EA003734B1 - Нейротрофические факторы - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к полипептидам нейротрофического фактора нейбластина, нуклеиновым кислотам, кодирующим полипептиды нейбластина, и антителам, которые специфично связываются с полипептидами нейбластина, а также к способам их создания и способам их применения.

Description

Настоящее изобретение относится к полипептидам нейротрофических факторов, нуклеиновым кислотам, кодирующим полипептиды нейротрофических факторов и антителам, которые специфично связываются с нейротрофическими факторами.

Предпосылки изобретения

Нейротрофические факторы являются белками природного происхождения, которые способствуют выживаемости, обеспечивают фенотипическую дифференцировку, предотвращают дегенерацию и усиливают активность нервных клеток и тканей. Нейротрофические факторы выделены из нервной ткани и из ткани, отличной от нервной, но иннервированной нервной системой и подразделенной на функционально и структурно близкие группы, называемые также семействами, надсемействами или подсемействами. Среди надсемейств нейротрофических факторов имеются надсемейства фактора роста фибробластов, нейротрофина и трансформирующего фактора роста-β (ТСЕ-β). Отдельные виды нейротрофических факторов различаются по физическому строению, по их взаимодействию с соответствующими им сложными рецепторами и по их влиянию на различные типы нервных клеток. По классификации к надсемейству ТСЕ-β (Маккадие, е! а1., Тгепбк ίη Се11 Βίο1оду, 1994, 4, 172-178) относятся лиганды, представляющие собой нейротрофические факторы, полученные из линии глиальных клеток (ΟΌΝΕ; XV Ο 93/06116, включенная сюда в качестве ссылки), к которым относится ΟΌΝΕ, персефин (Р8Р; МйЬгапб! е! а1., №игоп, 1998, 20, 245-253, включенная сюда в качестве ссылки) и нейртурин (ΝΤΝ; XVО 97/08196, включенная сюда в качестве ссылки). Общим свойством лигандов подсемейства ΟΌΝΡ является их способность индуцировать передачу сигнала через тирозинкиназу рецептора ВЕТ. Эти три лиганда подсемейства ΟΌΝΡ различаются по своему относительному сродству к семейству нейротрофических рецепторов, рецепторов СЕВ.

Поскольку нейротрофические факторы влияют на нервную ткань, существует потребность в идентификации и характеристике дополнительных нейротрофических факторов для диагностики и лечения нарушений нервной системы.

Сущность изобретения

Данное изобретение относится к новому нейротрофическому фактору, называемому здесь нейбластином или ΝΒΝ. Нейбластин отнесен к подсемейству ΟΌΝΕ, поскольку он содержит области, гомологичные таковым других лигандов ΟΌΝΕ (см. ниже табл. 3 и 4), и способен взаимодействовать с ВЕТ (см., например, Айакктеп е! а1., Мо1. Се11. Nеи^οкс^еηсе. 1999, 13, 313-325), нейбластин является новым и уникальным нейротрофическим фактором. В отличие от других лигандов ΟΌΝΕ, нейбластин проявляет высокое сродство к комплексу рецепторов СЕВа3-ВЕТ и имеет уникальные области в аминокислотной последовательности.

Термин полипептид нейбластина, в том смысле, в котором здесь используется, означает полипетид, который обладает нейротрофической активностью (например, как описано в примерах 6, 7, 8 и 9), и включает в себя такие полипептиды, которые имеют аминокислотную последовательность, по меньшей мере, на 70% гомологичную полипептидам нейбластина человека, представленным аминокислотными последовательностями АК-₉₅-АК₁₀₅ в 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 2, АК!-АК₁₀₅ в 5ЕО ГО ΝΟ: 2, ЛК_-97-ЛК₁₄₀ в 5ЕО ГО ΝΟ: 4, АК_-41-АК₁₄₀ в 8Ер ГО ΝΟ: 4, (про), АК!-АК₁₄₀ в 5ЕО ГО ΝΟ: 4, ЛК_-80-ЛК₁₄₀ в 5ЕО ГО ΝΟ: 9 (препро дикого типа), АК_-41-АК₁₄₀ в 5ЕО ГО ΝΟ: 9 (про), АК^АК^ в 8Ер ГО ΝΟ: 5 (зрелый, 140 ЛК), АК₁-ЛК₁₁₆ в 5ЕО ГО ΝΟ: 6 (зрелый, 116 ЛК), АК₁-ЛК₁₁₃ в 5ЕО ГО ΝΟ: 7 (зрелый, 113 ЛК), АК^АК^ в 5ЕО ГО ΝΟ: 10 (зрелый, 140 ЛК), АК₁-АК₁₁₆ в 5ЕО ГО ΝΟ: 11 (зрелый, 116 ЛК), АК!-ЛК₁₁₃ в 5ЕО ГО ΝΟ: 12 (зрелый, 113 ЛК), и их варианты и производные. Кроме того, в данном изобретении рассматриваются такие полипептиды, которые имеют аминокислотную последовательность, по меньшей мере, на 70% гомологичную полипептидам нейбластина мышей, представленным АК1ЛК₂₂₄ в 5ЕО ГО ΝΟ: 16.

Предпочтительно, С-концевая последовательность охарактеризованных выше полипептидов нейбластина имеет последовательность аминокислот, которая представлена АК₇₂-АК_£05 в 5ЕО ГО ΝΟ: 2 (т.е., АК₁₀₇-АК₁₄₀ в 5ЕО ГО ΝΟ: 9), более предпочтительно АК₄₁-АК₁₀₅ в 8ЕО ГО ΝΟ: 2 (т.е. АК₇₆-АК₁₄₀ в 5ЕО ГО ΝΟ: 9) или последовательность аминокислот, представленную АК₁₉₁-АК₂₂₄ в 5ЕО ГО ΝΟ: 16.

Также предпочтительно, чтобы в полипептиде нейбластина были сохранены 7 консервативных остатков Сук, которые характерны для семейства ΟΌΝΕ и надсемейства ТСЕ-бета.

Предпочтительно полипептид нейбластина имеет аминокислотную последовательность, гомологичную более чем на 85%, более предпочтительно гомологичную более чем на 95%, упомянутым выше последовательностям (т.е. ЛК_-95-ЛК₁₀₅ в 5ЕО ГО ΝΟ: 2, АК^-АК^ в 5ЕО ГО ΝΟ: 2, АК_-97-АК₁₄₀ в 5ЕО ГО ΝΟ: 4, АК_Г АК₁₄₀ в 5ЕО ГО ΝΟ: 4, АК_-41-АК₁₄₀ в 5ЕО ГО ΝΟ: 4, АК_-80-АК1₄₀ в 8ЕО ГО ΝΟ: 9 (препро дикого типа), АК_-41-АК1₄₀ в 8ЕО ГО ΝΟ: 9 (про), АК!-АК₁₄₀ в 5ЕО ГО ΝΟ: 5 (зрелый, 140 ЛК), АК₁-ЛК₁₁₆ в 5ЕО ГО ΝΟ: 6 (зрелый, 116 ЛК), АК₁-ЛК₁₁₃ в 5ЕО ГО ΝΟ: 7 (зрелый, 113 ЛК), АК!-АК₁₄₀ в 5ЕО ГО ΝΟ: 10 (зрелый, 140 ЛК), АК₁-АК₁₁₆ в 5ЕО ГО ΝΟ: 11 (зрелый, 116 ЛК), АК₁-ЛК₁₁₃ в 5ЕО ГО ΝΟ: 12 (зрелый, 113 ЛК) и АК_гАК₂₂₄ в 5ЕО ГО ΝΟ: 16.

Нуклеиновая кислота нейбластина, в используемом здесь смысле, означает полинуклеотид, который кодирует полипептид нейбластина. Соответственно, изолированная нуклеиновая кислота нейбластина является молекулой полинуклеотида, имеющего открытую рамку считывания нуклеотидных кодонов, несущую информацию или кодирующую полипептид нейбластина при действии соответствующих необходимых для трансляции компонентов. Нуклеиновыми кислотами нейбластина изобретения могут быть РНК или ДНК, например геномная ДНК или ДНК, которая комплементарна мРНК нейбластина и/или транскрибирована на этой мРНК (кДНК). Таким образом, нуклеиновая кислота нейбластина изобретения, кроме того, включает в себя полинуклеотидные молекулы, которые при очень жестких условиях гибридизации специфично гибридизуются с полинуклеотидом, который кодирует полипептид нейбластина. Данное изобретение также относится к праймерам нуклеиновых кислот, которые пригодны для идентификации, выделения и амплификации полинуклеотидов, которые кодируют полипептиды нейбластина или их фрагменты. В некоторых вариантах изобретения некоторые из этих праймеров являются зондами, специфичными для нейбластина, пригодными для гибридизации с нуклеиновой кислотой нейбластина, но не с нуклеиновыми кислотами, кодирующими другие представители семейства ΟΌΝΤ. Под терминами специфичный, специфичность или специфично подразумевается способность гибридизоваться с нуклеиновой кислотой нейбластина и неспособность гибридизоваться с нуклеиновыми кислотами, не являющимися нуклеиновыми кислотами нейбластина, включая неспособность гибридизоваться с нуклеиновыми кислотами, которые однозначно кодируют лиганды ΟΌΝΡ (например ΟΌΝΡ, персефин и нейртурин).

В другом варианте нуклеиновой кислотой нейбластина изобретения является такая кислота, которая идентифицируется как нуклеиновая кислота, комплементарная полинуклеотиду, который кодирует полипептид нейбластина либо благодаря тому, что имеет комплементарную последовательность нуклеиновой кислоты, либо путем демонстрации того, что она при очень жестких условиях гибридизации специфично гибридизуется с полинуклеотидом, который кодирует нейбластин. К конкретным нуклеиновым кислотам изобретения без ограничения относятся показанные здесь последовательности нуклеиновых кислот, обозначенные 8ЕО ΙΌ N0: 1, 8ЕС ΙΌ N0: 3, 8ЕС ΙΌ N0: 8, 8ЕС ΙΌ N0: 13, 8ЕС ΙΌ N0: 14, 8ЕС ΙΌ N0: 15, 8ЕС ΙΌ N0: 29 и 8Е0 ΙΌ N0: 30, а также праймеры 8Е0 ΙΌ N0: 17-28, 31 и 32. Нуклеиновая кислота изобретения, кроме того, включает в себя уникальную область или фрагмент нуклеиновой кислоты нейбластина, включая без ограничения фраг менты нуклеиновой кислоты, показанные на фиг. 8.

Нуклеиновые кислоты нейбластина изобретения могут быть использованы для экспрессии полипептида нейбластина, например путем осуществления экспрессии полипептида нейбластина ίη νίίτο, или путем введения нуклеиновой кислоты нейбластина животному для экспрессии ίη νίνο. Нуклеиновые кислоты нейбластина могут быть включены в состав векторной нуклеиновой кислоты, например в экспрессирующий вектор или клонирующий вектор. Нуклеиновая кислота нейбластина может, но это не обязательно необходимо, поддерживаться, репродуцироваться, передаваться или экспрессироваться как часть векторной нуклеиновой кислоты. Рекомбинантный экспрессирующий вектор, содержащий полинуклеотидную последовательность нейбластина, может быть введен и/или сохраняться внутри клетки. Клетками, выполняющими функции клеток хозяев для вектора нейбластина, могут быть прокариотические клетки. В альтернативном случае нуклеиновая кислота нейбластина может быть введена в эукариотическую клетку, например в эукариотическую клетку, которая содержит подходящий аппарат посттрансляционного процессинга полипептида в зрелый белок, и/или подходящий аппарат секреции полипептида во внеклеточное окружение клетки.

В изобретении также дается характеристика нейбластинового нейротрофического фактора, нейбластина. Нейбластин может быть в форме полипептида или может быть мультимером из двух или большего количества полипептидов нейбластина, например в форме нейбластинового димера. Полипептиды нейбластина ассоциированы в мультимеры с помощью межмолекулярных структурных связей, известных специалистам в данной области, включая без ограничения взаимодействия цистеин-цистеин, дисульфидные связи и нековалентные взаимодействия. К конкретным полипептидам нейбластина без ограничения относятся аминокислотные последовательности, заявленные здесь и обозначенные 8ЕС ΙΌ N0: 2, 8Е0 ΙΌ N0: 4, 8 ЕС) ΙΌ N0: 5, 8 ЕС) ΙΌ N0: 6, 8 ЕС) ΙΌ N0: 7, 8ЕС) ΙΌ N0: 9, 8ЕС) ΙΌ N0: 10, 8ЕС) ΙΌ N0: 11, 8ЕС) ΙΌ N0: 12 и 8ЕС) ΙΌ N0: 16.

Полипептид нейбластина изобретения пригоден для лечения дефекта нейрона, включая, без ограничения, пораженные нейроны и травмированные нейроны. Периферические нервы, которые испытывают травму, включают в себя, но не ограничиваются этим, черепномозговые нервы, происходящие из продолговатого мозга, или спинно-мозговые нервы. Полипептиды нейбластина пригодны для лечения нейродегенеративного заболевания, например повреждения нейронов в результате ишемии головного мозга, невропатии, например периферической невропатии, болезни Альцгеймера, болезни Гентингтона, болезни Паркинсона, бокового амиотрофического склероза (БАС). Кроме того, предполагается применение полипептидов нейбластина для лечения ослабленной памяти, например ухудшения памяти, связанного с деменцией.

Краткое описание рисунков

Фиг. 1 является фотографическим изображением двух нозерн-блотов, анализируемых с помощью меченых ³²Р зондов кДНК нейбластина, где сравниваются относительные уровни экспрессии гена нейбластина в различных типах тканей взрослого человека (панель А) и в различных районах мозга взрослого человека (панель В).

Фиг. 2 является фотографическим изображением нозерн-блота, анализируемого с помощью меченого ³²Р зонда кДНК нейбластина, где сравнивается количество кДНК нейбластина, экспрессированной в нетрансфицированной линии клеток Н1В5, с количеством кДНК нейбластина, экспрессированной в линии клеток, трансфицированных кДНК нейбластина, и с линией клеток, трансфицированных ΟΌΝΓкДНК.

Фиг. 3 является фотографическим изображением двух вестерн-блотов, на которых сравниваются уровни экспрессии белка нейбластина в нетрансфицированных клетках Н1В5 (дорожка 1) и в линии клеток Н1В5, стабильно трансфицированных кДНК нейбластина (дорожка 2), где белок анализировали либо с помощью специфичных для нейбластина антител Ат-2 (левый блот; панель А), либо с помощью специфичных для нейбластина антител Ат-1 (правый блот; панель В).

Фиг. 4 является графической иллюстрацией влияния нейбластина на выживаемость культивируемых в среде без сыворотки допаминэргических нейронов вентральной части среднего мозгового пузыря эмбрионов крыс и на ХАТ активность в холинэргических мотонейронах черепно-мозгового нерва. В частности, фиг.4А является иллюстрацией кривой зависимости ХАТ активности от дозы рекомбинантного ΟΌΝΓ (расп./мин/ч). Фиг. 4В является иллюстрацией ХАТ активности (расп./мин/час) при использовании разведенной кондиционированной среды либо от продуцирующих нейбластин, либо от продуцирующих ΟΌΝΓ клеток. Фиг. 4С является иллюстрацией количества иммунореактивных при анализе на тирозингидроксилазу клеток на лунку.

Фиг. 5 является иллюстрацией влияния нейбластина, секретируемого из клеток ΗίΒ5ρυΜ1ζΝΒΝ22 на функционирование и выживаемость культивируемых срезов допаминэргических нейронов вентральной поверхности среднего мозгового пузыря эмбрионов свиней, культивируемых совместно либо с клетками ΗίΒ5ρυΜ1ζΝΒΝ22 (нейбластин), либо с клетками Н1В5 (контроль). На фиг. 5А и фиг. 5В пока зан допамин, высвобождаемый в среду в И1У12 [допамин (пмоль/мл)-день 12] и И1У21 [допамин (пмоль/мл) -день 21], соответственно. Фиг. 5С является иллюстрацией количества иммунореактивных при анализе на тирозингидроксилазу клеток в культуре [ТГ-ир клеток в культуре] в И1У21.

Фиг. 6 является иллюстрацией влияния нейбластина, продуцируемого лентивирусами, на допаминовые нейроны черного вещества ίη νίνο.

Фиг. 7 представляет собой схематичную диаграмму геномной структуры гена нейбластина, включая нуклеотидные праймеры, которые могут применяться для идентификации полноразмерного гена нейбластина, и их пространственную ориентацию по отношению к геномной последовательности, кодирующей нейбластин (т.е. по отношению к гену).

Фиг. 8 является иллюстрацией специфичных для нейбластина праймеров, применяемых для идентификации клона кДНК, кодирующего полипептид нейбластина человека, которые гибридизуются с нуклеиновыми кислотами, которые кодируют полипептиды нейбластина, но не гибридизуются с нуклеиновыми кислотами, кодирующими другие известные представители семейства ΟΌΝΓ (т.е., ΟΌΝΓ, персефин и нейртурин).

На фиг. 9 показана нейротрофическая активность полипептидов, заявленных в данном изобретении, в культурах диссоциированных клеток ганглиев задних корешков крыс на различных стадиях развития по сравнению с активностями, достигнутыми в присутствии известных нейротрофических факторов [0 контрольный эксперимент (в отсутствии факторов)]; 1 в присутствии ΟΌΝΓ; 2 в присутствии нейртурина; 3 в присутствии нейбластина изобретения; Э12 - 12-й эмбриональный день; Э16 - 16-й эмбриональный день; П0 - день рождения; П7 - 7-й день после рождения; и П15 -15-й день после рождения].

На фиг.10 показана продукция нейбластина линиями клеток СНО.

На фиг. 11 показано сравнение связывания нейбластина и ΟΌΝΓ с рецепторами СРКа-1 и СГКа-3.

Фиг.12 представляет собой фотографическое изображение вестерн-блота, на котором показано связывание антипептидного антитела К.30 и антипептидного антитела К31 с нейбластином.

Фиг.13 представляет собой изображение геля, где показана экстракция нейбластина с помощью аффинного связывания на КЕТЬ3-1д.

Фиг. 14 представляет собой карту плазмиды рЕТ19Ь-нейбластин наряду с последовательностью синтетического гена нейбластина.

Фиг. 15 представляет собой карту плазмиды рМ!В 164-Н18-нейбластин, наряду с последо003734 вательностью синтетического гена Ηίκнейбластина.

Подробное описание изобретения

Заявители идентифицировали нуклеиновую кислоту, которая кодирует новый нейротрофический фактор, который здесь упоминается как нейбластин или ΝΒΝ. Нейбластин является членом подкласса нейротрофического фактора, полученного из линии глиальных клеток (ΟΌΝΡ) надсемейства нейротрофических факторов трансформирующего фактора роста-β (ΤΟΡ-β).

кДНК, кодирующая нейбластин исходно была идентифицирована следующим образом. Сначала, используя алгоритм ΤΒΕΑ8ΤΝ 1.4.11 (Αΐκοΐιι.11 е! а1., ΝποΙ.Αοίάκ Кек., 1997, 25, 33893402) и персефин человека в качестве запроса (ОепВапк Инв.№ ΑΡ040962), фрагмент длиной 290 п.н. в высокопроизводительной геномной последовательности (ΗΟΤ8) двух искусственных бактериальных хромосом, содержащих ДНК человека (ИБХ), был отождествлен с элементами ОепВапк АС005038 и АС005051. АС005038 состоит примерно из 190000 п.н. 5 контигов неупорядоченных последовательностей и АС005051 состоит примерно из 132000 п.н. 12 контигов неупорядоченных последовательностей. Доказано, что фрагмент длиной 290 п.н., идентифицированный в двух ИБХ клонах, имел районы, которые были гомологичны, но не идентичны кодирующему району кДНК нейротрофического фактора персефина человека.

На этой последовательности 290 п. н. были синтезированы два праймера ПЦР, специфичные для нейбластина (праймер верхней цепи |8ЕС ΙΌ ΝΟ: 17] и праймер нижней цепи |8ЕЦ ГО ΝΟ: 18]). Был проведен скрининг библиотеки кДНК мозга эмбриона человека. Начальный скрининг включал в себя 96-луночный скрининг, основанный на ПЦР с двумя ПЦРпраймерами |8ЕС ГО ΝΟ: 17 и 18], библиотеки кДНК в основном планшете Мак!ег Р1а!е с 500000 клонами кДНК, содержащем примерно 5000 клонов/лунку. Вторая основанная на ПЦР проверка проводилась на библиотеке кДНК мозга эмбриона человека в суб-планшете 8иЬР1а!е, содержащем глицериновую культуру Ε.οοίί примерно с 5000 клонов/лунку.

Фрагмент длиной 102 п.н. ^ЕЦ ГО ΝΟ: 13] был идентифицирован в результате основанного на ПЦР скрининга обеих библиотек в основном планшете (Мак!ег Р1а!е) и суб-планшете (8иЬ Р1а!е). Позитивный клон кДНК (содержащий фрагмент длиной 102 п.н.) отбирали и высевали на два планшета, содержащих ЬВ/антибиотик, и выращивали в течение ночи. Из этих планшетов отбирали в общей сложности 96 бактериальных колоний и отдельно высевали в лунки нового 96-луночного планшета для ПЦР, содержащие оба праймера ПЦР ^ЕЦ ГО ΝΟ: 17 и 18] и все необходимые реагенты для ПЦР амплификации.

Затем выполняли ПЦР амплификацию и 96 отдельных ПЦР реакций анализировали с помощью электрофореза в 2% агарозном геле. Затем была идентифицирована позитивная колония с клоном, содержащим фрагмент из 102 п. н. Из позитивной колонии, содержащей фрагмент длиной 102 п.н., была получена и секвенирована плазмидная ДНК. Последующий анализ путем секвенирования выявил наличие полноразмерной кДНК из 861 п.н. ^ЕЦ ГО ΝΟ: 8]. Открытая рамка считывания (ОРС) длиной 663 п.н. или кодирующий район (СГО8). тождественный 8ЕЦ ГО ΝΟ: 8, кодирует пре-про-полипептид (названный пре-про-нейбластин) и показанный в 8ЕЦ ГО ΝΟ: 9. На основании 8ЕЦ ГО ΝΟ: 9 были идентифицированы три варианта полипептидов нейбластина. Эти варианты включают в себя:

(ί) полипептид из 140 АК, названный здесь ΝΒΝ140, который имеет аминокислотную последовательность, обозначенную 8ЕЦ ГО ΝΟ: 10;

(ίί) полипептид из 116 АК, названный здесь ΝΒΝ116, который имеет аминокислотную последовательность, обозначенную 8ЕЦ ГО ΝΟ: 11; и (ίίί) полипептид из 113 АК, названный здесь ΝΒΝ113, который имеет аминокислотную последовательность, обозначенную 8ЕЦ ГО ΝΟ:

12.

Полная последовательность кДНК, содержащая 782 п.н. 5' нетранслируемой ДНК, 663 п.н. кодирующей ДНК и 447 п.н. 3' нетранслируемой ДНК (в общем насчитывающая 1992 п.н.), была представлена в ΟеηΒаηк под инвентарным номером ΑΡ 120274.

Геномная последовательность, кодирующая нейбластин, была идентифицирована следующим образом.

С целью клонирования геномной последовательности, кодирующей нейбластин, был получен дополнительный набор праймеров. В частности, пара праймеров № 1 включала в себя [смысловую = 8ЕЦ ГО ΝΟ: 23 и антисмысловую = 8ЕЦ ГО ΝΟ: 24] и пара праймеров № 2 включала в себя [смысловую = 8ЕЦ ГО ΝΟ: 25 и антисмысловую = 8ЕЦ ГО ΝΟ: 26].

С помощью пары праймеров № 2 в результате ПЦР из препарата геномной ДНК человека был амплифицирован фрагмент ДНК длиной 887 п.н., клонирован в вектор рСК11 Ппуйгодеп) и в результате трансформации введен в Ε.οοίί. Полученная в результате плазмида была секвенирована, и предполагаемая последовательность кДНК из 861 п.н. (кодирующей белок, названный здесь нейбластином) была рассчитана (как указано в 8ЕЦ ГО ΝΟ: 3). Сходным образом, с помощью пары праймеров № 1 в результате ПЦР геномной ДНК человека был получен фрагмент ДНК длиной 870 п.н. В этом фрагменте, по сравнению с последовательностью длиной 887 п.н., был обнаружен дополнительный район из 42 п.н. на 3'-конце открытой рамки считывания (ОРС). Геномная структура гена нейбластина была предсказана путем его сравнения с последовательностями нуклеиновых кислот других нейротрофических факторов, путем картирования экзонинтронных границ. Этот анализ показал, что ген нейбластина имеет, по меньшей мере, два экзона, разделенных интроном длиной 70 п.н.

Эта последовательность также была использована для скрининга СеиБапк на наличие Е8Т последовательностей нейбластина. Три последовательности были идентифицированы с помощью элементов СепБапк АА844072, АА931637 и АА533512, что свидетельствует о том, что нуклеиновые кислоты нейбластина транскрибируются в мРНК.

Сравнение полной последовательности полученной кДНК (АГ 120274) и геномной последовательности, присутствующей в элементах СепБапк ГС005038 и ГС005051, показало, что ген нейбластина состоит, по меньшей мере, из пяти экзонов (включая три кодирующих), разделенных четырьмя интронами (см., например, фиг. 8). Вместе экзоны имеют предсказанную последовательность для аминокислот полипептида нейбластина полной длины. Следует также отметить, что было обнаружено, что фрагмент длиной 887 п.н. содержит полный кодирующий район про-нейбластина. Рассчитанная кДНК |8ЕЦ ΙΌ N0: 3] содержит открытую рамку считывания (ОРС), кодирующую про-нейбластин (181 аминокислотный остаток), которая проявляет гомологию с тремя известными белками человека - персефином, нейртурином и ΟΌΝΕ.

Нуклеиновые кислоты нейбластина по настоящему изобретению

Другим аспектом изобретения является предоставление полинуклеотидов, способных экспрессировать полипептиды изобретения. Полинуклеотиды изобретения включают в себя последовательности ДНК, кДНК и РНК, а также антисмысловые последовательности, и включают полинуклеотиды природного происхождения, синтетические и специально приготовленные полинуклеотиды. К полинуклеотидам изобретения также относятся последовательности, которые являются генетически вырожденными, но которые кодируют экспрессию полипептида нейбластина.

Как здесь определено, термин полинуклеотид относится к полимерной форме нуклеотидов длиной, по меньшей мере, 10 нуклеотидов, предпочтительно, по меньшей мере, длиной 15 нуклеотидов. Под изолированным полинуклеотидом подразумевается полинуклеотид, который не соприкасается непосредственно с двумя кодирующими последовательностями, с которыми он непосредственно соседствует (одна на 5' конце и одна на 3' конце) в геноме природного происхождения того организма, из которого он получен. Поэтому термин включает в себя рекомбинантную ДНК, которая встроена в экспрессирующий вектор, в автономно реплицирующуюся плазмиду или вирус, или в геномную ДНК прокариота или эукариота, или который существует в виде отдельной молекулы, например кДНК, независимо от других последовательностей.

Полинуклеотиды изобретения также включают в себя аллельные варианты и мутантные полинуклеотиды, имеющие нуклеотидную последовательность, которая отличается от нуклеотидной последовательности, представленной здесь, по одной или большему количеству нуклеотидных положений.

В предпочтительном варианте полинуклеотид изобретения имеет последовательность нуклеиновой кислоты (ДНК), способную гибридизоваться с полинуклеотидной последовательностью, представленной в виде 8ЕЦ ΙΌ N0: 1, полинуклеотидной последовательностью, представленной в виде 8ЕЦ ΙΌ N0: 3, полинуклеотидной последовательностью, представленной в виде 8ЕЦ ΙΌ N0: 8, или полинуклеотидной последовательностью, представленной в виде 8ЕЦ ΙΌ N0: 15, с комплементарными им нитями или их суб-последовательностями при, по меньшей мере, средних, средних/жестких или очень жестких условиях, как описано ниже более детально.

В другом предпочтительном варианте изолированный полинуклеотид изобретения имеет последовательность нуклеиновой кислоты (ДНК), которая, по меньшей мере, на 70%, предпочтительно, по меньшей мере, на 80%, более предпочтительно, по меньшей мере, на 90%, наиболее предпочтительно, по меньшей мере, на 95%, гомологична полинуклеотидной последовательности, представленной в виде 8ЕЦ ΙΌ N0: 1, полинуклеотидной последовательности, представленной в виде 8ЕЦ ΙΌ N0: 3, полинуклеотидной последовательности, представленной в виде 8ЕЦ ΙΌ N0: 8, или полинуклеотидной последовательности, представленной в виде 8ЕЦ ΙΌ N0: 15.

В наиболее предпочтительном варианте полинуклеотид имеет последовательность ДНК, представленную в виде 8ЕЦ ΙΌ N0: 1, последовательность ДНК, представленную в виде 8ЕЦ ΙΌ N0: 3, последовательность ДНК, представленную в виде 8ЕЦ ΙΌ N0: 8, или полинуклеотидную последовательность, представленную в виде 8ЕО ΙΌ N0: 15.

Данное изобретение также предоставляет новые праймеры и последовательности ДНК для идентификации, выделения и амплификации полинуклеотидов нейбластина, которые кодируют экспрессию полипептидов нейбластина или их фрагментов. Такие праймеры включают в себя полинуклеотиды, приведенные в 8ЕЦ ΙΌ N0: 17-28 и 31-32. Кроме того, данное изобретение предоставляет последовательности ДНК нейбластина, образованные с этих праймеров, включая последовательности, приведенные в 8Е0 ΙΌ N0: 13 и 14. Кроме того, данное изобретение предоставляет последовательности ДНК из 3' или 5' нетранслируемых областей (НТО) геномной ДНК, которые фланкируют экзоны нейбластина; такие последовательности пригодны для идентификации, выделения и амплификации полинуклеотидов нейбластина, которые кодируют экспрессию полипептидов нейбластина или их фрагментов.

3'НТО последовательности изобретения включают в себя последовательности, представленные следующими нуклеотидами:

нуклеотиды 721-865 в 8Е0 ΙΌ N0: 1, нуклеотиды 718-861 в 8Е0 ΙΌ N0: 3, нуклеотиды 718-861 в 8Е0 ΙΌ N0: 8, нуклеотиды 1647-2136 в 8Е0 ΙΌ N0: 15 и примыкающие последовательности от 10 до 25 нуклеотидов, полученные из (т.е. являющиеся частью) предшествующих последовательностей (которые пригодны, например, в качестве праймеров).

5'НТО последовательности изобретения включают в себя последовательности, представленные следующими нуклеотидами:

нуклеотиды 1-10 в 8Е0 ΙΌ N0: 1, нуклеотиды 1-57 в 8Е0 ΙΌ N0: 8, нуклеотиды 1-974 в 8Е0 ΙΌ N0: 15, и примыкающие последовательности от 10 до 25 нуклеотидов, полученные из (т.е. являющиеся частью) предшествующих последовательностей (которые пригодны, например, в качестве праймеров).

Полинуклеотиды изобретения предпочтительно могут быть получены с помощью процедур клонирования, например как описано в СитгеШ РтоФсок ίη Мо1еси1аг ВФ1оду [Фйп XVПсу & 8опк, Фс.]. В предпочтительном варианте полинуклеотид клонируют из или получают на основе геномной ДНК человека или библиотеки кДНК мозга человека.

Гомология последовательностей ДНК

Гомология последовательностей ДНК, указанных выше, может быть определена по степени идентичности между двумя последовательностями, показывающей происхождение первой последовательности из второй. Гомология может быть надлежащим образом определена с помощью компьютерных программ, известных в данной области, таких как ОАР, предоставляемой в пакете программ ОСО [№ей1ешап, 8 .В. апй ΧνιιηκΟι С.Э.. 1оитпа1 ок Мо1еси1аг ВФ1оду 1970, 48, 443-453]. Используя ОАР со следующими установочными параметрами для сравнения последовательностей ДНК: штрафной балл при создании ОАР 5,0 и штрафной балл при расширении ОАР 0,3, кодирующие районы вышеуказанных аналогичных последовательностей ДНК проявляют идентичность предпочтительно, по меньшей мере, на уровне 70%, более предпочтительно, по меньшей мере, 80%, более предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, с СИ8 (кодирующей) частью последовательности ДНК, показанной в 8Е0 ΙΌ N0: 1, или СИ8 (кодирующей) частью последовательности ДНК, показанной в 8Е0 ΙΌ N0: 3, или СИ 8 (кодирующей) частью последовательности ДНК, показанной в 8Е0 ΙΌ N0: 8, СЭ8 (кодирующей) частью последовательности ДНК, показанной в 8ЕО ΙΌ N0: 15.

