CN1311818A - 神经营养因子 - Google Patents

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N·布洛姆
C·汉森
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Abstract

本发明涉及neublastin神经营养因子多肽,编码neublastin多肽的核酸和特异性结合neublastin多肽的抗体,及其制备和使用方法。

Description

神经营养因子
发明背景
本发明涉及神经营养因子多肽，编码神经营养因子多肽的核酸和特异性结合神经营养因子的抗体。
发明背景
神经营养因子是天然蛋白质，它可促使神经元细胞和组织的存活，维持其表型分化，防止其退化并增强其活性。神经营养因子分离自神经组织和由神经系统支配的非-神经组织，并被分为功能和结构相关的组，也称家族，超家族或亚族。神经营养因子超家族包括成纤维细胞生长因子，神经营养蛋白和转化生长因子-β(TGF-β)超家族。可根据其物理结构，与其复合受体的相互作用及其对多种类型神经细胞的影响来区分各种神经营养因子。被分在TGF-β超家族(Massague等，Trends in Cell Biology,1994,4 172-178)的是得自胶质细胞系的神经营养因子配体(“GDNF”；WO93/06116，列入本文作为参考)，其包括GDNF,persephin(“PSP”；Milbrandt等，神经元，1998 20 245-253，列入本文作为参考)和neurturin(“NTN”；WO97/08196，列入本文作为参考)。GDNF亚族的配体都能通过RET受体酪氨酸激酶诱导信号传递。GDNF亚族的这三种配体对神经营养受体家族，GFR受体的相对亲和性有所不同。
鉴于神经营养因子对神经元组织的影响，仍需要鉴定和表征其它神经营养因子以用于诊断和治疗神经系统疾病。
发明简述
本发明涉及新的神经营养因子，本文称之为“neublastin”，或“NBN”。neublastin属于GDNF亚族的成员，因为它与其它GDNF配体共享同源性区域(见下文表3和4)，并能与RET相互作用(例见Airaksinen等，Mol.Cell.Neuroscience,1999 13 313-325),neublastin是新的，独特的神经营养因子。与其它GDNF配体不同的是，neublastin表现出与GFRα3-RET受体复合物的高亲和性，而且，其氨基酸序列中具有独特的亚区。
本文所用“neublastin多肽”是具有神经营养活性的多肽(如实施例6,7,8和9所述)，其包括具有与人“neublastin”多肽的同源性至少为70％的氨基酸序列的多肽及其变体和衍生物，所述人“neublastin”多肽示于SEQ ID NO:2的AA-95-AA105,SEQ ID NO:2的AA1-AA105,SEQ ID NO:4的AA-97-AA140,SEQ ID NO:4的AA-41-AA140(pro),SEQID NO:4的AA1-AA140,SEQ ID NO:9的AA-80-AA140(“野生型”prepro),SEQ ID NO:9的AA-41-AA140(pro),SEQ ID NO:5的AA1-AA140(成熟的140AA),SEQ ID NO:6的AA1-AA116(成熟的116AA),SEQID NO:7的AA1-AA113(成熟的113AA),SEQ ID NO:10的AA1-AA140(成熟的140AA),SEQ ID NO:11的AA1-AA116(成熟的116AA),SEQ IDNO:12的AA1-AA113(成熟的113AA)。另外，本发明还包括具有与鼠“neublastin”多肽的同源性至少为70％的氨基酸序列的多肽，所述鼠“neublastin”多肽示于SEQ ID NO:16的AA1-AA224。
上文所鉴定的neublastin多肽的C-末端序列优选具有SEQ IDNO:2的AA72-AA105(即SEQ ID NO:9的AA107-AA140)所示的氨基酸序列，更优选具有SEQ ID NO:2的AA41-AA105(即SEQ ID NO:9的AA76-AA140)所示的氨基酸序列，或SEQ ID NO:16的AA191-AA224所示的氨基酸序列。
另外，优选neublastin多肽保留7个保守的Cys残基，所述残基是GDNF家族和TGF-β超家族所特有的残基。
优选neublastin多肽具有与上述序列和SEQ ID NO:16的AA1-AA224的同源性大于85％，最优选大于95％的氨基酸序列，上述序列即为SEQ ID NO:2的AA-95-AA105,SEQ ID NO:2的AA1-AA105,SEQ IDNO:4的AA-97-AA140,SEQ ID NO:4的AA-41-AA140,SEQ ID NO:4的AA1-AA140,SEQ ID NO:9的AA-80-AA140(“野生型”prepro),SEQ IDNO:9的AA-41-AA140(pro),SEQ ID NO:5的AA1-AA140(成熟的140AA),SEQ ID NO:6的AA1-AA116(成熟的116AA),SEQ ID NO:7的AA1-AA113(成熟的113AA),SEQ ID NO:10的AA1-AA140(成熟的140AA),SEQ ID NO:11的AA1-AA116(成熟的116AA),SEQ ID NO:12的AA1-AA113(成熟的113AA)。
本文所用“neublastin核酸”是编码neublastin多肽的多核苷酸。因此，分离的neublastin核酸是具有核苷酸密码子开放阅读框的多核苷酸分子，当其暴露于翻译所需的适当组分中时可编码neublastin多肽。本发明的neublastin核酸可以是RNA或DNA，例如基因组DNA，或与neublastin mRNA互补和/或由其转录的DNA(“cDNA”)。因此，本发明的neublastin核酸还包括在高度严紧的杂交条件下与编码neublastin多肽的多核苷酸特异性杂交的多核苷酸分子。本发明还涉及核酸引物或其片段，所述引物可用于鉴定，分离和扩增编码neublastin多肽的多核苷酸。在本发明的某些实施方案中，某些引物是neublastin-特异性的探针，所述探针可用于与neublastin核酸杂交，而不与编码GDNF家族其它成员的核酸杂交。“特异的”，“特异性”或“特异地”指的是能与neublastin核酸杂交，而不能与非-neublastin核酸杂交，包括不能与编码GDNF配体(例如GDNF,persephin和neurturin)的独特核酸杂交。
在另一个实施方案中，通过具有互补核酸序列，或阐明它能在高度严紧的杂交条件下与编码neublastin的多核苷酸特异性杂交，而将本发明的neublastin核酸鉴定为与编码neublastin多肽的多核苷酸互补的核酸。特定的neublastin核酸包括但不限于本文所示的核酸序列和SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:13,SEQ IDNO:14,SEQ ID NO:15,SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30以及引物SEQID NO:17-28,31和32所示的核酸序列。本发明的neublastin核酸还包括neublastin核酸独特的亚区域或片段，包括但不限于图8所示的核酸片段。
可使用本发明的neublastin核酸表达neublastin多肽，例如通过体外表达neublastin多肽，或通过给动物施用neublastin核酸以在体内表达。neublastin核酸可包含在诸如表达载体或克隆载体的核酸载体中。neublastin核酸可以，但不是必须作为核酸载体的一部分被维持，复制，转移或表达。可将含有neublastin多核苷酸序列的重组表达载体导入细胞和/或在所述细胞中维持。neublastin载体的宿主细胞可以是原核细胞。或者，可将neublastin核酸导入真核细胞，例如含有适当元件的真核细胞，所述元件负责在翻译后将多肽加工成成熟的蛋白质和/或负责将多肽分泌至细胞的胞外环境中。
本发明还涉及neublastin类神经营养因子“neublastin”。neublastin可以是多肽的形式，也可以是两个或多个neublastin多肽的多聚体，例如neublastin二聚体。neublastin多肽通过本领域技术人员公知的分子间结构连键连接成多聚体，所述连键包括但不限于半胱氨酸-半胱氨酸相互作用，sulmydryl键和非-共价相互作用。特定neublastin多肽包括但不限于本文所公开的氨基酸序列和SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:9,SEQ IDNO:10,SEQ ID NO:11,SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列。
本发明的neublastin多肽可用于治疗神经元缺陷，包括但不限于受损害的神经元和受外伤的神经元。受外伤的外周神经包括但不限于髓神经或脊髓神经。neublastin多肽可用于治疗神经变性疾病，例如大脑局部缺血性神经元损伤；神经病，例如外周神经病，阿尔茨海默氏病，亨廷顿氏病，帕金森氏病，肌萎缩性侧索硬化(ALS)。neublastin多肽还可用于治疗记忆减退，例如与痴呆有关的记忆减退。
附图简述
图1是与32P-标记的neublastin cDNA杂交的2个Northern印迹的照片，照片中比较了neublastin基因在多种成人组织类型(A系列)和多个成人脑区(B系列)中的相对表达水平。
图2是与32P-标记的neublastin cDNA杂交的Northern印迹照片，照片中比较了neublastin cDNA在未经转染的细胞系HiB5，经neublastin cDNA转染的细胞系和经GDNF-cDNA转染的细胞系中的表达量。
图3是与neublastin-特异性抗体Ab-2(左印迹；A序列)或与neublastin-特异性抗体Ab-1(右印迹；B序列)杂交的2个Western印迹的照片，照片中比较了neublastin蛋白在未经转染的HiB5细胞(泳道1)和经neublastin cDNA稳定转染的HiB5细胞系(泳道2)中的表达水平。
图4图示了neublastin在无血清培养基中对经培养的大鼠胚胎神经元，多巴胺能神经元，前侧中脑神经元的存活，和对胆碱能颅神经运动神经元的ChAT活性的影响。尤其是，图4A阐明了重组GDNF对ChAT活性(dpm/小时)之影响的剂量-反应曲线。图4B使用经稀释的得自生产neublastin或生产GDNF之细胞的条件培养基阐明了ChAT活性(dpm/小时)。图4C阐明了每孔中的酪氨酸羟化酶免疫反应细胞的数目。
图5阐明了HiB5pUbi1zNBN22细胞分泌的neublastin对与HiB5pUbi1zNBN22细胞(neublastin)或HiB5细胞(对照)共培养的猪胚胎多巴胺能前侧中脑神经元之切片培养物的功能和存活的影响。图5A和图5B分别阐明了于DIV12[多巴胺(pmol/ml)-第12天]和DIV21[多巴胺(pmol/ml)-第21天]释放至培养基中的多巴胺。图5C阐明了于DIV21切片培养物中的酪氨酸羟化酶免疫反应细胞的数目[TH-ir细胞/培养物]。
图6阐明了由慢病毒产生的neublastin在体内对黑质多巴胺神经元的影响。
图7图示了neublastin基因的基因组结构，包括可用于鉴定全长neublastin基因的核酸引物及其相对于编码neublastin的基因组序列(即基因)的空间定向。
图8阐明了用于鉴定编码人neublastin多肽之cDNA克隆的neublastin特异性引物，该引物能与编码neublastin多肽的核酸杂交，但不能与编码其它已知的GDNF家族成员(即GDNF,persephin和neurturin)的核酸杂交。
图9阐明了与已知神经营养因子相比，本发明的多肽对得自不同发育阶段的经解离的大鼠侧根神经节细胞培养物的神经营养活性[0：对照实验(缺乏因子)；1：存在GDNF；2：存在neurturin；3：存在本发明的neublastin；E12：胚胎第12天；E16：胚胎第16天；P0：出生的当天；P7：出生后第7天；P15：出生后15天]。
图10显示了CHO细胞系的neublastin生产情况。
图11比较了neublastin和GDNF与GFRα-1和GFRα-3受体的结合。
图12是Western印迹照片，显示出R30抗-肽抗体和R31抗-肽抗体与neublastin的结合。
图13是凝胶照片，显示出通过亲和结合于RETL3-Ig来提取neublastin。
图14是pET19b-Neublastin的质粒图谱以及Neublastin合成基因的序列。
图15是pMJB164-HisNeublastin的质粒图谱以及HisNeublastin合成基因的序列。
发明详述
申请人已鉴定出编码新的神经营养因子(本文称之为“neublastin”或“NBN”)的核酸。neublastin属于神经营养因子的转化生长因子-β(TGF-p)超家族，并且是其中得自胶质细胞系的神经营养因子(GDNF)亚类的成员。
编码neublastin的cDNA最初是按下述鉴定的。使用TBLASTN1.4.11算法规则(Atschul等，核酸研究，1997,25 3389-3402)，对人persephin(GenBank登记号AF040962)表示怀疑，首先在2个人细菌人工染色体(BAC)的高通量基因组序列(HGTS)中鉴定出290bp的片段，这2个BAC的GenBank登记号为AC005038和AC005051。 AC005038由约190,000bp的5个非顺序序列重叠群组成，AC005051由约132,000bp的12个非顺序序列重叠群组成。经证实，在2个BAC克隆中鉴定的290bp片段具有与神经营养因子，人persephin的cDNA编码区同源但不相同的区域。
由该290bp序列合成2个Neublastin-特异性PCR引物(上链引物[SEQ ID NO:17]和下链引物[SEQ ID NO:18])。筛选人胎脑cDNA文库，最初的筛选包括使用2个PCR引物[SEQ ID NO:17和18]，基于96孔PCR筛选cDNA文库“主平板”，所述主平板由含有约5,000个克隆/孔的500,000个cDNA克隆组成。对人胎脑cDNA文库“次平板”进行第二次基于PCR的筛选，所述“次平板”每孔含有约5,000个克隆的大肠杆菌甘油原种。
在基于PCR筛选主平板和次平板时鉴定出102bp的片段[SEQ IDNO:13]，选择阳性cDNA克隆(具有102bp片段)，铺于2个含有LB/抗生素的平板，培养过夜。从这些平板中总共选择出96个细菌菌落，将它们各自置于新的96孔PCR板的孔中，每个孔中含有两种PCR引物[SEQ ID NO:17和18]和必需的PCR扩增试剂。然后进行PCR扩增，通过2％琼脂糖凝胶电泳分析96个独立的PCR反应。然后鉴定具有含102bp片段之克隆的阳性菌落。由含有102bp片段的阳性菌落得到质粒DNA并测序。随后的测序分析揭示出861bp的全长cDNA[SEQ IDNO:8]的存在。在SEQ ID NO:8中鉴定的663bp开放阅读框(ORF)或编码区(CDS)编码前-多肽原(称为“前-Neublastin原”)，其示于SEQ IDNO:9。根据SEQ ID NO:9，鉴定出3个Neublastin多肽变体，这些变体包括：
(ⅰ)本文称之为NBN140的140AA多肽，其具有SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列；
(ⅱ)本文称之为NBN116的116AA多肽，其具有SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列；和
(ⅲ)本文称之为NBN113的113AA多肽，其具有SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列。
含有782bp 5’非翻译DNA,663bp编码DNA和447bp 3’非翻译DNA(总共为19926p)的完整cDNA序列已被呈送至GenBank，登记号为AF120274。
按下述鉴定基因组中的Neublastin编码序列：
为了克隆基因组中的neublastin编码序列，制备了另一套引物，具体包括1号引物对[有义=SEQ ID NO:23，反义=SEQ ID NO:24]和2号引物对[有义=SEQ ID NO:25，反义=SEQ ID NO:26]。
使用2号引物对，通过PCR由人基因组DNA制品扩增887bp DNA片段，并克隆至pCRⅡ载体(Invitrogen)，然后转化至大肠杆菌。对所得质粒进行测序，推测出861bp的推定cDNA序列(编码在本文中被称为neublastin的蛋白质)(如SEQ ID NO:3所示)。类似地，使用1号引物对，通过对人基因组DNA进行PCR而得到870bp的DNA片段。在此片段中发现了位于开放阅读框(ORF)3’末端的42bp区域，相对于887bp序列而言，该区域是额外的。通过将neublastin基因与其它神经营养因子的核酸序列相比较，并作图外显子-内含子边界序列即可推测出该基因的基因组结构。此分析阐明neublastin基因具有至少两个被70bp内含子分开的外显子。
另外，使用此序列筛选GenBank中的neublastin EST序列。鉴定出3个这样的序列，它们的GenBank登记号为AA844072,AA931637和AA533512，这表明neublastin核酸被转录成mRNA。
将所得的完整cDNA序列(AF120274)和GenBank登记号为AC005038和AC005051的基因组序列相比较，结果表明neublastin基因由至少5个被4个内含子分开的外显子(包括3个编码外显子)组成(例见图8)。总之，外显子具有全长Neublastin多肽的推测氨基酸序列。还应说明的是，我们发现887bp的片段含有完整的neublastin原编码区。推测的cDNA[SEQ ID NO:3]含有编码neublastin原的开放阅读框(ORF)(181个氨基酸残基)，其显示出与3个已知的人蛋白质-Persephin,Neurturin和GDNF的同源性。本发明的neublastin核酸
另一方面，本发明提供了能表达本发明多肽的多核苷酸。本发明的多核苷酸包括DNA,cDNA和RNA序列以及反义序列，并包括天然的，合成的和经人为改造的多核苷酸。本发明的多核苷酸还包括因遗传密码所致的简并序列，但该序列仍编码neublastin多肽。
本文所定义的术语“多核苷酸”指的是长度至少为10个碱基，优选长度至少为15个碱基的核苷酸聚合物形式。“分离的多核苷酸”指的是不与两个编码序列紧邻的多核苷酸，而在分离得到该多核苷酸之生物体的天然基因组中，该多核苷酸与上述两个编码序列(一个在5’端，一个在3’端)紧邻。因此，该术语包括重组DNA，它可掺入表达载体，自我复制的质粒或病毒，或原核生物或真核生物的基因组DNA中，它也可以是独立的分子，例如不依赖于其它序列的cDNA。
本发明的多核苷酸还包括等位基因变体和“突变的多核苷酸”，其具有的核苷酸序列与本文所提供的核苷酸序列在一个或多个核苷酸位置处有所不同。
在优选的实施方案中，本发明的多核苷酸具有的核酸(DNA)序列能在如下文详述的至少中度，中度/高度，或高度严紧的条件下，与SEQID NO:1所示的多核苷酸序列，SEQ ID NO:3所示的多核苷酸序列，SEQ ID NO:8所示的多核苷酸序列，或SEQ ID NO:15所示的多核苷酸序列，其互补链，或其亚序列杂交。
在另一个优选的实施方案中，本发明的分离的多核苷酸具有的核酸(DNA)序列与SEQ ID NO:1所示的多核苷酸序列，SEQ ID NO:3所示的多核苷酸序列，SEQ ID NO:8所示的多核苷酸序列，或SEQ IDNO:15所示的多核苷酸序列至少70％，优选至少80％，更优选至少90％，最优选至少95％同源。
在最优选的实施方案中，多核苷酸具有SEQ ID NO:1所示的DNA序列，SEQ ID NO:3所示的DNA序列，SEQ ID NO:8所示的DNA序列，或SEQ ID NO:15所示的多核苷酸序列。
本发明还提供了新的引物和DNA序列，它们可用于鉴定，分离和扩增编码neublastin多肽或其片段的neublastin多核苷酸。所述引物包括SEQ ID NO:17-28和31-32所示的多核苷酸。另外，本发明还提供了由这些引物产生的neublastin DNA序列，包括SEQ ID NO:13和14所示的序列。另外，本发明还提供了得自基因组DNA中的3’或5’非翻译区域(“UTR”)的DNA序列，该序列侧翼于neublastin外显子；该序列可用于鉴定，分离和扩增编码neublastin多肽或其片段的neublastin多核苷酸。
本发明的3’UTR序列包括下列序列:
SEQ ID NO:1的核苷酸721-865，
SEQ ID NO:3的核苷酸718-861，
SEQ ID NO:8的核苷酸718-861，
SEQ ID NO:15的核苷酸1647-2136，和
得自(即包含于)上述序列中的长度为10至25个核苷酸的邻接序列(可用作引物)。
本发明的5’UTR序列包括下列序列：
SEO ID NO:1的核苷酸1-10，
SEQ ID NO:8的核苷酸1-57，
SEQ ID NO:15的核苷酸1-974，和
得自(即包含于)上述序列中的长度为10至25个核苷酸的邻接序列(可用作引物)。
优选通过克隆方法得到本发明的多核苷酸，所述方法例见“最新分子生物学方法”[John Wiley & Sons公司]。在优选的实施方案中，可由人脑的人基因组DNA或cDNA文库克隆多核苷酸，或者在所述文库的基础上产生多核苷酸。DNA序列的同源性
可将上文所提及的DNA序列同源性测定为两个序列之间的同一性程度，示出第一个序列与第二个序列的差异。利用本领域已知的计算机程序可适当地测定同源性，所述程序包括例如GCG程序包中提供的GAP[Needleman,S.B和Wunsch C.D.,分子生物学杂志1970,48:443-453]。使用具有下列设置的GAP进行DNA序列比较：GAP产生罚分为5.0,GAP延伸罚分为0.3，上文所提及的类似DNA序列编码区与SEQ ID NO:1所示DNA序列的CDS(编码)部分，或SEQ IDNO:3所示DNA序列的CDS(编码)部分，或SEQ ID NO:8所示DNA序列的CDS(编码)部分，或SEQ ID NO:15所示DNA序列的CDS(编码)部分的同一性程度优选至少为70％，更优选至少为80％，更优选至少为90％，更优选至少为95％。
术语“序列同一性”指的是在特定的比较区域内，两个多核苷酸序列在核苷酸-紧接着-核苷酸的基础上的相同程度。术语“序列同一性的百分比”是通过下列方法计算的，即比较两个在比较区域内排列得最令人满意的序列，测定在两个序列中出现相同核酸碱基(例如A,T,C,G,U或I)的位置数以产生匹配位置数，用匹配位置数除以比较区域内的位置总数(即窗口大小)，将结果乘以100即产生序列同一性的百分比。本文所用术语“基本上相同”表示多核苷酸序列的特征，其中，多核苷酸含有的序列在比较区域内与参照序列相比具有至少80％的序列同一性，优选为至少85％的同一性，经常为90至95％的序列同一性，更通常为至少99％的序列同一性。杂交方法
本发明的多核苷酸所具有的核酸序列能在如下文详述的至少中度，中度/高度，或高度严紧的条件下，与SEQ ID NO:1所示的多核苷酸序列，SEQ ID NO:3所示的多核苷酸序列，或SEQ ID NO:8所示的多核苷酸序列，或SEQ ID NO:15所示的多核苷酸序列，或其互补链，或其亚序列杂交。
测定核苷酸探针和同源DNA或RNA序列之间的杂交的适当实验条件包括：预先在5×SSC[氯化钠/柠檬酸钠；参见Sambrook等；分子克隆：实验室手册，冷泉港实验室，冷泉港，纽约1989]中将含有待杂交的DNA片段或RNA的滤膜浸泡10分钟，在5×SSC,5×Denhardt’s溶液[参见Sambrook等，文献同上],0.5％SDS和100μg/ml变性的经超声处理的鲑精DNA[参见Sambrook等，文献同上]中预杂交滤膜，接着于约45℃，在含有10ng/ml探针的相同溶液中杂交12小时，所述探针为随机-引发的[Feinberg A P & Vogelstein B；分析生物化学，1983,132,6-13]，并经32P-dCTP-标记(比活＞1×109cpm/μg)的探针。然后在温度至少为60℃(中度严紧条件)，优选至少为65℃(中度/高度严紧条件)，更优选至少为70℃(高度严紧条件)，甚至更优选至少为75℃(很高的严紧条件)时，在0.1×SSC,0.5％SDS中将滤膜洗涤2次，时间长达30分钟。使用X-射线胶片可检测到在这些条件下与寡核苷酸探针杂交的分子。克隆的多核苷酸
尤其是，本发明的分离的多核苷酸可以为克隆的多核苷酸。本文所定义的术语“克隆的多核苷酸”指的是根据基因工程领域最新使用的标准克隆方法克隆的多核苷酸或DNA序列，所述克隆方法可以将DNA区段，尤其是cDNA，即通过酶的作用由RNA产生的cDNA从其天然位置移位至不同位点，在所述位点处，该DNA区段可以再生。
通过任何适当的途径都可以完成克隆，包括例如逆转录酶技术，PCR技术等，以及切下和分离所需的DNA区段。
本发明的克隆的多核苷酸也可被称为“DNA构建体”或“分离的DNA序列”，尤其可以是互补DNA(cDNA)。生物来源
本发明的分离的多核苷酸可以得自任何适当的来源。
在优选的实施方案中，本发明的多核苷酸克隆自下列cDNA文库，或在这些文库的基础上产生，所述文库包括得自下列的cDNA文库，例如胎儿或成人脑，尤其是前脑，后脑，皮质，纹状体，扁桃体，小脑，尾状核，胼胝体，海马，丘脑核，丘脑下核，溴核，豆状核，黑质，侧根神经节，三叉神经神经节，肠系膜上动脉或丘脑；脊髓；心脏；胎盘；肺；肝脏；骨骼肌；肾脏；胰腺；肠；眼；视网膜；牙髓；毛囊；前列腺；垂体；或气管。
可商购的多种人和非人组织的cDNA文库得自例如Stratagene和Clontech。可通过标准方法，例如工作实施例中所述的那些方法得到本发明的分离的多核苷酸。本发明的neublastin多肽
如上文所述，本文所用“neublastin多肽”是具有神经营养活性的多肽(如实施例6,7,8和9所述)，其包括具有与“neublastin”多肽的同源性至少为70％的氨基酸序列的多肽及其变体和衍生物，所述“neublastin”多肽示于SEQ ID NO:2的AA-95-AA105,SEQ ID NO:2的AA1-AA105,SEQ ID NO:4的AA-97-AA140,SEQ ID NO:4的AA-41-AA140,SEQ ID NO:4的AA1-AA140,SEQ ID NO:9的AA-80-AA140(“野生型”prepro),SEQ ID NO:9的AA-41-AA140(pro),SEQ ID NO:5的AA1-AA140(成熟的140AA),SEQ ID NO:6的AA1-AA116(成熟的116AA),SEQ ID NO:7的AA1-AA113(成熟的113AA),SEQ ID NO:10的AA1-AA140(成熟的140AA),SEQ ID NO:11的AA1-AA116(成熟的116AA),SEQ ID NO:12的AA1-AA113(成熟的113AA),SEQ ID NO:16的AA1-AA224(鼠prepro)。
上文所鉴定的neublastin多肽的C-末端序列优选具有SEQ IDNO:2的AA72-AA105(即SEQ ID NO:9的AA107-AA140)所示的氨基酸序列，更优选具有SEQ ID NO:2的AA41-AA105(即SEQ ID NO:9的AA76-AA140)所示的氨基酸序列。
另外，优选neublastin多肽保留7个保守的Cys残基，所述残基是GDNF家族和TGF-β超家族所特有的残基。
