20% SDS-PAGE gelu (Owl Scientific). Gel se podrobil elektroforéze konstantním proudem 40 mA po dobu 72 minut.

V případě analýzy western přenosem se protein elektroblotoval na nitrocelulózou membránu (Schleicher and Schuell) na zařízení Hofer Scientific v lOmM CAPS, 10% methanolu, 0,05% SDS, pH 11,2 (po dobu 45 minut při konstantním proudu 400 mA). Po přenosu se nitrocelulózo35 vý filtr odstranil z kazety a markéry molekulových hmotností se vizualizovaly barvením roztokem 0,1 % Ponceau S v 1% kyselině octové po dobu 60 vteřin. Membrána se rozstrihla na dvě sekce a přebytečné barvivo se odstranilo mírným mícháním v destilované vodě. Membrány se blokovaly v 2% netučném sušeném mléku v TBS přes noc při teplotě 4 °C. Membrány se inkubovaly jednotlivě se dvěma afinitně čištěnýma protilátkami proti neublastinovému peptidu (R30 a R31) při koncentraci 1,0 pg/ml v 2% netučném sušeném mléce v TBS. Membrány se promyly třikrát po dobu 10 minut v TBS-Tween a inkubovaly se s antikráličím IgG-HRP konjugátem (Biorad) v ředění 1:5000 po dobu 30 minut. Membrány se třikrát promyly po dobu 10 minut v TBS-Tween a vyvíjely se substrátem ECL (Amersham). Jak je zobrazeno na obrázku č. 12. Oběma druhy protilátek se detekovaly v proteinech extrahovaných z neublastinu, který produkuje buněčná linie CHO, specifické pruhy (dráha 2 a 4). Tyto pruhy se porovnaly s pruhy pozorovanými v proteinech extrahovaných z buněčné linie, která slouží jako negativní kontrola (dráha 1 a 3).

Molekulová hmotnost nižších druhů je přibližně 13 kD a pravděpodobně reprezentuje zralou oblast neublastinu, která vzniká po štěpení pro-domény. Toto štěpení se může objevit po libovol50 něm ze tří zbytků Arg- (například -RXXRÍ-) prepro-neublastínového proteinu za vzniku buď 140 ak, nebo 113 ak, jak se uvádí v SEQ ID NO: 10, 11 nebo 12. Stanovil se, že předpovězené molekulové hmotnosti neupravených (to znamená, že chybí post-translační úpravy) neublastinových polypeptidů NBN140 (SEQ ID NO: 10), NBN116 (SEQ ID NO: ll)aNBN113 (SEQ ID

-35 CZ 303358 B6

NO: 12) jsou 14,7 kD, 12,4 kD a 12,1 kD. Pro potvrzení struktury těchto druhů stejně jako jiných pruhů specifických pro neublastin je nutné provést další analýzu.

Ve druhém experimentu se neublastin extrahoval s hGFRa3-Ig na destičkách vhodných pro test

ELISA. Aby vznikl fúzní protein mezi extrabuněčnou doménou lidského fragmentu DNA hGFRcú (popisuje se ve zveřejněné přihlášce WO97/44356, listopad 27, 1997) a Fc doménu lidského IgGl (hGFRa3-Ig), fragment DNA kódující aminokyseliny 1 až 364 lidského GFRa3 se ligoval k fragmentu, který obsahuje oblast Fc lidských IgGl a klonoval se do expresívního vektoru CH269 popsaného v publikaci Sanicola et al., Proč. Nati. Acad. Sci USA, 1997, 94, 6238). io Fúzní protein kódovaný tímto plazmidem se dočasně exprimoval v buňkách 293 s jaderným antigenem kódovaným virem Epstein-Barrové (EBNA) a čistil se na imunoafínítní koloně na sefaróze s proteinem A za použití standardních metod.

Šest prohlubní destičky s 96 prohlubněmi se potáhlo přes noc při teplotě 4 °C kozími antilidský15 mi IgG (specifický pro fragment Fcy, Jackson Immunologics) v koncentraci 25 mg/ml v PBS (300 ml/prohlubeň). Prohlubně se blokovaly po dobu jedné hodiny při teplotě místnosti 400 ml 1% BSA v PBS. Po 3 hodinách promývání s PBST (PBS + 0,05 % Tween 20) se do každé prohlubně přidalo 300 ml hGFRa3-Ig (10 mg/ml v PBS obsahující 0,1 % BSA). Plotna se inkubovala po dobu 1 hodiny při teplotě místnosti a aby se dosáhlo maximálního navázání, destička se slabě míchala (200 kmitů/min). Prohlubně se pak vyprázdnily a opět se třikrát promyly s PBST. Do každé ze tří prohlubní se přidalo 250 ml upraveného média z buněčné linie CHO, která slouží jako negativní kontrola nebo buněčné linie CHO #25 produkující neublastin. Destička se inkubovala po dobu 3 hodin při teplotě místnosti a jemně se míchala (300 kmitů/min). Prohlubně se pak promyly dvakrát s PBST. Do první prohlubně se přidalo 25 ml neredukčního pufru Laemli a destička se rychle míchala po dobu 5 minut, aby se vymyly navázané proteiny (1300 kmitů/min). Obsah se přenesl do vedlejší prohlubně a postup se opakoval, aby se vymyly proteiny navázané ve druhé nebo třetí prohlubni. Po přidání B-merkaptoethanolu (konečná koncentrace je 5%) se vzorky povařily po dobu 5 minut a analyzovaly se na SDS-PAGE na 10 až 20% polyakry (amidovém gelu.

