BRPI9912819B1 - vetor de expressão, micro-organismo transgênico, usos de uma molécula de ácido nucléico e de um fator de crescimento neurotrófico, bem como composições farmacêuticas compreendendo os mesmos - Google Patents

Abstract

patente de invenção: <b>"fator de crescimento neurotrófico"<d>. a esse respeito é revelado uma molécula de ácido nucléico isolada codificando uma enovin designada de fator de crescimento neurotrófico humano e tendo a seqüência de aminoácido ilustrada na figura 1, 21, 23 ou 24 ou codificando um equivalente, derivado ou bioprecusor funcional do dito fator de crescimento. o fator de crescimento preferivelmente compreende a seqüência de aminoácio de posição 27 a 139 da seqüência ilustrada na figura 1, ou um equivalente, derivado ou bioprecusor funcional disso. a molécula de ácido nucléico codificando enovin pode ser usada para transformar uma célula, tecido ou organismo hospedeiro incluindo-o em um vetor apropriado. a célula, tecido ou organismo hospedeiro e o vetor também formam parte da invenção.

Description

(54) Título: VETOR DE EXPRESSÃO, MICRO-ORGANISMO TRANSGÊNICO, USOS DE UMA MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLÉICO E DE UM FATOR DE CRESCIMENTO NEUROTRÓFICO, BEM COMO COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS COMPREENDENDO OS MESMOS (51) Int.CI.: C07K 14/00 (30) Prioridade Unionista: 08/06/1999 US 09/327,668, 12/02/1999 US 09/248,772, 14/07/1998 GB 98 15283.8 (73) Titular(es): JANSSEN PHARMACEUTICA N.V.

(72) Inventor(es): HUGO ALFONS GABRIEL GEERTS; STEFAN LEO JOZEF MASURE; THEO FRANS MEERT; MIROSLAV CIK; LUC AUGUST LAURENTIUS VER DONCK (85) Data do Início da Fase Nacional: 15/01/2001

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para VETOR DE

EXPRESSÃO, MICRO-ORGANISMO TRANSGÊNICO, USOS DE UMA

MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLÉICO E DE UM FATOR DE CRESCIMENTO

NEUROTRÓFICO, BEM COMO COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS

COMPREENDENDO OS MESMOS.

A presente invenção refere-se a um fator neurotrófico e, em particular, a clonagem e expressão de um novo elemento da família GDNF de fatores neurotróficos, designados aqui como enovin (EVN).

Introdução

Fatores neurotróficos estão envolvidos em diferenciação, desenvolvimento e manutenção de neurônios. Estas proteínas podem prevenir degeneração e promover sobrevivência de tipos diferentes de células de neurônios e são assim agentes terapêuticos potenciais para doenças neurodegenerativas. Fator neurotrófico derivado de linha de célula glial (GDNF) foi o primeiro elemento de uma subfamília crescente de fatores neurotróficos estruturalmente distintos das neurotrofinas. GDNF é um elemento da superfamília de fator de crescimento transformador β (TGF-β) de fatores de crescimento, caracterizado por um modelo específico de sete resíduos de cisteína altamente conservados dentro da sequência de aminoácido (Kingsley, 1994). GDNF foi originalmente purificado usando um ensaio baseado em sua estabilidade para manter a sobrevivência e função de neurônios dopaminérgicos do mesencéfalo ventral embriônico in vitro (Lin e outros, 1993). Outros tipos de células de neurônios nos sistemas nervosos central (CNS) ou periférico (PNS) são também responsivos aos efeitos de sobrevivência de GDNF (Henderson e outros, 1994, Buj-Bello e outros, 1995, Mount e outros, 1995, Oppenheim e outros, 1995). GDNF é produzido por células em uma pró-forma inativa, a qual é clivada especificamente em um sítio de reconhecimento de furina RXXR para produzir GDNF ativo (maduro) (Lin e outros, 1993). Administração exógena de GDNF tem efeitos neuroprotetores potentes em modelos animais de mal de Parkinson, um distúrbio neurodegenerativo comum ca30 racterizado pela perda de até 70% de células dopaminérgicas na substância negra do cérebro (Beck e outros, 1995, Tomac e outros, 1995, Gash e outros, 1996,

Choi-Lundberg e outros, 1997, Bilang-Bleuel e outros, 1997).

Recentemente, fatores neurotróficos adicionais da família GDNF

Petição 870160018635, de 09/05/2016, pág. 10/23

• · * têm sido descobertos. Neurturina (NTN) foi purificada proveniente de meio condicionado de células do ovário de hamster chinês (CHO) usando um ensaio baseado em sua capacidade para promover a sobrevivência de neurônios simpáticos em cultura (Kotzbauer e outros, 1996). A proteína de NTN madura é 57% similar a GDNF maduro. Persefina (PSP) foi descoberta por clonagem usando PCR de iniciador degenerado com DNA genômico como um padrão. O PSP maduro, tipo GDNF maduro, promove a sobrevivência de neurônios dopaminérgicos de mesencéfalo ventrais e de neurônios motores em cultura (Milbrandt e outros, 1998). A similaridade da proteína PSP madu10 ra com GDNF e NTN maduros é « 50%. Artemina (ARTN) foi descoberta por pesquisa de bancos de dados de DNA e é um fator de sobrevivência de neurônios sensórios e simpáticos em cultura (Baioh e outros, 1998b).

GDNF, NTN, PSP e ARTN exigem um complexo receptor heterodimérico a fim de realizar transdução de sinal intracelular a jusante. GDNF ^15 aglutina a subunidade de receptor de família GDNF alfa 1 (GFRa-1; Comitê 'í de Nomenclatura de GFRa, 1997), uma proteína de membrana ancorada de glicosil-fosfatidil-inositol (glicosil-Ptdlns) (Jing e outros, 1996, Treanor e outros, 1996, Sanicola e outros, 1997). O complexo GDNF/GFRa-1 subseqüentemente aglutina a e ativa o proto-oncogene cRET, uma tirosina cinase ligada à membrana (Durbec e outros, 1996, Trupp e outros, 1996), resultando na fosforilação de resíduos de tirosina em cRET e ativação subseqüente de caminhos de transdução de sinal a jusante (Worby e outros, 1996). Diversos outros elementos da família GFRa de receptores de aglutinação de ligante têm sido caracterizados (Baioh e outros, 1997, Sanicola e outros 1997,

Klein e outros, 1997, Buj-Bello e outros, 1997, Suvanto e outros, 1997). GFRa-2 e GFRa-3 (Jing e outros, 1997, Masure e outros, 1998, Woby e outros, 1998, Naveilham e outros, 1998, Baioh e outros, 1998a) têm sido identificados por um número de grupos diferentes. GFRa-1 e GFRa-2 são amplamente expressos em quase todos os tecidos e expressão pode ser evolu-,.

cionariamentè regulada (sanicola e outros, 1997, Widenfalk e outros, 1997).

GFRa-3 não é expresso no sistema nervoso central em desenvolvimento ou adulto, mas é altamente expresso em vários gânglios senso* ♦

·· ··· res e simpáticos em desenvolvimento e adultos do sistema nervoso periférico--(-Widenfalk e outros, 1998, Naveilham e outros, 1998, Baloh e outros, 1998a). Um quarto elemento da família, GFRa-4, foi clonado de cDNA de galinha (Thompson e outros, 1998). GFRa-1 é o receptor preferido para

GDNF, ao passo que GFRa-2 preferencialmente aglutina NTN (Jing e outros, 1996, Treanor e outros, 1996, Klein e outros, 1997). GFRa-4 de galinha forma um complexo receptor funcionai para PSP em combinação com cRET( Enokido e outros, 1998). Células expressando ambos GFRa-3 e cRET foram apresentadas não para responder a ou GDNF, NTN ou PSP (Worby e ou10 tros, 1998, Baloh e outros, 1998a). Recentemente, ART tem sido apresentado para indicar através de cRET usando GFRa-3 como o receptor de aglutinação de ligante preferido (Baloh e outros, 1998b). Comunicação cruzada entre os fatores neurotróficos e receptores de GFRa é possível ín vitro, como GDNF pode aglutinar a GFRa-2 ou GFRa-3 na presença de cRET (Sanicola e outros, 1997, Trupp e outros, 1998) e NTN pode aglutinar a J GFRa-1 com baixa afinidade (Klein e outros, 1997). Em resumo, GDNF, NTN, PSP e ART são parte de um sistema de sinalização neurotrófico pelo qual subunidades de aglutinação de ligante diferentes (GFRa-1 a -4) podem interagir com a mesma subunidade de tirosina cinase (cRET). A relevância psicológica destas descobertas in vitro foi recentemente mostrada em estudos decisivos de genes (revistos por Rosenthal, 1999), os quais claramente mostram que GDNF interage com GFRa-1 in vitro, enquanto NTN é o ligante preferido para GFRa-2.

Os inventores presentes têm identificado, clonado, expresso, cromossomicamente localizado e caracterizado Enovin (EVN), o quarto elemento da família de GDNF. O conhecimento da proteína EVN madura tem sido estendido com a descoberta de variantes de junções de mRNA funcionais e não funcionais diferentes. Além do mais, apresentou-se dados de expressão, dados de aglutinação de EVN a GFRa-3 e efeitos in vitro de EVN em desenvolvimento e proteção de neurite contra neurotoxicidade induzida por taxol em culturas de células de neuroblastoma humana SH-SY5Y diferenciada por estauroporina.

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Sumário da Invenção

No presente pedido, nesse respeito é fornecido uma molécula de ácido nucléico codificando um novo fator de crescimento neurotrófico humano enovin, um vetor de expressão compreendendo a dita molécula de áci5 do nucléico, uma célula hospedeira transformada com o dito vetor, um fator de crescimento neurotrófico codificado pela dita molécula de ácido nucléico, enovin isolado, compostos os quais atuam como agonistas ou antagonistas de enovin e composições farmacêuticas contendo o ácido nucléico ou a proteína de enovin ou os agonistas ou antagonistas disso.

Descrição Detalha da Invenção

De acordo com o primeiro aspecto da presente invenção, a esse respeito, é fornecido uma molécula de ácido nucléico codificando um fator de crescimento neurotrófico humano, designado aqui como enovin, tendo a seqüência de aminoácido ilustrada na Figura 21, ou codificando um equivalí 5 lente funcional, derivativo ou biprecursor do dito fator de crescimento. Preferivelmente, a dita molécula de ácido nucléico é DNA e ainda mais preferivelmente uma molécula de cDNA.

Preferivelmente, o ácido nucléico de acordo com a invenção compreende a seqüência proveniente de posições 81 a 419 da seqüência ilustrada na Figura 1 e, mais preferivelmente, proveniente de posições 81 a 422 e ainda mais preferivelmente a seqüência completa ilustrada na Figura 1.

A molécula de ácido nucléico proveniente de posições 81 a 419 é acreditada codificar a seqüência da proteína de enovin madura subse25 quente a processamento da pró-forma da proteína no sítio de processamento RXXR presente na pró-forma estável da dita proteína de enovin.

A esse respeito é também fornecido pela invenção uma molécula de anti-sentido capaz de hibridizar a qualquer uma das seqüências de ácido nucléico de acordo com a invenção, sob condições de alto rigor, as quais seriam bem conhecidas àqueles versados na técnica.

Rigor de hibridização como usado aqui refere-se a condições sob as quais ácidos polinucléicos estão estáveis. A estabilidade de híbridos

»·* »· •·· é refletida na temperatura de fusão (Tm) dos híbridos. Tm pode ser aproximadõpela fórmula:

81,5°C-16,6 (log10[Na⁺]+0,41 (%G&C)-600/l onde 1 é o comprimento dos híbridos em nucleotídeos. Tm decresce aproximadamente por 1-1,5°C com cada 1% de diminuição em homologia de se5 qüência.

Vantajosamente, a molécula de ácido nucléico de acordo com a invenção pode ser usada para expressar o fator de crescimento neurotrófico humano de acordo com a invenção, em uma célula hospedeira ou coisa parecida usando um vetor de expressão apropriado.

Um vetor de expressão de acordo com a invenção inclui vetores capazes de expressar DNA operativamente ligado a seqüências reguladoX ras, tais como regiões promotoras, que são capazes de efetuar expressão de tais fragmentos de DNA.

Elementos reguladores exigidos para expressão incluem se15 qüências promotoras para aglutinar RNA polimerase e seqüências de iniciação de transcrição para aglutinação de ribossomo. Por exemplo, um vetor de expressão bacterial pode incluir um promotor tal como o promotor lac e para iniciação de transcrição a seqüência Shine-Dalgarno e o códon de iniciação AUG. Similarmente, um vetor de expressão eucariótico pode incluir um pro20 motor heterólogo ou homólogo para RNA polimerase II, um sinal de poliadenilação a jusante, o códon inicial AUG, e um códon de terminação para separação do ribossomo. Tais vetores podem ser obtidos comercialmente ou reunidos das seqüências descritas por métodos bem conhecidos na técnica.

Assim, um vetor de expressão refere-se a um construto de DNA ou RNA recombinante, tal como um plasmídeo, um fago, vírus recombinante ou outro vetor que em introdução em uma célula hospedeira apropriada resulta em expressão dos fragmentos de DNA ou RNA. Vetores de expressão apropriados são bem conhecidos àqueles versados na técnica e incluem aqueles que são reaplicáveis em células eucarióticas e/ou células procarió-

• * toicas e aqueles que permanecem episomal ou aqueles os quais integram no genoma da célula hospedeira.

A molécula de anti-sentido capaz de hibridizar ao ácido nucléico de acordo com a invenção pode ser usada como uma sonda ou como um medicamento ou em uma composição farmacêutica.

Moléculas de ácido nucléico de acordo com a invenção podem ser inseridas nos vetores descritos em uma orientação de anti-sentido a fim de fornecer a produção de RNA de anti-sentido. RNA de anti-sentido ou outros ácidos nucléicos de anti-sentido podem ser produzidos por meios sinté10 ticos.

Um aspecto adicional da invenção compreende a célula hospedeira transformada, transfectada ou infectada com o vetor de expressão de acordo com a invenção, a qual célula preferivelmente compreende uma célula eucariótica e mais preferivelmente uma célula de mamífero.

*15 Incorporação de DNA clonado em um vetor de expressão adequado para transformação subseqüente da dita célula e seleção subseqüente das células transformadas é bem conhecido por aqueles versados na técnica como fornecido em Sambrook e outros (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press.

Um aspecto adicional da presente invenção compreende uma molécula de ácido nucléico tendo pelo menos 15 nucleotídeos da molécula de ácido nucléico de acordo com a invenção e preferivelmente de 15 a 50 nucleotídeos.

Estas sequências podem, vantajosamente, ser usadas como sondas ou iniciadores para iniciar reprodução ou coisa parecida. Tais moléculas de ácido nucléico podem ser produzidas de acordo com técnicas bem conhecidas na técnica, tais coimo por meios recombinantes ou sintéticos. Eles podem também ser usados em kits ou dispositivos diagnósticos ou coisa parecida para detectar a presença de um ácido nucléico de acordo com a invenção. Estes testes geralmente compreendem entrar em contato a sonda com a amostra sob condições de hibridização e detectar a presença de qualquer formação dúplex entre a sonda e qualquer ácido nucléico na

i · • « amostra.

De acordo com a presente invenção estas sondas podem ser ancoradas a um suporte sólido. Preferivelmente, elas podem estar presente em uma disposição de modo que sondas múltiplas possam simultaneamente hibridizar a uma amostra biológica simples. As sondas podem ser assinaladas na disposição ou sintetizadas in situ na disposição. (Veja Lockhart e outros, Nature Biotechnology, vol. 14, dezembro de 1996 Expressing monitoring by hybridisation into high density oligonucleotide arrays. Uma disposição simples pode conter mais do que 100, 500 ou ainda 1.000 sondas dife10 rentes em localizações discretas.

Moléculas de ácido nucléico de acordo com a invenção podem também ser produzidas usando tais meios recombinantes ou sintéticos, tais como, por exemplo, usando mecanismos de clonagem de PCR os quais geralmente envolvem fazendo um par de iniciadores, os quais podem ser de 'Ί 5 aproximadamente 10 a 50 nucleotídeos para uma região do gene que é desejada a ser clonada, aglutinando os iniciadores em contato com mRNA, cDNA, ou DNA genômico de uma célula humana, executando uma reação de cadeia de polimerase sob condições as quais levam aproximadamente amplificação da região desejada, isolando a região amplificada ou fragmento e recuperação do DNA amplificado. Geralmente, tais técnicas como definidas aqui são bem conhecidas na técnica, tais como descrito em Sambrook e outros (Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 1989).

Os ácidos nucléicos ou oligonucleotídeos de acordo com a invenção podem transportar uma marca reveladora. Marcas adequadas inclu25 em radioisótopos tais como ³²P ou ³⁵S, marcas de enzima ou outras marcas de proteínas tais como biotina ou marcadores fluorescentes. Tais marcas podem ser adicionadas aos ácidos nucléicos ou oligonucleotídeos da invenção podem ser detectadas usando técnicas conhecidas per se.

