HU226073B1

HU226073B1 - Neurotrophic growth factor

Info

Publication number: HU226073B1
Application number: HU0102821A
Authority: HU
Inventors: Hugo Alfonso Geerts; Stefan Leo Jozef Masure; Theo Frans Meert; Miroslav Cik; Donck Luc August Laurentiu Ver
Original assignee: Janssen Pharmaceutica Nv
Priority date: 1998-07-14
Filing date: 1999-07-14
Publication date: 2008-04-28
Also published as: KR100773776B1; US7544788B2; DK1640381T3; CZ303868B6; PL348431A1; CY1105949T1; EP1640381A2; EP1640381A3; ID27024A; ES2479067T3; CZ200128A3; JP4469500B2; PT1097167E; JP4624476B2; JP2010158241A; WO2000004050A2; CA2333910A1; KR20060061408A; SK287361B6; HRP20010036B1

Description

HU 226 073 Β1

A találmány tárgyát neurotróf faktor, valamint a neurotróf faktorok GDNF-családjába tartozó új tagjának, a leírás szerinti „enovin (EVN) elnevezésű faktornak a klónozása és expresszáltatása képezi.

A neurotróf faktorok a neuronális differenciálódásban, fejlődésben és fenntartásban vesznek részt. Ezek a proteinek megakadályozzák a degenerációt, és elősegítik neuronális sejtek különböző típusainak a túlélését, és ennek megfelelően neurodegeneratív betegségekben potenciális terápiás ágensek lehetnek. A gliasejtvonal-eredetű neurotróf faktor (GDNF) volt az első tagja a neurotrofinektől strukturálisan eltérő neurotróf faktorok növekvő alcsaládjának. A GDNF a növekedési faktorok β-transzformáló növekedési faktor (TGF-β) szupercsalád tagja, amelyre jellemző az aminosavszekvencia hét, erősen konzervált ciszteincsoportja által alkotott specifikus mintázat [Kingsley, (1994)]. A GDNF-proteint eredetileg azon tulajdonságára alapozott vizsgálattal tisztították, hogy képes embrionális, ventrális középagyi, dopaminerg neuronok túlélését és működését fenntartani in vitro [Lin és munkatársai, (1993)]. A központi (CNS) vagy a perifériás (PNS) idegrendszerben más neuronális sejttípusok is válaszolnak a GDNF túlélést előidéző hatására [Henderson és munkatársai, (1994); Buj-Bello és munkatársai, (1995); Mount és munkatársai, (1995); Oppenheim és munkatársai, (1995)]. A GDNF-proteint a sejtek inaktív előalak (prekurzor) formájában állítják elő, amely specifikusan hasad egy RXXR furint felismerő helyen, hogy aktív (érett) GDNF képződjön [Lin és munkatársai, (1993)]. GDNF exogén beadása markáns neuroprotektív hatást mutat Parkinson-kór állatmodelljeiben, amely kór egy gyakori neurodegeneratív rendellenesség, amelyet az agy substantia nigra régiója dopaminerg sejtjeinek akár 70%-ának elvesztése jellemez [Beck és munkatársai, (1995); Tornác és munkatársai, (1995); Gash és munkatársai, (1996); Choi-Lundberg és munkatársai, (1997); Bilang-Bleuel és munkatársai (1997)]·

A közelmúltban a GDNF-családba tartozó további neurotróf faktorokat fedeztek fel. A neurturin (NTN)proteint kínaihörcsög-ováriumsejtek („Chinese Hamster Ovary”, CHO) kondicionált tápközegéből tisztították, azon tulajdonsága alapján, hogy képes szimpatikus neuronok túlélését tenyészetben fenntartani [Kotzbauer és munkatársai, (1996)]. Az érett NTN-protein 57%-os hasonlóságot mutat az érett GDNF-proteinnel. A persephin (PSP)-proteint klónozással fedezték fel, degenerált láncindító oligonukleotid PCR-t, és templátként genomiális DNS-t alkalmazva. Az érett PSP, akárcsak az érett GDNF, segíti ventrális középagyi dopaminerg neuronok és motoros neuronok túlélését tenyészetben [Milbrandt és munkatársai, (1998)]. Az érett PSP-proteinnek az érett GDNF-, valamint NTN-proteinhez való hasonlósága =50%-os. Az artemin (ARTN)proteint DNS-adatbázis-kereséssel fedezték fel, és a szenzorikus, valamint szimpatikus neuronok egyik túlélési faktora tenyészetben [Baloh és munkatársai, 1988, Neuron (12); 1291-1302]. A 00/01815 számú nemzetközi közzétételi irat ismertet egy, a GDNF-családba tartozó további neurotróf faktort Neublastin néven.

A GDNF-, NTN-, PSP- és ARTN-proteineknek heterodimer receptorkomplexre van szükségük ahhoz, hogy a „lefelé” irányú intracelluláris szignáltranszdukciójuk végbemenjen. A GDNF-protein a GDNF-családi alfa-1 [GFRa-1; GFRa; Nómenklatúra Bizottság, (1997)] receptoralegységhez kötődik, amely egy lehorgonyzóit, glikozil-foszfatidil-inozitol (glikozil-Ptdlns) membránprotein [Jing és munkatársai, (1996); Treanor és munkatársai, (1996); Sanicola és munkatársai, (1997)]. A GDNF/GFRa-1 komplex ezt követően a cRET-protoonkogénhez, egy membránhoz kötött tirozinkinázhoz kötődik, amelyet aktivál [Durbec és munkatársai, (1996); Trupp és munkatársai, (1996)], ami a cRET-molekulában található tirozincsoportok foszforilációját, ezt követően a „lefelé” („befelé”) irányú szignáltranszdukciós anyagcsereutak aktiválását eredményezi [Worby és munkatársai, (1996)]. A ligandumkötő receptorok GFRa-családjának számos más tagját jellemezték [Baloh és munkatársai, (1997); Sanicola és munkatársai (1997); Klein és munkatársai, (1997); BujBello és munkatársai, (1997); Suvanto és munkatársai, (1997)]. Több különböző kutatócsoport [Jing és munkatársai, (1997); Masure és munkatársai, (1998); Woby és munkatársai, (1998); Naveilham és munkatársai, (1998); Baloh és munkatársai (1988a)] azonosította a GFRa-2 és GFRa-3 receptorokat. A GFRa-1 és GFRa-2 széles körben expresszálódik szinte minden szövetben, és az expresszió az egyedfejlődés szerint regulálódhat [Sanicola és munkatársai, (1997); Widenfalk és munkatársai, (1997)].

A GFRa-3 nem expresszálódik fejlődő, vagy kifejlett központi idegrendszerben, de erősen expresszálódik a perifériás idegrendszer számos fejlődő és kifejlett, szenzorikus és szimpatikus ganglionjában [Widenfalk és munkatársai, (1998); Naveilhan és munkatársai, (1998); Baloh és munkatársai, (1998a)]. A család negyedik tagját, a GFRa-4 receptort csirke-cDNS-ből klónozták (Thompson és munkatársai, (1998)]. A GRF-1 a GDNF első számú receptora, míg a GFRa-2 elsősorban NTN-proteint köt [Jing és munkatársai, (1996); Treanor és munkatársai, (1996); Klein és munkatársai, (1997)]. A csirkeeredetű GFRa-4 a cRET-protoonkogénnel kombinálva képez funkcionális receptorkomplexet a PSP számára [Enokido és munkatársai, (1998)]. A GFRa-3-, és cRET-molekulát egyszerre expresszáló sejtekről kimutatták, hogy nem válaszolnak a GDNF-, NTN- vagy PSP-molekulák egyikére sem [Worby és munkatársai, (1998); Baloh és munkatársai, (1998a)]. A közelmúltban kimutatták, hogy az ART a cRET-protoonkogénen keresztül küld szignált, a GFRa-3 receptort alkalmazva előnyös ligandkötő receptorként [Baloh és munkatársai, (1998b)]. A GRFareceptorok és a neurotróf faktorok közötti „áthallás” („cross-talk”) lehetséges in vitro, mivel a GDNF kötődni képes a GFRa-2 és GFRa-3 receptorokhoz cRET jelenlétében [Sanicola és munkatársai, (1997); Trupp és munkatársai, (1998)], valamint az NTN képes alacsony affinitással kötődni a GFRa-1 receptorhoz [Klein és

HU 226 073 Β1 munkatársai, (1997)]. összefoglalva, a GDNF, az NTN, a PSP és az ART egy neurotróf szignálozórendszer részét képezik, amelyben különböző ligandkötő alegységek (GFRa-1-4) kölcsönhatásba lépnek ugyanazon tirozinkináz alegységgel (cRET). Ezen in vitro felfedezések fiziológiai relevanciáját a közelmúltban génkiütéses vizsgálatokkal mutatták ki [összefoglalta Rosenthal, (1999)], amelyek világosan mutatják, hogy a GDNF kölcsönhatásba lép a GFRa-1 receptorral, míg a GFRa-2 liganduma elsősorban az NTN.

Azonosítottuk, klónoztuk, expresszáltattuk, kromoszomálisan lokalizáltuk és jellemeztük az Enovin (EVN) proteint, a GDNF-család negyedik tagját. Az érett EVNproteinről szerzett ismereteink funkcionális és nem funkcionális, mRNS-érési („splice) variánsok felfedezésével bővültek. Ezen túlmenően ismertetünk expressziós adatokat, kötődési adatokat EVN és GFRa-3 receptor között, továbbá ismertetjük az EVN in vitro hatását neuritok növekedésére, valamint taxollal indukált neurotoxicitás elleni védelemre staurosporindifferenciált, SH-SY5Y jelű, humán eredetű neuroblasztóma-sejttenyészetekben.

Az alábbiakban röviden összefoglaljuk a találmány lényegét. Leírásunkban ismertetünk egy nukleinsavmolekulát, amely egy új, humán neurotróf faktort, az „enovin”-proteint kódolja, ismertetünk egy, a nukleinsavmolekulát tartalmazó expressziós vektort, a vektort tartalmazó gazdaszervezetet, a nuklelnsavmolekula által kódolt neurotróf növekedési faktort, izolált enovinproteint, ágenseket, amelyek az enovin agonistáiként vagy antagonistáiként hatnak, valamint ismertetünk a nukleinsavat vagy enovinproteint, vagy annak agonistáit vagy antagonistáit tartalmazó gyógyászati készítményeket.

Az alábbiakban részletesen ismertetjük a találmányt.

A találmány első szempontja szerint a találmány tárgyát képezi nuklelnsavmolekula, amely a 21. ábra (SEQ ID No. 4) szerinti aminosavszekvenciát mutató, enovin elnevezésű humán neurotróf növekedési faktort, vagy a növekedési faktor funkcionális megfelelőjét, származékát vagy bioprekurzorát kódolja, különösen a hosszú (23. ábra-SEQ ID No. 9), a rövid (24. ábra-SEQ ID No. 10) és a 21. ábrán bemutatott további érési variánsokat (SEQ ID No. 11, 12, 13, 14 vagy 15). Előnyösen, a nuklelnsavmolekula DNS-, előnyösebben cDNS-molekula.

Előnyösen, a találmány szerinti nuklelnsavmolekula az 1. ábra (SEQ ID No. 2) szerinti szekvencia 81.-től a 419. pozícióig tartó szekvenciát, előnyösebben a 81.-től a 422. pozícióig tartó szekvenciát, még előnyösebben a teljes, 1. ábra szerinti szekvenciát tartalmazza.

A 81.-től a 419. pozícióig tartó szekvenciájú nukleinsavmolekuláról úgy tudjuk, hogy az érett enovinproteint kódolja, miután a protein előalakja hasítási folyamaton esik át, az enovinprotein stabil előalakjában található RXXR hasítóhelynél.

A hibridizáció sztringenciája alatt a leírásban olyan körülményeket értünk, amelyek mellett a polinukleotidok stabilak. A hibridek stabilitását azok olvadáspontja (Tm) fejezi ki. A Tm értéke az alábbi képlet szerint becsülhető meg:

81,5 °C-16,6 (log10(Na*)+0,41 (%G&C)-600/l ahol I a nukleotidokban lévő hibridek hossza.

A Tm értéke 1-1,5 °C-kal csökken a szekvenciahomológia minden 1%-os csökkenésével.

Előnyösen, a találmány szerinti nukleinsavmolekulát alkalmazhatjuk a találmány szerinti, humán eredetű neurotróf faktor expresszáitatására egy gazdasejtben vagy hasonlóban, megfelelő expressziós vektort alkalmazva. Egy, a találmány szerinti expressziós vektor olyan vektor lehet, amely képes expresszálni szabályozószekvenciákhoz operatív módon kapcsolt DNS-t. A szabályozószekvenciák lehetnek például olyan promoterrégiók, amelyek képesek segíteni az ilyen DNSfragmentumok expresszióját.

Az expresszióhoz szükséges szabályozóelemek lehetnek RNS-polimerázt kötő promoterszekvenciák és transzkripciót elindító szekvenciák a riboszómákhoz történő kötődéshez. Például bakteriális expressziós vektor lehet egy promoter, például a lac-promoter, és a transzkripciót elindító szekvencia lehet a Shine-Dalgarno-szekvencia és az AUG-startkodon. Hasonlóképpen, eukarióta expressziós vektor lehet heterológ vagy homológ promoter az RNS-polimeráz II számára, egy 5’-irányú poliadenilációs szignál, az AUG-startkodon és egy terminációs kodon, a riboszómáról történő leválás céljából. Ilyen vektorok kereskedelmi úton beszerezhetők, vagy összeállíthatók szakember számára jól ismert eljárásokkal, ismert szekvenciákból.

Ennek megfelelően, egy expressziós vektor rekombináns DNS-t vagy RNS-t jelent, mint például plazmidot, fágot, rekombináns vírust vagy más vektort, amelynek megfelelő gazdaszervezetbe történő bevitele a DNS- vagy RNS-fragmentum expresszióját eredményezi. Megfelelő expressziós vektorok szakember számára jól ismertek, ezek közé tartoznak azok, amelyek replikálódnak eukarióta és/vagy prokarióta sejtekben, és azok, amelyek episzomálisak maradnak vagy integrálódnak a gazdasejtgenomba.

A találmány szerinti nukleinsavmolekulákat az ismertetett vektorokba inszertálhatjuk antiszensz orientációban, hogy antiszensz RNS-t állítsunk elő. Antiszensz RNS-t vagy más antiszensz nukleinsavakat előállíthatunk szintetikus úton is.

A találmány tárgyát képezi továbbá a találmány szerinti expressziós vektorral transzformált, transzfektált vagy infektált gazdasejt, amely sejt előnyösen eukarióta sejt, előnyösebben emlőssejt.

Klónozott DNS bevitele megfelelő expressziós vektorba a sejt transzformálása céljából, majd a traszformált sejtek ezt követő szelekciója szakember számára jól ismert, amint azt az alábbi szakirodalmi hely ismerteti: Sambrook és munkatársai: „Molecular Cloning, A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbour Laboratory Press.

A találmány tárgyát képezik továbbá nukleinsavmolekulák, amelyek a találmány szerinti nukleinsavmolekula legalább 15 nukleotidját tartalmazzák, előnyösen 15-50 nukleotidot.

HU 226 073 Β1

Előnyösen ezek a nukleotidok alkalmazhatók mint próbák vagy láncindító oligonukleotidok a replikáció elindítására vagy hasonló célra. Ilyen nukleinsavmolekulákat előállíthatunk szakember számára jól ismert eljárásokkal, például rekombináns vagy szintetikus úton. Alkalmazhatók például diagnosztikai készletben vagy készülékekben (eszközökben) a találmány szerinti nukleinsav jelenlétének a kimutatására. Az ilyen vizsgálatok során általában érintkeztetjük a próbát a mintával hibridizálókörülmények mellett, és detektáljuk az esetleges duplexképződést a próba és a mintában található bármely nukleinsav között.

A találmány szerint ezeket a próbákat szilárd hordozóhoz rögzíthetjük. Előnyösen ezek egy lemezen helyezkednek el, így egyidejűleg nagyszámú próba hibridizálódhat egyetlen biológiai mintához. A próbákat felcseppenthetjük a lemezre, vagy azokat in situ szintetizálhatjuk a tálcán [Lockhart és munkatársai: „Expression monitoring by hybridisation intő high density oligonucleotide arrays Natúré Biotechnology 14, (1996 december)]. Egyetlen lemez tartalmazhat 100, 500 vagy akár 1000 különböző próbát, adott elhelyezkedés szerint.

A találmány szerinti nukleinsavakat előállíthatjuk olyan rekombináns vagy szintetikus eljárással, mint például PCR klónozási mechanizmusok alkalmazásával, amely szerint általában egy 10-50 nukleotidot tartalmazó láncindító oligonukleotidpárt állítunk elő a klónozni kívánt gén egy régiójához, a láncindító oligonukleotidot érintkeztetjük egy emlőssejt-eredetű mRNS, cDNS vagy genomiális DNS-molekulával, polimerázláncreakciót végzünk olyan körülmények mellett, hogy a kívánt régió amplifikálódjon, izoláljuk az amplifikált régiót vagy fragmentumot, és kinyerjük az amplifikált DNS-t. Általában olyan eljárások, mint amelyet a leírásban ismertetünk, szakember számára jól ismertek [Sambrook és munkatársai: „Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press (1989)].

A találmány szerinti nukleinsavak vagy oligonukleotidok hordozhatnak kimutatható jelölőanyagot. Megfelelő jelölőanyag lehet radioizotóp, mint például ³²P vagy ³⁵S, enzim vagy más protein, például biotin, vagy fluoreszcens marker. Az Ilyen jelölőanyagokat ismert eljárásokkal adhatjuk a nukleinsavakhoz vagy oligonukleotidokhoz, és detektálhatjuk.

Előnyösen, a találmány szerinti DNS-molekula humán eredetű allélikus variánsait és polimorfizmusait azonosíthatjuk például úgy, hogy egyének csoportjaiból, például különböző populációkból származó cDNS-t vagy genomiális könyvtárakat a próbákkal vizsgáljuk. Ezen túlmenően, a találmány szerinti nukleinsavakat és próbákat alkalmazhatjuk egyének genomiális DNS-ének szekvenálására jól ismert eljárásokkal, például a Sanger didezoxi-láncterminációs eljárásával, hogy előnyösen megbizonyosodjunk egyéneknek a találmány szerinti növekedési faktorral asszociált rendellenességre való hajlamáról.

A találmány tárgyát képezi továbbá transzgenikus sejt, szövet vagy organizmus, amely tartalmazza a találmány szerinti, enovin elnevezésű, humán eredetű neurotróf faktor expresszálására képes transzgént.

A leírásban az „expresszálódásra képes transzgén'' alatt bármely megfelelő nukleinsavszekvenciát értünk, amely a találmány szerinti neurotróf faktorral azonos funkciójú és/vagy aktivitású neurotróf faktor expresszálódásához vezet. A transzgén tartalmazhat például humán eredetű sejtekből izolált genomiális nukleinsavat vagy szintetikus nukleinsavat, beleértve cDNS-t, kromoszómába integrálva vagy extrakromoszomális állapotban.

Előnyösen, a transzgén tartalmaz egy, a találmány szerinti vektort, amely vektor tartalmaz egy, a neurotróf faktort vagy funkcionális fragmentumát kódoló nukleinsavat. A nukleinsav „funkcionális fragmentuma kifejezés alatt a neurotróf faktort vagy funkcionális megfelelőjét kódoló gén vagy cDNS fragmentumát értjük, amely fragmentum expresszáltatható, hogy egy, a találmány szerinti funkcionális neurotróf faktort állítsunk elő. Ennek megfelelően például a találmány tárgyát képezik továbbá a találmány szerinti neurotróf növekedési faktor azon fragmentumai, amelyek megfelelnek a megfelelő receptorral kölcsönhatásba lépő specifikus aminosavcsoportoknak, valamint amely fragmentumok agonistaként funkcionálnak, a találmány szerinti növekedési faktor megfelelő receptorát aktiválva, hogy kifejthesse növekedést előidéző és túlélést fenntartó hatását a sejtekre. A találmány ezen szempontja szerint a találmány tárgyát képezik továbbá a találmány szerinti nukleinsavak differenciálisán hasított izoformjai és transzkripcionális kiindulóhelyei.

A találmány szerint egy meghatározott nukleinsav nemcsak azonos nukleinsavat tartalmaz, hanem bármely, kisfokú bázisvariációkat, elsősorban például olyan szubsztitúciókat, amelyek szinonim kodont eredményeznek (eltérő kodon ugyanazon aminosavat határoz meg) konzervatív aminosavszubsztitúciók során előforduló degenerált kód miatt. Leírásunkban a „nukleinsavmolekula kifejezés tartalmazza bármely egyszálú szekvenciával komplementer szekvenciát is, a bázisvariációk tekintetében.

Egy további szempontból a találmány tárgyát képezi izolált, humán eredetű neurotróf növekedési faktor, amelyet a leírásban definiált nukleinsav kódol. Előnyösen, a növekedési faktor tartalmazza az 1. ábra szerinti aminosavszekvencia 27. pozíciójától a 139. pozíciójáig tartó aminosavszekvenciát vagy funkcionális ekvivalensét, származékát, vagy bioprekurzorát.

Leírásunkban a „funkcionális ekvivalens” kifejezés alatt olyan növekedési faktort értünk, amely mutatja az enovin növekedési faktorra jellemző valamennyi, növekedést előidéző tulajdonságot és funkcionalitást. Leírásunkban az enovin „származéka” kifejezésbe olyan polipeptidek tartoznak, amelyekben bizonyos aminosavakat megváltoztattunk, deletáltunk vagy más aminosavra cseréltünk, és amely polipeptidek megtartják az enovin biológiai aktivitását, és/vagy amely polipeptidek reagálni képesek a találmány szerinti enovint mint kiváltó antigént alkalmazva előállított ellenanyagokkal.

HU 226 073 Β1

A találmány oltalmi körébe tartoznak az enovin hibrid és módosított formái, beleértve fúziós proteineket és fragmentumokat. A hibrid és módosított formákhoz tartozik például, amikor bizonyos aminosavakat módosításnak vagy helyettesítésnek teszünk ki, például pontmutációval, amely módosítás mégis olyan proteint eredményez, amely megtartja a találmány szerinti enovin biológiai aktivitását. Adott aminosavszekvenciákat szakember megváltoztathat úgy, hogy olyan növekedési faktort állítson elő, amely az enovinnal azonos vagy lényegében azonos tulajdonságokat mutat.

Amint az szakember számára jól ismert, számos protein úgy termelődik in vivő, hogy a protein N-terminális végén (pre) szignálszekvencia található. Továbbá, az ilyen proteinek tartalmazhatnak egy további proszekvenciát, amely az érett protein egy stabil prekurzorát képviseli. Az ilyen pre- és proszekvenciák általában nem szükségesek a biológiai aktivitáshoz. A találmány szerinti enovinmolekula nem csak a 21. ábra szerinti teljes szekvenciát tartalmazza, hanem a 27. pozíciótól a 139. pozícióig terjedő szekvenciát, amely követi az ilyen típusú növekedési faktorokban jelen lévő RXXR proteolitikus hasítási helyet, és amelyről úgy tudjuk, hogy az enovin érett szekvenciáját képviseli.