V případě analýzy western blotem se proteiny přenesly na nitrocelulózu. Membrána se blokovala a testovala se sondou v 5% beztučném sušeném mléce, PBST a promyla se PBST. Neublastin se po reakci s polyklonálními protilátkami (R30 a R31) vzniklými proti dvěma neublastinovým peptidům (v koncentraci 1 pg/ml) testovaly elektrochemoluminiscencí. Pak následuje reakce s kozími anti-králičími protilátkami konjugovanými s HRP (BioRad). Jak je zobrazeno na obrázku č. 13, v extrahovaných proteinech z buněčné linie CHO produkující neublastin se detekovalo pět pruhů specifických pro neublastin (dráha 2). Dva nižší pruhy jsou velmi podobné pruhům pozorovaným na obrázku č. 12. Nižší pruh pravděpodobně reprezentuje zralou oblast neublastinu vytvořenou po štěpení pro-domény.

Následná analýza (data nejsou uvedena) pruhů na obrázku č. 13 ukazuje, že deglykosylace s PGNázou F pruhu, který odpovídá molekulové hmotnosti 18 kD, redukuje molekulovou hmotnost pruhu na velikost odpovídající nejnižšímu pruhu na gelu na obrázku č. 13. To naznačuje, že neublastin se může produkovat jako glykosylovaný protein v savčích buňkách.

Exprese neublastinu v bakteriích E. coli.

Za účelem exprimovat gen neublastinu v bakteriích E. coli se zkonstruovaly syngeny s nižším obsahem GC a preferované kodony E. coli. Syngen se klonoval do dvou vektorů pET19b apMJBl64, které jsou deriváty pET19b. Konstrukce s pET19b je zobrazena na obrázku č. 14,

V této konstrukci se sekvence kódující zralou oblast neublastinu (NBN113) přímo fúzuje s iniciačním methioninem. Konstrukce spMJB164 je zobrazena na obrázku č. 15. V této konstrukci se zralá oblast neublastinu fúzuje s histidinovým tag (to je 10 histidinů) separovaných enterokinázovým místem štěpení. Iniciační methionin leží před histidinovým tag.

-36CZ 303358 B6

Nukleotidová sekvence kódující neublastin na obrázku č. 14

ATGGCTGGAGGACCGGGATCTCGTGCTCGTGCAGCAGGAGCACGTGGCTGTCG

TCTGCGTTCTCAACTAGTGCCGGTGCGTGCACTCGGACTGGGACACCGTTCCGA

CGAACTAGTACGTTTTCGTTTTTGTTCAGGATCTTGTCGTCGTGCACGTTCTCCG

CATGATCTATCTCTAGCATCTCTACTAGGAGCCGGAGCACTAAGACCGCCGCCG

GGATCTAGACCTGTATCTCAACCTTGTTGTAGACCTACTAGATACGAAGCAGTAT

CTTTCATGGACGTAAACTCTACATGGAGAACCGTAGATAGACTATCTGCAACCGC

ATGTGGCTGTCTAGGATGATAATAG [SEQ ID NO: 29]

Nukleotidová sekvence kódující neublastin s his-tag na obrázku č. 15

ATGGGCCATCATCATCATCATCATCATCATCATCACTCGAGCGGCCATATCGACG

ACGACGACAAGGCTGGAGGACCGGGATCTCGTGCTCGTGCAGCAGGAGCACGT

GGCTGTCGTCTGCGTTCTCAACTAGTGCCGGTGCGTGCACTCGGACTGGGACAC

CGTTCCGACGAACTAGTACGTTTTCGTTTTTGTTCAGGATCTTGTCGTCGTGCAC

GTTCTCCGCATGATCTATCTCTAGCATCTCTACTAGGAGCCGGAGCACTAAGACC

GCCGCCGGGATCTAGACCTGTATCTCAACCTTGTTGTAGACCTACTAGATACGAA

GCAGTATCTTTCATGGACGTAAACTCTACATGGAGAACCGTAGATAGACTATCTG

CAACCGCATGTGGCTGTCTAGGATGATAATAG [SEQ ID NO: 30J ¹⁰

Příklad 6: Účinek neublastinu na přežití krysích zárodečných dopaminergických neuronů a aktivitu ChAT

V této sérii experimentů se stanovil účinek upraveného média z buněk HiB5pUblzNBN22 pro15 dukujících neublastin, jak se popisuje shora v textu.

Příprava kultur

Ventrální mesencefalon nebo mícha se získala z embryí krys E14 v chlazeném Hanksově pufrovaném roztoku solí (HBSS). Kousky tkáně se inkubovaly ve sterilním filtrovaném 0,1% trypsinu (Worthington) a 0,05% DNázy (Sigma) v HBSS při teplotě 37 °C po dobu 20 minut. Kousky tkáně se pak promyly čtyřikrát v HBSS + 0,05% DNáze a rozmělnily se za použití automatické pipety o objemu 1 ml. Suspenze se pak centrifugovala při 600 ot./min. po dobu 5 minut a pelet se resuspendoval v kultivačním médiu upraveném sérem (SCM, DMEM s 10% zárodeč25 ním telecím sérem). Celkový počet buněk se stanovil barvivém tryptofanovou modří a nanesl se na plotny s hustotou 100 000 buněk/cm² v komůrce sosmi prohlubněmi (Nunc) potaženými poly-L-lyzinem vhodných pro odhad dopaminergických neuronů nebo při 200 000 buněk/cm⁵ na plotnách s 48 prohlubněmi (Nunc) v případě měření aktivity ChAT. Buňky se inkubovaly v SCM v atmosféře 5 % CO₂/95 % O₂ a 95% vlhkosti při teplotě 37 °C po dobu 24 až 48 hodin a pak se médium vymění za médium bez séra (SEM) a přidají se neurotrofické faktory.

Buňky vhodné pro stanovení přežití dopaminergických neuronů se nechaly 5 dní v SFM s trofickým faktorem a pak se fixovaly po dobu 5 minut v 4% PFA a obarvily se imunohistochemickou metodou, přičemž se stanovila přítomnost tyrosinové hydroxylázy.

-37CZ 303358 B6

Buňky vhodné pro stanovení aktivity ChAT se nechaly tři dni s SFM a pak se lyžovaly v HBSS a 0,1 % Triton X-100 a nechaly se bezprostředně zmrznout na suchém ledu až do měření aktivity Chat.