Термин идентичность последовательностей относится к степени, с которой две полинуклеотидные последовательности идентичны по основаниям нуклеотид за нуклеотидом на протяжении конкретной области сравнения. Термин процент идентичности последовательностей означает процент, рассчитанный путем сравнения двух оптимально выровненных последовательностей по всей этой области сравнения, определения числа позиций, в которых идентичные основания нуклеиновой кислоты (например А, Т, С, О, и или Ι) встречаются в обеих последовательностях, чтобы получить количество совпадающих позиций, путем деления количества совпадающих позиций на общее количество позиций в области сравнения (т.е. размер окна) и умножения результата на 100, чтобы получить процент идентичности последовательностей. Термин значительная идентичность в том смысле, в котором здесь используется, означает характеристику полинуклеотидной последовательности, при которой полинуклеотид включает в себя последовательность, которая идентична, по меньшей мере, на 80% по последовательности, предпочтительно идентична, по меньшей мере, на 85%, и часто идентична по последовательности на 90-95%, чаще, по меньшей мере, на 99% идентична по последовательности эталонной последовательности на всем протяжении области сравнения.

Протокол гибридизации

Полинуклеотидами изобретения являются такие полинуклеотиды, которые имеют нуклеотидную последовательность, способную к гибридизации с полинуклеотидной последовательностью, представленной в 8Е0 ΙΌ N0: 1, с полинуклеотидной последовательностью, представленной в 8Е0 ΙΌ N0: 3, или с полинуклеотидной последовательностью, представленной в 8Е0 ΙΌ N0: 8, или с полинуклеотидной последовательностью, представленной в 8Е0 ΙΌ N0: 15, или с комплементарными им цепями, или с их суб-последовательностями, по меньшей мере, при средних, средних/жестких или очень жестких условиях, как более детально описано ниже.

Приемлемый экспериментальный режим определения гибридизации между нуклеотидным зондом и гомологичной ДНК или РНК последовательностью включает в себя предварительное вымачивание фильтра, содержащего фрагменты ДНК или РНК, для гибридизации в 5 х 88С [хлорид натрия/цитрат натрия; сравни

8атЬгоок е! а1.; Мо1еси1аг С1ошпд: А ЬаЬота!огу Мапиа1, Со 16 8ртшд НагЬог ЬаЬ., Со 16 8ртшд НагЬог, ΝΥ 1989] в течение 10 мин и предгибридизацию фильтра в растворе 5 х 88С, 5 х растворе Денхардта [сравни 8атЬтоок е! а1.; уже цитированная работа], 0,5% 8Ό8 и 100 мкг/мл денатурированной озвученной ДНК спермы лосося [сравни 8атЬтоок е! а1.; уже цитированная работа] с последующей гибридизацией в таком же растворе, содержащем полученный методом рассеянной затравки [ЕешЬетд А. Р. & УодеШеш В.; АпаЕВюсбет., 1983, 132, 6-13], меченый ³²Р-дЦТФ (удельная активность > 1 х 10⁹ имп/мин/мкг) зонд, в концентрации 10 нг/мл, в течение 12 ч при температуре примерно 45°С. Затем фильтр дважды промывали в течение 30 мин в 0,1 х 88С, 0,5% 8Ό8 при температуре, по меньшей мере, 60°С (условия средней жесткости), предпочтительно, по меньшей мере, при 65°С (условия средней/высокой жесткости), более предпочтительно, по меньшей мере, при 70°С (условия высокой жесткости) и еще более предпочтительно, по меньшей мере, при 75°С (условия очень высокой жесткости). Молекулы, с которыми гибридизуется олигонуклеотидный зонд при этих условиях, могут быть выявлены с помощью рентгеновской пленки.

Клонированные полинуклеотиды

Изолированным полинуклеотидом изобретения, в частности, может быть клонированный полинуклеотид. Как здесь определено, термин клонированный полинуклеотид относится к полинуклеотиду или последовательности ДНК, клонированной в соответствии со стандартными процедурами клонирования, используемыми в настоящее время в генетической инженерии для перемещения сегмента ДНК, который, в частности может быть представлен кДНК, т.е. ДНК, полученной ферментативным путем на основе РНК, из его природного положения в другой сайт, где он будет репродуцироваться.

Клонирование может осуществляться различными приемлемыми путями и может включать в себя такие методики, как технология, основанная на обратной транскриптазе, ПЦР технология и им подобные, а также вырезание и выделение требуемого сегмента ДНК.

Клонированный полинуклеотид изобретения может альтернативно называться ДНК конструкцией или изолированной последовательностью ДНК и может, в частности, представлять собой комплементарную ДНК (кДНК).

Биологические источники

Изолированный полинуклеотид изобретения может быть получен из любого приемлемого источника.

В предпочтительном варианте этот полинуклеотид изобретения клонируется или создается на основе библиотеки кДНК, например библиотеки кДНК мозга плода или взрослого организма, в частности переднего мозга, заднего мозга, коры головного мозга, полосатого тела, миндалевидного тела, мозжечка, хвостатого ядра, мозолистого тела, гиппокампа, ядер таламуса, ядер гипоталамуса, обонятельного ядра, скорлупы, черного вещества, ганглия заднего корешка, ганглия тройничного, нерва, верхней брыжеечной артерии или таламуса; спинного мозга; сердца; плаценты; легкого; печени; скелетной мышцы; почки; поджелудочной железы; кишечника; глаза; сетчатки; пульпы зуба; волосяного фолликула; предстательной железы; гипофиза; или трахеи.

Коммерческие библиотеки кДНК различных тканей, как человека так и других организмов, можно приобрести, например, в 81га1адепе и С1оп1ес11. Изолированный полинуклеотид изобретения может быть получен стандартными способами, например способами, описанными в рабочих примерах.

Полипептиды нейбластина по настоящему изобретению

Как отмечено выше, полипептид нейбластина в используемом здесь смысле представляет собой полипептид, который обладает нейротрофической активностью (например, как описано в примерах 6, 7, 8 и 9) и этот термин включает в себя такие полипептиды, которые имеют аминокислотную последовательность, которая имеет, по меньшей мере, 70% гомологии с полипептидами нейбластина, представленными АК_-95-АК1₀₅ в 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 2, АК₁АК₁₀₅ в 8ЕС ГО ΝΟ: 2, АК_-97-АК₁₄₀ в 8ЕС ГО ΝΟ: 4, АК_-41-АК₁₄₀ в 8ЕС ГО ΝΟ: 4, АЩ-АК^ в 8 ЕС) ГО ΝΟ: 4, АК_-80-АК₁₄₀ в 8 ЕС) ГО ΝΟ: 9 (препро дикого типа), АК_₄1-АК1₄₀ в 8ЕЦ ГО νΟ: 9 (про), АК_£-АК₁₄₀ в 8ЕЦ ГО ΝΟ: 5 (зрелый, 140 АК), АК₁-АК₁₁₆ в 8 ЕС) ГО ΝΟ: 6 (зрелый, 116 АК), АК₁-АКц₃ в 8ЕЦ ГО ΝΟ: 7 (зрелый, 113 АК), АК!-АК₁₄₀ в 8 ЕС) ГО ΝΟ: 10 (зрелый, 140 АК), АК_ГАК₁₁₆ в 8 ЕС) ГО ΝΟ: 11 (зрелый, 116 АК), АК_ГАК₁₁₃ в 8 ЕС) ГО ΝΟ: 12 (зрелый, 113 АК), АА!-АА₂₂₄ в 8 ЕС) ГО ΝΟ: 16 (препро мыши) и варианты, и производные каждого упомянутого выше полипептида.

Предпочтительно С-концевая последовательность охарактеризованных выше полипептидов нейбластина имеет аминокислотную последовательность, представленную АК72-АК105 в 8ЕС) ГО ΝΟ: 2 (т.е. АК₁₀₇-АК₁₄₀ в 8ЕС) ГО ΝΟ: 9), более предпочтительно АК₄₁-АК₁₀₅ в 8ЕЦ ГО ΝΟ: 2 (т.е. АК₇₆-АК₁₄₀ в 8ЕС) ГО ΝΟ: 9).

Также предпочтительно, чтобы в полипептиде нейбластина были сохранены 7 консервативных остатков Су8, которые характерны для семейства ΟΌΝΕ и надсемейства ТСЕ-бета.

Предпочтительно полипептид нейбластина имеет аминокислотную последовательность гомологичную более чем на 85%, более предпочтительно гомологичную более чем на 95%, упомянутым выше последовательностям (т.е. АК_-95-АК₁₀₅ в 8ЕС) ГО ΝΟ: 2, АЩ-АК^ в 8 ЕС) ГО ΝΟ: 2, АК_-97-АК₁₄₀ в 8 ЕС) ГО ΝΟ: 4, АК_-41АК₁₄₀ в 8ЕС) ГО ΝΟ: 4, АКрАК^ в 8ЕС) ГО ΝΟ:

4, ЛК.₈о-ЛК₁₄о в 8ЕЦ ΙΌ N0: 9 (препро дикого типа), АК_-41-АК₁₄₀ в 5ЕО ΙΌ N0: 9 (про), АК₁АК₁₄₀ в 8Е0 ΙΌ N0: 5 (зрелый, 140 АК), АК₁АК₁₁₆ в 8Е0 ΙΌ N0: 6 (зрелый, 116 АК), АК₁АК₁₁₃ в 8Е0 ΙΌ N0: 7 (зрелый, 113 АК), АК₁АК₁₄₀ в 8Е0 ΙΌ N0: 10 (зрелый, 140 АК), АК₁АК₁₁₆ в 5ЕО ΙΌ N0: 11 (зрелый, 116 АК), АК₁АК₁₁₃ в 5ЕО ΙΌ N0: 12 (зрелый, 113 АК), АК₁АК₂₂₄ в 8ЕЦ ΙΌ N0: 16 (препро мыши)), и предпочтительно любой из вышеупомянутых полипептидов с С-концевой последовательностью охарактеризованных выше полипептидов нейбластина имеет аминокислотную последовательность, представленную АК₇₂-АК₁₀₅ в 8ЕЦ ΙΌ N0: 2 (т.е. АК₁₀₇-АК₁₄₀ в 5ЕО ΙΌ N0: 9), более предпочтительно АК₄₁-АК₁₀₅ в 8ЕЦ ΙΌ N0: 2 (т.е. АК₇₆-АК₁₄₀ в 5ЕО ΙΌ N0: 9) или АК₁₉₁АК₂₂₄ в 5ЕО ΙΌ N0: 16.

Кроме того, в изобретении рассматриваются такие полипептиды, которые имеют аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 70% гомологична полипептидам нейбластина мышей, представленным АК₁-АК₂₂₄ в 5ЕО ΙΌ N0: 16.

Среди предпочтительных полипептидов изобретения в одном варианте представлены препропоследовательность (как представлено в 8ЕЦ ΙΌ N0: 2, 4, 9 и 16, соответственно), пропоследова-тельность (как представлено АК_-75АК₁₀₅ в 8ЕЦ ΙΌ N0: 2 или АК_-41-АК₁₄₀ в 8ЕЦ ΙΌ N0: 4 и 9, соответственно) и последовательность зрелого нейбластина (как представлено в 8ЕЦ ΙΌ N0: 5, 6, 7, 10, 11 или 12, предпочтительно 8Е0 ΙΌ N0: 10, 11, 12).

К полипептидам изобретения относятся варианты полипептидов. В контексте данного изобретения термин вариант полипептида означает полипептид (или белок), имеющий аминокислотную последовательность, которая отличается от последовательности, представленной в виде 8Е0 ΙΌ N0: 2, 5ЕО ΙΌ N0: 4, 5ЕО ΙΌ N0: 5, 8Е0 ΙΌ N0: 6, 5ЕО ΙΌ N0: 7, 5 ЕС) ΙΌ N0: 9, 5ЕС) ΙΌ N0: 10, 5ЕС) ΙΌ N0: 11, 5ЕС) ΙΌ N0: 12 или 8ЕЦ ΙΌ N0: 16 в одном или большем количестве аминокислотных положений. К таким вариантам полипептидов относятся модифицированные полипептиды, описанные выше, а также полипептиды с консервативными заменами, варианты сплайсинга, изоформы, гомологи других видов и полиморфные варианты.

Как определено здесь, термин консервативные замены означает замену аминокислотного остатка другим, биологически сходным остатком. Например, следует ожидать, что консервативные аминокислотные замены будут оказывать небольшое влияние или не будут оказывать влияния на биологическую активность, особенно если они представляют менее 10% общего количества остатков в полипептиде или белке. Предпочтительно, консервативные аминокислотные замены представляют собой изменения менее 5% полипептида или белка, наибо лее предпочтительно менее 2% полипептида или белка (например, когда расчет проводили в отношении ИВ№13, наиболее предпочтительно консервативные замены были представлены менее чем 3 аминокислотными заменами в зрелой аминокислотной последовательности дикого типа). В особенно предпочтительном варианте имеется единственная аминокислотная замена в зрелой последовательности, где обе аминокислоты, замещаемая и замещающая, являются нециклическими.

К другим конкретным примерам консервативных замен относится замена одним гидрофобным остатком, таким как изолейцин, валин, лейцин или метионин другого остатка, или замена одним полярным остатком другого, такая как замена лизина аргинином, аспарагиновой кислоты глутаминовой кислотой или аспарагина глутамином, и им подобные.

Термин консервативная замена также включает в себя использование замещенного аминокислотного остатка на месте незамещенного исходного аминокислотного остатка при условии, что антитела, наработанные к замещенному полипептиду, также иммунореактивны по отношению к незамещенному полипептиду.

Результатом модификаций этой первичной аминокислотной последовательности могут быть белки, которые, в основном, обладают эквивалентной активностью по сравнению с не модифицированной копией полипептида, и, таким образом, могут считаться функциональными аналогами исходных белков. Такие модификации могут быть преднамеренными, например, как модификации путем сайт-специфичного мутагенеза, или они могут происходить спонтанно и включают в себя варианты сплайсинга, изоформы, гомологи других видов и полиморфные формы. Такие функциональные аналоги также рассматриваются согласно данному изобретению.

Кроме того, результатом модификаций первичной аминокислотной последовательности могут быть белки, которые не сохраняют биологическую активность исходного белка, включая доминантные негативные формы, и т.д. Доминантный негативный белок может конкурировать с белком дикого типа, связываясь или другим путем образуя комплекс с регуляторными агентами, такими как компоненты выше по течению или ниже по течению, которые обычно функционально взаимодействуют с полипептидом. Такие доминантные негативные формы также рассматриваются согласно изобретению.

Сигнальный пептид означает пептидную последовательность, которая направляет синтезированный полипептид, с которым этот сигнальный пептид соединен, к эндоплазматическому ретикулюму для дальнейшего посттрансляционного процессинга и размещения.

Гетерологичный сигнальный пептид, используемый здесь в контексте с нейбластином, означает сигнальный пептид, который не является сигнальным пептидом нейбластина человека, обычно сигнальный пептид другого белка млекопитающих, отличного от нейбластина.

Специалисту понятно, что последовательность ДНК нейбластина человека (либо кДНК, либо геномная ДНК), или последовательности, которые отличаются от ДНК нейбластина человека либо молчащими изменениями кодонов, либо изменениями кодонов, которые вызывают консервативные аминокислотные замены, могут быть использованы для того, чтобы генетически модифицировать культивируемые клетки человека, так что они будут осуществлять сверхэкспрессию и секретировать фермент.

Полипептиды данного изобретения также включают химерные полипептиды или способные расщепляться гибридные полипептиды, в которых другой полипептид сливается с Νконцом или С-концом полипептида или его фрагмента. Химерный полипептид может быть получен путем слияния последовательности нуклеиновой кислоты (или ее части), кодирующей другой полипептид, с последовательностью нуклеиновой кислоты (или ее части) данного изобретения.

Способы получения химерных полипептидов представляют собой стандартные способы. Такие способы обычно требуют соединения последовательностей таким способом, что они обе оказываются в одной и той же рамке считывания, и экспрессия гибридного полипептида находится под контролем одного и того же промотора(ров) и терминатора.

Полипептиды данного изобретения также включают в себя укороченные формы полноразмерной молекулы нейбластина. В таких укороченных молекулах одна или большее количество аминокислот делетированы на Ν-конце или на С-конце, предпочтительно на Ν-конце.

Гомология аминокислотных последовательностей

Степень гомологии отобранного для испытаний полипептида с полипептидом нейбластина изобретения определяется как степень идентичности между двумя аминокислотными последовательностями. Высокий уровень идентичности последовательностей свидетельствует о вероятности того, что первая последовательность получена из второй.

Гомология определяется с помощью компьютерного анализа, таким является, но не ограничивает, анализ с помощью С1ик1а1Х компьютерной программы выравнивания [Ткотркоп ГО, С1Ькоп Т1, Р1е\\'шак Р, 1еаптоидт Р. & Ηί§щпк ΌΟ: Тке С1ик1а1Х \\'к16о\\ъ кИегГасе: Г1ех1Ь1е кЩНещек Гог тц1йр1е кесщепсе акдптеШ аНеб Ьу с.|иак1у апа1ук1к 1оо1к; ШсШс Ααάκ Век., 1997, 25 (24): 4876-82], и здесь предлагаются используемые по умолчанию параметры. С использованием этой программы показано, что зрелая часть полипептида, кодируемая аналогичной последо вательностью ДНК изобретения, проявляет степень идентичности, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, наиболее предпочтительно, по меньшей мере, 98%, с аминокислотной последовательностью, представленной здесь в виде БЕС ГО N0: 2, БЕС ГО N0: 4, БЕС ГО N0: 5, БЕС ГО N0: 6, БЕС ГО N0: 7, БЕС ГО N0: 9, БЕС ГО N0: 10, БЕС ГО N0: 11, БЕС ГО N0: 12 или БЕС ГО N0: 16.

На основании определения гомологии подтверждено, что полипептид изобретения, относящийся к надсемейству ТСР-β, относится к субсемейству СОШ, но представляет собой особый член этого семейства.

Биологически активные полипептиды

Полипептид изобретения может быть представлен какой-либо биологически активной формой, включая форму пре-про-белков, пробелков, зрелых белков, гликозилированных белков, фосфорилированных белков или любого другого посттрансляционно модифицированного белка.

Полипептидом изобретения, в частности, может быть ^гликозилированный полипептид, и этот полипептид предпочтительно гликозилирован по N-остаткам, указанным в списках последовательностей.

В предпочтительном варианте полипептид изобретения имеет аминокислотную последовательность, представленную в виде БЕС ГО N0: 9, содержащую гликозилированный остаток аспарагина в положении 122; аминокислотную последовательность, представленную в виде БЕС ГО N0: 10, содержащую гликозилированный остаток аспарагина в положении 122; аминокислотную последовательность, представленную в виде БЕС ГО N0: 11, содержащую гликозилированный остаток аспарагина в положении 98; или аминокислотную последовательность, представленную в виде БЕС ГО N0: 12, содержащую гликозилированный остаток аспарагина в положении 95.

В данном изобретении также рассматриваются гибридные белки нейбластина, такие как 1д-гибриды, как описано, например, в патенте США 5434131, включенном сюда в качестве ссылки.

В одном варианте изобретение предоставляет полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, показанную в виде БЕС ГО N0: 2, или аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, примерно на 85%, предпочтительно, по меньшей мере, примерно на 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, примерно на 98% и наиболее предпочтительно, по меньшей мере, примерно на 99% гомологична последовательности, представленной в виде БЕС ГО N0: 2.

В другом варианте изобретение предоставляет полипептид, имеющий аминокислотную последовательность БЕС ГО N0: 4 или аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, на 95%, еще более предпочтительно, по меньшей мере, на 98%, наиболее предпочтительно по меньшей мере на 99% гомологична последовательности, представленной в виде 8ЕО ГО N0: 4.

В третьем варианте изобретение предоставляет полипептид, имеющий аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0: 5 или аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, на 95%, наиболее предпочтительно, по меньшей мере, на 98%, гомологична последовательности, представленной в виде 8ЕО ГО N0: 5.

В четвертом варианте изобретение предоставляет полипептиды, имеющие аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0: 6 или аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, на 95%, наиболее предпочтительно, по меньшей мере, на 98% гомологична последовательности, представленной в виде 8Е0 ГО N0: 6.

В пятом варианте изобретение предоставляет полипептиды, имеющие аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0: 7 или аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, на 95%, наиболее предпочтительно, по меньшей мере, на 98% гомологична последовательности, представленной в виде 8ЕЕ) ГО N0: 7.

Полипептид нейбластина изобретения включает в себя аллельные варианты, например аминокислотные последовательности полипептидов 8Е0 ГО N0: 5-7, в которых Хаа означает Аки или Т11Г. и Уаа означает А1а или Рго.

В шестом варианте изобретение предоставляет полипептиды, имеющие аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0: 9 или аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, на 95%, наиболее предпочтительно, по меньшей мере, на 98% гомологична последовательности, представленной в виде 8Е0 ГО N0: 9.

В седьмом варианте изобретение предоставляет полипептид, имеющий аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0: 10 или аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, на 95%, наиболее предпочтительно, по меньшей мере, на 98% гомологична последовательности, представленной в виде 8ЕЕ) ГО N0: 10.

В восьмом варианте изобретение предоставляет полипептид, имеющий аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0: 11 или аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, на 95%, наиболее предпочти тельно, по меньшей мере, на 98% гомологична последовательности, представленной в виде 8ЕЕ) ГО N0: 11.

В девятом варианте изобретение предоставляет полипептид, имеющий аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0: 12 или аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, на 95%, наиболее предпочтительно, по меньшей мере, на 98% гомологична последовательности, представленной в виде 8ЕЕ) ГО N0: 12.

В десятом варианте изобретение предоставляет полипептид, имеющий аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0: 16 или аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, на 95%, наиболее предпочтительно, по меньшей мере, на 98% гомологична последовательности, представленной в виде 8Е0 ГО N0: 16, которая является пре-пронейбластином, источником получения которого являются мыши.

В другом варианте полипептид изобретения имеет отпечаток пальцев субсемейства СБДЕ, т.е. аминокислотные остатки, подчеркнутые в таблице 3.

В следующем варианте изобретение предоставляет полипептид, кодируемый полинуклеотидной последовательностью, способной гибридизоваться в условиях высокой жесткости с полинуклеотидной последовательностью, представленной в виде 8Е0 ГО N0: 1, с комплементарной ей цепью, или ее суб-последовательностью. В предпочтительном варианте полипептид изобретения кодируется полинуклеотидной последовательностью, по меньшей мере, на 70% гомологичной полинуклеотидной последовательности, представленной в виде 8Е0 ГО N0: 1. В наиболее предпочтительном варианте полипептид изобретения кодируется полинуклеотидной последовательностью, представленной в виде 8Е0 ГО N0: 1.

В еще одном варианте изобретение предоставляет новые полипептиды, которые кодируются полинуклеотидной последовательностью, способной гибридизоваться в условиях высокой жесткости с полинуклеотидной последовательностью, представленной в виде 8Е0 ГО N0: 3, с комплементарной ей цепью или ее субпоследовательностью. В предпочтительном варианте полипептид изобретения кодируется полинуклеотидной последовательностью, по меньшей мере, на 70% гомологичной полинуклеотидной последовательности, представленной в виде 8Е0 ГО N0: 3. В наиболее предпочтительном варианте полипептид изобретения кодируется полинуклеотидной последовательностью, представленной в виде 8Е0 ГО N0: 3.

В еще одном варианте изобретение предоставляет новые полипептиды, которые кодируются полинуклеотидной последовательно стью, способной гибридизоваться в условиях высокой жесткости с полинуклеотидной последовательностью, представленной в виде ЗЕЦ ГО N0: 8, с комплементарной ей цепью или ее субпоследовательностью. В предпочтительном варианте полипептид изобретения кодируется полинуклеотидной последовательностью, по меньшей мере, на 70% гомологичной полинуклеотидной последовательности, представленной в виде ЗЕЦ ГО N0: 8. В наиболее предпочтительном варианте полипептид изобретения кодируется полинуклеотидной последовательностью, представленной в виде 8ЕЦ ГО N0: 8.

В еще одном варианте изобретение предоставляет новые полипептиды, которые кодируются полинуклеотидной последовательностью, способной гибридизоваться в условиях высокой жесткости с полинуклеотидной последовательностью, представленной в виде ЗЕЦ ГО N0: 15, с комплементарной ей цепью или ее субпоследовательностью. В предпочтительном варианте полипептид изобретения кодируется полинуклеотидной последовательностью, по меньшей мере, на 70% гомологичной полинуклеотидной последовательности, представленной в виде ЗЕЦ ГО N0: 15. В наиболее предпочтительном варианте полипептид изобретения кодируется полинуклеотидной последовательностью, представленной в виде 8ЕЦ ГО N0: 15.

Биологический источник

Полипептид изобретения может быть выделен из клеток млекопитающих, предпочтительно из клеток человека или из клеток мыши.

В наиболее предпочтительном варианте полипептид изобретения может быть выделен из ткани сердца человека, из скелетной мышцы человека, из поджелудочной железы человека или из ткани головного мозга человека, в частности из хвостатого ядра или из таламуса, или он может быть получен из ДНК, происходящей из клеток млекопитающих, как обсуждается более подробно ниже.

Нейротрофическая активность

Полипептиды нейбластина изобретения применимы для замедления метаболизма, роста, дифференцировки или выживания нервов или нервных клеток. В частности, полипептиды нейбластина применимы для лечения или смягчения расстройства или заболевания у существующих животных, например у человека, такого нарушения или заболевания, которое поддается действию нейротрофических агентов. Такие обработки и способы лечения более подробно описаны ниже.

Антитела

Полипептиды нейбластина или полипептидные фрагменты изобретения применяются для получения антител, специфичных для нейбластина. В используемом здесь смысле специфичными для нейбластина антителом является антитело, например поликлональное антитело или моноклональное антитело, которое является иммунореактивным по отношению к полипептиду нейбластина или полипептидному фрагменту или которое специфично связывается с эпитопами полипептидов нейбластина.

Получение поликлональных и моноклональных антител хорошо известно в данной области. Поликлональные антитела могут быть, в частности, получены, как описано, например, Сгееи е! а1.,: Ргобисйои οί Ро1ус1опа1 Аийзега в 1ттипос11ст1са1 Рго!осо1з (Маизои, Еб.); Нитаиа Ргезз, 1992, радез 1-5; СоШдаи е! а1.,: Ргобисбои οί Ро1ус1оиа1 Аийзега ш ВаЬЬйз, К.а!з, М1се аиб Натз1егз в Сиггеи! Рго1осо1з ш 1ттиио1оду, 1992, 8есйои 2.4.1; и Еб Наг1оте аиб Эау1б Ьаие (Ебз.) в АийЬоб1ез: А 1аЬога1огу таииа1 Со1б 8ргтд НагЬог ЬаЬ. Ргезз, 1988. Эти протоколы, таким образом, включены сюда в качестве ссылки. Моноклональные антитела могут быть, в частности, получены как описано, например, Кой1ег & Мбз!ет, №щ.1ге. 1975, 256: 495; Сойдаи е! а1., в Сиггеи! Рго1осо1з ш 1ттиио1оду, 1992, 8есйои 2.5.1-2.6.7; и Наг1оте е! а1., в АийЬоб1ез: А 1аЬога!огу Маииа1; Со1б 8ргшд НагЬог, РиЬ., 1988, раде 726; и эти протоколы включены сюда в качестве ссылки.

Коротко, моноклональные антитела могут быть получены путем инъекции, например, мышам композиции, содержащей антиген, проверки наличия продукции антител путем отбора образца сыворотки, извлечения селезенки, чтобы получить В-лимфоциты, слияния Влимфоцитов с клетками миеломы для получения гибридом, клонирования гибридом, отбора позитивных клонов, которые продуцируют антитела против антигена, и выделения антител из гибридомных культур.

Моноклональные антитела могут быть выделены и очищены из гибридомных культур с помощью множества хорошо разработанных способов, включая аффинную хроматографию с использованием белок-А-сефарозы, эксклюзионную хроматографию по размеру молекул и ионообменную хроматографию, смотри, например, Сойдаи е! а1. в Сиггеи! Рго!осо1з ш 1ттиио1оду, 1992, 8есйои 2.7.1-2.7.12, аиб 8есйои 2.9.1-2.9.3; и Вагиез е! а1.: Рипйсайои οί 1ттииод1оЬийи С (1дС) в Ме!йобз ш Мо1еси1аг Вю1оду; Нитаиа Ргезз, 1992, Уо1.10, Радез 79-104. Поликлональные или моноклональные антитела далее могут быть необязательно очищены, например, путем связывания и элюирования из матрикса, с которым связан полипептид, к которому выработаны антитела.

Антитела, которые связываются с полипептидом нейбластина изобретения, могут быть получены с использованием в качестве иммунизирующего антигена интересующего интактного полипептида или фрагментов, содержащих небольшие пептиды. Полипептид, используемый для иммунизации животного, может быть получен с помощью технологии рекомбинантных ДНК или путем химического синтеза и может быть необязательно конъюгирован с белкомносителем. Обычно используемые белкиносители, которые химически связываются с пептидом, включают в себя гемоцианин моллюска блюдечко (кеу1о1е Нтре!) (ГМБ), тироглобулин, бычий сывороточный альбумин (БСА) и токсоид столбняка. Затем связанный пептид может использоваться для иммунизации животного, которым может быть, в частности, мышь, крыса, хомячок или кролик.

В одном варианте антитела получают, используя следующие пептиды: пептид 1: ΟΒΡΤΚΎΕΑνδΡΜΌνΝδΤ (аминокислоты 108124 8ЕО ГО N0: 9); или пептид 2:

АЕИРРРС,8ИР\8ОРС (аминокислоты 93-107 8Е0 ГО N0: 9). Способы получения антител с использованием этих полипептидов описаны в примере 10.

Авторы также получили поликлональные антитела кролика к следующим пептидам:

пептид К27: 6Р08КАК.АА6АК.0С (аминокислоты 30-43 8Е0 ГО N0: 9);

пептид К.28: Ь0НК8ПЕЬ\КРКРС (аминокислоты 57-70 8Е0 ГО N0: 9);

пептид К29: СККАК.8РНПЬ8Ь (аминокислоты 74-85 8ЕО ГО N0: 9);

пептид К30: РКРРРС18ИР\8ОРС (аминокислоты 94-107 8Е0 ГО N0: 9); и пептид К31: §Т^КТ\0КБ8АТАС (аминокислоты 123-136 8ЕО ГО N0: 9).

В данной группе только антитела против пептидов К30 и К31, расположенных относительно близко к С-концу, узнавали денатурированный белок при восстанавливающих условиях на вестерн-блоте.

Авторы также идентифицировали дополнительные пептиды, производные нейбластина, полученные из зрелого белка, как описано более детально ниже, которые являются предполагаемыми, экспонированными на поверхности, петлями, это предположение сделано на основании известной структуры СЭЖ (Е1депЬго! апб ОегЬег, №!.8!гис!.Вю1., 1997, 4, 435-438), и поэтому они пригодны для образования антител:

Район 1: СРРР80Р\Т\ИАРС1РС111Р81)ЕР \РРРРС (АК 43-70 8ЕО ГО N0: 9);

Район 2: СКК.АК.8РНПЬ8ЬА8ЬЬ6А6АЬ КРРРС18ИР\8ОРС (АК 74-107 8ЕО ГО N0: 9);

Район 3: СИРТИ¥ЕА\8Р\11)\А8Т\\'ИТ \ЭКЬ8АТАС (АК 108-136 8ЕО ГО N0: 9).

Согласно другому аспекту изобретения антитела, которые специфично связывают нейбластин, или полученные на основе нейбластина пептиды, могут применяться для выявления наличия таких нейбластиновых нейротрофических факторов в различных средах, и, в частности, для диагностики состояний или заболеваний, связанных с молекулами нейбластина изобретения. Многочисленные протоколы такого выявления известны в данной области, включая ЕЫ8А, РИА и РАС8.