Egy, a találmány szerinti, definiált proteinbe, polipeptidbe vagy aminosavszekvenciába nemcsak az identikus aminosavszekvencia tartozik, hanem azok izomerjei, a természetes aminosavszekvenciától történő kismértékű aminosaveltéréseken kívül, beleértve a konzervatív aminosavhelyettesítéseket (olyan aminosawal történő helyettesítés, amely oldallánca tekintetében rokonságot mutat). Idetartoznak továbbá olyan aminosavszekvenciák, amelyek eltérnek a természetes aminosavszekvenciától, azonban olyan polipeptidet eredményeznek, amelyek immunológiailag identikusak vagy hasonlók a természetben előforduló szekvencia által kódolt polipeptidhez.

A találmány szerinti proteinek vagy polipeptidek közé tartoznak továbbá az ilyen szekvenciák variánsai, beleértve a természetben előforduló allélikus variánsokat, amelyek lényegében homológok a proteinekkel vagy polipeptidekkel. Ebben a vonatkozásban, lényegében homológnak tekinthető az a szekvencia, amely legalább 70%, előnyösen 80%, 90% vagy 95% aminosavhomológiát mutat a találmány szerinti nukleinsavmolekulák által kódolt proteinekkel vagy polipeptidekkel.

A találmány szerinti gazdasejtek által expresszált neurotróf növekedési faktorok szintén a találmány tárgyát képezi.

A leírásban ismertetett növekedési faktor, valamint a GDNF-családba tartozó, már korábban azonosított növekedési faktorok közötti szekvenciabeli hasonlóság miatt feltételezzük, hogy az enovin szintén képes elősegíteni sejtek túlélését és növekedését, és alkalmas ezen neurotróf faktor funkciójának vagy expressziójának a hibája okozta rendellenességek kezelésére.

A találmány szerinti neurotróf növekedési faktor neurotróf és neuroprotektív hatást fejt ki neuronális sejtekre vagy sejtpopulációkra, elsősorban olyan neuronális sejtekre és sejtpopulációkra, amelyek úgy indukálódtak, hogy apoptózison mennek keresztül. Ennek megfelelően a találmány szerinti nukleinsavat vagy magát az enovint alkalmazhatjuk gyógyszerként.

Ezen túlmenően, amint azt az alábbi példában részletesen ismertetjük, az enovinről kimutattuk, hogy felgyorsítja indukált szenzorikus kiesések regenerálódását, ezért az enovin lehetséges hatóanyagjelölt lehet perifériás vagy centrális neurogén komponensű fájdalomszindróma, reumás/gyulladásos betegségek, valamint ingervezetési rendellenességek kezelésére vagy enyhítésére azáltal, hogy arra rászoruló egyénnek olyan koncentrációban adjuk be, amely elegendő ezen rendellenességek tüneteinek az enyhítésére vagy megelőzésére.

A fent ismertetett idegrendszeri rendellenességek kezelésére alkalmas más eljárás szerint, egy egyénbe olyan sejteket implantálunk, amelyek expresszálják a találmány szerinti, humán eredetű neurotróf növekedési faktort, mint például a leírás szerinti transzgén sejt.

A találmány szerinti nukleinsavmolekulákat és neurotróf növekedési faktort kiszerelhetjük gyógyászati készítményben, gyógyászatilag elfogadható hordozóval, oldószerrel és vivőanyaggal elegyítve.

A találmány szerinti neurotróf növekedési faktor elleni ellenanyagokat szakember számára jól ismert eljárásokkal állíthatunk elő. Például poliklonális ellenanyagokat állíthatunk elő úgy, hogy inokulálunk egy gazdaállatot, például egeret a növekedési faktorral vagy epitópjával, majd összegyűjtjük az immunszérumot. Monoklonális ellenanyagot állíthatunk elő ismert eljárásokkal, mint amelyet Köhler és Milstein ismertet [Köhler és Milstein: Natúré 256, 495-497 (1975)].

A találmány szerinti ellenanyagok előnyösen alkalmazhatók a találmány szerinti neurotróf növekedési faktor jelenlétének kimutatására kifejlesztett eljárásban, amely eljárás szerint az ellenanyagot mintákkal reagáltatjuk, és azonosítunk az ellenanyaghoz kötődött bármely proteint. A találmány tárgyát képezi továbbá készlet az eljárás kivitelezésére, amely tartalmaz a találmány szerinti ellenanyagot, és eszközt az ellenanyag és a minta reagáltatására.

A találmány tárgyát képezi továbbá készlet vagy készülék (eszköz) a találmány szerinti neurotróf növekedési faktor jelenlétének kimutatására mintákból, amely a fent ismertetett ellenanyagot, valamint az ellenanyag és a minta reagáltatására alkalmas módszert, eszközt tartalmaz.

Olyan proteineket, amelyek kölcsönhatásba lépnek a találmány szerinti neurotróf növekedési faktorral, úgy azonosíthatunk, hogy protein-protein kölcsönhatásokat vizsgálunk a két hibrid vektorrendszerrel, amely molekuláris biológus számára jól ismert [Fields és Song: Natúré 340, 245 (1989)]. Ez az eljárás egy riportergént aktiváló transzkripciós faktor in vivő funkcionális rekonstitúcióján alapul. Közelebbről, az eljárás szerint megfelelő gazdasejtbe olyan DNS-konstrukciót viszünk be, amely aktiválódomént és kötődomént tartalmazó transzkripciós faktor által irányított promoter szabályozása alatt álló riportergént tartalmaz, ez a gazdasejt5

HU 226 073 Β1 ben expresszál egy olyan első hibrid DNS-szekvenciát, amely kódolja a találmány szerinti teljes nukleinsavszekvenciának vagy fragmentumának első fúzióját, és vagy a DNS-kötő domént vagy az -aktiváló domént, ezáltal expresszál a gazdasejtben egy második hibrid DNS-szekvenciát, mint például egy könyvtárat vagy hasonlót, amely a vizsgálni kívánt lehetséges kötőproteineket együtt kódolja a transzkripciós faktor DNS-kötő vagy -aktiváló doménjával, amely nincs beépülve az első fúzióba; kimutatjuk a vizsgálni kívánt proteinek kötődését a találmány szerinti proteinnel azáltal, hogy detektáljuk a riportergén termékének jelenlétét a gazdasejtben; kívánt esetben izoláljuk a kötőproteint kódoló második hibrid DNS-szekvenciát.

Ilyen eljárás szerint alkalmazzuk például a GAL4 proteint élesztőben. A GAL4 protein a galaktózmetabolizmus transzkripcionális aktivátora élesztőben, amely egy külön, a galaktózmetabolizmus-génektől 5’-irányba található aktivátorokhoz kötődő domént, valamint egy külön proteinkötő domént tartalmaz. Nukleotidvektorokat állítunk elő, az egyik tartalmazza a GLA4 protein DNS-kötő doménját kódoló nukleotidszekvenciát. Ezeket a kötődomén-szekvenciákat fuzionáltatjuk ismert proteint kódoló szekvenciákkal, például a találmány szerinti nukleinsavszekvenciákkal. A másik vektor a GAL4 protein proteinkötő doménját kódoló szekvenciát tartalmazza. Ezeket a szekvenciákat fuzionáltatjuk a vizsgálni kívánt proteint kódoló szekvenciákkal, amelyek előnyösen a kérdéses gerinces szignáltranszdukciós anyagcsereútjából származik. A találmány szerinti nukleinsav által kódolt neurotróf növekedési faktor, valamint a vizsgált protein közötti kölcsönhatás riportermolekula transzkripcionális aktiválódását eredményezi GAL4-transzkripcióra nézve deficiens élesztőben, amelybe a vektorokat transzformáltuk. Előnyösen egy riportermolekula, mint például a β-galaktozidáz aktiválódik az élesztő galaktózmetabolizmusgének transzkripciójának helyreállítása nyomán.

Az enovin receptoraként a GFRa-3 proteint azonosítottuk. Ennek megfelelően, vizsgálatokat végezhetünk az enovin agonista vagy antagonista vegyületeinek azonosítására. Ezt a vizsgálatot alkalmazhatjuk más neurotróf növekedési faktorok és megfelelő receptoruk esetében is. Az azonosított vegyületeket alkalmazhatjuk olyan rendellenességek, mint például a Parkinson-kór, az Alzheimer-kór, kiterjesztett („expanded”) poliglutaminszekvenciákkal asszociált neuronális rendellenességek, mint például a Huntingdon-kór, perifériás neuropátia, akut agysérülés, idegrendszeri tumorok, sclerosis multiplex, amiotróf laterális szklerózis, perifériás ideg traumája vagy sérülése, neurotoxinoknak kitett állapot, multiplex endokrin neoplázia és örökletes Hírschsprung-kór, prionnal asszociált betegségek, Creutzfeld-Jacob-kór, stroke, lényegében perifériás vagy centrális neurogén komponensű fájdalomszindrómák, reumás/gyulladásos betegségek, valamint ingervezetési rendellenességek kezelésére és megelőzésére azáltal, hogy egyéneknek az agonista vagy antagonista vegyület adagját olyan koncentrációban adjuk be, amely elegendő a neurális rendellenesség kezelésére vagy megelőzésére. Ilyen vegyületeket kiszerelhetünk gyógyászati készítményben, gyógyászatilag elfogadható hordozóval, oldószerrel vagy vivőanyaggal elegyítve. Egy megvalósítási mód szerint, egy neurotróf növekedési faktor (mint például enovin) agonistáját vagy antagonistáját úgy azonosíthatjuk, hogy megfelelő receptort és cRET-protoonkogént expresszáló sejtet, szövetet vagy organizmust érintkeztetünk egy vizsgálni kívánt vegyülettel a neurotróf növekedési faktor jelenlétében és nélkül, és összehasonlítjuk a RET-aktiválódás szintjét a sejtben, szövetben vagy organizmusban a kontrollal, amelyet nem érintkeztettünk a vizsgálni kívánt vegyülettel.

A találmány más megvalósítási módja szerint, olyan eljárással azonosítjuk a neurotróf növekedési faktor agonistáit és antagonistáit, amelyben érintkeztetjük a neurotróf növekedési faktor megfelelő receptorát és cRET-protoonkogént expresszáló sejtet, szövetet vagy organizmust egy vizsgálni kívánt vegyülettel a neurotróf növekedési faktor jelenlétében, mérjük a szignált létrehozó kinázaktiválódás szintjét a szignáltranszdukciós anyagcsereútban, amelynek a megfelelő receptor alkotórésze, ezt követően riportermolekulával konjugált, a szignált létrehozó kinázra specifikus ellenanyagot mérünk be, majd az eredményt összehasonlítjuk olyan sejt, szövet vagy organizmus eredményével, amelyet nem érintkeztettük a vegyülettel.

További szempontból, a találmány tárgyát képezi eljárás, amely szerint gyógyászati készítményt állítunk elő enovin humán neurotróf növekedési faktorral összefüggő rendellenességek kezelésére, amely eljárás során kiválasztunk egy, a találmány szerinti enovin agonistájaként vagy antagonistájaként azonosított vegyületjelöltet, abból nagy mennyiséget állítunk elő, majd az előállított vegyületet gyógyászatilag elfogadható hordozóval kiszereljük.

Amint a példákban részletesebben ismertetjük, az enovin sikerrel csökkentette a taxollal indukált szenzorikus kieséseket. Ennek megfelelően, az enovin szerepet játszhat lényegében perifériás és centrális neurogén komponensű fájdalomszindrómákban, reumatikus betegségekben, valamint ingervezetési zavarokban, és szabályozószerepet játszhat szenzorikus folyamatokban transzdermális, topikális, lokális centrális (például epidurális, intrathekális, ICV, intraplexus, Intraneuronális), orális, rektális és szisztémás beadást követően. Ennek megfelelően, az enovin által médiáit, más állapotoknál ismertetettekhez hasonlóan, ezeket az állapotokat enyhíthetjük, vagy akár megelőzhetjük azáltal, hogy vagy antiszensz molekulát, nukleinsavat, enovinproteint, gyógyászati készítményt vagy agonistaként, vagy antagonistaként azonosított vegyület egyikét, amelyik épp megfelelő, a találmány szerinti megoldással összhangban, adjuk be elegendő koncentrációban ahhoz, hogy a rendelleneség(ek) tüneteit enyhítsük vagy megelőzzük.

A találmány szerinti terápiás vagy gyógyászati készítmények bármely, a technika állása szerint jól ismert, megfelelő úton beadhatók, ideértve például az intravénás, szubkután, intramuszkuláris, transzdermá6

HU 226 073 Β1 lis, intrathekális vagy intracerebrális beadást, vagy sejtekhez adást ex vivő kezelési rend során. A beadás lehet gyors, mint injekció formában, vagy bizonyos időtartam alatti, mint lassú infúzió révén, vagy a hatóanyagot lassan elengedő, retard kiszerelésben adjuk be. A központi idegrendszer szöveteinek a kezelése céljából a beadást végezhetjük a cerebrospinális folyadékba (CSF) történő injektálással vagy infundálással.

Az enovint kapcsolhatjuk vagy konjugálhatjuk is olyan ágensekkel, amelyek kívánt gyógyászati vagy farmakokinetikai tulajdonságot biztosítanak. Például, kapcsolható bármely, a technika állása szerint ismert olyan ágenshez, amely segíti az vér-agy gáton történő penetrálódást vagy átjutást, ilyen például egy ellenanyag a transzferrinreceptor ellen, intravénás injekció formájában beadva.

Az enovin, az antiszensz molekulák vagy a találmány szerinti, az enovin agonistájaként vagy antagonistájaként azonosított vegyületek gyógyászati készítmény formájában alkalmazhatók, amelyet a technika állása szerint jól ismert eljárásokkal állíthatunk elő. Előnyös készítmények tartalmaznak gyógyászatilag elfogadható hordozóanyagot, oldószert vagy vivőanyagot, mint amilyen például a fiziológiás konyhasóoldat. Alkalmazhatunk más, gyógyászatilag elfogadható vivőanyagokat, beleértve más, nem toxikus sókat, steril vizet vagy hasonlókat. Olyan megfelelő puffer is jelen lehet, amely lehetővé teszi a készítmény liofilezését és a steril tárolást mindaddig, amíg steril vízzel rekonstituáljuk, mielőtt beadjuk. Az enovint inkorporálhatjuk biológiailag kompatibilis szilárd vagy félszilárd mátrixba, amelyet implantálhatunk a kezelésre szoruló szövetbe.

A vivőanyag tartalmazhat más, gyógyászatilag elfogadható komponenseket, olyan körülmények módosítása céljából, mint a pH, ozmolaritás, viszkozitás, sterilitás, lipofil tulajdonság, oldhatóság vagy hasonlók. A készítmény tartalmazhat továbbá olyan, gyógyászatilag elfogadható komponenseket, amelyek lehetővé teszik a fenntartott vagy késleltetett felszabadulást a beadást követően.

A találmány szerinti enovinproteint vagy nukleinsavmolekulákat, vagy vegyületeket beadhatjuk szájon át. Ezen megvalósítási mód szerint azokat enkapszuláljuk és szilárd dózis formában kombináljuk megfelelő hordozóanyagokhoz, amint az szakember számára jól ismert.

Amint az szakember számára jól ismert, a fajlagos adagolási rendet kiszámolhatjuk az egyén testfelszínének a területe alapján, vagy az elfoglalt testűr térfogata alapján, az alkalmazott beadási módtól függően. Az készítmény aktuálisan beadott mennyiségét a kezelőorvos határozza meg, a kezelni kívánt rendellenességhez tartozó körülmények alapján, mint például a tünetek súlyossága, a beadni kívánt készítmény fajtája, az adott egyén kora, testtömege, válaszkészsége és a választott beadási mód szerint.

A találmányt jobban érthetővé tesszük az alábbi példákkal, amelyek csak példaként szolgálnak, hivatkozva a csatolt ábrákra, amelyek az alábbiakat mutatják:

Az 1. ábra a találmány szerinti, enovinnak elnevezett neurotróf növekedési faktor részleges cDNS-szekvenciáját mutatja. A konszenzusszekvenciát PCR amplifikálással állítottuk elő PNHsp3 és PNHapI láncindító oligonukleotidok alkalmazásával, különböző cDNSeken és genomiális DNS-en, amit klónozás és szekvenciaanalízis követett, majd összehasonlítottuk a kapott szekvenciákat. A kikövetkeztetett, egybetűs aminosavszekvenciát a DNS-szekvencia fölött ábrázoltuk. A nukleotidok pozíciószámát a DNS-szekvencia jobb oldalán, míg az aminosavak pozíciószámát a transziáit proteinszekvencia jobb oldalán tüntettük fel. A prodomén feltételezett RXXR hasítási helyét vastagon szedve és aláhúzva ábrázoltuk. Az érett protein feltételezett kezdetét nyíllal jelöltük. A hét konzervált ciszteincsoportot, amely jellemző a TGF-6-családra, vastagon szedve ábrázoltuk. A feltételezett N-glikozilezési helyet kétszeresen aláhúztuk.

A 2. ábra a humán GDNF, NTN, PSP és EVN kikövetkeztetett aminosavszekvenciáját mutatja egymás alá illesztve. A szekvenciákat ClustalW illesztőprogram alkalmazásával illesztettük egymáshoz. A mind a négy protein között konzervált aminosavakat fekete mezőben ábrázoltuk. A két vagy három szekvencia között konzervált aminosavakat szürke mező jelzi. A hét konzervált ciszteint, amelyek a TGF-p-családra jellemzők, a szekvencia fölött csillag jelöli. Az aminosavakat jobb felé számoztuk. A szaggatott vonalak az optimális illesztés érdekében a szekvenciákba bevitt hiányokat jelölik.

A 3. ábra az enovin részleges cDNS-szekvenciáját ábrázolja. A konszenzusszekvenciákat PCR amplifikálással állítottuk elő (primer PCR-t végeztünk PNHspl és PNHapI láncindító oligonukleotidokkal és illesztett PCR-t PNHsp2 és PNHap2 láncindító oligonukleotidokkal) különböző cDNS-eken, amelyet klónozás és szekvenciaanalízis követett, majd összehasonlítottuk a kapott szekvenciákat. A 30-284. pozíciójú nukleotidok transzlálódott, egybetűs kódú aminosavszekvenciáját (A. leolvasási keret) a szekvencia fölött ábrázoltuk és balról jobbra számoztuk (A1-A85). Ez a leolvasási keret tartalmaz egy feltételezett ATG transzlációs startkodont. A 334-810. pozíciójú nukleotidok transzlálódott, egybetűs kódú aminosavszekvenciáját a szekvencia fölött ábrázoltuk és balról jobbra számoztuk (B1-B159). Ez a leolvasási keret tartalmazza a GDNF-, NTN- és PSP-proteinekkel homológiát mutató régiót. A nukleotidok pozíciószámát a DNS-szekvenciától jobbra jelöltük. A prodomén feltételezett RXXR hasítóhelyét vastagon szedve ábrázoltuk és aláhúztuk. Az érett protein kezdetét nyíllal jelöltük. A hét konzervált ciszteint, amely jellemző a TGF-p-családra, vastagon szedve ábrázoltuk. Egy feltételezett N-glikozilezési helyet kétszeresen aláhúztunk.

A 4. ábra a humán enovin kromoszomális lokalizációját mutatja. (A) A diagram az enovinra jellemző FISH-térképezés eredményét ábrázolja. Minden pont a humán 1-es kromoszóma p31.3-p32 régiójában detek7

HU 226 073 Β1 tált dupla FISH-szignálokat képviseli. (B) példa az enovin FISH-térképezésére. A bal panel FISH-szignálokat mutat az 1. kromoszómán. A jobb panel ugyanazt a mitotikus képet mutatja 4’,6-diamidino-2-fenil-indol-reagenssel festve, amely azonosítja az 1-es kromoszómát.

Az 5. ábra az enovin expresszálódását illusztrálja különböző szövetekben. (A), (B) és (C) az enovin szöveti expresszálódásának Northern-blot-vizsgálatai. Enovin mRNS-ének expresszálódását vizsgáltuk különböző humán szövetben, az enovin kódolórégiójának egy részének megfelelő próbát alkalmazva (beleértve az érett enovinproteint kódoló régiót), hogy humán eredetű poli(A)-ban gazdag RNS-blotokat analizáljunk. (A) több szöveten végzett Northern-blot; (B) több szöveten végzett Norhtern-blot II; több szöveten végzett magzati Northern-blot II. A (D) panel humán eredetű RNS mester („master)-blot autoradiográfiáját mutatja, amelyhez próbaként ugyanazon enovin-cDNS-fragmentumot használtuk. Az (E) panel a humán eredetű szöveti mRNS-minták elhelyezkedését mutatja a (D) panel szerinti mesterbloton.

A 6. ábra grafikusan illusztrálja SH-SY5Y sejtek összes túlélését 72 órás, 10-6 M taxolreagenssel történt kezelés után, és emelkedő enovindózisok hatását a túlélésre, az eredményeket a közeg körülményeire normalizáltuk. Az SH-SY5Y sejteket 5 napon át differenciáltattuk 25 nmol/l staurosporin jelenlétében, mielőtt a taxosporint hozzájuk adtuk. Az adatok két, egymástól független vizsgálatból származnak, amelyeket hat párhuzamossal végeztünk. Ábrázoltuk az átlagot és a standard deviációt.

A 7. ábra grafikusan ábrázolja az enovin növekvő koncentrációjának hatását staurosporinnal differenciáltatott SH-SY5Y sejtek neuritjának kinövésére 48 óra alatt, a közeg körülményeire normalizálva. Az SH-SY-5Y sejteket 5 napon át differenciáltattuk 25 nmol/l staurosporin jelenlétében, mielőtt a 48 órás vizsgálatot elkezdtük. Pozitív kontrollként 12 nmol/l staurosporin differenciáltató hatását mutattuk. A neuritok hosszát legalább 5000 sejten határoztuk meg. Az adatok két párhuzamos vizsgálatból származnak. Átlagot és standard deviációt ábrázoltunk.

A 8-18. ábrák az enovin különböző sejttípusok proliferációjára gyakorolt hatását illusztrálják grafikusan.

A 19. ábra grafikusan ábrázolja az enovin hatását taxollal indukált szenzorikus kiesésekre a tűszúrásteszt alkalmazásával. Megadtuk olyan patkányok átlagos (+/-1 SEM) kumulatív pontszámait az idő függvényében, amelyek vagy két különböző dózisban enovint (23 vagy 130 pg/ml; n=10 patkány) vagy fiziológiás konyhasóoldat/vivőanyagot (n=20 patkány) kaptak taxolkezelés után. Az enovint vagy a fiziológiás konyhasóoldatot/vivőanyagot 75 pl térfogatban injektáltuk a bal hátsó láb szubplantáris területébe.

A 20. ábra grafikusan ábrázolja az enovin hatását taxollal indukált szenzorikus kiesésekre a tűszúrásteszt alkalmazásával. Megadtuk olyan patkányok átlagos (+1-1 SEM) kumulatív pontszámait az idő függvényében, amelyek vagy két különböző dózisban enovint (23 vagy 130 pg/ml; n=10 patkány) vagy fiziológiás konyhasóoldat/vivőanyagot (n=20 patkány) kaptak taxolkezelés után. Az enovint vagy a fiziológiás konyhasóoldatot/vivőanyagot 75 pl térfogatban injektáltuk a bal hátsó láb szubplantáris területébe.

