KR100712223B1 - 신경친화성 성장 인자 - Google Patents

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Abstract

에노빈으로 기술된 인간 신경친화성 성장 인자를 코딩하고 도 1,21,23에 도시된 아미노산 서열을 갖거나, 상기 성장 인자의 기능적 동등물, 유도체 또는 생물학적 전구체를 코딩하는 단리된 핵산 분자를 개시한다. 이 성장 인자는 바람직하게는 도 1에 도시된 서열의 위치 27 내지 139의 아미노산 서열, 또는 그의 기능적 동등물, 유도체 또는 생물학적 전구체를 포함한다. 에노빈을 코딩하는 핵산 분자는 적절한 벡터내에 이것을 포함하면서 숙주 세포, 조직 또는 개체를 형질전화시키는 데 사용될 수 있다. 숙주 세포, 조직 또는 개체 및 벡터는 또한 본 발명의 일부를 형성한다.

Description

신경친화성 성장 인자{Neurotrophic Growth Factor}
본 발명은 신경친화성 인자 및, 특히, 본 명세서에서 "에노빈(enovin(EVN))"으로 기술되는, 신경친화성 인자중 GDNF 패밀리의 신규한 요소를 클로닝하고 발현시키는 것에 관한 것이다.
신경친화성 인자는 신경분화, 발달 및 유지에 포함된다. 이 단백질은 다양한형태의 신경세포의 퇴화를 예방하고 생존을 증진시킬 수 있으며, 따라서, 신경퇴화성 질병에 대한 잠재적 치료제이다. 신경교세포주로부터 유래된 신경친화성 인자(GDNF)는 뉴트로핀과 구조적으로 구별되는 신경친화성 인자중 성장하는 서브패밀리의 첫번째 요소이다. GDNF는 아미노산 서열내 7개의 고도로 보존되는 시스테인 잔기의 특정 패턴에 의해 특징되어지는, 성장 인자의 형질전환 성장인자 β(TGF-β) 슈퍼 패밀리의 요소이다(Kingsley, 1994). 초기에 GDNF는 시험관내 배 복부 중뇌 도파민성 뉴런의 생존과 기능을 유지시키는 능력을 기초로 한 분석을 사용함으로써 정제되었다(Lin et al., 1993). 중추 신경계(CNS) 또는 말초 신경계(PNS)내 다른 신경세포 형태 또한 GDNF의 생존 영향에 반응성이다(Henderson et al., 1994, Buj-Bello et al., 1995, Mount et al., 1995, Oppenheim et al., 1995). GDNF는 세포에 의해 불활성 예비형태(proform)로 생산되고, 이는 활성(성숙) GDNF를 생산 하기 위해 특정적으로 세포의 RXXR 푸린 인식 부위가 절단된다(Lin et al., 1993). 외부적으로 투여된 GDNF는 뇌의 흑질 중 도파민성 세포가 70%정도까지 손실되는 것을 특징으로 하는 일반적인 신경퇴화성 질환인 파킨슨 질병을 앓는 동물 모델에서 효능이 있는 신경보호 효과를 갖는다(Beck et al., 1995, Tomac et al., 1995, Gash et al., 1996, Choi-Ludnberg et al., 1997, Bilang-Bleuel et al., 1997).
최근, GDNF 패밀리의 추가적인 신경친화성 인자들이 발견되었다. 뉴트린(NTN)은 배양중 교감 뉴런의 생존을 증진시키는 능력에 기초한 분석을 이용함으로써 중국 햄스터 난소(CHO)세포로부터 유래된 조정배지로부터 정제되었다(Kotzbauer et al., 1996). 성숙한 NTN 단백질은 성숙한 GDNF와 57% 유사하다. 퍼세핀(Persephin(PSP))은 주형으로서 게놈DNA와 함께 퇴화 프라이머 PCR을 사용하여 클로닝시킴으로서 발견되었다. 성숙한 GNDF처럼, 성숙한 PSP도 배양중 복부 중뇌 도파민성 뉴런 및 운동뉴런의 생존을 증진시킨다(Milbrandt et al., 1998). 성숙한 PSP 단백질과 성숙한 GDNF 및 NTN은 약 50%정도 유사하다. 아테민(Artemin(ARTN))은 DNA 데이타베이스 조사를 통해 발견되었고 이는 배양중 감각 및 교감 뉴런의 생존 인자이다(Baloh et al., 1998b).
GDNF, NTN, PSP 및 ARTN은 하류로 세포내 신호 형질도입을 수행하기 위해 이형 이량체의 수용체 복합체를 필요로 한다. GDNF는 막 단백질에 부착된 글라이코실-포스패티딜-이노시톨(glycosyl-PtdIns)인 GDNF 패밀리 수용체 알파 1(GFRα-1; GFRαNomenclature Committee, 1997) 서브유니트에 결합한다(Jing et al., 1996, Treanor et al.,1996, Sanicola et al., 1997). GDNF/GFRα-1 복합체는 이어서 막 결합 티로신 키나아제인 cRET 프로토-암유전자에 결합하고 이를 활성화시켜 cRET내 티로신 잔기를 인산화시키고 하류 신호 형질도입 경로를 계속해서 활성화시킨다(Worby et al., 1996). 리간드 결합 수용체중 GFRα패밀리의 수개의 다른 요소들이 특징지워졌다(Baloh et al., 1997, Sanicola et al., 1997, Klein et al., 1997, Buj-Bello et al., 1997, Suvanto et al., 1997). GFRα-2 및 GFRα-3(Jing et al., 1997, Masure et al., 1998, Woby et al., 1998, Naveilham et al., 1998, Baloh et al., 1998a)이 많은 다수의 상이한 그룹에 의해 증명되었다. GFRα-1 및 GFRα-2는 거의 모든 조직에서 넓게 발현되고 발현은 발생적으로 조절될 수 있다(Sanicola et al., 1997, Widenfalk et al., 1997).
GFRα-3는 발달중인 또는 성인 중추 신경계에서는 발현되지 않으나 말초 신경계의 수개 발달중인 성인 감각 및 교감 신경절에서 고도로 발현된다(Widenfalk et al., 1998, Naveilhan et al., 1998, Baloh et al., 1998a). 네번째 패밀리 요소, GFRα-4가 닭 cDNA로부터 클로닝되었다(Thompson et al., 1998). GFRα-1는 GDNF에 대한 선호되는 수용체인 반면, GFRα-2는 선호적으로 NTN에 결합한다(Jing et al., 1996, Treanor et al., 1996, Klein et al., 1997). 닭 GFRα-4는 cRET와 배합하여 PSP에 대한 기능적 수용체 복합체를 형성한다(Enokido et al., 1998). GFRα-3 및 cRET 모두를 발현시키는 세포는 GDNF, NTN 또는 PSP중 어느 것에 대해서도 반응하지 않는 것으로 나타났다(Worby et al., 1998, Baloh et al., 1998a). 최근, ART가 바람직한 리간드-결합 수용체로 GFRα-3를 사용하여 cRET를 통해 신호를 전달하는 것으로 밝혀졌다(Baloh et al., 1998b). cRET 존재하에서 GDNF는 GFR α-2 또는 GFRα-3과 결합할 수 있고(Sanicola et al., 1997, Trupp et al., 1998), NTN은 낮은 친화력으로 GFRα-1과 결합할 수 있기 때문에, 시험관내에서 신경친화성 인자와 GFRα수용체 사이의 크로스-톨크(Cross-talk)가 가능하다. 다시 말해, GDNF, NTN, PSP 및 ART는 신경친화성 신호계의 한 부분이고, 이에 의해 상이한 리간드-결합 서브유니트(GFRα-1 내지 -4)가 동일한 티로신 키나제 서브유니트(cRET)와 상호작용할 수 있다. 최근 시험관 발견에서의 이들의 생리학적 연관성이 유전자 넉아웃(knockout) 연구에서 밝혀졌고(Rosenthal에 의해 리뷰된, 1999), 이는 생체내에서 GDNF는 GFRα-1과 상호작용하는 반면, NTN은 GFRα-2에 대한 바람직한 리간드임을 확실히 나타낸다.
본 발명자들은 GDNF 패밀리의 네번째 요소인 에노빈(Enovin(EVN))을 동정하고, 클로닝하고, 발현시키며, 염색체적으로 위치를 찾아내고 특정화시켜왔다. 성숙한 EVN 단백질에 관한 지식이 상이한 기능적 및 비-기능적 mRNA 스플라이스 변이체의 발견으로 넓어졌다. 또한, 우리는 스타우로스포린-분화된 SH-SY5Y 인간 신경모세포 배양내에서의 발현 데이타, EVN과 GFRα-3의 결합 데이타 및 시험관내에서 신경돌기 외향 성장과 탁솔-유도된 신경독성에 대한 보호에 미치는 EVN의 영향을 제공한다.
발명의 요약
본 명세서에서, 신규한 인간 신경친화성 성장 인자, "에노빈"을 코딩하는 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터, 상기 벡터로 형질전환된 숙주 세포, 상기 핵산 분자에 의해 코딩된 신경친화성 성장 인자, 단리된 에노빈, 에노빈 의 작용제 또는 길항제로 작용하는 화합물, 및 핵산 또는 에노빈 단백질 또는 그의 작용제 또는 길항제을 함유하는 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 제 1면에 따라, 도 21에 도시된 아미노산 서열을 갖고 본 명세서에서 에노빈으로 기재된 인간 신경친화성 성장 인자, 또는 상기 성장 인자의 기능적 동등물, 유도체 또는 생물학적 전구체를 코딩하는 핵산 분자를 제공한다. 바람직하게는, 상기 핵산은 DNA 분자이고 더욱 바람직하게는 cDNA 분자이다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 핵산은 도 1에 도시된 서열의 위치 81 내지 419의 서열을 포함하고, 보다 바람직하게는 위치 81 내지 422의 서열이며, 더욱 바람직하게는 도 1에 도시된 전체 서열을 포함한다.
위치 81 내지 419의 핵산 분자는, 상기 에노빈 단백질의 안정한 예비형태에 존재하는 RXXR 처리 부위에서 단백질의 예비형태의 처리에 이어지는 성숙한 에노빈 단백질로 코딩된다고 여겨진다.
또한, 본 발명에 의해, 본 당업자에게 잘 알려진 고도로 엄격한 조건하에서 본 발명에 따른 어느 핵산 서열과도 혼성화될 수 있는 안티센스 분자를 제공한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 혼성의 엄격함은 폴리-핵산이 안정적인 조건을 언급한다. 혼성물의 안정성은 혼성물의 용융점(Tm)에 반영된다. Tm은 하기 식에 의해 접근될 수 있다:
81.5℃-16.6 (log10[Na+]+0.41) (%G&C)-600/1
여기서,
1은 뉴클레오타이드내 혼성물의 길이이다.
Tm은 서열 상동성의 매 1% 감소당 대략적으로 1-1.5℃씩 감소한다.
유리하게는, 본 발명에 따른 핵산 분자는 적절한 발현 벡터를 사용하여 숙주 세포등에서 본 발명에 따른 인간 신경친화성 성장 인자를 발현시키는 데 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 발현 벡터는 DNA 단편의 발현에 영향을 미칠 수 있는 조절 서열, 예를들면 프로모터 부위에 작동적으로 연결된 DNA를 효과적으로 발현시킬 수 있는 벡터를 포함한다.
발현에 필요한 조절 요소는 RNA 중합효소에 결합하는 프로모터 서열 및 리보솜에 결합하기 위한 전사 개시 서열을 포함한다. 예를 들면, 박테리아 발현 벡터는 lac 프로모터와 같은 프로모터 및 전사 개시를 위한 Shine-Dalgarno 서열과 개시 코돈 AUG를 포함할 수 있다. 유사하게, 진핵세포 발현 벡터는 RNA 중합효소Ⅱ에 대한 이형 또는 동형 프로모터, 하류 폴리아데닐레이션(polyadenylation) 신호, 개시 코돈 AUG, 및 리보솜 으로부터 유리되기 위한 종결 코돈을 포함할 수 있다. 이러한 벡터를 시판용으로 얻거나 본 분야에서 공지된 방법에 의해 기술된 서열로부터 조립될 수 있다.
따라서, 발현 벡터는 플라스미드와 같은 재조합 DNA 또는 RNA 작제물, 파지, 재조합 바이러스 또는 적절한 숙주 세포에 도입되어 이 DNA 또는 RNA 단편이 발현되도록하는 또다른 벡터를 언급한다. 적절한 발현 벡터는 당업자에게 잘 공지되어 있고 진핵세포 및/또는 원핵세포에서 복제가능한 것 및 에피솜으로 남아있거나 숙주 세포내로 통합되는 것을 포함한다.
본 발명에 따른 핵산에 혼성화될 수 있는 안티센스 분자는 프로브 또는 약제물 또는 약제학적 조성물내에서 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 핵산 분자는 안티센스 RNA의 제조를 위해 안티센스 배향으로 기술된 벡터내로 삽입될 수 있다. 안티센스 RNA 또는 다른 안티센스 핵산은 합성법에 의해 생산될 수 있다.
본 발명의 추가된 면은, 본 발명에 따른 발현 벡터에 의해 형질전환된, 트랜스펙트된(transfected) 또는 감염된 숙주 세포를 포함하고, 이 세포는 바람직하게는 진핵 세포, 더욱 바람직하게는 포유류 세포를 포함한다.
상기 세포의 형질전환 및 형질전환된 세포의 선별을 위해 클론된 DNA를 적절한 발현 벡터내로 혼입시키는 것은 [Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning, A Laboratory manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press]에 제공되는 바와 같이 당업자에게 공지되어 있다.
본 발명의 추가적 일면은 본 발명에 따른 핵산 분자의 적어도 15개의 뉴클레오타이드, 바람직하게는 15 내지 50 뉴클레오타이드를 갖는 핵산 분자를 포함한다.
이들 서열은 유리하게는 프로브로서 또는 복제등을 시작하기 위한 프라이머로 사용될 수 있다. 이러한 핵산 분자는 본 분야에서 공지된 기술, 예를들면, 재조합 또는 합성법에 의해 생산될 수 있다. 또한, 이들은 본 발명에 따른 핵산의 존재를 검출하기 위한 진단용 키트 또는 장치등에 사용될 수 있다. 이 시험은 보통 혼 성 조건하에서 프로브에 샘플을 접촉시키는 것과 프로브와 샘플중의 핵산의 이중구조의 존재에 대한 검출을 포함한다.
본 발명에 따라, 프로브는 고체 지지체에 고정될 수 있다. 바람직하게는, 다수의 프로브가 단일의 생물학적 샘플과 동시에 혼성화될 수 있도록 어레이상에 존재한다. 프로브는 어레이상에 스포팅(spotted)될 수 있거나 합성될 수 있다(참조 Lockhart et al., Nature Biotechnology, vol. 14, December 1996 "Expressing monitorng by hybridisation into high density oligonucleotide arrays"). 단일 어레이는 분리된 위치들에 100, 500 또는 심지어 1000개의 상이한 프로브를 함유할 수 있다.
본 발명에 따른 핵산 분자는 또한, 재조합 또는 합성적 방법, 예를들면 보통 클론될 유전자 부위의 대략 10부터 50까지의 뉴클레오타이드인 프라이머 쌍을 만들고, 프라이머를 인간 세포로부터 유래된 mRNA, cDNA, 또는 게놈 DNA와 접촉시키고, 필요한 부위를 증폭시킬 수 있는 조건하에서 중합효소연쇄반응을 수행하고, 증폭된 영역 또는 단편을 분리하고 증폭된 DNA를 회복시키는 것을 일반적으로 포함하는 PCR 클로닝 원리를 사용하여 생산될 수 있다. 보통, 본 명세서에서 정의된 이러한 기술은 Sambrook et al(Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 1989)에서 기재된 바와 같이 본 분야에 공지되어 있다.
본 발명에 따른 핵산 또는 올리고뉴클레오타이드는 표식 라벨을 수반할 수 있다. 적절한 라벨은 32P 또는 35S와 같은 방사선 동위 원소, 바이오틴과 같은 효소 라벨 또는 다른 단백질 라벨 또는 형광 마커를 포함한다. 이러한 라벨은 본 발명의 핵산 또는 올리고뉴클레오타이드에 첨가될 수 있고 그 자체로 공지된 기술을 사용하여 검출될 수 있다.
유리하게는, 인간 대립유전자 변이체 또는 본 발명에 따른 DNA 분자의 다형을, 예를 들면, 다양한 군집으로부터의 일정 범위의 개개인으로부터 cDNA 또는 게놈 라이브러리를 프로빙하여 동정할 수 있다. 또한 본 발명에 따른 핵산과 프로브는, 생거 디데옥시 쇄 종결 방법(Sanger Dideoxy chain termanation method)와 같은 공지된 기술을 사용하여 환자로부터 유래된 게놈 DNA를 서열화하는데 사용될 수 있고, 이것은 유리하게는 본 발명에 따른 성장 요소와 관련된 특정 질환을 앓는 환자의 소인을 확인할 수 있다.
추가로, 본 발명에 따른 인간 신경친화성 인자 에노빈을 발현시킬 수 있는 트랜스진(transgene)을 포함하는 트랜스제닉 세포, 조직 또는 개체는 제공된다.
본 명세서에서 사용된 용어 " 발현할 수 있는 트랜스진"은 본 발명에 따른 신경친화성 인자와 동일한 기능 및/또는 활성을 갖는 신경친화성 인자를 발현시키는 적절한 핵산 서열을 의미한다. 예를 들면, 트랜스진은 인간 세포로부터 단리된 게놈 핵산 또는 cDNA를 포함하고, 염색체내로 통합되거나 염색체 외부에 있는 상태의 합성 핵산을 포함할 수 있다.