Антитела изобретения также могут применяться для блокирования действия нейротрофического фактора, и, в частности, могут быть нейтрализующими антителами.

Способы получения полипептидов изобретения

Клетку, содержащую последовательность ДНК, кодирующую полипептид нейбластина изобретения, культивируют в условиях, обеспечивающих продукцию полипептида, с последующим извлечением полипептида из культуральной среды, как описано более подробно ниже. В том случае, когда клетки надо генетически модифицировать в целях получения полипептида нейбластина, клетки могут быть модифицированы обычными способами или путем активации гена.

Согласно традиционным способам, молекула ДНК, которая содержит кДНК или геномную последовательность ДНК нейбластина, может находиться в экспрессирующей конструкции и может быть трансфицирована в клетки стандартными способами, включая, но не ограничивая этими способами, трансфекцию, опосредованную липосомами, полибреном или ДЭАЭ декстраном, электропорацию, преципитацию фосфатом кальция, микроинъекцию или скоростные управляемые микроснаряды (ЬюШДск). В альтернативном случае можно использовать систему, которая доставляет ДНК с помощью вирусного вектора. К известным вирусам, пригодным для переноса генов, относятся аденовирусы, аденоассоциированный вирус, лентивирус, герпесвирус, вирус эпидемического паротита, полиовирус, ретровирусы, вирус Синдбис и вирус осповакцины, такой как вирус оспы канареек, а также бакуловирусная инфекция клеток насекомых, в частности клеток насекомых 8ГР9.

В альтернативном случае клетки могут быть модифицированы с помощью метода активации генов (ГА), такого как описано в патентах США 5733761 и 5750376, каждый из которых включен сюда в качестве ссылки.

Таким образом, термин генетически модифицированный, используемый здесь в отношении клеток, означает получение клеток, которые экспрессируют конкретный генный продукт вследствие введения молекулы ДНК, кодирующей данный генный продукт, и/или регуляторных элементов, которые контролируют экспрессию последовательности, кодирующей генный продукт. Молекула ДНК может быть введена путем направления гена в определенную мишень, что позволяет включать молекулу ДНК в конкретный геномный сайт.

Рекомбинантные экспрессирующие векторы

Согласно следующему аспекту, изобретение предоставляет рекомбинантный экспрессирующий вектор, содержащий полинуклеотид изобретения. Рекомбинантным экспрессирующим вектором изобретения может быть любой приемлемый эукариотический экспрессирующий вектор. Предпочтительными рекомбинантными экспрессирующими векторами являются вектор рТЕ1-8, содержащий промотор убиквитина ПоЬшъсп ТЕ, 8с1юе11ег М8, Ток!оу 8, 8с1таП/ Т; РЕВ8 ЬеЩ 1990, 276, 289-294), и его производные, например ρυόίΙΖ. Предпочтительным доступным коммерческим эукариотическим экспрессирующим вектором является, например, вектор ροΟΝΑ-3, содержащий вирусный промотор (доступный для приобретения в 1пу|1годеп). В другом предпочтительном экспрессирующем векторе используются ранний промотор 8У40 и главный поздний промотор аденовируса (полученные из плазмиды рАЭ2бета; №г1оп апб Со1йп, Мо1.Се11.Вю1., 1985, 5, 281).

Данное изобретение также предоставляет прокариотические экспрессирующие векторы и синтетические гены (сингены) с оптимизацией кодонов для экспрессии у прокариот. Были сконструированы сингены с более низким содержанием ОС и предпочтительно бактериальными (например, Е.соИ) кодонами. Синген клонирован в двух векторах, рЕТ19Ь и рМ1В164, производном рЕТ19Ь. Конструкции с рЕТ19Ь показаны на фиг.14. В этой конструкции последовательность, кодирующая домен зрелого нейбластина, непосредственно сливается с инициирующим кодоном метионина. Конструкция с рМ1В164 показана на фиг.15.

Клетки-продуценты

Согласно еще одному аспекту изобретение предоставляет клетки-продуценты, которые в результате генетических манипуляций содержат изолированную полинуклеотидную последовательность изобретения и/или рекомбинантный экспрессирующий вектор изобретения. Клеткой изобретения может быть, в частности, полученная в результате генетических манипуляций клетка, которая временно или стабильно экспрессирует, сверхэкспрессирует или совместно экспрессирует полипептид изобретения. Способы получения временной или стабильной экспрессии известны в данной области.

Полинуклеотид изобретения может быть встроен в экспрессирующий вектор, например в плазмиду, вирус или другой экспрессирующий переносчик, и путем лигирования оперативно сцеплен с последовательностями, контролирующими экспрессию так, чтобы экспрессия кодирующей последовательности достигалась при условиях, которые сочетаются с последовательностями, контролирующими экспрессию. Приемлемые контролирующие экспрессию последовательности включают в себя промоторы, энхансеры, терминаторы транскрипции, стартовые кодоны, сигналы сплайсинга интронов и стоп-кодоны, все они содержатся в правильной рамке считывания полинуклеотида изобретения так, чтобы обеспечить правильную трансляцию мРНК. Последовательности, контролирующие экспрессию, также могут включать в себя дополнительные компоненты, такие как лидерные последовательности и последовательности гибридного партнера.

Промотор может быть, в частности, конститутивным или индуцибельным промотором. При клонировании в бактериальных системах могут быть использованы такие индуцибельные промоторы, как рЬ бактериофага λ, р1ас, р1гр, р1ас (р!гр-1ас гибридный промотор). При клонировании в системах млекопитающих могут использоваться промоторы, полученные из генома клеток млекопитающих, например промотор убиквитина, промотор ТК или промотор металлотионеина, или из вирусов млекопитающих, например длинный концевой повтор ретровирусов, поздний промотор аденовирусов или промотор 7,5К вируса осповакцины. Для обеспечения транскрипции полинуклеотида изобретения также могут быть использованы промоторы, полученные с помощью техники рекомбинантных ДНК или синтетическим способом.

Обычно приемлемые экспрессирующие векторы содержат точку начала экспрессии, промотор, а также специфичные гены, которые позволяют проводить фенотипическую селекцию трансформированных клеток, и включают в себя векторы, подобные основанному на Т7 экспрессирующему вектору для экспрессии в клетках бактерий [ЯокепЬегд е! а1.; Сепе. 1987, 56, 125], рТЕ1-8, риЬ1^, рсПт-3 и р\18Х№) экспрессирующие векторы для экспрессии в клетках млекопитающих [Бее апб №1йап8, 1. Вю1. Сйет., 1988, 263, 3521], векторы, полученные на основе бакуловирусов, для экспрессии в клетках насекомых, и экспрессирующий вектор ооцитов ΡΤΕΝ |Богепх С, Риксй М. & 1еп(5с11 Т. 1: Не!еготиШтепс СЬС сЫопбе сйаппеК \νί11ι поуе1 ргорегйек; Ргос. №111. Асаб. 8сЕ и8А 1996, 93, 13362-13366].

В предпочтительном варианте клетка изобретения является эукариотической клеткой, например клеткой млекопитающих, например клеткой человека, ооцитом или дрожжевой клеткой. Клеткой изобретения, без ограничения, может быть клетка эмбриональной почки человека (НЕК), например клетка НЕК293, клетка ВНК21, клетка яичника китайского хомячка (СНО), клетка ооцита Хепорик 1аег15 (ХЬО). В другом варианте клетка изобретения является клеткой грибов, например клеткой нитчатого гриба. В другом предпочтительном варианте клетка представляет собой клетку насекомого, наиболее предпочтительно клетку 819. Дополнительными предпочтительными клетками млекопитающих изобретения являются линии клеток РС12, Н1В5, К.№33Ь и клетки-предшественники нервных клеток человека. Наиболее предпочтительными являются клетки человека.

Примеры первичных или вторичных клеток включают в себя фибробласты, эпителиальные клетки, включая эпителиальные клетки мо лочной железы и кишечника, эндотелиальные клетки, форменные элементы крови, включая лимфоциты, и клетки костного мозга, глиальные клетки, гепатоциты, кератиноциты, мышечные клетки, нервные клетки или предшественники этих типов клеток. Примеры иммортализованных линий клеток человека, пригодные для применения в представленных способах, включают в себя, но не ограничиваются этим, клетки меланомы Во\\'С5 (АТСС инвентарный Νο. СКЬ 9607), клетки Όαιιάί (АТСС инвентарный Νο. ССЬ 213), клетки НеЬа и производные клеток НеЬа (АТСС инвентарные Νοκ. ССЬ 2, ССЬ 2.1 и ССЬ 2.2), НЬ-60 (АТСС инвентарный Νο. ССЬ 240), клетки НТ-1080 (АТСС инвентарный Νο. ССЬ 121), клетки 1итка1 (АТСС инвентарный Νο. Т1В 152), клетки карциномы КВ (АТСС инвентарный Νο. ССЬ 17), клетки лейкоза К-562 (АТСС инвентарный Νο. ССЬ 243), клетки рака молочной железы МСР-7 (АТСС инвентарный Νο. ВТН 22), клетки МОЬТ-4 (АТСС инвентарный Νο. 1582), клетки ΝαιηαΡνα (АТСС инвентарный Νο. СКЬ 1432), клетки Кац (АТСС инвентарный Νο. ССЬ 86), клетки КРМ1 8226 (АТСС инвентарный Νο. ССЬ 155), клетки И937 (АТСС инвентарный Νο. СКЬ 1593), сублиния У1-38УА13 клеток 2К4 (АТСС инвентарный Νο. СЬЬ 75.1) и клетки карциномы яичника 2780ΑΌ (Уап бет ВНек е! а1., Сапсег Кек., 1988, 48, 5927-5932), а также гетерогибридомные клетки, полученные путем слияния клеток человека и клеток других видов. Также могут быть использованы вторичные линии фибробластов человека, такие как 1-38 (АТСС инвентарный Νο. ССЬ 75) и МКС-5 (АТСС инвентарный Νο. ССЬ 171).

В том случае, когда клетка изобретения представляет собой эукариотическую клетку, включение гетерологичного полинуклеотида изобретения может быть, в частности, проведено путем инфекции (с применением вирусного вектора), путем трансфекции (с применением плазмидного вектора), с помощью преципитации фосфатом кальция, микроинъекции, электропорации, липофекции или другими физикохимическими способами, известными в данной области.

В более предпочтительном варианте изолированная последовательность полинуклеотида изобретения и/или рекомбинантный экспрессирующий вектор изобретения трансфицируются в клетку-хозяина млекопитающих, клеткупредшественника нервной клетки, астроглиальную клетку, Т-клетку, гемопоэтическую стволовую клетку, неделящуюся клетку или эндотелиальную клетку мозга, содержащую, по меньшей мере, одну молекулу ДНК, способную опосредовать иммортализацию клеток и/или трансформацию.

Активация эндогенного гена в клеткехозяине может быть выполнена путем введения регуляторных элементов, в частности путем введения промотора, способного влиять на транскрипцию эндогенного гена, кодирующего полипептид нейбластина изобретения.

Фармацевтические композиции

Согласно другому аспекту изобретение предоставляет новые фармацевтические композиции, содержащие терапевтически эффективное количество полипептида изобретения.

Для применения в терапевтических целях полипептид изобретения может быть введен в любой подходящей форме. В предпочтительном варианте полипептид изобретения включается в фармацевтическую композицию вместе с одним или большим количеством адъювантов, наполнителей, носителей и/или разбавителей, и фармацевтическая композиция готовится специалистом стандартными способами, известными в данной области.

Такие фармацевтические композиции могут содержать полипептид изобретения или антитело против него. Композиция может вводиться отдельно или в комбинации с одним или с большим количеством других агентов, лекарственных средств или гормонов.

Фармацевтическая композиция данного изобретения может быть введена любым приемлемым способом, включая, но не ограничивая этим, пероральное, внутривенное, внутримышечное, внутриартериальное, интрамедуллярное, внутритрахеальное, внутрижелудочковое, трансдермальное, подкожное, внутрибрюшинное, интраназальное, через тонкий кишечник, локальное, подъязычное или ректальное применение, трансбуккальное, вагинальное, внутриглазничное, интрацеребральное, внутричерепное, интраспинальное, внутрижелудочковое, внутрицистерновое, интракапсулярное, внутрилегочное, через слизистые оболочки или путем ингаляции.

Способы, аппаратура и приготовление лекарственного средства для внутрилегочной доставки описаны, например, в патентах США 5785049, 5780019 и 5775321, каждый из которых включен сюда в качестве ссылки. Введение может быть в виде периодических инъекций ударных доз препарата, или может проводиться более непрерывно путем внутривенного или внутриперитонеального введения из резервуара, который находится снаружи (например, баллон IV) или внутри (например, биологически разлагаемый имплантат, искусственный биологический орган или колония имплантированных клеток, продуцирующие нейбластин). См., например, патенты США 4407957, 5798113 и 5800828, каждый из которых включен сюда в качестве ссылки. Способы и аппаратура для внутрилегочной доставки описаны, например, в патентах США 5654007, 5780014 и 5814607, каждый из которых включен сюда в качестве ссылки.

Введение нейбластина согласно данному изобретению может быть достигнуто, в частно сти, с помощью любых приемлемых способов доставки, включая:

(a) насос (см., например, Аппа1к οί РйагтасоЫегару, 27:912 (1993); Сапсег, 41:1270 (1993); Сапсег Кекеагсй, 44:1698 (1984), включенные сюда в качестве ссылки), (b) микрокапсулирование (смотри, например, патенты США 4352883; 4353888 и 5084350, включенные сюда в качестве ссылки), (c) полимерный имплантат непрерывного высвобождения (смотри, например, 8аЬе1, патент США 4883666, включенный сюда в качестве ссылки), (й) микрокапсулирование (смотри, например, патенты США 5284761, 5158881, 4976859 и 4968733 и опубликованные РСТ заявки на патент \У0 92/19195, \У0 95/05452, каждая из которых включена сюда в качестве ссылки), (е) непокрытые или некапсулированные клеточные трансплантаты в ЦНС (смотри, например, патенты США 5082670 и 5618531, каждый из которых включен сюда в качестве ссылки), (ί) инъекции, либо подкожные, внутривенные, внутриартериальные, внутримышечные, либо в другое приемлемое место; и (д) пероральное введение в капсуле, жидкости, таблетке, пилюле или композиции замедленного высвобождения.

В одном варианте данного изобретения нейбластин доставляется непосредственно в ЦНС, предпочтительно в желудочки мозга, паренхиму мозга, подоболочечное пространство или в другие приемлемые места ЦНС, наиболее предпочтительно в подоболочечное пространство.

Другим предпочтительным вариантом авторы считают системную доставку путем подкожной инъекции, внутривенного введения или внутривенной инфузии.

Другие применяемые парентеральные системы доставки включают в себя частицы сополимера этиленавинилацетата, осмотический насос, имплантируемые системы инфузии, доставку с помощью насоса, доставку капсулированных клеток, доставку липосомами, инъекции через иглу, инъекции без иглы, распылитель, аэрозоли-затор, электропорацию и трансдермальный пластырь.

Дальнейшие детали способов получения композиции и введения можно найти в последней редакции ИеттдЮп'к Рйагтасеийса1 8с1епсек (Мааск РиЬйкЫпд Со., ЕакЮп, РА).

Активный ингредиент может вводиться в виде одной или нескольких доз в сутки. В настоящее время подходящими считаются дозы между 0,5 нг нейбластина/кг веса тела до примерно 50 мкг/кг на одно введение и примерно от 1,0 нг/кг до примерно 100 мкг/кг в сутки. Фармацевтическая композиция, содержащая нейбластин, должна обеспечивать локальную концентрацию нейротрофического фактора при мерно от 5 нг/мл цереброспинальной жидкости (ЦСЖ) до 25 нг/мл ЦСЖ.

Конечно, вводимая доза должна быть тщательно подобрана в соответствии с возрастом, весом и состоянием человека, которому проводится лечение, и также, конечно, практикующий врач должен определять путь введения, лекарственную форму и схему приема лекарственного средства, желаемый результат и точную дозу.

В следующем варианте полипептид нейбластина изобретения может быть введен с помощью генной доставки, с применением клеточных линий и векторов, как описано ниже в способах лечения. Чтобы создать такие терапевтические линии клеток, полинуклеотид изобретения может быть встроен в экспрессирующий вектор, например плазмиду, вирус или другой экспрессирующий переносчик, и сцеплен в одном опероне с последовательностями, контролирующими экспрессию, путем лигирования так, чтобы экспрессия кодирующей последовательности достигалась при условиях, совместимых с последовательностями, контролирующими экспрессию. Приемлемые контролирующие экспрессию последовательности включают в себя промоторы, энхансеры, терминаторы транскрипции, стартовые кодоны, сигналы сплайсинга интронов и стоп-кодоны, все они содержатся в правильной рамке считывания полинуклеотида изобретения так, чтобы обеспечить правильную трансляцию мРНК. Последовательности, контролирующие экспрессию, также могут включать в себя дополнительные компоненты, такие как лидерные последовательности и последовательности гибридного партнера.

Промотор может быть, в частности, конститутивным или индуцируемым промотором. Конститутивные промоторы могут быть синтетическими, вирусными или полученными из генома клеток млекопитающих, например промотор убиквитина человека. В предпочтительном варианте терапевтическая клеточная линия будет представлять собой непрерывно делящуюся линию нервных клеток, экспрессирующую полипептид изобретения. При имплантации авторы полагают имплантировать примерно от 10⁵ до 10¹⁰ клеток, более предпочтительно от 10⁶ до примерно 10⁸ клеток.

Способы лечения

Данное изобретение, которое относится к полинуклеотидам и белкам, полипептидам, пептидным фрагментам или полученным на их основе производным, а также к антителам, направленным против таких белков, пептидов или производных, может применяться для лечения или облегчения расстройства или заболевания животных, включая человека, тех расстройств или заболеваний, которые восприимчивы к действию нейротрофических агентов.

Полипептиды данного изобретения могут применяться непосредственно, например, по средством инъекционных, имплантируемых или принимаемых внутрь фармацевтических композиций для лечения патологического процесса, чувствительного к полипептидам нейбластина.

Полинуклеотиды изобретения, включая комплементарные им последовательности, могут применяться для экспрессии нейротрофического фактора изобретения. Это может достигаться с помощью линий клеток, экспрессирующих такие белки, пептиды или производные изобретения, или с помощью вирусных векторов, кодирующих такие белки, пептиды или производные изобретения, или с помощью клеток-хозяев, экспрессирующих такие белки, пептиды или производные. Эти клетки, векторы и композиции могут вводиться для обработки области-мишени, чтобы повлиять на процесс заболевания, чувствительный к полипептидам нейбластина.

Приемлемые экспрессирующие векторы могут быть получены на основе лентивирусов, ретровирусов, аденовирусов, герпесвирусов или вирусов осповакцины, или на основе плазмид, полученных из бактерий, и могут применяться для ίη νίνο доставки нуклеотидных последовательностей в целый организм или в мишень в виде органа, ткани или популяции клеток. К другим способам относятся, но не ограничивают этим, трансфекция с помощью липосом, электропорация, трансфекция с помощью пептидов носителей, содержащих сигналы ядерной или другой локализации, и генная доставка посредством систем замедленного высвобождения. Согласно еще одному аспекту изобретения для ингибирования или усиления экспрессии нейбластина могут применяться антисмысловые нуклеотидные последовательности, комплементарные гену нейбластина или его частям.

Согласно еще одному аспекту изобретение относится к способу лечения или облегчения расстройства или заболевания животных, включая человека, такого расстройства или заболевания, которое чувствительно к действию нейротрофических агентов.

Расстройством или заболеванием может быть, в частности, повреждение нервной системы в результате травмы, операции, ишемии, инфекции, болезней обмена веществ, дефицита питательных веществ, злокачественного процесса или токсических агентов и генетических или идиопатических процессов.

Повреждение может, в частности, произойти в чувствительных нейронах или клетках ретинального ганглия, включая нейроны ганглия заднего корешка или в любой из следующих тканей: ганглий коленца, нижний ганглий языкоглоточного нерва или узловатый ганглий; вестибулярно-слуховой комплекс УШ-го черепного нерва; вентролатеральный полюс верхне- и нижнечелюстной доли узла тройничного нерва; и ядро среднемозгового тракта тройничного нерва.

В предпочтительном варианте способа изобретения заболеванием или расстройством является нейродегенеративное заболевание, в которое вовлечены поврежденные или травмированные нейроны, в частности, травматические повреждения периферических нервов, продолговатого мозга и/или спинного мозга, повреждение нейронов в результате ишемии головного мозга, невропатия и особенно периферическая невропатия, травма или повреждение периферического нерва, ишемический инсульт, острое повреждение головного мозга, острое повреждение спинного мозга, опухоли нервной системы, рассеянный склероз, воздействие нейротоксинов, болезни обмена веществ, такие как сахарный диабет или нарушение функции почек, и повреждение, вызванное инфекционными агентами, нейродегенеративные заболевания, включая болезнь Альцгеймера, болезнь Гентингтона, болезнь Паркинсона, синдром с проявлениями болезни Паркинсона, прогрессирующий супрануклеарный паралич (синдром Стила-Ричадсона-Ольшевского), оливопонтоцеребеллярную дегенерацию (ОПЦД), синдром Шая-Дрейджера (множественная системная атрофия), комплекс деменция-паркинсонизм (Гуам-тип), боковой амиотрофический склероз или любое другое врожденное или нейродегенеративное заболевание, и ухудшение памяти, связанное с деменцией.

Предпочтительным вариантом авторы считают лечение чувствительных нейронов и/или нейронов автономных систем. Другим предпочтительным вариантом авторы полагают лечение заболеваний мотонейронов, таких как боковой амиотрофический склероз (БАС) и спинальная амиотрофия. Еще одним предпочтительным вариантом авторы считают применение молекул нейбластина данного изобретения для ускорения восстановления нервов после травматического поражения. В одном варианте авторы предполагают применение канала управления нервом с помощью матрикса, содержащего полипептиды нейбластина. Такие каналы управления нервами заявлены, например, в патенте США № 5834029, включенном сюда в качестве ссылки.

В предпочтительном варианте полипептиды и нуклеиновые кислоты изобретения (и фармацевтические композиции, которые их содержат) используются для лечения периферических невропатий. Среди периферических невропатий предполагается лечить молекулами данного изобретения индуцированные травмами невропатий, например такие, которые вызваны физическим повреждением или патологическим состоянием, физическое повреждение головного мозга, физическое повреждение спинного мозга, инсульт, связанный с повреждением мозга, и неврологические нарушения, связанные с нейродегенерацией.

Авторы также предполагают лечение невропатий, индуцированных химиотерапией (таких как невропатий, вызванные поступлением химиотерапевтических средств, например таксола или цисплатина); невропатий, индуцированных токсинами, невропатий, индуцированных лекарственными средствами, невропатий, индуцированных недостатком витаминов; идиопатических невропатий; и диабетических невропатий. См., например, патенты США 5496804 и 5916555, каждый из которых включен сюда в качестве ссылки.

Авторы также предполагают лечение не невропатических болезней, множественных мононевропатий, полиневропатий, включая аксональную и демиелинизирующую невропатий, с помощью нуклеотидов и полипептидов нейбластина изобретения.

В другом предпочтительном варианте полипептиды и нуклеиновые кислоты данного изобретения (и фармацевтические композиции, которые их содержат) применяются для лечения различных заболеваний глаза, включая разрушение фоторецепторов сетчатки у пациентов, страдающих дегенерацией желтого пятна, пигментным ретинитом, глаукомой и сходными заболеваниями.

Другим объектом данного изобретения является предоставление способа предотвращения дегенеративных изменений, связанных с указанными выше заболеваниями и расстройствами, путем имплантации в мозг млекопитающих, включая человека, векторов или клеток, способных продуцировать биологически активную форму нейбластина или предшественника нейбластина, т.е. молекулу, которая в организме легко может быть превращена в биологически активную форму нейбластина, или клетки, которые секретируют нейбластин, могут быть дополнительно капсулированы, например, в полупроницаемые мембраны.

Клетки могут выращиваться ш νίίΓΟ в целях применения для трансплантации или приживления в мозг млекопитающих, включая человека.

В предпочтительном варианте ген, кодирующий полипептид изобретения, трансфицируется в подходящую клеточную линию, например в линию непрерывно делящихся стволовых нервных клеток крыс, подобную Н1В5 и КХ33Ь, или в линию иммортализованных предшественников нервных клеток человека, и полученная в результате линия клеток имплантируется в мозг живого организма, включая человека, чтобы секретировать терапевтический полипептид изобретения в ЦНС, например с помощью экспрессирующих векторов, описанных в заявке на международный патент XV 0 98/32869.

Способы диагностики и скрининга

Нуклеиновая кислота нейбластина может быть использована для определения того, пред расположен ли индивидуум к развитию неврологического расстройства, возникающего из-за дефекта в гене нейбластина, например дефекта в аллели нейбластина, который получен благодаря генетическому наследованию, из-за аномального эмбрионального развития или в результате приобретенного повреждения ДНК. Анализ может проводиться, например, путем выявления делеции(ций) или точковой мутации(ций) в пределах гена нейбластина или путем выявления наследования такой предрасположенности к этим генетическим дефектам на основе полиморфизма длин специфичных фрагментов рестрикции (ПДРФ), путем выявления наличия или отсутствия нормального гена нейбластина с помощью гибридизации образца нуклеиновой кислоты пациента с зондом(ами) нуклеиновой кислоты, специфичным для гена нейбластина, и выявлением способности зонда гибридизоваться с нуклеиновой кислотой.

В частности, в качестве зонда для гибридизации может использоваться нуклеиновая кислота нейбластина. Такие гибридизационные исследования могут применяться для обнаружения, прогнозирования, диагностики или наблюдения за различными состояниями, расстройствами или заболеваниями, связанными с отклоняющимися от нормы уровнями мРНК, кодирующих белок нейбластина. Нуклеиновая кислота нейбластина может быть сконструирована в качестве маркера физиологических процессов, зависимых от нейротрофического фактора нейбластина. К таким процессам относятся, но не ограничиваются ими, нормальные физиологические процессы (например, функция нейронов) и патологические процессы (например, нейродегенеративные болезни). Характеристика конкретной субпопуляции пациентов с аберрантными (т.е. повышенными или недостаточными) уровнями белка нейбластина и или мРНК, кодирующей нейбластин, может привести к разработке новой классификации болезней. Термин аберрантные уровни в используемом здесь смысле, означает повышенный или пониженный уровень относительно уровня контрольного образца или индивидуума, не имеющего нарушений, выявляемых количественными или качественными способами.

Нуклеиновые кислоты и полипептиды нейбластина изобретения могут быть также использованы для скрининга и идентификации аналогов нейбластина, включая небольшие молекулы миметиков нейбластина. В одном рассматриваемом варианте изобретение предоставляет способ идентификации соединения, предполагаемого кандидата, которое индуцирует опосредуемое нейбластином биологическое действие, способ, включающий в себя этапы подготовки тестируемой клетки, в которой при контакте с нейбластином индуцируется экспрессия регистрируемого продукта, воздействие на эту клетку выбранного для исследования со единения и выявление регистрируемого продукта. Экспрессия регистрируемого продукта является показателем способности выбранного для исследования соединения индуцировать опосредуемое нейбластином биологическое действие.

Кроме того, нуклеиновые кислоты и полипептиды нейбластина данного изобретения могут быть использованы в ДНК чипах или белковых чипах или в компьютерных программах для идентификации близких новых генных последовательностей и белков, кодируемых ими, включая аллельные варианты и полиморфные формы, отличающиеся только одним нуклеотидом (ОНП). Такие способы описаны, например, в патентах США №№ 5795716, 5754524, 5733729, 5800992, 5445934, 5525464, каждый из которых включен сюда в качестве ссылки.

Примеры

Пример 1. Способы выделения нуклеиновых кислот нейбластина.

Способ 1. Быстрый скрининг кДНК мозга эмбриона человека на наличие гена нейбластина.

Фрагмент длиной 290 п.н. был идентифицирован в двух высокопроизводительных геномных последовательностях (ВПГП), представленных в ОеиВаик (Инвентарный Νο. АС005038 и АС005051), на основе их гомологии с персефином человека. На последовательности нуклеиновой кислоты фрагмента длиной 290 п.н. были синтезированы два специфичных для нейбластина праймера. Праймер верхней цепи гена нейбластина (ΝΒΝίπΙ.смысловой) имел последовательность 5'-ССТ ООС СаО ССТ АСТ ООО-3' |8Е0 ГО N0: 17]. Праймер нижней цепи гена нейбластина (ΝΒΝίηΐ. антисмысловой) имел последовательность 5'-ААО ОАО АСС ОСТ ТСО ТАО СО-3' [8Ер ГО N0: 18]. С использованием этих праймеров были выполнены 96-луночные ПЦР реакции.

96-луночный основной планшет, содержащий плазмидную ДНК 500000 клонов кДНК, был заполнен примерно по 5000 клонов в лунке. 96-луночный суб-планшет использовали с глицериновой культурой Ε.εοίί ΌΗ10Β, и он содержал по 50 клонов в лунке.

Нуклеиновую кислоту нейбластина идентифицировали в результате трех раундов амплификации с помощью технологии полимеразной цепной реакции (ПЦР); амплификация увеличивала число копий нуклеиновой кислоты в образце.

Скрининг на основном планшете. С помощью метода 96-луночного ПЦР скрининга, описанного выше, был проведен скрининг кДНК мозга эмбриона человека на основном планшете с помощью ген-специфичных праймеров, чтобы выделить кДНК нейбластина человека.

Из соответствующей лунки основного планшета было получено тридцать нанограмм (30 нг) кДНК мозга эмбриона человека (6 нг/мкл; Опдеп Тесйпо1од1ек) и ее вносили в смесь общим объемом 25 мкл, которая содержала следующие реагенты: 0,2 мМ каждого из указанных выше ген-специфичных праймеров (т.е. ΝΒΝίηΐ. смысловой и ΝΒΝίπΙ.антисмысловой). 1 х стандартный буфер ПЦР (Буфер V, Абуапсеб Вю1есйпо1од1ек, ИК), 0,2 мМ дНТФов (Атегкйат-Рйаттас1а), 0,1М ОС-расплав (С1оп1есй ЬаЬогаЮпек, И8А); и 0,5 единиц ДНК полимеразы Тад (5 ед/мкл; Абуапсеб Вю1есйпо1од1ек, ИК).

Термоциклические ПЦР реакции проводили с помощью следующей процедуры и при следующих условиях. Вначале ДНК денатурировали при 94°С в течение 3 мин, и затем следовали 35 циклов денатурации при 94°С по 1 мин каждая, отжиг при 55°С в течение 1 мин, первая элонгация при 72°С в течение 90 с; и конечная элонгация при 72°С в течение 5 мин. Продукты 96 индивидуальных ПЦР реакций анализировали путем гель-электрофореза с использованием 2% агарозного геля, содержащего краситель бромид этидия. Было обнаружено, что выявленный в лунке позитивный ПЦР продукт длиной 102 п.н. соответствует единственному 96луночному суб-планшету.

Фрагмент нуклеиновой кислоты длиной 102 п.н. имел следующую последовательность |81Т) ГО Ν0: 13]:

5’-ССТЕЕССАСССТАСТЕЕССССССЕОССССТЕСЕАССЕСССССЕ С6СТСССССССССТСА6ССАЕСССТЕСТССССАСССАС6ССТАС ЕААССООТСТССТТ-3'

Скрининг на суб-планшетах. Проводили скрининг 96-луночного суб-планшета мозга эмбриона человека с помощью опосредованной ПЦР амплификации, путем помещения 1 мкл глицериновой культуры из соответствующей лунки суб-планшета в смесь с общим объемом 25 мкл, содержащую: 0,2 мМ каждого из двух ген-специфичных праймеров; 1 х стандартный буфер ПЦР (Буфер V, Абуапсеб Вю1есйпо1од1ек, ЦК), 0,2 мМ дНТФов (Атегкйат-Рйаттааа), 0,1М ОС-расплав (С1оп1есй ЬаЬогаЮпек, И8А); и 0,5 единиц ДНК полимеразы Тад (5 ед/мкл; Абуапсеб Вю1есйпо1од1ек, ИК).

Были использованы такие же условия термоциклических ПЦР, как описано для скрининга на основном планшете. 96 индивидуальных ПЦР реакций анализировали на 2% агарозном геле, содержащем бромид этидия, и идентифицировали позитивную лунку, из которой получали фрагмент ПЦР длиной 102 п.н.

