PL198599B1 - Izolowany kwas nukleinowy neublastyny, wektor ekspresji, izolowana komórka, polipeptyd, sposób wytwarzania polipeptydu, oczyszczony polipeptyd, kompozycja, zastosowanie polipeptydu, sekwencja kwasu nukleinowego primera, sposób wytwarzania peptydów, sposób wytwarzania peptydu neublastyny, syntetyczny gen, peptyd neublastyny, przeciwciało, zastosowanie czynnika neurotroficznego neublastyny i zastosowanie kwasu nukleinowego - Google Patents

Abstract

1. Izolowany kwas nukleinowy neublastyny zawieraj acy sekwencj e wybran a z grupy obejmuj acej: a) sekwencj e nukleotydow a SEQ ID nr: 1, b) sekwencj e nukleotydow a zawierajac a otwart a ramk e odczytu, która koduje ekspresj e pepty- du neublastyny lub polipeptydu z niej pochodz acego, posiadaj aca co najmniej 90% homologi e amino- kwasów (AA) do AA 1 -AA 105 w sekwencji SEQ ID nr: 2. c) kwas nukleinowy hybrydyzuj acy specyficznie w ostrych warunkach roztworu hybrydyzacyjne- go z kwasem nukleinowym posiadaj acym sekwencj e nukleotydow a SEQ ID nr: 1, lub jego nici a kom- plementarn a. d) kwas nukleinowy, który wykazuje co najmniej 70% homologii do sekwencji nukleotydowej SEQ ID nr: 1. e) kwas nukleinowy, który wykazuje co najmniej 70% homologii do sekwencji nukleotydowej SEQ ID nr: 1, zasad 405-719. 2. Kwas nukleinowy wed lug zastrz. 1, znamienny tym, ze kodowany polipeptyd stanowi ami- nokwasy AA 1 -AA 105 sekwencji SEQ ID nr: 2. 3. Kwas nukleinowy wed lug zastrz. 1, znamienny tym, ze kodowany polipeptyd stanowi SEQ ID nr: 5. PL PL PL PL PL PL

Description

Opis wynalazku

Dziedzina wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest izolowany kwas nukleinowy neublastyny, wektor ekspresji, izolowana komórka, polipeptyd, sposób wytwarzania polipeptydu, oczyszczony polipeptyd, kompozycja, zastosowanie polipeptydu, sekwencja kwasu nukleinowego primera, sposób wytwarzania peptydów, sposób wytwarzania peptydu neublastyny, syntetyczny gen, peptyd neublastyny, przeciwciało, zastosowanie czynnika neurotroficznego neublastyny i zastosowanie kwasu nukleinowego. Ogólnie wynalazek odnosi się do polipeptydów czynnika neurotroficznego, kwasów nukleinowych kodujących polipeptydy czynnika neurotroficznego, oraz przeciwciał, które specyficznie wiążą się z czynnikami neurotroficznymi.

Stan techniki

Czynniki neurotroficzne są naturalnie występującymi białkami, które sprzyjają przeżyciu komórek, utrzymują różnicowanie fenotypowe, zapobiegają degeneracji i wzmagają działalność komórek oraz tkanek nerwowych. Neurotroficzne czynniki izoluje się z tkanki nerwowej oraz tkanki nienerwowej, unerwionej przez system nerwowy i dziel się je na grupy funkcjonalne i spokrewnione strukturalnie, określane także jako rodziny, nadrodziny, lub podrodziny. Wśród nadrodzin czynnika neurotroficznego są nadrodzinny czynnika wzrostu fibroblastu, neurotrofina, i transformujący czynnik wzrostu-β (TGF-β). Poszczególne rodzaje czynników neurotroficznych są rozróżniane przez ich fizyczną budowę, ich interakcję ze złożonymi receptorami, i ich wpływowi na różne typy komórek nerwowych. Klasyfikowane w ramach nadrodziny TGF-β (Massague, i inni, Trends in Cell Biology, 1994 4 172-178) są ligandami czynnika neutroficznego otrzymanego z linii komórkowej gleju („GDNF”; WO 93/06116, załączony w niniejszym jako odniesienie), które obejmują GDNF, persefinę („PSP”; Milbrandt i inni, Neuron 1998 20 245-253, załączony jako odniesienie) oraz neurturynę („NTN”; WO 97/08196, załączony jako odniesienie). Ligandy podrodziny GDNF mają wspólną zdolność indukowania sygnalizowania przez receptor kinazy tyrozynowej RET. Te trzy ligandy podrodziny GDNF różnią się pod względem powinowactwa względnego w stosunku do rodziny receptorów neurotroficznych, receptorów GFRO.

Ze względu na wpływ czynników neurotroficznych na tkankę nerwową, istnieje potrzeba identyfikacji i charakteryzacji innych czynników neutroficznych do diagnozowania i leczenia schorzeń układu nerwowego.

Streszczenie wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest izolowany kwas nukleinowy neublastyny zawierający sekwencję wybraną z grupy obejmującej:

a) sekwencję nukleotydową SEQ ID nr: 1,

b) sekwencję nukleotydową zawierającą otwartą ramkę odczytu, która koduje ekspresję peptydu neublastyny lub polipeptydu z niego pochodzącego, posiadająca co najmniej 90% homologię do AA1-AA105 w sekwencji SEQ ID nr: 2.

c) kwas nukleinowy hybrydyzujący specyficznie w ostrych warunkach roztworu hybrydyzacyjnego z kwasem nukleinowym posiadającym sekwencję nukleotydową SEQ ID nr: 1, lub jego nić komplementarna.

d) kwas nukleinowy, który wykazuje co najmniej 70% homologii do sekwencji nukleotydowej

SEQ ID nr: 1; i

e) kwas nukleinowy, który wykazuje co najmniej 70% homologii do sekwencji nukleotydowej SEQ ID nr: 1, zasady 405-719.

Korzystnie, kwas nukleinowy według wynalazku stanowi taki kwas nukleinowy, który koduje polipeptyd AA1-AA105 sekwencji SEQ ID nr: 2.

Korzystnie kwas nukleinowy według wynalazku jest takim kwasem nukleinowym, że kodowany polipeptyd stanowi SEQ ID nr: 5, ewentualnie polipeptyd stanowi SEQ ID nr: 6, lub ewentualnie polipeptyd stanowi SEQ ID nr: 7.

Korzystnie kwas nukleinowy zawiera sekwencje SEQ ID nr: 3. W innym korzystnym wykonaniu wynalazku kwas nukleinowy jest w co najmniej 80% homologiczny do sekwencji polinukleotydowej prezentowanej jako SEQ ID nr: 1, ewentualnie co najmniej 90% homologiczny do sekwencji polinukleotydowej prezentowanej jako SEQ ID nr: 1.

Przedmiotem wynalazku jest także wektor ekspresji zawierający kwas nukleinowy jak zdefiniowano powyżej.

PL 198 599 B1

Przedmiotem wynalazku jest również izolowana komórka transformowana kwasem nukleinowym lub wektorem jak zdefiniowano powyżej.

Korzystnie, komórka według wynalazku może być komórką eukariotyczną, bardziej korzystnie komórką wybraną z grupy obejmującej komórki ssaków, grzybów i drożdży; jeszcze bardziej korzystnie, wybraną z grupy obejmującej komórkę jajnika chomika chińskiego, komórki HEK293, COS, PC12, HiB5, RN33b i ludzkie komórki rdzenia nerwowego.

Przedmiotem wynalazku jest również polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasową, która jest w co najmniej w 90% homologiczna z sekwencją aminokwasów od 1 do 105 w sekwencji SEQ ID nr: 2. Polipeptyd według wynalazku korzystnie jest kodowany przez kwas nukleinowy według wynalazku zdefiniowany powyżej.

Przedmiotem wynalazku jest także polipeptyd neurotroficznego czynnika neublastyny zawierający sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEQ ID nr: 2.

Przedmiotem wynalazku jest także polipeptyd neurotroficznego czynnika neublastyny zawierający sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEQ ID nr: 4.

Przedmiotem wynalazku jest także polipeptyd neurotroficznego czynnika neublastyny zawierający sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEQ ID nr: 5.

Przedmiotem wynalazku jest także polipeptyd neurotroficznego czynnika neublastyny zawierający sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEQ ID nr: 6.

Przedmiotem wynalazku jest także polipeptyd neurotroficznego czynnika neublastyny zawierający sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEQ ID nr: 7.

Korzystnie polipeptydy według wynalazku mogą być glikozylowane.

Przedmiotem wynalazku jest również sposób wytwarzania polipeptydów zdefiniowanych powyżej, polegający na tym, że dokonuje się ekspresji wspomnianego polipeptydu przez kwas nukleinowy czynnika neurotroficznego neublastyny. W sposobie tym korzystnie prowadzi się etap hodowli komórek zawierających wspomniany kwas nukleinowy czynnika neurotroficznego neublastyny w podłożu hodowlanym, które pozwala na wytwarzanie wspomnianego polipeptydu. Ewentualnie sposób ten może ponadto obejmować etap odzyskiwania wspomnianego polipeptydu z podłoża hodowlanego.

Przedmiotem wynalazku jest też oczyszczony polipeptyd otrzymany powyższym sposobem.

Przedmiotem wynalazku jest również kompozycja zawierająca polipeptyd według wynalazku i farmaceutycznie akceptowalny noś nik.

Przedmiotem wynalazku jest także zastosowanie polipeptydu według wynalazku do wytwarzania leku.

Korzystnie zastosowaniem polipeptydu jest wytworzenie leku do leczenia choroby neurodegeneracyjnej zawiązanej z uszkodzonymi i dotkniętymi urazem neuronami, takimi jak uszkodzenia urazowe nerwów obwodowych rdzenia i/lub rdzenia kręgowego, niedokrwiennnego uszkodzenia neuronów mózgu, neuropatii i zwłaszcza neuropatii obwodowej, choroby Alzheimera, choroby Huntingtona, choroby Parkinsona, stwardnienia zanikowego bocznego lub innych chorób neurodegeneracyjnych, i upoś ledzenia pamię ci zwią zanego z demencją .

Przedmiotem wynalazku jest także sekwencja kwasu nukleinowego primera PCR stanowiąca którąkolwiek z sekwencji przedstawionych jako SEQ ID nr: 17, 18, 19, 20, 23, 24, 25, 26 lub 28.

Przedmiotem wynalazku jest także sposób wytwarzania któregokolwiek z peptydów przedstawionych w sekwencji SEQ ID nr: 2, 4, 5, 6 lub 7, polegający na tym, że obejmuje hodowanie komórki, która zawiera jeden z kwasów nukleinowych z sekwencji przedstawionych jako sekwencje SEQ ID nr: 1 lub SEQ ID nr: 3, w warunkach umożliwiających wytwarzanie polipeptydu i odzyskiwanie tego polipeptydu w pożywki hodowli.

Przedmiotem wynalazku jest także sposób wytwarzania peptydu neublastyny według wynalazku polegający na tym, że:

a) wprowadza się polinukleotyd, który koduje ekspresję dla polipetydy neublastyny do komórki, lub wprowadza się sekwencję regulatorową poprzez rekombinację homologiczną do komórki, taką że sekwencja regulatorowa reguluje ekspresję genu endogennej neublastyny, dla wytworzenia komórki do produkcji neublastyny; i

b) hoduje się komórkę produkującą neublastynę w warunkach hodowli, które wywodują ekspresję polipeptydu neublastyny. Przedmiotem wynalazku jest również syntetyczny gen kodujący polipeptyd neublastyny, zawierający sekwencję przedstawioną w sekwencjach SEQ ID nr: 29 lub 30.

Przedmiotem wynalazku jest także peptyd neublastyny mający jedną z następujących sekwencji:

GPGSRARAAGARGC (aminokwasy 30-43 z SEQ ID nr: 9);

PL 198 599 B1

LGHRSDELVFRFC (aminokwasy 57-70 z SEQ ID nr: 9);

CRRARSPHDLSL (aminokwasy 74-85 z SEQ ID nr: 9);

LRPPPGSRPVSQPC (aminokwasy 94-107 z SEQ ID nr: 9);

STWRTVDRLSATAC (aminokwasy 123-136 z SEQ ID nr: 9).

CRLRSQLVPVRALGLGHRSDELVRFRFC (aminokwasy 43-70 z SEQ ID nr: 9);

CRRARSPHDLSLASLLGAGALRPPPGSRPVSQPC (aminokwasy 74-107 z SEQ ID nr: 9);

CRPTRYEAVSFMDVNSTWRTVDRLSATAC (aminokwasy 108-136 z SEQ ID nr: 9).

CRPTRYEAVSFMDVNST (aminokwasy 108-124 z SEQ ID nr: 9) oraz

ALRPPPGSRPVSQPC (aminokwasy 93-107 z SEQ ID nr: 9)

Przedmiotem wynalazku jest także przeciwciało wytworzone przeciw jednemu z peptydów zdefiniowanych powyżej.

Przedmiotem wynalazku jest także zastosowanie czynnika neurotroficznego neublastyny posiadającego sekwencję aminokwasową, która jest co najmniej w 70% homologiczna do którejkolwiek sekwencji w sekwencjach o numerach SEQ ID nr: 2, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 12 i 16 do wytwarzania leku do leczenia chorób oczu, które to choroby obejmują utratę fotoreceptorów w siatkówce u pacjentów dotkniętych zwyrodnieniem plamki żółtej, retinopatię barwnikową i jaskrę.

Przedmiotem wynalazku jest także zastosowanie kwasu nukleinowego zawierającego otwartą ramkę odczytu, który koduje ekspresję polipeptydu neublastyny posiadającego sekwencję aminokwasową, która jest co najmniej w 70% homologiczna z którąkolwiek sekwencją przedstawioną w sekwencji SEQ ID nr: 2, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 12 i 16 do wytwarzania leku do leczenia chorób oczu, które to choroby obejmują utratę fotoreceptorów w siatkówce u pacjentów dotkniętych zwyrodnieniem plamki żółtej, retinopatię barwnikową i jaskrę.

Jak opisano powyżej, wynalazek ten ogólnie odnosi się do nowych czynników neurotroficznych zwanych tutaj „neublastyną,” lub „NBN”. Neublastyna należy do podrodziny GDNF ponieważ zajmuje ona regiony o homologii takiej jak inne ligandy GDNF (patrz tabele 3 i 4, poniżej) i z powodu jej zdolności do interakcji z RET (patrz, np., Airaksinen i inni., Mol, Cell, Neuroscience, 1999 13 313-325), neublastyna jest nowym i unikalnym czynnikiem neurotroficznym. Inaczej niż inne ligandy GDNF, neublastyna wykazuje wysokie powinowactwo dla kompleksu receptora GFRa3-RET i unikatowych subregionów jego sekwencji aminokwasowej.

„Polipeptyd neublastynowy,” jak stosuje się w tym opisie wynalazku, oznacza polipeptyd który posiada aktywność neurotroficzną (np., jak opisano w przykładach 6, 7, 8, i 9) i obejmuje te 5 polipeptydów, które mają sekwencję aminokwasową posiadającą co najmniej 70% homologii w stosunku do polipeptydów ludzkiej „neublastyny” przedstawionych w AA-95-AA105 z SEQ ID nr: 2, AA1-AA105 z SEQ

ID nr: 2, AA-97-AA140 z SEQ ID nr: 4, AA41-AA140 z SEQ ID nr: 4 („pro”), AA1-AA140 z SEQ ID nr: 4, AA-80-AA140 z SEQ ID nr: 9 („dzikiego typu” prepro), AA-41-AA140 z SEQ ID nr: 9 (pro), AA1-AA140 z SEQ ID nr: 5 (dojrzały 140AA), AA1-AA116 z SEQ ID nr: 6 (dojrzały 116AA), AA1-AA113 z SEQ ID nr: 7 (dojrzały 113AA), AA1-AA-140 z SEQ ID nr: 10 (dojrzały 140AA), AA1-AA116 z SEQ ID nr: 11 (dojrzały 116AA), AA1-AA113 z SEQ ID nr: 12 (dojrzały 113AA), oraz i ich odmiany i pochodne. Oprócz tego, wynalazek obejmuje też te polipeptydy, które mają sekwencję aminokwasową posiadającą co najmniej 70% homologii w stosunku do polipeptydów „neublastyny” mysiej przedłożonych w AA1-AA224 z SEQ ID nr: 16.

Korzystnie, sekwencja C-terminalna wyżej określonych polipeptydów neublastynowych posiada sekwencją aminokwasową przedstawioną w AA72-AA105 z SEQ ID nr: 2 (czyli, AA107-AA140 z SEQ ID nr: 9), korzystniej AA41-AA105 z SEQ ID nr: 2 (czyli, AA76-AA140 z SEQ ID nr: 9), lub sekwencję aminokwasową przedstawioną w AA191-AA224 SEQ ID Nr: 16.

Także, korzystne jest aby polipeptyd neublastynowy zachowywał 7 zakonserwowanych reszt Cys które są charakterystyczne dla rodziny GDNF i dla nadrodziny TGF-beta. Korzystnie, polipeptyd neublastynowy posiada sekwencję aminokwasową o homologii większej niż 85%, najkorzystniej o homologii większej niż 95%, w stosunku do powyższych 25 sekwencji (czyli, AA-95-AA105 z SEQ ID nr: 2, AA₁-AA₁₀₅ z SEQ ID nr: 2, AA_-97-AA₁₄₀ z SEQ ID nr: 4, AA₁-AA₁₄₀ z SEQ ID nr: 4, AA_-41-AA₁₄₀ z SEQ ID nr: 4, AA-80-AA140 z SEQ ID nr: 9 („dzikiego typu” prepro), AA-41-AA140 z SEQ ID nr: 9 (pro), AA1-AA140 z SEQ ID nr: 5 (dojrzały 140AA), AA1-AA116 z SEQ ID nr: 6 (dojrzały 116AA), AA1-AA113 z SEQ ID nr: 7 (dojrzały 113AA), AA1-AA140 z SEQ ID Nr: 10 (dojrzały 140AA), AA1-AA116 z SEQ ID nr: 11 (dojrzały 116AA), AA1-AA113 z SEQ ID nr: 12 (dojrzały 113AA)), oraz AA1-AA224 z SEQ ID nr: 16.

„Kwas nukleinowy neublastyny”, oznacza polinukleotyd, który koduje polipeptyd neublastynowy. W związku z tym, wyizolowany kwas nukleinowy neublastyny oznacza cząsteczkę polinukleotydową

PL 198 599 B1 mającą otwartą ramkę odczytu o kodonach nukleotydowych, które podczas zetknięcia z odpowiednimi składnikami wymaganymi dla translacji, będą kodować, lub kodują, polipeptyd neublastynowy. Kwasy nukleinowe neublastyny według wynalazku mogą być RNA lub DNA, np., genomowym DNA, lub DNA, który jest komplementarny wobec i/lub transkrybowany z mRNA neublastyny („cDNA”). Tak więc, kwas nukleinowy neublastyny według wynalazku dodatkowo obejmuje cząsteczki polinukleotydowe, które hybrydyzują specyficznie, w surowych warunkach hybrydyzacji, z polinukleotydem, który koduje polipeptyd neublastynowy. Wynalazek ten odnosi się także do primerów kwasu nukleinowego, które są użyteczne w identyfikacji, izolacji i powielaniu polinukleotydów, które kodują polipeptydy neublastynowe, lub ich fragmenty. W pewnych postaciach realizacji wynalazku, niektóre z tych primerów są sondami specyficznymi wobec neublastyny użytecznymi do hybrydyzacji z kwasem nukleinowym neublastyny, lecz nie z kwasami nukleinowymi kodującymi innych członków rodziny GDNF. Przez „specyficzny”, „specyficzność”, lub „specyficznie”, rozumie się zdolność do hybrydyzacji z kwasem nukleinowym neublastyny oraz niezdolność do hybrydyzacji z kwasami nukleinowymi nieneublastynowymi, włączając niezdolność do hybrydyzacji z kwasami nukleinowymi które kodują wyjątkowo ligandy GDNF (np., GDNF, persefinę, oraz neurturynę).

W innej postaci realizacji wynalazku, za kwas nukleinowy neublastyny uważ a się taki, który jest komplementarny z polinukleotydem, który koduje polipeptyd neublastynowy, albo przez posiadanie komplementarnej sekwencji kwasu nukleinowego albo pokazanie, że hybrydyzuje on specyficznie, w bardzo surowych warunkach hybrydyzacji, z polinukleotydem, który koduje neublastynę . Poszczególne kwasy nukleinowe neublastyny obejmują, bez ograniczenia, przedstawione sekwencje kwasu nukleinowego i oznaczone SEQ ID Nr: 1, SEQ ID Nr: 3, SEQ ID Nr: 8, SEQ ID Nr: 13, SEQ ID Nr: 14, SEQ ID Nr: 15, SEQ ID Nr: 29 oraz SEQ ID Nr: 30 jak również primery SEQ ID Nr: 17-28, 31 i 32. Kwas nukleinowy neublastyny według wynalazku dodatkowo obejmuje unikatowy subregion, lub fragment, kwasu nukleinowego neublastyny, włączając bez ograniczenia fragmenty kwasu nukleinowego ukazane na fig. 8.

Kwasy nukleinowe neublastyny według wynalazku można stosować do ekspresji polipeptydu neublastynowego, np., przez ekspresję polipeptydu neublastynowego in vitro, lub przez podawanie kwasu nukleinowego neublastyny zwierzęciu w celu ekspresji in vivo. Kwasy nukleinowe neublastyny mogą wchodzić w skład wektora kwasu nukleinowego, np., wektora ekspresji lub wektora kloningowego. Kwas nukleinowy neublastyny może, lecz nie musi koniecznie, być utrzymywany, odtwarzany, przenoszony, lub może ulegać ekspresji jako część wektora kwasu nukleinowego. Rekombinowany wektor ekspresji zawierający sekwencję polinukleotydową neublastyny można wprowadzać i/lub utrzymywać w komórce. Komórki posiadające wektor neublastynowy mogą być prokariotyczne. Alternatywnie, kwas nukleinowy neublastyny można wprowadzać do komórki eukariotycznej, np., komórki eukariotycznej która zawiera odpowiednie możliwości obróbki potranslacyjnej polipeptydu do dojrzałego białka, i/lub odpowiednie możliwości do wydzielania polipeptydu do zewnętrznego środowiska komórki.

Wynalazek dodatkowo opisuje neublastynowy czynnik neurotroficzny, „neublastynę”. Neublastyna może występować w postaci polipeptydu, lub może być multimerem o dwóch lub więcej polipeptydach neublastynowych, np., dimer neublastynowy. Polipeptydy neublastynowe są połączone w postaci multimerów przez między cząsteczkowe połączenia strukturalne znane fachowcom, włączając bez ograniczenia interakcję cysteina-cysteina, wiązania siarczkowe, i interakcje nie kowalentne. Poszczególne polipeptydy neublastynowe obejmują, bez ograniczenia, sekwencję aminokwasową opisaną w niniejszym i oznaczoną SEQ ID Nr: 2; SEQ ID Nr: 4; SEQ ID Nr: 5; SEQ ID Nr: 6; SEQ ID Nr: 7; SEQ ID Nr: 9; SEQ ID Nr: 10; SEQ 5 ID NO: 11, SEQ ID Nr: 12 oraz SEQ ID Nr: 16.

Polipeptyd neublastynowy według wynalazku jest użyteczny do leczenia uszkodzenia w neuronie, włączając bez ograniczenia obumieranie neuronów i urazy neuronów. Nerwy obwodowe, które doświadczają urazu obejmują, lecz bez ograniczenia, nerwy rdzenia lub rdzenia kręgowego. Polipeptydy neublastynowe są użyteczne przy leczeniu chorób neurodegeneracyjnych, np., uszkodzenia nerwów w następstwie niedokrwienia mózgu; neuropatii, np., neuropatii obwodowej, choroby Alzheimera, choroby Huntingtona, choroby Parkinsona, stwardnienia zanikowego bocznego (ALS). Polipeptydy neublastynowe dodatkowo bierze się pod uwagę do stosowania przy leczeniu zaburzeń pamięci, np., zaburzeń pamięci związanych z demencją.

PL 198 599 B1

Krótki opis rysunków

Figura 1 jest obrazem fotograficznym dwóch odcisków northern sondowanych znakowanym ³²P cDNA neublastyny, porównującym relatywne poziomy ekspresji genu neublastyny w różnych ludzkich dorosłych typach tkanek (panel A) i w różnych regionach dorosłego ludzkiego mózgu (panel B).

Figura 2 jest obrazem fotograficznym odcisku northern sondowanego znakowanym ³²P cDNA neublastyny, porównującym ilość cDNA neublastyny po ekspresji w nie transfekowanej linii komórkowej, HiB5, z ilością cDNA neublastyny po ekspresji w linii komórkowej transfekowanej cDNA neublastyny, oraz z użyciem linii komórkowej transfekowanej cDNA GDNF-.

Figura 3 jest obrazem fotograficznym dwóch odcisków western, który porównuje stopień do jakiego białko neublastyny ulega ekspresji w nie transfekowanych komórkach HiB5 (tor 1) w stosunku do linii komórkowej HiB5 stabilnie transfekowanej cDNA neublastyny (tor 2), który sondowano albo przeciwciałem specyficznym wobec neublastyny Ab-2 (lewy odcisk; panel A) lub przeciwciałem specyficznym wobec neublastyny Ab-1 (prawy odcisk; panel B).

Figura 4 jest graficzną ilustracją wpływu neublastyny na przeżycie hodowanych szczurzych zarodkowych, dopaminergicznych, brzusznych neuronów śródmózgowiowych i aktywność ChAT w cholinergicznych neuronach ruchowych nerwu czaszkowego w pożywce pozbawionej surowicy. W szczególności, fig. 4A jest ilustracją krzywej odpowiedzi na dawkę dla rekombinowanego GDNF podczas aktywności ChAT (dpm/godzinę). Figura 4B jest ilustracją aktywności ChAT (dpm/godzinę) przy użyciu rozcieńczonej kondycjonowanej pożywki albo z komórek wytwarzających neublastynę lub wytwarzających GDNF. Figura 4C jest ilustracją liczby immunoreaktywnych komórek hydroksylazy tyrozynowej, na studzienkę.

Figura 5 jest ilustracją wpływu neublastyny wydzielonej z komórek HiB5pUbi1zNBN22 na działanie oraz przeżycie hodowli warstwowych świńskich zarodkowych dopaminergicznych brzusznych śródmózgowiowych neuronów hodowanych wspólnie albo z komórkami HiB5pUbi1zNBN22 (neublastyna) lub komórkami HiB5 (control). Figura 5A i Figura 5B ilustrują dopaminę uwalnianą do pożywki przy DIV12 [Dopamina (pmol/ml) - dzień 12) oraz DIV21 [Dopomina (pmol/ml) - dzień 21], odpowiednio. Figura 5C jest ilustracją liczby immunoreaktywnych komórek hydroksylazy tyrozynowej na hodowlę [komórki TH-ir na hodowlę] przy DIV21.

Figura 6 jest ilustracją wpływu in vivo neublastyny wytworzonej przez lentiwirusa na neurony nigral dopaminowe.

Figura 7 jest schematycznym wykresem struktury genomowej genu neublastyny, włączając primery kwasu nukleinowego, które można stosować do identyfikacji pełnej długości genu neublastyny, oraz ich orientacji przestrzennej w stosunku do genomowej sekwencji kodującej neublastynę (czyli genu).

Figura 8 jest ilustracją primerów specyficznych wobec neublastyny użytych do identyfikacji klonu cDNA kodującego ludzki polipeptyd neublastynowy, który hybrydyzuje z kwasami nukleinowymi, które kodują polipeptydy neublastynowe, lecz nie hybrydyzuje z kwasami nukleinowymi kodującymi innych znanych członków rodziny GDNF (czyli, GDNF, persefinę i neurturynę).

Figura 9 ilustruje aktywność neurotroficzną w hodowlach zdysocjowanych szczurzych grzbietowych korzeni komórek zwoju z różnych stadiów rozwojowych polipeptydu opisanych w niniejszym wynalazku w porównaniu z otrzymanymi z użyciem znanych czynników neurotroficznych [0 doświadczenie kontrolne (przy braku czynników); 1 w obecności GDNF; 2 w obecności neurturyny; 3 w obecności neublastyny według wynalazku; E12 dzień zarodkowy 12; E16 dzień zarodkowy 16; PO dzień narodzin; P7 dzień 7 po narodzinach; i P15 dzień 15 po narodzinach].

Figura 10 ilustruje wytwarzanie neublastyny z linii komórkowych CHO.

Figura 11 ilustruje porównanie wiązania neublastyny i GDNF z receptorami GFRa-1 i GFRa-3. Figura 12 jest obrazem fotograficznym western blot który ilustruje wiązanie przeciwciała antypeptydowego R30 i przeciwciała anty-peptydowego R31 z neublastyną.

Figura 13 jest obrazem żelu pokazującym ekstrakcję neublastyny przez powinowactwo wiązania na RETL3-Ig.

Figura 14 jest mapą plazmidu pET19b-Neublastin, razem z sekwencją syntetycznego genu Neublastyny.

Figura 15 jest mapą plazmidu pMJB164-HisNeublastin, razem z sekwencją syntetycznego genu HisNeublastyny.

PL 198 599 B1

Szczegółowy opis wynalazku

Zgłaszający zidentyfikował kwas nukleinowy, który koduje nowe czynniki neurotroficzne, określane jako „neublastyna,” lub „NBN.” Neublastyna jest członkiem podklasy czynników neurotroficznych pochodzących od linii komórkowej gleju (GDNF) czynników neurotroficznych z nadrodziny transformującego czynnika wzrostu β (TGF-β).

cDNA kodujący neublastynę początkowo zidentyfikowano w następujący sposób. Stosując algorytm TBLASTN 1.4.11 (Atschul i inni., Nucl. Acids Res. 1997 25 3389-3402) oraz ludzką persefinę jako zapytanie (GenBank Acc. No. AF040962), zidentyfikowano początkowo fragment o 290 bp w High-Throughput Genomic Sequence (HGTS) o dwóch ludzkich bakteryjnych sztucznych chromosomach (BAC) z dostępem do GenBank AC005038 i AC005051. AC005038 składa się z około 190,000 bp o 5 sąsiadujących nieuporządkowanych sekwencjach, a AC005051 składa się z około 132,000 bp o 12 sąsiadujących nieuporządkowanych sekwencjach. Fragment o 290 bp zidentyfikowany w dwóch klonach BAC jak udowodniono, posiada regiony homologiczne, lecz nie identyczne, do regionu kodującego 15 cDNA czynników neurotroficznych, ludzkiej persefiny.

Z tej sekwencji o 290 bp syntetyzowano dwa primery PCR specyficzne dla neublastyny (primer górnej nici [SEQ ID Nr: 17] oraz primer dolnej nici [SEQ ID Nr: 18]). Przeprowadzono skrining biblioteki cDNA ludzkiego mózgu płodowego. Początkowy skrining obejmował 96-studzienkowy skrining w oparciu o PCR z użyciem dwóch primerów PCR [SEQ ID Nr: 17 i 18] biblioteki cDNA „płytki głównej” z 500,000 klonów cDNA, zawierających około 5,000 klonów/studzienkę. Drugi przesiew w oparciu o PCR przeprowadzono na bibliotece cDNA ludzkiego mózgu płodowego „płytka dalsza” zawierającej masową hodowlę glicerolową E. coli z około 5,000 klonów/studzienkę.

Fragment o 102 bp [SEQ ID Nr: 13] zidentyfikowano w przesiewach w oparciu o PCR zarówno płytki głównej jak i płytki dalszej. Wyselekcjonowano dodatnie klony cDNA (posiadające fragment o 102 bp), powleczono na dwóch płytkach zawierających LB/antybiotyk, i hodowano przez noc. Z tych płytek, wyselekcjonowano całość 96 kolonii bakteryjnych i indywidualnie umieszczono w studzienkach nowej, 96-studzienkowej płytce PCR zawierającej zarówno primery PCR [SEQ ID Nr: 17 i 18] jak i pomocnicze odczynniki powielenia PCR. Następnie przeprowadzono powielenie PCR i 96 poszczególnych reakcji PCR analizowano przez elektroforezę w 2% żelu agarozowym. Następnie zidentyfikowano dodatnie kolonie z klonem, zawierającym fragment o 102 bp. DNA plazmidowy otrzymano z dodatniej kolonii zawierającej fragment o 102 bp i sekwencjonowano. Kolejna analiza sekwencji ujawniła obecność pełnej długości cDNA o 861 bp [SEQ ID Nr: 8]. Otwarta ramka odczytu (ORF) o 663 bp, lub region kodujący (CDS), zidentyfikowany w SEQ ID Nr: 8, koduje the pre-pro-polipeptyd (oznaczony „pre-pro-neublastyna”) i jest ukazany w SEQ ID Nr: 9. Na podstawie SEQ ID Nr: 9, zidentyfikowano trzy odmiany polipeptydów neublastynowych.