A 21. ábra az enovin DNS-szekvenciáját ábrázolja. A konszenzusszekvenciát PCR amplifikálással kaptuk, a PNHsp5 és PNHapI láncindító oligonukleotidok alkalmazásával humán eredetű frontáliskortex-cDNS-en és humán eredetű genomiális DNS-en, ezt klónozás és szekvenciaanalízis követte, majd összehasonlítottuk az így kapott szekvenciákat. A kikövetkeztetett aminosavszekvenciát az egyetlen olyan vágási variáns DNSszekvenciája fölött jelöltük, amely a transzlációt követően az egyetlen funkcionális enovinproteint eredményezte. A nukleotidok pozíciószámát a DNS-szekvenciák bal oldalán, míg az aminosavak pozíciószámát a transzlálódott proteinszekvencia jobb oldalán tüntettük fel. A szekvenált cDNS-fragmentumok és a genomiális szekvencia összehasonlításával detektált 5' vágási helyeket balra, a 3' vágási helyeket jobbra hajló függőleges vonalakkal jelöltük, és folyamatosan számoztuk. A prodomén feltételezett RXXR furin hasítási helyét vastagon szedve ábrázoltuk és aláhúztuk. Az érett protein kezdetét nyíllal jelöltük. A TGF-p-család minden tagjára jellemző hét ciszteint vastagon szedve ábrázoltuk. Egy potenciális N-glikozilezési helyet kétszeresen aláhúztunk. Az 5’ és 3’ vágási helyeket megszámoztuk és bekarikáztuk.

A 22. ábra különböző enovinvágási variánsok expresszálódását illusztrálja humán eredetű szövetekben. (A) A sematikus diagram különböző, humán eredetű szövetekből származó RNS-en, enovinre fajlagos láncindító oligonukleotidokkal végzett RT-PCR vizsgálatokkal azonosított enovinvágási variánsokat mutat klónozás és a PCR-termékek szekvenciavizsgálata után. A felső vonal egy skálát mutat bázispárban megadva. A második vonal az enovin genomiális szekvenciát képviseli. A start- és a stopkodon pozícióját, az érett enovint kódoló szekvencia kezdetét és az 5’ és 3’ vágási helyeket (lásd a 21. ábrát) megjelöltük. Az ábra jobb oldala olyan PCR-termékeket mutat, amelyeket ovárium- és frontáliskortex-eredetű RNS-en végzett RT-PCR vizsgálattal kaptunk, valamint mutat egy 100 bázispár DNS-létrát. A különböző mRNS-variánsok pozícióját méretükkel együtt tüntettük fel (a startkodontól a stopkodonig). A transzlálódott proteineket a bal oldalon mutatjuk. A táblázatszerű rácsgrafikában delineáltuk a cDNS-ben képviselt régiókat. A szaggatott vonalak kivágott genomiális DNS-t jelentenek. A satírozott régió képviseli az érett enovint kódoló szekvenciát. A pontozott vonal jelzi az érett enovint kódoló szekvencia kezdetét. A funkcionális enovinproteint eredményező két transzkriptumot a bal oldalon csillaggal jelöltük. (B) A fő vágási variánsok szöveti megoszlása. A fénykép különböző, humán eredetű cDNSeken, enovinre fajlagos láncindító oligonukleotidokkal, RT-PCR eljárással kapott PCR-fragmentumokat mutat. A négy fő vágási variánst (A-D) nyilakkal jelöltük a bal oldalon. A méreteket a jobb oldalon tüntettük fel, a

HU 226 073 Β1

100 bázispár létrát alkalmazva referenciaméretként a gélen.

A 23. ábra az enovin hosszú vágási variánsának kikövetkeztetett aminosavszekvenciája; ezt a variánst úgy kaptuk, hogy a 21. ábra szerinti DNS-szekvenciából kivágtuk a két intront. Az 5’-1 és 3’—1 vágási helyeket alkalmaztuk az első intron eltávolítására, az 5’-2 és 3’-3 vágási helyeket pedig a második intron eltávolítására. Ez olyan cDNS-szekvenciát eredményez, amelyben található nyitott leolvasási keret az ábrán látható, 228 aminosavat tartalmazó proteint kódolja.

A 24. ábra az enovin egy alternatív (rövid) vágási variánsának a kikövetkeztetett aminosavszekvenciáját mutatja, amely variánst úgy állítottunk elő, hogy a 21. ábra szerinti DNS-szekvenciából kivágtunk két intront. Az 5’—1 és 3'-2 vágási helyeket alkalmaztuk az első intron eltávolítására, az 5’—2 és 3'-3 vágási helyeket pedig a második intron eltávolítására. Ez olyan cDNS-szekvenciát eredményez, amelyben található nyitott leolvasási keret az ábrán látható, 220 aminosavat tartalmazó proteint kódolja. Ebből az aminosavszekvenciából, a 23. ábra szerinti szekvenciával összehasonlítva, 8 aminosav hiányzik.

A 25. ábra grafikusan jeleníti meg azon vizsgálataink eredményeit, amelyben célul tűztük ki összehasonlítani az enovin expresszálódásának a szintjét normál- és beteg szövetben. Enovin és GAPDH expresszálódását ábrázoltuk agyszöveten, sclerosis multiplex és Alzheimer-kór esetében.

A 26. ábra grafikusan jeleníti meg Parkinson-kóros és rákos szövetből meghatározott enovin- és GAPDHexpresszálódás szintjét.

Az enovint kódoló DNS-szekvenciát tartalmazó EVNmat/pRSETB plazmidot LMBP3931 nyilvántartási szám alatt, 1999. május 6-án letétbe helyeztük a Belga Koordinált Mikrobiológiai Gyűjteménybe (Belgian Coordinated Collections of Microbiology, BCCM), Laboratórium voor Moleculaire-Plasmidencollectie (LMBP) B9000, Ghent, Belgium, az 1997. április 28-i Budapesti Egyezmény ajánlásának megfelelően.

Anyagok és módszerek

Anyagok

A natív Taq polimeráz, ampicillin, IPTG (izopropilβ-D-tiogalaktozid), X-gal (5-bromo-4-kloro-3-indolil^D-galaktopiranozid) és az összes restrikciós enzim Boehringer Mannheim (Mannheim, Németország) eredetű volt. Tíz mmol/l dNTP-elegyet a Life Technologies (Gaithersburg, MD, USA) cégtől vásároltunk. A TOPO-TA klónozókészletet az Invitrogen BV (Leek, Hollandia) cégtől vettük. A Qiagen mini- vagy midiDNS-tisztító készlet, a Qiaprep Spin Miniprep készlet és a Qiaquick gélextrakciós készlet a Qiagen GmbH (Düsseldorf, Németország) cégtől származik. A cDNSkönyvtárak, a Marathon™ Ready cDNS-készlet, humán eredetű, többszövetes cDNS-panel-l és -panel-ll (MTC™), többszövetes Northern-blotok és az Advantage-GC cDNS-PCR készletet a Clontech Laboratories (Palo Alto, CA, USA) cégtől származnak. Minden PCR vizsgálatot egy GeneAmp PCR system 9600 cycler (Perkin-Elmer, Foster City, CA, USA) berendezésen végeztünk. Az LB (Luria-Bertani) tápközeg 10 g/l triptont, 5 g/l élesztőkivonatot, és 10 g/l NaCI-ot, 15 g/l agart és 100 mg/ml ampicillint tartalmazott.

Homológíakeresés és szekvencia-összehasonlítás adatbázisban

BLAST [Basic Local Aligment Search Tool; Altschul és munkatársai, (1990)] keresést végeztünk teljes, humán eredetű gliasejtvonalból származó neurotróf faktor (GDNF, nyilvántartási szám: Q99748), neurturin (NTN, nyilvántartási szám: P39905) és persephin (PSP, nyilvántartási szám: AF040962) cDNS-ből származtatott proteinszekvenciákat alkalmazva keresőszekvenciákként, a naponta frissített, EMBL/GenBank humán expresszált szekvenciaszakaszokat (EST) tartalmazó és genomiális adatbázisokban.

További BLAST-kereséseket végeztünk úgy, hogy a genomiális szekvenciát az AC005038 nyilvántartási számú szekvenciával alkalmaztuk, és a GenBank adatbázisban számos, ezzel a genomiális szekvenciával homológiát mutató EST-et detektáltunk.

A GDNF-család tagjai közötti százalékos azonosságot és százalékos hasonlóságot a szekvenciák páronként! összehasonlításával számoltuk ki, a BESTFIT program (Genetics Computer Group szekvenciaanalízis-szoftvercsomag, 8.0 verzió, University of Wisconsin, Madison, WI, USA) alkalmazásával. A DNS- vagy aminosavszekvenciák illesztését a ClustalW illesztőprogrammal (EMBL, Heidelberg Németország) végeztük.

Oligonukleotidok szintézise PCR és DNSszekvenálás céljára

Minden láncindító oligonukleotidot az Eurogentec (Seraing, Belgium) cégtől rendeltük. Az inszertspecifikus, szekvenáló láncindító oligonukleotidokat (15 és 16 tagú oligonukleotidokat) és a PCR vizsgálatokban alkalmazott láncindító oligonukleotidokat manuálisan állítottuk össze. DNS-t Qiagen-tip-20 vagy -100 anioncserélő, vagy Qiaquick spin oszlopokon (Qiagen GmbH, Düsseldorf, Németország) állítottunk elő, majd az oszlopról 30 μΙ TE-pufferben [10 mmol/l Tris.HCI, 1 mmol/l EDTA (nátriumsó), pH=8,0] gyűjtöttük be.

A szekvenálási reakciókat mindkét szálon elvégeztük az ABI prizmás BigDye Terminato Cycle szekvenálókészlet alkalmazásával, és a reakciókat Applied Biosystems 377XL szekvenálóberendezésen (Perkin-Elmer, ABI Division, Foster City, CA, USA) futtattuk. A Sequencher™ szoftvert alkalmaztuk a szekvenciák összeállításához és manuális szerkesztéshez (GeneCodes, Ann Arbor, Ml, USA).

Új GDNF-homolőg klónozása

Az AC005038 nyilvántartási számú EMBL 67411-68343 pozíciószámú nukleotidokra kiterjedő DNS-régiót, amelynek a transziáit proteinszekvenciája homológiát mutatott az érett NTN- és PSP-proteinekkel, alkalmaztuk láncindító oligonukleotidok tervezésére PCR-amplifikálás céljára. Az alkalmazott különböző láncindító oligonukleotidokat mutatja az 1. táblázat.

HU 226 073 Β1

1. táblázat

AC005038 fragmentumok PCR-amplifikálására alkalmazott láncindító oligonukleotidok

L. oligo. neve	Láncindító oligonukleotid szekvenciája
PNHspl	5'-CGGTGCACTCAGGTGATTCCTCC-3'
PNHsp2	5’-GGCAGCAAACCCATTATACTG- GAACC-3’
PNHsp3	5'-CGCTGGTGCAGTGGAAGAGCC-3'
PNHsp4	5'-CTGCACCCCCATCTGCTCTTCC-3’
PNHapI	5'-GCAGGAAGAGCCACCGGTAAGG-3’
PNHap2	5’-CCAGTCTGCAAAGCCCTGGAGC-3'

A PNHsp3 és PNHapI láncindító oligonukleotidokat alkalmaztuk egy 502 bázispár méretű fragmentum amplifikálására különböző, humán eredetű szövetekből [magzati agy, egész magzat, prosztata vagy tüdő Marathon-Ready™ cDNS (Clontech Laboratories), frontáliskortex-, hipokampusz- és cerebellum-cDNS] származó cDNS-en és humán eredetű genomiális DNS-en. A EMBL/GenBank adatbázisból (nyilvántartási szám: AC005038) származó genomiális szekvencia alapján, az amplifikálni kívánt fragmentum G+C tartalmát 76%-ra következtettük. Ennek megfelelően, az amplifikálást Advantage-GC cDNS-PCR készlettel (Clontech Laboratories, Palo Alto, CA, USA) végeztük, GC-ben gazdag DNS-szekvenciák amplifikálására optimalizálva. A PCR vizsgálatokat 50 μΙ össztérfogatban végeztük, amely az alábbiakat tartalmazta: 1XGC cDNS-PCR reakciópuffert, 0,2 mmol/l dNTP-reagenst, 1 mol/l GC-MELT™ reagenst, 200 nmol/l PNHsp3 és PNHapI láncindító oligonukleotidot, 1 μΙ Advantage KlenTaq polimerázelegyet és 1-5 μΙ cDNS-t vagy 0,5 μg genomiális DNS-t. A mintákat 95 °C-ra hevítettük 5 percre, majd 35 ciklust végeztünk az alábbi paraméterek mellett: 45 mp-ig 95 °C-on, 1 percig 58 °C-on, és 40 mp-ig 72 °C-on, végül utolsó lépésben 7 percig 72 °C-on. A mintákat végül kezeltük 2,5 E-natív Taq DNS-polimerázzal, amivel poli(A)-toldalékot építettünk be. A PCR-termékeket 1%-os (tömeg/térfogat) agarózgélen vizsgáltuk 1XTAE-pufferben [40 mmol/l Tris-acetát, 1 mmol/l EDTA (nátriumsó) pH=8,3]. A várt méretű (495 bázispár) PCR-fragmentumokat kivágtuk a gélből és Qiaquick gélextrakciós készlettel tisztítottuk. A PCRfragmentumokat szekvenáltuk, hogy meggyőződjünk azonosságukról és a pCR2.1-TOPO plazmidvektorba klónoztuk a TOPO TA klónozókészlet alkalmazásával, a gyártó utasításai szerint. Körülbelül 20 ng tisztított fragmentumot elegyítettünk 1 μΙ pCR2.1-TOPO vektorral, 5 μΙ össztérfogatban. A reakcióelegyet szobahőmérsékleten (20 °C-on) inkubáltuk 5 percen át. A reakcióelegy 2 μΙ-ét TOP10F' kompetens sejtekbe (Invitrogen BV) transzformáltuk hősokk-transzformálási eljárással, majd a sejteket kiszélesztettük 2XYT/ampicillin lemezekre, amelyeket 10 mmol/l IPTG-reagenssel és 2% (tömeg/térfogat) X-gal reagenssel egészítettünk ki, hogy lehetővé tegyük a telepek kék-fehér kiválogatását. Éjszakán át történő növekedés után a fehér telepeket levettük a lemezekről, 5 ml térfogatnyi, 100 mg/l ampicillinnel kiegészített LB-tápközegben tenyésztettük, majd Qiaprep Spin Miniprep készlet alkalmazásával plazmidDNS-t állítottunk elő. A várt méretű inszert jelenlétéről EcoRI restrikciós emésztéssel győződtünk meg. Számos pozitív klón plazmidinszertjét szekvenáltuk meg, és a kapott szekvenciákat a ClustalW illesztőprogrammal összehasonlítottuk. Hogy az új GDNF-homológot kódoló további szekvenciát kapjunk, az EMBL/GenBank szekvencia alapján (nyilvántartási szám: AC005038) 931 bázispár (bp) méretűre becsült fragmentumot amplifikáltunk a PNHspl és PNHapI láncindító oligonukleotidok alkalmazásával. A PCR vizsgálatokat 50 μΙ össztérfogatban végeztük, amely az alábbiakat tartalmazta: 1XGC cDNS-PCR reakciópuffert, 0,2 mmol/l dNTP-reagenst, 1 mol/l GC-MELT™ reagenst, 200 nmol/l PNHspl és PNHapI láncindító oligonukleotidot, 1 μΙ Advantage KlenTaq polimerázelegyet és 1-5 μΙ, cerebellum-, frontáliskortex- vagy hipokampuszeredetű cDNS-t vagy 0,5 pg genomiális DNS-t. A mintákat 95 ’C-ra hevítettük 5 percre, majd 35 ciklust végeztünk az alábbi paraméterek mellett: 45 mp-ig 95 ’C-on, 1 percig 58 ’C-on, és 1 perc 30 mp-ig 72 ’C-on, végül utolsó lépésben 7 percig 72 ’C-on. A PCR-termékeket 1%-os (tömeg/térfogat) agarózgélen vizsgáltuk 1XTAE pufferben [40 mmol/l Tris-acetát, 1 mmol/l EDTA (nátriumsó), pH=8,3], Egy második amplifikációs ciklust végeztünk, illesztett láncindító oligonukleotidokkal (PNHsp2 és PNHap2). Az első amplifikációs reakcióelegy 1 μΙ-ét alkalmaztuk 50 μΙ össztérfogatban, amely az alábbiakat tartalmazta: 1XGC cDNS-PCR reakciópuffert, 0,2 mmol/l dNTP-reagenst, 1 mol/l GC-MELT™ reagenst, 200 nmol/l PNHsp2 és PNHap2 láncindító oligonukleotidot, 1 μΙ Advantage KlenTaq polimerázelegyet. A mintákat 95 ’C-ra hevítettük 5 percre, majd 35 ciklust végeztünk az alábbi paraméterek mellett: 45 mp-ig 95 ’C-on, 1 percig 58 ’C-on, és 1 perc 30 mp-ig 72 ’C-on, végül utolsó lépésben 7 percig 72 ’C-on. A PCR-termékeket 1%-os (tömeg/térfogat) agarózgélen vizsgáltuk 1XTAE pufferben [40 mmol/l Tris-acetát, 1 mmol/l EDTA (nátriumsó)]. A várt méretű (870 bp) PCR-fragmentumokat kivágtuk a gélből és Qiaquick gélextrakciós készlettel tisztítottuk. A PCRfragmentumokat szekvenáltuk, hogy meggyőződjünk azonosságukról, kezeltük 2,5 E Taq-polimerázzal és a pCR2.1-TOPO plazmidvektorba klónoztuk a TOPO TA klónozókészlet alkalmazásával, a gyártó utasításai szerint. Körülbelül 20 ng tisztított fragmentumot elegyítettünk 1 μΙ pCR2.1-TOPO vektorral, 5 μΙ össztérfogatban. A reakcióelegyet szobahőmérsékleten (20 ’C-on) inkubáltuk 5 percen át. A reakcióelegy 2 μΙ-ét TOP10F’ kompetens sejtekbe (Invitrogen BV) transzformáltuk hősokktranszformálási eljárással, majd a sejteket kiszélesztettük 2XYT/ampicillin lemezekre, amelyeket 10 mmol/l IPTG-reagenssel és 2% (tömeg/térfogat) X-gal reagenssel egészítettünk ki, hogy lehetővé tegyük a telepek kék-fehér kiválogatását. Éjszakán át történő növekedés után a fehér telepeket levettük a lemezekről, 5 ml térfogatnyi, 100 mg/l ampicillinnel kiegészített

HU 226 073 Β1

LB-tápközegben tenyésztettük, majd Qiaprep Spin Miniprep készlet alkalmazásával plazmid-DNS-t állítottunk elő. A várt méretű inszert jelenlétéről EcoRI restrikciós emésztéssel győződtünk meg. Számos pozitív klón plazmidinszertjét szekvenáltuk meg, és a kapott szekvenciákat a ClustalW illesztőprogrammal összehasonlítottuk.

Enovin-génexpresszió vizsgálata RT-PCR vizsgálattal

A PNHsp3 és PNHapI láncindító oligonukleotidokat (lásd az 1. táblázatot) alkalmaztuk az enovingén 502 bp méretű fragmentumának specifikus amplifikálására. A PCR-amplifikálást humán eredetű, több szövetből származó (MTC™) cDNS-panelen végeztük, amelyet hat különböző cselédgén („housekeeping gene”) mRNS-expressziós szintjéhez normalizáltunk. PCR vizsgálatokat végeztünk enovinspecifikus láncindító oligonukleotidok alkalmazásával, 50 μΙ össztérfogatban, amely az alábbiakat tartalmazta: 5 μΙ cDNS-t, 1XGC cDNS-PCR reakciópuffert, 0,2 mmol/l dNTP-reagenst, 1 mol/l GC-MELT™-reagenst, 400 nmol/l PNHsp3 és PNHapI láncindító oligonukleotidokat és 1 μΙ Advantage LkenTaq polimerázelegyet. A mintákat 95 °C-ra hevítettük 30 mp-re, majd a ciklust az alábbi paraméterekkel végeztük, 35 cikluson keresztül: 30 mp-ig 95 ’C-on, 30 mp-ig 68 °C-on. A mintákat 1,2%-os (tömeg/térfogat) agarózgélen vizsgáltuk 1XTAE pufferben [40 mmol/l Tris-acetát, 1 mmol/l EDTA (nátriumsó) pH=8,3] és az etidium-bromiddal festett gélekről Eagle Eye II Videorendszerrel (Stratagene, La Jolla, CA, USA) képeket készítettünk. A humán eredetű neurturinnal és persephinnel végzett hasonlóságkeresés a naponta frissített EMBL/GenBank adatbankban olyan genomiális DNS-re vezetett, amely egy feltehetően új proteint kódol, amely hasonló a GDNF, NTN és PSP neurotróf növekedési faktorokhoz, és amelyet enovinnak neveztünk. Az adatbankban végzett további homológiakeresés az enovint kódoló régiót körülvevő genomiális DNS-szekvenciát alkalmazva expresszált szekvenciaszakaszok (EST) számos kiónját eredményezte, amelyek különböző, humán eredetű szövetekből származnak {prosztata epithelium [nyilvántartási szám: AA533512 (ID1322952)], tüdőkarcinóma [nyilvántartási szám: AA931637] és paratireoid tumor [nyilvántartási szám: AA844072]}. Ezek a kiónok olyan DNS-szekvenciát tartalmaznak, amelyek kívül esnek a GDNF-, PSPvagy NTN-proteinekkel való homológia régióján, de megerősítik, hogy az enovin expresszálódik normál- és tumoros szövetekben. Genomiális szekvencián alapuló láncindító oligonukleotidok (PNHsp3 és PNHapI) alkalmazásával végzett kezdeti PCR-amplifikálás eredményezett egy »500 bp méretű fragmentumot magzatból, magzati agyból, prosztatából, frontális kódexből, hipokampuszból, cerebellum-cDNS-ből és genomiális DNS-ből, de tüdőeredetű cDNS-ből nem. Ezen fragmentumok klónozása és szekvenciavizsgálata egy 474 bp méretű DNS-szekvenciát eredményezett, ez egy 139 aminosavat tartalmazó kikövetkeztetett proteinszekvenciára transzlálódott, amely magában foglalt hét konzervált ciszteint, ami a proteinek transzformáló növekedési faktorok β típusú családjának (TGF-β) minden tagjára jellemző [Kingsley, (1994)] (lásd az 1. ábrát). A szekvencia tartalmazott továbbá egy RXXR motívumot a prodomén hasítására (RAAR, a 23-26. aminosavpozícióban) [Barr, (1991)]. Hasonló hasítási hely található a GDNF-, NTN- és PSP-proteinekben, a prodoménszekvencia hasonló pozíciójában. Ha feltételezzük, hogy az enovinprodomén hasítása ezen a helyen történik in vivő, az érett EVN-proteinszekvencia 113 aminosavat tartalmaz és kalkulált molekulatömege 11 965 Da, izoelektromos pontja 11,8. Az érett szekvenciában egy potenciális N-glikozilezési hely található (NST a 121-123. pozícióban). Ráadásul számos olyan régió, amely a GDNF, NTN és PSP ismert neurotróf növekedési faktorok érett formái között konzerválódott, az enovinban szintén megtalálható (lásd a 2. ábrát). A 2. táblázat összefoglalja a GDNF-család tagjainak érett proteinszekvenciájának összehasonlításával kapott eredményeket a BESTFIT program alkalmazásával. Az azonosság és a hasonlóság százalékos mértékét mutatjuk. Az ebben az összehasonlításban alkalmazott GDNF, NTN, PSP és EVN érett szekvenciák az RXXR hasítási helyet követő első aminosavtól kezdődnek.