ПЦР колоний: 1 мл глицериновой культуры из позитивной лунки суб-планшета разбавляли 1:100 в среде Луриа (ЕВ). 1 мл и 10 мл указанного выше разведения помещали в два отдельных планшета с агаром, содержащим среду Луриа (ЬВ), и 100 мкг/мл карбенициллина. Затем ЬВ планшеты инкубировали в течение ночи при 30°С. 96 колоний из этих планшетов собирали в новый 96-луночный ПЦР планшет, содержащий 0,2 мМ каждого из двух указанных выше ген-специфичных праймеров, 1 х стандартный буфер ПЦР (Буфер V, Айуапсей В1о!есЬпо1од1ек, ИК), 0,2 мМ дНТФов (АтегкйатРЬагтас1а), 0,1М ОС-расплав (С1оп!есй ЬаЬога!опек, И8А); и 0,5 единиц ДНК полимеразы Тач (5 ед/мкл; Айуапсей Вю!есйпо1од1ек, ИК) в конечном объеме 25 мкл.

Были использованы такие же условия термоциклических ПЦР, как описано для скрининга на основном планшете. 96 индивидуальных ПЦР реакций анализировали на 2% агарозном геле, содержащем бромид этидия. Потом идентифицировали позитивную колонию, содержащую фрагмент длиной 102 п.н.

При секвенировании плазмидной ДНК, полученной из этой позитивной колонии, обнаружена кДНК полной длины из 861 п.н. |8ЕО ΙΌ N0: 8]. кДНК кодировала пре-про-нейбластин |8Е0 ΙΌ N0: 9]. Автоматизированное секвенирование ДНК выполняли с помощью набора терминаторов цикла секвенирования В1дЭуе® (РЕ АррНей ВюкуЧетк, И8А). Разделение в секвенирующих гелях проводили на ΛΕΙ Ргкт 377 (РЕ АррНей Вюкуйетк, И8А).

Способ 2. Клонирование кДНК нейбластина мозга человека. Дополнительный способ амплификации кДНК нейбластина полной длины или фрагмента кДНК может быть выполнен с помощью КАСЕ (быстрая амплификация концов кДНК) и специфичных для нейбластина праймеров ИВ№п!. смыслового и ИВ№п!. антисмыслового, описанных выше, в комбинации с праймерами, специфичными для вектора или адаптера, например, используя набор для амплификации ДНК МагаФоп (С1оп!есй ЬаЬога!оис8, и8А, Са!. Ыо. К1802-1).

Готовая полная кДНК мозга человека МагаФоп (С1оп!есй ЬаЬога!ог1ек, И8А, Са!а1одие №. 7400-1) может быть использована для амплификации полноразмерной кДНК нейбластина. К пригодным для амплификации праймерам относятся праймер верхней цепи нейбластина 5'-АТООААСТТООАСТТОО-3' |8ЕО ΙΌ N0: 19] (№В№х1.смысловой) и праймер нижней цепи нейбластина 5'-ТССАТСАСССАССООС-3' |8Е0 ΙΌ N0: 20] (№В№х1.антисмысловой) в комбинации с адаптерным праймером АР1, включенным в набор с готовой кДНК Мага!йоп. Также использовали альтернативный праймер верхней цепи 5'-СТАООАОСССАТОССС-3' |8Е0 ΙΌ N0: 28]. Также может быть использован другой альтернативный праймер нижней цепи 5'-ОАОСОАОСССТСАОСС-3' |8ЕО ΙΌ N0: 33]. Подобным образом, также могут использоваться альтернативные праймеры нижней цепи 8Е0 ΙΌ N0: 24 и 26.

Способ 3. Клонирование кДНК нейбластина мозга человека. Другим способом клонирования кДНК нейбластина является скрининг библиотек мозга взрослого организма и эмбриона человека с помощью одного или большего количества описанных здесь зондов нейбласти на (и как приведено в примере на фигуре 1). К этим библиотекам относятся: λ§111 библиотека мозга человека (С1оп!есй ЬаЬога!ог1ек, И8А, Са!. № НЬ3002Ь); или λ§!11 библиотека мозга эмбриона человека (С1оп!есй ЬаЬогаФпек, И8А, Са!. № НЬ3002Ь).

Способ 4. Быстрый скрининг кДНК эмбриона мыши на ген нейбластина.

Процедура быстрого скрининга на наличие гена нейбластина была выполнена следующим способом. 96-луночный основной планшет, содержащий плазмидную ДНК 500000 клонов кДНК, был заполнен примерно по 5000 клонов на лунку. 96-луночный суб-планшет был использован с глицериновой культурой Е.сой и содержал по 50 клонов на лунку. Было выполнено три раунда опосредованной ПЦР амплификации, чтобы идентифицировать интересующий ген (т.е. ген нейбластина).

Скрининг на основном планшете: проводили скрининг основного планшета, заполненного очищенной кДНК мыши, с помощью ПЦР в 96 лунках, используя ген-специфичные праймеры, чтобы выделить кДНК нейбластина мыши. Были синтезированы следующие два праймера:

(1) С2 праймер нейбластина (ИВ№п!. смысловой): 5'-ООССАССОСТССОАСОАО-3' |8ЕО ΙΌ N0: 21]; и (2) С2ас праймер нейбластина (ИВ№п!. антисмысловой): 5'-ООСООТССАС ООТТСТССАО-3' |8ЕО ΙΌ N0: 22]. С помощью этих двух ген-специфичных праймеров был идентифицирован позитивный ПЦР продукт длиной 220 п.н. Нуклеиновая кислота длиной 220 п. н. имела следующую последовательность |8ЕО ΙΌ N0: 14]:

5’-ССССАССССТССбАССАССТСАТАСеТТТССССТТСТбСАССеб

СТСбТеССССССАССАСеСТСССАССАСЕАТСТСАЕТСТееССАС ССТАСТССЙСССТеЕСССССТАСССТССССТССССССТСССССС ССАТСА0ССАССССТССТЕСССССССАСТСССТАТ6АСССССТСТ ССТТСАТС6АССТСААСАССАССТССАСААСССТССАССССС-3 '

Затем были выполнены ПЦР реакции в 96 лунках следующим образом. Тридцать нанограмм кДНК мозга эмбриона мыши (6 нг/мкл; 0пдеп Тес11по1од1ек) получали из соответствующих лунок основного планшета и вносили в смесь общим объемом 25 мкл, которая также содержала: 0,2 мМ каждого из двух указанных выше ген-специфичных праймеров (т.е. С2 праймера (№N1^. смысловой) и праймера нейбластина С2ас (ИВ№п!.антисмысловой)), 1 х стандартный буфер ПЦР (Буфер V, Аймапсей Вю!есйпо1од1ек, ИК), 0,2 мМ дНТФов (Атегкйат-Рйагтааа), 0,1М ОС-расплав (С1оп!есй ЬаЬога!ог1ек, И8А); и 0,5 единиц ДНК полимеразы Тач (5 ед/мкл; Айуапсей Вю!есйпо1од1ек, ИК).

Были использованы следующие условия ПЦР термоциклирования: начальная денатурация при 94°С в течение 3 мин, с последующими 35 циклами денатурации при 94°С по 1 мин ка ждая, отжига при 55°С в течение 1 мин, элонгации при 72°С в течение 90 с;

и конечной элонгации при 72°С в течение 5 мин. 96 индивидуальных ПЦР реакций анализировали в 2% агарозном геле, содержащем краситель бромид этидия. Было обнаружено, что позитивный ПЦР продукт длиной 220 п.н., выявленный в лунке, соответствует единственному 96-луночному суб-планшету. Затем 96 индивидуальных ПЦР реакций анализировали с помощью электрофореза в 2% агарозном геле, содержащем краситель бромид этидия. Позитивный ПЦР продукт, который был идентифицирован, соответствовал единственной лунке 96луночного суб-планшета.

Скрининг на суб-планшете: проводили скрининг 96-луночного суб-планшета мозга эмбриона мыши с помощью опосредованной ПЦР амплификации, путем помещения 1 мкл глицериновой культуры из соответствующих лунок суб-планшета в смесь с конечным общим объемом 25 мкл, которая содержала: 0,2 мМ каждого из двух указанных выше ген-специфичных праймеров; 1 х стандартный буфер ПЦР (Буфер V, Айтапсей Вю1ес11по1од1е5, ИК), 0,2 мМ дНТФов (Атегайат-Рйаттааа), 0,1М ОСрасплав (С1оШес11 ЬаЬогаЮпех И8А); и 0,5 единиц ДНК полимеразы Тад (5 ед/мкл; Айуапсей В|о1ес11по1оДе5, ИК). ПЦР термоциклирование было выполнено в соответствии с условиями, описанными выше для скрининга основного планшета.

Затем 96 индивидуальных ПЦР реакций анализировали на 2% агарозном геле, содержащем бромид этидия и идентифицировали позитивную лунку, в которой получали фрагмент длиной 220 п. н.

ПЦР колоний: один мл глицериновой культуры из позитивной лунки суб-планшета разбавляли 1:100 в среде Луриа (ЬВ). Затем один мл и 10 мл указанного выше разведения помещали в два отдельных ЬВ планшета, содержащих 100 мкг/мл карбенициллина, и инкубировали в течение ночи при 30°С. Были выделены в общей сложности 96 колоний и перенесены в 96-луночный ПЦР планшет, содержащий: 0,2 мМ каждого из двух указанных выше ген-специфичных праймеров, 1 х стандартный буфер ПЦР (Буфер V, Айуапсей Вю1ес11по1од1е5, ИК), 0,2 мМ дНТФов (Атегайат-Рйатташа), 0,1М ОС-расплав (С1оп1есй ЬаЬогаЮпех И8А); и 0,5 единиц ДНК полимеразы Тад (5 ед/мкл; Айуапсей В1о1есйпо1од1е8, ИК) в конечном объеме 25 мкл.

ПЦР термоциклирование было выполнено в соответствии с условиями, описанными выше (см. скрининг на основном планшете ниже). 96 индивидуальных ПЦР реакций анализировали с помощью гель-электрофореза в 2% агарозном геле, содержащем бромид этидия. Идентифицировали позитивную колонию по наличию фрагмента длиной 220 п.н. Из этой позитивной колонии была получена плазмидная ДНК. Клон секвенировали с помощью автоматизированного секвенирования ДНК, используя набор терминаторов цикла секвенирования В1дБуе® (РЕ Аррйей ВюклЫетх И8А) с ДНК полимеразой АтрйТад. Разделение в секвениру-ющих гелях проводили на АВ1 РгЬт 377 (РЕ Аррйей ВюклЫетх И8А). В полученной последовательности этого клона выявлена полноразмерная кДНК из 2136 п.н. |8ЕЦ ГО N0: 15]. кДНК включает в себя открытую рамку считывания с рассчитанной аминокислотной последовательностью, показанной в 8ЕЦ ГО N0: 16, которая кодирует полипептид пре-про-нейбластина.

Пример 2. Клонирование геномной последовательности нейбластина.

Как обсуждалось выше, заявители идентифицировали фрагмент нуклеиновой кислоты длиной 290 п.н. в двух ИБХ клонах человека с помощью элементов ОепВапк (с инвентарными №. АС005038 и АС005051), которые имели области гомологии с персефином и с фланкирующими последовательностями персефина. Заявители использовали 861 п.н. предсказанной последовательности, описанной выше, чтобы разработать дополнительные праймеры с целью клонирования нуклеиновой кислоты, кодирующей дополнительные нуклеиновые кислоты нейбластина, с помощью компьютерной программы Ьакетдепе (□ХАЗии, 1пс.). Были использованы две пары праймеров, чтобы клонировать ген нейбластина с помощью ПЦР реакций на геномной ДНК. Две пары праймеров показаны ниже.

Пара праймеров №. 1

5'-ССА АдС ССА ССТ ддд ТдС ССТ СТТ ТСТ СС-3' (смысловой) |8ЕС ГО N0: 23].

5'-САТ САС ССА ССд дСА ддд дСС ТСТ САд-3' (антисмысловой) |8ЕЦ ГО N0: 24].

Пара праймеров №. 2 5'-дАдСССА1дСССддССТдАТСТСАдСС СдА ддАСА-3' (смысловой) |8ЕЦ ГО N0: 25].

5'-СССТддСТдАддССдСТддСТАдТдддАС ТСТдС-3' (антисмысловой) |8ЕЦ ГО N0: 26].

Используя пару праймеров №.1, амплифицировали фрагмент ДНК длиной 887 п.н. из препарата геномной ДНК человека, приобретенной в С1оп(есй ЬаЬотаФпек (Кат. №. 6550-1).

Протокол ПЦР: ПЦР была выполнена с использованием высокоточной ПЦР системы Ехрапй™ (Воейппдет Маппйепп) с буфером 1. В реакционную смесь для ПЦР добавляли 5% диметилсульфоксида (ДМСО) и 17,5 пмоль каждого из дНТФ в общем объеме 50 мкл. Термоциклирование выполняли с этапом предварительной денатурации при 94°С в течение 2 мин, с последующими 35 двухстадийными циклами при 94°С в течение 10 с и при 68°С в течение 1 мин, соответственно. Термоциклирование заканчивали инкубацией при 68°С в течение 5 мин. Термоциклирование проводили в термоциклере ДНК РТС-225 Епдте Те(гай (йегтосу с1ег (М1 Кс5саге11. МА). Продукты ПЦР анализировали с помощью электрофореза в 2% агарозе (ЕМС) и затем фотографировали.

Фрагмент длиной 887 п.н., амплифицированный на геномной ДНК человека с помощью пары праймеров № 1, клонировали в векторе рСКИ (1пуЦгодеп) и использовали для трансформации компетентных клеток Е.соН ХЬ 1В1ие (81га1адепе). Полученная в результате плазмида, названная нейбластин-2, была секвенирована с помощью термосеквеназы (Атегкйат Рйагтааа В1о!есй). Продукты секвенирования анализировали с помощью электрофореза на автоматическом секвенаторе АЬЕЕхргекк (Атегзйат Рйагтас1а Вю1ес11).

Фрагменты, полученные ПЦР амплификацией геномной ДНК человека с помощью второй пары праймеров (пара праймеров № 2, указанная выше), секвенировали, при этом выявили дополнительную область из 42 п.н. на 3'-конце открытой рамки считывания. Последовательность полной длины анализировали путем ее сравнения с последовательностями нуклеиновых кислот других нейротрофических факторов, а также путем картирования экзон-интронных границ с помощью компьютерных программ нахождения генов, которые идентифицируют возможные соединения при сплайсинге и области с высокой вероятностью кодирования, используя компьютерные программы №1депе и Сепе Магк (Вгипак е! а1., 1. Мо1. Вю1., 1991, 220, 49-65); Вогобо^ку е! а1., №с1Ас1б5 Кез., 1995, 23, 3554-62). Границы экзонов-интронов были подтверждены с помощью кДНК, полученной при быстром скрининге, описанном выше.

Как показано на фиг.7, полученный в результате ген нейбластина имеет два экзона, разделенных интроном длиной 70 п. н. Вместе экэоны содержат предсказанную аминокислотную последовательность полипептида нейбластина полной длины. Предсказанная кДНК |5>ЕО ГО ΝΟ: 3] содержит открытую рамку считывания (ОРС), кодирующую 238 аминокислотных остатков |5>ЕО ГО ΝΟ: 4]. Клон нейбластин-2 содержал полную кодирующую последовательность про-нейбластина. Аминокислотная последовательность, кодируемая геном, проявляла высокую гомологию с тремя белками, персефином, нейртурином и СИИЕ.

Пример 3. Экспрессия нуклеиновых кислот нейбластина.

Экспрессия РНК нейбластина была выявлена как в нервной, так и в ненервной ткани у грызунов и человека и на различных стадиях развития молодого и взрослого организма с помощью способов, описанных ниже.

Способ выявления экспрессии РНК нейбластина с помощью ОТ-ПЦР

На основании последовательности ДНК нейбластина, обозначенной 8ЕО ГО ΝΟ: 1, были синтезированы следующие праймеры:

(1) праймер нейбластина С2 5'-ССССАС СССТСССАССАС-3' ^ΗΕ) ГО ΝΟ: 21] и (2) праймер нейбластина С2ас 5'-ССС ССТССАСССТТСТССАС-3' [8Ер ГО ΝΟ: 22].

Этот набор праймеров был использован для ОТ-ПЦР амплификации фрагмента ДНК на мРНК целого мозга взрослого организма и эмбриона человека. Среди фрагментов ДНК, полученных с помощью этой реакции, один был длиной 220 п.н. Идентификация этого фрагмента ДНК длиной 220 п.н. подтвердила, что ген нейбластина экспрессируется в тканях мозга взрослого организма и эмбриона. Фрагмент ДНК длиной 220 п.н. был также амплифицирован на геномной ДНК с использованием этих праймеров.

Способ выявления экспрессии РНК нейбластина с помощью нозерн-блот гибридизации

Нозерн блоты с полиА⁺ РНК из тканей взрослого человека были получены от коммерческого поставщика (С1оп(ес11 ЕаЬогаЮпех, и8А) и исследованы с помощью ³²Р-меченого зонда нейбластиновой кДНК. Меченая кДНК нейбластина была получена в соответствии со способом, описанным выше в примере 1.

Подготовка зондов: фрагмент нуклеиновой кислоты нейбластина (нуклеотиды 296-819 8ЕО ГО ΝΟ: 8) метили с помощью набора для мечения Кеб|рпте II (Атегзйат; Катал. №.

КРЮ633) для того, чтобы использовать в качестве зонда при гибридизации, как рекомендовано изготовителем. Коротко, образец ДНК разбавляли до концентрации 2,5-25 нг в 45 мкл 10 мМ буфера ТЭ (10 мМ трис-НС1, рН 8,0, 1 мМ ЭДТА). Затем ДНК денатурировали нагреванием образца до 95-100°С в течение 5 мин в кипящей водяной бане, быстро охлаждали образец, помещая его в лед на 5 мин, и затем его недолго центрифугировали, чтобы содержимое переместилось ко дну реакционной пробирки. Все количество денатурированной ДНК добавляли вместе с 5 мкл [³²Р]дЦТФ Кеббие (Атегзйат Рйагтааа В1о!есй Ь1б.) в реакционную пробирку, содержащую буферный раствор дАТФ, дГТФ, дТТФ, свободный от экзонуклеазы фермент Кленова и случайный праймер в сухой стабилизированной форме. Раствор перемешивали пипетированием вверх и вниз 2 раза, вращая кончик пипетки в растворе, и реакционную смесь инкубировали при 37°С в течение 10 мин. Реакцию мечения останавливали добавлением 5 мкл 0,2М ЭДТА. Для использования в качестве зонда для гибридизации меченую ДНК денатурировали до одноцепочечных нитей путем нагревания образца ДНК до 95-100°С в течение 5 мин, затем мгновенно охлаждая образец ДНК на льду в течение 5 мин. Пробирку центрифугировали, и ее содержимое хорошо перемешивали. В конце одноцепочечный ДНК зонд очищали с помощью набора для удаления нуклеотидов (фадеп).

Способы гибридизации: готовые нозерн блоты были приобретены от коммерческого поставщика (МиШр1е Т1ккие ΝογΙΙκγπ ΒΙοΙκ, С1оп1ес11 ^аЬο^аΐο^^еκ, И8А, Νο. по каталогу 7760-1 и 7769-1), и гибридизацию проводили в соответствии с инструкциями изготовителя, используя ³²Р-меченый нейбластиновый зонд, приготовленный как описано выше. Для гибридизации использовали раствор ЕхргеккНуЬ (СкШесБ Ьа^гакпек, И8А) и применяли концентрацию меченого зонда примерно 3 нг/мл. Раствор ЕхргеккНуЬ нагревали до 68°С и затем перемешивали, чтобы растворить какой бы то ни было осадок. Каждую нозерн блот мембрану (10х10 см) предгибридизовали по меньшей мере в 5 мл раствора ЕхргеккНуЬ при 68°С в течение 30 мин в термостате для гибридизации НуЬа1й в соответствии с инструкциями производителя. ³²Рмеченый нейбластиновый зонд денатурировали при 95-100°С в течение 2 мин и затем быстро охлаждали на льду. Четырнадцать микролитров (14 мкл) меченого зонда добавляли к 5 мл свежего ЕхргеккНуЬ и тщательно перемешивали. Раствор ЕхргеккНуЬ, использованный в предварительной гибридизации, заменяли путем равномерного распределения над блотами 5 мл свежего раствора ЕхргеккНуЬ, содержащего меченый зонд ДНК. Блоты инкубировали при 68°С в течение 1 ч в термостате для гибридизации НуЬа1й. После инкубации блоты смывали и несколько раз промывали в мягких условиях (2 х 88С буфер, содержащий 0,05% 8Ό8 при комнатной температуре) с последующим промыванием в жестких условиях (0,1 х 88С, содержащий 0,1% 8Ό8 при 50°С) [20Х 88С представляет собой 0,3М №10/0,3М цитрат №, рН 7,0]. Блоты экспонировали с пленкой НурегШт МР (АтегкБат РБагтас1а Β^οΐеοй Ый.) при -80°С, используя усиливающие экраны.

Результаты экспериментов по нозерн блот гибридизации представлены на фиг.1. Фиг.1А (слева) и фиг.1В (справа) представляют собой нозерн блоты полиА⁺ РНК, которые были тестированы с помощью ³²Р-меченого зонда кДНК нейбластина, как описано в примере 3. Маркеры представлены нуклеотидами размером 1,35 тысяч пар нуклеотидов (т.п.н.), 2,4 т.п.н., 4,4 т.п.н., 7,5 т.п.н. и 9,5 т.п.н. Мембрана, представленная на фиг. 1А, была получена с мРНК, экстрагированной из различных тканей взрослого человека. На основании результатов анализа с помощью нозерн блот гибридизации заявители сделали вывод, что мРНК нейбластина экспрессируется во многих тканях взрослого человека. Самый высокий уровень экспрессии нейбластина выявлен в сердце, скелетной мышце и в поджелудочной железе. Мембрана, показанная на фиг. 1В, была получена с РНК, экстрагированной из различных районов головного мозга взрослого человека. В пределах головного мозга взрослого организма самый высокий уровень экспрессии наблюдается в хвостатом ядре и в таламусе. Предпочтительной формой мРНК нейбластина, экспрессируемой в мозге был транскрипт мРНК длиной примерно 5 т.п.н.

Способ выявления экспрессии мРНК нейбластина с помощью ίπ кйн гибридизации в тканях

Чтобы измерить экспрессию РНК нейбластина в тканях животных, например тканях грызунов, с помощью антисмыслового нейбластинового зонда, использовали следующие способы.

Экспрессия у мышей

Подготовка образцов ткани: мышей (В&К Ишуегка1, ЗкскМт, 8\\'ейеп) забивали во время беременности путем смещения шейных позвонков на 13,5 или 18,5 день беременности. При вскрытии в стерильных условиях извлекали эмбрионы и сразу же погружали в раствор 0,1М фосфатного буфера (ФБ), содержащего 4% параформальдегида (ПФА), на 24-30 часов и затем извлекали из ПФА и хранили в ФСБ (фосфатно-солевой буфер). Ткань готовили для получения срезов путем погружения ткани в раствор 30% сахарозы и затем заключали в блоки Т1ккие ТесП (О.С.Т. Сοтрοипй, 8акига Ете1ек И8А, СА). Делали шесть серий коронарных или сагиттальных срезов (12 мкм каждый) в криостате и размораживали, помещая на положительно заряженные предметные стекла. Головы/мозг новорожденных (П1, П7) фиксировали, следуя такому же протоколу, как и для эмбриональных стадий, и ткани мозга взрослого организма рассекали, сразу же замораживали на сухом льду и делали срезы в криостате без какоголибо предварительного заключения в блоки.

Подготовка рибозондов нейбластина: антисмысловой нейбластиновый РНК зонд (ниже рибозонд нейбластина) получали следующим образом. Нуклеотиды 1109-1863 последовательности кДНК нейбластина мыши [8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 15] субклонировали в векторе Β1ие8с^^рΐ (§1га(адеше). Полученную в результате плазмиду разрезали для получения линейной ДНК с помощью рестрикционной эндонуклеазы ΕсοК1. ЕтоК! фрагмент ДНК транскрибировали ίπ νίίτο с помощью РНК полимеразы Т3 и набора для мечения РНК дигоксигенином (ДИГ) в соответствии с инструкциями производителя (ΒοеБгшдег МаппНенп).

Гибридизация: криостатированные срезы фиксировали в течение 10 мин в 4% ПФА, обрабатывали в течение 5 мин 10 мг/мл протеиназы К, последовательно дегидратировали в 70% и 95% этаноле в течение 5 и 2 мин, соответственно, и затем давали высохнуть на воздухе. Буфер для гибридизации (50% деионизованного формамида, 10% раствора сульфата декстрана 50% концентрации, 1% раствор Денхардта, 250 мкг/мл дрожжевой тРНК, 0,3М №С1, 20 мМ трис-НС1 (рН 8), 5 мМ ЭДТА, 10 мМ NаРΟ₄, 1% саркозил), содержащий 1 мкг/мл ДИГ-меченого зонда, нагревали при 80°С в течение 2 мин и наносили на срезы. Затем срезы покрывали па рафильмом и инкубировали при 55°С в течение 16-18 ч.

На следующий день срезы промывали в условиях высокой жесткости (2 х ББС, содержащий 50% формамид) при 55°С в течение 30 мин и затем промывали в буфере для РНКазы и инкубировали с 20 мкг/мл РНКазыА в течение 30 мин при 37°С. Чтобы выявить ДИГ-меченый зонд, срезы предварительно инкубировали в блокирующем растворе (ФСБ, содержащий 0,1% твина-20 и 10% инактивированной нагреванием сыворотки козы) в течение 1 ч и затем инкубировали в течение ночи при 4°С с антиДИГ антителами, соединенными со щелочной фосфатазой, в разведении 1:5000 (Воейгтдег МаппЪет). На следующий день для каждого среза проводили четыре двухчасовые промывки в ФСБ, содержащем 0,1% твин-20, и затем проводили две десятиминутные промывки в буфере №ТМТ (100 мМ №С1, 100 мМ трис-НС1 (рН 9,5), 50 мМ МдС1₂, 0,1% твин-20). Затем срезы инкубировали в ВМ-фиолетовом субстрате, содержащем 0,5 мг/мл левамизола в течение 48 ч. Цветную реакцию останавливали промыванием в ФСБ. Срезы сушили на воздухе и покрывали покровным стеклом с ΌΡΧ (КЕВ0-1аЬ, Б\\'е6еп).

Результаты реакций ш κίΐιι гибридизаций представлены в табл. 1.

Таблица 1. Экспрессия нейбластина у мышей

Структура	Э13.5	Э18.5	П1	П7	Взрослый организм
Передний мозг	++
Вентральная часть среднего мозга	-
Ганглии дорсальных корешков	++
Спинной мозг	+
Сетчатка		+++	+++	+
Обонятельная доля		++	++	++
Пульпа зуба		++	++	+
Ганглии тройничного нерва		++	++	++
Полосатое тело		+	+	++
Кора головного мозга		++	++	++	+
Зубчатая извилина				++	+

Как показано в табл. 1, на 13,5 эмбриональный день (Э13,5) нейбластин экспрессировался в спинном мозге и в заднем мозге и слабо в переднем мозге. Экспрессия нейбластина также была выявлена в развивающейся сетчатке и в чувствительных ганглиях (ганглии дорсальных корешков и ганглии тройничного нерва (V)). Вне нервной системы слабый сигнал был обнаружен в почке, легком и кишечнике, что свидетельствует о том, что нейбластин также экспрессируется в этих тканях.

На 18,5 эмбриональный день (Э18,5) более заметно нейбластин экспрессировался в ганглии тройничного нерва (V). Экспрессия нейбластина была также выявлена в сетчатке, полосатом теле и коре головного мозга. Кроме того, экспрессия наблюдалась в зачатке зуба.

Снова обращаясь к табл. 1, увеличенная экспрессия нейбластина от временной точки, соответствующей Э18,5, до постнатальных дней 1 и 7 наблюдалась в коре головного мозга, полосатом теле и ганглии тройничного нерва (V). Экспрессия нейбластина была более заметной в наружных слоях коры головного мозга, чем во внутренних слоях коры головного мозга. На П7 экспрессия была обнаружена в тех же структурах, как и на 1 день, дополнительно экспрессия нейбластина была обнаружена в гиппокампе, особенно в зубчатой извилине и в мозжечке. В мозге взрослых мышей нейбластин строго экспрессировался в зубчатой извилине при очень низких или нерегистрируемых уровнях экспрессии нейбластина в других тестируемых тканях.

Экспрессия у крыс

Следующий эксперимент описывает гибридизацию тканей крыс с олигодезоксинуклеотидным нейбластиновым антисмысловым зондом, меченым щелочной фосфатазой.

Подготовка образцов тканей: эмбрионы крыс (Э14) получали от беременных крыс \М1к1аг (Мо11едааг6 Вгеебшд, Эептагк) после анестезии пентобарбиталом. Крыс в постнатальный период (П0, П7, взрослых) забивали декапитацией. Вскрытый мозг и целые головы сразу же погружали в холодный 0,9% №С1, свежезамораживали и готовили срезы по 20 мкм в криостате (коронарные и сагиттальные срезы, 10 серий).

1п 811и гибридизация: Две серии срезов гибридизовали, используя антисмысловой олигодезоксинуклеотидный зонд, коньюгированный с щелочной фосфатазой (ЩФ) (5'№А СОТ СОТ ССС ТСС ССС ССС ССА АСА ССС С-3' [БЕС ΙΌ N0: 27], 011§о. №. 164675, ^NА Тесйио1оду, Оептагк). Этот зонд комплементарен основаниям с 1140 до 1169 кДНК нейбластина мыши БЕС ΙΌ N0: 15.

Перед гибридизацией срезы сушили на воздухе при комнатной температуре, нагревали до 55°С в течение 10 мин и затем обрабатывали 96% этанолом при 4°С в течение ночи. Затем срезы сушили на воздухе и инкубировали в среде для гибридизации (5,0 пмоль зонда/мл) в течение ночи при 39°С (Ршкеп е1 а1., №игокск, 1992, 47, 105-113; \\ек! е! а1., 1.Сотр.№иго1., 1996, 370, 11-22).

Пост-гибридизационная обработка состояла из четырех тридцатиминутных промывок в 1 х ББС (0,15М №С1, 0,015М цитрат №) при 55°С с последующими тремя десятиминутными промывками в трис-НС1, рН 9,5, при комнатной температуре перед нанесением проявителя ЩФ. Проявитель ЩФ готовили непосредственно перед использованием, и он содержал нитросиний тетразолий СВТ, Бщта), 5-бром, 4-хлор, 3индолилфосфат (ВС1Р, Б1дта) и трис-НС1-МдС1₂ буфер, рН 9,5 (Ршкеп е1 а1., №игокск, 1992, 47, 105-113). Проявление ЩФ проходило в темноте при комнатной температуре в течение 48 ч. Цветную реакцию останавливали промыванием срезов в дистиллированной воде. Срезы дегидратировали градиентными промывками ацетоном, размягчали в ксилолфенол креозоте (А11с11ет, ИК), очищали в ксилоле и покрывали покровными стеклами, используя ЕикШ (В1е & Ветрен, Эептагк).

Контрольные реакции состояли из (1) предварительной обработки срезов РНКазойА (50 мкг/мл, Ркагтааа, 8^ейеп) перед гибридизацией; (2) гибридизации срезов со стократным избытком немеченого зонда; и (3) гибридизации срезов только в присутствии одного буфера для гибридизации. Результаты реакций гибридизации представлены в табл. 2.