바람직하게는, 트랜스진은 본 발명에 따른 벡터를 포함하고, 이 벡터는 언급된 신경친화성 인자를 코딩하는 핵산 분자 또는 상기 핵산 분자의 기능적 단편을 포함한다. 상기 핵산 분자의 "기능적 단편"은 상기 신경친화성 인자 또는 그의 기능적 동등물을 코딩하는 유전자 또는 cDNA의 단편을 의미하고, 이 단편은 본 발명 에 따른 기능적 신경친화성 성장 인자를 생산하기 위하여 발현될 수 있다. 따라서, 예를 들면, 상응하는 수용체와 상호작용하는 특정 아미노산 잔기에 상응하는, 본 발명에 따른 신경친화성 성장 인자의 단편은 또한 본 발명의 일부를 형성하고 이 단편은 세포에 대한 성장 증진 및 생존 유지 효과를 알아내기 위하여 본 발명에 따른 성장 인자에 상응하는 수용체를 활성화시키는 작용제로서 작용할 수 있다. 본 발명의 이 면은 또한 본 발명에 따른 핵산의 상이하게 스플라이스된 이소형태 및 전사 개시를 포함한다.
본 발명에 따라, 정의된 핵산은 동일한 핵산 및 보존적 아미노산 치환체중 축중 암호(degenerate code)에 의해 유사한 코돈(동일한 아미노산 잔기를 특정하는 상이한 코돈)을 초래하는 염기내 치환을 포함하는 최소 염기 변이체를 포함한다. 용어 "핵산 분자"는 또한 염기 변이체에 관하여 주어진 단일가닥 서열에 상보적인 서열을 포함한다.
본 발명의 추가적 일면은, 본 명세서에 정의된 바와 같이, 핵산 분자에 의해 코딩되는, 단리된 인간 신경친화성 성장 인자를 제공한다. 바람직하게는, 성장 인자는 도 1 아미노산 서열의 위치 27 내지 139의 아미노산 서열 또는 그의 기능적 동등물, 유도체 또는 생물학적 전구체를 포함한다.
본 명세서에 정의된 "기능적 동등물"은 성장 인자 에노빈과 관련된 모든 성장 성질 및 기능성을 나타내는 성장 인자를 의미한다. 본 명세서에서 정의된 바의, 에노빈의 "유도체"는 폴리펩타이드 내 특정 아미노산이 변경되거나 결실되거나 다양한 아미노산으로 치환된 폴리펩타이드 및 에노빈의 생물학적 활성을 갖고/갖거나 챌린징(challenging) 항원으로서 본 발명에 따른 에노빈을 사용하여 생성된 항체와 반응할 수 있는 폴리펩타이드를 포함한다.
본 발명의 범위내에, 융합 단백질 및 단편을 포함하는 에노빈의 잡종 및 변형된 형태가 포함된다. 예를 들면, 에노빈의 잡종 및 변형된 형태는, 특정 아미노산이 예를들면 점돌연변이에 의해 변형 또는 치환되었어도, 이 변형은 본 발명에 따른 에노빈의 생물학적 활성을 그대로 유지하는 단백질 발현시키는 것을 포함한다. 특정 핵산 서열은 에노빈과 동일하거나 실질적인 특성을 나타내는 성장 인자를 생산하기위하여 본 분야의 숙련된 자에 의해 변형될 수 있다.
본 분야에서 공지된 바와 같이, 많은 단백질은 생체내에서 단백질의 N-말단에 프리(pre) 신호 서열을 갖는 많은 단백질이 생산된다. 또한, 이러한 단백질은 성숙한 단백질로의 안정한 전구체를 나타내는 추가의 프로(pro) 서열을 포함할 수 있다. 이러한 프리 및 프로 서열은 보통 생물학적 활성에 필요한 것은 아니다. 본 발명에 따른 에노빈 분자는 도 21에 도시된 전체길이의 서열 및 위치 27 내지 139를 포함하고, 이는 이러한 형태의 성장 인자내에 존재하는 RXXR 단백질분해 처리 부위에 이어지고 에노빈의 성숙한 서열을 나타내는 것으로 여겨진다.
본 발명에 따른 정의된 단백질, 폴리펩타이드 또는 아미노산 서열은 동일한 아미노산 서열 및 그의 이성질체, 추가로 보존적 아미노산 치환(그의 측쇄에 관련된 아미노산으로 치환된 치환체)을 포함하는 본래의 아미노산 서열로부터 유도된 최소 아미노산 변이체를 포함한다. 또한 본래의 아미노산과는 다르지만, 본래대로 생성된 서열에 의해 코딩된 폴리펩타이드와 면역학적으로 일치하거나 유사한 폴리 펩타이드를 생성하는 아미노산 서열이 포함된다.
본 발명에 따른 단백질 또는 폴리펩타이드는 추가로 상기 단백질 또는 폴리펩타이드와 실질적으로 상동적인 본래대로 생성된 대립유전자 변이체를 포함하여, 이 서열의 변이체를 포함한다. 이에 관련하여,실질적인 상동성은 본 발명에 따른 핵산 분자에 의해 코딩되는 단백질 또는 폴리펩타이드와 적어도 70%, 및 바람직하게는 80%, 90% 또는 95% 아미노산 상동성을 갖는 서열이라고 여겨진다.
본 발명에 따른, 숙주 세포에 의해 발현되는 신경친화성 성장 인자 또한 본 발명내에 포함된다.
본 발명은 추가로 안티센스 기술을 이용하여 생체내에서 본 발명에 따른 신경친화성 성장 인자를 저해하는 것에 관한 것이다. 안티센스 기술은 폴리뉴클레오타이드와 DNA 또는 RNA의 결합에 기초한 두가지 방법, 삼중-나선 구조 또는 안티센스 DNA 또는 RNA를 통해 유전자 발현을 조절하는데 사용할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 성숙한 단백질을 코딩하는 DNA 서열의 일부는 10 내지 50 염기쌍 길이의 안티센스 RNA 올리고뉴클레오타이드를 디자인하는데 사용될 수 있다. DNA 올리고뉴클레오타이드는 전사에 포함되는 유전자 부위에 상보적이도록 디자인되어 에모빈의 전사와 생산을 방해한다(삼중 나선구조- 참조 Lee et al. Nucl. Acids. Res., 6:3073 (1979); Cooney et al., Science, 241:456 (1988); 및 Dervan et al., Science, 251:1360 (1991). 생체내에서 안티센스 RNA 올리고뉴클레오타이드는 mRNA와 혼성화되어 mRNA 분자가 에노빈으로 해독되는 것을 방해한다.
본 명세서에 기재된 성장 인자와 앞서 동정된 GDNF 패밀리의 성장 인자의 서열이 유사하기 때문에, 에노빈은 세포 생존과 성장을 증진시킬수 있고 언급된 신경친화성 인자의 기능과 발현의 결함으로 초래된 질환을 치료할 수 있는 것으로 여겨진다.
그러므로, 본 발명에 따른 핵산 분자 또는 신경친화성 인자는, 신경성 질환의 이상을 완화시키기위해 충분한 농도의 본 발명에 따른 핵산 분자 또는 성장 인자의 소정량을 환자에 투여함으로써 환자의 신경질환을 치료하거나 예방하는데 이용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 핵산 분자는 신경 세포의 유지와 생존을 증진시키고 신경 질환 또는 파킨슨병과 같은 신경퇴화성 질환, 알츠하이머 질병, 말초 신경병증, 근위축성측삭경화증, 말초 및 중추 신경 외상, 신경독소에 대한 손상 및 노출을 치료하는데 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 신경친화성 성장 인자는 신경 세포 또는 세포군집, 특히 세포 사멸하도록 유도되어진 세포 또는 세포 군집에 신경친화적 또는 신경보호적 효과를 준다고 관찰되어왔다. 따라서, 본 발명에 따른 핵산 또는 에노빈 성장 인자 는 신경 질환의 이상을 줄이거나 예방하기 위해 충분한 농도의 핵산 분자 또는 에노빈을 환자에게 소정량 투여함으로서 발작같은 신경퇴화성 질환, 헌팅톤병, 말초신경병증, 급성 뇌 상해, 신경계암, 다발성경화증, 근위축성측삭경화증, 말초 신경외상, 신경독소에 대한 노출, 복합내분비선신생조직형성, 가족히르쉬스프룽병 계열, 프리온 관련 질환, 크로이츠펠트-야콥병을 치료하는데 사용될 수 있다.
추가적으로, 하기 실시예에서 좀더 상세히 설명되는 에노빈은 질환의 이상을 감소시키거나 예방하기 위해 충분한 농도로 환자에 투여됨으로서, 유도된 감각 결 함을 빠른 속도로 회복시킨다는 것으로 나타났고, 이는 에노빈을 말초 또는 중추 신경형성 성분을 갖는 동통증후군, 류마티스/면역성 질환 및 유도능 장애를 치료하거나 예방하는 후보임을 확인시킨다.
상기 기재된 신경 질환을 치료하는 대체 방안은 본 발명에 따른 인간 신경친화성 성장 인자를 발현시키는 세포, 예를 들면, 본 명세서에서 기재되는 트랜스제닉 세포를 이식시키는 것을 포함한다.
본 발명에 따른 핵산 분자 및 신경친화성 성장 인자는 또한 약제학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제와 함께 약제학적 조성물에 포함될 수 있다.
본 발명의 신경친화성 인자에 대한 항체는 유리하게는 본 분야에서 공지된 기술에 의해 제조될 수 있다. 예를 들면, 폴리클로날 항체는 마우스와 같은 숙주 동물을 성장 인자 또는 그의 에피토프(epitope)로 접종하고 면역 혈청을 회수하여 제조할 수 있다. 모노크로날 항체는 예를 들면 [Kohler R. 및 Milstein C., Nature (1975) 256, 495-497}에 기재된 공지된 기술 따라 제조될 수 있다.
본 발명에 따른 항체는 유리하게는 본 발명에 따른 성장 인자의 존재를 검출하는 방법에서 사용될 수 있고 이 방법은 항체와 샘플을 반응시키고 상기 항체에 결합한 단백질을 동정하는 것을 포함한다. 상기 방법을 수행하기 위해 본 발명에 따른 항체 및 항체와 상기 샘플을 반응시키기 위한 수단을 포함하는 키트가 제공된다.
또한, 상기 기술된 항체 및 상기 항체와 상기 샘플을 반응시키기 위한 수단을 포함하는, 샘플내 본 발명에 따른 신경친화성 성장 인자의 존재를 검출하기 위 한 키트 또는 장치가 제공된다.
본 발명의 신경친화성 인자와 상호작용하는 단백질, 예를 들면 상응하는 세포 수용체는 분자생물학자에게 잘 공지된 2-잡종 벡터 시스템을 사용하여 단백질-단백질 상호작용을 조사함으로서 동정될 수 있다(Field & Song, Nature 340:245 1989). 이 기술은 리포터 유전자를 활성화시키는 전사 인자를 생체내에서 기능적으로 재구성하는 것에 기초한다. 보다 특히, 상기 기술한 적절한 숙주 세포에 DNA 결합 도메인 및 활성 도메인를 갖는 전사 인자에 의해 조절되는 프로모터의 조절하의 리포터 유전자를 포함하는 DNA 작제물을 제공하고, 숙주 세포에서 본 발명에 따른 핵산 서열 모두와 또는 전사 인자의 상기 DNA 결합 도메인 또는 상기 활성 도메인의 첫번째 융합물을 코딩하는 첫번째 혼성 DNA를 발현시키고, 첫번째 융합에서 혼입되지 않은 전사 인자의 DNA 결합 또는 활성 도메인와 함께 조사되는 추정상의 결합 단백질을 코딩하는 라이브러리등과 같은 적어도 하나의 두번째 잡성 DNA를 숙주 세포에서 발현시키고; 숙주 세포내에서 리포터 유전자 생성물의 존재를 검출하기 위하여 본 발명에 따른 단백질과 함께 조하되는 단백질의 결합을 검출하며; 임의적으로 결합 단백질을 코딩하는 두번째 잡종 DNA 서열을 분리하는것을 포함한다.
이러한 기술의 실시예는 효모의 GAL4 단백질을 사용한다. GAL4는 효모의 갈라토오스 대사의 전사 활성제이고 갈락토오스 대사 유전자의 상류에 활성제에 결합하는 별개의 도메인 및 단백질 결합 도메인를 갖는다. 뉴클레오타이드 벡터는 작제되고, 이 중 하나는 GAL4의 DNA 결합 도메인을 코딩하는 뉴클레오타이드 잔기를 포 함한다. 이 결합 도메인 잔기는 공지된 단백질을 코딩하는 서열, 예를 들면, 본 발명에 따른 핵산에 융합될 수 있다. 다른 벡터는 GAL4의 단백질 결합 도메인을 코딩하는 잔기를 포함한다. 이 잔기는 바람직하게는 문제의 척추동물의 신호 형질도입 경로로부터 유래된 시험 단백질을 코딩하는 잔기에 융합된다. 본 발명에 따른 핵산에 의해 코딩된 신경친화성 인자와 시험되는 단백질사이의 상호작용으로 벡터가 형질전환된 GAL-4 전사 결핍 효소 세포에서 리포터 분자의 전사 활성화가 이뤄진다. 바람직하게는, β-갈락토시다아제 같은 리포터 분자는 효모 갈락토오스 대사 유전자의 전사 회복시에 활성화된다.
에노빈에 대한 수용체는 본 발명자에 의해 GFRα3으로 동정되었다. 그러므로, 에노빈의 작용제 또는 길항제을 동정하기 위해 분석를 준비할 수 있다. 이 분석은 또한 다양한 신경친화성 인자 및 그들의 상응하는 수용체와 관련하여 사용될 수 있다. 동정된 화합물은 신경 질환을 예방하거나 치료하기 위하여 충분한 농도의 상기 작용제 또는 길항제의 소정량을 환자에게 투여하여, 파킨슨 질병, 알츠하이머 질병, 헌팅통병과 같은 연장된 폴리글루타민 서열과 관련된 뉴우런 질환, 말초 신경병, 급성 뇌 상해, 신경계암, 다발성경화증, 근위축성측삭경화증, 말초신경외상, 신경독소에 대한 상해 노출, 복합내분비선신생조직형성, 가족히르쉬스프룽병 계열, 프리온 관련 질환, 크로이츠펠트 야콥병, 발작, 실질적으로 말초 또는 중추 신경형성 성분을 포함하는 동통증후군, 류마티스/염증성 질환 및 유도능 장애와 같은 질환을 치료하거나 예방하는데 사용될 수 있다. 이러한 화합물은 또한 약제학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제와 함께 약제학적 조성물에 포함될 수 있다.
성장 인자(에노빈)의 작용제 또는 길항제은 한 구체예에서 성장 인자의 존재하에서 적절한 수용체 및 cRET를 발현하는 세포 조직 또는 개체를 후보 화합물에 접촉시키고, 상기 세포, 조직 또는 개체내의 RET 활성 수준을 후보 화합물과 접촉되지 않은 대조군과 비교함으로서 동정될 수 있다.
본 발명의 다른 구체예는 신경친화성 인자의 길항제를 동정하는 방법을 포함하고, 상기 방법은 상기 성장 인자의 존재하에서 상기 성장 인자의 적절한 수용체 및 cRET를 발현시키는 세포 조직 또는 개체를 후보 화합물과 접촉시키고, 리포터 분자에 컨쥬게이트된 신호 키나제에 특이적인 항체를 가한 후, 상기 화합물과 접촉하지 못한 세포 조직 또는 개체과 비교되는 적절한 수용체가 한 성분인 신호 형질 도입 경로에서 신호 키나제의 활성화 수준을 측정하는 것을 포함한다.
본 발명의 추가적 일면은 증가된 장 연동 운동에 의해 매개된 위장관 질환 또는 질환 치료용 약제의 제조에 있어서, 본 발명에 따라 길항제로 동정된 화합물의 용도를 포함한다.
본 발명의 분석에서 동정된 화합물은 위장관의 운동성을 증진키는데 사용될 수 있고, 그러므로 방해를 받거나 손상된 위장관 이동과 관련된 이상을 치료하는데 유용할 수 있다.
따라서, 이러한 화합물은 방해를 받거나 손상된 장 공복과 관련된 이상으로 앓거나 더욱 일반적으로 방해를 받거나 손상된 위장관 이동과 관련된 이상으로 앓는, 인간을 포함한 온혈동물을 치료하는데 유용할 수 있다. 결과적으로, 예를 들면 위식도 역류, 소화불량, 위마비, 수술 후의 장폐색, 및 가장폐색과 같은 이상을 환 자에게서 완화시키는 방법이 제공된다.
소화불량은 소화기능의 손상이며, 이는 초기 위장관 기능장애, 특히, 증가된 근육의 수축과 관련된 위장관 기능성 장애의 이상으로서, 또는 맹장염, 담낭 장애, 또는 영양 실조와 같은 다른 질병에 기인한 합병증으로서 발생할 수 있다. 소화 불량의 이상은 예를 들면, 식욕 부진, 포만감, 초기 포만, 구역질, 구토 및 고장증이다.
위마비는 위장의 기형에 의해 초래될 수 있고, 당뇨병, 진행성전신성경화증, 식욕부진, 신경절제 및 긴장성근이영양증과 같은 질환의 합병증으로 초래될 수 있다.
수술 후의 장폐색은 수술후에 따르는 근육 수축의 파괴에 의한 장에서의 장애 및 운동 손상이다.
가장폐색은 변비, 복통 및 구토로 특징화되는 이상으로 생리적 장애에 관한증거는 없다.
본 발명의 화합물은, 따라서 이상의 실제 원인을 제거하거나 이상을 경감시키는데 사용될 수 있다.
추가로 결장의 운동활성 자극제인 일부의 화합물은 운동성 장애, 예를 들면 소장 및 대장의 감소된 연동운동 또는 지연된 위 공복과 배합된 운동성 장애와 관련된 이상을 앓는 환자에서 장 이동을 정상화시키거나 개선시키는데 유용하다.
본 발명의 화합물의 결장 운동 이용과 관련하여, 장의 운동성 장애, 예를 들면 변비증, 가장애, 장무긴장증, 수술 후 장무긴장증, 과민성 장 증후군(IBS), 및 약물-유도성 운송 지연을 앓는 인간을 포함하는 온혈 동물을 치료하는 방법이 제공된다.