Přidání trofického faktoru:

Upravené médium se získalo z netransfekovaných kontrolních buněk HiB5 nebo buněk HiB5 produkujících neublastin (HiB5pUbi1žNBN22) nebo GDNF (HiB5pUbilzGDNF-L17). HiB5pUbilzNBN22 produkuje přibližně 20 ng GDNF za 24 hodin z 10⁵ buněk, jak se stanovilo testem GDFN-ELISA v případě upraveného média, které se shromáždilo z kultivace buněk. Buněčné linie se kultivovaly přes noc s DMEM a 1% FCS a supematant se odebral a skladovat při teplotě -20 °C až do doby dalšího použití. Supematanty se ředily v poměru 1:50 v SFM a pak se přidaly k buňkám. Oddělené prohlubně se pak ošetřily supematantem pocházejícím z kontrolních buněk HiB5 (1:50) a čištěným rekombinantním krysím GDNF (z 0,03 až 10 ng/ml).

Výsledky uvedených experimentů jsou zobrazeny na obrázku č. 4. Obrázek č. 4A až 4C jsou to ilustrace účinku neublastinu vylučovaného z buněk HiB5pUbilžNBN22 na přežití kultivovaných krysích zárodečných dopamínergických ventrálních mezencefalických neuronů a aktivity ChAT v cholinergických motorických neuronů hlavového nervu v médiu, které neobsahuje sérum, jak se popisuje v příkladu 5.1 shora v textu.

Obrázek č. 4A zobrazuje křivky odezvy na dávku v případě rekombínantního GDNF na aktivitu ChAT (dpm/hodinu) měřeno v D1V5 v kulturách bez séra, které byly vznikly z El4 ventrálního středního mozku (to je HiB5, GDNF 0,03 ng/ml, GDNF 0,1 ng/ml, GDNF 0,3 ng/ml, GDNF 1 ng/ml, GDNF 10 ng/ml, GDNF 100 ng/ml).

Obrázek č. 4B zobrazuje aktivitu ChAT (dpm/hodinu) měřenou při DIV5 v kulturách bez séra, které zpočátku vznikly z E14 ventrálního středního mozku. Přidalo se ředěné upravené kultivační médium pocházející z kultivace buněk HiB5pUbilzNBN22, které produkují neublastin, (neublastin) nebo buněk HÍB5GDNFL-17, které produkují GDNF (GDNFL-17), jak se uvádí na obrázku (to znamená neublastin 1:10, neublastin 1:50, GDNF 1-17 1:50).

Na obrázku č. 4C je uveden počet imunoreaktivních buněk s tyrozinovou hydrolýzou v jedné prohlubni (počet TH+ buněk/prohlubeň) v DIV7 v kulturách bez séra, které vznikly z El4 krysího ventrálního středního mozku. Přidalo se ředěné upravené kultivační médium buď z netransfekovaných buněk HiB5 (HiB5), nebo z buněk HiB5pUbilzNBN22 produkujících neublastin (neublastin) nebo rekombinantní GDNF v různých koncentracích, jak se uvádí na obrázku (to je HiB5 1:10, HiB 1:40, GDNF 0,1 ng/ml, GDNF 10 ng/m 1, GDNF 100 ng/ml a neublastin 1:40).

Upravené kultivační médium získané z buněk HiB5 transfekovaných neublastínem ředěné 1:40 podstatně zvyšuje počet TH imunoreaktivních buněk v jedné prohlubni ve srovnání s kontrolními (netransfekovanými) buňkami HiB5 při ekvivalentním a nižším ředění (1:10 a 1:40) (uvádí se například na obrázku č. 4B). Zvýšení buněk imunoreaktivních s TH je srovnatelné se zvýšením pozorovaným při maximální koncentraci GDNF (10 ng/ml). To indikuje, že neublastin vylučovaný do kultivačního média má účinek na přežití populace dopamínergických neuronů z krysího zárodečného ventrálního středního mozku. Na rozdíl od GDNF vylučovaný z transfekovaných buněk HiB5 upravené médium z buněk HiB5 transfekovaných neublastínem nevykazuje žádný účinek na jinou populaci nervových buněk ve stejné kultuře cholinergických neuronů (zobrazeno například na obrázku £. 4A).

-38CZ 303358 B6

Příklad 7: Účinek neublastinu na přežití kultur v tenké vrstvě prasečích zárodečných dopaminergických neuronů ventrálního středního mozku.

V tomto experimentu se zkoumá účinek společné kultivace buněk HiB5pUbilzNBN22 produkujících neublastin s kulturou neuronů středního mozku v tenké vrstvě z prasečích embryí.

Příprava kultur:

io Ventrální střední mozek (VM) se izoloval z prasečích embryí (E28, n=12) za sterilních podmínek. Nařezal se na plátky o tloušťce 400 gm a umístil se do chlazeného Geyova rovnovážného roztoku solí (GiBco) s glukózou (6,5 mg/ml). Plátky tkáně se kultivovaly kultivační metodou na fázovém rozhraní, která se popisuje v publikaci L. Stoppini, P. A. Buchs, D. Muller, J. Neurosci. Methods 1991, 37, 173 až 182).

Proužky se umístily na semi-porézní membránu (Millipore, 0,3 gm, 8 plátků na membránu odpovídající jedné VM) umístěné jako inzerty na destičkách se 6 prohlubněmi (Costar) s kultivačním médiem, které obsahuje sérum (Gibco BRL). Každá prohlubeň obsahovala 1 ml kultivačního média (50 % Optimem, 25 % koňského séra, 25 % Hankova rovnovážného roztoku solí (vše od firmy Gibco) doplněné D-glukózou na konečnou koncentraci 25 mM. V den 0 se na každý plátek tkáně naneslo 7000 transfekovaných buněk HiB5pUbilzNBN22 (neublastin) nebo 7000 netransfekovaných buněk HiB5 (kontrolní). Společné kultury se nejdříve kultivovaly v inkubátoru při teplotě 33 °C po dobu 48 hodin, což umožnilo buňkám Hib5 imortalizováným onkogenem citlivým na teplotu se pomnožit a pak se umístily do inkubátoru při teplotě 37 °C, kde došlo k dife25 renciaci buněk. Kultivační médium se vyměnilo dvakrát za týden. V žádném stádiu se nepoužila ani antimitotíka ani antibiotika.