Таблица 2. Экспрессия нейбластина у крыс

Структура	Э14	П0/П1	П7	Взрослый организм
Передний мозг	++
Вентральная часть среднего мозга	-
Ганглии дорсальных корешков	++
Спинной мозг	+
Сетчатка	+
Обонятельная доля	(+)	++	++
Мозжечок		+	++	+
Ганглии тройничного нерва		++	++
Полосатое тело		+	+(+)
Кора головного мозга	(+)	++	++	+
Гиппокамп		(+)	++	++

В эмбрионах крыс на 14 эмбриональный день (Э14) нейбластин слабо экспрессировался в переднем мозге, в заднем мозге и в спинном мозге. мРНК нейбластина была также выявлена в глазе (сетчатка), ганглиях дорсальных корешков, ганглиях тройничного нерва (V) и в почках, легких, сердце, печени и кишечнике. У новорожденных крыс (ПО) заметная экспрессия нейбластина была в коре головного мозга и полосатом теле. Экспрессия нейбластина была также выявлена в обонятельной доле и в гиппокампе. У 7-дневных крыс (П7) нейбластин экспрессировался в коре головного мозга, полосатом теле, обонятельной доле и в мозжечке. Заметный сигнал был виден в гиппокампе. У взрослых крыс в большинстве областей мозга были выявлены очень низкие или нерегистрируемые уровни экспрессии нейбластина. Слабые сигналы были выявлены в таламическом ядре, и заметная экспрессия нейбластина была выявлена в гиппокампе.

Пример 4. Полипептиды нейбластина.

Открытая рамка считывания или кодирующий район (КДП), обозначенный 8ЕЦ ΙΌ N0: 8, кодирует пре-про-полипептид (называемый пре-про-нейбластин). Аминокислотная последовательность, предсказанная на основе открытой рамки считывания, показана в 8ЕЦ ΙΌ N0: 9. На основании 8ЕЦ ΙΌ N0: 9 были идентифицированы три варианта полипептидов нейбластина. К этим вариантам относятся:

(ί) полипептид, называемый здесь ^№N140, который имеет аминокислотную последовательность, указанную в 8ЕЦ ΙΌ N0: 10;

(ίί) полипептид, называемый здесь ^№N116, который имеет аминокислотную последовательность, указанную в 8ЕЦ ΙΌ N0: 11; и (ίίί) полипептид, называемый здесь ^№N113, который имеет аминокислотную последовательность, указанную в 8ЕЦ ΙΌ N0: 12;

Сходным образом, на основании кодирующего района (КДП), указанного в 8ЕЦ ΙΌ N0: 3, который кодирует пре-про-полипептид, имеющий аминокислотную последовательность (указанную в 8ЕЦ ΙΌ N0: 4), были идентифицированы три варианта нейбластина. К этим вариантам относятся:

(ί) полипептид, который имеет аминокислотную последовательность, указанную в 8ЕЦ ΙΌ N0: 5;

(ίί) полипептид, который имеет аминокислотную последовательность, указанную в 8ЕЦ ΙΌ N0: 6; и (ίίί) полипептид, который имеет аминокислотную последовательность, указанную в 8ЕЦ ΙΌ N0: 7;

На основании множественного совмещения последовательностей, которое базируется на С1и8(а1 V (1.75), 8ЕЦ ΙΌ N0: 9 была совмещена с аминокислотными последовательностями СОХЕ, персефина и нейртурина. Это совмещение показано в табл. 3.

Таблица 3. Сравнение аминокислотной последовательности нейбластина с персефином, нейртурином и СЭКЕ

Полноразмерный нейотурин	--------------------М0ВИКАААЕА5УЬС35УЬ51ИМСК£СЬЬЪ£НВЬСРА
Нейбластин	МЕЬСЬССЕЗТЬЗНСРИРПК0РАЬИРТЬААЬАЕЬ53УАЕАЗЬ55АРК5РАР£<ЕСРРР
Полноразмерный персефин
Полноразмерный 3ΡΝΓ человека	-----МКЕНРУУАУСЕУЕЕНТАЗАГРЕРАСКЯРРЕАРАЕРЯЗЕЗКЯЯАРГАЕЗЗРЗ
Полноразмерный нейртурин	ЬУРЬНКЬ₽К.ТЬОАК1АВЬАОУйАЬЬОСАРОАМЕЬ&ЕЕТРНАСЯРРСРаВНАС₽айК
Нейбластин	УЬА8РАСНЬР2СКТАКНСЗСРАККРРР<2Р5КРАРРРРАРРЗА1.РР.ССБ1ААЕАССРС
Полноразмерный пеосефин	-МАУСКЕЕЕСЗЕЕЪЕ5Ы2ЕС-0СНСРРАЯСУРУАРСЕГЗЗЕ<2УАКАССТНЕЗТНЯРЕ
Полноразмерный 3ΡΝΓ человека	ΝΜΡΕΡΥΡΡΟΓΡΡνΜΡΕΙΩΑΤΙΚΒΕΚΕΒΡΡΚαΜΑνΕΡΡΚΕΡΝΡΟΑΑΑΑΝΡΞΝΕΚεκε
Полнора змерный нейртурин	КАРАКЬЗАКРСЗЬРЕЬЕУЯУЗЕЬСЬСУАЗОЕТУЬГЯУСАОАСЕА-ААЕУУОЬСЬКР
Нейбластин	ЗВАВААЗАаССВЬВЗСЕУРУаАЬСЕСНВЗРЕЬУВГКГСЗеЗСЯК-АВЗРНРЕЗЕАЗ
Полноразмерный персефин	АРЬРНАЕЗСРСОЬНЗЬТЬЗУАЕЬСЪаУАЗЕЕКУТтУСАСЗСРР.ОАКТОНСЬАЬАР.
Полноразмерный 3ΡΝΓ человека	ВВЗОВСКМКССУЕТА1НЕНУТРЬаЬСУЕТКЕЕЕ1га¥СЗСЗСРА-АЕТТУРК1ЕКЫ
	* * ; * *“*::.*:“·;*:*:* ’ *
Полноразмерный нейртурин	ЕЯ0ВВРЕРВЕ-ЯУЯАйРССМ>ТАУЕРЕУЗГЕРАН8ВУНТУНЕЬ5АВЕСАСУ-
Нейбластин	ЬЫЗАЗАЕВРРРСЗВРУЗОРССКРТВУЕ-АУЗЕМРУМЗТИВТУРВЕЗАТАСССЕС
Полноразмерный персефин	Е<2<ЗОСЕАНЗС--------РССНРТВУТ-РУАЕЕРРВНКМОКЕРОЕЗАААСОСбС
Полноразмерный СЭМ·- человека	ЕЗКЫаЯЬУЗР----КУС0АССКР1АГРРРЕ8ГЕРРЫЕУУН1ЕВКНЗАКВССС1-
	* . *.*

* показывает положения, которые имеют отдельный полностью консервативный остаток;

: показывает, что одна из следующих строгих групп полностью консервативна: - 8ТА, \ЕСЖ NН^К, N^Е^, РНКК, ΜΙβν, МШЕ, НУ, ЕУ^;

• показывает, что одна из следующих менее строгих групп полностью консервативна:- С8А, АТО, 8АС, 8ТНК, 8ТРА, 8С№, 8N^Е^К, \Г)Е(,)НК_ №рНРК, νΠΜ, ΗΕΥ.

На основании совмещения аминокислотных последовательностей, показанных в табл. 3, можно видеть, что нейбластин имеет семь кон49 сервативных остатков в положениях, которые консервативны в пределах надсемейства ΤΟΕ-β. В одном варианте предпочтительный полипептид нейбластина содержит (семь) цистеи-нов, консервативных как в 8ЕО ΙΌ N0: 2 в положениях 8, 35, 39, 72, 73, 101 и 103, или как в 8Е0 ΙΌ N0: 4 и 9 в положениях 43, 70, 74, 107, 108, 136 и 138. Известно, что эти семь консервативных остатков цистеина в надсемействе ΤΟΕ-β образуют внутримономерные дисульфидные связи (предполагаемые, например, в 8Е0 ΙΌ N0: 2 между остатками цистеина 8-73, 35-101 и 39-103, и, например, в 8Е0 ΙΌ N0: 4 и 9 между остатками цистеина 43-108, 70-136 и 74-138) и одну дисульфидную связь между мономерами (предполагаемую, например, в 8Е0 ΙΌ N0: 2 между остатками цистеина 72-72, и, например, в 8Е0 ΙΌ N0: 4 и 9 между остатками цистеина 107-107), которая вместе с протяженным бета районом нити составляет консервативный структурный мотив надсемейства ΤΟΕ-β. См., например, Иаорт еί а1., Ргсйетк, 1993, 17, 176192.

На основании этого совмещения последовательностей было показано, что нейбластин является членом ОИ№ субсемейства нейротрофических факторов (Е6Ь6-ЕК(¥/Е)С8б8сРхССВР-8АххСОС, фингерпринт субсемейства подчеркнутый в табл. 3).

Была рассчитана гомология нейбластина и других представителей семейства ОИ№ и результаты представлены ниже в табл. 4.

Таблица 4. Гомология полипептидов нейбластина с другими представителями семейства

	Зрелый белок NВN140	Зрелый белок NВN113
	Гомология	Гомология полноразмерных пептидов	Гомология	Гомология полноразмерных пептидов
Нейротрофический фактор	Идентичность	Перекрывание (ак)	Строгая гомология	Идентичность	Идентичность	Перекрывание (ак)	Строгая гомология	Идентичность
(И)^'	34% (47/137)	137	48% (67/137)	31,9%	36% (41/111)	111	52% (59/111)	29,5%
NΤN	48% (61/127)	127	56% (72/127)	36,9%	49% (56/114)	114	57% (66/114)	44,7%
Р8Р	44% (55/125)	125	56% (71/125)	36,9%	45% (51/111)	111	57% (65/111)	44,3%
ША	31% (25/81)	81	-	25,2%	31% (25/81)	81	-	22,5%
ΤΟΕ-β2	23% (17/73)	73	-	18,5%	23% (17/73)	73	-	20,2%

= нейротрофический фактор, полученный из линии глиальных клеток. NΒN = нейртурин

Р8Р = персефин

ΙΗΑ = ингибин-α

ΤΟΕ-β2 = трансформирующий фактор роста - β2.

Строгая гомология указывает на то, что следующие строгие группы являются консервативными: 8ΤΑ, МПА МЮА МАО, ΟΗΠΕ, ΜΙΕν, ΜΙΕΕ, ΗΥ, ΕΥΑ.

Пример 5. Получение нейбластина.

Авторы получили нейбластин в обоих типах клеток эукариотических и прокариотических, как описано ниже.

Экспрессирующие векторы

Полноразмерная кДНК, кодирующая нейбластин, была встроена в эукариотический экспрессирующий вектор ρΌΝΙΖ. Этот вектор был создан путем клонирования промотора ИЬС человека в модифицированную версию ρс^NΑ3.1/ Ζеο. Немодифицированный ρс^NΑ3.1/Ζеο доступен для коммерческого приобретения (ΙιινίίΓοдеп). Модифицированный ρс^NΑ3.1/Ζеο меньше чем исходный вектор, поскольку из него были удалены ген ампициллина (положения с 3933 до 5015) и последовательность в положениях от 2838 до 3134. В этой модифицированной версии ρс^NΑ3.1/Ζеο промотор СМV был заменен промотором ИЬС из ρΤΤΙ-8 (1ойапкеп еί а1., ЕЕВ8 БеИ., 1990, 267, 289-294), давая в результате ρυόίΐζ.

Экспрессия в клетках млекопитающих

Затем вектор ρυόίΙΖ, содержащий кодирующие последовательности нейбластина, был трансфицирован в линию клеток млекопитающих Н1В5, которая является иммортализованной линией нервных клеток крысы (ВепГгапх еί а1., Се11, 1991, 66, 713-729). Было создано несколько линий клеток Н1В5, стабильно экспрессирующих нейбластин (как было определено с помощью ОТ-ПЦР). В одной из этих стабильных клеточных линий Η^В5ρυЬ^1ζNВN22 экспрессия была подтверждена с помощью гибридизации суммарной РНК на нозерн блоте с нейбластиновым зондом, меченым ³²Р. Результаты этих исследований показаны на фиг. 2. Затем

Н1В5риЫк№№2 была использована в качестве источника нейбластина для изучения нейротрофической активности нейбластина.

На фиг. 2 показана экспрессия кДНК нейбластина в клоне Н1В5риЫк№№2 (т.е. нозерн блот анализ с помощью ³²Р-меченой нейбластиновой кДНК данного изобретения, как описано ниже). Блот был приготовлен с помощью суммарной РНК, экстрагированной из нетрансфицированных клеток Н1В5, клеток Н1В5риЫ1х

NВN22 и Н|В5риЬ|1хСЭХР 14, соответственно, как показано. На блоте указаны положения 288 и 188 рРНК полос, соответствующих 4,1 т.п.н. и 1,9 т. п.н, соответственно.

Как показано на фиг. 3, антитела, индуцированные против полипептидов производных нейбластина, также узнавали белок размером примерно 13 килодальтон (кД) в кондиционированной среде клона Н|В5риЫ1хНВ№2. но не в среде нетрансфицированных клеток Н1В5 (сравни пример 6).

Были определены предсказанные молекулярные массы немодифицированных (т.е. при отсутствии пост-трансляционных модификаций) полипептидов нейбластина NВN140 |8ЕО ГО ΝΟ: 10], ΝΗΝ116 |8ЕС) ГО ΝΟ: 11] и ИВМ 13 |8ЕС) ГО ΝΟ: 12] - 14,7 килодальтон (кД), 12,4 кД и 12,1 кД, соответственно.

Способы

Нозерн блот с суммарной РНК (10 мкг) из нетрансфицированных клеток Н1В5 и клона Н|В5риЫ1хНВ№2 был приготовлен путем электрофореза в 0,8% формальдегидно-агарозном геле и блотированием на нейлоновую мембрану (ЭигаВпе, 81га1адепе). Блот гибридизовали и промывали, как описано в примере 3, с использованием ³²Р-меченого зонда размером 1,3 т.п. н., полученного путем случайного мечения, охватывающего 8ЕО ГО ΝΟ: 8 и дополнительные нуклеотиды из 5'НТР и 3'НТР кДНК нейбластина. Блот экспонировали с НурегШт МР (Атегкйат) при -80°С, используя усиливающие экраны.

Кондиционированную среду от клеток Н|В5риЫ1хНВ№2 или нетрансфицированных клеток Н1В5, инкубированных в течение ночи в среде без сыворотки с добавлением Ν2 добавки (ЫЕе ТесЬгю^щек; Са!. Νο. 17502-048), концентрировали и разделяли на 15% полиакриламидных гелях (АтегкЬат Рйагтааа Вю!есй; Са!. Νο. 80-1262-01). Белки переносили на РУЭРмембраны (АтегкЬат РйагтаДа Вю!есй; Са!. Νο. ΚΡΝ-303Ρ) и сайты неспецифичного связывания белка блокировали 5% обезжиренным сухим молоком в ФСБ с 0,1% твином-20. Мембраны инкубировали в течение ночи с поликлональными нейбластиновыми антителами (1:1000), после чего инкубировали со вторыми антителами против 1дС кролика (АтегкЬат РЬагтаДа Вю!есЬ; Са!. Νο. NΑ 934), конъюгированными с пероксидазой хрена (1:2000). Визуализацию иммунного окрашивания проводили с использованием усиленной хемилюминисценции (УХЛ) (АтегкЬат РЬагтааа Вю!есЬ; Са!. Νο. ΚΡΝ2109) или УХЛ⁴ (АтегкЬат РЬагтааа Вю!есЬ; Са!. Νο. ΚΡΝ2132) в соответствии с инструкциями изготовителя (АтегкЬат).

Результаты этих экспериментов показаны на фиг. 3. Фиг. 3А и 3В являются иллюстрациями экспрессии белка нейбластина в трансфицированных клетках Н1В5. Среду от культивированных в течение ночи нетрансфицированных клеток Н1В5 [дорожка 1] или от клона Н1В5, стабильно трансфицированного кДНК нейбластина [дорожка 2], концентрировали, как описано ниже. Затем среду анализировали с помощью вестерн-блоттинга, используя два различных типа поликлональных антител Ат-1 и Ат-2, описанных в примере 10, специфичных для нейбластина. Обнаружено, что в среде, полученной от трансфицированных клеток, оба типа антител узнают белок с молекулярной массой примерно 15 кД. Этот белок не выявляется в нетрансфицированных клетках Н1В5.

Клонированная кДНК, кодирующая нейбластин, также может быть встроена в другой эукариотический экспрессирующий вектор, например, в эукариотический экспрессирующий вектор ТЕ1-8 (^οЬаηкеη е! а1., РЕВ8 Ье!!., 1990, 267, 289-294) или рсЭХА-3 (1пу1!годеп), и полученная в результате экспрессирующая плазмида может быть трансфицирована в альтернативную линию клеток млекопитающих, например в клетки яичника китайского хомячка (СНО), в линии клеток НЕК293, СО8, РС12 или КЫ33Ь или в стволовые нервные клетки человека. Стабильные клеточные линии, экспрессирующие нейбластин, используются, например, для получения белка нейбластина.

Экспрессия в клетках СНО

Конструирование плазмиды р1С070.14. Чтобы экспрессировать кДНК нейбластина в клетках яичника китайского хомячка, фрагмент кДНК, кодирующий пре-про-форму нейбластина человека, встраивали в экспрессирующий вектор млекопитающих рЕАС347, чтобы создать плазмиду р1С070.14. рЕАС347 содержит тандем раннего промотора 8У40 и главного позднего промотора аденовируса (полученный из плазмиды рАЭ2бета; ΝοΠοη апб ΡοΓΓίη, Мο1.Се11.В^ο1., 1985, 5, 281), уникальный сайт клонирования Νο!1, после чего следует сигнал поздней терминации транскрипции 8У40 и полиА сигнал (полученные из плазмиды рСМУ бета; МасСте^ апб Саккеу, Шс! АсЛк Кек., 1989, 17, 2365). Кроме того, рЕАС347 содержит остов, полученный из плазмиды рИС19, и ген 6Ыг, полученный из р8У26Ыг, для селекции в присутствии метотрексата (МТХ) и амплификации в трансфицированных клетках СНО.

Плазмида р1С070.14 была создана в два этапа. Сначала фрагмент, кодирующий пре-проформу нейбластина человека, был выделен из плазмиды риЫЙ-ХВХ с помощью полимеразной цепной реакции с олигонуклеотидами ΚΌ2-

824 5'ААССААААААСССССССССА ТССАА СТТСС АСТТССАСС3' |8ЕС) ГО ΝΟ: 31], КГО2-

825 5'ТТТТТТССТТ 66С66СС6СТ САСССС АССС АСССССАСС3' |8ЕС) ГО ΝΟ: 32] и полимеразы РРи. Фрагмент был клонирован в 8гГ1 сайте рРСК-8спр! Атр 8К(+), чтобы создать плазмиду р1С069. На втором этапе было проведено частичное переваривание Νο!-1 плазмиды р1С069, чтобы образовать фрагмент длиной 685

п.н. (содержащий ген нейбластина), который был клонирован в Νοΐ-1 сайт плазмиды рЕАС347, чтобы создать плазмиду р1С070.14. Транскрипция гена нейбластина в плазмиде р1С070.14 контролируется главным поздним промотором аденовируса.

Создание линий клеток СНО, экспрессирующих нейбластин. 200 мкг р1С070.14 переводили в линейную форму перевариванием эндонуклеазой рестрикции М1и-1. ДНК экстрагировали фенолом : хлороформом : изоамиловым спиртом (25:24:1) и осаждали этанолом. Линеаризованную ДНК ресуспендировали в 20 мМ Нерек рН 7,05, 137 мМ ЫаС1, 5 мМ КС1, 0,7 мМ Ν^ΡΟ^ 6 мМ декстрозе (НЕВ8) и вводили в ~4Е7 СНО бикх В1 (бЬГг-) клетки (р23) путем электропорации (280 В и 960 мкФ). После электропорации клетки возвращали в культуру в а+ модифицированную среду Игла (МСИ) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (ФБС) на два дня. Затем клетки трипсинизировали и повторно высевали в 100 мм чашки (100000 клеток/чашку) в α-МСИ (в отсутствии рибо- и дезоксирибонуклеозидов) с добавлением 10% диализованной ФБС на пять дней. Потом клетки делили до плотности 100000 клеток/100 мм чашку и проводили селекцию в 200 нМ метотрексате. Резистентные колонии отбирали и наращивали в 6 луночных планшетах; кондиционированную среду от каждого клона подвергали скринингу с помощью специфичного анализа на нейбластин, описанного ниже. Двенадцать клонов, экспрессирующих наиболее высокий уровень нейбластина, наращивали во флаконах Т162 и потом исследовали повторно. Как показано на фиг. 10, линии клеток СНО продуцировали нейбластин в пределах от 25 до 50 нг/мл.

Исследование нейбластина путем анализа тройного комплекса. Лвторы исследовали наличие нейбластина в среде из надосадков линии клеток СНО с помощью модифицированного анализа тройного комплекса, описанного 8ашсо1а е! а1. (Ргос.№!1.Асаб.8сЕи8А, 1997, 94, 6238).

В данном исследовании возможности ΟΌΝΕ-подобных молекул могут быть оценены по их способности опосредовать связывание между внеклеточным доменом ВЕТ и различными ко-рецепторами, ΟΕВα1, ΟΕВα2 и ΟΕВα3. Растворимые формы ВЕТ и ко-рецепторов были получены в виде гибридных белков. Гибридный белок, образованный внеклеточным доменом ВЕТ крыс и плацентарной щелочной фосфатазой (ВЕТ-ЩФ), и гибридный белок между внеклеточным доменом ΟΕΡα.1 крыс (заявлен в опубликованной заявке νΟ 9744356; 27 ноября 1997, включена сюда в качестве ссылки) и Εс доменом 1дС1 человека (ΎΟΕΡαΓΙβ) описаны (8апасо1а е! а1., Ргос.№11.Асаб.8сШ8А, 1997, 94, 6238).

Чтобы создать гибридный белок между внеклеточным доменом ΟΕВα3 мыши и Εс доменом 1дС1 человека (тΟΕВα3-Iд), фрагмент ДНК, кодирующий аминокислоты 1-359 ВЕТБ3 мышей, лигировали с фрагментом, содержащим Εс домен 1дС1 человека и клонировали в экспрессирующем векторе рЕАС347, чтобы создать плазмиду рСЛ44. Плазмидой рСЛ44 трансфицировали клетки яичника китайского хомячка (СНО), чтобы получить стабильную линию клеток, продуцирующих гибридный белок, который был очищен на иммуноаффинной колонке, содержащей белок Л-сефарозу, с помощью стандартных методов. В общем, если в данном исследовании ΟΌΝΕ-подобная молекула может опосредовать связывание ко-рецептора с ВЕТ, то ВЕТ-ЩФ гибридный белок будет удерживаться на планшетах, и количество, которое будет удерживаться, может быть измерено с помощью хемилюминисцирующего субстрата щелочной фосфатазы.

Планшеты Эупех М1сго1йе-1 ЕБ18А (Эупех Тес11по1од1к) покрывали антителами козы, специфичными для Εс человека, в концентрации 1 мкг/мл в 50 мМ бикарбонате/карбонате, рН 9,6, в течение 16 ч. Содержимое планшетов сливали и их наполняли 300 мкл 1% Ι-блокирующего агента (Тгор1х) в ТБС/0,5% твин-20 (ТБСТ) на 1 ч. После трехразовой промывки ТБСТ лунки заполняли 100 мкл 1 мкг/мл (СВа^д или тΟΕВα3-Iд, разведенных в кондиционированной среде клеток 293ЕΒNА, экспрессирующих гибридный ген ВЕТ-ЩФ. Затем добавляли 100 мкл кондиционированной среды из нейбластиновых клонов СНО в верхнюю лунку колонки ячеек и делали двукратные серийные разведения в каждом нижнем ряду лунок и инкубировали в течение 1,5 ч при комнатной температуре. Затем планшеты промывали три раза ТБСТ и дважды 200 мМ трис, рН 9,8, 10 мМ МдС1₂, (буфер С8РО). Затем промывочный раствор заменяли 425 мкМ С8РО (Тгор1х) в буфере С8РО, содержащем 1 мг/мл усилителя темно-синей хемилюминисценции (Тгор1х), и инкубировали в течение 30' при комнатной температуре. Выход хемилюминисценции измеряли с помощью люминометра Оупа!есй.

В начальных экспериментах авторы исследовали, могут ли продуцирующие нейбластин линии клеток СНО опосредовать связывание ΟΕВα1 или ΟΕВα3 с внеклеточным доменом ВЕТ. Как показано на фиг. 11, кондиционированная среда клона клеток СНО №53 давала сильный сигнал в исследовании тройного комплекса в том случае, когда был включен тΟΕВα3-Iд гибридный белок, но не давала сигнала, когда был включен ιΌΕΡα1χ гибридный белок, что свидетельствует о том, что нейбластин связывается с ΟΕВα3, но не с ΟΕВα1. Такое поведение четко отличает нейбластин от ΟΌΝΕ; как показано на фиг. 11, ΟΌΝΕ связыва ется с СЕКа1, но не связывается с СЕКа3. Сигнала не наблюдалось ни с какими гибридными белками ко-рецепторов при исследовании кондиционированной среды исходной линии клеток СНО или чистой среды.

Чтобы количественно оценить уровни экспрессии нейбластина в линиях клеток СНО, была получена стандартная кривая с использованием гСЕКаЫд и СЭ№, начиная с концентрации 1 нг/мл. Затем с помощью стандартной кривой были рассчитаны концентрации нейбластина для различных линий клеток СНО; уровни, продуцируемые пятью линиями клеток СНО, показаны на фиг. 10. Поскольку это определение зависит от непроверенного предположения о том, что сродство связывания между СООТ¹ и СЕКа1 сходно со сродством связывания между нейбластином и СЕКа3, эти уровни являются только приблизительными.

Анализ нейбластина из надосадков линий клеток СНО

Для того чтобы провести дальнейший анализ нейбластина, продуцируемого линиями клеток СНО, с помощью СЕЯа3-1д гибридного белка из среды был экстрагирован белок и проанализирован с помощью вестерн-блотов с использованием поликлональных антител, полученных против пептидов нейбластина.

В первом эксперименте нейбластин был экстрагирован с помощью тСЕЯа3-1д, прикрепленного к сефарозным шарикам. тСЕЯа3-1д был присоединен к шарикам сефарозы в условиях, рекомендованных изготовителем, Рбагтас1а 1пс. 100 мкл тСЕЯа3-1д-сефарозы добавляли к 1,0 мл образцам кондиционированной среды из линии клеток СНО, являющихся негативным контролем, или из линии клеток СНО №16, продуцирующих нейбластин. Суспензии инкубировали в течение двух часов на качалке. Каждую суспензию центрифугировали и удаляли надосадок после трех промывок по 1,0 мл 10 мМ НЕРЕ8, 100 мМ №С1, рН 7,5. В каждом случае смолу ресуспендировали в 100 мкл 2Х восстанавливающего буфера для образца и нагревали до 100°С в течение 5 мин. 20 мкл надосадка буфера для образца и 10 мкл стандарта молекулярной массы (ЕМС) наносили в каждую лунку 10-20% готового геля для 8Э8-ПЛАГ (Ον1 8с1епОПс). Электрофорез в геле проводили при постоянном токе в 40 мА в течение 72 мин.

Для вестерн-блот анализа белок с помощью электроблоттинга переносили на нитроцеллюлозу (8сЫе1сбег апб 8сбие11) в приборе НоГег 8с1епбйс в буферной системе, содержащей 10 мМ САР8, 10% метанол, 0,05% 8Ό8, рН 11,2 (45 мин при постоянном токе в 400 мА). После переноса нитроцеллюлозный фильтр извлекали из кассеты и визуализацию маркеров молекулярной массы проводили путем окрашивания раствором 0,1% красного 8 в 1% уксусной кислоте в течение 60 с. Мембрану разрезали на две части и избыток красителя удаляли мягким покачиванием в дистиллированной воде. Мембраны блокировали в 2% растворе обезжиренного сухого молока в ТБС в течение ночи при 4°С. Мембраны инкубировали отдельно с двумя аффинно-очищенными антителами против пептида нейбластина (К.30 и К.31) при концентрации 1,0 мкг/мл в 2% растворе обезжиренного сухого молока в ТБС. Мембраны промывали три раза по десять минут в ТБС-твине и инкубировали с конъюгатом антител козы против 1дС кролика-НКР (Вюгаб) в разведении 1:5000 в течение 30 мин. Мембраны промывали три раза по 10 мин ТБС-твином и проявляли с помощью субстрата УХЛ (Атегкбат). Как показано на фиг. 12, специфичные полосы были выявлены в случае белков, экстрагированных из линии клеток СНО, продуцирующей нейбластин, с помощью обоих антител (дорожки 2 и 4) при сравнении с полосами, наблюдаемыми в белках, экстрагированных из линии клеток, служащей негативным контролем (дорожки 1 и 3).

Вид белка, расположенного внизу, имеет молекулярную массу примерно 13 кД и, вероятно, представляет собой зрелый домен нейбластина, возникший после отщепления продомена. Такое расщепление могло произойти после любого из трех остатков Агдпре-пробелка нейбластина (например, -КХХК1-), давая либо 140АК, 116АК, либо 113АК формы, указанные в 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 10, 11 или 12, соответственно. Предсказанные молекулярные массы не модифицированных (т.е. без посттрансляционных модификаций) полипептидов нейбластина ΝΒΝ140 |8ЕО ΙΌ ΝΟ: 10], ΝΒΝ116 |8ЕО ΙΌ ΝΟ: 11] и ΝΒΝ113 |8ЕО ΙΌ ΝΟ: 12] были определены равными 14,7 кД, 12,4 кД и 12,1 кД, соответственно. Необходим дополнительный анализ, чтобы подтвердить структуру этих видов, а также других специфичных для нейбластина полос.

Во втором эксперименте нейбластин экстрагировали с помощью НСЕКаЛ-Ю фиксированных на планшетах ЕЫ8А. Чтобы получить гибридный белок между внеклеточным доменом СЕКа3 человека (заявлен в опубликованной заявке ^Ο97/44356, 27 ноября 1997, включенной сюда в качестве ссылки) и Ес доменом !дС1 человека (ЬСЕКа3-!д), фрагмент ДНК, кодирующий аминокислоты 1-364, СЕКа3 человека лигировали с фрагментом, содержащим Ес домен !дС 1 человека и клонировали в экспрессирующий вектор СН269, описанный 8атсо1а е! а1. (Ргос.№!1.Аса6.8сЕи8А, 1997, 94, 6238). Гибридный белок, кодируемый этой плазмидой, временно экспрессировался в клетках с ядерным антигеном, кодируемым вирусом Эпштейн Барра 293 (ЕΒNА), и его очищали на иммуноаффинной колонке с белокА-сефарозой стандартными способами.

Шесть лунок 96-луночного планшета были покрыты в течение ночи при 4°С антителами козы против 1дС человека (специфичны для Есу фрагмента; 1аскзои 1ттиио1од1сз) при концентрации 25 мг/мл в ФСБ (300 мкл/лунку). Лунки блокировали в течение 1 ч при комнатной температуре с помощью 400 мкл 1% БСА в ФСБ. После трех промывок ФСБТ (ФСБ+0,05% твин20) в каждую лунку добавляли 300 мл йСЕКа31д (10 мг/мл в ФСБ, содержащем 0,1% БСА). Планшет инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре и мягком встряхивании (200 ударов/мин), чтобы обеспечить максимальное связывание. Затем лунки опорожняли и снова 3 раза промывали ФСБТ. 250 мкл кондиционированной среды из линии клеток СНО, служащей негативным контролем, или из линии клеток СНО №25, продуцирующей нейбластин, добавляли в каждую из 3 лунок. Планшет инкубировали в течение 3 ч при комнатной температуре и мягком встряхивании (300 ударов/мин). Затем лунки дважды промывали ФСБТ. 25 мкл невосстанавливающего буфера для нанесения Лэммли добавляли в первую лунку и планшет быстро встряхивали в течение 5 мин, чтобы элюировать связанные белки (1300 ударов/мин). Содержимое переносили в следующую лунку и процедуру повторяли, чтобы элюировать белки, связанные во второй и третьей лунках. После добавления β-меркаптоэтанола (5% конечная концентрация) образцы кипятили 5 мин и анализировали с помощью 8О8-ПААГ в 10-20% полиакриламидном геле.