본 발명의 분석에 따른 길항제로 동정된 화합물은 또한 설사(분비성 설사, 박테리아 유발성 설사, 콜레라성 설사, 여행자설사 및 신경성 설사를 포함), 크론병, 경성결장, 과민성 장 증후군(IBS), 설사성 과민성 장 증후군과 같은, 장내 연동운동의 증가로 초래된 위장관 이상의 치료 또는 예방에 사용될 수 있다.
본 발명의 화합물의 용도성과 관련하여, 본 발명은 또한 과민성 장 증후군(IBS)와 같은 위장관 이상, 특히 설사성 IBS를 앓는 인간을 포함한, 온혈동물을 치료하는 방법을 제공한다. 결과적으로 과민성 장 증후군(IBS), 설사성 과민성 장 증후군, 장 과민증 및 위장 과민증과 관련된 동통의 감소와 같은 이상을 앓는 환자로부터 완화시키는 치료법이 제공된다.
본 화합물은 또한 예를 들면 상부 장의 운동성과 관련된 다른 위장관 질환에서 잠재적으로 사용될 수 있고, 구토 및 세포독성 약물 및 방사성 유도 구토 치료용 항구토제로 잠재적으로 사용될 수 있다.
염증성 장 질환은 예를들면, 궤양성 대장염, 크론병등을 포함한다.
본 발명의 추가적 일면은 상기 질환의 이상을 경감하거나 완화시키기에 충분한 농도의 본 발명에 따른 안티센스 분자 또는 그의 길항제의 소정량을 환자에게 투여하여 본 발명에 따른 에노빈의 발현에 의한 질환을 치료하는 방법을 포함한다.
에노빈의 발현의 불활성화 또는 억제에 의한 질환은 또한 유리하게는 질환의 이상을 감소시키거나 예방하기 위해서 충분한 농도의 에노빈의 작용제로로 동정 된 화합물의 소정량을 개인에게 투여함으로서 치료될 수 있다.
추가적인 면에서, 본 발명은, 본 발명에 따라 작용제 또는 길항제로 동정된 후보 화합물을 선별하고, 대량의 상기 화합물을 제조하며, 제조된 화합물을 약제학적으로 허용가능한 담체에 제형화시키는 것을 포함하는, 인간 신경친화성 성장 인자, 에노빈과 관련된 질병 치료용 약제학적 제제를 제조하는 방법을 제공한다.
하기 실시예에서 더욱 상세히 설명되는 바와 같이, 에노빈은 탁솔 유도성 감각 결함을 감소시키는데 성공적이었다. 그러므로, 에노빈은 실질적으로 말초 및 중추 신경형성 성분을 갖는 동통증후군, 류마티스 질환 및 유도능 장애에서 역할을 할 수 있고, 경구, 직장 및 전신 적용의 경피적, 국소적, 국부적, 중추적(예를 들면, 경막상으로, 초내로, ICV, 신경총내로, 신경내로) 적용한 후, 감각 과정에서 조절자로서 역할을 할 수 있다. 그러므로, 에노빈에 의해 매개된 다른 이상에 대해 본 명세서에 기술된 방법과 동일한 방법으로, 상기 질환의 이상을 완화하거나 예방에 충분한 농도로, 본 발명에 따라 적절한 것으로서 안티센스 분자 ,핵산, 에노빈 단백질, 약제학적 조성물 또는 작용제 또는 길항제로 동정된 화합물을 투여함으로서 이들 이상을 완화하거나 심지어 예방할 수 있다.
본 발명의 치료적 또는 약제학적 조성물은 본 분야에서 공지된 적절한 경로예들 들면, 정맥내로, 피하로, 근육내로, 경피로, 초내로 또는 대뇌내를 통해 투여될 수 있거나 생체외 처리 프로토콜에서 세포내로 투여할 수 있다. 투여는 주사에 의해 빠르게 또는 느린 주입 또는 느린 방출 제제의 투여로 소정기간에 걸쳐 수행될 수 있다. 중추 신경계내 조직을 치료하기 위해 투여는 뇌척수액(CSF)내로 주사 또는 주입되어 이뤄질 수 있다.
에노빈은 또한 필요한 약제학적 또는 약동학적 성질을 제공하는 제제와 함께 연결되거나 결합될 수 있다. 예를 들면, 이는 혈-뇌막을 가로지르는 침투와 이동을 증진시키는 것으로 본 분야에 알려진 물질, 예를 들면, 트랜스페린 수용체에 대한 항체와 같은 물질과 결합될 수 있고 정맥내 주사로 투여될 수 있다.
에노빈, 안티센스 분자 또는 본 발명에 따라 에노빈의 작용제 또는 길항제로 동정된 화합물은 약제학적 조성물의 형태로 사용될 수 있고, 이는 본 분야에서 잘 공지된 과정에 따라 제조될 수 있다. 바람직한 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제 또는 부형제, 예로서 생리학적 식염수 용액을 포함한다. 또다른 비-독성 염, 멸균수등을 포함하는 약제학적으로 허용가능한 다른 담체 또한 사용가능하다. 계속된 투여를 위해 멸균수를 가하여 재구성하기에 앞서, 조성물이 동결되고 멸균 조건하에서 저장될 수 있도록 하는 적절한 완충액 또한 존재할 수 있다. 처리을 필요로 하는 조직내로 이식될 수 있는 고체 또는 반고체의 생물학적으로 적합합 반-고체 매트릭스내로 에노빈을 혼입시킬 수 있다.
담체는 또한 pH, 삼투압, 점성, 무균도, 지질도, 용해도등 또다른 조건을 변형시키기 위해 약제학적으로 허용가능한 다른 부형제를 함유할 수 있다. 투여된 후 지속되거나 지연된 방출을 허용하는 약제학적으로 허용가능한 부형제 또한 포함될 수 있다.
본 발명에 따른 에노빈 단백질 또는 핵산 분자 또는 화합물은 경구로 투여될 수 있다. 본 구체예에서, 이들은 캡슐화 될 수 있고 당업자에게 공지된 고체 복용 형태로 적당한 담체와 함께 배합될 수 있다.
당업자에게 공지된 바와 같이, 특정 복용법은 사용되는 특정 투여 경로에 의해 좌우되어 환자의 신체 표면적 또는 차지하고 있는 체적에 따라 계산될 수 있다. 그러나, 실제로 투여되는 조성물의 양은 이상의 심각성, 투여되는 조성물, 나이, 체중, 및 각 환자의 반응, 선택된 투여 경로와 같은 치료하려는 질환에 속하는 환경에 기초하여, 의사에 의해 결정된다.
본 발명은 순전히 하기 실시예 및 및 동반되는 도면을 참조로하여 보다 명확히 이해될 것이다.
도 1은 에노빈으로 기술된 본 발명에 따른 신경친화성 인자의 cDNA 서열의 일부이다. 이 컨센서스(consensus) 서열은 상이한 cDNAs상 및 게놈 DNA상에서 프라이머 PNHsp3 및 PNHap1를 이용하여 PCR증폭하고 클론닝시키고 수득된 서열을 분석하고 비교하여 수득하였다. 예상된 한 문자 코드의 아미노산 서열이 DNA 서열상에 표시된다. 뉴클레오타이드 잔기 번호는 DNA 서열의 오른쪽에 표시되고 여기서 아미노산 잔기 번호는 해독된 단백질 서열 오른쪽에 표시된다. 프로도메인의 예측되는 RXXR 절단되는 부위는 굵게 및 밑줄로 표시되어 있다. 성숙한 단백질의 추정되는 개시는 화살표로 표시된다. TGF-β패밀리의 모든 요소에 대해 특징적인 7개의 보존적 시스테인 잔기는 굵게 표시된다. N-글라이코실레이션 위치는 이중 밑줄로 표시된다.
도 2는 인간 GDNF, NTN, PSP 및 EVN의 예상되는 성숙한 단백질 서열이다. 서열은 ClustalW 나열 프로그램을 사용하여 배열되었다. 3개의 단백질 모두에서 보 존되는 아미노산 잔기는 검은 부분에 포함된다. 2 또는 3개의 단백질에서 보존되는 아미노산 잔기는 어둡게 그늘져 있다. TGF-β패밀리의 요소의 특징적인 7개의 보존되는 시스테인 잔기는 서열위에 별로 표시된다. 아미노사 잔기는 오른쪽에 번호가 매겨진다. 대쉬는 배열을 최적화시키기 위해 서열에 도입된 갭을 표시한다.
도 3은 에노빈의 cDNA 서열의 일부이다. 이 컨센서스 서열은 상이한 cDNAs상에서 PCR증폭(프라이머 PNHsp1 및 PNHap1을 이용하여 첫번째 PCR을 하고 프라이머 PNHsp2 및 PNHap2을 이용하여 네스티드(nested) PCR을 한)하고 클론닝시키고 수득된 서열을 분석하고 비교하여 수득되었다. 뉴클레오타이드 30 내지 284(리딩 프레임A)의 해독된 한 문자 코드 아미노산 서열은 서열위에 표시되고 오른쪽에 번호가 매겨진다(A1 내지 A85). 이 리딩 프레임은 예상된 ATG 해독 개시 코돈을 포함한다. 뉴클레오타이드 334 내지 810(리딩 프레임B)의 해독된 한 문자 코드 아미노산 서열은 서열위에 표시되고 오른쪽에 번호가 매겨진다(B1 내지 B159). 이 리딩 프레임은 GDNF, NTN 및 PSP와 상동한 영역을 함유한다. 뉴클레오타이드 잔기 번호는 DNA 서열의 오른쪽에 표시된다. 프로도메인의 추정되는 RXXR 절단 부위는 굵게 및 밑줄로 표시된다. 성숙한 단백질의 예상되는 개시는 화살표로 표시된다. TGF-β 패밀리 모든 구성요소에 대해 특징적인 7개의 보존되는 시트테인 잔기는 굵게 표시된다. N-글라이코실레이션 부위는 이중 밑줄로 표시된다.
도 4는 인간 에노빈의 염색체 배치의 도면이다. (A)에노빈에 대한 FISH 지도작성 결과의 도표. 각각의 점은 인간 염색체 1, 영역 p31.3-p32상에서 검출된 이중 FISH 신호를 표시한다. (B) 에노빈의 FISH 지도작성의 예. 왼쪽 패널은 염색체 1상 의 FISH 신호를 표시한다. 오른쪽 패널은 염색체 1을 동정하기 위하여 4',6-디아미디노-2-페닐인돌로 염색된 동일한 유사분열의 그림을 나타낸다.
도 5는 상이한 인간의 조직내에서의 에노빈의 발현 도면이다. (A), (B), (C)는 에노빈 조직 발현의 노던 블랏 분석이다. 상이한 인간 조직에서의 에노빈 mRNA 발현은 인간 폴리(A) 리치(rich) RNA의 블랏을 분석하기 위해 에노빈의 코딩 영역 부분(성숙한 에보빈 단백질의 코딩 영역을 포함하는)과 일치하는 프로브를 사용하여 확인하였다. (A) 다양한 조직 노던 (MTN) 블랏; (B) MTN 블랏Ⅱ 태아 MTN 블랏Ⅱ. 패널 D는 동일한 에노빈 cDNA 단편으로 프로브된 인간 RNA 마스터 블랏의 방사선 자동사진을 나타낸다. 패널(E)는 (D)로부터 유도된 RNA 마스터 블랏상의 인간 조직 mRNA 샘플의 위치를 나타낸다,
도 6은 10-6M 탁솔로 처리하고 72시간 후, SH-SY5Y 세포의 전체 생존 및 용매의 조건에 따라 표준화됐을 때 에노빈 증가 투여량에 따른 이 생존에 대한 효과를 설명하는 그래프이다. 탁솔로 처리하기 전에 SH-SY5Y 세포를 25nM 스타우로스포린(staurosporine)을 이용하여 5일동안 분화시킨다. 6개의 실험중 2개의 독립된 실험을 통해 데이터를 얻는다. 평균과 표준편차가 표시되어있다.
도 7은 용매의 조건에 대해 표준화 됐을 때, 스타우로스포린-분화된 SH-SY5Y세포의 신경돌기 외향 성장에 대한 48시간에 걸친 에노빈의 증가된 농도에 대한 효과를 나타내는 그래프이다. 48시간에 걸친 실험을 하기 전에 SH-SY5Y 세포를 25nM 스타우로스포린을 이용하여 5시간동안 분화시킨다. 양성 대조군으로서, 25nM의 스타우로스포린의 분화 효과가 표시된다. 신경돌기 길이는 적어도 5000 세포상에서 계산된다. 데이타는 이중으로 수행된 실험으로부터 제공된다. 평균과 표준편차가 표시되어 있다.
도 8 내지 18은 다양한 세포의 증식에 대한 에노빈의 효과를 나타내는 그래프이다.
도 19는 핀 프릭 시험(pin prick test)를 사용하여 탁솔 유도된 감각 결함에 대한 에노빈의 효과를 나타낸 그래프이다. 탁솔 처리 후 2개의 상이한 용량의 에노빈(23 또는 130㎍/ml; n은 10 래트/ 그룹) 또는 담체/ 염수(n은 20 래트)로 처리된 쥐의 경과시간에 걸친 평균(±SEM) 누적 점수가 주어진다. 75㎕의 에노빈 또는 담체/ 염수를 오른쪽 뒷다리 발바닥에 주입하였다.
도 20은 핀 프릭 시험을 사용하여 탁솔 유도된 감각 결함에 대한 에노빈의 효과를 나타낸 그래프이다. 탁솔 처리 전 2개의 다른 투여량의 에노빈(23 또는 130㎍/ml; n은 10 래트/ 그룹) 또는 담체/ 염수(n은 20 래트)로 처리된 쥐의 평균(±SEM) 누적 점수가 주어진다. 75㎕ 부피의 에노빈 또는 염수/담체을 오른쪽 뒷다리 발바닥에 주입하였다.
도 21은 에노빈의 DNA 서열이다. 콘센서스 서열을 인간 전두엽 피질 cDNA상 및 인간 게놈 DNA상에서 프라이머 PNHsp5 및 PNHap1을 사용하여 PCR로 증폭시킨 후 클로닝하고 수득된 서열 분석 및 결과 서열과 비교하여 수득하였다. 해독 후, 기능적 에노빈 단백질을 생산하는 스플라이스 변이체에 대해서만 DNA 서열상에 예상된 아미노산 서열을 표시한다. 뉴클레오타이드 잔기 번호는 DNA 서열의 왼쪽에 표시하고, 반면에 아미노산 잔기 번호는 해독된 단백질 서열의 오른쪽에 표시된다. 게놈 서열과 서열화된 cDNA 단편의 비교에 의해 검출된 5' 및 3' 스플라이스 부위는 왼쪽 또는 오른쪽으로 굽어진 수직선으로 각각 표시되고 연속적으로 번호가 매겨진다. 프로도메인의 예상되는 RXXR 퓨린 절단 부위는 굵게 및 밑줄로 표시된다. 성숙한 단백질의 예상되는 개시는 화살표로 표시된다. TGF-β 패밀리의 모든 구성요소의 특징인 7개의 보존되는 시트테인 잔기는 굵게 표시된다. N-연결된 글라이코실레이션 부위는 이중 밑줄로 표시된다. 5' 및 3' 스플라이스 위치는 넘버링되고 원이 쳐져있다.
도 22는 인간 조직에서 상이한 에노빈 스플라이스 변이체의 발현을 나타낸 도면이다. (A)상이한 인간 조직으로부터 유래된 RNA 상에서 에노빈 특이적 프라이머를 이용한 RT-PCR시험으로 동정되고 클로닝되며 PCR 생성물의 서열 분석된 에노빈 스플라이스 스플라이스 변이체의 도면. 윗줄은 크기(bp)를 나타낸다. 둘째줄은 에노빈 게놈 서열을 나타낸다. 해독의 개시 및 종결 코돈, 성숙한 에노빈 코딩 서열의 개시 위치 및 5' 및 3' 스플라이스 위치의 부위( 참조 도면 21)가 표시된다. 도의 오른쪽 부위는 100 bp DNA 래더와 함께 난소 및 전두엽 피질에서 RT-PCR에 의해 수득된 PCR 생성물을 표시한다. 상이한 mRNA 변이체의 위치는 크기와 함께 표시된다(개시부터 종결코돈까지). 해독된 단백질은 왼쪽에 표시된다. 박스는 cDNA에서 나타내지는 영역을 기술한다. 점선은 스플라이스된 게놈 DNA를 나타낸다. 빗금친 부위는 성숙한 에노빈 코딩 서열을 표시한다. 점선은 성숙한 에노빈 코딩 서열의 개시를 나타낸다. 기능적 에노빈 단백질은 생산할 수 있는 두개의 트랜스크립트(transcripts)는 왼쪽에 별표로 표시된다.(B)주된 스플라이스 변이체 의 조직 분포. 사진은 상이한 인간 cDNA상에서 에노빈 특이적 프라이머를 이용한 RT-PCR로 수득된 PCR 단편을 나타낸다. 4개의 주된 스플라이스 변이체(A 내지 D)는 왼쪽에서 화살표로 표시된다. 크기는 겔상에서 크기 참조로 사용된 100 bp DNA 래더에 기초하여 오른쪽에 표시된다.
도 23은 도 21의 DNA 서열에서 2개의 인트론을 스플라이싱해냄으로서 수득된 에노빈의 긴 스플라이스 변이체의 예상되는 단백질 서열이다. 스플라이스 부위 5'1 및 3'1 이 첫번째 인트론을 제거하기 위해 사용되었고 스플라이스 부위 5'2 및 3'-3은 두번째 인트론을 제거하기 위해 사용되었다. 이는 상기 나타난 바와 같이 228개 아미노산 잔기 단백질을 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 갖는 cDNA를 가져온다.