Vantajosamente, variantes alélicas humanas ou polimorfismos da molécula de DNA de acordo com a invenção podem ser identificadas por, por exemplo, cDNA de sondagem ou bibliotecas genômicas de um limite de indivíduos, por exemplo, de populações diferentes. Além disso, ácidos nu8 cléicos e sondas de acordo com a invenção podem ser usados a uma seqüêncíFde DNA genômica de pacientes usando técnicas bem conhecidas na técnica, tais como o método de terminação de cadeia Dideóxi Sanger, o qual pode vantajosamente verificar qualquer predisposição de um paciente a certos distúrbios associados com um fator de crescimento de acordo coma invenção.

Além disso, fornecido pela presente invenção é uma célula, tecido ou organismo transgênico compreendendo um transgene capaz de expressar o enovin de fator neurotrófico humano de acordo com a invenção.

O termo transgene capaz de expressão como usado aqui significa qualquer seqüência de ácido nucléico adequada a qual leva a expressão de um fator neurotrófico tendo a mesma função e/ou atividade de um fator neurotrófico de acordo com a invenção. O transgene pode incluir, por exemplo, ácido nucléico genômico isolado de células humanas ou ácido *5 nucléico sintético incluindo cDNA, integrado no cromossomo ou em um es\ tado extracromossômico.

Preferivelmente, o transgene compreende um vetor de acordo com a invenção, cujo vetor inclui uma molécula de ácido nucléico codificando o dito fator neurotrófico, ou um fragmento funcional da dita molécula de ácido nucléico. Um fragmento funcional do dito ácido nucléico deveria ser tomado para significar um fragmento do gene ou cDNA codificando o dito fator neurotrófico ou um equivalente funcional disso, cujo fragmento é capaz de ser expresso para produzir um fator de crescimento neurotrófico funcional de acordo com a invenção. Assim, por exemplo, fragmentos do fator de crescimento neurotrófico de acordo com a invenção os quais correspondem aos resíduos de aminoácido específicos interagindo com o receptor correspondente também formam parte da presente invenção e cujos fragmentos podem servir para função como agonistas ativando o receptor correspondente do fator de crescimento de acordo com a invenção a fim de extrair seus efeitos de promoção de crescimento e de sustentação de sobrevivência em células. Este aspecto da invenção também incluem isoformas unidas diferencialmente e inícios transcripcionais dos ácidos nucléicos de acordo

com a invenção.

De acordo com a presente invenção, um ácido nucléico definido inclui não somente o ácido nucléico idêntico mas também quaisquer variações de bases menores incluindo, em particular, substituições em bases as quais resultam em um códon sinônimo (um códon diferente especificando o mesmo resíduo de aminoácido) devido ao código degenerado em substituições de aminoácido conservador. O termo molécula de ácido nucléico também inclui a seqüência complementar, para qualquer seqüência retorcida única dada com respeito as variações de base.

De acordo com um aspecto adicional, a invenção fornece um fator de crescimento neurotrófico humano isolado, codificado por uma molécula de ácido nucléico como definida aqui. Preferivelmente, o fator de crescimento compreende uma seqüência de aminoácido de posição 27 a 139 da seqüência de aminoácido de Figura 1 ou um equivalente, derivado ou bio15 precursor funcional disso.

Um equivalente funcional como definido aqui deveria ser tomado a significar um fator de crescimento que exibe todas as propriedades de crescimento e funcionalidade associadas com o enovin de fator de crescimento. Um derivado de enovin como é definido aqui é pretendido incluir um polipeptídeo no qual certos aminoácidos têm sido alterados ou apagados ou substituídos com outros aminoácidos e cujo polipeptídeo retém a atividade biológica de enovin e/ou cujo polipeptídeo pode reagir com anticorpos aumentados usando enovin de acordo com a invenção como o antígeno de desafio.

Abrangido dentro do objetivo da presente invenção são formas híbridas e modificadas de enovin, incluindo proteínas e fragmentos de fusão. As formas híbridas e modificadas incluem, por exemplo, quando certos aminoácidos têm sido sujeitos a alguma modificação ou substituição, tais como por exemplo, por mutação de ponto ainda cujas modificações ainda resultam em uma proteína que retém a atividade biológica de enovin, de acordo com a invenção. Seqüências de ácido nucléico específico podem ser alteradas por aqueles versados na técnica para produzir um fator de crescimento exi-

»·* ··· bindo as mesmas ou substancialmente propriedades para enovin.

Como é bem conhecido na técnica, muitas proteínas são produzidas in vivo com uma (pré) seqüência de sinal no N-terminal da proteína. Além disso, tais proteínas podem compreender uma pró-seqüência adicional que representa um precursor estável à proteína madura. Tais pré e pró seqüências são geralmente necessárias para atividade biológica. A molécula de enovin de acordo com a invenção inclui não somente a seqüência de comprimento total ilustrada na Figura 21, mas proveniente de posição 27 a 139, que segue o sítio de processamento proteólítico RXXR presente em fatores de crescimento deste tipo e que se acredita representar a seqüência madura de enovin.

Uma proteína, polipeptídeo ou seqüência de aminoácido definida de acordo com a invenção inclui não somente a seqüência de aminoácido idêntica mas isômeros disso além de variações de aminoácido menores da *15 seqüência de aminoácido natural incluindo substituições de aminoácido con> servadoras (uma substituição por um aminoácido que é referido em suas cadeias laterais). Também incluído são seqüências de aminoácido as quais variam do aminoácido natural mas resultam em um polipeptídeo o qual é imunologicamente idêntico ou similar ao polipeptídeo codificado pela se20 qüência ocorrendo naturalmente.

Proteínas ou polipeptídeos de acordo com a invenção além disso incluem variantes de tais seqüências, incluindo variantes alélicas ocorrendo naturalmente as quais são substancialmente homólogas a ditas proteínas ou polipeptídeos. Neste contexto, homologia substancial é considera25 da como uma seqüência a qual tem pelo menos 70%, e preferivelmente 80%, 90% ou 95% de homologia de aminoácido com as proteínas ou polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucléico de acordo com a invenção.

Fatores de crescimento neurotróficos expressos pelas células hospedeiras de acordo com a invenção são também abrangidos dentro da presente invenção.

A presente invenção é, além disso, direcionada para inibir o fator

de crescimento neurotrófico de acordo com a invenção in vivo pelo uso de tecnologia de anti-sentido. Tecnologia de anti-sentido pode ser usada para controlar expressão de gene através de formação de hélice tripla ou DNA ou RNA de anti-sentido, ambos de cujos métodos são baseados em aglutinação de um polinucleotídeo a DNA ou RNA. Por exemplo, a parte da seqüência de DNA codificando para a proteína madura da presente invenção é usada para um oligonucleotídeo de RNA de anti-sentido de 10 a 50 pares de base em comprimento. Um oligonucleotídeo de DNA é designado a ser complementar a uma região do gene envolvido em transcrição (hélice tripla - veja Lee e outros, Nucl. Acids. Res., 6:3073 (1979); Cooney e outros, Science, 241:456 (1988); e Dervan e outros, Science, 251:1360 (1991), desse modo, prevenindo a transcrição e a produção de enovin. O oligonucleotídeo de RNA de anti-sentido hibridiza ao mRNA in vivo e bloqueia translação de uma molécula de mRNA em enovin.

Devido a similaridade da seqüência entre o fator de crescimento descrito aqui com fatores de crescimento identificados previamente da família de GDNF, enovin é também acreditado ser capaz de promover sobrevivência e crescimento da célula e tratar distúrbios resultantes de defeitos em função ou expressão do dito fator neurotrófico.

As moléculas de ácido nucléico ou o fator neurotrófico de acordo com a invenção podem, vantajosamente, portanto, ser usadas para tratar ou prevenir distúrbios neurais em um sujeito administrando ao dito sujeito uma quantidade de molécula de ácido nucléico ou fator de crescimento de acordo com a invenção em concentração suficiente para reduzir os sintomas do dito distúrbio. Assim, as moléculas de ácido nucléico da invenção podem ser usadas para promover manutenção e sobrevivência de células de neurônios e para tratar distúrbios de neurônios ou condições neurodegenerativas incluindo mal de Parkinson, mal de Alzheimer, neuropatia periférica, esclerose lateral amiotrópica, trauma do nervo periférico e central ou dano de exposição a neurotoxinas.

O fator de crescimento neurotrófico de acordo com a invenção tem, vantajosamente, sido observado a conferir um efeito neurotrófico ou ^^dS%

Ά ~ a ^°/Rr_n -\^ neuroprotetor em células de neurônios ou populações de células, particular- ^σ mente aquelas células de neurônios ou populações de células as quais têm sido induzidas para suportar apoptose. Conformemente, o ácido nucléico ou o próprio fator de crescimento de enovin de acordo com a invenção pode adicionalmente ser usado em tratar distúrbios neurodegenerativos tais como derrame, doença de Huntingdons, neuropatia periférica, dano cerebral agudo, tumores no sistema nervoso, esclerose múltipla, esclerose lateral amiotrófica, trauma no nervo periférico, dano de exposição a neurotoxinas, neoplasina endócrina múltipla, doença de Hirschsprung familiar, doença associada a Prion, doença de Creutzfeld - Jacob administrando a um paciente em necessidade disso, uma quantidade do dito ácido nucléico ou enovin em concentração suficiente para reduzir ou prevenir os sintomas dos distúrbios de neurônios descritos aqui contidos.

Adicionalmente, e o qual está descrito em maiores detalhes no exemplo abaixo, enovin tem sido apresentado a acelerar recuperação de déficits sensórios induzidos, a qual identifica enovin como um candidato para tratar ou aliviar síndromes de dores com um componente neurogênico periférico ou central, doenças reumáticas/inflamatórias tanto como distúrbio de condutância, por administração a um paciente em necessidade disso em concentração suficiente para reduzir ou prevenir os sintomas destes distúrbios.

Um método alternativo para tratar os distúrbios nervosos descritos acima compreende implantar em células submetidas que expressam um fator de crescimento neurotrófico humano de acordo com a invenção tal como a célula transgênica descrita aqui.

As moléculas de ácido nucléico e fator de crescimento neurotrófico de acordo com a invenção podem também ser incluídos em uma composição farmacêutica junto com um veículo, diluente ou excipiente aceitável farmaceuticamente a esse respeito.

Anticorpos ao fator neurotrófico da presente invenção podem, vantajosamente, ser preparados por técnicas as quais são conhecidas na técnica. Por exemplo, anticorpos policlonais podem ser preparados inocu-

• * • · · ·

·.·. ·.·· lando um animal hospedeiro tal como um camundongo com o fator de crescimento ou um epítope disso e recuperando o soro imune. Anticorpos monoclonais podem ser preparados de acordo com técnicas conhecidas tais como descrito por Kohler R. e Milstein C., Nature (1975) 256, 495-497.

Anticorpos de acordo com a invenção podem, vantajosamente, ser usados em um método de detectar a presença de um fator de crescimento de acordo coma invenção, cujo método compreende reagir o anticorpo com uma amostra e identificar qualquer proteína ligada ao dito anticorpo. Um kit é também fornecido para executar o dito método o qual compreende um anticorpo de acordo com a invenção e meios para reagir o anticorpo com a dita amostra.

Também fornecido pela presente invenção é um kit ou dispositivo para detectar a presença de um fator de crescimento neurotrófico de acordo com a invenção em uma amostra, compreendendo um anticorpo *15 como descrito acima e meios para reagir o dito anticorpo e a dita amostra. _r Proteínas as quais interagem com o fator neurotrófico da invenção, tais como, por exemplo, receptor celular correspondente dele podem ser identificadas investigando interações proteína-proteína usando o sistema de vetor de dois híbridos o qual é bem conhecido para biólogos moleculares (Fields & Song, Nature 340:245 1989). Esta técnica é baseada em reconstituição funcional in vivo de um fator de transcrição o qual ativa o gene repórter. Mais particularmente, a técnica compreende fornecer uma célula hospedeira apropriada com um construto de DNA compreendendo um gene repórter sob o controle de um promotor regulado por um fator de transcrição tendo um domínio de aglutinação de DNA e um domínio de ativação, expressando na célula hospedeira uma primeira seqüência de DNA híbrido codificando uma primeira fusão de um fragmento ou tudo de uma seqüência de um ácido nucléico de acordo com a invenção e ou o dito domínio de aglutinação de DNA ou o dito domínio de ativação do fator de transcrição, ex30 pressando no hospedeiro pelo menos uma segunda seqüência de DNA híbrido, tal como uma biblioteca ou coisa parecida, codificando proteínas de aglutinação putativas a serem investigadas junto com o domínio de aglutina14

ção ou ativação de DNA do fator de transcrição o qual não é incorporado na primeira fusão; detectar qualquer aglutinação das proteínas a serem investigadas com a proteína de acordo com a invenção detectando a presença de qualquer produto de gene repórter na célula hospedeira; optativamente iso5 lando segundas seqüências de DNA híbrido codificando a proteína de aglutinação.

Um exemplo de tal técnica utiliza a proteína GAL4 em levedura. GAL 4 é um ativador transcripcional de metabolismo de galactose em levedura e tem um domínio separado para aglutinar a ativadores a montante dos genes metabolisantes de galactose tanto como um domínio de aglutinação de proteína. Vetores de nucleotídeos podem ser construídos, um dos quais compreende os resíduos de nucleotídeos codificando o domínio de aglutinação de DNA de GAL4. Estes resíduos de domínio de aglutinação podem ser fundidos a uma seqüência de codificação de proteína conhecida, tal como, *15 por exemplo, os ácidos nucléicos de acordo com a invenção. O outro vetor compreende os resíduos codificando o domínio de aglutinação de proteína de GAL4. Estes resíduos são fundidos a resíduos codificando a proteína de teste, preferivelmente do caminho de transdução de sinal do vertebrado em questão. Qualquer interação entre fator neurotrófico codificado pelo ácido nucléico de acordo com a invenção e a proteína a ser testada leva a ativação transcripcional de uma molécula repórter em uma célula de levedura deficiente de transcrição de GAL-4 na qual os vetores têm sido transformados. Preferivelmente, uma molécula repórter tal como β-galactosidase é ativada em restauração de transcrição dos genes de metabolismo de galactose de levedura.

O receptor para enovin tem sido identificado pelos presentes inventores como GFRa3. Ensaios podem, portanto, ser preparados para identificar compostos agonistas ou antagonistas de enovin. Este ensaio pode também ser usado em associação com outros fatores de crescimento neu30 rotróficos e seus receptores correspondentes. Compostos identificados podem ser usados para tratar ou prevenir distúrbios tais como mal de Parkinson, mal de Alzheimer, distúrbios neuronais associados com seqüências de

poliglutamina expandidas tais como doença de Huntingdons, neuropatia periférica, dano cerebral agudo, tumores no sistema nervoso, escierose múltipla, escierose lateral amiotrófica, trauma no nervo periférico ou dano de exposição a neurotoxinas, neoplasina endócrina múltipla ou doença de Hirschsprung familiar, doença associada a Prion, doença de Creutzfeld - Jacob, derrame, síndromes de dores com um componente neurogênico periférico ou central substancialmente, doenças reumáticas/inflamatórias tanto como distúrbios de condutância administrando a um indivíduo uma quantidade do dito agonista ou antagonista em concentração suficiente para prevenir ou tratar os ditos distúrbios neurais. Tais compostos podem também ser incluídos em composições farmacêuticas junto com um veículo, diluente ou excipiente aceitável farmaceuticamente a isso.

Agonistas ou antagonistas de um fator de crescimento (tal como, por exemplo, enovin) podem ser identificados em uma concretização entrando em contato com célula tecido ou organismo expressando um receptor apropriado e cRET com um composto candidato na presença do fator de crescimento e comparando os níveis de ativação de RET na dita célula, tecido ou organismo com um controle o qual não tem estado em contato com o dito composto candidato.

Uma concretização alternativa da invenção compreende um método de identificar agonistas ou antagonistas de um fator de crescimento neurotrófico, o dito método compreendendo entrar em contato uma célula tecido ou organismo expressando um receptor apropriado do dito fator de crescimento e cRET com um composto candidato na presença do dito fator de crescimento, medindo o nível de ativação de uma cinase de sinalização no caminho de transdução de sinal do qual o dito receptor apropriado é um componente seguindo adição de um anticorpo específico para a dita cinase de sinal conjugada a uma molécula repórter comparada a uma célula tecido ou organismo o qual não tem estado em contato com dito composto.

Um aspecto adicional da invenção compreende o uso de um composto identificado como um antagonista de acordo com a invenção na produção de um medicamento para tratar distúrbios ou condições gastrintes-

tinais mediados por movimento intestinal peristáltico aumentado.

Os compostos identificados nos ensaios da presente invenção podem vantajosamente ser usados para realçar a mobilidade gastrintestinal e, portanto, podem ser úteis em tratar condições relacionadas a um trânsito gastrintestinal impedido ou prejudicado.