优选neublastin多肽具有与上述序列的同源性大于85％，最优选大于95％的氨基酸序列，上述序列即为SEQ ID NO:2的AA-95-AA105,SEQ ID NO:2的AA1-AA105,SEQ ID NO:4的AA-97-AA140,SEQ ID NO:4的AA-41-AA140,SEQ ID NO:4的AA1-AA140,SEQ ID NO:9的AA-80-AA140(“野生型”prepro),SEQ ID NO:9的AA-41-AA140(pro),SEQ IDNO:5的AA1-AA140(成熟的140AA),SEQ ID NO:6的AA1-AA116(成熟的116AA),SEQ ID NO:7的AA1-AA113(成熟的113AA),SEQ ID NO:10的AA1-AA140(成熟的140AA),SEQ ID NO:11的AA1-AA116(成熟的116AA),SEQ ID NO:12的AA1-AA113(成熟的113AA),SEQ ID NO:16的AA1-AA224(鼠prepro),具有上文所鉴定的neublastin多肽之C-末端序列的上述任一多肽优选具有SEQ ID NO:2的AA72-AA105(即SEQ IDNO:9的AA107-AA140)所示的氨基酸序列，更优选具有SEQ ID NO:2的AA41-AA105(即SEQ ID NO:9的AA76-AA140)或SEQ ID NO:16的AA191-AA224所示的氨基酸序列。
另外，本发明包括具有与鼠“neublastin”多肽的同源性至少为70％的氨基酸序列的多肽，所述鼠“neublastin”多肽示于SEQ ID NO:16的AA1-AA224。
在一个实施方案中，本发明优选的多肽为neublastin的前序列原(分别示于SEQ ID NO:2,4,9和16)，序列原(分别示于SEQ ID NO:2的AA-75-AA105，或SEQ ID NO:4和9的AA-41-AA140)和成熟序列(示于SEQ ID NO:5,6,7,10,11或12，优选为SEQ ID NO:10,11,12)。
本发明的多肽包括变体多肽。在本发明的上下文中，术语“变体多肽”指的是多肽(或蛋白质)具有的氨基酸序列与SEQ ID NO:2,SEQID NO:4,SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:9,SEQ ID NO:10,SEQ ID NO:11,SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:16所示的序列在一个或多个氨基酸位置处有所不同。这种变体多肽包括上文所述的经修饰多肽，以及保守取代，剪接变体，同种型，得自其它物种的同系物和多态性。
本文所定义的术语“保守取代”表示某个氨基酸残基被另一个生物特性相似的残基所取代。例如，人们希望保守的氨基酸取代仅对生物活性有很小的影响或没有影响，当保守取代占多肽或蛋白质残基总数的10％以下时，更希望如此。保守的氨基酸取代优选为低于5％的多肽或蛋白质中的变化，最优选为低于2％的多肽或蛋白质中的变化(例如当根据NBN113进行计算时，最优选的保守取代为野生型成熟氨基酸序列中少于3个的氨基酸取代)。在特别优选的实施方案中，成熟序列中仅有单个氨基酸取代，其中被取代的和取代的氨基酸都是非-环形的。
其它特别保守的取代例子包括用一个诸如异亮氨酸，缬氨酸，亮氨酸或甲硫氨酸的疏水残基取代另一个疏水残基，或用一个极性残基取代另一个极性残基，如用精氨酸取代赖氨酸，用谷氨酸取代天冬氨酸，或用谷氨酰胺取代天冬酰胺等。
术语保守取代也包括使用经取代的氨基酸残基取代未经取代的亲代氨基酸残基，只要针对经取代多肽而产生的抗体也能与未经取代的多肽发生免疫反应即可。
修饰该原始氨基酸序列可产生活性与未经修饰的相应多肽基本上相同的蛋白质，因此，可认为该蛋白质是亲代蛋白质的功能类似物。所述修饰可以是有意的，例如通过定点诱变，或者可以自发产生，所述修饰包括剪接变体，同种型，得自其它物种的同系物和多态性。本发明还包括上述功能类似物。
此外，修饰原始氨基酸序列可产生未保留亲代蛋白质之生物活性的蛋白质，包括显性失活形式等。显性失活蛋白质通过结合，或要不然螯合通常与多肽发生功能性相互作用的调节剂(如上游或下游组分)来干扰野生型蛋白质。本发明也包括这种显性失活形式。
“信号肽”是肽序列，它可使新合成的与信号肽结合的多肽定位于内质网(ER)以进行进一步的翻译后加工和分布。
对neublastin而言，本文所用“异源信号肽”指的是非人neublastin信号肽，一般指的是一些除neublastin之外的哺乳动物蛋白质的信号肽。
熟练技术人员会认为：可使用人neublastin DNA序列(cDNA或基因组DNA)，或使用因沉默密码子变化或产生保守氨基酸取代的密码子变化而与人neublastin DNA有所不同的序列对经培养的人细胞进行基因修饰，以使所述细胞能过量表达和分泌酶。
本发明的多肽还包括嵌合多肽或可裂解的融合多肽，所述融合多肽中的另一种多肽与多肽或其片段的N末端或C末端融合。通过将编码另一种多肽的核酸序列(或其部分)与本发明的核酸序列(或其部分)融合即可产生嵌合多肽。
产生嵌合多肽的技术是标准技术。所述技术通常需要以一定的方式连接序列以使两个序列位于相同的阅读框中，并且，融合多肽的表达处于相同启动子和终止子的控制之下。
本发明的多肽还包括全长neublastin分子的截短形式。在该截短分子中，一个或多个氨基酸从N末端或C末端，优选从N末端缺失。氨基酸序列同源性
候选多肽与本发明的neublastin多肽的同源性程度被测定为两个氨基酸序列之间的同一性程度。高水平的序列同一性表示第一个序列很可能得自第二个序列。
通过计算机分析可测定同源性，所述程序例如但不限于ClustalX计算机序列对比程序[Thompson JD,Gibson TJ,Plewniak F,Jeanmougin F,& Higgins DG:ClustalX windows界面：借助于质量分析工具进行多个序列对比的灵活策略；核酸研究，1997,25(24):4876-82],本文建议了其缺省参数值。使用该程序，由本发明的类似DNA序列所编码多肽的成熟部分与本文SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:4,SEQ IDNO:5,SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:9,SEQ ID NO:10,SEQ ID NO:11,SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:16所示氨基酸序列的同一性程度至少为90％,更优选至少为95％，最优选至少为98％。
根据同源性的检测结果，证实属于TGF-β超家族的本发明多肽与GDNF亚族相关，但本发明的多肽是该亚族中的一个与众不同的成员。生物活性多肽
可以任何生物活性形式提供本发明的多肽，包括前-蛋白质原，蛋白质原，成熟蛋白质，糖基化蛋白质，磷酸化蛋白质或任何其它经翻译后修饰的蛋白质。
本发明的多肽尤其可以是N-糖基化多肽，优选该多肽在序列表所示的N-残基处糖基化。
在优选的实施方案中，本发明的多肽具有SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列，在第122位具有糖基化的天冬酰胺残基；SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列，在第122位具有糖基化的天冬酰胺残基；SEQ IDNO:11所示的氨基酸序列，在第98位具有糖基化的天冬酰胺残基；或SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列，在第95位具有糖基化的天冬酰胺残基。
本发明还包括neublastin融合蛋白，例如Ig-融合蛋白，例见美国专利5,434,131(列入本文作为参考)。
在一个实施方案中，本发明提供了具有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽，或具有与SEQ ID NO:2所示序列至少约85％，优选至少约90％，更优选至少约98％，最优选至少约99％同源之氨基酸序列的多肽。
在另一个实施方案中，本发明提供了具有SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的多肽，或具有与SEQ ID NO:4所示序列至少约90％，优选至少约95％，更优选至少约98％，最优选至少约99％同源之氨基酸序列的多肽。
在第三个实施方案中，本发明提供了具有SEQ ID NO:5所示氨基酸序列的多肽，或具有与SEQ ID NO:5所示序列至少约90％，更优选至少约95％，最优选至少约98％同源之氨基酸序列的多肽。
在第四个实施方案中，本发明提供了具有SEQ ID NO:6所示氨基酸序列的多肽，或具有与SEQ ID NO:6所示序列至少约90％，更优选至少约95％，最优选至少约98％同源之氨基酸序列的多肽。
在第五个实施方案中，本发明提供了具有SEQ ID NO:7所示氨基酸序列的多肽，或具有与SEQ ID NO:7所示序列至少约90％，更优选至少约95％，最优选至少约98％同源之氨基酸序列的多肽。
本发明的neublastin多肽包括等位基因变体，例如SEQ ID NO:5-7的多肽氨基酸序列，其中Xaa表示Asn或Thr,Yaa表示Ala或Pro。
在第六个实施方案中，本发明提供了具有SEQ ID NO:9所示氨基酸序列的多肽，或具有与SEQ ID NO:9所示序列至少约90％，更优选至少约95％，最优选至少约98％同源之氨基酸序列的多肽。
在第七个实施方案中，本发明提供了具有SEQ ID NO:10所示氨基酸序列的多肽，或具有与SEQ ID NO:10所示序列至少约90％，更优选至少约95％，最优选至少约98％同源之氨基酸序列的多肽。
在第八个实施方案中，本发明提供了具有SEQ ID NO:11所示氨基酸序列的多肽，或具有与SEQ ID NO:11所示序列至少约90％，更优选至少约95％，最优选至少约98％同源之氨基酸序列的多肽。
在第九个实施方案中，本发明提供了具有SEQ ID NO:12所示氨基酸序列的多肽，或具有与SEQ ID NO:12所示序列至少约90％，更优选至少约95％，最优选至少约98％同源之氨基酸序列的多肽。
在第十个实施方案中，本发明提供了具有SEQ ID NO:16所示氨基酸序列的多肽，或具有与SEQ ID NO:16所示序列至少约90％，更优选至少约95％，最优选至少约98％同源之氨基酸序列的多肽，所述多肽是鼠源前-neublastin原。
在另一个实施方案中，本发明的多肽具有GDNF亚族指纹，即表3中的下划线氨基酸残基。
在另一个实施方案中，本发明提供了由下述多核苷酸序列编码的多肽，所述多核苷酸序列能在高度严紧的条件下与SEQ ID NO:1所示的多核苷酸序列，其互补链，或其亚-序列杂交。在优选的实施方案中，本发明的多肽由下述多核苷酸序列所编码，所述多核苷酸序列与SEQID NO:1所示的多核苷酸序列至少70％同源。在最优选的实施方案中，本发明的多肽由SEQ ID NO:1所示的多核苷酸序列所编码。
在另一个实施方案中，本发明提供了由下述多核苷酸序列编码的新多肽，所述多核苷酸序列能在高度严紧的条件下与SEQ ID NO:3所示的多核苷酸序列，其互补链，或其亚-序列杂交。在优选的实施方案中，本发明的多肽由下述多核苷酸序列所编码，所述多核苷酸序列与SEQ ID NO:3所示的多核苷酸序列至少70％同源。在最优选的实施方案中，本发明的多肽由SEQ ID NO:3所示的多核苷酸序列所编码。
在另一个实施方案中，本发明提供了由下述多核苷酸序列编码的新多肽，所述多核苷酸序列能在高度严紧的条件下与SEQ ID NO:8所示的多核苷酸序列，其互补链，或其亚-序列杂交。在优选的实施方案中，本发明的多肽由下述多核苷酸序列所编码，所述多核苷酸序列与SEQ ID NO:8所示的多核苷酸序列至少70％同源。在最优选的实施方案中，本发明的多肽由SEQ ID NO:8所示的多核苷酸序列所编码。
在另一个实施方案中，本发明提供了由下述多核苷酸序列编码的新多肽，所述多核苷酸序列能在高度严紧的条件下与SEQ ID NO:15所示的多核苷酸序列，其互补链，或其亚-序列杂交。在优选的实施方案中，本发明的多肽由下述多核苷酸序列所编码，所述多核苷酸序列与SEQ ID NO:15所示的多核苷酸序列至少70％同源。在最优选的实施方案中，本发明的多肽由SEQ ID NO:15所示的多核苷酸序列所编码。生物来源
本发明的多肽可分离自哺乳动物细胞，优选分离自人细胞或鼠源细胞。
在最优选的实施方案中，本发明的多肽可分离自人的心脏组织，人骨骼肌，人胰腺，人脑组织，尤其可分离自尾状核或丘脑，或者可得自哺乳动物源的DNA，这一点将在下文详细讨论。神经营养活性
本发明的neublastin多肽可用于缓和神经或神经元细胞的代谢，生长，分化或存活。特别是，neublastin多肽可用于治疗或缓解活动物，例如人的失调或疾病，所述失调或疾病对神经营养剂的活性有反应。下文将更详细地描述这种治疗和方法。抗体
可使用本发明的neublastin多肽或多肽片段产生neublastin-特异性抗体。本文所用“neublastin-特异性抗体”是抗体，例如多克隆抗体或单克隆抗体，所述抗体能与neublastin多肽或多肽片段发生免疫反应，或者与neublastin多肽的表位特异性结合。
多克隆和单克隆抗体的制备是本领域众所周知的。尤其是，可按以下文献所述得到多克隆抗体：例如Green等：“产生多克隆的抗血清”，免疫化学方法(Manson编)；Humana出版社，1992,p1-5；Coligan等：“在兔，大鼠，小鼠和仓鼠中产生多克隆抗血清”，最新免疫学方法，1992，第2.4.1节；Ed Harlow和David Lane(编)：“抗体：实验室手册”，冷泉港实验室出版社，1988；这些方法都列入本文作为参考。尤其是，可按以下文献所述得到单克隆抗体：Kohler & Milstein，自然，1975,256:495；Coligan等，最新免疫学方法，1992，第2.5.1-2.6.7节；和Harlow等，“抗体：实验室手册”，冷泉港实验室出版社，1988,p726；这些方法都列入本文作为参考。
简单地说，可通过下述方法得到单克隆抗体，即用含有抗原的组合物注射例如小鼠，通过取出血清样品证实抗体的产生，取出脾脏，得到B淋巴细胞，使B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合以产生杂交瘤，克隆杂交瘤，选择产生针对抗原之抗体的阳性克隆，从杂交瘤培养物中分离抗体。
可通过多种已成熟建立的技术从杂交瘤培养物中分离和纯化单克隆抗体，所述技术包括用A蛋白Sepharose进行亲和层析，大小排阻层析和离子交换层析，例见Coligan等，最新免疫学方法，1992，第2.7.1-2.7.12节和第2.9.1-2.9.3节；和Barnes等：“免疫球蛋白G(IgG)的纯化”，分子生物学方法；Humana出版社，1992,Vol.10,p79-104。任选通过与基质结合并从基质上洗脱下来以进一步纯化多克隆或单克隆抗体，所述基质上结合有产生抗体的多肽。
使用含有所需小肽(作为免疫抗原)的完整多肽或片段可制备出与本发明的neublastin多肽结合的抗体。通过重组DNA技术或通过化学合成可得到用于免疫动物的多肽，任选将所述多肽与载体蛋白缀合。常用的与肽化学偶联的载体蛋白包括匙孔嘁血蓝蛋白(KLH)，甲状腺球蛋白，牛血清白蛋白(BSA)和破伤风类毒素。然后可使用偶联的肽免疫动物，所述动物尤其可以是小鼠，大鼠，仓鼠或兔。
在一个实施方案中，可使用下列肽产生抗体：
肽1:CRPTRYEAVSFMDVNST(SEQ ID NO:9的氨基酸108-124)；或
肽2:ALRPPPGSRPVSQPC(SEQ ID NO:9的氨基酸93-107)。实施例10中描述了使用这些多肽产生抗体的方法。
我们还针对下列肽产生了兔多克隆抗体：
肽R27:GPGSRARAAGARGC(SEQ ID NO:9的氨基酸30-43)；
肽R28:LGHRSDELVRFRFC(SEQ ID NO:9的氨基酸57-70)；
肽R29:CRRARSPHDLSL(SEQ ID NO:9的氨基酸74-85)；
肽R30:LRPPPGSRPVSQPC(SEQ ID NO:9的氨基酸94-107)；
肽R31:STWRTVDRLSATAC(SEQ ID NO:9的氨基酸123-136)。
在该组肽中，只有相对靠近于C末端的肽R30和R31才能识别Western印迹上的在还原条件下变性的蛋白质。
如下文所详述，我们还鉴定了其它得自成熟蛋白质的neublastin-衍生肽，根据已知的GDNF结构(Eigenbrot和Gerber,Nat.Struct.Biol.,1997 4 435-438)，推测它们是暴露于表面的环，因此可用于产生抗体：
区域1:CRLRSQLVPVRALGLGHRSDELVRFRFC(SEQ ID NO:9的AA43-70)；
区域2:CRRARSPHDLSLASLLGAGALRPPPGSRPVSQPC(SEQID NO:9的AA74-107)；
区域3:CRPTRYEAVSFMDVNSTWRTVDRLSATAC(SEQ IDNO:9的AA108-136)。
在本发明的另一方面，与neublastin或neublastin-衍生肽特异性结合的抗体可用于检测多种介质中所述neublastin神经营养因子的存在，尤其可用于诊断与本发明的neublastin分子相关的病症或疾病。包括ELISA,RIA和FACS的多种检测方法是本领域已知的。
本发明的抗体也可用于阻断神经营养因子的作用，尤其可以是中和抗体。产生本发明多肽的方法
如下文所详述，在允许产生多肽的条件下培养细胞，所述细胞含有编码本发明neublastin多肽的DNA序列，接着从培养基中回收多肽。当为了产生neublastin多肽需要对细胞进行基因修饰时，可通过常规方法或通过基因激活修饰细胞。
根据常规方法，可将含有neublastin cDNA或基因组DNA序列的DNA分子包含在表达构建体中，并通过标准方法转染至细胞中，所述转染方法包括但不限于脂质体-,Polybrene-或DEAE葡聚糖-介导的转染，电穿孔，磷酸钙沉淀，微量注射或速度驱动的微粒轰击(“biolistics”)。或者，也可使用通过病毒载体传递DNA的系统。已知可用于基因转移的病毒包括腺病毒，腺-相关病毒，慢病毒，疱疹病毒，腮腺炎病毒，脊髓灰质炎病毒，逆转录病毒，新培斯病毒和痘苗病毒，如金丝雀痘病毒，以及昆虫细胞(尤其是SfP9昆虫细胞)的杆状病毒感染。
或者，可使用基因激活(“GA”)法修饰细胞，所述方法描述于例如美国专利5,733,761和5,750,376(皆列入本文作为参考)。
因此，本文所用术语“经基因修饰的细胞”包括在导入DNA分子之后能表达特定基因产物的细胞，所述DNA分子编码所述基因产物和/或控制该基因产物编码序列之表达的调节元件。可通过基因靶向导入DNA分子，使DNA分子掺入特定的基因组位点。重组表达载体
在本发明的另一方面，提供了含有本发明的多核苷酸的重组表达载体。本发明的重组表达载体可以是任何适当的真核表达载体。优选的重组表达载体是含有遍在蛋白启动子的载体pTEJ-8(Johansen TE,Schoeller MS,Tolstoy S,Schwartz T；FEBS Lett.1990 267 289-294)，及其衍生物，例如pUbi1Z。优选的商购真核表达载体是例如含有病毒启动子的载体pcDNA-3(可得自Invitrogen)。另一个优选的表达载体使用SV40早期启动子和腺病毒主要晚期启动子(衍生自质粒pAD2β；Norton和Coffin，分子细胞生物学，1985,5,281)。
本发明还提供了原核表达载体和合成基因(syngene)，所述合成基因的密码子经最优化后适于原核表达。用较低的GC含量和偏好的细菌(例如大肠杆菌)密码子构建合成基因。将合成基因克隆至两个载体，pET19b和pMJB164(pET19b的衍生物)。pET19b的构建示于图14。在此构建体中，编码neublastin成熟结构域的序列直接与起始甲硫氨酸融合。pMJB164的构建示于图15。生产细胞
在本发明的另一方面，提供了生产细胞，所述细胞经基因操作后含有本发明的分离的多核苷酸序列，和/或本发明的重组表达载体。特别是，可对本发明的细胞进行基因操作以瞬时或稳定表达，过量表达或共表达本发明的多肽。产生瞬时和稳定表达的方法是本领域已知的。
可将本发明的多核苷酸插入表达载体，例如质粒，病毒或其它表达载体，所述多核苷酸与表达控制序列以特定的连接方式可操作相连，从而使编码序列能在与表达控制序列相容的条件下进行表达。适当的表达控制序列包括启动子，增强子，转录终止子，起始密码子，内含子的剪接信号和终止密码子，它们都维持于本发明的多核苷酸的正确读码框内，从而能适当翻译mRNA。表达控制序列还包括其它组分，例如前导序列和融合配对物序列。
启动子尤其可以是组成型或诱导型启动子。当克隆至细菌系统时，可使用诱导型启动子，例如噬菌体λ的pL,plac,ptrp,ptac(ptrp-lac杂合启动子)。当克隆至哺乳动物系统时，可使用得自哺乳动物细胞基因组的启动子，例如遍在蛋白启动子，TK启动子，或金属硫蛋白启动子，或得自哺乳动物病毒的启动子，例如逆转录病毒长的末端重复，腺病毒晚期启动子或痘苗病毒7.5K启动子。也可使用通过重组DNA或合成技术得到的启动子以提供本发明多核苷酸的转录。
适当的表达载体一般含有表达起点，启动子以及能用表型选择转化细胞的特定基因，所述载体包括在细菌中表达的基于T7的表达载体[Rosenberg等，基因，1987,56,125]，在哺乳动物细胞中表达的pTEJ-8,pUbi1Z,pcDNA-3和pMSXND表达载体[Lee和Nathans，生物化学杂志，1988 263 3521]，在昆虫细胞中表达的衍生自杆状病毒的载体，和卵母细胞表达载体PTLN[Lorenz C,Pusch M & Jentsch T J：具有新特性的异多亚基CLC氯通道；Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1996 9313362-13366]。
在优选的实施方案中，本发明的细胞是真核细胞，例如哺乳动物细胞，如人细胞，卵母细胞或酵母细胞。本发明的细胞包括但不限于人胚肾(HEK)细胞，例如HEK293细胞，BHK21细胞，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，Xenopus laevis卵母细胞(XLO)。在另一个实施方案中，本发明的细胞是真菌细胞，例如丝状真菌细胞。在另一个优选的实施方案中，细胞是昆虫细胞，最优选为Sf9细胞。本发明另一个优选的哺乳动物细胞是PC12,HiB5,RN33b细胞系和人神经祖细胞。最优选的是人细胞。
原代或继代细胞的例子包括成纤维细胞，上皮细胞(包括乳房和肠上皮细胞)，内皮细胞，血液的组成成分(包括淋巴细胞和骨髓细胞)，胶质细胞，肝细胞，角质形成细胞，肌细胞，神经细胞或这些细胞类型的前体细胞。用于本发明方法的无限增殖化人细胞系的例子包括但不限于Bowes黑素瘤细胞(ATCC登记号为CRL9607),Daudi细胞(ATCC登记号为CCL213),HeLa细胞和HeLa细胞的衍生物(ATCC登记号为CCL2,CCL2.1和CCL2.2),HL-60细胞(ATCC登记号为CCL240),HT-1080细胞(ATCC登记号为CCL121),Jurkat细胞(ATCC登记号为TIB152),KB癌细胞(ATCC登记号为CCL17),K-562白血病细胞(ATCC登记号为CCL243),MCF-7乳腺癌细胞(ATCC登记号为BTH22),MOLT-4细胞(ATCC登记号为1582),Namalwa细胞(ATCC登记号为CRL1432),Raji细胞(ATCC登记号为CCL86),RPMI 8226细胞(ATCC登记号为CCL155),U-937细胞(ATCC登记号为CRL1593),WI-38VA13亚系2R4细胞(ATCC登记号为CLL75.1)和2780AD卵巢癌细胞(Van der Blick等，癌症研究，1988,48,5927-5932)，以及通过融合人细胞和另一物种的细胞而产生的异杂交瘤细胞。也可使用继代人成纤维细胞系，如WI-38(ATCC登记号为CCL75)和MRC-5(ATCC登记号为CCL171)。
当本发明的细胞是真核细胞时，本发明的异源多核苷酸的掺入可特别地通过以下方法来实现，即感染(利用病毒载体)，转染(利用质粒载体)，使用磷酸钙沉淀，微量注射，电穿孔，脂转染法，或其它本领域已知的物理-化学方法。
在更优选的实施方案中，可将本发明的分离的多核苷酸序列和/或本发明的重组表达载体转染至哺乳动物宿主细胞，神经祖细胞，星形细胞，T-细胞，造血干细胞，非-分裂细胞，或脑内皮细胞，所述细胞含有至少一种能介导细胞无限增殖化和/或转化的DNA分子。
通过导入调节元件，尤其是导入启动子可以激活宿主细胞中的内源性基因，所述启动子能导致编码本发明之neublastin多肽的内源性基因的转录。药物组合物
在本发明的另一方面，提供了新的药物组合物，其含有治疗有效量的本发明多肽。
为了用于治疗，可以任何方便的形式施用本发明的多肽。在优选的实施方案中，本发明的多肽与一种或多种佐剂，赋形剂，载体和/或稀释剂混合于药物组合物中，本领域技术人员使用本领域已知的常规方法即可制备药物组合物。
这种药物组合物可含有本发明的多肽或其抗体。可以单独施用该组合物，也可与一种或多种其它药剂，药物或激素一起施用该组合物。
可通过任何适当的途径施用本发明的药物组合物，包括但不限于口服，静脉内，肌内，动脉间，髓内，鞘内，室内，经皮，皮下，腹膜内，鼻内，anteral，局部，舌下或直肠给药，颊内，阴道内，眶内，脑内，颅内，脊柱内，室内，池内，囊内，肺内，经粘膜，或经由吸入。
肺内传递方法，装置和药物制品描述于例如美国专利5,785,049,5,780,019和5,775,320(皆列入本文作为参考)。可通过周期性注射药物制品的巨丸剂进行给药；也可通过静脉内或腹膜内途径更连续地给药，所述药物得自外部(例如Ⅳ袋)或内部(例如生物可腐蚀的植入物，生物人工器官，或植入的neublastin生产细胞集落)药物库。例见美国专利4,407,957,5,798,113和5,800,828(皆列入本文作为参考)。肺内传递方法和装置描述于例如美国专利5,654,007,5,780,014和5,814,607(皆列入本文作为参考)。
尤其是，使用任何适当的传递方式都可施用本发明的neublastin,所述方式包括：
(a)泵(例见药物治疗年鉴，27:912(1993)；癌症，41:1270(1993)；癌症研究，44:1698(1984)，列入本文作为参考)，
(b)微囊化(例见美国专利4,352,883；4,353,888和5,084,350，列入本文作为参考)，
(c)持续释放的聚合植入物(例见Sabel，美国专利4,883,666，列入本文作为参考)，
(d)巨囊化(例见美国专利5,284,761,5,158,881,4,976,859和4,968,733和公开的PCT专利申请WO92/19195,WO95/05452，皆列入本文作为参考)，
(e)移植至CNS的裸露的或未囊化的细胞移植物(例见美国专利5,082,670和5,618,531，皆列入本文作为参考)，
(d)皮下，静脉内，动脉内，肌内注射或注射至其它适当的位点；和
(g)以胶囊，液体，片剂，丸剂或延长释放的制剂口服给药。
在本发明的一个实施方案中，直接将neublastin传递至CNS，优选传递至脑室，脑实质，鞘内间隙或其它适当的CNS位置，最优选传递至鞘内。
在另一个优选的实施方案中，我们希望通过皮下注射，静脉内给药或静脉内灌注全身性传递给药。
其它有用的非肠道传递系统包括乙烯-乙烯基醋酸酯共聚物颗粒，渗透泵，可植入的灌注系统，泵传递，胶囊化细胞传递，脂质体传递，针头-传递的注射，无针头注射，喷雾器，烟雾剂，电穿孔和经皮贴片。
有关配制和给药技术的其它详情可参见Remington’s药物科学(Maack出版公司，Easton,PA)的最新版本。
每天以一个或几个剂量施用活性成分。本发明所希望的适当剂量为每次给药0.5ng neublastin/kg体重至约50μg/kg，每天给药约1.0ng/kg至约100μg/kg。neublastin药物组合物应该提供局部浓度为约5ng/ml脑脊髓液(“CSF”)至25ng/ml CSF的神经营养因子。
当然，应当根据年龄，体重和接受治疗的个体的身体状况以及给药途径，剂量形式和制度，所需结果小心地调整给药的剂量，医生应当可以确定精确的剂量。