도 24는 도 21의 DNA 서열로부터 두개의 인트론을 스플라이싱해으로서 수득된 에노빈의 다른(짧은) 스플라이스 변이체의 예상되는 단백질 서열이다. 스플라이스 부위 5'1 및 3'2 이 첫번째 인트론을 제거하기 위해 사용되었고 스플라이스 부위 5'2 및 3'-3은 두번째 인트론을 제거하기 위해 사용된다. 이는 상기 나타난 바와 같이 220개 아미노산 잔기 단백질을 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 갖는 cDNA 서열을 가져온다. 이 단백질 서열은 도 23 서열과 비교할 때 8개의 아미노산 잔기가 빠져있다.
도 25는 보통 질환의 조직에 에노빈의 발현 수준을 비교하기 위해 설계된 실험으로부터 얻은 결과를 나타내는 그래프이다. 에노빈 및 GAPDH 발현은 다발성경화증 및 알츠하이머 질병과 관련하여 뇌조직에서 나타내진다.
도 26은 파킨슨 질병 및 암에서 에노빈 및 GAPDH의 발현 수준을 검출하기 위 해 얻은 결과를 나타내는 그래프이다.
기탁
에노빈을 코딩하는 서열을 포함하는 플라스미드 EVNmat/pRSETB를 1999년 5월 6일, 수탁번호 제 LMBP3931호로 1997년 4월 28일의 부다페스트 조약의 규정에 따라, 벨기에 겐트 B9000 소재의 라보라토리엄 부르 몰레쿨-플라시미던콜렉티(Laboratorium voor Moleculaire-Plasmidencollectie (LMBP))의 마이크로 바이얼러지의 벨기에 코디네이트 콜렉션(Belgian Coordinated Collections of Micro-Biologie(BCCM))에 기탁하였다.
재료 및 방법
재 료
천연 타크(Taq) 중합효소, 앰피실린(ampicillin), IPTG(이소프로필-β-D-티오갈락토사이드), X-gal(5-브로모-4-클로로-3-인돌일-β-D-갈락토피라노시드) 및 모든 사용된 제한 효소는 베링거만하임(Mannhein, Germany)으로부터 얻었다. 10mM dNTP 혼합물을 라이프 테크날러지(Life Technologies)(Gaithersburg, MD, USA)에서 구입하였다. TOPO-TA 클로닝 키트는 인비트로겐 BV(Leek, The Netherlands)에서 구입하였다. 퀴아진 플라스미드 미니- 또는 미디- DNA(Qiagen plasmid mini- or midi- DNA) 정제키트, 퀴아프렙 스핀 미니프렙 키트(Qiaprep Spin Miniprep kit) 및 퀴아퀵 겔(Qiaquick gel) 추출 키트는 퀴아겐 GmbH (Qiagen GmbH(Dusseldorf, Germany)에서 구입했다. cDNA 라이브러리, 마라톤TM(Marathon) 레디 cDNA 키트, 인 간 다양한 조직 cDNA(MTCTM) 패널 Ⅰ및 Ⅱ 다양한 조직 노던 블랏 및 어드밴티지-GC cDNA PCR 키트는 클론테크 라이브러리(Palo Alto, CA, USA)에서 구입했다. 모든 PCR 반응은 GeneAmp PCR 시스템 9600 사이클러(Perkin Elmer, Foster City, CA, USA)에서 수행하였다. LB(Luria-Bertani) 배지는 10g/l 트립톤, 5g/l 효모 추출물 및 10g/l NaCl로 구성된다. 2x YT/앰피실린 플래이트는 16g/l 트립톤, 10g/l 효모 추출물, 5g/l NaCl, 15g/l 아가 및 100mg/l 앰피실린으로 구성된다.
데이터베이스 상동성 조사 및 서열 비교.
조회 서열로서 완전한 인간 신경교 세포주 유도성 신경친화성 인자(GDNF; 수탁번호 제 Q99748호), 뉴트린(NTN; 수탁번호 제 P39905호) 및 퍼스핀(PSP; 수탁번호 제 AF040962호)의 cDNA 유도성 단백질 서열을 사용하여, 최신의 EMBL/GenBank 인간 발현된 서열 태그(EST) 및 게놈 데이터베이스상에서 BLAST(Basic Local Alignment Search Tool; Altschul et al., 1990) 조사를 수행하였다.
GenBank 데이터베이스에 제공된 수탁번호 제 AC005038호 및 다수의 EST와 함께 게놈 서열을 사용하여 추가적인 BLAST 조사를 수행하고 이 게놈 서열과 상동성을 나타냄을 검출하였다.
BESTFIT 프로그램(Genetics Computer Group sequence analysis software package, version 8.0, University of Wisconsin, Madison, WI, USA)을 사용하여 서열을 한쌍씩 비교함으로써 GDNF 패밀리의 요소 사이의 일치도 퍼센트 및 유사도 퍼센트를 계산하였다. DNA 또는 단백질 서열의 배열은 ClustalW 배열 프로그램(EMBL, Heidelberg, Germany)으로 수행되었다.
PCR을 위한 올리고뉴클레오타이드 합성 및 DNA 시퀀싱.
모든 올리고뉴클레오타이드 프라이머는 Eurogentec(Seraing, Belgium)으로부터 주문되었다. 특정 삽입 시퀸싱 프라이머(15- 및 16-mers) 및 PCR 반응에 사용되는 프라이머는 손수 제작하였다. DNA를 퀴아젠-팁-20 또는 -100 음이온 교환(Qiagen-tip-20 or -100 anion exchange) 또는 퀴아퀵 나선 칼럼(Qiaquick spin colums)상에서 제조하였고 30㎕ TE-완충액(10mM Tris. HCl, 1mM EDTA (나트륨 염), pH 8.0)중 칼럼으로부터 회수하였다.
ABI 프리즘 빅다이 터미네이터 사이클 시퀸싱 키트(ABI prism BigDye Terminator Cycle sequencing)을 사용하여 두 개의 스트랜드상에서 시퀸싱 반응을 수행하고 어플라이드 바이오 시트템(Applied Biosystems) 377XL 서열기(Perkin Elmer, ABI Division, Foster City, CA, USA)상에서 진행시켰다. 서열 조립 및 수작업 편집에 시퀀서TM 소프트웨어(Sequencher software)를 사용하였다(GeneCodes, AnnArbor, MI, USA).
신규한 GDNF 상동물의 클로닝
해독된 단백질의 서열이 성숙한 NTN 및 PSP와 일치하는 EMBL 수탁번호 제 AC005038호의 뉴클레오타이드 67411 내지 68343의 DNA 영역을 사용하여 PCR 증폭을 위한 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 설계하였다. 사용된 상이한 프라이머를 표1에 나타내었다.
표 1. AC005038 단편의 PCR 증폭을 위해 사용된 프라이머.
Figure 112001000767140-pct00001

프라이머 PNHsp3 및 PNHap1을 사용하여, 상이한 인간 조직으로부터 유래된 cDNA(태아 뇌, 전체 태아, 전립선 또는 폐 Marathon-ReadyTH cDNA(Clontech Laboratories), 전두엽 피질, 해마 및 중뇌 cDNA) 및 인간 게놈 DNA상에서 502bp의 단편을 증폭시켰다. EMBL/GenBank 데이터베이스로부터 얻은 게놈 서열(수탁번호 제 AC005038호)에 기초하여, 증폭될 단편은 76%의 G+C를 함유하고 있다는 것을 예측하였다. 따라서, GC가 풍부한 DNA 서열을 증폭시키기 위해 최적화된 Advantage-GC cDNA PCR 키트(Clontech laboratories, Palo Alto, CA, USA)를 사용하여 증폭시켰다. PCR 반응은, 1xGC cDNA PCR 반응 완충액, 0.2mM dNTP, 1M GC-MELTTM, 200nM 프라이머 PNHsp3 및 PNHap1, 1㎕의 어드밴티지 글렌타크(Advantage KlenTaq) 폴리머레이즈 혼합물 및 1 내지 5㎕의 cDNA 또는 0.5㎍의 게놈 DNA를 함유하는 전체 부피 50㎕중에서 수행되었다. 샘플을 95℃로 5분동안 가열하고 최종 단계는 7분에서 72℃로하여, 35회 반복을 위해 45초동안 95℃에서, 1분동안 58℃에서 40초동안 72℃에서 반복하였다. 샘플을 최종적으로 2.5U의 천연 타크 DNA 폴리머레이즈로 처리 하여 오버행(Aoverhang)을 가하였다. PCR 생성물을 1xTAE 완충액(40mM 트리스-아세테이트, 1mM EDTA(나트륨 염), pH 8.3)중 1%(w/v) 아가로스 겔상에서 분석하였다. 예상된 크기(495bp)의 PCR 단편을 겔로부터 잘라내고 퀴아퀵 겔 추출 키트(Qiaquick gel extraction kit)를 이용하여 정제시켰다. PCR 단편을 시퀸싱시켜 그들의 일치성을 확인하고 제작자의 지시에 따라 TOPO TA 클로닝 키트를 사용하여 플라스미드 벡터 pCR2.1-TOPO내로 클로닝시켰다. 약 20ng의 정제된 단편이 전체 부피 5㎕중 1㎕의 pCR2.1-TOPO 벡터와 결합되었다. 반응물을 실온(20℃)에서 5분동안 인큐베이션시켰다. 2㎕의 반응물을 열-쇼크 형질전환을 이용하여, TOP10F'의 적절한 세포(Invitrogen BV)내로 형질전환시키고 블루-화이트 스크리닝을 위해 10mM IPTG 및 2%(w/v) X-gal로 보충된 2xYT/앰피실린(ampicillin) 플레이트에 플레이트시켰다. 밤새도록 증식한 흰 콜로니를 플레이트로부터 채취하여 100mg/l 앰피실린 및 퀴아프렙 스핀 미니프렙 키트(Qiaprep Spin Miniprep kit)을 사용하여 제조된 플라스미드 DNA로 보충된 5ml의 LB 배지에서 키웠다. 예상된 크기의 삽입 존재를 EcoRI을 이용한 제한 분해에 의해 확인하였다. 다수의 양성 클론의 플라스미드 삽입을 시퀸싱하고 수득된 서열을 ClustalW 배열 프로그램을 이용하여 비교하였다.
신규한 GDNF 상동물에 대한 추가적인 코딩 서열을 수득하기 위해, EMBL/GenBank 서열(수탁번호 제 AC005038호)에 기초한 931bp의 예상된 크기의 단편을 프라이머 PNHsp1 및 PNHap1을 이용하는 PCR로 증폭시켰다. PCR 반응은, 1xGC cDNA PCR 반응 완충액, 0.2mM dNTP, 1M GC-MELTTM, 200nM 프라이머 PNHsp1 및 PNHap1, 1㎕의 어드밴티지 클렌타크(Advantage KlenTaq) 폴리머레이즈 혼합물 및 중뇌, 전두엽 피질 또는 해마로부터 유래된 1 내지 5㎕의 cDNA 또는 0.5㎍의 게놈 DNA를 함유하는 전체 부피 50㎕중에서 수행되었다. 샘플을 95℃로 5분동안 가열하고 최종 단계는 7분에서 72℃로하여, 35회 반복을 위해 45초동안 95℃에서, 1분동안 58℃에서 1분 30초동안 72℃에서 반복하였다. 샘플을 1xTAE 완충액(40mM 트리스-아세테이트, 1mM EDTA(나트륨 염), pH 8.3)중 1%(w/v) 아가로스 겔상에서 분석하였다. 두 번째 증폭은 비축된 프라이머(PNHsp2 및 PNHap2)를 이용하여 수행되었다. 1㎕의 첫 번째 증폭 반응물을, 1xGC cDNA PCR 반응 완충액, 0.2mM dNTP, 1M GC-MELTTM, 200nM 프라이머 PNHsp2 및 PNHap2, 1㎕의 어드밴티지 클렌타크 폴리머레이즈 혼합물을 함유하는 전체 부피 50㎕중에서 사용하였다. 샘플을 95℃로 5분동안 가열하고 최종 단계는 7분에서 72℃로하여, 35회 반복을 위해 45초동안 95℃에서, 1분동안 58℃에서 1분 30초동안 72℃에서 반복하였다. 샘플을 1xTAE 완충액중 1%(w/v) 아가로스 겔상에서 분석하였다. 예상된 크기(870bp)의 PCR 단편을 겔로부터 잘라내고 퀴아퀵 겔 추출 키트를 이용하여 정제시켰다. PCR 단편을 시퀸싱시켜 그들의 일치성을 확인하고, 2.5U의 태크 폴리머레이즈로 처리하고, 제작자의 지시에 따라 TOPO TA 클로닝 키트를 사용하여 플라스미드 벡터 pCR2.1-TOPO내로 클로닝시켰다. 약 20ng의 정제된 단편이 전체 부피 5㎕중 1㎕의 pCR2.1-TOPO 벡터와 결합되었다. 반응물을 실온(20℃)에서 5분동안 인큐베이션시켰다. 2㎕의 반응물을 열-쇼크 형질전환을 이용하여, TOP10F'의 적절한 세포내로 형질전환시키고 블루-화이트 스크리닝을 위해 10mM IPTG 및 2%(w/v) X-gal로 보충된 2xYT/앰피실린 플레이트에 플레이트시켰다. 밤새도록 성장한 흰 콜로니를 플레이트로부터 채취하여 100mg/l 앰피실린 및 퀴아프렙 스핀 미니프렙 키트(Qiaprep Spin Miniprep kit)을 사용하여 제조된 플라스미드 DNA로 보충된 5ml의 LB 배지에서 키웠다. 예상된 크기의 삽입 존재를 EcoRI을 이용한 제한 분해에 의해 확인하였다. 다수의 양성 클론의 플라스미드 삽입을 시퀸싱하고 서열을 ClustalW 배열 프로그램을 이용하여 비교하였다.
RT-PCR 분석에 의한 에노빈 유전자 발현 분석
에노빈으로부터 유래된 502bp 단편의 특정 PCR 증폭을 위해 올리고뉴클레오타이드 프라이머 PNHsp3 및 PNHap1(참조 표 1)을 사용하였다. 6개의 상이한 하우스키핑(housekeeping) 유전자의 mRNA 발현 수준에 표준화된 인간 다양한 조직 cDNA(MTMTM) 패널상에서 PCR 증폭을 수행하였다. 에노빈 특정 프라이머를 이용한 PCR 반응을, 1xGC cDNA PCR 반응 완충액, 0.2mM dNTP, 1M GC-MELTTM, 400nM 프라이머 PNHsp3 및 PNHap1, 및 1㎕의 어드밴티지 클렌타크(Advantage KlenTaq) 폴리머레이즈 혼합물을 함유하는 전체 부피 50㎕중에서 수행하였다. 샘플을 95℃로 30초동안 가열하고 35회 반복을 위해 30초동안 95℃에서, 30초동안 68℃에서 반복하였다. 샘플을 1xTAE 완충액(40mM 트리스-아세테이트, 1mM EDTA(나트륨 염), pH 8.3)중 1.2%(w/v) 아가로스 겔상에서 분석하고 Eagle Eye II 비디오시스템(Stratagene, La Jolla, CA, USA)을 사용하여 브롬화 에티듐으로 염색된 겔의 상을 얻었다.
인간 뉴트린 및 퍼스핀 단백질 서열과 함께 최신의 EMBL/GenBank 데이터베이스의 유사성 조사를 통하여 신경친화성 인자 GDNF, NTN 및 PSP와 유사한 예상의 신 규한 단백질, 에노빈(EVN)을 코딩하는 게놈 DNA 서열을 얻었다. 에노빈을 코딩하는 영역을 둘러싼 게놈 DNA 서열을 사용한 추가적 데이터베이스 상동성 조사를 통하여 상이한 인간 조직으로부터 유래된 다수의 발현된 서열 태그(EST) 클론(전립선 상피[수탁번호 제 AA533512호 (ID1322952)], 폐 암종[수탁번호 제 AA931637호], 및 부갑상선 종양[수탁번호 제 AA844072호]를 얻었다. 이 클론들은 GDNF, PSP 또는 NTN과 동일한 영역밖의 DNA 서열을 함유하지만, 에노빈 mRNA는 정상 및 종양 조직에서 발현된다는 것을 확인시켰다.
게놈 서열에 기초하여 프라이머(PNHsp3 및 PNHap1)를 사용한 초기 PCR 증폭을 통해 폐 cDNA를 제외한 태아, 태아 뇌, 전립선, 전두엽 피질, 해마, 중뇌 cDNA 및 게놈 DNA로부터 유래된 약 500bp의 단편을 얻었다. 이들 단편의 클로닝과 서열 분석을 통해 형질전환성 성장 인자 β(TGF-β) 패밀리의 모든 요소 단백질의 특징인 7개의 보존적 시스테인 잔기를 포함하는 139 아미노산 잔기의 예측되는 단백질 서열로 해독되는 474bp의 DNA 서열을 얻었다(Kingsley, 1994) (도 1). 서열은 또한 프로도메인의 절단을 위한 RXXR 모티프(RAAR, 아미노산 위치 23 내지 26)를 함유한다(Barr, 1991). GDNF, NTN 및 PSP 단백질 서열에 프로도메인 서열중 상응하는 위치에 유사한 절단 부위가 존재한다.
생체내에서 에노빈 프로도메인의 이 부위가 절단된다고 가정할 경우, 성숙한 EVN 단백질 서열은 113 아미노산 잔기(도 1의 잔기 27 내지 139)을 함유하고 11965 Da의 계산된 분자량과 11.8의 등전점을 갖는다. 성숙한 서열에 존재하는 효능있는 N-글라이코실레이션 부위( 아미노산 위치 121-123에 NST)가 존재한다. 또한, 공지 된 신경친화성 인자 GDNF, NTN 및 PSP의 성숙한 형태 사이에서 보존되는 다수의 영역이 또한 에노빈에 존재한다(도 2). 표 2는 BESTFIT 프로그램을 사용하여 GDNF 패밀리 요소의 성숙한 단백질 서열을 비교한 결과를 요약한다. 일치도 퍼센트 및 유사도 퍼센트가 나타난다. 사용된 GDNF, NTN, PSP 및 EVN의 성숙한 서열의 비교는 RXXR 절단 부위 다음의 첫번째 아미노산 서열 잔기에서 시작한다.