Conformemente, tais compostos podem ser úteis em tratar animais de sangue quente, incluindo seres humanos, sofrendo de condições relacionadas a um vazio gástrico impedido ou prejudicado ou mais geralmente sofrendo de condições relacionadas a um trânsito gastrintestinal im10 pedido ou prejudicado. Conseqüentemente, um método de tratar é fornecido para abrandar condições de pacientes, tais como, por exemplo, refluxo gastroesofageano, dispepsia, gastroparese, íleo pós operatório, e pseudoobstrução intestinal.

Dispesia é um depreciação da função de digestão, que pode *15 surgir como um sintoma de uma disfunção gastrintestinal primária, especialmente uma disfunção gastrintestinal relacionada a um tônus muscular aumentado ou como uma complicação devido a outros distúrbios tais como apendicite, distúrbios de galbladder, ou desnutrição. Sintomas dispépticos são, por exemplo, uma perda de apetite, sensação de plenitude, saciedade precoce, náusea, vômito e inchação.

Gastroparese pode ser causado por uma anormalidade no estômago ou como uma complicação de doenças tais como diabete, esclerose sistêmica progressiva, anorexia, distrofia nervosa ou miotônica.

íleo pós operatório é uma obstrução ou uma deterioração cinéti25 ca no intestino devido a um disrupção em tônus muscular seguinte a cirurgia.

Pseudo-obstrução intestinal é uma condição caracterizada por constipação, dor cólica, e vômito, mas sem evidência física.

Os compostos da presente invenção podem assim ser usados ou para levar embora a causa atual da condição ou para aliviar os sintomas das condições.

Adicionalmente, alguns dos compostos sendo estimuladores de atividade cinética no cólon, podem ser úteis para normalizar ou melhorar o

trânsito gastrintestinal em sujeitos sofrendo de sintomas relacionados a mobilidade perturbada, por exemplo, uma peristalse diminuída do intestino delgado e grosso sozinha ou em combinação com vazio gástrico retardado.

Em vista da utilidade cinética do cólon dos compostos da pre5 sente invenção, a esse respeito é fornecido um método para tratar animais de sangue quente, incluindo seres humanos, sofrendo de distúrbios de mobilidade do sistema intestinal, tais como, por exemplo, constipação, pseudoobstrução, atonia intestinal, atonia intestinal pós-operatória, síndrome de intestinos irritáveis (IBS), e trânsito atrasado induzido por medicamento.

Compostos identificados como antagonistas de acordo com os ensaios da presente invenção podem também ser de uso potencial no tratamento ou profilaxia de condições gastrintestinais resultantes de movimentos peristálticos aumentados no intestino, tais como diarréia (incluindo diarréia secretora, diarréia induzida bacterial, cólica de diarréia, diarréia móvel, e di15 arréia psicogênica), doença de Crohn, cólon espástico, síndrome de intestinos irritáveis (IBS), hipersensibilidade gastrintestinal de intestinos irritáveis por diarréia predominante.

Em vista da utilidade dos compostos da invenção, segue que a presente invenção também fornece um método para tratar animais de san20 gue quente, incluindo seres humanos sofrendo de condições gastrintestinais tais como síndrome de intestinos irritáveis (IBS), especialmente os aspectos de diarréia de IBS. Conseqüentemente, um método de tratamento para abrandar pacientes sofrendo de condições tais como síndrome de intestinos irritáveis (IBS), síndrome de intestinos irritáveis por diarréia predominante, hipersensibilidade de intestinos e a redução de dor associada com hipersensibilidade gastrintestinal.

Os presentes compostos podem também ser de uso potencial em outros distúrbios gastrintestinais, tais como aqueles associados com mobilidade do intestino superior, e como antieméticos para tratar êmese, e dro30 ga citotóxica e êmese induzida por radiação.

Doenças de intestinos inflamatórias incluem, por exemplo, colite ulcerativa, doença de Crohn e outras mais.

*

Um aspecto adicional da invenção também compreende um método de tratar um distúrbio mediado por expressão de enovin de acordo com a invenção administrando a um paciente uma quantidade de uma molécula de anti-sentido ou um antagonista disso de acordo com a invenção em concentração suficiente para aliviar ou reduzir os sintomas do dito distúrbio.

Distúrbios mediados inativação ou inibindo expressão de enovin podem também vantajosamente ser tratados administrando a um indivíduo uma quantidade de composto identificado como um agonista de enovin em concentração suficiente para reduzir ou prevenir os sintomas do distúrbio.

Em um aspecto adicional, a invenção fornece um método para fazer uma formulação farmacêutica para o tratamento de doenças associadas com enovin de fator de crescimento neurotrófico humano, o dito método compreendendo, selecionar um composto candidato identificado como um agonista ou antagonista de enovin de acordo com a invenção, produzindo *15 quantidades de volumes do dito composto e formular o composto produzido em um veículo aceitável farmaceuticamente.

Como será visto em maiores detalhes dos exemplos abaixo, enovin tem sido bem-sucedida em reduzir déficits sensórios induzidos por taxol. Enovin pode, portanto, desempenhar um possível papel em síndromes de dores com um componente neurogênico periférico ou central substancialmente, doenças reumáticas tanto como distúrbios de condutância e podem desempenhar um papel modulador em processos sensórios após aplicação transdérmica, tópica, central local, (tais como epidural, intratecal, ICV, intraplexus, intraneuronal) por aplicação oral, retal e sistêmica. Portanto, no mesmo modo como descrito aqui para outras condições mediadas por enovin, estas condições podem ser aliviadas ou ainda prevenidas administrando ou uma molécula de anti-sentido, um ácido nucléico, uma proteína de enovin, composição farmacêutica, ou um composto identificado como um agonista ou um antagonista, como apropriado, de acordo com a invenção, em concentrações suficientes para aliviar ou prevenir os sintomas do(s) dito(s) distúrbio(s).

Composições terapêuticas ou farmacêuticas da presente inven.· · ção podem ser administradas por qualquer rota adequada conhecida na técnica incluindo, por exemplo, intravenosa, subcutânea, intramuscular, transdérmica, intratecal, ou intracerebral ou administração para células em protocolos de tratamento ex vivo. Administração pode ser ou rápida como por in5 jeção ou durante um período de tempo como por infusão lenta ou administração de formulação de liberação lenta. Para tratar tecidos no sistema nervoso central, administração pode ser por injeção ou infusão no fluido cerebroespinhal (CSF).

Enovin pode ser também ligado ou conjugado com agentes que 10 fornecem propriedades farmacêuticas ou farmacodinâmicas desejáveis. Por exemplo, pode ser acoplado a qualquer substância conhecida na técnica para promover penetração ou transporte através da barreira sangue-cérebro tal como um anticorpo para o receptor de transferina, e administrado por injeção intravenosa.

*15 Enovin, as moléculas de anti-sentido ou realmente dos compostos identificados como agonistas ou antagonistas de enovin de acordo com a invenção podem ser usadas na forma de uma composição farmacêutica, a qual pode ser preparada de acordo com procedimentos bem conhecidos na técnica. Composições preferidas incluem um veículo ou diluente ou excipi20 ente aceitável farmaceuticamente, tais como, por exemplo, uma solução salina fisiológica. Outros veículos aceitáveis farmaceuticamente incluindo outros sais não tóxicos, água estéril ou o coisa parecida podem também ser usados. Um tampão adequado pode também estar presente permitindo às composições serem liofilizadas e armazenadas em condições estéreis antes da reconstituição pela adição de água estéril para administração subseqüente. Incorporação de enovin em uma matriz compatível biologicamente sólida ou semi-sólida pode ser realizada a qual pode ser implantada em tecidos exigindo tratamento.

O veículo pode também conter outros excipientes aceitáveis farmaceuticamente para modificar outras condições tais como pH, osmolaridade, viscosidade, esterilidade, lipofilicidade, solubilidade ou coisa parecida. Excipientes aceitáveis farmaceuticamente os quais permitem liberação susό ··· <' tentada ou atrasada seguindo administração podem também ser incluídos.

A proteína de enovin ou as moléculas de ácido nucléico ou os compostos de acordo coma a invenção podem ser administrados oralmente.

Nesta concretização eles podem ser encapsulados e combinados com veí5 culos adequados em formas de dosagem sólidas as quais seriam bem conhecidas àqueles versados na técnica.

Como seria bem conhecido por aqueles versados na técnica, o regime de dosagem específico pode ser calculado de acordo com a área de superfície corporal do paciente ou o volume de espaço corporal a ser ocupa10 do, dependente da rota particular de administração a ser usada. A quantidade de composição atualmente administrada será, entretanto, determinada por um profissional médico, baseado nas circunstâncias pertencentes ao distúrbio a ser tratado, tal como a gravidade dos sintomas, a composição a ser administrada, a idade, peso, e resposta do paciente individual e a escoai 5 lha da rota de administração.

, A presente invenção pode ser mais claramente compreendida pelos exemplos seguintes os quais são puramente exemplares e por referência aos desenhos acompanhantes onde:

Figura 1: é seqüência de cDNA parcial de um fator neurotrófico de acordo com a invenção designada como enovin. A seqüência de consenso foi obtida por amplificação de PCR com iniciadores PNHsp3 e PNHapl em cDNAs diferentes e um DNA genômico seguido por clonagem e análise de seqüência e comparação das seqüências obtidas. A seqüência de aminoácido de código de uma letra predita é mostrada acima da seqüência de DNA.

O número de resíduo de nucleotídeo é mostrado à direita da seqüência de DNA, enquanto o número de resíduo de aminoácido é mostrado à direita da seqüência de proteína translada. O sítio de divagem RXXR putativo do pródomínio é indicado em negrito e sublinhado. O início putativo da proteína madura é indicado por uma flecha. As sete características de resíduos de cisteína conservados para todos os elementos da família TGF-β estão indicadas em negrito. Um sítio de N-glicosilação potencial é sublinhado duas vezes.

Figura 2: é alinhamento das seqüências de proteína madura preditas de GDNF, NTN, PSP e EVN humano. As seqüências foram alinhadas usando o programa de alinhamento ClustaLW- Resíduos de aminoácido conservados entre todas as três proteínas são incluídos nas áreas negras.

Resíduos conservados entre duas ou três das seqüências são transformados gradativamente em cinza. A característica dos resíduos de cisteína conservados 7 para elementos da família TGF-β está indicada por asteriscos acima da seqüência. Resíduos de aminoácido são numerados à direita. Os pontinhos indicam aberturas introduzidas na seqüência para otimizar o ali10 nhamento.

Figura 3: é seqüência de cDNA parcial de enovin. A seqüência de consenso foi obtida por amplificação de PCR (PCR primário com iniciadores PNHspI e PNHapl e PCR aninhado com iniciadores PNHsp2 e PNHap2) em cDNAs diferentes seguido por clonagem e análise de seqüência e com15 paração das seqüências obtidas. A seqüência de aminoácido de código de , uma letra translada de nucleotídeos 30 a 284 (lendo estrutura A) é mostrada acima da seqüência e numerada à direita (A1 a A85). Esta estrutura de leitura contém o códon de início de translação ATG putativo. A seqüência de aminoácido de código de uma letra translada de nucleotídeos 334 a 810 (lendo estrutura B) é mostrada acima da seqüência e numerada à direita (B1 a B159). Esta estrutura de leitura contém a região de homologia de GDNF, NTN e PSP. O número de resíduo de nucleotídeo é mostrado à direita da seqüência de DNA. O sítio de divagem RXXR putativo para o pró-domínio é indicado em negrito e sublinhado. O início putativo da proteína madura é indicado por uma flecha. As sete características de resíduos de cisteína conservados para todos os elementos da família TGF-β estão indicadas em negrito. Um sítio de N-glicosilação potencia! é sublinhado duas vezes.

Figura 4: é uma ilustração da localização do cromossomo de Enovin humano. (A) Diagrama de mapeamento FISH resulta para Enovin.

Cada um não representa os duplos sinais FISH detectados em cromossomo 1 humano, região p31.3-p32. (B) Exemplo de mapeamento FISH de Enovin. O painel esquerdo mostra os sinais de FISH em cromossomo 1. O painel

direito mostra a mesma figura mitótica manchada com 4’, 6'-diamidino-2fenilindol para identificar o cromossomo 1.

Figura 5: é uma ilustração de expressão de Enovin em tecidos humanos diferentes. Análises Northern blots (A), (B), (C) de expressão de tecido de Enovin. A expressão de mRNA de Enovin em tecidos humanos diferentes foi tributada usando uma sonda correspondente a parte da região de codificação de Enovin (incluindo a região de codificação para a proteína de Enovin madura) para análise de manchas de poli(A) humano rico em RNA. (A) Northern blot de tecido múltiplo (MTN); (B) Mancha II fetal de MTN de mancha II) de MTN. Painel (D) mostra uma auto-radiografia da mancha mestre de RNA humano sondado com o mesmo fragmento de cDNA de Enovin. Painel (E) mostra a localização de amostras de mRNA de tecido humano na mancha mestre de RNA de (D).

aumento de doses de enovin nesta sobrevivência, normalizado à condição do solvente. Células SH-SY5Y são diferenciadas por 5 dias com estaurosporina 25 nM antes de aplicação de taxol. Dados são provenientes de dois experimentos independentes em seis vezes. Meio e st. dev. são mostrados.

Figura 7: é uma representação gráfica do efeito de aumento de concentrações de enovin durante 48 horas em crescimento de neurite de estaurosporina - células SH-SY5Y diferenciadas, normalizadas à condição do solvente. Células SH-SY5Y são diferenciadas por 5 dias com estaurosporina 25 nM antes de iniciar as 48 horas do experimento. Como um controle positivo, o efeito diferenciador de estaurosporina 25 nM é mostrado. Comprimento de neurite é calculado em pelo menos 5000 células. Dado é fornecido dos experimentos executados em duplicatas. Meio e st. dev. são mostrados.

Figura 8 a 18: são representações gráficas do efeito de enovin em proliferação de vários tipos de células.

Figura 19: é uma representação gráfica dos efeitos de enovin em déficits sensórios induzidos por taxol usando o teste de pontadas de alfinete.

Dadas são as contagens cumulativas médias (± 1 SEM) durante tempo de ratos tratados com ou 2 doses diferentes de enovin (23 ou 130 pg/ml; n=10 ratos/grupo) ou veículo/solução salina (n=20 ratos) após taxol. Enovin ou solução salina/ veículo foram injetados em um volume de 75 μ! na área sub5 plantar da pata traseira direita.

Figura 20: é uma representação gráfica dos efeitos de enovin em déficits sensórios induzidos por taxol usando o teste de pontadas de alfinete. Dadas são as contagens cumulativas médias (± 1 SEM) durante tempo de ratos tratados com ou 2 doses diferentes de enovin (23 ou 130 μg/ml; n=10 ratos/grupo) ou veículo/solução salina (n=20 ratos) antes de taxol. Enovin ou solução salina/ veículo foram injetados em um volume de 75 μΙ na área subplantar da pata traseira direita.

Figura 21: é uma seqüência de DNA de enovin. A seqüência de consenso foi obtida por amplificação de PCR usando iniciadores PNHspS e

PNHapl em cDNA de córtex frontal humano e em DNA genômico humano seguido por clonagem, análise de seqüência e comparação das seqüências resultantes. A seqüência de aminoácido predita é mostrada acima a seqüência de DNA para a única variante de junção rendendo uma proteína de Enovin funcional após translação. O número de resíduo de nucleotídeo é mos20 trado à esquerda da seqüência de DNA, enquanto o número de resíduo de aminoácido é mostrado à direita da seqüência de proteína translada. Sítios de emenda 5' e 3' detectados por comparação de fragmentos de cDNA seqüenciados com a seqüência genômica são indicados por linhas verticais dobrando à esquerda ou direita, respectivamente, e são numerados conse25 cutivamente. O sítio de divagem de furina RXXR putativo para o pró-domínio é indicado em negrito e sublinhado. O início putativo da proteína madura é indicado por uma flecha. As sete características de resíduos de cisteína conservados para todos os elementos da família TGF-β estão indicados em negrito. Um sítio de N-glicosilação N-ligado potencial é sublinhado duas vezes.

Os sítios de emenda 5'e 3' são numerados e envolvidos.

Figura 22: é uma ilustração de expressão de variantes de junção de Enovin diferentes em tecidos humanos. (A) diagrama esquemático de

variantes de junção de Enovin identificadas por experimentos RT-PCR com iniciadores específicas de Enovin em RNA derivados de diferentes tecidos humanos seguidos por clonagem e análise de seqüência de produtos de PCR. A linha superior mostra uma escala (em bp). A segunda linha representa a seqüência genômica de Enovin. A posição do códon de início e parada de translação, e o início da seqüência de codificação de Enovin maduro e os sítios de emenda 5' e 3' (veja Figura 21) são indicados. A parte direita da figura mostra os produtos PCR obtidos por RT-PCR em ovário e em RNA de córtex frontal junto com uma escada de DNA de 100 bp. A posição das variantes de mRNA diferentes é indicada junto com seus tamanhos (de códon de início a parada). As proteínas transladas são mostradas na mão lateral esquerda. Caixas delineiam regiões representadas no cDNA. Linhas tracejadas representam DNA genômico unido fora. A região sombreada representa a seqüência de codificação de Enovin madura. A linha pontilhada marca o início da seqüência de codificação de Enovin madura. Os dois transcritos capazes de render proteína de Enovin funcional são indicados por um asterisco na mão lateral esquerda. (B) Distribuição de tecido das variantes de junção principais. A fotografia mostra os fragmentos de PCR obtidos por RT-PCR com iniciadores específicos de Enovin em cDNAs humanos diferentes. As 4 variantes de junção principais (A a D) são indicadas por flechas na mão lateral esquerda. Tamanhos são indicados na mão lateral direita baseados na escada de DNA de 100 bp usada como referência de tamanhos no gel.