在其它实施方案中，可使用下文“治疗方法”一节中所述的细胞系和载体，通过基因传递施用本发明的neublastin多肽。为了产生这种治疗性的细胞系，可将本发明的多核苷酸插入表达载体，例如质粒，病毒或其它表达载体，所述多核苷酸与表达控制序列以特定的连接方式可操作相连，从而使编码序列能在与表达控制序列相容的条件下进行表达。适当的表达控制序列包括启动子，增强子，转录终止子，起始密码子，内含子的剪接信号和终止密码子，它们都维持于本发明的多核苷酸的正确读码框内，从而能适当翻译mRNA。表达控制序列还包括其它组分，例如前导序列和融合配对物序列。
启动子尤其可以是组成型或诱导型启动子。组成型启动子可以是合成的，病毒的或得自哺乳动物细胞基因组的启动子，例如人遍在蛋白启动子。在优选的实施方案中，治疗性的细胞系是表达本发明多肽的人无限增殖化神经细胞系。为了进行植入，我们希望植入约105至1010个细胞，更优选植入106至约108个细胞。治疗方法
本发明涉及多核苷酸和蛋白质，多肽，肽片段或由它们产生的衍生物，以及针对所述蛋白质，肽或衍生物的抗体，本发明可用于治疗或缓解活动物体，包括人的失调或疾病，所述失调或疾病对神经营养剂的活性有反应。
可经由例如注射入，植入或食入的药物组合物，直接使用本发明的多肽来治疗对neublastin多肽有所反应的病理过程。
可使用本发明的多核苷酸，包括其互补序列来表达本发明的神经营养因子。通过表达本发明的这种蛋白质，肽或衍生物的细胞系，或通过编码本发明的这种蛋白质，肽或衍生物的病毒载体，或通过表达这种蛋白质，肽或衍生物的宿主细胞可实现这一目的。可在治疗的靶区域施用这些细胞，载体和组合物以影响对neublastin多肽有所反应的疾病过程。
适当的表达载体可衍生自慢病毒，逆转录病毒，腺病毒，疱疹病毒或痘苗病毒，或衍生自多种由细菌产生的质粒，可在体内使用这些表达载体将核苷酸序列传递至整个生物体或靶器官，组织或细胞群体。其它方法包括但不限于脂质体转染，电穿孔，用含有核或其它定位信号的载体肽转染，和经由缓释系统进行基因传递。在本发明的另一方面，可使用与neublastin基因或其部分互补的“反义”核苷酸序列抑制或增强neublastin表达。
本发明的另一方面涉及治疗或缓解活动物体，包括人的失调或疾病的方法，所述失调或疾病对神经营养剂的活性有反应。
失调或疾病尤其可以是由创伤，外科手术，局部缺血，感染，代谢疾病，营养缺陷，恶性肿瘤或毒性剂和遗传或自发过程导致的神经系统损伤。
损伤尤其可发生在感觉神经元或视网膜神经节细胞，包括侧根神经节中的神经元或下列任何组织中的神经元：膝状，岩部和结节状神经节；第Ⅷ根颅神经的耳前庭复合体；三叉神经神经节之上下颌叶的腹外侧极；和中脑三叉神经核。
在本发明方法的优选实施方案中，疾病或失调是涉及受损和受伤的神经元的神经变性疾病，例如外周神经，髓质和/或脊髓的外伤性损害，大脑局部缺血性神经元损害，神经病(尤其是外周神经病)，外周神经创伤或外伤，局部缺血性中风，急性脑损伤，急性脊髓损伤，神经系统肿瘤，多发性硬化，暴露于神经毒素，代谢疾病(例如糖尿病或肾功能异常)和由感染因子导致的损伤，神经变性失调，包括早老性痴呆，杭廷顿氏病，帕金森氏病，Parkinson-Plus综合征，进行性核上麻痹(Steele-Richardson-Olszewski综合征)，橄榄体脑桥小脑萎缩(OPCA),Shy-Drager综合征(多系统萎缩)，Guamanian帕金森氏综合征痴呆复征，肌萎缩性侧硬化，或任何其它先天的或神经变性疾病，和与痴呆相关联的记忆损伤。
在优选的实施方案中，我们希望治疗感觉和/或自主系统的神经元。在另一个优选的实施方案中，我们希望治疗运动神经元疾病，例如肌萎缩性侧硬化(“ALS”)和脊柱肌萎缩。在另一个优选的实施方案中，我们希望使用本发明的neublastin分子增强外伤后的神经恢复。在一个实施方案中，我们希望使用神经引导通道，该通道具有含neublastin多肽的基质。这种神经引导通道公开于例如美国专利5,834,029(列入本文作为参考)。
在优选的实施方案中，可使用本发明的多肽和核酸(和含有它们的药物组合物)治疗外周神经病。在外周神经病中，有望用本发明的分子进行治疗的是外伤-诱导的神经病，例如由物理损伤或疾病状态，对脑的物理损伤，对脊髓的物理损伤，与脑损伤相关的中风和与神经变性相关的神经失调所致的神经病。
我们还希望治疗由化学治疗诱导的神经病(例如由诸如红豆杉醇或顺式铂氨的化学治疗剂的传递所导致的神经病)；毒素-诱导的神经病，药物-诱导的神经病，维生素-缺乏-诱导的神经病；自发性的神经病和糖尿病性神经病，例见美国专利5,496,804和5,916,555(皆列入本文作为参考)。
我们还希望使用本发明的neublastin核苷酸和多肽治疗非-神经病，单-多重神经病和多-神经病，包括轴索和脱髓鞘神经病。
在另一个优选的实施方案中，本发明的多肽和核酸(和含有它们的药物组合物)可用于治疗多种眼病，包括受斑变性，色素性视网膜炎，青光眼和类似疾病困扰的患者的视网膜光受体损失。
本发明的另一个目的是提供预防与上述疾病和失调相关联的变性变化的方法，所述方法包括将人载体或细胞植入哺乳动物的脑，所述载体或细胞能产生neublastin的生物活性形式或neublastin前体，即易于通过哺乳动物体转变为neublastin的生物活性形式的分子，或者，另外可将分泌neublastin的细胞包裹于例如半透膜内。
可在体外培养细胞以用于移植至或植入哺乳动物(包括人)的脑。
在优选的实施方案中，可使用例如国际专利申请WO98/32869中所述的表达载体，将编码本发明多肽的基因转染至适当的细胞系，例如无限增殖化的大鼠神经干细胞系，如HiB5和RN33b，或转染至人无限增殖化的神经祖细胞系，再将所得的细胞系植入活体(包括人)的脑中，以在CNS中分泌本发明的治疗性多肽。诊断和筛选方法
可使用neublastin核酸测定个体是否因neublastin基因缺损，如neublastin等位基因的缺损而先倾向于患有神经失调症，所述缺损是通过例如基因遗传，异常胚胎发育，或获得性DNA损伤而获得的。所述分析包括例如检测neublastin基因内的缺损或点突变，或检测具有特异性限制性片段长度多态性(RFLP)的基因缺损诱因的遗传性，通过使患者的核酸样品与neublastin基因特异性的核酸探针杂交来检测是否存在正常的neublastin基因，并且测定探针与核酸杂交的能力。
可特别地将neublastin核酸用作杂交探针。可使用这种杂交分析检测，预测，诊断或监测与编码neublastin蛋白之mRNA的异常水平相关的病症，失调或疾病。可将neublastin核酸当作neublastin神经营养因子-依赖型生理过程的“标记”。这些过程包括但不限于“正常的”生理过程(如神经元功能)和病理过程(如神经变性疾病)。neublastin蛋白和/或编码neublastin的mRNA水平异常(即升高或降低)的特定患者亚群的鉴定导致新的疾病分类。本文所定义的“异常水平”指的是：经定量或定性方法测定，上述水平相对于对照样品或未患病的个体而言有所增加或降低。
也可使用本发明的neublastin核酸和多肽筛选和鉴定neublastin类似物，包括neublastin的小分子模拟物。在一个经深思熟虑的实施方案中，本发明提供了鉴定候选化合物的方法，所述化合物可诱导neublastin-介导的生物学作用，所述方法包括以下步骤：提供受试细胞，当其与neublastin接触时可被诱导表达可测的产物，将细胞暴露于候选化合物，并检测可测产物。可测产物的表达是候选化合物能诱导neublastin-介导的生物学作用的标志。
此外，本发明的neublastin核酸和多肽可用于DNA芯片或蛋白质芯片，或用于计算机程序以鉴定相关的新基因序列和由其编码的蛋白质，包括等位基因变体和单核苷酸多态性(“SNP”)。所述方法描述于例如美国专利5,795,716；5,754,524；5,733,729；5,800,992；5,445,934；5,525,464(皆列入本文作为参考)。实施例实施例1：分离neublastin核酸的方法方法1：快速筛选人胎脑cDNA中的neublastin基因
通过与人persephin的同源性，在两个提交至GenBank的高通量基因组序列(HGTS)(登记号为AC005038和AC005051)中鉴定出290bp片段。由290bp片段的核酸序列合成两个neublastin特异性引物。neublastin上链引物(“NBNint.sence”)具有序列5’-CCTGGCCAGCCTACTGGG-3’[SEQ ID NO:17]。neublastin下链引物(“NBNint.antisence”)具有序列5’-AAGG AGACCGCTTCGTAGCG-3’[SEQ ID NO:18]。用这些引物进行96孔PCR反应。
96孔主平板含有500,000个cDNA克隆的质粒DNA，每孔上样约5000个克隆。96孔次平板使用的是大肠杆菌DH10B甘油原种，每孔含有50个克隆。
使用聚合酶链反应(“PCR”)技术通过3轮扩增鉴定出neublastin核酸；扩增增加了样品中的核酸拷贝数。
主平板筛选：使用上述96-孔PCR筛选技术，用基因-特异性引物筛选人胎脑cDNA主平板以分离人neublastin cDNA。
从主平板的相应孔中得到30纳克(30ng)人胎脑cDNA(6ng/μl；Origene Technologies)，将其置于总体积为25μl的溶液中，所述溶液含有下列试剂：0.2mM上述两种基因-特异性引物(即NBNint.sence和NBNint.antisence),1×标准的PCR缓冲液(Buffer V,Advanced Bio-technologies,UK),0.2mM dNTP(Amersham-Pharmacia),0.1M GC-Melt(Clontech Laboratories,USA)和0.5单位Taq DNA聚合酶(5U/μl；Advanced Biotechnologies,UK)。
使用下列方案和条件进行PCR热循环反应。起初使DNA于94℃变性3分钟，然后按下述进行35轮循环：94℃变性1分钟，55℃退火1分钟，72℃第一次延伸90秒；72℃最终延伸5分钟。使用含有溴化乙锭染料的2％琼脂糖凝胶经凝胶电泳分析96个独立的PCR反应产物。由一个孔中得到的102bp阳性PCR产物对应于独特的96孔次平板。
102bp核酸片段具有下列序列[SEQ ID NO:13]5′-CCTGGCCAGCCTACTGGGCGCCGGGGCCCTGCGACCGCCCCCGGGCTCCCGGCCCGTCAGCCAGCCCTGCTGCCGACCCACGCGCTACGAAGCGGTCTCCTT-3′
次平板筛选：将1μl得自相应次平板孔的甘油原种置于总体积为25μl的溶液中，经PCR-介导的扩增筛选96孔人胎脑次平板，所述溶液含有：0.2mM上述两种基因-特异性引物，1×标准的PCR缓冲液(Buffer V,Advanced Biotechnologies,UK),0.2mM dNTP(Amersham-Pharmacia),0.1M GC-Melt(Clontech Laboratories,USA)和0.5单位Taq DNA聚合酶(5U/μl；Advanced Biotechnologies,UK)。
使用的PCR热循环条件与主平板筛选所用的条件相同。在含有溴化乙锭的2％琼脂糖凝胶上分析96个独立的PCR反应，鉴定出给出102bp PCR片段的阳性孔。
菌落PCR：用Luria肉汤(LB)将1ml得自阳性次平板孔的甘油原种稀释100倍，然后将1ml和10ml上述稀释液铺于2个含有Luria肉汤(LB)和100μg/ml羧苄青霉素的独立琼脂平板上，于30℃将LB平板保温过夜。从这些平板中挑选出96个菌落，置于新的96孔PCR板的孔中，每孔的终体积为25μl，其中含有0.2mM上述两种基因-特异性引物，1×标准的PCR缓冲液(Buffer V,Advanced Biotechnologies,UK),0.2mM dNTP(Amersham-Pharmacia),0.1M GC-Melt(ClontechLaboratories,USA)和0.5单位Taq DNA聚合酶(5U/μl；AdvancedBiotechnologies,UK)。
使用的PCR热循环条件与主平板筛选所用的条件相同。在含有溴化乙锭的2％琼脂糖凝胶上分析96个独立的PCR反应，随后鉴定出含有102bp片段的阳性菌落。
对由该阳性菌落制备的质粒DNA进行测序，显示出861bp的全长cDNA[SEQ ID NO:8]。该cDNA编码前-neublastin原[SEQ ID NO:9]。使用BigDye终止循环测序试剂盒(PE Applied Biosystems,USA)进行自动化的DNA测序。在ABI Prism 377(PE Applied Biosystems,USA)上电泳测序凝胶。方法2：从人脑中克隆neublastin cDNA:
通过联合使用RACE(快速扩增cDNA末端)，上文所述的neublastin-特异性引物NBNint.sence和NBNint.antisence，以及载体-特异性或衔接子-特异性引物，例如通过使用Marathon cDNA扩增试剂盒(Clontech Laboratories,USA,Cat.No.K1802-1)，可实施扩增全长neublastin cDNA或cDNA片段的另一种方法。
使用整个人脑Marathon-Ready cDNA(Clontech Laboratories,USA,Cat.No.7400-1)扩增全长neublastin cDNA。扩增所用的引物包括neublastin上链引物5’-ATGGAACTTGGACTT GG-3’[SEQ IDNO:19](“NBNext.sence”)，和neublastin下链引物5’-TCCATCACCCACCGG C-3’[SEQ ID NO:20](“NBNext.antisence”)，以及包含在Marathon-Ready cDNA中的衔接子引物AP1。也可使用另一种上链引物，5’-CTAGGAGCCCATGCCC-3’[SEQ ID NO:28]。也可使用另一种下链引物5’-GAGCGAGCCCTCAGCC-3’[SEQ ID NO:33]。类似地，也可使用另一种下链引物SEQ ID NO:24和26。方法3：从人脑中克隆neublastin cDNA:
克隆neublastin cDNA的另一种方法是通过用本文所述的一种或多种neublastin探针筛选成人或胎儿的脑文库(如图1所例举)。这些文库包括：λgt11人脑(Clontech Laboratories,USA,Cat.No.HL3002b)；或λgt11人胎脑(Clontech Laboratories,USA,Cat.No.HL3002b)。方法4：快速筛选小鼠胎cDNA中的neublastin基因
按下述方法进行快速筛选neublastin基因的方案。96孔主平板含有500,000个cDNA克隆的质粒DNA，每孔上样约5000个克隆。96孔次平板使用的是大肠杆菌甘油原种，每孔含有50个克隆。进行3轮PCR-介导的扩增以鉴定出感兴趣的基因(即neublastin)。
主平板筛选：使用基因-特异性引物，通过96-孔PCR筛选小鼠胎cDNA主平板以分离小鼠neublastin cDNA。合成下列两个引物：
(1)neublastin C2引物(NBNint.sence):5’-GGCCACCGCTCCGACGAG-3’[SEQ ID NO:21]；和(2)neublastin C2as引物(NBNint.antisence):5’-GGCGGTCCACGGTTCTCCAG-3’[SEQID NO:22]。通过使用这两个基因-特异性引物，鉴定出220bp的阳性PCR产物。220bp核酸具有下列序列[SEQ ID NO:14]:5′-GGCCACCGCTCCGACGAGCTGATACGTTTCCGCTTCTGCAGCGGCTCGTGCCGCCGAGCACGCTCCCAGCACGATCTCAGTCTGGCCAGCCTACTGGGCGCTGGGGCCCTACGGTCGCCTCCCGGGTCCCGGCCGATCAGCCAGCCCTGCTGCCGGCCCACTCGCTATGAGGCCGTCTCCTTCATGGACGTGAACAGCACCTGGAGAACCGTGGACCGCC-3′
然后按下列方法进行96孔PCR反应。从主平板的相应孔中得到30纳克小鼠胎脑cDNA(6gng/l；Origene Technologies)，将其置于总体积为25μl的溶液中，所述溶液含有下列试剂：0.2mM上述两种基因-特异性引物(即C2引物(NBNint.sence)和neublastin C2as引物(NBNint.antisence)),1×标准的PCR缓冲液(Buffer V,Advanced Bio-technologies,UK),0.2mM dNTP(Amersham-Pharmacia),0.1M GC-Melt(Clontech Laboratories,USA)和0.5单位Taq DNA聚合酶(5U/μl；Advanced Biotechnologies,UK)。
使用下列PCR热循环条件：起初使DNA于94℃变性3分钟，然后按下述进行35轮循环：94℃变性1分钟，55℃退火1分钟，72℃延伸90秒；72℃最终延伸5分钟。在含有溴化乙锭染料的2％琼脂糖凝胶上分析96个独立的PCR反应。由一个孔中得到的220bp阳性PCR产物对应于独特的96孔次平板。在含有溴化乙锭染料的2％琼脂糖凝胶上分析96个独立的PCR反应。鉴定出的220bp阳性PCR产物对应于96孔次平板特有的孔。
次平板筛选：将1μl得自相应次平板孔的甘油原种置于最终总体积为25μl的溶液中，经PCR-介导的扩增筛选96孔小鼠胎次平板，所述溶液含有：0.2mM上述两种基因-特异性引物，1×标准的PCR缓冲液(Buffer V,Advanced Biotechnologies,UK),0.2mM dNTP(Amersham-Pharmacia),0.1M GC-Melt(Clontech Laboratories,USA)和0.5单位Taq DNA聚合酶(5U/μl；Advanced Biotechnologies,UK)。使用的PCR热循环条件与上文所述的主平板筛选所用的条件相同。
在含有溴化乙锭的2％琼脂糖凝胶上分析96个独立的PCR反应，鉴定出产生220bp片段的阳性孔。
菌落PCR：用Luria肉汤(LB)将1ml得自阳性次平板孔的甘油原种稀释100倍，然后将1ml和10ml上述稀释液铺于2个含有100μg/ml羧苄青霉素的独立LB平板上，于30℃保温过夜。总共分离出96个菌落，将这些菌落转移至96孔PCR板的孔中，每孔的终体积为25μl，其中含有0.2mM上述两种基因-特异性引物，1×标准的PCR缓冲液(Buffer V,Advanced Biotechnologies,UK),0.2mM dNTP(Amersham-Pharmacia),0.1M GC-Melt(Clontech Laboratories,USA)和0.5单位Taq DNA聚合酶(5U/μl；Advanced Biotechnologies,UK)。
使用的PCR热循环条件与主平板筛选所用的条件相同。在含有溴化乙锭的2％琼脂糖凝胶上通过凝胶电泳分析96个独立的PCR反应，通过220bp片段的存在鉴定出阳性菌落。由该阳性菌落制备质粒DNA，使用具有AmpliTaq DNA聚合酶的BigDye终止循环测序试剂盒对克隆进行自动化的DNA测序。在ABIPrism 377(PE Applied Biosystems,USA)上电泳测序凝胶。所得克隆序列显示出2136bp的全长cDNA[SEQ ID NO:15]。此cDNA包括具有SEQID NO:16所示的推测氨基酸序列的开放阅读框，其编码小鼠前-neublastin原多肽。实施例2：克隆基因组neublastin
如上文所讨论，申请人在两个登录至GenBank的人BAC克隆(登记号为AC005038和AC005051)中鉴定出290bp的核酸片段，该片段具有与persephin和persephin的侧翼序列同源的区域。申请人使用上文所述的861bp推测序列设计出其它引物，目的是使用LasergeneSoftware(DNAStar公司)克隆出编码其它neublastin核酸的核酸。通过对基因组DNA进行PCR反应，使用两对引物克隆neublastin基因。这两对引物如下。1号引物对：5’CCA AgC CCA CCT ggg TgC CCT CTT TCT CC 3’(有义)[SEQ IDNO:23]5’CAT CAC CCA Ccg gCA ggg gCC TCT Cag 3’(反义)[SEQ IDNO:24]。2号引物对：5’gAgCCCAtgCCCggCCTgATCTCAgCCCgAggACA 3’(有义)[SEQ IDNO:25]5’CCCTggCTgAggCCgCTggCTAgTgggACTCTgC 3’(反义)[SEQ IDNO:26]。
使用1号引物对，由购自Clontech Laboratories(Cat.No.6550-1)的人基因组DNA制品扩增887bp DNA片段。
PCR方案：使用具有缓冲液1的ExpandTM High Fidelity PCR系统(Boehringer Mannheim)进行PCR。总体积为50μl的PCR反应混合物中添加有5％二甲基亚砜(DMSO)和17.5pmol各种dNTP。热循环反应为94℃预-变性2分钟，接着进行35轮94℃10秒和68℃1分钟的两-步循环。通过于68℃保温5分钟终止热循环。在PTC-225 DNAEngine Tetrad热循环仪(MJ Research,MA)中进行热循环。通过在2％琼脂糖(FMC)上进行凝胶电泳来分析PCR产物，然后进行照相。
将用1号引物对扩增自人基因组DNA的887bp片段克隆至pCRⅡ载体(Invitrogen)，并转化至XL 1-Blue感受态大肠杆菌细胞(Stratagene)。所得质粒被称为neublastin-2，使用热测序酶(AmershamPharmacia Biotech)对该质粒测序。通过在ALFExpress自动测序仪(Amer-sham Pharmacia Biotech)上电泳来分析测序产物。
对用第二对引物(上述1号引物对)PCR扩增人基因组DNA得到的片段进行测序，显示出位于开放阅读框3’引物末端的额外的42bp区域。通过将此全长序列与其它神经营养因子的核酸序列相比较，以及使用寻找基因的软件程序作图外显子-内含子边界序列来分析此全长序列，所述程序可使用Netgene和Gene Mark软件(Brunak等，分子生物学杂志，1991,220 49-65；Borodovsky等，核酸研究，1995,23,3554-62)鉴定适当的剪接接头和具有高编码潜力的区域。通过得自上述快速筛选的cDNA进一步证实外显子-内含子边界序列。
如图7所示，所得neublastin基因具有两个被70bp内含子分开的外显子。总之，外显子具有全长Neublastin多肽的推测氨基酸序列。推测的cDNA[SEQ ID NO:3]含有编码238个氨基酸残基[SEQ ID NO:4]的开放阅读框(ORF)。Neublastin-2克隆含有neublastin原的完整编码序列。由此基因编码的氨基酸序列显示出与3个蛋白质，presephin,neublastin和GDNF具有高同源性。实施例3：表达neublastin核酸
使用下述技术检测啮齿类动物和人的神经和非-神经组织，以及多个发育不成熟和成年阶段的neublastin RNA表达。
使用RT-PCR检测Neublastin RNA表达的方法：根据SEQ IDNO:1所鉴定的neublastin DNA序列，合成了下列引物：(1)neublastinC2引物：5’-GGCCACCGCTCCGACGAG-3’[SEQ ID NO:21]；和(2)neublastin C2as引物：5’-GGCGGTCCACGGTTCTCCAG-3’[SEQID NO:22]。使用该套引物由成人和胎儿全脑mRNA RT-PCR扩增DNA片段，通过此反应产生的DNA片段中有一个为220bp。鉴定该220bpDNA片段，结果表明成人和胎儿脑组织中表达了neublastin基因。使用这些引物从基因组DNA中也扩增到220bp DNA片段。通过Northern印迹杂交检测Neublastin RNA表达的方法：
具有成人组织的polyA+RNA的Northern印迹购自厂商(ClontechLaboratories,USA)，并用32P-标记的neublastin cDNA作探针与其杂交。根据上文实施例1所述的方法制备经标记的neublastin cDNA。
制备探针：按照厂商的说明，使用Rediprime Ⅱ标记试剂盒(Amersham；Cat.No.RPN1633)标记neublastin核酸DNA片段(SEQ IDNO:8的核苷酸296-819)以用作杂交探针。简单地说，用10mM TE缓冲液(10mM Tris-HCl,pH8.0,1mM EDTA)稀释DNA样品至浓度为2.5-25ng/45μl。然后在开水浴中将样品加热至95-100℃达5分钟，将其置于冰上放5分钟以快速冷却样品，简单离心使内容物沉至反应管底部，从而使DNA变性。在反应管中加入上述所有变性的DNA以及5μl Redivue[32P]dCTP(Amersham Pharmacia Biotech Ltd)，该反应管中还同时含有dATP,dGTP,dTTP的缓冲溶液，干燥的稳定化形式的无外切核酸酶的Klenow酶和随机引物。通过用移液管上下抽吸2次，用移液管搅动溶液以混合溶液，于37℃将反应混合物保温10分钟。通过加入5μl 0.2M EDTA终止标记反应。为了用作杂交探针，通过将DNA样品加热至95-100℃达5分钟，然后将其置于冰上放5分钟以快速冷却DNA样品，从而使经标记的DNA变性为单链。离心试管，充分混合其内容物。最后，使用Nucleotide Removal试剂盒(Qiagen)纯化单链DNA探针。
杂交技术：制备的Northern印迹购自厂商(“多组织Northern印迹”，Clontech Laboratories,USA,Cat.No.7760-1和7769-1)，根据厂商说明，使用上文所制备的neublastin 32P-标记的探针与所述印迹杂交。为了进行杂交，使用了ExpressHyb溶液(Clontech Laboratories,USA)和浓度约为3ng/ml的经标记探针。将ExpressHyb溶液加热至68℃，然后搅拌以溶解任何沉淀物。根据厂商说明，于68℃，在Hybaid杂交烘箱中的至少5ml ExpressHyb溶液中将每个Northern印迹膜(10×10cm)预-杂交30分钟。于95-100℃放置2分钟使neublastin 32P-标记的探针变性，然后在冰上快速冷却。在5ml新鲜的ExpressHyb中加入14μl经标记的探针并彻底混合。预-杂交中所用的ExpressHyb溶液被5ml均匀分布于印迹膜的含有经标记探针的新鲜ExpressHyb溶液所替代。于68℃，在Hybaid杂交烘箱中将印迹保温1小时。保温后，在低严紧度(含有0.05％SDS的2×SSC缓冲液，室温)下将印迹冲洗和洗涤几次，接着在高严紧度(含有0.1％SDS的0.1×SSC,50℃)[20×SSC是0.3M NaCl/0.3M柠檬酸钠，pH7.0]下洗涤。于-80℃,使用增感屏将印迹暴露于Hyperfilm MP(Amersham PharmaciaBiotech Ltd.)。
Northern印迹杂交实验的结果示于图1。图1A(左)和图1B(右)是按实施例3所述与32P-标记的neublastin cDNA探针杂交的polyA+RNANorthern印迹。标记物表示大小为1.35千碱基对(“kb”),2.4kb,4.4kb,7.5kb和9.5kb的多核苷酸。用提取自多种成人组织的mRNA制备图1A的膜。由Northern印迹杂交分析的结果，申请人得出结论：很多成人组织中都表达neublastin mRNA。在心脏，骨骼肌和胰腺中检测到最高水平的neublastin表达。用提取自成人脑的多个区域的RNA制备图1B的膜。在成人脑中，尾状核和丘脑中的表达水平最高。在脑中，约5kb的mRNA转录物是主要表达的neublastin mRNA形式。使用原位杂交检测组织中的neublastin RNA表达的方法：
使用以下技术，用neublastin反义探针测定动物组织，例如啮齿动物组织中的neublastin RNA表达。在小鼠中的表达：