표 2. BESTFIT 프로그램을 사용한 성숙한 인간 GDNF 패밀리 요소의 쌍 비교.
Figure 112001000767140-pct00002

이 비교를 통하여, 성숙한 에노빈 단백질은 GDNF 보다는 퍼스핀 및 뉴트린과 좀더 밀접하게 관련된다는 것을 밝힌다.
게놈 EMBL/GenBank 서열(수탁번호 제 AC005038호)에 기초한 전두엽 피질 cDNA로부터 유래된 에노빈 DNA 서열의 좀더 큰 단편을 프라이머를 사용하여 증폭시키고, 클로닝하고 서열을 분석함으로써 819bp의 서열을 얻었다(도 3). 이 서열은 뉴클레오타이드 위치 30-32에 예측되는 ATG 개시 코돈을 함유하고 뉴클레오타이드 위치 285-287에 종결 코돈까지 이어진 오픈 리딩 프레임(도 3의 리딩 프레임 A)을 생산한다. 이 영역의 해독된 단백질 서열은 데이터베이스중 공지된 어느 단백질과도 유사성을 보이지 않았다. 두 번째 리딩 프레임(도 3의 리딩 프레임 B)의 cDNA 서열의 해독을 통해 159 아미노산 잔기의 예측된 단백질 서열을 수득한다. 이 서열은 RXXR 절단 부위(위치 B43 내지 B46; 뉴클레오타이드 위치 460-471) 및 성숙한 에노빈 서열과 일치하는 서열(위치 B47 내지 B159; 뉴클레오타이드 위치 472-810)을 함유한다. RXXR 절단 부위 및 성숙한 에노빈을 코딩하는 서열을 포함하는 오픈 리딩 프레임은 뉴클레오타이드 위치 334(프레임내 종결 코돈 앞에)부터 위치 811-813에 종결 코돈까지 이어지지만, 개시 메티오닌 잔기에 대한 ATG 코돈을 함유하지 않는다. 퍼스핀에 유추하여(Milbrandt et al., 1998) 언스플라이스된 인트론(unspliced intron)이 EVN 유전자로부터 유래된 대다수의 mRNA 트랜스크립트에 존재한다고 가정한다. GDNF 및 NTN 또한 그들의 각각의 프로도메인 코딩 영역내 인트론을 갖고 있다(Matsushita et al., 1997, Heuckeroth et al., 1997)
에노빈에 대한 상이한 mRNA 트랜스크립트의 존재를 판단하기위해, 에노빈 코딩 서열의 5’말단, 바로 상류 ATG 개시 코돈의 5' 말단에 위치하는 프라이머(프라이머 PNsp5 [5'-GCA AGC TGC CTC AAC AGG AGG G-3'] 및 네스티드(nested) 프라이머 PNHsp6 [5'-GGT GGG GGA ACA GCT CAA CAA TGG-3']) 및 3' 말단에 존재하는 프라이머(프라이머 PNHap1 및 네스티드 프라이머 PNHap2) [참조 표 1]을 이용하여 RT-PCR 실험을 수행하였다.
실험은 인간 다양한 조직 cDNA 패널(Clontech MTC 패널 I 및 II), 태아 심장 cDNA 라이브러리(Clontech) 및 인간 중뇌, 해마 또는 전두엽 피질로부터 유래된 cDNA상에서 수행되었다(Masure et al., 1998) 초기 PCR 반응은 기술된 바와 같이, 30회의 반복을 위해(95℃-30초, 60℃-30초, 72℃-1분) GC가 풍부한 조건하에서 프라이머 PNHsp5 및 PNHap1을 이용하여 수행되었다(Advantage GC-PCR kit, Clontech). 네스티드 PCR 반응은 30회의 반복을 위해 동일한 조건하에서 프라이머 PNHsp6 및 PNHap2를 이용하여 1㎕의 초기 PCR 생성물상에서 수행하였다.
생성된 PCR 생성물을 1.5% 아가로스 겔상에서 분석하고 ±350bp 내지 ±800bp의 크기로 분류하였다.
다수의 밴드를 겔로부터 정제하고 PCR 단편을 직접 시퀀싱하였다. 일부 정제된 PCR 생성물을 또한 벡터 pCR2.1-TOPO(TOPO-TA 클로닝 키트, Invitrogen)에서 클로닝시키고 이어서 시퀸싱하였다. 서열 분석을 통해 에노빈 서열을 함유하는 상이한 mRNA 분자의 존재를 확인하였다. 수득한 단편의 서열을 게놈 에노빈과 비교하였다. 이로써, 게놈 서열내 다수의 가능한 5' 및 3' 스플라이스 부위를 동정하였다(도 21). 이 모든 스플라이스 부위들은 공여체 및 수용체 스플라이스 부위(Senapathy, P., Shapiro, M.B. & Harris, N.L.(1990)) 스플라이스 접합, 분지점(branch point)부위 및 엑손에 대한 컨센서스 서열에 대응하였다:서열 통계, 동정, 및 게놈 프로젝트의 응용(Methods Enzymol. 183, 252-278). 동정된 상이산 에뇐 스플라이스 변이체들 및 상이한 인간 조직내 그들의 존재를 도 22에 요약한다. 5개의 서열화된 트랜스크립트중 단지 2개만이 ATG 개시 코돈부터 해독되어 기능적 에노빈 단백질을 생산하였다. 이들 2개의 트랜스크립트는 각각 47 및 39 아미노산 잔기의 예측되는 신호 펩티드를 갖는 228 또는 220 아미노산에 대한 단백질을 코딩 한다. 이들 2개의 변이체의 예측되는 단백질 서열이 도 23(긴 변이체) 및 도 24(짧은 변이체)에 보여진다. 긴 변이체는 위치 5'-1과 3'-1에 첫 번째 인트론 및 5'-2와 3'-3에 두 번째 인트론의 스플라이싱을 거쳐 도 21의 DNA 서열로부터 유래될 수 있다. 오픈 리딩 프레임의 해독시 도 23의 예측되는 단백질 서열을 수득한다. 짧은 변이체는 위치 5'-1과 3'-2에 첫 번째 인트론 및 5'-2와 3'-3에 두 번째 인트론의 스플라이싱을 거쳐 도 21의 DNA 서열로부터 유래될 수 있다. 오픈 리딩 프레임의 해독시 도 24의 예측되는 단백질 서열을 수득한다.
도 22B의 밴드 밀도에 의해 판별되는 바와 같이 가장 긴 트랜스크립트가 대부분의 조직에서 가장 풍부한 것으로 보인다. 더 짧은 트랩스크립트는 GDNF, NTN 및 PSP와 일치하는 성숙한 에노빈 아미노산 서열이 결실된 해독된 단백질을 생산하는 프레임 쉬프트를 초래한다. 두 개의 가장 짧은 트랜스크립트는 성숙한 코딩 서열의 일부가 결실되어 있고, 7개의 고도로 보존되는 시스테인 잔기중 2개를 포함한다. 도 22B는 상이한 인간 조직에 주된 스플라이스 변이체의 분포를 나타낸다. 기능적 에노빈 mRNA는 시험된 거의 모든 조직, 뇌, 심장, 신장, 간, 폐, 췌장, 골격근, 결장, 소장, 말초 혈액 백혈구, 지라, 흉선, 전립선, 정소, 난소, 태반 및 태아 심장에서 발현된다. 일부 인간 조직에서(예, 중뇌, 해마), 단지 비-기능적 트랜스크립트의 PCR에 의해 증폭될 수 있다. 전에는 이런 범위까지의 비-기능적 mRNA 트랜스크립트의 발생을 기술한 적이 없었다. 생물학적으로 중요한 이 발견은 연구되어질 것이다. 상이한 조직에 NTN 및 PSP의 발현이 완전히 특정화되지는 않았지만, 그들의 발현 수준은 더욱 낮은 것처럼 보이고 발현은 특정 조직에서 더욱 제한 되는 것처럼 보인다(Kotzbauer et al., 1996, Milbrandt et al., 1998).
E. coli내에서 에노빈의 재조합 발현
에노빈 발현 플라스미드의 작제
프라이머 PNHsp4 및 PNHap2(표 1)를 이용하여 인간 게놈 DNA로부터 414bp PCR 단편을 증폭시키고 TA-클로닝(Invitrogen)을 사용하여 벡터 pCR2.1-TOPO에 클론닝하였다. 서열 분석을 통해 삽입물의 서열을 확인하였다. 에노빈 컨센서스 서열(클론 36)과 함께 삽입물을 함유하는 클론을 사용하여 발현 플라스미드를 작제하였다. 그들의 5' 말단에 적절한 제한 부위를 함유하는 2개의 프라이머를 설계하였다. 전향(forward)프라이머 PNHexp-sp1(5'-GCG GAT CCG GCT GGG GGC CCG GGC A -3')는 BamHI 제한 부위를(밑줄) 함유하고 역 프라이머 PNHexp-ap1(5'-GCC TCG AGT CAG CCC AGG CAG CCG CAG G-3')는 XhoI 제한 부위를(밑줄) 함유한다. 이들 프라이머를 이용하여, 성숙한 에노빈을 코딩하는 343bp 단편(도 1의 위치 81 내지 422)을 클론 36으로부터 증폭시켰다. PCR 반응을, 1xGC cDNA PCR 반응 완충액, 0.2mM dNTP, 1M GC-MELTTM, 200nM 프라이머 PNHexp-sp1 및 PNHexp-ap1, 1㎕의 어드밴티지 클렌타크(Advantage KlenTaq) 폴리머레이즈 혼합물 및 클론 36으로부터 유래된 10ng의 플라스미드 DNA를 함유하는 전체 부피 50㎕중에서 수행되었다. 샘플을 94℃로 5분동안 가열하고 최종 단계는 7분에서 72℃로하여, 25회 반복을 위해 45초동안 94℃에서, 1분동안 58℃에서 30초동안 72℃에서 반복하였다. 퀴아퀵 PCR 정제 키트(Qiagen)를 사용하여 50㎕의 결과 생성물을 정제시키고 이 DNA를 30㎕중에서 용리시켰다. 이어서, 이 정제된 생성물 25㎕를 1시간동안 37℃에서 1x완충액 B(Boehringer Mannheim)중 10U BamHI 및 10U XhoI를 이용하여 30㎕ 반응물에서 분해하였다. 1x TAE 완충액(40mM 트리스-아세테이트, 1mM EDTA(나트륨 염), pH 8.3)중 1%(w/v) 아가로스 겔에서 전기영동시킨 후, 예측되는 353 bp 밴드를 겔로부터 잘라내고 퀴아퀵 겔 추출 키트를 사용하여 정제시켰다. 생성된 단편을 BamHI 및 XhoI으로 연결된 벡터 pRSET B(Invitrogen)에 결찰시켰다. 생성된 플라스미드 작제물의 삽입물(hEVNmat/pRSETB)을 완전한 서열 분석으로 확인하였다. 결과 작제물은 성숙한 에노빈 코딩 서열 프레임에 융합되는 NH2-말단 6x His-tag를 포함하고, 15704 Da의 예측된 분자량을 갖는 146 아미노산 단백질을 코딩한다. 결과 단백질의 NH2-말단 아미노산 서열은 MRGSHHHHHHGMASMTGGQQMGRDLYDDDDKDPAGGPGS(굵게 표시된 성숙한 에노빈 서열, 밑줄 표시된 6x His 태그(tag))이다.
BL21(DE3) E.coli 세포내 에노빈의 발현
뉴트린에 대해 [Creedon et al. (1997)]에 기재된 바와 같이 변형을 이용하여 에노빈 단백질 재조합 생산을 실질적으로 수행하였다. 재조합 에노빈 단백질을 생산하기위해, 플라스미드 hEVNmat/pRSETB를 E. coli 균주 BL21(DE3)(Novagen)에 형질전환시키고 발현을 유도하기 위해 IPTG를 최종 농도 0.2mM에 가하기 앞서, 약 0.5의 OD600까지 30℃(225rpm) 또는 37℃(300rpm)에서 2xYT/앰피실린 배지(16g/l 트립톤, 10g/l 효모 추출물, 5g/l NaCl 및 100mg/l 앰피실린)에서 배양하였다. 3시간의 유도기후 세포 펠릿을 원심분리로 수득하고 포스페이트-버퍼 염수로 세척하고 원심분리한 후 냉동 보관하였다. 정제 및 재폴딩 하기위해, 초음파 처리 완충액(20mM 트리스-HCl, pH 8.0, 300mM NaCl, 1mM 2-머캅토에탄올, 프로테아제 저 해제(CompleteTM protease inhibitor), 칵테일 정제(Boehringer Mannheim, 50ml 완충액 당 1 정제), 및 500mg 세포 펠릿당 1mg 라이소자임)중에서 세포 펠릿을 재현탁시켰다. 세포를 초음파처리하여 파괴하고 함유체를 원심분리를 통해 수득하였다. 함유체를 Ni-NTA 수지(니켈 니트릴로트리아세트산, Qiagen)에 가하기 앞서, 30분동안 37℃에서 완충액 A(8M 우레아, 20mM 트리스-HCl pH 7.6, 200mM NaCl, 1mM 2-머캅토에탄올)중에 용해시키고 인큐베이션시켰다. 37℃에서 40분동안 진탕한 후, 샘플을 완충액 A로 한번 세척한 후 5ml Ni-NTA 칼럼 상에 로딩하였다. 칼럼을 계속적으로 10칼럼 부피 완충액 A, pH 7.2에서 10칼럼 부피 완충액 A로 세척하고, pH 7.2, 10mM 이미다졸하에서 10 칼럼 부피 완충액 A로 세척하였다. 에노빈을 pH 7.2, 200mM 이디마졸하에서 4칼럼 부피 완충액 A중 칼럼으로부터 용리시켰다.
에노빈 재폴딩을, 각 단계마다 감소된 우레아의 양(6M 내지 4M 내지 3M 내지 2M 내지 1M내지 0.5M 내지 0M 우레아)을 함유하는 탈변성(renaturation) 완충액(0.1M 인산나트륨, 0.15M NaCl, 3μM 시스테인, 0.02% 트윈-20, 10% 그리세롤, 0.01M 트리스-HCl, pH 8.3)중에서 4℃에서 밤새도록 투석시켜 단계적으로 수행하였다. 정제된 단백질을 할당하고 -20℃에서 저장하고 추가로 기능적 분석에 사용하였다.
에노빈 유전자의 염색체 위치 측정
프라이머 EVN(7)-sp1(5'-TTC GCG TGT CTA CAA ACT CAA CTC CC-3') 및 PNHap1(5'-GCA GGA AGA GCC ACC GGT AAG G-3')을 사용하여 EMBL 수탁번호 제 AC005038호상에서 설계된 3.3kb 에노빈의 유전자의 단편을 중뇌 cDNA로부터 증폭시 켰다. PCR 반응은, 1x 엑스팬드 롱 템플레이트(Expand Long Template) PCR 반응 완충액(Boehringer Mannheim), 0.5mM dNTP, 1M GC-MELT(Clontech Laboratories), 400nM 프라이머 EVN(7)-sp1 및 PNHap1 및 1㎕의 중뇌 cDNA를 함유하는 전체 부피 50㎕중에서 수행되었다. 2분동안 94℃에서 시작한 후, 0.75㎕의 엑스팬드 롱 템플레이트 폴리머레이즈(Boehringer Mannheim)를 가하고, 10회 반복을 위해 10초동안 94℃에서, 30초동안 58℃에서 3분동안 68℃에서 반복하였다. 이어서, 68℃에서 매 반복시마다 20초씩 연장하면서 20회의 반복을 추가로 수행하였다. 최종적으로 7분동안 68℃에서 수행하였다. 0.8% 아가로스/TAE 겔에서 전기영동 시킨 후, 생성된 3.3kb의 단편을 정제하고 TA-클로닝(Invitrogen)을 사용하여 벡터 pCR2.1-TOPO에서 클로닝하였다. 한 클론의 3.3 kb 삽입물의 완전한 서열 분석을 통하여 수득된 cDNA 서열이 EMBL 데이터베이스(수탁번호 제 AC005038호)에 게놈 서열과 일치한다는 것을 확인하였다. 중뇌 cDNA로부터 수득된 cDNA에서는 어떤 인트론도 스플라이스 아웃(splice out)되지 않았다.
기술된 바와 같이 즉석에서 형광 혼성(FISH) 분석을 통해 염색체 지도작성 연구를 수행하였다(Heng et al., 1992, Heng & Tsui, 1993). 세포 군집에서 세포 반복을 동조하기 위해 0.18mg/ml의 5-브롬-2'-디옥시유리딘(BrdU)로 처리하기 전에 인간 림프구를 37℃에서 68-72시간동안 배양하였다. 동조된 세포를 세척하고 37℃에서 6시간동안 재배양시켰다. 세포를 수득하고 저장액 처리, 고정 및 공기-건조를 포함하는 표준 과정을 사용하여 슬라이드를 제조하였다. 에노빈에 대한 3.3kb 프로브를 바이오틴화 시키고 FISH 검출에 사용하였다. 슬라이드를 55℃에서 1시간동안 굽고, RNase로 처리하고 2분동안 70℃에서 2xNaCl/Cit(20xNaCl/Cit 3M NaCl, 0.3M 디소듐시트레이트, pH 7.0)중 70% 포름아미드에서 변성화시키고, 에탄올로 탈수소화시켰다. 프로브를, 변성된 염색체 슬라이드상에 로딩하기 전에 변성화시켰다. 밤새도록 혼성화시킨 후, 슬라이드를 세척하고 FISH 신호 및 4',6-디아미디노-2-페닐인돌 밴딩 모형을 각각 사진 필름에 기록하고, FISH 신호를 4',6-디아미디노-2-페닐인돌 밴드 염색체와 포개놓음으로써 염색체 밴드를 사용하여 FISH 지도작성 데이터를 얻을 수 있었다(Heng & Tsui, 1993). 사용된 조건하에서, 혼성화율은 이 프로브에 대해 약 72%였다(100개의 체크된 유사분열 도면중에서, 72개가 한쌍의 염색체상의 신호을 나타낸다). 4',6-디아미디노-2-페닐인돌 밴딩을 사용하여 특정 염색체를 동정하였기 때문에, 프로브 및 염색체 1의 짧은 암(arm)으로부터 유래된 신호사이의 할당을 얻을 수 있었다. 10개의 사진(도 4A)의 요약에 기초하여 상세한 위치를 추가로 결정하였다. 사용된 조건하에서, FISH 검출로 선택된 추가적인 로커스(locus)는 존재하지 않았기 때문에, 우리는 에노빈은 인간 염색체 1, 영역 p31.3-p32에 위치한다고 결론을 내린다. 지도작성 결과 예를 도 4B에 제공한다.