2. táblázat

Érett, humán eredetű GDNF-család tagjainak páronként! összehasonlítása a BESTFIT program alkalmazásával

Összehasonlítás	Azonosság, %	Hasonlóság, %
EVN vs GDNF	38,8	47,2
EVN vs NTN	51	56,1
EVN vs PSP	53,3	57,8
GDNF vs NTN	44,8	57,3
GDNF vs PSP	44,3	50
NTN vs PSP	50	54,4

Ebből az összehasonlításból nyilvánvaló, hogy az érett enovinprotein közelebbi rokonságban áll a PSPés NTN-proteinekkel, mint a GDNF-proteinnel.

Frontális kódexből származó, cDNS-eredetű, nagyobb enovin-DNS-szekvenciafragmentum amplifikálása, klónozása és szekvenciavizsgálata genomiális EMBL/GenBank szekvenciára (nyilvántartási szám: AC0055038) alapozott láncindító oligonukleotidokat alkalmazva, egy 819 bp méretű szekvenciát eredményezett (lásd a 3. ábrát).

Ez a szekvencia tartalmaz egy feltételezett ATG startkodont a 30-32. nukleotidpozícióban, és olyan nyitott leolvasási keretet (a 3. ábra szerinti A. leolvasási keret) eredményez, amely a 285-287. nukleotidpozícióban található stopkodonig terjed. Ezen régió transziáit aminosavszekvenciája nem mutat hasonlóságot az adatbázis egyetlen ismert proteinjével sem. A második leolvasási keretben (a 3. ábra szerinti B. leolvasási keret) található cDNS-szekvencia transzlációja egy 159 aminosavból álló kikövetkeztetett aminosavszek11

HU 226 073 Β1 venciát eredményezett. Ez a szekvencia tartalmazza az RXXR hasítási helyet (B43-B46. pozíció; 460-471. nukleotidpozíció) és az érett enovinszekvenciának megfelelő szekvenciát (B47-B159. pozíció; 472-810. nukleotidpozíció). A nyitott leolvasási keret, amely magában foglalja az RXXR hasítási helyet és az érett enovint kódoló szekvenciát, a 334. pozíciószámú nukleotidtól (ezt egy kereten belüli stopkodon előzi meg) a 811-813. pozícióban található stopkodonig terjed, de nem tartalmaz egy kiindulómetioninnak megfelelő ATG-kodont. A PSP-protein analógiájára [Milbrandt és munkatársai, (1998)] feltételezzük, hogy egy nem vágott intron található az EVN-génről készült mRNStranszkriptumok többségén. A GDNF- és NTN-proteinekben szintén található egy intron a prodomént kódoló régiójukban [Matsushita és munkatársai, (1997); Heuckeroth és munkatársai (1997)].

Hogy megvizsgáljuk az enovin különböző mRNStranszkriptumainak létezését, RT-PCR vizsgálatokat végeztünk úgy, hogy a következő módon elhelyezett láncindító oligonukleotidokat alkalmaztuk: egyrészt az enovint kódoló szekvencia 5’-végén, éppen 5’-irányban egy lehetséges 5’-végi ATG-startkodon mellett a PNHsp5 láncindító oligonukleotidot (5’-GCA AGC TGC CTC AAC AGG AGG G-3'), és a beágyazott („nested”) PNHsp6 láncindító oligonukleotidot (5'-GGT GGG GGA ACA GCT CAA CAA TGG-3’), másrészt a 3'-végen a PNHapI láncindító oligonukleotidot és a beágyazott PNHap2 láncindító oligonukleotidot (lásd az 1. táblázatot).

A vizsgálatokat humán eredetű, többféle szövetből származó cDNS-paneleken (Clontech MTC I és II panelek), magzatiszív-cDNS-könyvtáron (Clontech) és humán eredetű cerebellum-, hipokampusz- vagy frontáliskortex-eredetű cDNS-en végeztük [Masure és munkatársai, (1998)]. A primer PCR vizsgálatokat a PNHsp5 és PNHapI láncindító oligonukleotidokkal végeztük, GC-gazdag körülmények mellett (Advantage GC-PCR készlet, Clontech), 30 cikluson keresztül (95 °C - 30 mp, 60 °C - 30 mp, 72 °C - 1 perc), amint azt ismertettük. Az illesztett PCR vizsgálatokat a primer PCR-termék 1 μΙ-én végeztük, a PNHsp6 és PNHap2 láncindító oligonukleotidok alkalmazásával, azonos körülmények mellett, 30 cikluson keresztül. A kapott PCR-termékeket 1,5%-os agarózgélen vizsgáltuk, és azok mérete -350-800 bp tartományba esett. A gélből számos csíkot megtisztítottunk és a PCR-fragmentumokat közvetlenül megszekvenáltuk. Néhány tisztított PCR-terméket meg is klónoztunk a pCR2.1-TOPO (TOPO-TA klónozókészlet, Invitrogen) vektorban, majd megszekvenáltuk. A szekvenciavizsgálat megerősítette különböző, enovinszekvenciát tartalmazó mRNS-molekulák létezését. A kapott fragmentumszekvenciákat összehasonlítottuk a genomiális enovinszekvenciákkal. Ez lehetővé tette számunkra számos lehetséges 5' és 3’ vágási hely azonosítását a genomiális szekvenciában (lásd a 21. ábrát). Ezen vágási helyek mindegyike a donor- és akceptorvágási helyek konszenzusszekvenciájának felelnek meg. A különböző, azonosított enovinvágási variánsokat és különböző humán eredetű szövetekben való előfordulásukat foglalja össze a 22. ábra. Az öt szekvenált transzkript közül csak kettő eredményezett funkcionális enovinproteint a startkodontól kiinduló transzlációt követően. A két transzkriptum egyike 228 aminosavat tartalmazó proteint kódol, 47 aminosavból álló kikövetkeztetett szignálpeptiddel, a másik 220 aminosavat tartalmazó proteint kódol, 39 aminosavból álló kikövetkeztetett szignálpeptiddel. A két variáns kikövetkeztetett aminosavszekvenciáját a 23. ábra (hosszú variáns) és a 24. ábra (rövid variáns) mutatja. A hosszú variáns kikövetkeztethető a 21. ábra szerinti DNS-szekvenciából úgy, hogy kivágjuk az első intront az 5’—1 és 3’—1 pozíciókban, és a második intront az 5’-2 és 3’-3 pozíciókban. A nyitott leolvasási keretet transzlálva, megkapjuk a 23. ábra szerinti kikövetkeztetett aminosavszekvenciát. A rövidebb variánst kikövetkeztethetjük a 21. ábra szerinti DNS-szekvenciából úgy, hogy kivágjuk az első intront az 5’—1 és 3’—2 pozíciókban, és a második intront az 5’-2 és 3’-3 pozíciókban. A nyitott leolvasási keretet transzlálva, megkapjuk a 24. ábra szerinti kikövetkeztetett aminosavszekvenciát.

Úgy tűnik, a leghosszabb transzkriptum fordul elő a legnagyobb mennyiségben a legtöbb szövetben, amint azt a 22B. ábrán látható csík intenzitásából megítéltük. A rövidebb transzkriptumok kereteltolódást mutatnak, és olyan transziáit proteint eredményeznek, amelyből hiányzik az érett enovin azon aminosavszekvenciája, amely homológiát mutat a GDNF-, NTN- és PSP-szekvenciákkal. A két legkisebb transzkriptumból az érett kódolószekvencia egy része, és a hét, magas fokban konzervált ciszteinből kettő hiányzik. Funkcionális enovin-mRNS csaknem minden szövetben expresszálódik, például agyban, szívben, vesében, májban, tüdőben, hasnyálmirigyben, vázizomban, vastag- és vékonybélben, perifériásvér-eredetű fehérvérsejtekben, lépben, tímuszban, prosztatában, herékben, petefészekben, placentában és magzati szívben. Néhány humán eredetű szövetben (például cerebellum, hipokampusz) csak nem funkcionális transzkriptumokat tudtunk amplifikálni PCR eljárással. Tudomásunk szerint, nem funkcionális mRNS-transzkriptumok ilyen mértékű előfordulását még nem ismertették. Ezen felfedezés biológiai jelentőségét még tanulmányozni kell. Bár az NTN és PSP különböző szövetekben történő expresszálódását nem teljesen jellemezték, azok expressziós szintje sokkal alacsonyabbnak tűnik, és az expresszálódás nagyobb mértékben korlátozódik néhány szövetre [Kotzbauer és munkatársai, (1996); Milbrandt és munkatársai, (1998)].

Az enovin rekombináns expresszálódása E. coliban, enovin expressziós plazmid előállítása Egy 414 bp méretű PCR-fragmentumot amplifikáltunk humán eredetű genomiális DNS-ből a PNHsp4 és PNHap2 (lásd az 1. táblázatot) láncindító oligonukleotidokat alkalmazva, és pCR2.1-TOPO vektorba klónoztuk TA-klónozással (Invitrogen). Az inszert szekvenciáját szekvenciavizsgálattal megerősítettük. Az enovin konszenzusszekvenciát tartalmazó inszertet tartalmazó kiónt (36-os klón) alkalmaztuk expressziós plazmid

HU 226 073 Β1 előállítására, öt vessző végükön megfelelő restrikciós helyeket tartalmazó láncindító oligonukleotidokat terveztünk. A PNHexp-sp1 (5'-GCG GAT CCG GCT GGG GGC CCG GGC A-3’) előre láncindító oligonukleotid egy BamHI restrikciós helyet tartalmazott (aláhúzva), a PNHexp-ap1 (5’-GCC TCG AGT CAG CCC AGG CAG CCG CAG G-3') reverz láncindító oligonukleotid egy Xhol restrikciós helyet tartalmazott (szintén aláhúzva). Ezeket a láncindító oligonukleotidokat alkalmazva, az érett enovint kódoló (az 1. ábrán a 81-422. pozíció), 343 bp méretű fragmentumot amplifikáltuk a 36-os klónból. A PCR vizsgálatot 50 μΙ össztérfogatban végeztük, amely 1XGC cDNS-PCR reakciópuffert, 0,2 mmol/l dNTP-reagenst, 1 mol/l GC-MELT™-reagenst, 200 nmol/l PNHexp-sp1 és PHNexp-ap1 láncindító oligonukleotidot, 1 μΙ Advantage KlenTaq polimerázelegyet és 10 ng, a 36-os klónból származó DNS-t tartalmazott. A mintákat 94 °C-ra hevítettük 5 percig, majd 25 ciklust végeztünk az alábbi paraméterek szerint: 45 mp-ig 94 °C-on, 1 percig 58 °C-on, és 30 mp-ig 72 °C-on, majd egy utolsó lépésben 7 percig 72 °C-on. Az így kapott 50 μΙ terméket Qiaquick PCR tisztítókészlet (Qiagen) alkalmazásával tisztítottuk és a DNS-t 30 μΙ térfogatban eluáltuk. Ennek a tisztított terméknek 25 μΙ-ét emésztettük 30 μΙ reakcióelegyben 10 E BamHl és 10 E Xhol enzimekkel 1XB pufferrel (Boehringer Mannheim), 1 órán át, 37 °C-on. A terméket elektroforézisnek vetettük alá, 1%-os (tömeg/térfogat) agarózgélben, 1XTAE pufferben [40 mmol/l Tris-acetát 1 mmol/l EDTA (nátriumsó), pH=8,3], majd a várt, 353 bp méretű csíkot kivágtuk a gélből, és Qiaquick gélextrakciós készlettel tisztítottuk. Az így kapott fragmentumot a pRSETB vektorba (Invitrogen) ligáltuk, amelyet BamHI és Xhol enzimekkel linearizáltunk. Az így kapott plazmidkonstrukció (hEVNmat/pRSETB) inszertjét teljes szekvenciavizsgálattal ellenőriztük. Az így előállított konstrukció egy 146 aminosavat tartalmazó proteint kódol, amelynek kikövetkeztetett molekulatömege 15704 Da, beleértve egy NH₂-terminális Hisvéget, amelyet az érett enovint kódoló szekvenciához a keretbe fuzionáltattunk. Az így kapott protein terminális aminosavszekvenciája tehát MRGSHHHHHHGMASMTGG QQMGRDLYDDDDKDPAGGPGS (érett enovinszekvencia vastagon szedve, a 6XHis vég aláhúzva).

Enovin expresszáltatása BL21(DE3) E. colisejtekben

Az enovinprotein rekombinánseljárással történő előállítását alapjaiban úgy végeztük, amint azt Creedon és munkatársai (1997) ismertették NTN esetében, néhány módosítással. Rekombináns enovinprotein előállítása céljából, a hEVNmat/pRSETB plazmidot a BL21(DE3) E. coli-törzsbe (Novagen) transzformáltuk, amelyet 2XYT/ampicillin tápközegben (16 g/l tripton, 10 g/l élesztőkivonat, 5 g/l NaCI és 100 mg/l ampicillin) tenyésztettünk 30 °C-on (225 rpm) vagy 37 °C-on (300 rpm) 600 nm hullámhosszon mért 0,5-es értékig, az IPTG 0,2 mmol/l végkoncentrációban történő hozzáadása előtt, hogy indukáljuk az expressziót. Háromórás indukciós periódust követően sejtüledéket gyűjtöttünk centrifugálással, az üledéket foszfáttal puffereit fiziológiás konyhasóoldattal mostuk, centrifugáltuk és fagyasztva tároltuk. Tisztítás és visszahajtogatás céljából a sejtüledéket szonikációs pufferben [20 mmol/l TrisHCI, pH=8,0, 300 mmol/l NaCI, 1 mmol/l 2-merkaptoetanol, proteázinhibitorok (Complete™ proteázinhibitor koktéltabletta, Boehringer Mannheim, 1 tabletta/50 ml puffer) és 1 mg lizozim/500 mg sejtüledék] reszuszpendáltuk. A sejteket szonikálással roncsoltuk, és a zárványtesteket centrifugálással összegyűjtöttük. A zárványtesteket A pufferben oldottuk fel és inkubáltuk (8 mol/l urea, 20 mmol/l Tris-HCI, pH=7,6, 200 mmol/l NaCI, 1 mmol/l 2-merkapto-etanol) 30 percen át, 37 °C-on, mielőtt Ni-NTA gyantára (nikkel-nitrilo-triecetsav, Qiagen) vittük fel. Negyven percig, 37 °C-on történő rázatást követően, a mintákat egyszer mostuk A pufferben, majd felvittük egy 5 ml-es Ni-NTA oszlopra. Az oszlopot egymás után mostuk 10 oszloptérfogatnyi A pufferrel (pH=7,6), 10 oszloptérfogatnyi A pufferrel (pH=7,2), 10 oszloptérfogatnyi, 10 mmol/l imidazollal kiegészített A pufferrel (pH=7,2). Az enovint 4 oszloptérfogatnyi, 200 mmol/l imidazollal kiegészített A pufferrel (pH=7,2) eluáltuk.

Az enovin visszahajtogatását lépcsőzetes, éjszakán át tartó dializálással végeztük 4 °C-on, renaturáló pufferben (0,1 mol/l nátrium-foszfát, 0,15 mol/l NaCI, 3 pmol/l risztéin, 0,02% Tween-20, 10% glicerin, 0,01 mol/l Tris-HCI, pH=8,3), amely minden egyes lépcsőben csökkenő mennyiségű ureát tartalmazott (6, 4, 3, 2, 1, 0,5 és 0 mol/l ureát). A tisztított proteint szétmértük adagokra, -20 °C-on tároltuk, majd funkcionális vizsgálatokra alkalmaztuk.

Az enovingén kromoszomális lokalizációja

Az enovingén 3,3 kb méretű fragmentumát amplifikáltuk cerebellumeredetü cDNS-ből az EVN(7)-sp1 (5’TTC GCG TGT CTA CAA ACT CAA CTC CC-3’) és PNHapI (5’-GCA GGA AGA GCC ACC GGT AAG G-3') láncindító oligonukleotidok alkalmazásával, amelyeket az EMBL AC005038 nyilvántartási számú szekvencia alapján terveztünk. A PCR vizsgálatot 50 μΙ össztérfogatban végeztük, amely 1X Expand Long Template PCR-reakciópuffert (Boehringer Mannheim), 0,5 mmol/l dNTP-reagenst, 1 mol/l GC-MELT reagenst (Clontech Laboratories), 400 nmol/l EVN(7)-sp1 és PNHapI láncindító oligonukleotidot és 1 μΙ cerebellumeredetű cDNS-t tartalmazott. Kezdeti, 94 °C-on, 2 percig tartó hevítést követően, 0,75 μΙ Expand Long Template polimerázt (Boehringer Mannheim) mértünk be, és 10 ciklust végeztünk az alábbi paraméterek mellett: 10 mp-ig 94 °C-on, 30 mp-ig 58 °C-on és 3 percig 68 °C-on. Ezt követően, további 20 ciklust végeztünk, ciklusonként 20 mp-cel növelve a 68 °C-on történő inkubálást. Utolsó lépésként 7 percig inkubáltunk 68 °C-on. Az így kapott 3,3 kb méretű fragmentumot 0,8%-os agaróz/TAE gélen elektroforetizáltuk, tisztítottuk, majd pCR2 1-TOPO vektorba klónoztuk TA-klónozással (Invitrogen). Az egyik klón teljes szekvenciavizsgálata megerősítette, hogy a kapott cDNS-szekvencia megfelelt az EMBL-adatbázis szerinti genomiális szekvenciának (nyilvántartási szám: AC005038).

HU 226 073 Β1

A cerebellumeredetű cDNS-ből kapott cDNS-ben az intronokat nem vágtuk ki.

Kromoszóma-térképezési vizsgálatokat végeztünk fluoreszcens in situ hibridizálás (FISH)-vizsgálattal, lényegében ahogy azt már ismertették [Heng és munkatársai, (1992); Heng&Tsui, (1993)]. Humán eredetű limfocitákat tenyésztettünk 37 °C-on 68-72 órán át, mielőtt azokat 5-bróm-2'-dezoxi-uridinnal (BrdU) kezeltük, hogy a sejtpopulációban szinkronizáljuk a sejtciklust. A szinkronizált sejteket mostuk, és visszahelyeztük tenyészetbe 37 °C-on, 6 órán át. A sejteket összegyűjtöttük, majd tárgylemezmintákat készítettünk szokásos eljárással, amely magában foglalt hipotóniás kezelést, fixálást és levegőn történő szárítást. Az enovinra fajlagos 3,3 kb próbát biotiniláltuk és FISH-detektálásra alkalmaztuk. A tárgylemezeket 1 órán át 55 °C-on hőkezeltük, ribonukleázzal kezeltük és 2X NaCI/Cit pufferrel készített 70%-os formamiddal denaturáltuk (20X NaCI/Cit=3 mol/l NaCI, 0,3 dinátrium-citrát, pH=7) 2 percen át 70 °C-on, majd etanollal dehidráltuk. A próbát denaturáltuk, mielőtt rávittük volna a denaturált kromoszómákat tartalmazó tárgylemezekre. Éjszakán át tartó hibridizálást követően a lemezeket mostuk, majd a FISH-szignálokat, valamint a 4’,6-diamidino-2-fenilindol-csíkozási mintázatot külön-külön fotográfiás filmre rögzítettük, és a FISH-térképezési adatok, valamint a kromoszomális csíkok összevetése úgy történt, hogy a FISH-szignálok fölé helyeztük a 4’,6-diamidino-2-fenil-indol-reagenssel csíkozott kromoszómákat (Heng&Tsui). Az alkalmazott körülmények mellett, a próba hibridizálási hatásfoka 72%-os volt (100 vizsgált mitotikus alakzatból 72 mutatott szignált a kromoszómapárok egyikén). Mivel a 4’,6-diamidino-2-fenil-indolcsíkozást alkalmaztuk a specifikus kromoszóma azonosítására, a próbától származó szignál és az 1. kromoszóma rövid karja közötti egybeesést kaptunk. A részletes pozíciót tovább határoztuk, 10 fénykép összefoglalása alapján (4. ábra). Az alkalmazott feltételek mellett nem találtunk további lókuszt a FISH-detektálással, ennek megfelelően arra a következtetésre jutottunk, hogy az enovin a humán 1-es kromoszómán helyezkedik el, a p31.3-p32 régióban. A térképezési eredmények egy példáját képviseli a 4B. ábra.

A „National Center fór Biotechnology Information Center” (NCBI, http://www.ncib.nlm.nih.gov/genemap) gétérképének adatai alapján kikövetkeztethető, hogy az enovinszekvenciát tartalmazó genomiális klón (EMBL nyilvántartási száma AC005038) az 1-es kromoszómán helyezkedik el, a D1S2843 és D1S417 markerek között. Ez megfelel az 1-es kromoszóma p31.1-p32.3 régiónak, megerősítve a FISH-vizsgálattal kapott eredményeket.

Az enovin szöveti megoszlása Northern-blot- és dot-blot-vizsgálattal

Különböző humán eredetű szövetekből származó, 2 pg poli(A)-gazdag RNS-t tartalmazó Northern-blotokat (Clontech Laboratories, Palo Alto, CA, USA; MTN™ biot, MTN™ biot II és Fetal MTN™ biot II) hibridizáltattunk a gyártó utasításai szerint [a32P-dCTP random-láncindítással jelölt (HighPríme készlet, Boehringer Mannheim)] egy 897 bp méretű enovinfragmentummal. Ezt a fragmentumot PCR-amplifikálással kaptuk a PNHspl és PNHapI láncindító oligonukleotidokkal, frontáliskortex-cDNS-en, és amelyet a pCR2.1-TOPO vektorba klónoztunk. A fragmentum az enovinszekvencia 897 bázispárját tartalmazza a stopkodonig, és tartalmazza az érett enovinprotein teljes kódolószekvenciáját.

Az enovin-mRNS-t egy körülbelül 4,5 kb méretű fő transzkriptumként detektáltuk (5A-C. ábrák). EnovinmRNS expresszálódott egy sor szövetben, legprominensebben szívben, vázizomban, hasnyálmirigyben és prosztatában. Néhány kisebb méretű transzkriptum található például a placentában (4 kb, 2,4 kb és 1,6 kb) és a prosztatában (4 kb és 1,6 kb). Magzati szövetben egy prominens 2,4 kb transzkriptum található a májban és kisebb mértékben a tüdőben. Más transzkriptumok szintén jelen vannak a magzati vesében, májban, tüdőben és agyban.