制备组织样品：在怀孕第13.5或18.5天，通过颈脱位处死怀孕小鼠(B&K Universal,Stockholm,Sweden)。在无菌条件下解剖，取出胚胎，立即浸入含有4％低聚甲醛(“PFA”)的0.1M磷酸盐缓冲液(PB)中达24至30小时，然后从PFA中取出并储存于PBS中。通过将组织浸入30％蔗糖溶液，然后在TissueTech(O.C.T.Compound,SakuraFinetek USA,Torrance,CA)中包埋该组织即可制备出切片用的组织。在低温恒温器上切下6个冠状或矢状切片(各为12μm)系列，并融化固定在带正电的玻片上。在实施与胚胎阶段相同的方案之后，固定新生儿的头/脑(P1,P7)，解剖成年脑组织，立即在干冰中冻干，无需包埋即可在低温恒温器上进行切片。
制备neublastin Riboprobe：按下述制备反义neublastin RNA探针(下文称之为neublastin riboprobe)。将小鼠neublastin cDNA序列的核苷酸1109-1863[SEQ ID NO:15]亚克隆至BlueScript载体(Stratagene)。使用EcoRⅠ限制性内切核酸酶将所得质粒切割成线性DNA。根据厂商(Boehringer Mannheim)说明，使用T3 RNA聚合酶和地高辛配基(“DIG”)RNA标记试剂盒体外转录EcoRⅠ DNA片段。
杂交：在4％PFA中将低温恒温器切片固定10分钟，用10mg/ml蛋白酶K处理5分钟，依次分别用70％和95％乙醇脱水5和2分钟，然后风干。将含有1μg/ml DIG-标记探针的杂交缓冲液(50％去离子化的甲酰胺，50％葡聚糖硫酸酯溶液中的10％,1％ Denhardt溶液，250μg/ml酵母tRNA,0.3M NaCl,20mM Tris-HCl(pH8),5mM EDTA,10mM NaPO4,1％十二烷基肌氨酸钠)加热至80℃达2分钟，并应用于切片上，然后用石蜡膜覆盖切片，于55℃保温16至18小时。
第二天，于55℃，在高严紧度(含有50％甲酰胺的2×SSC)下洗涤切片30分钟，然后用RNA酶缓冲液洗涤，并于37℃与20μg/ml RNA酶A保温30分钟。为了检测DIG-标记的探针，在封闭溶液(含有0.1％吐温-20和10％热-灭活的山羊血清的PBS)中将切片预保温1小时，然后于4℃与按1∶5000稀释的碱性磷酸酶-偶联的抗-DIG抗体(Boehringer Mannheim)保温过夜。第二天，用含有0.1％吐温-20的PBS将每个切片洗涤4次，每次2小时，然后用NTMT缓冲液(100mM NaCl,100mM Tris-HCl(pH9.5),50mM MgCl2,0.1％吐温-20)洗涤2次，每次10分钟。然后在含有0.5mg/ml levamisole的BM-紫色底物中将切片保温48小时。通过用PBS洗涤以终止颜色反应，风干切片，用具有DPX的封套(KEBO-lab,Sweden)覆盖切片。
原位杂交反应的结果示于表1。表1：在小鼠中表达neublastin结构              E13.5   E18.5   P1   P7    成年的前脑               ++前侧中脑           -侧根神经节         ++脊髓               +视网膜                     +++   +++    +嗅球                       ++    ++     ++牙髓                       ++    ++     +三叉神经的神经节           ++    ++     ++纹状体                     +     +      ++皮质                       ++    ++     ++    +齿状回                                  ++    +
如表1所示，在第13.5天胚胎期(“E13.5”)，脊髓和后脑中表达了neublastin，前脑中仅有微弱表达。在发育中的视网膜和感觉神经节(侧根神经节和三叉神经的神经节(V))中也检测到neublastin表达。除神经系统外，在肾，肺和肠中发现了微弱信号，这表明这些组织中也表达neublastin。
在第18.5天胚胎期(“E18.5”)，三叉神经神经节(V)中的neublastin表达最为显著，也在视网膜，纹状体和皮质中检测到neublastin表达。另外，还在牙髓中观察到表达。
参照表1，在皮质，纹状体和三叉神经神经节(V)中，由E18.5时间点至出生后第1和7天，neublastin的表达逐步增加。皮质外层的neublastin表达比皮质内层更加显著。在P7天，有表达的结构与P1天的相同，但另外还在海马，尤其是齿状回和小脑中发现了neublastin表达。在成年的鼠脑中，neublastin在齿状回中大量表达，而在受试的其它组织中仅检测到很低或不可测水平的neublastin表达。在大鼠中表达：
下列实验描述了大鼠组织与碱性磷酸酶-标记的寡脱氧核苷酸neublastin反义探针的杂交。
制备组织样品：用戊巴比妥麻醉之后，由怀孕的Wistar大鼠(Mollegaard Breeding,Denmark)得到大鼠胚胎(E14)。通过断头杀死出生后的大鼠(P0,P7，成年)。立即将解剖的脑和整个头浸入冷的0.9％NaCl中，新鲜冷冻并在低温恒温器上切片成20μm(冠状或矢状切片，10个系列)。
原位杂交：使用反义碱性磷酸酶(AP)缀合的寡脱氧核苷酸探针(5’-NCAGGTGGTCCG TGGGGGGCGCCAAGACCGG-3’[SEQ IDNO:27],Oligo.No.164675,DNA Technology,Denmark)杂交两个切片系列。所述探针与SEQ ID NO:15所示小鼠neublastin cDNA的碱基1140至1169互补。
在杂交之前，室温风干切片，加热至55℃10分钟，然后于4℃用96％乙醇处理过夜。然后风干切片，于39℃在杂交介质(5.0pmol探针/m1)中保温过夜(Finsen等，神经科学，1992,47,105-113；West等，J.Comp.Neurol,1996,370,11-22)。
杂交后的处理包括：于55℃用1×SSC(0.15M NaCl,0.015M柠檬酸钠)冲洗4次，每次30分钟，接着在室温下用Tris-HCl,pH9.5冲洗3次，每次10分钟，然后使用AP显色剂。AP显色剂即用即制，其含有氮蓝四唑(NBT,Sigma),5-溴,4-氯,3-吲哚磷酸(BCIP,Sigma)和Tris-HCl-MgCl2缓冲液，pH9.5(Finsen等，神经科学，1992,47,105-113)。室温下，在黑暗中进行AP显色48小时。通过用蒸馏水冲洗切片来终止颜色反应。在梯度丙酮中使切片脱水，用二甲苯-苯酚木溜油(Allchem,UK)使其软化，用二甲苯清洗，并使用Eukitt(Bie & Berntsen,Denmark)覆盖一层封套。
对照反应包括(1)在杂交前用RNA酶A(50μg/ml,Pharmacia,Sweden)预-处理切片；(2)用过量100倍的未经标记的探针与切片杂交；和(3)仅用杂交缓冲液与切片杂交。杂交反应的结果示于表2。表2：在大鼠中表达neublastin结构                 E14    P0/P1    P7    成年的前脑                 ++前侧中脑             -侧根神经节           ++脊髓                 +视网膜               +嗅球                (+)      ++      ++小脑                         +       ++       +三叉神经的神经节             ++      ++纹状体                       +       +(+)皮质                (+)      ++      ++       +海马                         (+)     ++       ++
在第14天胚胎期(E14),neublastin在大鼠胚胎的前脑，后脑和脊髓中微弱表达。在眼(视网膜)，侧根神经节，三叉神经神经节(V)和肾，肺，心脏，肝脏和肠中也检测到neublastin mRNA。在新生(P0)大鼠中，皮质和纹状体中的neublastin表达显著。在嗅球和海马中也检测到neublastin表达。在7天龄(P7)大鼠中，皮质，纹状体，嗅球和小脑表达了neublastin。在海马中发现了显著的信号。在成年大鼠中，在脑的大多数区域检测到很低或不可测的neublastin表达水平。在丘脑核中检测到微弱信号，在海马中检测到显著的neublastin表达。实施例4：neublastin多肽
在SEQ ID NO:8中鉴定的开放阅读框或编码区(CDS)编码前-多肽原(称为“前neublastin原”)。由此开放阅读框推测的氨基酸序列示于SEQ ID NO:9，鉴定了3个neublastin多肽变体，这些变体包括：(ⅰ)本文称为NBN140的多肽，其具有SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列；(ⅱ)本文称为NBN116的多肽，其具有SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列；和(ⅲ)本文称为NBN113的多肽，其具有SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列。
类似地，根据SEQ ID NO:3中鉴定的编码区(CDS)编码具有SEQID NO:4所示氨基酸序列的前-多肽原，鉴定了3个neublastin变体，这些变体包括：(ⅰ)具有SEQ ID NO:5所示氨基酸序列的多肽；(ⅱ)具有SEQ ID NO:6所示氨基酸序列的多肽；和(ⅲ)具有SEQ ID NO:7所示氨基酸序列的多肽。
根据基于Clustal W(1.75)的多序列对比，将SEQ ID NO:9与GDNF,persephin和neurturin的氨基酸序列相比较。对比结果示于表3。表3：neublastin与persephin,neurturin和GDNF的氨基酸序列比较Neurturin-full  --------------------MQRWKAAALASVLCSSVLSIWMCREGLLLSHRLGPANeublastin      MELGLGGLSTLSHCPWPRRQPALWPTLAALALLSSVAEASLGSAPRSPAPREGPPPPersephin-full  --------------------------------------------------------GDNF_HUMAN-full -----MKLWDVVAVCLVLLHTASAFPLPAGKRPPEAPAEDRSLGRRRAPFALSSDSNeurturin-full  LVPLHPLPRTLDARIARLAQYRALLQGAPDAMELRELTPWAGRPPGPRRRAGPRFRNeublastin      VLASPAGHLPGGRTARWCSGRARRPPPQPSRPAPPPPAPPSALPRGGRAARAGGPGPersephin-full  -MAVGKFLLGSLLLLSLQLGQGWGPDARGVPVADGEFSSEQVAJAGGTWLGTHRPLGDNF_HUMAN-full NMPEDYPDQFDDVMDFIQATIKRLKRSPDKQMAVLPRRERNRQAAAANPENSRGKGNeurturin-full  RARARLGARPCGLRELEVRVSELGLGYASDETVLFRYCAGACEA-AARVYDLGLPRNeublastin      SRARAAGARGCPLRSQLVPVRALGLGHRSDELVRFRFCSGSCRR-ARSPHDLSLASPersephin-full  ARLRRALSGPCQLWSLTLSVAELGLGYASEEKVIFRYCAGSCPRGARTQHGLALARGDNF_HUMAN-full RRGQRGKNRGCVLTAIHLNVTDLGLGYETKEELIFRYCSGSCDA-AETTYDKILKN
                      * *    : *  ****: :.* : **:*:*:*   *   :.  *Neurturin-full  LRQRRRLRRE---RVRAQPCCRPTAYEDEVSFLDAHSRYHTVHELSARECACV-Neublastin      LLGAGALRPPPGSRPVSQPCCRPTRYE-AVSFMDVNSTWRTVDRLSATACGCLGPersePhin-full  LQGQGG------------PCCRPTRYT-DVAFLDDRHRWQRLPQLSAAACGCGGGDNF_HUMAN-full LSRNRRLVSD----KVGQACCRPIAFDDDLSFLDDNLVYHILRKHSAKRCGCI-
                              .****  :   ::*:* .  :: : . **  *.**表示具有单个完全保守残基的位置；：表示下列“强(strong)”组之一是完全保守的：-STA,NEQK,NHQK,NDEQ,QHRK,MILV,MILF,HY,FYW；·表示下列“较弱(weaker)”组之一是完全保守的：-CSA,ATV,SAG,STNK,STPA,SGND,SNDEQK,NDEQHK,NEQHRK,VLIM,HFY。
由表3所示的氨基酸序列对比可以看出：neublastin有7个保守的半胱氨酸残基，它们位于TGF-β超家族保守的位置处。在一个实施方案中，优选的neublastin多肽含有(7个)保守的半胱氨酸，在SEQ IDNO:2中，保守位置为第8,35,39,72,73,101和103位，而在SEQ IDNO:4和9中，保守位置为第43,70,74,107,108,136和138。已知这7个保守的半胱氨酸残基在TGF-β超家族形成3个单体内二硫键(例如，在SEQ ID NO:2中为半胱氨酸残基8-73,35-101和39-103之间的二硫键，而在SEQ ID NO:4和9中为半胱氨酸残基43-108,70-136和74-138之间的二硫键)和1个单体间二硫键(在SEQ ID NO:2中为半胱氨酸残基72-72之间的二硫键，而在SEQ ID NO:4和9中为半胱氨酸残基107-107之间的二硫键)，它们与延伸的β链区域一起构成了TGF-β超家族保守的结构基元，例见Daopin等，蛋白质，1993,17,176-192。
根据此序列对比，表明neublastin是神经营养因子GDNF亚族的成员(LGLG-FR(Y/F)CS GSC-QxCCRP-SAxxCGC，表3中下划线的GDNF亚族指纹)。
计算neublastin与GDNF家族其它成员的同源性，结果示于下表4。
表4：neublastin多肽与GDNF家族其它成员的同源性
成熟蛋白质NBN140 成熟蛋白质NBN113
同源性 全长肽的同源性 同源性 全长肽的同源性
神经营养因子 同一性 重叠(aa) 强同源性 同一性 同一性  重叠  强同源(aa)    性 同一性
 GDNFNTNPSPIHATGF-β2  34％    137    48％(47/137)       (67/137)48％     127    56％(61/127)       (72/127)44％     125    56％(55/125)       (71/125)31％     81       -(25/81)23％     73       -(17/73) 31.9％36.9％36.925.2％18.5％ 36％    111    52％(41/111)      (59/111)49％    114    57％(56/114)      (66/114)45％    111    57％(51/111)      (65/111)31％     81       -(25/81)23％     73       -(17/73) 29.5％44.7％44.3％22.5％20.2％
GDNF=得自胶质细胞系的神经营养因子NTN=NeurturinPSP=PersephinIHA=抑制素-αTF-β2=转化生长因子-β2强同源性表明下列“强(strong)”组之一是保守的：STA,NEQK,NHQK,NDEQ,QHRK,MILV,MILF,HY,FYW。实施例5：生产neublastin
如下文所述，我们在真核和原核细胞中生产出neublastin。
表达载体：将编码neublastin的全长cDNA插入真核表达载体pUbi1Z。该载体是通过将人UbC启动子克隆至pcDNA3.1/Zeo的经修饰形式而产生的。未经修饰的pcDNA3.1/Zeo可以商购(Invitrogen)。经修饰的pcDNA3.1/Zeo比原始载体小，因为除去了氨苄青霉素基因(第3933至5015位)和第2838至3134位的序列。在pcDNA3.1/Zeo的经修饰形式中，CMV启动子被得自pTEJ-8的UbC启动子(Johansen等，FEBS Lett,1990,267,289-294)取代，产生pUbi1Z。
哺乳动物细胞表达：然后用含有neublastin编码序列的pUbi1Z载体转染哺乳动物细胞系HiB5，该细胞系是无限增殖化的大鼠神经细胞系(Renfranz等，细胞，1991,66,713-729)。已建立了几株能稳定表达neublastin(通过RT-PCR测定)的HiB5细胞系。在一个这样的稳定细胞系中，通过在Northern印迹上使总RNA与32P-标记的neublastin探针杂交，证实了HiB5pUbi1zNBN22的表达。这些研究的结果示于图2。然后将HiB5pUbi1zNBN22用作neublastin的来源以研究neublastin的神经营养活性。
图2显示了HiB5pUbi1zNBN22克隆中的neublastin cDNA表达(即按上文所述用本发明的32P-标记的neublastin cDNA与Northern印迹杂交)。通过分别从未经转染的HiB5细胞，HiB5pUbi1zNBN22细胞和HiB5pUbi1zGDNF14中提取总RNA来制备印迹。如印迹上所示，28S和18S rRNA带的位置分别相当于4.1kb和1.9kb。
如图3所示，针对neublastin-衍生多肽产生的抗体还识别HiB5pUbi1zNBN22克隆而不是未经转染的HiB5细胞的条件培养基中约13kD的蛋白质(参见实施例6)。
经测定，未经修饰(即未经翻译后修饰)的neublastin多肽NBN140[SEQ ID NO:10],NBN116[SEQ ID NO:11]和NBN113[SEQ IDNO:12]的推测分子量分别为14.7kD,12.4kD和12.1kD。
方法：在0.8％甲醛琼脂糖凝胶上电泳得自未经转染的HiB5细胞和HiB5pUbi1zNBN22克隆的总RNA(10μg)，将其印迹至尼龙膜(Duralone,Stratagene)上，从而制备出Northern印迹。按实施例3所述，使印迹与1.3kb32P-标记的探针杂交并洗涤，所述探针是通过随机标记覆盖SEQ ID NO:8和得自neublastin cDNA之5’UTR和3’UTR的另一些核苷酸而制备的。于-80℃，使用增感屏将印迹暴露于Hyperfilm MP(Amersham)。
在添加有N2补充物(Life Technologies；Cat.No.17502-048)的无血清培养基中将得自HiB5pUbi1zNBN22或未经转染的HiB5细胞的条件培养基保温过夜，浓缩该条件培养基，在15％聚丙烯酰胺凝胶(Amersham Pharmacia Biotech；Cat.No.80-1262-01)上进行分离。将蛋白质转移至PVDF-膜(Amersham Pharmacia Biotech；Cat.No.RPN-303F)上，用含有0.1％吐温20和5％脱脂奶的PBS封闭非-特异性蛋白质-结合位点。将膜与多克隆的neublastin抗体(1∶1000)保温过夜，接着与抗-兔IgG第二抗体(Amersham Pharmacia Biotech；Cat.No.NA934)(1∶2000)保温，所述第二抗体上缀合有辣根过氧化物酶。根据厂商说明(Amersham)，使用增强的化学发光(ECL)(Amersham PharmaciaBiotech；Cat.No.RPN2109)或ECL+(Amersham Pharmacia Biotech；Cat.No.RPN2132)观察免疫染色。
这些实验的结果示于图3。图3A和3B显示了经转染的HiB5细胞中的neublastin蛋白表达。按上文所述浓缩得自未经转染的HiB5细胞[泳道1]，或被neublastin cDNA稳定转染的HiB5克隆[泳道2]的过夜培养基。然后使用实施例10中所述的两个特异于neublastin的不同多克隆抗体Ab-1和Ab-2，经Western印迹分析培养基。在源自经转染细胞的培养基中，这两种抗体都能识别分子量约为15kDa的蛋白质，而在未经转染的HiB5细胞中未发现这种蛋白质。
也可将编码neublastin的克隆cDNA插入其它真核表达载体，例如真核表达载体TEJ-8(Johansen等，FEBS Lett.1990,267,289-294)或pcDNA-3(Invitrogen)，将所得表达质粒转染至下述任一种哺乳动物细胞系，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，HEK293,COS,PC12或RN33b细胞系或人神经干细胞系。使用表达neublastin的稳定细胞系产生neublastin蛋白。在CHO细胞中表达
构建质粒pJC070.14为了在中国仓鼠卵巢细胞中表达NeublastincDNA，将编码人前Neublastin原形式的cDNA片段插入哺乳动物表达载体pEAG347以产生质粒pJC070.14。pEAG347含有串联的SV40早期和腺病毒主要晚期启动子(衍生自质粒pAD2β；Norton和Coffin，分子细胞生物学，1985,5,281)，唯一的NotⅠ克隆位点，紧接着的是SV40晚期转录终止子和polyA信号(得自质粒pCMVβ；MacGregor和Caskey，核酸研究，1989,17,2365)。另外，pEAG347含有源自pUC19的质粒骨架和源自pSV2dhfr的dhfr供MTX选择和在经转染的CHO细胞中扩增。
分两步产生质粒pJC070.14。首先，用寡核苷酸KD2-8245’AAGGAAAAAAGCGGCCGCCA TGGAACTTGG ACTTGGAGG3’[SEQ ID NO:31],KD2-8255’TTTTTTCCTT GGCGG CCGCTCAGCCCAGGC AGCCGCAGG3’[SEQ ID NO:32]和PFU聚合酶，经聚合酶链反应从质粒pUbi1Z-NBN中分离出编码人前Neublastin原形式的片段。将该片段克隆至pPCR-Script Amp SK(+)的Srf-1位点以产生质粒pJC069。在第二步中，对质粒pJC069进行部分Not-Ⅰ消化，产生685bp片段(含有neublastin基因)，将其克隆至质粒pEAG347的Not-Ⅰ位点，产生质粒pJC070.14。质粒pJC070.14中的neublastin基因转录受腺病毒主要晚期启动子的控制。
产生表达neublastin的CHO细胞系通过用限制性内切核酸酶Mlu-Ⅰ消化使200微克pJC070.14线性化。用苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)提取DNA，并用乙醇沉淀。将线性化的DNA重新悬浮于20mM HepespH7.05,137mM NaCl,5mM KCl,0.7mM Na2HPO4,6mM葡萄糖(HEBS)中，通过电穿孔(280V和960μF)导入～4E7 CHO dukx B1(dhfr-)细胞(p23)。电穿孔之后，将细胞返回添加有10％胎牛血清(FBS)的α+经改良的Eagle氏培养基(MEM)中培养2天。然后用胰蛋白酶消化细胞，重新铺于100mm平皿(100,000个细胞/皿)内的α-MEM(缺乏核糖和脱氧核糖核苷)中培养5天，所述培养基中添加有10％经透析的FBS。随后，以100,000个细胞/100mm平皿的密度使细胞分开，并在200nM氨甲蝶呤中选择。挑选抗性集落，刮至6孔培养板；使用下文所述的专用于neublastin的试验筛选得自各个克隆的条件培养基。将neublastin表达水平最高的12个克隆刮至T162培养瓶中，随后再进行分析。如图10所示，CHO细胞系产生25至50ng/ml neublastin。
neublastin的三元复合物试验我们使用Sanicola等(Proc NatlAcad Sci USA 1997 94 6238)所述的三元复合物试验的经改良形式分析CHO细胞系培养物的上清液中是否存在neublastin。
在此试验中，可评价GDNF-样分子介导RET之胞外结构域与多个共同-受体，GFRα1,GFRα2和GFRα3之间的结合的能力。RET的可溶性形式和共同受体以融合蛋白的形式产生。已有人描述了大鼠RET之胞外结构域和胎盘碱性磷酸酶(RET-AP)之间的融合蛋白，以及大鼠GFRα1(WO9744356；1997年11月27日，列入本文作为参考)的胞外结构域和人IgG1(rGFRα1-Ig)之Fc结构域之间的融合蛋白(Sanicola等，Proc NatlAcad Sci USA 1997 94 6238)。
为了产生鼠GFRα3之胞外结构域和人IgG1(mGFRα3-Ig)之Fc结构域之间的融合蛋白，将编码鼠RETL3之氨基酸1-359的DNA片段与含有人IgG1之Fc结构域的片段连接，克隆至表达载体pEAG347以产生质粒pGJ144。将质粒pGJ144转染至中国仓鼠卵巢细胞(CHO)，产生能生产融合蛋白的稳定细胞系，使用标准方法在A蛋白Sepharose免疫亲和柱上纯化该融合蛋白。简而言之，如果GDNF-样分子能在此试验中介导共同受体与RET的结合，那么，RET-AP融合蛋白可保留在平板上，使用碱性磷酸酶的化学发光底物可测定保留量。
用含有1μg/ml特异于人Fc的山羊抗体的50mM碳酸氢盐/碳酸盐，pH9.6将Dynex Microlite-1 ELISA板(Dynex Technologies)包被16小时。将ELISA板清空，加入300μl含有1％I-block(Tropix)的TBS/0.5％吐温-20(TBST)放置1小时。用TBST洗涤3次之后，在孔中加入100μl用条件培养基稀释过的1μg/ml rGFRα1-Ig或mGFRα3-Ig，所述条件培养基得自表达RET-AP融合基因的293 EBNA细胞。然后在竖行孔的上孔中加入100μl得自CHO neublastin克隆的条件培养基，每排孔往下进行2倍连续稀释，室温下保温1.5小时。然后用TBST将ELISA板洗涤3次，用200mMTris pH9.8,10mM MgCl2(CSPD缓冲液)洗涤2次。然后用含有425μM CSPD(Tropix)和1mg/ml Sapphire化学发光增强剂(Tropix)的CSPD缓冲液替代洗涤溶液，室温下保温30分钟。使用Dynatech发光计测定化学发光输出量。
在最初的实验中，我们研究了CHO细胞系所产生的neublastin是否能介导GFRα1或GFRα3与RET之胞外结构域的结合。如图11所示，当包括mGFRα3-Ig融合蛋白时，得自CHO细胞克隆#53的条件培养基在三元复合物试验中产生了强烈信号，但是，当包括rGFRα1-Ig融合蛋白时未观察到信号，这表明neublastin与GFRα3而不是GFRα1结合。这一行为将neublastin与GDNF清楚地区分开来；如图11所示，GDNF结合GFRα1而不是GFRα3。当检测得自胎盘CHO细胞系的条件培养基或纯粹的培养基时，用任一种共同受体融合蛋白都未观察到信号。
为了定量CHO细胞系中的neublastin表达水平，使用rGFRα1-Ig和浓度始于1ng/ml的GDNF绘制标准曲线。然后使用该标准曲线计算不同CHO细胞系的neublastin浓度；由5个CHO细胞系产生的水平示于图10。由于这一估计的根据是未经测试的假设，即GDNF和GFRα1之间的结合亲和性类似于neublastin和GFRα3之间的结合亲和性，因此这些水平仅是大致的数值。分析得自CHO细胞系上清液的neublastin