생물공학 정보를 위한 국립 센터에 유전자 지도 데이타(NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genemap)로부터, 에노빈 서열을 함유하는 게놈 클론(EMBL 수탁번호 제 AC005038호)이 염색체 1상에 마커 D1S2843 및 D1S417사이에 위치한다고 예측될 수 있다. 이는 염색체 1의 영역 p31.1 내지 p32.3에 일치하고, FISH 분석으로 수득된 데이터를 확인한다.
노던 블랏 및 점 블랏 분석에 의해 결정된 에노빈의 조직 분포.
상이한 인간 조직으로부터 유래된 2㎍의 폴리(A)-리치 RNA을 함유하는 노던 블랏(Clontech Laboratories, Palo Alto, CA,USA; MTMTM blot, MTNTM blot II 및 태아 MTNTM blot II)을 제작자의 지시에 따라 α-32P-dCTP 랜덤-프라이밍(random-priming) 라벨된 (HighPrime 키트, Boehringer Mannheim) 897bp 에노빈 단편과 함께 혼성화시켰다. 이 단편을 전두엽 피질 cNDA상에서 프라이머 PNHsp1 및 PNHap1을 이용하여 PCR 증폭으로 수득한 후, 벡터 cPR2.1-TOPO에서 클로닝하였다. 단편은 종결 코돈까지 에노빈 서열의 897bp을 함유하고 성숙한 에노빈 단백질에 대한 완전한 코딩 서열을 포함한다.
에노빈 mRNA은 약 4.5kb의 주된 트랜스크립트로 검출된다(도 5A-C). 에노빈 mRNA은 조직 범위에서, 가장 현저하게는 심장, 골격근, 췌장 및 전립선에서 발현된다. 일부의 좀더 작은 크기의 트랜스크립트는 예를들면, 태반(4kb, 2.4kb 및 1.6kb) 및 전립선(4kb 및 1.6kb)에 존재한다. 태아 조직에서는, 2.4kb 트랜스크립트가 현저하게 간에 존재하고 좀더 적은양은 폐에도 존재한다. 또다른 트랜스크립트가 태아 신장, 간, 폐 및 뇌에 존재한다.
또한, 상이한 인간 조직 및 발달 단계로부터 유래된 폴리(A) 리치 RNA를 함유하는 RNA 마스터 블랏(Clontech Labortories)을 또한 897bp 에노빈 프로브와 함께 혼성화시켰다. 이 블랏을 만들기위해 사용된 폴리(A) 리치 RNA 샘플이 제작자에 의해 8개의 상이한 하우스키핑(housekeeping) 유전자의 mRNA 발현 수준으로 표준화되었다. 에노빈 mRNA은 편재적으로 발현되었고 그러나 고도의 mRNA 수준은 전립선, 뇌하수체, 기관, 태반, 태아 폐, 췌장 및 신장에서 분명해졌다(도 5D와 E).
GFRα-IgG-Fc 융합 벡터의 작제.
신호 펩티드 및 GPI-부착에 포함된 COOH-말단 소수성 영역을 코딩하는 서열을 제외한 GFRα-1, GFRα-2 및 GFRα-3의 cDNA 영역(각각, 아미노산 27 내지 427을, 20 내지 431을, 28 내지 371을 코딩하는)을 발현 벡터 신호 pIg 플러스(Signal pIg plus)중 인-프레임(in-frame)에서 클로닝하였다(R&D Systems Europe Ltd.). 이들 작제물로부터 발현된 결과 단백질은 17 아미노산 NH2-말단 CD33 신호 펩티드, GFRα단백질 영역 및 243 아미노산 COOH-말단 인간 IgG1-Fc 융합 도메인을 함유한다. CHO 세포를 GFRα 융합 작제물로 트랜스펙트시키고 안정하게 트랜스펙트된 세포를 500㎍ G418을 사용하여 선별하였다. 항 Fc 항체를 사용하여 영구적인 클론을 선별하였다. GFRα 융합 단백질을 정제시키기위해, 세포를 무-혈청 배지에서 배양하고 매 3일 후 마다 세포를 수득하였다. 배지를 원심분리시키고 단백질 A 칼럼(단백질 A Sepharose, Pharmacia Biotech)에 적용시켰다. 결합된 단백질을 pH 3.0에서 0.1M의 시트레이트나트륨으로 용리시키고 pH 8.4에서 1M의 트리스 완충액내로 수득하였다. 1.5의 흡광계수를 이용하여 280nm에서의 흡광도로 단백질 농도를 평가하였다. 이들 정제된 용해되는 GFRα-1 내지 -3 Fc 융합 단백질을 연속된 결합 연구에 사용하였다.
표면 플라스몬(plasmon) 공명 분석
BIAcore 3000 기계를 사용하여 25℃에서 표면 플라스몬 공명(SPR) 실험을 수 행하였다. 고정된 리간드로 에노빈 및 NGF를 이용하여 분석하였다. FI 센서 칩의 카르복실화된 매트릭스를 400mM N-에틸-N-(디메틸아미노프로필)-카보디이미드 및 100mM N-하이드록시-숙신이미드의 1:1 혼합물로 10분동안 먼저 활성화시켰다. 이어서, 재조합 에노빈 및 NGF를 pH 4.5, 유속 5㎕/분으로 10mM 아세테이트 완충액중 활성화된 표면상에 적용시켰다. 빈 반응 그룹을 1M의 에탄올아민 하이드로클로라이드로 불활성화시켰다. 결합 실험을 위해, 용해되는 GFRα1-3- Fc를 유속 10㎕/분으로 HEPES 완충 처리된 염수(150mM NaCl, 3.5 mM EDTA, 0.05% P-20, 10mM HEPES, pH 7.4)중 10-100nM의 농도에서 슈퍼퓨즈시켰다. 3분동안 결합을, 1분동안 해리를 모니터하고 5mM NaOH를 이용하여 재생시켰다. 해리는 HEPES 완충 처리된 염수를 이용한 슈퍼퓨전으로 개시되었다. BIAcore 평가 소프트웨어, 3.0을 사용하여 결합율(ka), 해리율(kd) 및 평형 해리 상수(KD, kd/ka 로 계산된)를 계산하였다.
결과
SPR를 사용하여 용해성 GFRα1-3과 고정된 에노빈의 결합을 측정하였다. 에노빈과 단지 용해성 GFRα3만이 특이적 결합하는 것으로 검출될 수 있었다. GFRα1 및 GFRα2는 고정된 에노빈과 결합하지 않았다. NGF와 결합하지 않는 것만큼 GFRα3의 관찰된 결합은 특이적이었다. 별도의 대조군 실험에서, TrkA-Fc(NGF 수용체)는 고정된 에노빈과는 결합하지 않고 고정된 NGF와 특이적으로 결합하는 것이 검출되었다.
3개의 다른 농도의 GFRα를 사용하여 얻은 결합 곡선으로부터, 표 3의 하기 상수를 유도하였다. 이 결과들은 GFRα3이 에노빈과 특이적으로 결합한다는 것을 증명한다.
표 3
Figure 112001000767140-pct00003

GDNF, NTN 및 PSP 모두는 상이한 형태의 신경 세포의 유지와 생존을 증진시키기 때문에, 에노빈도 역시 신경세포 및 가능하게는, 다른 세포 형태에도 유사한 생물학적 효과를 갖는다고 예측된다. 그러므로, 에노빈 단백질은 보통, 파킨슨 질병, 알츠하이머 질병, 말초신경증, 근위축성측삭경화증(ALS), 헌팅톤병, 급성 뇌 상해, 신경계 암, 다발성경화증, 말초 신경 외상 또는 신경독소에 손상 및 노출을 포함하는 신경 질환을 치료하는데 유용하다는 것이 직시된다.
에노빈은 또한 신경보호의 다양한 측면에서 유용할 수 있다. 상이한 신경 세포 군집의 생존 및 우리 모델 SHSY5Y 세포중 관찰된 신경돌기(neurite) 신장에 미치는 효과를 고려할 경우, 우리는 이 화합물이 신경보호적이고 신경재생산적인 적용성을 갖는다는 것을 제안한다.
이것은 하기 관찰에 기초한다. 탁솔은 NGF에 의해 분화된 PC12 래트 갈색세포종(pheochromocytoma) 세포중 신경성 세포 사멸을 유도한다(Nuydens et al.). 그러므로, 탁솔 유도된 세포 파괴는 DNA 단편화, 어넥신(Annexin) V 라벨링 및 bcl-2 보호에 의해 모니터된 바와 같이, 신경 세포 사멸적 성질을 갖는다. 그러므로, 넓게는 탁솔은 분화된 SH-SY5Y 세포에서 세포 사멸을 유도한다는 것을 예측할 수 있 다. 에노빈은 이 세포 사멸을 감소시킬 수 있고 그러므로, 보통 신경세포 사멸을 전환시킬 수 있다는 것을 보인다.
그러므로 화합물을 세포 사멸이 관찰되는 신경퇴화성 질환, 예를 들면 뇌졸중(Hakim 1998), 파킨슨 질병(Marsden et al 1998), 알츠하이머 질병(Nagy et al 1998), 헌팅톤병(Wellington et al. 1997), 신경외상(Smirnova et al. 1998), 말초 신경마비(Srinivisan et al. 1998)에 유용할 것이다.
최근 임상 실험의 예로서, 우리는 신경친화성 인자는 실제로 탁솔 유도된 세포독성에 대하여 분화된 SH-SY5Y 인간 신경아세포종 세포를 보호한다는 것을 보여왔다.
생존능력 측정의 방법론.
DMEM(37℃)중 0.02mM의 페나진 메토설페이트(PMS, Sigma)로 보충된 100㎕의 1mg/ml 2,3-비스[2-메톡시-4-니트로-5-설포페닐]-2H-테트라졸리움-5-카복스아닐리드(XTT,Sigma) 용액을 각 웰에 가하여 세포 생존능력을 결정하였다. 이어서, 플레이트를 37℃에서 2.5시간동안 배양하였다. 참조로서 650nm을 사용하여, 450nm에서 광학 밀도를 읽었다(Molecular devices). XTT 분석은 테트라졸리윰 염 XTT를 적색 포르마잔 생성물로 전환시키는 것에 기초한다. 이 반응은 미토콘드리아 효소로 수행한다.
신경 분화의 방법론.
1. 인간 신경아세포종 SHSY5Y 세포에서 분화.
SHSY5Y 세포를 25nM 스타우로스포린을 이용하여 5일동안 분화시켰다. 실험 개시 72시간 후 에노빈의 효과를 측정한다(참조 Jalava et al. "Protein Kinase inhibitor staurosporine induces a mature neuronal phenotype in SH-SY5Y human Neuroblastoma cells Through an a,b,z PKC idependent pathway" Journ cell Physiol 155, 301-312 (1993)).
2. 신경돌기 신장 측정.
신경세포의 형태 변화를 하기와 같이 자동적으로 측정하였다. 간단히말해, 적절한 시간에, 글루타르알데히드를 직접 배지에 가하고 30분동안 실온에 방치하였다. 적절한 시점에 세포의 형태가 실제 상황을 반영한다는 것을 확신시킨다. 세포는 인디 워크스테이션(Indy workstation)(Silicon Graphics, Mountain Vies, USA)에 의해 조정되는 마르쯔 하우저 스캐닝 스테이지(Marzhauser scanning stage)로 장치된, Axiovert 현미경(Zeiss Oberkochen, Germany)에 투과 광선 양식으로 관찰하였다. MX5 비디오 카메로로 상을 잡았다(HCS). 약 3000개의 세포가 8x8 사각 매트릭스의 상을 형성하면서 64개의 나열된 상을 관찰하였다. 정확하게 나열된 상을 통하여 신경돌기는 한 상 분야에서 다음 상 분야로 나타난다. 폴리클로날 타우(tau) 항체에 표식된 신경돌기의 신장을 곡선구조의 무편향(unbiased) 탐지기를 사용하여 자동적으로 검출하였다(Steger 1998). 분석 소프트웨어는 자동적으로 전체 세포체 구역, 세포체 수 및 전체 신경돌기 길이를 계산한다.
상이한 세포 형태에 대한 에노빈의 효과를 조사하기위하여, 2개의 분석, DNA 합성 분석 및 주화성 분석를 수행하였다.
DNA 합성 분석
인간 피부 섬유아세포(397SK), 인간 제 정맥 내피 세포(HUVEC), 인간 민무늬근 세포(HSMC), 인간 연골 세포, 및 래트 조골세포를 포함하는 세포를 37℃에서 5% 이산화탄소 및 95%의 공기하에서 10% FBS(39-SK, HSMC, 래트 조골세포) 또는 정의 배지(연골 세포 및 HUVEC)에 유지시켰다. DNA 합성 분석를 위해, 세포를 10% FBS를 함유하는 DMEM중의 96-웰 조직 배양 플레이트에 5,000세포/웰 농도로 시딩(seeding)하고 24시간동안 배양하였다. 이어서, 배양 배지를 다양한 농도의 에노빈 및 0.1% BSA(for 39-SK, 조골세포, HSMC, 연골세포)를 함유하는 DMEM 또는 다양한 농도의 에노빈 및 0.5% FBS(for HUVEC)를 함유하는 DMEM으로 치환하고 세포를 24시간동안 인큐베이션시켰다. 이어서, 배양 배지를 5% FBS 및 0.1μCi [3H]-티미딘을 함유하는 100㎕ DMEM로 치환하였다.
2시간동안 파동 표지하고, 세포를 1시간동안 실온에서 메탄올/아세트산(3:1, vol/vol)로 고정시켰다. 고정된 세포를 80% 메탄올로 두번 세척하였다. 세포를 30분동안 0.05% 트립신(100㎕/웰)에 용해시키고 이어서, 추가로 30분동안 0.5% SDS(100㎕/웰)에 용해시켰다.
세포 여액(lysate)의 일부(ailiquote)를 2ml의 섬광 칵테일과 배합시키고 액체 섬광 계수기를 사용하여 세포 여액의 방사활성을 측정하였다(Wallac 1409).
주화성 분석
세포를 "DNA 합성 분석"에 기술된 바와 같이 유지시켰다. 12-웰 변형된 Boyden Chamber를 사용하여 에노빈의 주화성을 분석하였다(McQuillan, D.J., Handley, C.J., Campbell, M.A., Bolis, S., Molway, V.E., Herington, A.C., (1986), "Stimulation of Proteoglycan biosysthesis by serum and insulin-like growth factor-I in cultured bovine articular cartilage", Biochem. J. 240:423-430). 0.05% 트립신 및 0.5mM EDTA를 사용하여 세포를 트립신화시키고 DMEM중에서 재현탁시켰다. 다양한 농도의 에노빈을 함유하는 배지를 150㎕씩 Boyden 챔버(chamber)의 하단 웰에 가하였다. 0.1mg/ml 콜라겐 I 형으로 코팅된 폴리카보네이트 막(8㎛)을 하단 웰의 상부에 놓고 상단 웰과 결합시켰다. 세포(70,000 세포/웰)를 100㎕씩 상단 웰에 가하였다. 6시간동안 인큐베이션시킨후, 기구를 분리시켰다. 막 상부에 남아있는 세포를 제거하였다. 막을 15분동안 10% 포름알데히드에 고정시키고 길 세기(Gill's strengh) 헤모톡실린으로 염색하였다. 세포를 현미경하에서(250배 확대) 계수하고 각 웰의 5 영역으로부터 얻은 세포 계수 평균을 사용하였다. 각 실험을 적어도 4회 반복하였다. 결과물은 대조군(0.1% BSA를 함유하는 DMEM)의 배로 발현되었다.
도 8 내지 18에 설명되는 결과에서와 같이, 에노빈은 사용된 각 세포 형태의 증식에 또는 상기 기재된 HUVEC 세포의 이동(도 14)에 아무런 영향을 주지 않는다. SH-SY-5Y 신경모세포상에는 에노빈은 효과가 있었다. 이것은 신경성 세포에 대한 에노빈의 선택적 효과를 증명했다.
GDNF 및 NTN은 리간드-결합 구성요소, GFRα-1 또는 GFRα-2, 및 신호 서브유니트, cRET 단백질 타이로신 키나제로 구성된 신호 복합체를 통하여 신호를 전달한다고 알려져왔다. 에노빈은 cRET 또는 또다른 신호 파트너와 결합하여 GFRα결합 파트너(GFRα-1, GFRα-2, 최근 특징화된 고아 수용체 GFRα-3, 또는 아직 비특징 화된 GFRα패밀리의 요소등)로 구성된, 유사한 신호 복합체를 통하여 생물학적 효과를 보인다는 것을 예측할 수 있다. 또한 우리의 결합 데이타는 에노빈은 GFRα-3과 특이적으로 결합할 수 있다는 것을 나타낸다.
GDNF 및 cRET중 생식계통 돌연변이로 내분비선신생조직형성 및 히르쉬스프룽병 계열(Familial Hirschsprung disease) (HSCR)을 포함하는 일부 질환 이상을 유도할 수 있다(Romeo et al., 1994, Edery et al., 1994, Angrist et al., 1996). 두 질환은 장 비운동성과 관련되고 태아의 선천성 장장애의 가장 보편적인 원인인 히르쉬스프룽병과 관련된다. 흥미롭게도, GDNF 및 cRET 넉아웃 마우스들은 콩팥 발육 부전 및 소장 신경절세포결손과 현저하게 유사한 이상을 나타낸다(Sanchez et al., 1996; Moore et al., 1996; Pichel et al., 1996). 에노빈은 장 또는 신장의 유사한 질환과 관련될 수 있고, 편재되어 발현됨으로 신체에서 다른 말초 기관의 발생에 중요하다.