Odmiany te obejmują:

(i) polipeptyd o 140 AA oznaczony w niniejszym jako NBN140, który posiada sekwencję aminokwasową oznaczoną jako SEQ ID Nr: 10;

(ii) polipeptyd o 116 AA oznaczony w niniejszym jako NBN116, który posiada sekwencję aminokwasową oznaczoną jako SEQ ID Nr: 11; oraz (iii) polipeptyd o 113 AA oznaczony w niniejszym jako NBN113, który posiada sekwencję aminokwasową oznaczoną jako SEQ ID Nr: 12.

Całą sekwencję cDNA zawierającą nie poddany translacji DNA 5' o 782 bp, kodujący DNA o 663 bp, oraz 447 3' nie poddany translacji (całość 1992 bp) poddano do GenBank przy numerze dostępu AF 120274.

Sekwencje genomowe kodujące neublastynę zidentyfikowano następująco:

W celu przeprowadzenia kloningu genomowej sekwencji kodującej neublastynę, wytworzono dodatkowy zbiór primerów. W szczególności, para primerów nr. 1 zawierała [sensowna = SEQ ID Nr: 23 oraz antysensowna = SEQ ID Nr: 24] a para primerów nr. 2 zawierała [sensowna = SEQ ID Nr: 25 i antysensowna = SEQ ID Nr: 26].

Stosując parę primerów nr. 2, fragment DNA o 887 bp powielono przez PCR z preparatu ludzkiego genomowego DNA, i klonowano do wektora pCRII (Invitrogen) i transformowano do E. coli. Otrzymany plazmid sekwencjonowano i o 861 bp przypuszczalną sekwencję cDNA (kodującą białko zwane w niniejszym neublastyną) wywnioskowano (jak przedłożono w SEQ ID Nr: 3). Podobnie, stosując parę primerów nr. 1, otrzymano fragment DNA o 870 bp przez PCR ludzkiego genomowego DNA. W tym fragmencie odkryto dodatkowy region 42 bp na końcu 3' otwartej ramki odczytu (ORF), w porównaniu z sekwencją o 887 bp. Genomową strukturę genu neublastyny wywnioskowano porów8

PL 198 599 B1 nując ją z sekwencjami kwasów nukleinowych innych czynników neurotroficznych, przez mapowanie granic egzon-intron. Ta analiza pokazała, że gen neublastyny posiada co najmniej dwa egzony rozdzielone intronem o 70 bp.

Sekwencję tę użyto także do przesiania GenBank pod względem sekwencji EST neublastyny. Zidentyfikowano trzy z wejściami GenBank AA844072, AA931637 i AA533512, wskazując, że kwasy nukleinowe neublastyny są transkrybowane do mRNA.

Uzyskane porównanie całej sekwencji cDNA (AF 120274) sekwencji genomowej obecnej w wejś ciach GenBank AC005038 i AC005051 ujawnił o, ż e gen neublastyny skł ada się z co najmniej pięciu egzonów (włączając trzy kodujące) rozdzielone czterema intronami (patrz, np., fig. 8). Razem, egzony posiadają przewidywaną sekwencję aminokwasową pełnej długości polipeptydu neublastyny. Należy także zauważyć, że odkryto iż fragment o 887 bp zawiera cały region kodujący proneublastynę. Przewidywany cDNA [SEQ ID Nr: 3] zawiera otwartą ramkę odczytu (ORF) kodującą proneublastynę (reszt aminokwasowych 181), które wykazywały homologię do trzech znanych ludzkich białek - persefiny, neurturyny, oraz GDNF.

Kwasy nukleinowe neublastyny według wynalazku

W innym aspekcie wynalazek zastrzega polinukleotydy zdolne do ekspresji polipeptydów według wynalazku. Polinukleotydy według wynalazku obejmują sekwencje DNA, cDNA oraz RNA, jak również antysensowne sekwencje, i obejmują naturalnie występujące, syntetyczne, oraz celowo manipulowane polinukleotydy. Polinukleotydy według wynalazku obejmują także sekwencje, które są zdegenerowane jako rezultat kodu genetycznego, lecz które kodują, podczas ekspresji, polipeptyd neublastynowy.

Jak określono, termin „polinukleotydy” odnosi się do polimerycznej postaci nukleotydów o co najmniej 10 zasadach długości, korzystnie co najmniej o 15 zasadach długości. Przez „izolowany polinukleotyd” rozumie się polinukleotyd, który nie sąsiaduje bezpośrednio z obiema sekwencjami kodującymi, z którymi bezpośrednio sąsiaduje (jedna na końcu 5' i jedna na końcu 3') w naturalnie występującym genomie organizmu, od którego pochodzi. Termin obejmuje zatem rekombinowany DNA, który wprowadza się do wektora ekspresji, do autonomicznie replikującego plazmidu lub wirusa, lub do genomowego DNA prokarioty lub eukarioty, lub który istnieje jako oddzielna cząsteczka, np., cDNA, niezależnie od innych sekwencji.

Polinukleotydy według wynalazku obejmują także odmiany alleliczne oraz „polinukleotydy zmutowane” mające sekwencję nukleotydową różniącą się sekwencji nukleotydowych przedstawionych w niniejszym w jednej lub więcej pozycji nukleotydowych.

W zalecanej postaci realizacji, polinukleotyd według wynalazku posiada sekwencję kwasu nukleinowego (DNA) zdolną do hybrydyzacji z sekwencją polinukleotydową przedstawioną jako SEQ ID Nr: 1, sekwencją polinukleotydową przedstawioną jako SEQ ID Nr: 3, sekwencją polinukleotydową przedstawioną jako SEQ ID Nr: 8, lub sekwencją polinukleotydową przedstawioną jako SEQ ID Nr: 15, jej nicią komplementarną, lub jej subsekwencją w warunkach co najmniej średnio, średnio/bardzo, lub bardzo surowych, jak opisano bardziej szczegółowo poniżej.

W innej zalecanej postaci realizacji, wyizolowany polinukleotyd według wynalazku posiada sekwencję kwasu nukleinowego (DNA), który jest co najmniej w 70%, korzystnie co najmniej w 80%, korzystniej co najmniej w 90%, najkorzystniej co najmniej w 95% homologiczny w stosunku do sekwencji polinukleotydowej przedstawionej jako SEQ ID Nr: 1, sekwencji polinukleotydowej przedstawionej jako SEQ ID Nr: 3, sekwencji polinukleotydowej przedstawionej jako SEQ ID Nr: 8, lub sekwencji polinukleotydowej przedstawionej jako SEQ ID Nr: 15.

W najbardziej zalecanej postaci realizacji wynalazku, polinukleotyd posiada sekwencję DNA przedstawioną jako SEQ ID Nr: 1, sekwencję DNA przedstawioną jako SEQ ID Nr: 3, sekwencję DNA przedstawioną jako SEQ ID Nr: 8, lub sekwencję polinukleotydów przedstawioną jako SEQ ID Nr: 15.

Wynalazek ten zastrzega także nowe primery i sekwencje DNA do identyfikacji, izolacji oraz powielania polinukleotydów neublastyny, które kodują, podczas ekspresji, polipeptydy neublastynowe lub ich fragmenty. Takie primery obejmują polinukleotydy przedłożone w SEQ ID Nr 17-28, oraz 31-32. Oprócz tego, wynalazek ten zastrzega sekwencje DNA neublastyny wytworzone z tych primerów, włączając przedłożone w SEQ ID Nr 13 i 14. Dodatkowo, wynalazek ten zastrzega sekwencje DNA od regionów nie poddanych translacji 3' lub 5' („UTR”) w genomowym DNA który oskrzydla egzony neublastyny; takie sekwencje są użyteczne przy identyfikacji, izolacji oraz powielaniu polinukleotydów neublastyny, które kodują podczas ekspresji polipeptyd neublastynowe lub ich fragmenty.

PL 198 599 B1

Sekwencje 3' UTR według tego wynalazku obejmują sekwencje przedłożone w:

nukleotydach 721-865 z SEQ ID nr: 1, nukleotydach 718-861 z SEQ ID nr: 3, nukleotydach 718-861 z SEQ ID nr: 8, nukleotydach 1647-2136 z SEQ ID nr: 15, oraz sekwencjach sąsiadujących o około 10-25 nukleotydach pochodzących od (czyli, wchodzących w zakres) powyż szych sekwencji (które są uż yteczne, np., jako primery).

Sekwencje 5' UTR według tego wynalazku obejmują sekwencje przedłożone w: nukleotydach 1-10 z SEQ ID nr: 1, nukleotydach 1-57 z SEQ ID nr: 8, nukleotydach 1-974 z SEQ ID nr: 15, oraz sekwencjach sąsiednich o około 10-25 nukleotydach pochodzących (czyli wchodzących w zakres) powyższych sekwencji (które są użyteczne, np., jako primery).

Polinukleotydy według wynalazku można korzystnie otrzymać przez procedury kloningowe, np., jak opisano w „Current Protocols in Molecular Biology” [John Wiley & Sons, Inc.]. W zalecanej postaci realizacji, polinukleotyd klonuje się, lub wytwarza na podstawie ludzkiego genomowego DNA lub biblioteki cDNA ludzkiego mózgu.

Homologia sekwencji DNA

Homologię sekwencji DNA przytaczanych powyżej można określić jako stopień identyczności między dwoma sekwencjami wskazując na pochodzenie pierwszej sekwencji od drugiej. Homologię można odpowiednio określić za pomocą programów komputerowych znanych w technice, takich jak GAP dostarczonych w pakiecie programowym GCG [Needleman, S.B. i Wunsch C.D., Journal of Molecular Biology 1970 48 443-453]. Stosując GAP z następującymi ustawieniami dla porównywania sekwencji DNA: sankcja tworzenia GAP 5.0 oraz GAP sankcja wydłużenia 0.3, region kodujący analogicznych sekwencji DNA przytaczanych powyżej wykazuje stopień identyczności korzystnie wynoszący co najmniej 70%, korzystniej co najmniej 80%, korzystniej co najmniej 90%, korzystniej co najmniej 95%, z CDS (kodującymi) dla część sekwencji DNA ukazanej w SEQ ID Nr: 1, lub CDS (kodującymi) dla części sekwencji DNA ukazanej w SEQ ID Nr; 3, lub CDS (kodującymi) dla części sekwencji DNA ukazanej w SEQ ID Nr: 8, CDS (kodującymi) dla części sekwencji DNA ukazanej w SEQ ID Nr: 15.

Termin „identyczność sekwencji” odnosi się do stopnia, w stosunku do którego dwie sekwencje polinukleotydowe są identyczne na podstawie nukleotyd za nukleotydem przez poszczególny region porównania. Termin „procent identyczności sekwencji” oblicza się przez porównanie dwóch optymalnie uszeregowanych sekwencji poprzez ten region porównania, określając liczbę pozycji przy których występują identyczne zasady kwasu nukleinowego (np., A, T, C, G, U, lub I) w obu sekwencjach, uzyskując liczbę pasujących pozycji, dzieląc liczbę pasujących pozycji przez całkowitą liczbę pozycji w regionie porównania (czyli, wielkość okienka), i mnożąc wynik przez 100 otrzymują c procent identyczności sekwencji. Termin „zasadnicza identyczność” jak stosuje się w niniejszym opisuje cechę sekwencji polinukleotydowej, w którym polinukleotyd obejmuje sekwencję, która posiada co najmniej 80 procent identyczności sekwencji, korzystnie co najmniej 85 procent identyczności a często 90 do 95 procent identyczność sekwencji, zwykle co najmniej 99 procent identyczność sekwencji w porównaniu z sekwencją referencyjną poprzez region porównania.

Protokół hybrydyzacji

Polinukleotydy według wynalazku to takie, które posiadają sekwencję kwasu nukleinowego zdolną do hybrydyzacji z sekwencją polinukleotydową przedstawioną jako SEQ ID Nr: 1, sekwencją polinukleotydową przedstawioną jako SEQ ID Nr: 3, lub sekwencją polinukleotydową przedstawioną jako SEQ ID Nr: 8, lub sekwencją polinukleotydową przedstawioną jako SEQ ID Nr: 15, lub ich nicią komplementarną, lub jej subsekwencją w warunkach co najmniej średnio, średnio/bardzo lub bardzo surowych, jak opisano bardziej szczegółowo poniżej.

Odpowiednie warunki doświadczalne dla określenia hybrydyzacji między sondą nukleotydową i homologiczną sekwencją DNA lub RNA, obejmują wstępne nasycenie filtra zawierającego fragmenty DNA lub RNA do hybrydyzacji, w 5 x SSC [chlorek sodu/cytrynian sodu; patrz Sambrook i inni.; Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, NY 1989] przez minut, oraz wstępną hybrydyzację filtra w roztworze 5 x SSC, 5 x roztwór Denhardt'a [patrz Sambrook i inni.; cytowane powyżej], 0,5% SDS oraz 100 μg/ml denaturowanej traktowanej dźwiękami spermy łososia DNA [patrz Sambrook i inni.; cytowane powyżej], następnie hybrydyzację w takim samym roztworze zawierającym stężenie wynoszące 10 ng/ml losowo zapoczątkowanej [Feinberg A P & Vogelstein 8; Anal. Biochem. 1983 132 6-13], znakowanej ³²P-dCTP (specyficzna aktywność > 1 x 10⁹ cpm/ng) sondy przez 12 godzin w temperaturze około 45°C. Następnie filtr przemywa się dwukrotnie

PL 198 599 B1 przez 30 minut w 0,1 x SSC, 0,5% SDS w temperaturze wynoszącej co najmniej 60°C (średnio surowe warunki), korzystnie co najmniej 65°C (średnio/bardzo surowe warunki), korzystniej co najmniej 70°C (bardzo surowe warunki), a nawet korzystniej co najmniej 75°C (niezwykle surowe warunki). Cząsteczki z którymi hybrydyzuje sonda oligonukleotydowa w tych warunkach, można wykryć stosując błonę rentgenowską.

Klonowane polinukleotydy

Wyizolowany polinukleotyd według wynalazku może być w szczególności klonowanym polinukleotydem. Jak określono, termin „klonowany polinukleotyd”, opisuje polinukleotyd lub sekwencję DNA klonowaną zgodnie ze standardowymi procedurami kloningowymi aktualnie stosowanymi w inżynierii genetycznej do przemieszczania segmentu DNA, którym może być w szczególności cDNA, czyli otrzymany enzymatycznie z RNA, od jego naturalnego położenia do innego miejsca gdzie zostanie odtworzony.

Kloning można uzyskać każdą odpowiednią drogą i może obejmować techniki takie jak technologia odwrotnej transkryptazy, technologia PCR, i inne, jak również odcinanie i izolacja żądanego segmentu DNA.

Klonowany polinukleotyd według wynalazku można alternatywnie nazwać „konstrukcją DNA” lub „izolowaną sekwencją DNA”; i może być w szczególności komplementarnym DNA (cDNA).

Wyizolowany polinukleotyd według wynalazku można otrzymać z każdego odpowiedniego źródła.

W zalecanej postaci realizacji, w którym polinukleotyd według wynalazku klonuje się, lub wytwarza na podstawie biblioteki cDNA, np., biblioteki cDNA płodowego lub dorosłego mózgu, w szczególności przodomózgowia, tyłomózgowia, kory, ciała prążkowatego, jądra migdałowatego, móżdżku, jądra ogoniastego, ciała modzelowatego, hipokampu, jądra wzgórzowego, jądra podwzgórzowego, jądra węchowego, skorupy, istoty szarej pnia mózgu, zwoju korzenia grzebietowego, zwoju trójdzielnego, większej tętnicy krezkowej, lub wzgórza wzrokowego; rdzenia kręgowego; serca; łożyska; płuca; wątroby; mięśnia szkieletowego; nerki; wątroby; trzustki; jelit; oka; siatkówki; zębiny; cebulki włosa; prostaty; przysadki; lub tchawicy.

Rynkowe biblioteki cDNA z różnych tkanek, zarówno ludzkich jak i nie ludzkich, są dostępne od np., Stratagene i Clontech. Wyizolowany polinukleotyd według wynalazku można otrzymać standardowymi metodami, np., opisanymi w przykładach.

Polipeptydy neublastynowe według wynalazku

Jak zauważono powyżej, „polipeptyd neublastynowy”, jak stosuje się w niniejszym, oznacza polipeptyd, który posiada aktywność neurotroficzną (np., jaką opisano w przykładach 6, 7, 8, i 9) i obejmuje te polipeptydy, które mają sekwencję aminokwasową posiadającą co najmniej 70% homologii w stosunku do polipeptydów „neublastynowych” przedłożonych w AA-95-AA105 z SEQ ID nr: 2,

AA₁-AA₁₀₅ z SEQ ID nr: 2, AA_-97-AA₁₄₀ z SEQ ID nr: 4, AA_-41-AA₁₄₀ z SEQ ID nr: 4, AA₁-AA₁₄₀ z SEQ ID nr: 4, AA-80-AA140 z SEQ ID nr: 9 („dzikiego typu” prepro), AA-41-AA140 z SEQ ID nr: 9 (pro), AA1-AA140 z SEQ ID nr: 5 (dojrzały 140AA), AA1-AA116 z SEQ ID nr: 6 (dojrzały 116AA), AA1-AA113 z SEQ ID nr: 7 (dojrzały 113AA), AA1-AA140 z SEQ ID nr: 10 (dojrzały 140AA), AA1-AA116 z SEQ ID nr: 11 (dojrzały 116AA), AA1-AA113 z SEQ ID nr: 12 (dojrzały 113AA), AA1-AA224 z SEQ ID nr: 16 (mysi prepro), oraz odmiany i pochodne każdego z powyższych.

Korzystnie, sekwencja C-terminalna wyżej określonych polipeptydów neublastynowych posiada sekwencję aminokwasową jaką przedłożono w AA72-AA105 z SEQ ID nr: 2 (czyli, AA107-AA140 z SEQ ID nr: 9), korzystniej AA41-AA105 z SEQ ID nr: 2 (czyli, AA76-AA140 z SEQ ID nr: 9).

Także, korzystne jest aby polipeptyd neublastynowy zachowywał 7 zakonserwowanych reszt Cys które są charakterystyczne dla rodziny GDNF i dla nadrodziny TGF-beta.

Korzystnie polipeptyd neublastynowy posiada sekwencję aminokwasową o homologii większej niż 85%, najkorzystniej o homologii większej niż 95%, w stosunku do powyższych sekwencji (czyli, AA_-95-AA₁₀₅ z SEQ ID nr: 2, AA_-95-AA₁₀₅ z SEQ ID nr: 2, AA₉₇-AA₁₄₀ z SEQ ID nr: 4, AA_-41-AA₁₄₀ z SEQ ID nr: 4, AA1-AA140 z SEQ ID nr: 4, AA-80-AA140 z SEQ ID nr: 9 („dzikiego typu” prepro), AA-41-AA140 z SEQ ID nr: 9 (pro), AA1-AA140 z SEQ ID nr: 5 (dojrzały 140AA), AA1-AA116 z SEQ ID nr: 6 (dojrzały 116AA), AA1-AA113 z SEQ ID nr: 7 (dojrzały 113AA), AA1-AA140 z SEQ ID nr: 10 (dojrzały 140AA), AA1-AA116 z SEQ ID nr: 11 (dojrzały 116AA), AA1-AA113 z SEQ ID Nr: 12 (dojrzały 113AA), AA1-AA224 z SEQ ID nr: 16 (mysi prepro), i korzystnie każdy z powyższych polipeptydów z sekwencją Cterminalną wyżej określonych polipeptydów neublastynowych, posiada sekwencję aminokwasową jaką przedłożono w AA72-AA105 z SEQ ID nr: 2 (czyli, AA107-AA140 z SEQ ID nr: 9), korzystniej AA41-AA105 z SEQ ID nr: 2 (czyli, AA76-AA140 z SEQ ID nr: 9) lub AA191-AA224 z SEQ ID nr: 16.

PL 198 599 B1

Oprócz tego, wynalazek ten bierze pod uwagę te polipeptydy, które mają sekwencję aminokwasową, posiadająca co najmniej 70% homologii to polipeptydów mysiej „neublastyny” przedłożonych w AA1-AA224 z SEQ ID nr: 16.

Wśród zalecanych polipeptydów według wynalazku jedna postać realizacji przedstawia preprosekwencję (jaką przedłożono odpowiednio w SEQ ID Nr 2, 4, 9, i 16), prosekwencję (jaką przedłożono w AA-75-AA105 z SEQ ID nr: 2, lub AA-41-AA140 z SEQ ID nr: 4 i 9, odpowiednio) oraz dojrzałą sekwencję neublastyny (jaką przedłożono w SEQ ID Nr 5, 6, 7, 10, 11, lub 12, korzystnie SEQ ID Nr 10, 11, 12).

Polipeptydy według wynalazku obejmują odmiany polipeptydów. W kontekście tego wynalazku, termin „odmiana polipeptydu” oznacza polipeptyd (lub białko) mający sekwencję aminokwasową różniącą się od sekwencji przedstawionej jako SEQ ID Nr: 2, SEQ ID Nr: 4, SEQ ID Nr: 5, SEQ ID Nr: 6, SEQ ID Nr: 7, SEQ ID Nr: 9, SEQ ID Nr: 10, SEQ ID Nr: 11, SEQ ID Nr: 12, lub SEQ ID Nr: 16, w jednej lub więcej pozycjach aminokwasowych. Takie odmiany polipeptydów obejmują polipeptydy modyfikowane opisane powyżej, jak również substytucje konserwatywne, odmiany splicingu, izoformy, homologi od innych gatunków, oraz polimorfizmy.

Jak określono tutaj, termin „substytucje konserwatywne” opisuje zastąpienie reszty aminokwasowej inną, biologicznie podobną resztą. Przykładowo, można oczekiwać, że konserwatywne substytucje aminokwasowe mają mały lub żadnego wpływu na aktywność biologiczną, szczególnie jeśli reprezentują one mniej niż 10% całkowitej ilości reszt w polipeptydzie lub białku. Korzystnie, konserwatywne substytucje aminokwasowi reprezentują zmiany w mniej niż 5% polipeptydu lub białka, najkorzystniej mniej niż 2% polipeptyd lub białka (np., przy obliczeniu zgodnie z NBN113, najkorzystniej substytucje konserwatyne będą reprezentować trochę więcej niż 3 substytucje aminokwasowe w dojrzałej sekwencji aminokwasowej dzikiego typu). W szczególnie zalecanej postaci realizacji, istnieje pojedyncza substytucja aminokwasowa w dojrzałej sekwencji, w której zarówno podstawiony jak i zastąpiony aminokwas są nie cykliczne.

Inne przykłady poszczególnych substytucji konserwatywnych obejmują substytucję jednej reszty hydrofobowej takiej jak izoleucyna, walina, leucyna lub metionina, na inną, lub substytucję jednej reszty polarnej na inną, tak jak substytucję argininy na lizynę, kwas glutaminowy na asparaginowy, lub glutaminy na asparaginę, i inne.

Termin substytucja konserwatywna obejmuje także stosowanie podstawionej reszty aminokwasowej w miejsce nie podstawionej rodzicielskiej reszty aminokwasowej pod warunkiem, że przeciwciała wzbudzone w stosunku do podstawionego polipeptydu także reagują immunologicznie z nie podstawionym polipeptydem.

Modyfikacje tej pierwotnej sekwencji aminokwasowej mogą dawać białka, które mają zasadniczo równoważną aktywność w porównaniu z nie modyfikowanym odpowiednikiem polipeptydowym, a więc można go uznać za funkcjonalnie analogiczny wobec białek rodzicielskich. Takie modyfikacje można rozważać, np., jako przez mutagenezę skierowaną miejscowo, lub mogą one występować spontanicznie, i obejmują odmiany splicingu, izoformy, homologi od innych gatunków, i polimorfizmy. Takie analogi funkcjonalne także bierze się pod uwagę zgodnie z wynalazkiem.

Ponadto, modyfikacje pierwotnej sekwencji aminokwasowej mogą dawać białka, które nie zachowywały aktywności biologicznej białka rodzicielskiego, włączając dominujące formy ujemne, itd. Dominujące ujemne białka mogą zakłócać białka dzikiego typu przez wiązanie, lub inaczej sekwestrację czynników regulacji, takich jak składniki powyżej lub poniżej, które normalnie oddziałują funkcjonalnie z polipeptydem. Takie dominujące formy ujemne są także rozważane zgodnie z wynalazkiem.

„Peptyd sygnałowy” oznacza sekwencję peptydową która kieruje nowo syntetyzowany polipeptyd, do którego peptyd sygnałowy jest dołączony, do retikulum endoplazmatycznego (ER) dla dodatkowej potranslacyjnej obróbki i rozprowadzenia.

„Heterologiczny peptyd sygnałowy,” jak stosuje się w niniejszym w kontekście neublastyny, oznacza peptyd sygnałowy który nie jest peptydem sygnałowym ludzkiej neublastyny, zazwyczaj peptydem sygnałowym niektórych białek ssaczych innych niż neublastyna.

Fachowcy poznają, że sekwencja DNA ludzkiej neublastyny (albo cDNA albo genomowy DNA), lub sekwencje które różnią się od DNA ludzkiej neublastyny albo z powodu cichych zmian kodonów albo zmian w kodonach, które tworzą konserwatywne substytucje aminokwasowe, można stosować modyfikacji genetycznej hodowanych ludzkich komórek tak że będą wykazywać nadekspresję i wydzielać enzym.

Polipeptydy według niniejszego wynalazku mogą tworzyć także polipeptydy chimeryczne lub możliwe do rozszczepienia polipeptydy fuzyjne w których drugi polipeptyd jest dołączony na końcu N

PL 198 599 B1 lub końcu C polipeptydu lub jego fragmentu. Polipeptyd chimeryczny można wytworzyć przez fuzję sekwencji kwasu nukleinowego (lub jej części) kodujących drugi polipeptyd z sekwencją kwasu nukleinowego (lub jej części) według niniejszego wynalazku.

Techniki wytwarzania polipeptydów chimerycznych są technikami standardowymi. Takie techniki zwykle wymagają łączenia sekwencji w taki sposób aby obie były w tej samej ramce odczytu, a ekspresja połączonego polipeptydu pod kontrolą takiego samego promotora (promotorów) i terminatora.

Polipeptydy według niniejszego wynalazku obejmują także formy skrócone pełnej długości cząsteczki neublastyny. W takich skróconych cząsteczkach, jeden lub więcej aminokwasów usunięto z końca N lub końca C, korzystnie końca N.

Homologia sekwencji aminokwasowej

Stopień, do którego kandydujący polipeptyd dzieli homologię z polipeptydem neublastynowym według wynalazku określa się jako stopień identyczności między dwiema sekwencjami aminokwasowymi. Wysoki poziom identyczności sekwencji wskazuje na prawdopodobieństwo, że pierwsza sekwencja pochodzi od drugiej.

Homologię określa się przez analizę komputerową, taką jak, bez ograniczeń, komputerowy program uszeregowania ClustalX [Thompson JD, Gibson TJ, Plewniak F, Jeanmougin F, & Higgins DG: The ClustalX windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools; Nucleic Acids Res. 1997, 25 (24): 4876-82], oraz domyślne parametry sugerowane w niniejszym. Stosując ten program, dojrzała część polipeptydu kodowana przez analogiczną sekwencję DNA według wynalazku, wykazuje stopień identyczności co najmniej 90%, korzystniej co najmniej 95%, najkorzystniej co najmniej 98% z sekwencją aminokwasową obecną w niniejszym jako SEQ ID Nr: 2, SEQ ID Nr: 4; SEQ ID Nr: 5; SEQ ID Nr: 6; SSQ ID Nr: 7; SEQ ID Nr: 9; SEQ ID Nr: 10; SEQ ID Nr: 11; SEQ ID Nr: 12, lub SEQ ID Nr: 16.

Na podstawie określenia homologli potwierdza się, że polipeptyd według wynalazku, należący do nadrodziny TGF-β, jest spokrewniony z podrodziną GDNF, lecz reprezentuje innego członka tej podrodziny.

Bioaktywne polipeptydy

Polipeptyd według wynalazku może występować w każdej biokatywnej postaci, włączając postać pre-pro-białek, pro-białek, dojrzałych białek, glikozylowanych białek, fosforylowanych białek, lub każdego innego białka modyfikowanego po translacyjnie.

Polipeptyd według wynalazku może być w szczególności polipeptydem N-glikozylowanym, który to polipeptyd korzystnie jest glikozylowany przy N-resztach zaznaczonych w liście sekwencji.

W zalecanej postaci realizacji, polipeptyd według wynalazku posiada sekwencję aminokwasową przedstawioną jako SEQ ID Nr: 9, utrzymującą glikozylowaną resztę asparaginową w pozycji 122; sekwencję aminokwasową przedstawioną jako SEQ ID Nr: 10, utrzymującą glikozylowaną resztę asparaginową w pozycji 122; sekwencję aminokwasową przedstawioną jako SEQ ID Nr: 11, utrzymującą glikozylowaną resztę asparaginową w pozycji 98; lub sekwencję aminokwasową przedstawioną jako SEQ ID Nr: 12, utrzymującą glikozylowaną resztę asparaginową w pozycji 95.

Polipeptyd według wynalazku może także istnieć pod postacią białka fuzyjnego neublastyny, takiego jak Ig-fuzje, jakie opisano, np., w patencie Stanów Zjednoczonych 5,434,131, załączonego jako odnośnik.

Polipeptyd według wynalazku można izolować z komórek ssaków, korzystnie z komórek ludzkich lub z komórki pochodzenia mysiego.

W najkorzystniej postaci realizacji, polipeptyd według wynalazku można izolować z tkanki ludzkiego serca, z ludzkiego mięśnia szkieletowego, z ludzkiej trzustki, lub z tkanki ludzkiego mózgu, w szczególności z jądra ogoniastego lub ze wzgórza wzrokowego, lub można go otrzymać z DNA pochodzenia ssaczego, jak omówiono bardziej szczegółowo poniżej.

Aktywność neurotroficzna.

Polipeptydy neublastynowe według wynalazku są użyteczne do regulacji metabolizmu, wzrostu, różnicowania, lub przeżycia nerwu lub komórki nerwowej. W szczególności, polipeptydy neublastynowe stosuje się do leczenia lub znoszenia schorzenia lub choroby żywego zwierzęcia, np., człowieka, które to schorzenie lub choroba odpowiada na aktywność czynników neurotroficznych. Takie traktowanie i metody są opisane bardziej szczegółowo poniżej.

Przeciwciała

Polipeptydy neublastynowe lub fragmenty polipeptydu według wynalazku stosuje się do wytworzenia przeciwciał specyficznych wobec neublastyny. „Przeciwciało specyficzne wobec neublastyny”

PL 198 599 B1 oznacza przeciwciało, np., przeciwciało poliklonalne lub przeciwciało monoklonalne, które jest immunoreaktywne w stosunku do polipeptydu neublastynowego lub fragmentu polipeptydu, lub które wiąże się specyficznie z epitopami polipeptydów neublastynowych.

Wytwarzanie przeciwciał poliklonalnych i monoklonalnych jest dobrze znane. Przeciwciała poliklonalne można w szczególności otrzymać jak opisano u np., Green i inni.: „Production of Polyclonal Antisera” in Immunochemical Protocols (Manson, Ed); Humana Press, 1992, strony 1-5; przez Coligan i inni.,: „Production of Polyclonal Antisera in Rabbits, Rats, Mice and Hamsters” w Current Protocols in Immunology, 1992, Section 2.4.1, oraz przez Ed Harlow i David Lane (wydawcy) w „Antibodies; A laboratory manual” Cold Spring Harbor Lab. Press 1988. Te protokoły załącza się w niniejszym jako odniesienie. Przeciwciała monoklonalne można w szczególności otrzymać jak opisano przez, np., Kohler & Milstein, Nature. 1975, 256:495; Coligan i inni., w Current Protocols in Immunology, 1992, Sections 2.5.1 - 2.6.7; oraz Harlow i inni., w Antibodies: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor, Pub., 1988, strona 726; które to protokoły załącza się jako odniesienie.