Для вестерн-блот анализа белки переносили на нитроцеллюлозу. Мембрану блокировали и анализировали в 5% растворе обезжиренного сухого молока, ФСБТ и промывали в ФСБТ. Нейбластин выявляли с помощью электрохемилюминисценции после реакции с поликлональными антителами (К30 и К31), направленными против двух пептидов нейбластина (при концентрации 1 мкг/мл), с последующей реакцией с антителами козы против 1д кролика, коньюгированными с НКР (ВюКаб). Как показано на фиг. 13, пять специфичных для нейбластина полос было выявлено в белках, экстрагированных из линии клеток СНО, продуцирующих нейбластин (дорожка 2). Две нижние полосы очень сходны с полосами, видимыми на фиг. 12; и снова, нижняя полоса, по-видимому, представляет собой зрелый домен нейбластина, возникший после отщепления про-домена.

Последующий анализ (данные не показаны) полос на фиг. 13 показал, что дегликозилирование РСNазοй Е белка в полосе, соответствующей примерно 18 кД, восстанавливает белок в этой полосе до размера, эквивалентного самой нижней полосе в геле на фиг. 13. Это подтверждает, что нейбластин может продуцироваться в клетках млекопитающих в виде гликозилированного белка.

Экспрессия нейбластина в Е.сой

Чтобы экспрессировать ген нейбластина в Е.сой, были сконструированы сингены с более низким содержанием СС и предпочтительными кодонами Е.сой. Синген клонируется в двух векторах, рЕТ19Ь и рМ1В164, производном рЕТ19Ь. Конструкция с рЕТ19Ь показана на фиг. 14. В этой конструкции последовательность, кодирующая зрелый домен нейбластина (№N113), непосредственно сливается с инициирующим кодоном метионина. Конструкция с рМ1В164 показана на фиг. 15. В этой конструкции зрелый домен нейбластина слит с гистидиновой меткой (т. е. 10 гистидинами), отделенной сайтом расщепления энтерокиназой. Инициирующий метионин предшествует гистидиновой метке.

Нуклеотидная последовательность, кодирующая нейбластин на фиг. 14.

АТСССТбСАССАСССССАТСТССТССТССТбСАССАССАССАСбТСССТСТСС

ТСТСССТТСТСААСТАСТСССССТССеТССАСТСССАСТСССАСАСССТТСССА

ССААСТАСТАССТТТТССТТТТТСТТСАССАТСТТСТССТССТССАССТТСТССС

САТСАТСТАТСТСТСТАССАТСТСТАСТАССАСССССАССАСТААСАССССССССС ССАТСТА6АССТСТАТСТСААССТТСТТСТАСАССТАСТАСАТАС6ААССАСТАТ СТТТСАТССАССТАААСТСТАСАТССАСААСССТАСАТАСАСТАТСТССААСССС АТСТ63СТСТСТАССАТСАТААТА6 [5Е<2 Ю N0: 19]

Нуклеотидная последовательность, кодирующая меченый гистидином нейбластин на фиг. 15.

АТСССССАТСАТСАТСАТСАТСАТСАТСАТСАТСАСТССАССССССАТАТССАСС

АССАССАСААСССТССАССАСССССАТСТССТССТССТССАССАССАССАССТ

СССТСТССТСТСССТТСТСААСТАСТСССССТСССТССАСТСССАСТСССАСАС

СОТТСССАССААСТАСТАСеТТТТССТТТТТСТТСАОСАТСТТСТССТССТССАС

СТТСТСССССАТСАЛСТАТСТСТАССАТСТСТАСТАССАСССССАССАСТААСАСС СССССССССАТСТАСАССТСТАТСТСААССТТеТТСТАСАССТАСТАСАТАССАА 6САСТАТСТТТСАТССАССТАААСТСТАСАТССАСААСССТАСАТА5АСТАТСТС СААССССАТСТСССТСТСТА6САТСАТААТАС [ЗЕ<2 Ю ΝΟ: 30]

Пример 6. Влияние нейбластина на выживаемость допаминэргических нейронов эмбрионов крыс и ХАТ активность.

В этой серии экспериментов оценивали влияние кондиционированной среды от продуцирующих нейбластин клеток Н|В5риЬП/ХВХ22, описанных выше.

Подготовка культур. Вентральную часть среднего мозгового пузыря или спинной мозг извлекали из вскрытых эмбрионов крыс Э14 и помещали в холодный буферный солевой раствор Хенкса (БСРХ). Кусочки ткани инкубировали в стерильно отфильтрованном 0,1% трипсине (ЛУоПйтдЮи) и 0,05% ДНКазе (81дта) в БСРХ при 37°С в течение 20 мин. Затем кусочки ткани четыре раза промывали в БСРХ+0,05% ДНКаза и диссоциировали с помощью автоматической пипетки объемом 1 мл. Затем суспензию центрифугировали при 600 об/мин в течение 5 мин и осадок ресуспендировали в кондиционированной среде с сывороткой (КСС; ОМЕМ с 10% фетальной сыворотки теленка). Общее количество клеток оценивали с помощью метода исключения с красителем трипановым синим, и клетки высевали при плотности 100000 клеток/см² в покрытые поли-Ь-лизином восьмилуночные камеры (Мшс) для оценки выживаемости допаминэргических нейронов, или при плотности 200000 клеток/см² в 48 луночные планшеты (Мше) для измерений ХАТ активности. Клетки инкубировали в КСС при 5% С0₂/95% 0₂ и 95% влажности при 37°С в течение 24-48 ч до смены на среду без сыворотки (СБС) с добавлением нейротрофических факторов.

Для оценки выживаемости допаминэргических нейронов клетки оставляли на 5 дней в СБС + добавки трофических факторов и затем фиксировали в течение 5 мин в 4% ПФА и красили на тирозингидроксилазу с помощью иммуногистохимии.

Для определения ХАТ активности клетки оставляли на 3 дня в СБС и затем лизировали в БСРХ + 0,1% тритон Х-100 и сразу же замораживали в сухом льду вплоть до измерения ХАТактивности.

Добавление трофических факторов. Собирали кондиционированную среду от нетрансфицированных Н1В5 контрольных клеток или от Н1В5 клеток, продуцирующих нейбластин (Н|В5риЫ1хХВХ22) или СОХЕ (ΗίΒ5ρυΐ>ί1ζ6 ЭХЕ-Е17). Η^В5ρυЬ^1ζNВN22 продуцирует примерно 20 нг 00^/24 ч/10⁵ клеток, как было определено с помощью СОХЕ-ЕЕКЕ в кондиционированной среде, собранной от клеток. Соответствующие линии клеток инкубировали в течение ночи в ЭМЕМ + 1% ФБС и отбирали надосадок и хранили при -20°С вплоть до использования. При добавлении к клеткам надосадки разводили 1:50 в СБС. Отдельные лунки обрабатывали надосадком от контрольных клеток Н1В5 (1:50) + очищенный рекомбинантный СЭНЕ крысы (от 0,03 - 10 нг/мл).

Результаты этих экспериментов показаны на фиг. 4. Фиг. 4А-4С являются иллюстрациями влияния нейбластина, секретируемого клетками Η^В5ρυЬ^1ζNВN22, на выживаемость культивируемых допаминэргических нейронов вентральной части среднего мозгового пузыря эмбрионов крыс и на ХАТ активность в холинэргических мотонейронах черепно-мозгового нерва в бессывороточной среде, как описано ниже в примере 5.1.

Фиг. 4А является иллюстрацией кривой зависимости ХАТ активности от дозы рекомбинантного СОИЕ (расп./мин/ч), измеренной на ΌΙν 5 в бессывороточных культурах, которые исходно были созданы из вентральной части средних мозговых пузырей эмбрионов Э14 [т.е. НВ5; СОИЕ 0,03 нг/мл; бОИЕ 0,1 нг/мл; бОИЕ 0,3 нг/мл; СЭКЕ 1 нг/мл; СЭКЕ 10 нг/мл; СЭКЕ 100 нг/мл].

Фиг. 4В является иллюстрацией ХАТ активности (расп./мин/час), измеренной на ΌΙν5 в бессывороточных культурах, которые исходно были созданы из вентральной части средних мозговых пузырей эмбрионов Э14. Разбавленную кондиционированную среду либо от продуцирующих нейбластин клеток ШВ^^иШЕ №N22 (нейбластин), либо от ООкЕ продуцирующих Η^В56^NЕ^-17 (ΟΌ№Ε-17) клеток добавляли, как показано на фигуре [т.е. нейбластин 1:10; нейбластин 1:50; 6Э№Е-17 1:50].

Фиг. 4С является иллюстрацией количества иммунореактивных при анализе на тирозингидроксилазу клеток в лунке [N0. ТГ⁺ клеток/лунку] на ΌΙν7 в бессывороточных культурах, которые исходно были созданы из вентральных частей средних мозговых пузырей эмбрионов крыс Э14. Разбавленную кондиционированную среду либо от нетрансфицированных клеток Н1В5 (Н1В5), либо от продуцирующих нейбластин клеток Η^В5ρυЬ^1ζNВN22 (нейбластин) или рекомбинантный ΟΌ№ добавляли в различных концентрациях, как показано на фигуре [т.е. Н1В5 1:10; Н1В5 1:40; СО№

O, 1 нг/мл; ΟΌ№ 10 нг/мл; ΟΌ№ 100 нг/мл; и нейбластин 1:40].

Кондиционированная среда от трансфицированных нейбластином клеток Н1В5 в разведении 1:40 значительно увеличивала количество ТГ-иммунореактивных клеток на лунку, по сравнению с контрольными (нетрансфицированными) клетками Н1В5 при эквивалентном и меньшем разведении (1:10 и 1:40) (см., например, фиг. 4В). Увеличение количества ТГиммунореактивных клеток сравнимо с увеличением, наблюдаемым при максимальной концентрации СО№ (10 нг/мл). Это свидетельствует о том, что нейбластин, секретируемый в среду, оказывает влияние на выживаемость популяции допаминэргических нейронов вентральной части среднего мозгового пузыря эмбрионов крыс. Напротив, в отличие от ΟΌ№, секретируемого трансфицированными клетками Н1В5, не наблюдалось влияния кондиционированной среды от трансфицированных нейбластином клеток Н1В5 на другую популяцию нейронов в такой же культуре на холинэргические нейроны (см., например, фиг. 4А).

Пример 7. Влияние нейбластина на выживаемость культур срезов допаминэргических нейронов вентральной части среднего мозгового пузыря эмбрионов свиней.

В этом эксперименте оценивали результат совместного культивирования продуцирующих нейбластин клеток Η^В5ρυЬ^1ζNВN22 и культивируемых срезов вентральной части средних мозговых пузырей эмбрионов свиней.

Подготовка культур. Вентральные части средних мозговых пузырей (ВСМ) выделяли из эмбрионов свиней (Э28; п=12) в стерильных условиях, нарезали 400 мкл срезы и помещали в охлажденный сбалансированный солевой раствор Гейза (6ΙΒ00) с глюкозой (6,5 мг/мл). Тканевые срезы культивировали с помощью метода контактирующих культур, первоначально разработанного δΐορρίηί с1 а1. [Ε.δΐορρίηί,

P. А.ВисЕк, Э.Ми11ег. 1№иго8С1. МеБюйк. 1991, 37, 173-182].

Коротко, срезы, помещенные на полупроницаемые мембраны (М1Шроге, 0,3 мкм; 8 срезов/мембрану, соответствующих одному ВСМ), помещали в виде вкладышей в 6-луночные планшеты (Сойаг) в среду, содержащую сыворотку (С1Ьсо ВЯЬ). Каждая лунка содержала 1 мл среды (50% Орйтет, 25% сыворотки лошади, 25% сбалансированного солевого раствора Хенкса (все реактивы С1Ьсо)) с добавлением Όглюкозы до конечной концентрации 25 мМ. В 0 день 7000 трансфицированных клеток Н1В5р υόί1ζΝΕΝ22 (нейбластин) или 7000 нетрансфицированных клеток Н1В5 (контроль) высевали на каждый тканевой срез. Совместные культуры сначала выращивали в инкубаторе при 33°С в течение 48 ч, что позволяло клеткам Н1В5 стать иммортализованными, благодаря температурочувствительному онкогену, чтобы они могли пролиферировать, и затем помещали в инкубатор при 37°С, где происходила дифференцировка клеток Н1В5. Среду меняли дважды в неделю. Антимитотические средства и антибиотики не использовались ни на какой стадии.

Определение допамина с помощью ВЭЖХ. На 12 и 21 день культивирования ш νίΙΐΌ собирали культуральную среду и анализировали допамин, используя ВЭЖХ с электрохимической детекцией (Α.Ν. 81оо111, ГВ.Р. СгаткЬегдеп, 1№иго8сЕМе!й., 1995, 60, 141-149).

Обработка ткани и иммуногистохимия. На 21 день культуры фиксировали в 4% параформальдегиде в фосфатном буфере в течение 60 мин, дегидратировали в 20% растворе сахарозы в течение 24 ч, замораживали, делали срезы размером 20 мкм (4 серии) в криостате и готовили препараты на покрытых желатином покровных стеклах для микроскопа. Одну серию срезов подвергали иммунному окрашиванию на тирозингидроксилазу (ТГ). Коротко, срезы промывали в 0,05М трис-буферном солевом растворе (ТБС, рН 7,4), содержащем 1% тритон Х100, в течение 3 х 15 мин и инкубировали с 10% очищенной бычьей сыворотки (ОБС, Ые ТесНпо1о§1е5) в ТБС в течение 30 мин. Затем ткань инкубировали в течение 24 ч при 4°С с моноклональными анти-ТГ антителами мыши (ВоеНппдег МаппНепп) в разведении 1:600 в ТБС с 10% ОБС. После промывки в ТВС с 1% тритоном Х-100 3 х 15 мин срезы инкубировали в течение 60 мин с биотинилированными антителами против 1дС мыши (АтегкЬат) в разведении 1:200 в ТБС с 10% ОБС. Затем срезы промывали в ТБС с 1% тритоном Х-100 (3 х 15 мин) и инкубировали в течение 60 мин со стрептавидин-пероксидазой (Пако) в разведении 1:200 в ТБС с 10% ОБС. После промывания в ТБС (3 х 15 мин) связавшиеся антитела выявляли обработкой 0,05% 3,3-диаминобензидином (81дта) в ТБС, содержащем 0,01% Н₂О₂. В конце срезы дегидратировали в спирте, очищали в ксилоле и накрывали покровным стеклом в Еик1й.

Подсчет клеток и морфометрический анализ. Определение количества иммунореактивных ТГ-ир нейронов проводили с помощью светлопольной микроскопии (О1утрик). Подсчитывали только интенсивно окрашенные клетки с хорошо сохранившейся структурой клетки и отчетливым ядром. Определение было основано на подсчете клеток в каждом четвертом культивируемом срезе, используя объектив х20. Количество клеток уточняли двойным подсчетом в соответствии с формулой АЬегсготЫе (М.АЬегсготЫе, АпаЕЯес., 1946, 94, 239-47), используя средний диаметр ядер в ТГ-ир нейронах (6,6±0,2 мкм, п=30). Размер ядер оценивали, используя систему мечения нейронов (№иго1ис1ба, М1сгоВг1дЫ-Р1е1б, 1пс.).

Результаты этих экспериментов показаны на фиг. 5. Фиг. 5А-5С являются иллюстрациями влияния нейбластина, секретируемого из клеток Н1В5риЬШ№№2, на функционирование и выживаемость культивируемых срезов допаминэргических нейронов вентральной части среднего мозгового пузыря эмбрионов свиней, культивируемых совместно либо с клетками Н1В5р υΜ1ζΝβΝ22 (нейбластин), либо с клетками Н1В5 (контроль), как описано ниже. Фиг. 5А и фиг. 5В иллюстрируют допамин, вышедший в среду в Όΐν12 [допамин (пмоль/мл) - день 12] и Όΐν21 [допамин (пмоль/мл) - день 21], соответственно. Фиг. 5С является иллюстрацией количества иммунореактивных при анализе на тирозингидроксилазу клеток в культуре [ТГ-ир клеток на культуру] в Όΐν21.

ВЭЖХ анализ на 12 день показал, что среда совместных Н1В5-нейбластиновых культур содержит допамина на 84% больше, чем среда совместных Н1В5-С контрольных культур (фиг. 5А). На 21 день различие было на 78% (фиг. 5В), и количество клеток показало, что совместные Н1В5-нейбластиновые культуры содержали иммунореактивных на тирозингидроксилазу нейронов на 66% больше, чем совместные Н1В5С контрольные культуры (Р<0,05) (фиг. 5С). Это свидетельствует о том, что нейбластин, секретируемый из клона Н1В5риЬШ№№2, оказывает эффективное действие на выживаемость допаминэргических нейронов эмбрионов свиней.

Пример 8. Выживаемость клеток ганглия дорсального корешка в бессывороточной среде.

Этот пример показывает нейротрофическую активность полипептида нейбластина в сравнении с известными нейротрофическими факторами.

Беременных самок мышей забивали путем смещения шейных позвонков. Эмбрион обрабатывали для культивирования следующим образом.

Электролитически заостренные вольфрамовые иглы использовали для препарирования ганглиев дорсальных корешков на указанных стадиях у мышей С57/В16 (Мо11едаагб Вгеебтд, Оептагк). Эмбриональные ганглии инкубирова ли в течение 5 мин при 37°С с 0,05% трипсина (С1Ьсо/ВКБ) в сбалансированном солевом растворе Хенкса без кальция и магния. Постнатальные ганглии обрабатывали коллагеназой/диспазой 1 мг/мл в течение от 30 до 45 мин и затем трипсином/ДНКазой 0,25% в течение 15 мин. После удаления раствора трипсина ганглии один раз промывали 10 мл БМЕМ, содержащей 10% инактивированной нагреванием сыворотки лошади, и осторожно растирали Пастеровской пипеткой с оплавленным концом, чтобы получить суспензию отдельных клеток.

Клетки высевали на 24 луночные планшеты Щипс), которые предварительно покрывали полиорнитином (0,5 мг/мл, в течение ночи) и ламинином (20 мг/мл в течение 4 ч; С1Ьсо/ВКБ). Нейроны инкубировали при 37°С в инкубаторе с увлажнением и при 5% С02 в определенной среде, содержащей Натз Р14 с добавлением 2 мМ глутамина, 0,35% бычьего сывороточного альбумина, 60 нг/мл прогестерона, 16 мг/мл путресцина, 400 нг/мл Б-тироксина, 38 нг/мл селенита натрия, 340 нг/мл трииодтиронина, 60 мг/мл пенициллина и 100 мг/мл стрептомицина.

После 48 ч инкубации нейроны были четко различимы по их биполярной морфологии с помощью фазово-контрастной оптики. Процент выживаемости нейронов в отсутствии или в присутствии трофических факторов (добавленных в культуральную среду перед высеванием нейронов в концентрации 10 нг/мл) или кондиционированной среды от продуцирующих нейбластин клеток Н1В5риЬ1к№№2 оценивали подсчетом нейронов в лунках на 48 ч инкубации.

Результаты этих экспериментов представлены на фиг. 9, на этой фигуре означает контрольный эксперимент (в отсутствии факторов);

означает эксперименты в присутствии СБЖ;

означает эксперименты в присутствии нейртурина;

означает эксперименты в присутствии нейбластина изобретения;

Э12 представляет данные экспериментов, выполненных на клетках ГДК (ганглии дорсальных корешков), выделенных на 12 день эмбрионального развития;

Э16 представляет данные экспериментов, выполненных на клетках ГДК, выделенных на 16 день эмбрионального развития;

П0 представляет данные экспериментов, выполненных на клетках ГДК, выделенных в день рождения;

П7 представляет данные экспериментов, выполненных на клетках ГДК, выделенных на 7 день после рождения; и

П15 представляет данные экспериментов, выполненных на клетках ГДК, выделенных на 15 день после рождения.

Эти результаты ясно показывают, что нейротрофический фактор изобретения проявляет активность, сравнимую, или даже лучше, чем активности хорошо установленных нейротрофических факторов.

Пример 9. Влияние нейбластина на допаминовые нейроны черного вещества ίη νίνο.

Чтобы оценить способность нейбластина (нейбластин) защищать допаминовые (ИА) нейроны черного вещества взрослого организма от дегенерации, индуцированной 6-гидроксидопамином, авторы использовали модель болезни Паркинсона у крыс (8аиег апб 0ег1е1, №иго8с1епсе, 1994, 59, 401-415) и перенос гена нейбластина с помощью лентивирусов.

Получение лентивирусов: чтобы создать лентивирусный вектор переноса генов, кодирующий нейбластин, рНК'-нейбластин, ВатН1 фрагмент кДНК нейбластина длиной 1331 п.н. субклонировали в ВатН1/Вд1 II сайте р8Б301 (1пуйгодеп). Из этой конструкции вырезали ВатН1/Х1о1 фрагмент длиной 1519 п.н. и встраивали в ВатН1/Х1о1 сайт посттрансляционного фрагмента вируса гепатита лесного североамериканского сурка, несущего рНК' (ΖιιΠοϊΌν К., Бопе11о БЕ., Тгопо Ό., Норе Т.Б: ХУообсйиск Ьера1й18 νίιυδ роЩгшъспрбошб геди1а!огу е1етеп! епйапсез ехргеззюп оГ 1гапздепез беНгегеб Ьу ге1гогйа1 гесЮгз; ΕνπΌ1., 1999, 73 (4) 2886-2892). Чтобы создать рНКСБЖ ВатН1/Х1ю1 фрагмент из рБЬИх-ОБЖ длиной 701 п.н., встраивали в ВатН1/Х1о1 сайт рНК'.

Получение лентивирусного вектора описано, например, 2иГГегеу е! а1. (^иГГегеу К., №щу Ό., Мапбе1 К..Б, №11бйи Б., Тгопо Ό.: МиШр1у айепиа!еб 1еп!Мга1 уес!ог асЫеуез еГПаеШ депе беНгегу 1п угго', №1.Вю1есЬпо1., 1997, 15(9), 871-875). Коротко конструкции для переноса и хелперные плазмиды рК8.91 и рМБС совместно трансфицировали в клетки 293Т. Собирали вирионы, высвободившиеся в среду через 48 и 72 ч после трансфекции. Чтобы сконцентрировать вирус, среду центрифугировали 1,5 ч при 141000 д, и осадок растворяли в БМЕМ. Титр контроля, несущего ген белка с зеленой флуоресценцией (СЕР), был определен с помощью СЕР флуоресценции клеток 293Т и был равен 10⁸ единиц трансформации (ЕТ)/мл. РНК слотблот технология (гоп 8с11\уеб1ег и., 8опд I., А1кеп С., Тгопо Б.:\|Г Б сгис1а1 Гог йитап 1ттипобейаепсу уииз 1уре 1 ргоуиа1 ^NΑ зупШе818 1п тГес1еб се11з; ΐνπΌ1., 1993, 76 (8), 49454955) была использована для определения титра вирусных частиц. В надосадке СО№ и нейбластиновом надосадке было в 10 раз меньше частиц по сравнению с СЕР надосадком.

Хирургические процедуры: все работы на животных проводились в соответствии с правилами, установленными Комитетом по этике использования лабораторных животных университета Ланда.

Использовали молодых взрослых самок крыс 8ргадие-0аМеу (В&К ишуегка1, 81оск11о1т, 8\\'ебеп), всего 21 особь, и помещали их в условия 12 часового цикла света: темноты при свободном доступе к еде и воде. Ретроградное мечение и повреждения 6-0ΗΌΛ выполняли за 3 недели до поражения, согласно 8аиег апб 0ег1е1 (8аиег апб 0ег1е1, №игокс1епсе, 1994, 59, 401-415). Коротко, под анестезией ЕдшШекш (0,3 мл/100 г) крысам проводили двустороннюю инъекцию 0,2 мкл 2% раствора (растворение в 0,9% №1С1) ретроградной метки Е1иого-Оо1б (ЕО; Е1иогосЬготе, 1пс., Епд1е^ооб, С0). Инъекции делали с помощью шприца Гамильтона объемом 2 мкл в точки, имеющие координаты: АР=+0,5 мм; МЬ=±3,4 мм относительно брегмы; Όν=-5,0 мм относительно твердой мозговой оболочки и корень резца устанавливали на 0,0 мм. Кроме того, 0,05 мкл/мин было инъецировано в течение дополнительных 5 мин, оставшихся до выведения иглы.

Через четырнадцать дней после инъекций ЕО животные получали в общей сложности 5 введений (1 мкл/введение) лентивирусного вектора, несущего ген белка с зеленой флуоресценцией (ОЕР), нейбластина или 6ΌΝΕ. Четыре введения были в полосатое тело при двух направлениям иглы со следующими координатами:

АР=+1,0 мм, МЬ=-2,6 мм, Όν₁=-5,0 мм, Όν₂=-4,5 мм и АР=0,0 мм, МЬ=-3,7 мм, Όν₁= -5,0 мм, Όν₂=-4,5 мм. Введение над черным веществом было сделано при АР=-5,2 мм, МЬ= -2,0 мм, Όν₁=-6,3 мм. Корень зуба был достигнут при -2,3 мм.

Через двадцать один день после ретроградного мечения и через 7 дней после инъекций лентивирусов животных повторно анестезировали и с помощью шприца Гамильтона объемом 10 мкл инъецировали однократную дозу 20 мкг 6-0НЭА (8щта; рассчитывали как свободное основание и растворяли в 3 мкл ледяного раствора соли с добавлением 0,02% аскорбиновой кислоты) в правое полосатое тело в те же место, что и введении ЕО. Скорость инъекции составляла 1 мкл/мин, и оставляли еще 3 мин до выведения иглы.

Обработка ткани: на 21 день после инъекции 6-0НЭА животных подвергали глубокой анестезии хлораль гидратом и перфузировали через сердце раствором соли (рН 7,4; комнатная температура) в течение одной минуты, после чего 200 мл ледяного раствора формальдегида (4% параформальдегид в 0,1М фосфатном буфере, рН 7,4). Мозг препарировали и вторично фиксировали в том же самом фиксаторе в течение 3-4 ч и затем переносили в 25% сахарозу/0,1М фосфатный буфер на 48 ч. Пять серий 40 мкм срезов полосатого тела и черного вещества (ЧВ) нарезали с помощью замораживающего микротома.

Количественная оценка допаминэргических нейронов в ЧВ: количество ЕО-меченых нейронов в рагк сотрас1а ЧВ оценивали слепым наблюдением, как описано ранее (8аиег апб 0ег1е1, №игокс1епсе, 1994, 59, 401-415). Коротко, были использованы три последовательных среза примерно на уровне медиального терминального ядра добавочного зрительного тракта (МТЯ; -5,3 в атласе Рахшок апб \Уа1коп (1997)), и все меченые/окрашенные нейроны, расположенные латерально по отношению к МТЯ, были подсчитаны при 40х увеличении (п=6-7/группу). ЕО-меченые нейроны включали в подсчет в том случае, если они ярко флуоресцировали при эпи-освещении при 330 нм, обнаруживали параметры нейронов и их участие распространялось, по меньшей мере, на один невритный процесс.

На поврежденной стороне у животных, получавших инъекции лентивирусов, несущих ОЕР, количество ЕО-позитивных нейронов черного вещества было снижено до 18% от количества на интактной стороне. Напротив, у животных, которым инъецировали ленти-нейбластин, наблюдалась почти полная защита количества ЕО-позитивных нейронов черного вещества (89%). Это было также эффективно, как у животных, обработанных ленти-ОП№, где 87% ретроградно меченых нейронов сохранялось на поврежденной стороне. Это свидетельствует о том, что нейбластин является эффективным фактором, обеспечивающим выживаемость поврежденных допаминэргических нейронов черного вещества взрослого организма, и что он является таким же эффективным, как и βΌΝΓ.

Фиг. 6 является иллюстрацией влияния продуцируемого ленти-вирусами нейбластина на допаминовые нейроны черного вещества ш У1уо. Нейроны рагк сотрас!а ЧВ у самок крыс 8ргадие Оа\\'1еу были ретроградно помечены Е1игодо1б (ЕО) за 3 недели до однократной инъекции 6-гидроксидопамина (6-0НОА) в правое полосатое тело. За неделю до инъекции 60НЭА животные получали инъекции лентивирусных векторов, экспрессирующих нейбластин [нейбластин], ОО№ [ОО№] или белок с зеленой флуоресценцией [ОЕР], как показано на фигуре. Через двадцать один день после инъекций 6-0НЭА было определено количество ЕОмеченных нейронов полосатых тел с двух сторон. На фигуре показан процент [%ЕО поврежденных/интактных] ЕО-меченных нейронов в полосатом теле на поврежденной (правой) стороне по сравнению с полосатым телом на интактной (левой) стороне в трех группах животных.

Пример 10. Получение антител.

Чтобы подготовить антитела против нейбластина, двух кроликов с 3 недельными интервалами иммунизировали либо пептидом 1: СЯРТΒΥΕАV8ЕМ^VN8Т (аминокислоты 108124 в 8ЕО ΙΌ Ν0: 9); либо пептидом 2:

АЬВРРРСБВРУБрРС (аминокислоты 93-107 в БЕС ΙΌ N0: 9), конъюгированным с белкомносителем. Два кролика для каждого пептида иммунизировали в 0, 3, 6 и 10 неделю, и образцы крови были собраны на 7 и 11 неделе. Вторые образцы крови были аффинно очищены на колонках с аффинным белком. Антитела были названы Ат-1 и Ат-2, в соответствии с пептидами.

Вестерн-блот: 2 х 10⁶ клеток Н1В5, стабильно трансфицированных кДНК нейбластина (Н^Ь5рυЬ^1ζNВN22), или нетрансфицированных клеток Н1В5 инкубировали в течение ночи в бессывороточной среде с добавлением N (С1ВС0). Среду концентрировали на небольших концентраторах с нарезанными мембранами на 5 кД (М1Шроге, ВебГогб, МА). К концентрированным образцам добавляли 5 х буфер для образцов Лэммли и нагревали до 95°С в течение 5 мин. Образцы разделяли с помощью электрофореза в БОБ полиакриламидном геле в 15% акриламидных гелях и переносили на мембраны РУЭР. Оставшиеся белок-связывающие сайты были блокированы 5% раствором обезжиренного сухого молока в ФСБ с 0,1% твином-20. Мембраны инкубировали в течение ночи с антителами против нейбластина (1:1000), после чего инкубировали со вторыми антителами против 1дС кролика или мыши, конъюгированными с пероксидазой хрена (1:2000).

Визуализацию иммуноокрашивания проводили с помощью усиленной хемилюминисценции плюс (УХЛ+) в соответствии с инструкциями изготовителя (АтегкЬат). Результаты этих экспериментов показаны на фиг. 3 и в примере 5.

Используя стандартные способы, авторы также получили поликлональные антитела кролика против следующих пептидов:

пептид В27: СРСБВАВААСАВСС (аминокислоты 30-43 БЕС ΙΌ N0: 9);

пептид В28: ЬСНВБПЕЬУВРВРС (аминокислоты 57-70 БЕС ΙΌ N0: 9);

пептид В29: СВВАВБРНПЬБЬ (аминокислоты 74-85 БЕС ΙΌ N0: 9);

пептид В30: ЕВРРРСБВРУБСРС (аминокислоты 94-107 БЕС ΙΌ N0: 9);

пептид В31: БТ^ВТУЭКЬБАТАС (аминокислоты 123-136 БЕС ΙΌ N0: 9).

Только пептиды В30 и В31, расположенные относительно близко к С-концу, узнавали денатурированный белок при восстанавливающих условиях на вестерн-блоте.