리간드와 그의 수용체의 상호작용은 보통 두 단백질의 특정 잔기의 특정 연결의 상호작용으로 이루어진다. 단백질 단편은 세포상에서 성장을 증진시키고 생존을 유지시키기위해 수용체를 활성화시키는 작용제로 작용할 수 있다. 그러므로 에노빈 단백질 서열에 기초한 에노빈의 일부 또는 합성 펩티드는 그의 수용체 GFRα3을 조절하기 위한 작용체 또는 길항제로서 유용하다. 펩티드 합성 또는 재조합 기술을 사용하여, GDNF, NTN,또는 PSP의 일부 또는 다른 신경친화성 성장 인자 또는 에노빈의 일부를 함유한 성장인자로 구성된 잡종 성장 인자는 새로운 특성을 갖는 신규한 합성 성장 인자를 생산하기위해 생산될 수 있다.
래트의 발바닥을 통해 주입시킨 후, 에노빈이 래트의 탁솔 유도된 감각 결함을 변화시킬 수 있는지를 시험하기위해 두가지 시도가 수행되었다. 첫번째 실험에서는, 에노빈의 단일처리로 탁솔-유도된 감각 결함을 바꿀 수 있는지 시험되었고 반면 두번째 시험에서는 에노빈이 탁솔-유도된 결함의 발생을 예방할 수 있는지 시험되었다.
탁솔-유도된 감각 기능장애의 반전
과정
300-340g 중량의 수컷 스프라그-돌리(Sprague-Dawley) 래트를 사용하였다. 동물을 각각 축사에 수용하고 사료와 물을 임의로 공급하였다. 실험을 시작하기 전에 동물들을 표준 관찰 우리에 방치하고 서식기간 15분후, 핀 프릭(pin prick) 반응을 측정하였다. 동물의 오른발의 발바닥 표면을 바늘로 자극하고 이 핀 프릭에 대한 반응성을 존재(득점=1) 또는 부재(득점=0)과 같이 기록하였다. 이 과정은 2회의 계속되는 자극사이에는 1분의 시간 간격을 두고 3회씩 반복한다; 이 핀 프릭 시험은 핀 프릭에 대한 반응성의 3회 측정으로 구성된다. 3회 핀 프릭에 대한 정상 반응을 갖는 래트만을 이 실험에 포함한다.
3일 연속하여 아침마다, 동물의 오른쪽 뒷다리의 발바닥에 50㎕ 탁솔(크레모포르(cremophor) 및 물이 첨가된 탈수 알콜에 용해된 3mg/ml 파클탁셀(paclitaxel))을 주입시켰다. 다음날 아침에는 핀 프릭 반응을 재측정하고 3회 자극에 대한 반응성을 보이지 않는 동물을 선별하였다. 이 동물을 오른쪽 뒷다리의 발바닥에 75㎕의 담체, 염수 또는 23 또는 130μg/ml 에노빈이 주입되는 서브 그룹(n=10/그룹)으로 무작위적으로 나누었다. 담체 및 염수 처리된 동물의 결과에서는 어떤 차이도 관찰되지 않았기 때문에, 두 그룹을 합하였다(대조 그룹). 마지막 처리 후, 1,4, 5 및 7일에 핀 프릭 시험을 아침(오전 8시 및 9시사이) 저녁(오후 3.30 및 4.30사이)에 수행하였다. 8일째, 마지막 핀 프릭 시험을 아침동안 수행하였다. 각 동물에 대해, 핀 프릭에 대한 반응 누적 점수를 측정하였다. 마지막 약물 처리후, 전체 9번의 핀 프릭 시험(매 시험은 3회 핀 프릭으로 구성됨)을 수행하였음으로 전체 실험 기간에 걸쳐 얻을 수 있는 최고 점수은 27이다.
결과
연속 3일에 걸친 발바닥으로의 반복된 탁솔 주입으로 대다수의 동물에서 핀 프릭 자극에 반응하지 않는 급성 염증성 반응이 초래된다. 발바닥으로 염수 또는 담체를 주입시켰을 때는 탁솔-유도된 결함에 아무 영향을 미치지 않았다. 첫번째 측정에서, 20개의 대조군중 단지 4개만이 3회의 핀 프릭에 적어도 1회의 반응을 나타냈고 첫번째 측정에서 대조군의 평균(±SEM) 핀 프릭 점수은 0.25(±0.12)였다; 이것은 모든 동물이 핀 프릭에 반응하기 때문에 평균 점수이 3.0(±0.0)인 실험 초기와는 대조적이다. 심지어 측정 8일후에도 대조군의 반응성은 여전히 손상되고 적어도 한번 반응을 하는 래트는 20마리중 11마리였으며 평균 핀 프릭 점수은 0.75(±0.18)였다. 이 대조군내에서, 모든 3회의 자극에 정상적인 반응을 보이는 래트는 존재하지않았다. 대조군의 누적 핀 프릭 점수는 도 19에 나타내었다. 동물은 8일동안 9회 시험되었으므로, 각 시험의 3회의 핀 프릭으로 얻을 수 있는 최대 기록은 27이다. 그래프에 나타나는 바와 같이, 염수 또는 담체를 발바닥에 주입시 켰을 경우, 시험기간동안 탁솔-유도된 결함을 반전시키지 못했다. 실험의 최종 단계에서 대조군의 평균 전체 누적 점수는 5.10(±0.87)이었다; 얻을 수 있는 최고 점수의 18.9%이다.
75㎕의 23μg/ml 에노빈을 발바닥에 단일 주입시킨 경우, 초기 실험후, 적어도 한번 반응을 보이는 래트는 10마리중 4이고 평균 핀 프릭 점수는 0.70(±0.33)이었다. 8일째 10마리의 동물 모두 핀 프릭에 적어도 한번 반응하였고 10마리중 5마리가 정상 반응을 나타냈다. 8일째 이 그룹의 평균 핀 프릭 점수는 2.20(±0.29)였다. 대조군과 비교하였을 때, 8일째 측정된 평균 누적 점수는 현저하게 증가되었고(Mann-Whitney U-test, two-tailed, p<0.01), 14.50(±1.96)의 평균 핀 프릭 점수를 얻었다(도 19) 이것은 최고 점수의 53.7%이다.
또한 발바닥에 130μg/ml 에노빈을 주입시킨 경우, 대조군과 다른 개선된 효과가 있었다. 첫번째 측정에서 130μg/ml 에노빈을 주입시킨 후,10마리 중 6마리가 적어도 한 번 반응하였고 평균 핀 프릭 점수는 1.10(±0.35)였다. 8일째, 10마리 동물 모두 적어도 한번 핀 프릭에 반응하였고 평균 점수는 2.60(±0.22)이었다. 10마리중 8마리가 3회의 핀 프릭에 대한 정상 반응을 보였다. 이 그룹에서 실험의 최종 단계에서 평균 누적 전체 핀 프릭 점수는 17.20(±1.94)였다. 이것은 전체 가능 점수의 63.7%이고 대조군과 비교하였을 때 현저하게 개선되었다(p<0.01).
탁솔-유도된 감각 장애의 예방
과정
300-340g 중량의 수컷 스프라그-돌리(Sprague-Dawley) 래트를 사용하였다. 동물을 각각 축사에 수용하고 사료와 물을 임의로 공급하였다. 실험을 시작하기 전에 동물들을 표준 관찰 우리에 방치하고 서식기간 15분후, 핀 프릭 반응을 측정하였다. 동물의 오른발의 발바닥 표면을 바늘로 자극하고 이 핀 프릭에 대한 반응성을 존재( 득점=1) 또는 부재(득점=0)과 같이 기록하였다. 이 과정은 2회의 계속되는 자극사이에는 1분의 시간 간격을 두고 3회씩 반복한다; 이 핀 프릭 시험은 핀 프릭에 대한 방응성의 3회 측정으로 구성된다. 3회 핀 프릭에 대한 정상 반응을 갖는 래트만을 이 실험에 포함한다(핀 프릭 점수=3). 이러한 대조군 측정 후, 이 동물을 오른쪽 뒷다리의 발바닥에 75㎕의 담체, 염수 또는 23 또는 130μg/ml 에노빈이 주입되는 서브 그룹(n=10/그룹)으로 무작위적으로 나눈다. 담체 및 염수 처리된 동물의 결과에서는 어떤 차이도 관찰되지 않았기 때문에, 두 그룹을 합하였다(대조 그룹). 3일 연속하여 매일, 동물의 오른쪽 뒷다리의 발바닥에 50㎕ 탁솔(크레모포르(cremophor) 및 물이 첨가된 탈수 알콜에 용해된 3mg/ml 파클타셀(paclitaxel)을 주입시켰다. 탁솔 마지막 처리 후, 1,4, 5 및 7일에 핀 프릭 시험을 아침(오전 8시 및 9시사이) 저녁(오후 3.30 및 4.30사이)으로 2번 수행하였다. 8일째, 마지막 핀 프릭 시험을 아침동안 수행하였다. 각 동물에 대해, 핀 프릭에 대한 반응 누적 점수를 측정하였다. 탁솔 처리후, 전체 9번의 핀 프릭 시험(매 시험은 3회 핀 프릭으로 구성됨)을 수행하였음으로 전체 실험 기간에 걸쳐 얻을 수 있는 최고 점수은 27이다.
결과
탁솔을 처리하기전, 발바닥으로 염수 또는 담체를 주입한 경우 핀 프릭 시험 에서 탁솔 유도된 결함을 예방하지 못했다. 탁솔 처리후 첫번째 시험에서, 20마리 래트중 8마리가 적어도 한번 핀 프릭에 반응하였고 0.60(±0.18)의 평균 핀 프릭 점수를 보였다. 8일째, 탁솔에 의하여 유도된 결함은 여전히 존재하였고 20마리중 단지 8마리만 반응하였고 평균점수 0.8(±0.25)를 보였다.두 동물내 표준화된 핀 프릭 반응이 존재하였다. 시간 경과후, 누적 핀 프릭 점수는 감소하였고, 평균 점수는 6.55(±1.08)로 이는 최고 점수의 24.3%이다(도 20).
23μg/ml 에노빈으로 전처리된 경우 핀 프릭상에서 탁솔-유도된 결함은 감소하였다. 1일째, 10마리중 8마리가 적어도 한번 반응하였고 평균 핀 프릭점수는 1.70(±0.40)이었다. 8일째, 모든 동물은 핀 프릭 자극에 대해 적어도 한번 반응하였고 2.50(±0.27)의 평균 점수를 보였다. 7마리가 모든 핀 프릭 노출에 대해 정상 반응을 보였다. 시간경과에 따른 누적 반응과 관련하여(도 20), 전체 점수는 18.40(±1.73)의 대조군의 수준에 비하여 현저하게 증가되었다(p<0.01); 이것은 최고 값의68.1%이다.
130㎍/ml 에노빈으로 예비처리한 후, 비교되는 결과를 얻었다. 1.70(+0.31)의 평균 핀 프릭 점수를 갖는 첫번째 실험을 하는 동안, 10마리중 6마리가 반응하였다. 8일째, 모든 동물은 핀 프릭 자극에 대해 적어도 한번 반응하였고 2.40(+0.22)의 평균 점수를 보였고 반정도의 동물에서 모든 3반응은 정상이었다. 누적 점수와 관련하여, 8일째 수득된 평균 점수는 17.70(±1.92)로 이는 전체 점수의 65.5%이다.
일련의 실험은 핀 플릭 시험을 통해 측정된 바와 같이 에노빈의 1회 발바닥 주사가 탁솔-유도된 감각 결함을 감소시킬 수 있다는 것을 암시한다. 약을 탁솔처리 전후로 모두에서 적용시켰을때 활성을 나타낸다.
에노빈은 주로 말초 및 중추 신경형성 성분을 갖는 동통증후군, 류마티스/염증성 질환 및 유도능 장애에 대한 후보이고 경피, 국소, 국부, 중추(예를 들어, 경막외, 초내 등) 및 전신 적용후 감각 과정에서 조절자 역할을 한다.
추가로 상기 언급된 분야에서 생리병리학적 변화를 조사하기 위한 진단용 도구로서 에노빈을 사용할 수 있다.
정상 조직과 질환성 조직에서 발현되는 에노빈 mRNA의 비교
파마진 라보라토리 엘티디(Pharmagene Laboratories Ltd)(Royston, United Kingdom)에서 개발되고 수행된 특허 기술을 이용한 ABI 프리즘 7700 서열 검출 시스템(TaqMan; Perkin Elmer)을 사용하여 에노빈 mRNA의 발현을 정량적으로 분석하였다. 이 시스템은 PCR동안 형광 신호에 특정적인 서열을 생산하기위해 형광성 프로브를 사용한다. 프로브는 형광성 리포터 및 부착된 소광자(quencher) 도료를 갖는 올리고뉴클레오타이드이고 순 및 역 PCR 프라이머 사이에 배치된다. 원래,리포터 형광성의 강도는 소광자에 의해 억제된다.
프로브가 복제 복합체의 일부를 형성하기 때문에, 형광 리포터는 타크 폴리머레이즈의 5' 내지 3' 절단 활성에 의해 소광자로부터 절단된다. 반응내 형광성 리포터의 증가는 PCR 생성물의 누적을 직접적으로 나타낸다. mRNA 표적 서열의 출발 복사 수(Cn)는 형광 신호가 역치 기준선 위를 통과하는 점인, PCR 생성물이 처음 검출되는 분획 PCR 반복 수(Ct)결정하여 설정하였댜. 각 샘플내 표적 mRNA 양의 정량화는 실험적 Ct 값과 표준 곡선의 비교로 설정하였다.
RNA 제조 및 품질 조절
전체 RNA를 공급자의 프로토콜에 따라 트리-졸 시약(Life Technologies, Gaithersburg, MD, USA)를 사용하여 전체 및 부분 절개 조직으로부터 분리시켰다. 모든 RNA 샘플을 위한 품질 조절 과정은 무결정(본래의 18S 및 28S 리보솜RNA)의 평가 및 다량(액틴) 및 소량(트랜스페린 수용체)의 트랜스크립트의 존재의 결정을 포함한다.
프라이머/프로브 설계
에노빈으로부터 유래된 특정 서열을 증폭시키기위해 프라이머와 TaqMan 프로브의 한 쌍을 설계하였다.
프라이머 1 : 5' ACGGTTCTCCAGGTGCTGT 3'
프라이머 3 : 5' TGCTGCCGACCCACG 3'
프로브 5 : 5' CTACGAAGCGGTCTCCTTCATGGACG 3'
추가로, 인트론을 메우고 인간 GAPDH 유전자의 일부를 증폭시키기위해 프라이머와 TaqMan 프로브의 한쌍을 설계하였다.
프라이머 2 :
5' CAGAGTTAAAAGCAGCCCTGGT 3'
프라이머 4:
5' GAAGGTGAAGGTCGGAGTCAAC 3'
프로브 6:
5' TTTGGTCCGTATTGGGCGCCT 3'
프로브 5는 플루오르 FMA으로, 프로브 6는 플루오르 IC로 표지시켰다.
전체 RNA의 DNase처리
시험될 각 조직을 위해 2.2㎍의 전체 RNA를 15분동안 실온에서 20㎕의 1xDAase 완충액(Gibco BRL)중에 2단위의 RNase가 없는 DNase(Gibco BRL)로 분해시켰다. 2㎕의 25mM EDTA 용액을 첨가하여 반응을 정지시켰다. 이어서 샘플은 65℃에서 10분동안 배양시켜 효소를 불활성화시켰다.
첫 번째 스트랜드 cDNA 합성
시험될 각 조직을 위해 100ng의 전체 RNA를 첫 번째 스트랜드 cDNA 합성에 대한 주형으로 사용하였다. 50nM 프라이머 1 및 2, 1xPCR 완충액 II(Perkin Elmer) 및 5mM MgCl2의 존재하에서 부피 4ml의 RNA를 5분동안 72℃까지 가열하고 55℃까지 천천히 냉각시켰다. 모든 다른 시약을 추가로 첨가한 후, 6ml의 반응물을 48℃에서 30분동안 인큐베이션히키고 90℃에서 5분동안 효소를 불활성시키는 단계를 거쳤다. 최종 반응 조건은 하기와 같았다: 1xPCR 완충액 II, 5mM MgCl2, 1mM dATP, dTTP, dGTP, dCTP, 12.5 단위 MuLV 역전사효소(Gibco BRL).
첫 번째 스트랜드 cDNA 생성물의 PCR증폭
각 샘플을 위해 100ng 전체 RNA로부터 유래된 cDNA를 단일 반응중 PCR 증폭에 적용시켜 표적 및 GAPDH 트랜스크립트를 동정하였다. 표적을 위한 프라이머/프 로브의 최종 농도는 300nM 프라이머 1, 300nM 프라이머 3 및 200mM 프로브 5이고 GAPDH를 위한 프라이머/프로브의 최종 농도는 20nM 프라이머2, 20nM 프라이머4 및 100nM 프로브 6이었다. 반응물중 다른 시약의 최종 농도는 4.5% 글리세롤, 1xTaqMan 완충액 A(Perkin Elmer), 6.25mM Mgcl2, 430M dATP, dUTP, dGTP, dCTP, 2.5 단위 앰플리타크 골드(AmpliTaq Gold)였다. PCR 증폭은 ABI 7700 서열 검출 시스템에서 수행하고, 초기에 94℃에서 12분동안 효소를 활성화 시키고 94℃에서 15초동안, 60℃에서 1분(최소 램프(ramp) 시간)동안 반복시켰다
시험된 질병 및 조직
질병 환자 및 정상 대조군으로부터 유래된 조직중에서 에노빈 mRNA 발현을 비교하였다(도 25 및 26). 하기 표는 조사된 질환 및 상응하는 조직을 나타낸다. 각 조건을 위해, 3개의 질병 샘플 및 3개의 대조 샘플을 분석하였다.