Figura 23: Seqüência de proteína predita da variante de junção longa de Enovin, obtida juntando fora dos dois íntrons da seqüência de DNA de Figura 21. Sítios de emenda 5Ί e 3-1 são usados para remover o primeiro íntron e sítios de emenda 5'-2 e 3'-3 são usados para remover o segundo íntron. Isto resulta em uma seqüência de cDNA tendo uma codificação de estrutura de leitura aberta para a proteína de resíduo de aminoácido 228 mostrada acima.

Figura 24: Seqüência de proteína predita de uma variante de junção alternativa (curta) de Enovin, obtida juntando fora dos dois íntrons da

seqüência de DNA de Figura 21. Sítios de emenda 5'-1 e 3’-2 são usados para remover d primeiro intron e sítios de emenda 5-2 e 3’-3 são usados para remover o segundo intron. Isto resulta em uma seqüência de cDNA tendo uma codificação de estrutura de leitura aberta para a proteína de resí5 duo de aminoácido 220 mostrada acima. Esta seqüência de proteína perde 8 resíduos de aminoácido comparada à seqüência de Figura 23.

Figura 25: é uma representação gráfica dos resultados obtidos de experimentos designados para comparar os níveis de expressão de enovin em tecido adoecido normal. Expressão de Enovin e GAPDH é represen10 tada em tecido cerebral, a respeito de esclerose múltipla e mal de Aízheimer.

Figura 26: é uma representação gráfica dos resultados obtidos para detectar níveis de expressão de enovin GAPDH em mal de Parkinson e câncer.

Depósitos ---------------------15 (Plasmídeo EVNmat/pRSETB incluindo a seqüência de DNA codificando enovin, foi depositadoem, 6 de maio de 1999 sob n°,.de...Acessão LMBP 3931, na The Belgian coordinated collections of Micro-Biologie (BCCM) em Laboratorium voor Molecuaire - plasmidencollectie (LMBP) B9000, Ghent, Bélgica, de acordo com as provisões do Tratado de Buda20 peste de 28 de abril de 1997.

Materiais e Métodos Materiais

Polimerase Taq nativa, ampicilina, IPTG (isopropil-p-Dgalactopiranosídeo), X-gal (5-bromo-4-cloro-indolil-p-D-tíogalactosídeo) e todas as enzimas de restrição usadas foram provenientes de Boehringer Mannheim (Mannheim, Alemanha). Mistura de dNTP 10 nM foi adquirida de Life Tecnologies (Gaithersburg, MD, EUA). O kit de clonagem TOPO-TA foi adquirido de Invitrogen BV (Leek, Holanda). O kit de purificação de mini- ou midi-DNA de plasmídeo Qiagen, o kit Miniprep Spin Qiaprep e o kit de gel de extração Quiaquick foram adquiridos de Qiagen GmbH (Dusseldorf, Alemanha). Bibliotecas de cDNA, kits de cDNA Prontos Maraton™, Northern blots de tecidos múltiplos de painéis I e II de cDNA de tecido múltiplo humano

(MTC™) e o kit PCR de cDNA Advantage-GC foram obtidos de Clontech Laboratories (Paio Alto, CA, EUA). Todas as reações PCR foram executadas em um dador 9600 de sistema PCR GeneAMP (perkin Elmer, Foster City, CA, EUA). Meio LB (Luria-Bertani) consiste em 10g/I de triptona, 5g/l de ex5 trato de levedura e 10g/I de NaCI. Placas de 2x YT/ampicilina consiste em 16 g/l de triptona, 10g/I de extrato de levedura, 5 g/l de NaCI. 15g/l de agar e 100 mg/l de ampicilina.

Pesquisa de homologia de banco de dados e comparação de seqüência

Usando o fator neurotrófico derivado de linha de célula glial hu10 mano completo (GDNF; n° de acessão Q99748), neurturina (NTN; n° de acessão P39905) e persefina (PSP; no, de acessão AF040962) seqüências de proteínas derivadas de cDNA como seqüências duvidosas, um BLAST (Ferramenta de Pesquisa de Alinhamento Local Básico; Altschul e outros, 1990) pesquisa foi executada no cotidiano atual da seqüência tag expressa *

humana EMBL/Banco de gene (EST) e bancos de dados genômicos.

Pesquisas de BLAST adicionais foram executadas usando a seqüência genômica com n° de acessão AC005038 e vários ESTs presentes no banco de dados do banco de gene e mostrando homologia a esta seqüência foram detectados.

A porcentagem de identidade e porcentagem de similaridade entre elementos da família de GDNF foi calculada por modo de comparação de pares das seqüências usando o programa BETFIT (Pacote de software de análise de seqüência de Grupo de Computador Genéticos, versão 8.0, Universidade de Wisconsin, Madison, Wl, EUA). Alinhamentos de DNA ou seqüências de proteína foram feitos com o programa de alinhamento ClustalW (EMBL, Heidelberg, Alemanha).

Síntese de Oligonicleotídeo para PCR e seqüenciamento de DNA

Todos os iniciadores de oligonucleotídeos foram encomendadas de Eurogentec (Seraing, Bélgica). Iniciadores de seqüenciamento específico à inserção (15- e 16- mero) e iniciadores para uso em reações de PCR foram designadas manualmente. DNA foi preparado em colunas de troca de ânion Qiagen-tip-20 ou -100 ou Quiaquick spin (Qiagen GmbH, Dusseldorf,

► »·

Alemanha) e recuperadas das colunas em 30 μΙ de TE-tampão (10mM Tris. HCl, 1 mM de EDTA (sal de sódio), pH 8,0).

Reações de seqüenciamento foram feitas em ambas margens usando o kit de seqüenciamento de Ciclo Terminador de Grande Tintura de prisma ABI e foram passados em uns seqüenciadores de Biossistemas Aplicados 377XL(Perkim, Elmer, ABI Division, Foster City, CA, EUA). O software de Seqüenciador™ foi usado para reunir seqüência e edição manual (GeneCodes, AnnArbor, Ml, EUA).

Clonagem de um novo homólogo de GDNF

Uma região de DNA transpondo nucleotídeos 67411 a 68343 de

EMBL n° de acessão AC005038 da qual a seqüência de proteína translada estava homóloga para NTN maduro e PSP foi usado para designar cápsulas de oligonucleotídeos para amplificação PCR. As cápsulas diferentes usadas são mostradas em Tabela 1.

Ίδ Tabela 1: Iniciadores usados para a amplificação PCR de fragmentos de AC005038.

Nome da Iniciador	Seqüência do Iniciador
PNHspl	5'	- CGGTGCACTCAGGTGATTCCTCC - 3'
PNHsp2	5'	“ GGCAGCAAACCCATTATACTGGAACC - 3'
PNHsp3	5'	- CGCTGGTGCAGTGGAAGAGCC - 3'
PNHsp4	5'	- CTGCACCCCCATCTGCTCTTCC - 3'
PNHapl	5'	- GCAGGAAGAGCCACCGGTAAGG - 3'
PNHap2	5'	- CCAGTCTGCAAAGCCÇTGGAGC - 3'

Iniciadores PNHsp3 e PNHapl foram usados para amplificar um fragmento de 502 bp em cDNA derivado de tecidos humanos diferentes (cé20 rebro fetal, feto total, próstata ou cDNA Pronto de Maraton™ do pulmão (Clontech Laboratories), córtex frontal, hipocampos e cDNA do cerebelo) e um DNA genômico humano. Baseado na seqüência genômica base de dados de EMBL/Banco de gene (no. de acc. AC005038), o fragmento a ser amplificado foi predito a ter um conteúdo de G+C de 76%. Portanto, amplifi25 cações foram feitas usando o kit de PCR Advantage-GC (Clontech Laboratories, Paio Alto, CA, EUA) otimizado para a amplificação de seqüências de

• *·

DNA ricas em GC. Reações PCR foram executadas em um volume total de 50 μΙ, contendo 1x de tampão de reação de PCR de cDNA GC, 0,2 mM de dNTP, 1M de GC-MELT™, 200 nM de Iniciadores de PNHsp3 e PNH apl, 1 μΙ de mistura de polimerase Advantage Klentaq e 1 a 5 μΙ de cDNA ou 0,5 μg de DNA genômico. Amostras foram aquecidas a 95°C por 5 min e ciclo foi feito por 45s a 95°C, 1 min a 58°C e 40s a 72°C por 35 ciclos, com uma etapa final de 7 min a 72°C. Amostras foram finalmente tratadas com 2,5 U de polimerase de DNA Taq nativa para adicionar um balanço A. Produtos foram analisados em um gel de agarose 1% (p/v) em 1x de tampão TAE (40mM de

Tris-acetato, 1mM de EDTA (sal de sódio), pH 8,3). Fragmentos de PCR do tamanho esperado (495 bp) foram excisados do gel e purificados com o kit de extração de gel Quiaquick. Os fragmentos foram seqüenciados para confirmar sua identidade e clonados no vetor de plasmídeo pCR2.1-TOPO usando o kit de clonagem TOPO TA de acordo com instruções do fabricante.

Aproximadamente 20 ng de fragmento purificado foram combinados com 1 μΙ de vetor pCR2.1-TOPO em um volume total de 5 μΙ. Reações foram incubadas à temperatura ambiente (20°C) por 5 min. 2 μΙ da reação foram transformados em células competentes de TOP10F' (Invitrogen BV) usando transformação de aquecimento a choque e colocado em placas de 2x placas de YT/ampicilina suplementadas com 10 mM de IPTG e 2% (p/v) de X-gal para peneiramento azul-branco. Colônias brancas após cultivo durante a noite foram colhidas das placas, cultivo em 5 ml de meio LB suplementado com 100g/l de ampicilina e DNA de plasmídeo preparado usando o kit de Miniprep Spin Qiaprep. A presença de uma inserção do tamanho esperado foi confirmada por digestão de restrição com EcoRI. A inserção de plasmídeo de vários clones positivos foi seqüenciada e as seqüências obtidas comparadas usando o programa de alinhamento ClustaIW.

Para obter seqüência de codificação adicional obtida para o novo homólogo de GDNF, um fragmento com um tamanho esperados de

931 bp baseado na seqüência de EMBL/ Banco de gene (no. de ac.

AC005038) foi amplificado por PCR usando iniciadores de PNHspI a PNH apl. Reações de PCr foram executadas em um volume total de 50 μΙ, con-

tendo 1x de tampão de reação de PCR de cDNA GC, 0,2 mM de dNTP, 1 M GC-MELT™, 200 nM de iniciadores PNHspI e PNHapl, 1 μΙ de mistura de polimerase Advantage Klentaq e 1 a 5 μΙ de cDNA de cerebelo, córtex frontal ou hipocampo ou 0,5 pg de DNA genômico. Amostras foram aquecidas a

95°C por 5 min e ciclo foi feito por 45s a 95°C, 1 min a 58 C e 1 min e 30 s a

72°C por 35 ciclos, com uma etapa final de 7 min a 72°C. Produtos PCR foram analisados em um gel de agarose 1% (p/v) em 1x de tampão TAE (40 mM de Tris-acetato, 1 mM de EDTA (sal de sódio), pH 8,3). Uma segunda rodada de amplificação foi executada com iniciadores aninhados (PNHsp2 e

PNHap2). 1 μΙ da primeira rodada de amplificação foi usado em um volume total de 50 μΙ, contendo 1x de tampão de reação de PCR de cDNA GC, 0,2 mM de dNTP, 1 M GC-MELT™, 200 nM de iniciadores PNHsp2 e PNHap2 e 1 μΙ de mistura de polimerase Advantage Klentaq. Amostras foram aquecidas a 95°C por 5 min e ciclo foi feito por 45s a 95°C, 1 min a 58°C e 1 min e

30 s a 72°C por 35 ciclos, com uma etapa final de 7 min a 72°C. Amostras foram analisados em um gel de agarose 1% (p/v) em 1x de tampão TAE. Fragmentos de PCR do tamanho esperado (870 bp) foram excisados do gel e purificados com o kit de extração de gel Quiaquick. Os fragmentos foram seqüenciados para confirmar sua identidade e clonados no vetor de plasmí20 deo pCR2.1-TOPO usando o kit de clonagem TOPO TA de acordo com instruções do fabricante. Aproximadamente 20 ng de fragmento purificado foram combinados com 1 μΙ de vetor pCR2.1-TOPO em um volume total de 5 μΙ. Reações foram incubadas à temperatura ambiente (20 C) por 5 min. 2 μΙ da reação foram transformados em células competentes de TOP10F' usando transformação de aquecimento a choque e colocado em placas de 2x placas de YT/ampicilina suplementadas com 10 mM de IPTG e 2% (p/v) de X-gal para peneiramento azul-branco. Colônias brancas após cultivo durante a noite foram colhidas das placas, cultivo em 5 ml de meio LB suplementado com 100 mg/l de ampicilina e DNA de plasmídeo preparado usando o kit de

Miniprep Spin Qiaprep. A presença de uma inserção do tamanho esperado foi confirmada por digestão de restrição com EcoRI. A inserção de plasmídeo de vários clones positivos foi seqüenciada e as seqüências obtidas (4

comparadas usando o programa de alinhamento ClustaIW.

Análise de expressão de gene de enovin por análise RT-PCR

Iniciadores PNHsp3 e PNHapl (vejam tabela 1) foram usadas para a amplificação de um fragmento de 502 bp de enovin. Amplificações

PCR foram executadas em painéis de cDNA de tecido múltiplo humano (MTC™) normalizados aos níveis de expressão de mRNA de seis genes de organização diferentes. Reações de PCR com iniciadores específicos de enovin foram executadas em um volume total de 50 μΙ, contendo 5 μΙ de cDNA, 1x de tampão de reação de PCR de cDNA GC, 0,2 mM de dNTP, 1M de GC-MELT ™, 400 nM de iniciadores de PNHsp3 e PNH apl e 1 μΐ de mistura de polimerase Advantage Klentaq. Amostras foram aquecidas a 95°C por 30 s e ciclo foi feito por 30s a 95°C, e 30s a 68°C por 35 ciclos. Amostras foram analisadas em um gel de agarose 1,2 % (p/v) em 1x de tampão TAE (40 mM de Tris-acetato, 1 mM de EDTA (sal de sódio), pH 8,3) e imagens dos géis manchados de brometo de etídio foram obtidas usando um sistema de vídeo de Visão Aguda II (stratagene La Jolla, CA, EUA).

Pesquisa de similaridade da atualização diária de EMBL/Banco de gene com as seqüências de proteína de neurturina e persefina humanas renderam um seqüência de DNA genômica codificando para uma proteína nova putativa similar aos fatores neurotróficos GDNF, NTN e PSP a qual tem sido chamada de enovin (EVN). Pesquisa de homologia do banco de dados adicional usando a seqüência de DNA genômica rodeando a região de codificação para enovin rendeu vários clones de tag de seqüência expressa (EST) derivados de tecidos humanos diferentes (epitélio da próstata [no. de acessão AA533512 (ID1322952)], carcinoma pulmonar [no. de acessão AA931637] e tumor da paratiróide [no. de acessão AA844072]). Estes clones contém seqüência de DNA externo à região de homologia com GDNF, PSP ou NTN, mas confirmou que mRNA de enovin é expresso em tecidos normais e de tumor.

Amplificação de PCR inicial usando iniciadores (PNHsp3 e

PNHapl) baseada na seqüência genômica rendeu um fragmento « 500 bp de feto, cérebro fetal, próstata, córtex frontal, hipocampo, cDNA de cerebelo e

···· de DNA genômico, mas não de cDNA pulmonar. Clonagem e análise da sequência” destes fragmentos rendeu uma seqüência de DNA de 474 bp que transladou em uma seqüência de proteína predita de Ig^resíduos de aminoácido incluindo sete características de resíduos de cisteína conservados de todos os elementos da família de fator de crescimento transformador β (TGF-β) de proteínas (Kingsley, 1994) (Figura 1). A seqüência também conteve um motivo RXXR para divagem do pró-domínio (RAAR, posição de aminoácido 23 a 26) (Barr, 1991). Um sítio de divisão similar está presente nas seqüências de proteína de GDNF, NTN e PSP, em uma posição comparável na seqüência do pró-domínio. Admitindo divisão do pró-domínio de enovin ocorre neste sítio in vivo, a seqüência de proteína EVN madura contém 113 resíduos de aminoácidos (resíduo 27 a 139 na Figura 1) e tem uma massa molecular calculada de 11965 Da e um ponto isoelétrico de 11,8. Existe um sítio de N-glicosilação potencial presente na seqüência madura (NST em posição de aminoácido 121-123). Além do mais, várias regiões conservadas entre as formas maduras dos fatores neurotróficos conhecidos GDNF, NTN e PSP estavam também presentes em enovin (Figura 2). A Tabela 2 resume os resultados da comparação das seqüências de proteína maduras dos elementos da família de GDNF pelo programa BESTFIT. Porcentagem de identidade e porcentagem de similaridade são mostradas. As seqüências maduras de GDNF, NTN, PSP e EVN usadas nesta comparação iniciaram no primeiro resíduo de aminoácido seguindo o sítio de divisão RXXR.