为了进一步分析由CHO细胞系产生的neublastin，使用GFRα3-Ig融合蛋白从培养基中提取蛋白质，并通过用针对neublastin肽的多克隆抗体进行Western印迹以分析这些蛋白质。
在第一个实验中，用结合于Sepharose珠上的mGFRα3-Ig提取neublastin。使用厂商(Pharmacia公司)建议的条件使mGFRα3-Ig与Sepharose珠结合。在1.0ml得自阴性对照CHO细胞系或得自生产neublastin的CHO细胞系#16的条件培养基样品中加入100μlmGFRα3-Ig-Sepharose。在摇动的平台上将悬浮液保温2小时。离心各悬浮液，除去上清液，然后用1.0ml 10mM HEPES,100mM NaCl,pH7.5洗涤3次。将各树脂重新悬浮于100μl 2×还原样品缓冲液中，加热至100℃达5分钟。将20μl样品缓冲液上清液和10μl分子量标准(FMC)上样于10-20％SDS-PAGE预制凝胶(Owl Scientific)的各孔中。以40mA的恒电流电泳凝胶72分钟。
为了进行Western印迹分析，在Hofer Scientific装置中，在10mMCAPS,10％甲醇，0.05％SDS,pH11.2的缓冲液系统内将蛋白质电印迹至硝酸纤维素滤膜(Schleicher和Schuell)(400mA恒电流，45分钟)。转移之后，从盒中取出硝酸纤维素滤膜，通过用含有0.1％Ponceau S的1％醋酸溶液染色60秒以用内眼观察分子量标记。将膜切成两节，通过在蒸馏水中轻轻搅动以除去过量的染料。4℃，用含有2％脱脂奶的TBS将膜封闭过夜。将两片膜各与两个经亲和纯化的抗-neublastin肽抗体(R30和R31)保温，所述抗体的浓度为1.0μg/ml，并且溶于含2％脱脂奶的TBS中。用TBS-吐温将膜洗涤3次，每次10分钟，然后与经1∶5000稀释的山羊抗-兔IgG-HRP缀合物(Biorad)保温30分钟。用TBS-吐温将膜洗涤3次，每次10分钟，用ECL底物(Amersham)显色。如图12所示，相对于用上述两种抗体在提取自阴性对照细胞系的蛋白质中所观察到的带(泳道1和3)而言，在提取自生产neublastin的CHO细胞系的蛋白质中检测到特异性的带(泳道2和4)。
较低的带的分子量约为13kD，可能表示neublastin的成熟结构域，该结构域是在裂解原-结构域之后产生的。所述裂解可以在前neublastin原蛋白的3个Arg-＿(如-RXXR↓-)残基中的任一个之后发生，从而分别产生SEQ ID NO:10,11或12所示的140AA,116AA或113AA形式。经测定，未经修饰(即未经翻译后修饰)的neublastin多肽NBN140[SEQ ID NO:10],NBN116[SEQ ID NO:11]和NBN113[SEQ IDNO:12]的推测分子量分别为14.7kD,12.4kD和12.1kD。需要进一步的分析以证实这些带的结构以及其它neublastin特异性带。
在第二个实验中，用ELISA板所捕获的hGFRα3-Ig提取neublastin。为了产生人GFRα3(WO97/44356；1997年11月27日，列入本文作为参考)的胞外结构域和人IgG1(hGFRα3-Ig)之Fc结构域之间的融合蛋白，将编码人GFRα3之氨基酸1-364的DNA片段与含有人IgG1之Fc结构域的片段连接，克隆至表达载体CH269 (Sanicola等，Proc Natl Acad Sci USA 1997 94 6238)。由此质粒编码的融合蛋白在293-Epstein-Barr病毒所编码的核抗原(EBNA)细胞中瞬时表达，使用标准方法在A蛋白Sepharose免疫亲和柱上纯化该融合蛋白。
4℃，用含有25mg/ml山羊抗人IgG(Fcγ片段特异性的；JacksonImmunulogics)的PBS(300ml/孔)将96孔培养板的6个孔包被过夜。室温下，用400ml含1％BSA的PBS将孔封闭1小时。用PBST(PBS+0.05％吐温20)洗涤3次，在每孔中加入300ml hGFRα3-Ig(10mg/ml，溶于含0.1％BSA的PBS中)。室温下将培养板保温1小时，轻轻振荡(每分钟振荡200下)以进行最大程度的结合。然后清空孔，用PBST再洗涤3次。在3个孔中各自加入250ml得自阴性对照CHO细胞系或得自生产neublastin的CHO细胞系#25的条件培养基。室温下将培养板保温3小时，轻轻振荡(每分钟振荡300下)，用PBST将孔再洗涤2次。在第一个孔中加入25ml非-还原性的Laemli上样缓冲液，将培养板快速振荡5分钟以洗脱结合的蛋白质(每分钟振荡1300下)。将内容物转移至下一个孔中，重复上述方法以洗脱第二和第三个孔中结合的蛋白质。加入b-巯基乙醇(终浓度为5％)之后，将样品煮沸5分钟，在10-20％聚丙烯酰胺凝胶上通过SDS-PAGE分析样品。
为了进行Western印迹，将蛋白质转移至硝酸纤维素滤膜上。用含有5％脱脂奶的PBST封闭和探测膜，并用PBST洗涤膜。与针对两个neublastin肽产生的多克隆抗体(R30和R31)(1ug/ml)反应，接着与HRP-缀合的山羊抗兔抗体(BioRad)反应之后，通过电化学发光检测neublastin。如图13所示，在提取自生产neublastin的CHO细胞系的蛋白质中检测到5条neublastin特异性带(泳道2)。较下方的两条带与在图12中所观察到的带非常相似；较下方的带可能也表示neublastin的成熟结构域，该结构域是在裂解原-结构域之后产生的。
随后，对图13中的带进行分析(数据未显示)，结果表明用PGNaseF使约为18kD的带去糖基化后，该带的大小等同于图13凝胶中最下HiB5pUbi1zNBN22细胞的条件培养基所发挥的作用。
制备培养物：在冷的Hanks缓冲盐溶液(HBSS)中，解剖得到大鼠E14胚胎的前侧中脑或脊髓。于37℃，在含有经无菌过滤的0.1％胰蛋白酶(Worthington)和0.05％DNA酶(Sigma)的HBSS中将组织块保温20分钟。然后用HBSS+0.05％DNA酶将组织块冲洗4次，使用1ml自动移液管解离。将悬浮液以600rpm离心5分钟，将沉淀物重新悬浮于血清条件培养基(SCM；含10％胎牛血清的DMEM)中。通过台盼蓝染料排除法评估细胞总数，以100,000个细胞/cm2的密度铺于用聚-L-赖氨酸包被的8孔槽载玻片(Nunc)上，评估多巴胺能神经元的存活；或者以200,000个细胞/cm2的密度铺于48孔培养板(Nunc)上以测定ChAT活性。于37℃，在SCM中，在5％CO2/95％O2和95％湿度的氛围下将细胞保温24至48小时，然后用添加有神经营养因子的无血清培养基(SFM)更换原培养基。
将评估多巴胺能神经元存活所用的细胞在SFM+营养因子中放置5天，然后用4％PFA固定5分钟，通过免疫组化染色酪氨酸羟化酶。
将测定ChAT活性的细胞在SFM中放置3天，然后用HBSS+0.1％Triton X-100裂解，立即在干冰中冷冻直至测定ChAT活性。
加入营养因子：由未经转染的HiB5对照或生产neublastin(HiB5pUbi1zNBN22)或GDNF(HiB5pUbi1zGDNF-L17)的HiB5收集条件培养基。通过对收集自细胞的条件培养基进行GDNF-ELISA测定，证实HiB5pUbi1zNBN22产生约20ng的GDNF/24小时/105个细胞。将各个细胞系与DMEM+1％FCS保温过夜，取出上清液，储存于-20℃待用。当加入细胞中时，用SFM将上清液稀释50倍。用HiB5对照上清液(1∶50)+纯化的重组大鼠GDNF(0.03-10ng/ml)处理各个孔。
这些实验的结果示于图4。如上文实施例5.1所述，图4A-4C显示出HiB5pUbi1zNBN22细胞分泌的neublastin在无血清培养基中对经培养的大鼠胚胎神经元，多巴胺能神经元，前侧中脑神经元存活的影响和对胆碱能颅神经运动神经元中的ChAT活性的影响。
图4A阐明了重组GDNF对ChAT活性(dpm/小时)之影响的剂量-反应曲线，所述活性是于DIV5在无血清培养物中测定的，所述培养物最初是由E14前侧中脑建立的[即HiB5；GDNF 0.03ng/ml；GDNF0.1ng/ml；GDNF 0.3ng/ml；GDNF 1ng/ml；GDNF 10ng/ml；GDNF 100ng/ml]。
图4B阐明了于DIV5在无血清培养物中测定的ChAT活性(dpm/小时)，所述培养物最初是由E14前侧中脑建立的。如图中所示，加入了经稀释的得自生产neublastin的HiB5pUbi1zNBN22细胞(neublastin)或生产GDNF的HiB5GDNF-L17(GDNFL-17)细胞的条件培养基[即neublastin 1∶10；neublastin 1∶50；GDNF L-17 1∶50]。
图4C阐明了于DIV7在无血清培养物中测定的每孔中的酪氨酸羟化酶免疫反应细胞的数目[TH+细胞数目/孔]，所述培养物最初是由E14前侧中脑建立的。如图中所示，加入了经稀释的得自未经转染的HiB5细胞(HiB5)或生产neublastin的HiB5pUbilzNBN22细胞(neublastin)的条件培养基，或多种浓度的重组GDNF[即HiB5 1∶10；HiB5 1∶40；GDNF 0.1ng/ml；GDNF 10ng/ml；GDNF 100ng/ml和neublastin 1∶40]。
与相同和较低稀释度(1∶10和1∶40)的对照(未经转染的)HiB5细胞相比，按1∶40稀释的得自经neublastin转染的HiB5细胞的条件培养基能显著增加每孔中的TH免疫反应细胞数目(例见图4B)。TH-免疫反应细胞的增加与GDNF浓度最大(10ng/ml)时观察到的增加差不多。这表明分泌至培养基中的neublastin对得自大鼠胚胎前侧中脑的多巴胺能神经元群体的存活有影响。相反，与经转染的HiB5细胞分泌的GDNF不同的是，得自经neublastin转染的HiB5细胞的条件培养基对相同培养物中的另一个神经元群体，即胆碱能神经元没有影响(例见图4A)。实施例7：neublastin对猪胚胎多巴胺能前侧中脑神经元的薄切片培养物存活的影响
在此实验中，研究了共培养的生产neublastin的方的那条带。这表明哺乳动物细胞中可产生糖基化形式的neublastin蛋白。在大肠杆菌中表达neublastin
为了在大肠杆菌中表达neublastin基因，用较低的GC含量和偏好的大肠杆菌密码子构建合成基因。将合成基因克隆至两个载体pET19b和pMJB164(pET19b的衍生物)。pET19b的构建示于图14。在此构建体中，编码neublastin之成熟结构域(NBN113)的序列直接与起始甲硫氨酸融合。pMJB164的构建示于图15。在此构建体中，neublastin的成熟结构域与被肠激酶裂解位点分开的组氨酸标记(即10个组氨酸)融合。组氨酸标记的前面是起始甲硫氨酸。编码图14中的neublastin的核苷酸序列ATGGCTGGAGGACCGGGATCTCGTGCTCGTGCAGCAGGAGCACGTGGCTGTCGTCTGCGTTCTCAACTAGTGCCGGTGCGTGCACTCGGACTGGGACACCGTTCCGACGAACTAGTACGTTTTCGTTTTTGTTCAGGATCTTGTCGTCGTGCACGTTCTCCGCATGATCTATCTCTAGCATCTCTACTAGGAGCCGGAGCACTAAGACCGCCGCCGGGATCTAGACCTGTATCTCAACCTTGTTGTAGACCTACTAGATACGAAGCAGTATCTTTCATGGACGTAAACTCTACATGGAGAACCGTAGATAGACTATCTGCAACCGCATGTGGCTGTCTAGGATGATAATAG [SEQ ID NO:29]编码图15中的his-标记的neublastin的核苷酸序列ATGGGCCATCATCATCATCATCATCATCATCATCACTCGAGCGGCCATATCGACGACGACGACAAGGCTGGAGGACCGGGATCTCGTGCTCGTGCAGCAGGAGCACGTGGCTGTCGTCTGCGTTCTCAACTAGTGCCGGTGCGTGCACTCGGACTGGGACACCGTTCCGACGAACTAGTACGTTTTCGTTTTTGTTCAGGATCTTGTCGTCGTGCACGTTCTCCGCATGATCTATCTCTAGCATCTCTACTAGGAGCCGGAGCACTAAGACCGCCGCCGGGATCTAGACCTGTATCTCAACCTTGTTGTAGACCTACTAGATACGAAGCAGTATCTTTCATGGACGTAAACTCTACATGGAGAACCGTAGATAGACTATCTGCAACCGCATGTGGCTGTCTAGGATGATAATAG  [SEQ ID NO: 30]实施例6：neublastin对大鼠胚胎多巴胺能神经元的存活和ChAT活性的影响
在此实验系列中，评估了得自上文所述的生产neublastin的HiB5pUbi1zNBN22细胞对猪胚胎前侧中脑之薄切片培养物的影响。
制备培养物：在无菌条件下由猪胚胎(E28；n=12)分离前侧中脑(VM)，切成400μm的薄切片，置于冷的含葡萄糖(6.5mg/ml)的Gey氏平衡盐溶液(GIBCO)。通过界面培养法培养组织切片，所述方法最初是由Stoppini等[L.Stoppini,P.A.Buchs,D.Muller,神经科学方法杂志，1991,37,173-182]发展起来的。
简单地说，将组织切片置于半透膜(Millipore,0.3μm；对应于一个VM，每张膜上放8个切片)上，将膜插入6孔板(Costar)中的含血清培养基(Gibco BRL)中。每孔含有1ml培养基(50％0ptimem,25％马血清，25％Hank氏平衡盐溶液(都得自GIBCO))，其中添加有终浓度为25mM的D-葡萄糖。第0天，在每个组织切片上接种7000个经转染的HiB5pUbi1zNBN22(neublastin)或7000个未经转染的HiB5细胞(对照)。首先在33℃的温箱中共培养48小时，使得因具有温度敏感型癌基因而无限增殖化的HiB5细胞得以增殖，然后转移至37℃的温箱使HiB5细胞分化。每周换2次培养基。在任何阶段都不使用抗有丝分裂剂和抗生素。
通过HPLC测定多巴胺：在体外第12和21天，收集培养基，使用具有电化学检测的HPLC分析多巴胺(W.N.Slooth,J.B.P.Gramsbergen，神经科学方法杂志，1995,60,141-49)。
组织处理和免疫组化：在第21天，在含4％低聚甲醛的磷酸盐缓冲液中将培养物固定60分钟。在20％蔗糖溶液中脱水24小时，冷冻，在低温恒温器上切下20μm的切片(4个系列)，将切片置于包被有明胶的显微镜载玻片上。对一个切片系列中的酪氨酸羟化酶(TH)进行免疫染色。简单地说，用含有1％Triton X-100的0.05M Tris-缓冲盐水(TBS,pH7.4)将切片洗涤3×15分钟，并与含有10％胎牛血清(FBS,LifeTechnologies)的TBS保温30分钟。然后于4℃将组织与用含10％FBS的TBS稀释600倍的小鼠抗TH单克隆抗体(Boehringer Mannheim)保温24小时。用含1％Triton X-100的TBS洗涤3×15分钟之后，将切片与用含10％FBS的TBS稀释200倍的生物素化抗小鼠IgG抗体(Amersham)保温60分钟。然后用含1％Triton X-100的TBS洗涤切片(3×15分钟)，并与用含10％FBS的TBS稀释200倍的链霉抗生物素蛋白-过氧化物酶(Dako)保温60分钟。用TBS洗涤(3×15分钟)之后，通过用含有0.05％3,3-二氨基联苯胺(Sigma)和0.01％H2O2的TBS处理以观察结合的抗体。最后，用乙醇使切片脱水，用二甲苯清洗切片，并在Eukitt中覆盖封套。
细胞计数和形态测量分析：使用亮视野显微镜(Olympus)对免疫反应性的TH-ir神经元进行定量测定。仅计数显示出强染色的，且细胞结构保持完好，细胞核清晰可辨的细胞。使用×20倍的物镜对每4个培养物切片进行细胞计数，以此为基础进行估计。根据Abercrombie’s公式(M.Abercrombie,Anat.Rec.1946 94 239-47)，使用TH-ir神经元的核平均直径(6.6±0.2μm,n=30)校正两次计数的细胞数目。使用神经元示踪系统(Neurolucida,Micro-BrightField公司)估计核的大小。
这些实验的结果示于图5。图5A-5C阐明了HiB5pUbi1zNBN22细胞分泌的neublastin对与HiB5pUbi1zNBN22细胞(neublastin)或HiB5细胞(对照)共培养的猪胚胎多巴胺能前侧中脑神经元之切片培养物的功能和存活的影响。图5A和图5B分别阐明了于DIV12[多巴胺(pmol/ml)-第12天]和DIV21[多巴胺(pmol/ml)-第21天]释放至培养基中的多巴胺。图5C阐明了于DIV21，每个切片培养物中的酪氨酸羟化酶免疫反应细胞的数目[TH-ir细胞/培养物]。
在第12天，HPLC分析表明：得自HiB5-neublastin共培养物的培养基所含有的多巴胺比得自HiB5-C共培养物的培养基中的多巴胺多84％(图5A)。在第21天，差异是78％(图5B)，细胞计数表明HiB5-neublastin共培养物含有的酪氨酸羟化酶免疫反应神经元比HiB5-C共培养物的多66％(p＜0.05)(图5C)。这表明HiB5pUbi1zNBN22克隆分泌的neublastin对猪胚胎多巴胺能神经元的存活具有潜在的影响。实施例8：无血清培养基中侧根神经节细胞的存活
本实施例显示出neublastin多肽与已知神经营养因子相比较的神经营养活性。
通过颈脱位处死怀孕的雌性小鼠，按下述处理胚胎以进行培养。
使用经电解削尖的钨针头，由所示阶段的C57/B16小鼠(Mollegaard Breeding,Denmark)解剖得到侧根神经节。于37℃，将胚胎神经节与含有0.05％胰蛋白酶(Gibco/BRL)的无钙和镁的Hanks平衡盐溶液保温5分钟。用胶原酶/分散酶(1mg/ml)将神经节处理30至45分钟，然后用胰蛋白酶/DNA酶(0.25％)处理15分钟。除去胰蛋白酶溶液之后，用10ml含有10％热灭活马血清的DMEM将神经节洗涤1次，用经烧边处理的Pasteur移液管将神经节轻轻捣碎以得到单细胞悬浮液。
将细胞铺于预先用聚鸟氨酸(0.5mg/ml，过夜)和层粘连蛋白(20mg/ml,4小时；Gibco/BRL)包被的24孔培养板(Nunc)上，于37℃，在潮湿的5％CO2温箱内的确定培养基中保温神经元，所述培养基由添加有2mM谷氨酰胺，0.35％牛血清白蛋白，60ng/ml孕酮，16mg/ml腐胺，400ng/ml L-甲状腺素，38ng/ml硒酸钠，340ng/ml三碘代-甲状腺原氨酸，60mg/ml青霉素和100mg/ml链霉素的Hams F14组成。
保温48小时之后，在相差光学显微镜下，因神经元的两极形态而能清楚地识别该神经元。通过在第48小时时计数孔中的神经元来评估神经元在缺乏或存在营养因子(在接种神经元之前加入培养基中，浓度为10ng/ml)时的存活百分比，或在得自生产neublastin的HiB5pUbi1zNBN22细胞的条件培养基中的存活百分比。
这些实验的结果示于图9，其中：
0表示对照实验(缺乏营养因子)；
1表示存在GDNF时的实验；
2表示存在Neurturin时的实验；
3表示存在本发明的Neublastin时的实验；
E12表示对分离自12天-胚胎的DRG细胞所进行实验的数据；
E16表示对分离自16天-胚胎的DRG细胞所进行实验的数据；
P0表示对分离自出生当天的DRG细胞所进行实验的数据；
P7表示对分离自出生后7天的DRG细胞所进行实验的数据；和
P15表示对分离自出生后15天的DRG细胞所进行实验的数据。
这些结果清楚地表明本发明的神经营养因子显示出相当于或甚至优于已知神经营养因子的活性。实施例9：neublastin对黑质多巴胺神经元的体内影响
为了检测neublastin是否能够保护成熟黑质多巴胺(DA)神经元免受6-羟基多巴胺诱导的降解，我们利用了患帕金森氏病的大鼠模型(Sauer和Oertel，神经科学，1994,59,401-415)以及neublastin的慢病毒基因转移。
慢病毒的产生：为了产生编码neublastin的慢病毒转移载体pHR’-neublastin，将得自neublastin cDNA的1331bp BamHⅠ片断亚克隆至pSL301(Invitrogen)的BamHⅠ/BglⅡ位点。从此构建体上切下1519bp的BamHⅠ/XhoⅠ片断，连接至pHR’的BamHⅠ/XhoⅠ位点，所述pHR’携有土拨鼠肝炎病毒翻译后片断(Zufferey R,Donello JE,Trono D,Hope TJ：土拨鼠肝炎病毒转录后的调节元件能增强由逆转录病毒载体传递的转基因的表达；病毒学杂志，1999 73(4):2886-2892)。为了产生pHR-GDNF，将得自pUbi1z-GDNF的701bpBamHⅠ/XhoⅠ片断连接至pHR’的BamHⅠ/XhoⅠ位点。
Zufferey等人描述了慢病毒载体的产生(Zufferey R,Nagy D,Mandel RJ,Naldini L,Trono D：多重减毒的慢病毒载体能在体内进行有效的基因传递；Nat.Biotechnol,1997,15(9)871-875)。简单地说，用转移构建体和辅助质粒pR8.91和pMDG共同转染293T细胞。在转染后48和72小时收集释放至培养基中的毒粒。为了浓缩病毒，以141000g将培养基离心1.5小时，并将沉淀物溶解于DMEM中。通过GFP荧光，测定出283T细胞中的携有绿色荧光蛋白(GFP)基因的对照的滴度为108个转化单位(TU)/ml。使用RNA狭线印迹技术(von Schwedler U,Song J,Aiken C,Trono D:Vif对感染细胞中的人Ⅰ型免疫缺损病毒原病毒DNA合成至关重要，病毒学杂志，1993,67(8)4945-4955)测定病毒颗粒的滴度。在GDNF上清液和neublastin上清液中，病毒颗粒比GFP上清液中的少10倍。
外科手术方案：所有涉及动物的工作都按照Lund大学实验室动物使用伦理委员会所制订的细则执行。
总共使用21只刚成年的雌性Sprague-Dawley大鼠(B&K Universal,Stockholm,Sweden)，在12小时光照：黑暗周期中圈养这些大鼠，圈养过程中不给大鼠进食和喂水。在损害前3周，根据Sauer和Oertel(Sauer和Oertel，神经科学，1994,59,401-415)所述进行逆行标记和6-OHDA损害。简单地说，在Equithesin麻醉(0.3ml/100g)下，给大鼠两侧注射0.2μl 2％逆行示踪Fluoro-Gold(FG；Fluorochrome公司，Englewood,CO)溶液(溶解于0.9％NaCl中)。使用2μl Hamilton注射器在以下坐标处进行注射：AP=+0.5mm；ML=离前囟门+3.4mm；DV=离硬脑膜-5.0mm，切齿线被设置于0.0mm。另外，在抽出针头之前，以0.05μl/min的速度再注射5分钟。
在FG注射之后14天，动物总共接受5个慢病毒载体沉积物(1μl/沉积物)，所述载体携有绿色荧光蛋白(GFP),neublastin或GDNF的基因。在下列坐标处，沿着两条针道将4个沉积物注射至纹状体：AP=+1.0mm,ML=-2.6mm,DV1=-5.0mm,DV2=-4.5mm和AP=0.0mm,ML=-3.7mm,DV1=-5.0mm,DV2=-4.5mm。在AP=-5.2mm,ML=-2.0mm,DV1=-6.3mm处将沉积物注射至黑质上。切齿线被设置于-2.3mm。
逆行标记21天之后，和注射慢病毒7天之后，重新麻醉动物，用10μl Hamilton注射器将单个沉积物，即20μg 6-OHDA(Sigma；计算为游离碱基并溶解于3μl冰冷的添加有0.02％抗坏血酸的盐水中)注射至与FG沉积物位置相同的右纹状体。注射速率为1μl/min，在抽出针头之前再保留3分钟。
组织处理：在注射6-OHDA之后21天，用水合氯醛深度麻醉动物，经贲门灌流盐水(pH7.4；室温)达1分钟，接着灌流200ml冰冷的甲醛溶液(含4％低聚甲醛的0.1M磷酸盐缓冲液，pH7.4)。解剖取脑，在相同的固定剂中固定3至4小时，然后转移至25％蔗糖/0.1M磷酸盐缓冲液中放置48小时。在冰冷的切片机上切下穿过纹状体和黑质(SN)的5个40μm切片系列。
定量评估SN中的多巴胺能神经元：如前人所述(Sauer和Oertel,神经科学，1994,59,401-415)，通过不透光的观察仪评估SN双致密层中经FG标记的神经元数目。简单地说，使用了3个连串切片，这些切片集中于辅助视束的中间末端核水平线周围(MTN；Paxinos和Watson(1997)图片-5.3)，以40倍的放大倍数计数MTN侧向的所有经标记/染色的神经元(n=6-7/组)。如果FG-标记的神经元在波长为330nm的表面照射下能发出明亮的荧光，显示出神经元分布图并延伸至少一个神经过程，即将这些神经元包括在内。
在接受携有GFP之慢病毒注射的动物的受损害的一侧，FG-阳性黑质神经元的数目降低为完好的一侧的18％。相反，用慢病毒-neublastin注射的动物显示出对FG-阳性黑质神经元数目近乎完全的保护(89％)。这与用慢病毒-GDNF处理的动物同样有效，其中87％逆行标记的神经元保留在受损的一侧。这表明neublastin对受损的成年黑质多巴胺神经元而言是强有力的存活因子，并且象GDNF一样有效。
图6阐明了慢病毒产生的neublastin对黑质多巴胺神经元的体内影响。用Flurogold(FG)逆行标记雌性Sprague Dawley大鼠的SN双致密层中的神经元，3周后用6-羟基多巴胺(6-OHDA)单次注射右纹状体。在注射6-OHDA之前1周，如图所示，使动物接受表达neublastin[neublastin],GDNF[GDNF]或绿色荧光蛋白[GFP]的慢病毒载体注射。注射6-OHDA 21天之后，测定纹状体两侧经FG标记的神经元数目。图中显示出3组动物纹状体的损害(右)侧对完好(左)侧中经FG标记的神经元的百分比[％FG损害/完好]。实施例10：产生抗体
为了制备抗neublastin的抗体，以3周为间隔，用肽1：CRPTRYEAVSFMDVNST(SEQ ID NO:9的氨基酸108-124)或肽2：ALRPPPGSRPVSQPC(SEQ ID NO:9的氨基酸93-107)免疫2只兔子，所述肽与载体蛋白缀合。在第0,3,6和10周用每种肽免疫2只兔子，在第7和11周收集血液。经由肽亲和柱亲和纯化第二次采的血液。根据肽的不同，将抗体称为Ab-1和Ab-2。
Western印迹：在含有N2添加物(GIBCO)的无血清培养基中将2×106个被neublastin cDNA稳定转染的HiB5细胞(HiB5pUbi1zNBN22)或未经转染的HiB5细胞保温过夜。在具有5kDa截留膜(Millipore,Bedford,MA)的小浓缩器上浓缩培养基，在浓缩的样品中加入5×Laemmli样品缓冲液，加热至95℃5分钟，在15％丙烯酰胺凝胶上通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离样品，并转移至PVDF-膜。用含有5％脱脂奶和0.1％吐温-20的PBS封闭残留的蛋白质-结合位点。将膜与neublastin抗体(1∶1000)保温过夜，接着与同辣根过氧化物酶缀合的抗兔或抗小鼠IgG第二抗体(1∶2000)保温。
根据厂商(Amersham)说明，使用增强的化学发光Plus(ECL+)观察免疫染色。这些实验的结果示于图3和实施例5。
使用标准技术，我们还针对下列肽产生了兔多克隆抗体：
肽R27:GPGSRARAAGARGC(SEQ ID NO:9的氨基酸30-43)；
肽R28:LGHRSDELVRFRFC(SEQ ID NO:9的氨基酸57-70)；
肽R29:CRRARSPHDLSL(SEQ ID NO:9的氨基酸74-85)；
肽R30:LRPPPGSRPVSQPC(SEQ ID NO:9的氨基酸94-107)；和