질병 조직 1 조직 2 조직 3
알츠하이머 질병 측두엽피질 해마 후두엽 피질
다발성 경화증 척수 실주위의 백질 중뇌
파킨슨 질병 흑절 피각 중뇌
암 결장 선암 유방관 폐 인상세포 종양


통계학적 분석
3 조직의 각 그룹에 대한 평균 및 표준 편차를 Ct 값(보통 주어진다)을 기초로 하여 계산하였고 이어서 식 Cn=10((Ct-40.007)/-3.623)에 따라, Cn 값으로 전환시켰다. 또한 Ct값에 대한 분산 분석(ANOVA)을 수행하고 정상 조직 대 질병 조직에서의 평균 에노빈 mRNA 발현을 비교하였다.
도 25 및 26은 대조 조직에 대한 질병 조직 중에서 평균 에노빈 mRNA 복사 수(±SD; n=3)를 나타낸다. 통계학적 분석을 통해, 다발성경화증을 앓는 환자의 실 주위의 백질에서 에노빈 발현 수준이 유의하게 증가하였음을 나타냈다(p=0.013). 내부 GAPDH 대조군은 별 다른 차이를 나타내지 않았다(p=0.79). 실주위의 백질에서의 에노빈 발현 수준은 정상 조직에서보다 매우 낮지만(평균적으로 100ng의 전체 RNA당 270 복사 대 GAPDH의 200000복사), 다발성 경화증에서 수준은 3배정도 높았다(825).
하나의 다른 질병 조직에서만 정상 대조군에 대해 현저한 차이를 나타냈다: 유방관 선암에서 에노빈mRNA 발현 수준은 6배( 6000 대 1000; p=0.007) 높지만 GAPDH 대조군 값은 또한 유의하게 증가하고(165000 대 44000;p=0.03), 이는 mRNA 수준의 일반적 증가를 나타낸다.
결론적으로, 다발성경화증을 앓는 환자의 실주위의 백질에서 에노빈 mRNA의 수준은 조절되지 않는다는 것을 발견하였다.
GFRα3/cRET 수용체 복합체 상에 에노빈 유사물을 조사하기 위해 ELISA에 기초한 인산-특이 항체 세포의 용도
방법은 또한 GFRα1, GFRα2, GFRα4, TrkA, TrkB 및 TrkC와 같은 다른 신경친화성 수용체의 작용제 또는 길항제를 동정하기 위해 사용될 수 있다.
분석
이 분석을 사용하여 신경친화성 경로에서 활성화된 중요한 신호 키나제의 활성을 측정하거나 cRET 수용체 키나제의 활성을 측정하여 신경친화성 성장 인자의 작용제 또는 길항제 화합물을 동정할 수 있다. 인산-특이 항체를 사용하여 인산화된 키나제 또는 수용체 키나제의 양을 검출하여 활성을 측정한다. 일시적으로 또는 계속적으로 TrkA, TrkB, TrkC, GFRα1/cRET, GFRα2/cRET, GFRα3/cRET, 또는 GFRα4/cRET을 발현시키는 NIH 3T3 세포를 사용할 것이다.
시판되는 인산-특이 항체를 사용하여 p42/p44 MAP 키나제, PKB 키나제, c-jun, CREB, JNK/SAPK 키나제 및 다른 키나제의 활성을 검출한다. 또한, 인산-특이 cRET 항체를 사용하여 cRET 활성을 측정할 수 있다.
사용된 프로토콜은 하기와 같았다:
-NIH 3T3 세포를 10% 송아지 혈청중 96-웰에 놓고, 세포는 자극시키기 전에 80% 융합(confluent)하여야 한다.
-다음날, 배지를 혈청이 없는 배지로 교환하고 18-24시간동안 세포를 굶긴다.
-굶긴 후, 양성 대조군으로서 화합물과 신경친화성 인자(신경친화성 인자 10ng/ml)를 이용하여 세포를 자극시킨다.
-4℃에서 20분동안 PBS중 4% 포름알데히드로 세포를 고정시킨다.
-5분동안 200㎕ PBS/0.1% 트리톤(Triton)을 이용하여 세포를 3회 세척한다.
-20분동안 PBS/0.1% 트리톤중 100㎕의 0.6% H2O2를 이용하여 세포를 냉각시킨 다.
-5분동안 200㎕의 PBS/0.1% 트리톤으로 세포를 세번 세척한다.
-60분동안 PBS/0.1% 트리톤중 100㎕의 10% 태아 송아지 혈청을 이용하여 세포를 블라킹(blocking)한다.
-밤새도록 4℃에서 50㎕의 5% BSA/PBS/0.1% 트리톤중 인산 특이적 항체를 이용하여 세포를 배양시킨다. 항체 희석은 실험적으로 결정되어지며 범위는 1:100-1:250으로 제안된다.
-5분동안 200㎕ PBS/0.1% 트리톤(Triton)을 이용하여 세포를 3회 세척한다.
-1시간동안 실온에서, 50㎕의 5% BSA/PBS/0.1% 트리톤중 희석액 1:100을 연결된 이차 항체(HRP)와 함께 인큐베이션시킨다.
-5분동안 200㎕ PBS/0.1% 트리톤(Triton)을 이용하여 세포를 3회 세척한다.
-25ml 완충액(0.5ℓ H2O중 3.65g 시트르산 -H2O 및 5.9g Na2HPO4-2H 2O, pH 5.6)에 1 정제 OPD(Sigma)를 용해시키고 12.5㎕ H2O2를 첨가한다. 각 웰에 50㎕를 가하고 알루미늄 호일로 덮힌 진탕기상에서 15분동안 인큐베이션시킨다(200rpm).
-25㎕ H2SO4를 이용하여 반응을 종결시킨다.
-ELISA 판독기상에서 OD490-650을 측정한다.
중뇌 도파민성 신경세포 배양
신경세포 배양
신경세포 배양액을 효소적이고 기계적으로 분산시켜 태아 래트 중뇌 전방으 로부터 제조하였다. 조직을 수득하고, 0.6% 포도당(PBSG)를 함유하는 얼음-냉각 Ca2+- 및 Mg2+가 없는 인산 완충화된 염수로 세척시킨 후 37℃에서 30분동안 0.1%트립신을 함유하는 PBSG와 함께 인큐베이션시켰다. 세포 현탁액을 2.5x 105 세포/㎤의 농도로 96 웰 NUNC 조직 배양 플레이트에 놓았다. 앞서, 배양 플레이트를 10% 태아 송아지 혈청을 함유하는 폴리-L-오르니틴 및 CDM으로 코팅시킨다. 배양액을 Dulbecco's Modified Eagles 배지 및 포도당(0.6%), 글루타민(2mM), 중탄산나트륨(3mM), HEPES(5mM), 인슐린(25μg/ml), 인간 트랜스페린(100μg/ml), 푸트레신(60μg/ml), 아셀렌산 나트륨(30nM), 스트렙토마이신(100μg/ml) 및 페니실린(100IU/ml)으로 보충된 F12영양의 1:1 혼합물로 구성된, 화학적으로 정의된 배지(CDM)에서 유지시킨다.
신경친화성 인자를 이용한 처리
뉴로트로핀을 저장액으로서 0.5% 소 혈청 알부민에 용해시켰다. 초기 플레이팅 후 3시간 및 배양 5일후 뉴로트로핀을 배양액에 가하였다. 동일한 양의 0.5% 소 혈청 알부민을 대조군 웰에 가하였다.
고-친화성 도파민 흡수
10일후 도파민 흡수를 측정하였다. 흡수를 위해, 세포를 포도당(5mM), 아스코브산(100mM) 및 파르길(100mM)으로 보충된 예비 가온된 PBS로 두번 세척하고 동일한 용액을 이용하여 10분동안 예비 인큐베이션시킨다. 예비-인큐베이션 용액을 50nM [3H]DA를 함유하는 동일한 용액으로 교환시키고 15분동안 37℃에서 인큐베이션 을 계속한다. 얼음 -냉각된 PBS로 3회 신속히 세척시켜 흡수를 종결시켰다. 30분동안 실온에서 산성화된 에탄올과 함께 배양시켜 축적된 [3H] 도파민을 방출시킨다. 4ml의 섬광 액체를 가한 후, Packard 섬광 계수기를 사용하여 방사활성을 결정하였다. 20μM 코카인을 가하여 비-특이적 흡수를 결정하였다.
표 4. [3H] 도파민 흡수에 대한 에노빈의 효과.
Figure 112001000767140-pct00004

에노빈이 존재 또는 부재하에서 세포를 10일동안 배양시켰다. 비처리된 대조군을 100%로 하였다. 결과를 1-5 독립적 실험으로 수득한다.
약어 리스트
BLAST : 기초 위치 서열 조사 도구(basic local alignment search tool)
bp : 염기 쌍(base pair)
cDNA : 상보적 DNA(complementary DNA)
CNS : 중추 신경계(central nervous system)
EST : 발현된 서열 태그(expressed sequence tag)
EVN : 에노빈(enovin)
GDNF : 신경교세포주 유도성 신경친화성 인자.(glial cell-line derived neurotrophic factor)
GFRα: GDNF 패밀리 수용체 α(GDNF family receptor α)
GPI : 글리코실 포스패티딜 이노시톨(glycosyl phoshatidyl inositol)
MTC : 다양한 조직 cDNA(multiple tissue cDNA)
NTN : 뉴트린(neurturin)
PCR : 중합효소 연쇄 반응 (polymerase chain reaction)
PNS : 말초 신경계 (peripheral nervous system)
PSP : 퍼스핀 (persephin)
RT-PCR : 역전사 PCR (reverse transcription PCR)
TGF-β : 형질전환성 성장 인자 β(transforming growth factor β)
FISH : 즉석 형광성 혼성화(fluorescent in situ hybridisation)
MTN : 다양한 조직 노던(multiple tissue northern)
NGF : 신경 성장 인자(nerve growth factor)
SPR : 표면 플라스몬 공명(surface plasmon resonance)
참조 문헌
Figure 112001000767140-pct00005
Figure 112001000767140-pct00006
Figure 112001000767140-pct00007
Figure 112001000767140-pct00008
Figure 112001000767140-pct00009
Figure 112001000767140-pct00010
Figure 112001000767140-pct00011
Figure 112001000767140-pct00012
Figure 112001000767140-pct00013
Figure 112001000767140-pct00014

Claims (52)

  1. SEQ ID NO:2에 도시된 아미노산 서열을 갖고 에노빈(enovin)으로 기술되는 인간 신경친화성 성장 인자를 코딩하는 단리된 핵산 분자.
  2. 제 1항에 있어서, DNA 분자인 핵산 분자.
  3. 제 1항에 있어서, cDNA 분자인 핵산 분자.
  4. 제 1항에 있어서, SEQ ID NO:1에 도시된 서열의 위치 81 내지 419의 핵산 서열을 갖는 핵산 분자.
  5. 삭제
  6. 제 1항에 있어서, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:3에 도시된 핵산 서열을 갖는 핵산 분자.
  7. 삭제
  8. 제1항 내지 제4항 및 제6항 중 어느 한 항에서 정의된 핵산 분자에 의해 코딩된 단리된 인간 신경친화성 성장 인자.
  9. 제 8항에 있어서, SEQ ID NO:2에 도시된 아미노산 서열의 위치 27 내지 139의 아미노산 서열을 포함하는 성장 인자.
  10. 제 8항에 있어서, SEQ ID NO:2에 도시된 아미노산 서열을 포함하는 성장 인자.
  11. 제 8항에 있어서, SEQ ID NO:7 또는 SEQ ID NO:8에 도시된 아미노산 서열을 포함하는 성장 인자.
  12. 제2항 내지 제4항 및 제6항 중 어느 한 항에 따른 DNA 분자를 포함하는 발현 벡터.
  13. 삭제
  14. 제 12항에 있어서, 리포터 분자를 코딩하는 추가의 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터.
  15. 제 12항에 따른 벡터에 의해 형질전환되거나 트랜스펙트된 숙주 세포.
  16. 제 15항에 있어서, 세포가 진핵 또는 박테리아 세포인 숙주 세포.
  17. 제 8항에 따른 인간 신경친화성 인자 에노빈을 발현시킬 수 있는 트랜스진을 포함하는 트랜스제닉 세포 또는 조직.
  18. 제 17항에 있어서, 상기 트랜스진이 제 12항 또는 제 14항에 따른 벡터를 포함하는 트랜스제닉 세포 또는 조직.
  19. 제 15항 내지 제 18항 중 어느 한 항에 따른 세포에 의해 발현되는 신경친화성 성장 인자.
  20. 제 17항 또는 제 18항에 따른 트랜스제닉 세포 또는 조직에 의해 발현되는 신경친화성 성장 인자.
  21. 제1항 내지 제4항 및 제6항 중 어느 한 항에 따른 핵산 분자를 포함하는 신경 질환 치료 또는 예방용 약제.
  22. 제 21항에 있어서, 상기 신경 질환이 파킨슨 질병, 알츠하이머 질병, 헌팅톤병과 같은 연장된 폴리글루타민 서열과 관련된 뉴우런 질환, 말초 신경병, 급성 뇌 상해, 신경계 암, 다발성경화증, 근위축성측삭경화증, 말초신경외상, 신경독소에 대한 손상 및 노출, 복합내분비선신생조직형성, 가족히르쉬스프룽병 계열, 프리온 관련 질환, 크로이츠펠트 야콥병, 발작, 실질적으로 말초 또는 중추 신경형성 성분을 포함하는 동통증후군, 류마티스/염증성 질환 및 유도능 장애로 구성된 그룹으로부터 선택되는 약제.
  23. 제 8항에 따른 신경친화성 성장 인자를 포함하는 신경 질환 치료 또는 예방용 약제.
  24. 제 23항에 있어서, 상기 신경 질환이 파킨슨 질병, 알츠하이머 질병, 헌팅톤병과 같은 연장된 폴리글루타민 서열과 관련된 뉴우런 질환, 말초 신경병, 급성 뇌 상해, 신경계암, 다발성경화증, 근위축성측삭경화증, 말초신경외상, 신경독소에 대한 손상 및 노출, 복합내분비선신생조직형성, 가족히르쉬스프룽병 계열, 프리온 관련 질환, 크로이츠펠트 야콥병, 발작, 실질적으로 말초 또는 중추 신경형성 성분을 포함하는 동통증후군, 류마티스/염증성 질환 및 유도능 장애로 구성된 그룹으로부터 선택되는 약제.
  25. 약제학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제와 함께 제1항 내지 제4항 및 제6항 중 어느 한 항에 따른 핵산 분자를 포함하는 신경 질환 치료 또는 예방용 약제학적 조성물.
  26. 약제학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제와 함께 제 8항에 따른 성장 인자를 포함하는 신경 질환 치료 또는 예방용 약제학적 조성물.
  27. 삭제
  28. 삭제
  29. 제 8항에 따른 성장 인자 또는 그의 에피토프에 결합할 수 있는 항체.
  30. 제 29항에 따른 항체를 샘플과 반응시키고 상기 항체와 상기 성장 인자의 결합을 검출하는 것을 포함하는, 샘플중 성장 인자의 존재를 검출하는 방법.
  31. 제 30항에 있어서, 상기 항체가 리포터 분자에 컨쥬게이트된 방법.
  32. 제 29항에 따른 항체 및 상기 항체와 샘플을 반응시키기 위한 수단을 포함하는, 샘플중 신경친화성 성장 인자의 존재를 검출하는 키트 또는 장치.
  33. 삭제
  34. 삭제
  35. 삭제
  36. 삭제
  37. 삭제
  38. 삭제
  39. 삭제
  40. 제1항 내지 제4항 및 제6항 중 어느 한 항에 따른 핵산 분자 또는 제8항에 따른 신경친화성 성장 인자를 포함하는, 인간 신경친화성 성장 인자의 발현 또는 활성에 의해 매개되는 질환의 치료 또는 예방용 약제.
  41. 제1항 내지 제4항 및 제6항 중 어느 한 항에 따른 핵산 분자 또는 제8항에 따른 성장 인자를 포함하는, 인간 신경친화성 성장 인자의 불활성화에 의해 매개되는 질환의 치료 또는 예방용 약제.
  42. 제1항 내지 제4항 및 제6항 중 어느 한 항에 따른 핵산 분자 또는 제8항에 따른 성장 인자를 포함하는, 방해받거나 또는 손상된 위장관 경로에 의해 매개된 위장관 질환 또는 이상 치료용 약제.
  43. 제 42항에 있어서, 상기 질환 또는 이상이 위식도 역류, 소화불량, 위마비, 수술 후 장폐색증 및 가장폐색증, 소장 또는 대장의 감소된 연동운동 및/또는 지연된 위 공복, 변비, 장무긴장증, 수술 후 장무긴장증, 과민성 장 증후군(IBS), 약물 유도성 운송 지연, 구토 및 세포독성 약물 및 방사능 유도성 구토중 어느 하나를 포함하는 약제.
  44. 제1항 내지 제4항 및 제6항 중 어느 한 항에 따른 핵산 분자 또는 제8항에 따른 성장 인자를 포함하는, 증가된 소장 연동운동에 의해 매개되는 위장관 질환 또는 이상 치료용 약제.
  45. 제 44항에 있어서, 상기 질환이 분비성 설사, 박테리아 유도성 설사, 콜레라성 설사, 여행자 설사, 및 신경성 설사를 포함하는 설사, 크론병, 경성결장, 과민성 장 증후군(IBS), 설사성 과민성 장 증후군, 장 과민증 및 위장 과민증과 관련된 동통의 감소중 어느 하나를 포함하는 약제.
  46. 삭제
  47. 삭제
  48. 삭제
  49. 약제학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제와 함께 제29항에 따른 항체를 포함하는 약제학적 조성물.
  50. 삭제
  51. LMBP 수탁번호 제 LMBP 3931호로 기탁된 플라스미드 EVNmat/pRSETB.
  52. 삭제
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