Przeciwciała monoklonalne można otrzymać przez wstrzyknięcie, np., myszom kompozycji zawierającej antygen, weryfikując obecność wytworzonego przeciwciała, przez usunięcie próbki surowicy, usuwając śledzionę aby otrzymać limfocyty B, łącząc limfocyty B z komórkami szpiczaka aby wytworzyć hybrydomy, klonując hybrydomy, selekcjonując klony dodatnie które wytwarzają przeciwciała w stosunku do antygenu, oraz izolują c przeciwciał a z hodowli hybrydom.

Przeciwciała monoklonalne można izolować i oczyszczać z hodowli hybrydom różnymi dobrze ustalonymi technikami, włączając chromatografię powinowactwa z A Sepharose białka, chromatografię ekskluzyjną pod względem wielkości, oraz chromatografię jono-wymienną, patrz, np., Caligan i inni. w Current Protocols in Immunology, 1992, sekcje 2.7.1 2.7.12, i sekcje 2.9.1 - 2.9.3; oraz Barnes i inni.: „Purification of Immunoglobulin G (IgG)” in Methods in Molecular Biology; Humana Press, 1992, Vol. 10, strony 79-104.

Przeciwciała poliklonalne lub monoklonalne można ewentualnie dodatkowo oczyszczać, np., przez wiązanie i wymywanie z matrycy, z którą związany jest polipeptyd, wobec którego przeciwciała zostały wzbudzone.

Przeciwciała, które wiążą się z polipeptydem neublastynowym według wynalazku można wytworzyć stosując nieuszkodzony polipeptyd lub fragmenty zawierające małe peptydy będące przedmiotem badań, jako antygen immunizujący. Polipeptyd użyty immunizacji zwierzęcia można otrzymać przez techniki rekombinacji DNA lub przez syntezę chemiczną, i można ewentualnie sprzęgać z białkami nośnikowymi. Powszechnie stosowane białka nośnikowe, które są chemicznie sprzężone z peptydem, obejmują hemocyjaninę doświadczalnego zapalenia stawów (KLH), tyroglobulinę, albuminę surowicy bydlęcej (BSA), oraz anatoksyna tężcowa. Następnie sprzężony peptyd można użyć do immunizacji zwierzęcia, którym może być w szczególności mysz, szczur, chomik lub królik.

W jednej postaci realizacji, przeciwciał a wytwarza się stosują c nastę pujące peptydy:

Peptyd 1: CRPTRYEAVSFMDVNST (aminokwasy 108-124 z SEQ ID nr: 9); lub Peptyd 2: ALRPPPGSRPVSQPC (aminokwasy 93-107 z SEQ ID nr: 9). Metody wytwarzania przeciwciała przy użyciu tych polipeptydów są opisane w przykładzie 10.

Wytworzyliśmy także królicze przeciwciała poliklonalne wobec następujących peptydów. Peptyd R27: GPGSRARAAGARGC (aminokwasy 30-43 z SEQ ID nr: 9); Peptyd R28: LGHRSDELVRFRFC (aminokwasy 57-70 z SEQ ID nr: 9); Peptyd R29: CRRARSPHDLSL (aminokwasy 74-85 z SEQ ID nr: 9); Peptyd R30: LRPPPGSRPVSQPC (aminokwasy 94-107 z SEQ ID nr: 9); oraz Peptyd R31: STWRTVDRLSATAC (aminokwasy 123-136 z SEQ ID nr: 9).

Z tej grupy, tylko peptydy R30 i R31, stosunkowo bliskie wobec ko ń ca C, rozpoznawał y denaturowane białka w warunkach redukujących na Western blot. Zidentyfikowaliśmy także dodatkowe peptydy pochodzące od neublastyny otrzymane od dojrzałego białka, jak wyszczególniono poniżej, który są przewidywanymi wystawionymi na powierzchnię pętlami w oparciu o znaną strukturę GDNF (Eigenbrot i Gerber, Mat. Struct. Biol., 1997 4 435-438), a więc są użyteczne do tworzenia przeciwciał:

Region 1: CRLRSQLVPVRALGLGHRSDELVRFRFC (AA43-70 z SEQ ID nr:9);

Region 2: CRRARSPHDLSLASLLGAGALRPPPGSRPVSQPC (AA74-107 z SEQ ID nr: 9);

Region 3: CRPTRYEAVSFMDVNSTWRTVDRLSATAC (AA108-136 z SEQ ID nr: 9).

W innym aspekcie według wynalazku, przeciwciała, które specyficznie wiążą neublastynę lub peptydy pochodzące od neublastyny, można stosować do wykrywania obecności takich neublastynowych czynników neurotroficznych w różnych środowiskach, a w szczególności do diagnozowania sta14

PL 198 599 B1 nów lub chorób związanych z cząsteczkami neublastynowmi według wynalazku. W technice znane są różne protokoły takiego wykrywania, włączając ELISA, RIA i FACS.

Przeciwciała według tego wynalazku można także stosować do blokowania wpływu czynników neurotroficznych, i mogą to być w szczególności przeciwciała neutralizujące.

Sposoby wytwarzania polipeptydów według wynalazku

Komórkę zawierającą sekwencję DNA kodującą polipeptyd neublastynowy według wynalazku hoduje się w warunkach pozwalających na wytwarzanie polipeptydu, po czym odzyskuje polipeptyd z pożywki hodowlanej, jak wyszczególniono poniżej. Jeśli komórki nie muszą być genetycznie modyfikowane do celów wytwarzania polipeptydu neublastynowego, komórki można modyfikować konwencjonalnymi metodami lub przez aktywację genu.

Zgodnie z konwencjonalnymi metodami, cząsteczka DNA, która zawiera cDNA neublastyny lub genomową sekwencję DNA, może być zawarta w konstrukcji ekspresji i transferowana do komórek standardowymi metodami włączając, lecz bez ograniczenia, transfekcje za pośrednictwem liposomu, polibrenu, lub DEAE dekstranu, elektroporację, strącanie fosforanem wapnia, mikorinjekcję, lub mikropociski napędzane prędkością („biolistyczne”). Alternatywnie, można stosować system który dostarcza DNA przez wektor wirusowy. Wirusy, o których wiadomo, że są użyteczne do przenoszenia genu obejmują adenowirusy, wirusy związane z adenowirusami, lentiwirus, herpeswirus, wirus świnki, poliowirus, retrowirusy, wirus Sindbis, i wirus ospy taki jak kanarków pokswirus, jak również zakażenie Bakulowirusem komórek owadzich, w szczególności komórek owadzich SfP9. Alternatywnie, komórki można modyfikować stosując podejście aktywacji genu („GA”), tak jak opisano w patencie Stanów Zjednoczonych 5,733,761 i 5,750,376, każdy załączony w niniejszym jako odniesienie.

W związku z tym, termin „genetycznie modyfikowane,” jaki stosuje się w niniejszym w odniesieniu do komórek, obejmuje w zamierzeniu komórki które wykazują ekspresję poszczególnego produktu genowego po wprowadzeniu cząsteczki DNA kodującego produkt genowy i/lub elementy regulatorowe które kontrolują ekspresje sekwencji kodującej pod względem produktu genowego. Cząsteczka DNA może być wprowadzona przez ukierunkowanie na gen, pozwolenie na wprowadzenie cząsteczki DNA w poszczególnym miejscu w genomie.

Rekombinowąne wektory ekspresji

W dodatkowym aspekcie wynalazek zastrzega rekombinowany wektor ekspresji, zawierający polinukleotyd według wynalazku. Rekombinowany wektor ekspresji według wynalazku może być każdym odpowiednim eukariotycznym wektorem ekspresji. Zalecanymi rekombinowanymi wektorami ekspresji są wektor zawierający promotor ubikwitynowy pTEJ-8 (Johansen TE, Schoeller MS, Tolstoy S, Schwartz T; FEBS Lett. 1990 267 289-294), i jego pochodne, np. pUbi1Z. Zalecanymi dostępnymi na rynku eukariotycznymi wektorami ekspresji są np. wektor zawierający promotor wirusowy pcDNA-3 (dostępny od Invitrogen). Inny zalecany wektor ekspresji wykorzystuje promotor SV40 wczesny i adenowirusowy główny późny (otrzmany z plazmidu pAD2beta; Norton i Coffin, Mol. Cell. Biol. 1985 5 281).

Wynalazek ten zastrzega także prokariotyczne wektory ekspresji i geny syntetyczne (syngeny) z optymalizacją kodonów pod względem ekspresji prokariotycznej. Syngeny skonstruowano obniżając zawartość GC oraz z zalecanymi kodonami bakteryjnymi (np., E. coli). Syngen klonuje się do dwóch wektorów, pET19b i pMJB164, pochodnej pET19b. Konstrukcja z pET19b jest ukazana w fig. 14. W tej konstrukcji, sekwencję kodującą dojrzałą domenę neublastyny łączy się bezpośrednio z początkową metioniną. Konstrukcją z pMJB164 jest ukazana w fig. 15.

Komórki produkcyjne

W jeszcze dodatkowym aspekcie wynalazek zastrzega komórkę produkcyjną manipulowaną genetycznie aby zawierała wyizolowaną sekwencję polinukleotydową według wynalazku, i/lub rekombinowąny wektor ekspresji według wynalazku. Komórka według wynalazku może w szczególności być manipulowana genetycznie w celu krótkotrwałej lub stabilnej ekspresji, nadekspresji lub koekspresji polipeptydu według wynalazku. Metody wytwarzania krótkotrwałej i stabilnej ekspresji są znane w technice.

Polinukleotyd według wynalazku może być wprowadzony do wektora ekspresji, np. plazmidu, wirusa lub innego nośnika ekspresji, i operacyjnie połączony z sekwencjami kontrolnymi ekspresji przez ligację w taki sposób, że ekspresję sekwencji kodującej uzyskuje się w warunkach zgodnych z sekwencjami kontrolnymi ekspresji. Odpowiednie sekwencje kontrolne ekspresji obejmują promotory, enhancery, terminatory transkrypcji, kodony startowe, sygnały splicingu dla intronów, oraz kodony przestankowe, wszystkie utrzymane w prawidłowej ramce odczytu polinukleotydu według wynalazku

PL 198 599 B1 tak aby pozwolić na prawidłową translację mRNA. Sekwencje kontrolne ekspresji mogą także obejmować dodatkowe składniki takie jak sekwencje liderowe oraz połączone sekwencje partnerskie.

Promotor może być w szczególności promotorem konstytutywnym lub indukowanym. Podczas kloningu w układach bakteryjnych, można użyć promotory indukowane, takie jak pL bakteriofaga λ, plac, ptrp, ptac (ptrp-lac promotor hybrydowy). Podczas kloningu w układach ssaczych, można użyć promotory otrzymane z genomu komórki ssaka, np. promotor ubikwitynowy, promotor TK, lub promotor metalotioneiny, albo od wirusów ssaczych, np. retrowirusowe powtórzenie długiego końca, późny promotor adenowirusa lub promotor wirusa krowianki 7.5K. Promotory otrzymane przez techniki rekombinacji DNA lub syntetyczne można także stosować do zapewnienia transkrypcji polinukleotydu według wynalazku.

Odpowiednie wektory ekspresji zwykle obejmują początek ekspresji, promotor jak również specyficzne geny które pozwalają na selekcję fenotypową transformowanej komórki, i obejmują wektory takie jak na wektor ekspresji bazie T7 do ekspresji w bakteriach [Rosenberg i inni; Gene 1987 56 125], wektory ekspresji pTEJ-8, pUbi1Z, pcDNA-3 oraz pMSXND do ekspresji w komórkach ssaków [Lee i Nathans, J. Biol. Chem. 1988 263 3521], wektory pochodzące od bakulowirusa do ekspresji w komórkach owadów, oraz oocytowe wektory ekspresji PTLN [Lorenz C, Pusch M & Jentsch T J: Heteromultimeric CLC chloride channels with novel properties; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996 93 1336213366].

W zalecanej postaci realizacji, komórka według wynalazku jest komórką eukariotyczną, np., komórką ssaka, np., komórką człowieka, oocytem, lub komórką drożdżową. Komórka według wynalazku może być bez ograniczenia ludzką komórką zarodkową nerki (HEK), np., komórką HEK 293, komórką BHK21, komórką jajnika chomika chińskiego (CHO), komórką jajową Xenopus laevis (XLO). W innej postaci realizacji, komórka według wynalazku jest komórką grzyba, np., komórką grzyba nitkowatego. W innej zalecanej postaci realizacji, komórka jest komórką owada, najkorzystniej komórką Sf9. Innymi zalecanymi komórkami ssaków według wynalazku są linie komórkowe PC12, HiB5, RN33b oraz ludzkie nerwowe komórki potomne.

Przykłady pierwotnych lub wtórnych komórek obejmują fibroblasty, komórki nabłonkowe włączając komórki gruczołu sutkowego oraz nabłonka jelita, komórki śródbłonka, elementy utworzone z krwi włączając limfocyty oraz komórki szpiku kostnego, komórki glejowe, hepatocyty, keratynocyty, komórki mięśniowe, komórki nerwowe, lub prekursory tych typów komórek.

Przykłady unieśmiertelnionych ludzkich linii komórkowych użytecznych w niniejszych sposobach obejmują, lecz bez ograniczenia, komórki Bowes Melanoma (ATCC numer dostępu CRL 9607), komórki Daudi (ATCC numer dostępu CCL 213), komórki HeLa i pochodne komórek HeLa (ATCC numery dostępu CCL 2, CCL 2.1, i CCL 2.2), komórki HL-60 (ATCC numer dostępu CCL 240), komórki HT-1080 (ATCC numer dostępu CCL 121), komórki Jurkat (ATCC numer dostępu TIB 152), komórki raka KB (ATCC numer dostępu CCL 17), komórki białaczki K-562 (ATCC numer dostępu CCL 243), komórki raka piersi MCF-7 (ATCC numer dostępu BTH 22), komórki MOLT-4 (ATCC numer dostępu 1582), komórki Namalwa (ATCC numer dostępu CRL 1432), komórki Raji (ATCC numer dostępu CCL 86), RPMI komórki 8226 (ATCC numer dostępu CCL 155), komórki U-937 (ATCC numer dostępu CRL 1593), komórki sub linii 2R4 WI-38VA13 (ATCC numer dostępu CLL 75.1), oraz komórki raka jajnika 2780AD (Van der Blick i inni Cancer Res. 1988 48 5927-5932), jak również komórki heterohybrydomy wytworzonej przez fuzję ludzkich komórek i komórek innych gatunków. Można także stosować wtórne szczepy ludzkich fibroblastów, takie jak WI-38 (ATCC numer dostępu CCL 75) i MRC-5 (ATCC numer dostępu CCL 171).

Jeśli komórka według wynalazku jest komórką eukariotyczną, wprowadzenie heterologicznego polinukleotydy według wynalazku można w szczególności przeprowadzić przez infekcję (wykorzystując wektor wirusowy), przez transfekcję (wykorzystując wektor plazmidowy), stosując wytrącanie fosforanem wapnia, mikroinjekcję, elektroporację, lipoinfekcję, lub inne fizyko-chemiczne metody znane w technice.

W bardziej zalecanej postaci realizacji izolowana sekwencję polinukleotydową według wynalazku, i/lub rekombinowany wektor ekspresji według wynalazku transfekuje się w ssaczej komórce gospodarza, nerwową komórką potomną, komórką gwiaździstą, komórką T, krwiotwórczą komórką macierzystą, komórką nie dzielącą się, lub mózgową komórką śródbłonkową, zawierającą co najmniej jedną cząsteczkę DNA zdolną do pośredniczenia w unieśmiertelnianiu komórek i/lub transformacji.

PL 198 599 B1

Aktywację genu endogenicznego w komórce gospodarza można uzyskać przez wprowadzenie elementów regulatorowych, w szczególności przez wprowadzenie promotora zdolnego do wpływania na transkrypcję genu endogenicznego kodującą polipeptyd neublastyny według wynalazku.

Kompozycje farmaceutyczne

W innym aspekcie wynalazek zastrzega nowe kompozycje farmaceutyczne zawierające terapeutycznie skuteczną ilość polipeptydu według wynalazku.

Do stosowania w terapii polipeptyd według wynalazku można podawać w każdej dogodnej postaci. W zalecanej postaci realizacji, polipeptyd według wynalazku wprowadza się do kompozycji farmaceutycznej razem z jednym lub więcej adujwantów, zaróbek, nośników i/lub rozcieńczalników, i kompozycję farmaceutyczną wytwarza osoba fachowa stosując konwencjonalne metody znane w technice.

Takie kompozycje farmaceutyczne mogą obejmować polipeptyd według wynalazku, lub jego przeciwciała. Kompozycję można podawać pojedynczo lub w połączeniu z jednym lub więcej innych czynników, leków lub hormonów.

Kompozycję farmaceutyczną według tego wynalazku można podawać każdą odpowiednią drogą, włączając, lecz bez ograniczenia stosowanie doustne, dożylne, domięśniowe, dotętnicze, do móżdżka, dokanałowe, dokomorowe, przeskórne, podskórne, dootrzewnowe, donosowe, do przodomózgowia, miejscowe, podjęzykowe lub doodbytnicze, dopoliczkowe, pochwowe, do oczodołu, domózgowe, doczaszkowe, do rdzenia, dokomorową, do cystern, wewnątrztorebkowe, dopłucne, przez błonę śluzową, lub przez inhalację.

Metody dostarczania dopłucnego, urządzenie i preparat lękowy są opisane, np., w patentach U.S. 5,785,049, 5,780,019, i 5,775,320, każdy załączony w niniejszym jako odniesienie. Podawanie może następować przez okresowe iniekcje dużej dawki preparatu, może być bardziej ciągłe przez podawanie dożylne lub dootrzewnowe z pojemnika zewnętrznego (np., torba do kroplówki dożylnej) lub wewnętrznego (np., implantu ulegającego biodegradacji, sztucznego narządu, lub kolonii wszczepionych komórek wytwarzających neublastynę). Patrz, np., patenty U.S. 4,407,957, 5,798,113, i 5,800,828, każdy załączony w niniejszym jako odniesienie. Metody dostarczania dopłucnego oraz urządzenie są opisane, np., w patentach U.S. 5,654,007, 5,780,014, i 5,814,607, każdy załączony w niniejszym jako odniesienie.

W szczególności, podawanie neublastyny według tego wynalazku można uzyskać stosując każdy odpowiedni sposób dostarczania, włączając:

(a) pompę (patrz, np., Annals of Pharmacotherapy, 27:912 (1993); Cancer, 41:1270 (1993); Cancer Research, 44:1698 (1984), załączony w niniejszym jako odniesienie), (b) mikrokapsułki (patrz, np., patenty Stanów Zjednoczonych 4,352,883; 4,353,888; i 5,084,350, w załączone niniejszym jako odniesienie), (c) polimerowe implanty o ciągłym uwalnianiu (patrz, np., Sabel, patent Stanów Zjednoczonych 4,883,666, załączony w niniejszym jako odniesienie), (d) makrokapsułki (patrz, np., patenty Stanów Zjednoczonych 5,284,761, 5,158,881, 4,976,859 i 4,968,733 i opublikowane zgłoszenia patentowe PCT WO 92/19195, WO 95/05452, każdy załączony w niniejszym jako odniesienie), (e) nagie lub kapsułkowane przeszczepy komórkowe do CNS (patrz, np., patenty Stanów Zjednoczonych 5,082,670 i 5,618,531, każdy załączony w niniejszym jako odniesienie);

(f) iniekcja, albo podskórna, dożylna, dotętnicza, domięśniowa, albo w inne odpowiednie miejsce; oraz (g) podawanie doustne, w kapsułce, płynie, tabletce, pigułce, lub preparacie do przedłużonego uwalniania.

W jednej postaci realizacji tego wynalazku, neublastynę dostarcza się bezpośrednio do CNS, korzystnie do komór mózgowych, parenchymy mózgowej, przestrzeni kanałowej lub innego odpowiedniego miejsca CNS, najkorzystniej dokanałowo.

W innej zalecanej postaci realizacji, rozważamy dostarczanie układowe przez iniekcję podskórną, podawanie dożylne, lub infuzję dożylną.

Inne użyteczne pozajelitowe układy dostarczania obejmują cząstki kopolimeru etylen-octan winylu, pompy osmotyczne, wszczepialne układy infuzyjne, dostarczanie pompą, dostarczanie kapsułkowanych komórek, dostarczanie przez liposomy, iniekcję za pomocą igły, iniekcję bez igły, nebulizator, urządzenie aerozolowe, elektroporację oraz plaster przeskórny.

PL 198 599 B1

Dodatkowe szczegóły technik sporządzania i podawania można znaleźć w ostatnim wydaniu Remington's Pharmaceutical Sciences (Maack Publishing Co., Easton, PA).

Składnik aktywny można podawać w jednej lub kilku dawkach dziennie. Aktualnie rozważane odpowiednie dawkowanie wynosi między 0,5 ng neublastyny/kg ciężaru ciała do około 50 μg/kg na podanie, i od około 1,0 ng/kg do około 100 μg/kg dziennie. Neublastynowa kompozycja farmaceutyczna powinna zapewnić miejscowe stężenie czynnika neurotroficznego wynoszące od około 5 ng/ml płynu mózgowo-rdzeniowego („CSF”) do 25 ng/ml CSF.

Podawana dawka musi oczywiście być ostrożnie wyregulowana w zależności od wieku, ciężaru i stanu leczonego osobnika, jak również drogi podawania, postaci i trybu dawkowania, oraz pożądanego wyniku, i dokładne dawkowanie powinno być oczywiście określone przez osobę praktykującą.

W dodatkowych postaciach realizacji, polipeptyd neublastynowy według wynalazku można podawać przez dostarczanie genetyczne, stosując linie komórkowe i wektory jakie opisano poniżej w metodach leczenia. Aby utworzyć takie terapeutyczne linie komórkowe, polinukleotyd według wynalazku może być wprowadzony do wektora ekspresji, np. plazmidu, wirusa lub innego nośnika ekspresji, i operacyjnie połączony z sekwencjami kontrolnymi ekspresji przez ligację w taki sposób, aby ekspresję sekwencji kodującej otrzymywało się w warunkach zgodnych z sekwencjami kontrolnymi ekspresji. Odpowiednie sekwencje kontrolne ekspresji obejmują promotory, enhancery, terminatory transkrypcji, kodony startowe, sygnały splicingu dla intronów, oraz kodony przestankowe, wszystkie utrzymywane w prawidłowej ramce odczytu polinukleotydu według wynalazku, tak aby pozwolić na prawidłową translację mRNA. Sekwencje kontrolne ekspresji mogą także obejmować dodatkowe składniki takie jak sekwencje liderowe fuzyjne sekwencje partnerskie.

Promotor może w szczególności być promotorem konstytutywnym lub indukowanym. Promotory konstytutywne mogą być syntetyczne, wirusowe lub otrzymane z genomu komórki ssaka, np. ludzki promotor ubikwitynowy. W zalecanej postaci realizacji terapeutyczną linią komórkową będzie ludzką unieśmiertelnioną linią komórek nerwowych wykazującą ekspresję polipeptydu według wynalazku. Pod względem wszczepiania, rozważamy wszczepianie między około 10⁵ do 10¹⁰ komórek, korzystniej 10⁶ do około 10⁸ komórek.

Metody leczenia

Niniejszy wynalazek, który odnosi się do polinukleotydów i białek, polipeptydów, fragmentów peptydów i pochodnych z nich wytworzonych, jak również do przeciwciał skierowanych przeciwko takim białkom, peptydom lub pochodnym, można stosować do leczenia lub znoszenia schorzenia lub choroby żywego organizmu zwierzęcego, włączając człowieka, które to schorzenie lub choroba odpowiada na aktywność czynników neurotroficznych.

Polipeptydy według niniejszego wynalazku można stosować bezpośrednio przez, np., wstrzyknięte, wszczepione zjedzone kompozycje farmaceutyczne do leczenia procesu patologicznego odpowiadającego na polipeptydy neublastyny.

Polinukleotyd według wynalazku, włączając jego sekwencje komplementarne, można użyć do ekspresji czynnika neurotroficznego według wynalazku. Można to uzyskać przez linie komórkowe wykazujące ekspresję takich białek, peptydy lub pochodne według wynalazku, lub przez wektory wirusowe kodujące takie białka, peptydy lub pochodne według wynalazku, lub przez komórki gospodarza wykazujące ekspresję takich białek, peptydy lub pochodne. Te komórki, wektory i kompozycje można podawać do leczenia obszarów docelowych wpływając na proces chorobowy odpowiadający na polipeptydy neublastynowe.

Odpowiednie wektory ekspresji mogą pochodzić od lentiwirusów, retrowirusów, adenowirusów, herpeswirusów lub wirusów ospy, lub od różnych bakteryjnie wytworzonych plazmidów, które można użyć do dostarczania in vivo sekwencji nukleotydowych całemu organizmowi lub docelowemu narządowi, tkance lub populacji komórek. Inne metody obejmują, lecz bez ograniczenia, transfekcję liposomową, elektroporację, transfekcję jądrem zawierającym peptydy nośnikowe lub inne sygnały lokalizujące, oraz dostarczanie genów poprzez systemy powolnego uwalniania. W jeszcze innym aspekcie według wynalazku, „antysensowne” sekwencje nukleotydowe komplementarne w stosunku do genu neublastyny lub jego części, można użyć do hamowania lub wzmacniania ekspresji neublastyny.

W jeszcze innym aspekcie wynalazek odnosi się do sposobu leczenia lub znoszenia schorzenia lub choroby żywego organizmu zwierzęcego, włączając człowieka, które to schorzenie lub choroba odpowiada na aktywność czynników neurotroficznych.

PL 198 599 B1

Schorzenie lub choroba może w szczególności być uszkodzeniem układu nerwowego spowodowanego przez uraz, operację, niedokrwienie, infekcję, choroby metaboliczne, niedobory pokarmowe, czynniki złośliwe lub toksyczne, oraz procesy genetyczne lub idiopatyczne.

Uszkodzenie może w szczególności wystąpić w neuronach czuciowych lub komórkach zwoju siatkówki, włączając neurony w zwoju korzenia grzbietowego lub w jakiejkolwiek z następujących tkanek: zwojach kolankowatych, skalistych i guzkowatych; kompleksie przedsionkowo-słuchowym VIII nerwu czaszkowego; biegunie brzusznobocznym urazu szczękowo-żuchwowego zwoju trójdzielnego; oraz jądra trójdzielnego śródmózgowia.

W zalecanej postaci realizacji sposobu według wynalazku, chorobą lub schorzeniem jest choroba neurodegeneracyjna obejmująca uszkodzone lub urażone neurony, takie jak uszkodzenia urazowe nerwów obwodowych, móżdżku, i/lub rdzenia kręgowego, uszkodzenie spowodowane niedokrwieniem mózgu, neuropatia a zwłaszcza neuropatia obwodowa, uszkodzenie lub zranienie nerwuobwodowego, wstrząs niedokrwienny, ostre uszkodzenie mózgu, ostre uszkodzenie rdzenia kręgowego, nowotwory układu nerwowego, stwardnienie rozsiane, kontakt z neurotoksynami, choroby metaboliczne takie jak cukrzyca albo dysfunkcja nerek i uszkodzenie spowodowane czynnikami zakaźnymi, schorzenia neurodegeneracyjne włączając chorobę Alzheimera, chorobę Huntington'a, chorobę Parkinson'a, zespoły Parkinson-Plus, postępujące porażenie nadjądrowe (zespół Steele-Richardson-Olszewski), Olivopontocerebellar Atrophy (OPCA), Shy-Drager Syndrome (atrofia wieloukładowa), kompleks demencji i parkinsonizmu Guamana, stwardnienie zanikowe boczne, lub każda inna choroba wrodzona lub neurodegeneracyjna, zaburzenia pamięci połączone z demencją.

W zalecanej postaci realizacji, rozważamy leczenie neuronów układu czuciowego i/lub autonomicznego. W innej zalecanej postaci realizacji, rozważamy leczenie chorób neuronu ruchowego takich jak stwardnienie zanikowe boczne („ALS) rdzeniową atrofię mięśniową. W jeszcze innej zalecanej postaci realizacji, rozważamy stosowanie cząsteczek neublastyny według tego wynalazku do poprawiania regeneracji nerwu po uszkodzeniu urazowym. W jednej postaci realizacji rozważamy stosowanie kanału przewodnictwa nerwowego z użyciem matrycy, zawierającej polipeptydy neublastynowe. Takie kanały przewodnictwa nerwowego opisano, np., w patencie Stanów Zjednoczonych Nr. 5,834,029, załączonym w niniejszym jako odniesienie.

W zalecanej postaci realizacji, polipeptydy i kwasy nukleinowe według tego wynalazku (oraz kompozycje farmaceutyczne zawierający je) stosuje się w leczeniu neuropatii obwodowych. Wśród neuropatii obwodowych branych pod uwagę do leczenia cząsteczkami według tego wynalazku są neuropatie indukowane urazem, np., powodowane przez fizyczne uszkodzenie lub stan chorobowy, fizyczne uszkodzenie mózgu, fizyczne uszkodzenie rdzenia kręgowego, udar związany z uszkodzeniam mózgu, oraz schorzenia neurologiczne pokrewne neurodegeneracji.

Rozważamy także leczenie neuropatii indukowanych chemioterapią (tak jak powodowanych przez dostarczenie czynników chemioterapeutycznych, np., taksolu lub cisplatyny); neuropatii indukowanych toksyną, neuropatii indukowanych lekami, neuropatii indukowanych niedoborem witamin; neuropatii idiopatycznych; oraz neuropatii cukrzycowych. Patrz, np., patenty Stanów Zjednoczonych 5,496,804 i 5,916,555, każdy załączony w niniejszym jako odniesienie.

Rozważamy także leczenie nie neuropatii, neuropatii pojedynczych i wielokrotnych, oraz wieloneuropatii, włączając neuropatie aksonową i demielizacyjną, stosując nukleotydy neublastynowe i polipeptydy według tego wynalazku.

W innej zalecanej postaci realizacji, polipeptydy oraz kwasy nukleinowe według tego wynalazku (i kompozycje farmaceutyczne zawierający je) stosuje się w leczeniu różnych schorzeń w oku, włączając utratę fotoreceptora w siatkówce u pacjentów mających zwyrodnienie plamki, barwnikowe zwyrodnienie siatkówki, jaskrę i podobne choroby.

Innym przedmiotem niniejszego wynalazku jest zastrzeżenie sposobu zapobiegania zmianom degeneracyjnym związanym z powyższymi chorobami i schorzeniami, przez wszczepienie do mózgu ssaka, włączając człowieka, wektory lub komórki zdolne do wytwarzania biologicznie aktywnej postaci neublastyny lub prekursora neublastyny, czyli cząsteczki, która w organizmie może się łatwo przekształcić w biologicznie aktywną postać, lub dodatkowo komórki które wydzielają neublastynę mogą być kapsułkowane, np. w błony półprzepuszczalne.

Komórki można hodować in vitro do stosowania w transplantacji lub wszczepiania do mózgu ssaka włączając człowieka.

W zalecanej postaci realizacji, gen kodujący polipeptyd według wynalazku transfekuje się do odpowiedniej linii komórkowej, np. do unieśmiertelnionej szczurzej nerwowej macierzystej linii komórPL 198 599 B1 kowej takiej jak HiB5 i RN33b, lub do ludzkiej unieśmiertelnionej nerwowej potomnej linii komórkowej, i otrzymaną linię komórkową wszczepia się w mózg żywego organizmu, włączając człowieka, aby wydzielała terapeutyczny polipeptyd według wynalazku w CNS, np. stosując wektory ekspresji opisane w międzynarodowym zgłoszeniu patentowym WO 98/32869.

Metody diagnozy i skriningu

Kwas nukleinowy neublastyny można stosować do określania czy osobnik jest predysponowany do rozwinięcia schorzenia neurologicznego wynikającego z defektu w genie neublastynowym, np., defektu w allelu neublastynowym, który nabyto przez, np., odziedziczalność genetyczną, przez nienormalny roztwór zarodkowy, lub przez nabyte uszkodzenie DNA. Analiza może być np., wykrywanie delecji lub mutacji punktowych w genie neublastynowym, lub wykrywanie dziedziczności predyspozycji do takich defektów genetycznych z specyficznymi polimerofizmami ograniczającymi długość fragmentu (RFLP), wykrywanie obecności lub normalnego genu neublastyny przez hybrydyzację próbki kwasu nukleinowego od pacjenta z sondą (sondami) kwasu nukleinowego specyficznymi dla genu neublastyny, oraz określanie zdolności sondy do hybrydyzacji z kwasem nukleinowym.