肽R31:STWRTVDRLSATAC(SEQ ID NO:9的氨基酸123-136)。
在该组肽中，只有相对靠近于C末端的肽R30和R31才能识别Western印迹上的在还原条件下变性的蛋白质。
序列表<160>33<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>865<212>DNA<213>Homo sapiens<220><221>CDS<222>(120)..(719)<220><221>5′UTR<222>(1)..(119)<220><221>3′UTR<222>(721)..(865)<220><221>sig_肽<222>(120)..(179)<220><221>mat_肽<222>(405)..(719)<220><221>misc_结构<222>(661)..(663)<223>CARBOHYD:在Asn 87处的糖基化天冬酰胺<220><221>misc_结构<222>(426)..(623)<223>DISULFID-Cys8-Cys73二硫桥<220><221>misc_结构<222>(507)..(707)<223>DISULFID:Cys35-Cysl01二硫桥<220><221>misc_结构<222>(519)..(713)<223>DISULFID:Cys39-Cys103二硫桥<220><221>misc_结构<222>(616)..(619)<223>DISULFID:Cys72-Cys72链间二硫桥<400>1ctaggagccc atgcccggcc tgatctcagc ccgaggacag cccctccttg aggtccttcc 60tccccaagcc cacctgggtg ccctctttct ccctgaggct ccacttggtc tctccgcgc  119atg cct gcc ctg tgg ccc acc ctg gcc gct ctg gct ctg ctg agc agc   167Met Pro Ala Leu Trp Pro Thr Leu Ala Ala Leu Ala Leu Leu Ser Ser-95                 -90                 -85                 -80gtc gca gag gcc tcc ctg ggc tcc gcg ccc cgc agc cct gcc ccc cgc    215Val Ala Glu Ala Ser Leu Gly Ser Ala Pro Arg Ser Pro Ala Pro Arg
            -75                 -70                 -65gaa ggc ccc ccg cct gtc ctg gcg tcc ccc gcc ggc cac ctg ccg ggg    263Glu Gly Pro Pro Pro Val Leu Ala Ser Pro Ala Gly His Leu Pro Gly
        -60                 -55                 -50gga cgc acg gcc cgc tgg tgc agt gga aga gcc cgg cgg ccg cgc cgc    311Gly Arg Thr Ala Arg Trp Cys Ser Gly Arg Ala Arg Arg Pro Arg Arg
    -45                 -40                 -35aga cac ttc tcg gcc cgc gcc ccc gcc gcc tgc acc ccc atc tgc tct    359Arg His Phe Ser Ala Arg Ala Pro Ala Ala Cys Thr Pro Ile Cys Ser
-30                 -25                 -20tcc ccg cgg gtc cgc gcg gcg cgg ctg ggg ggc cgg gca gcg cgc tcg    407Ser Pro Arg Val Arg Ala Ala Arg Leu Gly Gly Arg Ala Ala Arg Ser-15                 -10                  -5              -1   1ggc agc ggg ggc gcg ggg tgc cgc ctg cgc tcg cag ctg gtg ccg gtg    455Gly Ser Gly Gly Ala Gly Cys Arg Leu Arg Ser Gln Leu Val Pro Val
          5                  10                  15cgc gcg ctc ggc ctg ggc cac cgc tcc gac gag ctg gtg cgt ttc cgc    503Arg Ala Leu Gly Leu Gly His Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg Phe Arg
     20                  25                  30ttc tgc acc ggc tcc tgc ccg cgc gcg cgc tct cca cac gac ctc agc    551Phe Cys Thr Gly Ser Cys Pro Arg Ala Arg Ser Pro His Asp Leu Ser
 35                  40                  45ctg gcc agc cta ctg ggc gcc ggg gcc ctg cga ccg ccc ccg ggc tcc    599Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ala Gly Ala Leu Arg Pro Pro Pro Gly Ser50                  55                  60                  65cgg ccc gtc agc cag ccc tgc tgc cga ccc acg cgc tac gaa gcg gtc    647Arg Pro Val Ser Gln Pro Cys Cys Arg Pro Thr Arg Tyr Glu Ala Val
             70                  75                  80tcc ttc atg gac gtc aac agc acc tgg aga acc gtg gac cgc ctc tcc    695Ser Phe Met Asp Val Asn Ser Thr Trp Arg Thr Val Asp Arg Leu Ser
         85                  90                  95gcc acc gcc tgc ggc tgc ctg ggc tgagggctcg ctccagggct ttgcagactg   749Ala Thr Ala Cys Gly Cys Leu Gly
    100                 105gacccttacc ggtggctctt cctgcctggg accctcccgc agagtcccac tagccagcgg   809cctcagccag ggacgaaggc ctcaaagctg agaggcccct gccggtgggt gatgga       865<210>2<211>200<212>PRT<213>Homo sapiens<400>2Met Pro Ala Leu Trp Pro Thr Leu Ala Ala Leu Ala Leu Leu Ser Ser-95                 -90                 -85                 -80Val Ala Glu Ala Ser Leu Gly Ser Ala Pro Arg Ser Pro Ala Pro Arg
            -75                 -70                 -65Glu Gly Pro Pro Pro Val Leu Ala Ser Pro Ala Gly His Leu Pro Gly
        -60                 -55                 -50Gly Arg Thr Ala Arg Trp Cys Ser Gly Arg Ala Arg Arg Pro Arg Arg
    -45                 -40                 -35Arg His Phe Ser Ala Arg Ala Pro Ala Ala Cys Thr Pro Ile Cys Ser
-30                  -25                -20Ser Pro Arg Val Arg Ala Ala Arg Leu Gly Gly Arg Ala Ala Arg Ser-15                 -10                  -5              -1   1Gly Ser Gly Gly Ala Gly Cys Arg Leu Arg Ser Gln Leu Val Pro Val
          5                  10                  15Arg Ala Leu Gly Leu Gly His Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg Phe Arg
     20                  25                  30Phe Cys Thr Gly Ser Cys Pro Arg Ala Arg Ser Pro His Asp Leu Ser
 35                  40                  45Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ala Gly Ala Leu Arg Pro Pro Pro Gly Ser50                  55                  60                  65Arg Pro Val Ser Gln Pro Cys Cys Arg Pro Thr Arg Tyr Glu Ala Val
             70                  75                  80Ser Phe Met Asp Val Asn Ser Thr Trp Arg Thr Val Asp Arg Leu Ser
         85                  90                  95Ala Thr Ala Cys Gly Cys Leu Gly
    100                 105<210>3<211>861<212>DNA<213>Homo sapiens<220><221>CDS<222>(7)..(717)<220><221>5′UTR<222>(1)..(6)<220><221>3′UTR<222>(718)..(861)<220><221>sig_肽<222>(7)..(174)<220><221>mat_肽<222>(298)..(717)<220><221>mat_肽<222>(370)..(717)<220><221>mat_肽<222>(379)..(717)<220><221>misc_结构<222>(661)..(663)<223>CARBPHYD:在Asn122处的糖基化天冬酰胺<220><221>misc_结构<222>(424)..(621)<223>DISULFID:Cys43-Cys108二硫桥<220><221>misc_结构<222>(505)..(705)<223>DISULFID:Cys70-Cys136二硫桥<220><221>misc_结构<222>(517)..(711)<223>DISULFID:Cys74-Cys138二硫桥<220><221>misc_结构<222>(616)..(618)<223>DISULFID:Cys107-Cys107链间二硫桥<400>3gagccc atg ccc ggc ctg atc tca gcc cga gga cag ccc ctc ctt gag   48
   Met Pro Gly Leu Ile Ser Ala Arg Gly Gln Pro Leu Leu Glu
           -95                 -90                 -85gtc ctt cct ccc caa gcc cac ctg ggt gcc ctc ttt ctc cct gag gct   96Val Leu Pro Pro Gln Ala His Leu Gly Ala Leu Phe Leu Pro Glu Ala
        -80                 -75                 -70cca ctt ggt ctc tcc gcg cag cct gcc ctg tgg ccc acc ctg gcc gct   144Pro Leu Gly Leu Ser Ala Gln Pro Ala Leu Trp Pro Thr Leu Ala Ala
    -65                 -60                 -55ctg gct ctg ctg agc agc gtc gca gag gcc tcc ctg ggc tcc gcg ccc   192Leu Ala Leu Leu Ser Ser Val Ala Glu Ala Ser Leu Gly Ser Ala Pro
-50                 -45                 -40cgc agc cct gcc ccc cgc gaa ggc ccc ccg cct gtc ctg gcg tcc ccc   240Arg Ser Pro Ala Pro Arg Glu Gly Pro Pro Pro Val Leu Ala Ser Pro-35                 -30                 -25                 -20gcc ggc cac ctg ccg ggg gga cgc acg gcc cgc tgg tgc agt gga aga   288Ala Gly His Leu Pro Gly Gly Arg Thr Ala Arg Trp Cys Ser Gly Arg
            -15                 -10                  -5gcc cgg cgg ccg ccg ccg cag cct tct cgg ccc gcg ccc ccg ccg cct   336Ala Arg Arg Pro Pro Pro Gln Pro Ser Arg Pro Ala Pro Pro Pro Pro
     -1   1               5                  10gca ccc cca tct gct ctt ccc cgc ggg ggc cgc gcg gcg cgg gct ggg   384Ala Pro Pro Ser Ala Leu Pro Arg Gly Gly Arg Ala Ala Arg Ala Gly
 15                  20                  25ggc ccg ggc aac cgc gct cgg gca gcg ggg gcg cgg ggc tgc cgc ctg   432Gly Pro Gly Asn Arg Ala Arg Ala Ala Gly Ala Arg Gly Cys Arg Leu30                  35                  40                  45cgc tcg cag ctg gtg ccg gtg cgc gcg ctc ggc ctg ggc cac cgc tcc   480Arg Ser Gln Leu Val Pro Val Arg Ala Leu Gly Leu Gly His Arg Ser
             50                  55                  60gac gag ctg gtg cgt ttc cgc ttc tgc agc ggc tcc tgc cgc cgc gcg   528Asp Glu Leu Val Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly Ser Cys Arg Arg Ala
         65                  70                  75cgc tct cca cac gac ctc agc ctg gcc agc cta ctg ggc gcc ggg gcc   576Arg Ser Pro His Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ala Gly Ala
     80                  85                  90ctg cga ccg ccc ccg ggc tcc cgg ccc gtc agc cag ccc tgc tgc cga   624Leu Arg Pro Pro Pro Gly Ser Arg Pro Val Ser Gln Pro Cys Cys Arg
 95                 100                 105ccc acg cgc tac gaa gcg gtc tcc ttc atg gac gtc aac agc acc tgg   672Pro Thr Arg Tyr Glu Ala Val Ser Phe Met Asp Val Asn Ser Thr Trp110                 115                 120                 125aga acc gtg gac cgc ctc tcc gcc aac ccc tgc ggc tgc ctg ggc       717Arg Thr Val Asp Arg Leu Ser Ala Asn Pro Cys Gly Cys Leu Gly
            130                 135                 140tgagggctcg ctccagggct ttgcagactg gacccttacc ggtggctctt cctgcctggg 777accctcccgc agagtcccac tagccagcgg cctcagccag ggacgaaggc ctcaaagctg 8137agaggcccct gccggtgggt gatg                                        861<210>4<211>237<212>PRT<213>Homo sapiens<400>4Met Pro Gly Leu Ile Ser Ala Arg Gly Gln Pro Leu Leu Glu Val Leu
    -95                 -90                 -85Pro Pro Gln Ala His Leu Gly Ala Leu Phe Leu Pro Glu Ala Pro Leu
-80                 -75                 -70Gly Leu Ser Ala Gln Pro Ala Leu Trp Pro Thr Leu Ala Ala Leu Ala-65                 -60                 -55                 -50Leu Leu Ser Ser Val Ala Glu Ala Ser Leu Gly Ser Ala Pro Arg Ser
            -45                 -40                 -35Pro Ala Pro Arg Glu Gly Pro Pro Pro Val Leu Ala Ser Pro Ala Gly
        -30                 -25                 -20His Leu Pro Gly Gly Arg Thr Ala Arg Trp Cys Ser Gly Arg Ala Arg
    -15                 -10                  -5Arg Pro Pro Pro Gln Pro Ser Arg Pro Ala Pro Pro Pro Pro Ala Pro-1   1               5                  10                  15Pro Ser Ala Leu Pro Arg Gly Gly Arg Ala Ala Arg Ala Gly Gly Pro
             20                  25                  30Gly Asn Arg Ala Arg Ala Ala Gly Ala Arg Gly Cys Arg Leu Arg Ser
         35                  40                  45Gln Leu Val Pro Val Arg Ala Leu Gly Leu Gly His Arg Ser Asp Glu
     50                  55                  60Leu Val Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly Ser Cys Arg Arg Ala Arg Ser
 65                  70                  75Pro His Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ala Gly Ala Leu Arg80                  85                  90                  95Pro Pro Pro Gly Ser Arg Pro Val Ser Gln Pro Cys Cys Arg Pro Thr
            100                 105                 110Arg Tyr Glu Ala Val Ser Phe Met Asp Val Asn Ser Thr Trp Arg Thr
        115                 120                 125Val Asp Arg Leu Ser Ala Asn Pro Cys Gly Cys Leu Gly
    130                 135                 140<210>5<211>140<212>PRT<213>Homo sapiens<220><223>其中134位上的Xaa表示Asn或Thr,
135位上的Yaa表示Ala或Pro<400>5Pro Pro Pro Gln Pro Ser Arg Pro Ala Pro Pro Pro Pro Ala Pro Pro1               5                  10                  15Ser Ala Leu Pro Arg Gly Gly Arg Ala Ala Arg Ala Gly Gly Pro Gly
         20                  25                  30Asn Arg Ala Arg Ala Ala Gly Ala Arg Gly Cys Arg Leu Arg Ser Gln
     35                  40                  45Leu Val Pro Val Arg Ala Leu Gly Leu Gly His Arg Ser Asp Glu Leu
 50                  55                  60Val Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly Ser Cys Arg Arg Ala Arg Ser Pro65                  70                  75                  80His Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ala Gly Ala Leu Arg Pro
             85                  90                  95Pro Pro Gly Ser Arg Pro Val Ser Gln Pro Cys Cys Arg Pro Thr Arg
        100                 105                 110Tyr Glu Ala Val Ser Phe Met Asp Val Asn Ser Thr Trp Arg Thr Val
    115                 120                 125Asp Arg Leu Ser Ala Xaa Yaa Cys Gly Cys Leu Gly
130                 135                 140<210>6<211>116<212>PRT<213>Homo sapiens<220><223>其中110位上的Xaa表示Asn或Thr,
111位上的Yaa表示Ala或Pro<400>6Ala Ala Arg Ala Gly Gly Pro Gly Asn Arg Ala Arg Ala Ala Gly Ala1               5                  10                  15Arg Gly Cys Arg Leu Arg Ser Gln Leu Val Pro Val Arg Ala Leu Gly
         20                  25                  30Leu Gly His Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly
     35                  40                  45Ser Cys Arg Arg Ala Arg Ser Pro His Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu
 50                  55                  60Leu Gly Ala Gly Ala Leu Arg Pro Pro Pro Gly Ser Arg Pro Val Ser65                  70                  75                  80Gln Pro Cys Cys Arg Pro Thr Arg Tyr Glu Ala Val Ser Phe Met Asp