<160> 33 <170> Патент Версия 2.0 <210> 1 <211> 865 <212> ДНК <213> Ното δδρίβπδ <220>

<221> Кодирующая последовательность <222> (120) .. (719) <220>

<221> 5'НТР <222> (1)..(119) <220>

<221> З'НТР <222> (721)..(865) <220>

<221> сигнальный пептид <222> (120)..(179) <220>

<221> зрелый пептид <222> (405)..(719) <220>

<221> тбзс-структура <222> (661)..(663) <223> КАРБОГИД: Гликозилированный аспарагин в положении Азп87 <220>

<221> тхзс-структура <222> (426)..(623) <223> ДИСУЛЬФИД - Суз8-Суз73 дисульфидный мостик <220>

<221> т1зс~структура <222> (507)..(707) <223> ДИСУЛЬФИД - Суз35-Суз101 дисульфидный мостик <220>

<221> тбзс-структура <222> (519)..(713) <223> ДИСУЛЬФИД - Суз39-Суз103 дисульфидный мостик <220>

<221> шхзс-структура <222> (616)..(619) <223> ДИСУЛЬФИД - Суз72-Суз72 дисульфидный мостик <400 1 сЕаддадссс асдсссддес Едассесаде ссдаддасад ссссЕессЕд аддсеесссс 6С сосссаадсс сассЕдддСд сссессеесе ссссдаддае ссасСЕддЕс ссЕссдсдс 119

асд ссс Мес Рго -95

дсс А1а

сед Беи

Едд ссс асе сед дсс

дсс сЕд дсс сЕд сЕд аде аде А1а Беи Айа Беи Беи Зег Зег

167

Тгр

Рго ТЬг -90

Беи

Айа

-85

-80

дсс

дса

дад

дсс

ССС

ссд

ддс

Ссс

дед

ссс

сдс

аде

ССЕ

дсс

ссс

сдс

215

Уа1

А1а

С1и

А1а

Зег -75

Беи

31у

Айа

Рго -70

Лтд

Бег

Рте

Айа

Ргэ -65

Агд

даа

сдс

ССС

ссд

ССС

дсс

сад

дед

Ссс

ССС

дсс

ддс

сас

сЕд

ссд

ЯЯЯ

263

С1и

С1у

Рго

Рго -6С

Рта

Уа1

Беи

Айа

Зег -55

Рго

Айа

01у

Н1з

Беи -50

Рго

Сйу

дда

сдс

асд

дсс

сдс

Сдд

сас

аде

ада

ада

дсс

едд

сад

ссд

сдс

сдс

311

С1у

Агд

ТЬг -45

А1а

Агд

Тгр

Суз

Зег -40

<31у

Агд

Айа

Агд

Агд -55

Рго

Агд

Агд

ада

сас

ссс

Ссд

дсс

сдс

дсс

ссс

дсс

дсс

Еде

асе

ссс

асе

Еде

Есе

359

Агд

Н£* -30

РЬе

Зег

А1а

Агд

А1а -25

Рго

А1а

Айа

Суз

ТЬг -20

?го

Не

Суз

Зег

Ссс

ссд

едд

дсс

сде

дед

дед

едд

ссд

ддд

ддс

едд

дса

дес

сдс

Ссд

4С7

Зег -15

Рго

Агд

Уа1

Агд

А1а -10

Айа

Агд

Беи

31/

С1у

Агд

Айа

Айа

Агд

Зег 1

ддс

аде

ЯЯЯ

ддс

дед

ЯЯЯ

Сдс

сдс

сед

сдс

Еед

сад

сед

дед

ссд

дед

455

С1у

Зег

С1у

С1у 5

А1е

31у

Суз

Агд

Баи 10

Агд

Зег

Ч.-1П

Беи

7а1 15

Ргз

Уа1

сдс

дед

СЕС

ддс

ссд

дсс

сас

еде

ссс

дас

дад

сЕд

дед

сдЕ

ЕЕ:

сдс

503

Агд

А1а

Беи 23

С1у

Беи

С1у

Ηίδ

Агд

Зег

Азр

С1и

Беи

ν&ι

Агд

РЬе

Агд

сес

еде

асе

ддс

Ссс

Сдс

ссд

сдс

дед

сдс

ЕСЕ

сса

сас

дас

ссс

аде

551

РЬе

Суз 35

ТЬг

с1у

Зег

Суз

Рго 40

Агд

Айа

Агд

Зег

Рго 45

Ей»

Азр

Беи

Зех

сед

дсс

аде

сса

сад

ддс

дсс

ЯЯЯ

дсс

ссд

еда

сед

ссс

ссд

дд:

Есе

599

50

А1а

Зег

Беи

Беи

61у 55

А1а

С1’/

Айа

Беи

Агд 60

Рго

Рго

Рго

С1у

Зег 65

едд

ССС

дсс

аде

сад

ссс

сдс

Сдс

еда

ссс

асд

сдс

ЕЭС

даа

дед

дсс

647

Агд

Рго

Уа1

Зег

С1п 70

Рго

Су»

Суз

Агд

Рго 75

ТЬг

Агд

Туг

21и

Айа 80

Уай

Ссс

С ЕС

аЕд

дас

дсс

аае

аде

асе

ъдд

ада

асе

дед

дас

сдс

СЕС

ССС

695

Зег

РЬе

Мее

Азр 85

Уа1

Аз η

Зег

ТЬг

Тгр 90

Агд

ТЬг

ν>1

А=р

Агд 95

Беи

Зег

дсс А1а

асе ТЬг

дсс А1а 100

сде Суз

ддс <31у

сдс Суз

ссд Беи

ЯЯ<= С1у 105

Сдадддсссд есссадддсс сс

дс-адасед

749

Список последовательностей дасссссасс ддкддсСскк сскдсскддд асссксссдс ададгсссас садссадсдд 809 ссссадссад ддасдааддс сксааадссд ададдсссск дссддсдддк сакдда 865 <210> 2 <211> 200 <212> белок <213> Ното зарйепв <400> 2

Мек

Рго

Айа

Ьеи

Тгр

Рго

ТЫ

Ьеи

Айа

Айа

Ьеи

Айа

Ьеи

Ьеи

Зег

Зег

-95

-90

-В5

-80

Уай

Айа

Сйи

Айа

Зег

Ьеи

Ойу

Зег

Айа

Рго

Агд

Зег

Рго

Айа

Рго

Агд

-75

-70

-65

Сйи

Ойу

?гс

Рго

Рго

Уай

Ьеи

Айа

Зег

Рте

Айа

Сйу

Ηίβ

Ьеи

Рго

Ойу

-60

-55

-50

Ойу

Агд

ТЬг

Айа

Агд

Тгр

Суз

Зег

Ойу

Агд

Айа

Агд

Агд

Рго

Агд

Агд

-45

-40

-35

Агд

ΕΪ3

РЬе

Зег

Айа

Агд

Айа

Рго

Айа

Айа

Суз

ТЫ

Рго

Не

Суз

Зег

-30

-25

-20

Зег

Рго

Агд

Уай

Агд

Айа

Айа

Агд

Ьеи

Сйу

<31у

Агд

Айа

Айа

Агд

Зег

-15

-10

-5

-1

1

Ойу

Зег

Сйу

Ойу

Айа

Сйу

Суз

Агд

Ьеи

Агд

Зет

С1п

Ьеи

Уай

Рго

Уай

5

10

-5

Агд

Айа

Ьеи

Сйу

Ьеи

Сйу

Н1з

Агд

Зег

Азр

С1и

Ьеи

Уай

Агд

РЬе

Агд

20

25

30

РЬе

Суз

ТЬг

Ойу

Зег

Суз

Рго

Агд

Айа

Агд

Зег

Рго

Нхз

Азр

Ьеи

Зег

25

40

45

Ьеи

Айа

Зег

Ьеи

Ьеи

Ойу

Айа

Сйу

Айа

ьеи

Агд

Рго

РГО

Рго

Ойу

Зег

50

55

60

65

Агд

Рго

Уай

Зег

Ойп

Рго

Суз

Суз

Агд

Рго

ТЫ

Агд

Туг

Сйи

Айа

Уай

70

75

80

Зег

РЬе

Мек

Азр

Уай

Азп

Зег

ТЬг

тгр

Агд

ТЬг

Уай

Азр

Агд

Ьеи

Зег

85

90

95

Айа

ТЬг

Айа

Суз

Ойу

Суз

Ьеи

Ойу

100

105

<210> 3 <211> 861 <212> ДНК <213> Ното зархепз <220>

<221> Кодирующая последовательность <222> (7)..(717) <220>

<221> 5ΉΤΡ <222> (1)..(6) <220>

<221> З’НТР <222> (718)..(861) <220>

<221> сигнальный пептид <222> (7).. (174) <220>

<221> зрелый пептид <222> (298)..(717) <220>

<221> зрелый пептид <222> (370).. (717) <220>

<221> зрелый пептид <222> (379)..(717) <220>

<221> гпдзс-структура <222> (661)..(663) <223> КАРБОГИД: Гликозилированный аспарагин в положении Азп122 <220>

<221> тхзс-структура <222> (424)..(621) <223> ДИСУЛЬФИД: Суз43-Суз108 дисульфидный мостик <220>

<221> тйзс-структура <222> (505)..(705) <223> ДИСУЛЬФИД: Суз70-Суз136 дисульфидный мостик <220>

<221> тйзс-структура <222> (517)..(711) <223> ДИСУЛЬФИД: Суз74-Суз138 дисульфидный мостик <220>

<221> тйзс-структура <222> (616)..(618) <223> ДИСУЛЬФИД: Суз107-Суз107 дисульфидный мостик между цепями <400> 3 дадссс асд асе аде скд аЬс Сса дсс еда дда сад ссс ссс екк дад43

Мек Рго 61у Ьеи Не Зег А1а Агд С1у С1п Рго Ьеи Ьеи С1и

-95 -90-85

дке екк Уай Ьеи

сек ссс

саа <31п

дсс сас сед ддк дсс скс ккк скс сек дад дек

96

Рго

Рго -80

Айа Нйз

Ьеи

Ойу А1а -75

Ьеи РЬе

Ьеи

Рго Ойи Айа -70

сса

екк

ддс

скс

ксс

дед

сад

С”

дсс

сСд

кдд

ссс

асе

ссд

дсс

дсс

144

Ьеи

Ну -65

Ьеи

Зег

Айа

С’п

Рго -60

Айа

Ьеи

Тгр

Рго

ТЫ -55

Ьеи

Айа

Айа

скд

дек

с кд

ссд

аде

аде

дсс

дса

дад

дсс

Ссс

скд

ддс

ССС

дед

ссс

192

Ьеи

Айа -50

Ьеи

Ьеи

Зег

Зег

Уай -45

Айа

Сйи

Айа

Зег

Ьеи -40

Сйу

Зег

А1а

Рго

сдс

аде

сек

дсс

ссс

сдс

даа

ддс

ссс

ссд

сск

дке

ссд

дед

Ссс

ссс

240

Агд -35

Зег

Рго

А1а

Рго

Агд -30

Сйи

Ойу

Рго

Рго

Рго -25

Уай

Ьеи

Айа

Зег

Рго -20

дсс

ддс

сае

с кд

ссд

ддд

дда

сдс

аса

дсс

сдс

кдд

Сдс

аде

дда

ада

288

Айа

Ойу

Нйз

Ьеи

Рго -15

Сйу

Сйу

Агд

ТЫ

Айа -йС

Агд

Тгр

Суз

Зег

сйу -5

Агд

дсс

едд

едд

ссд

ссд

ссд

сад

сск

сск

едд

ссс

дед

ссс

ссд

ссд

сск

336

Айа

Агд

Агд -1

Рго

Рго

Рго

Сйп

Рго 5

Зег

Агд

Рго

А1а

Рго 10

Рго

Рго

Рго

дса

ССС

сса

кек

дек

сск

ссс

сдс

ддд

ддс

сдс

дед

дед

едд

дсс

ддд

384

Айа

Рго 15

Рго

Зег

Айа

Ьеи

Рго 20

Агд

Ойу

Сйу

Агд

Айа 25

Айа

Агд

Айа

Сйу

ддс

сед

ддс

аас

сдс

дек

едд

дса

дед

ддд

ссд

едд

ддс

сдс

сдс

скд

432

Ойу 30

Рго

<31у

Азп

Агд

Айа 35

Агд

Айа

Айа

Сйу

Айа 40

Агд

Сйу

Суз

Агд

Ьеи 45

сдс

кед

сад

с кд

дкд

ссд

дед

сдс

дед

СкС

ддс

скд

еде

сас

сдс

ссс

480

Агд

Зег

С 1г.

Ьеи

Уай 50

РГО

Уай

Агд

Айа

Ьеи 55

Ойу

Ьеи

Сйу

Нхз

Агд 60

Зет

дас

дад

ссд

дкд

едк

ккс

сдс

ккс

сдс

аде

ддс

ксс

Сдс

сдс

сдс

дед

528

Азр

Сйи

Ьеи

Уай 65

Агд

РЬе

Агд

РЬэ

Суз 70

Зег

Ойу

Зег

Суз

Агд 7С

Агд

Айа

сдс

кек

сса

сае

дас

скс

аде

ссд

дсс

аде

ска

скд

ддс

дсс

ддд

дсс

576

Агд

Зег

Рго во

Ηίε

Азр

Ьеи

Зег

Ьеи 35

Айа

Зет

Ьеи

Ьеи

Сйу 90

Айа

Сйу

Айа

сζд

еда

ссд

ссс

ссд

ддс

Ссс

едд

ссс

дсс

аде

сад

ссс

Сдс

сдс

еда

624

Ьеи

Агд 95

Рте

Рго

Рго

С1у

Зег 100

Агд

Рго

Уа!

Зег

Сйп 105

Рго

Суз

Суз

Агд

ССС

асд

сдс

к ас

даа

дед

дсс

ссс

ксс

асд

дас

дке

аас

аде

асе

едд

672

?го 110

ТЫ

Агд

Туг

Сйи

Айа 115

Уай

Зег

РЬе

Мес

Азр 120

Уай

Азп

Зег

ТЫ

Тгр 125

ада Агд

асе ТЫ

дкд Уай

дас Азр

сдс Агд 130

скс Ьеи

ксс Зег

дсс Айа

аас Азп

ссс Рго 135

кде Суз

ддс Сйу

Сдс Суз

скд Ьеи

ддс Ойу 140

717

кдадддсксд скссадддск ккдсадаскд дасссккасс ддкддскскк сскдсскддд 777 асссссссдс ададксссас Садссадссд ссксадссад ддасдааддс сксааадссд 837 ададдсссск дссддсдддк дакд861 <210> 4 <211> 237 <212> белок <213> НотО зарйепз <400> 4

Мек

Рго

сйу

Ьеи

Не

Зег

Айа

Агд

С-йу

Сйп

Рго

Ьеи

Ьеи

Сйи

Уай

Ьеи

-95

-90

-85

Рго

Рго

Сйп

Айа

Н1з

Ьеи

Ойу

Айа

Ьеи

РЬе

Ьеи

Рго

Сйи

Айа

Рго

Ьеи

-80

-75

-70

Ойу

Ьеи

Зег

Айа

айп

Рго

Айа

Ьеи

Тгр

Рго

ТЫ

Ьеи

Айа

Айа

Ьеи

Айа

-65

-60

-55

-5С

Ьеи

Ьеи

Зег

Зег

Уай

Айа

Сйи

Айа

Зег

Ьеи

Ойу

Зег

Айа

Рго

Агд

Зег

-45

-40

-35

Рго

А! а

Рго

Агд

Сйи

Сйу

Ртз

Рго

Рго

Уай

Ьеи

Айа

Зег

Рго

Айа

ойу

-30

-25

-20

Нйз

Ьеи

Рго

Сйу

Сйу

Агд

ТЫ

Айа

Агд

Тгр

Суз

Зег

Сйу

Агд

Айа

Агд

-15

-10

-5

Агд

Рго

Рго

Рго

Сйп.

Рте

Зег

Агд

Рго

Айа

Рго

Рго

Рго

Рго

Айа

Рго

-1

5

10

15

Рго

Зег

Айа

Ьеи

Рго

Агд

Ойу

31у

Агд

Айа

Айа

Агд

Айа

Сйу

Сйу

Рго

20

25

ЗС

Ойу

Азп

Агд

Айа

Агд

А1а

Айа

ойу

А1а

Агд

Сйу

Суз

Агд

Ьеи

Агд

Зег

35

40

45

Сйп

Ьеи

Уай

Рго

Уай

Агд

Айа

Ьеи

Ойу

Ьеи

Сйу

Нйз

Агд

Зег

Азр

Сйи

50

55

60

Ьеи

Уай

Агд

РЬе

Агд

РЬе

Суз

Зет

Ойу

Зег

Суз

Агд

Агд

Айа

Агд

Зег

65

70

75

Рго

ΕΪ3

Азр

Ьеи

Зет

Ьеи

Айа

Зег

Ьеи

Ьеи

Сйу

Айа

Сйу

Айа

Ьеи

Агд

80

85

90

95

Рго

Рго

Рго

Сйу

Зег

Агд

Рго

Уай

Зег

Ойп

Рго

Суз

Суз

Агд

Рго

ТЫ

100

105

110

Агд

Туг

Сйи

Айа

Уа1

Зег

РЬе

Мек

Азр

Уай

АЗП

Заг

ТЫ

Тго

Агд

ТЬг

115

120

125

Уай

Азр

Агд

Ьеи

Зег

Айа

Азп

Рго

Суз

Ойу

Суб

Ьеи

Сйу

130

135

140

<210> 5 <211> 140 <212> белок <213> Ното зархепз <220>

<223> где Хаа в положении 134 означает Азп или ТЬг, и ¥аа в положении 135 означает А1а или Рго <400> 5

Рго

Рго

Рго

С1п

Рго

Зег

Агд

Рго

А1а

Рго

Рго

Рго

Рго

АХа

Рго

РГО

1

5

10

15

Зег

АХа

Ьеи

Рте

Агд

С1у

С1у

Агд

АХа

АХа

Агд

АХа

СХу

ЗХу

Рго

б!у

20

25

30

Азп

Агд

А1а

Ахд

АХа

А1а

<31у

А1а

Ахд

31у

Суз

Агд

Ьеи

Агд

Зег

С1п

35

40

45

Ьеи

Ча1

Рго

ЧаХ

Агд

АХа

Ьеи

СХу

Ьеи

СХу

ΗΪ3

Агд

Зег

Аяр

СХи

Ьеи

50

35

60

Ча1

Агд

РЬе

Агд

РЬе

Суз

Зет

С1у

Зег

Суз

Агд

Агд

А1а

Агд

Зет

РГО

65

70

75

80

Н15

Азр

Ьеи

Зег

Ьеи

АХа

Зег

Ьеи

Ьеи

<51у

А1а

С1у

АХа

Ьеи

Агд

Рго

85

90

95

Рго

Рго

<ЗХу

Зег

Агд

Рго

Ча1

Зег

С1п

Рго

Суз

Суз

Агд

Рго

ТЬг

Агд

ЮО

105

110

Туг

ЗХи

А1а

Ча1

Зег

РЬе

Не С

Азр

Ча1

Азп

Зег

Т.Ъг

Тгр

Агд

ТЬг

Ча1

115

120

125

Азр Агд Ьеи	Зег А1а Хаа Уаа Суз <5Χν	Суз Ьеи ЗХу
130	135	140

<210> б <211> 116 <212> белок <213> Ното зархепз <220>

<223> где Хаа в положении 110 означает Азп или ТЬг, и Уаа в положении 111 означает А1а или Рго

<400> 6

А1а

АХа

Агд

А1а

С1у

б1у

Рго

С1у Азп

Агд

А1а

Агд

А1а

АХа

СХу

АХа

1

5

10

15

Агд

С1у

Суз

Агд

ьеи

Агд

Зех

31п Ьеи

ЧаХ

РГО

Ча1

Агд

АХа

Ьеи

С1у

20

25

30

Ьеи

<31у

Н1з

Ахд

5ег

Азр

С1и

Ьеи Уа1

Агд

РЬе

Ахд

РЬе

Суя

Зег

СХу

35

40

45

Зег Суз Агд Агд А1а Агд Зег Рго Н1з Азр Ьеи Зег Ьеи А1а Зег Ьеи

5560

Ьеи С1у А1а С1у А1а Ьеи Агд Рго Рго Рго С1у Зег Агд Ргс Уа1 Зег

70 7580

С1п Ргс Суз Суз Агд Рхо ТЬг Агд Туг <51и А1а Ча1 Зег РЬе МеС Азр 05 9095

Ча1 Азп Зег ТЬг Тгр Агд ТЬг Ча1 Азр Ахд Ьеи Зег А1а Хаа Уаа Суз

ЮС 105110

С1у Суз Ьеи С1у

115 <210> 7 <211> 113 <212> белок <213> Ното зархепз <220>

<223> где Хаа в положении 107 означает Азп или ТЬг, и Уаа в положении 108 означает АХа или Рго <400> 7

А1а С1у 1

<31у Рго С1у Азп 5

Агд А1а Агд

А1а АХа СХу А1а 10

Аге СХу Суз 15

Агд

Ьеи

Агд

Зег

С1п

Ьеи

Ча1

Рго

Ча1

Агд

А1а

Ьеи

С1у

Ьеи

СХу

Ηί3

20

25

30

Ахд

Зег

Азр

(31и

Ьеи

Ча1

Агд

РЬе

Агд

РЬе

Суз

Зег

СХу

Зег

•Суз

Агд

35

40

45

Агд

АХа

Агд

Зег

Рго

И1з

Азр

Ьеи

Зет

Ьеи

А1а

Зег

Ьеи

Ьеи

СХу

А1а

50

55

60

С1у

А1а

Ьеи

Агд

Рго

Рго

Рго

О1у

Зег

Агд

Рго

Ча1

Зег

ЗХп

Ргс

Суз

65

70

75

80

Суз

Агд

Ргс

ТЬг

Агд

Тут

СХи

А1а

ча!

Вег

РЬе

МеС

Азр

ЧаХ

АЗП

Зег

85

90

95

ТЬг

Тгр

Агд

ТЬг

Ча1

Азр

Агд

Ьеи

Зег

А1а

Хаа

Уаа

Суз

С Χν

Суз

Ьеи

100

105

хх'о

<51у

<210>

8

<211>

861

<212>

ДНК

<213>

Ното зархепа

<220>

<221> Кодирующая последовательность <222> (58)..(717) <220>

<221> 5ΉΤΡ <222> (1).. (57) <220>

<221> З'НТР <222> (718)..(861) <220>

<221> сигнальный пептид <222> (58) . . (174) <220>

<221> зрелый пептид <222> (298)..(717) <220>

<221> зрелый пептид <222> (370).. (717) <220>

<221> зрелый пептид <222> (379) .. (717) <220>

<221> тхзс-структура <222> (661)..(663) <223> КАРБОГИД: Гликозилированный аспарагин в положении Азп122 <220>

<221> тгзс-структура <222> (424)..(621) <223> ДИСУЛЬФИД: Суз43-Суз108 дисульфидный мостик <220>

<221> т1зс-структура <222> (505)..(705) <223> ДИСУЛЬФИД: Суз70-Суз136 дисульфидный мостик <220>

<221> шхзс-структура <222> (517)..(711) <223> ДИСУЛЬФИД: Суз74-Суз138 дисульфидный мостик <220>

<221> тхзс-структура <222> (616)..(618) <223> ДИСУЛЬФИД: Суз107-Суз107 дисульфидный мостик между цепями <400> 8 аддадддсдд дддаасадсе саасааСддс СдаСдддсдс СссОддодсс дасадад57 аСд даа есс дда сСС дда ддс есс Ссс асд сед Ссс сас Сдс ссс Сдд105

МеС С1и Ьеи С1у Ьеи С1у С1у Ьеи Зег ТЬг Ьеи Зег Нхз Су в РгоТгр

-80 -75 -70-65

ссе адд сдд сад ссь дсс Рго Агд Агд СХп Рго А1а

ссд сдд ссс асе еСд дсс дсс сСд

дсс сед АХа Ьеи -50

153

Ьеи

Тгр

Рго ТЬг -55

Ьеи

А1а АХа Ьеи

-60

сьд

аде

аде

дСс

дса

дад

дсс

Ссс

ссд

ддс

Ссс

дед

ссс

сдс

аде

ссС

201

Ьеи

Зег

Зег

Ча1

АХа

СХи

АХа

Зег

Ьеи

С1у

Зет

АХа

Рго

Агд

Зег

РГО

-45

-40

-35

дсс

ссс

сдс

даа

ддс

ссс

ссд

ссс

дсс

сСд

дед

Ссс

ссс

ЯСС

ддс

сас

249

А1а

Рго

Агд

О1и

С1у

Рго

Рго

Рго

Ча1

Ьеи

АХа

Зег

РГО

АХа

С1у

НХз

-30

-25

-20

сСд

ссд

ддд

дда

сдс

асд

дсс

сдс

Сдд

еде

аде

дда

ада

дсс

сдд

сдд

297

Ьеи

Рго

СХу

С1у

Агд

ТЬг

АХа

Агд

Тгр

=У5

Зет

СХу

Ахд

АХа

Агд

Агд

-15

-10

-э

-1

ссд

ссд

ссд

сад

ссС

Ссс

сдд

ссс

дед

ССС

ссд

ссд

есс

дса

ССС

сса

345

Рго

Рго

Рго

С1п

Рго

Зех

Агд

Рго

А1а

Ргс

Рго

Рго

Ргс

АХа

Рго

Рте

1

5

10

15

ссс

дсс

есс

ссс

еде

ддд

ддс

сдс

дед

дед

сдд

дсс

дд?

ддс

ссд

ддс

393

Зег

А1&

Ьеи

Рго

Агд

СХу

СХу

Агд

АХа

А1а

Агд

АХа

СХу

СХу

Рго

СХу

20

25

30

аде

сдс

дсс

сдд

дса

дед

ддд

дед

сдд

ддс

сде

сдс

сед

сде

ссд

сад

441

Зег

Агд

А1а

Ахд

АХа

АХа

С1у

АХа

Агд

С1у

Суз

Агд

Ьеи

Агд

Зег

СХп

35

40

45

сСд

дСд

ссд

дСд

сдс

дед

еСс

ддс

сСд

ддс

сас

сдс

Ьсс

дас

дад

ссд

489

Ьеи

ЧаХ

Рго

ЧаХ

Ахд

А1а

Ьеи

СХу

Ьеи

С1у

Н1з

Ахд

Зег

Азр

С1и

Ьеи

50

55

60

д^д

сдс

ССС

сдс

ССс

сдс

аде

ддс

ССС

сдс

сдс

сдс

дед

сдс

есс

сса

537

Ча1

Агд

РЬе

Агд

РЬе

Суз

Зег

81у

Зег

Суз

Агд

Агд

А1а

Агд

Зег

Рго

65

70

75

80

сас

дас

сСс

аде

еСд

дсс

аде

сса

сед

ддс

дсс

ддд

дсс

сид

еда

ссд

585

ΗΪ3

Азр

Ьеи

Зег

Ьеи

А1а

Зег

Ьеи

Ьеи

С1у

А1а

(51у

АХа

Ьеи

Агд

Рго

85

90

95

ссс

ссд

ддс

ССС

сдд

ссс

дсс

аде

сад

ССС

Сдс

еде

еда

ссс

асд

сдс

633

Ргс

Рго

С1у

Зег

Агд

Рго

ЧаХ

Зег

С1п

Рго

Суз

Суз

Агд

Рго

ТЬг

Агд

100

105

110

Сас

даа

дед

дсс

ССС

ССС

аСд

дас

дСс

аас

аде

асе

йдд

ада

асе

дед

681

туг

С1и

А1а

Ча1

Зег

РЬе

МеС

Азр

Ча1

Азп

Зег

ТЬг

Тгр

Агд

ТЬг

Ча1

115

120

125

дас

сдс

ссс

Ссс

дсс

асе

дсс

Сдс

ддс

сдс

ссд

ддс

Сдадддсс

;сд

727

Азр

Агд

Ьеи

Зег

А1а

ТЬг

А1а

Суг

С1у

Суз

Ьеи

С1у

130 135 140 сСссадддсС сСдсадасЬд дасссССасс ддСддсСсСС ссСдссСддд асссСсссдс 787 ададссссас Садссадсдд ссСсадсеад ддасдааддс сСсааадсСд ададдссссС 847 ассддсдддс дасд ³⁶¹

<210>	9
<211>	220
<212>	белок
<213>	Ното ;
<4Э0>	9

МеС <31и Ьеи С1у Ьеи С1у

С1у Ьеи

Зег ТЬг Ьеи Зег Низ -73

Суз

Рго

Тгр -65

-80

-75

Рго

Агд

Агд

С1п

Рго

А1а

Ьеи

Тгр

Рго

Таг

Ьеи

А1а

АД а

Ьеи

А1а

Ьеи

-60

-55

-50

Ьеи

Зег

Зег

Уа1

А1а

С1и

А1а

Зег

Ьеи

•31у

Зег

А1а

Рго

Агд

Зег

Рго

-45

-40

-35

А1а

Рго

Агд

С1и

С-1у

Рго

Ргс

Рго

7а1

Ьеи

А1а

Зег

Рго

А1а

<31у

ΗΪ5

-30

-25

-20

Ьеи

Рго

С1у

С1у

Ахд

Тег

А1а

Агд

Тгр

Суя

Зег

С1у

Агд

А1а

Агд

Агд

-15

-10

-5

Рго

Рго

Рго

С1п

Рго

Зег

Агд

Рго

А1а

Рго

Рго

Рго

Рго

А1а

Рго

Рго

1

5

10

15

Зег

А1а

Ьеи

Рго

Агд

б!у <31у

Агд

А1а

А1а

Агд

А1а

51у

31у

Рго

С1у

20

25

30

5ет

Агд

А1а

Агд

А1а

А1а

(31у

А1а

Агд

С1у

Суз

Агд

Ьеи

Агд

Зег

С1п

35

40

45

Ьеи

ν»ι

Рго

Уа1

Агд

А1а

Ьеи

<31у

Ьеи

б1у

ΗΪ3

Агд

Зег

Азр

С1и

Ьеи

50

55

60

V»!

Агд

РЬе

Агд

РЬе

Суз

Зег

С1у

Зег

Суз

Агд

Агд

А1а

Агд

Зег

Рго

65

70

75

80

ΗΪ5

Азр

Ьеи

Зег

Ьеи

А1а

Зег

Ьеи

Ьеи

С1у

А1а

С1у

А1а

Ьеи

Агд

Рго

В5

90

95

Рго

Рго

С1у

5ег

Агд

Рхо

Уа1

Зег

С1п

Ргэ

Суз

Суз

Агд

Рго

ТЬг

Агд

100

105

110

Туг

О1и

А1а

7а1

Зег

РНе

Мес

Азр

Уа1

Азп

Зег

ТЬг

Тгр

Агд

ТЬг

Уа1

115

120

125

Азр

Агд

Ьеи

Зег

А1а

ТНг

А1а

Суз

О1у

Суз

Ьеи

С1у

130

135

140

<210> 10 <211> 140 <212> белок <213> Ното зархепз <220>

<221> КАРБОГИД <222> (122) <223> гликозилированный аспарагин <400> 1С

Рго 1

Рго

Рго

С1п

Ргэ Зег Агд Рго А1а Рго Рго Рго Рго А1а Рго Рго

5

10

15

Зег

А1а

Ьеи

Рго

Агд

С1у

С1у

Агд

А1а

А1а

Агд

А1а

С1у

С1у

Рго

01 у

20

25

30

Зег

Агд

А1а

Агд

АД а

А1а

С1у

А1а

Агд

О1у

Суз

Агд

Ьеи

Агд

Зег

С1п

35

40

45

Ьеи

Уа1

Рго

ν»ι

Агд

А1а

Ьеи

(51у

Ьеи

С1у

ΗΪ5

Агд

Зег

Азр

31и

Ьеи

50

55

6С

Уа1

Агд

РИе

Агд

РЬе

Суз

Зег

61у

Зег

Суз

Агд

Агд

А1а

Агд

Зег

Рго

65

70

75

80

ΗΪ5

Азр

Ьеи

Зег

Ьеи

А1а

Зег

Ьеи

Ьеи

С1у

А1а

С1у

А1а

Ьеи

Агд

Рго

85

90

95

Рго

Рго

С1у

Зег

Агд

Ргс

νβΐ

Зег

С1п

Ргс

Суз

Суз

Агд

Ргс

ТЬг

Агд

100

105

110

Туг

31и

А1а

7а1

Зег

РЬе

МеС

Азр

7а1

Азп.