W szczególności, kwas nukleinowy neublastyny można stosować jako sondę hybrydyzacji. Takie testy hybrydyzacji można użyć do wykrywania, prognozowania, diagnozowania lub monitorowania różnych stanów, schorzeń, lub stanów chorobowych związanych z nienormalnym poziomem mRNA kodującego białko neublastynowe. Kwas nukleinowy neublastyny można skonstruować jako „marker” dla procesów fizjologicznych zależnych od czynników neurotroficznych. Procesy te obejmują, lecz bez ograniczenia, „normalne” procesy fizjologiczne (np., funkcję nerwową) oraz procesy patologiczne (np., chorobę neurodegeneracyjną). Charakteryzacja poszczególnych subpopulacji pacjentów z nienormalnym (czyli, podniesionym lub obniżonym) poziomem białka neublastynowego i lub mRNA kodującego neublastynę może prowadzić do nowej klasyfikacji chorobowej. Przez „nienormalny poziom,” jak określono w niniejszym, rozumie się zwiększony lub zmniejszony poziom w stosunku do próbki kontrolnej lub osobnika nie mającego schorzenia określonego środkami ilościowymi lub jakościowymi.

Kwasy nukleinowe neublastyny oraz polipeptydy według tego wynalazku można także stosować do skriningu i identyfikacji analogów neublastynowych, włączając małe cząsteczki naśladujące neublastynę. W jednej rozważanej postaci realizacji, wynalazek zastrzega sposób identyfikacji związku kandydującego który indukuje wpływ biologiczny za pośrednictwem neublastyny, przy czym sposób obejmuje etapy dostarczenia komórki testowej która po zetknięciu z neublastyna jest indukowana i wykazuje ekspresję wykrywalnego produktu, ekspozycję komórki wobec kandydują cego zwią zku, i detekcję wykrywalnego produktu. Ekspresja wykrywalnego produktu jest wskaź nikiem zdolnoś ci kadydującego związku do indukcji wpływu biologicznego za pośrednictwem neublastyny.

Dodatkowo, kwasy nukleinowe neublastyny i polipeptydy według tego wynalazku można użyć na płytkach DNA lub płytkach białek, lub w programach komputerowych do identyfikacji pokrewnych nowych sekwencji genowych i białek kodowanych przez nie, włączając odmiany alleliczne i pojedyncze polimorfizmy nukleotydowe („SNP”). Takie metody są opisane, np., w patencie Stanów Zjednoczonych Nos. 5,795,716; 5,754,524; 5,733,729; 5,800,992; 5,445,934; 5,525,464, każdy w niniejszym załączonym jako odniesienie.

Przykłady

P r z y k ł a d 1: Metody izolacji kwasów nukleinowych neublastyny

Metoda 1: Szybki skrining cDNA ludzkiego mózgu płodowego pod względem genu neublastyny

Zidentyfikowano fragment o 290 bp w dwóch genomowych sekwencjach o dobrej użyteczności (HGTS) poddanych GenBank (numer dostępu AC005038 i AC005051) przez swą homologię do ludzkiej persfeiny. Z sekwencji kwasu nukleinowego fragmentu o 290 bp, syntetyzowano dwa primery specyficzne dla neublastyny. Neublastynowy primer górnej nici („NBNint.sence”) miał sekwencję 5'-CCT GGC GAG CCT ACT GGG-3' [SEQ ID nr: 17]. Neublastynowy primer dolnej nici („NBNint.antisence”) miał sekwencję 5'-AAG GAG ACC GCT TCG TAG CG-3' [SEQ ID Nr: 18]. Stosując te primery, przeprowadzono 96-studzienkową reakcję PCR.

96-studzienkową płytkę główną, zawierającą plazmidowy DNA z 500,000 klonów cDNA, załadowano około 5000 klonów na studzienkę. 96-studzienkową płytkę dalszą wykorzystano przy hodowli masowej w glicerolu E. coli DH 10B zawierającej 50 klonów na studzienkę.

Kwas nukleinowy neublastyny zidentyfikowano trzy okrążenia powielenia stosując techniki reakcji łańcuchowej polimerazy („PCR”); powielenie zwiększa liczbę kopii kwasu nukleinowego w próbce. Skrining płytki głównej: Stosując technikę skriningową 96-studzienkowej PCR opisaną powyżej,

PL 198 599 B1 płytkę główną cDNA ludzkiego mózgu płodowego przesiano z primerami specyficznymi wobec genu aby wyizolować cDNA ludzkiej neublastyny.

Trzydzieścinanogramów (30 ng) cDNA ludzkiego mózgu płodowego (6 ng/μΐ; Origene Technologies) otrzymano z odpowiedniej studzienki płytki głównej i umieszczono w całkowitej objętości 25 μl która zawierała następujące odczynniki: 0,2 mM każdego z dwóch wyżej wspomnianych primerów specyficznych wobec genu (czyli, NBNint.sence i NBNint.antisence), 1x standardowy bufor PCR (Buffer V, Advanced Biotechnologies, UK), 0,2 mM dNTPs (Amersham-Pharmacia), 0,1 M GC-Melt (Clontech Laboratories, USA); oraz 0,5 jednostek polimerazy DNA Taq (5 U/gl; Advanced Biotechnologies, UK).

Reakcje termocykliczne PCR przeprowadzono stosując następującą procedurę i warunki. DNA początkowo zdenaturowano w temperaturze 94°C przez 3 minuty, a następnie przeprowadzono 35 cykli od denaturacji w temperaturze 94°C przez 1 minutę każdy, hybrydyzacji w temperaturze 55°C przez 1 minutę, pierwszego wydłużania w temperaturze 72°C przez 90 sekund; oraz końcowego wydłużania w temperaturze 72°C przez 5 minut. Produkty 96 poszczególnych reakcji PCR analizowano przez elektroforezę żelową stosując 2% żel agarozowy, zawierający barwnik bromek etydium. Dodatni produkt PCR o 102 bp, widoczny w studzience odpowiada jak odkryto unikatowej 96-studzienkowej płytce dalszej.

Fragment kwasu nukleinowego o 102 bp miał następującą sekwencję [SEQ ID NO. 13]:

5'-CCTGGCCAGCCTACTGGGCGCCGGGGCCCTGCGACCGCCCCCG

GGCTCCCGGCCCGTCAGCCAGCCCTGCTGCCGACCCACGCGCTACGAAGCGGTCTCCTT-3'

Skrining płytki dalszej: 96-studzienkową płytkę dalszą z ludzkim mózgiem płodowym przesiano przez powielenie za pośrednictwem PCR przez umieszczenie 1 gl hodowli masowej w glicerolu z odpowiadającej studzienki płytki dalszej, w całkowitej objętości 25 gl, która zawierała: 0,2 mM każdego z dwóch primerów specyficznych wobec genu; 1x standardowy PCR bufor (Buffer V; Advanced Biotechnologies, UK); 0,2 mM dNTPs (Amersham-Pharmacia); 0,1 M GC-Melt (Clontech Laboratories, USA); i 0,5 jednostek polimerazy DNA Taq (5 U/il; Advanced Biotechnologies, UK).

Wykorzystano takie same warunki termocyklingu PCR jak opisano dla skriningu płytki głównej. 96 poszczególnych reakcji PCR analizowano na 2% żelu agarozowym, zawierającym bromek etydium i zidentyfikowano dodatnią studzienkę która dała fragment PCR o 102 bp.

PCR kolonii: Jeden ml hodowli masowej w glicerolu z dodatniej studzienki płytki dalszej rozcieńczono 1:100 w bulionie Luria (LB). Następnie jeden ml i 10 ml wyżej wymienionego rozcieńczenia powleczono na dwóch oddzielnych płytkach agarowych zawierający bulion Luna („LB”), oraz 100 ig/ml karbenicyliny. Następnie płytki LB inkubowano przez noc w temperaturze 30°C. Z tych płytek, 96 kolonii zebrano do nowej 96-studzienkowej płytki PCR zawierającej: 0,2 mM każdego z dwóch wyżej wymienionych primerów specyficznych wobec genu, 1x standardowy bufor PCR (Buffer V; Advanced Biotechnologies, UK), 0,2 mM dNTP (Amersham-Pharmacia ), 0,1 M GC-Melt (Clontech Laboratories, USA), i 0,5 jednostek polimerazy DNA Taq (5 U/il; Advanced Biotechnologies, UK) w końcowej objętości wynoszącej 25 il.

Wykorzystano takie same warunki termocyklingu PCR jak opisano dla skriningu płytki głównej. Następnie 96 poszczególnych reakcji PCR analizowano na 2% żelu agarozowym zawierającym bromek etydium. Następnie zidentyfikowano dodatnią kolonię zawierającą fragment o 102 bp.

Sekwencjonowanie plazmidowego DNA wytworzonego z pozytywnej kolonii ujawniło pełnej długości cDNA o 861 bp [SEQ ID Nr: 8]. cDNA kodował preproneublastynę [SEQ ID Nr: 9]. Automatyczne sekwencjonowanie DNA przeprowadzono stosując zestaw do sekwencjonowania z terminatorem cyklu BigDye^® (PE Applied Biosystems, USA). Żele sekwencjonujące uruchomiono na ABI Prism 377 (PE Applied Biosystems, USA).

Metoda 2: Kloning cDNA neublastyny z ludzkiego mózgu:

Inną metodę powielania pełnej długości cDNA neublastyny lub fragmentu cDNA można przeprowadzić przez RACE (szybkie powielenie końców cDNA) i primery specyficzne dla neublastyny NBNint.sence oraz NBNint.antisence opisane powyżej, połączono z primerami specyficznymi dla wektora lub specyficznymi dla adaptora, np. stosując zestaw do powielania Marathon (Clontech Laboratories, USA, nr katalogowy. K1802-1).

Marathon-Ready cDNA całego ludzkiego mózgu (Clontech Laboratories, USA, nr katalogowy. 7400-1) można stosować do powielenia pełnej długości cDNA neublastyny. Użyteczne primery do powielania obejmują neublastynowy primer górnej nici 5'-ATGGAACTTGGACTTGG-3' [SEQ ID Nr: 19] („NBNext.sence”), oraz neublastynowy primer dolnej nici 5'-TCCATCACCCACCGGC-3' [SEQ

PL 198 599 B1

ID Nr: 20] („NBNext. Antisence”), połączony z primerem adapterowym AP1 zawartym w MarathonReady cDNA. Użyto także alternatywny primer górnej nici, 5'-CTAGGAGCCCATGCCC-3' [SEQ ID nr: 28]. Można także stosować dodatkowy alternatywny primer dolnej nici, 5'-GAGCGAGCCCTCAGCC-3' [SEQ ID nr: 33]. Podobnie, można także stosować alternatywny primer dolnej nici SEQ ID Nr: 24 i 26.

Metoda 3: Kloning cDNA neublastyny z ludzkiego mózgu:

Inną metodą kloningu cDNA neublastyny jest skrining bibliotek ludzkiego dorosłego lub płodowego mózgu jedną lub więcej sond neublastynowych opisanych w niniejszym (i pokazanych przykładowo w fig. 1). Te biblioteki obejmują: λgt11 ludzkiego mózgu (Clontech Laboratories, USA, numer katalogowy HL3002b); lub λgt11 ludzkiego mózgu płodowego (Clontech Laboratories, USA, numer katalogowy HL3002b).

Metoda 4: Szybki skrining mysiego płodowego cDNA pod względem genu neublastyny

Przeprowadzono procedurę szybkiego skriningu pod względem genu neublastyny w następujący sposób. 96-studzienkową płytkę główną, zawierającą plazmidowy DNA z 500,000 cDNA klonów, załadowano około 5000 klonów na studzienkę. A 96-studzienkową płytkę pomniejszą wykorzystano do hodowli masowej w glicerolu E. coli zawierającej 50 klonów na studzienkę. Przeprowadzono trzy okrążenia powielenia za pośrednictwem PCR w celu identyfikacji badanego genu (czyli, neublastyny).

Skrining płytki głównej: Płytkę główną z cDNA mysiego płodu przesiano przez 96-studzienkową PCR stosując primery specyficzne dla genu aby wyizolować mysi cDNA neublastyny. Syntetyzowano następujące dwa primery:

(1) neublastynowy primer C2 (NBNint.sence): 5'-GGCCACCGCTCCGACGAG-3' [SEQ ID nr: 21]; oraz (2) neublastynowy primer C2as (NBNint.antisence): 5'-GGCGGTCCACGGTTCTCCAG-3' [SEQ ID nr: 22]. Przez stosowanie tych dwóch primerów specyficznych dla genu zidentyfikowano dodatni produkt PCR o 220 bp. Kwas nukleinowy o 220 bp posiadał następującą sekwencję [SEQ ID nr: 14]:

5'-GGCCACCGCTCCGACGAGCTGATACGTTTCCGCTTCTGCAGCGG

CTCGTGCCGCCGAGCACGCTCCCAGCACGATCTCAGTCTGGCCAG

CCTACTGGGCGCTGGGGCCCTACGGTCGCCTCCCGGGTCCCGGC

CGATCAGCCAGCCCTGCTGCCGGCCCACTCGCTATGAGGCCGTCT

CCTTCATGGACGTGAACAGCACCTGGAGAACCGTGGACCGCC-3'

Następnie przeprowadzono reakcje 96-studzienkowej PCR w następujący sposób. Trzydzieści nanogramów cDNA mysiego mózgu płodowego (6 ng/gl; Origene Technologies) otrzymano z odpowiadającej studzienki płytki głównej i umieszczono w całkowitej objętości 25 gl która zawierała także: 0,2 mM każdego z dwóch wyżej wymienionych primerów specyficznych dla genów (czyli, primer C2 (NBNint.sence) i primer neublastyny C2as (NBNint.antisence)), 1x standardowy PCR bufor (Buffer V; Advanced Biotechnologies, UK), 0,2 mM dNTPs (Amersham-Pharmacia), 0,1 M GC-Melt (Clontech Laboratories, USA), i 0,5 jednostek polimerazy DNA Taq (5 U/gl; Advanced Biotechnologies, UK).

Wykorzystano następujące warunki termocyklingu PCR: początkowa denaturacja w temperaturze 94°C przez 3 minuty, następnie 35 cykli denaturacji w temperaturze 94°C przez 1 minutę każdy, hybrydyzacja w temperaturze 55°C przez 1 minutę, wydłużanie w temperaturze 72°C przez 90 sekund; i końcowe wydłużanie w temperaturze 72°C przez 5 minut. 96 poszczególnych reakcji PCR analizowano na 2% żelu agarozowym zawierającym barwnik bromek etydium. Dodatni produkt PCR o 220 bp, widoczny w studzience odpowiada jak odkryto unikatowej 96-studzienkowej płytce dalszej. Następnie 96 poszczególnych reakcji PCR analizowano przez elektroforezę żelową na 2% żelu agarozowym zawierającym barwnik bromek etydium. Dodatni produkt PCR o 220 bp który zidentyfikowano odpowiadał unikatowej studzience 96-studzienkowej płytki dalszej.

Skrining płytki dalszej: 96-studzienkową płytkę dalszą z mysim płodem przesiano przez powielenie za pośrednictwem PCR przez umieszczenie 1 gl hodowli masowej w glicerolu z odpowiadającej studzienki płytki dalszej do ostatecznej, całkowitej objętości wynoszącej 25 gl która zawierała: 0,2 mM każdego z dwóch wyżej wymienionych primerów specyficznych dla genu; 1x standardowy PCR bufor (Buffer V; Advanced Biotechnologies, UK); 0,2 mM dNTPs (Amersham-Pharmacia); 0,1 M GC-Melt (Clontech Laboratories, USA); i 0,5 jednostek polimerazy DNA Taq (5 U/gl; Advanced Biotechnologies, UK). Termocykling PCR przeprowadzono zgodnie z warunkami opisanymi powyżej dla przesiewu płytki głównej.

Następnie analizowano poszczególne 96 PCR reakcji na 2% żelu agarozowym zawierającym bromek etydium i zidentyfikowano dodatnią studzienkę, która wytworzyła fragment o 220 bp.

PCR kolonii: Jeden ml hodowli masowej w glicerolu z dodatniej studzienki płytki dalszej rozcieńczono 1:100 w bulionie Luria (LB). Następnie powleczono jeden ml i 10 ml wyżej wymienionego roz22

PL 198 599 B1 cieńczenia na dwóch oddzielnych płytkach LB, zawierających 100 μg/ml karbenicyliny, i inkubowano w temperaturze 30°C przez noc. Całość 96 kolonii wyizolowano i przeniesiono do 96-studzienkowej płytki PCR zawierającej: 0,2 mM każdego z dwóch wyżej wymienionych primerów specyficznych dla genu, 1x standardowy bufor PCR (Buffer V; Advanced Biotechnologies, UK), 0,2 mM dNTP (Amersham-Pharmacia); 0,1 M GC-Melt (Clontech Laboratories, USA), i 0,5 jednostek polimerazy DNA Taq (5 U/gl; Advanced Biotechnologies UK) w końcowej objętości wynoszącej 25 gl.

Termocykling PCR przeprowadzono zgodnie z warunkami opisanymi powyżej (patrz, „skrining płytki głównej”, poniżej). 96 poszczególnych reakcji PCR analizowano przez elektroforezę żelową na 2% żelu agarozowym zawierającym 5 bromek etydium. Zidentyfikowano dodatnią kolonię przez obecność fragmentu o 220 bp. z tej dodatniej kolonii wytworzono plazmidowy DNA. Klon sekwencjonowano przez automatyczne sekwencjonowanie DNA stosując zestaw do sekwencjonowania z terminatorem cyklu BigDye^® z polimerazą DNA AmpliTaq. Żele sekwencjonujące uruchomiono na ABI Prism 377 (PE Applied Biosystems). Otrzymana sekwencja tego klonu ujawniła pełnej długości cDNA o 2136 bp [SEQ ID nr: 15]. cDNA obejmuje otwartą ramkę odczytu z przewidywaną sekwencją aminokwasową ukazaną w SEQ ID nr: 16, która koduje mysi pre- pro- polipeptyd neublastyny.

P r z y k ł a d 2: Kloning genomowej neublastyny

Jak omówiono powyżej, zgłaszający zidentyfikowali fragment kwasu nukleinowego o 290 bp w dwóch ludzkich klonach BAC z wejściami w GenBank (z numerami dostępu AC005038 i AC005051) która posiadała regiony homologii do persefiny i do sekwencji oskrzydlających persefinę. Zgłaszający użyli przewidywaną sekwencję o 861 bp opisaną powyżej do zaplanowania dodatkowych primerów, w celu kloningu kwasu nukleinowego kodującego dodatkowo kwasy nukleinowe neublastyny, stosując Lasergene Software (DNAStar, Inc.). Dwie pary primerów użyto do klonowania genu neublastyny przez stosowanie reakcji PCR na genomowym DNA. Dwie pary primerów zilustrowano poniżej.

Para primerów nr. 1

5' CCA AgC CCA CCT ggg TgC CCT CTT TCT CC 3' (sensowny) [SEQ ID nr: 23].

5' CAT CAC CCA CCg gCA ggg gCC TCT CAg 3' (antysensowny) [SEQ ID nr: 24].

Para primerów nr. 2

5' gAgCCCAtgCCCggCCTgATCTCAgCCCgA ggACA 3' (sensowny) [SEQ ID nr: 25].

5' CCCTggCTgAggCCgCTggCTAgTgggACTCTgC 3' (antysensowne) [SEQ ID nr: 26].

Stosując parę primerów nr. 1, powielono fragment DNA o 887 bp z preparatu ludzkiego genomowego DNA nabytego od Clontech Laboratories, (numer katalogowy 6550-1).

Protokół PCR: PCR przeprowadzono stosując system PCR Expand(TM) High Fidelity (Boehringer Mannheim) z buforem 1. Mieszaninę reakcji PCR uzupełniono 5% dimetylosulfotlenkiem (DMSO) i 17,5 pmoli każdego dNTP w całkowitej objętości 50 gl. Termocykling przeprowadzono z etapem wstępnej denaturacji w temperaturze 94°C przez 2 minuty, następnie 35 dwuetapowych cykli w temperaturze 94°C przez 10 sekund, i temperaturze 68°C przez 1 minutę, odpowiednio. Termocykling zakończono przez inkubację w temperaturze 68°C przez 5 minut. Termocykling przeprowadzono w termocyklerze PTC-225 DNA Engine Tetrad (MJ Research, MA). Produkty PCR analizowano przez elektroforezę żelową na 2% agarozie (FMC) i następnie sfotografowano.

Fragment o 887 bp powielony z ludzkiego genomowego DNA z użyciem pary primerów nr. 1 klonowano do wektora pCRII (Invitrogen), i transformowano do XL 1-Blue kompetentnych komórek E. coli (Stratagene). Otrzymany plazmid, oznaczono neublastin-2, sekwencjonowano stosując Thermosequenase (Amersham Pharmacia Biotech). Produkty sekwencjonowania analizowano przez elektroforezy na automatycznym sekwenatorze ALFExpress (Amersham Pharmacia Biotech).

Fragmenty otrzymane przez powielenie PCR ludzkiego genomowego DNA z użyciem drugiej pary primerów (para primerów nr. 1, powyżej), sekwencjonowano, ujawniając dodatkowy region o 42 bp na uzbrojonym końcu 3' otwartej ramki odczytu. Pełnej długości sekwencję analizowano porówując ją w stosunku do sekwencji kwasów nukleinowych innych czynników neurotroficznych, jak również przez mapowanie ograniczeń egozn-intron stosując oprogramowania znajdujące geny, które identyfikują prawdopodobne połączenia splicingowe i regiony o wysokiej sile kodowania, stosując oprogramowanie Netgene i Gene Mark (Brunak i inni, J. Mol. Biol. 1991 220 49-65); Borodovsky i inni, Nucl. Acids Res. 1995 23 3554-62). Granice egzon-intron potwierdzono przez cDNA otrzymany z Rapid Screen opisanego powyżej.

Jak zilustrowano w fig. 7, otrzymany gen neublastyny posiada dwa egzony rozdzielone intronem o 70 bp. Razem, egzony mają przewidywaną sekwencję aminokwasową o pełnej długości polipeptydu neublastyny. Przewidywany cDNA [SEQ ID nr: 3] zawiera otwartą ramkę odczytu (ORF) koPL 198 599 B1 dującą 238 reszt aminokwasowych [SEQ ID nr: 4]. Klon Neublastin-2 zawierał pełną sekwencję kodująca pro-neublastyny. Sekwencja aminokwasowa kodowana przez gen wykazywała wysoką homologię do trzech białek, persefiny, neurturyny, i GDNF.

P r z y k ł a d 3: Ekspresja kwasów nukleinowych neublastyny

Ekspresję RNA neublastyny wykrywano zarówno w tkance nerwowej jak i nie nerwowej u gryzoni i u ludzi, i w różnych stadiach rozwojowych niedojrzałych i dorosłych, stosując techniki opisane poniżej.

Metoda wykrywania ekspresji RNA neublastyny przy użyciu RT-PCR: Na podstawie sekwencji DNA neublastyny zidentyfikowanej jako SEQ ID nr: 1, syntetyzowano następujące primery: (1) C2 primer neublastyny 5'-GGCCACCGCTCCGACGAG-3' [SEQ ID nr: 21], oraz (2) primer C2as neublastyny 5'-GGCGGTCCACGGTTCTCCAG-3' [SEQ ID nr: 22]. Ten zbiór primerów użyto do powielenia RT-PCR fragmentu DNA z dorosłego i płodowego mRNA całego ludzkiego mózgu. Wśród fragmentów DNA wytworzonych przez tę reakcję był jeden o 220 bp. Identyfikacja tego fragmentu DNA o 220 bp potwierdziła, że gen neublastyny ulega ekspresji w dorosłej i płodowej tkance mózgu. Fragment DNA o 220 bp powielono także z genomowego DNA z zastosowaniem tych primerów.

Metoda wykrywania ekspresji RNA neublastyny przez hybrydyzację northern blot: Northern blot z polyA+ RNA od dorosłej ludzkiej tkanki nabyto od rynkowego dostawcy (Clontech Laboratories, USA) i sondowano z użyciem znakowaneego ³²P cDNA neublastyny. Znakowany cDNA neublastyny wytworzono zgodnie z metodami opisanymi w przykładzie 1, powyżej.

Wytwarzanie sond: Fragment DNA kwasu nukleinowego neublastyny (nukleotydy 296-819 z SEQ ID nr: 8) oznakowano z użyciem zestawu do znakowania Rediprime II (Amersham; numer katalogowy RPN1633) w celu użycia jako sondy hybrydyzacji, zgodnie z rekomendacjami producenta. Krótko, próbkę DNA rozcieńczono do stężenia wynoszącego 2,5-25 ng w 45 μΐ 10 mM TE Buffer (10 mM Tris-HCI, pH 8,0, 1 mM EDTA). Następnie DNA denaturowano przez ogrzewanie próbki do temperatury 95-100°C przez 5 minut w łaźni z wrząca wodą, szybkie ochłodzenie próbki przez umieszczenie jej na lodzie przez 5 minut, i następnie krótkie wirowanie w celu sprowadzenia zawartości na dno rurki do wirowania. Całkowita ilość zdenaturowanego DNA dodano razem z 5 μl Redivue [32P] dCTP (Amersham Pharmacia Biotech Ltd.) w rurce reakcyjnej, zawierającej buforowany roztwór dATP, dGTP, dTTP, pozbawiony endonukleazy enzym Klenowa i losowym primerem w wysuszonej ustabilizowanej postaci. Roztwór wymieszano przez pipetowanie do góry i na dół 2 razy, poruszając zakończenie pipety w roztworze, i mieszaninę reakcyjną inkubowano w temperaturze 37°C przez 10 minut. Reakcję znakowania zatrzymano dodając 5 μl do 0,2 M EDTA. Do stosowania jako sondy hybrydyzacji znakowany DNA zdenaturowano do pojedynczych nici przez ogrzewanie próbki DNA do temperatury 95-100°C przez 5 minut, następnie krótkie ochłodzenie próbki DNA na lodzie przez 5 minut. Rurkę wirowano i jej zawartość dobrze wymieszano. Na koniec, sondę DNA o pojedynczej nici oczyszczono stosując Nucleotide Removal Kit (Qiagen).

Techniki hybrydyzacji: Wytworzone northern blots nabyto od rynkowego dostawcy („Multiple Tissue Northern Blots, Clontech Laboratories, USA; numery katalogowe 7760-1 i 7769-1) i hybrydyzowano zgodnie z instrukcjami producenta stosując neublastynową sondę znakowaną ³²P wytworzoną powyżej. Do hybrydyzacji, użyto ExpressHyb Solution (Clontech Laboratories, USA), i wykorzystano stężenie wynoszące około 3 ng/ml znakowanej sondy. Roztwór ExpressHyb ogrzano do temperatury 68°C i następnie mieszano do rozpuszczenia jakiegokolwiek osadu. Każda membranę northern blot (10x10 cm) wstępnie hybrydyzowano w co najmniej 5 ml ExpressHyb Solution w temperaturze 68°C przez 30 minut w Hybaid Hybridization Oven zgodnie z instrukcjami producenta. Neublastynową sondę znakowaną ³²P zdenaturowano w temperaturze 95-100°C przez 2 minuty i następnie stopiono szybko na lodzie. Czternaście mikrolitrów (14 μθ znakowanej sondy dodano do 5 ml świeżego ExpressHyb, dokładnie wymieszano. ExpressHyb Solution użyty we wstępnej hybrydyzacji zastąpiono równe rozmieszczenie na odciskach 5 ml świeżego ExpressHyb Solution zawierającego znakowaną sondę DNA. Odciski inkubowano w temperaturze 68 °C przez 1 godzinę w Hybaid hybridization Oven. Po inkubacji, odciski przepłukano i przemyto kilkakrotnie przy małej surowości (2x SSC bufor zawierający 0,05% SDS w temperaturze pokojowej) po czym przemyto z dużą surowością (0,1x SSC zawierający 0,1% SDS w temperaturze 50°C) [20X SSC oznacza 0,3 M NaCl/0,3 M cytrynian Na, pH 7.0]. Odciski wystawiono wobec Hyperfilm MP (Amersham Pharmacia Biotech Ltd.) w temperaturze -80°C stosując ekrany wzmacniające.

Wyniki doświadczeń hybrydyzacji northern blot przedstawione w fig. 1. fig. 1A (lewo) i fig. 1B (prawo) są northern blots polyA+ RNA który sondowano znakowanym ³²P cDNA neublastyny jak opi24

PL 198 599 B1 sano w przykładzie 3. Markery reprezentują polinukleotydy o 1.35 kilozasad („kb”), 2,4 kb, 4,4 kb,

7,5 kb, oraz 9,5 kb wielkości. Błonę z fig. 1A wytworzona z użyciem mRNA ekstrahowano z różnych dorosłych ludzkich tkanek: z wyników analizy hybrydyzacji northern blot, zgłaszający wnioskują, że mRNA neublastyny podlega ekspresji w wielu dorosłych tkankach ludzkich. Najwyższy poziom ekspresji neublastyny wykrywa się w sercu w mięśniach szkieletowych i trzustce. Błonę z fig. 1B wytworzoną z użyciem RNA ekstrahowano z różnych regionów dorosłego ludzkiego mózgu. W dorosłym mózgu, najwyższy poziom ekspresji jest widoczny w jądrze i we wzgórzu. Transkrypt mRNA o około 5 kb był najpowszechniejszą formą mRNA neublastyny ulegającej ekspresji w mózgu.

Metoda wykrywania ekspresji RNA neublastyny z zastosowaniem przez hybrydyzację in situ w tkankach:

Następujące techniki stosuje się do pomiaru ekspresji RNA neublastyny w tkankach zwierzęcych, np., tkankach gryzoni, z użyciem anty-sensownej sondy neublastynowej.

Ekspresja u myszy:

Wytwarzanie próbek tkankowych: Ciężarne myszy (B&K Universal, Stockholm, Szwecja) zabito przez przerwanie szyi, w dniu ciąży 13,5 lub 18,5. Zarodki usunięto przez wycięcie w jałowych warunkach, i bezpośrednio zanurzono w roztworze 0,1 M buforu fosforanowego (PB) zawierającego 4% paraformaldehyd („PFA”) na 24-30 godzin, i następnie usunięto z PFA i przechowywano w PBS. Wytworzono tkankę do przekrojów przez zanurzenie tkanki w roztworze 30% sacharozy, a następnie umocowanie jej w TissueTech (O.C.T. Compound, Sakura Finetek USA, Torrance, CA). Sześć serii przekrojów wieńcowych lub strzałkowych (12 μm każdy) pocięto na kriostacie, roztopiono, mocując na dodatnio naładowanych szkiełkach. Noworodkowe głowy/mózgi (P1, P7) utrwalono postępując zgodnie z takim samym protokołem jak dla etapów zarodkowych, i pocięto dorosłą tkankę mózgową, natychmiast zamrożono na suchym lodzie, i pocięto na krostacie bez żadnego wcześniejszego osadzania.

Wytwarzanie rybosond neublastynowych: Wykonano antysensowną sondę RNA neublastyny (w niniejszym potem przytaczaną jako „rybosonda neublastynowa”) w następujący sposób. Nukleotydy 1109-1863 mysiej sekwencji cDNA neublastyny [SEQ ID nr: 15] subklonowano do wektora BLueScript (Stratagene). Otrzymany plazmid pocięto do liniowego DNA stosując endonukleazę restrykcyjną EcoRI. Fragment DNA EcoRI transkrybowano in vitro z użyciem polimerazy RNA T3 i digoxigenin („DIG”) RNA Labelling Kit zgodnie z instrukcjami producenta (Boehringer Mannheim).

Hybrydyzacja: Przekroje z kriostatu utrwalono przez 10 minut w 4% PFA, traktowano przez 5 minut 10 mg/ml proteinazy K, odwodniowo kolejno w 70% i 95% etanolu odpowiednio przez 5 i 2 minuty, i następnie pozostawiono do wyschnięcia na powietrzu. Bufor hybrydyzacji (50% dejonizowany formamid, 10% 50% roztworu siarczanu dekstranu, 1% roztwór Denhardt'a 250 μg/ml yeast tRNA, 0,3 M NaCl, 20 mM Tris-HCI (pH 8), 5 mM EDTA, 10 mM NaPO₄, 1% sarkozyl) zawierający 1 μg/ml sondy znakowanej DIG ogrzano do temperatury 80°C przez 2 minuty i nałożono na przekroje. Następnie przekroje przykryto parafilmem i inkubowano w temperaturze 55°C przez 16-18 godzin.