Stanovení dopaminu pomocí HPLC

V den 12 a 21 in vitro se shromáždilo kultivační médium a pomocí HPLC s elektrochemickou detekcí se analyzovala přítomnost dopaminu (W. N. Slooth, J. B. P. Gramsbergen, J. Neurosci Meth. 1995, 60, 141 až 49).

Zpracování tkání a imunohistochemie

21. den se kultury fixovaly ve 4% paraformaldehydu ve fosfátovém pufru po dobu 60 minut, dehydratovaly se v roztoku 20% sacharózy po dobu 24 hodin, zmrazily se, v kryostatu se nařezaly na sekce o tloušťce 20 gm (4 série) a nanesly se na želatinou potažená mikroskopická sklíčka. Jedna série sekcí se imunologicky obarvila, aby se zjistila přítomnost tyrosinové hydrolázy (TH). Sekce se promyly v 0,05M fyziologickém roztoku pufrovaném Trís (TBS, pH 7,4), který obsahuje 1 % Tritonu X-100 po dobu 3x15 minut a vše se inkubovalo s 10% bovinním sérem (FBS, Life Technologies) v TBS po dobu 30 minut. Tkáň se pak inkubovala po dobu 24 hodin při teplotě 4 °C s monoklonálními myšími protilátkami proti TH (Boehringer Manheim) ředěnými 1:600 v TBS s 10 % FBS. Po promytí v TBS s 1% Tritonem X-100 po dobu 3x15 minut se sekce inkubovaly po dobu 60 minut biotinylovanými protilátkami proti myšímu IgG (Amersham) ředěnými 1:200 v TBS s 10 % FBS. Sekce se pak promyly v TBS s 1% Tritonem X-100 (3x15 minut) a inkubovaly se po dobu 60 minut se streptavidinem-peroxidázou (Dako) ředěnou 1:200 v TBS s 10 % FBS. Po promytí v TBS (3x15 minut) se vázané protilátky zviditelnily ošetřením 0,05% 3, 3-diaminobenzidinem (Sigma) v TBS, který obsahuje 0,01 % H₂O₂. Nakonec se sekce dehydratovaly v alkoholu, čistily se xylenem a překryly se sklíčkem ze sady Eukitt. Stanovení počtu buněk a morfometrická analýza

Stanovení počtu neuronů imunologicky reagujících sTH se provedlo za použití mikroskopie ve světelném poli (Olympus). Započítávaly se pouze buňky vykazující intenzivní zbarvení dobře

-39CZ 303358 B6 zachovanou buněčnou strukturou a oddělené jádro. Odhad se založil na počtu buněk v každé čtvrté sekci za použití objektivu x20. Počet buněk se upravil dvojím počítáním podle Abercrombieho vzorce (popisuje se v publikaci M. Abercrombie, Anat. Rec. 1946, 9,239 až 47), za použití průměrného průměru jádra v neuronech Th-ir (6,6 ± 0,2 μηι, N - 30). Velikost jádra se odhadla za použití systému vyhledávání neuronů (Neurolucida, MicroBrightField, lne.).

Výsledky těchto experimentů jsou zobrazeny na obrázku Č. 5. Obrázky č. 5A až 5C jsou ilustrace účinku neublastinu vylučovaného z buněk HiB5pUbilzNBN22 na funkci a přežití kultur dopaminergních neuronů ventrálního středního mozku prasečích zárodků kultivovaných společně buď s buňkami HiB5pUbilzNBN22 (neublastin), nebo s buňkami HiB5 (kontrolní buňky), jak se popisuje shora v textu. Obrázek č. 5A a 5B ilustruje dopamin uvolněný do kultivačního média v DIV 12 (dopamin (pmol/ml) - den 12) a DIV21 (dopamin (pmol/ml)-den 21). Obrázek č. 5C ilustruje počet buněk v kultuře, které imunologicky reagují s tyrozinovou hydroxylázou (Buněk TH-ír v kultuře) v DIV21.

V den 12 analýza za použití HPLC ukázala, že kultivační médium kultur HiB5-neubIastin obsahuje o 84 % více dopaminu ve srovnání s kulturami HÍB5-C (obrázek č. 5A). V den 21 tento rozdíl byl 78 % (obrázek č. 5B) a počet buněk ukazuje, že kultuiy HÍB5-neublastinu obsahovaly o 66 % více neuronů imunologicky reagujících s tyrozinovou hydroxylázou než kultury HÍB5-C (P<0,05) (Obrázek Č. 5C). To ukazuje, že neublastin vylučovaný z klonu HiB5pUbilzNBN22 má potenciál ovlivnit přežití dopaminergických neuronů prasečího embrya.

Příklad 8: Přežití buněk ganglionů dorzálních kořenů v kultivačním médiu bez séra

Tento příklad ukazuje neutrofickou aktivitu polypeptidu neublastin v porovnání se známými neurotrofickými faktory.

Samice myší čekající mláďata se usmrtila cervikální dislokací. Embrya se upravila pro kultivaci následujícím způsobem.

K rozřezání ganglii dorzálních kořenů z indikovaného stádia myší C57/B16 (Mollegaard Breeding, Denmark) se použily elektrolyticky ostřené wolframové jehly. Ganglia zárodků se inkubovaly po dobu 5 minut při teplotě 37 °C s 0,05 % trypsinem (Gibco/BRL) Hanksově rovnovážném roztoku soli bez vápníku a hořčíku. Postnatální ganglia se ošetřila kolagenázou/dispázou v koncentraci 1 mg/ml po dobu 30 až 45 minut a pak trypsinem/DNázou v koncentraci 0,25 % po dobu 15 minut. Po odstranění roztoku trypsinu se ganglie promyly jednou 10 ml DMEM, které obsahuje 10 % teplem deaktivovaného koňského séra a jemně se triturovaly nad ohněm sterilizovanou Pasterovou pipetou, přičemž se tvoří suspenze jednotlivých buněk.