Tabela 2: Comparação em forma de par de elementos de família GDNF humano maduro usando o programa BESTFIT.

Comparação	% de identidade	% de similaridade
EVN vs GDNF	38,8	47,2
EVN vs NTN	51	56,1 ·
EVN vs PSP	53,3 -	57,8
GDNF vs NTN	44,8	57,3
GDNF vs PSP	44,3	50
NTN vs PSP	50	54,4

Destas comparações é aparente que a proteína de enovin madura é mais aproximadamente relacionada a persefina e a neurturina do que a

GDNF.

Amplificação, clonagem e análise de uma seqüência de um 5 fragmento grande da seqüência de DNA de enovin de cDNA de córtex frontal usando iniciadores baseados na seqüência EMBL/Banco de gene genômica (no. de acc. AC005038) rendeu uma seqüência de 819 bp (Figura 3). Esta seqüência contém um códon de início ATG putativo em posições de nucleotídeo de 30 a 32 e rende uma estrutura de leitura aberta (estrutura de leitura

A em Figura 3) que estende até a um códon parado em posições de nucleotídeos 285-287. A seqüência de proteína translada desta região não mostra similaridade a qualquer proteína conhecida na base de dados. Translação da seqüência de cDNA na segunda estrutura de leitura (estrutura de leitura B em figura 3) rende um seqüência de proteína predita de 159 resíduos de aminoácido. Esta seqüência contém o sítio de divisão RXXR (posição B43 a B46; posição de nucleotídeo 460-471) e a seqüência correspondente a uma seqüência de enovin madura (posição B47 a B159; posição de nucleotídeo 472-810). A estrutura de leitura aberta incluindo o sítio de divisão RXXR e a seqüência de codificação de enovin madura estende de posição 334 do nu20 cleotídeo (precedida por um códon estático dentro da estrutura) a um códon parado em posição 811-813, mas não contém um códon ATG para um resíduo de metionina inicial. Em analogia com persefina (Milbrant e outros, 1998) hipotetiza-se que um íntron não unido está presente na maioria dos transcritos de mRNA do gene de EVN. GDNF e NTN também têm um íntron em suas regiões de codificação de pró-domínio respectivas (Matsushita e outros, 1997, Heuckeroth e outros, 1997).

Para avaliar a existência de transcritos de mRnA diferentes para Enovin, experimentos de RT-PCR foram executados usando iniciadores situados na extremidade 5' da seqüência de codificação Enovin exata 5' de um possível códon de início de ATG a montante (iniciador PNHsp5 [5-GCA

AGC TGC CTC AAC AGG AGG G-3’] e iniciador PNHsp6 aninhado [5'-GGT

GGG GGA ACA GCT CAA CAA TGG-3’] e na extremidade 3'(iniciador

PNHapl e iniciador PNHap2 aninhado [veja Tabela 1]. Experimentos foram executados em painéis de cDNA de tecido múltiplos (Painéis I e II MTC de Clontech), em uma biblioteca de cDNA de coração fetal (Clontech) e em cDNA derivado de cerebelo humano, hipocampo, ou córtex frontal (Masure e outros, 1998). Reações de PCR primárias foram executadas com iniciadores PNHspõ e PNHapl sob condições ricas em GC (kit GC-PCR de Superioridade, Clontech) para 30 ciclos de (95°C - 30s, 60 C -30s, 72°C - 1 min) como descrito. Reações de PCR aninhadas foram executadas em 1 μΙ do produto de PCR primário usando iniciadores de PNHsp6 e PNHap2 sob as mesmas condições para 30 ciclos. Produtos de PCR resultantes foram analisados em um gel de agarose de 1,5% e limitado em tamanho de +350 bp a ± 800 bp. Várias faixas foram purificadas do gel e os fragmentos de PCR seqüenciados diretamente. Alguns produtos de PCR purificados foram também clonados em vetor pCR2.1-TOPO (kit de clonagem TOPO-TA, Invitrogen) e então seqüenciado). Análise de seqüência confirmou a existência de moléculas de mRNA diferentes contendo seqüência de Enovin. As seqüências de fragmentos obtidas foram comparadas com a seqüência de Enovin genômica. Isto permitiu identificar vários sítios de emendas 5' e 3' possíveis na seqüência genômica (Figura 21). Todos estes sítios de emenda corresponderam a seqüência de consenso para sítios de emenda doadores e receptores (Senapathy, P., Shapiro, M.B. & Harris, N.L. (1990)) junções de emenda, sítios de ponto de ramificação, e exons: estatísticas, identificação e aplicações de seqüências a projeto de genoma. Métodos Enzimol. 183.252-278). As variantes da junção de Enovin diferentes identificadas e sua presença em tecidos humanos diferentes são resumidas na Figura 22. Somente dois dos 5 transcritos seqüenciados rendem proteína de Enovin funcional em translação do códon de início de ATG. Dois destes transcritos codificam para proteínas de 228 a 220 aminoácido, respectivamente com peptídeos de sinal predito de 47 e 39 resíduos de aminoácido. As seqüências de proteínas preditas destas duas variantes são mostradas na Figura 23 (variante longa) e Figura 24 (variante curta). A variante longa pode ser deduzida da seqüência de DNA de Figura 21 juntando o primeiro íntron em localizações 5-1 e 3-1 e ι

· · * ο segundo íntron em 5'-2 e 3-3. Em translação da estrutura de leitura aberta, a sequência de proteína predita de Figura 23 é obtida. A variante curta pode ser deduzida da seqüência de DNA de Figura 21 juntando o primeiro íntron em localizações 5'-1 e 3'-2 e o segundo íntron em 5’-2 e 3'-3. Em translação da estrutura de leitura aberta, a seqüência de proteína predita de Figura 24 é obtida.

O transcrito mais longo parece ser o mais abundante na maioria dos tecidos como julgado pela intensidade de fita na Figura 22B. Os transcritos mais curtos resultam em substituição de estrutura rendendo uma pro10 teína translada perdendo um homólogo de seqüência de aminoácido de Enovin maduro com GDNF, NTN E PSP. Os dois transcritos menores ainda perdem parte da seqüência de codificação madura, incluindo dois dos sete resíduos de cisteína altamente conservados. Figura 22 B mostra a distribuição das variantes de junção principais em tecidos humanos diferentes.

Ί5 mRNA de Enovin funcional é expresso em quase todos os tecidos testados, incluindo cérebro, coração, rim, fígado, pulmão, pâncreas, músculo esquelético, cólon, intestino delgado, leucócitos do sangue periféricos, baço, timo, próstata, testículos, ovário, placenta, e coração fetal. Em alguns tecidos humanos (por exemplo cerebelo, hipocampo), somente transcritos não funcio20 nais poderiam ser amplificados por PCR. Para o conhecimento, a ocorrência de transcritos de mRNA não funcionais a tal extensão não foi descrita antes. O significado biológico desta descoberta permanece para ser estudado. Embora a expressão de NTN e PSP em tecidos diferentes não tem sido completamente caracterizada, seus níveis de expressão parecem muito menores e a expressão mais restrita a certos tecidos (Kotzbauer e outros, 1996, Milbrandt e outros 1998).

Expressão recombinante de Enovin em Construção de E. coli de um plasmídeo de expressão de Enovin

Um fragmento de PCR 414 foi ampliado de DNA genômico hu30 mano com iniciadores de PNHsp4 e PNHap2 (Tabela 1) e clonado em vetor pCR2.1-TOPO usando clonagem TA (Invitrogen). A seqüência da inserção foi confirmada pela análise da seqüência. Um clone contendo uma inserção

* · · com a seqüência de consenso de Enovina (clone 36) foi usado para construção subseqüente de um plasmídeo de expressão. Duas cápsulas foram designadas contendo sítios de restrição apropriados em extremidades 5'. Adiante iniciador PNHexp-sp1 (5¹- GCG GAT CCG GCT GGG GGC CCG GGC A-3’) conteve um sítio de restrição BamHI (sublinhado) e iniciador reverso de PNHexp-ap1 (5’-GCC TCG AGT CAG CCC AGG CAG CCG CAG G-3’) conteve um sítio de restrição Xhoi (também sublinhado). Usando estes iniciadores, o fragmento 343 bp codificando para Enovin maduro (posição 81 a 422 em Figura 1) foi ampliado de clone 36. A reação de PCR foi executada em um volume total de 50 μΙ, contendo 1x de tampão de reação de PCR de cDNA GC, 0,2 mM de dNTP, 1M de GC-MELT™ (, 200 nM de iniciadores de PNHexp-sp1 e PNHexp-ap1, 1 μΙ de mistura de polimerase Advantage Klentaq e 10 ng de plasmídeo de DNA de clone 36. Amostras foram aquecidas a 94 C por 5 min e ciclo foi feito por 45s a 94 C, 1 min a 58°C e 30s a 72°C por 25 ciclos, com uma etapa final de 7 min a 72°C. O produto de 50 μΙ resultante foi purificado usando o kit de purificação Qiaquick PCR (qiagen) e o DNA eluído em 30 μΙ. 25 μΐ deste produto purificado foram então digeridos em uma reação de 30 μΙ com 10 U de BamHI e 10 U de Xhol em 1x de tampão B (Boehringer Mannheim) por 1h a 37 C. Após eletroforese em um gel de agarose 1% (p/v) em 1x de tampão TAE (40mM de Tris-acetato, 1mM de EDTA (sal de sódio), pH 8,3), a faixa esperada de 353 bp foi excisada do gel e purificadas com o kit de extração de gel Quiaquick. O fragmento resultante foi ligado no vetor pRSET B (Introgen) linearisado com BamHI e Xhol. A inserção da construção de plasmídeo foi resultante (hEVNmat/pRSETB) foi confirmada por análise de seqüência completa. A construção resultante codifica para uma proteína de 146 aminoácidos com uma massa molecular predita de 15704 Da incluindo um NH2-terminal 6x His-tag fundido em estrutura a seqüência de codificação de Enovin madura. A seqüência de aminoácido NH2 terminal da proteína resultante é assim MRGSHHHHHHGMASMTGGQQMGRDLYDDDDKDPAGGPGS (seqüência de Enovin madura em negrito, 6x His tag sublinhado).

Expressão de Enovin em células de E. coli L21(DE3)

Produção recombinante de proteína de Enovin foi executada essencialrriènte como descrito para Neurturina por Creedon e outros (1997), com modificações. Para a produção de proteína de Enovin recombinante o plasmídeo hEVNmat/pRSETB foi transformado em cepa de E. coli BL21 (DE3) e cultivada em meio de 2xYT/ampicilina (16g/l de triptona, 10g/l de extrato de levedura, 5 g/l de NaCl e 100 mg/l de ampicilina) a 30 C (225 rpm) ou 37 C (300 rpm) a um OD 600 de aproximadamente 0,5 antes da adição de IPTG a uma concentração final de 0,2 mM para induzir expressão. Péletes de células foram colhidas por centrifugação seguindo um período de indução de 3h, lavadas com solução salina de tampão de fosfato, centrifugadas e armazenadas congeladas. Para purificação e redobramentro, péletes de células foram ressuspensas em tampão de sonicação (20 mM de TrisHCI, pH 8,0, 300 mM de NaCl, 1 mM de 2-mercaptoetanol, inibidores de protease (tabletes de coquetel de inibidor de protease completo™(Boehringer Mannheim, 1 tablete por 50 ml de tampão) e 1 mg de lisozima por 500 mg de pélete de célula). Células foram disruptadas por sonicação e corpos de inclusão colhidos por centrifugação. Corpos de inclusão foram dissolvidos e incubados em tampão A (8 M de uréia, 20 mM de Tris-HCI pH 7,6, 200 mM de NaC, 1 mM de 20 mercaptoetanol) por 30 min a 37°C antes de adicionar a resina de Ni-NTA (ácido nitrilotriacético de níquel, Qiagen). Após 40 minutos agitando a 37°C, amostras foram lavadas uma vez com tampão A e carregadas em uma coluna de Ni-NTA. A coluna foi lavada sucessivamente com 10 volumes de coluna de tampão A, 10 volumes de coluna de tampão A em pH 7,2 e 10 volumes de coluna de tampão A em pH 7,2 + 10 mM de imidazol. A Enovin foi eluída da coluna em 4 volumes de coluna de tampão A em pH 7,2 +200 mM de imidazol.

Redobramento de Enovin foi executado por forma de etapa em diálise durante a noite a 4 C em tampão de renaturação (0,1 M de fosfato de sódio, 0,15 M de NaCl, 3μΜ de cisteína, 0,02% de Tween-20, 10% de glicerol, 0,01 M de Tris-HCI, pH 8,3) contendo quantidades decrescentes de uréia em cada etapa ( 6M a 4M a 3M a 2M a 1M a 0,5 M a 0 M de uréia). A proteína purificada foi aliquotada, armazenada a -20 C e além disso usada para

ensaios funcionais.

Localização cromossômica do gene de Enovin

Um fragmento de 3,3 kb do gene de Enovin foi amplificado de cDNA de cerebelo usando iniciadores EVN (7)-sp1 (5'-TTC GCG TGT CTA CAA ACT CAA CTC CC-3’) e PNHapl (5'-GCA GGA AGA GCC ACC GGT AAG G-3') designados na seqüência de número de acessão de EMBL AC005038. A reação de PCR foi executada em um volume total de 50 μΙ, contendo tx de tampão de reação de PCR de Padrão Longo Expandido (Boehringer Mannheim), 0,5 mM de dNTP, 1M de GC-MELT™ ((Clontech Laboratories), 400 nM de iniciadores de EVN(7)-sp1 e PNHapl e 1 μΙ de cDNA de cerebelo. Após 2 min iniciais a 94 C, 0,75 μΙ de polimerase de Padrão Longo Expandido (Boehringer Mannheim) foi adicionado e ciclo foi feito por 10s a 94°C, 30s a 58°C e 3 min a 68°C por 10 ciclos. Então, 20 ciclos adicionais foram executados aumentando o tempo de extensão a 68°C com 20s a cada ciclo. Um final de 7 min a 68°C foi também incluído. O fragmento de 3,3 kb resultante foi purificado após eletroforese em um gel de agarose/TAE 0,8% e clonado em vetor de pCR2.1-TOPO usando clonagem TA (Invitrogen). Análise de seqüência completa da inserção 3,3 kb de um clone confirmou que a seqüência de cDNA obtida correspondeu à seqüência genômica no banco de dados EMBL (número de acessão AC005038). Nenhum íntron foi juntado no cDNA obtido de cDNA de cerebelo.

Estudos de mapeamento de cromossomos foram realizados usando análise de hibridização in situ fluorescente (FISH) essencialmente como descrito (Heng e outros, 1992, Heng & Tsui, 1993). Linfócitos humanos foram cultivados a 37 C por 68-72 horas antes do tratamento com 0,18 mg/mi de 5-bromo-2'-deoxiuridina (BrdU) para sincronizar os ciclos celulares na população da célula. As células sincronizadas foram lavadas e recultivadas a 37°C por 6 horas. Células foram colhidas e lâminas foram preparadas usando procedimentos padrões incluindo tratamento hipotônico, fixação e secagem por ar. A sonda de 3,3 kb para Enovin foi biotinilada e usada para detecção de FISH. Lâminas foram cozidas a 55°C por 1 h, tratadas com RNase e desnaturadas em 70% de formamida em 2x NaCI/Cit (20x de

NaCI/Cit sendo 3M NaCI, 0,3 M de citrato de dissódio, pH 7,0) por 2 min a 70 C seguido de desidratação com etanol. A sonda foi desnaturada antes de carregar nas lâminas cromossômicas desnaturadas. Após hibridização durante a noite, lâminas foram lavadas e sinais de FISH e o modelo de faixa de

4',6’-diamidino-2-fenilindol foram gravados separadamente em filme fotográfico, e a designação do dado de mapeamento de FISH com faixas cromossômicas foi alcançado por superimposição de sinais de FISH com cromossomos 4',6'-diamidino-2-fenilindol em tiras (Heng & Tsui, 1993). Sob as condições usadas, a eficiência da hibridização foi de aproximadamente 72% para esta sonda (entre 100 figuras mitóticas checadas, 72 delas mostraram sinais em um par dos cromossomos). Já que a faixa de 4',6'-diamidino-2fenilindol foi usada para identificar o cromossomo específico, a designação entre o sinal da sonda e o braço curto de cromossomo 1 foi obtida. A posição detalhada foi além disso determinada baseada no resumo de 10 foto15 grafias (Figura 4A). Não existia localização adicional escolhida por detecção de FISH sob a condição usada, portanto, conclui-se que Enovin está localizada no cromossomo humano 1, região p31.3-p32. Um exemplo dos resultados de mapeamento está apresentado em Figura 4B.