Następnego dnia przekroje przemyto przy dużej surowości (2x SSC zawierający 50% formamid) w temperaturze 55°C przez 30 minut, a następnie przemyto w buforze RNase i inkubowano z 20 μg/ml RNaseA przez 30 minut w temperaturze 37°C. Aby wykryć sondę znakowaną DIG, przekroje wstępnie inkubowano w roztworze blokującym (PBS zawierającym 0,1% Tween-20 i 10% inaktywowaną gorącem surowice kozią) przez 1 godzinę i następnie inkubowano przez noc w temperaturze 4°C z 1:5000 rozcieńczeniem sprzężonego z fosfatazą alkaliczną przeciwciała anty-DIG (Boehringer Mannheim). Następnego dnia, każdy przekrój przemyto cztery razy po dwie godziny w PBS zawierającym 0,1% Tween-20, a następnie przemyto dwukrotnie po dziesięć minut w buforze NTMT (100 mM NaCl, 100 mM Tris-HCl (pH 9,5), 50 mM MgCl2, 0,1% Tween-20). Przekroje następnie inkubowano w substracie BM-purpury zawierającym 0,5 mg/ml lewamizolu przez 48 godzin. Reakcję barwną zatrzymano przez przemycie w PBS, przekroje wysuszono na powietrzu i nakryto szkiełkiem nakrywkowym z DPX (KEBO-lab, Szwecja).

Wyniki reakcji hybrydyzacji in situ przedstawia się w tabeli 1.

T a b e l a 1:

Ekspresja neublastyny u myszy

Struktura	E13.5	E78.5	P1	P7	Adult
1	2	3	4	5	6
Przodomóżdże	++

PL 198 599 B1 cd. tabeli 1

1	2	3	4	5	6
Brzuszne śródmózgowie	-
Zwoje korzenia grzbietowego	++
Rdzeń kręgowy	+
Siatkówka		+++	+++	+
Buławka węchowa		++	++	++
Zębina		++	++	+
Zwój trójdzielny		++	++	++
Prążkowie		+	+	++
Kora		++	++	++	+
Zakręt zębaty				++	+

Jak ukazano w tabeli 1, w dniu zarodkowym 13,5 („E13,5”), ekspresja neublastyny zachodziła w w rdzeniu kręgowym i w tyłomózgowiu, i słabo w przodomózgowiu. Ekspresję neublastyny wykryto także w rozwijającej się siatkówce i w zwojach czuciowych (zwojach korzeniu grzbietowych oraz zwoju trójdzielnym (V)). Poza układem nerwowym, słaby sygnał wykryto w nerce, płucu i jelicie, wskazując, że neublastyna także ulega ekspresji w tych tkankach.

W zarodkowym dniu 18,5 („E18,5”), ekspresja neublastyny była najpowszechniejsza w w zwoju trójdzielnym (V). Ekspresję neublastyny wykryto także w siatkówce, prążkowiu, i korze. Poza tym, ekspresja była widoczna w zawiązku zęba.

Ponownie odnosząc się do tabeli 1, większa ekspresja neublastyny, od punktu czasowego E18.5 do dni po urodzeniu 1 i 7, była widoczna w korze, prążkowiu oraz zwoju trójdzielnym (V). Ekspresja neublastyny była wyraźniejsza w warstwach zewnętrznych kory niż w warstwach wewnętrznych kory. W P7, ekspresję wykryto w tych samych strukturach co w dniu 1 lecz oprócz tego ekspresję neublastyny wykryto w hipokampie, zwłaszcza w zakręcie zębatym i móżdżku. W dorosłym mysim mózgu, neublastyna ulegała silnej ekspresji w zakręcie zębatym, przy czym bardzo niski lub nie wykrywalny poziom ekspresji neublastyny wykryto w innych testowanych tkankach.

Ekspresja u szczura:

Następujące doświadczenie opisuje hybrydyzację tkanek szczura z oligodeoksynukleotydową neublastynową antysensowną sondą znakowaną fosfatazą alkaliczną.

Wytworzenie próbek tkankowych: Zarodki szczurze (E14) otrzymano od ciężarnych szczurów Wistar (Mollegaard Breeding, Dania) po znieczuleniu pentobarbitalem. Szczury w okresie postnatalnym (P0, P7, dorosłe) zabito przez dekapitację. Wypreparowane mózgi i całe głowy natychmiast zanurzono w zimnym 0,9% NaCl, świeżo zamrożony i wykonano przekroje o 20 gm na cryostacie (przekroje wieńcowe i strzałkowe, 10 serii).

Hybrydyzacja in situ: Dwie serie przekrojów hybrydyzowano stosując antysensowną sprzężoną z fosfatazą alkalinczą (AP) sondą oligodeoksynukleotydową (5'-NCA GGT GGT CCG TGG GGG GCG CCA AGA CCG G-3' [SEQ ID Nr: 27], Oligo. Nr. 164675, DNA Technology, Dania,). Ta sonda jest komplementarna wobec zasad 1140 do 1169 mysiego cDNA neublastyny z SEQ ID nr: 15).

Przed hybrydyzacją, przekroje wysuszono na powietrzu w temperaturze pokojowej, ogrzano w temperaturze 55°C przez 10 minut, a następnie traktowano 96% etanolem w temperaturze 4°C przez noc. Następnie przekroje wysuszono na powietrzu i inkubowano w pożywce do hybrydyzacji (5,0 pmol sondy/ml) przez noc w temperaturze 39°C (Finsen i inni, Neurosci. 1992 47 105-113; West i inni., J., Comp. Neurol. 1996 370 11-22).

Po hybrydyzacji traktowanie składało się z czterech, trzydziestominutowych płukań w 1x SSC (0,15M NaCl, 0,015 M Na-cytrynian) w temperaturze 55°C, następnie trzech dziesięciminutowych przepłukań w Tris-HCl, pH 9,5 w temperaturze pokojowej przed nałożeniem AP wywoływacza. Wywoływacz AP wytworzono tuż przed nałożeniem i zawierał nitroblue tetrazoleum (NBT, Sigma), 5-bromo, 4-chloro, 3-indololofosforan (BCIP, Sigma), i bufor Tris-HCl-MgCl2, pH 9.5 (Finsen i inni., Neurosci. 1992 47 105-113). Wywoływanie AP miało miejsce w ciemności w temperaturze pokojowej przez 48 godzin. Reakcję barwną zatrzymano przez przepłukanie przekrojów w dejonizowanej wodzie.

PL 198 599 B1

Przekroje odwodniowo w czystym acetonie, zmiękczono w kreozocie ksylenowo-fenolowym (Allchem, UK), sklarowano w ksylenie, i przykryto stosując Eukitt (Bie & Berntsan, Dania).

Reakcje kontrolne składały się z (1) wstępnego traktowania sekcji RNase A (50 μg/ml, Pharmacia, Szwecja) przed hybrydyzacją; (2) hybrydyzacji przekrojów stukrotnym nadmiarem nieznakowanej sondy; oraz (3) hybrydyzacji przekrojów buforem do hybrydyzacji pojedynczo. Wyniki reakcji hybrydyzacji przedstawiono w tabeli 2.

T a b e l a 2:

Ekspresja neublastyny u szczurów

Struktura	E14	P0/P1	P7	Dorosłe
Przodomózgowie	++
Śródmózgowie brzuszne	-
Zwój korzenia grzbietowego	++
Rdzeń kręgowy	+
Siatkówka	+
Buławka węchowa	(+)	++	++
Móżdżek		+	++	+
Zwój trójdzielny		++	++
Prążkowie		+	+(+)
Kora	(+)	++	++	+
Hipokamp		(+)	++	++

W zarodkowym dniu 14 (E14), ekspresja neublastyny była słaba w zarodkach szczurzych w przodomózgowiu, w tyłomózgowiu, i w rdzeniu kręgowym. mRNA neublastyny wykryto także w oku (siatkówka), zwojach korzeni grzbietowych, zwojach trójdzielnych(V), oraz w nerce, płucu, sercu, wątrobie, i jelitach. U nowonarodzonych (PO) szczurów istniała zamarkowana ekspresja neublastyny w korze i w prażkowiu. Ekspresję neublastyny wykryto także w buławce węchowej i w hipokampie. U 7-dniowych (P7) szczurów, neublastyna ulegała ekspresji w korze, prążkowiu, buławce węchowej, i w móżdżku. Markowany sygnał był widoczny w hipokampie u dorosłych szczurów, bardzo niski niewykrywalny poziom ekspresji neublastyny wykryto w większości obszarów mózgu. Słabe sygnały wykryto w jądrze wzgórza, i markowaną ekspresję neublastyny wykrywano w hipokampie.

P r z y k ł a d 4: Polipeptydy neublastynowe

Otwarta ramka odczytu, lub region kodujący (CDS), zidentyfikowany w SEQ ID NO: 8 koduje prepropolipeptyd (oznaczony „pre-pro-neublastyna”). Sekwencja aminokwasowa przewidywana z tej otwartej ramki odczytu jest ukazana w SEQ ID NR: 9. Na podstawie SEQ ID NR: 9, trzy odmiany polipeptydów neublastynowych zidentyfikowano. Odmiany te obejmują:

(i) polipeptyd oznaczony w niniejszym jako NBN140, który posiada sekwencję aminokwasową oznaczoną jako SEQ ID NR: 10;

(ii) polipeptyd oznaczony w niniejszym jako NBN116, który posiada sekwencję aminokwasową oznaczoną jako SEQ ID NR: 11; oraz (iii) polipeptyd oznaczony w niniejszym jako NBN113, który posiada sekwencję aminokwasową oznaczoną jako SEQ ID NR: 12.

Podobnie, na podstawie regionu kodującego (CDS) jaki zidentyfikowano w SEQ ID NR: 3, która koduje pre-pro-polipeptyd posiadający sekwencję aminokwasową (oznaczoną jako SEQ ID NR: 4), zidentyfikowano trzy odmiany neublastyny. Te odmiany obejmują:

(i) polipeptyd, który posiada sekwencję aminokwasową oznaczoną jako SEQ ID NR: 5;

(ii) polipeptyd, który posiada sekwencję aminokwasową oznaczoną jako SEQ ID NR: 6; oraz (iii) polipeptyd, który posiada sekwencję aminokwasową oznaczoną jako SEQ ID NR: 7.

Na podstawie Clustal W (1.75) - w oparciu o uszeregowanie wielu sekwencji, SEQ ID NR: 9 uszeregowano z sekwencjami aminokwasowymi GDNF, persefiny i neurturyny. To uszeregowanie zilustrowano w tabeli 3.

PL 198 599 B1

T a b e l a 3:

Porównanie sekwencji aminokwasowej neublastyny z persefiną, neurturyną, GDNF

Neurturyna pełna -------------------MQRWFCAAALASVZCSSVLSIWMCREGLLLSHRLGPA Neublastin

MELGLGGLSTLSHCPWPRRQPALWPTLAALALLSSVAEASLGSAPRSPAPREGPPP Persefina pełna ------------------------------------------GDNF_ludzki-pełny

MKLWDVVAVCLVLLHTASAFPLPAGKRPPEAPAEDRSLGRRRAPFALSSDS

Neurturyna-pełna

LVPLHRLPRTLDARIARLAQYRALLQGAPDAMELRELTPWAGRPPGPRRRAGPRRR

Neublastyna

VLASPAGHLPGGRTARWCSGRARRPPPQPSRPAPPPPAPPSALPRGGRAARAGGPG Persefina-pełna MAVGKFLLGSLLLLSLQLGQGWGPDARGVPVADGEFSSEQVAKAGGTWLGTHRPL GDNF_ludz ki-pełny

NMPEDYPDQFDDVMDFIQATIKRLKRSPDKQMAVLPRRERNRQAAAANPENSRGKG

Neurturyna-pełny

RARtARLGARPCGLRSLEVRVSELGLGYASDETVLFRYCAGACEA-AARVYDLGLRR

Neublastyna

5RARAAGARGCRLRSQLVPVRALGLGHRSDELVRFRFCSGSCRR-ARSPHDLSLAS

Persefina-pełna

ARLRRAL S G PCQLW Ξ L T L S VAELGLGYAS EEKVIFRYCAGSC PRGART QHGLALAR

GDNF-ludzki-pełny

RRGQRGKNRGCVLTAIHLNVTDLGŁGYETKEELIFRYCSGSCDA-AETTYDKILKN

4- * * * ****·+ k « k

Neurturyna-pełny LRQRRRLRRE

RVRAQPCCRPTAYEDEVSFLDAHSRYHTVHELSARECACVNeublastyna LLGAGALRPPPGSRPVSQPCCRPTRYEAVS FMDVNS TWRTVDRLSATACGCLG

Persef ina-pełny LQGQGRAHGG---------PCCRPTRYTDVAFLDDRHRWQRLPQLSAAACGCGG '

GDNF_ludzki-pełny LSRNRRLVSD

KVGQACCRPIAFDDDLSFLDDNLVYHILRKHSAKRCGCI* .**** ::*:* .

. . . * * * * * . * * wskazuje pozycje, które mają pojedyncze, w pełni zakonserwowane reszty.

: wskazuje że jedna z następujących ‘silnych' grup jest w pełni zakonserwowana: -STA, NEQK, NHQK, NDEQ, QHRK, MILY, MILF, HY, FYW.

. wskazuje że jedna z następujących ‘słabszych' grup jest w pełni zakonserwowana:

- CSA, ATV, SAG, STNK, STPA, SGND, SNDEQK, NDEQHK, NEQHRK, VLIM, HFY.

PL 198 599 B1

Z uszeregowania sekwencji aminokwasowej ukazanej w tabeli 3, można zobaczyć, że neublastyna ma siedem zakonserwowanych reszt cysteinowych w położeniach które są zakonserwowane w nadrodzinie TGF-β. W jednej postaci realizacji, zalecany polipeptyd neublastynowy zawiera (siedem) cystein zakonserwowanych jak w SEQ ID NR: 2 w pozycjach 8, 35, 39, 72, 73, 101 i 103, lub jak w SEQ ID NR: 4 i 9 w pozycjach 43, 70, 74, 107, 108, 136 i 138. Te siedem zakonserwowanych reszt cysteinowych jest znanych w nadrodzinie TGF-b z tego, że tworzą trzy wewnątrzmonomerowe wiązania disiarczkowe (rozważane, np., w SEQ ID NR: 2 między resztami cysteinowymi 8-73, 35-101, i 39-103, oraz, np., w SEQ ID Nr: 4 i 9 między resztami cysteinowymi 43-108, 70-136, oraz 74-138) i jedno wewnątrzmonomerowe wiązanie disiarczkowe (rozważane, np., w SEQ ID NO: 2 między resztami cysteinowymi 72-72, i, np., in SEQ ID Nr: 4 i 9 między resztami cysteinowymi 107-107), które razem z wydłużonym regionem nici beta stanowi zakonserwowany motyw strukturalny dla nadrodziny TGF-b. Patrz, np., Daopin i inni, Proteins 1993 17 176-192.

Na podstawie tego uszeregowania sekwencji, okazało się, że neublastyna jest członkiem nadrodziny GDNF czynników neurotroficznych (LGLG - FR(Y/F)CSGSC - QxCCRP -SAxxCGC, cecha charakterystyczna dla podrodziny GDNF, podkreślona w tabeli 3).

Obliczono homologię neublastyny z innymi członkami rodziny GDNF, i wyniki przedstawiono w Tabeli 4, poniżej.

T a b e l a 4:

Homologia olipeptydów neublastyny w stosunku do innych członków rodziny GDNF

	Dojrzałe białko NBN140	Dojrzałe białko NBN113
	Homologia	Homologia pełnej długości peptydów	Homologia	Homologia pełnej długości peptydów
Czynnik Neurotroficzny	Identyczność (aa) nałożenie Silna Homologia	Identyczność	Identyczność (aa) nałożenie Silna Homologia	Identyczność
GDNF	34%	137	31.9%	36%	111	29.5%
	48%			52%
	(47/137)			(411111)
	(67/137)			(59/111)
NTN	48%	127	36.9%	49%	114	44.7%
	56%			57%
	(61/127)			(561114)
	(72/127)			(66/114)
PSP	44%	125	36.9	45%	111	44.3%
	56%			57%
	(55/125)			(511111)
	(711125)		(65/111)
IHA	31%	81 -	25.2%	31%	81	22.5%
	(25/81)			(25/81)
TGF-P2	23%	73 -	18.5%	23%	73	20.2%
	(17/73)		(17173)

GDNF = Czynnik neurotroficzny otrzymany z linii komórkowej gleju NTN = Neurturyna PSP = Persefina IHA = Inhibina -α

TF-p2= Transformujący czynnik wzrostu-p2

PL 198 599 B1

Silna homologia wskazuje że jeden z następujących „silnych” grup jest zakonserwowany: STA,

NEQK, NHQK, NDEQ, QHRK, MILY, MILF, HY, FYW.

P r z y k ł a d 5: Wytwarzanie neublastyny

Wytworzyliśmy neublastynę zarówno w komórkach eukariotycznych jak prokariotycznych, jak opisano poniżej.

Wektory ekspresji

Pełnej długości cDNA kodujący neublastynę wprowadzono do eukariotycznego wektora ekspresji pUbi1Z. Ten wektor utworzono przez kloning ludzkiego promotora UbC do modyfikowanej wersji pcDNA3.1/Zeo. Niemodyfikowany pcDNA3.1/Zeo jest dostępny na rynku (Invitrogen). Modyfikowany pcDNA3.1/Zeo jest mniejszy od wektora rodzicielskiego, z powodu genu ampicylinowego (od pozycji 3933 do 5015) oraz sekwencji od pozycji 2838 do 3134, które usunięto. W tej modyfikowanej wersji pcDNA3.1/Zeo, promotor CMV zastąpiono promotorem UbC z pTEJ-8 (Johansen i inni, FEBS Lett. 1990 267 289-294), otrzymując pUbi1Z.

Ekspresja w komórkach ssaków

Wektor pUbi1Z który zawierał sekwencje kodujące neublastynę następnie transfekowano do ssaczej linii komórkowej HiB5, które jest unieśmiertelnioną szczurzą linią komórek nerwowych (Renfranz i inni, Cell, 1991 66 713-729). Ustalono kilka HiB5 linii komórkowych stabilnie wykazujących ekspresję neublastyny (co określono przez RT-PCR). W jednej z tych stabilnych liniach komórkowych, HiB5pUbi1zNBN22 ekspresję potwierdzono przez hybrydyzację całego RNA w Northern blot z użyciem znakowanej ³²P- sondy neublastynowej. Wyniki tych badań ukazano w fig. 2. Następnie HiB5pUbi1zNBN22 użyto jako źródło neublastyny do badań aktywności neurotroficznej neublastyny.

Figura 2 ukazuje ekspresję cDNA neublastyny w klonie HiB5pUbi1zNBN22 (czyli, Northern blot sondowano znakowanym ³²P cDNA neublastyny według niniejszego wynalazku jak opisano poniżej). Wytworzono odcisk przez całkowitą ekstrakcję RNA z nie transfekowanych komórek HiB5, komórek HiB5pUbi1zNBN22 oraz HiB5pUbi1zGDNF14, odpowiednio, jak zaznaczono. Pozycje wstęg 28S i 18S rRNA odpowiednio odpowiadające 4.1 kb i 1.9 kb, zaznaczono na odcisku.

Jak ukazano w fig. 3, przeciwciał wzbudzone przeciwko polipeptydom otrzymanym z neublastyny także rozpoznawały białko o około 13 kilodaltonach („kD”) w kondycjonowanej odżywce z klonu HiB5pUbi1zNBN22 lecz nie z nie transfekowanych komórek HiB5 (patrz przykład 6).

Przewidywane ciężary cząsteczkowe nie modyfikowanych (czyli bez zmian potranslacyjnych) polipeptydów neublastynowych NBN140 [SEQ ID NR: 10], NBN116 [SEQ ID NR: 11] i NBN113 [SEQ ID NR: 12] określono odpowiednio na 14,7 kilodaltonów („kD”), 12,4 kD, i 12,1 kD,.

Metody: Northern blot z całym RNA (10 gg) z nie transfekowanych komórek HiB5 oraz klonu HiB5pUbi1zNBN22 wytworzono przez elektroforezę na 0.8% żelu formaldehydowo agarozowym i odciśnięto na błonie nylonowej (Duralone, Stratagene). Odcisk poddano hybrydyzacji i przemyto jak opisano w przykładzie 3 z 1.3 kb sondą znakowaną ³²P wytworzoną przez losowe znakowanie pokrywając SEQ ID NR: 8 i dodatkowe nukleotydy z 5'UTR i 3'UTR cDNA neublastyny. Odcisk poddano ekspozycji wobec Hyperfilm MP (Amersham) w temperaturze -80°C stosując ekrany wzmacniające.

Kondycjonowaną pożywkę z Hib5pUbi1zNBN22, lub nietransfekowanych komórek Hib5 inkubowaną przez noc pożywce pozbawionej surowicy i uzupełnionej dodatkiem N2 (Life Technologies; numer katalogowy 17502-048) zatężono i rozdzielono na 15% żelach poliakrylamidowych (Amersham Pharmacia Biotech; numer katalogowy 80-1262-01). Białka przeniesiono na błony PVDF (Amersham Pharmacia Biotech; numer katalogowy RPN-303F) a nie specyficzne miejsca wiązania białek zablokowano 5% odtłuszczonym mlekiem w proszku w PBS z 0,1% Tween-20. Błony inkubowano przez noc z poliklonalnym przeciwciałem neublastynowym (1:1000), następnie inkubowano z wtórnym antykróliczym przeciwciałem IgG (Amersham Pharmacia Biotech; numer katalogowy NA 934) sprzężonym z peroksydazą chrzanową (1:2000). Barwienie immunologiczne uwidoczniono stosując wzmocnioną chemoiluminescencję (ECL) (Amersham Pharmacia Biotech; numer katalogowy RPN2109) lub ECL+ (Amersham Pharmacia Biotech; numer katalogowy RPN2132) zgodnie z instrukcjami producenta (Amersham).

Wyniki tych doświadczeń ukazano w fig. 3. Figury 3A i 3B są ilustracjami ekspresji białka neublastyny w transfekowanych komórkach HiB5. Całonocna pożywka z nie transfekowanych komórek HiB5 [tor 1], lub z klonu HiB5 stabilnie transfekowanych cDNA neublastyny [tor 2], zatężono jak opisano poniżej. Następnie pożywkę analizowano przez Western blotting stosując dwa różne przeciwciała poliklonalne, Ab-1 i Ab-2 opisane w przykładzie 10, specyficzne dla neublastyny. W pożywce pochodzącej od transfekowanych komórek komórki, oba przeciwciała rozpoznają jak się okazuje biał30

PL 198 599 B1 ko o ciężarze cząsteczkowym o około 15 kDa. Białko to nie było widoczne w nie transfekowanych komórkach HiB5.

Klonowany cDNA kodujący neublastynę można także wprowadzić do innego wektora ekspresji, np. eukariotycznego wektora ekspresji TEJ-8 (Johansen i inni FEBS Lett. 1990 267 289-294) lub pcDNA-3 (Invitrogen), i otrzymany plazmid ekspresji transfekować do alternatywnej ssaczej linii komórkowej, np., komórek Chinese Hamster Ovary („CHO”), linii komórkowej HEK293, COS, PC12, lub RN33b, lub ludzkich nerwowych komórek macierzystych. Stabilne linie komórkowe wykazujące ekspresję neublastyny stosuje się, np., do wytworzenia białka neublastynowego.

Ekspresja w komórkach CHO

Konstrukcja plazmidu pJC070.14 W celu ekspresji cDNA neublastyny w komórkach jajnika chomika chińskiego, fragment cDNA kodujący formę prepro ludzkiej neublastyny wprowadzono do ssaczego wektora ekspresji pEAG347 aby utworzyć plazmid pJC070.14. pEAG347 zawiera tandemowy SV40 wczesny i adenowirusowy późny promotor (otrzymany z plazmidu pAD2beta; Norton i Coffin, Mol. Cell. Biol. 1985 5 281), unikalne miejsce kloningowe Notl, następnie SV40 późne sygnały terminacji transkrypcji i polyA (otrzymane z plazmidu pCMVbeta; MacGregor i Caskey, Nucl. Acids. Res. 1989 17 2365). Oprócz tego, pEAG347 zawiera szkielet plazmidowy pochodzący od pUC19 oraz dhfr pochodzący od pSV2dhfr do selekcji MTX i powielenia w transfekowanych komórkach CHO.

Plazmid pJC070.14 utworzono w dwóch etapach. Po pierwsze, fragment kodujący formę prepro ludzkiej neublastyny wyizolowano z plazmidu pUbi1Z-NBN stosując reakcję łańcuchową polimerazy z oligonukleotydami KD2-824 5'AAGGAAAAAA GCGGCCGCCA TGGAACTTGG ACTTGGAGG3' [SEQ ID NR: 31], KD2-825 5'TTTTTTCCTT GGCGGCCGCT CAGCCCAGGC AGCCGCAGG3' [SEQ ID Nr: 32] oraz polimerazą PFU. Fragment klonowano do miejsca Srf-1 pPCR-Script Amp SK(+) aby utworzyć plazmid pJC069. W drugim etapie, przeprowadzono częściowe trawienie Not-1 na plazmidzie pJC069 aby utworzyć fragment o 685bp (zawierający gen neublastyny) który klonowano do miejsca Not-1 plazmidu pEAG347 aby utworzyć plazmid pJC070.14. Transkrypcja genu neublastyny w plazmidzie pJC070.14 jest kontrolowana przez główny późny promotor adenowirusowy.

Utworzenie linii komórkowych CHO wykazujących ekspresje neublastyny. 200 μg pJC070.14 linearyzowano przez trawienie endonukleazą restrykcyjną Mlu-1. DNA ekstrahowano mieszaniną fenol:chloroform:alkohol izoamylowy (25:24:1) i wytrącono etanol. Linearyzowany DNA ponownie zawieszono w 20 mM Hepes pH 7,05, 137 mM NaCl, 5 mM KCl, 0,7 mM Na2HPO4, 6 mM dekstrose (HEBS) i wprowadzono do komórek ~4E7 CHO dukx Bl(dhfr-) (p23) przez elektroporację (280V i 960 uF). Po elektroporacji, komórki zawrócono do hodowli w alfa+ Modified Eagle's Medium (MEM) uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) przez dwa dni. Następnie komórki poddano działaniu trypsyny i ponownie powleczono w 100 mm płytkach (100,000 komórek/płytkę) w alfa-MEM (bez rybo- i deoksyrybonukleozydów), uzupełnionych 10% dializowanego FBS, na pięć dni. Komórki następnie podzielono przy gęstości 100,000 komórek/100 mm płytkę, i selekcjonowano w 200 nM metotraksacie. Zebrano kolonie oporne i zwiększono do 6 studzienkowych płytek; kondycjonowane pożywki z każdego klonu przesiano stosując specyficzny test dla neublastyny, opisany poniżej. Dwanaście klonów wykazujących ekspresję najwyższego poziomu neublastyny zwiększono do kolb T162 i następnie ponownie testowano. Jak ukazano w fig. 1.0, linie komórkowe CHO wytworzyły neublastynę w zakresie 25 do 50 ng/ml.

Trzecirzędowy kompleksowy test pod względem neublastyny. Testowaliśmy pod względem obecności neublastyny w supernatantach pożywek linii komórkowej CHO stosując modyfikowaną formę trzecirzędowego kompleksowego testu opisanego przez Sanicola i inni (Proc Natl Acad Sci USA

1997 94 6238).

W tym tekście, zdolność cząsteczek podobnych do GDNF można ocenić pod względem ich zdolności do pośredniczenia wiązaniu między domeną zewnątrzkomórkową RET i różnymi koreceptorami, GFRa1, GFRa2, i GFRa3. Rozpuszczalne postacie RET oraz koreceptorów utworzono w postaci białek fuzyjnych. Opisano białko fuzyjne między domeną zewnątrzkomórkową szczurzego RET i fosfatazą alkaliczną łożyska (RET-AP) oraz białko fuzyjne między domeną zewnątrzkomórkową szczurzego GFRa1 (ujawnione w opublikowanym zgłoszeniu patentowym WO 9744356; 27 listopada, 1997, w niniejszym załączonym w niniejszym jako odniesienie) i domeną Fc ludzkiej IgGl (rGFRa1-Ig) (Sanicola i inni Proc Natl Acad Sci USA 1997 94 6238).

Aby utworzyć białko fuzyjne między domeną zewnątrzkomórkową mysiego GFRa3 oraz domeną Fc ludzkiej IgG1 (mGFRa3-Ig), fragment DNA kodujący aminokwasy 1-359 mysiego RETL3 połączono z fragmentem zawierającym domenę Fc ludzkiej IgGl i klonowano do wektora ekspresji pEPL 198 599 B1

AG347 aby utworzyć plazmid pGJ144. Plazmid pGJ144 transfekowano do komórek jajnika chomika chińskiego (CHO) aby utworzyć stabilną linię komórkową wytwarzającą białko fuzyjne, które oczyszczono na kolumnie powinowactwa immunologiczne Protein A Sepharose stosując standardowe metody w skrócie jeśli cząsteczka podobna GDNF może pośredniczyć w wiązaniu koreceptora z RET w tym teście, wtedy białko fuzyjne RET-AP będzie utrzymywało się na płytce i ilość która jest utrzymywana można zmierzyć stosując substrat chemoiluminescencyjny dla fosfatazy alkalicznej.

Płytki Dynex Microlite-1 ELISA (Dynex Technologies) powleczono 1 μg/ml koziego przeciwciała specyficznego dla ludzkiej Fc w 50 mM wodorowęglan/węglan, pH 9,6 przez 16 h. Płytki opróżniono i napełniono 300 μl 1% 1-block (Tropix) w TBS/0,5% Tween-20 (TBST), na 1 godzinę. Po trzykrotnym przemyciu TBST studzienki napełniono 100 μl 1 μg/ml rGFRa1-Ig lub mGFRa3-Ig rozcieńczonego w kondycjonowanej pożywce z komórek 293 EBNA wykazujących ekspresję genu fuzyjnego RET-AP. 100 μl kondycjonowanej pożywki z klonów neublastynowych CHO następnie dodano do górnej studzienki kolumny studzienek, przeprowadzono 2 krotne seryjne rozcieńczenie w dół każdego rządka studzienek, inkubowano przez 1,5 godziny w temperaturze pokojowej. Następnie płytki przemyto trzy razy TBST, i dwukrotnie 200 mM Tris pH 9,8, 10 mM MgCl2 (bufor CSPD). Następnie roztwór do przemywania zastąpiono 425 μM CSPD (Tropix) w buforze CSPD zawierającym 1 mg/ml Sapphire wzmacniacza chemiluminescencji (Tropix), i inkubowano przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Ujście chemiluminescencji mierzono stosując luminometr Dynatech.

W początkowych doświadczeniach, badaliśmy czy neublastyna wytworzona przez linie komórkowe CHO mogła pośredniczyć w wiązaniu GFRa1 lub GFRa3 z domeną zewnątrzkomorkową RET. Jak ukazano w fig. 11, kondycjonowana pożywka z klonem komórkowym CHO #53 wytworzyła silny sygnał w trzecirzedowym kompleksowym teście jeśli zawarte było białko fuzyjne mGFRa3-Ig, lecz nie było sygnału gdy zawarte było białko fuzyjne rGFRa1-Ig, wskazując, że neublastyna wiąże się z GFRa3 lecz nie z GFRa1. To zachowanie wyraźnie odróżnia neublastynę od GDNF; jak ukazano w fig. 11, GDNF wiąże się z GFRa1 lecz nie z GFRa3. Nie obserwowano sygnału z żądnym białkiem fuzyjnym koreceptora, gdy testowano kondycjonowaną pożywkę z rodzicielskiem linii komórkowej CHO lub prostą pożywkę.