Tyto buňky se nanesly na destičky s 24 prohlubněmi (Nunc), které se předem pokryly polyomitinem (0,5 mG/ml, přes noc) a lamininem (20 mg/ml po dobu 4 hodin, Gibco/BRL). Neurony se inkubovaly při teplotě 37 °C v humidifikovaném inkubátoru v atmosféře 5 % CO2 v definovaném kultivačním médiu, které obsahuje Hams F14 doplněné 2 mM glutaminem, 0,35% albumin bovinního séra, 60 nG/ml progesteronu, 16 mg/ml putrescinu, 400 ng/ml L-thyroxinu, 38 ng/ml seleničitanu sodného, 340 ng/ml trijodothyroninu, 60 mg/ml penicilinu a 100 mg/ml streptomycinu.

Po 48 hodinách inkubace se neurony jasně rozlišily podle jejich bipolámí morfologie optikou s fázovým kontrastem. Procento přežitých neuronů v nepřítomnosti nebo v přítomnosti trofických faktorů (přidá se ke kultivačním médiu dříve než se neurony nanesou na plotnu v koncentraci 10 ng/ml) nebo upraveného média z buněk HiB5pUbilzNBN22, které produkují neublastin se odhadlo stanovením počtu neuronů v prohlubních po 48 hodinách kultivace.

Výsledky těchto experimentů jsou zobrazeny na obrázku č. 9, kde:

-40CZ 303358 B6

O reprezentuje kontrolní experiment (v nepřítomnosti faktorů) reprezentuje experimenty v přítomnosti GDNF, reprezentuje experimenty v přítomnosti neurturinu, reprezentuje experimenty v přítomnosti neublastinu podle vynálezu,

E12 reprezentuje data z experimentů provedených za použití buněk DRG izolovaných z embryí v den 12,

El6 reprezentuje data z experimentů provedených za použití buněk DRG izolovaných z embryí io v den 16,

PO reprezentuje data z experimentů provedených za použití buněk DRG izolovaných v den narození,

P7 reprezentuje data experimentů provedených za použití buněk izolovaných 7 dní po narození a

P15 reprezentuje data z experimentů provedených za použití buněk DRG izolovaných 15 dní po narození.

Tyto výsledky jasně ukazují, že neurotrofický faktor podle vynálezu ukazuje aktivity srovnatelné nebo dokonce vyšší s aktivitami dobře zavedených neurotrofických faktorů.

Příklad 9: Účinky neublastinu na nigrální dopaminové neurony in vivo

Za účelem testovat schopnost neublastinu (neublastin) chránit nigrální dopaminové neurony dospělého jedince (DA) proti degeneraci indukované 6-hydroxydopaminem se použil krysí model Parkinsonovy nemoci (popisuje se v publikaci Sauer and Oertel, Neuroscience, 1994, 59, 401 až 415) a transfer lentivirového genu neublastinu.

Produkce lentiviru

Aby vznikl lentivirový transferový vektor kódující neublastin, pHR'-neublastin, BamHl fragment o velikosti 1 331 bp z cDNA neublastinu se subklonoval do restrikčního místa

BamHl/Bglli vektoru pSL30 (Invitrogen). Z této konstrukce se izoloval BamHl/Xhol fragment o velikosti 1 519 bp a ligoval se do restrikčního místa BamHl/Xhol pHR', který nese posttranslační fragment viru hepatitidy sviště stepního (popisuje se v publikaci Zufferey R, Donello JE, Trono D, Hope TJ: „Woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulátory element enhances expression of transgenes delivered by retroviral vectors“, J. Virol. 1999, 73 (4), 2886 až 2892).

Aby vznikl pHR-GDNF, BamHl/Xhol fragment o velikosti 701 bp zpUbilz-GDNF se ligoval do restrikčního místa BamHl/Xhol pHR'.

Produkce lentivirového vektoru se popisuje v publikaci Zufferey R., Nagy D., Mandel Rj, Naldini L., Trono D.: „Multiply attenuated lentiviral vector achieves efficient gene delivery in vivo“, Nat.

Biotechnol. 1997, 15, (9), 871 až 875). Transferové konstrukce a pomocné plazmidy pR8.91 a pMDG se kontransfekovaly do buněk 293T. Viriony uvolněné do kultivačního média se shromáždily 48 a 72 hodin po transfekci. Aby se zvýšila koncentrace viru, kultivační médium se centrifúgovalo po dobu 1,5 hodiny při 141 000 g a pelet se rozpustil v DMEM. Hodnota titru kontroly v buňkách 293T, která nese gen zeleného fluorescenčního proteinu (GFP), je 10* trans50 formačních jednotek (TU) v mililitru, což se stanovilo fluorescencí GFP. Ke stanovení titru virových částic se použila metoda přenosu RNA slotů (popisuje se v publikaci von Schwedler U, Song J, Aiken C, Trono D: „Vif is crucial for human immunodeficienty virus type 1 proviral

-41 CZ 303358 B6

DNA synthesis in infected cells“, J. Virol. 1993, 67, (8), 4945 až 4955). V supematantu GDNF a neublastinu existuje 1 Okřát méně částic ve srovnání se supematantem GFP.

Chirurgické postupy

Všechny postupy provedené na zvířatech se provedly v souladu s pravidly Etické komise pro použití laboratorních zvířat na Lundské univerzitě.