Különböző humán eredetű szövetekből és fejlődési stádiumokból származó poli(A)-gazdag RNS-mesterblotot szintén hibridizáltattuk a 897 bp enovinpróbával. A biot végzéséhez alkalmazott poli(A)-gazdag RNSmintákat nyolc különböző cselédgén mRNS-expressziós szintjéhez normalizálta a gyártó. Az enovinmRNS minden szövetben expresszálódott, de a legmagasabb szintek láthatóan a prosztatában, hipofízisben, tracheában, placentában, magzati tüdőben, hasnyálmirigyben és vesében találhatók (5D-E. ábrák).

GFRa-lgG-Fc fúziós vektorok előállítása

GFRa-1 cDNS-régiót (27-427. aminosavat kódoló), GFRa-2 cDNS-régiót (20-431, aminosavat kódoló) és GFRa-3 cDNS-régiót (28-371. aminosavat kódoló) klónoztunk egy leolvasási keretbe a Signal plg plus (R&D Systems Europe Ltd.) expressziós vektorba, kivéve a szignálpeptidet, és a GPI-horgonyzásért felelős COOH-terminális hidrofób régiót kódoló szekvenciákat. Az ezekből a konstrukciókból expresszáltatott proteinek tartalmaznak egy 17 aminosav méretű CD33 szignálpeptidet, a GFRa-proteinrégiót és egy 243 aminosav méretű, COOH-termlnális humán lgG_rFc fúziós domént. CHO-sejteket transzferáltunk GFRa fúziós konstrukciókkal, és a stabilan transzferált sejteket 500 pg G418 reagens alkalmazásával szelektáltuk. Permanens kiónokat szelektáltunk Fc elleni ellenanyaggal. A GFRa fúziós proteinek tisztítása érdekében, a sejteket szérummentes tápközegben tenyésztettük, és a tápközeget 3 naponként összegyűjtöttük. A tápközeget centrifugáltuk, majd Protein A oszlopra (Protein A Sepharose, Pharmacia Biotech) vittük. A kötődött proteint 0,1 mol/l citráttal (pH=3) eiuáltuk és 1 mol/l Tris-pufferbe (pH=8,4) gyűjtöttük. A proteinek koncentrációját 280 nm hullámhosszon történő fényelnyelés alapján becsültük meg, 1,5 extinkciós koefficienssel számolva. Ezeket a tisztított GFRa-1, -2 és -3 Fc fúziós proteineket alkalmaztuk a kötési vizsgálatokhoz.

Felszíni plazmon-rezonanciavizsgálatok

Felszíni plazmonrezonancia („surface plasmon resonance: SPR)-vizsgálatokat végeztünk 25 °C-on, BIA14

HU 226 073 Β1 core 3000 berendezés alkalmazásával. A vizsgálatokat úgy végeztük, hogy az enovint és NGF-et immobilizált ligandumként alkalmaztuk. Egy F1 szenzorchip karboxilált mátrixát először aktiváltuk 1:1 arányban elegyített 400 mmol/l N-etil-N-(dimetil-amino-propÍI)-karbodiimid és 100 mmol/l N-hidroxi-szukcinimid reagensekkel 10 percen át. Ez után rekombináns enovint és NGF-et érintkeztettünk az aktivált felszínnel 10 mmol/l acetátpufferben (pH=4,5) 5 μΙ/perc átfolyási sebességgel. A szabad reaktív csoportokat 1 mol/l etanol-amin-hidrokloriddal inaktiváltuk. A kötési vizsgálatokhoz az oldható GFRa-1-3-Fc proteineket szuperfuzionáltattuk 10-100 nmol/l koncentrációban, HEPES-szel puffereit fiziológiás konyhasóoldatban (150 mmol/l NaCI, 3,5 mmol/l EDTA, 0,05% P20, 10 mmol/l HEPES, pH=7,4), 10 μΙ/perc átfolyási sebesség mellett. Az asszociációt 3 percen át monitoroztuk, a disszociációt 1 percen át, ezt regenerálás követte 5 mmol/l NaOH alkalmazásával. A disszociációt HEPES-szel puffereit fiziológiás konyhasóoldattal történő szuperfuzionáltatással iniciáltuk. BIAcore 3.0 kiértékelőszoftvert alkalmaztunk az asszociációs ráta (K_a), disszociációs ráta (K_d) és az ekvilibrium disszociációs konstans (K_D, amely a K_d/K_a hányados) kiszámolására.

SPR-eljárást alkalmaztunk oldható GFRa-1-3 proteinek immobilizált enovinhoz kötődésének mérésére. Specifikus kötődést az enovinhoz csak az oldható GFRa-3 proteinnel tudtunk kimutatni. A GFRa-1 és GFRa-2 proteinek nem kötődtek az immobilizált enovinhoz. A GFRa-3 esetében megfigyelt kötődés specifikus volt, mivel az NGF-hez nem történt kötődés. Egy külön kontrollvizsgálatban TrkA-Fc (NGF-receptor) specifikus kötődését észleltük az immobilizált NGFhez, de az immobilizált enovinhoz nem. Három különböző GFRa-3-koncentrációt alkalmazva kapott kötési görbékből az alábbi 3. táblázat szerinti konstansokat számoltuk.

3. táblázat

	K_a (1/Ms)	K_d(1/s)	K_d(M)
GFRa-3	1,65*10⁵	5,0810-	3,1*10-⁹

Mivel a GDNF-, NTN- és PSP-proteinek mindegyike segíti különböző típusú neuronális sejtek fenntartását és túlélését, előre látható volt, hogy az enovin hasonló biológiai hatással van idegsejtekre és valószínűleg más sejtekre is. Előre látható tehát, hogy az enovinprotein alkalmas lehet neurális rendellenességek kezelésére általában, amely rendellenesség lehet Parkinson-kór, Alzheimer-kór, perifériás neuropátia, amiotróf laterális szklerózis (ALS), Huntingdon-kór, akut agysérülés, idegrendszertumorok, sclerosis multiplex, perifériás idegek sérülése vagy traumája és neurotoxinoknak kitett állapot.

Az enovin alkalmazható továbbá a neuroprotekció különböző aspektusaiból. Figyelembe véve különböző neuronális sejtpopulációk túlélésére kifejtett hatását, valamint a megfigyelt neuritnyúlványokat az SHSY%Ysejt-modellünkben, javasoljuk, hogy ez a vegyület neuroprotektív és neuroregeneratív alkalmazást nyerjen.

Ez az alábbi megfigyeléseken alapul.

A taxol neuronális apoptózist okoz NGF-differenciált patkányeredetű PC12 feokromocitómasejtekben (Nuydens és munkatársai, közlésre beküldve). Ennek megfelelően, a taxol által indukált citotoxicitás a neuronális apoptózis jellemzőit mutatja, amint azt a DNSfragmentálódás, Annexin V jelölés és bcl-2-védelem mutatja. Ezért a fentieket kiterjesztve következtethetünk, hogy a taxol apoptózist indukál differenciált SH-SY5Y-sejtekben. Az enovinről kimutattuk, hogy csökkenti ezt a sejthalált, ezért visszafordíthat neuronális apoptózist általában.

Ez a protein ezért alkalmazható lehet az alábbi neurodegeneratív állapotokban, amelyekben apoptózist figyeltek meg: stroke [Hakim, (1998)], Parkinsonkór [Marsden és munkatársai, (1998)], Alzheimer-kór [Nagy és munkatársai, (1998)], Huntington-kór [Wellington és munkatársai, (1997)], neurotrauma [Smirnova és munkatársai (1998)] és perifériás neuropátiák [Srinivisan és munkatársai, (1998)].

Példaként a fenti utolsó klinikai indikációra, kimutattuk, hogy ez a neurotróf faktor valójában megvédi a differenciált, humán eredetű SH-SY5Y neuroblasztómasejteket a taxollal indukált sejttoxicitástól.

Eljárás életképesség mérésére

A sejtek életképességét úgy határoztuk meg, hogy egy sejttenyésztő lemez minden lyukába az alábbi reagenselegy 100 μΙ-ét mértük be: DMEM-tápközegben (37 °C) oldott, 0,02 mmol/l fenazin metoszulfát (PMS, Sigma) reagenssel kiegészített, 1 mg/ml 2,3-bisz[2-metoxi-4-nitro-5-szulfofenil]-2H-tetrazólium-5-karboxanilid (XTT, Sigma) reagenst. A lemezeket 37 °C-on inkubáltuk 2,5 órán át. Az optikai denzitásértékeket 450 nm hullámhosszon olvastuk le (Molecular devices), 650 nm-t alkalmazva referenciaként. Az XTT-vizsgálat az XTT tetrazóliumsó piros színű formazántermékké történő konverzióján alapul. Ezt a reakciót mitokondriális enzimek végzik.

Eljárás neuronális differenciálódás meghatározására

1. SH-SY5Y humán neuroblasztómasejtek differenciáltatása

SH-SY5Y-sejteket differenciáltattunk 5 napon át, 25 nmol/l staurosporintartalmú tápközegben. Az enovin hatását 72 órával a vizsgálat megkezdése után mértük, [lásd Jalava és munkatársai: „Protein kinase inhibitor staurosporin induces a mature neuronal phenotype in SH-SY5Y humán neuroblastoma cells through an a, b, z PKC independent pathway Journ. Cell Physiol. 155, 301-312 (1993).

2. Neuritnyúlványok mérése

Neuronok morfológiai változásait kvantitáltuk automatizált eljárással az alábbiak szerint. Megfelelő időpontokban, glutáraldehidet adtunk közvetlenül a tápközeghez, és hagytuk 30 percig szobahőmérsékleten. Ez a fixálás biztosította, hogy a sejtek morfológiája abban az időpontban a valós helyzetet tükrözték. A sejteket áteső fényben figyeltük meg egy Axiovert mikroszkóppal (Zeiss Oberkochen, Németország), amely egy Indy

HU 226 073 Β1 munkaállomással (Silicon Graphics, Mountain View, USA) vezérelt Marzhauser pásztázóállvánnyal („scanning stage”) volt felszerelve. Képeket egy MX5 videokamerával (HCS) készítettünk. Körülbelül 3000 sejtet értékeltünk ki, 64 illesztett felvételen, amely a képek 8*8-as négyzetes mátrixát képezték. A pontos illesztés biztosította, hogy a neuritok követhetők legyenek egyik képmezőből a másikba. A poliklonális tau-ellenanyaggal jelölt neuritnyúlványok automatizált detektálását görbe vonalú szerkezetek torzítatlan detektálására alkalmas detektorral végeztük [Steger, 1998)]. A vizsgálathoz alkalmazott szoftver automatikusan kiszámolta a teljes sejttest területét, a sejttestek számát és az összesített neurithosszt.

Hogy megvizsgáljuk az enovin hatását különböző sejttípusokra, két vizsgálatot végeztünk, egy DNS-szintézis-vizsgálatot, és egy kemotaxisvizsgálatot.

DNS-szintézis vizsgálata

Olyan sejteket, mint humán eredetű dermális fibroblasztokat (39SK), humán eredetű köldökzsinórvéna endotheliális sejteket (HUVEC), humán eredetű simaizomsejteket (HSMC), humán eredetű kondrocitákat és patkányeredetű oszteoblasztokat 10% fbs-t tartalmazó DMEM-tápközegben (39SK, HSMC, patkányeredetű oszteoblaszt) vagy definiált tápközegben (kondrociták és HUVEC) tenyésztettük 37 °C-on, 5% CO₂ és 95% levegő közegben. A DNS-szintézis vizsgálata esetén, a sejteket 96 lyukú szövettenyésztő lemez lyukaiba helyeztük 5000 sejt/lyuk denzitásban, 10% FBS-t tartalmazó DMEM-tápközegben, és 24 órán át inkubáltuk. A tápközeget ekkor lecseréltük különböző koncentrációjú enovint és 0,1% BSA-t tartalmazó DMEM-tápközegre (39SK, oszteoblaszt, HSMC és kondrociták esetében) vagy különböző koncentrációjú enovint és 0,5% FBS-t (HUVEC esetében) tartalmazó DMEM-tápközegre, majd a sejteket 24 órán át inkubáltuk. Ezt követően, a tápközeget lecseréltük 5% fbs-t és 0,1 μθ aktivitású [³H]-timídint tartalmazó DMEM-tápközegre. Két órán át tartó impulzusjelölés után a sejteket metanol/ecetsav eleggyel fixáltuk 1 órán át, szobahőmérsékleten. A fixált sejteket kétszer mostuk 80%-os metanollal. A sejteket 0,05%-os tripszinben (100 μΙ/lyuk) 30 percen át, majd 0,5%-os SDS-ben (100 μΙ) további 30 percen át szolubilizáltuk. A sejtlizátumokból vett mintákat (180 μΙ) 2 ml szcintillációs koktéllal elegyítettük, majd a sejtlizátumok radioaktivitását folyadékszcintillációs számlálóban mértük (Wallac 1409).

Kemotaxisvizsgálat

A sejteket a „DNS-szintézis-vizsgálat fejezetben ismertetettek szerint tenyésztettük. Az enovin kemotaktikus aktivitását 12 lyukú, módosított Boyden-kamra alkalmazásával vizsgáltuk [McQuillan, D. J., Handley, C. J., Campbell, M. A., Bolis, S„ Milway, V. E. és Herington, A. C: „Stimulation of proteoglycan biosynthesis by serum and insulin-like growth factor-l in cultured bovine articular cartilage, Biochem. J. 240, 423-430 (1986)]. A sejteket tripszinnel kezeltük, 0,05%-os tripszin és 0,5 mmol/l EDTA alkalmazásával, majd DMEMtápközegben szuszpendáltuk. Egy Boyden-kamra alsó kamráiba különböző koncentrációjú enovint tartalmazó tápközeg 150 μΙ-es adagjait mértük be. Az alsó kamrák fölé 0,1 mg/ml l-es típusú kollagénnel fedett polikarbonátmembránt (8 (pm) helyeztünk, majd hozzáillesztettük a felső kamrákat. A felső kamrákba 100 μΙ térfogatban sejteket mértünk be (70 000 sejt/ml). Hat órán át tartó ínkubálást követően, a készüléket szétszereltük. A membrán fölött maradt sejteket eltávolítottuk. A membránt 10% formaldehiddel 15 percen át fixáltuk, majd Gill-féle erős hematoxilinnel festettük. A sejteket mikroszkóp alatt számoltuk (250-szeres nagyítás mellett), és minden kamra öt látótémyi területének átlagos sejtszámát vettük figyelembe. Minden vizsgálatot legalább négyszer megismételtünk. Az eredményeket a kontrollérték többszöröseként fejeztük ki (0,1% BSA-t tartalmazó DMEM).

Amint azt a 8-18. ábrák mutatják, az enovin egyetlen alkalmazott sejttípus proliferációjára sincs hatással, sem a HUVEC-sejtek migrációjára (14. ábra), amint azt fent ismertettük. Hatást mutatott viszont az enovin az SH-SY5Y neuroblasztómasejtekre. Ez arra utal, hogy az enovin szelektív módon hat neuronális sejtekre.

Mind a GDNF-ről, mind az NTN-ről kimutatták, hogy egy olyan szignálkomplexen keresztül küld szignált, amely egy ligandkötő alegységet, a GFRa-1 vagy GFRa-2 receptort, és egy szignálalegységet, a tirozinkináz-cRET-proteint tartalmazza. Az enovinről feltételeztük, hogy biológiai hatását hasonló szignálkomplexen keresztül fejti ki, amely egy GFRa-kötő partnert (például a GFRa-1, GFRa-2, a nemrég karakterizált árva GFRa-3 receptor vagy más, a GFRa-család eddig még nem jellemzett tagja), a cRET-proteinnel, vagy más szignálpartnerrel kombinálva tartalmazza. Valójában kötési eredményeink adatai szerint az enovin specifikusan kötődik a GFRa-3 receptorhoz.

Emberekben, a GDNF- vagy cRET-proteinek csírasejt-mutációi számos betegség-fenotípushoz vezethetnek, például endokrin neoplázia multiplexhez vagy örökletes Hirschsprung-kórhoz (HSCR) [Romeo és munkatársai, (1994); Edery és munkatársai, (1994); Angrist és munkatársai, (1996)]. Mindkét betegségre jellemző a rendellenes bélmozgás, a Hirschsprung-kór pedig a leggyakoribb oka újszülöttek veleszületett bélobstrukciójának. Érdekes módon, GDNF- és cRETgén-kiütött („knock out) egerek hasonló kórtüneteket mutatnak, renális agenezissel és intesztinális aganglionózissal [Sanchez és munkatársai, (1996); Moore és munkatársai, (1996); Pichel és munkatársai, (1996)]. Az enovin szerepet játszhat a bél vagy vesék hasonló rendellenességeiben, vagy, mivel expresszálódása ubiquiter, fontos lehet a szervezet más perifériás szerveinek a fejlődésében. Ligandumok receptoraikkal történő kölcsönhatása általában mindkét protein adott csoportja közötti specifikus kötések kölcsönhatása révén valósul meg. Egy protein fragmentumai agonistaként szolgálhatnak, aktiválva a receptort, hogy kifejtse növekedést serkentő és túlélést fenntartó hatását sejtekre. Az enovin részei, vagy az enovin aminosavszekvenciáján alapuló szintetikus peptidek hasznosak lehetnek mint agonisták vagy antagonisták, az enovin GFRa-3 receptorának regulálásában. Peptidszintézis

HU 226 073 Β1 vagy rekombinánseljárások alkalmazásával olyan hibrid növekedési faktorokat állíthatunk elő, amelyek tartalmazzák a GDNF, NTN, PSP vagy bármely más neurotróf vagy növekedési faktor részét, az enovin részeivel kombinálva, hogy egy új szintetikus növekedési faktort kapjunk.

Két elővizsgálatot végeztünk annak megállapítására, hogy az enovin képes-e változtatni taxollal indukált szenzoríkus kiesésen, szubplantáris Injektálást követően, patkányokban. Az első vizsgálatban azt teszteltük, hogy enovinnal történő egyetlen kezelés visszafordítja-e a taxollal indukált szenzoríkus kiesést, míg egy második vizsgálatban azt teszteltük, hogy az enovin képes-e megelőzni a taxollal indukált kiesések kifejlődését.

Taxollal indukált szenzoríkus diszfunkció visszafejlődése az idő függvényében Háromszáz-háromszáznegyven gramm testtömegű, hím Sprague-DawIey-patkányokat alkalmaztunk. Az állatokat egyedi ketrecekben tartottuk, ad libitum élelem és vízellátással. A vizsgálat megkezdése előtt az állatokat szokásos megfigyelőketrecbe helyeztük, majd 15 perc megszokási idő után tűszúrásreflexet váltottunk ki. Ezt úgy végeztük, hogy az állat jobb mancsának plantáris felszínét tűvel stimuláltuk, és a tűszúrásra adott választ értékeltük, úgymint van (pontszámúi), valamint hiányzik (pontszám=0). Egy-egy alkalommal a procedúrát háromszor ismételtük, egy perc szünetet tartva két, egymást követő stimulus között; ezek szerint, a tűszúrásteszt a tűszúrásra adott reakció 3 mérését foglalja magában. Csak olyan patkányt vettünk be a vizsgálatba, amely a 3 tűszúrásra normális reakciót adott.

Három egymást követő nap reggelén, az állatok 50 μΙ taxolt (3 mg/ml kremoforban és dehidrált alkoholhoz adott vízben oldott paclitaxel) kaptak szubplantáris injekció formájában a jobb hátsó lábukba. A következő reggel újra kiváltottuk a tűszúrásreflexet, és kiválasztottuk azokat az állatokat, amelyek nem mutattak reaktivitást a 3 stimulus egyikére sem. Ezeket az állatokat random alcsoportokra osztottuk (n=10/csoport), amelyek jobb hátsó lábukba, szubplantáris injekció formájában, 75 μΙ térfogatban vivőanyagot vagy fiziológiás konyhasóoldatot, vagy 23 vagy 130 μg/ml enovint kaptak. Mivel a vivőanyaggal és a fiziológiás konyhasóoldattal kezelt állatok eredményei között nem figyeltünk meg különbséget, a két csoportot összevontuk (kontrollcsoport). Az utolsó kezelést követő 1., 4., 5. és 7. napon tűszúrástesztet végeztünk reggel (8 és 9 óra között) és délután (15.30 és 16.30 óra között). A 8. napon egy utolsó tűszúrástesztet végeztünk reggel. Minden egyes állat esetében, a tűszúrásra adott reakció kumulatív pontszámát mértük az idő függvényében. Mivel az utolsó drogkezelést követően összesen 9 tűszúrástesztet végeztünk (ezek mindegyike 3 tűszúrásból állt), a vizsgálat teljes időtartama alatt elérhető pontszám 27 volt.

Taxol 3 egymást követő napon ismételt szubplantáris injektálása akut gyulladásos reakciót eredményez, valamint az állatok többségében a tűszúrás-stimulációra adott válasz hiányával jár. Fiziológiás konyhasóoldat vagy vivőanyag szubplantáris injektálása nem befolyásolta a taxollal indukált kiesést. Az első méréskor a 20 kontroll közül csak 4 állat mutatott legalább 1 reakciót a 3 tűszúrásra, és a kontrollok átlagos (+/-SEM) tűszúrásreflex-pontszáma az első méréskor 0,25 (+/-0,25) volt; ez kontrasztot jelent a vizsgálat kezdetének pontszámához, ahol az átlagos pontszám 3,0 (+/-0,0) volt, mert minden állat válaszolt a tűszúrásra. Még a vizsgálat 8. napján is a kontrollok reaktivitása károsodott volt, 20 állatból 11 válaszolt legalább egyszer, és az átlagos tűszúrásreflex-pontszám 0,75 (+/-0,18) volt. A kontrollcsoporton belül egyetlen patkány sem mutatott normálreaktivitást mindhárom stimulusra. A kontrollok kumulatív tűszúrásreflex-pontszámait az idő függvényében a 19. ábra mutatja. Mivel az állatokat kilencszer teszteltük a 8 napos időtartam alatt, az alkalmankénti 3 tűszúrással elérhető maximális pontszám 27 volt. Amint az ábrán látható, fiziológiás konyhasóoldat vagy vivőanyag szubplantáris injektálása nem volt képes visszafordítani a taxollal indukált kiesést a vizsgálat időtartama alatt. A vizsgálat végén a kontrollok átlagos összes kumulatív pontszáma 5,10 (+/-0,87) volt; ez 18,9%-a az elérhető maximális pontszámnak.

Hetvenöt μΙ, 23 μg/ml enovin egyszeri szubplantáris injektálása azt eredményezte, hogy az első mérés után 10 állatból 4 legalább egyszer válaszolt, az átlagos tűszúrásreflex-pontszám 0,70 (+/-0,33) volt. A 8. napon mind a 10 állat legalább egyszer válaszolt a tűszúrásra, és 10 állatból 5 normálreaktivitást mutatott. Ebben a csoportban az átlagos tűszúrásreflex-pontszám a 8. napon 2,20 (+/-0,29) volt. A kontrollokhoz viszonyítva, az átlagos kumulatív pontszám a vizsgálat 8. napján szignifikáns mértékben emelkedett (Mann-Whitney-Uteszt, kétcsúcsú, p<0,01) elérve a 14,50 (+/-1,96) átlagos tűszúrásreflex-pontszámot. Ez a maximális pontszám 53,7%-a.