W celu oceny ilościowej poziomu ekspresji neublastyny w liniach komórkowych CHO, utworzono krzywą standardową stosując rGFRa1-Ig i GDNF zaczynając przy stężeniu 1 ng/ml. Następnie obliczono stężenia neublastyny dla różnych linii komórkowych CHO stosując tę standarową krzywą; poziom wytworzony przez pięć linii komórkowych CHO ukazano w fig. 10. Ponieważ ten szacunek zależy od nietestowanego założenia że powinowactwo wiązania między GDNF i GFRalfa1 jest podobny do powinowactwa wiązania między neublastyną i GFRa3, poziomy te są tylko przybliżone.

Analizą neublastyny z supernatantów linii komórkowej CHO.

W celu dodatkowego przeanalizowania neublastyny wytworzonej przez linie komórkowe CHO, białko ekstrahowano z pożywki stosując białko fuzyjne GFRa3-Ig i analizowano przez western blots z przeciwciałami poliklonalnymi wzbudzonymi peptydom neublastyny.

W pierwszym doświadczeniu, neublastynę ekstrahowano z mGFRa3-lg dołączonym do paciorków Sepharose. mGFRa3-Ig połączono z paciorkami Sepharose stosując warunki sugerowane przez producenta, Pharmacia Inc. 100 μl mGFRa3-Ig-Sepharose dodano do 1,0 ml próbek kondycjonowanej pożywki z ujemnej kontrolnej linii komórkowej CHO lub z linii komórkowej CHO #16 wytwarzającej neublastynę. Zawiesiny inkubowano przez dwie godziny na kołyszącej się platformie. Każdą zawiesinę wirowano i supernatant usunięto, następnie wykonano trzy 1,0 ml przemycia 10 mM HEPES, 100 mM NaCl, pH 7,5. Każdą żywicę zawieszono ponownie w 100 μl 2X redukującego buforu do próbek i ogrzewano do temperatury 100°C przez 5 minut. 20 μl supernatantu buforu do próbek oraz 10 μl standardu ciężaru cząsteczkowego (FMC) nałożono do każdej studzienki z 10-20% wstępnie odlanego żelu SDS-PAGE (Owl Scientific). Żel elektroforezowano przy 40 mA prądu stałego przez 72 minuty.

Do analizy western blot, białko poddano elektroblottingowi na nitrocelulozę (Schleicher i Schuell) w aparacie Hofer Scientific w 10 mM CAPS, 10% metanolu, 0,05% SDS, pH 11,2 układ buforowy (45 minut przy 400 mA prądu stałego). Po przeniesieniu, filtr nitrocelulozowy usunięto z kasetki i uwidoczniono markery ciężaru cząsteczkowego przez zabarwienie roztworem 0.1% Ponceau S w 1% kwasie octowym przez 60 sekund. Błonę pocięto na dwie sekcje i usunięto nadmiar barwnika przez delikatne mieszanie w wodzie destylowanej. Błony zablokowano w 2% odtłuszczonym mleku w proszku w TBS przez noc w temperaturze 4°C. Błony inkubowano indywidualnie z dwoma z przeciwciałami anty peptydowi neublastyny oczyszczonymi przez powinowactwo (R30 i R31) o stężeniu 1,0 μg/ml w 2% odtłuszczonym mleku w proszku w TBS). Błony przemyto trzema 10-minutowymi przemywkami

PL 198 599 B1 w TBS-Tween i inkubowano w rozcieńczonym 1:5000 kozim anty-króliczym IgG-HRP koniugatem (Biorad) przez 30 minut. Błony przemyto trzema 10-minutowymi przemywkami TBS-Tween i wywołano z substratem ECL (Amersham). Jak ukazano w fig. 12, specyficzne wstęgi wykryto w białkach ekstrahowanych z wytwarzającej neublastynę linii komórkowej CHO z oboma przeciwciałami (tory 2 i 4), po porównaniu ze wstęgami obserwowanymi w ekstrahowanych białkach z ujemnej kontrolnej linii komórkowej (tory 1 i 3).

Ciężar cząsteczkowy niższych rodzajów wynosi około 13kD i prawdopodobnie reprezentuje dojrzałą domenę neublastyny, utworzoną po rozszczepieniu domeny pro. To rozszczepienie mogło wystąpić po którejkolwiek z trzech reszt Arg-_ (np., -RXXRv-) białka prepro neublastyny aby utworzyć albo formy 140 AA, 116 AA albo 113 AA, jak przedłożono odpowiednio w SEQ ID Nr 10, 11, lub 12. Przewidywane ciężary cząsteczkowe nie modyfikowanych (czyli, bez modyfikacji potranslacyjnych) polipeptydów neublastynowych NBN140 (SEQ ID Nr: 10], NBN116 (SEQ ID nr: 11], oraz NBN113 [SEQ ID Nr: 12] określono na 14,7 kD, 12,4 kD, oraz 12,1 kD, odpowiednio. Dodatkowo potrzebna będzie analiza potwierdzająca strukturę tych rodzajów jak również innych wstęg specyficznych dla neublastyny.

W drugim doświadczeniu, neublastynę ekstrahowano z hGFRa3-Ig wychwyconym na płytce ELISA. Aby utworzyć białko fuzyjne miedzy domeną zewnątrzkomórkową ludzkiej GFRa3 (opisaną w opublikowany zgłoszeniu patentowym WO97144356; 27 listopada, 1997, załączonym w niniejszym jako odniesienie) oraz domeną Fc ludzkiej IgG1 (hGFRa3-Ig), fragment DNA kodujący aminokwasy 1-364 ludzkiej GFRa3 połączono z fragmentem zawierającym domenę Fc ludzkiej IgG1 i klonowano do wektora ekspresji CH269 opisanego przez Sanicala i inni. (Proc Natl Acad Sci USA 1997 94 6238). Białko fuzyjne kodowane przez ten plazmid poddano krótkotrwałej ekspresji w komórkach antygenu jądrowego kodowanego przez wirus Epstein-Barr 293 (EBNA) i oczyszczono na kolumnie powinowactwa immunologicznego Protein A Sepharose stosując standardowe metody.

Sześć studzienek 96-studzienkowej płytki powleczono przez noc w temperaturze 4°C kozią antyludzką IgG (specyficzny fragment Fcy; Jackson Immunulogics) przy stężeniu 25 mg/ml w PBS (300 ml/studzienki). Studzienki zablokowano na 1 godzinę w temperaturze pokojowej z 400 ml 1% BSA w PBS. Po 3 przemyciach PBST (PBS + 0,05% Tween 20), 300 ml hGFRa3-Ig (10 mg/ml w PBS zawierającym 0,1% BSA) dodano do każdej studzienki. Płytki inkubowano przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej i wytrząsano delikatnie (200 wstrząsów/minutę) aby zmaksymalizować wiązanie. Następnie studzienki opróżniono i przemyto ponownie 3 razy PBST. 250 ml kondycjonowanych pożywek z ujemnej kontrolnej linii komórkowej CHO lub z wytwarzającej neublastynę linii komórkowej CHO #25 dodano do każdej z 3 studzienek. Płytkę inkubowano inkubowano przez 3 godziny w temperaturze pokojwej i delkatnie wytrząsano (300 wstrząsów/minutę). Następnie studzienki przemyto dwukrotnie PBST. 25 ml nie redukującego buforu do ładowania dodano do pierwszej studzienki i płytkę szybko wytrząsano w ciągu 5 minut w celu wyeluowania związanych białek (1300 wstrząsów/minutę). Zawartość przenoszono do następnej studzienki i procedurę powtarzano w celu wyeluowania białek związanych w drugiej i trzeciej studzience. Po dodaniu β-merkaptoetanolu (5% stężenie końcowe), próbkę gotowano w ciągu 5 minut i analizowano przez SDS-PAGE w 10-20% żelu poliakryloamidowym.

Do analizy poprzez blotting typu Western białka przenoszono na nitrocelulozę. Membranę blokowano i sondowano w 5% odtłuszczonym mleku w proszku, PBST i przemywano PBST. Neublastynę wykrywano przez eletrochemiluminescencję po reakcji z przeciwciałami poliklonalnymi (R30 i R31) utworzonymi przeciw dwóm peptydom neublastyny (w stężeniu 1 μg/ml), a następnie ze sprzężonymi z HR kozimi przeciwciałami skierowanymi przeciw immunoglobulinom królika (BioRad). Jak przedstawiono w fig. 13, w białkach wyekstrahowanych z wytwarzającej neublastynę linii komórek CHO wykrywano pięć wstęg specyficznych dla neublastyny (ścieżka 2). Niższe dwie wstęgi są bardzo podobne do wstęg obserwowanych w fig 12; ponownie, niższa wstęga prawdopodobnie stanowi dojrzałą domenę neublastyny utworzoną po rozszczepieniu domeny pro.

Późniejsza analiza (dane nieprzedstawione) wstęg z Figury 13 wykazuje, że deglikozylacja PGNazą F wstęgi odpowiadającej masie cząsteczkowej 18 kD zmniejsza jego wielkość do tej równoważnej najniższej wstędze w żelu z fig 13. Sugeruje to, że komórki ssacze mogą wytwarzać neublastynę w postacji białka glikozylowanego.

Ekspresja neublastyny w E. coli

W celu przeprowadzenia ekspresji genu neublastyny w E. coli, skonstruowano syngeny o niższej zawartości par GC i kodonach najczęściej wykorzystywanych w E. coli. Syngen klonuje się w dwóch wektorach, pET19b i pMJB164, pochodnej pET19b. Konstrukcję z pET19b przedstawiono na

PL 198 599 B1

Figurze 14. W konstrukcji tej sekwencja kodująca dojrzałą domenę neublastyny (NBN113) jest bezpośrednio połączona z inicjującą metioniną. Konstrukcję z pMJB164 przedstawiono na Figurze 15. W konstrukcji tej dojrzała domena neublastyny połączona jest z sekwencją kodującą znacznik histydynowy (tj. reszt histydyny), oddzieloną sekwencją kodującą miejsce rozszczepiania przez enterokinazę. Inicjująca metionina poprzedza znacznik histydynowy.

Sekwencja nukleotydowa kodująca neublastynę z fig. 14

ATGGCTGGAGGACCGGGATCTCGTGCTCGTGCAGCAGGAGCACGTGGCTGTCG

TCTGCGTTCTCAACTAGTGCCGGTGCGTGCACTCGGACTGGGACACCGTTCCGA

CGAACTAGTACGTTTTC GTTTTTGTTCAGGATCTTGTCGTCGTGCAC GTTCTC C G

CATGATCTATCTCTAGCATCTCTACTAGGAGCCGGAGCACTAAGACCGCCGCCG

GGATCTAGACCTGTATCTCAACCTTGTTGTAGACCTACTAGATACGAAGCAGTAT

CTTTCATGGACGTAAACTCTACATGGAGAACCGTAGATAGACTATCTGCAACCGC

ATGTGGCTGTCTAGGATGATAATAG [SEQ ID nr: 29]

Sekwencja nukleotydowa kodująca neublastynę ze znacznikiem histydynowym z fig. 15

ATGGGCCATCATCATCATCATCATCATCATCATCACTCGAGCGGCCATATCGACG

ACGACGACAAGGCTGGAGGACCGGGATCTCGTGCTCGTGCAGCAGGAGCACGT

GGCTGTCGTCTGCGTTCTCAACTAGTGCCGGTGCGTGCACTCGGACTGGGACAC

CGTTCCGACGAACTAGTACGTTTTCGTTTTTGTTCAGGATCTTGTCGTCGTGCAC

GTTCTCCGCATGATCTATCTCTAGCATCTCTACTAGGAGCCGGAGCACTAAGACC

GCCGCCGGGATCTAGACCTGTATCTCAACCTTGTTGTAGACCTACTAGATACGAA

GCAGTATCTTTCATGGACGTAAACTCTACATGGAGAACCGTAGATAGACTATCTG

CAACCGCATGTGGCTGTCTAGGATGATAATAG [SEQ ID nr: 30]

P r z y k ł a d 6: Wpływ neublastyny na przeżywanie szczurzych zarodkowych neuronów dopaminergicznych, i aktywność ChAT.

W tej serii doświadczeń oznaczano wpływ kondycjonowanego podłoża opisanych powyżej, wytwarzających neublastynę komórek HiB5pUbi1zNBN22.

Przygotowywanie hodowli: Z zarodków szczurów E14 wycinano brzuszną stronę śródmózgowia lub rdzeń kręgowy w zimnym roztworze zbuforowanej soli Hanksa (HBSS). Kawałki tkanki inkubowano w wyjałowionej przez sączenie 0,1% trypsynie (Worthington) i 0,05% DNazie (Sigma) w HBSS w temperaturze 37°C w ciągu 20 minut. Następnie kawałki tkanki czterokrotnie przemywano HBSS + 0,05% DNazą i rozbijano stosując pipetę automatyczną o pojemności 1 ml. Zawiesinę wirowano następnie przy 600 obrotach na minutę w ciągu 5 minut i osad ponownie zawieszano w podłożu kondycjonowanym surowicą (SCM; DMEM z 10% płodową surowicą cielęcą). Całkowitą liczbę komórek oceniano metodą wykluczania z barwnikiem błękitem tryptanowym i umieszczano z gęstością 100 000 komórek/cm² na 8-studzienkowych płytkach powleczonych poli-L-lizyną (Nunc) w celu oceny przeżywania neuronów dopaminergicznych, lub z gęstością 200 000 komórek/cm² w 48-studzienkowych płytkach (Nunc) do pomiarów aktywności ChAT. Komórki inkubowano w SCM w atmosferze 5% CO2/95% O2 i przy 95% wilgotności w temperaturze 37°C w ciągu 24-48 godzin przed zmianą podłoża na wolne od surowicy (SFM) z dodatkiem czynników neurotroficznych.

Komórki do oceny przeżywania neuronów dopaminergicznych pozostawiano na pięć dni w SFM z dodatkiem czynników troficznych, a następnie w ciągu 5 minut utrwalano w 4% PFA i immunohistochemicznie wybarwiano hydroksylazę tyrozynową.

Komórki do pomiaru aktywności ChAT pozostawiano na 3 dni w SFM, a następnie lizowano w HBSS + 0,1% Triton X-100 i natychmiast zamrażano w suchym lodzie do czasu pomiarów aktywności ChAT.

Dodawanie czynników troficznych: Zbierano kondycjonowane podłoże z niestransfekowanych komórek kontrolnych HiB5 lub komórek HiB5 wytwarzających neublastynę (HiB5pUbi1zNBN22) lub GDNF (HiB5pUbi1zGDNF-L17). HiB5pUbilzNBN22 wytwarzają około 20 ng GDNF/24 godziny/10⁵ komórek, jako określono przez pomiar GDNF w kondycjonowanym podłożu metodą ELISA.

Odpowiednie linie komórkowe inkubowano przez noc z DMEM + 1% FCS, pobierano supernatant i przechowywano do ponownego użycia w -20°C. Roztwory znad osadu rozcieńczano 1:50 w SFM przed dodaniem do komórek. Oddzielne studzienki traktowano kontrolnym roztworem HiB5 (1:50) + oczyszczony rekombinacyjny szczurzy GDNF (od 0.03 do 10 ng/ml). Wyniki tego eksperymentu zostały ukazane na fig. 4. Figury 4A-4C prezentują wpływ neublastyny, wydzielanej przez komórki HiB5pUbi1zNBN22, na przeżywalność hodowanych szczurzych embrionalnych brzusznych

PL 198 599 B1 śródmózgowiowych neuronów dopaminergicznych, i aktywność ChAT w cholinergicznych neuronach ruchowych nerwu czaszkowego w przesaczach nie zawierających surowicy jak opisano w przykładzie 5.1.

Figura 4A przedstawia krzywą odpowiedzi na dawki rekombinacyjnego GDNF uzyskiwanej dla aktywności ChAT (dpm/godzinę) mierzonych dla DIV5 w przesaczach nie zawierających surowicy z hodowli którą pierwotnie pochodziła z brzusznych śródmózgowiowych E14 [czyli, HiB5; GDNF 0.03 ng/ml; GDNF 0.1 ng/ml; GDNF 0.3 ng/ml; GDNF 1 ng/ml; GDNF 10 ng/ml; GDNF 100 ng/ml]. Figura 4B przedstawia aktywności ChAT (dpm/godzinę) mierzone dla DIV5 w przesączach nie zawierających surowicy z hodowli która pierwotnie pochodziła z brzusznych śródmózgowiowych E14. Rozcieńczone, zrównoważone przesącze z hodowli komórek HiB5pUbi1zNBN22 produkujących neuroblastynę (neuroblastyna) albo komórek HiB5GDNFL-17 produkujących GDNF (GDNF-17) podawano jak przedstawiono na figurze [czyli, neublastyna 1:10; neublastyna 1:50; GDNF L-17 1:50], fig. 4C przedstawia liczbę komórek o aktywności odpornościowej hydroksylazy tyrozynowej przypadających na studzienkę [liczba komórek TH+ /studzienkę] dla DIV7 w przesączach nie zawierających surowicy w hodowlach szczurzych brzusznych śródmózgowiowych E14. Rozcieńczone, zrównoważone przesącze z hodowli komórek HiB5 nietransfekowanych (HiBS) oraz z komórek produkujących neuroblastynę (neuroblastyna) podawano, w różnych rozcieńczeniach, jak przedstawiono na figurze [czyli, HiB5 1:10; HiB5 1:40; GDNF 0.1 ng/ml; GDNF 10 ng/ml; GDNF 100 ng/ml; i neublastyna 1:40].

Zrównoważone przesącze z komórek HiB5 transfekowanych neuroblastyną rozcieńczone 1:40 znacząco zwiększają liczbę komórek o aktywności odpornościowej hydroksylazy tyrozynowej na studzienkę w porównaniu z kontrolnymi (nietransfekowanymi) komórkami HiB5 przy równoważnym i niższym rozcieńczeniu (1:10 i 1:40) (patrz, np., fig. 4B). Wzrost ilości komórek o aktywności odpornościowej hydroksylazy tyrozynowej jest porównywalny ze wzrostem obserwowanym dla maksymalnego stężenia GDNF (10 ng/ml). Wskazuje to, że neublastyna wydzielana do płynu hodowlanego wpływa na przeżywalność w populacji embrionalnych szczurzych brzusznych śródmózgowiowych neuronów dopaminergicznych. W przeciwieństwie do tego, w odróżnieniu od GDNF wydzielanego przez transfekowane komórki HiB5, nie zaobserwowano wpływu równoważonych przesączów z hodowli komórek HiB5 transfekowanych neublastyna na inną hodowlaną populację neuronów, tj. neurony cholinoergiczne (patrz, np., fig. 4A).

P r z y k ł a d 7: Wpływ neublastyny na przeżywalność płytkowych hodowli świńskich embrionalnych brzusznych śródmózgowiowych neuronów dopaminergicznych. W tym eksperymencie badano wpływ wspólnej hodowli komórek HiBSpUbi1zNBN22 produkujących neuroblastynę na płytkowe hodowle świńskich embrionalnych brzusznych śródmózgowiowych neuronów dopaminergicznych.

Przygotowanie hodowli: Brzuszne śródmózgowie (VM) wyizolowano z embrionów świni (E28; n=12) zachowując sterylność, siekano na 400 gm plastry i umieszczano w schłodzonym, zrównoważonym roztworze soli Gey-a (GIBCO) zawierającym glukozę (6.5 mg/ml). Plastry tkanki hodowano techniką hodowli intereferencyjnej, pierwotnie rozwiniętą przez Stoppini i inni [L. Stoppini, P.A. Buchs,

D. Muller, J. Neurosci. Metody 1991 37 173-182].

W skrócie, plastry umieszczano na półporowatej błonie (Millipore, 0.3 pm; 8 plastrów/błonę odpowiadającą jednemu VM) i wkładano do 6-studzienkowych płytek (Costar) z płynem hodowlanym zawierającym osocze (Gibco BRL). Każda studzienka zawierała 1 ml medium (50% Optimem, 25% surowicy końskiej, 25% roztworu soli Hank-a (wszystkie produkowane przez GIBCO)) uzupełniano D-glukozą do końcowego stężenia 25 mM. W dniu 0, 7000 komórek HiB5pUbi1zNBN22 (neublastyna) lub 7000 nietransfekowanych komórek HiB5 (kontrola) przesiewano na plastry tkankowe. Wspólne hodowle początkowo hodowano w 33°C przez 48 godzin pozwalając na proliferację unieśmiertelnianych komórek HiB5 wrażliwym na temperaturę onkogenem, a następnie umieszczano w inkubatorze w 37°C, gdzie komórki HiB5 ulegały różnicowaniu. Medium zmieniano dwukrotnie w tygodniu. Na każdym etapie stosowano środki antygrzybicze i antybiotyki.

Pomiar dopaminy techniką HPLC: W 12 i 21 dniu hodowli in vitro, pobierano płyn hodowlany i mierzono ilość dopaminy stosując HPLC z detekcją elektrochemiczną (W.N. Slooth, J.P. Gramsbergen, J. Neurosci. Meth. 1995 60 141-49). Obróbka tkanek i techniki immunochemiczne: W 21 dniu, hodowle ustalano 4% paraformaldehydem w buforze fosforanowym przez 60 min., odwadniano w 20% roztworze sacharozy przez 24 godziny, zamrażano, cięto w kriostacie na 20 gm wycinki (4 serie), umieszczano w zatapianych w żelatynie preparatach mikroskopowych. Jedną z serii wycinków wybarwiano immunochemicznie w celu stwierdzenia obecności hydroksylazy tyrozynowej (TH). Krótko, wycinki przemywano w buforowanym 0.05M tris roztworze fizjologicznym (TBS, pH 7.4) zawierającym 1% Triton X-100 przez 3x15 min. i inkubowano wraz z 10% surowicą cielęcą (FBS, Life Technologies)

PL 198 599 B1 w TBS przez 30 min. Następnie tkanki inkubowano przez 24 godziny w 4°C wraz z mysimi monoklonalnymi przeciwciałami anty-TH (Boehringer Mannheim) rozcieńczonymi 1:600 w TBS wraz z 10% FBS. Po płukaniu w TBS z 1% Triton X-100 przez 3x15 min., wycinki inkubowano przez 60 min. biotynizowanymi antymysimi przeciwciałami IgG (Amersham) rozcieńczonymi 1:200 w TBS zawierającym 10% FBS. Następnie wycinki przemywano TBS z 1% Triton K-100 (3x15 min.) i inkubowano przez 60 min. wraz z peroksydazą streptawidynową (Dako) rozcieńczoną 1:200 w TBS wraz z 10% FBS. Po przepłukaniu TBS (3x15 min.), związane przeciwciała wizualizowano traktując 0.05% 3,3-diaminobenzydyną (Sigma) w TBS zawierającym 0.01 % H2O2. W końcu, wycinki odwadniano alkoholem, klarowano ksylenem, i pokrywano stosując Eukitt.

Komórki zliczano i poddawano analizie morfologicznej: Zliczanie immunoreaktywnych TH-ir neuronów przeprowadzono stosując mikroskopię w zaciemnionym polu (Olympus). Tylko komórki wykazujące intensywne wybarwianie przejawiające dobrze zachowaną strukturę komórkową i zliczano wyraźne jądra. Szacowania opierano na zliczeniach komórek w każdym z czterech hodowanych wycinkach stosując obiektyw x20. Liczba komórek była korygowana dwukrotnym zliczaniem zgodnie z zasadą Abercrombie (M. Abercrombie, Anat. Rec. 1946 94 239-47), stosując przeciętną średnicę jądra neuronów TH-ir (6.6 ± 0.2 μm, n = 30). Wielkość jądra szacowano stosując system do obserwowania neuronów (Neurolucida, MicroBrightField, Inc.). Wyniki tych eksperymentów przedstawiono na fig. 5. Figury 5A-5C są ilustracją wpływu neublastyny wydzielanej przez komórki HiBSpUbi1zNBN22 na funkcjonowanie i przeżywalność plastrowych hodowli świńskich embrionalnych brzusznych śródmózgowiowych neuronów dopaminergicznych hodowanych wspólnie z komórkami Hi85pUbi1zNBN22 (neublastyna) albo komórkami HiB5 (kontrola) co opisano poprzednio. Figury 5A i fig. 5B: przedstawiają uwalnianie dopaminy do medium w DlV12 [dopamina (pmol/ml) - dzień 12] i DIV21 [dopamina(pmol/ml) - dzień 21], odpowiednio. Figura 5C prezentuje liczbę komórek immunoreaktywnych wobec hydroksylazy tyrozynowej przypadających na hodowlę [komórki TH-ir na hodowlę] dla DIV21.

W 12 dniu analiza HPLC ujawniła, że medium z hodowli zawierającej HiB5-neublastynę zawierało o 84% więcej dopaminy, niż medium z hodowli zawierającej HiB5-C (fig. 5A). W dniu 21 różnica wynosiła 78% (fig. 5B), a zliczanie komórek wykazało, że hodowla zawierająca HiB5-neublastynę zawierała o 66% więcej neuronów immunoreaktywnych wobec hydroksylazy tyrozynowej niż hodowle zawierające HiB5-C(P<0.05) (fig. 5C). Wskazuje to, że neublastyna wydzielana przez klony HiB5pUbi1zNBN22 posiada silny wpływ przeżyciowy na dopaminergiczne neurony embrionów świni.

P r z y k ł a d 8: Przeżywalność hodowanych komórek grzbietowych korzeni zwoju w medium nie zawierającym surowicy.

Przykład ten prezentuje neurotroficzną aktywność polipeptydu neublastyny w porównaniu ze znanymi czynnikami nurotroficznymi. Ciężarne samice myszy zabijano przez dekapitację. Następnie embriony przygotowywano do hodowli. Elektrolitycznie ostrzone igły wolframowe stosowano do przeprowadzenia sekcji grzbietowych korzeni zwoju prowadzonej na myszach w stadium ofi C57/B16 (Mollegaard Breeding, Denmark). Embrionalne zwoje inkubowano przez 5 minut w 37°C wraz z 0.05% trypsyną (GibcoIBRL) w wolnym od wapnia i magnezu zrównoważonym roztworze Hanks-a. Następnie zwoje traktowano kolagenazą/dispazą 1 mg/ml przez 30 do 45 minut i następnie trypsyną/DNAzą 0,25% przez 15 minut. Po usunięciu roztworu trypsyny, zwoje przemywano ponownie 10 ml roztworem DMEM zawierającym 10% inaktywowaną ciepłem końską surowicę, a następnie delikatnie rozpipetowywano opalaną pasterówką uzyskując jednokomórkowe zawiesiny.

Komórki umieszczano w 24 studzienkowych płytkach (Nunc), pokrywano wstępnie poliornityną (0.5 mg/ml, przez noc) i lamininą (20 mg/ml przez 4 h; Gibco/BRL). Neurony inkubowano w 37°C wysycanym 5% CO2 inkubatorze w ustalonym medium zawierającym Hams F14 uzupełnione 2 mM glutaminą, 0.35% albuminą z surowicy bydlęcej, 60 ng/ml progesteron, 16 mg/ml putrescynę, 400 ng/ml L-tyroksynę, 38 ng/ml selenian sodu, 340 ng/ml trijodo-tyroninę, 60 mg/ml penicilinę i 900 mg/ml streptoomycynę.

Po 48 godzinnej inkubacji, neurony były łatwo rozpoznawalne po ich dwubiegunowej morfologii w obserwacji optycznej w kontraście fazowym. Procentowa przeżywalność neuronów przy braku lub w obecności czynników troficznych (dodawanych do medium hodowlanego przed wysianiem neuronów w ilości 10 ng/ml), lub w równoważonym medium z przesączów hodowlanych z hodowli komórek produkujących HiB5pUbi1zNBN22, była szacowana poprzez zliczanie neuronów w studzienkach po 48 godzinach.

Wyniki tych eksperymentów przedstawiono na Fig. 9, na której to:

reprezentują eksperyment kontrolny (przy braku czynników);

PL 198 599 B1 reprezentują eksperyment w obecności GDNF;

reprezentują eksperymenty w obecności Neurturiny;

reprezentują eksperymenty w obecności Neublastyny według wynalazku;

E12 reprezentują dane z eksperymentów przeprowadzonych na komórkach DRG wyizolowanych z embrionów w dniu 12;

E16 reprezentują dane z eksperymentów przeprowadzonych na komórkach DRG wyizolowanych z embrionów w dniu 16;

PO reprezentują dane z eksperymentów przeprowadzonych na komórkach DRG wyizolowanych z embrionów w dniu narodzin;

P7 reprezentują dane z eksperymentów przeprowadzonych na komórkach DRG wyizolowanych z embrionów w dniu 7 po narodzinach; i

P15 reprezentują dane z eksperymentów przeprowadzonych na komórkach DRG wyizolowanych z embrionów w dniu 15 po narodzinach.

Wyniki te jasno dowodzą, że czynnik neurotroficzny według wynalazku wykazuje aktywność porównywalną, lub nawet lepszą niż aktywność obserwowana dla dobrze poznanych czynników neurotroficznych.

P r z y k ł a d 9: Rezultaty zastosowania in vivo neublastyny na dopaminowe neurony substancji nigra

W celu przetestowania możliwości jakie daje wykorzystanie neublastyna w ochronie przed indukowaną przez hydroksydopaminę degeneracją dojrzałych neuronów dopaminowych (DA), zastosowano szczurzy model choroby Parkinsona (Sauer and Oertel, Neuroscience 1994 59, 401-415) oraz dostarczono neubastynę za pomocą genu lentiwirusa.

Produkcja lentiwirusa: W celu otrzymania lentiwirusowego wektora przenoszącego gen neublastyny, pHR'-neublastin, wklonowano fragment BamHl długości 1331 pz, pochodzący z cDNA neublastyny w miejscu BamHl/Bgl II wektora pSL301 (Invitrogen). Pochodzący z tak otrzymanego konstruktu 1519 pz fragment BamHl/Xhol wycinano i ligowano w miejscu BamHl/Xhol wektora pHR' przenoszącego potranlacyjny fragment pochodzący z wirusa a woodchuck hepatitis (Zufferey R, Donello JE, Trono D, Hope TJ: Woodchuck hepatitis wirus posttranscriptional regulatory element enhances expression of transgenes delivered by retroviral wektors”; J. Virol. 1999 73 (4) 2886-2892). W celu otrzymania wektora pHR-GDNF, 701 pz BamHl/Xhol fragment, pochodzący z wektora pUbi1z-GDNF ligowano w miejscu BamHl/Xhol wektora pHR'. Produkcja lentiviralego wektora została opisana przez np. Zufferey i wsp. (Zufferey R, Nagy D, Mande/ RJ, Naldini L, Trano D: „Multiply attenuated lentiviral vector achieves efficient gene delivery in vivo; Nat. Biotechnol. 1997 15 (9) 871-875). W skrócie, przenoszone konstrukty oraz plazmidy pomocnicze pR8.91, a także plazmid pMDG transfekowano do komórki 293T. Uwalniane do podłoża wiriony zbierano po upływie 48 oraz 72 godzin po transfekcji. Następnie, w celu zagęszczenia cząsteczek wirusa, podłoże to wirowano 1.5 godz. przy 141 000 g i tak otrzymany osad rozpuszczano w DMEM. Mianem kontroli przenoszącej gen białka zielonej fluorescencji („GFP”) określono 108 jednostek transformujących (TU)/ml, poprzez fluorescencję GFP w komórkach 293T. W celu określenia miana cząsteczek wirusa zastosowano technikę „slot-blot” RNA (von Schwedler U, Song J, Aiken C, Trono D: „Vifis crucial for human immunodeficiency virus type 1 proviral DNA synthesis in infected cells”; J. Virol. 1993 67 (8) 4945-4955). Zaobserwowano, że w płynie pohodowlany GDNF oraz zawierającym neublastinę znajdowało się 10 razy mniej cząsteczek w porównaniu z przypadkiem, gdy zastosowano GFP. Procedury chirurgiczne: Wszystkie eksperymenty, w których uczestniczyły zwierzęta wykonane były zgodnie z zasadami ustalonymi przez Ethical Committee dla wykorzystania zwierząt laboratoryjnych na Lund Uniwersytecie. Wykorzystano wszystkie 21 młode, dorosłe osobniki żeńskie szczurów Sprague-Dawley (B&K Universal, Stockholm, Sweden), które poddano 12 godzinnemu cyklowi hodowlanemu: światło:ciemność, bez dostępu do pożywienia i wody. Znakowanie Retrograde (retroznakowanie) oraz uszkodzenia 6-OHDA przeprowadzono 3 tygodnie przed pojawieniem się zmian chorobowych, zgodnie z Sauer i Oertel (Sauer i Oerte, Neuroscience 1994 59 401-415). Krótko, szczury szczepiono obustronnie pod narkozą Equithesin (0.3 ml/200 g) 0.2 gl 2% roztworem (rozpuszczonym w 0.9% NaCl) znacznika retrograde tracer Fluoro-Gold (FG; Fluorochrome, Inc., Englewood, CO). Szczepienia dokonano stosując 2 gl strzykawki Hamilton, o współrzędnych: AP= +0.5 mm; ML= ±3.4 mm względem bregma; DV= -5.0 mm względem dura oraz punkcie „icisor bar set” wynoszącym 0.0 mm. Ponadto, 0.05 gl/min wstrzykiwano wraz z kolejną dawką 5 min później przed wyjęciem igły.