Použilo se celkem 21 mladých dospělých krysích samic Sprague-Dawley (B and K Universal, Stockholm, Sweden). Zvířata se udržovala ve dvanáctihodinovém cyklu světla a tmy s volným přístupem k potravě a vodě. Retrográdní značení a 6-OHDA lézí se uskutečnilo 3 týdny před vznikem lézí (popisuje se v publikaci Sauer and Oertel, Neuroscience 1994, 59, 401 až 415). Při anestezi equithesinem (0,3 ml ve 100 g) se krysám bilaterální injekcí zavedlo 0,2 μΐ 2% roztoku (rozpuštěného v 0,9% NaCl) retrográdnf detekční příměsi fluoro-zlato (FG, Fluorochrom, lne. Englewood, CO). Injekce se zavedly za použití Hamiltonovy stříkačky o objemu 2 μΐ při souřadnicích: AP= +0,5 mm, ML= ±3,4 mm vztaženo k bregma, DV= -5,0 vztaženo k důra mater a řezákový mezemík je nastaven na 0,0 mm. Dále se po pěti minutách injekcí zavedlo 0,05 μΐ/min, dříve než se jehla vytáhla.

dní po injekci FG se zvířatům aplikovalo celkem 5 dávek (1 mi kro litr na jednu dávku) lentivirového vektoru, který nese gen zeleného fluorescenčního proteinu (GFP), neublastinu nebo GDFN. Čtyři dávky se zavedly do striatu použitím dvou jehel podle následujících koordinát AP= +1,0 mm, ML= -2,6 mm, DV|= -5,0, Dv₂ = -4,5 mm a AP = 0,0 mm, ML= -3,7 mm, DV|= -5,0 mm, DV₂= -4,5 mm. Supranigrální zavedení se provedlo při AP= -5,2 mm, ML= -2,0 mm, DVj= -6,3 mm. Mezemík zubů se nastavil na-2,3 mm.

dní po retrográdním značení a 7 dní po lentivirových injekcích se zvířata znovu podrobila anestezii a aplikovalo se jim Hamiltonovou stříkačkou o objemu 10 μΐ jediná dávka 20 μ§ 6OHDA (Sigma, vypočteno jako volná báze a rozpuštěno ve 3 μΐ ledem chlazeného fyziologického roztoku doplněného 0,02 % kyselinou askorbovou) zavedou do pravého striatu ve stejné poloze jako v případě dávky FG. Rychlost aplikace injekce byla 1 μΐ/min, jehla se vytáhla po dalších třech minutách.

Zpracování tkáně:

dní po aplikaci 6-OHDA se zvířata podrobily hluboké anestezi chloralhydrátem a transkardiálně se perfundovaly fyziologickým roztokem (4% paraformaldehyd v 0,1% M fosfátovém pufru, pH 7,4). Mozky se rozřezaly a zafixovaly po dobu 3 až 4 hodin a přenesly se do 25 % sacharózy/0,1 M fosfátového pufru po dobu 48 hodin. Nařezalo se pět sérií sekcí o tloušťce 40 pm stratiem a substrátem nigra (SN) na mrazicím mikrotomu.

Kvantitativní odhad dopaminergických neuronů v SN

Počet neuronů značených FG v SN se odhadlo zaslepeným pozorovacím zařízením, jak se popisuje v publikaci Sauer and Oertel, Neuroscience 1994, 59, 401 až 415. Použily se tři konzekutivní sekce uspořádané okolo středu mediálních terminálních jader optického traktu (MTN, -5,3 v atlasu podle Paxinos and Watson (1997)) a spočítaly se všechny značené/barvené neurony položené laterálně k MTN při 40 násobném zvětšení (n= 6 až 7 ve skupině). Započítaly se neurony značené FG, jestliže jasně fluorescenční při epiluminiscenci při vlnové délce 330 nm, vykazovaly neuronální profil a prodloužily alespoň jeden neuritický proces.

Zvířatům se na straně lézí aplikovaly injekce lentiviru, který nese GFP. Počet FG-pozitivních nigrálních neuronů se snížil na 18 % hodnoty získané u i n tak tni sekce. Naopak zvířata, kterým se injekcí aplikoval lenti-neublastin vykazují skoro úplnou ochranu FG-pozitivních nigrálních neu-42CZ 303358 B6 ronů (89%). Tato ochrana je stejně účinná jako u zvířat ošetřených Lenti-GDNF, kde 87 % retrogradálně značených neuronů se zachovalo na straně léze. To naznačuje, že neublastin je potentní faktor přežití v případě dospělých nigrálních dopaminových neuronů z lézí a že jeho aktivita je stejná jako GDFN.

Na obrázku č. 6 je znázorněna ilustrace účinku in vtvo neublastinu produkovaného lentivirem v případě nigrálních dopaminových neuronů. Neurony SN u samic krys Sprague Dawley se 3 týdny před jedinou injekcí 6_hydroxydopaminu (6-OHDA) do pravého striatu značily retrográdně fluorozlatem (FG). Jeden týden před zavedením 6-OHDA se zvířatům aplikovaly injekce io s lentivirovými vektory, které exprimují neublastin (neublastin), GDNF (GDNF) nebo zelený fluorescenční protein (GFP), jak je zobrazeno na obrázku. 21 dní po injekcích 6-OHDA se stanovil počet neuronů značených FG na obou stranách striatu. Obrázek ukazuje procento (% FG lézí/intaktní) neuronů značených FG v místě lézí (pravá strana) versus neporušená (levá) strana striatu u třech skupin zvířat.

Příklad 10: Produkce protilátek > by se připravily protilátky proti neublastinu, dva králíci se imunizovaly buď peptidem 1: 20 cr PTRYEAVSFMDVNST (aminokyseliny 108 až 124 SEQ ID NO: 9), nebo peptidem 2: ALRPPPGSRPVSQPC (aminokyseliny 93 až 107 SEQ ID NO: 9) konjugovaným s nosičovým proteinem v intervalu tří týdnů. V týdnu 0, 3, 6 a 10 se v případě každého peptidu imunizovaly dva králíci a v týdnu 7 a 11 se odebrala králíkům krev. Krev z druhého odběru se čistila na peptidové afínitní koloně. Protilátky se pojmenovaly Ab-1 a Ab-2 v souladu s peptidem.