Зег

ТЬг

Тгр

Агд

ТЬг

Уа1

115

120

125

Азр

Агд

ьеи

Зег

А1а

ТЬг

А1а

суз

С1у

Суз

Ьеи

-31у

.30 135 140 <210> 11 <211> 116 <212> белок <213> Ното зархепз <220>

<221> КАРБОГИД <222> (98) <223> гликозилированный аспарагин

<400> 11

А1а

А1а

Агд

А1а

С1у

&1у

Рго

С1у

Зег

Ахд

А1а

Агд

А1а

А1а

е1у

А1а

1

5

10

15

Агд

С1у

Суз

Агд

Ьеи

Агд

Зег

С1п

Ьеи

νβΐ

Рго

Уа1

Агд

А1а

Ьеи

31у

20

25

30

Ьеи

С1у

Ηίβ

Агд

Зег

Азр

С1и

Ьеи

Уа1

Агд

РЬе

Агд

РЬ.е

Суз

Зег

<31 у

35

40

45

Зег

Суз

Агд

Агд

А1а

Агд

Зег

Рго

ΗΧΞ

Азр

Ьеи

Зег

Ьеи

А1а

Зег

Ьеи

50

55

60

Ьеи

С1у

А1а

С1у

А1а

Ьеи

Агд

Рго

Рго

Рте

С-1у

Зег

Агд

Рго

7а1

Зег

65

70

75

80

С1п

Рго

суз

Суз

Агд

Рго

ТЬг

Агд

Туг

31и А1а Уа1

Зег РЬе

МеС

Азр

85

90

95

Уа1

АЗП

Зег

ТЬг

Тгр

Агд

ТЬг

Уа1

Азр

Агд Ьеи Зег

А1а ТНг

А1&

Суз

100

105

110

СПу

Суз

Ьеи

61у

115

<210> 12 <211> 113 <212> белок <213> Ното заргепз <220>

<221> КАРБОГИД <222> (95) <223> гликозилированный аспарагин <400> 12

А1а

С1у

С1у

Ргэ

С1у

Зех

Агд

А1а

Агд

А1а

А1а

С1у

А1а

Ахд

е1у

Суз

1

5

10

15

Агд

Ьеи

Агд

Зег

<Э1п

Ьеи

νβΐ

Рго

Уа1

Агд

А1а

Ьеи

С1у

Ьеи

С1у

Н1з

20

25

30

Ахд

Зег

Азр

31и

Ьеи

Уа1

Агд

РЬе

Ахд

РЬе

Суз

Зех

О1у

Зег

Суз

Ахд

35

40

45

Агд

АД а

Агд

Зег

Рго

Нхз

Азр

Ьеи

Зег

Ьеи

А1а

Зех

Ьеи

Ьеи

С1у

А1а

50

55

60

61у

А1а

Ьеи

Ахд

Рго

Рго

Рго

С1у

5ег

Ахд

Рго

νβΐ

Зег

<31п

Рхо

Суз

65

70

75

ВО

Суз

Агд

Рго

ТЬх

Ахд

Тух

<3хи

А1а

Уа1

Зег

РЬе

Мес

Азр

Уа1

Азп

Зет

85

90

95

ТЬх

Тхр

Ахд

ТЬг

Уа1

Азр

Ахд

Ьеи

Зег

А1а

ТЬх

А1а

Суз

С1у

Суз

Ьеи

100

105

110

С1у <210> 13 <211> 102 <212> ДНК <213> Ното зархепз <400> 13 ссЕддссадс сЕасЕдддсд ссддддсссЕ дсдассдссс ссдддсЕссс ддсссдСсад 60 ссадссседс Едссдассса адсдсеасда адсддесссс ЬС 102 <210> 14 <211> 220 <212> ДНК <213> Мигхпае деп.зр.

<400> 14
ддссассдсС	ссдасдадсс	даСасдСЬСс	сдсЕЕсЬдса	дсддсьсдед	ссдссдадса	60
сдсисосадс	асдассисад	ЕсЕддссадс	сСасхдддсд	сиддддсссе	асддесдссС	120
сссдддсссс	ддссдассад	ссадссседс	Сдссддссса	сьсдсЬайда	ддссдСсСсс	180
ССсаСддасд	сдаасадсас	сСддадаасс	дЬддассдсс			220

<210> 15 <211> 2136 <212> ДНК <213> Миг1пае деп.зр.

<220>

<221> Кодирующая последовательность <222> (975).. (1646) <400 15

дсддссдсда	аЕЕсддсасд	адддсдссЕс	дсЕдсасссс	дсдассЕсЕа	сЕсЕдесссс	60
хддддессье	ЕсеаааЕдЕс	Еадсссссас	схададддас	сЕадссЕадс	садсддддас	120
сддаиссдда	дддЕддадсд	дссаддЕдад	ссссдааадд	еддддеддггд	сдддддсдсЕ	180
сьдддсссса	ссссдддаЕс	Еддсдасдсс	ддддссддаа	ЕСЕдасассд	даеддеддед	240
здгаддаддг	ЕдсЕдаддда	ЕддадЕЕддд	сЕсддссссс	адасдсддсс	сдсдддсесс	300
дгсадсааса	адЕсссЕсдд	дссссадссс	есдстдсдас	ЕддддсЕЕдд	адсссЕдсас	360
ссаадддсас	адаседдсЕд	ссааддсссс	асЕЕЕЕаасЕ	аааададдсд	ссдссаддЕд	420
сасаасесхд	ддсаЕдаЕсс	асЕЕдадсЕЕ	едддддааад	сссадсасЕд	десссаддад	480
аддсдсссад	ааддасасдд	ассаддассс	сгссддсаЕд	дадЕдаасдс	сдадсасдда	540
дйддааддаа	сЕсаадссас	тасЕсЕсЕсс	аассаесссд	дсасссссад	сссЕдаадса	вег
сададсадаа	дддЕсЕЕада	адасаддасс	асадсЕдЕдс	дадЕсЕСССС	ссЕдаддссЕ	660
садасдахст	сЕдадсЕсад	сЕдадсЕЕсд	ЕЕЕдсссаЕс	ЕддадаадЕд	адссаЕЕдаЕ	720
СдассСедед	дсаЕсдсдаа	ддаасаддЕс	сЕдссаадса	ссСаасасад	ададсааддЕ	780
Ьсьссассдс	адссассдсЕ	дссдадссда	сЕссадссас	СссаассЕсс	ЕдддСсдсЕЕ	840
едададассд	дадеддаадд	аддаасассс	саааддаЕаа	сЕаасЕсаЕс	ЕЕСсадЕЕЕд	900
саадссдссд	саддаададд	дЕддддааас	дддсссасда	аддсЕЕЕсда	сдддадсСЕс	960
Еддадссдаа	адсЕ аЕд даа сед дда сее дса дад МеС С1и Ьеи С1у Ьеи А1а С1и 1 5	ссе аст дса ЕЕд ссс Рго ТЬх А1а Ьеи Зех 10	1010
сас Еде спс едд ссС адд :дд сад сса дсс Едд ΗΪ3 Суз Ьеи Агд Рго Ахд Тгр С1п Зет А1а Тгр 15 20	Едд сса асе Тгр Рго ТЬх 25	: сЕа дсЕ ' Ьеи А1а	1058

дсс сса дсс сед

сед аде

Сдс дес аса даа дес Ссс сСд дас сса аед

1106

ν·ι

Ьеи 30

Айа

Ьеи

Ьеи

Зег

Суз Уай ТНг 35

Ойи А1а

Зег 40

Ьеи Азр Рго Мес

Ссс

сдс

аде

ссс

дес

дес

сдс

дас

дде

ссс

еса

ссд

дСс

ссд

дед

ссс

1154

Вег 45

Агд

Зег

Рго

Айа

А1а 50

Агд

Азр

С1у

Рго

Зег 55

Рте

Уай

Ьеи

А1а

Это 60

ссе

асд

дас

сас

сед

ссе

ддд

дда

сас

асе

дед

еас

сед

сдс

аде

даа

1202

Эхо

ТНг

Азр

Ейз

Ьеи 65

Эго

31у

Ойу

Н1з

ТЬт 70

А1а

Н1з

Ьеи

Суз

Зег 75

О1и

ада

асе

сед

еда

сес

сед

ссс

сад

ССС

ссе

сад

ссс

дса

ссс

ссд

ссд

125С

Агд

ТНг

Ьеи

Агд 80

Рго

Рго

Рго

Сйп

Зег 85

Рго

Сйп

Рго

Айа

Ргс 90

Рго

Рго

ООО

ддс

ссс

дед

ссс

сад

ссс

ссс

ссс

дсе

дед

=Сс

сдс

ддд

дса

ссс

1298

ЭГО

С1у

Эго 95

Айа

Ьеи

Сйп

Зег

Рго 100

РГО

Айа

Айа

Ьеи

Агд 105

в1у

А1а

Агд

дед

дед

еде

дса

дда

асе

едд

аде

аде

сдс

дса

едд

асе

аса

дас

дед

1346

Айа

Айа 110

Агд

Айа

С1у

ТНг

Агд

Зег

Заг

Агд

Айа

Агд 120

ТНг

ТНг

Азр

Айа

сдс

дде

еде

сдс

сед

сдс

сед

еад

сед

дед

ссд

дед

аде

дед

сес

ддс

1394

Агд 125

С1у

Суз

Агд

Ьеи

Агд 130

Зег

С1п

Ьеи

Уа1

Рго 13 5

Уа1

Зег

Айа

Ьеи

С1у 140

сса

дде

сас

аде

ссс

дас

дад

сед

аса

сдС

ссс

сдс

есс

Сдс

аде

дде

1442

Ьеи

С1у

Яйз

Зег

Зег 145

Авр

31и

Ьеи

Не

Агд 150

Рае

Агд

РЬе

Суз

Зег 155

Зйу

есд

еас

сдс

еда

дса

сдс

есс

сад

сас

дас

сес

аде

сед

дсс

аде

сСа

1490

Зег

Суз

Агд

Агд 16С

Айа

Агд

Зег

Ойп

Н1з 155

Азр

Ьеи

Зег

Ьеи

Айа 170

Зег

Ьеи

сед

ддс

дсе

ддд

дес

сСа

едд

Сед

ссе

ссс

Я59

Ссс

едд

сед

асе

аде

1535

Ьеи

Ойу

Айа 175

О1у

А1а

Ьеи

Агд

Зег 190

Рго

Рго

□1у

Зег

Агд 185

Рго

11а

Зег

сад

ссе

Сдс

сдс

едд

ссс

асе

сдс

Сас

дад

дсс

дсс

ссс

есс

аед

дас

1586

О1п

Рго 190

Суз

Суз

Агд

Рго

ТНг 195

Агд

Туг

О1и

Айа

Уа1 200

Зег

?Нв

Нес

Азр

дед

аас

аде

асе

едд

адд

асе

дед

дас

сас

ССС

Ссс

дсс

асе

дсс

сдс

1634

Уай 205

Аз η

Зег

ТНг

Тгр

Агд 210

ТЬт

Уай

АЗр

ΗΪ3

Ьеи 215

Зет

А1а

ТНг

Айа

Суз 220

ддс <31у

сдс Суз

сСд Ьеи

ддс Ойу

СдаддаСдаС ссасссссаа дссСеСдеас асСадассса

1686

сдедссдссс	сасседдаас	адсессассд	ддесСсэсСа	ассаддадсс	СсаасСсадс	1746
аддаеасдда	ддседсадад	сСсаддееее	аддесддсда	дСдасадасд	есдссддсаС	1806
дасадасада	дсдааадасд	есддаассае	Сдассаасад	сессаадссд	еесаеддасс	1866
осадссссас	адасаддада	ааесссадсе	ааададаасс	ссСсСдддад	ааСссадааа	1926
сддсссссед	СссСддддаа	СдааССССда	ададаеаСас	аеасаСасаС	асаседсаде	1986
сдедеедсСд	дассадссСд	едседааасс	адссссдедС	ссасседСдд	аадссдаадс	2046
сссасесаее	ассесеааас	еасссасеса	ссседааааа	ааасддссаа	десддссхсс	2106

сСССадСдад ддССааСССд СдаСсссддд <210> 16 <211> 224 <212> белок <213> Мигйпае деп.зр.

<400> 16

Мес 1

Сйи

Ьеи

Ойу

Ьеи 5

Айа

Ойи

Рго

ТНг

Айа 10

Ьеи

Зег

Ηίβ

Суз

Ьеи 15

Агд

РГО

Агд

Тгр

Сйп 20

Зег

Айа

Тгр

Тгр

Рго 25

ТНг

Ьеи

Айа

Уай

Ьеи 30

Айа

Ьеи

Ьеи

Зег

Суз 35

V»!

ТЕг

Ойи

Айа

Зег 40

Ьеи

Азр

Это

МеС

Зег 45

Агд

Зег

Рго

Айа

Айа 50

Агд

Азр

Ойу

Рго

Зег 55

Рго

Уай

Ьеи

А1а

Рго 60

Рго

ТНг

Азр

Нйз

Ьеи 65

Рго

О1у

Ойу

Н1з

ТНг 70

А1а

ΗΪ5

Ьеи

Суз

Зег 75·

Ойи

Агд

ТНг

Ьеи

Агд 80

Рго

Рго

Рго

61п

Зег 85

Рго

С1Г.

Рго

Айа

Эго 90

Ргс·

Эго

Рго

ойу

Рго 95

Айа

Ьеи

Сйп

Зег

Рго 100

Рго

Айа

Айа

Ьеи

Агд 105

Ойу

Айа

Агд

А1а

Айа но

Агд

Айа

Ойу

ТНг

Агд 115

Зег

Зег

Агд

Айа

Агд 120

ТЬт

ТНг

Азр

Айа

Агд 125

ойу

Суз

Агд

Ьеи

Агд 130

Зег

Сйп

Ьеи

Уа1

Рго 13 5

Уа1

Зег

Айа

Ьеи

Ойу 140

Ьеи

ойу

ΗΪ5

Зег

Зег 145

Азр

Сйи

Ьеи

Не

Агд 150

РЬе

Агд

РЬе

Суз

Зег 155

О1у

Зег

Суз

Агд

Агд 160

А1а

Агд

Зег

Ойп

Нйз 165

Азр

Ьеи

Зег

Ьеи

Айа 170

Зег

Ьеи

Ьеи

Ойу

А1а 175

Ойу

Айа

Ьеи

Агд

Зег 180

Рго

Рго

Ойу

Зег

Агд 185

Рго

Не

Зег

О1п

Рго 190

Суз

Суз

Агд

РГО

ТНг 195

Агд

Туг

О1и

Айа

Уай 2С0

Зег

РЬе

МеС

Азр

ν<1 205

АЗП

Зег

ТНг

Тгр

Агд 210

ТЬт

Уай

Азр

Ей 5

Ьеи 215

Зег

Айа

ТНг

Айа

суз 220

Ойу

Суз

Ьеи

Ойу

<210> 17 <211> 18 <212> ДНК <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> Описание синтетической проследовательности: ПЦР праймер <400> 17 ссСддссадс сьасСддд <210> <211> <212>

<213>

<220>

<223>

ДНК

Синтетическая последовательность

Описание синтетической последовательности:

<400> 18 ааддадассд сСЬсдсадсд <210>

<211>

<212>

<213>

<220>

<223>

днк

Синтетическая последовательность

Описание синтетической последовательности:

<400> 19 асддаасссд дасССдд <210> <211> <212>

<213>

<220>

<223>

ДНК

Синтетическая последовательность

Описание синтетической последовательности:

<400> 20 сссассассс ассддс <210> <211> <212>

<213>

<220>

<223>

ДНК

Синтетическая последовательность

Описание синтетической последовательности:

<400> 21 ддссассдсС ссдасдад <210>

<211>

<212>

<213>

<220>

<223>

ДНК

Синтетическая последовательность

Описание синтетической последовательности:

<400> ддсддЬссас ддсесСссад <210> <211> <212>

<213>

<220>

<223>

ДНК

Синтетическая последовательность

Описание синтетической последовательности:

<400> 23 ссаадсссас сйдддсдссс ЬсссссЬсс <210>

<211>

<212>

<213>

<220>

<223>

ДНК

Синтетическая последовательность

Описание синтетической последовательности:

<400> 24 саСсасссас сддсаддддс сссЬсад <210> <211> <212>

<213>

<220>

<223>

ДНК

Синтетическая последовательность

Описание синтетической последовательности:

<400> 25 дадсссаСдс ссддссЬдас ссадсссда ддаса <210>

<211>

<212>

<213>

<220>

<223>

ДНК

Синтетическая последовательность

Описание синтетической последовательности:

ПЦР праймер

ПЦР праймер

ПЦР праймер

ПЦР праймер

ПЦР праймер

ПЦР праймер

ПЦР праймер

ПЦР праймер

ПЦР праймер <400> 26 ссссддссда ддссдсСддс СадЬдддасс сСдс <210> <211> <212> <213>

<220>

<223>

ДНК

Синтетическая последовательность

Описание синтетической последовательности: зонд для гибридизации <400> 27 псаддЕддЕс сдЕддддддс дссаадассд д <210> <211> <212>

<213>

ДНК

Синтетическая последовательность <220>

<223>

Описание синтетической последовательности: ПЦР праймер <210>

<211>

<212>

<213>

351

ДНК

Ното зар1епз :400> 29 асддсЕддад дассдддаЪс

СсдСдсЬсдС дсадсаддад сг1сдСдд=Ед ЕсдЕссдсдс :сСсаасСад ЕдссддСдсд

ЕдсасСсдда сЕдддасасс дЕЕссдасда ассадсасдг

0 слссдсссс:

дЕЕсаддасс ьсдсадсгдс. дсасдЕЕССс ссгсасда се аЕсЕсЕадса

180

ЕсЕссасЕад дадссддадс ассаадассд ссдссдддаС ссадасс дс аЕсСсаассЕ

240

Едьсдсадас :сассада£а сдаадсадЕа ЕсЕЕЕсасдд асдСааа сс ЕасаЕддада

ЗСО ассдЕадаЕа дасЕаЕСЕдс аассдсаЕдЕ ддсЕдЕсСад саСдасааЕа д

351 <210>

<211>

<212>

<213>

414

ДНК

Ното зарДепз <400> 30 аЕдддссаЕс аЕсаЕсаЕса

ЕсаЕсаЕсаЕ саЕсасесда дсддссаеае сдасдасдас дасааддсСд даддассддд аесссдЕдсЕ сдсдсадсад дадсасдЕдд ссдссдЕСЕд

123 сдЕЕсЕсаас ЕадЕдссддЕ дсдсдсасСс ддасЕдддас ассдЕЕссда сдаассадса

180 сдЕЕЕЕсдсЕ ЕЕЕдЕЕсадд аЕсЕЕдесдЕ сдЕдсасдЕЕ сессдсаЕда ЕсЕаЕсссЕа

240 дсаЕсЕсЕас Еаддадссдд адсасЕаада ссдссдссдд дассЕадасс ЕдЕаЕсЕсаа

300 ссЕЕдЕЕдЕа дассЕасЕад аЕасдаадса дЕаЕсЕЕЕса ЕддасдЕааа сЕсЕасаЕдд

360 адаассдЕад аЕадасЕаЕс <210> <211> <212> <213>

Едсаассдса

ДНК

Синтетическая :дСддеЕд~с ЕаддаЕдаЕа аЕад последовательность

414 <220>

<223>

Описание синтетической последовательности:

ПЦР праймер <400> 31 ааддаааааа дсддссдсса ЕддаасЕЕдд асЕЕддадд <210> <211> <212>

<213>

ДНК

Синтетическая последовательность <220>

<223>

Описание синтетической последовательности:

праймер <400>

ЕЕЕЕЕЕссЕЕ ддсддссдсЕ садсссаддс адссдсадд <210> <211> <212>

<213>

ДНК

Синтетическая последовательность <220>

<223>

Описание синтетической последовательности:

праймер <400> 33 дадсдадссс

Есадсс

Claims (48)

1. ФОРМУЛЛ ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Изолированная нуклеиновая кислота, содержащая нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из

   a) нуклеотидов 405-719 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 1;

   b) нуклеотидной последовательности, которая специфично гибридизуется с последовательностью, комплементарной нуклеотидам 405-719 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 1 в условиях высокой жесткости;

   где нуклеотидная последовательность кодирует полипептид нейбластин, содержащий (ί) семь консервативных цитеиновых остатка в положениях 8, 35, 39, 72, 73, 101 и 103 при нумерации в соответствии с 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 2;

   (ίί) следующие аминокислотные остатки:

   С в положении 8, Ь в положении 10, V в положении 17, Ь в положении 20, Ο в положении 21, Ь в положении 22, Ο в положении 23, Е в положении 28, Ε в положении 32, В в положении 33, Ε в положении 34, С в положении 35, Ο в положении 37, С в положении 39, С в положении 72, С в положении 73, В в положении 74, Р в положении 75, Ε в положении 83, Ό в положении 85, 8 в положении 97, Л в положении 98, С в положении 101 и С в положении 103 при нумерации в соответствии с 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 2;

   (ш) повтор ΕΟΕΟ, мотив ΕВΕС, мотив ОРССВР и мотив 8АТА^С и (ίν) аминокислотную последовательность, обладающую, по крайней мере, 90% гомологией с последовательностью ЛК!-ЛК₁₀₅ 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 2.
2. 2. Нуклеиновая кислота, содержащая последовательность нуклеиновой кислоты, которая комплементарна нуклеиновой кислоте по п.1.
3. 3. Вектор, содержащий нуклеиновую кислоту по п.1.
4. 4. Вектор по п.3, где указанный вектор представляет собой экспрессирующий вектор.
5. 5. Штамм клеток, трансформированных ш νίΐΐΌ вектором по п.3 или 4.
6. 6. Штамм по п.5, где указанные клетки выбраны из группы, состоящей из клеток млекопитающих, клеток грибов, клеток дрожжей, клеток насекомых и клеток бактерий.
7. 7. Штамм по п.6, где указанные клетки представляют собой клетки яичника китайского хомячка.
8. 8. Штамм по п.6, где указанные клетки представляют собой клетки, полученные из центральной нервной системы млекопитающего.
9. 9. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид нейбластин, причем указанная молекула нуклеиновой кислоты содержит последовательность, приведенную в 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 29 или 30.
10. 10. Вектор, содержащий нуклеиновую кислоту по п. 9.
11. 11. Вектор по п.10, где указанный вектор представляет собой экспрессирующий вектор.
12. 12. Штамм клеток, трансформированных ш νίΙΐΌ вектором по п.10 или 11.
13. 13. Штамм по п.12, где указанные клетки представляют собой бактериальные клетки.
14. 14. Изолированный полипептид нейбластин, содержащий (a) семь консервативных цитеиновых остатка в положениях 8, 35, 39, 72, 73, 101 и 103 при нумерации в соответствии с 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 2;

    (b) следующие аминокислотные остатки:

    С в положении 8, Ь в положении 10, V в положении 17, Ь в положении 20, Ο в положении 21, Ь в положении 22, Ο в положении 23, Е в положении 28, Ε в положении 32, В в положении 33, Ε в положении 34, С в положении 35, Ο в положении 37, С в положении 39, С в положении 72, С в положении 73, В в положении 74, Р в положении 75, Ε в положении 83, Ό в положении 85, 8 в положении 97, Л в положении 98, С в положении 101 и С в положении 103 при нумерации в соответствии с 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 2;

    (с) повтор ЬСЬС, мотив ЕКЕС, мотив ЦРССКР и мотив 8АТАССС и (6) аминокислотную последовательность, обладающую, по крайней мере, 90% гомологией с последовательностью АК1-АК1₀₅ 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 2.
15. 15. Полипептид по п.14, где указанный полипептид гликозилирован.
16. 16. Полипептид по п.14, где указанный полипептид кодируется нуклеиновой кислотой по п.1 или 2.
17. 17. Полипептид по любому из пп.14-16, где полипептид имеет С-концевую аминокислотную последовательность, представленную АК₇₂АК₁₀₅ 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 2.
18. 18. Полипептид по любому из пп.14-16, где полипептид имеет С-концевую аминокислотную последовательность, представленную АК41АК₁₀₅ 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 2.
19. 19. Полипептид по любому из пп.14-16, где консервативные замены аминокислот составляют менее 10% от общего количества остатков в полипептиде.
20. 20. Полипептид по п.19, где консервативные замены аминокислот составляют менее 2% полипептида.
21. 21. Полипептид по п.19, где консервативные замены аминокислот представляют собой единичные аминокислотные замены в последовательности зрелого пептида, где как заменяемая, так и заменяющая аминокислоты являются нециклическими аминокислотами.
22. 22. Пептид нейбластин, имеющий любую из следующих последовательностей:

    ОРСЗВАВААСАВСС (АК 30-43 ЗЕО Ю N0: 9);

    ЬОНВЗОЕЬУВЕКЕС (АК 57-70 ЗЕО Ю N0: 9) ;

    СВКАВЗРНОЬЗЬ (АК 74-85 3ΕΩ Ю N0: 9) ;

    ЬВРРРСЗНРУЗОРС (АК 94-107 ЗЕО Ю N0: 9);

    ЗТИВТУОКЬЗАТАС (АК 123-136 ЗЕ(2 Ю N0: 9); СКЕКЗаЪУРУВАЬСЬСНВЗОЕЪУКЕКГС (АК 43-70 ЗЕО Ю N0: 9);

    СККАВЗРНОЬЗЬАЗЬЬеАСАЬВРРРбЗКВУЗОРС (АК 74-107 ЗЕО Ю N0: 9) СВРТВУЕАУЗЕМОУЫЗТИНТУОКЬЗАТАС (АК 108-136 ЗЕО 10 N0: 9); 0ΒΡΤΒΥΕΑν3ΕΜϋνΝ3Τ (АК 108-124 ЗЕО Ю N0: 9); и

    АЬКРРРСЗКРУЗСгРС (АК 93-107 ЗЕ5 Ю N0: 9) .
23. 23. Композиция, содержащая полипептид по любому из пп. 14-22 и фармацевтически приемлемый носитель.
24. 24. Способ введения полипептида по любому из пп.14-16, предусматривающий стадию доставки указанного полипептида в культуру клеток ш νίΙΐΌ или ш у1уо в организм млекопитающего.
25. 25. Способ по п.24, где указанное введение включает в себя системное введение.
26. 26. Способ по п.24, где указанное млекопитающее поражено состоянием, выбранным из группы, состоящей из ишемического повреждения нейронов головного мозга, травматического повреждения головного мозга, периферической невропатии, болезни Альцгеймера, болезни Ген тингтона, болезни Паркинсона, бокового амиотрофического склероза и ухудшения памяти.
27. 27. Способ по п.24, где указанное млекопитающее поражено нейрональным нарушением периферической нервной системы, продолговатого мозга или спинного мозга.
28. 28. Применение нуклеиновой кислоты по п.1 или 2 для производства лекарственного препарата для лечения нейродегенеративного заболевания или нарушения у животного.
29. 29. Применение полипептида нейбластина по любому из пп. 14-16 для производства лекарственного препарата для лечения нейродегенеративного заболевания или нарушения у животного.
30. 30. Антитело, которое специфично связывается с любым из полипептидов по п.14-16.
31. 31. Антитело по п.30, где указанное антитело является моноклональным антителом.
32. 32. Способ определения взаимосвязи наличия нейродегенеративного заболевания или нарушения у животного с измененной активностью полипептидного нейротрофического фактора нейбластина, причем указанный способ предусматривает следующие стадии:

    (a) контакт биологического образца, полученного от указанного животного, с антителом по п. 30 или 31, (b) определение образования иммунного комплекса между указанным антителом и указанным белком;

    (c) сравнение содержания указанного иммунного комплекса, который образуется в указанном образце, с содержанием указанного иммунного комплекса, который образуется в соответствующем биологическом образце, полученном от пациента, не пораженного указанным нервным состоянием, и (6) определение на основании указанного сравнения связи указанного заболевания или нарушения с указанным измененным уровнем активности указанного полипептидного нейротрофического фактора нейбластина.
33. 33. Штамм клеток, содержащий экзогенную регуляторную последовательность, клонированную в функциональной связи с эндогенным геном нейбластина, причем указанный ген нейбластина способен кодировать полипептид по п.14.
34. 34. Способ получения полипептида нейбластина по любому из пп.14-22, причем указанный способ предусматривает культивирование клеток штамма по любому из пп.5-8, 12, 13 и 33 в условиях, обеспечивающих экспрессию указанного полипептида.
35. 35. Способ по п.34, дополнительно включающий стадию выделения полученного полипептида.
36. 36. Последовательность изолированной нуклеиновой кислоты, содержащая нуклеотиды 721-865 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 1.
37. 37. Антитело, которое специфично связывается с любым из пептидов, охарактеризованных в п.22.
38. 38. Набор, в который входит один или несколько контейнеров с веществом, выбранным из группы, состоящей из

    a) полипептида нейбластина по любому из пп.14-22;

    b) антитела по любому из пп.30, 31 и 37;

    c) одного или нескольких нуклеотидных зондов, способных гибридизоваться с РНК нейбластина; или

    й) по крайней мере, одной пары нуклеотидных праймеров, способных инициировать амплификацию, по крайней мере, части гена нейбластина.
39. 39. Способ диагностики или скрининга наличия у субъекта или предрасположенности субъекта к развитию заболевания или нарушения, которое характеризуется аномальным содержанием полипептида нейбластина по любому из пп.14-22, предусматривающий измерение содержания указанного полипептида нейбластина, РНК, кодирующей полипептид нейбластин, или функциональной активности полипептида нейбластина в образце, полученном от субъекта, причем увеличение или уменьшение содержания полипептида нейбластина, РНК нейбластина или функциональной активности полипептида нейбластина в образце относительно содержания полипептида нейбластина, РНК нейбластина или функциональной активности нейбластина, выявленных в аналогичном образце в отсутствие заболевания или нарушения или в отсутствие предрасположенности к развитию заболевания или нарушения, свидетельствует о наличии заболевания или нарушения или предрасположенности к развитию заболевания или нарушения.
40. 40. Способ скрининга очищенного полипептида нейбластина по любому из пп.14-22, или его производного, или его фрагмента или модулятора активности упомянутых выше пептидов на предмет активности в лечении или профилактике заболевания, причем указанный способ предусматривает:

    (a) измерение изменений фенотипа, генотипа, поведения, выживаемости или пролиферации клеток из клеточных линий или тестируемого животного, причем указанные клетки или животное получают в состоянии заболевания, или они проявляют признаки, связанные с заболеванием, и указанные клетки или животные взаимодействуют с полипептидом нейбластином, его производным, фрагментом или модулятором, или им вводят полипептид нейбластин, его производное, фрагмент или модулятор, и (b) сравнение указанных изменений с фенотипом, генотипом, поведением, выживаемостью или пролиферацией клеток или животных, которые не взаимодействовали таким образом с полипептидом нейбластином, его производным, фрагментом или модулятором, или которым не вводили полипептид нейбластин, его производное, фрагмент или модулятор.
41. 41. Способ лечения периферических невропатий у млекопитающего, причем указанный способ предусматривает введение терапевтически эффективного количества полипептида нейбластина по любому из пп.14-22, причем указанная периферическая невропатия выбрана из группы, состоящей из невропатий, индуцированных травмами; невропатий, индуцированных химиотерапией; невропатий, индуцированных токсинами; невропатий, индуцированных лекарственными средствами; невропатий, индуцированных недостатком витаминов;

    идиопатических невропатий и диабетических невропатий.
42. 42. Способ по п.25, при котором нейбластин доставляется непосредственно в центральную нервную систему.
43. 43. Способ по п.25, при котором нейбластин доставляется системно путем подкожной инъекции, внутривенной инъекции или внутривенной инфузии.
44. 44. Способ идентификации, выделения или определения новых последовательностей нуклеиновых кислот, предусматривающий применение последовательности одной или нескольких нуклеиновых кислот по любому из пп.1, 2 и 36 в компьютерной программе для идентификации, выделения или определения новых последовательностей нуклеиновых кислот.
45. 45. Фиксированный субстрат или ДНКчип, включающий в себя одну или несколько нуклеиновых кислот по любому из пп.1, 2 и 36.
46. 46. Способ идентификации, выделения или определения новых последовательностей нуклеиновых кислот, предусматривающий применение фиксированного субстрата или ДНК-чипа по п.45.
47. 47. Способ идентификации, выделения или определения новых последовательностей нуклеиновых кислот, предусматривающий применение последовательности одного или нескольких полипептидов по любому из пп.14-22 в компьютерной программе для идентификации, выделения или определения новых последовательностей нуклеиновых кислот.
48. 48. Способ идентификации соединения, которое предположительно индуцирует опосредуемый нейбластином биологический эффект, причем указанный способ предусматривает следующие стадии:

    (a) получение тестируемой клетки, причем в указанной клетке при взаимодействии с полипептидом нейбластином по любому из пп.14-22 индуцируется экспрессия определяемого продукта;

    (b) взаимодействие клетки с тестируемым соединением и (c) выявление определяемого продукта, причем указанная экспрессия определяемого продукта свидетельствует о способности тестируемого соединения индуцировать указанное опосредуемое нейбластином биологическое действие.