Do dado do mapa do gene no Centro Nacional para Informação de Biotecnlogia (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genemap), pode ser deduzido que o clone genômico contendo a seqüência de Enovin (número de acessão EMBL AC005038) está localizado no cromossomo 1, entre marcadores D1S2843 e D1S417. Isto corresponde a cromossomo 1, região p31.1 a p32.3, conforme o dado obtido por análise FISH.

Distribuição de Tecido de Enovin como determinado por Northern blot e análise de nódoa de ponto

Northern blots contendo 2 μρ de RNA rico em poIi(A) derivado de tecidos humanos diferentes (Clontech Laboratories, Paio Alto, CA, EUA; nódoa MTN™, nódoa MTN™ II e nódoa MTN™ II fetal) foram hibridizados de acordo com as instruções do fabricante com um cápsula aleatória a-³²PdCTP rotulada (kit de Casula Elevada, Boehringer Mannheim) fragmento de

Enovin. 897 bp. Este fragmento foi obtido por amplificação de PCR com ini• · • « ·♦

. ··· ciadores de PNHspI e PNHapl em cDNA de córtex frontal e clonagem subseqüénfe em vetor pCR2.1-topo. O fragmento contém 897 bp de seqüência de Enovin até o códon parado e inclui a seqüência de codificação completa para proteína de Enovin madura.

mRNA de Enovin foi detectado como um transcrito principal de aproximadamente 4,5 kb (Fig 5A-C). mRNA de Enovin foi expresso em um limite de tecidos, mais proeminentemente em coração, músculo esquelético, pâncreas e próstata. Alguns transcritos de tamanhos menores estão presentes em por exemplo placenta (4 kb, 2,4 kb e 1,6 kb) e próstata (4 kb e 1,6 kb). Em tecido fetal, um transcrito proeminente de 2,4 kb está presente no fígado e para um pulmão de extensão menor. Outros transcritos estão também presentes em rim, fígado, pulmão e cérebro fetal.

Além disso uma mancha mestre de RNA (Clontech Laboratories) contendo RNA rico em poli(A) de tecidos humanos diferentes e estágios de desenvolvimento foi também hibridizada com a sonda de Enovin de 897 bp. As amostras de RNA ricas em poli(A) usadas para fazer esta mancha têm sido normalizadas aos níveis de expressão de oito genes de orientação diferentes pelo fabricante. mRNA de Enovin foi expresso de forma ubíqua, mas níveis de mRNA maiores estavam aparentes em próstata, glândula pituitária, traquéia, placenta, pulmão fetal, pâncreas e rim (Figura 5D+E).

Construção de vetores de fusões de GRFa-lgG-FC

Regiões de cDNA de GFRa-1, GFRa-2 e GFRa-3 (codificando para aminoácidos 27 a 427, 20 a 431 e 28 a 371, respectivamente) excluindo as codificações de seqüências ao sinal de peptídeo e para a região hidrófoba terminal COOH envolvida em ancoramento de GPI foram clonados em estrutura no sinal do vetor de expressão plg plus (R&D Systems Europe Ltd.). As proteínas resultantes expressas destes construtores contêm um peptídeo de sinal CD33 NH2 terminal de aminoácido 17, a região de proteína GFRa e um domínio 243 de fusão de IgGi-FC humano COOH terminal de aminoácido. Células CHO foram transferidas com construções de fusão GFRa e células transferíveis estáveis foram selecionadas usando 500 [ig de G418. Clones permanentes foram selecionados usando anticorpos anti Fc.

**

Para purificação de proteínas de fusão GFRa, células foram cultivadas em meio livre de soro e meio foi coletado após cada três dias. Meio foi centrifugado e aplicado a coluna de proteína A (Proteína A sepharose, Pharmacia Biotech). Limite de proteína foi eluído com 0,1 M de citrato de Na, pH 3,0 e coletado em tampão Tris 1 M, pH 8,4. Concentração de proteína foi estimada por absorbância a 280 nm usando um coeficiente de extinção de 1,5. Estas proteínas de fusão GFRa-1 a -3 Fc solúveis purificadas foram usadas para estudos de aglutinação subseqüentes.

Análise de ressonância de plásmon de superfície

Experimentos de ressonância de plásmon de superfície (SPR) foram executados a 25°C usando um instrumento de BIAcore 3000. Análises foram executadas com enovin e NGF como ligantes imobilizados. A matriz carboxilada de um chip sensorial F1 foi primeiro ativada com uma mistura 1:1 de 400 mM de N-etil-N-(dimetilaminopropil)-carbodiimida e 100 mM Nhidróxi-sucinamida por 10 min. Então enovin recombinante e NGF foram aplicados na superfície ativada em tampão de acetato 10 mM, pH 4,5 em uma taxa de fluxo de 5 μΙ/min. Grupos reativos não ocupados foram inativados com 1M de cloridrato de etanolamina. Para experimentos de aglutinação, GFRa1-3-Fc solúveis foram superfundidos em concentrações de ΙΟΙ 00 nM em solução salina de tampão de HEPES (150 mM de NaCI, 3,5 mM de EDTA, 0,05% P-20, 10 mM de HEPES, pH 7,4) em uma taxa de fluxo de ΙΟμΙ/min. A associação foi monitorada por 3 min e dissociação por 1 min seguida por regeneração com 5 mM de NaOH. Dissociação foi iniciada por superfusão com salina de tampão de HEPES. Um software de avaliação de BIAcore, 3,0 foi usado para calcular a taxa de associação (Ka), taxa de dissociação (Kd) θ as constantes de dissociação de equilíbrio (Kd calculada como Kd/Kg).

Resultados

SPR foi usado para medir aglutinação de GFRa1-3 solúveis para enovin imobilizada. Aglutinação específica para enovin poderia ser detectada com o GFRa3 somente. GFRal e GFRa2 não aglutinam a enovin imobilizada. A aglutinação observada de GFRa3 foi específica como se não /Η existisse aglutinação a NGF. Na aglutinação específica de experimento de controlê^èparado de TrkA-Fc (receptor NGF) ao NGF imobilizado foi detectado sem aglutinar a enovin imobilizada.

Das curvas de aglutinação obtidas usando três concentrações diferentes de GFRa, as constantes seguintes em Tabela 3 foram derivadas. Estes resultados demonstram que GFRa3 aglutina especificamente a enovin.

Tabela 3

Ka(1/Ms)	Kd(1/s)	KD (M)
GFRa3 1,6510®	5,08 10‘4	3,1 10’9

Já que GDNF, NTN e PSP todos promovem a manutenção e sobrevivência de tipos diferentes de células neuronais, é antecipado que enovin tem efeitos biológicos similares em células nervosas e, possivelmente, em outros tipos de células também. Portanto, é considerado que proteína de enovin pode ser útil no tratamento de distúrbios neurais em geral, incluindo mal de Parkinson, mal de Alzheimer, neuropatia periférica, esclerose lateral amiotrófica (ALS), doença de Huntington, dano cerebral agudo, tumores no sistema nervoso, esclerose múltipla, trauma no nervo periférico ou dano e exposição a neurotoxinas.

Enovin poderia também ser útil em vários aspectos de neuroproteção. Considerando seu efeito em sobrevivência de populações de células neuronais diferentes e nas extensões de neurite observadas no modelo de células de SHSY5Y, propõe-se que este composto poderia ter aplicações neuroprotetoras e neurorregenerativas.

Isto é baseado nas observações seguintes. Taxol induz apoptose neuronal em células de feocromocitoma de rato PC12 diferenciadas de NGF (nuydens e outros, submetido). Portanto, citotoxicidade induzida por taxol tem aspectos de apoptose neuronal, como monitorado por fragmentação de DNA, Marcação de Anexina V e proteção de bcl-2. Como uma extensão, portanto, pode ser deduzido que taxol induz apoptose em células SHSY5Y diferenciadas. Enovin é agora mostrado estar apto a reduzir esta morte celular e portanto pode reverter apoptose em geral.

O composto pode portanto ser útil nas condições neurodegenerativas seguintes nas quais apoptose tem sido observada, derrame (Hakim 1998), mal de Parkinson (Mardsen e outros 1998), mal de Alzheimer (Nagy e outros 1998), doença de Huntingtons (Wellington e outros 1997), Neurotrauma (Smirnova e outros 1998), Neuropatias periféricas, (Srinivisan e outros, 1998).

Como um exemplo para a última indicação clínica tem-se mostrado que este fator neurotrófico atualmente protege células de neuroblastomas humanas de SH-SY5Y diferenciadas contra toxicidade celular induzida por taxol.

Metodologia de Medidas de Viabilidade

Viabilidade celular foi determinada adicionando 100 μΐ de uma solução de 2,3-bis[2-metóxi-4-nitro-5-sulfofenil]-2H-tetrazólio-5-carboxanilida (XTT, sigma) de 1 mg/ml em DMEM (37 C)suplementada com 0,02 M de metossulfato de fenazina (PMS, Sigma) para cada cavidade. As placas foram então incubadas a 37 C por 2,5 horas. As densidades ópticas foram lidas (dispositivos moleculares) a 450 nm, usando 650nm como uma referência. O ensaio XTT é baseado na conversão do sal de tetrazólio XTT em um produto de formazan colorido de vermelho. Esta reação é executada por enzimas mitocondriais.

Metodologia de diferenciação neuronal

1. Diferenciação em células SHSY5Y de neuroblastoma humana

Células de SHSY5Y são diferenciadas por 5 dias com 25 nM de estaurosporina. Efeito de Enovin é medido 72 horas após início do experimento. (referência Jalava e outros Protein kinase inhibitor staurosporine induces a mature neuronal phenotype in SH-SY5Y human neuroblastoma cells through na a, b, z PKC (independent pathway Jornal cell physiol 155,

301-312 (1993)).

2. Medida de extensão de neurite

Mudanças morfológicas de neurônios foram automaticamente quantificadas como segue. Brevemente, em tempos apropriados, glutaraldeído foi adicionado diretamente ao meio e deixado por 30 minutos à tempe-

• · ·!

·: ·:

·· »· ratura ambiente. Isto assegurou que a morfologia das células naquele ponto de tempo refletiu a situação real. As células foram observadas através de modo de luz transmitida em um microscópio de Axiovert (Zeiss Oberkochem, Alemanha), equipado com um estágio de exploração de Marzhauser direcionado por uma estação de trabalho Indy (Silicon Graphics, Mountain View, EUA). Imagens foram capturadas usando uma câmera de vídeo MX5 (HCS). Aproximadamente 3000 células foram avaliadas em 64 imagens alinhadas, formando uma matriz quadrada 8x8 de imagens. O alinhamento exato das imagens assegurou que neurites poderíam ser seguidas de um campo de imagem no próximo. Detecção automática das extensões de neurite, marcadas por anticorpo tau policlonal foi executada usando um detector imparcial de estruturas curvilineares (Steger 1998). A área corporal celular total calculada automaticamente por software de análise, número de corpos celulares e comprimento de neurite total.

Para investigar o efeito de enovin em tipos de células diferentes, dois ensaios foram executados, ensaio de síntese de DNA e um ensaio de quimiotaxia.

Ensaio de síntese de DNA

Células incluindo fibroblastos dérmicos humanos (39SK), células endoteliais de veia umbilical humana (HUVEC), células de músculo liso humano (HSMC), condrócitos humanos, e osteoblastos de rato foram mantidos em DMEM contendo 10% de FBS (39-SK, HSMC, osteoblastos de rato) em um meio definido (condrócitos e HUVEC) a 37 C com 5% de CO₂ e 95% de ar. Para o ensaio de síntese de DNA, células foram semeadas em placa de cultura de tecido de 96 cavidades em uma densidade de 5.000 células/cavidade em DMEM contendo 10% de FBS e incubado por 24 h. O meio de cultura então foi substituído com DMEM contendo várias concentrações de Enovin e 0,1% de BSA (para 39-SK, osteoblastos, HSMC, condrócitos) ou DMEM contendo várias concentrações de Enovin e 0,5% de FBS (para HUVEC) e células foram incubadas por 24 horas. Subseqüentemente, o meio de cultura foi substituído com 100 μΙ de DMEM contendo 5% de FBS e 0,1 μθΐ de [³H]-timidina. Seguindo 2 h de marcação de pulso, células foram fixa-

das com metanol/ácido acético (3:1, vol/vol) por 1 h à temperatura ambiente. As células fixadas foram lavadas duas vezes com metanol. As células foram solubilizadas em 0,05% de tripsina (100 μΙ/cavidade) por 30 min e então e, 0,5% SDS (100 μ/cavidade) para um adicional de 30 min. Alíquotas de lisatos celulares (180 μΙ) foram combinadas com 2 ml de coquetel de cintilação e a radioatividade de lisatos celulares foi medida usando um contador de cintilação líquido (Wallac 1409).

Ensaio de Quimiotaxia

Células foram mantidas como descrito em Ensaio de Síntese de DNA. A atividade quimiotática de Enovin foi analisada usando uma Câmara de Boyden modificada de 12 cavidades (McQuillan, D.J., Handley, C.J., Campbell, M.A., Bolis, S., Milway, V.E., Herington, A.C., (1986), Estimulation of Proteoglycan biosynthesis by serum and insulin-like growth factor-l in cultured bovine articular cartilage Biochem. J. 240:423-430). Células foram tripsinizadas usando 0.05% de tripsina e 0,5 mM de EDTA e ressuspenso em DMEM. Para as cavidades inferiores de uma câmara de Boyden, alíquotas de 150 μΙ de meio contendo várias concentrações de Enovin foram adicionadas. Uma membrana de policarbonato (8 μιτι) revestida com 0,1 mg/ml de colágeno tipo I foi colocado no topo da cavidade do fundo, seguiu reunindo as cavidades superiores. Para as cavidades superiores, alíquotas de 100 μΙ de células (70.000 células/ml) foram adicionadas. Seguindo um período de incubação de 6 h, a aparelhagem foi separada. Células permanecendo no topo da membrana foram removidas. A membrana foi fixada com 10% de formaldeído por 15 min, seguido por alteração cromática com hemotoxilina de intensidade de Gili. Células foram contadas sob microscopia (250 x de ampliação), e a média de células contadas proveniente de cinco áreas de cada cavidade foi usada. Cada experimento foi repetido pelo menos quatro vezes. Os resultados foram expressos como a dobra de controle (DMEM contendo 0,1% de BSA).

Como ilustrado pelos resultados em Figura 8 a 18, enovin não tem efeito em proliferação em cada um dos tipos de células usadas, ou em migração de células HUVEC (Figura 14) como descrito acima. Existia um

,· ·. ή ·, ϊ -»·' £ ·: μ efeito de enovin em células de neuroblastoma SH-SY-5Y. Isto demonstrou efeito seletivo de enovins em células neuronais.

Ambos GDNF e NTN têm sido apresentados para sinalizar via um complexo de sinalização composto de uma subunidade de aglutinação de ligante, ou GFRa-1. ou GFRa-2, e uma subunidade de sinalização, a proteína cRET de tirosina cinase. Enovin é esperado exercer aseus efeitos biológicos via um complexo de sinalização composto de um cônjuge de aglutinação de GFRa (ou GFRa-1, GFRa-2, o receptor órfão caracterizado recentemente GFRa-3 ou outros como elementos ainda descaracterizados da família de GFRa) em combinação com cRET ou outro cônjuge de sinalização. Realmente, os dados de aglutinação mostram que enovin pode aglutinar especificamente a GFRa-3.

Em seres humanos, mutações de linha de germe em GDNF ou cREt podem levar a vários fenótipos de doenças incluindo neoplasia endó15 crina múltipla e doença de Hirschsprung Familiar (HSCR) (Romeo e outros, 1994 Edery e outros, 1994, Angrist e outros, 1996). Ambas doenças são associadas com desmotilidade do intestino, com doença de Hirschsprung sendo a causa mais comum de obstrução dos intestinos congênita em crianças. Interessantemente, camundongo GDNF e cRET abatidos exibirem patologi20 as notavelmente similares com agênese renal e aganglionose intestinal (Sanchez e outros, 1996; Moore e outros, 1996; Pichei e outros, 1996). Enovin poderia ser envolvido em distúrbios similares do intestino ou dos rins ou, já que está de forma ubíqua expresso, poderia ser importante no desenvolvimento dos órgãos periféricos no corpo.

A interação de ligantes com seus receptores é geralmente alcançada pela interação de ligações específicas de resíduos particulares em ambas proteínas. Fragmentos de uma proteína servem como agonistas ativando o receptor para extrair seus efeitos promotores de crescimento e de sustentação de sobrevivência em células. Partes de enovin ou peptídeos sintéticos baseados na seqüência de proteína de enovin podem portanto ser úteis como agonistas ou antagonistas para regular seu GFRa3 receptor.

Usando síntese de peptídeo ou técnicas recombinantes, fatores de cresci-

mento híbrido compostos de partes de GDNF, NTN ou PSP ou qualquer outro fator neurotrófico ou de crescimento com partes de enovin podem ser produzidos para render um novo fator de crescimento sintético com novas propriedades.