PL 198 599 B1

Czternaście dni później zaszczepione FG zwierzęta otrzymały całkowita ilość 5 porcji (il/porcję) lentiwirusowego wektora przenoszącego gen zielono fluorescyjnego białka (GFP), neublastinę lub GDNF. Cztery z wlewów wykonywano wzdłuż ciała prążkowanego w dwóch rzędach nakłuć w następujących współrzędnych: AP= +1.0 mm, ML= -2.6 mm, DVI =-5,0 mm DV2=-4.5 mm and AP= 0, 0,0 mm, ML= -3.7 mm, DVI =-5,0 mm DV2=-4.5 mm. Wlewy do supranigral wykonywano w AP= -5.2 mm, ML= -2.0 mm, DVI =-6.3 mm. Odstęp wynosił -2.3 mm.

Dwadzieścia jeden dni po retrograde znakowaniu, oraz 7 dni po zaszczepieniu lentiwirusem ponownie poddawano narkozie zwierzęta i podawano im pojedynczą porcję 20 ig 6-OHDA za pomocą 10 il strzykawek Hamilton (Sigma; wyliczone jako wolna zasada i rozpuszczone w 3 il schłodzonego na lodzie roztworu soli fizjologicznej wraz z 0.02% kwasem askorbinowym) do prawego ciała prążkowanego w tym samym miejscu dzie zaszczepiano FG. Wielkość wlewu wynosiła 1 il/min, pozostawiając igłę 3 min przed wyjęciem.

Obróbka tkanek: W 21 dniu po zaszczepieniu 6-OHDA zwierzęta głęboko usypiano wodzianem chloru i poddawano pefruzji dotętniczej roztworem fizjologicznym (pH 7.4; temperatura pokojowa) przez jedną minutę a następnie 200 ml chłodzonym na lodzie roztworem formaldehydu (4% paraformaldehyd w 0,1 M buforze fosforanowym, pH 7.4). Mózgi poddawano sekcji i ustalano w ustalaczu przez 3-4 godziny i następnie przeniesiono do 25% sacharozy/0,1 M buforze fosforanowym na 48 godzin. Pięć serii 40 im wycinków przez ciało prążkowane i substantia nigra (SN) cięto na mokrogilotynie wymrożeniowej. Ilościowe szacowanie neuronów dopaminergicznych w SN: Liczba FG-znakowanych par SN szacowano prowadząc obserwacje ślepe jak opisano poprzednio (Sauer i Oetfel, Neuroscience 1994 59, 401-415). W skrócie, zastosowano trzy kolejne wycinki zgrupowane wokół poziomu średniego terminalnego jądra pomocniczego obszaru optycznego (MTN; -5.3 w atlasie Paxinos i Watson (1997)) a zliczane były wszystkie znakowane/wybarwione neurony boczne do MTN przy powiększeniu 40 x (n=6-7/grupę). Neurony znakowane-FG były ujęte, gdy dawały jasną fluorescencję pod epi-illuminatorem przy 330 nm, prezentowały neuronowy profil i przewodziły przynajmniej jeden proces nerwowy.

Po stronie chorej zwierząt otrzymujących zastrzyki lentiwirusów przenoszących GFP liczbą FG-dodatnich neuronów substancji nigra została zredukowana do 18% tych po stronie zdrowej. Dla kontrastu, zwierzęta zaszczepiane lenti-neubląstyną wykazywały prawie całkowite zabezpieczenie liczby FG-dodatnich neuronów substancji nigra (89%). Było to tak skuteczne, że u zwierząt traktowanych lenti-GDNF 87% retroznakowanych neuronów pozostawało po stronie chorobowo zmienionej. Dowodzi to, że neublastyna jest silnym czynnikiem przeżyciowym dla chorych dojrzałych neuronów dopaminowych substancji nigra i jest ona tak silna jak GDNF.

Figura 8 jest ilustracją wpływu in vivo neublastyny lentiwirusowej na neurony dopaminowe substancji nigra. Neurony z par SN, u samic szczura Sprague Dawley, retroznakowano stosując Fluorogold (FG), 3 tygodnie przed pojedynczym zaszczepieniem 6-hydroksydopaminą (6-OHDA) w prawym ciele prążkowanym. Tydzień przed iniekcją 6-OHDA, zwierzęta otrzymywały iniekcje wektorów lentiwirusowych ekspresjonujących neublastynę [neublastyna], GDNF [GDNF] lub białko zielonej fluorescencji [GFP] jak wskazano na figurze. Dwadzieścia jeden dni po iniekcji 6-OHDA, określano liczbę FG-znakowanych neuronów po obydwu stronach ciała prążkowanego. Figura prezentuje udział procentowy [%FG chore/zdrowe] wśród FG-znakowanych neuronów w chorej (prawej) stronie w porównaniu ze zdrową (lewą) stroną ciała prążkowanego z trzech grup zwierząt.

P r z y k ł a d 10: Otrzymywanie przeciwciał

W celu uzyskania przeciwciał specyficznych wobec neublastyny, immunizowano dwa króliki stosując peptyd 1: CRPTRYEAVSFMDVNST (aminokwasy 108-'I24 z SEQ ID nr: 9); lub peptyd 2: ALRPPPGSRPVSQPC (aminokwasy 93-107 z SEQ ID nr: 9) sprzęgnięte z białkiem nośnikowym, w trzytygodniowych odstępach. Dwa króliki dla każdego peptydu immunizowano w 0, 3, 6 i 10 tygodniu, i zbierano krew w 7 i 11 tygodniu. Następnie krew oczyszczano na białkowej kolumnie powinowactwa. Przeciwciała nazwano Ab-1 i Ab-2, odpowiednio do peptydów.

Western blot: 2 x 10⁶ komórek HiB5, stabilnie transfekowanych cDNA neublastyny (HibSpUbi1zNBN22), lub komórek HiB5 nietransfekowanych, inkubowano przez noc w medium nie zawierającym surowicy z dodatkiem N2 (GIBCO). Medium zatężano na małych zagęszczaczach membranowych o przepuszczalności granicznej 5 kDa (Millipore, Bedford, MA). Zatężone próbki dodawano do buforu do próbek 5 x Laemmli i ogrzewano do 95°C przez 5 minut. Próby rozdzielano elektroforetycznie na 12% żelu poliakrylamidowym z SDS i przeniesiono na membranę PVDF. Istniejące miejsca wiążące białka blokowano 5% beztłuszczowym mlekiem w proszku w PBS z 0.1% Tween-20. Mem38

PL 198 599 B1 brany inkubowano przez noc z przeciwciałami specyficznymi wobec neublastyny (1:1000); następnie inkubowano drugowarstwowym anty-króliczym lub anty-mysim przeciwciałem IgG sprzęgniętym z peroksydazą chrzanową (1:2000).

Immunowybarwianie wizualizowano stosując wzmocnioną chemiluminescencję Plus (ECL+) zgodnie z instrukcjami producenta (Amersham). Wyniki tych eksperymentów przedstawiono na fig. 3 i w przykł adzie 5.

Stosując standardowe techniki, uzyskano także królicze poliklonalne przeciwciała specyficzne wobec następujących peptydów:

Peptyd R27: GPGSRARAAGARGC (aminokwasy 30-43 z SEQ ID nr: 9);

Peptyd R28: LGHRSDELVRFRFC (aminokwasy 57-70 z SEQ ID nr: 9);

Peptyd R29: CRRARSPHDLSL (aminokwasy 74-85 z SEQ ID nr: 9);

Peptyd R30: LRPPPGSRPVSQPC (aminokwasy 94-107 z SEQ ID nr: 9); i

Peptyd R31: STWRTVDRLSATAC (aminokwasy 123-136 z SEQ ID nr: 9).

Tylko peptydy R30 i R31, stosunkowo bliskie C-końca, rozpoznawały zdenadurowane białka w warunkach redukują cych w Western blot.

Lista sekwencji <160> 33 <170> Patentln Ver. 2.0 <210> 1 <211> 865 <212> DNA <213> Homo sapiens <220>

<221> CDS <222> (120). . (719) <220>

<221> 5'UTR <222> (1).. (119) <220>

<221> 3'UTR <222> (721)..(865) <220>

<221> sig_peptyd <222> (120)...(179) <220>

<221> mat_peptyd <222> (405)..(719) <220>

<221> misc_struktura <222> (661)..(663) <223> CARBOHYD: Glikozylowana asparagina przy Asn87 <220>

<22l> miso_struktura <222> (426)..(623) <223> DISULFID -Mostek disiarczkowy Cys8-Cys73 <220>

<221> misc_struktura <222> (507)..(707) <223> DISULFID: Mostek disiarczkowy Cys35-Cysl01 <220>

<221> misc_struktura <222> (519)..(713) <223> DISULFID: Mostek disiarczkowy Cys39-Cysl03 <22 D>

<221> misc_struktura <222> (616)..(619) <223> DISULFID: Wewnątrzłańcuchowy mostek disiarczkowy Cys72-Cys72

PL 198 599 B1 <400> 1 ctaggagccc atgcccggcc tgatctcagc ccgaggacag cccctccttg aggtccttcc 60 tccccaagcc cacctgggtg ccctctttct ccctgaggct ccacttggtc tctccgcgc 119

atg Met -95

cct Pro

gcc Ala

ctg Leu

tgg ccc

acc Thr

ctg gcc get Leu Ala Ala

ctg get Leu Ala -85

ctg Leu

ctg Leu

agc Ser

agc Ser -80

157

Trp

Pro -90

gtc

gca

gag

gcc

tcc

ctg

ggc

tcc gcg ccc

cgc agc

cct

gcc

ccc

cgc

215

Val

Ala

Glu

Ala

Ser -75

Leu

Gly

Ser Ala Pro -70

Arg Ser

Pro

Ala

Pro -65

Arg

gaa

ggc

ccc

ccg

cct

gtc

ctg

gcg tcc ccc

ccc ggc

cac

ctg

ccg

ggg

263

Glu

Gly

Pro

Pro -60

Pro

Val

Leu

Ala Ser Pro -55

Ala Gly

His

Leu -50

Pro

Gly

gga

cgc

acg

gcc

cgc

tgg

tgc

agt gga aga

gcc cgg

cgg

ccg

cgc

cgc

311

Gly

Arg

Thr -45

Ala

Arg

Trp

Cys

Ser Gly Arg -40

Ala Arg

Arg -35

Pro

Arg

Arg

aga

cac

ttc

tcg

gcc

cgc

gcc

ccc gcc gcc

tgc acc

ccc

atc

tgc

tet

359

Arg

His -30

Phe

Ser

Ala

Arg

Ala -25

Pro Ala Ala

Cys Thr -20

Pro

Ile

Cys

Ser

tcc

ccg

cgg

gtc

cgc

gcg

gcg

cgg ctg ggg

ggc cgg

gca

gcg

cgc

tcg

407

Ser -15

Pro

Arg

Val

Arg

Ala -10

Ala

Arg Leu Gly

Gly Arg -5

Ala

Ala

Arg -1

Ser 1

ggc

agc

ggg

ggc

gcg

ggg

tgc

cgc ctg cgc

tcg cag

ctg

gtg

ccg

gtg

455

Gly

Ser

Gly

Gly 5

Ala

Gly

Cys

Arg Leu Arg 10

Ser Gin

Leu

Val 15

Pro

Val

cgc

gcg

ctc

ggc

ctg

ggc

cac

cgc tcc gac

gag ctg

gtg

cgt

ttc

cgc

503

Arg

Ala

Leu 20

Gly

Leu

Gly

His

Arg Ser Asp 25

Glu Leu

Val 30

Arg

Phe

Arg

ttc

tgc

acc

ggc

tcc

tgc

ccg

cgc gcg cgc

tet cca

cac

gac

ctc

agc

551

Phe

Cys 35

Thr

Gly

Ser

Cys

Pro 40

Arg Ala Arg

Ser Pro 45

His

Asp

Leu

Ser

ctg

gcc

agc

eta

ctg

ggc

gcc

ggg gcc ctg

ega ccg

ccc

ccg

ggc

tcc

599

Leu 50

Ala

Ser

Leu

Leu

Gly 55

Ala

Gly Ala Leu

Arg Pro 60

Pro

Pro

Gly

Ser 65

cgg

ccc

gtc

agc

cag

ccc

tgc

tgc ega ccc

acg cgc

tac

gaa

gcg

gtc

647

Arg

Pro

Val

Ser

Gin 70

Pro

Cys

Cys Arg Pro 75

Thr Arg

Tyr

Glu

Ala 80

Val

tcc

ttc

atg

gac

gtc

aac

agc

acc tgg aga

acc gtg

gac

cgc

ctc

tcc

695

Ser

Phe

Met

Asp 85

Val

Asn

Ser

Thr Trp Arg 90

Thr Val

Asp

Arg 95

Leu

Ser

gcc Ala

acc Thr

gcc Ala 100

tgc Cys

ggc Gly

tgc Cys

ctg Leu

ggc tgagggctcg ctccagggct ttgcagactg Gly 105

749

PL 198 599 B1 gacccttacc ggtggctctt cctgcctggg accctcccgc agagtcccac tagccagcgg 809 cctcagccag ggacgaaggc ctcaaagctg agaggcccct gccggtgggt gatgga 865 <210> 2 <211> 200 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2

Met

Pro

Ala

Leu

Trp

Pro

Thr

Leu

Ala

Ala

Leu

Ala

Leu

Leu

Ser

Ser

-95

-90

-85

-BO

Val

Ala

Glu

Ala

Ser

Leu

Gly

Ser

Ala

Pro

Arg

Ser

Pro

Ala

Pro

Arg

-75

-70

-65

Glu

Gly

Pro

Pro

Pro

Val

Leu

Ala

Ser

Pro

Ala

Gly

His

Leu

Pro

Gly

-60

-55

-50

Gly

Arg

Thr

Ala

Arg

Trp

Cys

Ser

Gly

Arg

Ala

Arg

Arg

Pro

Arg

Arg

-45

-40

-35

Arg

His

Phe

Ser

Ala

Arg

Ala

Pro

Ala

Ala

Cys

Thr

Pro

Ile

Cys

Ser

-30

-25

-20

Ser

Pro

Arg

Val

Arg

Ala

Ala

Arg

Leu

Gly

Gly

Arg

Ala

Ala

Arg

Ser

-15

-10

-5

-1

1

Gly

Ser

Gly

Gly

Ala

Gly

Cys

Arg

Leu

Arg

Ser

Gin

Leu

Val

Pro

Val

5

10

15

Arg

Ala

Leu

Gly

Leu

Gly

His

Arg

Ser

Asp

Glu

Leu

Val

Arg

Phe

Arg

20

25

30

Phe

Cys

Thr

Gly

Ser

Cys

Pro

Arg

Ala

Arg

Ser

Pro

His

Asp

Leu

Ser

35

40

45

Leu

Ala

Ser

Leu

Leu

Gly

Ala

Gly

Ala

Leu

Arg

Pro

Pro

Pro

Gly

Ser

50

55

60

65

Arg

Pro

Val

Ser

Gin

Pr-o

Cys

Cys

Arg

Pro

Thr

Arg

Tyr

Glu

Ala

Val

70

75

80

Ser

Phe

Met

Asp

Val

Asn

Ser

Thr

Trp

Arg

Thr

Val

Asp

Arg

Leu

Ser

85

90

95

Ala

Thr

Ala

Cys

Gly

cys

Leu

Gly

100

105

<210> 3 <211> 861 <212> DNA <213> Homo sapiens <220>

PL 198 599 B1 <221> CDS <222> (7)..{717ϊ <220>

<221> 5'UTR <222> (1)..(6) <220>

<221> 3’UTR <222> (718)..(861) <220>

<221> sig_peptyd <222> (7)..{174} <220>

<221> mat_peptyd <222> (298)..{717) <220>

<221> mat_peptyd <222> (370)..(717) <220>

<221> mat_peptyd <222> (379)..(717) <220>

<221> misc_struktura <222> (661)..(663) <223> CARBOHYD: Glikozylowana aspargina przy Asnl22 <220>

<221> misc_struktura <222> (424)..(621) <223> DISULFID: Mostek disiarczkowy Cys43-Cysl03 <220>

<221> misą struktura <222> (505T-.(705) <223> DISULFID: Mostek disiarczkowy Cys70-Cysl36 <220>

<221> misc_struk'tura <222> (517)..(711) <223> DISULFID: Mostek disiarczkowy Cys74-Cysl38 <220>

<221> misc_struktura <222> (616)..(618) <223> DISULFID:Wewnątrzłańcuchowy mostek disiarczkowy Cysl07-Cysl07 <400> 3 gagccc atg ccc ggc ctg atc tca gcc ega gga cag ccc ctc ctt gag 48

Met Pro Gly Leu. Ile Ser Ala Arg Gly Gin Pro Leu Leu Glu

-95 -90 -85

PL 198 599 B1

gtc Val

ctt Leu

cct Pro

ccc Pro -80

caa gcc Gin Ala

cac ctg ggt gcc

ctc Leu

ttt Phe

ctc Leu

cct gag gct Pro Glu Ala -70

96

His

Leu

Gly Ala -75

cca

ctt

ggt

ctc

tcc

gcg

cag

cct

gcc

ctg

tgg

ccc

acc

ctg

gcc

gct

144

Pro

Leu

Gly

Leu

Ser

Ala

Gin

Pro

Ala

Leu

Trp

Pro

Thr

Leu

Ala

Ala

-65

-60

-55

ctg

gct

ctg

ctg

agc

agc

gtc

gca

gag

gcc

tcc

ctg

ggc

tcc

gcg

ccc

192

Leu

Ala

Leu

Leu

Ser

Ser

Val

Ala

Glu

Ala

Ser

Leu

Gly

Ser

Ala

Pro

-50

-45

-40

cgc

agc

cct

gcc

ccc

cgc

gaa

ggc

ccc

ccg

cct

gtc

ctg

gcg

tcc

ccc

240

Arg

Ser

Pro

Ala

Pro

Arg

Glu

Gly

Pro

Pro

Pro

Val

Leu

Ala

Ser

Pro

-35

-30

-25

-20

gcc

ggc

cac

ctg

ccg

ggg

gga

cgc

acg

gcc

cgc

tgg

tgc

agt

gga

aga

288

Ala

Gly

His

Leu

Pro

Gly

Gly

Arg

Thr

Ala

Arg

Trp

Cys

Ser

Gly

Arg

-15

-10

-5

gcc

cgg

cgg

ccg

ccg

ccg

cag

cct

tet

cgg

ccc

gcg

ccc

ccg

ccg

cct

336

Ala

Arg

Arg

Pro

Pro

Pro

Gin

Pro

Ser

Arg

Pro

Ala

Pro

Pro

Pro

Pro

-1

1

5

10

gca

ccc

cca

tet

gct

ctt

ccc

cgc

ggg

ggc

cgc

gcg

gcg

cgg

gct

ggg

384

Ala

Pro

Pro

Ser

Ala

Leu

Pro

Arg

Gly

Gly

Arg

Ala

Ala

Arg

Ala

Gly

15

20

25

ggc

ccg

ggc

aac

cgc

gct

cgg

gca

gcg

ggg

gcg

cgg

ggc

tgc

cgc

ctg

432

Gly

Pro

Gly

Asn

Arg

Ala

Arg

Ala

Ala

Gly

Ala

Arg

Gly

Cys

Arg

Leu

30

35

40

45

cgc

tcg

cag

ctg

gtg

ccg

gtg

cgc

gcg

ctc

ggc

ctg

ggc

cac

cgc

tcc

480

Arg

Ser

Gin

Leu

Val

Pro

Val

Arg

Ala

Leu

Gly

Leu

Gly

His

Arg

Ser

50

55

60

gac

gag

ctg

gtg

cgt

ttc

cgc

ttc

tgc

agc

ggc

tcc

tgc

cgc

cgc

gcg

528

Asp

Glu

Leu

Val

Arg

Phe

Arg

Phe

Cys

Ser

Gly

Ser

Cys

Arg

Arg

Ala

65

70

75

cgc

tet

cca

cac

gac

ctc

agc

ctg

gcc

agc

eta

ctg

ggc

gcc

ggg

gcc

576

Arg

Ser

Pro

His

ASp

Leu

Ser

Leu

Ala

Ser

Leu

Leu

Gly

Ala

Gly

Ala

80

85

90

ctg

ega

ccg

ccc

ccg

ggc

tcc

cgg

ccc

gtc

agc

cag

ccc

tgc

tgc

ega

624

Leu

Arg

Pro

Pro

Pro

Gly

Ser

Arg

Pro

Val

Ser

Gin

Pro

Cys

Cys

Arg

95

100

105

ccc

acg

cgc

tac

gaa

gcg

gtc

tcc

ttc

atg

gac

gtc

aac

agc

acc

tgg

672

Pro

Thr

Arg

Tyr

Glu

Ala

Val

Ser

Phe

Met

Asp

Val

Asn

Ser

Thr

Trp

110

115

120

125

aga

acc

gtg

gac

cgc

ctc

tcc

gcc

aac

ccc

tgc

ggc

tgc

ctg

ggc

717

Arg

Thr

Val

Asp

Arg

Leu

Ser

Ala

Asn

Pro

Cys

Gly

Cys

Leu

Gly

130 135 140

PL 198 599 B1

tgagggctcg	ctccagggct	ttgcagactg	gacccttacc	ggtggctctt	cctgcctggg	777
accctcccgc	agagtcccac	tagccagcgg	cctcagccag	ggacgaaggc	ctcaaagctg	837
agaggcccct	gccggtgggt	gatg				861

<210> 4 <211> 237 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4

Met

Pro Gly -95

Leu

Ile Ser

Ala Arg Gly -90

Gin

Pro

Leu

Leu -85

Glu

Val Leu

Pro

Pro

Gin

Ala

His

Leu

Gly

Ala

Leu

Phe

Leu

Pro

Glu

Ala

Pro

Leu

-80

-75

-70

Gly

Leu

Ser

Ala

Gin

Pro

Ala

Leu

Trp

Pro

Thr

Leu

Ala

Ala

Leu

Ala

-65

-60

-55

-50

Leu

Leu

Ser

Ser

Val

Ala

Glu

Ala

Ser

Leu

Gly

Ser

Ala

Pro

Arg

Ser

-45

-40

-35

Pro

Ala

Pro

Arg

Glu

Gly

Pro

Pro

Pro

Val

Leu

Ala

Ser

Pro

Ala

Gly

-30

-25

-20

His

Leu

Pro

Gly

Gly

Arg

Thr

Ala

Arg

Trp

Cys

Ser

Gly

Arg

Ala

Arg

-15

-10

-5

Arg

Pro

Pro

Pro

Gin

Pro

Ser

Arg

Pro

Ala

Pro

Pro

Pro

Pro

Ala

Pro

-1

1

5

10

15

Pro

Ser

Ala

Leu

Pro

Arg

Gly

Gly

Arg

Ala

Ala

Arg

Ala

Gly

Gly

Pro

20

25

30

Gly

Asn

Arg

Ala

Arg

Ala

Ala

Gly

Ala

Arg

Gly

Cys

Arg

Leu

Arg

Ser

35

40

45

Gin

Leu

Val

Pro

Val

Arg

Ala

Leu

Gly

Leu

Gly

His

Arg

Ser

Asp

Glu

50

55

60

Leu

Val

Arg

Phe

Arg

Phe

Cys

Ser

Gly

Ser

Cys

Arg

Arg

Ala

Arg

Ser

65

70

75

Pro

His

Asp

Leu

Ser

Leu

Ala

Ser

Leu

Leu

Gly

Ala

Gly

Ala

Leu

Arg

80

85

90

95

Pro

Pro

Pro

Gly

Ser

Arg

Pro

Val

Ser

Gin

Pro

Cys

Cys

Arg

Pro

Thr

100

105

110

Arg

Tyr

Glu

Ala

Val

Ser

Phe

Met

Asp

Val

Asn

Ser

Thr

Trp

Arg

Thr

115

120

125

Val

Asp

Arg

Leu

Ser

Ala

Asn

Pro

Cys

Gly

Cys

Leu

Gly

130 135 140

PL 198 599 B1 <210> 5 <211> 140 <212> PRT <213> Homo sapiens <220>

<223> W którym Xaa w pozycji 134 oznacza Asn lub Thr, a Yaa w pozycji 135 oznacza Ala lub Pro <400> 5

Pro

Pro

Pro

Gin

Pro

Ser

Arg

Pro

Ala

Pro

Pro

Pro

Pro

Ala

Pro

Pro

.1

5

10

15

Ser

Ala

Leu

Pro

Arg

Gly

Gly

Arg

Ala

Ala

Arg

Ala

Gly

Gly

Pro

Gly

20

25

30

Asn

Arg

Ala

Arg

Ala

Ala

Gly

Ala

Arg

Gly

Cys

Arg

Leu

Arg

Ser

Gin

35

40

45

Leu

Val

Pro

Val

Arg

Ala

Leu

Gly

Leu

Gly

His

Arg

Ser

Asp

Glu

Leu

50

55

60

Gly

Cys

Arg

M -

O AW

Val

Arg

Phe

Arg

Pne

Cys

Ser

Ser

AXy

Λία

λχ y

65

70

75

80

His

Asp

Leu

Ser

Leu

Ala

Ser

Leu

Leu

Gly

Ala

Gly

Ala

Leu

Arg

Pro

85

90

95

Pro

Pro

Gly

Ser

Arg

Pro

Val

Ser

Gin

Pro

Cys

Cys

Arg

Pro

Thr

Arg

100

105

110

Tyr

Glu

Ala

Val

Ser

Phe

Met

Asp

Val

Asn

Ser

Thr

Trp

Arg

Thr

Val

115

120

125

Asp

Arg

Leu

Ser

Ala

Xaa

Yaa

Cys

Gly

Cys

Leu

Gly

130 135 140 <210> 6 <211> 116 <212> PRT <213> Homo sapiens <220>

<223> w którym Xaa w pozycji 110 oznacza Asn lub Thr, a Yaa w pozycji 111 oznacza Ala lub Pro

<400> 6 Ala Ala 1

Arg

Ala

Gly 5

Gly

Pro

Gly

Asn

Arg 10

Ala

Arg

Ala

Ala

Gly 15

Ala

Arg

Gly

Cys

Arg 20

Leu

Arg

Ser

Gin

Leu 25

Val

Pro

Val

Arg

Ala 30

Leu

Gly

Leu

Gly

His 35

Arg

Ser

Asp

Glu

Leu 40

Val

Arg

Phe

Arg

Phe 45

Cys

Ser

Gly

PL 198 599 B1

Ser

Cys 50

Arg

Arg

Ala

Arg

Ser 55

Pro

His

Asp

Leu

Ser 60

Leu

Ala

Ser

Leu

Leu 65

Gly

Ala

Gly

Ala

Leu 70

Arg

Pro

Pro

Pro

Gly 75

Ser

Arg

Pro

Val

Ser 80

Gin

Pro

Cys

Cys

Arg 85

Pro

Thr

Arg

Tyr

Glu 90

Ala

Val

Ser

Phe

Met 95

Asp

Val

Asn

Ser

Thr 100

Trp

Arg

Thr

Val

Asp 105

Arg

Leu

Ser

Ala

Xaa 110

Yaa

Cys

Gly Cys Leu Gly
	115
<210> <211> <212> <213>	7 113 PRT Homo sapiens

<220>

<223> W którym Xaa w pozycji 107 oznacza Asn lub Thr, a Yaa w pozycji 108 oznacza Ala lub Pro <400> 7

Ala Gly Gly Pro Gly Asn	Arg Ala Arg Ala Ala Gly Ala Arg Gly Cys
1	5	10	15
Arg Leu Arg Ser Gin Leu	Val Pro Val Arg	Ala Leu Gly Leu Gly His
	20	25	30
Arg Ser Asp Glu Leu Val	Arg Phe Arg Phe	Cys Ser Gly Ser Cys Arg
	35	40	45
Arg Ala Arg Ser Pro His	Asp Leu Ser Leu	Ala Ser Leu Leu Gly Ala
50	55	60
Gly Ala Leu Arg Pro Pro	Pro Gly Ser Arg	Pro Val Ser Gin Pro Cys
65	70		75 80
Cys Arg Pro Thr Arg Tyr	Glu Ala Val Ser	Phe Met Asp Val Asn Ser
	85	90	95
Thr Trp Arg Thr Val Asp	Arg Leu Ser Ala	Xaa Yaa Cys Gly Cys Leu
	100	105	110
Gly
<210>	8
<211>	861
<212>	DNA
<213>	Homo sapiens
<220>
<221>	CDS
<222>	(58)..(717)

PL 198 599 B1 <220>

<221> 5'UTR <222> (1)..(57) <220>

<221> 3'UTR <222> (718) . . (861) <220>

<221> sig_peptyd <222> (53) . . (174) <220>

<221> mat_peptyd <222> (298) . . (717) <220>

<221> matjoeptyd <222> (370) . . (717) <220>

<221> mat_peptyd <222> (379)..(717) <220>

<221> misc_struktura <222> (561)..(663) <223> CARBOHYD: Glikozylowana aspargina przy Aśril22 <220>

<221> misc_struktura <222> (424)..(621) <223> DISULFID: Mo&tek disiarczkowy Gly43-Glyl08 <220>

<221> misc_struktura <222> (505)..(705) <223> DISULFID:Mostek disiarczkowy Gly70-Glyl36 <220>

<221> misc_struktura <222> (517)..(711) <223> DISULFID:Mostek disiarczkowy Gly74-Glyl33 <220>

<221> misc_strukyura <222> (616)..(618) <223> DISULFID:Wewnątrzłańcuchowy mostek disiarczkowy Glyl07-Glyl07 <400> 8 aggagggtgg gggaacagct caacaatggc tgatgggcgc tcctggtgtt gatagag 57 atg gaa ctt gga ctt gga ggc etc tcc acg ctg tcc cac tgc ccc tgg 105