Western blot:

2x10⁶ buněk HiB5 se stabilně transfekovalo cDNA neublastinu (Hib5pUbilzNBN22) nebo netransfekované buňky HiB5 se inkubovaly přes noc v kultivačním médiu bez séra doplněného dusíkem (GIBCO). Koncentrace kultivačního média se zvýšila v malém koncentrátoru za použití membrány oddělující molekuly o molekulové hmotnosti 5 kDa (Millipore, Bedford, MA). Koncentrované vzorky se přidaly do 5 x koncentrovaného vzorkového pufru podle Laemmli a zahřály se na teplotu 95 °C po dobu 5 minut Vzorky se oddělily elektroforézou na SDS 15% polyakrylovém gelu a přenesly se na PVDF-membrány. Zbylá místa vázající protein se blokovala 5% netučným sušeným mlékem v PBS s 0,1 % Tween-20. Membrány se inkubovaly přes noc s neublastinovými protilátkami (1:1 000), pak následovala inkubace se sekundárními protilátkami proti králičímu nebo myšímu IgG konjugovanými s křenovou peroxidázou (1:2000).

Imunologické barvení se zviditelnilo použitím zesílené chemoluminíscence Plus (ECL+) podle 40 instrukcí výrobce (Amersham). Výsledky těchto experimentů jsou znázorněny na obrázku č. 3 a popisují se v příkladu 5.

Za použití standardních metod také vznikly králičí polyklonální protilátky proti následujícím peptidům:

peptid R27: GPGSRARAAGARGC peptid R28: LGHRSDELVRFRFC peptid R29: CRRARSPHDLSL peptid R30: LRPPPGSRPVSQPC peptid R31: STWRTVDRLSATAC (aminokyseliny 30 až 43 SEQ ID NO: 9), (aminokyseliny 57 až 70 SEQ ID NO: 9) (aminokyseliny 74 až 85 SEQ ID NO: 9), (aminokyseliny 94 až 107 SEQ ID NO: 9) a (aminokyseliny 123 až 136 SEQ ID NO: 9).

Pouze peptidy R30 a R31, které jsou relativně blízko C-konci, rozeznávají denaturovaný protein při redukčních podmínkách na western blotu.

Claims (43)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Izolovaný neublastinový polynukleotid, kódující polypeptid, který má neurotrofní aktivitu, kde polynukleotid je vybrán ze skupiny sestávající z

   a) polynukleotidu zahrnujícího nukleotidovou sekvenci SEQ ID NO: 1,

   b) polynukleotidu kódujícího neublastinový polypeptid nebo polypeptid z něho odvozený, kde maturovaná část polypeptidů vykazuje stupeň identity s aminokyselinami 1 až 105 ze SEQ ID NO: 2 alespoň 90%,

   c) polynukleotidu zahrnujícího nukleotidovou sekvenci, která je z alespoň 90 % identická s póly nukleotidovou sekvencí uvedenou jako SEQ ID NO: 1.
2. 2. Polynukleotid podle nároku 1, kde maturovaná část kódovaného polypeptidů vykazuje stupeň identity s aminokyselinami 1 až 105 ze SEQ ID NO: 2 alespoň 95 %.
3. 3. Polynukleotid podle nároku 1, kde kódovaný polypeptid sestává z aminokyselin 1 až 105 ze SEQ ID NO: 2
4. 4. Polynukleotid podle nároku 1, kde kódovaným polypeptidem je SEQ ID NO: 2.
5. 5. Polynukleotid podle nároku 1, kde kódovaným polypeptidem je SEQ ID NO: 4.
6. 6. Polynukleotid podle nároku 1, kde kódovaným polypeptidem je SEQ ID NO: 5.
7. 7. Polynukleotid podle nároku 1, kde kódovaným polypeptidem je SEQ ID NO: 6.
8. 8. Polynukleotid podle nároku 1, kde kódovaným polypeptidem je SEQ ID NO: 7.
9. 9. Polynukleotid podle nároku 1, zahrnující sekvenci SEQ ID NO: 3.
10. 10. Expresní vektor, zahrnující polynukleotid podle kteréhokoli z nároků 1 až 9.
11. 11. Izolovaná hostitelská buňka, zahrnující expresní vektor podle nároku 10.
12. 12. Buňka podle nároku 11, kde touto buňkou je eukaryotická buňka.
13. 13. Buňka podle nároku 12, kde buňka je vybrána ze skupiny sestávající ze savčí buňky, buňky hub a buňky kvasinek.
14. 14. Buňka podle nároku 13, kde savčí buňka je vybrána ze skupiny sestávající z vaječníkové buňky čínského křečka, HEK293, COS, PC 12, HiB5, RN33b a lidské neurální kmenové buňky.
15. 15. Polypeptid, kde maturovaná část polypeptidů vykazuje stupeň identity s aminokyselinami 1 až 105 ze SEQ ID NO: 2 alespoň 90 %, přičemž polypeptid má neurotrofní aktivitu.
16. 16. Polypeptid podle nároku 15, kde maturovaná část polypeptidů vykazuje stupeň identity s aminokyselinami 1 až 105 ze SEQ ID NO: 2 alespoň 95 %.

    -44CZ 303358 B6
17. 17. Polypeptid podle nároku 15, kterým je polypeptid neurotrofhího faktoru neublastinu zahrnující aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: 2.