Duas experiências piloto foram conduzidas para testar se enovin está apta a mudar os déficits sensórios induzidos por taxol em ratos após injeções subplantares em ratos. Em um primeiro experimento, foi testado se um único tratamento com enovin poderia reverter o déficit sensório induzido por taxol, enquanto em uma segunda experiência foi testado se enovin pode10 ria prevenir o desenvolvimento dos déficits induzidos por taxol.

Reversão durante período de disfunção sensória induzida por taxol Procedimento

Ratos Sprague-Dawley machos, pesando 300-340 gramas, foram usados. Os animais foram alojados individualmente com alimento e água a vontade. Antes do início do experimento, os animais foram colocados em jaulas de observação padrão e após um período de habituação de 15 minutos, o reflexo de pontada de agulha foi avaliado. Para fazer isso, a superfície plantar da pata direita do animal foi estimulada com uma agulha e a reatividade a esta pontada de agulha foi marcada como presente (marca =1) ou ausente (marca =0). Dentro de uma sessão, o procedimento foi repetido três vezes com um intervalo de tempo de 1 min entre 2 apresentações de estímulos consecutivos; tais como o teste de pontada de agulha consistiu em 3 medidas de reatividade para uma pontada de agulha. Somente ratos tendo reações normais nas três pontadas de agulha foram incluídos no experi25 mento.

Nos 3 dias consecutivos pela manhã, os animais receberam diariamente uma injeção subplantar de 50 μΙ de taxol (3 mg/ml paclitaxel dissolvido em cremofor e álcool desidratado mais água) na pata traseira direita. Durante a manhã seguinte, o reflexo de pontada de agulha foi reavaliado e animais não mostrando qualquer reatividade as 3 apresentações de estímulos foram selecionadas. Estes animais foram aleatoriamente divididos em subgrupos (n=10/grupo) recebendo uma injeção subplantar na pata traseira

,*· ·*· · ·♦* ··* ·

direita de 75 μΙ de veículo, salina ou 23 ou 130 μΙ/ml de enovin. Porque nenhuma diferença foi observada entre os resultados dos animais tratados com veículo e salina, ambos grupos foram juntados (grupo de controle). Nos dias 1, 4, 5 e 7 após o último tratamento, o teste de pontada de agulha foi exe5 cutado, ambos pela manhã ( entre 8 e 9 horas) e a tarde (entre 15:30 e 16:30 horas). No dia 8, o último teste de pontada de agulha foi feito durante a manhã. Para cada animal, a marca cumulativa de reatividade à pontada de agulha foi medida durante a ação do tempo. Porque em total de 9 testes de pontada de agulha (cada um consistindo em 3 apresentações de pontadas de agulha) foram executados após o último tratamento de droga, a marca máxima a ser atingida durante o período de tempo total do experimento é 27. Resultados

Injeções subplantares repetidas de taxol durante 3 dias consecutivos resulta em uma reação inflamatória aguda com uma perda de res15 posta a uma estimulação de pontada de agulha na maioria de animais. Uma injeção subplantar de salina ou veículo não afeta o déficit induzido de taxol. Na primeira medição, somente 4 de 20 controles apresentados em pelo menos 1 reação as três pontadas de agulhas e a marca de pontada de agulha média (± SEM) dos controles na primeira medição foi 0,25 (± 0,12); isto em contraste ao início do experimento onde a marca média foi (± 0,0)porque todos os animais responderam a pontada de agulha. Mesmo após 8 dias de medição, a reatividade nos controles estava ainda prejudicada com 11 de 20 ratos respondendo pelo menos uma vez e com uma marca de pontada de agulha média de 0,75 (± 0,18). Dentro deste grupo de controle, nenhum dos ratos mostrou uma reatividade normal a todos os 3 estímulos. A marca de pontada de agulha cumulativa dos controles durante o tempo está apresentado em Figura 19. Porque os animais foram testados 9 vezes durante um período de 8 dias cada teste é 27. Como visto no gráfico, uma injeção subplantar de salina ou veículo era incapaz de reverter o déficit induzido por ta30 xol durante o período de tempo testado. A marca cumulativa total média dos controles no final do experimento foi 5,10 (± 0,87); sendo 18,9% da marca máxima a ser atingida.

Uma única injeção subplantar de 75 μΙ de 23 ^g/ml de enovin, resuItÕLTãpós a primeira medição em 4 de 10 ratos respondendo pelo menos uma vez, com uma marca de pontada de agulha média de 0,70 (± 0,33). No dia 8, todos os 10 animais responderam pelo menos uma vez à pontada de agulha, e uma reatividade normal estava presente em 5 de 10 ratos. A média de marca de pontada de agulha deste grupo em 8 dias foi 2,20 (± 0,29). Como comparado aos controles, a média de marca cumulativa no final dos 8 dias de medição estava significantemente aumentada (Mann - Whitney, teste U, de duas pontas, p< 0,01), alcançando uma marca de pontada de agulha média de 14,50 (± 1.96) (Figura 19). Isto é 53,7% da marca máxima.

Também com uma injeção subplantar de 130 pg/ml de enovin, foi aperfeiçoado eficácia contra os controles. Após a primeira medição de 130 μg/ml, 6 de 10 de enovin ratos responderam pelo menos uma vez com uma marca de pontada de agulha média de 1,10 (± 0,35). No dia 8, todos os

10 animais responderam pelo menos uma vez à pontada de agulha com uma marca de pontada de agulha média de 2,60 (± 0,22). Uma reatividade normal às pontadas de agulha estava presente em 8 de 10 ratos. A média total cumulativa de marca de pontada de agulha no final do experimento neste grupo foi 17,20 (± 1,94). Isto é 63,7% da marca possível total e signifi20 cantemente aperfeiçoada como comparado ao grupo controle (p< 0,01). Prevenção durante tempo de disfunção sensória induzida por taxol. Procedimento

Ratos Sprague-Dawley machos, pesando 300-340 gramas, foram usados. Os animais firam alojados individualmente com alimento e água à vontade. Antes do início do experimento, os animais foram colocados em jaulas de observação padrão e após um período de habituação de 15 minutos, o reflexo de pontada de agulha foi avaliado. Para fazer isso, a superfície plantar da pata direita do animal foi estimulada com uma agulha e a reatividade a esta pontada de agulha foi marcada como ou presente (marca =1) ou ausente (marca =0). Dentro de uma sessão, o procedimento foi repetido três vezes com um intervalo de tempo de 1 min entre 2 apresentações de estímulos consecutivos; tais como o teste de pontada de agulha consistiu de 3

medidas de reatividade para uma pontada de agulha. Somente ratos tendo reações normais nas três pontadas de agulha foram incluídos no experimento (marca de pontada de agulha = 3). Após esta medição de controle, os animais foram aleatoriamente divididos em subgrupos (n=10/grupo) rece5 bendo uma injeção subplantar na pata traseira direita de 75μΙ de ou veículo, salina ou 23 ou 130 μΙ/ml de enovin. Porque nenhuma diferença foi observada ente os resultados dos animais tratados com veículo e salina, ambos grupos foram juntados (grupo de controle). Durante os 3 dias consecutivos, os animais receberam diariamente uma injeção subplantar de 50 μΙ de taxol (3mg/ml paclitaxel dissolvido em cremofor e álcool desidratado, mais água) na pata traseira direita. Nos dias 1,4, 5 e 7 após taxol, o teste de pontada de agulha foi executado ambos pela manhã ( entre 8 e 9 horas) e a tarde (entre 15:30 e 16:30 horas). No dia 8, o último teste de pontada de agulha foi feito durante a manhã. Para cada animal, a marca cumulativa de reatividade à pontada de agulha foi medida durante a ação do tempo. Porque em total de 9 testes de pontada de agulha (cada um consistindo de 3 apresentações de pontadas de agulha) foram executados após o tratamento de taxol, a marca cumulativa máxima a ser atingida durante o período de tempo total do experimento é 27.

Resultados

Injeções subplaníares de salina ou veículo antes de taxol não preveniram o déficit induzido de taxol no teste de pontada de agulha. No primeiro teste após taxol, 8 de 20 ratos responderam pelo menos uma vez a pontada de agulha, com uma marca de pontada de agulha média de 0,60 (±

0,18). No dia 8; o déficit induzido por taxol estava ainda presente, com somente 8 de 20 animais respondendo e tendo a marca média de 0,8 (± 0,25). Dentro de dois animais, um reflexo de pontada de agulha normalizado estava presente. Durante o tempo, a marca de pontada de agulha cumulativa foi também reduzida, resultando em um valor médio de 6,55 (± 1,08); o qual é

24,3% da marca máxima (Figura 20).

Pré-tratamento com 23 pg/ml de enovin reduziu os déficits induzidos por taxol na pontada de agulha. No dia 1, 8 de 10 animais responde50

ram pelo menos uma vez, e a média de marca de pontada de agulha foi 1,70 (±0,40). Nõ dia 8, todos os 10 animais estavam respondendo com uma marca média de 2,50 (± 0,27). Aqui 7 animais revelaram uma reatividade normal em todas as exposições de pontada de agulha. Com respeito a resposta cumulativa durante tempo (Figura 20), a marca total média foi significantemente aumentada (p< 0,01), sobre o nível de controle a 18,40 (± 1.73); isto é 68,1% do valor máximo.

Resultados comparáveis foram obtidos após um pré-tratamento com 130 ^g/ml de enovin. Aqui, 6 de 10 animais responderam durante o primeiro teste com uma marca de pontada de agulha média de 1,70 (± 0,31). No dia 8, todos os animais responderam pelo menos uma vez a estimulação de uma pontada de agulha com uma marca média de 2,40 (± 0,22) e todas as 3 reações estavam normal em metade dos animais. Com respeito a marca cumulativa, a marca média obtida no dia 8 é 17,70 (+ 1,92), representan15 do 65,5% da marca total.

As séries presentes de experimentos indicam que uma única injeção subplantar de enovin está apta a reduzir os déficits sensórios induzidos por taxol como medido por um teste de pontada de agulha. Atividade é vista quando a droga foi aplicada a ambos antes e após taxol.

Enovin é um candidato possível para síndromes de dores com principalmente um componente neurogênico periférico e central, doenças reumáticas/inflamatórias tanto como distúrbios de condutância, e pode desempenhar um papel modulador em processos sensórios após aplicação transdérmica, tópica, local, central (tal como epidural, intratecal, e outras mais) e sistêmica. Além disso é digno usar enovin como uma ferramenta diagnostica para peneirar mudanças fisiopatológicas nas áreas acima mencionadas.

Comparação de expressão de mRNA de Enovin em tecidos adoecidos versus normais

A expressão de mRNA de Enovin foi quantitativamente analisada usando o Sistema de Detecção de Seqüência de Prisma 7700 ABI (TaqMan; Perkin Elmer) usando tecnologia proprietária desenvolvida e realizada

em Pharmagene Laboratories Ltd, Royston, Inglaterra. O sistema usa uma sonda flüõrõgènica para gerar sinais fluorescentes específicos para a seqüência durante PCR. A sonda é um oligonucleotídeo com repórter fluorescente e corantes de têmpera ligadas, é posicionada entre os iniciadores de PCR dianteiros e reversos. Enquanto intacta, a fluorescência repórter é suprimida pela têmpera. Deveria a sonda formar parte de um complexo de resposta, o repórter fluorescente é clivado da têmpera por uma atividade de exonuclease 5' a 3' inerente em Taq polimerase. O aumento em sinal de repórter fluorescente dentro de uma reação é uma medida direta da acumulação de produto de PCR. O número de cópias inicial de uma seqüência alvo de mRNA (Cn) é estabelecido determinando o número de ciclo de PCR fracionário (Ct) no qual um produto PCR é primeiro detectado - o ponto no qual o sinal fluorescente passa acima de um linha de base limiar. Quantificação da quantidade de mRNA alvo em cada amostra é estabelecida através de comparação de valores de Ct experimentais com uma curva padrão. Preparação de RNA e controle de qualidade

RNA total foi isolado do tecido completo e subdissecado, usando reagente de Tri-Zol (Life Tecnologies, Gaithersburg, MD, EUA) de acordo com o protocolo dos fornecedores. Procedimentos de controle de qualidade para todas as amostras de RNA incluiu uma tributação de integridade (RNA de ribossomo 18S e 28S intacto) e determinação da presença de transcritos de alta abundância (actina) e de baixa abundância (receptor de transferina). Propósito de iniciador/sonda

Um par de iniciadores e uma sonda TaqMan foram designados a amplificar uma seqüência específica de Enovin Iniciador 1: 5' ACGGTTCTCCAGGTGCTGT 3'

Iniciador 3: 5’ TGCTGCCGCCACG 3'

Sonda 5: 5’ CTACGAAGCGGTCTCCTTCATGGACG 3'

Além de um par de iniciadores e uma sonda Taqman foram designados os quais transpõe um íntron e amplificam uma proção do gene

GAPDH humano

Iniciador 2:

5' CAGAGTTAAAAGCAGCCCTGGT 3'

Iniciador 4:

5' GAAGGTGAAGGTCGGAGTCAAC 3'

Iniciador 6:

5’ TTTGGTCCGTATTGGGCGCCT 3'

Sonda 5 é rotulada com o FAM de flúor enquanto sonda 6 é rotulada com o VIC de flúor.

Tratamento de DNase de RNA total

Para cada tecido testado 2,2μρ de RNA total foi digerido com 2 unidades de DNase livre de RNase (Gibco BRL) por 15 minutos a temperatura ambiente em um volume de 20 μΙ de 1x de tampão de DNase (Gibco BRL). A reação foi parada por adição de 2 μΙ de 25 mM de solução de EDTA. As amostras foram então incubadas a 65°C por 10 minutos para inativar a enzima.

Síntese de primeiro filamento de cDNA

Para cada tecido testado 100 ng de RnA total foi usado como molde para síntese de primeiro filamento de cDNA. O RNA em um volume de 4 ml e na presença de 50 nM de iniciadores 1 e 2, 1x de tampão II de PCR (Perkin Elmer) e 5 mM MgCÍ2 foi aquecido a 72°C por 5 minutos e res20 friado lentamente a 55°C. Após adição de todos os reagentes, a reação de 6 ml foi incubada a 48°C por 30 minutos seguido por uma etapa de inatinação de enzima de 90 C por 5 minutos. As condições de reação final eram como segue: 1x de tampão II de PCR, 5 mM de MgCb, 1mM de dATP, dTTP, dGTP, 12,5 unidades de transcriptase reversa MuLV (Gibco BRL).

Ampliação de PCR de produtos de primeiro filamento de cDNA

O cDNA derivado de 100 ng de RNA total para cada amostra foi sujeita a ampliação de PCR em uma única reação para identificar ambos transcritos alvo e de GAPDH. As concentrações de iniciadores/sondas finais para alvo foram 300 nM de iniciador 1, 300 nM de iniciador 3 e 200 nM de sonda 5, aqueles para GAPDH foram 20 nM de iniciador 2, 20 nM de iniciador 4 e 1 00 nM de sonda 6. A concentração final de outros reagentes na reação foram 4,5% de glicerol, 1x de tampão A de TaqMan (Perkin Elmer),

6,25 mM de MgCI₂, 430 M de dATP, dUTP, dGTP, dCTP, 2,5 unidades AmpliTaq-Gold. A ampliação de PCR foi realizada no sistema de detecção de seqüência de ABI 7700, uma etapa de ativação de enzima inicial de 94 C por 12 min foi seguida por 45 ciclos de 94 C a 15 seg, 60 C a 1 min (tempo de elevação mínimo).

Doenças e tecidos testados

Expressão de mRNA de Enovin foi comparada em tecidos derivados de pacientes com doenças e indivíduos de controle normais (Figura 25 e 26). A tabela abaixo mostra as doenças e tecidos correspondentes que têm sido investigados. Para cada condição, três amostras de doenças e três de controle foram analisadas.

Patologia	Tecido 1	Tecido 2	Tecido 3
Mal de Alzheimer	córtex temporal	hipocampo		córtex occipital
Esclerose múltipla	medula espinhal	matéria branca ventricular	peri-	Cerebelo
Mal de Parkinson	substância negra	putamen		Cerebelo
Câncer	Ad en oca rei n orna de cólon	adenocarcinoma duto da mama	do	carcinoma de célula escamosa do pulmão

Análise estatística

Para cada grupo de 3 tecidos, a média e desvio padrão foram calculados nos valores de Ct (os quais são normalmente distribuídos) e fo15 ram então convertidos em valores de Cn de acordo com a fórmula Cn=10^((Ct‘ 40.007)/-3.623) _rse d_e variação (ANOVA) foi executada nos valores de Ct também para comparar os níveis de expressão de mRNA de Enovin médios em tecidos normais versus adoecidos.

Figuras 25 e 26 mostram os números de cópia de mRNA de

Enovin médios (± SD; n=3) em tecidos adoecidos versus normais. Análise estatística mostrou um aumento significante no nível de expressão de Enovin na matéria branca periventricular de pacientes com esclerose múltipla (p=0,013). O controle GAPDH interno não mostrou nenhuma diferença significante (p= 0,79). Embora o nível de expressão de Enovin na matéria branca periventricular é quase baixo em tecido normal (270 cópias por 100ng de

* * ♦

» 4 * » » • Η

RNA total em média versus 200000 cópias de GAPDH), o nível é três vezes maior (825) em pacientes com esclerose múltipla.