Százharminc pg/ml enovin szubplantáris injektálásával szintén javulást értünk el a kontrollokhoz képest. A 130 pg/ml enovin beadása utáni első mérésnél 10 állatból 6 válaszolt legalább egyszer, az átlagos tűszúrásreflex-pontszám 1,1 (+/-0,35) volt. A 8. napon mind a 10 állat válaszolt legalább egyszer a tűszúrásra, 2,60 (+/-0,22) átlagos pontszámmal. Tíz állatból 8 normálreaktivitást mutatott a 3 szúrásra. Az átlagos kumulatív összes tűszúrásreflex-pontszám a vizsgálat végén ennél a csoportnál 17,20 (+/-1,94) volt. Ez az összes elérhető pontszám 63,7%-a, és szignifikánsan magasabb a kontrollcsoporthoz viszonyítva (p<0,01).

Taxollal indukált szenzoríkus diszfunkció megelőzése az idő függvényében Háromszáz-háromszáznegyven gramm testtömegű, hím Sprague-DawIey-patkányokat alkalmaztunk. Az állatokat egyedi ketrecekben tartottuk, ad libitum élelem és vízellátással. A vizsgálat megkezdése előtt, az állatokat szokásos megfigyelőketrecbe helyeztük, majd 15 perc megszokás! idő után tűszúrásreflexet váltottunk ki. Ezt úgy végeztük, hogy az állat jobb mancsának plantáris felszínét tűvel stimuláltuk, és a tűszú17

HU 226 073 Β1 rásra adott választ értékeltük, úgymint van (pontszámú), valamint hiányzik (pontszám=0). Egy-egy alkalommal a procedúrát háromszor ismételtük, egy perc szünetet tartva két, egymást követő stimulus között; ezek szerint, a tűszúrásteszt a tűszúrásra adott reakció 3 mérését foglalja magában. Csak olyan patkányt vettünk be a vizsgálatba, amely a 3 tűszúrásra normális reakciót adott (tűszúrásreflex-pontszám=3).

Ezt a kontrollmérést követően az állatokat random alcsoportokra osztottuk (n=10/csoport), amelyek jobb hátsó lábukba, szubplantáris injekció formájában, 75 μΙ térfogatban vivőanyagot vagy fiziológiás konyhasóoldatot, vagy 23 vagy 130 pg/ml enovint kaptak. Mivel a vivőanyaggal és a fiziológiás konyhasóoldattal kezelt állatok eredményei között nem figyeltünk meg különbséget, a két csoportot összevontuk (kontrollcsoport). Három egymást követő napon, az állatok naponta 50 μΙ taxolt (kremoforban, dehidrált alkoholban és vízben oldott, 3 mg/ml paclitaxel) kaptak szubplantáris injekció formájában, a jobb hátsó lábukba. A taxol beadását követő 1., 4., 5. és 7. napon tűszúrástesztet végeztünk reggel (8 és 9 óra között) és délután (15.30 és 16.30 óra között). A 8. napon egy utolsó tűszúrástesztet végeztünk reggel. Minden egyes állat esetében, a tűszúrásra adott reakció kumulatív pontszámát mértük az idő függvényében. Mivel az utolsó taxollal történő kezelést követően összesen 9 tűszúrástesztet végeztünk (ezek mindegyike 3 tűszúrásból állt), a vizsgálat teljes időtartama alatt elérhető maximális pontszám 27 volt.

A taxol előtt beadott fiziológiás konyhasóoldat vagy vivőanyag nem gátolta a taxollal indukált kiesést a tűszúrásreflex-vizsgálatban. A taxol beadását követő első méréskor 20 patkányból 8 válaszolt legalább egyszer a tűszúrásra, az átlagos tűszúrásreflex-pontszám 0,60 (+/-0,18) volt. A 8. napon a taxollal indukált kiesés még megfigyelhető volt, a 20 patkányból csak 8 válaszolt, az átlagos pontszám 0,80 (+/—0) volt. Két patkányban normalizált tűszúrásreflexet tapasztaltunk. Az idő múltával a kumulatív tűszúrásreflex-pontszám szintén csökkent, az átlagérték 6,55 (+/-1,08) volt, amely a maximális pontszám 24,3%-a (20. ábra).

Az enovinnal (23 pg/ml) történt előkezelés csökkentette a taxollal indukált kieséseket a tűszúrásreflexteszt szerint. Az 1. napon, 10 patkányból 1 válaszolt legalább egyszer, és az átlagos tűszúrásreflex-pontszám 1,7 (+/-0,40) volt. A 8. napon minden állat válaszolt, az átlagos pontszám 2,50 (+/-0,27) volt. Ebben a csoportban 7 állat mutatott normálreaktivitást minden tűszúrásra. Az idő függvényében észlelt kumulatív választ tekintve (20. ábra), az átlagos összes pontszám szignifikáns mértékben emelkedett (p<0,01) a kontrollérték fölé, 18,40 (+/-1,73) értékre, amely a maximális érték 68,1%-a.

Összehasonlítható eredményeket kaptunk 130 pg/ml enovinnal történt előkezelést követően. Ebben a csoportban, 10 patkányból 6 válaszolt az első tesztelésnél, az átlagos tűszúrásreflex-pontszám 1,70 (+/-0,31) volt. A 8. napon, minden állat legalább egyszer válaszolt a tűszúrás-stimulálásra, az átlagos pontszám 2,40 (+/-0,22) volt, és az állatok felében mindhárom reakció normális volt. Ami a kumulatív pontszámot illeti, a 8. napon kapott átlagos pontszám 17,7 (+/-1,92) volt, ami az összes pontszám 65,5%-át teszi ki.

Ezen vizsgálatsorozat eredményei arra utalnak, hogy egyetlen szubplantáris enovininjekció képes enyhíteni a taxollal indukált szenzorikus kieséseket, amint azt tűszúrásreflexteszttel kimutattuk. Bemutattuk az enovin aktivitását taxollal történő kezelés előtt, és után.

Az enovin egy lehetséges hatóanyagjelölt elsősorban perifériás és centrális neurogén komponensű fájdalomszindrómák, reumatikus/gyulladásos betegségek, valamint ingervezetési rendellenességek kezelésére, és modulációs szerepet játszhat szenzorikus folyamatokban transzdermális, topikális, lokális, centrális (például epidurális, intratracheális és hasonló) és szisztémás beadást követően.

Az enovin alkalmazható lehet továbbá diagnosztikai eszközként, patofiziológiai változások szűrésére, a fent említett területeken.

Enovin-mRNS expressziójának összehasonlítása normál- és beteg szövetekben

Enovin-mRNS kvantitatív expresszióját vizsgáltuk

ABI Prism 7700 Sequence Detection System (TaqMan; Perkin-Elmer) alkalmazásával a Pharmagene Laboratories Ltd (Royston, Egyesült Királyság) által kifejlesztett és kivitelezett, egyúttal a tulajdonát képező eljárással. A rendszer fluorogénpróbát alkalmaz szekvenciaspecifikus fluoreszcensszignálok gerjesztésére PCR alatt. A próba egy fluoreszcensriporterrel és kioltó („quencher)-festékkel toldott oligonukleotid, amely az előre és reverz PCR-láncindító oligonukleotidok között helyezkedik el. Érintetlen állapotban, a fluoreszcensriporter intenzitását elnyeli a kioltófesték. Amennyiben a próba egy replikációs komplex részévé válik, a fluoreszcensriportert lehasítja a kioltófestékről egy 5'-től 3’-irányú exonukleázaktivitás, amely benne van a Taqpolimerázban. A fluoreszcens riporterszignál fokozódása egy reakción belül közvetlenül mutatja a PCR-termék akkumulációjának mértékét. Egy mRNS-célszekvencia (Cn) kiindulási kópiaszámát úgy határozzuk meg, hogy meghatározzuk azon frakcionális PCR-ciklusszámot, amelynél egy PCR-terméket először detektálunk - a pont amelynél a fluoreszcensszignál meghalad egy alapvonal-küszöbértéket. Cél-mRNS-ek mennyiségének a kvantitatív meghatározását minden egyes mintából úgy végezzük, hogy az experimentális Ct-értékeket standard görbével hasonlítjuk össze.

RNS előállítása és a minőség ellenőrzése

Teljes RNS-t izoláltunk egész és tovább boncolt szövetekből, Tri-zol- reagens alkalmazásával (Life Technologies, Gaithersburg, MD, USA) a gyártó ajánlásai szerint. A minden RNS-minta esetében elvégzett minőségi ellenőrzés magában foglalta az integritás felbecsülését (intakt 18S és 28S riboszomális RNS), valamint nagy mennyiségben előforduló (aktin) és kis mennyiségben előforduló (transzferrinreceptor) transzkriptumok jelenlétének a meghatározását.

Láncindító oligonukleotid/próba tervezése

Egy láncindító oligonukleotidpárt és egy TaqManpróbát terveztünk az enovin egy speciális szekvenciájának amplifikálására:

HU 226 073 Β1 amelyet vizsgáltunk. Minden állapot esetében három beteg és három kontrollmintát analizáltunk.

1. láncindító oligonukleotid: 5’-ACGGTTCTCCAGGTGCTGT-3’

3. láncindító oligonukleotid: 5'-TGCTGCCGACCCACG-3’

5. próba: 5'-CTACGAAGCGGTCTCCTTCATGGACG-3’

Ezen túlmenően, terveztünk egy láncindító oligonukleotidpárt és egy TaqMan-próbát amely átfed egy intront és amplifikálja a humán eredetű GAPDH-gén egy részét:

2. láncindító oligonukleotid: 5'-CAGAGTTAAAAGCAGCCCTGGT-3'

4. láncindító oligonukleotid: 5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGTCAAC-3’

6. próba: 5'-TTTGGTCCGTATTGGGCGCCT-3’

Az 5. próbát a fluor-FAM reagenssel, míg a 6. próbát a fluor-VIC reagenssel jelöltük.

A teljes RNS kezelése dezoxiribonukleázenzimmel

Minden egyes vizsgált szövet esetében 2,2 pg teljes RNS-t emésztettünk RNáz-mentes DNáz-zal (Gibco BRL) 15 percen át, szobahőmérsékleten, 20 pl térfogatnyi 1x DNáz-pufferben (Gibco BRL). A reakciót 2 μΙ, 25 mmol/l EDTA-oldat hozzáadásával állítottuk le. A mintákat ezután 10 percen át, 65 °C-on inkubáltuk, hogy az enzimet inaktiváljuk.

Első cDNS-szál szintézise

Minden egyes vizsgált szövet esetében 100 ng teljes RNS-t alkalmaztunk templátként a cDNS első szál szintéziséhez. Az RNS-t 4 ml térfogatban, 50 nmol/l 1. és 2. láncindító oligonukleotid, 1x PCR-puffer II (Perkin-Elmer) és 5 mmol/l MgCI₂ jelenlétében 72 °C-on hevítettük 5 percen át, majd lassan hűtöttük 55 °C-ra. Miután minden egyéb reagenst hozzáadtunk a 6 ml térfogatú reakcióelegyet 48 °C-on inkubáltuk 30 percen át, majd az enzimet 90 °C-on inaktiváltuk 5 percen át. A végső reakcióelegy az alábbi volt: 1X PCR-puffer II, 5 nmol/l MgCI₂, 1 mmol/l dATP, dTTP, dGTP, dCTP, 12,5 egység MuLV reverz transzkriptáz (Gibco BRL).

Az első cDNS-szál-termékek PCR-amplifikálása

Minden egyes minta esetében, 100 ng teljes RNSből származó cDNS-t tettünk ki PCR-amplifikálásnak egyetlen reakcióban, hogy azonosítsuk a cél- és GAPDH-transzkriptumokat. A cél esetében a végső láncindító oligonukleotid/próba koncentrációk 300 nmol/l 3-as láncindító oligonukleotid és 200 nmol/l 5-ös próba volt, a GAPDH esetében 20 nmol/l 4-es primer és 100 nmol/l 6-os próba volt. A reakcióelegyben az egyéb reagensek végkoncentrációja az alábbi szerint alakult: 4,5% glicerol, 1X TaqMan-puffer A (Perkin-Elmer), 6,25 mmol/l MgCI₂, 430 nmol/l dATP, dUTP, dGTP, dCTP, 2,5 egység AmpliTaq Gold. A PCR-amplifikálást az ABI 7700 szekvenciadetektálási rendszerben végeztük, egy kezdeti enzimaktiválási lépést (12 perc, 94 °C-on) követően 45 ciklust végeztünk, 15 mp-ig 94 °C-on, és 1 percig 60 °C-on (minimális ’ramp’ idő).

Betegségek és vizsgált szövetek

Enovin-mRNS expresszióját hasonlítottuk össze beteg egyénekből, valamint normális kontroliegyénekből származó szövetekben (25. és 26. ábra). Az alábbi táblázat mutatja a betegséget és a megfelelő szövetet,

Betegség	1. szövet	2. szövet	3. szövet
Alzheimer- kór	temporális kortex	hipokam- pusz	okcipitális kortex
Sclerosis multiplex	gerincvelő	periventrikulásis fehér anyag	cerebellum
Parkinson- kór	substantia nigra	putamen	cerebellum
Rák	vastagbél- karcinóma	emlőtej- csatorna- adenokar- cinóma	tüdő pikkelysejtes karcinóma

Statisztikai analízis

Mindhárom szövetcsoport esetében, az átlagot és a standard deviációt a Ct-értékeken (amelyek normáleloszlást mutatnak) számoltuk ki, majd Cn-értékekre konvertáltuk az alábbi képlet szerint:

Cn=10[(^CM0007)^/-³·⁶²³]

A varianciaanalízist szintén a Ct-értékeken végeztük, hogy összehasonlíthassuk az átlagos enovin-mRNS expressziós szinteket beteg és normálszövetekben.

A 25. és 26. ábra mutatja az átlagos enovin-mRNS kópiaszámokat (+/-SD; n=3) beteg és kontrollszövetekben. A statisztikai analízis az enovin expressziós szintjének szignifikáns emelkedését mutatta sclerosis multiplexben szenvedő egyének periventrikuláris fehér anyagában (p=0,013). A belső GAPDH-kontroll nem mutatott szignifikáns különbséget (p=0,79). Bár az enovin expressziós szintje a periventrikuláris fehér anyagban igen alacsony normálszövetben (átlagban 270 kópia per 100 ng teljes RNS, szemben a 200 000 GAPDH-kópiával), ez a szint háromszor magasabb (825 kópia) sclerosis multiplexben szenvedő egyénekben.

Csak egyetlen másik beteg szövet mutatott szignifikáns különbséget a normálkontrolihoz képest: emlőtejvezeték-adenokarcinóma esetében az enovin-mRNS expressziós szintje hatszor magasabb volt (6000 kópia 1000-rel szemben; p=0,007), azonban a GAPDH-kontroll értéke szintén szignifikáns mértékben emelkedett (165 000 kópia szemben 44 000-rel; p=0,03), ami valószínűleg az mRNS-szintek általános emelkedésére utal.

Összefoglalva, azt tapasztaltuk, hogy az enovinmRNS szintek expressziója fokozódott („upregulated) sclerosis multiplexben szenvedő egyének periventrikuláris fehér anyagában.

Foszfospecifikus ellenanyaggal végzett sejtalapú

ELISA alkalmazása enovinmimetikumok szűrésére

GFRa-3/cRET receptorkomplexeken

Az eljárás alkalmazható más neurotrofinreceptorok, például GFRa-1, GFRa-2, GFRa-4, TrkA, TrkB vagy TrkC agonlstáinak és antagonistáinak azonosítására.

Ezt a vizsgálatot alkalmazva, azonosíthatjuk neurotróf növekedési faktorok agonistáit vagy antagonistáit azáltal, hogy mérjük a kulcs szignálküldő kinázok aktiválódását, amelyek a neurotróf anyagcsereútban akti19

HU 226 073 Β1 válódtak, vagy mérjük a cRET-receptorkináz aktiválódását. Az aktiválódást úgy mérjük, hogy foszfospecifikus ellenanyagokkal detektáljuk a foszforilált kináz vagy receptorkináz mennyiségét. A vizsgálatban NIH 3T3 sejteket alkalmaztunk amely tranziens vagy permanens módon expresszál TrkA, TrkB, TrkC, GFRa-1/cRET, GFRa-2/cRET, GFRa-3/cRET, GFRa-4/cRET komplexeket. A p42/p44 MAP, PKB, c-jun, CREB, JNK/SAPK kinázok és más kinázok aktiválódását kereskedelmi forgalomban kapható foszfospecifikus ellenanyagokkal határoztuk meg. Ezen túlmenően, a cRET aktiválódása foszfospecifikus ellenanyagokkal kiiktatható.

A vizsgálatot az alábbiak szerint végeztük:

- Kihelyeztünk NIH 3T3 sejteket 96 lyukú szövettenyésztő lemezre, 10% borjúszérumban, a sejteknek 80% benőttséget kell elérni a stimuláció előtt.

- A következő napon a tápközeget kicseréltük szérummentes tápközegre, a sejteket 18-24 órán át éheztettük.

Éheztetés után stimuláltuk a sejteket vegyületekkel és neurotróf faktorokkal pozitív kontrollként (neurotróf faktorok esetében 10 ng/ml).

- A sejteket 4%-os formaldehid-PBS-ben fixáltuk 4 ’C-on, 20 percig.

- A sejteket 3* mostuk 200 μΙ PBS/0,1% Triton oldattal 5 percig.

-A sejteket csillapítottuk („quench”) 100 μΙ 0,6%-os H₂O₂-reagenssel PBS/0,1% Triton oldatban, 20 percen át.

- A sejteket 3* mostuk 200 μΙ PBS/0,1% Triton oldattal 5 percig.

-A sejteket blokkoltuk 100 μΙ borjúszérummal PBS/0,1% Triton oldatban 60 percen át.

- Inkubáltuk a sejteket foszfospecifikus ellenanyaggal 50 μΙ térfogatban, 5% BSA/PBS/0,1% Triton oldatban, éjszakán át, 4 ’C-on. Az ellenanyag hígítását experimentálisán határozzuk meg, a javasolt hígítási tartomány 1:100-1:250.

- A sejteket 3* mostuk 200 μΙ PBS/0,1% Triton oldattal 5 percig.

- A sejteket HRPO-enzimmel jelölt második ellenanyag 1:100-as hígításával inkubáltuk 50 μΙ térfogatban, 5% BSA/PBS/0,1% Triton oldatban, 1 órán át szobahőmérsékleten.

- A sejteket 3* mostuk 200 μΙ PBS/0,1% Triton oldattal 5 percig.

- Felodottunk egy OPD-tablettát (Sigma) 25 ml pufferben (3,65 g citromsav-H₂O és 5,9 g Na₂HPO₄-2H₂O, pH=5,6) és hozzáadtunk 12,5 μΙ H₂O₂-reagenst. Az oldatból 50 μΙ-t adtunk minden lyukba, majd alumíniumfólia alatt, rázóasztalon (200 rpm) inkubáltuk 15 percen át.

- Leállítottuk a reakciót 25 μΙ H₂SO₄-tal.

- Mértük az optikai denzitást 490 és 650 nm-en ELISA-leolvasóberendezésen.

Mesencephaloneredetű, dopaminerg neuronális sejtkultúra

Neuronális sejtkultúra

Neuronális kultúrákat indítottunk patkánymagzatból származó, ventrális mesencephaloneredetű sejtekből, enzimatikus és mechanikai diszperzió alkalmazásával. A szövetet összegyűjtöttük mostuk Ca²⁺- és Mg²⁺mentes, 0,6% glükózt tartalmazó, jéghideg PBS-ben (PBSG) és 30 percen át inkubáltuk 0,1% tripszint tartalmazó PBSG-ben 37 ’C-on. A sejtszuszpenziót 2,5*10® sejt/cm² denzitásban kihelyeztük 96 lyukú NUNC szövettenyésztő lemezekre. Ezt megelőzően, a lemezeket fedtük poli-L-omitinnel, 10% borjúszérumot tartalmazó, kémiailag definiált tápközegben („chemically defined médium”, CDM). A kultúrákat CDM-tápközegben tartottuk fennt, amely az alábbi tápközegek 1:1 arányú elegyét tartalmazta: egy rész Dulbecco’s Modified Eaglestápközeget, és egy rész, az alábbi vegyületekkel kiegészített F12 Nutrient tápközeget: glükóz (0,6%), glutamin (2 mmol/l), nátrium-bikarbonát (3 mmol/l), HEPES (5 mmol/l, inzulin (25 pg/ml), humán transzferrin (100 pg/ml), putreszcin (60 pg/ml), nátrium-szelenit (30 nmol/l), streptomicin (100 pg/ml) és penicillin (100NE/ml).

Kezelés neurotróf faktorokkal A neurotrofinokat 0,5%-os BSA-ban oldottuk törzsoldatként. A neurotrofinokat a lemezre történt kihelyezést követő 3. órában, majd 5 napos tenyésztést követően adtuk a tenyészetekhez. Azonos mennyiségű 0,5%-os BSA-t adtunk a kontroli-lyukakhoz.

Nagy affinitású dopaminfelvétel A dopaminfelvételt 10 nap eltelte után mértük. A felvételkor a sejteket kétszer mostuk előre melegített, glükózt (5 mmol/l), aszkorbinsavat (100 mmol/l) és pargilint (100 mmol/l) tartalmazó PBS-ben, és ugyanebben a közegben inkubáltuk 10 percen át. Az előinkubálási közeget kicseréltük 50 nmol/l [³H]DA-t tartalmazó, ugyanezen oldatra, és az inkubálást folytattuk 15 percen át, 37 ’C-on. A felvételt jéghideg PBS-sel történő, háromszori gyors mosással állítottuk le. Az akkumulálódott [³H]-dopamint savas etanollal, szobahőmérsékleten 30 percen át tartó inkubálással szabadítottuk fel. A radioaktivitást 4 ml szcintillációs folyadék („Packard ultima gold MV”) hozzáadását követően, Packard szcintillációs számláló alkalmazásával határoztuk meg. A nem specifikus felvétel mértékét 20 μιτιοΙ/Ι kokain hozzáadásával határoztuk meg.

4. táblázat

Enovin hatása [³H]-dopamin felvételére

Kezelés	[³H]-dopamin-felvétel a kontroll százalékában	n
Kontroll	100	5
Enovin 300 ng/ml	111	4
Enovin 1000 ng/ml	127	5
Enovin 2000 ng/ml	152	5
Enovin 4000 ng/ml	161	1
Enovin 10 000 ng/ml	165	2

A sejteket 10 napig tenyésztettük enovin jelenlétében és nélkül. A nem kezelt kontrollokat vettük 100%20

HU 226 073 Β1 nak. Az eredményeket 1-5, egymástól független vizsgálat során kaptuk.

Irodalomjegyzék

Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W. & Lipman, D. J. (1990) Basic local alignment search tool, J. Mól. Bioi. 215, 403-410.