    5 19. Polypeptid podle nároku 15, kterým je polypeptid neurotrofního faktoru neublastinu zahrnující aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: 4.
18. 20. Polypeptid podle nároku 15, kteiým je polypeptid neurotrofhího faktoru neublastinu zahrnující aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: 5.

    to

    20. Polypeptid podle nároku 15, kterým je polypeptid neurotrofhího faktoru neublastinu zahrnující aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: 6.
19. 21. Polypeptid podle nároku 15, kterým je polypeptid neurotrofního faktoru neublastinu zahmu15 jící aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: 7.
20. 22. Polypeptid podle kteréhokoli z nároků 15 až 21, kde polypeptid je glykosylovaný.
21. 23. Polypeptid, který má neurotrofní aktivitu a je kódován polynukleotidem podle kteréhokoli 20 z nároků 1 až 9.
22. 24. Způsob výroby polypeptidu podle kteréhokoli z nároků 15 až 23, vyznačující se tím, že zahrnuje stupeň exprese polypeptidu z polynukleotidu neurotrofhího faktoru neublastinu podle kteréhokoli z nároků 1 až 9.
23. 25. Způsob podle nároku 24, vyznačující se tím, že zahrnuje stupeň kultivace buňky podle kteréhokoli z nároků 11 až 14, zahrnující uvedený polynukleotid neurotrofního faktoru neublastinu, v kultivačním médiu, které umožňuje produkci uvedeného polypeptidu.

    30
24. 26. Způsob podle nároku 25, vyznačující se tím, že dále zahrnuje stupeň získávání polypeptidu z kultivačního média.
25. 27. Způsob podle nároku 26, vyznačující se tím, že polypeptid se čistí.

    35
26. 28. Farmaceutická kompozice, zahrnující polypeptid podle kteréhokoli z nároků 15 až 23 a farmaceuticky přijatelný nosič.
27. 29. Polypeptid podle kteréhokoli z nároků 15 až 23 pro použití jako léčivo.

    40
28. 30. Použití polypeptidu podle kteréhokoli z nároků 15 až 23 pro přípravu farmaceutické kompozice pro léčbu neurodegenerativního onemocnění.
29. 31. Použití podle nároku 30, kde neurodegenerativní onemocnění zahrnuje poškozené a traumatické neurony.
30. 32. Použití podle nároku 31, kde poškozené a traumatické neurony jsou vybrány z jedné nebo více traumatických lézí periferního nervstva, dřeně a míchy.
31. 33. Použití podle nároku 30, kde neurodegenerativní onemocnění je vybráno ze skupiny sestáva50 jící z cerebrálního ischemického neuronálního poškození, neuropatie, periferní neuropatie,

    Alzheimerovy choroby, Huntingtonovy chorey, Parkinsonovy choroby, amyotrofní laterální sklerózy a zhoršení paměti souvisejícího s demencí.
32. 34. Použití podle kteréhokoli z nároků 30 až 33, kde neurodegenerativním onemocněním je peri55 femí neuropatie.

    --^5CZ 303358 B6
33. 35. Polypeptid podle kteréhokoli z nároků 15 až 23, pro použití při léčbě neurodegenerativního onemocnění. <
34. 36. Polypeptid podle nároku 35, kde neurodegenerativní onemocnění zahrnuje poškozené a trau- , matické neurony. j
35. 37. Polypeptid podle nároku 36, kde poškozené a traumatické neurony jsou vybrány z jedné j nebo více traumatických lézí periferního nervstva, dřeně a míchy. 9
36. 38. Polypeptid podle nároku 35, kde neurodegenerativní onemocnění je vybráno ze skupiny 1 sestávající z cerebrálního ischemického neuronálního poškození, neuropatie, periferní neuropatie, ;

    Alzheimerovy choroby, Huntingtonovy chorey, Parkinsonovy choroby, amyotrofní laterální skle- ' rózy a zhoršení paměti souvisejícího s demencí.
37. 39. Polypeptid podle kteréhokoli z nároků 35 až 38, kde neurodegenerativním onemocněním je periferní neuropatie.
38. 40. PCR—priměrová sekvence nukleových kyselin, sestávající z kteréhokoli ze sekvencí uvedených v SEQ ID NO: 17, 18, 19,20,23,24,25,26 nebo 28.
39. 41. Způsob produkce kteréhokoli z polypeptidů uvedených v SEQ ID NO: 2, 4, 5, 6 nebo 7, vyznačující se tím, že zahrnuje kultivaci buňky, která obsahuje kteroukoli ze sekvencí nukleových kyselin uvedených v SEQ ID NO: 1 nebo 3, za podmínek umožňujících produkci polypeptidů, a získání polypeptidů z kultivačního média.
40. 42. Způsob produkce neublastinového polypeptidů podle kteréhokoli z nároků 15 až 23, vyznačující se tím, že zahrnuje:

    a) zavedení polynukleotidu podle kteréhokoli z nároků 1 až 9, který kóduje expresi neublastinového polypeptidů, do buňky nebo zavedení regulační sekvence homologní rekombinací do buňky tak, že regulační sekvence reguluje expresi endogenního neublastinového genu za vzniku buňky produkující neublastin,

    b) kultivaci buňky produkující neublastin za kultivačních podmínek, které vedou k expresi neublastinového polypeptidů.
41. 43. Syntetický gen kódující neublastinový polypeptid, kde syntetický gen zahrnuje sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: 29 nebo 30.
42. 44. Neublastinový peptid, sestávající z kterékoli z následujících sekvencí:

    GPGSRARAAGARGC (AK 30-43 ze SEQ ID NO:9),

    LGHRSDELVRFRFC (AK 57-70 ze SEQ ID NO:9),

    CRRARSPHDLSL (AK 74-85 ze SEQ ID NO:9),

    LRPPPGSRFVSQPC (AK 94-107 ze SEQ ID NO:9),

    STWRTVDRLSATAC (AK 123-136 ze SEQ ID NO:9),

    CRLRSQLVPVRALGLGHRSDELVRFRFC (AK 43-70 ze SEQ ID NO:9), CRRARSPHDLSLASLLGAGALRPPPGSRPVSQPC (AK 74-107 ze SEQ ID NO: 9),

    -46CZ 303358 B6

    CRPTRYEAVS FMDVNSTWRTVDRLSATAC CRPTRYEAVSFMDVNST (AK 108-124 ALRPPPGSRPVSQPC (AK 93-107 ze (AK 108-136 ze SEQ ID NO:9) ze SEQ ID NO:9) nebo SEQ ID NO:9).
43. 45. Protilátka, která se specificky váže na kterýkoli z peptidů podle nároku 44.