Somente um outro tecido adoecido mostrou uma diferença significante versus controle normal: em adenocarcinoma de duto da mama, o ní5 vel de expressão de mRNA de Enovin é 6 vezes maior (6000 versus 1000; p= 0,007), mas o valor de controle de GAPDH é também significantemente aumentado (165000 versus 44000; p= 0,03), provavelmente representando um aumento geral em níveis de mRNA.

Em inclusão, encontrou-se níveis de mRNA de Enovin a serem regulados por cima na matéria branca periventricular de pacientes com esclerose múltipla.

Uso de Elisa baseado em célula de anticorpo fosfo-específico para peneiramento de mimético de enovin em complexo de receptor de GFRa3/cRET

Método pode também ser usado para identificação de agonista ou antagonista de outros receptores de neurotrofina, tais como GFRal, GFRa2, GFRa4, TrkA, TrkB e TrkC.

Ensaio

Usando este ensaio pode-se identificar compostos agonistas ou antagonistas de fatores de crescimento neurotróficos medindo a ativação de cinase de sinalização, chave ativada no caminho neurotrófico ou medindo a ativação de cinase receptora cRET. A ativação é medida detectando a quantidade de cinase fosforilada ou cinase receptora usando anticorpos fosfoespecíficos. Usa-se células NIH 3T3 expressando transitoriamente ou per25 manentemente TrkA, TrkB, TrkC, GFRot1/cRET, GFRot2/cRET, GFRa3/cRET ou GFRa4/cRET.

A ativação de cinase MAP p^/p⁴⁴, cinase PKB, C-jun, CREB, cinase JNK/SAPK e outras cinases são detectadas usando anticorpos fosfoespecíficos comercialmente disponíveis. Além disso, ativação cRET pode ser excluída usando um anticorpo cRET fosfo-específico.

O protocolo usado foi como segue:

- Células de placa NIH 3T3 em 96 cavidades em 10% de soro de

bezerro, células têm de ser 80% confluentes antes da estimulação.

Próximo dia, repor meio com meio livre de soro e deixar sem alimento células por 18-24 h.

- Após fome estimular células com compostos e fatores neuro5 tróficos como controle positivo (10 ng/ml para fatores neurotróficos)

- Fixar células com formaldeído 4% em PBS a 4 C por 20 min.

- Lavar células 3x com 200 μΙ de PBS/0,1% de tríton por 5 min.

- apagar células com 100 μΙ de H₂O₂ em a 6% PBS/0,1% de tríton por 20 min.

- Lavar células 3x com 200 μΙ de PBS/0,1 % de tríton por 5 min.

- Bloquear as células com 100 μΙ a 10% de soro de bezerro fetal em PBS/0,1 % de tríton por 60 min.

- Incubar as células com anticorpo fosfo-específico de com 50 μΙ a 5% de BSA//PBS/0,1% de tríton, durante a noite a 4 C. Diluição de anticor15 po deveria ser experimentalmente determinada, limite sugerido 1:100-1:250.

- Lavar células 3x com 200 μΙ de PBS/0,1 % de tríton por 5 min.

- Incubar com anticorpo Hrp secundário ligado, diluição 1:100 em 50μΙ de 5% de BSA//PBS/0,1% de tríton, por 1 hora a temperatura ambiente.

- Lavar células 3x com 200 μΙ de PBS/0,1 % de tríton por 5 min.

- Dissolver 1 tablete de OPD (sigma) em 25 ml de tampão (3,65 g de ácido cítrico- H₂O e 5,9 g de Na₂HPO4-2H2O em 0,51 de H₂O, pH 5,6) e adicionar 12,5 μΙ de H₂O₂. Adicionar 50 μΙ a cada cavidade e incubar por 15 min em agitador (200 rpm), coberto com lâmina de alumínio.

- Parar a reação com 25 μΙ de H2SO4.

- Medir OD490-650 no leitor de ELISA

Cultura neuronal dopaminérgica mesencefálica Cultura neuronal

Culturas neuronais foram preparadas do mesencéfalo ventral de feto de rato por dispersão enzimática e mecânica. O tecido foi colecionado, lavado em solução salina de tampão de fosfato livre de Ca²⁺ e Mg²⁺ congelada contendo glicose 0,6% (PBSG)e incubado por 30 min com PBSG contendo tripsina 0,1% a 37¾. A suspensão de célula foi colocada em placa a

uma densidade de 2,5 10⁵ células/cm² em placas de cultura de tecido NUNC de 96 cavidades. Antecipadamente, placas de cultura foram revestidas com poli-L-ornitina e CDM contendo soro de bezerro fetal 10%. As culturas foram mantidas em meio definido quimicamente (CDM) composto de uma mistura

1:1 de meio de Dulbecco Modified Eagles e Nutriente F12 suplementado com glicose (0,6%), glutamina, (2mM)₁ bicarbonato de sódio (3 mM), HEPES (5mM), insulina (25 pg/ml), transferina humana (100 pg/ml), putrescina (60 pg/ml), selenita de sódio (30 pg/ml), estreptomicina (100 pg/ml) e penicilina (100 IU/ml).

Tratamento com fatores neurotróf icos

Neurotrofinas foram dissolvidas em 0,5% de albumina de soro bovina como uma matéria-prima. Neurotrofinas foram adicionadas 3 h após colocação em placa inicia! e após 5 dias em cultura. A mesma quantidade de 0,5% de albumina de soro bovina foi adicionada às cavidades de controle.

Levantamento de dopamina de alta afinidade

Levantamento de dopamina foi medida após 10 dias. Para o levantamento, células foram lavadas duas vezes com PBS pré-aquecido suplementado com glicose (5mM), ácido ascórbico (100 mM) e pargilina (100 mM) e pré-incubado por 10 minutos com a mesma solução. A solução de pré-incubação foi substituída com a mesma solução contendo 50 mM [³H]DA e incubação continuou por 15 min a 37 C. Levantamento foi parado por 3 lavagens rápidas com PBS congelado. A [³H] dopamina acumulada foi liberada incubando com etanol acidificado por 30 min a temperatura ambiente. Radioatividade foi determinada após adição de 4 ml de líquido de contilação (Packard ultima Dourado MV) usando contador cintilação de Packard. Levantamento não específico foi determinado adicionando 20 pM de cocaína.

Tabela 4. Efeito de enovin em levantamento de [³H] dopamina

Tratamento	Porcentagem de Levantamento de [3H] dopamina de controle	n
5 Controle	100	5
Enovin 300 ng/ml	111	4
Enovin 1000 ng/ml	127	5
Enovin 2000 ng/ml	152	5
Enovin 4000 ng/ml	161	1
10 Enovin 1000 ng/ml	165	2

Células foram cultivadas por 10 dias na presença ou ausência de enovin. Controles não tratados foram estabelecidos como 100%. Resultados são obtidos em experimentos independentes 1-5.

Referências

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Lista de abreviação

BLAST férrãménta de pesquisa de alinhamento local básico

Bp pares de base cDNA DNA complementar

CNS sistema nervoso central EST seqüência tag expressa EVN enovin

GDNF fator neurotrófico derivado de linha de célula glial GFRa receptor de família GDNFa

GPI glicosil fosfatidil inositol MTC cDNA de tecido múltiplo NTN neurturina

PCR reação de cadeia de polimerase PNS sistema nervoso periférico

Ί5 PSP persefina

RT-PCR transcrição reversa de PCR TGF-β fator de crescimento transformador β FISH hibridização in situ fluorescente MTN tecido múltiplo setentrional

NGF fator de crescimento do nervo

SPR ressonância de plásmon de superfície

Claims (26)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Vetor de expressão, caracterizado pelo fato de que compreende uma molécula de cDNA que codifica um fator de crescimento neurotrófico humano designado enovin e apresenta a sequência de nucleotídeos de

   5 SEQ ID NO:8 da posição 715 à posição 1137 ou sequências de nucleotídeos degeneradas da mesma codificando a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4.
2. 2. Vetor de expressão de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de ácido nucléico adici10 onal codificando uma molécula repórter.
3. 3. Micro-organismo transgênico, caracterizado pelo fato de ser transformado ou transfectado com o vetor como definido na reivindicação 1 ou 2.
4. 4. Micro-organismo transgênico de acordo com reivindicação 3, 15 caracterizado pelo fato de ser uma célula bacteriana.
5. 5. Micro-organismo transgênico, caracterizado pelo fato de que compreende um transgene que codifica um fator de crescimento neurotrófico humano e apresenta a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO:8 da posição 715 à posição 1137 ou sequências de nucleotídeos degeneradas da

   20 mesma codificando a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4.
6. 6. Micro-organismo transgênico de acordo com reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o dito transgene compreende um vetor como definido na reivindicação 1 ou 2.
7. 7. Uso de uma molécula de ácido nucléico que codifica um fator 25 de crescimento neurotrófico humano designado enovin e apresenta a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO:8 da posição 715 à posição 1137 ou sequências de nucleotídeos degeneradas da mesma codificando a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, caracterizado pelo fato de ser na produção de um medicamento para tratar ou prevenir distúrbios neuronais em

   30 um sujeito.
8. 8. Uso de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o dito distúrbio neuronal é selecionado de qualquer um do grupo

   Petição 870160048476, de 01/09/2016, pág. 4/9 consistindo em mal de Parkinson, mal de Alzheimer, distúrbios neuronais associados com sequências de poliglutamina expandidas tais como doença de Huntingdons, neuropatia periférica, dano cerebral agudo, tumores no sistema nervoso, esclerose múltipla, esclerose lateral amiotrófica, trauma no

   5 nervo periférico, dano de exposição a neurotoxinas, neoplasina endócrina múltipla, doença de Hirschsprung familiar, doença associada a Prion, doença de Creutzfeld - Jacob, derrame, síndromes de dores com um componente neurogênico substancialmente periférico ou central, doenças reumáticas/inflamatórias e distúrbios de condutância.

   10 9. Uso do fator de crescimento neurotrófico humano designado enovin que apresenta a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO:8 da posição 715 à posição 1137 ou sequências de nucleotídeos degeneradas da mesma codificando a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, caracterizado pelo fato de ser na produção de um medicamento para tratar ou pre15 venir distúrbios neurais.

   10. Uso de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o dito distúrbio neuronal é selecionado de qualquer um do grupo consistindo em mal de Parkinson, mal de Alzheimer, distúrbios neuronais associados com sequências de poliglutamina expandidas tais como doença

   20 de Huntingdons, neuropatia periférica, dano cerebral agudo, tumores no sistema nervoso, esclerose múltipla, esclerose lateral amiotrófica, trauma no nervo periférico, dano de exposição a neurotoxinas, neoplasina endócrina múltipla, doença de Hirschsprung familiar, doença associada a Prion, doença de Creutzfeld - Jacob, derrame, síndromes de dores com um componente

   25 neurogênico substancialmente periférico ou central, doenças reumáticas/inflamatórias e distúrbios de condutância.

   11. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende uma molécula de cDNA que codifica um fator de crescimento neurotrófico humano designado enovin e apresenta a sequência de nucleotí30 deos de SEQ ID NO:8 da posição 715 à posição 1137 ou sequências de nucleotídeos degeneradas da mesma codificando a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, junto com um veículo, diluente ou excipiente farmaceutiPetição 870160048476, de 01/09/2016, pág. 5/9 camente aceitável.

   12. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende um fator de crescimento neurotrófico humano designado enovin que apresenta a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO:8 da posição 715

   5 à posição 1137 ou sequências de nucleotídeos degeneradas da mesma codificando a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, junto com um veículo, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável.

   Petição 870160048476, de 01/09/2016, pág. 6/9

   1/28 j?p)

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   LLGAGAE.RPPPGSRFV 3122 cctactgggcgccggggccctgcgacçgcçcccgggcccccggcccgtca 700

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   7/28

   EXP 13S6: XTT na 72h

   FIG 7 :Enovin em morfologia de células SHSY5Y estouro - diferenciadas • « · · «
9. 9/28

   FIG 8:0s efeitos de Evonin em taxa de proliferação de células de Fibroblastos dérmicos humanos (39SK) (Tratamento de um dia) (uido) euipiLuii-HS
10. 10/28

    FIG 9 : Os efeitos de Evonin em taxa de proliferação de células de Fibroblastos dérmicos humanos (39SK) (Tratamento de três dias)

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    (uido) euipiuiii-Ηε
11. 11/28

    FIG 10 : Os efeitos de Evonin em taxa de proliferação de células de Condrócitos humanos (39SK) (Tratamento de dois dias) (tudo) euipiLuii-Ηε

    PDGF «ί • *
12. 12/28

    Enovin PDGF-BB

    WdO
13. 13/28

    FIG 12 : Os efeitos de Evonin em taxa de proliferação de células Endoteliais de veia Umbilical humanas (HUVEC) (Tratamento de um dia) jopesuQpuoo

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    1/
14. 14/28

    FIG 13 : Os efeitos de Evonin em taxa de proliferação de células Endoteliais de veia Umbilical humanas (HUVEC) (Tratamento de um dia)

    O O o o O O o o o o O o o O o o o o o o o o O o o o o co co ”4“ CN O co co CN T“ τ— τ™

    (uido) euipiiULL-HC

    O tr
15. 15/28

    FIG 14 : Os efeitos de Evonin em migração células Endoteliais de veia Umbilical humanas μπ/Sn i lui/ãu ooi |UI/ãU0I o UJ |ui/2u o (ui/âuos oiueuiiosejo Θρ ΟΙΘΙΛΙ

    PDGF

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    CM

    8|o4uoo ep sejqoQ * ··
16. 16/28

    FIG 15 : Os efeitos de Evonin em taxa de proliferação de Osteoblastos de ratos (Tratamento de um dia)

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17. 17/28

    FIG 16 : Os efeitos de Evonin em taxa de proliferação de células de músculo liso humano (SMC) (Tratamento de um dia)

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    (tudo) euipiiULL-HÇ
18. 18/28

    ÍUíyfiuOOt

    FIG 17 : Os efeitos de Evonin em taxa de proliferação de células de músculo liso humano (SMC) (Tratamento de três dias) £ [UJ/ÔU oi lí>

    PDGF |W/e<íOOldOQd ΐω/βης

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    (tudo) euipiiuii-HÇ
19. 19/28

    FIG 18 : Os efeitos de Evonin em taxa de proliferação de células de músculo liso humano (SMC) (24 horas faminto seguido por tratamento de um dia) (indo) euipiujii-HS
20. 20/28

    Marca de pontada de agulha cumulativa (máx = 27)

    Dias após última injeção • · · * • ♦ ·: .

    ·♦ ··
21. 21/28

    Reversão de déficites sensórios induzidos por taxol

    Marca de pontada de agulha cumulativa (máx = 27)

    Dias após última injeção • : ·«· ** • * · ·
22. 22/28 ^Λ υ p'hw ’ . Λ,.ί'ν ΟΙΛ

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    181 GTGTGGGAGGGAAAATGGTCAGGGAGGGACCAGGTGAATGGGAGGAGGAGCGGGACTTCT

    241 CTGAATGGTCGGTGCACTCAGGTGATTCCTCCCCTGGGCTCCCAGAGGCAGCAAACCCAT

    301 TATACTGGAACCTAGGCCCTTCCTGAGTTTCCCCTCCACACAGCTAGGAGCCCATGCCCG

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    601 CGG|3TAGGTGAÇAGGGCGAGGGGGCGGGGCGGGGCTGGCCCGGG ACACCGCGCGTG ACTG 'pGRTARWCSGRARRPP 661 GGTCTCATTCCAGpGGGACGCACGGCCCGCTGGTGCAGTGGAAGAGCCCGGCGGCCGCCG

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23. 23/28

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24. 24/28

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    MELGLGGLST LSHCPWPRRQ PALWPTLAAL ALLSSVAEAS LGSAPRSPAP

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25. 25/28

    Evonin e expressão de GAPDH em esclerose múltipla de mal de Alzheimer

    Expressão de Enovin esclerose múltipla tecido cerebral

    FIG 25: Meio e SD foram calculados usando valores de CT e então convertidos a Cn. Comparações em forma de dor foram feitas por análise de ANOVA.
26. 26/28

    FIG 25 (Continuação)

    Expressão de Enovin em mal de Alzheimer

    Expressão de GAPDH em mal de Alzheimer temporal Tecido cerebral occipital * * - Diferença estatisticamente significante

    FIG 26 : Enovin e expressão de GAPDH em mal de Pakinson e câncer

    Expressão de Enovin em mal de Parkinson

    Tecido cerebral

    Expressão de GAPDH em mal de Parkinson

    Λ

    Substância Putamen Cerebelo cinza

    Tecido cerebral

    Meio e SD foram calculados usando valores de Ct e então convertidos a Cn. Comparações em forma de dor foram feitas por análise de ANOVA.

    28/28

    FIG 26 (Continuação)

    Expressão de Enovin em câncer

    Tipo de câncer

    Tipo de câncer

    Diferença estatisticamente significante