Angrist, M., Bőik, S., Halushka, M., Lapchak, P. A. & Chakravarti, A. (1996) Germline mutations in glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) and RÉT in a Hirschsprung disease patient. Natúré Genetics 14, 341-344. Baloh, R. H., Tansey, M. G„ Golden, J. P., Creedon, D. J., Heuckeroth, R. O., Keck, C. L., Zimonjíc, D. B., Popescu, N. C., Johnson, E. M. & Milbrandt, J. (1997) TrnR2, a növel receptor that mediates neurturin and GDNF signaling through Rét. Neuron 18, 793-802.

Baloh, R. H., Gorodinsky, A., Golden, J. P., Tansey, M. G., Keck, C. L., Popescu, N. C., Johnson, E. M. & Milbrandt, J. (1998) GFRa3 is an orphan member of the GDNF/neurturin/persephin receptor family. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 5801-5806.

Barr, P. J. (1991) Mammalian subtilisins: the longsought dibasic Processing endoproteases. Cell. 66,13. Beck, K. D., Valverde, J., Alexi, T., Poulsen, K., Moffat,

B. , Vandlen, RA., Rosenthal, A. & Hefti, F. (1995) Mesencephalic dopaminergic neurons protected by GDNF from axotomy-induced degeneration in the aduit brain. Natúré 373, 339-341.

Bilang-Bleuel, A., Revah, F., Colin, P., Locquet, I., Róbert J. J., Mailét, J. & Horellou, P. (1997) Intrastriatal injection of an adenoviral vector expressing glial-cellline-derived neurotrophic factor prevents dopaminergic neuron degeneration and behavioral impairment in a rat model of Parkinson disease. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 8818-8823.

Buj-Bello, A., Buchman, V. L., Horton, A., Rosenthal, A. & Davies A. M. (1995) GDNF is an age-specific survival factor fór sensory and autonomic neurons. Neuron 15, 821-828.

Buj-Bello, A., Adu, J., Pinon, L. G. P., Horton, A., Thompson, J., Rosenthal, A., Chinchetru, M., Buchman, V. L. & Davies, A. M. (1997) Neurturin responsiveness requires a GPI-linked receptor and the Rét receptor tyrosine kinase. Natúré 387, 721-724. Choi-Lundberg, D. L., Lin, Q., Chang, Y. N., Chiang, Y. L., Hay, C. M., Mohajeri, H., Davidson, B. L. & Bohn, M.

C. (1997) Dopaminergic neurons protected from degeneration by GDNF gene therapy. Science. 275, 838-841.

Creedon, D. J., Tansey, M. G., Baloh, R. H., Osbome,

P. A., Lampe, P. A., Fahrner, T. J., Heuckeroth, R. O., Milbrandt, J. & Johnson, E. M. (1997) Neurturin shares receptors and signal transduction pathways with glial cell line-derived neurotrophic factor in sympathetic neurons. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 7018-7023. Durbec, P., Marcos-Gutierrez, C. V., Kilkenny, C., Grigoriou, M., Wartiowaara, K., Suvanto, P., Smith, D., Ponder, B., Costantini, F., Saarma, M., Sariola, H. & Pachnis, v. (1996) GDNF signalling through the RÉT receptor tyrosine kinase. Natúré 381, 789-793. Edery,

P. , Lyonnet, S., Mulligan, L. M., Pelet, A., Dow, E., Ábel L., Holder S., Nihoul-Fekete, C., Ponder, B. A. & Munnich, A. (1994) Mutations of the RÉT proto-oncogene in Hirschsprung's disease. Natúré 367, 378-380.

Gash, D. M., Zhang, Z., Ovadia, A., Cass, W. A., Yi, A., Simmerman, L., Russell, D., Martin, D., Lapchak, P. A., Collins, F., Hoffer, B. J. & Gerhardt, G. A. (1996) Functional recovery in parkinsonian monkeys treated with GDNF. Natúré 380, 252-255.

GFRa Nomenclature Committee (1997) Nomenclature of GPI-linked receptors fór the GDNF ligand family. Neuron 19,485. Hakim A „Ischemic penumbra: the therapeutic window.” Neurology. 1998 Sep; 51(3 Suppl 3): S44-6.

Henderson, C. E., Phillips, H. S., Pollock, R. A., Davies, A. M., Lemeulle, C., Armanini, M., Simmons, L., Moffet, B., Vandlen, R. A., Koliatsos, V. E. & Rosenthal, A. (1994) GDNF: a potent survival factor fór motoneurons present in peripheral nerve and muscle. Science 266, 1062-1064.

Heng, Η. H. Q„ Squire, J. & Tsui, L.-C. (1992) High resolution mapping of mammalian genes by in situ hybridization to free chromatin. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 9509-9513.

Heng, Η. H. Q. & Tsui, L.-C. (1993) Modes of DAPI banding and simultaneous in situ hybridization. Chromosoma 102, 325-332.

Heuckeroth, R. O., Kotzbauer, P., Copeland, N. G., Gilbert, D. J., Jenkins, N. A., Zimonjic, D. B., Popescu, N. C., Johnson, E. M. & Milbrandt, J. (1997) Neurturin, a növel neurotrophic factor, is localized to mouse chromosome 17 and humán chromosome 19pl3.3. Genomics44, 137-140.

Jing, S., Wen, D„ Yu, Y., Holst, P. L., Luo, Y., Fang, M„ Tamir, R., Antonio, L., Hu, Z., Cupples, R., Louis, J.-C., Hu, S., Altrock, B. W. & Fox, G. M. (1996) GDNFinduced activation of the rét protein tyrosine kinase is mediated by GDNFR-a, a növel receptor fór GDNF. Cell 85, 1113-1124.

Jing, S., Yu, Y., Fang, M., Hu, Z., Holst, P. L., Boone, T., Delaney, J., Schultz, H., Zhou, R. & Fox, G. M. (1997) GFRa-2 and GFRa-3 are two new receptors fór ligands of the GDNF family. J. Bioi. Chem. 272, 33 111-33 117.

Kingsley, D. M. (1994) The TGF-beta superfamily: new members, new receptors, and new genetic tests of function in different organisms. Genes & Development 8, 133-146.

Klein, R. D., Sherman, D., Ho, W.-H., Stone, D., Bennett, G. L., Moffat, B., Vandlen, R., Simmons, L., Gu,

Q. , Hongo, J.-A., Devaux, B., Poulsen, K., Armanini, M„ Nozaki, C., Asai, N., Goddard, A., Phillips, H., Henderson, C. E., Takahashi, M. & Rosenthal, A. (1997) A GPI-linked protein that interacts with Rét to form a candidate neurturin receptor. Natúré 387, 717-721. Kotzbauer, P. T., Lampe, P. A., Heuckeroth, R. O., Golden, J. P., Creedon, D. J., Johnson, E. M. & Milbrandt, J. (1996) Neurturin, a relatíve of glial-cell-line-derived neurotrophic factor. Natúré 384, 467-470.

HU 226 073 Β1

Lin, L.-F. H., Doherty, D. H., Lile, J. D., Bektesh, S. & Collins, F. (1993) GDNF: a glial cell line-derived neurotrophic factor fór midbrain dopaminergic neurons. Science 260, 1130-1132.

Mandel, R. J„ Spratt, S. K„ Snyder, R. O. & Leff, S. E. (1997) Midbrain injection of recombinant adenoassociated vírus encoding rat glial cell line-derived neurotrophic factor protects nigral neurons in a Progressive 6-hydroxydopamine-induced degeneration model of Parkinson’s disease in rats. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 14 083-14 088.

Marsden et al. „The causes of Parkinson’s disease are being unraveled and rational neuroprotective therapy is close to reality.” Ann Neurol. 1998 Sep; 44 (3 Suppl 1):S189-96 Masure, S., Cik, M., Pangalos, Μ. N., Bonaventure, P„ Verhasselt, P., Lesage, A. S., Leysen, J.

E. & Gordon R. D. (1998) Molecular cloning, expression and tissue distribution of glial-cell-line-derived neurotrophic factor family receptor a-3 (GFRa-3). Eur. J. Biochem. 251,622-630.

Matsushita, N„ Fujita, Y., Tanaka, M., Nagatsu, T. & Kiuchi, K. (1997) Cloning and structural organization of the gene encoding the mouse glial cell line-derived neurotrophic factor, GDNF. Gene 203,149-157. Milbrandt, J., de Sauvage, F. J., Fahrner, T. J., Baloh,

R. H., Leitner, M. L., Tansey, M. G., Lampe, P. A., Heuckeroth, R. O., Kotzbauer, P. T., Simburger, K. S., Goidén, J. P., Davies, J. A., Vejsada, R., Kató, A. C., Hynes, M., Sherman, D., Nishimura, M., Wang, L. C„ Vandlen, R., Moffat, B., Klein, R. D., Poulsen, K„ Gray, C., Garces, A., Henderson, C. E., Phillips, H. S. & Johnson, E. M. Jr. (1998) Persephin, a növel neurotrophic factor related to GDNF and neurturin. Neuron 20, 245-253.

Moore, M. W., Klein, R. D., Farinas, I., Sauer, H., Armanini, M., Phillips, H., Reichardt, L. F., Ryan, A. M., Carver-Moore, K. & Rosenthal, A. (1996) Renal and neuronal abnormalities in mice lacking GDNF. Natúré 382, 76-79.

Mount, Η. T., Dean, D. O., Alberch, J., Dreyfus, C. F. & Black, I. B. (1995) Glial cell line-derived neurotrophic factor promotes the survival and morphologic differentiation of Purkinje cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 9092-9096.

Nagy Z et al. „The cell division cycle and the pathophysiology of Alzheimer's disease. Neuroscience. 1998 Dec; 87 (4): 731-9.

Naveilhan, P., Baudet, C., Mikaels, A., Shen, L., Westphal, H. & Ernfors, P. (1998) Expression and reguládon of GFRa3, a glial cell line-derived neurotrophic factor family receptor. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 1295-1300.

Nuydens R, Dispersyn G, Van den Kieboom G, De Jong M, Connors R, Ramaekers F, Borgers M, Geerts HBcl-2 protects neuronal cells against taxol-induced apoptosis by inducing multi-nucleation”, submitted Oppenheim, R. W., Houenou, L. J., Johnson, J. E., Lin, L.

F. , Li, L., Lo, A. C, Newsome, A. L., Prevette, D. M. & Wang, S. (1995) Developing motor neurons rescued from programmed and axotomy-induced cell death by

GDNF. Natúré 373, 344-346. Pichel, J. G., Shen, L., Sheng, Η. Z., Granholm, A. C, Drago, J., Grinberg, A., Lee, E. J., Huang, S. P„ Saarma, M., Hoffer, B. J., Sariola, H. & Westphal, H. (1996) Defects in enteric innervation and kidney development in mice lacking GDNF. Natúré 382, 73-76.

Romeo, G., Ronchetto, P., Luo, Y., Barone, V., Seri, M„ Ceccherini, I., Pasini, B., Bocciardi, R., Lerone, M., Kaariainen, H. et al. (1994) Point mutations affecting the tyrosine kinase domain of the RÉT protooncogene in Hirschsprung’s disease. Natúré 367, 377-378. Sanchez, M. P„ Silos-Santiago, I., Frisen, J., He, B., Líra, S. A. & Barbacid, M. (1996) Renal agenesis and the absence of enteric neurons in mice lacking GDNF. Natúré 382, 70-73.

Sanicola, M., Hession, C., Worley, D., Carmillo, P., Ehrenfels, C., Walus, L., Robinson, S., Jaworski, G., Wei, H., Tizard, R., Whitty, A., Pepinsky, R. B. & Cate, R. L. (1997) Glial cell line-derived neurotrophic factordependent RÉT activation can be mediated by two different cell-surface accessory proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 6238-6243.

Smirnova et al. „Thrombin is an extracellular signal that activates intracellular death protease pathways inducing apoptosis in model motor neurons”. J Neurobiol. 1998 Jul; 36 (1):64-80.

Srinivisan et al. „Serum from patients with type 2 diabetes with neuropathy induces complementindependent, calciumdependent apoptosis in cultured neuronal cells. J. Clin. Invest. 1998 Oct 1; 102 (7): 1454-62. Steger C „An unbiased detector of curvilinear structures” IEEE Transactions on pattem analysis and machine intelligence, 20,2, 113-125 (1998) Suvanto, P., Wartiovaara, K., Lindahl, M., Árum e, U., Moshnyakov, M., Horelli-Kuitunen, N„ Airaksinen, M. S., Palotie, A., Sariola, H. & Saarma, M. (1997) Cloning, mRNA distribution and chromosomal localisation of the gene fór glial cell line-derived neurotrophic factor receptor P, a homologue to GDNFRa. Humán Mól. Génét. 6, 1267-1273. Tornác, A., Lindqvist, E., Lin, L. F., Ogren, S. O., Young, D., Hoffer, B. J. & Olson, L. (1995) Protection and repair of the nigrostriatal dopaminergic system by GDNF in vivő. Natúré 373, 335-339.

Treanor, J. J. S., Goodman, L., de Sauvage, F„ Stone,

D. M., Poulsen, K. T., Beck, C. D„ Gray, C„ Armanini, Μ. P., Pollock, R. A., Hefti, F., Phillips, H. S., Goddard, A., Moore, M. W., Buj-Bello, A., Davies, A. M., Asai, N., Takahashi, M., Vandlen, R., Henderson, C. E. & Rosenthal, A. (1996) Characterization of a multicomponent receptor fór GDNF. Natúré 382, 80-83.

Trupp, M., Arenas, E., Fainzilber, M., Nilsson, A. S., Sieber, B. A., Grigoriou, M., Kilkenny, C., SalazarGrueso,

E. , Pachnis, V., Árum e, U., Sariola, H., Saarma, M. & Ibanez, C. F. (1996) Functional receptor fór GDNF encoded by the c-ret proto-oncogene. Natúré 381, 785-788. Wellington et al. „Toward understanding the molecular pathology of Huntington’s disease.” Brain Pathol. 1997 Jul; 7 (3): 979-1002.

Widenfalk, J., Nosrat, C., Tornác, A., Westphal, H., Hoffer, B. & Olson, L. (1997) Neurturin and glial cell

HU 226 073 Β1 line-derived neurotrophic factor receptor- (GDNFR-a), növel proteins related to GDNF and GDNFR-a with specific cellular patterns of expression suggesting roles in the developing and aduit nervous system and in peripheral organs. J. Neurosci. 17, 8506-8519.

Widenfalk, J., Tomac, A., Lindqvist, E., Hoffer, B. & Olson, L. (1998) GFRa-3, a protein related to GFRa-1, is expressed in developing peripheral neurons and ensheathing cells. Eur. J. Neurosci. 10, 1508-1517.

Worby, C. A., Vega, Q. C„ Zhao, Y„ Chao, H. H.-J., Seasholtz, A. F. & Dixon, J. E. (1996) Glial cell line derived neurotrophic factor signals through the RÉT receptor and activates nitogen-activated protein kinase.

J. Blol. Chem. 271, 23 619-23 622.

Worby, C. A., Vega, Q. C., Chao, Η. H. J., Seasholtz, 15 A. F., Thompson, R. C. & Dixon J. E. (1998) Identification and characterization of GFRa-3, a növel co-receptor belonging to the glial cell line-derived neurotrophic receptor family. J. Blol. Chem. 273, 3502-3508.

Yan, Q., Matheson, C. & Lopez, Ο. T. (1995) In vivő 20 neurotrophic effects of GDNF on neonatal and aduit facial motor neurons. Natúré 373, 341-344.

BLAST	Rövidítések jegyzéke „basic local aligment tool
bp	bázispár
cDNS	komplementer DNS
CNS	központi idegrendszer
EST	expresszált szekvenciavég
EVN	enovin
GDNF	gliális sejtvonal-eredetű neurotróf faktor
GFRa	GDNF-családba tartozó a-receptor
GPI	glikozil-foszfatidil-inozitol
MTC	több szöveti eredetű cDNS
NTN	neurturin
PCR	polimeráz-láncreakció
PNS	perifériás idegrendszer
PSP	persephin
RT-PCR	reverz transzkripciós PCR
TGF-β	transzformáló β-növekedési faktor
FISH	fluoreszcens in situ hibridizálás
MTN	többféle szöveten végezhető Northem-blot·
NGF	vizsgálat idegi növekedési faktor
SPR	felszíni plazmonrezonancia

Szekvencialista <110> Janssen Pharmaceutica N. V. et al.

<120> Neurotrophic Growth Factor <130> 50 936/002 <140> PCT/EP99/05 031 <141> 1999-07-14 <150> 9 815 283.3 <151> 1998-07-14 <150> 09/248,772 <151> 1999-02-12 <150> 09/327,668 <151> 1999-06-08 <160> 15 <170> Patentln Ver. 2.0 <210> 1 <211 >339 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 gctgggggcc cgggcagccg cgctcgggca gcgggggcgc ggggctgccg cctgcgctcg 60 cagctggtgc cggtgcgcgc gctcggcctg ggccaccgct ccgacgagct ggtgcgtttc 120 cgcttctgca gcggctcctg ccgccgcgcg cgctctccac acgacctcag cctggccagc 180 ctactgggcg ccggggccct gcgaccgccc ccgggctccc ggcccgtcag ccagccctgc 240 tgccgaccca cgcgctacga agcggtctcc ttcatggacg tcaacagcac ctggagaacc 300 gtggaccgcc tctccgccac cgcctgcggc tgcctgggc 339

HU 226 073 Β1 <210>2 <211 >474 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 cgccgccgca gccttctcgg cccgcgcccc cgccgcctgc acccccatct gctcttcccc 60 gcgggggccg cgcggcgcgg gctgggggcc cgggcagccg cgctcgggca gcgggggcgc 120 ggggctgccg cctgcgctcg cagctggtgc cggtgcgcgc gctcggcctg ggccaccgct 180 ccgacgagct ggtgcgtttc cgcttctgca gcggctcctg ccgccgcgcg cgctctccac 240 acgacctcag cctggccagc ctactgggcg ccggggccct gcgaccgccc ccgggctccc 300 ggcccgtcag ccagccctgc tgccgaccca cgcgctacga agcggtctcc ttcatggacg 360 tcaacagcac ctggagaacc gtggaccgcc tctccgccac cgcctgcggc tgcctgggct 420 gagggctcgc tccagggctt tgcagactgg acccttaccg gtggctcttc ctgc 474 <210>3 <211> 113 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3

Ala

Gly

Pro

Gly

Ser

Arg

Ala

Arg

Ala

Gly

Ala

Arg

Gly

Cys

1

5

10

15

Arg

Leu

Arg

Ser

Gin

Leu

Val

Pro

Val

Arg

Ala

Leu

Gly

Leu

Gly

His

20

25

30

Arg

Ser

Asp

Glu

Leu

Val

Arg

Phe

Arg

Phe

Cys

Ser

Gly

Ser

Cys

Arg

35

40

45

Arg

Ala

Arg

Ser

Pro

His

Asp

Leu

Ser

Leu

Ala

Ser

Leu

Gly

Ala

50

55

60

Gly

Ala

Leu

Arg

Pro

Gly

Ser

Arg

Pro

Val

Ser

Gin

Pro

Cys

65

70

75

80

Cys

Arg

Pro

Thr

Arg

Tyr

Glu

Ala

Val

Ser

Phe

Met

Asp

Val

Asn

Ser

85

90

95

Thr

Trp

Arg

Thr

Val

Asp

Arg

Leu

Ser

Ala

Thr

Ala

Cys

Gly

Cys

Leu

100 105 110

Gly <210>4 <211> 139 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400:

> 4

Pro

Gin

Pro

Ser

Arg

Pro

Ala

Pro

Ala

Pro

Ser

1

5

10

15

Ala

Leu

Pro

Arg

Gly

Arg

Ala

Arg

Ala

Gly

Pro

Gly

Ser

20

25

30

HU 226 073 Β1

Arg Ala Arg Ala Ala Gly Ala Arg

Gly Cys Arg Leu Arg 45

Ser

Gin

Leu

35

40

Val

Pro

Val

Arg

Ala

Leu

Gly

Leu

Gly

His

Arg

Ser

Asp

Glu

Leu

Val

50

55

60

Arg

Phe

Arg

Phe

Cys

Ser

Gly

Ser

Cys

Arg

Ala

Arg

Ser

Pro

His

65

70

75

80

Asp

Leu

Ser

Leu

Ala

Ser

Leu

Gly

Ala

Gly

Ala

Leu

Arg

Pro

85

90

95

Pro

Gly

Ser

Arg

Pro

Val

Ser

Gin

Pro

Cys

Arg

Pro

Thr

Arg

Tyr

100

105

110

Glu

Ala

Val

Ser

Phe

Met

Asp

Val

Asn

Ser

Thr

Trp

Arg

Thr

Val

Asp

115

120

125

Arg

Leu

Ser

Ala

Thr

Ala

Cys

Gly

Cys

Leu

Gly

130 135 <210> 5 <211> 819 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 gagtttcccc tccacacagc taggagccca tgcccggcct gatctcagcc cgaggacagc 60 ccctccttga ggtccttcct ccccaagccc acctgggtgc cctctttctc cctgaggctc 120 cacttggtct ctccgcgcag cctgccctgt ggcccaccct ggccgctctg gctctgctga 180 gcagcgtcgc agaggcctcc ctgggctccg cgccccgcag ccctgccccc cgcgaaggcc 240 ccccgcctgt cctggcgtcc cccgccggcc acctgccggg taggtgagag ggcgaggggg 300 cggggcgggg ctggcccggg acaccgcgcg tgactgggtc tcattccagg gggacgcacg 360 gcccgctggt gcagtggaag agcccggcgg ccgccgccgc agccttctcg gcccgcgccc 420 ccgccgcctg cacccccatc tgctcttccc cgcgggggcc gcgcggcgcg ggctgggggc 480 ccgggcagcc gcgctcgggc agcgggggcg cggggctgcc gcctgcgctc gcagctggtg 540 ccggtgcgcg cgctcggcct gggccaccgc tccgacgagc tggtgcgttt ccgcttctgc 600 agcggctcct gccgccgcgc gcgctctcca cacgacctca gcctggccag cctactgggc 660 gccggggccc tgcgaccgcc cccgggctcc cggcccgtca gccagccctg ctgccgaccc 720 acgcgctacg aagcggtctc cttcatggac gtcaacagca cctggagaac cgtggaccgc 780 ctctccgcca ccgcctgcgg ctgcctgggc tgagggctc 819 <210>6 <211> 85 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6