             85                  90                  95Val Asn Ser Thr Trp Arg Thr Val Asp Arg Leu Ser Ala Xaa Yaa Cys
        100                 105                 110Gly Cys Leu Gly
    115<210>7<211>113<212>PRT<213>Homo sapiens<220><223>其中107位上的Xaa表示Asn或Thr,
108位上的Yaa表示Ala或Pro<400>7Ala Gly Gly Pro Gly Asn Arg Ala Arg Ala Ala Gly Ala Arg Gly Cys1               5                  10                  15Arg Leu Arg Ser Gln Leu Val Pro Val Arg Ala Leu Gly Leu Gly His
         20                  25                  30Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly Ser Cys Arg
     35                  40                  45Arg Ala Arg Ser Pro His Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ala
 50                  55                  60Gly Ala Leu Arg Pro Pro Pro Gly Ser Arg Pro Val Ser Gln Pro Cys65                   70                 75                  80Cys Arg Pro Thr Arg Tyr Glu Ala Val Ser Phe Met Asp Val Asn Ser
             85                  90                  95Thr Trp Arg Thr Val Asp Arg Leu Ser Ala Xaa Yaa Cys Gly Cys Leu
        100                 105                 110Gly<210>8<211>861<212>DNA<213>Homo sapiens<220><221>CDS<222>(58)..(717)<220><221>5′UTR<222>(1)..(57)<220><221>3′UTR<222>(718)..(861)<220><221>sig_肽<222>(58)..(174)<220><221>mat_肽<222>(298)..(717)<220><221>mat_肽<222>(370)..(717)<220><221>mat_肽<222>(379)..(717)<221>misc_结构<222>(661)..(663)<223>CARBOHYD：在Asn122处的糖基化天冬酰胺<220><221>misc_结构<222>(424)..(621)<223>DISUFID:Gly43-Gly108二硫桥<220><221>misc_结构<222>(505)..(705)<223>DISULFID:Gly70-Gly136二硫桥<220><221>misc_结构<222>(517)..(711)<223>DISULFID:Gly74-Gly138二硫桥<220><221>misc_结构<222>(616)..(618)<223>DISULFID:Gly107-Gly107链间二硫桥<400> 8aggagggtgg gggaacagct caacaatggc tgatgggcgc tcctggtgtt gatagag     57atg gaa ctt gga ctt gga ggc ctc tcc acg ctg tcc cac tgc ccc tgg    105Met Glu Leu Gly Leu Gly Gly Leu Ser Thr Leu Ser His Cys Pro Trp-80                 -75                 -70                -65cct agg cgg cag cct gcc ctg tgg ccc acc ctg gcc gct ctg gct ctg    153Pro Arg Arg Gln Pro Ala Leu Trp Pro Thr Leu Ala Ala Leu Ala Leu
             -60                      -55                      -50ctg agc agc gtc gca gag gcc tcc ctg ggc tcc gcg ccc cgc agc cct    201Leu Ser Ser Val Ala Glu Ala Ser Leu Gly Ser Ala Pro Arg Ser Pro
        -45                 -40                 -35gcc ccc cgc gaa ggc ccc ccg cct gtc ctg gcg tcc ccc gcc ggc cac    249Ala Pro Arg Glu Gly Pro Pro Pro Val Leu Ala Ser Pro Ala Gly His
    -30                 -25                 -20ctg ccg ggg gga cgc acg gcc cgc tgg tgc agt gga aga gcc cgg cgg    297Leu Pro Gly Gly Arg Thr Ala Arg Trp Cys Ser Gly Arg Ala Arg Arg
-15                 -10                  -5              -1ccg ccg ccg cag cct tct cgg ccc gcg ccc ccg ccg cct gca ccc cca    345Pro Pro Pro Gln Pro Ser Arg Pro Ala Pro Pro Pro Pro Ala Pro Pro1               5                  10                      15tct gct ctt ccc cgc ggg ggc cgc gcg gcg cgg gct ggg ggc ccg ggc    393Ser Ala Leu Pro Arg Gly Gly Arg Ala Ala Arg Ala Gly Gly Pro Gly
         20                  25                  30agc cgc gct cgg gca gcg ggg gcg cgg ggc tgc cgc ctg cgc tcg cag    441Ser Arg Ala Arg Ala Ala Gly Ala Arg Gly Cys Arg Leu Arg Ser Gln
     35                  40                  45ctg gtg ccg gtg cgc gcg ctc ggc ctg ggc cac cgc tcc gac gag ctg    489Leu Val Pro Val Arg Ala Leu Gly Leu Gly His Arg Ser Asp Glu Leu
 50                  55                  60gtg cgt ttc cgc ttc tgc agc ggc tcc tgc cgc cgc gcg cgc tct cca    537Val Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly Ser Cys Arg Arg Ala Arg Ser Pro65                  70                  75                  80cac gac ctc agc ctg gcc agc cta ctg ggc gcc ggg gcc ctg cga ccg    585His Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ala Gly Ala Leu Arg Pro
             85                  90                  95ccc ccg ggc tcc cgg ccc gtc agc cag ccc tgc tgc cga ccc acg cgc    633Pro Pro Gly Ser Arg Pro Val Ser Gln Pro Cys Cys Arg Pro Thr Arg
        100                 105                 110tac gaa gcg gtc tcc ttc atg gac gtc aac agc acc tgg aga acc gtg    681Tyr Glu Ala Val Ser Phe Met Asp Val Asn Ser Thr Trp Arg Thr Val
    115                 120                 125gac cgc ctc tcc gcc acc gcc tgc ggc tgc ctg ggc tgagggctcg         727Asp Arg Leu Ser Ala Thr Ala Cys Gly Cys Leu Gly
130                 135                 140ctccagggct ttgcagactg gacccttacc ggtggctctt cctgcctggg accctcccgc  787agagtcccac tagccagcgg cctcagccag ggacgaaggc ctcaaagctg agaggcccct  847accggtgggt gatg                                                    861<210>9<211>220<212>PRT<213>Homo sapiens<400>9Met Glu Leu Gly Leu Gly Gly Leu Ser Thr Leu Ser His Cys Pro Trp-80                     -75             -70                 -65Pro Arg Arg Gln Pro Ala Leu Trp Pro Thr Leu Ala Ala Leu Ala Leu
            -60                 -55                 -50Leu Ser Ser Val Ala Glu Ala Ser Leu Gly Ser Ala Pro Arg Ser Pro
        -45                 -40                 -35Ala Pro Arg Glu Gly Pro Pro Pro Val Leu Ala Ser Pro Ala Gly His
    -30                 -25                 -20Leu Pro Gly Gly Arg Thr Ala Arg Trp Cys Ser Gly Arg Ala Arg Arg
-15                 -10                  -5              -1Pro Pro Pro Gln Pro Ser Arg Pro Ala Pro Pro Pro Pro Ala Pro Pro1               5                  10                  15Ser Ala Leu Pro Arg Gly Gly Arg Ala Ala Arg Ala Gly Gly Pro Gly
         20                  25                  30Ser Arg Ala Arg Ala Ala Gly Ala Arg Gly Cys Arg Leu Arg Ser Gln
     35                  40                  45Leu Val Pro Val Arg Ala Leu Gly Leu Gly His Arg Ser Asp Glu Leu
 50                  55                  60Val Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly Ser Cys Arg Arg Ala Arg Ser Pro65                  70                  75                  80His Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ala Gly Ala Leu Arg Pro
             85                  90                  95Pro Pro Gly Ser Arg Pro Val Ser Gln Pro Cys Cys Arg Pro Thr Arg
        100                 105                 110Tyr Glu Ala Val Ser Phe Met Asp Val Asn Ser Thr Trp Arg Thr Val
    115                 120                 125Asp Arg Leu Ser Ala Thr Ala Cys Gly Cys Leu Gly
130                 135                 140<210>10<211>140<212>PRT<213>Homo sapiens<220><221>CARBOHYD<222>(122)<223>糖基化天冬酰胺<400>10Pro Pro Pro Gln Pro Ser Arg Pro Ala Pro Pro Pro Pro Ala Pro Pro1               5                  10                  15Ser Ala Leu Pro Arg Gly Gly Arg Ala Ala Arg Ala Gly Gly Pro Gly
         20                  25                  30Ser Arg Ala Arg Ala Ala Gly Ala Arg Gly Cys Arg Leu Arg Ser Gln
     35                  40                  45Leu Val Pro Val Arg Ala Leu Gly Leu Gly His Arg Ser Asp Glu Leu
 50                  55                  60Val Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly Ser Cys Arg Arg Ala Arg Ser Pro65                  70                  75                  80His Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ala Gly Ala Leu Arg Pro
             85                  90                  95Pro Pro Gly Ser Arg Pro Val Ser Gln Pro Cys Cys Arg Pro Thr Arg
        100                 105                 110Tyr Glu Ala Val Ser Phe Met Asp Val Asn Ser Thr Trp Arg Thr Val
    115                 120                 125Asp Arg Leu Ser Ala Thr Ala Cys Gly Cys Leu Gly
130                 135                 140<210>11<211>116<212>PRT<213>Homo sapiens<220><221>CARBOHYD<222>(98)<223>糖基化天冬酰胺<400> 11Ala Ala Arg Ala Gly Gly Pro Gly Ser Arg Ala Arg Ala Ala Gly Ala1               5                  10                  15Arg Gly Cys Arg Leu Arg Ser Gln Leu Val Pro Val Arg Ala Leu Gly
         20                  25                  30Leu Gly His Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly
     35                  40                  45Ser Cys Arg Arg Ala Arg Ser Pro His Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu
 50                  55                  60Leu Gly Ala Gly Ala Leu Arg Pro Pro Pro Gly Ser Arg Pro Val Ser65                  70                 75                   80Gln Pro Cys Cys Arg Pro Thr Arg Tyr Glu Ala Val Ser Phe Met Asp
             85                  90                  95Val Asn Ser Thr Trp Arg Thr Val Asp Arg Leu Ser Ala Thr Ala Cys
        100                 105                 110Gly Cys Leu Gly
       115<210>12<211>113<212>PRT<213>Homo saDiens<220><221>CARBOHYD<222>(95)<223>糖基化天冬酰胺<400>12Ala Gly Gly Pro Gly Ser Arg Ala Arg Ala Ala Gly Ala Arg Gly Cys1               5                  10                  15Arg Leu Arg Ser Gln Leu Val Pro Val Arg Ala Leu Gly Leu Gly His
         20                  25                  30Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly Ser Cys Arg
     35                  40                  45Arg Ala Arg Ser Pro His Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ala
 50                  55                  60Gly Ala Leu Arg Pro Pro Pro Gly Ser Arg Pro Val Ser Gln Pro Cys65                  70                  75                  80Cys Arg Pro Thr Arg Tyr Glu Ala Val Ser Phe Met Asp Val Asn Ser
             85                  90                  95Thr Trp Arg Thr Val Asp Arg Leu Ser Ala Thr Ala Cys Gly Cys Leu
        100                 105                 110Gly<210>13<211>102<212>DNA<213>Homo sapiens<400>13cctggccagc ctactgggcg ccggggccct gcgaccgccc ccgggctccc ggcccgtcag 60ccagccctgc tgccgaccca cgcgctacga agcggtctcc tt                    102<210>14<211>220<212>DNA<213>Murinae gen. sp.<400>14ggccaccgct ccgacgagct gatacgtttc cgcttctgca gcggctcgtg ccgccgagca 60cgctcccagc acgatctcag tctggccagc ctactgggcg ctggggccct acggtcgcct 120cccgggtccc ggccgatcag ccagccctgc tgccggccca ctcgctatga ggccgtctcc 180ttcatggacg tgaacagcac ctggagaacc gtggaccgcc                       220<210>15<211>2136<212>DNA<213>Murinae gen. sp.<220><221>CDS<222>(975)..(1646)<400>15gcggccgcga attcggcacg agggcgtctc gctgcagccc gcgatctcta ctctgcctcc 60tggggtcttc tccaaatgtc tagcccccac ctagagggac ctagcctagc cagcggggac 120cggatccgga gggtggagcg gccaggtgag ccctgaaagg tggggcgggg cgggggcgct 180ctgggcccca ccccgggatc tggtgacgcc ggggctggaa tttgacaccg gacggcggcg 240ggcaggaggc tgctgaggga tggagttggg ctcggccccc agatgcggcc cgcgggctct 300gccagcaaca agtccctcGg gccccagccc tcgctgcgac tggggcttgg agccctgcac 360ccaagggcac agaccggctg ccaaggcccc acttttaact aaaagaggcg ctgccaggtg 420cacaactctg ggcatgatcc acttgagctt cgggggaaag cccagcactg gtcccaggag 480aggcgcctag aaggacacgg accaggaccc ctttggtatg gagtgaacgc tgagcatgga 540gtggaaggaa ctcaagttac tactttctcc aaccaccctg gtaccttcag ccctgaagta 600cagagcagaa gggtcttaga agacaggacc acagctgtgt gagtctcccc cctgaggcct 660tagacgatct ctgagctcag ctgagctttg tttgcccatc tggagaagtg agccattgat 720tgaccttgtg gcatcgcgaa ggaacaggtc ctgccaagca cctaacacag agagcaaggt 780tctccatcgc agctaccgct gctgagttga ctctagctac tccaacctcc tgggtcgctt 840cgagagactg gagtggaagg aggaataccc caaaggataa ctaactcatc tttcagtttg 900caagctgccg caggaagagg gtggggaaac gggtccacga aggcttctga tgggagcttc 960tggagccgaa agct atg gaa ctg gga ctt gca gag cct act gca ttg tcc   1010
            Met Glu Leu Gly Leu Ala Glu Pro Thr Ala Leu Ser
              1               5                  10cac tgc ctc cgg cct agg tgg cag tca gcc tgg tgg cca acc cta gct   1058His Cys Leu Arg Pro Arg Trp Gln Ser Ala Trp Trp Pro Thr Leu Ala
     15                  20                  25gtt cta gcc ctg ctg agc tgc gtc aca gaa gct tcc ctg gac cca atg   1106Val Leu Ala Leu Leu Set Cys Val Thr Glu Ala Ser Leu Asp Pro Met
 30                  35                  40tcc cgc agc ccc gcc gct cgc gac ggt ccc tca ccg gtc ttg gcg ccc   1154Ser Arg Ser Pro Ala Ala Arg Asp Gly Pro Ser Pro Val Leu Ala Pro45                  50                  55                  60ccc acg gac cac ctg cct ggg gga cac act gcg cat ttg tgc agc gaa   1202Pro Thr Asp His Leu Pro Gly Gly His Thr Ala His Leu Cys Ser Glu
             65                  70                  75aga acc ctg cga ccc ccg cct cag tct cct cag ccc gca ccc ccg ccg   1250Arg Thr Leu Arg Pro Pro Pro Gln Ser Pro Gln Pro Ala Pro Pro Pro
         80                  85                  90cct ggt ccc gcg ctc cag tct cct ccc gct gcg ctc cgc ggg gca cgc   1298Pro Gly Pro Ala Leu Gln Ser Pro Pro Ala Ala Leu Arg Gly Ala Arg