Met Glu Leu Gly Leu Gly Gly Leu Ser Tłir Leu Ser His Cys Pro Trp

-80 -75 -70 -65

PL 198 599 B1

cct Pro

agg Arg

cgg Arg

cag Gin

cct Pro -60

gcc Ala

ctg tgg ccc

acc Thr -55

ctg Leu

gcc Ala

get Ala

ctg Leu

get Ala -50

ctg Leu

153

Leu

Trp

Pro

ctg

age

age

gtc

gca

gag

gcc

tcc

ctg

ggc

tcc

gcg

ccc

ege

age

cct

201

Leu

Ser

Ser

Val -45

Ala

Glu

Ala

Ser

Leu -40

Gly

Ser

Ala

Pro

Arg -35

Ser

Pro

gcc

ccc

ege

gaa

ggc

ccc

ccg

cct

gtc

ctg

gcg

tcc

ccc

gcc

ggc

cac

249

Ala

Pro

Arg -30

Glu

Gly

Pro

Pro

Pro -25

Val

Leu

Ala

Ser

Pro -20

Ala

Gly

His

ctg

ccg

ggg

gga

ege

acg

gcc

ege

tgg

tgc

agt

gga

aga

gcc

cgg

cgg

297

Leu

Pro -15

Gly

Gly

Arg

Thr

Ala -10

Arg

Trp

cys

Ser

Gly -5

Arg

Ala

Arg

Arg -1

ccg

ccg

ccg

cag

cct

tet

cgg

ccc

gcg

ccc

ccg

ccg

cct

gca

ccc

cca

345

Pro 1

Pro

Pro

Gin

Pro 5

Ser

Arg

Pro

Ala

Pro 10

Pro

Pro

Pro

Ala

Pro 15

Pro

tez

get

ctt

ccc

ege

ggg

ggc

ege

gcg

gcg

cgg

get

ggg

ggc

ccg

ggc

393

Ser

Ala

Leu

Pro 20

Arg

Gly

Gly

Arg

Ala 25

Ala

Arg

Ala

Gly

Gly 30

Pro

Gly

age

ege

get

cgg

gca

gcg

ggg

gcg

cgg

ggc

tgc

ege

ctg

ege

teg

cag

441

Ser

Arg

Ala 35

Arg

Ala

Ala

Gly

Ala 40

Arg

Gly

Cys

Arg

Leu 45

Arg

Ser

Gin

ctg

gtg

ccg

gtg

ege

gcg

ctc

ggc

ctg

ggc

cac

ege

tcc

gac

gag

ctg

489

Leu

Val 50

Pro

Val

Arg

Ala

Leu 55

Gly

Leu

Gly

His

Arg 60

Ser

Asp

Glu

Leu

gtg

cgt

ttc

ege

ttc

tgc

age

ggc

tcc

tgc

ege

ege

gcg

ege

tet

cca

537

Val 65

Arg

Phe

Arg

Phe

Cys 70

Ser

Gly

Ser

Cys

Arg 75

Arg

Ala

Arg

Ser

Pro 80

cac

gac

ctc

age

ctg

gcc

age

eta

ctg

ggc

gcc

ggg

gcc

ctg

ega

ccg

585

His

Asp

Leu

Ser

Leu 85

Ala

Ser

Leu

Leu

Gly 90

Ala

Gly

Ala

Leu

Arg 95

Pro

ccc

ccg

ggc

tcc

cgg

ccc

gtc

age

cag

ccc

tgc

tgc

ega

ccc

acg

ege

633

Pro

Pro

Gly

Ser 100

Arg

Pro

Val

Ser

Gin 105

Pro

Cys

Cys

Arg

Pro 110

Thr

Arg

tac

gaa

gcg

gtc

tcc

ttc

atg

gac

gtc

aac

age

acc

tgg

aga

acc

gtg

681

Tyr

Glu

Ala 115

Val

Ser

Phe

Met

Asp 120

Val

Asn

Ser

Thr

Trp 125

Arg

Thr

Val

gac Asp

ege Arg 130

ctc Leu

tcc Ser

gcc Ala

acc Thr

gcc Ala 135

tgc Cys

ggc Gly

tgc Cys

ctg Leu

ggc Gly 140

tgagggctcg

727

ctccagggct ttgcagactg gacccttacc ggtggctctt cctgcctggg accctcccgc 787 agagtcccac tagccagcgg cctcagccag ggacgaaggc ctcaaagctg agaggcccct 847 accggtgggt gatg 861

PL 198 599 B1 <210> 9 <211> 220 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9

Met Glu Leu Gly Leu Gly

Gly Leu

Ser Thr Leu -70

Ser

His

Cys

Pro Trp -65

-80

-75

Pro

Arg

Arg

Gin

Pro

Ala

Leu

Trp

Pro

Thr

Leu

Ala

Ala

Leu

Ala

Leu

-60

-55

-50

Leu

Ser

Ser

Val

Ala

Glu

Ala

Ser

Leu

Gly

Ser

Ala

Pro

Arg

Ser

Pro

-45

-40

-35

Ala

Pro

Arg

Glu

Gly

Pro

Pro

Pro

Val

Leu

Ala

Ser

Pro

Ala

Gly

His

-30

-25

-20

Leu

Pro

Gly

Gly

Arg

Thr

Ala

Arg

Trp

Cys

Ser

Gly

Arg

Ala

Arg

Arg

-15

-10

-5

Pro

Pro

Pro

Gin

Pro

Ser

Arg

Pro

Ala

Pro

Pro

Pro

Pro

Ala

Pro

Pro

1

5

10

15

Ser

Ala

Leu

Pro

Arg

Gly

Gly

Arg

Ala

Ala

Arg

Ala

Gly

Gly

Pro

Gly

20

25

30

Ser

Arg

Ala

Arg

Ala

Ala

Gly

Ala

Arg

Gly

Cys

Arg

Leu

Arg

Ser

Gin

35

40

45

Leu

Val

Pro

Val

Arg

Ala

Leu

Gly

Leu

Gly

His

Arg

Ser

Asp

Glu

Leu

50

55

60

Val

Arg

Phe

Arg

Phe

Cys

Ser

Gly

Ser

Cys

Arg

Arg

Ala

Arg

Ser

Pro

65

70

75

80

His

Asp

Leu

Ser

Leu

Ala

Ser

Leu

Leu

Gly

Ala

Gly

Ala

Leu

Arg

Pro

85

90

95

Pro

Pro

Gly

Ser

Arg

Pro

Val

Ser

Gin

Pro

Cys

Cys

Arg

Pro

Thr

Arg

100

105

110

Tyr

Glu

Ala

Val

Ser

Phe

Met

Asp

Val

Asn

Ser

Thr

Trp

Arg

Thr

Val

115

120

125

Asp

Arg

Leu

Ser

Ala

Thr

Ala

Cys

Gly

Cys

Leu

Gly

130

135

140

<210> 10 <211> 140 <212> PRT <213> Homo sapiens
<220>
<221>	CARBOHYD
<222>	(122)

PL 198 599 B1 <223> glikolyzowana asparagina <400> 10

Pro 1

Pro

Pro

Gin

Pro 5

Ser

Arg

Pro

Ala

Pro 10

Pro

Pro

Pro

Ala

Pro 15

Pro

Ser

Ala

Leu

Pro 20

Arg

Gly

Gly

Arg

Ala 25

Ala

Arg

Ala

Gly

Gly 30

Pro

Gly

Ser

Arg

Ala 35

Arg

Ala

Ala

Gly

Ala 40

Arg

Gly

Cys

Arg

Leu 45

Arg

Ser

Gin

Leu

Val 50

Pro

Val

Arg

Ala

Leu 55

Gly

Leu

Gly

His

Arg 60

Ser

Asp

Glu

Leu

Val 65

Arg

Phe

Arg

Phe

Cys 70

Ser

Gly

Ser

Cys

Arg 75

Arg

Ala

Arg

Ser

Pro 80

His

Asp

Leu

Ser

Leu 85

Al a

Sat*

Τ1

GT v 90

Al s

m v

Al a

T.^·»

irrr • — » 95

Pro

Pro

Pro

Gly

Ser 100

Arg

Pro

Val

Ser

Gin 105

Pro

Cys

Cys

Arg

Pro 110

Thr

Arg

Tyr

Glu

Ala 115

Val

Ser

Phe

Ket

Asp 120

Val

Asn

Ser

Thr

Trp 125

Arg

Thr

Val

Asp

Arg

Leu

Ser

Ala

Thr

Ala

Cys

Gly

Cys

Leu

Gly

130 135 140 <210> 11 <211> 116 <212> PRT <213> Homo sapiens

<220> <221> CARBOHYD <222> (98) <223> glikolyzowana asparagina

<400> 11 Ala Ala Arg 1

Ala

Gly 5

Gly

Pro

Gly

Ser

Arg 10

Ala

Arg

Ala

Ala

Gly 15

Ala

Arg Gly Cys

Arg 20

Leu

Arg

Ser

Gin

Leu 25

Val

Pro

Val

Arg

Ala 30

Leu

Gly

Leu Gly His 35

Arg

Ser

Asp

Glu

Leu 40

Val

Arg

Phe

Arg

Phe 45

cys

Ser

Gly

Ser Cys Arg 50

Arg

Ala

Arg

Ser 55

Pro

His

Asp

Leu

Ser 60

Leu

Ala

Ser

Leu

Leu Gly Ala

Gly

Ala

Leu

Arg

Pro

Pro

Pro

Gly

Ser

Arg

Pro

Val

Ser

70 75 80

PL 198 599 B1

Gin

Pro

Cys

Cys

Arg Pro 85

Thr Arg

Tyr

Glu 90

Ala

Val

Ser

Phe

Met 95

Asp

Val

Asn

Ser

Thr 100

Trp Arg

Thr Val

Asp 105

Arg

Leu

Ser

Ala

Thr 110

Ala

Cys

Gly

Cys

Leu

Gly

115 <210> 12 <211> 113 <212> PRT <213> Homo sapiens <220>

<221> CARBOHYD <222> (95)

<223> glikozylowarta asparagina

<4oo> i; Ala Gly 1

i Gly

Pro

Gly 5

Ser

Arg

Ala

Arg

Ala 10

Ala

Gly

Ala

Arg

Gly 15

cys

Arg

Leu

Arg

Ser 20

Gin

Leu

Val

Pro

Val 25

Arg

Ala

Leu

Gly

Leu 30

Gly

His

Arg

Ser

Asp 35

Glu

Leu

Val

Arg

Phe 40

Arg

Phe

Cys

Ser

Gly 45

Ser

Cys

Arg

Arg

Ala 50

Arg

Ser

Pro

His

Asp 55

Leu

Ser

Leu

Ala

Ser 60

Leu

Leu

Gly

Ala

Gly 65

Ala

Leu

Arg

Pro

Pro 70

Pro

Gly

Ser

Arg

Pro 75

Val

Ser

Gin

Pro

cys 80

Cys

Arg

Pro

Thr

Arg 85

Tyr

Glu

Ala

Val

Ser 90

Phe

Met

Asp

Val

Asn 95

Ser

Thr

Trp

Arg

Thr 100

Val

Asp

Arg

Leu

Ser 105

Ala

Thr

Ala

Cys

Gly 110

Cys

Leu

Gly .

<210> 13 <211> 102 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 13 cctggccagc ctactgggcg ccggggccct gcgaccgccc ccgggctccc ggcccgtcag 60 ccagccctgc tgccgaccoa cgcgctacga agcggtctcc tt 102 <210> 14 <211> 220 <212> DNA <213> Murinae gen. sp. '

PL 198 599 B1

<400> 14 ggccaccgct	ccgacgagct	gatacgtttc	cgcttctgca	gcggctcgtg	ccgccgagca	60
cgctcccagc	acgatctcag	tctggccagc	ctactgggcg	ctggggccct	acggtcgcct	120
cccgggtccc	ggccgatcag	ccagccctgc	tgccggccca	ctcgctatga	ggccgtctcc	180
ttcatggacg	tgaacageac	ctggagaacc	gtggaccgcc			220

<210> 15 <211> 2136 <212> DNA <213 > Murinae gen. sp <220>

<221> CDS <222> {975).,(1646) <400> 15

gcggccgcga attcggcacg agggcgtctc gctgcagccc gcgatctcta ctctgcctcc 60
tggggtcttc	tccaaatgtc	tagcccccac	ctagagggac	ctagcctagc	cagcggggac	120
cggatccgga	gggtggagcg	gccaggtgag	ccctgaaagg	tggggcgggg	cgggggcgct	180
ctgggcccca	ccccgggatc	tggtgacgcc	ggggctggaa	tttgacaccg	gacggcggcg	240
ggcaggaggc	tgctgaggga	tggagttggg	ctcggccccc	agatgcggcc	cgcgggctct	300
gccagcaaca	agtccctcgg	gccccagccc	tegctgcgac	tggggcttgg	agccctgcac	360
ccaagggcac	agaccggctg	ccaaggcccc	acttttaact	aaaagaggcg	ctgccaggtg	420
cacaactctg	ggcatgatcc	acttgagctt	cgggggaaag	cccagcactg	gtcccaggag	480
aggcgcctag	aaggacacgg	accaggaccc	ctttggtatg	gagtgaacgc	tgagcatgga	540
gtggaaggaa	ctcaagttac	tactttctcc	aaccaccctg	gtaccttcag	ccctgaagta	600
cagagcagaa	gggtcttaga	agacaggacc	acagctgtgt	gagtctcccc	cctgaggcct	660
tagacgatct	ctgagctcag	ctgagctttg	tttgcccatc	tggagaagtg	agccattgat	720
tgaccttgtg	gcatcgcgaa	ggaacaggtc	ctgccaagca	cctaacacag	agagcaaggt	780
tctccatcgc	agctaccgct	gctgagttga	ctctagctac	tccaacctcc	tgggtcgctt	840
cgagagactg	gagtggaagg	aggaataccc	caaaggataa	ctaactcatc	tttcagtttg	900
caagctgccg	caggaagagg	gtggggaaac	gggtccacga	aggcttctga	tgggagettc	960

tggagccgaa agct atg

gaa

ctg

gga

ctt

gca

gag

cct

act

gca

ttg

tcc

1010

Met

Glu

Leu

Gly

Leu

Ala

Glu

Pro

Thr

Ala

Leu

Ser

1

5

10

cac

tgc

ctc

cgg

cct

agg

tgg

cag

tca

gcc

tgg

tgg

cca

acc

eta

get

1058

His

cys

Leu

Arg

Pro

Arg

Trp

Gin

Ser

Ala

Trp

Trp

Pro

Thr

Leu

Ala

15

20

25

PL 198 599 B1

gtt Val

eta Leu 30

gee Ala

ctg ctg

age Ser

tgc gtc Cys val 35

aca gaa Thr Glu

get Ala

tcc Ser 40

ctg gac Leu Asp

cca Pro

atg Met

1106

Leu

Leu

CCC

ege

agę

ccc

gee

get

ege

gac

ggt

ccc

tea

ccg

gtc

ttg

gcg

ccc

1154

Ser

Arg

Ser

Pro

Ala

Ala

Arg

Asp

Gly

Pro

Ser

Pro

Val

Leu

Ala

Pro

45

50

55

60

ccc

acg

gac

cac

ctg

cct

ggg

gga

cac

act

gcg

cat

ttg

tgc

age

gaa

1202

Pro

Thr

Asp

His

Leu

Pro

Gly

Gly

His

Thr

Ala

His

Leu

Cys

Ser

Glu

65

70

75

aga

acc

ctg

ega

ccc

ccg

cct

cag

tet

cct

eag

CCC

gca

ccc

ccg

ccg

1250

Arg

Thr

Leu

Arg

Pro

Pro

Pro

Gin

Ser

Pro

Gin

Pro

Ala

Pro

Pro

Pro

80

85

90

cct

ggt

ccc

gcg

etc

cag

tet

cct

ccc

get

gcg

etc

ege

ggg

gca

ege

1298

Pro

Gly

Pro

Ala

Leu

Gin

Ser

Pro

Pro

Ala

Ala

Leu

Arg

Gly

Ala

Arg

95

100

105

gcg

gcg

cgt

gca

gga

acc

cgg

age

age

ege

gca

cgg

acc

aca

gat

gcg

1346

Ala

Ala

Arg

Ala

Gly

Thr

Arg

Ser

Ser

Arg

Ala

Arg

Thr

Thr

Asp

Ala

110

115

120

cgc

ggc

tgc

ege

ctg

ege

teg

cag

ctg

gtg

ccg

gtg

age

gcg

etc

ggc

1394

Arg

Gly

Cys

Arg

Leu

Arg

Ser

Gin

Leu

Val

Pro

Val

Ser

Ala

Leu

Gly

125

130

135

140

eta

ggc

cac

age

tcc

gac

gag

ctg

ata

cgt

ttc

ege

ttc

tgc

age

ggc

1442

Leu

Gly

His

Ser

Ser

Asp

Glu

Leu

Ile

Arg

Phe

Arg

Phe

Cys

Ser

Gly

145

150

155

teg

tgc

ege

ega

gca

ege

tcc

cag

cac

gat

etc

agt

ctg

gee

age

eta

1490

Ser

Cys

Arg

Arg

Ala

Arg

Ser

Gin

His

ASp

Leu

Ser

Leu

Ala

Ser

Leu

160

165

170

ctg

ggc

get

ggg

gee

eta

cgg

teg

cct

ccc

ggg

tcc

cgg

ccg

atc

age

1538

Leu

Gly

Ala

Gly

Ala

Leu

Arg

Ser

Pro

Pro

Gly

Ser

Arg

Pro

Ile

Ser

175

180

185

cag

ccc

tgc

tgc

cgg

ccc

act

ege

tat

gag

gee

gtc

tcc

ttc

atg

gac

1586

Gin

Pro

Cys

Cys

Arg

Pro

Thr

Arg

Tyr

Glu

Ala

Val

Ser

Phe

Met

Asp

190

195

200

gtg

aac

age

acc

tgg

agg

acc

gtg

gac

cac

etc

tcc

gee

act

gee

tgc

1634

Val

Asn

Ser

Thr

Trp

Arg

Thr

Val

Asp

His

Leu

Ser

Ala

Thr

Ala

Cys

205

210

215

220

ggc tgt ctg ggc tgaggatgat ctatctccaa gcctttgcac aetagaceca 1686

Gly Cys Leu Gly

tgtgttgccc	tacctggaac	agctccaccg	ggcctcacta	accaggagcc	tcaactcagc	1746
aggatatgga	ggctgcagag	ctcaggcccc	aggccggtga	gtgacagacg	tcgtcggcat	1B06
gacagacaga	gtgaaagatg	tcggaaccac	cgaccaacag	tcccaagttg	ttcatggatc	1866
ccagctctac	agacaggaga	aacctcagct	aaagagaact	cctctgggag	aatccagaaa	1926
tggccctctg	tcctggggaa	tgaattttga	agagatatat	atacatatat	acattgtagt	1986
cgcgttgctg	gaccagcctg	tgctgaaacc	agtcccgtgt	tcacttgtgg	aagccgaagc	2046
cctatttatt	attcctaaat	tatttatrta	ctttgaaaaa	aaacggccaa	gtcggcctcc	2106

PL 198 599 B1 ccttagtgag ggttaatttg tgatcccggg 2136 <210> 16 <211> 224 <212> PRT <213> Murinae gen. sp <400> 16

Met 1

Glu

Leu

Gly Leu 5

Ala Glu Pro Thr Ala Leu Ser His Cys Leu Arg

15

Pro

Arg

Trp

Gin

Ser

Ala

Trp

Trp

Pro

Thr

Leu

Ala

Val

Leu

Ala

Leu

20

25

30

Leu

Ser

Cys

Val

Thr

Glu

Ala

Ser

Leu

Asp

Pro

Met

Ser

Arg

Ser

Pro

35

40

45

Ala

Ala

Arg

Asp

Gly

Pro

Ser

Pro

Val

Leu

Ala

Pro

Pro

Thr

Asp

His

50

55

60

Leu

Pro

Gly

Gly

His

Thr

Ala

His

Leu

Cys

Ser

Glu

Arg

Thr

Leu

Arg

65

70

75

80

Pro

Pro

Pro

Gin

Ser

Pro

Gin

Pro

Ala

Pro

Pro

Pro

Pro

Gly

Pro

Ala

85

90

95

Leu

Gin

Ser

Pro

Pro

Ala

Ala

Leu

Arg

Gly

Ala

Arg

Ala

Ala

Arg

Ala

100

105

110

Gly

Thr

Arg

Ser

Ser

Arg

Ala

Arg

Thr

Thr

Asp

Ala

Arg

Gly

Cys

Arg

115

120

125

Leu

Arg

Ser

Gin

Leu

Val

Pro

Val

Ser

Ala

Leu

Gly

Leu

Gly

His

Ser

130

135

140

Ser

Asp

Glu

Leu

Ile

Arg

Phe

Arg

Phe

Cys

Ser

Gly

Ser

Cys

Arg

Arg

145

150

155

160

Ala

Arg

Ser

Gin

His

Asp

Leu

Ser

Leu

Ala

Ser

Leu

Leu

Gly

Ala

Gly

165

170

175

Ala

Leu

Arg

Ser

Pro

Pro

Gly

Ser

Arg

Pro

Ile

Ser

Gin

Pro

Cys

Cys

180

185

190

Arg

Pro

Thr

Arg

Tyr

Glu

Ala

Val

Ser

Phe

Met

Asp

Val

Asn

Ser

Thr

195

200

205

Trp

Arg

Thr

Val

Asp

His

Leu

Ser

Ala

Thr

Ala

Cys

Gly

Cys

Leu

Gly

210

215

220

<210> 17 <211> 18 <212> DNA

<213> Sztuczna ’

sekwencj

a

PL 198 599 B1 <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji: prirner PCR <400> 17 cctggccagc ctactggg <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji: prirner PCR <400> 18 aaggagaccg cttcgtagcg 20 <210> 19 <211> 17 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji: prirner PCR <400> 19 atggaacttg gacttgg <210> 20 <211> 16 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji: prirner PCR <400> 20 tccatcaccc accggc 16 <210> 21 <211> 18 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji: primer PCR <400> 21 ggccaccgct ccgacgag <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja

PL 198 599 B1 <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji: primer PCR <400> 22 ggcggtccac ggttctccag <210> 23 <211> 29 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji: primer PCR <400> 23 ccaagcccac ctgggtgccc tctttctcc <210> 24 <211> 27 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji: primer PCR <400> 24 catcacccac cggcaggggc ctctcag <210> 25 <211> 35 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji: primer PCR <400> 25 gagcccatgc ccggcctgat ctcagcccga ggaca <210> 26 <211> 34 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji: primer PCR <400> 26 ccctggctga ggccgctggc tagtgggact ctgc <210> 27 <211> 31 <212> DNA <213> Stuczna sekwencja

PL 198 599 B1 <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji: sonda hybrydyzacji <400> 27 ncaggtggtc cgtggggggc gccaagaccg g 31 <210> 28 <211> 16 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji:	primer PCR	16
<400> 28 ctaggagccc	atgccc
<210> 29 <211> 351 <212> DNA <213> Homo	sapiens
<400> 29
atggctggag	gaccgggatc	tcgtgctcgt	gcagcaggag	cacgtggctg	tcgtctgcgt	60
tctcaactag	tgccggtgcg	tgcactcgga	ctgggacacc	gttccgacga	actagtacgt	120
tttcgttttt	gttcaggatc	ttgtcgtcgt	gcacgttctc	cgcatgatct	atctctagca	180
tctctactag	gagccggagc	actaagaccg	ccgccgggat	ctagacctgt	atctcaacct	240
tgttgtagac	ctactagata	cgaagcagta	tctttcatgg	acgtaaactc	tacatggaga	300
accgtagata	gactatctgc	aaccgcatgt	ggctgtctag	gatgataata	g	351
<210> 30 <211> 414 <212> DNA <213> Homo	sapiens
<400> 30 atgggccatc	atcatcatca	tcatcatcat	catcactcga	gcggccatat	cgacgacgac	60
gacaaggctg	gaggaccggg	atctcgtgct	cgtgcagcag	gagcacgtgg	ctgtcgtctg	120
cgttctcaac	tagtgccggt	gcgtgcactc	ggactgggac	accgttccga	cgaactagta	180
cgttttcgtt	tttgttcagg	atcttgtcgt	cgtgcacgtt	ctccgcatga	tctatctcta	240
gcatctctac	taggagccgg	agcactaaga	ccgccgccgg	gatctagacc	tgtatctcaa	300
ccttgttgta	gacctactag	atacgaagca	gtatctttca	tggacgtaaa	etctacafcgg	360
agaaccgtag	atagactatc	tgcaaccgća	tgtggctgtc	taggatgata	atag	414

PL 198 599 B1 <210> 31 <211> 39 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji: primer PCR <400> 31 aaggaaaaaa gcggccgcca tggaacttgg acttggagg 39 <210> 32 <211> 39 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji: primer PCR <400> 32 ttttttcctt ggcggccgct cagcccaggc agccgcagg 39 <210> 33 <211> 16 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji: primer <400> 33 gagcgagccc tcagcc 16

Claims (35)

1. Izolowany kwas nukleinowy neublastyny zawierający sekwencję wybraną z grupy obejmującej:

a) sekwencję nukleotydową SEQ ID nr: 1,

b) sekwencję nukleotydową zawierającą otwartą ramkę odczytu, która koduje ekspresję peptydu neublastyny lub polipeptydu z niej pochodzącego, posiadająca co najmniej 90% homologię aminokwasów (AA) do AA1-AA105 w sekwencji SEQ ID nr: 2.

c) kwas nukleinowy hybrydyzujący specyficznie w ostrych warunkach roztworu hybrydyzacyjnego z kwasem nukleinowym posiadającym sekwencję nukleotydową SEQ ID nr: 1, lub jego nicią komplementarną.

d) kwas nukleinowy, który wykazuje co najmniej 70% homologii do sekwencji nukleotydowej SEQ ID nr: 1.

e) kwas nukleinowy, który wykazuje co najmniej 70% homologii do sekwencji nukleotydowej SEQ ID nr: 1, zasad 405-719.

2. Kwas nukleinowy według zastrz. 1, znamienny tym, że kodowany polipeptyd stanowi aminokwasy AA1-AA105 sekwencji SEQ ID nr: 2.

3. Kwas nukleinowy według zastrz. 1, znamienny tym, że kodowany polipeptyd stanowi SEQ ID nr: 5.

4. Kwas nukleinowy według zastrz. 1, znamienny tym, że kodowany polipeptyd stanowi SEQ ID nr: 6.

5. Kwas nukleinowy według zastrz. 1, znamienny tym, że kodowany polipeptyd stanowi SEQ ID nr: 7.

6. Kwas nukleinowy według zastrz. 1, zawierający sekwencje SEQ ID nr: 3.

7. Kwas nukleinowy według zastrz. 1, będący w co najmniej 80% homologiczny do sekwencji polinukleotydowej prezentowanej jako SEQ ID nr: 1.

PL 198 599 B1

8. Kwas nukleinowy według zastrz. 1, będący w co najmniej 90% homologiczny do sekwencji polinukleotydowej prezenowanej jako SEQ ID nr: 1.

9. Wektor ekspresji zawierający kwas nukleinowy jak zdefiniowano w zastrz. 1-8.

10. Izolowana komórka transformowana kwasem nukleinowym jak zdefiniowano w zastrz. 1-8 lub wektorem jak zdefiniowano w zastrz. 9.

11. Komórka według zastrz. 10, znamienna tym, że komórka ta jest komórką eukariotyczną.

12. Komórka według zastrz. 10, znamienna tym, że komórka ta jest wybrana z grupy obejmującej komórki ssaków, grzybów i drożdży.

13. Komórka według zastrz. 10, znamienna tym, że komórka ta jest wybrana z grupy obejmującej komórkę jajnika chomika chińskiego, komórki HEK293, COS, PC12, HiB5, RN33b i ludzkie komórki rdzenia nerwowego.

14. Polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasową, która jest co najmniej w 90% homologiczna do aminokwasów od 1 do 105 w sekwencji SEQ ID nr: 2, korzystnie glikolizowany.

15. Polipeptyd neurotroficznego czynnika neublastyny zawierający sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEQ ID nr: 2, korzystnie glikolizowany.

16. Polipeptyd neurotroficznego czynnika neublastyny zawierający sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEQ ID nr: 4, korzystnie glikolizowany.

17. Polipeptyd neurotroficznego czynnika neublastyny zawierający sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEQ ID nr: 5, korzystnie glikolizowany.

18. Polipeptyd neurotroficznego czynnika neublastyny zawierający sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEQ ID nr: 6, korzystnie glikolizowany.

19. Polipeptyd neurotroficznego czynnika neublastyny zawierający sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEQ ID nr: 7, korzystnie glikolizowany.

20. Polipeptyd według zastrz. 14, znamienny tym, że polipeptyd ten jest kodowany przez kwas nukleinowy zdefiniowany w zastrz. 1-8.

21. Sposób wytwarzania polipeptydu zdefiniowanego w zastrz. 14-19, znamienny tym, że sposób ten obejmuje etap ekspresji wspomnianego polipeptydu przez kwas nukleinowy czynnika neurotroficznego neublastyny.

22. Sposób według zastrz. 21, znamienny tym, że obejmuje etap hodowli komórek zawierających wspomniany kwas nukleinowy czynnika neurotroficznego neublastyny w podłożu hodowlanym, które pozwala na wytwarzanie wspomnianego polipeptydu.

23. Sposób według zastrz. 22, znamienny tym, że ponadto obejmuje etap odzyskiwania wspomnianego polipeptydu z podłoża hodowlanego.

24. Oczyszczony polipeptyd otrzymany sposobem jak zdefiniowano w zastrz. 23.

25. Kompozycja zawierająca polipeptyd zdefiniowany w zastrz. 14-19 lub 24 i farmaceutycznie akceptowalny nośnik.

26. Zastosowanie polipeptydu jak zdefiniowano w zastrz. 14-19 lub 24 do wytwarzania leku.

27. Zastosowanie według zastrz. 26, do leczenia choroby neurodegeneracyjnej zawiązanej z uszkodzonymi i dotkniętymi urazem neuronami, takimi jak uszkodzenia urazowe nerwów obwodowych rdzenia i/lub rdzenia kręgowego, niedokrwiennnego uszkodzenia neuronów mózgu, neuropatii i zwłaszcza neuropatii obwodowej, choroby Alzheimera, choroby Huntingtona, choroby Parkinsona, stwardnienia zanikowego bocznego lub innych chorób neurodegeneracyjnych, i upośledzenia pamięci związanego z demencją.

28. Sekwencja kwasu nukleinowego primera PCR stanowiąca którąkolwiek z sekwencji przedstawionych jako SEQ ID nr: 17, 18, 19, 20, 23, 24, 25, 26 lub 28.

29. Sposób wytwarzania peptydów przedstawionych w sekwencji SEQ ID nr: 2, 4, 5, 6 lub 7, znamienny tym, że obejmuje hodowanie komórki, która zawiera jeden z kwasów nukleinowych z sekwencję przedstawioną w sekwencji SEQ ID nr: 1 lub 3, w warunkach umożliwiających wytwarzanie polipeptydu i odzyskiwanie tego polipeptydu w pożywki hodowli.

30. Sposób wytwarzania peptydu neublastyny zdefiniowanego w zastrz. 14-19, znamienny tym, że:

a) wprowadza się polinukleotyd, który koduje ekspresję dla polipetydy neublastyny do komórki, lub wprowadza się sekwencję regulatorową poprzez rekombinację homologiczną do komórki, taką że sekwencja regulatorowa reguluje ekspresję genu endogennej homologiczną do komórki, taką że sekwencja regulatorowa reguluje ekspresję genu endogennej neublastyny, dla wytworzenia komórki do produkcji neublastyny; i

PL 198 599 B1

b) hoduje się komórkę produkującą neublastynę w warunkach hodowli, które wywodują ekspresję polipeptydu neublastyny.

31. Syntetyczny gen kodujący polipeptyd neublastyny, zawierający sekwencję przedstawioną w sekwencjach SEQ ID nr: 29 lub 30.

32. Peptyd neublastyny mający jedną z następujących sekwencji:

GPGSRARAAGARGC (AA 30-43 z SBQ ID nr: 9);

LGHRSDELVRFRFC (AA 57-70 z SBQ ID nr: 9);

CRRARSPHDLSL (AA 74-85 z SEQ ID nr: 9);

LRPPPGSRPVSQPC (AA 94-107 z SEQ ID nr: 9);

STWRTVDRLSATAC (AA 123-136 z SEQ ID nr: 9).

CRLRSQLVPVRALGLGHRSDELVRFRFC (AA 43-70 z SEQ ID nr: 9);

CRRARSPHDLSLASLLGAGALRPPPGSRPVSQPC (AA 74-107 z SEQ ID nr: 9);

CRPTRYEAVSFMDVNSTWRTVDRLSATAC (AA 108-136 z SEQ ID nr: 9).

CRPTRYEAVSFMDVNST (AA 108-124 z SEQ ID nr: 9) oraz

ALRPPPGSRPVSQPC (AA 93-107 z SEQ ID nr: 9)

33. Przeciwciało wytworzone przeciw jednemu z peptydów zdefiniowanych w zastrz. 32.

34. Zastosowanie czynnika neurotroficznego neublastyny posiadającego sekwencję aminokwasową, która jest co najmniej w 70% homologiczna do którejkolwiek sekwencji w sekwencjach o numerach SEQ ID nr: 2, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 12 i 16 do wytwarzania leku do leczenia chorób oczu, które to choroby obejmują utratę fotoreceptorów w siatkówce u pacjentów dotkniętych zwyrodnieniem plamki żółtej, retinopatią barwnikową i jaskrą.

35. Zastosowanie kwasu nukleinowego zawierającego otwartą ramkę odczytu, który koduje ekspresję polipeptydu neublastyny posiadający sekwencję aminokwasową, która jest co najmniej w 70% homologiczna z którąkolwiek sekwencją przedstawioną w sekwencji SEQ ID nr: 2, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 12 i 16 do wytwarzania leku do leczenia chorób oczu, które to choroby obejmują utratę fotoreceptorów w siatkówce u pacjentów dotkniętych zwyrodnieniem plamki żółtej, retinopatią barwnikową i jaskrą .