Met 1

Pro

Gly

Leu

Ile 5

Ser

Ala

Arg

Gly

Gin 10

Pro

Leu

Glu

Val 15

Leu

Pro

Gin

Ala 20

His

Leu

Gly

Ala

leu 25

Phe

Leu

Pro

Glu

Ala 30

Pro

Leu

Gly

Leu

Ser

Ala

Gin

Pro

Ala

Leu

Trp

Pro

Thr

Leu

Ala

Leu

Ala

40 45

HU 226 073 Β1

Leu

Leu 50

Ser

Val

Alá

Glu 55

Alá

Ser

Leu

Gly

Ser 60

Alá

Pro

Arg

Ser

Pro

Alá

Pro

Arg

Glu

Gly

Pro

Val

Leu

Alá

Ser

Pro

Alá

Gly

65

70

75

80

His

Leu

Pro

Gly

Arg

<210>7 <211> 159 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7

Leu 1

Gly Leu

Ile

Pro Gly Gly 5

Arg

Thr Alá Arg 10

Trp

Cys

Ser

Gly 15

Arg

Alá

Arg

Pro

Gin

Pro

Ser

Arg

Pro

Alá

Pro

20

25

30

Alá

Pro

Ser

Alá

Leu

Pro

Arg

Gly

Arg

Alá

Arg

Alá

Gly

35

40

45

Gly

Pro

Gly

Ser

Arg

Alá

Arg

Alá

Gly

Alá

Arg

Gly

Cys

Arg

Leu

50

55

60

Arg

Ser

Gin

Leu

Val

Pro

Val

Arg

Alá

Leu

Gly

Leu

Gly

His

Arg

Ser

65

70

75

80

Asp

Glu

Leu

Val

Arg

Phe

Arg

Phe

Cys

Ser

Gly

Ser

Cys

Arg

Alá

85

90

95

Arg

Ser

Pro

His

Asp

Leu

Ser

Leu

Alá

Ser

Leu

Gly

Alá

Gly

Alá

100

105

110

Leu

Arg

Pro

Gly

Ser

Arg

Pro

Val

Ser

Gin

Pro

Cys

Arg

115

120

125

Pro

Thr

Arg

Tyr

Glu

Alá

Val

Ser

Phe

Met

Asp

Val

Asn

Ser

Thr

Trp

130

135

140

Arg

Thr

Val

Asp

Arg

Leu

Ser

Alá

Thr

Alá

Cys

Gly

Cys

Leu

Gly

145

150

155

<210> 8 <211> 1188 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 8 ctgatgggcg ctcctggtgt tgatagagat ggaacttgga cttggaggcc tctccacgct 60 gtcccactgc ccctggccta ggcggcaggt gagtggttct cccagtgact cctacctggt 120 actgaggaaa ggcggcttga ctggtgaggg agagcagggc ttggcttggg cagcggttag 180 gtgtgggagg gaaaatggtc agggagggac caggtgaatg ggaggaggag cgggacttct 240 ctgaatggtc ggtgcactca ggtgattcct cccctgggct cccagaggca gcaaacccat 300 tatactggaa cctaggccct tcctgagttt cccctccaca cagctaggag cccatgcccg 360 gcctgatctc agcccgagga cagcccctcc ttgaggtcct tcctccccaa gcccacctgg 420

HU 226 073 Β1 gtgccctctt tctccctgag gctccacttg gtctctccgc gcagcctgcc ctgtggccca 480 ccctggccgc tctggctctg ctgagcagcg tcgcagaggc ctccctgggc tccgcgcccc 540 gcagccctgc cccccgcgaa ggccccccgc ctgtcctggc gtcccccgcc ggccacctgc 600 cgggtaggtg agagggcgag ggggcggggc ggggctggcc cgggacaccg cgcgtgactg 660 ggtctcattc cagggggacg cacggcccgc tggtgcagtg gaagagcccg gcggccgccg 720 ccgcagcctt ctcggcccgc gcccccgccg cctgcacccc catctgctct tccccgcggg 780 ggccgcgcgg cgcgggctgg gggcccgggc agccgcgctc gggcagcggg ggcgcggggc 840 tgccgcctgc gctcgcagct ggtgccggtg cgcgcgctcg gcctgggcca ccgctccgac 900 gagctggtgc gtttccgctt ctgcagcggc tcctgccgcc gcgcgcgctc tccacacgac 960 ctcagcctgg ccagcctact gggcgccggg gccctgcgac cgcccccggg ctcccggccc 1020 gtcagccagc cctgctgccg acccacgcgc tacgaagcgg tctccttcat ggacgtcaac 1080 agcacctgga gaaccgtgga ccgcctctcc gccaccgcct gcggctgcct gggctgaggg 1140 ctcgctccag ggctttgcag actggaccct taccggtggc tcttcctg 1188 <210> 9 <211> 228 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9

Met 1

Glu

Leu

Gly

Leu 5

Gly

Leu

Ser

Thr 10

Leu

Ser

His

Cys

Pro 15

Trp

Pro

Arg

Gin

Alá

Pro

Leu

Gly

Leu

Ser

Alá

Gin

Pro

Alá

Leu

Trp

20

25

30

Pro

Thr

Leu

Alá

Leu

Alá

Leu

Ser

Val

Alá

Glu

Alá

Ser

35

40

45

Leu

Gly

Ser

Alá

Pro

Arg

Ser

Pro

Alá

Pro

Arg

Glu

Gly

Pro

50

55

60

Val

Leu

Alá

Ser

Pro

Alá

Gly

His

Leu

Pro

dy

Gly

Arg

Thr

Alá

Arg

65

70

75

80

Trp

Cys

Ser

Gly

Arg

Alá

Arg

Pro

Gin

Pro

Ser

Arg

Pro

85

90

95

Alá

Pro

Alá

Pro

Ser

Alá

Leu

Pro

Arg

Gly

Arg

100

105

110

Alá

Arg

Alá

Gly

Pro

Gly

Ser

Arg

Alá

Arg

Alá

Gly

Alá

115

120

125

Arg

Gly

Cys

Arg

Leu

Arg

Ser

Gin

Leu

Val

Pro

Val

Arg

Alá

Leu

Gly

130

135

140

Leu

Gly

His

Arg

Ser

Asp

Glu

Leu

Val

Arg

Phe

Arg

Phe

Cys

Ser

Gly

145

150

155

160

Ser

Cys

Arg

Alá

Arg

Ser

Pro

His

Asp

Leu

Ser

Leu

Alá

Ser

Leu

165

170

175

Leu

Gly

Alá

Gly

Alá

Leu

Arg

Pro

Gly

Ser

Arg

Pro

Val

Ser

180

185

190

Gin

Pro

Cys

Arg

Pro

Thr

Arg

Tyr

Glu

Alá

Val

Ser

Phe

Met

Asp

195 200 205

HU 226 073 Β1

Val

Asn 210

Ser

Thr

Trp

Arg

Thr Val 215

Asp Arg

Leu

Ser 220

Ala

Thr

Ala

Cys

Gly

Cys

Leu

Gly

225

<210> 10 <211 >220 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 10

Met

Glu

Leu

Gly

Leu

Gly

Leu

Ser

Thr

Leu

Ser

His

Cys

Pro

Trp

1

5

10

15

Pro

Arg

Gin

Pro

Ala

Leu

Trp

Pro

Thr

leu

Ala

Leu

Ala

Leu

20

25

30

Leu

Ser

Val

Ala

Glu

Ala

Ser

Leu

Gly

Ser

Ala

Pro

Arg

Ser

Pro

35

40

45

Ala

Pro

Arg

Glu

Gly

Pro

Val

Leu

Ala

Ser

Pro

Ala

Gly

His

50

55

60

Leu

Pro

Gly

Arg

Thr

Ala

Arg

Trp

Cys

Ser

Gly

Arg

Ala

Arg

65

70

75

80

Pro

Gin

Pro

Ser

Arg

Pro

Ala

Pro

Ala

Pro

85

90

95

Ser

Ala

Leu

Pro

Arg

Gly

Arg

Ala

Arg

Ala

Gly

Pro

Gly

100

105

110

Ser

Arg

Ala

Arg

Ala

Gly

Ala

Arg

Gly

Cys

Arg

Leu

Arg

Ser

Gin

115

120

125

Leu

Val

Pro

Val

Arg

Ala

Leu

Gly

Leu

Gly

His

Arg

Ser

Asp

Glu

Leu

130

135

140

Val

Arg

Phe

Arg

Phe

Cys

Ser

Gly

Ser

Cys

Arg

Ala

Arg

Ser

Pro

145

150

155

160

His

Asp

Leu

Ser

Leu

Ala

Ser

Leu

Gly

Ala

Gly

Ala

Leu

Arg

Pro

165

170

175

Pro

Gly

Ser

Arg

Pro

Val

Ser

Gin

Pro

Cys

Arg

Pro

Thr

Arg

180

185

190

Tyr

Glu

Ala

Val

Ser

Phe

Met

Asp

Val

Asn

Ser

Thr

Trp

Arg

Thr

Val

195

200

205

Asp

Arg

Leu

Ser

Ala

Thr

Ala

Cys

Gly

Cys

Leu

Gly

210

215

220

<210> 11 <211 >766 <212> DNA

HU 226 073 Β1 <213> Homo sapiens <400> 11 ctgatgggcg ctcctggtgt tgatagagac ggaacctgga cttggaggcc tctccacgct 60 gtcccactgc ccctggccta ggcggcaggc tccacttggt ctctccgcgc agcctgccct 120 gtggcccacc ctggccgctc tggctctgct gagcagcgtc gcagaggcct ccctgggctc 180 cgcgccccgc agccctgccc cccgcgaagg ccccccgcct gtcctggcgt cccccgccgg 240 ccacctgccg gggggacgca cggcccgctg gtgcagtgga agagcccggc ggccgccgcc 300 gcagccttct cggcccgcgc ccccgccgcc tgcaccccca tctgctcttc cccgcggggg 360 ccgcgcggcg cgggctgggg gcccgggcag ccgcgctcgg gcagcggggg cgcggggctg 420 ccgcctgcgc tcgcagctgg tgccggtgcg cgcgctcggc ctgggccacc gctccgacga 480 gctggtgcgt ttccgcttct gcagcggctc ctgccgccgc gcgcgctctc cacacgacct 540 cagcctggcc agcctactgg gcgccggggc cctgcgaccg cccccgggct cccggcccgt 600 cagccagccc tgctgccgac ccacgcgcta cgaagcggtc tccttcatgg acgtcaacag 660 cacctggaga accgtggacc gcctctccgc caccgcctgc ggctgcctgg gctgagggct 720 cgctccaggg ctttgcagac tggaccctta ccggtggctc ttcctg 766 <210> 12 <211 >742 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 12 ctgatgggcg ctcctggtgt tgatagagat ggaacttgga cttggaggcc tctccacgct 60 gtcccactgc ccctggccta ggcggcagcc tgccctgtgg cccaccctgg ccgctctggc 120 tctgctgagc agcgtcgcag aggcctccct gggctccgcg ccccgcagcc ctgccccccg 180 cgaaggcccc ccgcctgtcc tggcgtcccc cgccggccac ctgccggggg gacgcacggc 240 ccgctggtgc agtggaagag cccggcggcc gccgccgcag ccttctcggc ccgcgccccc 300 gccgcctgca cccccatctg ctcttccccg cgggggccgc gcggcgcggg ctgggggccc 360 gggcagccgc gctcgggcag cgggggcgcg gggctgccgc ctgcgctcgc agctggtgcc 420 ggtgcgcgcg ctcggcctgg gccaccgctc cgacgagctg gtgcgtttcc gcttctgcag 480 cggctcctgc cgccgcgcgc gctctccaca cgacctcagc ctggccagcc tactgggcgc 540 cggggccctg cgaccgcccc cgggctcccg gcccgtcagc cagccctgct gccgacccac 600 gcgctacgaa gcggtctcct tcatggacgt caacagcacc tggagaaccg tggaccgcct 660 ctccgccacc gcctgcggct gcctgggctg agggctcgct ccagggcttt gcagactgga 720 cccttaccgg tggctcttcc tg 742 <210> 13 <211 >603 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 13 ctgatgggcg ctcctggtgt tgatagagat ggaacttgga cttggaggcc tctccacgct 60 gtcccactgc ccctggccta ggcggcaggg ggacgcacgg cccgctggtg cagtggaaga 120 gcccggcggc cgccgccgca gccttctcgg cccgcgcccc cgccgcctgc acccccatct 180 gctcttcccc gcgggggccg cgcggcgcgg gctgggggcc cgggcagccg cgctcgggca 240 gcgggggcgc ggggctgccg cctgcgctcg cagctggtgc cggtgcgcgc gctcggcctg 300 ggccaccgct ccgacgagct ggtgcgtttc cgcttctgca gcggctcctg ccgccgcgcg 360 cgctctccac acgacctcag cctggccagc ctactgggcg ccggggccct gcgaccgccc 420 ccgggctccc ggcccgtcag ccagccctgc tgccgaccca cgcgctacga agcggtctcc 480 ttcatggacg tcaacagcac ctggagaacc gtggaccgcc tctccgccac cgcctgcggc 540 tgcctgggct gagggctcgc tccagggctt tgcagactgg acccttaccg gtggctcttc 600 ctg 603 <210> 14 <211 >489

HU 226 073 Β1 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 14 ctgatgggcg ctcctggtgt tgatagagat ggaacttgga cttggaggcc tctccacgct 60 gtcccactgc ccctggccta ggcggcagcc tgccctgtgg cccaccctgg ccgctctggc 120 tctgctgagc agcgtcgcag aggcctccct gggctccgcg ccccgcagcc ctgccccccg 180 cgaaggcccc ccgcctgtcc tggcgtcccc cgccggccac ctgccggcgg ctcctgccgc 240 cgcgcgcgct ctccacacga cctcagcctg gccagcctac tgggcgccgg ggccctgcga 300 ccgcccccgg gctcccggcc cgtcagccag ccctgctgcc gacccacgcg ctacgaagcg 360 gtctccttca tggacgtcaa cagcacctgg agaaccgtgg accgcctctc cgccaccgcc 420 tgcggctgcc tgggctgagg gctcgctcca gggctttgca gactggaccc ttaccggtgg 480 ctcttcctg 489 <210> 15 <211 >350 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 15 ctgatgggcg ctcctggtgt tgatagagat ggaacttgga cttggaggcc tctccacgct 60 gtcccactgc ccctggccta ggcggcagcg gctcctgccg ccgcgcgcgc tctccacacg 120 acctcagcct ggccagccta ctgggcgccg gggccctgcg accgcccccg ggctcccggc 180 ccgtcagcca gccctgctgc cgacccacgc gctacgaagc ggtctccttc atggacgtca 240 acagcacctg gagaaccgtg gaccgcctct ccgccaccgc ctgcggctgc ctgggctgag 300 ggctcgctcc agggctttgc agactggacc cttaccggtg gctcttcctg 350

Claims

1. Izolált nukleinsavmolekula, amely enovin elneve- 35 zésű, humán eredetű, a SEQ ID No. 4 azonosító számon bemutatott szekvenciájú neurotróf növekedési faktort kódol, vagy a fenti növekedési faktor olyan érési variánsát kódolja, amely a SEQ ID No. 9 vagy SEQ ID

No. 10 azonosító számú aminosavszekvenciát tártál- 40 máz.

2. Az 1. igénypont szerinti nukleinsavmolekula, amely DNS-molekula.

3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti nukleinsavmolekula, amely cDNS-molekula. 45

4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti nukleinsavmolekula, amely a SEQ ID No. 2 azonosító számú szekvencia 81-419. pozícióinak megfelelő nukleinsavszekvenciájú.

5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti izolált 50 nukleinsavmolekula, amelynek a szekvenciája megfelel a SEQ ID No 11., 12., 13., 14. vagy 15. azonosító számon bemutatott érési variánsok szekvenciái bármelyikének.

6. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti nuklein- 55 savmolekula, amelynek szekvenciája a SEQ ID No.

2 azonosító számon bemutatott nukleinsavszekvencia.

7. Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti nukleinsavmolekula által kódolt, izolált, humán neurotróf növekedési faktor. 60

8. Izolált, humán neurotróf növekedési faktor, amely a SEQ ID No. 4 azonosító számú aminosavszekvencia 27-139. pozíciónak megfelelő aminosavszekvenciát tartalmaz; vagy tartalmazza a SEQ ID No.

9. vagy SEQ ID No. 10 azonosító számú aminosavszekvenciát.

9. A 8. igénypont szerinti növekedési faktor, amely tartalmazza a SEQ ID No. 4 azonosító számú aminosavszekvenciát.

10. A 8. igénypont szerinti növekedési faktor, amely a SEQ ID No. 9 vagy SEQ ID No. 10 azonosító számú aminosavszekvenciából áll.

11. Izolált, humán neurotróf növekedési faktor, amely SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 9 vagy SEQ ID No. 10 azonosító számú aminosavszekvenciájú polipeptidet tartalmaz.

12. EVNmat/pRSETB plazmid, amely az LMBPnél az LMBP 3931 hozzáférési számon lett letétbe helyezve.

13. Expressziós vektor, amely a 2-6. igénypontok bármelyike szerinti DNS-molekulát tartalmaz.

14. A 13. igénypont szerinti expressziós vektor, amely riportermolekulát kódoló nukleinsavszekvenciát is tartalmaz.

15. A 13. vagy 14. igénypont szerinti vektorral transzformált vagy transzfektált gazdasejt.

16. A 15. igénypont szerinti gazdasejt, amely eukarlóta vagy bakteriális sejt.

HU 226 073 Β1

17. A SEQ ID No. 4 azonosító számú aminosavszekvenciával legalább 70%-os aminosavhomológiájú szekvenciát kódoló nukleinsavmolekula alkalmazása lényegében perifériás vagy centrális neurogén komponensű fájdalomszindrómák, reumás/gyulladásos betegségek, valamint ingervezetési rendellenességek kezelésére és megelőzésére alkalmas gyógyszer előállítása során.

18. Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti nukleinsavmolekula gyógyszerként történő alkalmazásra.

19. Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti nukleinsavmolekula alkalmazása lényegében perifériás vagy centrális neurogén komponensű fájdalomszindrómák, reumás/gyulladásos betegségek, valamint ingervezetési rendellenességek kezelésére és megelőzésére alkalmas gyógyszer előállítása során.

20. A SEQ ID No. 4 azonosító számú aminosavszekvenciával legalább 70%-os aminosavhomológiájú neurotróf növekedési faktor alkalmazása lényegében perifériás vagy centrális neurogén komponensű fájdalomszindrómák, reumás/gyulladásos betegségek, valamint ingervezetési rendellenességek kezelésére és megelőzésére alkalmas gyógyszer előállítása során.

21. A 8-11. igénypontok szerinti neurotróf növekedési faktor gyógyszerként történő alkalmazásra.

22. A 8-11. igénypontok szerinti neurotróf növekedési faktor alkalmazása lényegében perifériás vagy centrális neurogén komponensű fájdalomszindrómák, reumás/gyulladásos betegségek, valamint ingervezetési rendellenességek kezelésére és megelőzésére alkalmas gyógyszer előállítása során.

23. Gyógyászati készítmény, amely az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti nukleinsavmolekulát tartalmaz megfelelő, gyógyászatilag elfogadható hordozóanyaggal, hígítóanyaggal vagy kötőanyaggal együtt.

24. Gyógyászati készítmény, amely a 8-11. igénypontok bármelyike szerinti növekedési faktort tartalmaz megfelelő, gyógyászatilag elfogadható hordozóanyaggal, hígítóanyaggal vagy kötőanyaggal együtt.

25. Ellenanyag, amely a 8-11. igénypontok bármelyike szerinti növekedési faktorhoz vagy annak epitópjához képes kötődni.

26. Gyógyászati készítmény, amely a 25. igénypont szerinti ellenanyagot tartalmaz megfelelő, gyógyászatilag elfogadható hordozóanyaggal, hígítóanyaggal vagy kötőanyaggal együtt.

27. Eljárás a 8-11. igénypontok bármelyike szerinti növekedési faktor jelenlétének kimutatására mintában, azzal jellemezve, hogy a 25. igénypont szerinti ellenanyagot reagáltatjuk a mintával; és kimutatjuk az ellenanyag és növekedési faktor közt létrejött kötődést.

28. A 27. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy riportermolekulávai konjugált ellenanyagot reagáltatunk a mintával.

29. Reagenskészlet vagy készülék a 8-11. igénypontok bármelyike szerinti neurotróf növekedési faktor jelenlétének kimutatására mintában, amely a 25. igénypont szerinti ellenanyagot tartalmaz, az ellenanyag és a minta reagáltatását szolgáló egyéb eszközökkel együtt.

30. Eljárás a 8-11. igénypontok bármelyike szerinti humán neurotróf növekedési faktor agonistájának vagy antagonistájának azonosítására, azzal jellemezve, hogy a növekedési faktor receptorát expresszáló sejtet, szövetet vagy organizmust hatóanyagjelölt vegyülettel érintkeztetjük a növekedési faktor jelenlétében, és a RET-aktiváció sejtben, szövetben vagy organizmusban meghatározott szintjét a hatóanyagjelölt vegyülettel nem érintkeztetett kontroliban meghatározott szinttel hasonlítjuk össze.

31. Eljárás a 8-11. igénypontok bármelyike szerinti humán neurotróf növekedési faktor agonistájának vagy antagonistájának azonosítására, azzal jellemezve, hogy a növekedési faktor megfelelő receptorát és cRET-et expresszáló sejtet, szövetet vagy organizmust hatóanyagjelölt vegyülettel érintkeztetünk a növekedési faktor jelenlétében; a szignált létrehozó kinázra specifikus, riportermolekulával konjugált ellenanyag hozzáadását követően meghatározzuk egy, a szignáltranszdukciós úthoz - amelynek a receptorrésze - tartozó szignálátadó kináz aktivitásának szintjét; és az aktivitást olyan sejtben, szövetben vagy organizmusban meghatározott szinttel hasonlítjuk össze, amelyet nem érintkeztettünk a vegyülettel.

32. A 30. vagy 31. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a neurotróf növekedési faktor enovin, amelynek az aminosavszekvenciája megegyezik a SEQ ID No. 3 azonosító számú szekvenciával.

33. A 30-32. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a sejtszövet vagy organizmus az NIH 3T3 sejt.

34. A 30-33. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a receptor a GFRal-, GFRa2, GFRa3 vagy GFRa4 receptorok bármelyike.

35. A 30-34. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy p42/p44 MAP-kinázra, PKB-kinázra, c-jun-ra, CREB-re, vagy JNK/SAPIC kinázra specifikus ellenanyagot alkalmazunk.

HU 226 073 Β1

Int. Cl.: A01K 67/027

1. ábra

PPQPSRPAPPPPAPPS 16 cgecgccgcagccttctcggcccgcgcecccgccgccegcacccccaccc 50

Γ+

A L P R G G AAA * '· A O G P G S P. 33 gctcctccccgcggsggccgcgcggcgcgggctgggggcccgggcagccg 100

ARAAGARGCRLRSQLV 49 cgctcgggcagcgggggcgcggggctgccgcctgcgctcgcagctggcgc 150

P V R A LGLGHRSDSLVRF 66 cggtgcgcgcgctcggcccgggccaccgccccgaegagccggegcgcccc 200

RFCSGSCRRARSPHDLS 83 ege t ec tgcagcggc tcc cgccgccgcgcgcgc t c cccacacgacc ccag 250

LASLLGAGALRPPPÖS 93 cctggccagcctactgggcgccggggccctgcgaccgcccccgggctccc 300

RPVSQPCCRPTRYEAVS 116 ggcccgccagccagccccgctgccgacccacgcgccacgaagcggtcecc 350

F M D V N S . T WRTVDRLSAT 133

Ctcaeggacgecaacagcacctggagaaccgtggaccgcctctccgccac 400

A C G C L G · 139 cgcc egegge cgcc tgggc egaggge tege tccagggccttgcagac tgg 450 acccttaccggtggczccccccgc 474