     95                 100                 105gcg gcg cgt gca gga acc cgg agc agc cgc gca cgg acc aca gat gcg   1346Ala Ala Arg Ala Gly Thr Arg Ser Ser Arg Ala Arg Thr Thr Asp Ala
110                 115                 120cgc ggc tgc cgc ctg cgc tcg cag ctg gtg ccg gtg agc gcg ctc ggc   1394Arg Gly Cys Arg Leu Arg Ser Gln Leu Val Pro Val Ser Ala Leu Gly125                 130                 135                 140cta ggc cac agc tcc gac gag ctg ata cgt ttc cgc ttc tgc agc ggc   1442Leu Gly His Ser Ser Asp Glu Leu Ile Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly
            145                 150                 155tcg tgc cgc cga gca cgc tcc cag cac gat ctc agt ctg gcc agc cta   1490Ser Cys Arg Arg Ala Arg Ser Gln His Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu
        160                 165                 170ctg ggc gct ggg gcc cta cgg tcg cct ccc ggg tcc cgg ccg atc agc   1538Leu Gly Ala Gly Ala Leu Arg Ser Pro Pro Gly Ser Arg Pro Ile Ser
    175                 180                 185cag ccc tgc tgc cgg ccc act cgc tat gag gcc gtc tcc ttc atg gac   1586Gln Pro Cys Cys Arg Pro Thr Arg Tyr Glu Ala Val Ser Phe Met Asp
190                 195                 200gtg aac agc acc tgg agg acc gtg gac cac ctc tcc gcc act gcc tgc   1634Val Ash Ser Thr Trp Arg Thr Val Asp His Leu Ser Ala Thr Ala Cys205                 210                 215                 220ggc tgt ctg ggc tgaggatgat ctatctccaa gcctttgcac actagaccca       1686Gly Cys Leu Glytgtgttgccc tacctggaac agctccaccg ggcctcacta accaggagcc tcaactcagc 1746aggatatgga ggctgcagag ctcaggcccc aggccggtga gtgacagacg tcgtcggcat 1806gacagacaga gtgaaagatg tcggaaccac tgaccaacag tcccaagttg ttcatggatc 1866ccagctctac agacaggaga aacctcagct aaagagaact cctctgggag aatccagaaa 1926tggccctctg tcctggggaa tgaattttga agagatatat atacatatat acattgtagt 1986cgcgttgctg gaccagcctg tgctgaaacc agtcccgtgt tcacttgtgg aagccgaagc 2046cctatttatt atttctaaat tatttattta ctttgaaaaa aaacggccaa gtcggcctcc 2106ctttagtgag ggttaatttg tgatcccggg                                  2136<210>16<211>224<212>PRT<213>Murinae gen.sp.<400>16Met Glu Leu Gly Leu Ala Glu Pro Thr Ala Leu Ser His Cys Leu Arg1               5                  10                  15Pro Arg Trp Gln Ser Ala Trp TrP Pro Thr Leu Ala Val Leu Ala Leu
         20                  25                  30Leu Ser Cys Val Thr Glu Ala Ser Leu Asp Pro Met Ser Arg Ser Pro
     35                  40                  45Ala Ala Arg Asp Gly Pro Ser Pro Val Leu Ala Pro Pro Thr Asp His
 50                  55                  60Leu Pro Gly Gly His Thr Ala His Leu Cys Ser Glu Arg Thr Leu Arg65                  70                  75                  80Pro Pro Pro Gln Ser Pro Gln Pro Ala Pro Pro Pro Pro Gly Pro Ala
             85                  90                  95Leu Gln Ser Pro Pro Ala Ala Leu Arg Gly Ala Arg Ala Ala Arg Ala
        100                 105                 110Gly Thr Arg Ser Ser Arg Ala Arg Thr Thr Asp Ala Arg Gly Cys Arg
    115                 120                 125Leu Arg Ser Gln Leu Val Pro Val Ser Ala Leu Gly Leu Gly His Ser
130                 135                 140Ser Asp Glu Leu Ile Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly Ser Cys Arg Arg145                 150                 155                160Ala Arg Ser Gln His Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ala Gly
            165                 170                 175Ala Leu Arg Ser Pro Pro Gly Ser Arg Pro Ile Ser Gln Pro Cys Cys
        180                 185                 190Arg Pro Thr Arg Tyr Glu Ala Val Ser Phe Met Asp Val Asn Ser Thr
    195                 200                 205Trp Arg Thr Val Asp His Leu Ser Ala Thr Ala Cys Gly Cys Leu Gly
210                 215                 220<210>17<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：PCR引物<400>17cctggccagc ctactggg                                                18<210>18<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：PCR引物<400>18aaggagaccg cttcgtagcg                                           20<210>19<211>17<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：PCR引物<400>19atggaacttg gacttgg                                               17<210>20<211>16<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：PCR引物<400>20tccatcaccc accggc                                                    16<210>21<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：PCR引物<400>21ggccaccgct ccgacgag                                               18<210>22<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：PCR引物<400>22ggcggtccac ggttctccag                                             20<210>23<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：PCR引物<400>23ccaagcccac ctgggtgccc tctttctcc                                  29<210>24<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：PCR引物<400>24catcacccac cggcaggggc ctctcag                                     27<210>25<211>35<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：PCR引物<400>25gagcccatgc ccggcctgat ctcagcccga ggaca                            35<210>26<211>34<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：PCR引物<400>26ccctggctga ggccgctggc tagtgggact ctgc                              34<210>27<211>31<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：杂交<400>27ncaggtggtc cgtggggggc gccaagaccg g                                31<210>28<211>16<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：PCR引物<400>28ctaggagccc atgccc                                                  16<210>29<211>351<212>DNA<213>Homo sapiens<400>29atggctggag gaccgggatc tcgtgctcgt gcagcaggag cacgtggctg tcgtctgcgt 60tctcaactag tgccggtgcg tgcactcgga ctgggacacc gttccgacga actagtacgt 120tttcgttttt gttcaggatc ttgtcgtcgt gcacgttctc cgcatgatct atctctagca 180tctctactag gagccggagc actaagaccg ccgccgggat ctagacctgt atctcaacct 240tgttgtagac ctactagata cgaagcagta tctttcatgg acgtaaactc tacatggaga 300accgtagata gactatctgc aaccgcatgt ggctgtctag gatgataata g          351<210>30<211>414<212>DNA<213>Homo sapiens<400>30atgggccatc atcatcatca tcatcatcat catcactcga gcggccatat cgacgacgac 60gacaaggctg gaggaccggg atctcgtgct cgtgcagcag gagcacgtgg ctgtcgtctg 120cgttctcaac tagtgccggt gcgtgcactc ggactgggac accgttccga cgaactagta 180cgttttcgtt tttgttcagg atcttgtcgt cgtgcacgtt ctccgcatga tctatctcta 240gcatctctac taggagccgg agcactaaga ccgccgccgg gatctagacc tgtatctcaa 300ccttgttgta gacctactag atacgaagca gtatctttca tggacgtaaa ctctacatgg 360agaaccgtag atagactatc tgcaaccgca tgtggctgtc taggatgata atag       414<210>31<211>39<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：PCR引物<400>31aaggaaaaaa gcggccgcca tggaacttgg acttggagg                        39<210>32<211>39<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：PCR引物<400>32ttttttcctt ggcggccgct cagcccaggc agccgcagg                        39<210>33<211>16<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：PCR引物<400>33gagcgagccc tcagcc                                                 16

Claims (65)

1．分离的neublastin核酸，所述核酸含有SEQ ID NO:1,3,8,13,14,15,29和30中的任一个所示的序列。
2．核酸序列，其含有编码neublastin神经营养因子或其独特的亚区域的开放阅读框，该阅读框编码neublastin多肽的表达，所述多肽与SEQ IDNO:2,4,5,6,7,9,10,11,12和16具有至少70％的同源性。
3．核酸，它在高度严紧的溶液杂交条件下能与权利要求1或2的核酸特异性杂交。
4．核酸，其含有与权利要求3的核酸互补的核酸序列。
5．使用权利要求1至4之任一项的核酸的方法，所述方法包括在细胞中表达由所述核酸编码的多肽的步骤。
6．权利要求5的方法，其进一步包括给动物施用所述核酸，并在所述动物中表达所述多肽的步骤。
7．含有权利要求1至4之任一项的核酸的载体。
8．权利要求7的载体，其中所述载体是表达载体。
9．使用权利要求8的载体的方法，所述方法包括由所述核酸表达由所述核酸编码的多肽的步骤。
10．被权利要求1至4之任一项的核酸转化的细胞。
11．权利要求10的细胞，其中所述细胞选自哺乳动物细胞，真菌细胞，酵母细胞，昆虫细胞和细菌细胞。
12．权利要求11的方法，其中所述细胞是中国仓鼠卵巢细胞。
13．权利要求11的方法，其中所述细胞是得自哺乳动物中枢神经系统的细胞。
14．neublastin神经营养因子多肽，其含有SEQ ID NO:2,4,5,6,7,9,10,11,12和16中的任一个所示的氨基酸序列。
15．权利要求14的多肽，其中所述多肽是糖基化的多肽。
16．权利要求14的多肽，其中所述多肽由权利要求1至4之任一项的核酸所编码。
17．制备权利要求14至16之任一项的多肽的方法，所述方法包括由neublastin神经营养因子核酸表达所述多肽的步骤。
18．权利要求17的方法，所述方法包括在允许生产所述多肽的培养基中培养含有所述neublastin神经营养因子核酸的细胞的步骤。
19．权利要求18的方法，其进一步包括从所述培养基中回收所述多肽的步骤。
20．通过权利要求19的方法得到的纯化多肽。
21．组合物，其含有权利要求14至16和20之任一项的多肽和药物可接受载体。
22．多肽，其具有的氨基酸序列与SEQ ID NO:2,4,5,6,7,9,10,11,12和16中的任一个所示的序列至少90％同源。
23．施用权利要求14至16和20之任一项的多肽的方法，所述方法包括将所述多肽传递至体外细胞培养物或哺乳动物体内的步骤。
24．权利要求23的方法，其中所述施用包括全身性给药。
25．权利要求23的方法，其中所述哺乳动物患有选自下列的疾病：大脑局部缺血性神经元损伤，外伤性脑损伤，外周神经病，阿尔茨海默氏病，亨廷顿氏病，帕金森氏病，肌萎缩性侧索硬化和记忆减退。
26．权利要求23的方法，其中所述哺乳动物患有外周神经系统，髓质或脊髓的神经元失调。
27．治疗动物的神经变性疾病或失调的方法，所述方法包括给所述动物施用一种或多种SEQ ID NO:1,3,8,13,14,15,29和30所示的neublastin核酸。
28．治疗动物的神经变性疾病或失调的方法，所述方法包括给所述动物施用一种或多种SEQ ID NO:2,4,5,6,7,9,10,11,12和16所示的neublastin多肽。
29．抗体，所述抗体与SEQ ID NO:2,4,5,6,7,9,10,11,12和16所示的任一种多肽结合。
30．权利要求29的抗体，其中所述抗体是单克隆抗体。
31．测定动物的神经变性疾病或失调是否与neublastin神经营养因子多肽的活性改变有关的方法，所述方法包括步骤：(a)将得自所述动物的生物样品与权利要求29或30的抗体接触，和(b)测定所述抗体与所述蛋白质之间是否形成免疫复合物，以此判断所述神经元病症是否由所述neublastin神经营养因子多肽的活性水平改变所引起。
32．权利要求31的方法，其进一步包括将所述样品中形成的所述免疫复合物的水平与得自未患所述神经元病症的患者的相应生物样品中形成的所述免疫复合物水平相比较，并由所述比较结果确定所述疾病或病症是否由neublastin神经营养因子多肽活性异常所引起。
33．核酸，其含有SEQ ID NO:17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,31和32之任一个所示的序列。
34．生产SEQ ID NO:2,4,5,6,7,9,10,11,12和16所示的任一种多肽的方法，所述方法包括在允许生产多肽的条件下，培养含有SEQ ID NO:1,3,8,13,14,15,29和30所示的任一种核酸序列的细胞，并从培养基中回收多肽。
35．生产neublastin多肽的方法，所述方法包括：(a)将编码neublastin多肽表达的多核苷酸导入细胞或通过同源重组将调节序列导入细胞，以使调节序列能调节内源性neublastin基因的表达，从而产生neublastin生产细胞；(b)在导致neublastin多肽表达的培养条件下培养neublastin生产细胞。
36．neublastin多肽，其含有：(a)保守的Cys残基；(b)与SEQ ID NO:2,4,5,6,7,9,10,11,12和16所示的任一种序列至少70％同源的氨基酸序列，其中所述neublastin多肽表现出神经营养活性。
37．权利要求36的neublastin多肽，其中多肽具有SEQ ID NO:2的AA72-AA105所示的C末端氨基酸序列。
38．权利要求36的neublastin多肽，其中多肽具有SEQ ID NO:2的AA41-AA105所示的C末端氨基酸序列。
39．权利要求36,37或38之任一项的neublastin多肽，其中与SEQ IDNO:2,4,5,6,7,9,10,11,12和16所示的任一种序列的所述同源性大于85％。
40．权利要求36,37或38之任一项的neublastin多肽，其中与SEQ IDNO:2,4,5,6,7,9,10,11,12和16所示的任一种序列的所述同源性大于95％。
41．SEQ ID NO:2,4,5,6,7,9,10,11,12和16所示的任一种neublastin多肽，及其具有保守的氨基酸取代的变体。
42．权利要求41的neublastin多肽，其中保守的氨基酸取代占多肽残基总数的10％以下。
43．权利要求41的neublastin多肽，其中保守的氨基酸取代占多肽残基总数的2％以下。
44．权利要求41的neublastin多肽，其中保守的氨基酸取代是成熟序列中的单个氨基酸取代，其中经取代的和用于取代的氨基酸都是非环形的。
45．SEQ ID NO:17-28和31-32之任一个所示的分离的核酸序列。
46．分离的核酸序列，其含有SEQ ID NO:1的核苷酸721-865,SEQ IDNO:3的核苷酸718-861,SEQ ID NO:8的核苷酸718-861和SEQ IDNO:15的核苷酸1647-2136。
47．分离的核酸序列，其由权利要求46之任一个序列中的10-25个邻接的碱基对组成，或由权利要求46中的任一个序列所产生的10-25个邻接的碱基对组成。
48．分离的核酸序列，其含有SEQ ID NO:1的核苷酸1-10,SEQ ID NO:8的核苷酸1-57,SEQ ID NO:15的核苷酸1-974。
49．分离的核酸序列，其由权利要求48之任一个序列中的10-25个邻接的碱基对组成，或由权利要求48中的任一个序列所产生的10-25个邻接的碱基对组成。
50．鉴定，分离或扩增neublastin核酸序列的方法，所述方法包括使用权利要求45-49,43,44或45之任一项的核酸作为引物或探针。
51．通过权利要求50的方法分离的neublastin核酸。
52．分离的核酸序列，其含有SEQ ID NO:13或14所示的序列。
53．编码neublastin多肽的合成基因，所述合成基因如SEQ ID NO:29或30所示。
54．针对neublastin肽或neublastin多肽的抗体，其中使用下列肽中的任一种产生所述抗体：GPGSRARAAGARGC(SEQ ID NO:9的AA30-43)；LGHRSDELVRFRFC(SEQ ID NO:9的AA57-70)；CRRARSPHDLSL(SEQ ID NO:9的AA74-85)；LRPPPGSRPVSQPC(SEQ ID NO:9的AA94-107)；STWRTVDRLSATAC(SEQ ID NO:9的AA123-136)。CRLRSQLVPVRALGLGHRSDELVRFRFC(SEQ ID NO:9的AA43-70)；CRRARSPHDLSLASLLGAGALRPPPGSRPVSQPC(SEQ ID NO:9的AA74-107)；CRPTRYEAVSFMDVNSTWRTVDRISATAC(SEQ ID NO:9的AA108-136)。CRPTRYEAVSFMDVNST(SEQ ID NO:9的AA108-124)；和ALRPPPGSRPVSQPC(SEQ ID NO:9的AA93-107)。
55．权利要求36的neublastin多肽，其中所述多肽含有7个保守的半胱氨酸残基，它们位于SEQ ID NO:2中第8,35,39,72,73,101和103位，或SEQ ID NO:4和9中第43,70,74,107,108,136和138位。
56．试剂盒，该试剂盒在一个或多个容器中含有选自下列的物质：neublastin多肽，针对neublastin多肽的抗体，能与neublastin RNA杂交的核酸探针，或能引发扩增至少一部分neublastin基因的核酸引物对。
57．诊断或筛选受试者体内是否存在特征在于neublastin多肽水平异常的疾病或失调或产生所述疾病或失调的诱因的方法，所述方法包括测定所述neublastin多肽和编码neublastin多肽的RNA的水平，或测定得自受试者的样品中neublastin多肽的功能活性，其中neublastin多肽，neublastin RNA的水平或样品中neublastin多肽的功能活性相对于未患疾病或失调或不具有患疾病或失调之诱因的类似样品中发现的neublastin多肽，neublastin RNA的水平或neublastin的功能活性有所增加或降低，这表明存在疾病或失调或患有疾病或失调的诱因。
58．筛选纯化的neublastin多肽，或其衍生物或其片断，或者上述活性之调节剂的治疗或预防疾病之活性的方法，所述方法包括测定和比较衍生自或显示出疾病相关特征的细胞系或受试动物的细胞的表型，基因型，行为，存活或增殖的变化，所述细胞或动物已接触或施用了neublastin多肽，衍生物，片断或调节剂，所述变化是相对于未接触或施用过neublastin多肽，衍生物，片断或调节剂的细胞或动物中的表型，基因型，行为，存活或增殖而言的。
59．治疗哺乳动物中选自外周神经病的神经失调的方法，所述方法包括施用治疗有效量的neublastin多肽，其中所述外周神经病选自外伤-诱导的神经病，化学治疗-诱导的神经病，毒素-诱导的神经病，药物-诱导的神经病，维生素-缺乏-诱导的神经病；自发性的神经病和糖尿病性神经病。
60．权利要求23的方法，其中neublastin直接传递至中枢神经系统。
61．权利要求23的方法，其中通过皮下注射，静脉内给药或静脉内灌注给药全身性传递neublastin。
62．在计算机程序中使用权利要求1-4或45-49之任一项的一种或多种核酸序列鉴定，分离或检测新核酸序列的方法。
63．在固定底物或DNA芯片上使用权利要求1-4,33或45-49之任一项的一种或多种核酸序列鉴定，分离或检测新核酸序列的方法。
64．在计算机程序中使用权利要求14-16,20,22或36-44之任一项的一种或多种多肽的序列鉴定，分离或检测新核酸序列的方法。
65．鉴定候选化合物的方法，所述化合物能诱导neublastin-介导的生物学作用，所述方法包括步骤：(a)提供受试细胞，所述细胞当与neublastin接触时能被诱导表达可测产物；(b)将细胞暴露于候选化合物，并检测可测产物，所述可测产物的表达是候选化合物能诱导neublastin-介导的生物学作用的标志。
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